RU2649820C2 - Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа - Google Patents
Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2649820C2 RU2649820C2 RU2016101660A RU2016101660A RU2649820C2 RU 2649820 C2 RU2649820 C2 RU 2649820C2 RU 2016101660 A RU2016101660 A RU 2016101660A RU 2016101660 A RU2016101660 A RU 2016101660A RU 2649820 C2 RU2649820 C2 RU 2649820C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- col1a2
- gene
- seq
- cdna
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 412
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 182
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 89
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 title claims abstract description 5
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 title claims abstract 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 title abstract description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 title description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 306
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 281
- 101150072801 COL1A2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 252
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 190
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 125
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 102
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 62
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 144
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 144
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 143
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 143
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 70
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 48
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 31
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 29
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 7
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 229920000469 amphiphilic block copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 101710096389 Collagen alpha chain Proteins 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 abstract 3
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 abstract 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 96
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 93
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 87
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 67
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 66
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 63
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 45
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 45
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 9
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 102100039532 Calcium-activated chloride channel regulator 2 Human genes 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000888580 Homo sapiens Calcium-activated chloride channel regulator 2 Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 7
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 7
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027399 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710100366 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 2 Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101100328883 Arabidopsis thaliana COL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 208000002197 Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710098724 Protein alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000018678 bone mineralization Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- -1 dTCP Chemical compound 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 2
- 210000002310 elbow joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 101150098516 3.1 gene Proteins 0.000 description 1
- NGRLGBBJGNXVML-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylaniline Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 NGRLGBBJGNXVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQMVBICWFFHDNN-UHFFFAOYSA-N 5-amino-4-chloro-2-phenylpyridazin-3-one;(2-ethoxy-3,3-dimethyl-2h-1-benzofuran-5-yl) methanesulfonate Chemical compound O=C1C(Cl)=C(N)C=NN1C1=CC=CC=C1.C1=C(OS(C)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C(OCC)OC2=C1 XQMVBICWFFHDNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241001386444 Anahita Species 0.000 description 1
- 101100114361 Arabidopsis thaliana COL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100028789 Arabidopsis thaliana PBS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101150008656 COL1A1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 101710126238 Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000945357 Homo sapiens Collagen alpha-1(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010050207 Skin fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229940121370 gene therapy substance Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000005900 regulation of collagen biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается средства для коррекции состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, на основе генно-терапевтических субстанций с геном COL1A2, где клетки органов и тканей выбраны из фибробластов, кератоцитов, хондробластов и эпителиальных клеток роговицы глаза, органы и ткани выбраны из кожи, хрящевой ткани или мышечной ткани человека, представляющего собой по крайней мере одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена COL1A2 SEQ ID No: 1 или модифицированной кДНК гена COL1A2, при этом в качестве модифицированной кДНК гена COL1A2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы в сочетании с транспортной молекулой или без нее. Группа изобретений также касается способа получения указанного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, на основе генно-терапевтических субстанций с геном COL1A2; способа использования указанного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена COL1A2 и/или уменьшением активности белка каталазы. Группа изобретений обеспечивает высокий и стабильный уровень целевого белка в клетках. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 18 пр., 20 ил.
Description
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с пониженным количеством продукта гена COL1A1 - белка альфа-2 цепи коллагена I типа в частности, в терапевтических целях.
Предшествующий уровень.
Ген COL1A2 кодирует коллаген первого типа, альфа 2. Ген имеет в своей структуре 52 экзона. Белок COL1A2 состоит из 1366 аминокислотных остатков. Тип I коллагена является наиболее распространенным форма коллагена в организме человека.
Данные по нокаутным мышам по гену COL1A2 показали, что они демонстрируют нарушения в формировании костей, снижение уровня минерализации костей, и снижение массы тела.
[PMID: 8968022], [PMID: 12206762], [PMID: 8446583], [PMID: 8567960], [PMID: 19594296],
http://www.informatics.jax.org/reference/J:121691
Коллаген - основной структурный белок межклеточного матрикса. Он составляет от 25 до 33% общего количества белка в организме. Под термином "коллаген" подразумевают семейство близкородственных фибриллярных белков, которые являются основным белковым элементом кожи, костей, сухожилий, хряща, кровеносных сосудов, зубов. В разных тканях преобладают разные типы коллагена, а это, в свою очередь, определяется той ролью, которую коллаген играет в конкретном органе или ткани.
В тканях человека существует несколько различных типов коллагена. В настоящее время известно 19 типов коллагена, которые отличаются друг от друга по первичной структуре пептидных цепей, функциям и локализации в организме. Наиболее широко в организме присутствует коллаген I типа. Он встречается главным образом в соединительной ткани кожи, костях, сухожилиях, стенке артерий, роговице глаза, склере, плаценте, дентине. Причем около 40% его находится в коже, около 50% - в тканях скелета и 10% - в строме внутренних органов. Присутствие коллагена в коже придает ей эластичность, в хряще и кости -прочность, в сухожилиях - прочность и эластичность, в роговице глаза - обеспечивает прозрачность, также коллаген принимает участие в ранозаживляющих процессах.
Коллаген - внеклеточный белок, но он синтезируется в виде внутриклеточной молекулы предшественника, которая в ходе процессинга трансформируется в проколлаген и далее в коллаген. В коже, сухожилиях, и костях главным образом представлен коллаген, содержащий в своей структуре две молекулы альфа 1 типа и одну альфа 2 типа. Различия в коллагене из перечисленных выше трех типов ткани (кожа, сухожилия, кости) проявляются в уровне гидрокислирования пролиновых и лизиновых остатков. Коллаген имеет трехспиральную альфа структуру.
Ген COL1A2 кодирует белок альфа1-цепи коллагена I типа и является потенциально значимым в формировании генетической предрасположенности к остеопорозу и хрупкости костей с риском переломов. Мутации в локусе данного гена приводит к возникновению особей различных фенотипов, в том числе жизнеспособных и фертильных особей, так и тех, которые характеризуются летальностью еще в эмбриональном периоде развития. У гомозигот по COL1A1(-/-) аллелю наблюдаются нарушения в формировании костей, и их хрупкость, осетопороз, кожный фиброз, нарушение послеродовой инволюции матки. [PMID: 22589248], [PMID: 18248096], [PMID: 24443344], [PMID: 2402497], [PMID: 10608859]. Снижение активности белка альфа 1-цепи коллагена 1 типа наблюдается при некоторых болезнях при мутациях в гене COL1A2 а также вследствие экологических, возрастных причин, приводящих к снижению активности этого белка, что в свою очередь отражается на свойствах органов и тканей человека. Клиническая картина заболеваний, вызванных дефектами синтеза и созревания коллагена, является очень полиморфной. При многих заболеваниях отмечают не только костно-суставную патологию или изменения со стороны кожи, но и ярко выраженные висцеральные проявления (поражения кишечника, почек, легких, сердца, сосудов).
В связи с этим разработка лечебных средств для коррекции патологических состояний, связанных с понижением экспрессии гена(ов) коллагенов в клетках, тканях, органах человека является актуальной задачей.
Для коррекции патологических состояний в соединительных тканях человека существует несколько подходов с использованием коллагена.
Так в патенте RU 2136265 предложена гелеобразующая основа для косметических средств. Предлагаемая основа предназначена для использования в составах водосодержащих косметических средств для ухода за кожей и волосами. Основа, помимо белка коллагена, дополнительно содержит хитозан при массовом соотношении коллагена и хитозана 1:(0,012-0,48). Технический результат изобретения - расширение арсенала основ косметических средств. При этом известно, что все кремы, содержащие коллаген, эластин и гликозаминогликаны, дают временный незначительный эффект, так как эти субстанции редко проникают глубже эпидермиса и только частично сглаживают морщины и складки. Недостаток подхода наружного применения коллагенсодержащих препаратов кожи состоит в том, что эти вещества обладают краткосрочным действием и требуют постоянного применения, могут вызвать побочные явления, например, аллергическую реакцию, применение таких препаратов полностью не компенсирует недостаточную работу генов, ответственных за синтез коллагена в организме.
В патенте US 3949073, предложен способ укрепления соединительной ткани различных типов у млекопитающих при помощи введения в место укрепления полимеризующегося in situ раствора нативного коллагена, полученного с применением пепсина, т.е. лишенного неспиральных концов молекулы. Такие растворы коллагена могут быть введены в организм путем инъекции или нанесены на поверхность раны; при температуре тела эти растворы превращаются в гель. В них могут быть включены любые клетки, возможна также добавка к таким растворам других компонентов внеклеточного матрикса или лекарственных веществ. Это обусловило применение нативного коллагена, полученного с применением пепсина, с добавлением клеток и лекарственных препаратов или без них, для репарации различных тканевых патологий.
В патенте RU (11) 2214827 (13) С1 описан способ получения коллагена, изобретение может быть использовано при лечении различной тканевой патологии, в том числе восстановления тканей, для клеточного культивирования. В частности, коллагеном, полученным по указанной методике, проводили усиление соединительной ткани по методу, описанному в патенте US 3949073: после ряда манипуляций коллаген путем инъекции вводили в поврежденную ткань организма. В месте введения коллаген полимеризовывался (образовывал гель), и возникал аналог соединительной ткани, который в течение недели начинал заселяться фибробластами и васкуляризоваться. Также полученный коллаген был использован для репарации мочевого сфинктера (лечение недержания мочи). К коллагену могут быть добавлены любые клетки, компоненты межклеточного матрикса или лекарственные препараты, как например в заявке 2000115816 на изобретение РФ, МКИ A61K 35/48, опубл. 13.06.2000, где нативный коллаген с сохраненными неспиральными участками применялся для лечения кожных ран в сочетании с эмбриональными фибробластами человека и другими компонентами межклеточного матрикса, например, хондроитинсульфатом, и лекарственными препаратами. Как показали испытания, полученный по данному способу коллаген обладает низкой иммуногенной и аллергенной активностью. Предлагаемый коллаген также пригоден для получения тканевых эквивалентов и коллагеновых конструкций.
Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения нативного белка коллагена желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, и белок может вызвать побочные реакции.
В патенте US 0008071364 В2 описано генно-терапевтическое средство на основе эластина и коллагена для стимулирования образование хряща, например, суставного хряща.
За прототип авторами было принято решение по патентной заявке US 20030064369 А1, в которой описано генно-терапевтическое средство на основе проколлаген I N-протеиназы. Данный фермент участвует в процессинге проколлагена I и II типа в коллаген. В патенте показан список полипептидов и кодирующие их нуклеотидные последовательности, и антитела, которые иммуноспецифично связываются с полипептидом, а также производные, варианты, мутанты, фрагменты или вышеупомянутого полипептида, или полинуклеотида или антитела. Кроме того, изобретение раскрывает терапевтические, диагностические и исследовательские методы диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний, связанных с любой из приведенных в патенте нуклеиновых кислот и белков человека. В списке полипептидов приведен белок, который гомологичен проколлаген I N-протеиназе человека из семейства цинк-связывающих металлопротеиназ. Показано, что кодирующая этот белок нуклеотидная последовательность, собственно полипептид, антитела к нему и родственные соединения согласно изобретению применимы в терапевтических и диагностических целях, например; при лечении синдрома Элерса-Данлоса типа VII С и/или других патологий. Синдром Элерса-Данлоса типа VII С - генетически обусловленное заболевание, которое возникает из-за отсутствия активности проколлаген I N-протеиназы, коллаген не образуется и наблюдается вялая, мягкая, одутловатая кожа. Показанная в патентной заявке опосредованная регуляция синтеза коллагена является частью механизма его процессинга (созревания) в клетке и не может влиять на основной механизм синтеза молекул для сборки коллагена в клетках пациента, что часто является причиной патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека. Также при создании генно-терапевтическогосредства в этом изобретении не учитывается индивидуальные характеристики пациента.
