RU2646113C1 - Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells - Google Patents
Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646113C1 RU2646113C1 RU2016136040A RU2016136040A RU2646113C1 RU 2646113 C1 RU2646113 C1 RU 2646113C1 RU 2016136040 A RU2016136040 A RU 2016136040A RU 2016136040 A RU2016136040 A RU 2016136040A RU 2646113 C1 RU2646113 C1 RU 2646113C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- naf
- delivery
- fna
- solution
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 22
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 11
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 5
- SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N silanol Chemical compound [SiH3]O SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 150000004819 silanols Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 27
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 14
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 7
- 229910010413 TiO 2 Inorganic materials 0.000 description 7
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- -1 amino-substituted silanol Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- BDLVNNJRAIUIMO-UHFFFAOYSA-N amino(hydroxy)silicon Chemical compound N[Si]O BDLVNNJRAIUIMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPSYWNLKRDURMG-UHFFFAOYSA-L hydron;manganese(2+);phosphate Chemical compound [Mn+2].OP([O-])([O-])=O CPSYWNLKRDURMG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины и может быть использовано для создания систем доставки лекарственных средств (в частности, олигонуклеотидов) в клетки.The invention relates to the field of molecular biology, bioorganic chemistry and medicine and can be used to create systems for the delivery of drugs (in particular, oligonucleotides) into cells.
Использование фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов (ФНК) для селективного воздействия на внутриклеточный генетический материал является одной из важнейших задач современной биологии и фундаментальной медицины. В случае решения этой проблемы открывается возможность широкого использования этого подхода в практической медицине. Однако до конца не решенной проблемой является отсутствие эффективного способа доставки фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов внутрь клетки, поскольку известно, что сами по себе они проникают в клетки в очень малой степени, в первую очередь, из-за гидрофобного характера клеточной мембраны.The use of nucleic acid fragments and their analogues (FNAs) for selective action on intracellular genetic material is one of the most important tasks of modern biology and fundamental medicine. If this problem is solved, the possibility of widespread use of this approach in practical medicine opens up. However, the problem that has not been completely resolved is the lack of an effective method for delivering fragments of nucleic acids and their analogues into the cell, since it is known that by themselves they penetrate into the cells to a very small extent, primarily because of the hydrophobic nature of the cell membrane.
Известны способы доставки ФНК в клетки с помощью вирусных векторов [Bouard, D. еt al., British Journal of Pharmacology, 2009, v. 157, 153-165], путем включения в липосомы [Deshpande, D. et al., Pharm. Res., 1998, v. 15, p. 1340-1347], путем конъюгирования с катионными полимерами различной природы [Smedt, S.C. et al., Pharm. Res., 2000, v. 17, 113-126], с помощью электропорации [Baum С.et al., Biotechniques. 1994, v. 17, 1058-1062] и др. Однако проблема доставки пока не нашла окончательного решения и продолжает оставаться актуальной задачей.Known methods for delivering FNA to cells using viral vectors [Bouard, D. et al., British Journal of Pharmacology, 2009, v. 157, 153-165], by incorporation into liposomes [Deshpande, D. et al., Pharm. Res., 1998, v. 15, p. 1340-1347], by conjugation with cationic polymers of various nature [Smedt, S.C. et al., Pharm. Res., 2000, v. 17, 113-126], using electroporation [Baum C. et al., Biotechniques. 1994, v. 17, 1058-1062] and others. However, the problem of delivery has not yet found a final solution and continues to be an urgent task.
Известно использование наночастиц различной природы, в частности, неорганических наночастиц в качестве агентов доставки реакционноспособных олигонуклеотидов, обеспечивая тем самым высокоэффективное взаимодействие с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами.It is known to use nanoparticles of various nature, in particular, inorganic nanoparticles as agents for the delivery of reactive oligonucleotides, thereby providing highly efficient interaction with intracellular nucleic acids.
Описано использование наночастиц фосфата кальция для доставки плазмидной ДНК в стволовые клетки [Cao X, et al., Int. J. Nanomedicine, 2011; 6, 3335-3349]; наночастиц фосфатов магния и марганца для доставки олигонуклеотидов в клетки HeLa [Bhakta G, et al., Biomaterials. 2005, v. 26, 2157-2163], наночастиц карбонат-апатита для доставки ДНК в клетки млекопитающих [Hossain S, et al., Anal. Biochem., 2010, v. 397, 156-161]; наночастиц благородных металлов для детекции ДНК и их доставки в клетки [Chen XJ, et al., Wiley Interdiscip.Rev. Nanomed. Nanobiotechnol., 2012, doi: 10.1002/wnan. 1159].The use of calcium phosphate nanoparticles for delivering plasmid DNA to stem cells has been described [Cao X, et al., Int. J. Nanomedicine, 2011; 6, 3335-3349]; magnesium and manganese phosphate nanoparticles for the delivery of oligonucleotides to HeLa cells [Bhakta G, et al., Biomaterials. 2005, v. 26, 2157-2163], carbonate apatite nanoparticles for delivering DNA to mammalian cells [Hossain S, et al., Anal. Biochem., 2010, v. 397, 156-161]; noble metal nanoparticles for DNA detection and cell delivery [Chen XJ, et al., Wiley Interdiscip.Rev. Nanomed. Nanobiotechnol., 2012, doi: 10.1002 / wnan. 1159].
Известен способ получения наноразмерной системы доставки ФНК в клетки млекопитающих, включающий синтез наночастиц диоксида титана (ТiO2) размером ~5 нм и последующую иммобилизацию на них допамин-содержащего олигонуклеотида [Paunesku Т. et al., Nat. Mater. 2003, v. 2, 343-346; Thurn К.Т. et al., Small 2009, v. 5, 1318-1325; Kurepa, J. et al., Nano Lett. 2010, v. 10, 2296-2302].A known method for producing a nanoscale system for the delivery of FNA to mammalian cells, including the synthesis of titanium dioxide (TiO 2 ) nanoparticles of ~ 5 nm in size and subsequent immobilization of a dopamine-containing oligonucleotide on them [Paunesku T. et al., Nat. Mater. 2003, v. 2, 343-346; Thurn K.T. et al., Small 2009, v. 5, 1318-1325; Kurepa, J. et al., Nano Lett. 2010, v. 10, 2296-2302].
Наиболее близким к заявляемому способу – прототипом - является способ получения наноразмерной системы доставки олигонуклеотидов, включающий синтез наночастиц диоксида титана, синтез конъюгатов наночастиц диоксида титана с полилизином (TiO2-PL), иммобилизацию олигонуклеотидов на TiO2-PL, при этом иммобилизацию олигонуклеотида проводят в водном растворе при комнатной температуре, а не связавшийся с частицами конъюгат отмывают раствором NaCl. ФНК связываются с TiO2-PL за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных аминогрупп полилизина (NH2) и отрицательно заряженных межнуклеотидных фосфатных групп олигонуклеотида (р). Получают наноразмерную систему доставки ФНК в клетки, представляющую собой нанокомпозит TiO2-PL⋅ФНК с емкостью по ФНК, составляющей 0.2-60 нмоль/мг. Длительность способа получения системы доставки составляет 1.5-2 часа, а с учетом времени приготовления TiO2-наночастиц -2-3 суток. Получаемая таким способом наноразмерная система доставки ФНК в клетки состоит из наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином, на которых иммобилизованы ФНК, способные проникать в эукариотические клетки путем обычного эндоцитоза. В качестве линкера используют полиамины, содержащие от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле, преимущественно полилизин, полиэтиленимин или спермин (патент RU 2444571 С2, опубл. 10.03.2012).Closest to the claimed method - the prototype - is a method of obtaining a nanoscale oligonucleotide delivery system, including the synthesis of titanium dioxide nanoparticles, the synthesis of titanium dioxide nanoparticle conjugates with polylysine (TiO2-PL), the oligonucleotides are immobilized on TiO2-PL, while the oligonucleotide is immobilized into the oligonucleotide at room temperature, and not conjugated to particles, the conjugate is washed with a solution of NaCl. FNAs bind to TiO 2 -PL due to the electrostatic interaction of positively charged amino groups of polylysine (NH 2 ) and negatively charged internucleotide phosphate groups of the oligonucleotide (p). A nanoscale system for delivering FNA to cells is obtained, which is a TiO 2 -PL⋅FNA nanocomposite with a FNA capacity of 0.2-60 nmol / mg. The duration of the method of obtaining the delivery system is 1.5-2 hours, and taking into account the time of preparation of TiO 2 nanoparticles -2-3 days. Obtained in this way, the nanoscale system for the delivery of FNA to cells consists of titanium dioxide nanoparticles coated with polylysine, on which FNAs are immobilized, capable of penetrating into eukaryotic cells by conventional endocytosis. As the linker, polyamines are used containing from 3 to 1000 amino groups in the molecule, mainly polylysine, polyethyleneimine or spermine (patent RU 2444571 C2, publ. 10.03.2012).
Недостатками известного способа является необходимость предварительного синтеза конъюгатов наночастиц диоксида титана с полилизином (TiO2-PL), что требует использования относительно дорогого реактива (полилизина) и дополнительного времени, а также ограниченные функциональные возможности вследствие того, что в качестве основы для системы доставки используются нестабильные золи диоксида титана, склонные к агрегации, что может быть препятствием для использования нанокомпозитов TiO2-PL⋅ФНК в медицинской практике.The disadvantages of this method is the need for preliminary synthesis of conjugates of titanium dioxide nanoparticles with polylysine (TiO 2 -PL), which requires the use of a relatively expensive reagent (polylysine) and additional time, as well as limited functionality due to the fact that unstable are used as the basis for the delivery system aggregates of titanium dioxide, which may be an obstacle to the use of TiO 2 -PLOFNA nanocomposites in medical practice.
Техническим результатом является упрощение и сокращение длительности способа, а также расширение его функциональных возможностей.The technical result is to simplify and reduce the duration of the method, as well as expanding its functionality.
Технический результат достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.The technical result is achieved by the claimed method, which consists in the following.
Предварительно получают основу (носитель) для системы доставки. Для этого 3-аминопропилтриэтоксисилан (в концентрации 1-4 мг/мл в пересчете на Si) гидролизуют добавлением его по каплям к дистиллированной воде при значениях рН 10-11 и температуре от 20 до 70°С и перемешиванием в течение 8-15 ч. Полученный аминозамещенный силанол (Si~NH2) представляет собой прозрачный раствор, содержащий Si(OH)3(C3H6NH2) в виде мономера или димера или смеси мономера, димера и слабоконденсированных цепочек с соотношением Si/NH2=1:1. Высушенный на воздухе гидролизованный продукт представляет собой бесцветную стекловидную пленку. По данным рентгенофазового анализа (РФА) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) сухой продукт является аморфным веществом.Pre-receive the basis (carrier) for the delivery system. For this, 3-aminopropyltriethoxysilane (at a concentration of 1-4 mg / ml in terms of Si) is hydrolyzed by adding it dropwise to distilled water at pH 10-11 and a temperature of from 20 to 70 ° C and stirring for 8-15 hours. The obtained amino-substituted silanol (Si ~ NH 2 ) is a clear solution containing Si (OH) 3 (C 3 H 6 NH 2 ) in the form of a monomer or dimer or a mixture of monomer, dimer and weakly condensed chains with the ratio Si / NH 2 = 1: one. The air-dried hydrolyzed product is a colorless glassy film. According to x-ray phase analysis (XRD) and transmission electron microscopy (TEM), the dry product is an amorphous substance.
Перед иммобилизацией ФНК к раствору гидролизованного продукта добавляют 0.5-1%-ную уксусную кислоту до значений рН 8-9 и получают раствор Si~NH2 с концентрацией 1-4 мг/мл в пересчете на Si и соотношением Si/NH2=1:(0.4-0.5). К полученному раствору Si~NH2 (2-25 мкл, 1-4 мг Si/мл) добавляют 10-50 мкл 10-3-10-7 М раствора соответствующего ФНК длиной 10-1500 звеньев с соотношением 5-100 нмоль ФНК на 1 мг Si и инкубируют в 0.1-0.2М растворе NaCl, при комнатной температуре в течение 20-30 минут. ФНК количественно связываются с Si~NH2 за счет сильного электростатического взаимодействия положительно заряженных аминогрупп и отрицательно заряженных межнуклеотидных фосфатных групп олигонуклеотида. Получают систему доставки ФНК в клетки, представляющую собой нанокомпозит Si~NH2⋅ФНК с размером частиц от 1 до 8 нм (по данным атомной силовой микроскопии) с концентрацией 0.25-1 мг/мл по Si и с емкостью по ФНК, составляющей 10-100 нмоль/мг. Длительность способа получения системы доставки ФНК составляет не более 0.5 часа, а с учетом приготовления основы для доставки (Si~NH2) - не более 20 часов.Before immobilization of the FNA, 0.5-1% acetic acid is added to the solution of the hydrolyzed product to pH 8-9 and a solution of Si ~ NH 2 with a concentration of 1-4 mg / ml in terms of Si and the ratio Si / NH 2 = 1 is obtained: (0.4-0.5). To the resulting Si ~ NH 2 solution (2-25 μl, 1-4 mg Si / ml) add 10-50 μl of a 10 -3 -10 -7 M solution of the corresponding FNA with a length of 10-1500 units with a ratio of 5-100 nmol FNA per 1 mg Si and incubated in 0.1-0.2 M NaCl solution, at room temperature for 20-30 minutes. PNAs quantitatively bind to Si ~ NH 2 due to the strong electrostatic interaction of positively charged amino groups and negatively charged internucleotide phosphate groups of the oligonucleotide. A system for delivering FNA to cells is obtained, which is a Si ~ NH 2 ⋅ FNA nanocomposite with a particle size of 1 to 8 nm (according to atomic force microscopy) with a concentration of 0.25-1 mg / ml for Si and with a FNA capacity of 10- 100 nmol / mg. The duration of the method of obtaining the delivery system of FNK is not more than 0.5 hours, and taking into account the preparation of the basis for delivery (Si ~ NH 2 ) - not more than 20 hours.
Получаемая заявляемым способом система доставки ФНК в клетки представляет собой растворимый нанокомпозит, состоящий из аминосиланола, с аминогруппами которого электростатически связаны ФНК, способные проникать в эукариотические клетки предположительно путем обычного эндоцитоза, без использования дополнительных внешних методов трансфекции, и направленно воздействовать на внутриклеточный генетический материал и подавлять его дальнейшее функционирование.Obtained by the claimed method, the delivery system of FNK into cells is a soluble nanocomposite consisting of aminosilanol, with amino groups of which FNC are electrostatically coupled, capable of penetrating into eukaryotic cells presumably by conventional endocytosis, without using additional external methods of transfection, and targeting intracellular genetic material and suppressing its further functioning.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа от прототипа являются:The defining hallmarks of the proposed method from the prototype are:
1) В качестве основы для доставки ФНК в клетки используют аминозамещенный силанол (Si~NH2) в концентрации 1-4 мг Si/мл, который получают гидролизом в воде аминопропилтриэтоксисилана при рН 10-11 и температуре 20-70°С с последующей нейтрализацией до рН 8-9, что позволяет упростить способ и сократить его длительность за счет сокращения стадий, удешевить за счет исключения дорогого препарата полилизина и обеспечить получение растворимого препарата, что является преимуществом для использования в медицинской практике.1) Amino-substituted silanol (Si ~ NH 2 ) at a concentration of 1-4 mg Si / ml, which is obtained by hydrolysis of aminopropyltriethoxysilane in water at a pH of 10-11 and a temperature of 20-70 ° C, followed by neutralization, is used as the basis for the delivery of FNA to cells to a pH of 8-9, which allows to simplify the method and reduce its duration by reducing the stages, reduce the cost of eliminating the expensive drug polylysine and provide a soluble drug, which is an advantage for use in medical practice.
2) Последующую иммобилизацию ФНК на Si~NH2 осуществляют путем добавления рассчитанного количества 10-3-10-7М раствора соответствующего ФНК к прозрачному раствору Si~NH2 с концентрацией 1-4 мг/мл в пересчете на Si в 0.1-0.2 М NaCl при рН 8-9 и перемешивания при комнатной температуре в течение 20-30 минут, что обеспечивает прочное связывание ФНК с Si~NH2 за счет электростатического взаимодействия отрицательно заряженных фосфатных групп ФНК с положительно заряженными аминогруппами.2) Subsequent immobilization of the FNA on Si ~ NH 2 is carried out by adding the calculated amount of a 10 -3 -10 -7 M solution of the corresponding FNA to a clear Si ~ NH 2 solution with a concentration of 1-4 mg / ml in terms of Si in 0.1-0.2 M NaCl at pH 8-9 and stirring at room temperature for 20-30 minutes, which ensures strong binding of the FNA to Si ~ NH 2 due to the electrostatic interaction of negatively charged phosphate groups of FNA with positively charged amino groups.
Заявляемый способ обеспечивает получение нанокомпозита с практически такой же емкостью по ФНК, как и известный способ (прототип), и высокой прочностью связывания ФНК с Si~NH2, основанной на сильном электростатическом взаимодействии фосфатных групп с аминогруппами. Предлагаемый способ, как и известный способ (прототип), обеспечивает возможность присоединять к Si~NH2 любые ФНК и их аналоги, содержащие отрицательные заряды на межнуклеотидных фосфатных группах. Предлагаемый способ, как и известный способ (прототип), обеспечивает высокую противовирусную активность получаемых препаратов в отношении вируса гриппа А. Кроме этого, предлагаемый способ обеспечивает возможность получения прозрачных растворов нанокомпозитов, не содержащих агрегированных наночастиц, склонных к осаждению.The inventive method provides for the production of a nanocomposite with almost the same FNA capacity as the known method (prototype) and high binding strength of FNA to Si ~ NH 2 , based on the strong electrostatic interaction of phosphate groups with amino groups. The proposed method, as well as the known method (prototype), provides the ability to attach to Si ~ NH 2 any FNA and their analogues containing negative charges on internucleotide phosphate groups. The proposed method, like the known method (prototype), provides high antiviral activity of the obtained preparations against influenza A virus. In addition, the proposed method provides the possibility of obtaining transparent solutions of nanocomposites that do not contain aggregated nanoparticles prone to precipitation.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение Si~NH2.Example 1. Obtaining Si ~ NH 2 .
К 120 мл нагретой на водяной бане до 70°С дистиллированной воде по каплям добавляют 4 г 3-аминопропилтриэтоксисилана (508 мг по Si) до рН 10 и перемешивают при этой температуре 8 ч. Концентрация продукта составляет 4.2 мг Si/мл. По данным титрования продукта мольное соотношение NH2/Si в образце составляет 1:1. После охлаждения до комнатной температуры к раствору добавляют 0.5% раствор уксусную кислоту до рН 8. Концентрация наночастиц Si~NH2 после нейтрализации составляет 4 мг Si/мл. По данным титрования продукта мольное соотношение NH2/Si после нейтрализации составляет 0.5. Размер наночастиц - 1-8 нм по данным атомной силовой микроскопии.To 120 ml of distilled water heated in a water bath at 70 ° C, 4 g of 3-aminopropyltriethoxysilane (508 mg Si) are added dropwise to pH 10 and stirred at this temperature for 8 hours. The product concentration is 4.2 mg Si / ml. According to the titration of the product, the molar ratio of NH 2 / Si in the sample is 1: 1. After cooling to room temperature, 0.5% acetic acid solution was added to the solution to pH 8. The concentration of Si ~ NH 2 nanoparticles after neutralization was 4 mg Si / ml. According to the product titration, the molar ratio of NH 2 / Si after neutralization is 0.5. The size of the nanoparticles is 1-8 nm according to atomic force microscopy.
Пример 2. Получение Si~NH2.Example 2. Obtaining Si ~ NH 2 .
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что гидролиз 3-аминопропилтриэтоксисилана проводят при 20°С и рН 11 и перемешивают при этой температуре 15 ч. После гидролиза раствор нейтрализуют 1%-ный раствор уксусной кислотой до значений рН 9.The method is carried out analogously to example 1, except that the hydrolysis of 3-aminopropyltriethoxysilane is carried out at 20 ° C and pH 11 and stirred at this temperature for 15 hours. After hydrolysis, the solution is neutralized with a 1% solution of acetic acid to pH 9.
Пример 3. Получение Si~NH2.Example 3. Obtaining Si ~ NH 2 .
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что в реакции гидролиза используют 127 мг 3-аминопропилтриэтоксисилана (в пересчете на Si). Концентрация продукта после нейтрализации составляет 1 мг Si/мл.The method is carried out analogously to example 1, except that 127 mg of 3-aminopropyltriethoxysilane (in terms of Si) is used in the hydrolysis reaction. The concentration of the product after neutralization is 1 mg Si / ml.
Пример 4. Получение композита Si~NH2⋅oligo1Example 4. Obtaining a composite of Si ~ NH 2 ⋅oligo1
К 25 мкл Si~NH2, полученному по примеру 1, добавляют 65 мкл 0.16 М NaCl и 10 мкл 10-3 М (10 нмоль) раствора 10-звенного олигонуклеотида d(5'CATCCAGGATp)* (oligo1). Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Получают продукт Si~NH2⋅oligo1 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и емкостью по олигонуклеотиду 100 нмоль/мг Si.65 μl of 0.16 M NaCl and 10 μl of 10 -3 M (10 nmol) of a solution of 10-unit oligonucleotide d ( 5 ' CATCCAGGATp) * (oligo1) are added to 25 μl of Si ~ NH 2 obtained in Example 1. The reaction mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. Get the product Si ~ NH 2 ⋅oligo1 with a concentration of 1 mg / ml (Si) and a capacity for
Пример 5. Получение композитов Si~NH2⋅oligo2 и Si~NH2⋅oligo3.Example 5. Obtaining composites Si ~ NH 2 ⋅oligo2 and Si ~ NH 2 ⋅oligo3.
Способ осуществляют аналогично примеру 4, кроме того, что в качестве олигонуклеотидов используют 10-4 М растворы 21-звенных олигодезоксирибонуклеотидов d(5'GCAAAAGCAGGGTAGATAATCp) (oligo2) или d(5'GATCAACTCCATATGCCATGTp) (oligo3) (по 25 мкл, 2.5 нмоль), и реакцию проводят в 0.2 М NaCl, для чего в реакционную смесь добавляют 50 мкл 0.4 М NaCl. Получают композиты Si~NH2⋅oligo2 и Si~NH2⋅oligo3 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотиду 25 нмоль/мг Si.The method is carried out analogously to example 4, except that 10 -4 M solutions of 21-unit oligodeoxyribonucleotides d ( 5 ' GCAAAAGCAGGGTAGATAATCp) (oligo2) or d ( 5' GATCAACTCCATATGCCATGTp) (oligo3) (25 μl each) are used as oligonucleotides and the reaction is carried out in 0.2 M NaCl, for which 50 μl of 0.4 M NaCl is added to the reaction mixture. Composites Si ~ NH 2 ⋅oligo2 and Si ~ NH 2 ⋅oligo3 are obtained with a concentration of 1 mg / ml (by Si) and with an oligonucleotide capacity of 25 nmol / mg Si.
Пример 6. Получение композита Si~NH2⋅oligo4 и Si~NH2⋅oligo5.Example 6. Obtaining a composite of Si ~ NH 2 ⋅oligo4 and Si ~ NH 2 ⋅oligo5.
Способ аналогичен примеру 5, отличается тем, что в качестве олигонуклеотида используют 50 мкл 10-4 М (5 нмоль) раствора 30-звенного олигорибонуклеотида 5'CUGCUGUACAUGGCACAUGGAAUUGAUUA (oligo4) или 50 мкл 10-4 М раствора 16-звенного аналога олигодезоксирибонуклеотида dps(5'CCGTCGGTACCGGCCG) (oligo5), содержащего межнуклеотидные тиофосфатные группы (ps), и реакцию проводят в 0.1 М NaCl, для чего в реакционную смесь добавляют 25 мкл 0.4 М NaCl. Получают нанокомпозиты Si~NH2⋅oligo4 и Si~NH2⋅oligo5 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотидам 50 нмоль/мг Si.The method is similar to example 5, characterized in that 50 μl of a 10 -4 M (5 nmol) solution of a 30-unit 5 -unit oligoribonucleotide CUGCUGUACAUGGCACAUGGAAUUGAUUA (oligo4) or 50 μl of a 10 -4 M solution of a 16-unit oligodeoxyribonucleotide d ps analogue are used as an oligonucleotide 5 ' CCGTCGGTACCGGCCG) (oligo5) containing internucleotide thiophosphate groups (ps) and the reaction is carried out in 0.1 M NaCl, for which 25 μl of 0.4 M NaCl is added to the reaction mixture. Si ~ NH 2 ⋅oligo4 and Si ~ NH 2 ⋅oligo5 nanocomposites are obtained with a concentration of 1 mg / ml (by Si) and with an oligonucleotide capacity of 50 nmol / mg Si.
Пример 7. Получение композита Si~NH2⋅oligo5.Example 7. Obtaining a composite of Si ~ NH 2 ⋅oligo5.
Способ аналогичен примеру 4, отличается тем, что в качестве олигонуклеотида используют 50 мкл 1500-звенного фрагмента ДНК (oligo5) с концентрацией 2⋅10-7 М (1⋅10-2 нмоль), 2 мкл Si~NH2, полученного по примеру 3 и 48 мкл 0.4 М NaCl. Получают нанокомпозит Si~NH2⋅oligo5 с концентрацией 0.02 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотиду 5 нмоль/мг Si.The method is similar to example 4, characterized in that 50 μl of a 1500-unit DNA fragment (oligo5) with a concentration of 2⋅10 -7 M (1⋅10 -2 nmol), 2 μl of Si ~ NH 2 obtained according to example 1 is used as an oligonucleotide 3 and 48 μl of 0.4 M NaCl. Get a nanocomposite Si ~ NH 2 ⋅oligo5 with a concentration of 0.02 mg / ml (Si) and with an oligonucleotide capacity of 5 nmol / mg Si.
Пример 8. Оценка способности нанокомпозита Si~NH2⋅ФНК проникать в клетки.Example 8. Assessment of the ability of the nanocomposite Si ~ NH 2 ⋅FNA to penetrate into cells.
В эксперименте используют клетки линий HeLa и MDCK (полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская обл.), красители для окрашивания клеточных ядер и мембран (DAPI и Cell Mask Plasma Membrane Stain) и питательную среду для клеток DMEM, эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), антибиотики, буфер PBS (Invitrogen, США). Для приготовления образцов для конфокальной микроскопии клетки культивируют в полной среде DMEM в 8-луночных камерах до достижения 70% монослоя, после этого полную среду заменяют на среду без сыворотки, стрептомицина и пенициллина (160 мкл). Затем добавляют исследуемый нанокомпозит SiO2 Si~NH2⋅oligo2(Flu), полученный, как описано в примере 5 с использованием олигонуклеотида, меченного флуоресцеином (40 мкл в лунку) до конечной концентрации 0.01 мг/мл по Si и 0.25 нмоль/мл по олигонуклеотиду. После 24-ч инкубации клетки отмывают буфером PBS, фиксируют и окрашивают красителями (DAPI для ядер, и Cell Mask Plasma Membrane Stain для клеточных мембран) в течение 10 мин. Препараты анализируют с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 UV MetaMicroscope (Carl Zeiss, Inc.). На фиг. 1 представлены изображения клеток HeLa (А) и MDCK (Б) (а - ядра, б - границы клеток и внутриклеточные актиновые филаменты, в - флуоресцеин-меченные нанокомпозиты). Видно, что в случае обоих типов клеток (HeLa и MDCK) нанокомпозит Sid Si~NH2⋅oligo2(Flu) обнаруживается внутри клеток.In the experiment, HeLa and MDCK cell lines (obtained from the cell culture collection of the Federal State Institution of Biological Research, Vektor Vector, Koltsovo, Novosibirsk Region), dyes for staining cell nuclei and membranes (DAPI and Cell Mask Plasma Membrane Stain) and nutrient medium for DMEM cells, fetal calf serum (ETS), antibiotics, PBS buffer (Invitrogen, USA). To prepare samples for confocal microscopy, cells were cultured in complete DMEM in 8-well chambers until a 70% monolayer was reached, after which the complete medium was replaced with serum-free, streptomycin and penicillin (160 μl). Then, the studied nanocomposite SiO 2 Si ~ NH 2 ⋅oligo2 (Flu) is added, obtained as described in Example 5 using a fluorescein-labeled oligonucleotide (40 μl per well) to a final concentration of 0.01 mg / ml for Si and 0.25 nmol / ml for oligonucleotide. After a 24-hour incubation, cells were washed with PBS buffer, fixed and stained with dyes (DAPI for nuclei, and Cell Mask Plasma Membrane Stain for cell membranes) for 10 min. The preparations were analyzed using a LSM 510 UV MetaMicroscope confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Inc.). In FIG. Figure 1 shows images of HeLa (A) and MDCK (B) cells (a - nuclei, b - cell boundaries and intracellular actin filaments, c - fluorescein-labeled nanocomposites). It is seen that in the case of both types of cells (HeLa and MDCK), the Sid Si ~ NH 2 ⋅oligo2 (Flu) nanocomposite is found inside the cells.
Пример 9. Оценка цитотоксичности нанокомпозитов.Example 9. Assessment of the cytotoxicity of nanocomposites.
Для тестирования цитотоксичности препаратов используют перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл суспензии клеток MDCK с концентрацией 100 000 кл./мл в среде RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, вносят в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещают в термостат при температуре 37°С, 5% СО2 и 100% влажности на 2 сут до образования клеточного монослоя.To test the cytotoxicity of the preparations, a transplantable MDCK cell culture obtained from the collection of cell cultures of the FBSI SSC VB "Vector" is used. 100 μl of a suspension of MDCK cells with a concentration of 100,000 cells / ml in RPMI-1640 medium containing 5% blood serum of cow fruits was pipetted into 96-well plates using a 12-channel automatic pipette. Tablets with cells are placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days before the formation of a cell monolayer.
Для определения токсических концентраций образец разбавляют в несколько раз (в 2, 4, 8, 16, 20 раз, 32, 64 раза) средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы. Образец после каждого разведения вносят на монослой клеток MDCK в 4-х лунках по 100 мкл/лунку планшета и оставляют в термостате при температуре 37°С, 5% СО2 и 100% влажности. Токсическое действие образца на монослой клеток MDCK оценивают через 2 суток по соотношению живых и мертвых клеток с помощью инвертированного микроскопа.To determine toxic concentrations, the sample is diluted several times (2, 4, 8, 16, 20 times, 32, 64 times) with RPMI-1640 medium containing 5% blood serum of cow fruits. After each dilution, the sample is added to the monolayer of MDCK cells in 4 wells of 100 μl / well of the plate and left in an incubator at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity. The toxic effect of the sample on the monolayer of MDCK cells is evaluated after 2 days by the ratio of living and dead cells using an inverted microscope.
Эксперименты повторены 2-3 раза. Результаты представлены на фиг. 2, где квадраты - Si~NH2, треугольники - Si~NH2⋅oligo2. Из фиг. 2 видно, что выживаемость клеток примерно одинакова для исследуемых образцов, и величина ТС50 (концентрация препарата, при которой гибнет 50% клеток) составляет ~0.65 мг/мл в пересчете на Si.The experiments were repeated 2-3 times. The results are shown in FIG. 2, where the squares are Si ~ NH 2 , the triangles are Si ~ NH 2 ⋅oligo2. From FIG. Figure 2 shows that cell survival is approximately the same for the studied samples, and the TC 50 value (the concentration of the drug at which 50% of the cells die) is ~ 0.65 mg / ml in terms of Si.
Пример 10. Исследование противовирусной активности нанокомпозитов.Example 10. The study of the antiviral activity of nanocomposites.
В экспериментах используют вирус гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с исходным титром 106,5 ТЦД50/мл. Исследуют противовирусные свойства композитов Si~NH2⋅oligo2 и Si~NH2⋅oligo3, полученных как описано в примере 5, контрольного образца Si~NH2, полученного как в примере 1, а также образца TiO2-PL⋅oligo2, полученного известным способом (прототип). В качестве олигонуклеотидной части нанокомпозитов используют олигонуклеотиды: oligo2, комплементарный 3'-концу вирусной (-)РНК и имеющий выраженные противовирусные свойства по отношению к вирусу гриппа A H5N1, и oligo3, имеющий случайную последовательность той же длины.The experiments use the influenza virus A / chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1) with an initial titer of 10 6.5 TCD 50 / ml. The antiviral properties of the Si ~ NH 2 ⋅oligo2 and Si ~ NH 2 ⋅oligo3 composites prepared as described in Example 5, the control sample Si ~ NH 2 obtained as in Example 1, as well as the TiO 2 -PL⋅oligo2 sample prepared by known way (prototype). As the oligonucleotide part of the nanocomposites, oligonucleotides are used: oligo2, complementary to the 3'-end of the viral (-) RNA and having pronounced antiviral properties with respect to the influenza A H5N1 virus, and oligo3 having a random sequence of the same length.
Противовирусные свойства нанокомпозитов исследованы на культуре клеток MDCK. Используют среду DMEM с добавлением 2% FBS, глютамина и антибиотиков. Клетки культивируют, как описано в примере 13. Препараты разводят средой RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и вносят на монослой отмытых от сыворотки клеток MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета из расчета 0.1 мкМ по олигонуклеотиду (4 мкг/мл по Si) в конечной реакционной смеси. Концентрация препарата примерно в 150 раз меньше значения ТС50 (фиг. 2), т.е. используется нетоксическая концентрация. Реакционные смеси инкубируют при 37°С и 100% влажности в СО2-инкубаторе в течение 1 ч. Затем вносят вирус A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в разведениях на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, от -1 до -8 с десятикратным шагом в объеме 50 мкл/лунку. В качестве контроля используют вирус A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) без добавления исследуемых препаратов. Инкубируют в течение 2 суток в CO2-термостате при 37°С и 100% влажности; определяют наличие вируса визуально под микроскопом по ЦПД и в РГА с 1% эритроцитами петуха. Все препараты были проверены на противовирусную активность при n=6.The antiviral properties of nanocomposites were studied on an MDCK cell culture. Use DMEM medium supplemented with 2% FBS, glutamine and antibiotics. Cells were cultured as described in Example 13. The preparations were diluted with RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin and introduced onto a monolayer of serum-washed MDCK cells in a volume of 50 μl per well of a 96-well plate at the rate of 0.1 μM oligonucleotide (4 μg / ml by Si) in the final reaction mixture. The concentration of the drug is approximately 150 times lower than the TC 50 value (Fig. 2), i.e. non-toxic concentration is used. The reaction mixtures were incubated at 37 ° C and 100% humidity in a CO 2 incubator for 1 h. Then virus A / chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1) was added in dilutions on RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin , from -1 to -8 with tenfold increments in a volume of 50 μl / well. As a control, the virus A / chicken / Kurgan / 05/2005 (H5N1) is used without adding the studied drugs. Incubated for 2 days in a CO 2 thermostat at 37 ° C and 100% humidity; determine the presence of the virus visually under a microscope by the CPD and in the RGA with 1% rooster red blood cells. All drugs were tested for antiviral activity at n = 6.
На фиг. 3 приведены значения титра вируса (в единицах log ТЦД50/мл) в клетках МДСК, зараженных вирусом и обработанных исследуемыми препаратами. Из фиг. 3 следует, что контрольные образцы Si~NН2 (исходный силанол) и Si~NH2⋅oligo3 (содержащий случайную нуклеотидную последовательность, не комплементарную вирусной РНК) не проявляют заметной противовирусной активности, т.е. не происходит достоверно значимого снижения титра вируса в клетках. Образец Si~NH2⋅oligo2 обладает высокой противовируной активностью, которая даже несколько превосходит таковую для образца TiO2-PL⋅oligo2, полученного известным способом (прототип): разница между значениями титра вируса в контроле и опытах с соответствующими образцами составляет 3.2 log и 2.6 log, что соответствует подавлению репродукции вируса в 1000 и 400 раз соответственно.In FIG. Figure 3 shows the values of the titer of the virus (in units of log TCD 50 / ml) in MDSC cells infected with the virus and treated with the studied drugs. From FIG. 3 it follows that the control samples Si ~ NH 2 (starting silanol) and Si ~ NH 2 ⋅oligo3 (containing a random nucleotide sequence that is not complementary to viral RNA) do not exhibit significant antiviral activity, i.e. there is no significantly significant decrease in virus titer in cells. The Si ~ NH 2 ⋅oligo2 sample has a high antiviral activity, which even slightly exceeds that for the TiO 2 -PL⋅oligo2 sample obtained in a known manner (prototype): the difference between the values of the titer of the virus in the control and experiments with the corresponding samples is 3.2 log and 2.6 log, which corresponds to the suppression of virus reproduction in 1000 and 400 times, respectively.
Предлагаемый способ позволяет существенно упростить и сократить длительность, а также расширить функциональные возможности известного способа (прототипа) и обеспечить получение нанокомпозитов, представляющих собой систему доставки фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов в клетки млекопитающих. При этом получаемые заявляемым способом нанокомпозиты обладают свойствами, подобными нанокомпозитам, получаемым известным способом, а именно: такой же емкостью по ФНК, в частности олигодезоксирибонуклеотиду, высокой прочностью связывания олигонуклеотида с основой, способностью проникать через клеточную мембрану, низкой цитотоксичностью и специфической противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа А.The proposed method can significantly simplify and reduce the duration, as well as expand the functionality of the known method (prototype) and provide nanocomposites, which are a delivery system for fragments of nucleic acids and their analogues in mammalian cells. Moreover, the nanocomposites obtained by the claimed method have properties similar to nanocomposites obtained by a known method, namely, the same FNA capacity, in particular, oligodeoxyribonucleotide, high binding strength of the oligonucleotide to the base, ability to penetrate through the cell membrane, low cytotoxicity and specific antiviral activity with respect to to influenza A.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016136040A RU2646113C1 (en) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016136040A RU2646113C1 (en) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646113C1 true RU2646113C1 (en) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016136040A RU2646113C1 (en) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646113C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2693491C2 (en) * | 2014-12-18 | 2019-07-03 | Омиа Интернэшнл Аг | Method of producing pharmaceutical delivery system |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653124B1 (en) * | 2000-11-10 | 2003-11-25 | Cytoplex Biosciences Inc. | Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation |
| RU2563171C1 (en) * | 2014-10-15 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Method of producing nanosized system for delivering azidothymidine triphosphate to mammalian cells |
-
2016
- 2016-09-06 RU RU2016136040A patent/RU2646113C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653124B1 (en) * | 2000-11-10 | 2003-11-25 | Cytoplex Biosciences Inc. | Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation |
| RU2563171C1 (en) * | 2014-10-15 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Method of producing nanosized system for delivering azidothymidine triphosphate to mammalian cells |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2693491C2 (en) * | 2014-12-18 | 2019-07-03 | Омиа Интернэшнл Аг | Method of producing pharmaceutical delivery system |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Üzgün et al. | PEGylation improves nanoparticle formation and transfection efficiency of messenger RNA | |
| Sellner et al. | DNA nanotubes as intracellular delivery vehicles in vivo | |
| Gérard et al. | Dendrimer-enabled DNA delivery and transformation of Chlamydia pneumoniae | |
| Eroglu et al. | A nonviral pHEMA+ chitosan nanosphere-mediated high-efficiency gene delivery system | |
| Das et al. | A peptide nucleic acid–aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits Tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription | |
| US10155946B2 (en) | Particle-nucleic acid conjugates and therapeutic uses related thereto | |
| Bhosle et al. | Unifying in vitro and in vivo IVT mRNA expression discrepancies in skeletal muscle via mechanotransduction | |
| Khalil et al. | Functionalization of microparticles with mineral coatings enhances non-viral transfection of primary human cells | |
| RU2646113C1 (en) | Method for making system of delivery of nucleic acid fragments to mammalian cells | |
| Pan et al. | Efficient transfection by using PDMAEMA-modified SINWAs as a platform for Ca2+-dependent gene delivery | |
| Repkova et al. | Efficient inhibition of influenza A viral replication in cells by deoxyribozymes delivered by nanocomposites | |
| Amirkhanov et al. | Composites of peptide nucleic acids with titanium dioxide nanoparticles. IV. Antiviral activity of nanocomposites containing DNA/PNA duplexes | |
| Soliman et al. | Responsive polyelectrolyte complexes for triggered release of nucleic acid therapeutics | |
| Zhu et al. | A novel nonviral nanoparticle gene vector: Poly-L-lysine-silica nanoparticles | |
| RU2499045C1 (en) | Method for obtaining nanosized delivery system of fragments of nucleic acids and their analogues to cells of mammals | |
| S Levina et al. | TiO2∼ Deoxyribozyme nanocomposites as delivery system and efficient site-specific agents for cleavage of RNA targets | |
| Hasaneen et al. | Preparation, optimization, characterization and antimicrobial activity of chitosan and calcium nanoparticles loaded with Streptomyces Rimosus extracted compounds as drug delivery systems | |
| Luisetto et al. | Graphene and derivates: physico-chemical and toxicology properties in the mRNA vaccine manifacturing strategy | |
| RU2466188C2 (en) | Influenza a virus propagation inhibitor on basis of complex of titanium dioxide nanoparticles and oligonucleotide | |
| Asgatay et al. | Polynorbornene polycationic polymers as gene transfer agents: Influence of the counterion for in vitro transfection | |
| JP2005176830A (en) | Nucleic acid introduction carrier | |
| JPWO2005095621A1 (en) | Gene transfer regulation method and system using artificial magnetic material | |
| Dick et al. | Mineralized polyplexes for gene delivery: improvement of transfection efficiency as a consequence of calcium incubation and not mineralization | |
| US20100190257A1 (en) | Self-Assembly of a Cell-Microparticle Hybrid | |
| US20080261045A1 (en) | Composite and layered particles for efficient delivery of polyelectrolytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180907 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20220112 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |