RU2598273C2

RU2598273C2 - Производные инсулина, содержащие дополнительные дисульфидные связи

Info

Publication number: RU2598273C2
Application number: RU2012157683/10A
Authority: RU
Inventors: Петер МАДСЕН; Франтишек ХУБАЛЕК; Томас Бёрглум КЬЕЛЬДСЕН; Свенн ЛУДВИГСЕН
Original assignee: Ново Нордиск А/С
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2016-09-20
Also published as: AU2011269000A1; AU2011269000B2; US20140371140A1; CN102985440A; US9512195B2; US20130157938A1; JP5931857B2; AU2011269000C1; IL223288A0; MX337549B; ZA201209345B; BR112012033107A2; CN102985440B; CA2802510A1; MX2012014641A; KR20130036290A; WO2011161125A1; EP2585485A1; RU2012157683A; JP2013530974A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению производных инсулина, содержащих дополнительные дисульфидные связи, и может быть использовано в медицине. В человеческий инсулин вводят две цистеиновые замены, выбранные из группы А10С, В2С; А10С, В3С; и А10С, В4С и боковую цепь, которую присоединяют к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине. Изобретение позволяет получить производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем по сравнению с нативным человеческим инсулином. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 114 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производным инсулина, содержащим дополнительные дисульфидные связи, и к способам их получения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сахарный диабет представляет собой метаболическое расстройство, при котором частично или полностью утрачивается способность использовать глюкозу. При лечении сахарного диабета предлагали и использовали многие разновидности препаратов инсулина, такие как обычный инсулин, инсулин-изофан (обозначенный NPH), суспензии инсулин цинк (такие как Semilente®, Lente® и Ultralente®) и двухфазный инсулин-изофан.

Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, цепей А и В, которые содержат 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно. Цепи А и В взаимосвязаны двумя дисульфидными мостиками. Инсулин из большинства других видов является аналогичным, но может содержать замены аминокислот в некоторых положениях. В последнее десятилетие был разработан целый ряд аналогов человеческого инсулина. Они предназначены для конкретных профилей действия, т.е. быстродействующие или пролонгированного действия. Имеющиеся в продаже продукты, содержащие такие аналоги инсулина, включают Levemir®, NovoRapid®, Humalog®, Apidra® и Lantus®.

Человеческий инсулин быстро деградирует в полости желудочно-кишечного тракта действием многочисленных протеаз, ограничивающих его поглощение в систему кровообращения. Аналоги инсулина, которые являются гидрофильными и стабилизированными в отношении протеолитической деградации, демонстрируют большую биодоступность в животных моделях по сравнению с нативным инсулином.

Включение дисульфидных связей в белки является одним из природных способов улучшения стабильности белка; среди термофильных организмов была обнаружена корреляция между числом дисульфидных связей и максимальной температурой для роста, подразумевающая важность дисульфидных связей в стабилизации белка в средах с высокими темпеатурами (Mallick Р, et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9679-9684.; Ladenstein R, et al, 2006, FEBS J., 273, 4170-4185). Также имеется много примеров успешного конструирования дисульфидных связей в белках с сопутствующими увеличениями стабильности. Одна из сильнейших стабилизации была достигнута для РНКазы барназы (Clarke J., Fersht А., 1993, Biochem., 32, 4322-4329). Такая стабилизация осуществляется увеличением энергии активации, требующейся для разворачивания, или ограничением несвернутых конформаций белка и, посредством этого, снижением их конформационной энтропии (Расе C.N., 1990, Trends Biol. Sci., 14-17). Однако в этой формирующейся области исследования требуется узнать значительно больше. В настоящее время отсутствуют сообщения о сконструированных дисульфидных связях в инсулине.

Все еще имеется потребность в новых производных инсулина, которые являются стабильными.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производным инсулина, имеющим две или более чем две цистеиновые замены и боковую цепь, присоединенную к инсулину, где сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина, и сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине.

В одном аспекте получают производное инсулина по изобретению, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что (1) введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, и (2) производное инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином.

В одном аспекте получают производное инсулина по изобретению, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что (1) введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, и (2) производное инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином, и (3) производное инсулина имеет повышенную физическую стабильность относительно человеческого инсулина и/или производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

В одном аспекте получают производное инсулина по изобретению, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что (1) введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, (2) производное инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином, и (3) производное инсулина стабилизировано против протеолитической деградации.

Здесь также описан способ стабилизации производного инсулина, включающий замену двух или более чем двух аминокислот инсулина остатками цистеина и присоединение боковой цепи к инсулину, где

а. сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина и

б. сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине,

создавая, посредством этого, производное инсулина, содержащее одну или более чем одну дополнительную дисульфидную связь, не присутствующую в человеческом инсулине.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1: сравнение РК (фармакокинетических) профилей у крыс при внутривенном введении производного из примера 1 по сравнению с аналогичным производным без дополнительной дисульфидной связи.

Фиг.2: сравнение РК профилей у собак при внутривенном введении производного из примера 1 по сравнению с аналогичным производным без дополнительной дисульфидной связи.

Фиг.3: данные дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) производных инсулина по изобретению.

Фиг.4: данные дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) исходных аналогов инсулина.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении представлены новые производные инсулина, где в производных инсулина сконструированы дисульфидные связи.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет две или более чем две цистеиновых замены, и сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина.

В одном аспекте производное инсулина по изобретению имеет боковую цепь. В одном аспекте боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина. В одном аспекте боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет две или более чем две цистеиновых замены, сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина и боковая цепь, которая присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина как, например, в В-цепи.

В одном аспекте изобретения сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине.

Авторы данного изобретения обнаружили, что производные инсулина согласно изобретению имеют улучшенную физическую стабильность. Таким образом, было обнаружено, что у производных инсулина согласно изобретению снижается тенденция формировать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты аналогов инсулина, например, в результате воздействия на аналоги термо-механических стрессов и/или взаимодействия с поверхностями раздела и поверхностями, которые являются дестабилизирующими, такими как гидрофобные поверхности и поверхности раздела.

Человеческие производные инсулина согласно изобретению связываются с рецептором инсулина. Таким образом, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что производные человеческого инсулина согласно изобретению имеют и улучшенную физическую стабильность, и сохраняют связывание с рецептором инсулина.

В одном аспекте производные инсулина согласно изобретению, т.е. содержащие одну или более чем одну дополнительную дисульфидную связь, являются более пролонгированными, чем аналогичные производные инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. Под термином «более пролонгированный» здесь подразумевается то, что они имеют более длительный период полувыведения или, другими словами, инсулиновый эффект в течение длительного периода, т.е. большую продолжительность действия. Таким образом, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что производные инсулина, содержащие одну или более чем одну дисульфидную связь, могут иметь длительный период полувыведения или, другими словами, инсулиновый эффект в течение длительного периода, или пролонгированную продолжительность действия по сравнению с аналогичными производными инсулина с одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связью.

В одном аспекте производные инсулина по изобретению стабилизированы против протеолитической деградации, т.е. против быстрой деградации в желудочно-кишечном (ЖК) тракте или где-либо еще в организме. В одном аспекте производные инсулина по изобретению стабилизированы против протеолитической деградации относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

Производное инсулина, которое стабилизировано против протеолитической деградации, следует здесь понимать как производное инсулина, которое подвергается более медленной деградации одной или более чем одной протеазой относительно человеческого инсулина. В одном воплощении производное инсулина согласно изобретению подвергается более медленной деградации одной или более чем одной протеазой относительно человеческого инсулина. В другом воплощении изобретения производное инсулина согласно изобретению стабилизировано против деградации одним или более чем одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из следующих: пепсин (такой как, например, изоформы пепсин А, пепсин В, пепсин С и/или пепсин F), химотрипсин (такой как, например, изоформы химотрипсин А, химотрипсин В и/или химотрипсин С), трипсин, фермент, деградирующий инсулин (IDE), эластаза (такая как, например, изоформы эластаза I и/или II поджелудочной железы), карбоксипептидаза (например изоформы карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза А2 и/или карбоксипептидаза В), аминопептидаза, катепсин D и другие ферменты, присутствующие в экстрактах кишечника, полученных от крысы, свиньи или человека.

В одном воплощении производное инсулина согласно изобретению стабилизировано против деградации одним или более чем одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из следующих: химотрипсин, трипсин, фермент, деградирующий инсулин (IDE), эластаза, карбоксипептидазы, аминопептидазы и катепсин D. В другом воплощении производное инсулина согласно изобретению стабилизировано против деградации одним или более чем одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из: химотрипсина, карбоксипептидаз и IDE. В еще одном другом воплощении производное инсулина согласно изобретению стабилизировано против деградации одним или более чем одним ферментом, выбранным из: химотрипсина и IDE. В еще одном другом воплощении производное инсулина согласно изобретению стабилизировано против деградации одним или более чем одним ферментом, выбранным из: химотрипсина и карбоксипептидаз.

«Протеаза» или «протеазный фермент» представляет собой расщепляющий фермент, который деградирует белки и пептиды и который находится в разных тканях человеческого организма, таких как, например, желудок (пепсин), просвет кишок (химотрипсин, трипсин, эластаза, карбоксипептидазы и т.д.) или поверхности слизистых ЖК тракта (аминопептидазы, карбоксипептидазы, энтеропептидазы, дипептидилпептидазы, эндопептидазы и т.д.), печень (фермент, деградирующий инсулин, катепсин D и т.д.) и в других тканях.

T½ (период полувыведения) можно определять, как описано в примере 102, как меру протеолитической стабильности производного инсулина согласно изобретению в отношении протеазных ферментов, таких как химотрипсин, пепсин и/или карбоксипептидаза А, или в отношении смеси ферментов, таких как тканевые экстракты (из печени, почки, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки, толстой кишки, желудка и т.д.). В одном воплощении изобретения Т½ увеличивается относительно человеческого инсулина. В другом воплощении Т½ увеличивается относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 2 раза относительно человеческого инсулина. В еще одном другом воплощении T½ увеличивается по меньшей мере в 2 раза относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 3 раза относительно человеческого инсулина. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 3 раза относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В еще одном другом воплощении T½ увеличивается по меньшей мере в 4 раза относительно человеческого инсулина. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 4 раза относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В еще одном другом воплощении T½ увеличивается по меньшей мере в 5 раз относительно человеческого инсулина. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 5 раз относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 10 раз относительно человеческого инсулина. В еще одном другом воплощении Т½ увеличивается по меньшей мере в 10 раз относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную химическую стабильность. В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную физическую стабильность. В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную химическую и физическую стабильность.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную химическую и/или физическую стабильность относительно человеческого инсулина. В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную химическую и/или физическую стабильность относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

Термин «физическая стабильность» в том виде, как он здесь используется, относится к тенденции производного инсулина образовать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты белка в результате воздействия на белок термо-механических стрессов и/или взаимодействия с поверхностями раздела и поверхностями, которые являются дестабилизирующими, такими как гидрофобные поверхности и поверхности раздела. Физическая нестабильность, таким образом, включает конформационные изменения относительно человеческого инсулина, что включает потерю структуры более высокого порядка, агрегацию, фибрилляцию, осаждение и/или адсорбцию с поверхностями. Известно, что пептиды, такие как инсулин, склонны к нестабильности, например, из-за фибрилляции. Физическую стабильность раствора, содержащего производное инсулина, можно оценить традиционными способами, например, визуальной проверкой, нефелометрией и/или измерениями мутности после воздействия на раствор, которым заполнены подходящие контейнеры (например, картриджи или флаконы), механического/физического стресса (например встряхивания) при разных температурах в течение разных периодов времени. Визуальная проверка раствора проводится в точно сфокусированном свете с темным фоном. Мутность раствора характеризуется визуальным бальным ранжированием степени мутности, например, по шкале от 0 до 3 (раствор, не демонстрирующий мутность, соответствует визуальному бальному показателю 0, и раствор, демонстрирующий видимую мутность при дневном освещении, соответствует визуальному бальному показателю 3). Раствор классифицируется как физически нестабильный в отношении агрегации белка, когда он демонстрирует видимую мутность при дневном освещении. В качестве альтернативы, мутность раствора можно оценивать простыми измерениями мутности, хорошо известными специалисту. Физическую стабильность производного инсулина также можно оценивать посредством применения спектроскопического агента или зонда конформационного статуса производного инсулина. Зонд предпочтительно представляет собой маленькую молекулу, которая предпочтительно связывается с ненативным конформером белка. Одним примером низкомолекулярного спектроскопического зонда структуры белка является тиофлавин Т. Тиофлавин Т представляет собой флуоресцентный краситель, который широко использовался для детекции амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл, а возможно также и других конфигураций белка, тиофлавин Т дает новый максимум возбуждения при примерно 450 нм при и повышенное испускание при примерно 482 нм при связывании с фибриллярной формой белка. Несвязанный тиофлавин Т по существу не флуоресцирует при данных длинах волн. Физическую стабильность производных инсулина по изобретению, например, можно определить, как описано в примере 109.

В качестве зондов изменений структуры белка от нативных до ненативных состояний можно использовать другие маленькие молекулы. Например, зонды в виде «гидрофобной заплатки» (hydrophobic patch), которые предпочтительно связываются с экспонированными гидрофобными участками белка. Гидрофобные участки обычно скрыты в третичной структуре белка в его нативном состоянии, но становятся экспонированными по мере того, как белок начинает разворачиваться или денатурировать. Примерами данных низкомолекулярных спектроскопических зондов являются ароматические гидрофобные красители, такие как антрацен, акридин, фенантролин или тому подобное. Другие спектроскопические зонды представляют собой комплексы металл-аминокислота, такие как комплексы металла кобальт с гидрофобными аминокислотами, такими как фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин и валин или тому подобное.

Термин «химическая стабильность» производного инсулина в том виде, как он здесь используется, относится к химическим ковалентным изменениям в структуре белка, приводящим к образованию продуктов химической деградации с потенциально меньшей биологической активностью и/или потенциально повышенными иммуногенными свойствами по сравнению со структурой нативного белка, и включает избегание деградации ковалентных связей, такой как гидролиз, рацемизация, окисление или поперечное связывание. Могут образоваться разные продукты химической деградации, в зависимости от типа и природы нативного белка и среды, в которую экспонировано производное инсулина. Устранения химической деградации вероятнее всего нельзя полностью избежать, и часто на протяжении хранения и применения белкового препарата наблюдаются возрастающие количества продуктов химической деградации, как хорошо известно специалисту в данной области. Большинство белков склонно к дезаминированию, процессу, в котором гидролизуется амидная группа боковой цепи в глутамине или аспарагине с образованием свободной карбоновой кислоты. Остатки аспарагина и аспарагиновой кислоты могут дополнительно образовать продукты деградации на основе изоаспарагиновой кислоты. Другие пути деградации включают образование высокомолекулярных продуктов превращения, где две или более чем две молекулы белка ковалентно связаны друг с другом через трансамидирование и/или дисульфидные взаимодействия, приводящие к образованию ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов деградации (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Окисление (например, остатков метионина) и рацемизация могут быть упомянуты как другой вариант химической деградации. Химическую стабильность производного инсулина можно оценить измерением количества продуктов химической деградации в разные моменты времени после воздействия разных условий окружающей среды (образование продуктов деградации часто может быть ускорено, например, увеличением температуры). Отдельные продукты деградации часто определяют разделением продуктов деградации, в зависимости от размера молекулы и/или заряда, например, с использованием комбинации хроматографических (например гель-фильтрация-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), ВЭЖХ-ОФ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) или ИО-ВЭЖХ (ионообменная ВЭЖХ)) и спектроскопических способов (разные способы масс-спектрометрии), иногда в комбинациях с химической/ферментативной фрагментацией.

В одном воплощении производное инсулина по изобретению имеет улучшенную химическую стабильность относительно химической стабильности производного инсулина с одной или боле чем одной дополнительной дисульфидной связью при тестировании, как описано в примерах.

В одном воплощении производное инсулина по изобретению имеет повышенную гидрофильность относительно гидрофильности человеческого инсулина и/или производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи при тестировании на гидрофобность, как известно специалисту и, например, описано в примере 101.

В одном воплощении производное инсулина по изобретению имеет слабую тенденцию или не имеет тенденции к агрегации. Тенденция к агрегации предпочтительно значимо улучшается относительно тенденции к агрегации человеческого инсулина и/или производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи при тестировании в анализе с тиофлавином.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению имеет улучшенную термодинамическую стабильность, такую как, например, стабильность сворачивания, конформационная стабильность и/или более высокая температура плавления.

При использовании здесь говорят, что производное инсулина имеет улучшенную «термодинамическую стабильность», если для денатурации указанного производного требуется более высокий уровень стресса, как, например, более высокая температура и/или более высокая концентрация денатурирующего агента по сравнению с человеческим инсулином или производным инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

Конформационную стабильность можно оценивать круговым дихроизмом и ЯМР (ядерный магнитный резонанс) как, например, описано Hudson and Andersen, Peptide Science, vol 76 (4), pp.298-308 (2004). Температуру плавления следует понимать как температуру, при которой структура инсулина обратимо или необратимо изменяется. Более высокая температура плавления соответствует более стабильным структурам. Температуру плавления можно определять, например, оценкой комформационной стабильности круговым дихроизмом и/или ЯМР как функцию температуры или дифференциальной сканирующей калориметрией. Термодинамическую стабильность также можно определять CD (круговой дихроизм) спектроскопией и/или ЯМР в присутствии возрастающей концентрации денатурирующего агента, такого как, например, гуанидиния гидрохлорид. Свободную энергию разворачивания, как описано ранее (Kaarsholm, N.C., et al, 1993, Biochemistry, 32, 10773-8), можно определять из таких экспериментов. При денатурации белка отрицательный CD в интервале дальнего УФ (ультрафиолетовый) излучения (240-218 нм) постепенно уменьшается, что согласуется с потерей упорядоченной вторичной структуры, которая сопровождает разворачивание белка (Holladay et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta, 494, 245-254; Melberg and Johnson, 1990, Biochim. Biophys. Acta, 494, 245-254). CD спектр инсулина в интервале ближнего УФ излучения (330-250 нм) отражает окружение тирозинового хромофора с вкладом от дисульфидных связей (Morris et al., 1968, Biochim. Biophys. Acta., 160, 145-155; Wood et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta, 160, 145-155; Strickland & Mercola, 1976, Biochemistry, 15, 3875-3884). Ранее из таких исследований было рассчитано, что свободная энергия разворачивания инсулина составляет 4,5 ккал/моль (примерно 18,84 кДж/моль) (Kaarsholm, N.C., et al, 1993, Biochemistry, 32, 10773-8).

CD спектр инсулина в интервале ближнего УФ излучения (330-250 нм) отражает окружение тирозинового хромофора с вкладом от дисульфидных связей. Поскольку остатки тирозина представляют собой часть поверхности димера инсулина, изменения молярной эллиптичности в данной области (особенно при 276 нм) отражают состояние ассоциации инсулина. Другим способом измерения состояния ассоциации инсулина является применение гель-фильтрации при недиссоциирующих условиях, как известно в данной области и описано в примерах.

Производное инсулина согласно изобретению может иметь по существу такую же или повышенную активность in vivo относительно исходного инсулина. В одном аспекте производное инсулина по изобретению имеет по существу такую же активность in vivo относительно исходного инсулина. В одном аспекте производное инсулина по изобретению имеет повышенную активность in vivo относительно исходного инсулина.

Стандартные анализы для измерения активности инсулина in vivo известны специалисту в данной области и включают анализы, описанные в примерах, такие как: активность производных инсулина по изобретению относительно человеческого инсулина, внутривенные анализы при стационарной фиксации, такие как фармакокинетика у крыс и РК (фармакокинетика) у крыс после внутрикишечной инъекции, эффект снижения содержания глюкозы в крови и внутривенные анализы РК у крыс.

Производное инсулина согласно изобретению может иметь по существу такую же или повышенную активность in vitro относительно исходного инсулина. В одном аспекте производное инсулина по изобретению имеет по существу такую же активность in vitro относительно исходного инсулина. В одном аспекте производное инсулина по изобретению имеет повышенную активность in vitro относительно исходного инсулина.

Стандартные анализы для измерения активности инсулина in vitro известны специалисту в данной области и включают, среди прочих, приведенные ниже анализы in vitro:

(1) радиорецепторные анализы инсулина, в которых относительная активность инсулина определяется как отношение инсулина к производному инсулина, требующееся для вытеснения 50% ¹²⁵I-инсулина, специфично связанного с рецепторами инсулина, присутствующими на клеточных мембранах, например, во фракции плазматической мембраны печени крыс;

(2) анализы липогенеза, проведенные, например, с адипоцитами крыс, в которых относительная активность инсулина определяется как отношение инсулина к производному инсулина, требующееся для достижения 50% от максимального превращения [3-³H]глюкозы в вещество, экстрагируемое органическими растворителями (т.е. липиды); и

(3) анализы окисления глюкозы в выделенных жировых клетках, в которых относительная активность производного инсулина определяется как отношение инсулина к производному инсулина, требующееся для достижения 50% от максимального превращения глюкозы-1-[¹⁴C] до [¹⁴CO₂].

Дисульфидные связи получаются путем связывания двух тиольных групп, и здесь их следует понимать как связь между двумя атомами серы, т.е. структуру, имеющую общую организацию связей R-S-S-R. Дисульфидные связи также могут называться соединительными дисульфидными связями, SS-связями или дисульфидными мостиками. Дисульфидная связь создается введением двух остатков аминокислоты цистеина в пептид с последующим окислением двух тиольных групп до дисульфидной связи. Такое окисление можно проводить химически (как известно специалистам в данной области), или оно может происходить во время экспрессии инсулина, например, в дрожжах.

При введении остатков цистеина в производное инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого аналога инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине. Например, при размещении двух новых остатков цистеина, окружение новых остатков цистеина в трехмерной структуре является таким, что дисульфидная связь может образоваться между двумя новыми остатками цистеина.

Число дисульфидных связей в белке (таком как инсулин) можно легко определить точными измерениями интактной массы, как описано, например, в Примерах. Организацию связей дисульфидными связями можно подтвердить (определить) стандартными методиками, известными в данной области, такими как пептидное картирование. Общая стратегия картирования дисульфидных связей в пептиде инсулина включает следующие стадии: 1) фрагментация невосстановленного инсулина на пептиды, связанные дисульфидными связями, содержащие, если возможно, только одну дисульфидную связь на пептид. Выбранные условия также являются такими, что избегается реаранжировка дисульфидных связей, 2) разделение пептидов, связанных дисульфидными связями, друг от друга. 3) Идентификация остатков цистеина, участвующих в отдельных дисульфидных связях.

Человеческий инсулин типично расщепляется протеазой Glu-C, дающей пептид I, содержащий две дисульфидные связи (А6-А11 и А7-В7), и пептид II, содержащий одну дисульфидную связь (А20-В19). Для недвусмысленного приписывания дисульфидных связей в пептиде I необходима дополнительная фрагментация. Для гидролиза CysCys связей в белках ранее использовали кислотный гидролиз (Ryle at al., 1955 Biochem J. 60, 541-56), расщепление по Эдману вручную (Kumazaki Т, Ishii, S. 1990 J. Biochem (Tokyo) 17, 414-9) или длительное расщепление термолизином (Ota M, Ariyoshi, Y., 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1956-7). Альтернативным способом приписывания дисульфидных связей в пептиде I является частичное восстановление трискарбоксиэтилфосфином (восстановление дисульфидной связи А7-В7), алкилирование восстановленных остатков цистеина с последующим полным восстановлением и алкилирование цистеина с использованием другой алкильной группы (Yen, T.-Y., Yan, H., Macher, В., 2001 J Mass Spectrom. 37, 15-30). Стратегия картирования дисульфидов инсулинов, содержащих дополнительные дисульфидные связи, в принципе, является такой же, как описано выше для человеческого инсулина, с корректировкой для каждого аналога таким способом, который приспособлен для новой дисульфидной связи. Определение структуры инсулина ЯМР или рентгеновской кристаллографией является альтернативным подходом для подтверждения организации связывания дисульфидными связями. Условия для определения структур ЯМР и/или кристаллографией были описаны ранее и являются известными в данной области.

В одном аспекте изобретения предложено производное инсулина, которое имеет боковую цепь и по меньшей мере две цистеиновых замены, когда сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина.

Под термином «цистеиновая замена» здесь подразумевается замена аминокислоты, которая присутствует в человеческом инсулине, цистеином. Например, каждый из изолейцина в положении 10 в цепи А (IleA10) и глутамина в положении 4 цепи В человеческого инсулина (GlnB4) может быть заменен на остаток цистеина. Под термином «замена другим остатком аминокислоты» здесь подразумевается замена аминокислоты, которая присутствует в человеческом инсулине, аминокислотой, которая не является цистеином.

Термин «человеческий инсулин» в том виде, как он здесь используется, означает человеческий гормон инсулин, двухмерные и трехмерные структуры и свойства которого хорошо известны. Трехмерная структура человеческого инсулина была определена, например, ЯМР и рентгеновской кристаллографией при многих разных условиях, и многие из этих структур внесены в банк данных белков (http://www.rcsb.org). Неограничивающим примером структуры человеческого инсулина является структура Т6 (http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureld=1MSO) и структура R6 (http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureld=1EV3). Человеческий инсулин имеет две полипептидные цепи, названные А-цепь и В-цепь. А-цепь представляет собой пептид из 21 аминокислоты, и В-цепь представляет собой пептид из 30 аминокислот, причем две цепи соединены дисульфидными связями: первым мостиком между цистеином в положении 7 А-цепи и цистеином в положении 7 В-цепи, и вторым мостиком между цистеином в положении 20 А-цепи и цистеином в положении 19 В-цепи. Третий мостик присутствует между цистеинами в положении 6 и 11 А-цепи. Таким образом, «производное инсулина, в котором сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина» следует здесь понимать как производное инсулина, содержащее три дисульфидных связи человеческого инсулина, т.е. дисульфидную связь между цистеином в положении 7 А-цепи и цистеином в положении 7 В-цепи, дисульфидную связь между цистеином в положении 20 А-цепи и цистеином в положении 19 В-цепи и дисульфидную связь между цистеинами в положении 6 и 11 А-цепи.

В человеческом организме гормон инсулин синтезируется в виде одноцепочечного предшественника проинсулина (препроинсулина), состоящего из препептида из 24 аминокислот, с последующим проинсулином, содержащим 86 аминокислот в конфигурации: препептид-В-Arg Arg-C-Lys Arg-А, в которой С представляет собой соединительный пептид из 31 аминокислоты. Arg-Arg и Lys-Arg представляют собой сайты расщепления для отщепления соединительного пептида от цепей А и В.

В одном аспекте изобретения предложено производное инсулина, которое имеет две или более чем две цистеиновых замены, где сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина, и где по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из А9, А10 и А12 А-цепи, заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3, В4, В5 и В6 В-цепи заменен цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении B30. В одном аспекте изобретения аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30. В одном аспекте изобретения по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из А9, А10 и А12 А-цепи, заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3, В4, В5 и В6 В-цепи, заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из А14, А21, В1, В3, В10, В16, В22, В25, В26, В27, В28, В29, В30, В31, В32, заменен аминокислотой, которая не является цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30. Понятно, что когда В1 или В3 представляет собой цистеин, та же самая аминокислота не может быть аминокислотой, которая не является цистеином, тогда как если, например, В1 представляет собой цистеин, В3, согласно данному аспекту изобретения, может быть заменен аминокислотой, которая не является цистеином, и наоборот. В одном аспекте изобретения аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3 и В4 В-цепи, заменен цистеином, возможно по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен аминокислотой, которая не является цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30. В одном аспекте изобретения аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, возможно по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен аминокислотой, которая не является цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30. В одном аспекте изобретения аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении В3 В-цепи заменен цистеином, возможно по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен аминокислотой, которая не является цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30. В одном аспекте изобретения аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении В4 В-цепи заменен цистеином, возможно по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен аминокислотой, которая не является цистеином, боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

В одном аспекте получают производные инсулина согласно изобретению, где удален аминокислотный остаток в положении В30.

Дополнительная дисульфидная связь, полученная по изобретению, может соединять два цистеина той же самой цепи, т.е. два цистеина в А-цепи или два цистеина в В-цепи инсулина, или соединять цистеин в А-цепи с цистеином в В-цепи инсулина. В одном аспекте получают производное инсулина согласно изобретению, где по меньшей мере одна дополнительная дисульфидная связь связывает два цистеина в А-цепи или связывает два цистеина в В-цепи. В одном аспекте получают производное инсулина согласно изобретению, где по меньшей мере одна дополнительная дисульфидная связь связывает цистеин в А-цепи с цистеином в В-цепи.

При использовании здесь термин «дополнительные дисульфидные связи» означает одну или более чем одну дисульфидную связь, которая не присутствует в человеческом инсулине.

В одном аспекте изобретения замены на цистеин осуществляются в двух положениях производного инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:

А10С, В1С;

А10С, В2С;

А10С, В3С;

А10С, В4С;

А10С, В5С; и

В1С, В4С.

В одном аспекте изобретения замены на цистеин осуществляются в двух положениях аналога инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:

А10С, В1С;

А10С, В2С;

А10С, В3С;

А10С, В4С; и

В1С, В4С.

А10С, В1С;

А10С, В2С;

А10С, В3С; и

А10С, В4С.

А10С, В3С; и

А10С, В4С.

В одном аспекте изобретения замены на цистеин осуществляются в двух положениях аналога инсулина, где данными положениями являются А10С и В3С.

В одном аспекте изобретения замены на цистеин осуществляются в двух положениях аналога инсулина, где данными положениями являются А10С и В4С.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: А8Н, А14Е, А14Н, A18L, A21G, B1G, B3Q, В3Е, В3Т, B3V, B3K, B3L, В16Н, В16Е, В22Е, B24G, В25А, В25Н, B25N, В27Е, B27D, В27Р, B28D, В28Е, B28K, desB1, desB24, desB25, desB27 и desB30. В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: А8Н, А14Е, A21G, desB1, B1G, B3Q, В3Е, В10Е, В16Н, В16Е, B24G, В25Н, В25А, B25N, B25G, desB27, В27Е, В28Е, B28D и desB30.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: A21G, desB1, B1G, B3Q, B3S, В3Т и В3Е.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: А8Н, А14Е, А14Н, В16Н, В10Е, В16Е, В25Н, В25А, B25N, В27Е, В27Р, desB27 и В28Е.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: В28Е, B28D, desB27 и А14Е.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат одну или более чем одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: B3K, В29Е, В27Е, B27D, desB27, В28Е, B28D, B28K и В29Р.

В одном аспекте изобретения производные инсулина по изобретению, помимо цистеиновых замен, содержат С-пептид, соединяющий С-конец В-цепи с N-концом А-цепи (с образованием так называемого одноцепочечного производного инсулина). В одном воплощении изобретения исходный инсулин выбран из группы, состоящей из одноцепочечных аналогов инсулина. В одном воплощении изобретения исходный инсулин выбран из группы, состоящей из одноцепочечных аналогов инсулина, перечисленных в WO2007096332, WO2005054291 или WO2008043033, причем данные патенты конкретно включены сюда посредством ссылки.

В одном аспекте изобретения получают производное инсулина, которое содержит две цистеиновых замены, приводящие к образованию одной дополнительной дисульфидной связи относительно человеческого инсулина.

«Инсулин» согласно изобретению здесь следует понимать как человеческий инсулин, desB30 человеческий инсулин или аналог инсулина.

Термин «пептид инсулина» в том виде, как он здесь используется, означает пептид, который либо представляет собой человеческий инсулин, desB30 человеческий инсулин, либо его аналог или производное с инсулиновой активностью.

Термин «аналог инсулина» в том виде, как он здесь используется, означает модифицированный инсулин, где один или более чем один аминокислотный остаток инсулина был заменен другими аминокислотными остатками и/или где один или более чем один аминокислотный остаток был удален из инсулина, и/или где один или более чем один аминокислотный остаток был добавлен и/или вставлен в инсулин.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению представляет собой аналог инсулина (как определено выше), содержащий одну или более чем одну дополнительную дисульфидную связь(связи) относительно человеческого инсулина и содержащий боковую цепь, присоединенную к эпсилон аминогруппе остатка лизина, присутствующего в В-цепи молекулы.

Подразумевается, что термин «производное инсулина» означает инсулин (как опредлено выше), который был химически дериватизирован. Это означает, что с инсулином была связана боковая цепь (как здесь определено). В самом широком смысле боковая цепь может быть любого типа, такого как PEG (полиэтиленгликоль), но, более предпочтительно, боковая цепь содержит жирную кислоту или группировку жирной дикислоты.

Подразумевается, что термин «исходный инсулин» в том виде, как он здесь используется, означает инсулин с одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связью, т.е. человеческий инсулин, desB30 человеческий инсулин или аналог инсулина с одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связью, перед дериватизацией боковой цепью.

Подразумевается, что термин «производное инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи» в том виде, как он здесь используется, означает производное инсулина, имеющее три дисульфидные связи, присутствующие в природе в человеческом инсулине, т.е. первый мостик между цистеином в положении 7 А-цепи и цистеином в положении 7 В-цепи, второй мостик между цистеином в положении 20 А-цепи и цистеином в положении 19 В-цепи и третий мостик между цистеинами в положении 6 и 11 А-цепи, и боковую цепь, присоединенную к инсулину, но не дополнительные дисульфидные связи/мостики.

Подразумевается, что термин «боковая цепь» используется здесь для обозначения жирной кислоты или дикислоты (возможно через один или более чем один линкер), связанной с исходным инсулином по изобретению, как, например, с эпсилон аминогруппой лизина, присутствующего в В-цепи исходного инсулина. Часть боковой цепи в виде жирной кислоты или дикислоты придает аффинность к сывороточному альбумину, и линкеры действуют либо для того, чтобы модифицировать (например, увеличить) аффинность в отношении альбумина, модифицировать растворимость производного инсулина и/или модулировать (увеличить/снизить) аффинность производного инсулина в отношении рецептора инсулина.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению представляет собой аналог инсулина, содержащий по меньшей мере две цистеиновых замены, где аналог инсулина ацилирован по одной или более чем одной аминокислоте пептида инсулина.

Здесь термин «ацилированный инсулин» охватывает модификацию человеческого инсулина или аналога инсулина путем присоединения к инсулину одной или более чем одной ацильной группировки через линкер.

Неограничивающий пример производных инсулина в форме ацилированных аналогов инсулина, которые могут быть модифицированы цистеиновыми заменами согласно изобретению, можно найти, например, в WO 2009/115469 А1.

В одном воплощении производное инсулина согласно изобретению представляет собой модифицированный инсулин, где два аминокислотных остатка были заменены остатками цистеина, была введена боковая цепь и возможно была удалена аминокислота в положении В30, относительно аминокислотной последовательности человеческого инсулина.

В одном воплощении производное инсулина согласно изобретению содержит боковую цепь и от 2 до 9 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно, производное инсулина согласно изобретению содержит боковую цепь и от 2 до 8 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно - боковую цепь и от 2 до 7 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно - боковую цепь и от 2 до 6 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно - боковую цепь и от 2 до 5 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно - боковую цепь и от 2 до 4 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, альтернативно - боковую цепь и от 2 до 3 мутаций относительно человеческого инсулина, где по меньшей мере две замены делаются на остатки цистеина, или альтернативно - боковую цепь и 2 цистеиновых замены относительно человеческого инсулина.

Модификации в молекуле инсулина обозначены указанием цепи (А или В), положения и одно или трехбуквенного кода аминокислотного остатка, заменяющего нативный аминокислотный остаток.

Здесь термины, подобные «А1», «А2» и «A3» и т.д., указывают аминокислоту в положении 1, 2 и 3 и т.д. соответственно в цепи А инсулина (считая от N конца). Аналогично, термины, подобные В1, В2 и В3 и т.д., указывают аминокислоту в положении 1, 2 и 3 и т.д. соответственно в цепи В инсулина (считая от N-конца). При использовании однобуквенного кода для аминокислот, термин, подобный А10С, обозначает, что аминокислота в положении А10 представляет собой цистеин. При использовании трехбуквенного кода для аминокислот, соответствующим выражением является A10Cys.

Под "desB30", "В(1-29)" или "desThrB30" подразумевается цепь В природного инсулина или его аналога, в которой отсутствует аминокислота В30 (треонин, Thr), и «А(1-21)» означает цепь А природного инсулина. Таким образом, например, А10С, В1С, desB30 человеческий инсулин или альтернативно A10Cys, B1Cys, desB30 человеческий инсулин (или альтернативно CysA10, CysB1, desThrB30 человеческий инсулин) представляет собой аналог человеческого инсулина, где аминокислота в положении 10 цепи А заменена цистеином, аминокислота в положении 1 цепи В заменена цистеином, и аминокислота в положении 30 (треонин, Thr) в цепи В удалена.

Здесь наименование пептидов или белков осуществляется согласно следующим принципам: названия даются в виде мутаций и модификаций (таких как ацилирования) относительно исходного пептида или белка, такого как человеческий инсулин. Для наименования ацильной группировки наименование осуществляется согласно номенклатуре IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии), а в других случаях - при помощи номенклатуры пептидов. Например, наименованием ацильной группировки:

может быть, например, "октадекандиоил-γGlu-OEG-OEG", "октадекандиоил-gGlu-OEG-OEG", "октадекандиоил-gGlu-2xOEG" или "17-карбоксигептадеканоил-γGlu-OEG-OEG", где

OEG представляет собой сокращенное обозначение аминокислотного остатка, 8-амино-3,6-диоксаоктаноевой кислоты, -NH(СН₂)₂O(СН₂)₂OCH₂CO-, и γGlu (или gGlu) представляет собой сокращенное обозначение аминокислоты - гамма L-глутаминовой кислоты.

Например, инсулин из примера 1 (с последовательностью/структурой, приведенной ниже) назван "А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K (N^εоктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин" для указания того, что аминокислота в положении А10, I в человеческом инсулине, была мутирована до С; А14, Y в человеческом инсулине, была мутирована до Е, аминокислота в положении В4, Q в человеческом инсулине, была мутирована до С; аминокислота в положении В25, F в человеческом инсулине, была мутирована до Н; аминокислота в положении В29, K в человеческом инсулине, была модифицирована ацилированием по эпсилон азоту в остатке лизина В29, обозначенном N^ε, остатком октадекандиоил-γGlu-OEG-OEG, и аминокислота в положении В30, Т в человеческом инсулине, была удалена. Звездочки в формуле, приведенной ниже, указывают то, что рассматриваемый остаток отличается (т.е. мутирован) по сравнению с человеческим инсулином. Дисульфидные связи в том виде, в котором они находятся в человеческом инсулине, показаны с атомами серы, и дополнительная дисульфидная связь по изобретению показана линией.

Кроме того, инсулины по изобретению также можно назвать согласно номенклатуре IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC). Согласно данной номенклатуре приведенному выше ацилированному инсулину с дополнительным дисульфидным мостиком приписывается следующее наименование:

N{эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий).

Здесь термин «аминокислотный остаток» представляет собой аминокислоту, у которой из карбоксильной группы была удалена гидроксильная группа и/или у которой из аминогруппы был удален атом водорода.

В одном аспекте изобретения производное инсулина согласно изобретению содержит ацильную группу, например, на ε-аминогруппе остатка Lys аминокислотной последовательности инсулина. В одном аспекте производное инсулина содержит остаток, связывающий альбумин, т.е. остаток, который в условиях in vivo связывается с альбумином при присоединении к пептиду или белку.

В одном аспекте остаток, связывающий альбумин, представляет собой липофильный остаток. В другом аспекте липофильный остаток присоединен к аминокислотной последовательности инсулина через линкер.

В другом аспекте изобретения остаток, связывающий альбумин, является отрицательно заряженным при физиологическом рН. В другом аспекте изобретения остаток, связывающий альбумин, содержит группу, которая может быть отрицательно заряженной. Одна предпочтительная группа, которая может быть отрицательно заряженной, представляет собой карбоксильную группу.

В одном аспекте остаток, связывающий альбумин, представляет собой остаток α,ω-жирной дикислоты.

В другом аспекте изобретения остаток α,ω-жирной дикислоты липофильного остатка имеет от 6 до 40 атомов углерода, от 8 до 26 атомов углерода или от 8 до 22 атомов углерода, или от 14 до 22 атомов углерода, или от 16 до 22 атомов углерода, или от 16 до 20 атомов углерода, или от 16 до 18 атомов углерода, или 16 атомов углерода, или 18 атомов углерода, или 20 атомов углерода, или 22 атома углерода.

В другом аспекте изобретения остаток, связывающий альбумин, представляет собой ацильную группу алкан-α,ω-дикарбоновой кислоты с прямой или разветвленной цепью. В другом аспекте остаток, связывающий альбумин, представляет собой ацильную группу алкан-α,ω-дикарбоновой кислоты с прямой или разветвленной цепью, который включает аминокислотную часть, такую как, например, гамма-Glu часть. В еще одном другом аспекте остаток, связывающий альбумин, представляет собой ацильную группу алкан-α,ω-дикарбоновой кислоты с прямой или разветвленной цепью, который включает, две аминокислотные части, такие как, например, гамма-Glu часть и часть, представляющую собой 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (OEG). В еще одном другом аспекте остаток, связывающий альбумин, представляет собой ацильную группу алкан-α,ω-дикарбоновой кислоты с прямой или разветвленной цепью, который включает больше аминокислотных частей, таких как, например, одну гамма-Glu часть и последовательные части, представляющие собой 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (OEG).

В одном воплощении ацильная группировка, присоединенная к исходному аналогу инсулина, имеет общую формулу:

где n равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 3; m равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 10; p равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 10; Acy представляет собой жирную кислоту или жирную дикислоту, содержащую от примерно 8 до примерно 24 атомов углерода; АА1 представляет собой остаток нейтральной линейной или циклической аминокислоты, АА2 представляет собой остаток кислой аминокислоты; АА3 представляет собой остаток нейтральной алкиленгликольсодержащей аминокислоты; порядок, в котором АА1, АА2 и АА3 появляются в формуле, может независимо взаимоизменяться; АА2 может встречаться в формуле несколько раз (например, Acy-АА2-АА3₂-АА2-); АА2 может встречаться в формуле независимо (= быть отличным) несколько раз (например, Acy-АА2-АА3₂-АА2-); соединения между Acy, АА1, АА2 и/или АА3 представляют собой амидные (пептидные) связи, которые формально могут быть получены удалением атома водорода или гидроксильной группы (воды) от каждого из Acy, АА1, АА2 и АА3; и присоединение к инсулину, стабилизированному в отношении протеазы, может осуществляться от C-терминального конца остатка АА1, АА2 или АА3 в ацильной группировке формулы (I) или от одной из боковых цепей остатка АА2, присутствующего в группировке формулы (I).

В другом воплощении ацильная группировка, присоединенная к исходному аналогу инсулина, имеет общую формулу Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- (I), где АА1 выбран из Gly, D- или L-Ala, βAla, 4-аминомасляной кислоты, 5-аминовалериановой кислоты, 6-аминогексановой кислоты, D- или L-Glu-α-амида, D- или L-Glu-γ-амида, D- или L-Asp-α-амида, D- или L-Asp-β-амида, или группы одной из формул:

из которой был удален атом водорода и/или гидроксильная группа, и где q равен 0, 1, 2, 3 или 4 и, в данном воплощении, АА1, в качестве альтернативы, может представлять собой 7-аминогептановую кислоту или 8-аминооктановую кислоту.

В другом воплощении ацильная группировка, присоединенная к исходному аналогу инсулина, имеет общую формулу Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- (I), где АА1 является таким, как определено выше, и АА2 выбран из L- или D-Glu, L- или D-Asp, L- или D-гомо-Glu или любой из следующих:

из которой был удален атом водорода и/или гидроксильная группа, и где стрелки указывают точку присоединения к аминогруппе АА1, АА2, АА3 или к аминогруппе инсулина, стабилизированного в отношении протеазы.

В одном аспекте остаток нейтральной циклической аминокислоты, обозначенный АА1, представляет собой аминокислоту, содержащую насыщенное 6-членное карбоциклическое кольцо, возможно содержащее гетероатом азота, и предпочтительно кольцо представляет собой циклогексановое кольцо или пиперидиновое кольцо. Предпочтительно молекулярная масса данной нейтральной циклической аминокислоты находится в интервале от примерно 100 до примерно 200 Да.

Кислотный аминокислотный остаток, обозначенный АА2, представляет собой аминокислоту с молекулярной массой вплоть до примерно 200 Да, содержащую две карбоксильные группы и одну первичную или вторичную аминогруппу. В качестве альтернативы, кислотный аминокислотный остаток, обозначенный АА2, представляет собой аминокислоту с молекулярной массой вплоть до примерно 250 Да, содержащую одну карбоксильную группу и одну первичную или вторичную сульфонамидную группу.

Нейтральный алкиленгликольсодержащий аминокислотный остаток, обозначенный АА3, представляет собой алкиленгликольную группировку, возможно олиго- или полиалкиленгликольную группировку, содержащую на одном конце функциональную карбоксильную группу и на другом конце - функциональную аминогруппу.

Термин алкиленгликольная группировка здесь охватывает моноалкиленгликольные группировки, а также олигоалкиленгликольные группировки. Моно- и олигоалкиленгликоли включают цепи на основе моно- и олигоэтиленгликоля, на основе моно- и олигопропиленгликоля и на основе моно- и олигобутиленгликоля, т.е. цепи, которые основаны на повторяющейся единице -CH₂CH₂O-, -CH₂CH₂CH₂O- или -CH₂CH₂CH₂CH₂O-. Алкиленгликольная группировка является монодисперсной (с хорошо определенной длиной / молекулярной массой). Моноалкиленгликольные группировки содержат на каждом конце разные группы, содержащие -OCH₂CH₂O-, -OCH₂CH₂CH₂O- или -OCH₂CH₂CH₂CH₂O-.

Как здесь упомянуто, порядок, в котором АА1, АА2 и АА3 появляются в ацильной группировке формулы (I) (Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-) может независимо взаимоизменяться. Следовательно, формула Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- также охватывает группировки, подобные, например, формуле Acy-AA2_m-AA1_n-AA3_p-, формуле Acy-АА2-AA3_n-АА2- и формуле Acy-AA3_p-AA2_m-AA1_n-, где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p являются такими, как здесь определено.

Как здесь упомянуто, соединения между группировками Acy, АА1, АА2 и/или АА3 формально получены образованием амидной связи (пептидной связи) (-CONH-) путем удаления воды из исходных соединений, из которых они формально построены. Это означает то, что для получения полной формулы для ацильной группировки формулы (I) (Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-, где Acy, АА1, АА2, АА3, n, m и p являются такими, как здесь определено) формально нужно взять соединения приведенные для терминов Acy, АА1, АА2 и АА3, и удалить из них водород и/или гидроксил и, формально, соединить строительные блоки, полученные таким способом, на свободных концах, полученных таким способом.

Неограничивающие конкретные примеры ацильных группировок формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-, которые могут присутствовать в ацилированных аналогах инсулина по данному изобретению, перечислены в WO 2009/115469 А1, стр.27-43:

Любые из приведенных выше, неограничивающих конкретных примеров ацильных группировок формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- могут быть присоединены к эпсилон аминогруппе остатка лизина, присутствующего в любом из приведенных выше неограничивающих конкретных примеров исходных аналогов инсулина, давая, посредством этого, дополнительные конкретные примеры ацилированных аналогов инсулина по данному изобретению.

Исходные аналоги инсулина могут быть превращены в ацилированные инсулины, содержащие дополнительные дисульфидные связи по данному изобретению, путем введения желательной группы формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- в остаток лизина. Желательную группу формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p- можно вводить любым удобным способом, и для таких реакций в предшествующем уровне техники раскрыто много способов. Больше подробностей будет указано в приведенных здесь примерах.

В одном аспекте изобретения сайты цистеиновых замен выбраны таким способом, что производное человеческого инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином. Желательные биологические активности известны специалисту в данной области и включают, например, связывание с рецептором инулина, связывание с рецептором IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), активность in vitro, активность in vivo, как, например, описано в Примерах 106 и 107.

В одном аспекте получены производные инсулина согласно изобретению, где рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 1% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 3% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 5% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 10% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 15% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 20% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

В одном аспекте получают производные инсулина согласно изобретению, где рецепторное связывание с инсулиновым рецептором усиливается. В одном аспекте получают производные инсулина согласно изобретению, где рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 110% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 120% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 130% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 140% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 150% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 160% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет от 110 до 200% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет от 120 до 180% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет от 140 до 180% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи. В одном аспекте рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет от 150 до 170% от рецепторного связывания с инсулиновым рецептором производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

Получение полипептидов, например инсулинов, хорошо известно в данной области. Аналог инсулина, подлежащий применению для получения производного инсулина согласно изобретению, можно, например, получать классическим синтезом пептидов, например твердофазным синтезом пептидов с использованием химии t-Boc или Fmoc или других хорошо устоявшихся методик, смотрите, например, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999. Аналог инсулина также может быть получен способом, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность ДНК, кодирующую аналог, и способной экспрессировать аналог инсулина в подходящей питательной среде при условиях, обеспечивающих экспрессию аналога инсулина.

В получении человеческого инсулина и аналогов человеческого инсулина можно использовать несколько рекомбинантных способов. Три неограничивающих примера способов, которые можно использовать при получении инсулина в микроорганизмах, таких как, например Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, например, раскрыты в WO2008034881.

Типично аналог инсулина получают экспрессией последовательности ДНК, кодирующей рассматриваемый аналог инсулина или его предшественник, в подходящей клетке-хозяине хорошо известной методикой, как раскрыто, например, в ЕР 1246845 или W02008034881, причем оба данных патента конкретно включены сюда посредством ссылки.

Аналог инсулина можно экспрессировать с N-концевым удлинением, как раскрыто в ЕР 1246845. После секреции в культуральную среду и выделения, предшественник инсулина будет подвергнут разным процедурам in vitro для удаления возможной последовательности N-концевого удлинения и соединения пептида с получением аналога инсулина. Такие способы включают ферментативное превращение посредством трипсина или протеазы Achromobacter lyticus в присутствии сложного эфира L-треонина, с последующим превращением сложного эфира треонина аналога инсулина до аналога инсулина посредством основного или кислотного гидролиза, как описано в описании патента США №4343898 или 4916212.

Примеры N-концевых удлинений того типа, который является подходящим в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США №5395922 и патенте ЕР №765395, которые оба конкретно включены сюда посредством ссылки.

Для аналогов инсулина, содержащих остатки неприродных аминокислот, рекомбинантная клетка должна быть модифицирована так, что неприродные аминокислоты включаются в аналог, например, посредством применения мутантов тРНК. Следовательно, вкратце, аналоги инсулина согласно изобретению получают аналогично получению известных аналогов инсулина.

В еще одном другом воплощении изобретение относится к способу получения производного инсулина, включающему:

(1) культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую предшественник инсулина;

(2) выделение предшественника инсулина из культуральной среды;

(3) превращение предшественника инсулина до аналога инсулина ферментативным превращением in vitro;

и

(4) ацилирование аналога инсулина боковой цепью.

(3) превращение предшественника инсулина до аналога инсулина; и

В одном воплощении настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяин, и в другом воплощении дрожжевая клетка-хозяин выбрана из рода Saccharomyces. В другом воплощении дрожжевая клетка-хозяин выбрана из вида Saccharomyces cerevisiae.

Аналоги инсулина могут быть модифицированы, как, например, ацилированы, согласно способам, известным специалисту в данной области, как, например, описано в WO 2010/029159, WO 00/55119, WO 04/029077 и WO 2006/008238, которые включены посредством ссылки.

В одном аспекте изобретения получен способ стабилизации производного инсулина, который включает замену двух или более чем двух аминокислот производного инсулина остатками цистеина, где

б. сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого аналога инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине,

создавая, посредством этого, производное человеческого инсулина, содержащее одну или более чем одну дополнительную дисульфидную связь, не присутствующую в человеческом инсулине.

Из данного описания очевидно как получить производное инсулина согласно изобретению. Специалист в данной области, читая данное описание, таким образом, знает как модифицировать производное инсулина таким способом, что введенные остатки инсулина размещаются в трехмерной структуре свернутого аналога инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, помимо трех дисульфидных связей человеческого инсулина.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Другой целью настоящего изобретения является предложение фармацевтического препарата, содержащего производное инсулина согласно настоящему изобретению, который присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 500 мг/мл, и где указанный препарат имеет рН от 2,0 до 10,0. Препарат может дополнительно содержать ингибитор(ы) протеаз, буферную систему, консервант(ы), тонический(ие) агент(ы), хелатирующий(ие) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном воплощении изобретения фармацевтический препарат представляет собой водный препарат, т.е. препарат, содержащий воду.

В другом воплощении фармацевтический препарат представляет собой высушенный препарат (например, лиофилизированный или высушенный распылением), готовый для применения без какого-либо предварительного растворения.

Фармацевтические композиции, содержащие производное инсулина согласно настоящему изобретению, можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в нескольких сайтах, например, в местных сайтах, например, в сайтах, представляющих собой кожу или слизистую, в сайтах, в которых избегается поглощение, например, введение в артерию, в вену, в сердце, и в сайтах, которые включают поглощение, например, введение в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость.

Введение фармацевтических композиций согласно изобретению пациентам, нуждающимся в таком лечении, может осуществляться через несколько путей введения, например, язычное, подъязычное, трансбуккальное, в рот, пероральное, в желудок и кишечник, назальное, легочное, например через бронхиолы и альвеолы, или их комбинацию, эпидермальное, кожное, чрескожное, вагинальное, ректальное, глазное, например через конъюнктиву, уретральное и парентеральное.

Композиции по настоящему изобретению могут вводиться в нескольких лекарственных формах, например, в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, гетерогенных эмульсий, пен, кремов, паст, пластырей, мазей, таблеток, покрытых таблеток, промывок, капсул, например, твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, суппозиториев, ректальных капсул, капель, гелей, спрэев, порошка, аэрозолей, ингалянтов, глазных капель, офтальмологических мазей, офтальмологических промывок, вагинальных пессариев, вагинальных колец, вагинальных мазей, инъекционного раствора, растворов, превращающихся in situ, например, образующих гель in situ, отверждаемых in situ, выпадающих в осадок in situ, кристаллизующихся in situ, инфузионных растворов и имплантов.

Для парентерального введения производное инсулина по данному изобретению готовят в виде препарата аналогично препарату известных инсулинов. Кроме того, для парентерального введения производное инсулина по данному изобретению вводят аналогично введению известных инсулинов, и врачи знакомы сданной методикой.

Парентеральное введение можно осуществлять посредством шприца, возможно шприца-ручки. В качестве альтернативы, парентеральное введение можно осуществлять посредством инфузионного насоса.

Инъецируемые композиции, содержащие производное инсулина по данному изобретению, можно получать с использованием традиционных методик фармацевтической промышленности, которые включают растворение и смешивание ингредиентов по необходимости для получения желательного конечного продукта. Таким образом, согласно одной методике, производное инсулина по данному изобретению растворяют в количестве воды, которое является в некоторой степени меньшим, чем конечный объем композиции, подлежащей приготовлению. По мере необходимости добавляют изотонический агент, консервант и буфер, и значение рН раствора поводят, если необходимо, с использованием кислоты, например соляной кислоты, или основания, например водного гидроксида натрия, по мере необходимости. Наконец, объем раствора доводят водой с получением желательной концентрации ингредиентов.

Более точно, препарат производного инсулина по данному изобретению, например раствор или суспензию, можно получать растворением соединения по данному изобретению в водной среде при слегка кислотных условиях, например, при концентрации в интервале от примерно 240 до примерно 2400 нмоль/мл. Водную среду делают изотоничной, например, хлоридом натрия или глицерином. Кроме того, водная среда может содержать буферы, такие как ацетатный или цитратный, консерванты, такие как м-крезол или фенол, и ионы цинка, например, в концентрации вплоть до примерно 20 мкг Zn⁺⁺ на единицу инсулиновой активности. Значение рН растворов подводят к нейтральности, не приближаясь слишком близко к изоэлектрической точке соединения по данному изобретению для того, чтобы избежать осаждения. Значение рН конечного препарата инсулина зависит от того, какое соединение по данному изобретению используется, концентрации ионов цинка и концентрации соединения по данному изобретению. Препарат производного инсулина делают стерильным, например, посредством стерилизующей фильтрации.

Препараты, предназначенные для перорального применения, могут быть получены согласно любому известному способу, и такие препараты могут содержать один или более чем один агент, выбранный из группы, состоящей из подсластителей, корригентов, красителей и консервантов для того, чтобы получить фармацевтические препараты, имеющие привлекательный внешний вид и вкус. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые подходят для изготовления таблеток. Данные эксципиенты, например, могут представлять собой инертные разбавители, такие как маннит, мальтодекстрин, каолин, карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие агенты и разрыхлители, например, кукурузный крахмал; связующие агенты, например, крахмал, желатин, полимеры или аравийская камедь; и смазывающие агенты, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми, или они могут быть покрыты известными методиками для задержки распада или высвобождения терапевтически активного полипептида.

Препараты для перорального введения по настоящему изобретению можно получать и вводить согласно способам, хорошо известным в фармацевтической химии, смотрите Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed. (A. Osol ed., 1985).

Препараты производного инсулина по данному изобретению используют аналогично применению известных препаратов инсулина.

Решение о количестве соединения по данному изобретению, подлежащем введению, определение того, как часто вводить соединение по данному изобретению, и выбор того, какое соединение или соединения по данному изобретению вводить, возможно, вместе с другим соединением против диабета, принимаются при консультации с практиком, который знаком с лечением диабета.

В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению вводят перорально. В одном аспекте производное инсулина согласно изобретению вводят парентерально.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к производному инсулина согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

В одном воплощении производное инсулина согласно изобретению используют для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения гипергликемии, диабета 2-го типа, нарушенной толерантности к глюкозе и диабета 1-го типа.

В другом воплощении производное инсулина согласно изобретению используют в качестве лекарственного средства для задержки или предупреждения развития заболевания при диабете 2-го типа.

В одном воплощении изобретения производное инсулина согласно изобретению предназначено для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения гипергликемии, диабета 2-го типа, нарушенной толерантности к глюкозе, диабета 1-го типа или для задержки или предупреждения развития заболевания при диабете 2-го типа.

В другом воплощении изобретения предложен способ лечения или предупреждения гипергликемии, диабета 2-го типа, нарушенной толерантности к глюкозе, диабета 1-го типа или задержки или предупреждения развития заболевания при диабете 2-го типа, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества такого производного инсулина согласно изобретению.

Термин «диабет» включает диабет 1-го типа, диабет 2-го типа и другие состояния, которые вызывают гипергликемию.

Термин «лечение» заболевания включает лечение, предупреждение или облегчение заболевания.

Следующее представляет собой список аспектов, дополнительно описывающих изобретение:

1. Производное инсулина, имеющее две или более чем две цистеиновые замены и боковую цепь, присоединенную к инсулину, где сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина, и

сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине.

2. Производное инсулина согласно аспекту 1, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что

(1) введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, и

(2) производное человеческого инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином.

3. Производное инсулина согласно аспекту 1 или 2, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что

(1) введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине,

(2) производное человеческого инсулина сохраняет желательные биологические активности, ассоциированные с человеческим инсулином, и

(3) производное человеческого инсулина имеет повышенную физическую стабильность относительно человеческого инсулина и/или исходного инсулина.

4. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, где сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что

(3) производное человеческого инсулина стабилизировано относительно протеолитической деградации.

5. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из А9, А10, А11 и А12 А-цепи, заменен цистеином, по меньшей мере один аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3, В4, В5 и В6 В-цепи, заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

6. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

7. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

8. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, и аминокислотный остаток в положении В3 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

9. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

10. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, где аминокислотный остаток в положении А21 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В25 и В26 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30.

11. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В1, В2, В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30,

где период полувыведения производного инсулина продлен относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

12. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В3 и В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30,

13. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении В3 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30,

14. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда аминокислотный остаток в положении А10 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении В4 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30,

15. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, где аминокислотный остаток в положении А21 А-цепи заменен цистеином, аминокислотный остаток в положении, выбранном из группы, состоящей из В25 и В26 В-цепи заменен цистеином, и возможно удалена аминокислота в положении В30,

16. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда получается одна или более чем одна дополнительная дисульфидная связь между А-цепью и В-цепью.

17. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда получается одна или более чем одна дополнительная дисульфидная связь между А-цепью и В-цепью.

18. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда по меньшей мере одна дополнительная дисульфидная связь соединяет два цистеина в А-цепи или соединяет два цистеина в В-цепи.

19. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 1% от рецепторного связывания производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

20. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 25% от рецепторного связывания производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

21. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 50% от рецепторного связывания производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

22. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 75% рецепторного связывания производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

23. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда рецепторное связывание с инсулиновым рецептором составляет по меньшей мере 90% рецепторного связывания производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

24. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда оно имеет улучшенную физическую стабильность относительно исходного инсулина.

25. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда оно имеет более пролонгированный профиль, чем производное инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

26. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда оно имеет удлиненный период полувыведения относительно производного инсулина без одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи.

27. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда удалена аминокислота в положении В30.

28. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда по меньшей мере одна дополнительная дисульфидная связь соединяет два цистеина в А-цепи или соединяет цистеины в В-цепи.

29. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда оно имеет две цистеиновые замены.

30. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:

А10С, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В1С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В2С, В25А, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В2С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25А, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, B25N, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, desB1, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Н, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин

и боковая цепь присоединена к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине.

31. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:

А10С, А14Е, В1С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В2С, В25А, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В2С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25А, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, А14Н, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,

А10С, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,

и боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи инсулина.

32. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:

А10С, A21G, B1G, В3С, В27Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B1G, В3Е, В4С, В27Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В2С, В3Е, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В2С, В3Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3С, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3Е, В4С, В22Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3Е, В4С, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3Е, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3Е, В4С, desB24, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B3K, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B3Q, В4С, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B3Q, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В4С, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, B2C, В3Е, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, B2C, В3Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, В3С, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, В3С, В27Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, В3С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, В3Е, В4С, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, В3Е, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, desB1, B3Q, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A22K, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин

А10С, В1С, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, В3А, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B3D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, В3Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B3F, desB30 человеческий инсулин

А10С, В4С, B28D человеческий инсулин

А10С, В4С, B28D, desB30 человеческий инсулин

и боковая цепь присоединена к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине,

33. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:

А10С, A21G, B2C, В3Е, В27Е, B28K, desB29, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B2C, В3Е, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В3С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, B3Q, В4С, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В4С, В28Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, A21G, В4С, desB30 человеческий инсулин

А10С, A22K, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин

А10С, В1С, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B28D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, В3А, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B3D, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, В3Е, desB30 человеческий инсулин

А10С, B2C, B3F, desB30 человеческий инсулин

А10С, В4С, B28D человеческий инсулин

А10С, В4С, B28D, desB30 человеческий инсулин

34. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда боковая цепь присоединена к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине,

35. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда боковая цепь присоединена к эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи инсулина.

36. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда боковая цепь представляет собой ацильную группировку общей формулы: Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-.

37. Производное инсулина согласно любому из предшествующих аспектов, в том возможном случае, когда оно выбрано из группы, состоящей из производных инсулина, упомянутых в Примерах.

38. Способ стабилизации инсулина, включающий замену двух или более чем двух аминокислот инсулина остатками цистеина и присоединение к инсулину боковой цепи, где

а) сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина и

б) сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной или более чем одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине,

39. Фармацевтическая композиция, содержащая биологически активное количество производного инсулина согласно любому из аспектов 1-37 и фармацевтически приемлемый носитель.

40. Фармацевтическая композиция согласно аспекту 39, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент и, возможно, адъювант.

41. Способ лечения сахарного диабета у субъекта, включающий введение субъекту производного инсулина согласно любому из аспектов 1-37 или фармацевтической композиции согласно любому из аспектов 39-40.

42. Способ снижения уровня глюкозы в крови у млекопитающих путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически активной дозы производного инсулина согласно любому из аспектов 1-37 или фармацевтической композиции согласно любому из аспектов 39-40.

43. Производное инсулина согласно любому из аспектов 1-37 для применения в качестве фармацевтического средства в лечении или предупреждении гипергликемии, диабета 2-го типа, нарушенной толерантности к глюкозе и диабета 1-го типа.

44. Производное инсулина согласно любому из аспектов 1-37 для применения в качестве фармацевтического средства при задержке или предупреждении развития заболевания при диабете 2-го типа.

45. Способ получения фармацевтической композиции согласно любому из аспектов 39-40, включающий смешивание производного инсулина согласно любому из аспектов 1-37 с фармацевтически приемлемыми веществами и/или эксципиентами.

46. Фармацевтическая композиция, получаемая способом согласно аспекту 45.

Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, процитированные здесь, являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте и в той же самой степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана как включенная посредством ссылки и была здесь изложена во всей ее полноте (в максимальной степени, разрешенной законом).

Все заголовки и подзаголовки используются здесь лишь для удобства, и не должны истолковываться как ограничивающие изобретение каким-либо образом.

Применение приведенных здесь любого и всех примеров или формулировок для приведения примеров (например, «такой как») предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не ограничивает объем изобретения, если иное не заявлено в формуле изобретения. Никакая формулировка в описании изобретения не должна истолковываться как указывающая на какой-либо незаявленный элемент, являющийся существенным для воплощения изобретения на практике.

Цитирование и включение сюда патентных документов осуществляется лишь для удобства и не отражает какого-либо мнения относительно действительности, патентоспособности и/или законной силы таких патентных документов.

Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объектов изобретения, перечисленных в приложенной к нему формуле изобретения, как разрешено существующим законодательством.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предложены в качестве иллюстрации, а не ограничения.

Использованные здесь сокращения являются следующими; βAla представляет собой бета-аланил, Аос представляет собой 8-аминооктановую кислоту, tBu представляет собой трет-бутил, DCM представляет собой дихлорметан, DIC представляет собой диизопропилкарбодиимид, DIPEA=DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин, DMF представляет собой N,N-диметилформамид, DMSO представляет собой диметилсульфоксид, EtOAc представляет собой этилацетат, Fmoc представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонил, γGlu представляет собой гамма-L-глутамил, HCl представляет собой соляную кислоту, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, NMP представляет собой N-метилпирролидон, MeCN представляет собой ацетонитрил, OEG представляет собой [2-(2-аминоэтокси)этокси]этилкарбонил, Su представляет собой сукцинимидил-1-ил=2,5-диоксо-пирролидин-1-ил, OSu представляет собой сукцинимидил-1-илокси=2,5-диоксо-пирролидин-1-илокси, RPC представляет собой хроматографию с обращенной фазой, RT представляет собой комнатную температуру, TFA представляет собой трифторуксусную кислоту, THF представляет собой тетрагидрофуран, TNBS представляет собой 2,4,6-тринитробезолсульфоновую кислоту, TRIS представляет собой трис(гидроксиметил)аминометан и TSTU представляет собой O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат.

Следующие примеры и общие методики относятся к промежуточным соединениям и конечным продуктам, идентифицированным в описании изобретения и на схемах синтеза. Получение соединений по настоящему изобретению подробно описано с использованием следующих примеров, но описанные химические реакции раскрыты в терминах их общей применимости к получению соединений по изобретению. Изредка реакция может не быть применимой, как описано, к каждому соединению, включенному в раскрытый объем изобретения. Соединения, в отношении которых это происходит, будут легко распознаны специалистами в данной области. В данных случаях реакции можно успешно проводить традиционными модификациями, известными специалистам в данной области, то есть, посредством подходящей защиты мешающих групп, заменой на другие традиционные реактивы или обычной модификацией условий реакции. В качестве альтернативы, для получения соответствующих соединений по изобретению будут применимыми другие реакции, раскрытые здесь или являющиеся традиционными в других отношениях. Во всех способах получения все исходные вещества являются известными или могут быть легко получены из известных исходных веществ. Все температуры изложены в градусах Цельсия и, если не указано иное, все части и процентные содержания приведены по массе, когда они относятся к выходам, и все части приведены по объему, когда они относятся к растворителям и элюентам.

Соединения по изобретению можно очистить с использованием одной или более чем одной из следующих методик, которые являются типичными в пределах данной области. При необходимости данные методики могут быть модифицированы в отношении градиентов, рН, солей, концентраций, тока, колонок и так далее. Данные модификации могут быть легко распознаны и сделаны специалистом в данной области, в зависимости от таких факторов, как профиль примесей, растворимость рассматриваемых инсулинов и так далее.

После кислотной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) соединения выделяют лиофилизацией чистых фракций.

После нейтральной ВЭЖХ или анионообменной хроматографии соединения обессоливают, например, гель-фильтрацией, осаждают при изоэлектрической точке или обессоливают кислотной ВЭЖХ.

Типичные методики очистки:

Система ВЭЖХ представляет собой систему Gilson, состоящую из следующего: механизм подачи жидких проб модели 215, насос модели 322-Н2 и УФ (ультрафиолетовый) детектор модели 155. Детекция типично осуществляется при 210 и 280 нм.

Система ЖЭХБ (жидкостная экспресс-хроматография белков) Akta Purifier (Amersham Biosciences) состоит из следующего: насос модели Р-900, УФ детектор модели UV-900, детектор рН и проводимости модели рН/С-900, сборщик фракций модели Frac-950. УФ детекция типично осуществляется при 214 нм, 254 нм и 276 нм.

Кислотная ВЭЖХ:

Колонка: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4

Ток: 8 мл/мин

Буфер А: 0,1% TFA в ацетонитриле

Буфер Б: 0,1% TFA в воде.

Градиент: 0,0-5,0 мин: 10% А

5,00-30,0 мин: от 10% А до 90% А

30,0-35,0 мин: 90% А

35,0-40,0 мин: 100% А

Нейтральная ВЭЖХ:

Колонка: Phenomenex, Jupiter, С4 5 мкм 250×10,00 мм, 300 Å

Ток: 6 мл/мин

Буфер А: 5 мМ TRIS, 7,5 мМ (NH₄)₂SO₄, pH=7,3, 20% CH₃CN

Буфер Б: 60% CH3CN, 40% воды

Градиент: 0-5 мин: 10% Б

5-35 мин: 10-60% Б

35-39 мин: 60% Б

39-40 мин: 70% Б

40-43,5 мин: 70% Б

Анионообменная хроматография:

Колонка: RessourceQ, 1 мл

Ток: 6 мл/мин

Буфер А: 0,09% NH₄HCO₃, 0,25% NH₄OAc, 42,5% этанола, pH 8,4

Буфер Б: 0,09% NH₄HCO₃, 2,5% NH₄OAc, 42,5% этанола, pH 8,4

Градиент: от 100% А до 100% Б за 30 объемов колонки

Обессоливание:

Колонка: HiPrep 26/10

Ток: 10 мл/мин, 6 объемов колонки

Буфер: 10 мМ NH₄HCO₃

Общая методика для твердофазного синтеза ацилирующих реактивов общей формулы (II):

(II): Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act,

где Асу, АА1, АА2, АА3, n, m и p являются такими, как определено выше, и Act представляет собой уходящую группу активного сложного эфира, такого как N-гидроксисукцинимид (OSu), или 1-гидроксибензотриазол, и

где карбоновые кислоты в пределах группировок Acy и АА2 ацильной группировки являются защищенными в виде сложных трет-бутиловых эфиров.

Соединения общей формулы (II) согласно изобретению можно синтезировать на твердой подложке с использованием методик, хорошо известных специалистам в области твердофазного синтеза пептидов. Данная методика включает присоединение аминокислоты, защищенной Fmoc, к полистирол-2-хлортритилхлоридной смоле. Присоединение, например, может осуществляться с использованием свободной N-защищенной аминокислоты в присутствии третичного амина, подобного триэтиламину или N,N-диизопропилэтиламину (смотрите ссылки ниже). C-концевой конец (который присоединен к смоле) данной аминокислоты находится на конце синтетической последовательности, связываемой с исходными инсулинами по изобретению. После присоединения Fmoc аминокислоты к смоле, защиту в виде Fmoc группы снимают с использованием, например, вторичных аминов, подобных пиперидину или диэтиламину, с последующим связыванием другой (или такой же) аминокислоты, защищенной Fmoc, и снятием защиты. Синтетическая последовательность терминируется путем связывания жирных (α, ω) дикислот, защищенных моно-трет-бутилом, подобных сложным моно-трет-бутиловым эфирам гексадекандикарбоновой, гептадекандикарбоновой, октадекандикарбоновой или эйкозандикарбоновой кислоты. Отщепление соединений от смолы осуществляется с использованием разбавленной кислоты, подобной 0,5-5% TFA/DCM (трифторуксусная кислота в дихлорметане), уксусной кислоте (например, 10% в DCM, или НОАс/трифторэтанол/DCM 1:1:8) или гексафторизопропанолу в DCM (смотрите, например, "Organic Synthesis on Solid Phase", F.Z. Dorwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 или "The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG и ссылки, процитированные в них). Это обеспечивает то, что не снимается защита трет-бутиловыми сложными эфирами, присутствующими в соединениях в виде защитных групп карбоновых кислот. Наконец, активируют С-концевую карбоксильную группу (высвобожденную из смолы), например в виде N-гидроксисукцинимидилового сложного эфира (OSu), и используют либо непосредственно, либо после очистки в виде связывающего реактива при присоединении к исходным инсулинам по изобретению.

В качестве альтернативы, ацилирующие реактивы общей формулы (II), приведенной выше, можно получать синтезом в фазе раствора, как описано ниже.

Жирные дикислоты, защищенные моно-трет-бутилом, такие как сложные моно-трет-бутиловые эфиры гексадекандикарбоновой, гептадекандикарбоновой, октадекандикарбоновой или эйкозандикарбоновой кислоты, активируют, например, в виде OSu-сложных эфиров, как описано ниже, или в виде любого другого активированного сложного эфира, известного специалистам в данной области, такого как HOBt- или HOAt-сложные эфиры. Этот активный сложный эфир связывают с одной из аминокислот АА1, АА2, защищенной моно-трет-бутилом, или АА3 в подходящем растворителе, таком как THF, DMF, NMP (или в смеси растворителей) в присутствии подходящего основания, такого как DIPEA или триэтиламин. Промежуточное соединение выделяют, например, методиками экстракции или хроматографическими методиками. Образующееся промежуточное соединение вновь подвергают активации (как описано выше) и связыванию с одной из аминокислот АА1, АА2, защищенной моно-трет-бутилом, или АА3, как описано выше. Эту прцедуру повторяют, пока не получают желательное защищенное промежуточное соединение Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-OH. Его, в свою очередь, активируют с получением ацилирующих реактивов общей формулы (II) Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act.

Защита (трет-бутил) с ацилирующих реактивов, полученных любым из приведенных выше способов, может быть снята после активации в виде сложных эфиров OSu. Это может быть сделано обработкой TFA ацилирующего реактива, защищенного трет-бутилом, активированного OSu. После ацилирования любого стабилизированного в отношении протеазы инсулина, получают образующийся незащищенный ацилированный, стабилизированный в отношении протеазы инсулин по изобретению.

Если защита (трет-бутил) реактивов, полученных любым из приведенных выше способов, не снимается после активации в виде сложных эфиров OSu, тогда ацилирование любого стабилизированного в отношении протеазы инсулина дает соответствующий защищенный трет-бутилом, ацилированный, стабилизированный в отношении протеазы инсулин по изобретению. Для того чтобы получить незащищенный, ацилированный, стабилизированный в отношении протеазы инсулин по изобретению, следует снять защиту с защищенного инсулина. Это можно сделать обработкой TFA с получением незащищенного ацилированного, стабилизированного в отношении протеазы инсулина по изобретению.

Ацилирование остатка лизина (в эпсилон положении) человеческого инсулина или аналога инсулина проводится при щелочном рН (например, при рН 10; 10,5; 11; 11,5 или 12).

Общая методика (А) проиллюстрирована в первом примере.

Пример 1, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K (N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

А10С, В4С, А14Е, В25Н, desB30 человеческий инсулин (2 г) растворяли в 100 мМ водном Na₂CO₃ (50 мл), добавляли NMP (3 мл). рН доводили до 11,2 1 н. NaOH.

Октадекандиоил-gGlu-OEG-OEG-OSu (0,8 г, 1,4 экв.), растворенный в NMP (6 мл) добавляли одновременно с 1 н. NaOH, поддерживая рН приблизительно 11. Через 5 минут добавляли воду (40 мл), и рН снижали до 5,5 путем добавления 1 н. HCl. Осадок выделяли центрифугированием. Остаток растворяли в ацетонитриле (30 мл) и воде, содержащей 1% TFA (30 мл), и очищали ВЭЖХ за 4 прогона:

Колонка: Phenomenex, Gemini, 5 мкм, С18, 110 Å, 250×30 см

Ток: 20 мл/мин

Элюенты: А: 0,1% TFA в воде Б: 0,1% TFA в ацетонитриле

Градиент:

0-7,5 мин:	10%Б,
7,5-87,5 мин:	от 10%Б до 60%Б,
87,5-92,5 мин:	60%Б
92,5-97,5 мин:	от 60%Б до 100%Б
97,5-100 мин:	100%Б
100-103 мин:	10%Б

Чистые фракции объединяли и лиофилизировали. Сухое вещество растворяли в воде (200 мл), добавляли 0,1 н. NaOH до рН=8,1 и лиофилизировали с получением 1 г производного инсулина, указанного в заголовке.

MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной ионизацией/десорбцией в присутствии матрицы): m/z: 6340; расчетное: 6341.

LC-MS (жидкостная хроматография - масс-спектрометрия) (электрораспылительная): m/z=1586,04 (М+4)/4 (6340)

Пример 2, общая методика (А):

А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N(эпс)Октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

LCMS (электрораспылительная): m/z=1517,0 (М+4)/4 (6064)

Пример 3, общая методика (А):

А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-17-карбоксигептадеканоил-[CysA10,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1485,0 (5935,9). Расчетное: 1484,8

Пример 1, общая методика (А):

А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1525,8 (6099,1). Расчетное: 1525,8

Пример 2, общая методика (А):

А10С, А14Е, desB1, B4C, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-PheB1,ThrB30-инсулин(человеческий)-(А)-пептид,(В2-В29)-пептид

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1549,4 (6193,6). Расчетное: 1549,3

Следующее производное может быть получено аналогично:

Пример 3, общая методика (А):

A10C, А14Н, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоил-амино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,HisA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Следующие аналоги были получены аналогично:

Пример 4, общая методика (А):

A10C, A14E, В3С, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1597,6 (6386,4). Расчетное: 1597,5

Пример 5, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоил-амино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1588,9 (6351,6). Расчетное: 1588,8

Пример 6, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1514,1 (6351,6). Расчетное: 1513,8

Пример 7, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-ОЕО-ОЕС), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]-ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1589,6 (6355,4). Расчетное: 1589,9

Пример 8, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-B29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1549,2 (6194,2). Расчетное: 1549,6

Пример 9, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1488 (5948). Расчетное: 1488

Пример 10, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-17-карбоксигептадеканоил-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1481,9 (5921,9). Расчетное: 1481,5

Пример 11, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-B29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1546,1 (6180,2). Расчетное: 1545

Пример 12, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]-этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1593,6 (6370,4). Расчетное: 1593,6

Пример 13, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-кабокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1581,5 (6322,1). Расчетное: 1581,5

Пример 14, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]-этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1590,5 (6357,8). Расчетное: 1590,5

Пример 15, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^EМиристил), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-тетрадеканоил-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1460,0 (5835,8). Расчетное: 1460,0

Пример 16, общая методика (А):

A10C, ВАС, B29K(N^εМиристил), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-тетрадеканоил-[CysA10,CysB4],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/3: m/z=1961,4 (5881,2). Расчетное: 1961,4

Пример 17, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-B29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1492,2 (5964,0). Расчетное: 1492,0

Пример 18, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1564,7 (6254,3). Расчетное: 1564,6

Пример 19, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1524,4 (6093,1). Расчетное: 1524,3

Пример 20, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29Н2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1593,2 (6369,4). Расчетное: 1593,4

Пример 21, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1499,1 (5992,0). Расчетное: 1499,0

Пример 22, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиол-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,His25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

MS (электрораспылительная) m/4: m/z=1571,8 (6282,3). Расчетное: 1571,6

Аналогично, могут быть получены следующие производные инсулина:

Пример 23, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29Н(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 24, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 25, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-15-карбоксипентадеканоил-[CysA10,GluA14,Cys В4,Н18 В25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 26, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 27, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 28, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, desB27, В29Л(Т^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(48)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[Су5А10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 29, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 30, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,His25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 31, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 32, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 33, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 34, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 35, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 36, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,His25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 37, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 38, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Элсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,Hi3B25],de3-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 39, общая методика (А):

A10C, В1С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB1],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 40, общая методика (А):

A10C, В1С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB1],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 41, общая методика (А):

A10C, В1С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB1],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 42, общая методика (А):

A10C, В1С, B29K(N^εоктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB1],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 43, общая методика (А):

А10С, В2С, B29K(N^εоктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB2],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 44, общая методика (А):

А10С, В2С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB2],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 45, общая методика (А):

А10С, В2С, B29K(N^εгексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB2],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 46, общая методика (А):

А10С, В2С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB2],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 47, общая методика (А):

A10C, В3С, B29K(N^εгексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB3],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 48, общая методика (А):

A10C, В3С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB3],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 49, общая методика (А):

A10C, В3С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB3],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 50, общая методика (А):

A10C, В3С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB3],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 51, общая методика (А):

A10C, В4С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB4],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 52, общая методика (А):

A10C, В4С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB4],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 53, общая методика (А):

A10C, В4С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,CysB4],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 54, общая методика (А):

A10C, В4С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,CysB4],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 55, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 56, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^εэйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 57, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^EОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 58, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-

карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 59, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 60, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 61, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 62, общая методика (А):

A10C, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,His25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 63, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 64, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]зтокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 65, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 66, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 67, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 68, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 69, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 70, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 71, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 72, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 73, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 74, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-

карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,His25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 75, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 76, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 77, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 78, общая методика (А):

A10C, А14Е, В1С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB1,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 79, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 80, общая методика (А):

А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB2,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 81, общая методика (А):

А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 82, общая методика (А):

А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 83, общая методика (А):

A10C, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 84, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокс-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 85, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 86, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 87, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 88, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 89, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 90, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 91, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]-амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3],des-ThrB27,ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 92, общая методика (А):

А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 93, общая методика (А):

А10С, А14Е, В3С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]-этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB3,GluB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 94, общая методика (А):

А10С, А14Е, В4С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]-ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[CysA10,GluA14,CysB4,GluB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 95, общая методика (А):

A10C, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

Пример 96, общая методика (А):

А10С, А14Е, В4С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин

Название IUPAC (OpenEye, стиль IUPAC):

N{Эпсилон-В29}-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]-[CysA10,GluA14,CysB4,GluB16,HisB25],des-ThrB30-инсулин(человеческий)

Пример 100, связывание с рецептором инсулина:

Анализ связывания с рецептором инсулина (на солюбилизированном рецепторе инсулина)

Аффинность производного инсулина по изобретению в отношении человеческого рецептора инсулина определяли посредством сцинтилляционного анализа сближения (SPA) (согласно Glendorf et al. (2008), Biochemistry, 47, 4743-4751). Эксперименты по конкурентному связыванию проводили в 96-луночных планшетах (полистирольные Optiplate-96, PerkinElmer) на роботе Eppendorf epMotion 5075 с использованием солюбилизированного человеческого IR (рецептор инсулина) (холорецептор), частично очищенного посредством очистки с агглютинином зародышей пшеницы из клеток почки новорожденного хомяка (ВНК), которые были стабильно трансфицированы вектором pZem, содержащим вставку человеческого IR-A или IA-B. Анализы инициировали, делая серии разведении (восемь разведении, каждое в пять раз, первое разведение в 43 раза) дрожжевого супернатанта, содержащего производное инсулина и стандарт человеческого инсулина. К ряду разведении подходящих образцов добавляли смесь реактивов, состоящую из шариков SPA (SPA PVT шарики, связывающие антитела, реактив против мышиных антител с Кат. № RPNQ0017, GE Healthcare), ресуспендированных в буфере для связывания, моноклонального мышиного антитела против IR (83-7), солюбилизированного человеческого IR (hIR-A или hIR-В) и инсулина, меченного [¹²⁵I]A14Tyr. Конечная концентрация инсулина, меченного [¹²⁵I]A14Tyr, составляла 7,5 пМ, и буфер состоял из 100 мМ HEPES (рН 7,8), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgSO₄ и 0,025% (об./об.) Tween 20. Планшеты инкубировали с мягким встряхиванием в течение 24 ч при комнатной температуре, центрифугировали в течение 2 минут при 2000 об./мин и осуществляли счет радиоактивности в TopCount NXT в течение 3 мин/лунку. Данные от SPA анализировали согласно четырехпараметричекой логистической модели model (Volund, A., (1978), Biometrics, 34, 357-365.), и аффинности производного инсулина выражали относительно аффинности человеческого инсулина.

Данный анализ также проводится с 1,5% HSA (человеческий сывороточный альбумин) в буфере для анализа для того, чтобы имитировать физиологические условия.

Получение моноклональных антител mIR

Специфичные антитела (F12 или 83-7) получали посредством моноклональной методики: мышей RBF иммунизировали подкожным инъецированием 50 мкг очищенного mIR в FCA (полный адъювант Фрейнда), с последующими двумя инъекциями 20 мкг mIR в FIA (неполный адъювант Фрейнда). Мышей-респондеров с сильным ответом подвергали бустерной иммунизации внутривенно 25 мкг mIR, и отбирали селезенки через 3 суток. Клетки селезенки сливали с линией клеток миеломы Fox (Kohler, G & Milstein С. (1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30). Супернатанты подвергали скринингу на продукцию антител в ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), специфичном в отношении mIR. Клетки из позитивных лунок клонировали и тестировали посредством вестерн-блоттинга.

Анализ связывания с рецептором инсулина (на мембраноассоциированном рецепторе инсулина)

Связывание [¹²⁵I]-человеческого инсулина с изоформой А мембраноассоциированного рекомбинантного человеческого рецептора инсулина (hIR-A)

Экстракция мембраноассоциированных рецепторов инсулина: клетки ВНК (tk-ts13), экспрессирующие изоформу А человеческого рецептора инсулина, из десятислойной клеточной фабрики отбирали и гомогенизировали в 25 мл ледяного буфера (25 мМ HEPES рН 7,4, 2,5 мМ CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 250 мг/л бацитрацин, 0,1 мМ Pefablock (Roche)). Гомогенат аккуратно наносили на слои 41%-ной сахарозы, центрифугировали в ультрацентрифуге при 95000×g в течение 75 минут в роторе Beckman SW28 при 4°С. Плазматические мембраны собирали из верхней части сахарозного слоя, разводили 1:4 буфером и центрифугировали при 40000×g в течение 45 мин в роторе Beckman SW28. Осадки суспендировали в буфере (25 мМ HEPES рН 7,4, 2,5 мМ CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 250 мг/л бацитрацин, 0,1 мМ Pefablock) и хранили при -80°С.

Связывание радиолиганда с мембраноассоциированными рецепторами инсулина проводили в двойной повторное™ в 96-луночных OptiPlates (Perkin Elmer). Мембранный белок инкубировали в течение 150 минут при 25°C с 50 пМ [¹²⁵I-Tyr^A14]-человеческим инсулином в общем объеме буфера для анализа (50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgSO₄, 0,01% Triton X-100, 0,1% HSA (не содержащий жирных кислот) 200 мл с ингибиторами протеаз Complete™, не содержащими EDTA, возрастающими концентрациями человеческого инсулина или производного инсулина (типично от 0,01 до 300 нМ) и 1 мг микросфер PVT, покрытых WGA (агглютинин зародышей пшеницы) (GE Healthcare). Анализ завершали центрифугированием планшета при 2000 об./мин в течение 2 мин, и связавшуюся радиоактивность количественно измеряли счетом в Packard TopCount NXT после задержки 60 минут.

Данные по связыванию аппроксимировали с использованием алгоритма сигмоидной регрессии с четырьмя параметрами в GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software, San Diego, CA). Результаты приведены в виде ICao (полумаксимальная ингибиторная концентрация) относительно человеческого инсулина в %.

Аффинности рецептора инсулина:

№ примера	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@ 0% HSA)(%)	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@ 1,5% HSA) (%)
1	3,38	0,39
2	0,64	0,23
10	1,90	0,15
3	1,13	0,01
11	0,44	0,06
12	3,68	0,39

№ примера	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@ 0% HSA) (%)	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@ 1,5% HSA) (%)
13	5,14	0,52
14	1,90	0,25
4	2,79	0,18
9	3,98	0,89
15	2,57	0,04
16	0,60	0,03
17	0,17	0,01
18		0,27
19	29,29	0,48
5	2,54	0,08
20	1,00	0,06
21	1,05	0,06
7	0,50	0,05
8	0,40	0,03
22	0,42	0,01
23	2,18
24	0,45	0,03
25	0,66	0,08

Влияние дополнительного дисульфидного мостика в производных инсулина по изобретению является неожиданно слабым. Эффект жирнокислотной боковой цепи создает наибольшее влияние, находящееся на втором месте относительно влияния нецистеиновых мутаций в исходном инсулине. Это проиллюстрировано в следующей таблице и является основным открытием. Низкая аффинность к рецептору инсулина дериватизированных жирной кислотой инсулинов по изобретению является желательной для того, чтобы получить длительные и пролонгированные профили in vivo.

№ примера	Боковая цепь	Мутации исходного инсулина (относительно HI)	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@ 0% HSA) (%)	Относительная аффинность IR-A Анализ SPA (@1,5% HSA) (%)
		desB30	100,0
		A14E, B25H, desB30	25,0
		A10C, B4C, desB30	162,4
		А10С, В3С, desB30	51,3
		A10C, B2C, desB30	164,9
		A10C, B1C, desB30	56,9
		А10С, A14E, B4C, B25H, desB30	37,8
		А10С, A14E, В3С, B25H, desB30	11,4
		А10С, A14E, B2C, B25H, desB30	37,1
		А10С, A14E, B1C, B25H, desB30	13,2
	C18-gGlu-2xOEG	desB30	10,4	0,70
	C18-gGlu-2xOEG	A14E, B25H, desB30	2,3	0,11
1	C18-gGlu-2xOEG	А10С, A14E, B4C, B25H, desB30	3,4	0,39
10	C18-gGlu-2xOEG	А10С, A14E, В3С, B25H, desB30	1,9	0,15
15	C18-gGlu-2xOEG	А10С, A14E, B2C, B25H, desB30	2,6	0,04
16	C18-gGlu-2xOEG	А10С, A14E, B1C, B25H, desB30	0,6	0,03

Пример 101, Гидрофобность производных инсулина по изобретению

Гидрофобность производного инсулина находили посредством ВЭЖХ с обращенной фазой, проведенной при изократических условиях. Время элюции производного инсулина сравнивается со временем элюции человеческого инсулина (обозначенного здесь HI) или другого производного с известной гидрофобностью при тех же самых условиях. Гидрофобность, k'rel, рассчитывается как: k'rel_deriv=((t_deriv-t₀)/(t_ref-t₀))*k'rel_ref. При использовании HI в качестве стандарта: k'rel_ref=k'rel_HI=1. Исключенное время системы ВЭЖХ, t₀, определяется путем инъецирования 5 мкл 0,1 мМ NaNO₃. Условия разделения:

Колонка:	Lichrosorb RP-C18, 5 мкм, 4×250 мм
Буфер А:	0,1 М фосфат натрия рН 7,3,10% об. CH₃CN
Буфер Б:	50% об. CH₃CN
Инъекционный объем:	5 мкл
Время разделения:	максимум 60 минут

После прогона исходного градиента выбирают изократический уровень для прогона производного и стандарта (например, HI), и время элюции производного и стандарта при изократических условиях используют в приведенном выше уравнении для расчета k'rel_derive.

Пример 102, деградация производных инсулина с использованием ферментов полости двенадцатиперстной кишки

Деградация производных инсулина с использованием ферментов полости двенадцатиперстной кишки (полученных фильтрацией содержимого двенадцатиперстной кишки) от крыс SPD.

Анализ проводили посредством робота в 96-луночном планшете (2 мл) с 16 лунками, доступными для производных инсулина и стандартов. Производные инсулина ~15 мкМ инкубировали с ферментами двенадцатиперстной кишки в 100 мМ HEPES, рН=7,4 при 37°С, образцы отбирали через 1,15, 30, 60, 120 и 240 мин, и реакцию гасили добавлением TFA. Интактные производные инсулина в каждый момент времени определяли ВЭЖХ-ОФ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой). Полупериод деградации определяли экспоненциальной аппроксимацией данных и нормировали к полупериоду, определенному для эталонных инсулинов, А14Е, В25Н, desB30 человеческого инсулина или человеческого инсулина в каждом анализе. Количество добавленных ферментов для деградации было таким, что полупериод деградации эталонного инсулина составлял от 60 мин до 180 мин. Результат приведен в виде полупериода деградации для производного инсулина в двенадцатиперстной кишке крысы, поделенного на полупериод деградации эталонного инсулина из того же самого эксперимента (относительный показатель деградации).

№ примера	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с А14Е, В25Н, desB30 человеческим инсулином
1	1,9
2	3,2

№ примера	Деградация в двенадцатиперстной кишке. Относительная стабильность по сравнению с А14Е, В25Н, desB30 человеческим инсулином
10	2,1
3	1,2
11	2,3
12	13,4
13	0,9
14	3,6
4	1,5
9	3,1
15	4,3
16	1,5
17	1,4
18	0,4
19	0,1
5	2,9
6
20
21
7	1,7
8	0,6
22	2,8
23	1,2
24
25	6,1

Пример 103, фармакокинетика у крыс, РК (фармакокинетика) у крыс при внутривенном введении

Крысам под наркозом внутривенно (в.в.) дозировали прозводные инсулина в разных дозах, и плазматические концентрации используемых соединений измеряли с использованием иммуноанализов или масс-спектрометрии в определенные интервалы времени в течение 4 часов или более после дозы. Затем были рассчитаны фармакокинетические параметры с использованием WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, США).

Использовали неголодавших самцов крыс Wistar (Taconic), весящих приблизительно 200 граммов.

Измеряли массу тела и затем анестезировали крыс смесью гипнорм/дормикум (каждое соединение разведено поотдельности 1:1 в стерильной воде, и затем они смешаны; свежеприготовленные в сутки эксперимента). Анестезию инициировали 2 мл/кг смеси гипнорм/дормикум п.к. (подкожно), с последующими двумя поддерживающими дозами 1 мл/кг п.к. с 30 мин интервалами и двумя поддерживающими дозами 1 мл/кг п.к. с 45 мин интервалами. При необходимости, для того, чтобы поддерживать крыс под легким наркозом на протяжении всего периода исследования, применяли дополнительную дозу(зы) 1-2 мл/кг. Взвешивание и исходную анестезию проводили в комнате для содержания крыс для того, чтобы избежать стрессового воздействия на животных посредством перевода их из одной комнаты в другую.

РК профили показаны на Фиг.1.

Пример 104, фармакокинетика у собак, РК у собак при внутривенном введении

Самцы собаки породы бигль (весящие приблизительно 12 кг) получают внутривенно одну дозу аналога инсулина (2 нмоль/кг). Отбирают кровь и получают плазму в моменты времени 0,17; 0; 0,083; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 8; 10; 12; 16; 24; 32; 48; 72; 96; 120; 144 и 168 часов после дозировки. Образцы плазмы анализируют либо сэндвич-иммуноанализом, либо ЖХ/МС. Профили концентрации в плазме относительно времени анализируют фармакокинетическим анализом без компартментализации с использованием WinNonlin Professional 5.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, США).

Пример 105, фармакокинтика у крыс, РК у крыс после внутрикишечной инъекции

Крысам под наркозом внутрикишечно (в тощую кишку) дозировали прозводные инсулина. Измеряются концентрации использованных соединений в плазме, а также изменения глюкозы в крови в определенные интервалы в течение 4 часов или более после дозировки. Фармакокинетические параметры затем рассчитываются с использованием WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, США).

Самцов крыс Sprague-Dawley (Taconic), весящих 250-300 г, голодавших в течение - 18 ч анестезировали с использованием гипнорм/дормикум п.к. (0,079 мг/мл фентанилцитрата, 2,5 мг/мл флуанизона и 1,25 мг/мл мидазолама) 2 мл/кг в качестве затравочной дозы (до момента времени -60 мин до дозирования тестируемого вещества), 1 мл/кг через 20 мин с последующими 1 мл/кг каждые 40 мин.

Инсулины, подлежащие тестированию в модели внутрикишечной инъекции, приготовлены в виде препарата согласно следующей композиции (в % по массе):

45% пропиленгликоля	(Merck)
33% Capmul МСМ С10	(Abitec)
11% полоксамера 407	(BASF)
11% полиэтиленгликоля 3350 Ultra	(Fluka)

Количество добавленного инсулина вычитается равным образом из Capmul МСМ С10, полоксамера 407 и PEG 3350 (полиэтиленгликоль 3350), а не из пропиленгликоля для того, чтобы сохранять количество пропиленгликоля на постоянном уровне 45%, независимо от загрузки лекарственного средства.

Крысу под наркозом размещают на гомеотермическом одеяле, стабилизированном при 37°С. 20-см полиэтиленовый катетер, установленный на 1 мл шприце, заполняют препаратом инсулина или носителем. В брюшной стенке делают срединный 4-5 см разрез. Осторожно вставляют катетер в среднюю часть тощей кишки ~50 см от слепой кишки путем проникновения через стенку кишечника. Если присутствует содержимое кишечника, место введения перемещают на ±10 см. Кончик катетера помещают приблизительно на 2 см внутрь полости сегмента кишки и фиксируют без применения лигатур. Кишки вновь аккуратно помещают в брюшную полость, и брюшную стенку и кожу закрывают в каждом слое автозажимами. Во время 0 производят дозирование крысам через катетер 0,4 мл/кг тестируемого соединения или носителя.

Образцы крови для определения концентраций глюкозы в цельной крови отбирают в гепаринизированные 10 мкл капиллярные пробирки путем прокола капиллярных сосудов на кончике хвоста. Концентрации глюкозы в крови измеряют после разведения в 500 мкл буфера для анализа посредством способа с глюкозооксидазой с использованием автоанализатора Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Германия). Для каждого соединения определяют ход изменений средней концентрации глюкозы в крови (среднее ± стандартная ошибка среднего).

Отбирают образцы для определения концентрации инсулина в плазме. 100 мкл образцы крови отбирают в охлажденные пробирки, содержащие EDTA. Образцы хранят на льду до центрифугирования (7000 об./мин, 4°С, 5 мин), плазму отбирают пипеткой в пробирки Micronic и затем замораживают при 20°С до анализа. Концентрации производных инсулина в плазме измеряют в иммуноанализе, который считается подходящим или обоснованным для индивидуального производного.

Образцы крови отбирают в t=-10 (только для определения содержания. глюкозы в крови), в t=-1 (непосредственно перед дозировкой) и в определенные интервалы в течение 4 часов или более после дозировки.

Пример 106 активность ацилированных производных инсулина по данному изобретению относительно человеческого инсулина, стационарная фиксация с внутривенным введением

Для эксперимента по фиксации использовали самцов крыс Sprague Dawley, весящих в сутки эксперимента 238-383 г. Крысы имели свободный доступ к пище при контролируемых условиях окружающей среды и голодали в течение ночи (с 15:00) до эксперимента по фиксации.

Экспериментальный протокол

Крыс акклиматизировали в виварии в течение по меньшей мере 1 недели до хирургической процедуры. Приблизительно за 1 неделю до эксперимента по фиксации катетеры Tygon вставляют в яремную вену (для инфузии) и в сонную артерию (для отбора крови) под галотановой анестезией, выводят на поверхность тела и фиксируют на задней поверхности шеи. Крысам дают ветеринарный стрептоцилин (Boehringer Ingelheim; 0,15 мл/крысу, в.м. (внутримышечно)) постхирургически и помещают их в помещении для ухода за животными (25°С) во время периода восстановления. Для получения аналгезии на протяжении анестезии вводят анорфин (0,06 мг/крысу, п.к. (подкожно)), а римадил (1,5 мг/кг, п.к.) вводится после полного восстановления от анестезии (2-3 ч) и вновь один раз в сутки в течение 2 суток.

На сутки эксперимента в 7:00 крыс, голодавших в течение ночи (с 15:00 предыдущих суток), взвешивают и подсоединяют к шприцам, осуществляющим отбор проб, и к инфузионной системе (насосы Harvard 22 Basic, Harvard, и стеклянный подкожный шприц Perfectum, Aldrich) и затем помещают в индивидуальные фиксирующие клетки, где они находятся в состоянии покоя в течение приблизительно 45 мин до начала эксперимента. Крысы способны свободно двигаться на их обычном ложе на протяжении всего эксперимента и имеют свободный доступ к питьевой воде. После 30 мин исходного периода, на протяжении которого уровни глюкозы в плазме измерялись с 10 мин интервалами, производится инфузия (в.в.) производного инсулина, подлежащего тестированию, и человеческого инсулина (один уровень дозы на крысу, n=6-7 на уровень дозы) с постоянной скоростью в течение 300 мин. Возможно, для достижения немедленных стационарных уровней в плазме вводится затравочная болюсная инфузия производного инсулина, подлежащего тестированию. Доза затравочной болюсной инфузии может быть рассчитана на основе данных по клиренсу, полученных от в.в. фармакокинетики болюса, специалистом в области фармакокинетики. Уровни глюкозы в плазме измеряются с 10 мин интервалами на протяжении всего периода исследования, и инфузия 20%-ной водной глюкозы корректируется соответствующим образом для того, чтобы поддерживать нормогликемию. Образцы ресуспендированных эритроцитов от каждой крысы объединяются и возвращаются примерно в ½ мл объемах через катетер, вставленный в сонную артерию.

В каждые сутки эксперимента образцы растворов отдельных производных инсулина, подлежащих тестированию, и раствора человеческого инсулина отбираются до и в конце экспериментов по фиксации, и концентрации пептидов подтверждаются ВЭЖХ. Концентрации в плазме инсулина крыс и С-пептида, а также производного инсулина, подлежащего тестированию, и человеческого инсулина измеряются в релевантные моменты времени до и в конце исследований. В конце эксперимента крыс умерщвляют, используя чрезмерную дозу пентобарбитала.

Пример 107, активность ацилированных производных инсулина по данному изобретению относительно контрольного производного инсулина, подкожное введение крысам

Самцы крыс Sprague-Dawley (n=6 на группу) получают одиночную дозу носителя или аналога инсулина подкожно (50 или 200 нмоль/животное для аналогов со средней продолжительностью действия или длительной продолжительностью действия соответственно). Берут кровь (подъязычно), и отбирают плазму в моменты времени 0, 1, 2, 4, 8, 24 и 48 или 0, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 часов после дозировки, для аналогов со средней продолжительностью действия или длительной продолжительностью действия соответственно). Плазму анализируют на содержание глюкозы. Эффект снижения содержания глюкозы рассчитывают как площадь под кривой разницы концентрации глюкозы в плазме как функцию времени и сравнивают с контрольным производным инсулина.

Пример 108, определения температуры плавления

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

Отбор данных проводили с использованием дифференциального сканирующего микрокалориметра VP-DSC (MicroCal, LLC, Northampton, MA). Все сканирования белка (~200 мкМ производные инсулина) проводили с 2 мМ фосфатным буфером в контрольной ячейке от 15°С до 120°С со скоростью сканирования 1°С/мин и избыточным давлением 0,21 МПа. Все образцы и стандарты дегазировали непосредственно перед применением. Контрольное сканирование буфер-буфер вычитали из каждого сканирования образца до нормирования коцентрации.

Данные ДСК показаны на Фиг.3 и 4.

Пример 109, измерение склонности к фибрилляции

Общая методика анализа фибрилляции с тиофлавином Т (ThT)

Принцип

Низкая физическая стабильность пептида может приводить к образованию амилоидных фибрилл, которые наблюдаются в образце в виде хорошо упорядоченных, волокнистых макромолекулярных структур, приводящих, в конечном счете, к образованию геля. Это традиционно измеряли визуальной проверкой образца. Однако данный вид измерения является очень субъективным и зависящим от наблюдателя. Следовательно, применение низкомолекулярного индикаторного зонда является значительно более предпочтительным. Тиофлавин Т (ThT) представляет собой такой зонд и имеет отличные характеристики флуоресценции при связывании с фибриллами (Naiki et al. Anal. Biochem. 177, 244-249, 1989; Le-Vine, Methods Enzymol. 309, 274-284, 1999). Динамику образования фибрилл можно описать сигмоидной кривой с использованием следующего выражения (Nielsen at al. Biochemistry 40, 6036-6046, 2001):

F = f_{i} + m_{i} t + \frac{f_{f} + m_{f} t}{1 + e^{- [(t - t_{0}) / τ]}} У р а в н е н и е 1

Здесь F представляет собой флуоресценцию ThT во время t. Константа t₀ представляет собой время, требующееся для достижения 50% от максимума флуоресценции. Двумя важными параметрами, описывающими образование фибрилл, являются лаг-период, рассчитываемый посредством выражения t₀-2τ, и кажущаяся константа скорости k_app=1/τ.

Образование частично свернутого промежуточного соединения пептида предлагается в качестве общего инициирующего механизма фибрилляции. Небольшое число данных промежуточных соединений формирует затравку с образованием матрицы, на которой могут собираться дальнейшие промежуточные соединения и может идти фибрилляция. Лаг-период соответствует интервалу, во время которого создается критическая масса ядра, и кажущаяся константа скорости представляет собой скорость, с которой образуется сама фибрилла.

Получение образца

Образцы были свежеприготовленными перед каждым анализом. Каждый аналог растворяли в 7 мМ фосфате натрия, рН=7,4. Тиофлавин Т добавляли в образцы из маточного раствора в воде до конечной концентрации 1 мкМ. 200 мкл аликвоты образцов помещали в 96-лучночный планшет для микротитрования (Packard Optiplate™-96, белый полистирол). Обычно в одном вертикальном ряду лунок размещали четыре повторности каждого образца (соответствующие одному тестируемому условию). Планшет запечатывали Scotch Pad (Qiagen).

Инкубация и измерения флуоресценции

Инкубацию при заданной температуре, встряхивание и измерения испускания флуоресценции ThT проводили либо на планшет-ридере Fluoroskan Ascent FL, либо на Varioskan (Thermo Labsystems). Температуру доводили до 37°С. Круговое встряхивание во всех представленных данных доводили до 960 об./мин с амплитудой 1 мм. Измерения флуоресценции проводили с использованием возбуждения через 444 нм фильтр, и измерение испускания - через 485 нм фильтр.

Каждый прогон инициировали инкубированием планшета при температуре анализа в течение 10 мин. Измерения на планшете проводили каждые 20 минут типично в течение 45 часов. Между каждым измерением планшет встряхивали и нагревали, как описано выше.

Обработка данных

Точки данных измерений сохраняли для дальнейшей обработки и рисования кривых в формате Microsoft Excel, и аппроксимацию проводили с использованием GraphPad Prism. Фоновое испускание от ThT в отсутствие фибрилл было пренебрежимо малым. Точки данных типично представляют собой среднее значение от четырех образцов. На том же самом графике представлены только данные, полученные в том же самом эксперименте (т.е. образцы на том же самом планшете), обеспечивая относительную меру фибрилляции между индивидуальными образцами одного анализа, а не сравнение между разными анализами.

Набор данных может быть аппроксимирован Уравнением (1). Однако, поскольку полные сигмоидные кривые обычно являются недостижимыми на протяжении времени измерения, степень фибрилляции выражается как флуоресценция ThT в разные моменты времени, рассчитанная как среднее значение четырех образцов и показанная со стандартным отклонением.

			0 ч		2 ч	20 ч		45 ч
Человеческий инсулин			28±1		1567±46	1780±40		1732±48
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин (Пример 1)			33±1		24±1	24±1		24±2
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N(эпс)Октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин (Пример 2)			36±1		29±0	28±0		31±0

№ примера	ThT 0 ч	ThT 2 ч		ThT 20 ч			ThT 45ч
1	33,3+1,4	23,6+1,1		23,8+0,7			23,5+1,6
2	35,8+0,7	28,7+0,4		28,4+0,2			31,3+0,2
3	34,4±0,9	24,3±0,8		23±1,3			21,9±0,8
11	23,2±0,7	14,3±0,6		14,2±1,9			14,5±2
12	28,4±0,1	20,1±1,5		19,8±3,5			19,9±3,8
13	55,9±1,2	31±0,1		29,9±0,5			28,1±0,6
14	22,2±0,5	15,5±0,3		16,2±0,2			16,6±0,2
4	31±0,5	24,9±0,3		25,9±0,3			24,9±0,1
9	25,8±0,9	17,1±0,2		17±0,3			16,8±0,3

№ примера	ThT 0 ч	ThT 2 ч	ThT 20 ч	ThT 45 ч
15	27,7±0,3	20,7±0,3	20±0,5	19,3±0,4
16	25±0,4	17,2±0,4	18,2±0,3	18,6±0,3
17	27,5±0,6	17,7±0,7	17,5±1,3	16,9±1,3
18	63,7±0,8	38,б±3	34,7±5,4	31,9±5,3
19	б3,3±1,8	41,5±1,4	35,9±1,9	30,7±1,8
5	27,5±0,3	16,3±0,9	14,8±2,4	14,3±2,7
21	25,9±0,1	14,7±0,4	16,1±0,7	15,8±0,7

Очевидно, что ни один из инсулинов согласно изобретению, которые были протестированы в отношении фибрилляции в анализе ThT, не показывал каких-либо признаков фибрилляции, как видно по (отсутствию) повышенной флуоресценции как функции времени. Это является очень необычным и это преуменьшает пользу аналогов по изобретению.

Пример 110, липогенез в адипоцитах крыс

Липогенез можно использовать в качестве меры активности инсулинов по изобретению in vitro.

Первичные адипоциты крыс выделяют из эпидидимальных жировых прослоек и инкубируют с 3Н-глюкозой в буфере, содержащем, например, 1%-ный обезжиренный HSA и либо стандарт (человеческий инсулин, HI), либо инсулин по изобретению. Меченая глюкоза превращается в экстрагируемые липиды дозозависимым образом, приводя к полным кривым доза-ответ. Результат выражен в виде относительной активности (%) с 95%-ными доверительными интервалами инсулина по изобретению по сравнению со стандартом (HI).

Данные по липогенезу для инсулинов по изобретению:

№ примера	Липогенез в присутствии 0,1% HSA, относительная активность по сравнению с человеческим инсулином (%)
1 без дисульфидной связи (предшествующий уровень техники)	0,31
18	3,24
19	1,69
1	0,45
2	0,24
3	0,04
11	0,08
12	0,40
13	0,57
14	0,19
4	0,14
9	0,98
15	0,13
16	0,08
5	0,24
17	0,02
7	0,04
8	0,05
24	0,03
25	0,04

Для большинства аналогов согласно изобретению существует очень хорошая согласованность между полученными данными по липогенезу (в присутствии 0,1% HSA) и данными с инсулиновым рецептором, полученными в присутствии 1,5% HSA, таким образом, подтверждая то, что связывание с рецептором транслируется в активацию рецептора.

Пример 111, Химическая стабильность аналогов инсулина по изобретению

Химическая стабильность аналогов инсулина оценивается после инкубирования аналога инсулина в 2 мМ фосфате, рН=7,5 при 37°С в течение вплоть до 8 недель. Образование высокомолекулярных продуктов (HMWP) определяется посредством анализа при помощи гель-фильтрации на основе ВЭЖХ через 0, 2, 4 и возможно 8 недель. Результаты способа гель-фильтрации приведены в виде различия между образованием HMWP при 37°С и 5°С в исходном образце как процентная доля общего поглощения при 215 нм. Продукты химической деградации определяются поседством анализа ВЭЖХ-ОФ через 0, 2, 4 и возможно 8 недель. Результаты способа ВЭЖХ-ОФ приведены в виде различия между химической деградацией, наблюдающейся при 37°С и 5°С в исходном образце как процентная доля общего поглощения при 215 нм.

Способ гель-фильтрации на основе ВЭЖХ:

Растворитель:	500 мМ NaCl, 10 мМ NaH₂PO₄, 5 мМ H₃PO₄, 50% (об./об.) 2-пропанол
Ток:	0,5 мл/мин
Время прогона:	30 мин
УФ детекция:	215 нм
Колонка:	колонка для инсулиновых HMWP от Waters 7,8×300 мм
Температура:	50°С

Способ ВЭЖХ-ОФ:

Растворитель А:	0,09 М фосфатный буфер рН 3,6 (диаммония гидрофосфат), 10% MeCN (об./об.)
Растворитель Б:	80% MeCN (% об./об.)
Ток:	0,3 мл/мин
Время прогона:	33 мин
УФ детекция:	215 нм
Колонка:	С18 колонка Waters Acquity BEH130 1,7 мкм, 150×2,1 мм
Температура:	50°С

Градиент:

Время, мин		Ток, мл/мин		%А	%Б
0		0,3		95	5
2		0,3		95	5
25		0,3		45	55
27		0,3		20	80
28		0,3		20	80
29		0,3		95	5
33		0,3		95	5

№ примера	Химическая деградация (%) (4 недели 37°С - 0 недель 5°С)		Образование HMWP (%) (4 недели 37°С - 0 недель 5°С)
1 без А10-В4	11,7		1,0
дисульфидная связь (предшествующий уровень техники)
18	4,2		5,1
19	11,7		34,6
1	6,8		0,9
2	2,5		0,0
3	3,4		0,7
11	3,2		-0,2
12	7,3		-0,1
13	9,8		0,5
14	9,7		0,0
4	8,7		-0,4
9	5,7		0,7
15	10,4		1,2
16	58,0		42,7
5	12,5		0,4
17	13,3		0,2
7	0,6		0,4
8	66,4		54,5
24	2,0		0,4
25	1,9		0,8

Делается заключение о том, что аналоги с дисульфидом к В3 в общем являются более стабильными, чем аналоги с дисульфидом к В4, и аналоги с дисульфидом к В2 или В1 являются менее стабильными.

Пример 112, определение структуры посредством рентгеноструктурного анализа

Пример условий кристаллизации приведен ниже, однако, точные условия могли бы быть разными для разных аналогов, и оптимальные условия находят скринингом многих разных условий. Кристаллы получают способом диффузии пара сидячей капли из, например, резервуара с раствором, содержащим 0,8 М K/Na тартрат; 0,1 М Tris, pH 8,5; 0,5% PEG MME 5000. Данные получают вращающимся анодом (Rigaku, MicroMax-007HF), оснащенным детектором MarCCD, и обрабатывают XDS (J AppI Crystallogr 26:795-800). Структуру получают молекуляным замещением с использованием Molrep (J AppI Crystallogr 30:1022-1025.) со структурой, полученной собственными силами авторов изобретения, в качестве модели поиска. Уточнение данных и построение модели осуществляется с использованием программ Refmac (Acta Crystallogr D 53:240-255.) и Coot (Acta Crystallogr D 60:2126-2132.).

Пример 113, денатурация с гуанидиния гидрохлоридом

Денатурацию отобранных производных инсулина, содержащих дополнительные дисульфидные связи, с гуанидиния гидрохлоридом можно отслеживать спектроскопией кругового дихроизма (CD) для того, чтобы определить свободную энергию разворачивания. При денатурации белка отрицательный CD в интервале дальнего УФ (240-218 нм) постепенно снижается, что согласуется с потерей упорядоченной вторичной структуры, которая сопровождает разворачивание белка. CD спектр человеческого инсулина в дальнем УФ является чувствительным как к разворачиванию белка, так и к самоассоциации (Holladay et al., 1977 Biochim. Biophys. Acta 494, 245-254.; Melberg & Johnson, 1990, Biochim. Biophys. Acta 494, 245-254.). Для того чтобы разделить данные явления при рН 8, проводятся титрования GuHCl при разных концентрациях белка, например 3, 37 и 250 мкМ. При этих концентрациях аналоги инсулина существуют, главным образом, в виде мономеров, димеров и смеси димеров и агрегатов более высокого порядка. CD спектр инсулина в интервале ближнего УФ (330-250 нм) отражает окружение тирозинового хромофора с вкладами дисульфидных связей (Morris et al., 1968, Biochim. Biophys. Acta. 160, 145-155.; Wood et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta. 160, 145-155.; Strickland & Mercola, 1976, Biochemistry 15, 3875-3884.). Следует построить графики изменений молярных эллиптичностей как в областях ближнего, так и дальнего УФ как функцию концентрации деатурирующего агента. Свободная энергия разворачивания была ранее рассчитана из таких кривых денатурации инсулина, аппроксимированных при помощи двухуровневой модели (Kaarsholm, N.C. et al 1993 Biochemistry, 32, 10773-8).

Концентрации белка определяют посредством поглощения в УФ и/или ВЭЖХ-ОФ, и/или гель-фильтрацией на основе ВЭЖХ. Денатурировавшие образцы получают объединением разных соотношений маточных растворов белка и GuHCl с 10 мМ Tris/C104 буфером, рН 8,0. Маточные растворы белка типично имеют концентрацию 1,5 мМ в 10 мМ Tris/C104, рН 8,0. Маточные растворы GuHCl имеют концентрацию 8,25 М (определенную рефрактометрией) в 10 мМ Tris/C104, pH 8,0. Все CD спектры записывают при 25°С. Образцы для определения денатурации посредством CD в дальнем УФ сканируют от 250 до 218 нм. Типичная длина пути ячейки и концентрация белка составляют 0,2 см и 37 пМ соответственно. Образцы для определения денатурации посредством CD в ближнем УФ сканируют от 330 до 250 нм, используя длину пути 1 см и типично 75 пМ белка. Перед вычитанием подходящих пустых образцов, содержащих только растворитель, все спектры сглаживают посредством алгоритма с трансформацией Фурье. В интервале дальнего УФ Δε основан на молярной концетрации пептидной связи, тогда как в ближнем УФ Де нормируют относительно молярной концентрации мономера инсулина.

Кривые денатурации в GuHCl анализируют, предполагая, что переход сворачивание/разворачивание является бистабильным, при котором константы равновесия можно определить при каждой концентрации денатурирующего агента с использованием K=(Δε_N-Δε)/(Δε-Δε_U), где Δε представляет собой наблюдаемое значение CD, и Δε_N и Δε_U представляют собой значения CD для нативных и развернутых форм соответственно при данной концентрации GuHCl (Расе, С.N. (1975) CRC Crit. Rev. Biochem. 3, 1-43.). Значения Δε_N и Δε_U при концентрациях GuHCl в переходной области получали линейной экстраполяцией базовых линий до- и послепереходного состояния в переходную область, т.е. Δε_N=Δε°_N+m_N[GuHCl] и Δε_U=Δε°_U+m_U[GuHCl], где Δε°_N и Δε°_U представляют собой точки пересечения, и гпм и mu представляют собой наклоны базовых линий до- и послепереходного состояния соответственно. Свободная энергия разворачивания при данной концентрации денатурирующего агента в переходной зоне задана ΔG=-RT In K. Авторы изобретения предполагают линейную зависимость ΔG от концентрации денатурирующего агента: ΔG=ΔG_H2O-m[GuHCl], где ΔG_H2O представляет собой значение ΔG в отсутствие денатурирующего агента, и m является мерой зависимости ΔG от концентрации денатурирующего агента. Следовательно, значения ΔG, полученные из K в переходной зоне, могут быть экстраполированы обратно к концентрации денатурирующего агента 0 М, с получением ΔG_H2O. Связь между Δε и [GuHCl] для кривой полного разворачивания показана в уравнении 1 (Santoro, М. М., & Bolen, D. W. (1988) Biochemistry 27, 8063-8068.):

Δε={(Δε°_N+m_N[GuHCl])+(Δε°_U+m_U[GuHCl]) ехр[-(ΔG_H2O-m[GuHCl])/RT)}/{(I+ехр[-(ΔG_H2O-m[GuHCl])/RT]}

С Δε в качестве ответа и [GuHCl] в качестве независимой переменной, данное уравнение подвергается анализу нелинейным методом наименьших квадратов, используя, например, методику NLIN PC SAS (SAS Inc., Cary, NC). Тогда кривую денатурации описывают шесть параметров: Δε°_N, Δε°_U, m_N, m_U, m и ΔG_H2O. Кроме того, концентрация GuHCl в срединной точке кривой денатурации, C_mid, задана ΔG_H2O/m.Разницу свободной энергии разворачивания между человеческим и мутантным инсулинами тогда можно рассчитать из ΔΔG_H2O=ΔG_H2O(мутантный)-ΔG_H2O(дикого типа).

Пример 114, точное определение интактной массы

Оборудование ЖХ-МС состоит из системы Acquity UPLC (Waters, Milford, МА) и масс-спектрометра Synapt G2 (Waters, Milford, MA). Аналоги инсулина наносятся на С18 колонку ВЭЖХ с обращенной фазой и анализируются с использованием линейного градиента ацетонитрила в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте. Ток от ВЭЖХ наносится непосредственно на электрораспылительную поверхность раздела Synapt G2, работающего только в режиме положительной МС, с капиллярным потенциалом 2500 В, температурой источника 110°С, температурой десольватации 250°С и током газа в конусе (N₂) 50 л/ч. Спектры МС от m/z=100 до m/z=3000 получают два раза в секунду. До анализов прибор калибруют стандартной смесью Nal, и во время анализов ЖХ-МС наносят замыкающий спрэй лейцин энкефалина. Массы интактного инсулина реконструируют посредством BioPharmaLynx 1.2 (Waters, Milford, MA) с использованием алгоритма MaxEntS. Вместо Synapt G2 можно использовать масс-спектрометр Orbitrap XL (Thermo Fisher). Прибор Orbitrap работает в режиме положительной МС с напряжением источника 4 кВ, током источника 100 мкА, током газа в кожухе 40, током вспомогательного газа 10, током продувочного газа 5, напряжением на капилляре 20 В. Все параметры МС корректируются во время настройки приборов для оптимальной работы и могут слегка отклоняться от параметров, приведенных выше. Точность массы, полученной данным способом, лучше, чем 10 млн^-1.

Колонка:	Acquity ВЕН С18 1×150 мм, 1,7 мкм (Waters)
Ток:	0,1 мл/мин
Буфер А:	0,02% (об./об.) или 0,05% (об./об.) TFA
Буфер Б:	0,02% (об./об.) или 0,04% (об./об.) TFA в ацетонитриле
Градиент:	5% Б в течение 2 мин; от 5% Б до 50% Б за 12 мин, от 50% Б до 90% Б за 1 мин
УФ детекция:	215 нм

Claims

1. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем и имеющее две цистеиновые замены и боковую цепь, присоединенную к инсулину, где сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина, и сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, и где указанные замены на цистеин осуществлены в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:
А10С, В2С;
А10С, В3С; и
А10С, В4С;
где указанная боковая цепь присоединена к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине, и
где указанное производное человеческого инсулина имеет более пролонгированный профиль, чем производные инсулина без одной дополнительной дисульфидной связи.

2. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по п. 1, где указанные замены на цистеин осуществлены в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:
А10С, В2С;
А10С, В3С; и
А10С, В4С.

3. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по п. 2, где указанные замены на цистеин осуществлены в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:
А10С, В3С; и
А10С, В4С.

4. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по п. 3, где указанные замены на цистеин осуществлены в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данными положениями являются А10С и В3С.

5. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по п. 3, где указанные замены на цистеин осуществлены в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данными положениями являются А10С и В4С.

6. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-5, где инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В2С, В25А, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В2С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25А, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, B25N, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, desB1, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Н, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
и боковая цепь присоединена эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи.

7. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-5, где инсулин выбран из группы, состоящей из следующих:
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25А, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, В28Е, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, B25N, В27Е, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, B25N, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, desB1, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Н, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В3С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В3С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В4С, В25Н, desB27, desB30 человеческий инсулин,
А10С, В4С, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, desB30 человеческий инсулин,
и боковая цепь присоединена эпсилон аминогруппе остатка лизина в В-цепи.

8. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по п. 1, где указанная боковая цепь представляет собой ацильную группировку общей формулы Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-, где n равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 3; m равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 10; р равен 0 или представляет собой целое число в интервале от 1 до 10; Асу представляет собой жирную кислоту или жирную дикислоту, содержащую от примерно 8 до примерно 24 атомов углерода; АА1 представляет собой остаток нейтральной линейной или циклической аминокислоты, АА2 представляет собой остаток кислой аминокислоты; АА3 представляет собой остаток нейтральной алкиленгликольсодержащей аминокислоты; порядок, в котором АА1, АА2 и АА3 появляются в формуле, может независимо взаимоизменяться.

9. Производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-5 или 8, выбранное из группы, состоящей из:
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εоктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N(эпс)Октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, desB1, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Н, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, В29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εМиристил), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В4С, B29K(N^εМиристил), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиол-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В2С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В2С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В2С, B29K(N^εгексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В2С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В3С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В3С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В3С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В4С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В4С, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В4С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, В4С, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εГексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εОктадекандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu-OEG-OEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Н, В25Н, B29K(N^εЭйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В2С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В25Н, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)гексадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)октадекандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, desB27, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-gGlu-2xOEG), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В3С, В16Н, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин;
А10С, А14Е, В4С, В16Е, В25Н, B29K(N(эпс)эйкозандиоил-2xgGlu), desB30 человеческий инсулин.

10. Способ стабилизации человеческого инсулина, включающий замену двух аминокислот инсулина остатками цистеина и присоединение к инсулину боковой цепи, где
а) сохраняются три дисульфидные связи человеческого инсулина и
б) сайты цистеиновых замен выбраны таким образом, что введенные остатки цистеина размещаются в трехмерной структуре свернутого производного инсулина для обеспечения образования одной дополнительной дисульфидной связи, не присутствующей в человеческом инсулине, где указанные замены на цистеин осуществляют в двух положениях указанного модифицированного инсулина, где данные положения выбраны из группы, состоящей из:
А10С, В2С;
А10С, В3С;
А10С, В4С;
создавая посредством этого производное человеческого инсулина, обладающее пролонгированным профилем, содержащее одну дополнительную дисульфидную связь, не присутствующую в человеческом инсулине,
где указанная боковая цепь присоединена к N-концу инсулина или эпсилон аминогруппе остатка лизина в инсулине.

11. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения гипергликемии, диабета 2-го типа, нарушенной толерантности к глюкозе и диабета 1-го типа, содержащая эффективное количество производного человеческого инсулина, обладающего пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемые вещества и/или эксципиенты.

12. Способ лечения сахарного диабета у субъекта, включающий введение субъекту производного человеческого инсулина, обладающего пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-9 или фармацевтической композиции по п. 11.

13. Способ получения фармацевтической композиции по п. 11, включающий смешивание производного человеческого инсулина, обладающего пролонгированным профилем, по любому из пп. 1-9 с фармацевтически приемлемыми веществами и/или эксципиентами.