Раскрытие изобретения
Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний организма человека способных препятствовать количественному снижению белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена COL1A2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, приводящего к повышению количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.
Указанная задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена COL1A2 SEQ ID No: 1 или одну из модифицированных кДНК гена COL1A2, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена COL1A2 и увеличить количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или миоцитах, или миобластах, или фибробластах, или остеобластах, или кератоцитах, или эпителиальных клетках, или клетках роговицы, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в соединительно-тканных структурах, или коже, или суставах, или хрящевой ткани, или костной ткани, или мышечной ткани, или сухожилиях, или связках, или кровеносных сосудах, или стенке артерий, или роговице глаза, или склере, или плаценте, или дентине, или строме внутренних органов в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из созданной линейки представляет собой генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2, содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена COL1A2, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка альфа-2 цепи коллагена I типа, а именно: делеции 5'-нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена COL1A2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.
Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа заключается в том, что получают кДНК гена COL1A2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.
Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа заключается в том, что получают кДНК гена COL1A2, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.
Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.
Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.
Перечень фигур
На фиг. 1
Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена COL1A2, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_000089.3 COL1A2 SEQ ID No: 1.
На фиг. 2
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 2, которая
содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 4 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 3
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 3, которая
содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 8 нуклеотидных замен T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 4
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 4, которая
содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 12 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 5
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 5, которая
содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 16 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3189, 3249, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 6
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 6, которая
содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 20 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3117, 3189, 3249, 3405, 3486, 3963, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 7
Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A2, SEQ ID No: 7, которая
не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 20 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3117, 3189, 3249, 3405, 3486, 3963, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа.
На фиг. 8
С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2 проводили анализ эндогенной экспрессии гена COL1A2 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:
1 - кДНК гена COL1A2, фибробласты со сниженной экспрессией гена COL1A2
2 - кДНК гена COL1A2, фибробласты с нормальной экспрессией гена COL1A2
3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена COL1A2
4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена COL1A2
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 9
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A2 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена COL1A2 в фибробластах с нормальной экспрессией гена COL1A2,
2 - кДНК гена COL1A2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A2
3 - кДНК гена COL1A2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A2
4 - кДНК гена COL1A2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 после трансфекции вектором без кДНК гена COL1A2
5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена COL1A2,
6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A2
7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A2
8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A2 после трансфекции вектором без кДНК гена COL1A2
Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена COL1A2 уровень кДНК гена COL1A2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК COL1A2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A2 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена COL1A2 в нормальных фибробластах).
На фиг. 10
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена COL1A2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена COL1A2 представлен график изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК COL1A2 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1-COL1A2 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 происходит увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточном лизате.
На фиг. 11
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в интактной коже. Показано повышение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 (С).
На фиг. 12
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена 1 типа до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A2 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена COL1A2 представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2, используемой для трансфекции фибробластов.
Культуры фибробластов 28 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена COL1A2.
По итогам анализа количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 1,
в группе 2 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 2,
в группе 3 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 3,
в группе 4 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 4,
в группе 5 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 5,
в группе 6 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 6,
в группе 7 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7.
Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена COL1A2.
На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка альфа-2 цепи коллагена I типа (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2.
Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.
Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.
Обозначения:
На фиг. 13
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A2 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток роговицы глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена COL1A2, кератоциты до трансфекции
2 - кДНК гена COL1A2, эпителий роговицы до трансфекции
3 - кДНК гена COL1A2, кератоциты после трансфекции
4 - кДНК гена COL1A2, эпителий роговицы после трансфекции
5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции
6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции
7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции
8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции
Ген В2М использовали в качестве референтного.
Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена COL1A2 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.
На фиг. 14
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A2 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:
1 - кДНК гена COL1A2, до трансфекции
2 - кДНК гена COL1A2, после трансфекции
3 - кДНК гена В2М, до трансфекции
4 - кДНК гена В2М, после трансфекции
Ген В2М использовали в качестве референтного.
Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена COL1A2 вырос многократно.
На фиг. 15
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
На фиг. 16
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани человека при введении в хрящевую ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена COL1A2 pCDNA 3.1 COL1A2 SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань.
Показано увеличение количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптата хрящевой ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
На фиг. 17
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена COL1A2 - pCMV6-Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.
Обозначения:
На фиг. 18
С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A2 анализировали количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2.
Каждому из 24-х пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No: 1, pCMV6-SEQ ID No: 2, pCMV6- SEQ ID No: 3, pCMV6- SEQ ID No: 4, pCMV6-SEQ ID No: 5, pCMV6- SEQ ID No: 6, pCMV6- SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6- XL5.
По итогам анализа количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка альфа-2 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No:1,
в группе 2 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 2,
в группе 3 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 3,
в группе 4 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 4,
в группе 5 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 5,
в группе 6 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 6,
в группе 7 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалась при введении pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7.
Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа присутствует в случае введения плацебо.
На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка альфа-2 цепи коллагена I типа (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2.
Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.
Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.
Обозначения:
На фиг. 19
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена COL1A2.
По итогам анализа количества белка альфа-2 цепи коллагена 1 типа в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате клеточной культуры. В данном эксперименте максимальная концентрация белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате наблюдается при трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: 5, содержащей модифицированную кДНК COL1A2, что показано на фигуре 19.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
Обозначения:
1 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 1 (А)
2 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 2 (В)
3 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 3 (С)
4 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 4 (D)
5 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 5 (Е)
6 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 6 (F)
7 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 7 (G)
8 - клеточный лизат после трансфекции плацебо (Н)
На фиг. 20
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена COL1A2.
По итогам анализа количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при введении которой выявляется максимальная концентрация белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптата. В данном эксперименте максимальная концентрация белка альфа-2 цепи коллагена I типа отмечена при введении биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: 2, содержащей модифицированную кДНК COL1A2, что показано на фигуре 20.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.
Обозначения:
1 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 1 (А)
2 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 2 (В)
3 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 3 (С)
4 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 4 (D)
5 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 5 (Е)
6 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 6 (F)
7 - лизат биоптата после введения БАГТС COL1A2 SEQ ID No: 7 (G)
8 - лизат биоптата после введения плацебо (Н)
Реализация изобретения.
При снижении экспрессии генов, кодирующих белки коллагеногенеза, например гена COL1A2, происходит снижение количества белка в организме, что приводит к патологическим состояниям.
Данные по нокаутным мышам по гену COL1A2 показали, что они демонстрируют нарушения в формировании костей, снижение уровня минерализации костей, и снижение массы тела.
[PMID: 8968022], [PMID: 12206762], [PMID: 8446583], [PMID: 8567960], [PMID: 19594296],
Преимущества использования генетической конструкции с геном COL1A2 для коррекции количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей человека, по сравнению с использованием белка проколлаген I N-протеиназы, как по прототипу US 20030064369 А1 следующие:
1) легче обеспечить более высокий и стабильный уровень белка в клетках,
2) не требуется сложная и дорогостоящая процедура рефолдинга и очистки белкового препарата,
3) обеспечивается транспортировка биологически активной генно-терапевтической субстанции в больший спектр клеток органов и тканей человека, а также более эффективная внутриклеточная транспортировка биологически активной генно-терапевтической субстанции.
4) учитываются индивидуальные характеристики пациента.
Таким образом, для создания линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций по данному изобретению был выбран ген COL1A2, а не белок, кодируемый этим геном.
Для получения линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций осуществляют следующие действия:
1. Получение нативной кДНК гена COL1A2, содержащей белок-кодирующую область гена COL1A2, клонирование ее в промежуточную плазмиду для дальнейших модификаций этой кДНК
2. Внесение в последовательность нуклеотидов кДНК гена COL1A2 модификаций с целью создания линейки кДНК гена COL1A2, обеспечивающих достаточный для борьбы с патологическими проявлениями уровень трансляции белка альфа-2 цепи коллагена I типа
3. Клонирование нативной и модифицированных кДНК гена COL1A2 в векторные плазмиды, способные обеспечить эффективную экспрессию этой кДНК в клетках органов и тканей человека.
4. Трансформация каждой из полученных генетических конструкций бактериальных клеток E.coli, анализ трансформированных клонов на предмет наличия, ориентации и копийности вставки кДНК и наращивание отобранных клонов для получения необходимого для дальнейшей работы количества вариантов плазмидной ДНК.
5. Выделение линейки генетических конструкций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2 для создания на ее базе линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.
6. Создание линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций, каждая из которых включает генетическую конструкцию с модифицированной или нативной кДНК гена COL1A2, или комбинацию такой конструкции с транспортной молекулой для эффективной трансфекции различных типов клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека.
Для доказательства эффективности созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций, приводящих к увеличению экспрессии гена COL1A2, проводят следующие исследования:
A) Выращивание культур различных типов клеток из биоптатов различных органов и тканей человека, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы.
B) Выделение РНК из культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, и анализ экспрессии гена COL1A2 из генома этих клеток.
C) Трансфекция культуры клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, биологически активными генно-терапевтическимисубстанциями содержащими нативную и/или модифицированные кДНК гена COL1A2 и параллельная трансфекция культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена COL1A2 в различных комбинациях.
D) Сравнительный анализ изменения уровня кДНК и/или изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа после трансфекции в различных комбинациях клеток, например, фибробластов кожи человека, или хондробластов, или кератоцитов, или эпителиальных клеток роговицы, биологически активными генно-терапевтическими субстанциями содержащими нативную и/или модифицированные кДНК гена COL1A2 и параллельной трансфекции культуры этих же клеток векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена COL1A2. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью определения наиболее эффективной для пациента биологически активной генно-терапевтической субстанции.
E) Введение пациентам в органы и ткани культуры клеток с кДНК гена COL1A2, например, введение, в кожу человека, аутологичных фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 и параллельное введение пациентам в органы и ткани, например, в кожу, культур этих же клеток нетрансфицированных и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена COL1A2 и/или введение пациентам в органы и ткани биологически активных генно-терапевтических субстанций, например, введение в кожу человека биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК COL1A2, а также плацебо в различных комбинациях.
F) Сравнительный анализ количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в органах и тканях человека, в частности в коже человека, после введения клеток нетрансфицированных и трансфицированных биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими кДНК гена COL1A2 и векторными плазмидами, не содержащими кДНК гена COL1A2 и/или биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена COL1A2, а также плацебо.
G) Введение пациентам в органы и ткани, например, хрящевую ткань, или мышечную ткань биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК гена COL1A2, а также плацебо.
H) Сравнительный анализ количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в органах и тканях человека, в частности в хрящевой ткани, или мышечной ткани человека, после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и/или модифицированные кДНК COL1A2 а также плацебо.
I) Введение пациентам в органы и ткани, например, введение в кожу пациента биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и модифицированные кДНК гена COL1A2.
J) Сравнительный анализ количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в органах и тканях пациента, в частности в коже, после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную и модифицированные кДНК гена COL1A2. Данный анализ проводят, в частности, перед предполагаемой терапией с целью выбора наиболее эффективной для пациента биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Пример 1.
Получение нативной (немодифицированной) кДНК гена COL1A2.
Немодифицированная кДНК гена COL1A2 представляет собой последовательность нуклеотидов, идентичную приводимой в базе даных GenBank под номером NM_000089.3; нуклеотиды со 472 по 4572 транслируются в аминокислотную последовательность, соответствующую приведенной в GenBank под номером NP_000080.2.
Суммарную РНК получают из клеток человеческой крови с помощью набора PAXGeneBlood RNA Kit (Qiagen, Germany) используют для получения суммарной кДНК путем обратной транскрипции с помощью обратной транскриптазы RevertAid (ThermoScientific, USA) и случайных 9-нуклеотидных праймеров по методике производителя обратной транскриптазы. Затем, используя суммарную кДНК в качестве матрицы и специфичные, предварительно кинированные праймеры, комплементарные нуклеотидам 429-448 5' GGGGCTCTGCGACACAAGGA 3' (COL1A2F1) и 4782-4761 5' AATTTTTGGGGGAGCGGGGGAA 3' (COL1A2R1) из последовательности мРНК гена COL1A2 (GenBank NM_000089.3), получают кДНК COL1A2. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят с помощью ДНК-полимеразы Phusion (ThermoScientific, USA), дающей продукты с тупыми концами. ПЦР проводят с помощью амплификатора Master CyclerGradient (Eppendorf, USA) в 50 мкл. реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл суммарной кДНК первой цепи, по 0,1 мкМ каждого праймера COL1A2F1 и COL1A2R1, 250 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 100 мМтрис-HCl (рН 8,85 при 20°С), 50 мМ сульфата аммония, 250 мМ хлористого калия, 0,01% Твин-20 и 5 ед. Pfu ДНК-полимеразы (PhusionThermoScientific.USA) при следующих условиях: первоначальная денатурация при +98°С в течение 30 с, 35 циклов, включающих денатурацию при +98°С в течение 10 с, отжиг праймеров при +64°С в течение 30 с и элонгацию при +64°С в течение 9 минут.
Продукт амплификации выделяют из агарозного геля с помощью набора QIAquickGelExtractionKit (Qiagen, Germany)
Амплифицированный фрагмент кДНК, несущий ген COL1A2, клонируют в плазмидном векторе pUC19 (NEB, USA, кат номер N3041S). ДНК векторной плазмиды pUC19 (NEB, USA, кат. номер N3041S) гидролизуют рестриктазой Smal (NEB, USA), (или другой рестриктазой, дающей тупые концы) и обрабатывают щелочной фосфатазой. Амплифицированный фрагмент кДНК и линеаризованную плазмиду pUC19 лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 400000 ед./ мл. (NEB, USA, кат номер M0202S) из расчета 1 мкл фермента на 1 мкг ДНК. Лигирование проводят в объеме 20 мкл в присутствии 2 мМ АТФ, 50 мМ трис -HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT в течение 10 ч при +16°C.
Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coliTop10 (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html). которые высевают на чашки Петри с L-агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2% X-gal. Отдельные колонии анализируют на наличие вставки с помощью ПЦР с праймерами COL1A2F1 и COL1A2R1H подтверждают секвенированием по методу Сэнгера, которое показывает наличие клонов с разной ориентацией целевого гена: EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и HindIII-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI
Полученная таким образом клонированная частичная (с 429 по 4782 н.п.) нативная (немодифицированная) последовательность гена COL1A2 длиной 4354 н.п. в плазмиде pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 1 имеет первичную структуру, приведенную на фиг. 1.
Пример 2.
Получение модифицированных кДНК гена COL1A2.
Модификации проводят таким образом, чтобы не затрагивать первичную структуру белка альфа-2 цепи коллагена I типа, а именно, делеции 5'-нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.
В частности для получения линейки кДНК гена COL1A2 с целью повышения эффективности транскрипции и трансляции альфа-2 коллагена I типа в клетках тканей и органов человека в нативную последовательность кДНК COL1A2, используя принцип оптимизации кодонов, вносят модификации путем замены минорных кодонов на синонимичные мажорные, а также проводят делеции 5'-нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей таким образом, чтобы замены не привели к изменениям в аминокислотной последовательности белка или обрыву аминокислотной цепи при трансляции, не ухудшили процессы транскрипции и трансляции.
Все модификации осуществляют в несколько этапов методом ПЦР мутагенеза набором QuikChange II XL kit или QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (AgilentTechNo : logies, USA,) согласно рекомендациям производителя.
http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/200513.
К плазмидной ДНК pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 по Примеру 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI) в количестве 10-50 нг добавляют 50-100 нг праймера, содержащего необходимую замену, инсерцию или делецию длиной 25-45 н.п.и проводят ПЦР в буфере QuikChange Multi reaction buffer (AgilentTechNologies, USA) со смесью ферментов QuikChange Multi mix (AgilentTechNologies, USA) при следующих условиях: 95°C, 1 мин; далее от 30 до 35 циклов: 95°С 1 минута, 55°С 1 минута, 65°С 2 минуты/1000 н.п. После проведения ПЦР к амплификационной смеси добавляют 1-2 мкл рестриктазы Dpn I и инкубируют 1-2 часа при 37°С. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки E.coliTop10 (http://molbiol.ru/protocol/03_04.html), которые высевают на чашки с L- агаром содержащих 100 мкг/мл. Трансформированнные колонии анализируют на содержание мутаций секвенированием плазмидной ДНК по методу Сэнгера.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 2 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой Т→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 2 содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 4 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг. 2.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 3 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой T→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
6. COL1A2 1133-1157 F:
5' AGAGAGGACGGGTTGGTGCCCCTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1133-1157, с заменой T→G в позиции 1143;
7. COL1A2 1161-1193 F:
5' AGCTGGTGCCCGGGGCAGTGATGGAAGTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1161-1193, с заменой T→G в позиции 1173;
8. COL1A2 1303-1334F:
5' CCCGCCGGTCCCCGGGGTGAAGTGGGTCTTCC 3',
комплементарную нуклеотидам 1303-1334, с заменой T→G в позиции 1317;
9. COL1A2 1674-1701 F:
5' TCCTGGTTCTCGGGGTCTTCCTGGAGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1674-1701, с заменой T→G в позиции 1686.
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 3 содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 8 нуклеотидных замен T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг 3.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 4 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой T→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
6. COL1A2 1133-1157 F:
5' AGAGAGGACGGGTTGGTGCCCCTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1133-1157, с заменой T→G в позиции 1143;
7. COL1A2 1161-1193 F:
5' AGCTGGTGCCCGGGGCAGTGATGGAAGTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1161-1193, с заменой T→G в позиции 1173;
8. COL1A2 1303-1334F:
5' CCCGCCGGTCCCCGGGGTGAAGTGGGTCTTCC 3',
комплементарную нуклеотидам 1303-1334, с заменой T→G в позиции 1317;
9. COL1A2 1674-1701 F:
5' TCCTGGTTCTCGGGGTCTTCCTGGAGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1674-1701, с заменой T→G в позиции 1686.
10. COL1A2 1725-1755 F:
5' CCCTCCTGGTAGTCGGGGTGCAAGTGGCCCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1725-1755, с заменой T→G в позиции 1740;
11. COL1A2 2482-2516F:
5' AGAGATGGTGCTCGGGGTGCTCCTGGTGCTGTAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2482-2516, с заменой T→G в позиции 2496;
12. COL1A2 2601-2631F:
5' CCCTGGTGAACGGGGTGAGGTCGGTCCTGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 2601-2631, с заменой T→G в позиции 2613;
13. COL1A2 2785-2813 F:
5' GGTCCTGCTGGAAGTCGGGGTGATGGAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2785-2813, с заменой T→G в позиции 2802.
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 4 содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 12 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг 4.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No:5 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой T→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
6. COL1A2 1133-1157 F:
5' AGAGAGGACGGGTTGGTGCCCCTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1133-1157, с заменой T→G в позиции 1143;
7. COL1A2 1161-1193 F:
5' AGCTGGTGCCCGGGGCAGTGATGGAAGTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1161-1193, с заменой T→G в позиции 1173;
8. COL1A2 1303-1334F:
5' CCCGCCGGTCCCCGGGGTGAAGTGGGTCTTCC 3',
комплементарную нуклеотидам 1303-1334, с заменой T→G в позиции 1317;
9. COL1A2 1674-1701 F:
5' TCCTGGTTCTCGGGGTCTTCCTGGAGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1674-1701, с заменой T→G в позиции 1686.
10. COL1A2 1725-1755 F:
5' CCCTCCTGGTAGTCGGGGTGCAAGTGGCCCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1725-1755, с заменой T→G в позиции 1740;
11. COL1A2 2482-2516F:
5' AGAGATGGTGCTCGGGGTGCTCCTGGTGCTGTAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2482-2516, с заменой T→G в позиции 2496;
12. COL1A2 2601-2631F:
5' CCCTGGTGAACGGGGTGAGGTCGGTCCTGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 2601-2631, с заменой T→G в позиции 2613;
13. COL1A2 2785-2813 F:
5' GGTCCTGCTGGAAGTCGGGGTGATGGAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2785-2813, с заменой T→G в позиции 2802.
14. COL1A2 2911-2948 F:
5' GGGAAAGAAGGGCTTCGGGGTCCTCGGGGTGACCAAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2911-2948, с заменами T→G в позициях 2928, 2937;
15. COL1A2 3093-3125F:
5' TCTCCCTGGCTCCAGAGGTGAACGTGGTCTACC 3',
комплементарную нуклеотидам 3093-3125, с заменой G→C в позиции 3105;
16. COL1A2 3181-3209F:
5' GGGGCCCGGGGTCCTCCTGGTGCTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 3181-3209, с заменой T→G в позиции 3189;
17. COL1A2 3238-3266F:
5' GAAGCTGGTCGGGATGGCAACCCTGGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 3238-3266, с заменой T→G в позиции 3249.
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 5 содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 16 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3189, 3249, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг 5.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 6 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой T→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
6. COL1A2 1133-1157 F:
5' AGAGAGGACGGGTTGGTGCCCCTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1133-1157, с заменой T→G в позиции 1143;
7. COL1A2 1161-1193 F:
5' AGCTGGTGCCCGGGGCAGTGATGGAAGTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1161-1193, с заменой T→G в позиции 1173;
8. COL1A2 1303-1334F:
5' CCCGCCGGTCCCCGGGGTGAAGTGGGTCTTCC 3',
комплементарную нуклеотидам 1303-1334, с заменой T→G в позиции 1317;
9. COL1A2 1674-1701 F:
5' TCCTGGTTCTCGGGGTCTTCCTGGAGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1674-1701, с заменой T→G в позиции 1686.
10. COL1A2 1725-1755 F:
5' CCCTCCTGGTAGTCGGGGTGCAAGTGGCCCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1725-1755, с заменой T→G в позиции 1740;
11. COL1A2 2482-2516F:
5' AGAGATGGTGCTCGGGGTGCTCCTGGTGCTGTAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2482-2516, с заменой T→G в позиции 2496;
12. COL1A2 2601-2631F:
5' CCCTGGTGAACGGGGTGAGGTCGGTCCTGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 2601-2631, с заменой T→G в позиции 2613;
13. COL1A2 2785-2813 F:
5' GGTCCTGCTGGAAGTCGGGGTGATGGAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2785-2813, с заменой T→G в позиции 2802.
14. COL1A2 2911-2948 F:
5'
GGGAAAGAAGGGCTTCGGGGTCCTCGGGGTGACCAAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2911-2948, с заменами T→G в позициях 2928, 2937;
15. COL1A2 3093-3125F:
5' TCTCCCTGGCTCCAGAGGTGAACGTGGTCTACC 3',
комплементарную нуклеотидам 3093-3125, с заменой G→C в позиции 3105;
16. COL1A2 3181-3209F:
5' GGGGCCCGGGGTCCTCCTGGTGCTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 3181-3209, с заменой T→G в позиции 3189;
17. COL1A2 3238-3266F:
5' GAAGCTGGTCGGGATGGCAACCCTGGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 3238-3266, с заменой T→G в позиции 3249.
18. COL1A2 3099-3130 F:
5' TGGCTCCAGAGGTGAACGGGGTCTACCAGGTG 3',
комплементарную нуклеотидам 3099-3130, с заменами G→C в позиции 3105 и T→G в позиции 3117;
19. COL1A2 3391-3416 F:
5' AAACATGGAAACCGGGGTGAAACTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 3391-3416, с заменой T→G в позиции 3405;
20. COL1A2 3476-3501F:
5' AAGGCATTCGGGGCGATAAGGGAGAG 3',
комплементарную нуклеотидам 3476-3501, с заменой T→G в позиции 3486; и
21. COL1A2 3948-3977F:
5' AGCTCGCACATGCCGGGACTTGAGACTCAG 3',
комплементарную нуклеотидам 3948-3977, с заменой T→G в позиции 3963.
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 6 содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 20 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3117, 3189, 3249, 3405, 3486, 3963, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг 6.
Для получения модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No:7 проводят последовательный ПЦР-мутагенез с праймерами, комплементарными участкам нативной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 1 (вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и вариант pUC 19-COL1A2 SEQ ID No: 1 с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR- кДНК COL7A2-3'NTR-EcoRI), используемой в качестве матрицы:
1. COL1A2 4519-4553F:
5' GGTGCTGACCAGGAGTTCTTTGTGGACATTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 4519-4553F, с заменой A→G в позиции 4536;
2. COL1A2 577-609 F:
5' GGAGATAGAGGACCACGGGGAGAAAGGGGTCCA 3',
комплементарную нуклеотидам 577-609, с заменой T→G в позиции 594;
3. COL1A2 856-881 F:
5' GCAGGTGCTCGGGGTCCAGCTGGCCC 3',
комплементарную нуклеотидам 856-881, с заменой T→G в позиции 867;
4. COL1A2 956-979F:
5' AGGGTGCTCGGGGTTTCCCTGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 956-979F, с заменой T→G в позиции 966;
5. COL1A2 1110-1140 F:
5' AGGAGCCCGGGGGCTTCCTGGTGAGAGAGGA 3',
комплементарную нуклеотидам 1110-1140, с заменой T→G в позиции 1119.
6. COL1A2 1133-1157 F:
5' AGAGAGGACGGGTTGGTGCCCCTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1133-1157, с заменой T→G в позиции 1143;
7. COL1A2 1161-1193 F:
5' AGCTGGTGCCCGGGGCAGTGATGGAAGTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 1161-1193, с заменой T→G в позиции 1173;
8. COL1A2 1303-1334F:
5' CCCGCCGGTCCCCGGGGTGAAGTGGGTCTTCC 3',
комплементарную нуклеотидам 1303-1334, с заменой T→G в позиции 1317;
9. COL1A2 1674-1701 F:
5' TCCTGGTTCTCGGGGTCTTCCTGGAGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1674-1701, с заменой T→G в позиции 1686.
10. COL1A2 1725-1755 F:
5' CCCTCCTGGTAGTCGGGGTGCAAGTGGCCCT 3',
комплементарную нуклеотидам 1725-1755, с заменой T→G в позиции 1740;
11. COL1A2 2482-2516F:
5' AGAGATGGTGCTCGGGGTGCTCCTGGTGCTGTAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2482-2516, с заменой T→G в позиции 2496;
12. COL1A2 2601-2631F:
5' CCCTGGTGAACGGGGTGAGGTCGGTCCTGCT 3',
комплементарную нуклеотидам 2601-2631, с заменой T→G в позиции 2613;
13. COL1A2 2785-2813 F:
5' GGTCCTGCTGGAAGTCGGGGTGATGGAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2785-2813, с заменой T→G в позиции 2802.
14. COL1A2 2911-2948 F:
5'
GGGAAAGAAGGGCTTCGGGGTCCTCGGGGTGACCAAGG 3',
комплементарную нуклеотидам 2911-2948, с заменами T→G в позициях 2928, 2937;
15. COL1A2 3093-3125F:
5' TCTCCCTGGCTCCAGAGGTGAACGTGGTCTACC 3',
комплементарную нуклеотидам 3093-3125, с заменой G→C в позиции 3105;
16. COL1A2 3181-3209F:
5' GGGGCCCGGGGTCCTCCTGGTGCTGTGGG 3',
комплементарную нуклеотидам 3181-3209, с заменой T→G в позиции 3189;
17. COL1A2 3238-3266F:
5' GAAGCTGGTCGGGATGGCAACCCTGGGAA 3',
комплементарную нуклеотидам 3238-3266, с заменой T→G в позиции 3249.
18. COL1A2 3099-3130 F:
5' TGGCTCCAGAGGTGAACGGGGTCTACCAGGTG 3',
комплементарную нуклеотидам 3099-3130, с заменами G→C в позиции 3105 и T→G в позиции 3117;
19. COL1A2 3391-3416 F:
5' AAACATGGAAACCGGGGTGAAACTGG 3',
комплементарную нуклеотидам 3391-3416, с заменой T→G в позиции 3405;
20. COL1A2 3476-3501F:
5' AAGGCATTCGGGGCGATAAGGGAGAG 3',
комплементарную нуклеотидам 3476-3501, с заменой T→G в позиции 3486; и
21. COL1A2 3948-3977F:
5' AGCTCGCACATGCCGGGACTTGAGACTCAG 3',
комплементарную нуклеотидам 3948-3977, с заменой T→G в позиции 3963.
22. а также для удаления 5'-нетранслируемой области гена COL1A2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGG 3' для варианта с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI
23. а также для удаления 3'-нетранслируемой области гена COL1A2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' GGCCCAGTCTGTTTCAAATAAGGGTACCGAGCTCGAATTCACTG G 3' для варианта с ориентацией целевого гена HindIII-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI
24. а также для удаления 5'-нетранслируемой области гена COL1A2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером 5' GAATTCGAGCTCGGTACCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGA 3' для варианта с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII
25. а также для удаления 3'-нетранслируемой области гена COL1A2 из последовательности с внесенными заменами с помощью ПЦР мутагенеза с праймером: 5' TGGCCCAGTCTGTTTCAAATAAGGGGATCCTCTAGAGTCGACC 3' - для варианта с ориентацией целевого гена EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII
Модифицированная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК COL1A2 SEQ ID No: 7, размером 4101 н.п., не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4536, 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 3105; 20 нуклеотидных замены T→G в позициях 594, 867, 966, 1119, 1143, 1173, 1317, 1686, 1740, 2496, 2613, 2802, 2928, 2937, 3117, 3189, 3249, 3405, 3486, 3963, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-2 цепи коллагена I типа и имеет первичную структуру, приведенную на фиг 7.
Таким образом, получают линейку из 7 векторов на базе плазмиды pUC19, в которой клонированы кодирующие нативная и модифицированные нуклеотидные последовательности гена COL1A2 (при этом каждый вектор из линейки получен в двух вариантах и содержит целевой ген с ориентацией EcoRI-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTRHindIII и целевой ген с ориентацией HindIII-5'NTR- кДНК COL1A2-3'NTR-EcoRI для создания генетических экспрессионных конструкций на базе разных векторов) для создания линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Пример 3.
Создание генетических конструкций с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A2 для получения на их базе биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Для экспрессии кДНК гена COL1A2 в клетках органов и тканей человека полученные варианты кДНК COL1A2 по Примеру 1 и Примеру 2 помещают в векторную плазмиду, при выборе которой используют следующие критерии выбора:
1) плазмида должна обязательно реплицироваться в E.coli, желательно с высокой копийностью;
2) в плазмиде должен быть бактериальный фактор селекции;
3) в векторе должно быть наличие эукариотических регуляторных элементов - обязательных промотора и терминатора (сигнала полиаденилирования), например, энхансер и интронный(е) элемент(ы);
4) наличие удобного полилинкера для клонирования. Примером такой плазмиды может быть pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo (OriGene, USA) или pCDNA 3.1 (+) (ThermoFisherScientific, USA).
При клонировании кДНК гена COL1A2 в pCDNA 3.1 (+) кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину, и эукариотическим фактором селекции - геном устойчивости к неомицину. При клонировании учитывают последовательность расположения сайтов HindIII и EcoRI в полилинкере pCDNA 3.1 (+) и поэтому для клонирования в данный вектор используют HindIII-5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-Eco RI ориентированный фрагмент в pUC19 по примеру 1.
При клонировании кДНК гена COL1A2 в pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo кодирующая нуклеотидная последовательность помещается под контроль промотора цитомегаловируса человека CMV, эффективного в эукариотических клетках, и сигнала полиаденилирования гена гормона роста человека. Также данная плазмида обладает бактериальным фактором селекции - геном устойчивости к ампициллину. При клонировании учитывают последовательность расположения сайтов EcoRI и HindIII в полилинкере pCMV6-XL5 (pCMV6-Kan/Neo) и поэтому для клонирования в данный вектор используют Eco RI -5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR-HindIII ориентированный фрагмент в pUC19 по примеру 1.
Векторные плазмиды pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 1 с частичной нативной (немодифицированной) последовательностью гена COL1A2 (с 429 по 4782 н.п.), pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 2, pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 3, pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 4, pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 5, pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 6, с частичной модифицированной путем замены оснований нуклеотидной последовательностью гена COL1A2 (с 429 по 4782 н.п.) и pUC19- COL1A2 SEQ ID No: 7 с модифицированной кДНК гена COL1A2 и лишенной нетранслируемыех 5' и 3' областей данного гена, а также векторные плазмиды pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1 (+) для дальнейшей экспрессии гена COL1A2 в эукариотических клетках, гидролизуют рестриктазами EcoRI и HindIII(NEB, USA) при 37°С в соответствующем буфере (Маниатис Т., и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).
Продукты рестрикции разделяют с помощью электрофореза в геле 1% агарозы, окрашивают раствором бромистого этидия и фрагменты ДНК, соответствующие гену-вставке Hindill-5'NTR-кДНК COL7/42-3'NTR-EcoRI, либо Eco RI -5'NTR-кДНК COL1A2-3'NTR- HindIII и линеаризованной плазмиде pCMV6-XL5 и pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1(+), вырезают, выделяют из геля с помощью набора для выделения из геля QIAquickGelExtractionKit из примера 1 и смешивают. Полученную смесь рестрикционных фрагментов лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем - при 12°С в течение 10 ч. Лигированную ДНК используют для трансформации клеток Е.coli по стандартной методике с использованием хлористого кальция. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл). Плазмидную ДНК из ампициллин-устойчивых колоний выделяют с помощью набора для выделения плазмид QiagenSpinMiniprepKit, анализируют с помощью гидролиза рестриктазами тEcoRI и HindIII и отбирают генетическую(ие) конструкцию(ии), содержащую(ие) в своем составе кодирующую последовательность гена COL1A2 под контролем промотора цитомегаловируса CMV, и сигналом полиаденилирования гена гормона роста, обозначаемую как pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: (1-7) или pCMV6-Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: (1-7) или pCDNA 3.1 COL1A2 SEQ ID No: (1-7). Наличие вставки кДНК гена COL1A2, ее последовательность и ориентацию также подтверждают с помощью секвенирования ДНК генетических конструкций по методу Сэнгера.
Бактерии, содержащие полученные генетические конструкции на базе векторов pCMV6-XL5, pCMV6-Kan/Neo и pCDNA 3.1(+), выращивают на жидкой среде LB с ампициллином, лизируют и выделяют плазмидную ДНК для трансфекции специальным набором для выделения плазмид QiagenMaxiKit для получения соответствующих биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Полученные генетические экспрессионные конструкции используют для получения на их базе биологически активных генно-терапевтических субстанций, которые в дальнейшем применяют для трансфекции эукариотических клеток органов и тканей и/или введения в органы и ткани человека. В качестве контрольных плазмид используют исходный вектор pCMV6 - XL5, (pCMV6-Kan/Neo) или pCDNA 3.1(+) без вставки кДНК гена COL1A2.
Пример 4.
Наращивание генетической конструкции в бактериальной культуре.
Для получения препаративных количеств векторной плазмиды, содержащей один из вариантов кДНК гена COL1A2, полученными конструкциями по примеру 3 трансформируют бактериальные клетки E.coli (Маниатис Т., и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984) и выращивают полученные клоны бактерий, содержащие конструкцию, в присутствии бактериального фактора селекции - устойчивости к ампициллину.
Лигазную смесь по примеру 3 используют для трансформации компетентных клеток E.coli штамма XLblue. Предварительный отбор клонов, содержащих вставку кДНК гена COL1A2 в правильной ориентации и единичной копии, осуществляют путем гидролиза плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII и анализа продуктов рестрикции путем электрофореза в 1.2% агарозном геле. Отобранные клоны используют для препаративного наращивания плазмидной ДНК с целью дальнейшей трансфекции в культуры фибробластов (хондробластов, кератоцитов и др.).
Для получения препаративных количеств генетических экспрессионных конструкций по Примеру 3 выращивали 20 мл ночной культуры E.coli в LB-среде с 150 мкг/мл ампициллина. Этой культурой инокулировали 500 мл LB-среды с 100 мкг/мл ампициллина, рост осуществляли в шейкере-инкубаторе в течение 16 часов при 37°С и 200 об/мин. Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью набора EndoFreePlasmidMaxiKit (Qiagen, Germany). Выход составил 350 мкг ДНК.
Пример 5.
Культивирование эукариотических клеток, например, фибробластов для последующих трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией и анализа экспрессии гена COL1A2.
Для последующей трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей один из вариантов кДНК COL1A2 по примеру 3, выращивают первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов.
Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL) берут образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, например за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 3 мм, массой - до 20 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Выращивание первичной культуры клеток осуществляют на чашках Петри при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Трипсинизацию и пересев производят каждые 5 дней, для трипсинизации клетки промывали раствором PBS и инкубировали 30 минут при 37°С в растворе, содержащем 0.05% трипсина и 1 мМ ЭДТА. Для нейтрализации трипсина к клеткам добавляли 5 мл культуральной среды и центрифугировали суспензию при 600 об/мин 5 минут. Рост культуры фибробластов после 4-5 пассажей осуществляли в культуральных флаконах емкостью 75 мл в среде, содержащей 10 г/л DMEM, 3.7 г/л Na2CO3, 2.4 г/л HEPES, 10% фетальной сыворотки и 100 Ед/мл ампициллина. Смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 106 клеток.
Часть культуры фибробластов, предназначенную для выделения РНК с последующим анализом транскрипции гена COL1A2, центрифугировали при 1000 об/мин 20 минут и дважды отмывали в буферном растворе PBS центрифугированием при 600 об/мин в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в 1.5 мл стабилизирующего реагента RNAlater и хранили при 4°С в течение 10 дней для последующего выделения РНК.
Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit. (Qiagen, Germany). Выделенную РНК анализировали спектрофотометрически, измеряя соотношение оптической плотности при 260 и 280 нм, а также с помощью капиллярного электрофореза на приборе QIAxcel (Qiagen, Germany), используя картридж RNA Qiality Control. Для дальнейшей работы использовали только те образцы, для которых общее количество выделенной РНК было не менее 50 мкг РНК, соотношение D260 : D280 - не менее 1,8, а соотношение полос 28S : 18S на капиллярном электрофорезе - не ниже 1:1.
Синтез суммарной кДНК первой цепи проводили, используя обратную транскриптазу RevertAid (Thermo Scientific, USA), согласно рекомендациям изготовителя. 1-2 мкг суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК. В реакционную смесь для проведения обратной транскрипции вносили 100-200 ед. обратной транскриптазы и 10 пМ случайного 9-нуклеотидного праймера.
Пример 6.
Анализ эндогенной экспрессии гена COL1A2 в культуре первичных фибробластов.
Анализ экспрессии транскрипции гена COL1A2 из генома фибробластов проводят с целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции этих клеток генетическими конструкциями с кДНК гена COL1A2.
Для анализа используют клеточные линии фибробластов кожи, фибробласты с низкой экспрессией гена COL1A2 и фибробласты с нормальной экспрессией гена COL1A2, из которых выделяют РНК по стандартной методике (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).
Выделенную РНК анализируют методом ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК (3354-3533 н.п.), специфичной для гена COL1A2, используют прямой праймер COL1A2FA1 5' GCGGTGGTGGTTATGACTTTGG 3'
и обратный праймер COL1A2-RA1 5' GGCATGTGCGAGCTGGGTTC 3'
Длина продукта амплификации - 180 нуклеотидов. В качестве референтного гена используют ген бета-2-микроглобулина В2М, уровень экспрессии которого в фибробластах сопоставим с таковым в норме для гена COL1A2.
ПЦР-амплификацию проводят с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, USA) или другого набора для ПЦР в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого прймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляют на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 50°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин., затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 с, отжиг праймеров 55,9°С - 30 с и элонгацию 72°С - 30 с.
В качестве положительного контроля используют концентрацию ампликонов, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL1A2 и В2М. В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду (кривые накопления ПЦР продуктов отрицательного и положительных контролей для упрощения визуализации на фигуре 8 не показаны). Количество ПЦР продуктов - кДНК генов COL1A2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивают в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
По итогам анализа экспрессии, гена COL1A2 в разных культурах фибробластов (с низкой экспрессией гена COL1A2 и с нормальной экспрессией гена COL1A2) были отобраны клоны от пациентов одного возраста и одного типа старения, в которых количество ПЦР-продукта, соответствующего кДНК гена COL1A2, была в 10-20 раз ниже таковой кДНК гена В2М. Кривые накопления специфических ПЦР-продуктов приведены на фигуре 8.
Пример 7.
Трансфекция клеточной культуры фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A2 биологически активной генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A2 в культуре данных клеток.
Для оценки эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей немодифицированную кДНК гена COL1A2 по примеру 3, этой биологически активной генно-терапевтической субстанцией трансфицируют первичную культуру фибробластов человека со сниженной экспрессией гена COL1A2, отобранную по примеру 6.
Данную культуру фибробластов выращивают в культуральных флаконах (25 см2) до момента, когда клетки покрывают 50-70% поверхности флакона. Полученные клетки трансфицируют биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 1 в присутствии транспортной молекулы (например, дендримера) и вектором pCMV6-XL5 в качестве контроля.
6-луночный планшет с DMEM-средой с 10% фетальной телячьей сывороткой (1.6 мл в лунке) засевали фибробластами из расчета 1-4×105 клеток на лунку. Инкубировали клетки в течение 18 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Затем 2 мкг плазмидной ДНК растворяли в среде DMEM без сыворотки с буфером Трис-HCl 20 мМ с 1 мМ ЭДТА, рН 7-8 (минимальная концентрация ДНК - 0.1 мкг/мкл). Конечный объем смеси составлял 100 мкл.
В качестве транспортной молекулы использовали раствор дендримера SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия).
Приготовление комплекса ДНК-дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями: к 15 мкл раствора дендримера (с концентрацией 3 мкг/мкл) добавляли 5 мкл (с концентрацией 0,5 мкг/мкл) раствора плазмидной ДНК и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с дендримером в течение 5-10 минут при температуре 15-25°С.
Из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-дендример, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2, после чего оценивали уровень кДНК гена COL1A2 и контрольной кДНК гена В2М с помощью амплификации в режиме реального времени как описано в примере 6. Результаты анализа приведены на фигуре 9.
Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена COL1A2 уровень кДНК гена COL1A2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК COL1A2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A2 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена COL1A2 в нормальных фибробластах).
Показано, что в клетках трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6-COL1A2 SEQ ID No: 1 наблюдается усиление экспрессии целевого гена COL1A2.
Пример 8.
Трансфекция клеточной культуры фибробластов с нормальной экспрессией гена COL1A2 биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 с целью подтверждения увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культуре данных клеток.
Для оценки изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа использовали культуру фибробластов кожи человека по Примеру 5, в качестве транспортной молекулы - дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве трансфицируемых агентов - биологически активную генно-терапевтическую субстанцию на основе векторной плазмиды pCDNA 3.1(+), содержащую кДНК гена COL1A2 - pCDNA 3.1 COL1A2 SEQ ID No: 1(A), векторную плазмиду pCDNA 3.1(+), не содержащую кДНК гена COL1A2 (В), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без плазпрмидной ДНК (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию фибробластов проводили согласно Примеру 7.
После трансфекции клетки снимали раствором Версена. Для гомогенизации использовали смесь 100 мг клеток в 1 мл буфера PBS1×, которую подвергали двум этапам заморозки (-20°С на ночь) и разморозки в водяной бане (+37°С). После этого клеточный лизат центрифугировали 5 минут при 5000×g (+4°С).
Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение продукта кДНК гена COL1A2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США.
В наборе использованы высоко специфичные антитела к белка альфа-2 цепи коллагена I типа, адсорбированные на лунках микропланшета. При первой инкубации добавляли по 100 мкл каждого образца и калибраторов в соответствующие лунки, закрывали лунки клейкой пленкой и инкубировали 2 часа при 37°С. (Калибратор готовят следующим образом: прибавляют 1 мл Буфера для разведения образцов к лиофилизированному стандартному образцу, затем делают 2-кратные разведение стандартного образца). Исследование калибраторов и образцов клеточного лизата проводили в трех повторностях. После инкубации жидкость из лунок удаляли. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл связаннных с биотином анитител, закрывали лунки чистой клейкой пленкой и инкубировали 1 час при 37°С. Снимали пленку со стрипов и отбирали всю жидкость, после чего вносили по 200 мкл Промывочного раствора в каждую лунку, через 2 минуты удаляли жидкость. Повторяли промывку 3 раза.
Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора фермента Пероксидазы хрена, связанным с авидином, заклеивали планшет чистой пленкой и инкубировали 1 час при 37°С. А затем отбирали жидкость и повторяли промывку 5 раз как описано выше.
Затем в лунки добавили 90 мкл хромогенного субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) и инкубировали плашку 20 минут при 37°С в темноте. После добавляли 50 мкл стоп-реагента (1N H2SO4), тщательно перемешали. Оптическая плотность измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка COL1A2 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка COL1A2, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.
Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Таким образом показано, что трансфекция фибробластов полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, несущей кДНК гена COL1A2, приводит к увеличению количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках фибробластов.
Пример 9.
Введение в кожу человека клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A2 с целью подтверждения увеличения после этого количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптате кожи человека.
С целью анализа изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в тканях человека пациентам в кожу предплечья вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированных (А), трансфицированных вектором без вставки, например, pCMV6-XL5 (В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7(C) в комбинации с транспортными молекулами - липосомами TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA),
Приготовление суспензии липосом проводили по методике производителя (Promega, TransFast Transfection Reagent, Instruction for Use of Product, E2431) с некоторыми изменениями: к 0,4 мг порошка липосом добавляли 0,4 мл стерильной воды степени очистки Nuclease-Free. Суспензию хорошо перемешивали взбалтыванием. Полученный полупродукт суспензии липосом выдерживали в течение 18 часов при температуре - 20°С, затем оттаивали при комнатной температуре, ресуспендировали встряхиванием или на настольном миксере типа «ВОРТЕКС».
Для приготовления комплекса ДНК-липосомы к 400 мкл раствора липосом (с концентрацией 1 мг/мл) добавляли 400 мкл раствора плазмидной ДНК (с концентрацией 150 мкг/мл) и тщательно перемешивали. Затем инкубировали смесь ДНК с липосомами в течение 5-10 минут при температуре 15-25°С и использовали далее в качестве биологически активной генно-терапевтической субстанции.
Для последующей трансфекции клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией выращивали первичные культуры фибробластов человека из биоптатов кожи пациентов по примеру 5.
Для трансфекции из лунок планшета с клеточной культурой осторожно отбирали среду (не нарушая клеточного слоя) и промывали клетки 3 мл буфера PBS. К раствору, содержащему комплексы ДНК-липосимы, добавляли 600 мкл среды DMEM с фетальной сывороткой и переносили эту смесь в лунки планшета с клетками. Клетки инкубировали с комплексами 2-3 часа при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Затем осторожно удаляли среду и промывали клеточный слой 3 мл буфера PBS. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2.
Часть клеточной культуры центрифугировали при 700 об/мин, дважды отмывали клетки физиологическим раствором, ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1 млн клеток в 200 мкл и использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Очаги введения культур фибробластов располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Определение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения суспензии фибробластов. Взятие биопсии осуществляли из участков введения суспензии фибробластов, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (MedaxSRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Как видно из фигуры 11, в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- COL1A2 SEQ ID No: 7, произошло увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа, что может свидетельствовать об усилении экспрессии гена COL1A2. Тогда как при введении контрольных культур фибробластов (нетрансфицированных и трансфицированных вектором без вставки кДНК гена COL1A2 pCMV6-XL5) количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже не изменялась.
Таким образом показана эффективность биологически активной генно-терапевтической субстанции, несущей модифицированную кДНК гена COL1A2: трансфекция фибробластов полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией несущей модифицированную кДНК гена COL1A2, приводит к повышению количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках фибробластов.
Пример 10.
Трансфекция культур фибробластов из биоптатов группы различных пациентов биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК COL1A2.
С целью подтверждения индивидуального характера увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа до различного уровня при трансфекции клеточных культур фибробластов пациентов биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A2 анализировали количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточных лизатах фибробластов, трансфицированных разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями по примеру 3, содержащими модифицированные и нативную кДНК COL1A2 в группе пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2.
Последовательность нативной кДНК COL1A2 приведена на фигуре 1, SEQ ID No: 1., последовательности модифицированных кДНК COL1A2 приведены на фигурах 2-7 (SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7).
Вырастили культуры фибробластов из однотипных биоптатов кожи, отобранных из зоны внутренней боковой поверхности в зоне локтевого сустава 28 пациентов, выбранных случайным образом по примеру 5, отобрали аликвоты и оценили уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточных лизатах. Клеточный осадок, соответствующий 2×106 клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин, концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорда ([Bradford М.М. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254.]).
Затем каждую из 29-ти культур фибробластов разделили на 8 частей. Одну часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 1, содержащей немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 1) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 2, содержащей вариант 1 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 2) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 3-ю часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 3, содержащей вариант 2 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 3) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 4-ю часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 4, содержащей вариант 3 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 4) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 5-ю часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 5, содержащей 4 вариант модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 5) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 6-ю часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 6, содержащей вариант 5 модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 6) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 7-ю часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 7, содержащей вариант 6 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 7) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 8-ю часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК COL1A2 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Определение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
По итогам определения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции немодифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 3 культуры из 28.
В группе 2 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции 1 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 4 культуры из 28.
В группе 3 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции 2 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 5 культур из 28.
В группе 4 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа наблюдалось при трансфекции 3 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 6 культур из 28.
В группе 5 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции 4 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 5 культур из 28.
В группе 6 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции 5 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 2 культуры из 28.
В группе 7 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при трансфекции 6 вариантом модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 3 культуры из 28.
Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что при трансфекции вектором, не содержащим кДНК гена COL1A2 количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа присутствует в максимальных количествах.
На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентраций белка альфа-2 цепи коллагена I типа (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2.
Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.
Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций в рамках линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Пример 11.
Трансфекции клеточной культуры кератоцитов и эпителиальных клеток глаза биологически активной генно-терапевтическойсубстанцией без транспортной молекулы с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена COL1A2 в данных культурах клеток.
С целью выяснения эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей кДНК COL1A2, в различных типах клеток, трансфицировали кератоциты и эпителиальные клетки роговицы человека, без использования транспортных молекул.
Биопсийный материал из области лимба в виде круга диаметром 1-1.5 мм помещали в чашку Петри в сбалансированный солевой раствор Хэнкса, добавляли диспазу (20 мкл 25 ед/мл) и гентамицин и инкубировали 24 часа при +4. Затем отделяли эпителиальный слой от стромы и нарезали обе ткани кусочками 1-2 мм3.
Суспензию эпителиальных клеток получали путем инкубирования кусочков тканей в растворе Трипсин-ЭДТА в течение 15 минут при +37°С. Трипсинизацию останавливали добавлением соевого ингибитора трипсина в PBS. Клеточные суспензии отмывали центрифугированием при 700 об/мин и ресуспендировали в бессывороточной среде DMEM с гентамицином. Клетки растили в 25 см2 флаконах с 5 мл среды при 37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Через 24 часа среду с не прикрепившимися клетками удаляли и добавляли 5 мл свежей среды. Пересев производили каждые 7 дней в соотношении 1:2-1:3.
Суспензию кератоцитов получали путем инкубирования в среде RPMI-1640 с коллагеназой 300 ед/мл в течение 2 часов. Затем отмывали клетки и ресуспендировали в среде DMEM с 20% телячьей сывороткой и антибиотиком-антимикотиком. Клетки растили в 25 см2 флаконах с 1 мл среды при +37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Пересев производили каждые 7 дней в соотношении 1:4.
Поскольку эффективность трансфекции кератоцитов низкая, использовали биологически активную генно-терапевтическую субстанцию на основе плазмиды pCMV6-Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 2, содержащую дополнительный фактор селекции - ген neor, придающий устойчивость к антибиотику генетицину.
Биологически активную генно-терапевтическую субстанцию добавляли к клеткам и инкубировали клетки 1 час при 37°С. После инкубации добавляли бессывороточную среду DMEM к эпителиальным клеткам и среду DMEM, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки к кератоцитам и продолжали инкубировать 24 часа. После 24-часового инкубирования клетки высевали в новую среду DMEM, содержащую 400 μg/mL фактора селекции - антибиотика G418 (Geneticin). Выжившие клетки культивировали в течение 2 недель в 25 см3 флаконах с 5 мл среды с G418. Всего выращивали 24 образца культур эпителиальных клеток и 24 образца культур кератоцитов.
Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК проводили с помощью набора RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК гена COL1A2 проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-RadUSA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение экспрессии (транскрипции) гена COL1A2 наблюдали на 3 сутки для эпителиальных клеток и на 5 сутки - для кератоцитов.
На фигуре 13 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена COL1A2, в кератоцитах и эпителиальных клетках роговицы.
Показано, что в кератоцитах и эпителиальных клетках роговицы человека, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 2, без транспортной молекулы, наблюдается усиление экспрессии целевого гена COL1A2
Пример 12.
Трансфекции клеточной культуры хондробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с целью подтверждения при этом увеличения экспрессии гена COL1A2 в данных культуре клеток.
С целью выяснения эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции, содержащей кДНК гена COL1A2, в различных типах клеток, а также с целью оценки влияния транспортной молекулы на успешность трансфекции этой субстанцией - трансфицировали хондробласты человека, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры.
Биоптаты хрящевой ткани массой 50-150 мг измельчали на фрагменты до 10 мм3 и инкубировали в буферном растворе с коллагеназой II, гиалуронидазой и трипсином в течение 48 часов при +37°С. Клетки отмывали бессывороточной средой DMEM, ресуспендировали в той же среде с гентамицином и выращивали при +37°С и в атмосфере, содержащей 5% CO2 во флаконах 75 см2 с 15 мл среды. Рост осуществлялся в бессыворотчной среде, так как в монослойной культуре хондроциты меняют форму и биохимические свойства. Пересев производили каждые 4 дня в соотношении 1:3, клетки снимали с поверхности флакона раствором трипсин-ЭДТА с 0.02% раствором Версена.
Для трансфекции клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена COL1A2 использовали амфифильные блок-сополимеры. Применяли методику по (IntJPharm, 2012, 427, 80-87) или в (Macromol. Biosci. 2011, 11, 652-661), с некоторыми изменениями. Блок-сополимер синтезировали из смеси линейного полиэтиленимина (ПЭИ) (Polyscience Inc., США) и бифункционального полиэтиленгликоля (ПЭГ) N-гидроксисукцинимидил-75-N-(3-малеимидопропионил)-амидо-4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73 - тетракосаоксапента-гептаконтаноата (MAL-dPEG™-NHS ester, Quanta BioDesign, Ltd., США) в боратном буфере. Полиплекс готовили за 1 час до введения в клетки, смешивая раствор блок-сополимера с ДНК генетической конструкции pCMV6- Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 3 с модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 3. Смесь для трансфекции добавляли к суспензии клеток в 1 мл культуральной среды DMEM с 10% фетальной сывороткой и ампициллином.
Так как для трансфекции использовали конструкцию, содержащую фактор селекции (устойчивость к генетицину), то клетки после трансфекции выращивали в 25 см3 флаконах с 5 мл среды с генетицином в течение 12 дней, меняя среду каждые 4 дня. Каждые 24 часа из каждой культуры отбирали аликвоту по 500 мкл суспензии с целью выделения РНК и анализа уровня специфической кДНК. Выделение РНК производили с помощью набора RNeasyMiniKit (Qiagen, Germany). Образцы РНК были сгруппированы в 3 группы по 8 образцов с близкой концентрацией и объединены. Анализ уровня специфической кДНК COL1A2 проводили с помощью амплификации в режиме реального времени по методике и с праймерами по примеру 6, используя набор реагентов iTaqUniversalSYBRGreenSupermix (Bio-Rad, USA), амплификатор CFX96 (Bio-Rad, USA) и программное обеспечение Bio-RadCFXManager 2.1. Максимальное увеличение транскрипции COL1A2 наблюдали на 5 сутки. На фигуре 14 приведены кривые накопления специфического продукта амплификации, соответствующего кДНК гена COL1A2.
Показано, что в хондробластах трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на основе pCMV6- Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 3, используя в качестве транспортной молекулы амфифильные блок-сополимеры, наблюдается усиление экспрессии целевого гена COL1A2.
Пример 13.
Введение в кожу человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2 с целью подтверждения при этом увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже человека.
С целью анализа изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) -в кожу предплечья.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) по примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: 4, которая содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 4), и плазмиду pCMV6-XL5, используемую в качестве плацебо - которая не содержит кДНК гена COL1A2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.
Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,3 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в лизатах биоптатов кожи пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США),как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL) далее как описано в примере 9.
Показано, что в коже пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2, произошло увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа, тогда как при введении плацебо, количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в коже не изменялась, что говорит об усилении экспрессии гена COL1A2 при использовании биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2. Результаты отражены на фигуре 15.
Пример 14.
Введение в хрящевую ткань человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2 с целью подтверждения при этом увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани человека.
С целью анализа изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань ушных раковин с тыльной стороны.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANSFAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) no примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCDNA 3.1 COL1A2 SEQ ID No: 5, которая содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 5), и плазмиду pCDNA 3.1(+), используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена COL1A2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.
Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 1-2 мм в хрящевую ткань ушных раковин с тыльной стороны. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,2 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 2 -3 см друг от друга.
Количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в лизатах биоптатов хрящевой ткани пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков хрящевой ткани в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков и в зоне введения плацебо, методом чрескожной пункционного биопсии при помощи одноразовой ручной биопсийной иглы, далее по примеру 9.
Показано, что в хрящевой ткани пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2, произошло увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа, тогда как при введении плацебо количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани не изменялось, что подтверждает усиление экспрессии гена COL1A2 при использовании биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2. Результаты отражены на фигуре 16.
Пример 15.
Введение в мышечную ткань человека биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2 с целью подтверждения при этом увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в мышечной ткани человека.
С целью анализа изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа пациентам вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена COL1A2 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань икроножной мышцы.
В качестве транспортной молекулы использовали порошок липосом TRANS FAST ТМ Transfection Reagent (PROMEGA, USA) no примеру 9. Далее генетическую конструкцию pCMV6-Kan/Neo COL1A2 SEQ ID No: 6, которая содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 6), и плазмиду pCMV6-Kan/Neo, используемую в качестве плацебо, которая не содержит кДНК гена COL1A2, каждую из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free.
Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-липосомы по примеру 9.
Полученные биологически активную генно-терапевтическую субстанцию и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 15-20 мм. Объем вводимого раствора биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо - около 0,5 мл для каждого. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 5-7 см друг от друга.
Количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в лизатах биоптатов мышечной ткани пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани в зоне введения биологически активной генно-терапевтической субстанции, а также из интактных участков мышцы и в зоне введения плацебо, используя автоматическое устройство для взятия биопсии MAGNUM (компания BARD, USA), далее по примеру 9.
Показано, что, в мышечной ткани пациента в области введения биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2, произошло увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа, тогда как при введении плацебо количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в мышечной ткани не изменялась, что подтверждает усиление экспрессии гена COL1A2 при использовании биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена COL1A2. Результаты отражены на фигуре 17.
Пример 16.
Введение группе различных пациентов биологически активных генно-терапевтическиих субстанций содержащих модифицированные и нативную кДНК COL1A2.
С целью подтверждения индивидуального характера увеличения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа до различного уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A2 анализировали количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптатов кожи группы пациентов в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2.
Последовательность нативной кДНК COL1A2 приведена на фигуре 1, SEQ COL1A2 ID No: 1., последовательности модифицированных кДНК COL1A2 приведены на фигурах 2-7 (COL1A2 SEQ ID No: 2, COL1A2 SEQ ID No: 3, COL1A2 SEQ ID No: 4, COL1A2 SEQ ID No: 5, COL1A2 SEQ ID No: 6, COL1A2 SEQ ID No: 7).
При этом генетические конструкции, одна из которых содержит нативную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 1), вторая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 2), третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 3), четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 4)), пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 5), шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 6), седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 7), восьмая генетическая конструкция (плацебо), представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-дендример по примеру 7.
Полученные семь вариантов биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения в кожу пациентам. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Каждому из 24-х пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.
Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи, используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
А - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 1, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 1) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
В - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 2, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 2) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
С - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 3, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 3) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
D - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 4, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 4) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Е - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 5, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 5) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
F - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 6, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 6) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
G - биоптат, полученный после введения биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6- SEQ ID No: 7, содержащий немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 7) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Н - биоптат, полученный после введения векторной плазмиды pCMV6-XL5, не содержащая кДНК гена COL1A2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа оценивали в девяти биоптатах кожи от каждого пациента (от А до Н и в биоптате интактной кожи) через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
По итогам количественного анализа белка альфа-2 цепи коллагена I типа выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:
В группе 1 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении немодифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 3 биоптата из 24.
В группе 2 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 1 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 2 биоптата из 24.
В группе 3 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 2 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 3 биоптата из 24.
В группе 4 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 3 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 4 биоптата из 24.
В группе 5 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 4 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 3 биоптата из 24.
В группе 6 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 5 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошли 3 биоптата из 24.
В группе 7 максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, наблюдалось при введении 6 варианта модифицированной кДНК COL1A2. В эту группу вошло 6 биоптатов из 24.
Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что при введении плацебо - векторной плазмиды, не содержащей кДНК гена COL1A2 количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, присутствует в максимальных количествах.
На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2.
Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.
Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование биоптатов пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов на предмет максимальной эффективности терапевтического воздействия, созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций в рамках линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций.
Пример 17.
Трансфекция клеточной линии фибробластов пациента разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК COL1A2 с целью персонализированного выбора из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующей трансфекции этой субстанцией клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК COL1A2.
Последовательность нативной кДНК COL1A2 приведена на фигуре 1, SEQ ID No: 1., последовательности модифицированных кДНК COL1A2 приведены на фигурах 2-7 (SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7).
Вырастили культуры фибробластов из биоптата пациента по примеру 5, отобрали аликвоты и провели клеточный лизис: клеточный осадок, соответствующий 2×106 клеток, промывали фосфатным буфером и ресуспендировали во льду в лизирующем буфере, содержащем 25 мМ ХЕПЕС рН 7.9, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 10% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид. Лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин.
Затем культуру фибробластов пациента разделили на 8 частей. Одну часть, обозначенную (А), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 1, содержащей немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 1) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. Вторую часть, обозначенную (В), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 2, содержащей вариант 1 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 2) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 3-ю часть, обозначенную (С), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 3, содержащей вариант 2 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 3) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами попримеру 9. 4-ю часть, обозначенную (D), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 4, содержащей вариант 3 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 4) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 5-ю часть, обозначенную (Е), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 5, содержащей 4 вариант модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 5) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 6-ю часть, обозначенную (F), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 6, содержащей вариант 5 модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 6) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 7-ю часть, обозначенную (G), трансфицировали по примеру 7 биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCMV6- SEQ ID No: 7, содержащей вариант 6 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 7) по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9. 8-ю часть, обозначенную (Н), трансфицировали по примеру 7 векторной плазмидой pCMV6-XL5, не содержащей кДНК COL1A2 по примеру 3 в сочетании с транспортными молекулами - липосомами по примеру 9.
Определение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клеточных лизатах фибробластов пациента проводили через 72 часа после трансфекции методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
По итогам определения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой наблюдается максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате клеточной культуры и соответственно наблюдается максимальная экспрессия гена COL1A2. В данном эксперименте максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате отмечено при трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: 5, содержащей модифицированную кДНК COL1A2, что показано на фигуре 19.
Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.
Пример 18.
Введение в кожу пациента различных биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена COL1A2 с персонализированного целью выбора из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции применительно к данному пациенту для последующего введения этой субстанции пациенту в рамках терапевтической процедуры.
С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, содержащих нативную или модифицированные кДНК гена COL1A2.
Последовательность нативной кДНК COL1A2 приведена на фигуре 1, SEQ ID No: 1., последовательности модифицированных кДНК COL1A2 приведены на фигурах 2-7 (SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7)
Пациенту вводили 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо в кожу предплечья.
Первая биологически активная генно-терапевтическоая субстанция(А) на базе pCMV6- SEQ ID No: 1, содержащая немодифицированную кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 1) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
Вторая биологически активная генно-терапевтическая субстанция (В) на базе pCMV6- SEQ ID No: 2, содержащая вариант 1 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 2) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
3-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (C) на базе pCMV6- SEQ ID No: 3, содержащая вариант 2 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 3) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
4-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (D) на базе pCMV6- SEQ ID No: 4, содержащая вариант 3 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 4) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
5-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (Е) на базе pCMV6- SEQ ID No: 5, содержащая 4 вариант модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 5) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
6-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (F) на базе pCMV6- SEQ ID No: 6, содержащая вариант 5 модифицированной кДНК COL1A2 SEQ ID No: 6) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
7-я биологически активная генно-терапевтическая субстанция (G) на базе pCMV6- SEQ ID No: 7, содержащая вариант 6 модифицированной кДНК COL1A2 (SEQ ID No: 7) по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
8-я - векторная плазмида pCMV6-XL5, не содержащая кДНК COL1A2 по примеру 3 в сочетании с транспортной молекулой - дендримером по примеру 7.
При этом генетические конструкции, одна из которых содержит нативную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 1), вторая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 2), третья генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 3), четвертая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 4), пятая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 5), шестая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 6), седьмая генетическая конструкция содержит модифицированную кДНК гена COL1A2 (SEQ ID No: 7), восьмая плазмида (плацебо), представляет собой вектор pCMV6 XL5, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения биологически активных генно-терапевтических субстанций готовили комплексы ДНК-дендример по примеру 7.
Полученные семь вариантов биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции составлял около 0,3 мл. Очаги введения биологически активных генно-терапевтических субстанций и плацебо располагались на расстоянии 3-5 см друг от друга.
Биопсийные образцы брали через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций. Взятие биопсии осуществляли из участков введения биологически активных генно-терапевтических субстанций, плацебо, а также из интактной кожи используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL). Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца был около 3 мм, масса - до 20 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Определение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа определяли в девяти биоптатах кожи пациента через 72 часа после введения биологически активных генно-терапевтических субстанций методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Hum Human collagen alpha-2(I) chian (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), an collagen, type I, alpha 1 (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США), как описано в Примере 8.
По итогам определения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при введении которой в кожу наблюдается максимальное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в лизате биоптата кожи и соответственно наблюдается максимальная экспрессия гена COL1A2. В данном эксперименте максимальное количество целевого белка в лизате биоптата кожи отмечено при введении биологически активной генно-терапевтической субстанции на базе pCMV6 COL1A2 SEQ ID No: 2, содержащей модифицированную кДНК COL1A2, что показано на фигуре 20.
Таким образом выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для ее последующего введения пациенту в рамках терапевтической процедуры.
Создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, вследствие недостаточной экспрессии гена COL1A2, способ ее получения и использования.
Созданная линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций с использованием одной из модифицированных или нативной кДНК гена COL1A2 позволяет на практике использовать входящие в линейку биологически активные генно-терапевтические субстанции для повышения до необходимого уровня количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в различных клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека.
В результате проведения предварительных исследований биоптата пациента, либо клеток, выращенных из этих биоптатов, определяют, какой вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции из созданной линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций необходимо выбрать для данного пациента для того, чтобы повысить количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках этих органов и тканей и/или органах и тканях до необходимого уровня применительно к конкретному пациенту. В тех случаях, когда использование биологически активной генно-терапевтической субстанции с нативной кДНК гена COL1A2 не приводит к желаемому изменению уровня количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях, необходимо применять субстанцию на основе модифицированной кДНК гена COL1A2, приводящей к более эффективной экспрессии гена COL1A2.
При использовании заявленной биологически активной генно-терапевтической субстанции не происходит встраивания экзогенного генетического материала в геном клетки.
Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций обеспечивает высокий уровень экспрессии гена COL1A2, повышая количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека в частности, в гемопоэтических клетках, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или миоцитах, или миобластах, или фибробластах, или остеобластах, или кератоцитах, или эпителиальных клетках, или клетках роговицы, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в соединительно-тканных структурах, или коже, или суставах, или хрящевой ткани, или костной ткани, или мышечной ткани, или сухожилиях, или связках, или кровеносных сосудах, или стенке артерий, или роговице глаза, или склере, или плаценте, или дентине, или строме внутренних органов в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека.
Таким образом, приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно, создание линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций, при использовании которых применительно к клеткам органов и тканей и/или органам и тканям человека компенсируются дефекты гена COL1A2, влияющие на экспрессию этого гена или на количественный уровень белка альфа-2 цепи коллагена I типа, кодируемого этим геном, а также компенсируется недостаточное количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа, вызванная факторами, влияющими на экспрессию гена COL1A2.
Повышение эффективности коррекции количественного уровня белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей человека достигают за счет того, что при недостаточном количестве этого белка вследствие дефекта гена COL1A2 используют не белок, а генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A2, кодирующую этот белок. При введении генетических конструкций в отличие от введения непосредственно белка, как в прототипе, снижается требуемая частота их введения в связи с пролонгированным действием, а также облегчается внутриклеточная доставка.
Промышленная применимость.
Все приведенные примеры по созданию и использованию созданной линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций подтверждают ее промышленную применимость.
Перечень сокращений
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл - миллилитр,
мкл - микролитр
л - литр
мкг - микрограмм
мг - миллиграмм
г - грамм
мкМ - микромоль
мМ - миллимоль
об/мин - обороты в минуту
нм - нанометр
см - сантиметр
мВт - милливатт
о.е. ф-относительная единица флуоресценции
БАГТС - биологически активная генно-терапевтическая субстанция
Claims (5)
1. Средство для коррекции состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, на основе генно-терапевтических субстанций с геном COL1A2, где клетки органов и тканей выбраны из фибробластов, кератоцитов, хондробластов и эпителиальных клеток роговицы глаза, органы и ткани выбраны из кожи, хрящевой ткани или мышечной ткани человека, представляющее собой по крайней мере одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена COL1A2 SEQ ID No: 1 или модифицированной кДНК гена COL1A2, при этом в качестве модифицированной кДНК гена COL1A2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы в сочетании с транспортной молекулой или без нее, причем регуляторные элементы обеспечивают транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в клетках органов и тканей человека, способную обеспечить повышение экспрессии гена COL1A2 и увеличить количество белка альфа-2 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека.
2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что генетическая конструкция с кДНК гена COL1A2 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена COL1A2, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка альфа-2 цепи коллагена I типа - делеции 5'-нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность.
3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блок-сополимеры.
4. Способ получения средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена I типа, на основе генно-терапевтических субстанций с геном COL1A2 по п. 1, заключающийся в получении каждой генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций по п. 1, при этом получают кДНК гена COL1A2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена COL1A2 с кодирующей последовательностью белка каталазы, с делециями 5'- и 3'-нетранслируемых областей, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена COL1A2 SEQ ID No: 1, или модифицированной кДНК гена COL1A2, при этом в качестве модифицированной кДНК гена COL1A2 используют или SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7, или сочетание этих генетических конструкций.
5. Способ использования средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена COL1A2 и/или уменьшением активности белка каталазы, заключающийся в трансфекции генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1, клеток органов и тканей пациента и/или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1, и/или во введении в органы и ткани пациента генно-терапевтической субстанции или нескольких субстанций, выбранной/ выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1, или сочетанием обозначенных способов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016101660A RU2649820C2 (ru) | 2016-01-20 | 2016-01-20 | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016101660A RU2649820C2 (ru) | 2016-01-20 | 2016-01-20 | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016101660A RU2016101660A (ru) | 2017-07-25 |
| RU2649820C2 true RU2649820C2 (ru) | 2018-04-04 |
Family
ID=59498405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016101660A RU2649820C2 (ru) | 2016-01-20 | 2016-01-20 | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2649820C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015035395A1 (en) * | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Figene, Llc | Gene therapy for the regeneration of chondrocytes or cartilage type cells |
| WO2015066190A1 (en) * | 2013-10-29 | 2015-05-07 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for inhibting oxidative stress |
-
2016
- 2016-01-20 RU RU2016101660A patent/RU2649820C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015035395A1 (en) * | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Figene, Llc | Gene therapy for the regeneration of chondrocytes or cartilage type cells |
| WO2015066190A1 (en) * | 2013-10-29 | 2015-05-07 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for inhibting oxidative stress |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| GUIRAUD S., et al., The reverse block copolymer Pluronic 25R2 promotes DNA transfection of skeletal muscle. Macromol Biosci. 2011 May 12; 11(5): 590-4. doi: 10.1002/mabi.201000463. Epub 2011 Feb 17. * |
| ISHONINA O.G., et al., [Comparative characteristics of antioxidant status in women with diabetes type 2 of different age groups]. [Article in Russian] Adv Gerontol. 2011; 24(4): 645-9. * |
| LEVINE RM., et al., Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 2013 Jul 23; 29(29): 9208-15. doi: 10.1021/la400859e. Epub 2013 Jul 9. * |
| LJUNGGREN O., et al., Allele-specific gene silencing in osteogenesis imperfecta. Endocr Dev. 2011; 21: 85-90. doi: 10.1159/000328133. Epub 2011 Aug 22. * |
| LJUNGGREN O., et al., Allele-specific gene silencing in osteogenesis imperfecta. Endocr Dev. 2011; 21: 85-90. doi: 10.1159/000328133. Epub 2011 Aug 22. LEVINE RM., et al., Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 2013 Jul 23; 29(29): 9208-15. doi: 10.1021/la400859e. Epub 2013 Jul 9. ISHONINA O.G., et al., [Comparative characteristics of antioxidant status in women with diabetes type 2 of different age groups]. [Article in Russian] Adv Gerontol. 2011; 24(4): 645-9. * |
| WONG P.T., et al., Multivalent dendrimer vectors with DNA intercalation motifs for gene delivery. Biomacromolecules. 2014 Nov 10; 15(11): 4134-45. doi: 10.1021/bm501169s. Epub 2014 Oct 15. * |
| WONG P.T., et al., Multivalent dendrimer vectors with DNA intercalation motifs for gene delivery. Biomacromolecules. 2014 Nov 10; 15(11): 4134-45. doi: 10.1021/bm501169s. Epub 2014 Oct 15. GUIRAUD S., et al., The reverse block copolymer Pluronic 25R2 promotes DNA transfection of skeletal muscle. Macromol Biosci. 2011 May 12; 11(5): 590-4. doi: 10.1002/mabi.201000463. Epub 2011 Feb 17. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016101660A (ru) | 2017-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2658428C1 (ru) | Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена Р4НА1 и/или уменьшением количества белка пролил 4- гидрокислазы альфа 1 на основе генно-терапевтических субстанций с геном Р4НА1, способ получения и использования | |
| US10449271B2 (en) | Matrix scaffold with antimicrobial activity | |
| Labus et al. | Expression of Wnt genes in early wound healing | |
| CN107405412A (zh) | 通过递送bmp编码rna诱导骨生成 | |
| KR20220007596A (ko) | 고도로 기능적인 제조된 abcb5+ 중간엽 줄기 세포 | |
| TW200829267A (en) | Method of treating endothelial dysfunction | |
| CN1643140A (zh) | 生长因子和蛋白酶的组合 | |
| Vallee et al. | Organogenesis and angiogenin | |
| JP2002520421A (ja) | プロテアーゼ感受性ｉｉ | |
| RU2649820C2 (ru) | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа | |
| JP2002542824A (ja) | 組換えラミニン５ | |
| RU2652350C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена col1a1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования | |
| Yang et al. | PNPLA5-knockout rats induced by CRISPR/Cas9 exhibit abnormal bleeding and lipid level | |
| Binder et al. | Lysophosphatidic acid enhances stromal cell-directed angiogenesis | |
| RU2665771C1 (ru) | Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена ang и/или уменьшением количества и/или активности белка ангиогенина на основе генно-терапевтических субстанций с геном ang, способ получения и использования | |
| WO2020024774A1 (zh) | Dgcr8在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用 | |
| RU2700649C2 (ru) | Генетическая конструкция на основе невирусной векторной плазмиды, включающей кДНК гена Р4НА2, для купирования проявлений состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена Р4НА2 и/или уменьшением количества белка пролил 4-гидрокислаза альфа 2, способ получения и использования | |
| RU2651757C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования | |
| RU2652353C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования | |
| US20030077757A1 (en) | Method of treating aging-related disorders | |
| RU2652351C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfbr2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования | |
| RU2652312C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfb1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования | |
| RU2651048C1 (ru) | Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена il-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном il-11, способ получения и использования | |
| RU2652318C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена clca2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования | |
| RU2653491C2 (ru) | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена gpx1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования |