RU2575075C2 - Method of detection of microorganisms belonging to species of mycoplasma pneumoniae mind and/or mycoplasma genitalium - Google Patents
Method of detection of microorganisms belonging to species of mycoplasma pneumoniae mind and/or mycoplasma genitalium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575075C2 RU2575075C2 RU2012127809/10A RU2012127809A RU2575075C2 RU 2575075 C2 RU2575075 C2 RU 2575075C2 RU 2012127809/10 A RU2012127809/10 A RU 2012127809/10A RU 2012127809 A RU2012127809 A RU 2012127809A RU 2575075 C2 RU2575075 C2 RU 2575075C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mycoplasma
- dnak
- mycoplasma pneumoniae
- antibody
- pneumoniae
- Prior art date
Links
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 116
- 229940013390 Mycoplasma pneumoniae Drugs 0.000 title claims abstract description 111
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 title claims abstract description 72
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 58
- 241000894007 species Species 0.000 title description 6
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims description 96
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 claims description 5
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 33
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 33
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 32
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 31
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 21
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 17
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 11
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000002609 media Substances 0.000 description 9
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 8
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920001670 16S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 7
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 6
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 6
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 6
- 210000003800 Pharynx Anatomy 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 5
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- HQOJMTATBXYHNR-UHFFFAOYSA-M thallium(I) acetate Chemical compound [Tl+].CC([O-])=O HQOJMTATBXYHNR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 101700057829 CENPL Proteins 0.000 description 4
- 241000439309 Mycoplasma pneumoniae M129-B7 Species 0.000 description 4
- 208000000143 Urethritis Diseases 0.000 description 4
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000203024 Acholeplasma Species 0.000 description 3
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010000345 Immobilized Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 3
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 3
- 206010028470 Mycoplasma infection Diseases 0.000 description 3
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003567 Ascitic Fluid Anatomy 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229940038705 Chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000432072 Mycoplasma pneumoniae M129 Species 0.000 description 2
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 206010040490 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 2
- 230000002085 persistent Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 201000003176 severe acute respiratory syndrome Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203022 Acholeplasma laidlawii Species 0.000 description 1
- 241001495110 Acholeplasma oculi Species 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 Bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003311 CFU-EM Anatomy 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010064525 Chlamydial cervicitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N Cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headache Diseases 0.000 description 1
- 101710006547 Hsp70Ab Proteins 0.000 description 1
- 102000004854 Immunoglobulin M Human genes 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 206010025482 Malaise Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 210000002200 Mouth Mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000202956 Mycoplasma arthritidis Species 0.000 description 1
- 241000544264 Mycoplasma buccale Species 0.000 description 1
- 241000565677 Mycoplasma faucium Species 0.000 description 1
- 241000204048 Mycoplasma hominis Species 0.000 description 1
- 241000202966 Mycoplasma lipophilum Species 0.000 description 1
- 241000202894 Mycoplasma orale Species 0.000 description 1
- 241001135743 Mycoplasma penetrans Species 0.000 description 1
- 241000202892 Mycoplasma pirum Species 0.000 description 1
- 241000462791 Mycoplasma pneumoniae FH Species 0.000 description 1
- 241001466614 Mycoplasma pneumoniae MAC Species 0.000 description 1
- 241000403954 Mycoplasma pneumoniae PI 1428 Species 0.000 description 1
- 241000544275 Mycoplasma primatum Species 0.000 description 1
- 241000202889 Mycoplasma salivarium Species 0.000 description 1
- 241000894426 Mycoplasma spermatophilum Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002850 Nasal Mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035724 Pneumonia mycoplasmal Diseases 0.000 description 1
- 229940093430 Polyethylene Glycol 1500 Drugs 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108050000743 Ribosomal protein L7/L12 Proteins 0.000 description 1
- 102000008837 Ribosomal protein L7/L12 Human genes 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M Sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 241000935255 Ureaplasma parvum Species 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 206010046482 Urethritis chlamydial Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000024126 agglutination involved in conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002725 anti-mycoplasma Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 108060003523 dnaK Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin family Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 101710004799 sm-amp-x Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000002306 tributylsilyl group Chemical group C(CCC)[Si](CCCC)(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к способу и к набору реагентов для обнаружения микроорганизмов, принадлежащих виду Mycoplasma pneumoniae, который, как правило, является патогенным микроорганизмом, вызывающим пневмонию, и/или виду Mycoplasma genitalium, используя в качестве индикатора молекулу, специфичную для обнаружения микроорганизмов.The present invention relates to a method and a kit of reagents for detecting microorganisms belonging to the species Mycoplasma pneumoniae, which, as a rule, is a pathogenic microorganism that causes pneumonia, and / or species Mycoplasma genitalium , using as an indicator a molecule specific for the detection of microorganisms.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
(1) Процент пациентов и симптомы пневмонии, вызываемой Mycoplasma pneumoniae (1) Percentage of patients and symptoms of Mycoplasma pneumoniae pneumonia
Инфекции, вызываемые Mycoplasma pneumoniae, относят к внебольничной атипичной пневмонии и сообщается, что процент инфекций, вызываемых Mycoplasma pneumoniae, среди внебольничных пневмоний составляет от 30 до 40% у взрослых или даже от 60 до 70%, если взрослых ограничить совершеннолетними в возрасте от 15 до 25 лет. Респираторный тракт является путем инфицирования Mycoplasma pneumoniae и зачастую благоприятными условиями распространения инфекции, являются, например, школа и семья. Кроме того, при инфекциях, вызываемых Mycoplasma pneumoniae, пневмония встречается приблизительно в от 3 до 5% случаях, а в остальных случаях возникает бронхит, воспаление верхних дыхательных путей или инфекция протекает бессимптомно. Характерные симптомы включают упорный кашель, при котором отсутствует мокрота начальной стадии инфекции, который иногда может сопровождаться такими симптомами как высокая температура, головная боль, боль в горле, озноб или общее недомогание.Infections caused by Mycoplasma pneumoniae are attributed to community-acquired SARS and it is reported that the percentage of infections caused by Mycoplasma pneumoniae among community-acquired pneumonia is 30 to 40% in adults or even 60 to 70% if adults are limited to adults between the ages of 15 and 25 years. The respiratory tract is an infection of Mycoplasma pneumoniae and often favorable conditions for the spread of infection are, for example, school and family. In addition, in infections caused by Mycoplasma pneumoniae , pneumonia occurs in approximately 3 to 5% of cases, and in other cases bronchitis occurs, inflammation of the upper respiratory tract or the infection is asymptomatic. Typical symptoms include persistent coughing, in which there is no sputum at the initial stage of infection, which can sometimes be accompanied by symptoms such as fever, headache, sore throat, chills, or general malaise.
(2) Нынешнее состояние скрининга инфекций, вызываемых Mycoplasma pneumoniae (2) Current status of screening for infections caused by Mycoplasma pneumoniae
Скрининговое исследование культуры из мазка, взятого из зева пациентов и скрининговое исследование на антитела с исследованием сыворотки пациента являются принятыми в качестве скрининговых исследований инфекции, вызываемой Mycoplasma pneumoniae. Поскольку Mycoplasma pneumoniae сама по себе растет только в специальной культуральной среде, то культивирование сложно осуществимо, и для окончательной идентификации Mycoplasma pneumoniae необходимо проведение ПЦР, культуральный скрининг может быть проведен только в ограниченном числе лабораторий, и это нынешнее состояние скринингового исследования культуры. Кроме того, необходимо скрининговое исследование для быстрого получения результатов, так как для выращивания культуры необходимо несколько недель.Screening studies of culture from a smear taken from the pharynx of patients and screening for antibodies with a study of the serum of the patient are accepted as screening studies of infection caused by Mycoplasma pneumoniae . Since Mycoplasma pneumoniae itself grows only in a special culture medium, cultivation is difficult and the final identification of Mycoplasma pneumoniae requires PCR, culture screening can only be done in a limited number of laboratories, and this is the current state of the culture screening study. In addition, a screening study is needed to quickly obtain results, since it takes several weeks to grow a crop.
С другой стороны, поскольку скрининговое исследование на антитело обычно является простым с точки зрения методики проведения и быстрее дает результаты по сравнению со скрининговым исследованием культуры, то такое скрининговое исследование на антитело является широкоиспользуемым исследованием. Но у этого исследования существуют сложности определения того является ли инфекцией, существовавшей ранее, или инфекцией, присутствующей в настоящее время, так как титры антитела IgM к Mycoplasma долго присутствуют в сыворотке, и требуется длительное время для повышения титров антител. Для решения указанных выше проблем рекомендована оценка, основанная на повышении титров антител между острой фазой инфекции и фазой выздоровления в динамике по времени, но поскольку требуется очень длительное время для проведения анализа антител до фазы выздоровления, то лечение откладывается, и такая задержка в лечении может вызвать пролонгирование и ухудшение симптомов, а также нежелательный эффект утяжеления инфекции вследствие присоединения вторичной инфекции.On the other hand, since antibody screening is usually simple from the point of view of the methodology and gives faster results compared to culture screening, such antibody screening is a widely used study. But this study has difficulties in determining whether a pre-existing infection or currently present infection, since anti- Mycoplasma IgM antibody titers are present in serum for a long time, and it takes a long time to increase antibody titers. To solve the above problems, an assessment is recommended based on an increase in antibody titers between the acute phase of infection and the recovery phase over time, but since it takes a very long time to analyze the antibodies before the recovery phase, treatment is delayed, and such a delay in treatment can cause prolongation and worsening of symptoms, as well as the undesirable effect of worsening the infection due to the attachment of a secondary infection.
Кроме того, для решения указанных выше проблем, описаны антитела и способы обнаружения для специфического выявления микроорганизма, принадлежащего Mycoplasma pneumoniae, которые могут использоваться для диагностики инфекций Mycoplasma pneumoniae.In addition, to solve the above problems, antibodies and detection methods are described for the specific detection of a microorganism belonging to Mycoplasma pneumoniae , which can be used to diagnose Mycoplasma pneumoniae infections .
Например, в патентной литературе 1 описан способ иммунодетекции с использованием моноклонального антитела против антигенного белка мембраны Mycoplasma pneumoniae размером приблизительно 43 килодальтон (кДа). Также в патентной литературе 2 описано, что выявление Mycoplasma pneumoniae можно проводить с высокой точностью, используя антитела против рибосомального белка L7/L12. Кроме того, в патентной литературе 3 описано, что быстрое и специфическое диагностирование инфекции Mycoplasma pneumoniae возможно при использовании моноклонального антитела против белка P1 Mycoplasma pneumoniae, моноклональное антитело обладает перекрестной реактивностью только с 1% или менее других видов рода Mycoplasma или другими патогенными видами сопутствующей флоры.For example,
Однако для обнаружения микроорганизма, принадлежащего виду Mycoplasma pneumoniae, в клинических образцах, антитело, описанное выше, и в способе выявления с использованием антитела могут потребоваться сложная предварительная обработка образцов, содержащих микроорганизм, и существующая проблема заключается в том, что они не подходят для специфического диагностирования Mycoplasma pneumoniae вследствие сохраняющейся низкой специфичности и чувствительности.However, in order to detect a microorganism belonging to the species Mycoplasma pneumoniae in clinical samples, the antibody described above and in the detection method using the antibody may require complex preliminary processing of samples containing the microorganism, and the existing problem is that they are not suitable for specific diagnosis Mycoplasma pneumoniae due to persistent low specificity and sensitivity.
(3) Mycoplasma genitalium и заболевания(3) Mycoplasma genitalium and disease
Бактерия Chlamydia trachomatis известна как основная причина негонококкового уретрита. Однако Chlamydia trachomatis обнаруживается приблизительно у от 30 до 40% пациентов с негонококковым уретритом, и в большинстве случаев не понятно, с чем связаны возникающие симптомы. Кроме Chlamydia trachomatis особое внимание заслуживают микроорганизмы родов Mycoplasma и Ureaplasma, и, в частности, было показано, что Mycoplasma genitalium является одной из бактерий, вызывающих негонококковый уретрит и заболевания, передающиеся половым путем.The bacterium Chlamydia trachomatis is known as the main cause of non-gonococcal urethritis. However, Chlamydia trachomatis is found in approximately 30 to 40% of patients with non-gonococcal urethritis, and in most cases it is not clear what the resulting symptoms are. In addition to Chlamydia trachomatis , microorganisms of the genera Mycoplasma and Ureaplasma deserve special attention, and, in particular, it was shown that Mycoplasma genitalium is one of the bacteria that causes non-gonococcal urethritis and sexually transmitted diseases.
(4) Нынешнее состояние скрининга инфекций, вызываемых Mycoplasma genitalium (4) Current status of screening for infections caused by Mycoplasma genitalium
Отчеты об инфекциях, вызываемых Mycoplasma genitalium, выявленных культуральным методом или методом ПЦР, опубликованы в научных статьях, но поскольку быстрое диагностирование не может быть осуществлено указанными методами, требуется способ быстрого и специфического выявления микроорганизма, принадлежащего Mycoplasma genitalium, в клинических образцах.Reports of infections caused by Mycoplasma genitalium, detected by culture or PCR, are published in scientific articles, but since quick diagnosis cannot be carried out by these methods, a method for the rapid and specific detection of a microorganism belonging to Mycoplasma genitalium in clinical samples is required.
ПЕРЕЧЕНЬ ЦИТИРУЕМЫХ ССЫЛОКLIST OF QUOTED LINKS
ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРАPATENT LITERATURE
[Патентная литература 1] Японская патентная публикация (Kokai) No. 63-298, по которой не проведена экспертиза[Patent Literature 1] Japanese Patent Publication (Kokai) No. 63-298, on which the examination was not conducted
[Патентная литература 2] Международный патент WO2001/057199[Patent literature 2] International patent WO2001 / 057199
[Патентная литература 3] Японская патентная публикация (Kokai) No. 5-304990, по которой не проведена экспертиза[Patent Literature 3] Japanese Patent Publication (Kokai) No. 5-304990, for which no examination was conducted
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМАTECHNICAL PROBLEM
Согласно общепринятым методам, микроорганизмы, принадлежащие видам Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, не могут быть выявлены быстро и специфически. Таким образом, поскольку невозможно быстро диагностировать инфекции, вызванные Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, лечение откладывается, и его задержка может вызвать пролонгирование и ухудшение симптомов, а также нежелательный эффект распространения инфекции вследствие вторичной инфекции. Это текущая ситуация. Если инфекции, вызванные указанными микоплазмами, можно быстро выявить/диагностировать, становится возможным ввести макролидный антибиотик, эффективный в отношении микоплазм и начать соответствующее лечение на ранней стадии инфекции.According to generally accepted methods, microorganisms belonging to the species Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium cannot be detected quickly and specifically. Thus, since it is not possible to quickly diagnose infections caused by Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium , treatment is delayed and its delay can cause prolongation and worsening of symptoms, as well as the undesirable effect of the spread of infection due to secondary infection. This is the current situation. If infections caused by these mycoplasmas can be quickly detected / diagnosed, it becomes possible to introduce a macrolide antibiotic effective against mycoplasmas and begin appropriate treatment at an early stage of infection.
Кроме того, известно, что Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium серологически очень близки друг к другу, но поскольку очаг инфекции (например, ткани и органы) Mycoplasma pneumoniae отличается от очага инфекции Mycoplasma genitalium, как упоминалось выше, если возможно идентифицировать молекулу, способную обеспечить специфическое выявление двух микроорганизмов, считается, что диагностирование обоих инфекционных заболеваний становится возможным с применением такой молекулы в качестве индикатора.In addition, it is known that Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium are serologically very close to each other, but since the site of infection (for example, tissues and organs) of Mycoplasma pneumoniae is different from the site of infection of Mycoplasma genitalium, as mentioned above, if it is possible to identify a molecule capable of providing a specific identification of two microorganisms, it is believed that the diagnosis of both infectious diseases becomes possible using such a molecule as an indicator.
Настоящее изобретение было выполнено с учетом указанных проблем. Целью настоящего изобретения является определение молекулы для быстрого и специфического диагностирования инфекции Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium и предоставление способа выявления и набора для выявления с применением молекулы в качестве индикатора.The present invention has been made in view of these problems. An object of the present invention is to determine a molecule for the rapid and specific diagnosis of Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium infection and to provide a detection method and kit for detection using the molecule as an indicator.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫSOLUTION
В указанных обстоятельствах авторы настоящего изобретения проводили интенсивные исследования и обнаружили, что DnaK микроорганизмов, принадлежащих виду Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, может быть использован в качестве индикатора для быстрого и специфического выявления инфекций Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium. Белок DnaK, который также называют белком теплового шока 70 (Hsp70), обнаружен в виде группы белков, экспрессия которых возрастала, когда клетки подвергали воздействию стрессовых условий, например, нагреванию, для защиты клеток, и в настоящее время, известно, что он участвует во внутриклеточном транспорте или рефолдинге (функция молекулярного шаперона) транслируемых белков. Преимущества применения белка DnaK в качестве показателя в методах иммунологического анализа заключаются в том, что:In these circumstances, the authors of the present invention conducted intensive research and found that the DnaK of microorganisms belonging to the species Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium can be used as an indicator for the rapid and specific detection of infections of Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium . The DnaK protein, also called heat shock protein 70 (Hsp70), is found as a group of proteins whose expression increased when cells were exposed to stressful conditions, such as heat, to protect cells, and it is now known to be involved in intracellular transport or refolding (a function of molecular chaperone) of translated proteins. The advantages of using DnaK protein as an indicator in immunoassay methods are that:
(1) белок DnaK всегда экспрессируется, потому что он участвует в транспорте или рефолдинге белков,(1) DnaK protein is always expressed because it is involved in the transport or refolding of proteins,
(2) DnaK составляет приблизительно 1% общих белков, и(2) DnaK is about 1% of the total proteins, and
(3) DnaK представлен не в виде мономера, но в виде тримера, гексамера или других мультимеров.(3) DnaK is not represented as a monomer, but as a trimer, hexamer or other multimers.
Настоящее изобретение осуществлено на основе указанных данных.The present invention is based on these data.
Настоящее изобретение предоставляется в следующем виде:The present invention is provided as follows:
[1] Способ обнаружения Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium, отличающийся применением DnaK Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium в качестве индикатора.[1] A method for detecting Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium , characterized in using DnaK Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium as an indicator.
[2] Способ по [1], в котором белок DnaK анализируют иммунологически.[2] The method of [1], wherein the DnaK protein is immunologically assayed.
[3] Антитело anti-DnaK, специфичное к Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium.[3] An anti-DnaK antibody specific for Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium .
[4] Набор для обнаружения Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium, содержащий антитело anti-DnaK [3].[4] For the detection of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium, containing anti-DnaK antibody [3].
[5] Способ по [1], с применением гена DnaK в качестве индикатора.[5] The method according to [1], using the DnaK gene as an indicator.
[6] Праймер или зонд, специфичный к Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium.[6] A primer or probe specific for Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium .
[7] Набор для обнаружения Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium, содержащий праймер или зонд [6].[7] A kit for detecting Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium containing a primer or probe [6].
Термин "микроорганизмы", который используется в описании, означает Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium, в особенности, микроорганизмы, которые обладают патогенностью и имеют большое значение для диагностики в качестве микроорганизмов, вызывающих заболевания, описанные ниже.The term "microorganisms", as used herein, means Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium , in particular microorganisms that are pathogenic and of great importance for diagnosis as the microorganisms causing the diseases described below.
Термин "антитело, которое специфически реагирует с микроорганизмами", который используется в описании, означает антитело, которое специфически реагирует с видом или родом микроорганизмов. Антитело, которое специфически реагирует с видом микроорганизмов, является особенно полезным в диагностировании инфекций, вызываемых микроорганизмами.The term "antibody that specifically reacts with microorganisms", as used herein, means an antibody that specifically reacts with a species or genus of microorganisms. An antibody that specifically reacts with a species of microorganisms is particularly useful in diagnosing infections caused by microorganisms.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯUSEFUL EFFECTS OF THE INVENTION
Согласно способу определения микроорганизмов, принадлежащих к Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, с применением специфической молекулы в качестве индикатора в настоящем изобретении, инфекции Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, инфекции, вызванные указанными микроорганизмами, можно быстро и специфически диагностировать.According to a method for determining microorganisms belonging to Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium , using a specific molecule as an indicator in the present invention, infections of Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium, infections caused by said microorganisms can be quickly and specifically diagnosed.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фиг.1 иллюстрирует сравнение нуклеотидных последовательностей (1-720) генов DnaK (SEQ ID NO: 6) в штаммах Mycoplasma pneumoniae M129 (генотип P1: тип I) и FH (генотип P1: тип II).Figure 1 illustrates a comparison of the nucleotide sequences (1-720) of DnaK genes (SEQ ID NO: 6) in strains of Mycoplasma pneumoniae M129 (genotype P1: type I) and FH (genotype P1: type II).
Фиг.2 иллюстрирует, исходя из Фиг.1, сравнение нуклеотидных последовательностей (721-1440) генов DnaK в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Figure 2 illustrates, based on Figure 1, a comparison of the nucleotide sequences (721-1440) of DnaK genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.3 иллюстрирует, исходя из фиг.1 и фиг.2, сравнение нуклеотидных последовательностей (1441-1788) генов DnaK в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Figure 3 illustrates, based on figure 1 and figure 2, a comparison of the nucleotide sequences (1441-1788) of the DnaK genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.4 иллюстрирует сравнение нуклеотидных последовательностей (1-717 для штамма M129) генов P1 (штамм M129: SEQ ID NO: 7, и штамм FH: SEQ ID NO: 8) в штаммах Mycoplasma pneumoniae M129 (генотип P1: тип I) и FH (генотип P1: тип II).Figure 4 illustrates a comparison of the nucleotide sequences (1-717 for strain M129) of the P1 genes (strain M129: SEQ ID NO: 7 and strain FH: SEQ ID NO: 8) in Mycoplasma pneumoniae M129 strains (genotype P1: type I) and FH (genotype P1: type II).
Фиг.5 иллюстрирует, исходя из фиг.4, сравнение нуклеотидных последовательностей (718-1416 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Figure 5 illustrates, based on figure 4, a comparison of the nucleotide sequences (718-1416 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.6 иллюстрирует, исходя из фиг.4 и фиг.5, сравнение нуклеотидных последовательностей (1417-2136 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Fig.6 illustrates, based on Fig.4 and Fig.5, a comparison of the nucleotide sequences (1417-2136 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.7 иллюстрирует, исходя из фиг.4-6, сравнение нуклеотидных последовательностей (2137-2856 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Fig.7 illustrates, based on Fig.4-6, a comparison of the nucleotide sequences (2137-2856 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.8 иллюстрирует, исходя из фиг.4-7, сравнение нуклеотидных последовательностей (2857-3564 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Fig.8 illustrates, based on Fig.4-7, a comparison of the nucleotide sequences (2857-3564 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.9 иллюстрирует, исходя из фиг.4-8, сравнение нуклеотидных последовательностей (3565-4284 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Fig.9 illustrates, based on Fig.4-8, a comparison of the nucleotide sequences (3565-4284 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
Фиг.10 иллюстрирует, исходя из фиг.4-9, сравнение нуклеотидных последовательностей (4285-4884 для штамма M129) генов P1 в обоих штаммах Mycoplasma pneumoniae.Figure 10 illustrates, based on figure 4-9, a comparison of the nucleotide sequences (4285-4884 for strain M129) of the P1 genes in both strains of Mycoplasma pneumoniae .
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЙDESCRIPTION OF EMBODIMENTS
Настоящее изобретение далее будет подробно проиллюстрировано, но не с целью ограничения, следующими вариантами осуществления настоящего изобретения в качестве типичных примеров.The present invention will now be illustrated in detail, but not for the purpose of limiting, to the following embodiments of the present invention as typical examples.
Способ настоящего изобретения для выявления Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium отличается тем, что DnaK микроорганизмов используется в качестве индикатора для выявления Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium (т.е. либо Mycoplasma pneumoniae, либо Mycoplasma genitalium, или обе Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium, наиболее предпочтительно, обе Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium). Инфекции, вызываемые Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, можно диагностировать путем выявления микроорганизмов.The method of the present invention for detecting Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium is characterized in that DnaK of microorganisms is used as an indicator for detecting Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium (i.e., either Mycoplasma pneumoniae, or Mycoplasma genitalium , or both Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma gen most preferably, both Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium ). Infections caused by Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium can be diagnosed by detecting microorganisms.
Инфекция, вызываемая Mycoplasma pneumoniae, которую можно диагностировать с помощью настоящего изобретения, представляет собой микоплазменную пневмонию. Инфекция, вызываемая Mycoplasma genitalium, представляет собой негонококковый нехламидиальный уретрит или цервицит.The infection caused by Mycoplasma pneumoniae , which can be diagnosed using the present invention, is mycoplasma pneumonia. Mycoplasma genitalium infection is a non-gonococcal non-chlamydial urethritis or cervicitis.
При диагностике инфекции, вызываемой Mycoplasma pneumoniae, можно использовать образец, в котором может находиться Mycoplasma pneumoniae. Примеры образца включают мазок из зева, носоглоточный мазок, назальный аспират, назальную слизь, мокроту и жидкость, полученную с помощью бронхоальвеолярного лаважа. Если инфекция, вызываемая Mycoplasma genitalium, является инфекцией, которую нужно диагностировать, можно использовать образец, в котором может находиться Mycoplasma genitalium. Пример образца включает мочу, препараты уретральных мазков и препараты цервикальных мазков. Идентификацию двух инфекций можно разрешить путем выбора места забора образца в качестве мишени для измерения.When diagnosing an infection caused by Mycoplasma pneumoniae , you can use a sample in which Mycoplasma pneumoniae can be located. Examples of the sample include a throat swab, nasopharyngeal swab, nasal aspirate, nasal mucus, sputum and fluid obtained by bronchoalveolar lavage. If the infection caused by Mycoplasma genitalium is an infection that needs to be diagnosed, you can use a sample in which Mycoplasma genitalium can be found. An example sample includes urine, urethral smear preparations, and cervical smear preparations. The identification of two infections can be resolved by selecting the sampling site as the target for measurement.
DnaK, который используется в качестве индикатора в настоящем изобретении, представляет собой белок DnaK (номер NCBI: NP_110122) или ген DnaK (номер NCBI: NC_000912 REGION: 521837..523624), полученный из Mycoplasma pneumoniae, или белок DnaK (номер NCBI: AAC71527) или ген DnaK (номер NCBI: L43967 REGION: 374919..376706), полученный из Mycoplasma genitalium. Упомянутые выше белки и гены представляют собой примеры штамма, принадлежащего к микроорганизмам, и последовательности DnaK микроорганизмов в объеме настоящего изобретения включают последовательности, соответствующие белкам и генам DnaK, описанным выше.The DnaK used as an indicator in the present invention is a DnaK protein (NCBI number: NP_110122) or a DnaK gene (NCBI number: NC_000912 REGION: 521837..523624) obtained from Mycoplasma pneumoniae , or a DnaK protein (NCBI number: AAC71527 ) or the DnaK gene (NCBI number: L43967 REGION: 374919..376706) obtained from Mycoplasma genitalium . The proteins and genes mentioned above are examples of a strain belonging to microorganisms, and DnaK sequences of microorganisms within the scope of the present invention include sequences corresponding to the DnaK proteins and genes described above.
Как показано в примере 8, описанном ниже, гены DnaK, полученные из различных штаммов Mycoplasma pneumoniae, полностью (100%) соответствуют друг другу, даже среди штаммов, в которых типы гена P1 Mycoplasma pneumoniae были различны, и не обнаружены варианты среди штаммов, полученных из различных мест и на протяжении последних 50 лет. На основании этого считают, что последовательности гена DnaK и белка DnaK Mycoplasma pneumoniae являются стабильными. Таким образом, предпочтительно ссылаться на нуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности, опубликованные NCBI, как описано выше.As shown in Example 8, described below, DnaK genes obtained from different strains of Mycoplasma pneumoniae are completely (100%) consistent with each other, even among strains in which the types of P1 gene of Mycoplasma pneumoniae were different and no variants were found among the strains obtained from various places and over the past 50 years. Based on this, it is believed that the sequences of the DnaK gene and the DnaK protein of Mycoplasma pneumoniae are stable. Thus, it is preferable to refer to nucleotide sequences or amino acid sequences published by the NCBI, as described above.
1. Способ и набор для выявления микроорганизмов с применением антитела1. Method and kit for detecting microorganisms using antibodies
Первый вариант осуществления способа выявления Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium настоящего изобретения отличается применением антитела anti-DnaK, специфичного к микроорганизмам. Когда выбирают специфическое антитело, специфичность к микроорганизмам составляет по меньшей мере 105 КОЕ/мл или выше, предпочтительно 104 КОЕ/мл или выше, и более предпочтительно 103 КОЕ/мл, и специфичность к другим микроорганизмам составляет по меньшей мере 107 КОЕ/мл или меньше, и предпочтительно 108 КОЕ/мл или меньше.A first embodiment of the method for detecting Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium of the present invention is characterized by the use of an anti-DnaK antibody specific for microorganisms. When a specific antibody is selected, the specificity for microorganisms is at least 10 5 CFU / ml or higher, preferably 10 4 CFU / ml or higher, and more preferably 10 3 CFU / ml, and specificity for other microorganisms is at least 10 7 CFU / ml or less, and preferably 10 8 CFU / ml or less.
Антитело, которое можно применять в настоящем изобретении, может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело. Указанные антитела можно получить следующими способами или другими сходными способами, но способ не ограничивается тем самым способом.An antibody that can be used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies can be obtained by the following methods or other similar methods, but the method is not limited thereto.
В качестве первого варианта осуществления способа получения антитела, полноразмерный белок DnaK или его частичный пептид может быть использован для получения антитела. Что касается микроорганизмов, нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность белка DnaK которых известны, пептидный фрагмент можно синтезировать на основе области, которая меньше сходства с аминокислотными последовательностями белков DnaK других микроорганизмов. Длина пептида для получения антитела не ограничена, но в случае антитела против белка DnaK, можно использовать пептид, имеющий длину, позволяющую охарактеризовать белок, предпочтительно 5 аминокислот или больше, и наиболее предпочтительно 8 аминокислот или больше. Указанный пептид или полноразмерный белок в чистом виде, или их конъюгат, сшитый с белком-носителем, таким как KLH (гемоцианин лимфы улитки) или БСА (бычий сывороточный альбумин), может быть введен животному, необязательно вместе с адъювантом, и сыворотку животного собирают для получения антисыворотки, содержащей антитело (поликлональное антитело), которое распознает белок DnaK. Можно использовать антитело, которое выделяют из антисыворотки. Примеры животного, которое можно инокулировать, включают овцу, лошадь, козу, кролика, мышь и крысу, и кролик или коза являются предпочтительными для получения поликлонального антитела. Моноклональное антитело можно получить согласно известному методу получения гибридомных клеток, и в таком случае предпочтительна мышь.As a first embodiment of a method for producing an antibody, a full-length DnaK protein or partial peptide thereof can be used to produce an antibody. For microorganisms whose nucleotide sequence and amino acid sequence of the DnaK protein are known, the peptide fragment can be synthesized based on a region that is less similar to the amino acid sequences of the DnaK proteins of other microorganisms. The length of the peptide for producing the antibody is not limited, but in the case of an anti-DnaK protein antibody, a peptide having a length allowing the characterization of the protein, preferably 5 amino acids or more, and most preferably 8 amino acids or more, can be used. The specified peptide or full-sized protein in its pure form, or their conjugate crosslinked with a carrier protein such as KLH (cochlear lymphocyte hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin), can be administered to an animal, optionally together with an adjuvant, and the animal serum is collected for for producing an antiserum containing an antibody (polyclonal antibody) that recognizes a DnaK protein. An antibody that is isolated from antiserum can be used. Examples of an animal that can be inoculated include a sheep, horse, goat, rabbit, mouse and rat, and a rabbit or goat are preferred for the preparation of a polyclonal antibody. A monoclonal antibody can be prepared according to a known method for producing hybridoma cells, in which case a mouse is preferred.
В качестве антигена может быть использован полноразмерный гибридный белок или аминокислотная последовательность, состоящая из 5 остатков или больше (предпочтительно 8 остатков или больше) белка и глютатион S-трансферазы или тому подобного, после очистки гибридного белка, или без очистки. Антитело также может быть получено с помощью генетически рекомбинантного антитела, экспрессированного в культуре клеток с применением гена иммуноглобулина, выделенного методом генетического клонирования и различных методов, описанных в публикации: Antibodies; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press.As the antigen, a full-sized fusion protein or amino acid sequence consisting of 5 residues or more (preferably 8 residues or more) of protein and glutathione S-transferase or the like, after or without purification of the fusion protein, can be used. The antibody can also be obtained using a genetically recombinant antibody expressed in cell culture using an immunoglobulin gene isolated by genetic cloning and various methods described in the publication: Antibodies; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Из антител, полученных, как описано выше, антитело, обладающее высокой специфичностью, можно получить путем отбора антитела, которое специфически реагирует с Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium (т.е. либо Mycoplasma pneumoniae, либо Mycoplasma genitalium, или с обеими Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium, наиболее предпочтительно, с обеими Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium), и не реагирует с другими патогенными микроорганизмами, в соответствии с известным методом.From antibodies obtained as described above, an antibody having high specificity can be obtained by selecting an antibody that specifically reacts with Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium (i.e., either Mycoplasma pneumoniae , or Mycoplasma genitalium , or both Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium , most preferably with both Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium ), and does not react with other pathogens in accordance with a known method.
Антитело против DnaK, которое можно использовать в качестве маркерного антигена настоящего изобретения, можно получить с помощью следующих способов или других сходных способов, но способ не ограничивается тем самым способом.An anti-DnaK antibody that can be used as a marker antigen of the present invention can be obtained using the following methods or other similar methods, but the method is not limited to this method.
a) Что касается микроорганизмов, нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность белка DnaK которых известны, пептидный фрагмент можно синтезировать на основе области, которая проявляет меньше сходства с аминокислотными последовательностями белков DnaK других микроорганизмов, и поликлональное или моноклональное антитело можно получить с применением пептидного фрагмента в качестве антигена для получения интересующего антитела.a) For microorganisms whose nucleotide and amino acid sequences of the DnaK protein are known, the peptide fragment can be synthesized based on a region that is less similar to the amino acid sequences of the DnaK proteins of other microorganisms, and a polyclonal or monoclonal antibody can be obtained using the peptide fragment as an antigen to obtain the antibody of interest.
Полноразмерную нуклеотидную последовательность гена можно получить с применением общих методов генной инженерии, таких как амплификация гена методом ПЦР с применением в качестве праймеров последовательностей ДНК, расположенных на обоих концах известного гена, или гибридизация с применением гомологичной последовательности в качестве зонда-матрицы.A full-length nucleotide sequence of a gene can be obtained using general methods of genetic engineering, such as amplification of a gene by PCR using primers DNA sequences located at both ends of a known gene, or hybridization using a homologous sequence as a template probe.
Затем, интересующий белковый антиген можно получить путем создания гибридного гена с генами других белков, введения гибридного гена хозяину, например, E. coli с помощью известного метода введения гена, сверхпродукции гибридного белка, и очистки экспрессированного белка методом аффинной хроматографии на колонке с применением антитела против белка, использованного для получения гибридного белка. В таком случае, учитывая, что полноразмерный белок DnaK становится антигеном, если получают антитело против аминокислотной области, которая сохраняется среди микроорганизмов вне объема изобретения, такое антитело не может быть использовано в настоящем изобретении. Таким образом, с учетом антигена, получаемого указанным способом, интересующее антитело можно получить путем создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, и выбора клона, продуцирующего антитело, которое специфически реагирует с микроорганизмами.Then, the protein antigen of interest can be obtained by creating a hybrid gene with the genes of other proteins, introducing the hybrid gene to the host, for example, E. coli using a known method of introducing the gene, overproducing the hybrid protein, and purifying the expressed protein by column affinity chromatography using anti the protein used to produce the fusion protein. In this case, given that the full-sized DnaK protein becomes an antigen, if you receive an antibody against the amino acid region, which is stored among microorganisms outside the scope of the invention, such an antibody cannot be used in the present invention. Thus, taking into account the antigen obtained by this method, an antibody of interest can be obtained by creating hybridomas producing monoclonal antibodies and selecting a clone producing an antibody that specifically reacts with microorganisms.
b) Что касается микроорганизмов, аминокислотная последовательность белка DnaK которых неизвестна, поскольку аминокислотные последовательности белка DnaK обладают гомологией 80-100%, предпочтительно 90-100%, среди различных видов, интересующий ген белка можно легко получить с применением общих методов генной инженерии, таких как амплификация гена области специфической последовательности с помощью метода ПЦР на основе последовательности, гомологичной аминокислотной последовательности, или гибридизация с применением гомологичной последовательности в качестве зонда-матрицы.b) For microorganisms whose amino acid sequence of the DnaK protein is unknown, since the amino acid sequences of the DnaK protein have a homology of 80-100%, preferably 90-100%, among various species, the protein gene of interest can be easily obtained using general genetic engineering methods, such as gene amplification of a region of a specific sequence using PCR based on a sequence homologous to an amino acid sequence, or hybridization using a homologous sequence Nost as a probe matrix.
Интересующий белковый антиген можно получить путем создания гибридного гена из гена белка и других генов белков, введения гибридного гена хозяину, например, E. coli с помощью известного метода введения гена, сверхпродукции гибридного белка, и очистки экспрессированного белка методом аффинной хроматографии на колонке, с применением антитела против белка, использованного для получения гибридного белка. В таком случае, поскольку полноразмерный белок DnaK становится антигеном, если получают антитело против участка аминокислотной последовательности, который сохраняется среди микроорганизмов вне объема изобретения, такое антитело не может быть использовано в настоящем изобретении. Таким образом, что касается антигена, полученного указанным методом, интересующее антитело можно получить путем создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, и отбора клона, продуцирующего антитело, которое специфически реагирует с микроорганизмами.The protein antigen of interest can be obtained by creating a hybrid gene from a protein gene and other protein genes, introducing a hybrid gene to a host, for example, E. coli using a known method of gene introduction, overproduction of the hybrid protein, and purification of the expressed protein by column affinity chromatography using antibodies against the protein used to produce the fusion protein. In this case, since the full-sized DnaK protein becomes an antigen, if an antibody is obtained against an amino acid sequence that is retained among microorganisms outside the scope of the invention, such an antibody cannot be used in the present invention. Thus, with regard to the antigen obtained by this method, an antibody of interest can be obtained by creating hybridomas producing monoclonal antibodies and selecting a clone producing an antibody that specifically reacts with microorganisms.
c) В качестве другого способа, в случае когда аминокислотная последовательность белка DnaK неизвестна, создают синтетический пептид, состоящий из 5-30 аминокислот, соответствующих общему участку последовательности, который сохраняется среди микроорганизмов в известных аминокислотных последовательностях белка DnaK, и получают поликлональное или моноклональное антитело с применением пептидной последовательности в соответствии с известным методом. Высокоочищенный белок DnaK можно получить путем очистки клеточного гомогената интересующего микроорганизма с помощью аффинной хроматографии на колонке с применением антитела. Если чистота белка является недостаточной, чистоту можно увеличить с помощью известного метода очистки, такого как ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография или гель-фильтрация. Интересующее антитело можно получить путем создания гибридом с применением полученного антитела к очищенному белку DnaK, и отбора гибридомы, продуцирующей антитело, которое специфически реагирует с микроорганизмами.c) As another method, when the amino acid sequence of the DnaK protein is unknown, a synthetic peptide is created consisting of 5-30 amino acids corresponding to the common portion of the sequence that is stored among microorganisms in the known amino acid sequences of the DnaK protein and a polyclonal or monoclonal antibody is obtained with using a peptide sequence in accordance with a known method. Highly purified DnaK protein can be obtained by purification of the cell homogenate of the microorganism of interest using affinity column chromatography using an antibody. If the purity of the protein is insufficient, purity can be increased using a known purification method such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography or gel filtration. An antibody of interest can be obtained by creating hybridomas using the obtained antibody to a purified DnaK protein, and selecting a hybridoma that produces an antibody that specifically reacts with microorganisms.
В качестве второго варианта осуществления способа получения антитела, Mycoplasma pneumoniae может быть использована как антиген для получения антитела, которое реагирует с белком DnaK и является специфичным к Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, как показано в примере 1.As a second embodiment of the method for producing the antibody, Mycoplasma pneumoniae can be used as an antigen to produce an antibody that reacts with the DnaK protein and is specific for Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium , as shown in Example 1.
Аналогично, Mycoplasma genitalium может быть использована, как антиген для получения антитела. В случае, когда микроорганизм используют в качестве антигена, антиген можно получить в соответствии с известным методом. Примеры метода включают обработку ультразвуком, обработку нагреванием, обработку сурфактантом, обработку формалином, обработку замораживанием оттаиванием и обработку соляной кислотой.Similarly, Mycoplasma genitalium can be used as an antigen to produce antibodies. In the case where the microorganism is used as an antigen, the antigen can be obtained in accordance with a known method. Examples of the method include sonication, heat treatment, surfactant treatment, formalin treatment, freeze-thaw treatment, and hydrochloric acid treatment.
Антитело настоящего изобретения, которое получают с помощью методов описанных выше, и которое специфично к микроорганизмам, можно использовать в различных иммунологических тестах, и могут быть предоставлены различные реагенты и наборы для выявления, специфичные к интересующим микроорганизмам.The antibody of the present invention, which is obtained using the methods described above, and which is specific for microorganisms, can be used in various immunological tests, and various reagents and detection kits specific for the microorganisms of interest can be provided.
Антитело можно использовать в любом из известных иммунологических тестов, например, метод агглютинации с применением частиц из полистирольного латекса, на которых связывается антитело, метод ELISA, выполняемый в титрационном микропланшете, иммунохроматография, или сендвич-метод с применением антитела, меченного окрашенными частицами, способными развивать окраску, магнитными частицами, ферментом или флуоресцентным веществом, по отдельности или в комбинации.An antibody can be used in any of the known immunological tests, for example, an agglutination method using polystyrene latex particles on which an antibody binds, an ELISA method performed in a microtiter plate, immunochromatography, or a sandwich method using an antibody labeled with colored particles capable of developing staining with magnetic particles, an enzyme or a fluorescent substance, individually or in combination.
В способе выявления с применением DnaK в качестве индикатора настоящего изобретения, Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium можно специфически выявить, не разрушая специально клетки, или можно использовать известный метод обработки микроорганизмов, чтобы провести определение с высокой чувствительностью. Более подробно, может быть использован метод обработки с применением экстракционного реагента, включающего различные сурфактанты, такие как Triton X-100, Tween-20, или SDS, метод ферментной обработки с применением соответствующего фермента, например, протеазы, или известный метод разрушения клеточной структуры, например, разрушение клеток микроорганизмов физическим методом. Предпочтительно оптимальные условия выделения выбирают для каждого микроорганизма путем проверки комбинации реагентов, например, сурфактантов.In the detection method using DnaK as an indicator of the present invention, Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium can be specifically detected without specifically destroying the cells, or the known microorganism treatment method can be used to determine with high sensitivity. In more detail, a treatment method using an extraction reagent, including various surfactants, such as Triton X-100, Tween-20, or SDS, an enzymatic treatment method using an appropriate enzyme, for example, protease, or a known method for destroying the cell structure, can be used. for example, the destruction of microorganism cells by the physical method. Preferably, the optimal isolation conditions are selected for each microorganism by checking the combination of reagents, for example, surfactants.
Набор реагентов для выявления микроорганизмов с применением антитела настоящего изобретения соответствует набору реагентов для выявления с применением метода выявления.A kit of reagents for detecting microorganisms using an antibody of the present invention corresponds to a kit of reagents for detection using the detection method.
Состав набора не ограничен, при условии, что он содержит по меньшей мере одно антитело настоящего изобретения. Число, тип и комбинацию используемых антител можно изменять должным образом в соответствии с иммунологическим тестом, который используют. Набор может содержать жидкость для предварительной обработки в методе выделения, описанном выше, в качестве предварительной обработки образца.The composition of the kit is not limited, provided that it contains at least one antibody of the present invention. The number, type and combination of antibodies used can be changed appropriately in accordance with the immunological test that is used. The kit may contain pretreatment fluid in the isolation method described above as pretreatment of the sample.
2. Способ и набор для выявления микроорганизмов с использованием гена2. Method and kit for detecting microorganisms using a gene
В качестве метода выделения ДНК может быть использован известный метод. Примеры метода включают солюбилизацию образца сурфактантом или депротеинизацию с применением депротеинизирующего агента для получения ДНК. Предпочтительно при условии, что ген DnaK, как описано ниже, можно анализировать, например, если выделенный ген затем амплифицируют с помощью метода ПЦР, ДНК предпочтительно не содержит ингибиторов реакции ПЦР.As a method for isolating DNA, a known method can be used. Examples of the method include solubilizing the sample with a surfactant or deproteinization using a deproteinizing agent to produce DNA. Preferably, provided that the DnaK gene, as described below, can be analyzed, for example, if the isolated gene is then amplified by PCR, the DNA preferably does not contain PCR reaction inhibitors.
В качестве метода предварительной подготовки образца можно использовать подход, аналогичный подходу, описанному в методе выявления микроорганизмов с помощью антитела.As a method of preliminary sample preparation, an approach similar to that described in the method of detecting microorganisms using antibodies can be used.
Количество выделенной ДНК не ограничено при условии, что выделяют количество, которое позволяет провести анализ гена DnaK. Если ДНК подвергают анализу методом ПРЦ, количество составляет, например, 5-50 fg или больше на реакцию.The amount of DNA isolated is not limited, provided that an amount is isolated that allows the analysis of the DnaK gene. If DNA is subjected to PCR analysis, the amount is, for example, 5-50 fg or more per reaction.
Выделенную ДНК используют для анализа гена DnaK. Анализ гена DnaK можно осуществить в соответствии с известным методом. Примеры метода включают метод выявления с помощью амплификации гена DnaK с применением метода ПЦР, и метод выявления гена DnaK с применением зондового метода. Например, можно использовать любой метод амплификации гена DnaK с помощью метода ПЦР, при условии, что интересующая нуклеотидная последовательность может быть амплифицирована. Может быть использован любой метод определения гена DnaK зондовым методом, при условии, что можно установить интересующую нуклеотидную последовательность.Isolated DNA is used to analyze the DnaK gene. DnaK gene analysis can be carried out in accordance with a known method. Examples of the method include the detection method using amplification of the DnaK gene using the PCR method, and the detection method of the DnaK gene using the probe method. For example, you can use any method of amplification of the DnaK gene using the PCR method, provided that the nucleotide sequence of interest can be amplified. Any method for determining the DnaK gene by the probe method can be used, provided that the nucleotide sequence of interest can be established.
Чтобы амплифицировать или точно определить желаемую нуклеотидную последовательность гена DnaK, можно выбрать соответствующим образом последовательность, обладающую 80-100% гомологии с последовательностью Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium и обладающую гомологией предпочтительно 60% или меньше с последовательностями других патогенных микроорганизмов. Праймер или зонд могут содержать одну или более вариаций, делеций или добавлений в нуклеотидной последовательности, при условии, что интересующий фрагмент ДНК можно амплифицировать.In order to amplify or precisely determine the desired nucleotide sequence of the DnaK gene, a sequence having 80-100% homology with the sequence of Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium and having a homology of preferably 60% or less with sequences of other pathogenic microorganisms can be appropriately selected. The primer or probe may contain one or more variations, deletions or additions in the nucleotide sequence, provided that the DNA fragment of interest can be amplified.
Например, если ген DnaK Mycoplasma pneumoniae, является геном, который нужно амплифицировать, праймеры для ПЦР-амплификации можно создать на основе последовательности гена DnaK Mycoplasma pneumoniae (Номер NCBI: NC_000912 REGION: 521837..523624), опубликованной в NCBI, как описано в Примерах ниже. Более подробно, смысловой праймер MpDnaK_S и антисмысловой праймер MpDnaK_A можно использовать, чтобы амплифицировать полноразмерный ген DnaK.For example, if the DnaK Mycoplasma pneumoniae gene is the gene to be amplified, PCR amplification primers can be created based on the DnaK Mycoplasma pneumoniae gene sequence (NCBI Number: NC_000912 REGION: 521837..523624) published in the NCBI as described in Examples below. In more detail, the MpDnaK_S sense primer and the MpDnaK_A antisense primer can be used to amplify the full-sized DnaK gene.
Если ген DnaK Mycoplasma genitalium является геном, который нужно амплифицировать, праймеры для ПЦР-амплификации можно создать на основе последовательности гена DnaK Mycoplasma genitalium (Номер NCBI: L43967 REGION: 374919..376706), опубликованной в NCBI.If the DnaK Mycoplasma genitalium gene is the gene to be amplified, primers for PCR amplification can be created based on the DnaK Mycoplasma genitalium gene sequence (NCBI number: L43967 REGION: 374919..376706), published in NCBI.
Как показано в примере 8, гены DnaK, полученные из различных штаммов Mycoplasma pneumoniae, полностью (100%) соответствуют друг другу даже среди штаммов, в которых отличались типы гена P1 Mycoplasma pneumoniae, и не обнаружено вариаций среди штаммов, полученных из разных мест и на протяжении последних 50 лет. Поэтому нет необходимости учитывать различие между штаммами Mycoplasma pneumoniae, чтобы специфически обнаружить ген DnaK Mycoplasma pneumoniae, и праймеры или зонд можно создавать, принимая во внимание различия между штаммами, другими, чем штаммы Mycoplasma pneumoniae.As shown in example 8, DnaK genes obtained from different strains of Mycoplasma pneumoniae completely (100%) correspond to each other even among strains in which the types of P1 gene of Mycoplasma pneumoniae differed, and no variations were found among strains obtained from different places and over the past 50 years. Therefore, it is not necessary to take into account the difference between Mycoplasma pneumoniae strains in order to specifically detect the Mycoplasma pneumoniae DnaK gene, and primers or probe can be created taking into account differences between strains other than Mycoplasma pneumoniae strains.
Кроме того, поскольку считается, что последовательность белка DnaK Mycoplasma pneumoniae также является консервативной, считают, что антитела, полученные с применением белка DnaK, не проявляют различий в реактивности с учетом генотипа, места получения и времени получения, и, следовательно, могут использоваться на обширной территории и времени.In addition, since it is believed that the DnaK protein sequence of Mycoplasma pneumoniae is also conserved, it is believed that antibodies obtained using the DnaK protein do not show differences in reactivity, taking into account the genotype, place of receipt and time of receipt, and, therefore, can be used on an extensive territory and time.
Набор реагентов для выявления микроорганизмов с применением гена настоящего изобретения соответствует набору реагентов для выявления при помощи способа выявления. Он представляет собой набор, который используется в способе специфического выявления Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium, и который отличается содержанием по меньшей мере двух типов праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности, специфичной к интересующему гену DnaK.A set of reagents for detecting microorganisms using the gene of the present invention corresponds to a set of reagents for detection using the detection method. It is a kit that is used in a method for the specific detection of Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium , and which is characterized by the content of at least two types of primers for amplification of the nucleotide sequence specific for the DnaK gene of interest.
В качестве другого варианта осуществления, набор отличается содержанием по меньшей мере одного типа зонда для определения нуклеотидной последовательности, специфичной к интересующему гену DnaK.As another embodiment, the kit is characterized by containing at least one type of probe for determining the nucleotide sequence specific for the DnaK gene of interest.
Указанные наборы также могут содержать жидкость для предварительной обработки в методе выделения, описанном выше, в качестве подготовки образца.These kits may also contain pretreatment fluid in the isolation method described above as a sample preparation.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано, но не с целью ограничения следующими Примерами.The present invention will now be illustrated, but not for the purpose of limiting, to the following Examples.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Получение антител, специфичных к Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium, и идентификация специфического антигенаObtaining antibodies specific for Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium , and identification of specific antigen
(1) Получение моноклональных антител, специфичных к Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium (1) Obtaining monoclonal antibodies specific for Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium
(1-1) Культивирование штаммов для иммунизации и получение иммуногенов(1-1) Cultivation of strains for immunization and obtaining immunogens
Бульоны PPLO с глюкозой (содержащие лошадиную сыворотку, свежий экстракт дрожжей и ацетат таллия), каждый по отдельности засевали одним из 6 штаммов Mycoplasma pneumoniae (штаммы FH, Bru, Mac, M52, PI1428 и M129-B7: приобретенные в ATCC) и осуществляли культивирование при 37°C в течение 7 дней в аэробных условиях. Каждый штамм, собранный центрифугированием, отмывали и суспендировали в PBS. Суспензии замораживали и оттаивали для получения иммуногенов.Glucose PPLO broths (containing horse serum, fresh yeast extract and thallium acetate) were individually seeded with one of 6 Mycoplasma pneumoniae strains (FH, Bru, Mac, M52, PI1428 and M129-B7 strains: acquired from ATCC) and cultured at 37 ° C for 7 days under aerobic conditions. Each strain collected by centrifugation was washed and suspended in PBS. Suspensions were frozen and thawed to obtain immunogens.
(1-2) Иммунизация(1-2) Immunization
Самок мышей Balb/c в возрасте шести недель использовали для иммунизации (CREA Japan, Inc.). Каждый раствор иммуногена, полученный из штамма, эмульгировали с полным адъювантом Фрейнда (SIGMA). Каждую эмульсию (100 мкг антигена) вводили подкожно мыши. До тех пор, пока не наблюдали роста титра антител против иммуногена у каждой мыши, 50 мкг каждого антигена эмульгированного с неполным адъювантом Фрейнда (SIGMA) вводили подкожно мыши каждые две недели. Затем 25 мкг каждого антигена, разведенного PBS, вводили мыши внутрибрюшинно за три дня до слияния клеток.Six week old female Balb / c mice were used for immunization (CREA Japan, Inc.). Each immunogen solution obtained from the strain was emulsified with Freund's complete adjuvant (SIGMA). Each emulsion (100 μg antigen) was injected subcutaneously in the mouse. Until an anti-immunogen antibody titer increase was observed in each mouse, 50 μg of each antigen emulsified with Freund's incomplete adjuvant (SIGMA) was injected subcutaneously in the mouse every two weeks. Then 25 μg of each antigen diluted with PBS was injected intraperitoneally into the mouse three days before cell fusion.
(1-3) Получение гибридом(1-3) Obtaining hybridomas
Следующие процедуры проводили согласно стандартному методу. Клетки селезенки, асептически полученные от иммунизированных мышей, объединяли с миеломными клетками (P3U1) с применением полиэтиленгликоля 1500 (Roche), и засевали в лунки 96-луночных планшетов. Гибридомные клетки избирательно культивировали с применением среды HAT, и их культуральные супернатанты проверяли в условиях последующего теста ELISA. Иммобилизацию для ELISA осуществляли с применением антигена Mycoplasma pneumoniae (1 мкг/мл), полученного из каждого из 6 штаммов, использованных в качестве иммуногенов. После блокирующей обработки лунок супернатант каждой культуры добавляли в лунки и инкубировали при 4°C в течение ночи. Лунки отмывали жидкостью для отмывки три раза, и разведенные в 2000 раз HRP-меченное антимышиное Ig-антитело кролика (Dako) добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки отмывали промывочной жидкостью три раза и субстратный раствор (TMBZ) добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем реакцию останавливали, измеряли оптическую плотность при 450 нм. Затем отобранные гибридомы проверяли методом лимитирующих разведений для установления клонированных штаммов. В отношении моноклональных антител, полученных из 16 штаммов, в установленных клонированных штаммах, осуществляли следующие эксперименты. Моноклональные антитела, полученные из 16 клонированных штаммов, реагировали со всеми иммуногенами, полученными из 6 штаммов.The following procedures were carried out according to the standard method. Spleen cells, aseptically obtained from immunized mice, were combined with myeloma cells (P3U1) using polyethylene glycol 1500 (Roche), and seeded in the wells of 96-well plates. Hybridoma cells were selectively cultured using HAT medium, and their culture supernatants were checked under the conditions of a subsequent ELISA. Immobilization for ELISA was performed using the Mycoplasma pneumoniae antigen (1 μg / ml) obtained from each of the 6 strains used as immunogens. After blocking treatment of the wells, the supernatant of each culture was added to the wells and incubated at 4 ° C. overnight. The wells were washed three times with washing liquid, and 2000-fold diluted HRP-labeled rabbit anti-mouse Ig antibody (Dako) was added to the wells and incubated at room temperature for 1 hour. Wells were washed three times with wash liquid and substrate solution (TMBZ) was added to the wells and incubated at room temperature for 10 minutes. Then the reaction was stopped, the absorbance was measured at 450 nm. Then, the selected hybridomas were checked by limiting dilution to establish cloned strains. In relation to monoclonal antibodies obtained from 16 strains, the following experiments were carried out in established cloned strains. Monoclonal antibodies obtained from 16 cloned strains reacted with all immunogens obtained from 6 strains.
(1-4) Определение молекулярного веса белков, распознаваемых моноклональными антителами(1-4) Determination of the molecular weight of proteins recognized by monoclonal antibodies
Молекулярный вес каждого белка, распознаваемого 16 моноклональными антителами, определяли с помощью вестерн-блоттинга. Вначале проводили электрофорез 10 мкг антигена Mycoplasma pneumoniae (штамма FH) с помощью SDS-PAGE и переносили промоканием на нитроцеллюлозные мембраны. Каждый культуральный супернатант 16 клонов добавляли к мембранам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны отмывали промывочной жидкостью три раза, и разведенное в 1000 раз HRP-меченное антимышиное Ig-антитело кролика добавляли к мембранам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны отмывали промывочной жидкостью три раза и добавляли субстратный раствор (4-хлор-1-нафтол) к мембранам и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После развития окраски мембраны отмывали дистиллированной водой для остановки реакции.The molecular weight of each protein recognized by 16 monoclonal antibodies was determined using Western blotting. First, electrophoresis was performed on 10 μg of Mycoplasma pneumoniae antigen (strain FH) using SDS-PAGE and transferred by blotting onto nitrocellulose membranes. Each culture supernatant of 16 clones was added to the membranes and incubated at room temperature for 1 hour. The membranes were washed with washing liquid three times, and 1000-fold diluted HRP-labeled rabbit anti-mouse Ig antibody was added to the membranes and incubated at room temperature for 1 hour. The membranes were washed with washing liquid three times and a substrate solution (4-chloro-1-naphthol) was added to the membranes and incubated at room temperature for 10 minutes. After color development, the membranes were washed with distilled water to stop the reaction.
В результате обнаружили, что 10 моноклональных антител, распознавали молекулу, обладающую молекулярным весом 62-69 кДа, и 6 моноклональных антител распознавали молекулу, обладающую молекулярным весом 40-45 кДа. На основании указанного результата, авторы изобретения попробовали идентифицировать антиген с учетом молекулы 62-69 кДа, которую рассматривали как обладающую высокой иммуногенностью, в связи с получением большого числа клонов.As a result, it was found that 10 monoclonal antibodies recognized a molecule having a molecular weight of 62-69 kDa, and 6 monoclonal antibodies recognized a molecule having a molecular weight of 40-45 kDa. Based on this result, the inventors tried to identify the antigen in view of the 62-69 kDa molecule, which was considered as having high immunogenicity due to the production of a large number of clones.
(1-5) Определение подкласса полученных антител(1-5) Determination of the subclass of antibodies obtained
Применяли Iso Strip (Roche) для определения подкласса 10 моноклональных антител, которые распознавали молекулу 62-69 кДа. Обнаружили, что 6 антител представляли собой H-цепь G1/L-цепь k, 1 антитело представляло собой H-цепь G1/L-цепь λ, 1 антитело представляло собой H-цепь 2b/L-цепь k, 1 антитело представляло собой H-цепь 2b/L-цепь λ и 1 антитело представляло собой H-цепь 2a/L-цепь λ.Iso Strip (Roche) was used to identify a subclass of 10 monoclonal antibodies that recognized a 62-69 kDa molecule. 6 antibodies were found to be the G1 / L chain k chain H chain, 1 antibody was the G1 / L chain λ chain H chain, 1 antibody was the 2b / L chain k chain H chain, 1 antibody was H chain 2b / L chain λ and 1 antibody was an H chain 2a / L chain λ.
(2) Идентификация антигена, специфичного для Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium (2) Identification of antigen specific for Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium
(2-1) Очистка антигена, распознаваемого моноклональными антителами(2-1) Purification of Antigen Recognized by Monoclonal Antibodies
(2-1-1) Культивирование штамма(2-1-1) Cultivation of the strain
Штамм Mycoplasma pneumoniae M129-B7, полная генетическая последовательность которого уже установлена, использовали для очистки антигена. Mycoplasma pneumoniae (штамм M129-B7) засевали в бульон PPLO с глюкозой (содержащий лошадиную сыворотку, свежий экстракт дрожжей и ацетат таллия) и культивировали при 37°C в течение 7 дней в аэробных условиях. Клетки штамма, собранные центрифугированием, отмывали и суспендировали в PBS. Суспензию замораживали.The strain Mycoplasma pneumoniae M129-B7, the complete genetic sequence of which has already been established, was used to purify the antigen. Mycoplasma pneumoniae (strain M129-B7) was inoculated into glucose PPLO broth (containing horse serum, fresh yeast extract and thallium acetate) and cultured at 37 ° C for 7 days under aerobic conditions. Cells of the strain collected by centrifugation were washed and suspended in PBS. The suspension was frozen.
(2-1-2) Очистка распознанного антигена с помощью аффинной хроматографии(2-1-2) Purification of Recognized Antigen by Affinity Chromatography
Моноклональное антитело MCM12, полученное в (1), связывали с CNBr-активированной сефарозой 4B (GE healthcare) в качестве носителя в колонке, чтобы подготовить колонку для аффинной хроматографии к очистке антигена. Связывание с носителем в колонке осуществляли путем реакции геля 5 мг/мл IgG в 0,1 моль/л NaHCO3-NaOH и 0,5 моль/л NaCl (pH 8,3) при 4°C в течение ночи. Непрореагировавшие группы блокировали с помощью 0,2 моль/л глицинового буфера (pH 8).The monoclonal antibody MCM12 obtained in (1) was coupled to CNBr-activated Sepharose 4B (GE healthcare) as a column carrier to prepare an affinity chromatography column for antigen purification. Binding to the support in the column was carried out by reacting a gel of 5 mg / ml IgG in 0.1 mol / L NaHCO 3 -NaOH and 0.5 mol / L NaCl (pH 8.3) at 4 ° C. overnight. Unreacted groups were blocked with 0.2 mol / L glycine buffer (pH 8).
Белки, выделенные из штамма Mycoplasma pneumoniae, наносили на колонку. После того как элюировали неадсорбированную фракцию, адсорбированную на колонке фракцию элюировали с применением 3 моль/л тиоцианата натрия и собирали. Данную фракцию диализовали против 50 ммоль/л PBS (pH 7) для получения очищенного продукта.Proteins isolated from Mycoplasma pneumoniae strain were loaded onto a column. After the non-adsorbed fraction was eluted, the column adsorbed fraction was eluted using 3 mol / L sodium thiocyanate and collected. This fraction was dialyzed against 50 mmol / L PBS (pH 7) to obtain a purified product.
(2-2) Идентификация белка, распознаваемого полученными моноклональными антителами(2-2) Identification of the protein recognized by the obtained monoclonal antibodies
(2-2-1) Определение молекулярного веса установленного белка с помощью SDS-PAGE(2-2-1) Determination of the molecular weight of the established protein using SDS-PAGE
Очищенный антиген анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Очищенный антиген (0,1 мкг) подвергали электрофорезу с помощью SDS-PAGE и переносили промоканием на нитроцеллюлозные мембраны. Моноклональное антитело MCM12 или моноклональное антитело MCM19 (раствор 10 мкг/мл IgG) по отдельности добавляли к мембранам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны отмывали промывочной жидкостью три раза и разведенное в 1000 раз HRP-меченное антимышиное Ig-антитело кролика добавляли к мембранам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны отмывали промывочной жидкостью три раза, и раствор субстрата (4-хлор-1-нафтол) добавляли к мембранам и инкубировали при комнатной температуре. После развития окраски мембраны отмывали дистиллированной водой для остановки реакции.The purified antigen was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The purified antigen (0.1 μg) was electrophoresed by SDS-PAGE and blotted onto nitrocellulose membranes. The MCM12 monoclonal antibody or MCM19 monoclonal antibody (10 μg / ml IgG solution) was separately added to the membranes and incubated at room temperature for 1 hour. The membranes were washed with washing liquid three times and 1000-fold diluted HRP-labeled rabbit anti-mouse Ig antibody was added to the membranes and incubated at room temperature for 1 hour. The membranes were washed with washing liquid three times, and a substrate solution (4-chloro-1-naphthol) was added to the membranes and incubated at room temperature. After color development, the membranes were washed with distilled water to stop the reaction.
Подтверждали, что оба антитела распознавали очищенный антиген.Both antibodies were confirmed to recognize the purified antigen.
(2-2-2) Анализ N-концевой аминокислотной последовательности очищенного антигена(2-2-2) Analysis of the N-terminal amino acid sequence of the purified antigen
Анализировали 10 N-концевых аминокислотных остатков очищенного антигенного белка в соответствии с общепринятым методом. Очищенный антиген подвергали электрофорезу с помощью SDS-PAGE. Мембрану PVDF, на которую наносили образец, отмывали смесью 50% метанол/0,1% трифторуксусная кислота и метанолом и высушивали, и 10 циклов секвенирования белка осуществляли с N-конца. Белковый секвенатор PPSQ-23A (Shimadzu) и анализатор PTH SPD-10A (Shimadzu) применяли в качестве анализаторов.10 N-terminal amino acid residues of the purified antigenic protein were analyzed in accordance with a conventional method. The purified antigen was electrophoresed by SDS-PAGE. The PVDF membrane on which the sample was applied was washed with a mixture of 50% methanol / 0.1% trifluoroacetic acid and methanol and dried, and 10 protein sequencing cycles were carried out from the N-terminus. The PPSQ-23A protein sequencer (Shimadzu) and the PTH SPD-10A analyzer (Shimadzu) were used as analyzers.
В результате получали следующую последовательность:As a result, the following sequence was obtained:
STDNGLIIGI (SEQ ID NO: 1)STDNGLIIGI (SEQ ID NO: 1)
Проводили поиск с применением базы данных Swiss-Prot в соответствии с общепринятым методом, и полученная последовательность полностью соответствовала последовательности, состоящей из аминокислотных остатков со 2-го по 11-й шаперонного белка DnaK Mycoplasma pneumoniae. Молекулярный вес DnaK, рассчитанный на основе его аминокислотной последовательности, составлял 65 кДа, что почти совпадает с молекулярным весом распознаваемого антителами антигена, определяемого с помощью вестерн-блоттинга.A search was carried out using the Swiss-Prot database in accordance with the generally accepted method, and the obtained sequence completely corresponded to the sequence consisting of amino acid residues from the 2nd to the 11th chaperone protein DnaK Mycoplasma pneumoniae . The molecular weight of DnaK, calculated on the basis of its amino acid sequence, was 65 kDa, which almost coincides with the molecular weight of the antigen recognized by antibodies, as determined by Western blotting.
Как описано выше, подтверждали, что антитела, полученные как указано выше, являлись антителами anti-DnaK, специфичными к Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium.As described above, it was confirmed that the antibodies obtained as described above were anti-DnaK antibodies specific for Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium .
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Проверка чувствительности и перекрестной реактивности полученных антител методом ELISATesting the sensitivity and cross-reactivity of antibodies obtained by ELISA
Из моноклональных антител, полученных в Примере 1, моноклональное антитело MCM12 и моноклональное антитело MCM19 использовали для проверки чувствительности и перекрестной реактивности антител.Of the monoclonal antibodies obtained in Example 1, the monoclonal antibody MCM12 and the monoclonal antibody MCM19 were used to test the sensitivity and cross-reactivity of the antibodies.
(1) культивирование и получение штаммов, которые проверяют(1) cultivation and obtaining strains that test
(1-1) Штаммы для проведения теста на чувствительность(1-1) Strains for conducting a sensitivity test
Бульоны PPLO с глюкозой (содержащие лошадиную сыворотку, свежий экстракт дрожжей и ацетат таллия), каждый по отдельности засевали одним из 8 штаммов Mycoplasma pneumoniae, представленных в таблице 1, и осуществляли культивирование при 37°C в течение 4 дней в аэробных условиях. Штаммы, у которых значение pH бульона достигало 6,8, использовали в качестве тестовых штаммов. Чтобы определить количество клеток каждого штамма в бульоне, готовили серии 10-кратных разведений со стерильным PBS, и 10 мкл каждого разведения высевали на агарозную среду PPLO (содержащую лошадиную сыворотку, свежий экстракт дрожжей и ацетат таллия) и инкубировали при 37°C в течение 10 дней. Колонии роста на агарозной среде подсчитывали под оптическим микроскопом с увеличением 40 для определения числа колониеобразующих единиц каждого штамма. PPLO broths with glucose (containing horse serum, fresh yeast extract and thallium acetate) were individually seeded with one of the 8 Mycoplasma pneumoniae strains shown in Table 1 and cultured at 37 ° C for 4 days under aerobic conditions. Strains in which the pH of the broth reached 6.8 were used as test strains. To determine the number of cells of each strain in the broth, a series of 10-fold dilutions were prepared with sterile PBS, and 10 μl of each dilution was plated on PPLO agarose medium (containing horse serum, fresh yeast extract and thallium acetate) and incubated at 37 ° C for 10 days. Growth colonies on an agarose medium were counted under an optical microscope with a magnification of 40 to determine the number of colony forming units of each strain.
(1-2) Штаммы для проведения теста-1 перекрестной реактивности(1-2) Strains for conducting test-1 cross-reactivity
Штаммы, принадлежащие к роду Mycoplasma, отличающиеся от Mycoplasma pneumoniae, представленные в (1-1), к роду Ureaplasma, и к роду Acholeplasma, культивировали в соответствии с бульонами и условиями культивирования, представленными в таблице 2. Культивирование осуществляли при 37°C. Термины "аэробный" и "анаэробный" в таблице 2 означают аэробное культивирование и анаэробное культивирование, соответственно. Чтобы определить количество клеток каждого штамма в бульоне, готовили серии 10-кратных разведений со стерильным PBS, и 10 мкл каждого разведения высевали на агар PPLO (содержащий лошадиную сыворотку, свежий экстракт дрожжей и ацетат таллия) и инкубировали при 37°C в течение 10 дней. Колонии роста на агаре подсчитывали под оптическим микроскопом с увеличением 40 для определения количества колониеобразующих единиц каждого штамма. Тест осуществляли в количестве 106-107 КОЕ/мл. Strains belonging to the genusMycoplasmadifferent fromMycoplasma pneumoniae, presented in (1-1), to the genusUreaplasma, and to the familyAcholeplasma, cultivated in accordance with the broths and cultivation conditions presented in table 2. Cultivation was carried out at 37 ° C. The terms "aerobic" and "anaerobic" in table 2 mean aerobic cultivation and anaerobic cultivation, respectively. To determine the number of cells of each strain in the broth, a series of 10-fold dilutions were prepared with sterile PBS, and 10 μl of each dilution was plated on PPLO agar (containing horse serum, fresh yeast extract and thallium acetate) and incubated at 37 ° C for 10 days . Agar growth colonies were counted under an optical microscope with a magnification of 40 to determine the number of colony forming units of each strain. The test was carried out in an amount of 106-107 CFU / ml.
(1-3) Штаммы для проведения теста-2 на перекрестную реактивность(1-3) Strains for conducting test-2 for cross-reactivity
В таблицах 3-6 представлены микроорганизмы, которые использовали в тесте перекрестной реактивности бактерий и грибов, кроме микроорганизмов рода Mycoplasma, рода Ureaplasma и рода Acholeplasma, используемых в (1-1) и (1-2), и условия культивирования. Агар с сердечной вытяжкой (Difco), триптиказо-соевый агар II с 5% овечьей крови (Becton, Dickinson and Company), шоколадный агар (NISSUI), модифицированный агар GAM (NISSUI), среду Скирроу (Becton, Dickinson and Company) и агар Сабуро с декстрозой (Difco) использовали в качестве сред.Tables 3-6 show the microorganisms that were used in the cross-reactivity test of bacteria and fungi, except for the microorganisms of the genus Mycoplasma , the genus Ureaplasma, and the genus Acholeplasma used in (1-1) and (1-2), and cultivation conditions. Heart-drawn agar (Difco), trypticase-soy agar II with 5% sheep blood (Becton, Dickinson and Company), chocolate agar (NISSUI), modified GAM agar (NISSUI), Skirrow medium (Becton, Dickinson and Company) and agar Saburo with dextrose (Difco) was used as media.
Указанные штаммы культивировали на агаре и суспендировали в стерильном PBS в концентрации 107-108 КОЕ/мл для получения тестируемых штаммов. Для определения количества клеток каждого штамма, каждую тестируемую суспензию, в которой каждый штамм суспендировали в стерильном PBS, разводили пошагово (шаг 10) тем же PBS, и 50 мкл каждого разведения высевали на агарозную среду. Колонии роста на среде подсчитывали невооруженным глазом.These strains were cultured on agar and suspended in sterile PBS at a concentration of 10 7 -10 8 CFU / ml to obtain test strains. To determine the number of cells of each strain, each test suspension in which each strain was suspended in sterile PBS was diluted step by step (step 10) with the same PBS, and 50 μl of each dilution was plated on agarose medium. Growth colonies on the medium were counted with the naked eye.
Пустые места в колонке "№ штамма" в таблицах обозначают штаммы, которые выделяли и определяли из клинических образцов.Empty spaces in the column "strain No." in the tables indicate the strains that were isolated and determined from clinical samples.
Проверка чувствительности и перекрестной реактивности методом ELISAELISA sensitivity and cross-reactivity testing
(2-1) Проведение анализа методом ELISA(2-1) Conducting ELISA analysis
(2-1-1) Метод получения иммобилизованного антитела и метод иммобилизации(2-1-1) Method for the production of immobilized antibodies and immobilization method
Асцитическую жидкость, содержащую моноклональное антитело MCM19, применяли для фракционирования сульфатом аммония, IgG очищали с помощью rProteinA Sepharose FF (GE healthcare), и проводили количественный анализ белка биуретовым методом. Очищенное антитело IgG (10 мкг/мл) иммобилизовали на 96-луночном микропланшете.The ascitic fluid containing the monoclonal antibody MCM19 was used for fractionation with ammonium sulfate, IgG was purified using rProteinA Sepharose FF (GE healthcare), and protein was quantitated using the biuret method. Purified IgG antibody (10 μg / ml) was immobilized on a 96-well microplate.
(2-1-2) Метод получения антитела для мечения щелочной фосфатазой и метод получения меченого антитела(2-1-2) Method for producing an antibody for labeling with alkaline phosphatase and method for producing labeled antibody
Асцитическую жидкость, содержащую моноклональное антитело MCM12, применяли для фракционирования сульфатом аммония, и IgG очищали с помощью MEP Hypercel (Pall Corporation). IgG обрабатывали пепсином для получения F(ab')2 и сшивали F(ab')2 со щелочной фосфатазой для получения антитела, меченного щелочной фосфотазой.An ascitic fluid containing monoclonal antibody MCM12 was used for fractionation with ammonium sulfate, and IgG was purified using MEP Hypercel (Pall Corporation). IgG was treated with pepsin to obtain F (ab ') 2 and crosslinked F (ab') 2 with alkaline phosphatase to obtain an antibody labeled with alkaline phosphatase.
(2-1-3) Метод проведения теста ELISA(2-1-3) ELISA Test Method
Отмывали 96-луночный микропланшет с иммобилизованными антителами, и блокировали 0,1 ммоль/л раствором TBS (pH 7,5), содержащим 1% БСА, при комнатной температуре в течение 1 часа. Суспензию каждого штамма, который тестировали (100 мкл), добавляли в микропланшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Микропланшет отмывали и антитело, меченное щелочной фосфатазой (10 мкг/мл), добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Микропланшет отмывали, и получали развитие окраски с применением раствора субстрата (pNPP) в течение 30 минут. Реакцию останавливали и измеряли оптическую плотность при 405 нм.The 96-well microplate with immobilized antibodies was washed and blocked with 0.1 mmol / L TBS solution (pH 7.5) containing 1% BSA at room temperature for 1 hour. A suspension of each strain that was tested (100 μl) was added to the microplate and incubated at room temperature for 1 hour. The microplate was washed and alkaline phosphatase-labeled antibody (10 μg / ml) was added and incubated at room temperature for 1 hour. The microplate was washed and a color development was obtained using a substrate solution (pNPP) for 30 minutes. The reaction was stopped and the absorbance was measured at 405 nm.
(3) Тест определения чувствительности(3) Sensitivity Test
Тестируемые штаммы (1-1) применяли в тесте ELISA, описанном выше, и тестовое разведение, которое показало оптическую плотность 0,05 или выше и максимальную кратность разведения использовали для расчета количества клеток каждого штамма. Результаты представлены в таблице 7.The tested strains (1-1) were used in the ELISA test described above, and a test dilution that showed an optical density of 0.05 or higher and the maximum dilution ratio was used to calculate the number of cells of each strain. The results are presented in table 7.
Обнаружили на основании результатов, представленных в таблице 7, что чувствительность к Mycoplasma pneumoniae составляла 103-104 КОЕ/мл согласно тесту ELISA с использованием моноклональных антител.Found on the basis of the results presented in table 7, the sensitivity to Mycoplasma pneumoniae was 10 3 -10 4 CFU / ml according to the ELISA test using monoclonal antibodies.
(4) Тест определения перекрестной реактивности(4) Cross-reactivity test
Тестируемые штаммы (1-2) [рода Mycoplasma, за исключением Mycoplasma pneumoniae, рода Vreaplasma и рода Acholeplasma, представленные в таблице 2] и тестируемые штаммы (1-3) [другие бактерии и грибы, представленные в таблицах 3-6] применяли в тесте ELISA, описанном выше.The tested strains (1-2) [of the genus Mycoplasma , with the exception of Mycoplasma pneumoniae , the genus Vreaplasma and the genus Acholeplasma , are presented in table 2] and the tested strains (1-3) [other bacteria and fungi shown in tables 3-6] were used in ELISA test described above.
Все микроорганизмы, за исключением Mycoplasma genitalium показали значение оптической плотности меньше 0,010. В отношении Mycoplasma genitalium, количество клеток микроорганизма, рассчитанное из тестового разведения, которое показало значение оптической плотности 0,05 или выше и максимальную кратность разведения, составляло 6,9×104 КОЕ/мл.All microorganisms except Mycoplasma genitalium showed an optical density value of less than 0.010. For Mycoplasma genitalium , the number of microorganism cells calculated from the test dilution, which showed an optical density of 0.05 or higher and the maximum dilution ratio, was 6.9 × 10 4 CFU / ml.
Как показано в результатах, обнаружено, что тест ELISA с использованием моноклональных антител, показал перекрестную реактивность с Mycoplasma genitalium, но не показал перекрестной реактивности с другими микроорганизмами.As shown in the results, it was found that an ELISA using monoclonal antibodies showed cross-reactivity with Mycoplasma genitalium , but did not show cross-reactivity with other microorganisms.
Как описано выше, подтверждали, что тест ELISA не показал перекрестной реактивности со многими бактериями и грибами, которые могли бы помешать диагностике инфекции, вызываемой Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium.As described above, it was confirmed that the ELISA test did not show cross-reactivity with many bacteria and fungi that could interfere with the diagnosis of infections caused by Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium .
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
Проверка чувствительности и перекрестной реактивности полученных антител с помощью иммунохроматографииTesting the sensitivity and cross-reactivity of antibodies using immunochromatography
(1) Проведение иммунохроматографии(1) Immunochromatography
(1-1) Получение коллоидного золота, конъюгированного с антителом anti-Mycoplasma-pneumoniae (1-1) Preparation of Colloidal Gold Conjugated with Anti- Mycoplasma-pneumoniae Antibody
К раствору коллоидного золота, значение рН которого предварительно регулировали добавлением 2 мл 50 ммоль/л фосфатного буфера (pH 11) к 18 мл раствора коллоидного золота (Tanaka Kikinzoku), имеющего диаметр 40 нм, 2,5 мл 100 мкг/мл раствора моноклонального антитела MCM12 добавляли и перемешивали. Затем смесь перемешивали в течение 1 часа, 1 мл 1% масс. водного раствора полиэтиленгликоля (Mw. 20000, Wako Pure Chemical Industries) добавляли и перемешивали, и 2 мл 10% масс. водного раствора БСА (SIGMA) добавляли и перемешивали. Данный раствор центрифугировали при 4°C и 8000G в течение 15 минут, и почти весь супернатант удаляли, так что оставался приблизительно 1 мл супернатанта. Коллоидное золото повторно диспергировали с помощью ультразвукового генератора. Диспергированное коллоидное золото растворяли в 20 мл фосфатного буфера, содержащего БСА, и центрифугировали при 4°C и 8000G в течение 15 минут. Почти весь супернатант удаляли, так что оставался приблизительно 1 мл супернатанта, и коллоидное золото повторно диспергировали с помощью ультразвукового генератора для получения раствора коллоидного золота, конъюгированного с антителом.To a colloidal gold solution, the pH of which was previously adjusted by adding 2 ml of 50 mmol / L phosphate buffer (pH 11) to 18 ml of a colloidal gold solution (Tanaka Kikinzoku) having a diameter of 40 nm, 2.5 ml of 100 μg / ml of monoclonal antibody solution MCM12 was added and mixed. Then the mixture was stirred for 1 hour, 1 ml of 1% of the mass. an aqueous solution of polyethylene glycol (Mw. 20000, Wako Pure Chemical Industries) was added and mixed, and 2 ml of 10% of the mass. an aqueous solution of BSA (SIGMA) was added and mixed. This solution was centrifuged at 4 ° C and 8000G for 15 minutes, and almost all of the supernatant was removed, so that approximately 1 ml of supernatant remained. Colloidal gold was redispersed using an ultrasonic generator. Dispersed colloidal gold was dissolved in 20 ml of phosphate buffer containing BSA and centrifuged at 4 ° C and 8000G for 15 minutes. Almost all of the supernatant was removed, so that approximately 1 ml of supernatant remained, and the colloidal gold was redispersed using an ultrasonic generator to obtain a colloidal gold solution conjugated to the antibody.
(1-2) Получение подушки, содержащей коллоидное золото(1-2) Obtaining pillows containing colloidal gold
Раствор коллоидного золота, конъюгированного с антителом, полученный в (1-1), разводили фосфатным буфером, содержащим БСА, и заполняли в подушку из стекловолокна (Millipore) размером 20 мм × 300 мм, которую заранее вырезали. Подушку высушивали при комнатной температуре в течение ночи для получения подушки, содержащей антитело, конъюгированное с коллоидным золотом.The solution of colloidal gold conjugated to the antibody obtained in (1-1) was diluted with phosphate buffer containing BSA and filled into a 20 mm × 300 mm fiberglass pad (cut out in advance). The pillow was dried at room temperature overnight to obtain a pillow containing an antibody conjugated to colloidal gold.
(1-3) Приготовление мембраны с иммобилизованными антителами (носитель для иммунохроматографии)(1-3) Preparation of a membrane with immobilized antibodies (carrier for immunochromatography)
На нитроцеллюлозную мембрану (Millipore), которую обрезали до размера 30Ч300 мм, иммобилизовали антитело согласно следующему способу, чтобы приготовить мембрану с иммобилизованным антителом. Раствор моноклонального антитела MCM19 для иммобилизации (5 мг/мл) наносили линией шириной приблизительно 1 мм с помощью устройства для нанесения покрытия (BioDot), на расстоянии 16 мм от края по одной из длинных сторон мембраны, в качестве основы, и высушивали для получения мембраны с иммобилизованным антителом.An antibody was immobilized onto a nitrocellulose membrane (Millipore), which was cut to a size of 30 × 300 mm, according to the following method, in order to prepare a membrane with an immobilized antibody. The MCM19 monoclonal antibody solution for immobilization (5 mg / ml) was applied with a line of approximately 1 mm wide using a coating device (BioDot), 16 mm from the edge along one of the long sides of the membrane as a base, and dried to obtain a membrane with immobilized antibody.
(1-4) Создание набора для иммунохроматографии(1-4) Creating a kit for immunochromatography
Мембрану с иммобилизованным антителом, подушку, несущую коллоидальное золото, и абсорбирующую подушку (Pall corporation) прикрепляли к листу с адгезивной обратной стороной, так чтобы соседние детали перекрывали друг друга. Полученную перекрывающуюся структуру разрезали вдоль длинной стороны на ширину 6 мм, используя резак, для получения тест-полосок для иммунохроматографии. Каждую тест-полоску помещали в корпусный футляр для создания тест-набора для иммунохроматографии.An immobilized antibody membrane, a pillow carrying colloidal gold, and an absorbent pad (Pall corporation) were attached to the sheet with an adhesive back so that adjacent parts overlap each other. The resulting overlapping structure was cut along the long side to a width of 6 mm using a cutter to obtain test strips for immunochromatography. Each test strip was placed in a case to create a test kit for immunochromatography.
(1-5) Метод тестирования(1-5) Test Method
Культивируемые штаммы, штаммы, отмытые PBS, культуральные супернатанты и осадки культивируемых штаммов растворяли в фосфатном буфере, содержащем Triton X-100, для приготовления растворов антигена Mycoplasma pneumoniae (или штамма) для теста в заранее установленных концентрациях. К каждому иммунохроматографическому набору для теста добавляли по каплям 100 мкл раствора антигена Mycoplasma pneumoniae (или штамма) для теста. Через 15 минут после добавления образцы, в которых развитие окраски наблюдали невооруженным глазом в положении, где было нанесено антитело anti-Mycoplasma-pneumoniae, каждой мембраны с иммобилизованным антителом оценивали как "положительные", и образцы, где не выявляли развития окраски, оценивали как "отрицательные".Cultured strains, strains washed with PBS, culture supernatants and precipitates of cultured strains were dissolved in phosphate buffer containing Triton X-100 to prepare solutions of Mycoplasma pneumoniae antigen (or strain) for the test at predetermined concentrations. To each immunochromatographic test kit, 100 μl of Mycoplasma pneumoniae antigen solution (or strain) for the test was added dropwise. 15 minutes after addition, samples in which color development was observed with the naked eye at the position where the anti-Mycoplasma-pneumoniae antibody was applied, each membrane with immobilized antibody was evaluated as “positive,” and samples where no color development was detected were evaluated as “ negative. "
(2) Проверка чувствительности(2) Sensitivity Test
Тестируемые штаммы (1-1) примера 2 применяли для иммунохроматографии, как описано выше, и тестовое разведение, которое показало развитие окраски, возникающей на линии тестирования, и максимальную кратность разведения, использовали для расчета количества микробных клеток каждого штамма. Результаты представлены в таблице 8.The test strains (1-1) of Example 2 were used for immunochromatography as described above, and test dilution, which showed the development of color appearing on the test line, and the maximum dilution ratio, were used to calculate the number of microbial cells of each strain. The results are presented in table 8.
Обнаружили из результатов, представленных в таблице 8, что чувствительность к Mycoplasma pneumoniae составляла 103-104 КОЕ/мл при иммунохроматографии с использованием моноклональных антител.Found from the results presented in table 8 that the sensitivity to Mycoplasma pneumoniae was 10 3 -10 4 CFU / ml when immunochromatography using monoclonal antibodies.
(3) Тест на перекрестную реактивность(3) Cross-reactivity test
Тестируемые штаммы (1-2) [род Mycoplasma, кроме Mycoplasma pneumoniae, род Ureaplasma и род Acholeplasma, представлены в таблице 2] и тестируемые штаммы (1-3) [другие бактерии и грибы, представленные в таблицах 3-6] примера 2 применяли в иммунохроматографии, описанной выше.Test strains (1-2) [genus Mycoplasma, except Mycoplasma pneumoniae , genus Ureaplasma and genus Acholeplasma, are presented in table 2] and test strains (1-3) [other bacteria and fungi shown in tables 3-6] of example 2 were used in the immunochromatography described above.
Все микроорганизмы, за исключением Mycoplasma genitalium, являлись отрицательными, т.е. не проявляли какого-либо развития окраски. Напротив, развитие окраски обнаруживали для Mycoplasma genitalium, и количество клеток микроорганизма, рассчитанное из опытного разведения, показывающее концентрацию максимального разведения составляло 6,9×104 КОЕ/мл.All microorganisms, with the exception of Mycoplasma genitalium, were negative, i.e. did not show any color development. In contrast, color development was detected for Mycoplasma genitalium , and the number of microorganism cells calculated from the experimental dilution showing the maximum dilution concentration was 6.9 × 10 4 CFU / ml.
Как показано в результатах, обнаружили, что иммунохроматография с использованием моноклональных антител показывала перекрестную реактивность с Mycoplasma genitalium, но не показывала перекрестной реактивности с другими микроорганизмами.As shown in the results, it was found that immunochromatography using monoclonal antibodies showed cross-reactivity with Mycoplasma genitalium , but did not show cross-reactivity with other microorganisms.
Как описано выше, подтвердили, что иммунохроматография не показала перекрестной реактивности со многими бактериями и грибами, которые могли бы помешать диагностике инфекции Mycoplasma pneumoniae или Mycoplasma genitalium.As described above, it was confirmed that immunochromatography did not show cross-reactivity with many bacteria and fungi that could interfere with the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae or Mycoplasma genitalium infection.
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
Оценка клинических образцовAssessment of clinical samples
Брали мазки из зева у 3 пациентов, у которых подозревали микоплазменную инфекцию, и у 33 здоровых субъектов, и осуществляли детекцию Mycoplasma pneumoniae в соответствии с методом иммунохроматографии примера 3. В результате наблюдали положительную реакцию у 3 пациентов с подозрением на микоплазменную инфекцию, и результаты 33 здоровых субъектов были отрицательными, как показано в таблице 9.Throat swabs were taken in 3 patients in whom mycoplasma infection was suspected, and in 33 healthy subjects, and Mycoplasma pneumoniae was detected according to the method of immunochromatography of Example 3. As a result, a positive reaction was observed in 3 patients with suspected mycoplasma infection, and results 33 healthy subjects were negative, as shown in table 9.
Экстрагировали ДНК из тех же образцов в соответствии с общепринятым методом, и осуществляли детектирование гена Mycoplasma pneumoniae модифицированным методом, полученным из метода качественного анализа ПЦР по Jensen et al. (APMIS. 1989; 97(11): 1046-8), в котором амплифицировали часть гена P1 Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae M129-B7 Номер NCBI: NC_000912), и оба результата сравнивали друг с другом. Положительный и отрицательный результаты согласовывались друг с другом, как показано в таблице 9. DNA was extracted from the same samples in accordance with a conventional method, and the Mycoplasma pneumoniae gene was detected by a modified method obtained from the qualitative PCR analysis method according to Jensen et al. (APMIS. 1989; 97 (11): 1046-8) in which a portion of the P1 gene of Mycoplasma pneumoniae ( M. pneumoniae M129-B7 NCBI Number: NC_000912) was amplified, and both results were compared with each other. Positive and negative results were consistent with each other, as shown in table 9.
Показатель совпадения положительных результатов: 100% (3/3) Показатель совпадения отрицательных результатов: 100% (33/33) Общий показатель совпадения результатов: 100% (36/36)Match score: 100% (3/3) Match score: 100% (33/33) Match score: 100% (36/36)
Затем использовали последовательности ДНК, полученные из образцов, которые показали положительный результат в анализе иммунохроматографии и в качественном анализе методом ПЦР, и осуществляли детектирование гена Mycoplasma genitalium с применением модифицированного метода, полученного из метода качественного анализа ПЦР Yoshida et al. (J Clin Microbiol. 2002; 40(4): 1451-5) Mycoplasma genitalium, в котором амплифицировали часть области 16s рРНК Mycoplasma genitalium (M. genitalium G7 Номер NCBI: L43967). В результате, ген, полученный из Mycoplasma genitalium, не обнаружили ни в одном из образцов, как показано в таблице 10.Then, DNA sequences obtained from samples that showed a positive result in immunochromatography analysis and in qualitative analysis by PCR were used, and the Mycoplasma genitalium gene was detected using a modified method obtained from Yoshida et al. (J Clin Microbiol. 2002; 40 (4): 1451-5) Mycoplasma genitalium , in which a portion of the 16s rRNA region of Mycoplasma genitalium (M. genitalium G7 NCBI number: L43967) was amplified. As a result, the gene obtained from Mycoplasma genitalium was not found in any of the samples, as shown in table 10.
Таким образом подтвердили, что ген, полученный из Mycoplasma genitalium может быть амплифицирован указанным методом. Thus, it was confirmed that the gene obtained from Mycoplasma genitalium can be amplified by this method.
Как описано выше, показано, что антитело настоящего изобретения использовали для специфического выявления Mycoplasma pneumoniae, и можно диагностировать микоплазменную инфекцию.As described above, it is shown that the antibody of the present invention was used to specifically detect Mycoplasma pneumoniae , and mycoplasma infection can be diagnosed.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Амплификация гена DnaK культивируемых штаммов Mycoplasma pneumoniae Amplification of the DnaK gene of cultured Mycoplasma pneumoniae strains
В качестве образцов, которые нужно оценить, использовали 8 штаммов Mycoplasma pneumoniae, приобретенных в ATCC (M. pneumoniae FH: ATCC No. 15531, M. pneumoniae Bru: ATCC No. 15377, M. pneumoniae Mac: ATCC No. 15492, M. pneumoniae Mutant 22: ATCC No.39505, M. pneumoniae M52: ATCC No.15293, M. pneumoniae PI1428: ATCC No. 29085, M. pneumoniae M129-B7: ATCC No. 29342, и M. pneumoniae UTMB-10P: ATCC No. 49894). Указанные 8 штаммов Mycoplasma pneumoniae культивировали в среде PPLO и выделяли ДНК.Eight strains of Mycoplasma pneumoniae purchased from ATCC ( M. pneumoniae FH: ATCC No. 15531, M. pneumoniae Bru: ATCC No. 15377, M. pneumoniae Mac: ATCC No. 15492, M. were used as samples to be evaluated . pneumoniae Mutant 22: ATCC No.39505, M. pneumoniae M52: ATCC No.15293, M. pneumoniae PI1428: ATCC No. 29085, M. pneumoniae M129-B7: ATCC No. 29342, and M. pneumoniae UTMB-10P: ATCC No. 49894). These 8 strains of Mycoplasma pneumoniae were cultured in PPLO medium and DNA was isolated.
Выделение ДНК проводили с применением набора Sumitest EX-R&D (Medical & Biological Laboratories), и каждый образец ДНК суспендировали в буфере, содержащем 10 ммоль/л Tris-HCl, 1 ммоль/л EDTA, pH 8,0 (Nippon Gene)(в дальнейшем называемом буфер TE), и замораживали при -40°C.DNA was isolated using the Sumitest EX-R & D kit (Medical & Biological Laboratories), and each DNA sample was suspended in a buffer containing 10 mmol / L Tris-HCl, 1 mmol / L EDTA, pH 8.0 (Nippon Gene) (in hereinafter referred to as TE buffer), and frozen at -40 ° C.
В отношении выделенных ДНК, число копий гена определяли с помощью количественного анализа ПЦР общей для микоплазм области 16s рРНК. Каждую ДНК разводили буфером TE для получения препаратов 10-кратных разведений от 2×106 до 2×100 копий/мкл. Указанные разведения использовали для обнаружения гена DnaK.In relation to the isolated DNA, the number of copies of the gene was determined by quantitative PCR analysis of the total region of 16s rRNA for mycoplasmas. Each DNA was diluted with TE buffer to obtain 10-fold dilutions from 2 × 10 6 to 2 × 10 0 copies / μl. These dilutions were used to detect the DnaK gene.
Количественный анализ ПЦР для общей микоплазменной области 16s рРНК осуществляли следующим образом.Quantitative PCR analysis for the total mycoplasma region of 16s rRNA was performed as follows.
Создавали праймеры, которые являлись общими для рода Mycoplasma, для амплификации области 16s рРНК, и число копий гена в каждой экстрагированной ДНК M. pneumoniae рассчитывали методом ПЦР в режиме реального времени, с использованием стандарта. Анализ ПЦР в режиме реального времени проводили с применением циклера LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science).Primers were created that were common for the genus Mycoplasma for amplification of the 16s rRNA region, and the number of copies of the gene in each extracted M. pneumoniae DNA was calculated by real-time PCR using the standard. Real-time PCR analysis was performed using the LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science) cycle.
Использовали следующие последовательности праймеров.The following primer sequences were used.
Полный геном M. pneumoniae M129-B7: GenBank № доступа NC_000912Complete M. pneumoniae M129-B7 genome: GenBank Access no. NC_000912
FmY4: 5'-TGGGGAGCAAA(C/T)AGGATTAG-3' (SEQ ID NO: 2)FmY4: 5'-TGGGGAGCAAA (C / T) AGGATTAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
nt 119,081-119,100 20mernt 119,081-119,100 20mer
MGSO-2: 5'-CACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3' (SEQ ID NO: 3)MGSO-2: 5'-CACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3 '(SEQ ID NO: 3)
nt 119,332-119,356 25mernt 119,332-119,356 25mer
В отношении условий ПЦР, осуществляли реакцию при 95°C в течение 10 минут и цикл, состоящий из реакций денатурации при 94°C в течение 10 секунд, отжига при 60°C в течение 2 секунд, и при 72°C в течение 12 секунд повторяли 50 раз.Regarding PCR conditions, a reaction was carried out at 95 ° C for 10 minutes and a cycle consisting of denaturation reactions at 94 ° C for 10 seconds, annealing at 60 ° C for 2 seconds, and at 72 ° C for 12 seconds repeated 50 times.
В качестве стандарта использовали серии разведений (107, 105, 103, 102 и 101 копий/тест) T-вектора pT7Blue (Takara Bio) в котором часть 16s рРНК (771 bp: 302-1072 для 16s рРНК) M. pneumoniae (штамм M129) была рекомбинантной. Число копий в стандарте рассчитывали на основе следующих уравнений:A series of dilutions (10 7 , 10 5 , 10 3 , 10 2, and 10 1 copies / test) of the pT7Blue T-vector (Takara Bio) in which part of 16s rRNA (771 bp: 302-1072 for 16s rRNA) M was used as a standard pneumoniae (strain M129) was recombinant. The number of copies in the standard was calculated based on the following equations:
Концентрация ДНК (мкг/мл) = ABS (260 нм) × 50DNA concentration (μg / ml) = ABS (260 nm) × 50
1 пмоль 1 т.п.н. ДНК = 0,66 мкг1
Lp: длина плазмидыLp: plasmid length
Lr: длина рекомбинантной ДНКLr: length of recombinant DNA
Затем, ген DnaK Mycoplasma pneumoniae амплифицировали с помощью ПЦР, как изложено ниже. Что касается реакционной смеси ПЦР, 25 мкл Premix EX Taq Hot Start Version (TaKaRa), 1 мкл 10 пмоль/мкл смыслового праймера MpDnaK_S, и 1 мкл 10 пмоль/мкл антисмыслового праймера MpDnaK_A добавляли к 18 мкл дистиллированной воды Otsuka (Otsuka Pharmaceutical) для получения 45 мкл базовой смеси, и 5 мкл каждой выделенной ДНК добавляли к базовой смеси для доведения общего объема до 50 мкл. В качестве отрицательного контроля в ПЦР использовали буфер TE. Для амплификации гена DnaK, имеющего общую длину 1788 п.о., создавали смысловой праймер, состоящий из 81 п.о., расположенных в 5'-направлении от стартового кодона гена DnaK, и создавали антисмысловой праймер, состоящий из 53 п.о., расположенных в 3'-направлении от стоп-кодона. Более подробно, смысловой праймер MpDnaK_S соответствовал нуклеотидной последовательности 521,756-521,782 M. peumoniae M129 (GenBank Ace No. NC_000912), и антисмысловой праймер MpDnaK_A соответствовал нуклеотидной последовательности 523,655-523,677.Then, the DnaK gene of Mycoplasma pneumoniae was amplified by PCR, as described below. Regarding the PCR reaction mixture, 25 μl of the Premix EX Taq Hot Start Version (TaKaRa), 1 μl of 10 pmol / μl of the MpDnaK_S sense primer, and 1 μl of 10 pmol / μl of the MpDnaK_A antisense primer was added to 18 μl of Otsuka distilled water (Otsuka Pharmaceutical) obtaining 45 μl of the base mixture, and 5 μl of each isolated DNA was added to the base mixture to bring the total volume to 50 μl. A TE buffer was used as a negative control in PCR. To amplify a DnaK gene having a total length of 1788 bp, a sense primer was created consisting of 81 bp located in the 5'-direction from the start codon of the DnaK gene and an antisense primer consisting of 53 bp was created. located in the 3'-direction from the stop codon. In more detail, the sense primer MpDnaK_S corresponded to the nucleotide sequence 521,756-521,782 of M. peumoniae M129 (GenBank Ace No. NC_000912), and the antisense primer MpDnaK_A corresponded to the nucleotide sequence 523,655-523,677.
MpDnaK_S: 5'-CTCAAACGCTAAAAGTGCTAACG-3' 23mer (SEQ ID NO:4)MpDnaK_S: 5'-CTCAAACGCTAAAAGTGCTAACG-3 '23mer (SEQ ID NO: 4)
MpDnaK_A: 5'-AAACCATTATTACAGGTCAAATAAGAC-3' 27mer (SEQ ID NO: 5)MpDnaK_A: 5'-AAACCATTATTACAGGTCAAATAAGAC-3 '27mer (SEQ ID NO: 5)
В реакции ПЦР с применением устройства Mastercycler (Eppendorf) цикл, состоящий из реакций денатурирования при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд, и реакции при 72°C в течение 2 минут, повторяли 50 раз, и в заключение осуществляли реакцию при 72°C в течение 5 минут. После реакции ПЦР 5 мкл каждого продукта ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозе и окрашивали агарозный гель бромидом этидия и освещали ультрафиолетовым светом для подтверждения наличия полосы продукта амплификации приблизительно 1900 п.о.In a PCR reaction using a Mastercycler (Eppendorf) device, the cycle consisting of denaturing reactions at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 50 ° C for 30 seconds, and reactions at 72 ° C for 2 minutes, were repeated 50 times, and finally, a reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes. After the PCR reaction, 5 μl of each PCR product was electrophoresed in 2% agarose and the agarose gel was stained with ethidium bromide and irradiated with ultraviolet light to confirm the presence of an amplification product band of approximately 1900 bp.
8 штаммов Mycoplasma pneumoniae, полученных ранее, проверяли, чтобы подтвердить, что все 8 штаммов можно амплифицировать вплоть до 102 копий/тест.The 8 strains of Mycoplasma pneumoniae obtained previously were checked to confirm that all 8 strains can be amplified up to 10 2 copies / test.
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
Перекрестная реактивность со штаммами культуры микоплазмы, выделенными у человекаCross-reactivity with strains of mycoplasma culture isolated in humans
В качестве образцов для измерения использовали 17 штаммов микоплазмы, приобретенных в ATCC (M. genitalium: ATCC No. 33530, M. hominis: ATCC No.23114, Ureaplasma parvum: ATCC No. 700970, U. urealyticum: ATCC No. 27618, M. fermentans: ATCC No. 19989, Acholeplasma laidlawii: ATCC No. 23206, A. oculi: ATCC No. 51735, M. penetrans: ATCC No. 55252, M. pirum: ATCC No. 25960, M. orale: ATCC No. 23714, M. salivarium: ATCC No. 23064, M. arthritidis: ATCC No. 19611, M. buccale: ATCC No. 23636, M. faucium: ATCC No. 25293, M. lipophilum: ATCC No. 27104, M. primatum: ATCC No. 25948, и M. spermatophilum: ATCC No. 49695). Указанные 17 штаммов микоплазмы культивировали в среде PPLO. Аналогично примеру 5, выделяли ДНК, число копий гена определяли с помощью теста количественной ПЦР области 16s рРНК, и образец каждой ДНК разводили до концентрации 2×105 копий/мкл.17 mycoplasma strains purchased from ATCC ( M. genitalium : ATCC No. 33530, M. hominis : ATCC No.23114, Ureaplasma parvum : ATCC No. 700970, U. urealyticum : ATCC No. 27618, M fermentans : ATCC No. 19989, Acholeplasma laidlawii : ATCC No. 23206, A. oculi : ATCC No. 51735, M. penetrans : ATCC No. 55252, M. pirum : ATCC No. 25960, M. orale : ATCC No. 23714, M. salivarium : ATCC No. 23064, M. arthritidis : ATCC No. 19611, M. buccale : ATCC No. 23636, M. faucium : ATCC No. 25293, M. lipophilum : ATCC No. 27104, M. primatum : ATCC No. 25948, and M. spermatophilum : ATCC No. 49695). These 17 mycoplasma strains were cultured in PPLO medium. Analogously to example 5, DNA was isolated, the number of copies of the gene was determined using a quantitative PCR test of the 16s rRNA region, and a sample of each DNA was diluted to a concentration of 2 × 10 5 copies / μl.
Процедуры, описанные в примере 5, повторяли, причем 17 штаммов Mycoplasma использовали в качестве образцов, которые нужно оценить, осуществляли ПЦР на наличие гена DnaK Mycoplasma pneumoniae, и не обнаруживали полосы продукта амплификации ни у одного из 17 штаммов. Поскольку не выявили перекрестной реактивности, когда концентрация ДНК в образце в 10000 раз превышала концентрацию ДНК, необходимую для амплификации гена DnaK M. pneumoniae, обнаружили, что ПЦР на наличие гена DnaK Mycoplasma pneumoniae отличалась чрезвычайно высокой специфичностью.The procedures described in Example 5 were repeated, with 17 Mycoplasma strains being used as samples to be evaluated, PCR was performed for the DnaK Mycoplasma pneumoniae gene, and no amplification product band was found in any of the 17 strains. Since no cross-reactivity was detected when the DNA concentration in the sample was 10,000 times higher than the DNA concentration required for amplification of the M. pneumoniae DnaK gene, it was found that PCR for the presence of the DnaK Mycoplasma pneumoniae gene was extremely specific.
ПРИМЕР 7EXAMPLE 7
Амплификация гена DnaK Mycoplasma pneumoniae клинических образцовAmplification of the DnaK Mycoplasma pneumoniae gene of clinical samples
В качестве образцов для измерения, ДНК, выделенные в 46 случаях положительных клинических образцов (40 случаев мазков из зева, 2 случая назальной слизи, 1 случай носоглоточного аспирата и 3 случая мазков из носоглотки) и 30 случаев отрицательных образцов (10 случаев мазков из зева здоровых субъектов, 10 случаев мазков из зева из клинических образцов, 4 случая назальной слизи, 3 случая носоглоточных аспиратов и 3 случая мазков из носоглотки) тестировали методом вложенной ПЦР участка гена P1 Mycoplasma pneumoniae, как описано в разделе "Mycoplasma pneumonia" публикации National Institute of Infectious Diseases, "Pathogen Detection Manual" стр. 1309-1344.As samples for measurement, DNA isolated in 46 cases of positive clinical samples (40 cases of throat swabs, 2 cases of nasal mucus, 1 case of nasopharyngeal aspirate and 3 cases of nasopharyngeal swabs) and 30 cases of negative samples (10 cases of healthy throat swabs of subjects, 10 cases of throat swabs from clinical samples, 4 cases of nasal mucus, 3 cases of nasopharyngeal aspirates and 3 cases of nasopharyngeal swabs) were tested by nested PCR of the Mycoplasma pneumoniae P1 gene, as described in the Mycoplasma pneumonia section of Nati onal Institute of Infectious Diseases, "Pathogen Detection Manual" pp. 1309-1344.
ПЦР гена DnaK Mycoplasma pneumoniae осуществляли, чтобы подтвердить, что ген DnaK амплифицировался во всех 46 случаях положительных результатов ПЦР гена P1. Напротив, ген DnaK не амплифицировался ни в одном из 30 случаев отрицательного результата ПЦР гена P1. Mycoplasma pneumoniae DnaK gene PCR was performed to confirm that the DnaK gene was amplified in all 46 cases of positive P1 gene PCR results. In contrast, the DnaK gene was not amplified in any of the 30 cases of negative PCR of the P1 gene.
ПРИМЕР 8EXAMPLE 8
Анализ нуклеотидной последовательности гена DnaK, полученной из культивированных штаммов и из клинических образцовAnalysis of the nucleotide sequence of the DnaK gene obtained from cultured strains and from clinical samples
Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР 8 штаммов ATCC примера 5 и 8 клинических образцов (в 7 случаях мазки из зева и в 1 случае мазок из носоглотки) примера 7, в которых обнаружили амплификацию с помощью ПЦР гена DnaK, определяли с применением устройств BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) и 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).The nucleotide sequences of the PCR products of 8 ATCC strains of Example 5 and 8 clinical samples (in 7 cases of pharyngeal swabs and in 1 case of a nasopharyngeal swab) of Example 7, in which amplification was detected by PCR of the DnaK gene, was determined using BigDye Terminator v3.1 devices (Applied Biosystems) and 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
В результате, что касается гена DnaK (1788 п.о., SEQ ID NO: 6), продукты ПЦР 8 штаммов ATCC и 8 клинических образцов полностью (100%) соответствовали друг другу, и также полностью (100%) соответствовали штамму M129 (номер доступа NC_000912) и штамму FH (номер доступа CP002077), зарегистрированным в GenBank. Выравнивание последовательностей штамма M129 и штамма FH представлено на фиг.1-3.As a result, for the DnaK gene (1788 bp, SEQ ID NO: 6), the PCR products of 8 ATCC strains and 8 clinical samples fully (100%) corresponded to each other, and also completely (100%) corresponded to strain M129 ( accession number NC_000912) and strain FH (accession number CP002077) registered with GenBank. The alignment of the sequences of strain M129 and strain FH is shown in figures 1-3.
В отношении гена P1 проводили дифференциальное типирование методом ПЦР-ПДРФ в соответствии со ссылкой: JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 1996, p. 447-449 Vol. 34, No. 2, и 8 штаммов ATTC Примера 5 распределяли в две группы. Более подробно, 4 штамма, включающие M129-B7, M52, PI1428, и Mutant 22 относили к типу I, и 4 штамма, включающие FH, Bru, Mac и UTMB-10P, относили к типу II. Выравнивание последовательностей штамма M129 (SEQ ID NO: 7) и штамма FH (SEQ ID NO: 8), в качестве типичных штаммов, представлено на фиг.4-10.With respect to the P1 gene, differential typing was performed by PCR-RFLP according to JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 1996, p. 447-449 Vol. 34, No. 2, and 8 ATTC strains of Example 5 were divided into two groups. In more detail, 4 strains including M129-B7, M52, PI1428, and Mutant 22 were classified as Type I, and 4 strains including FH, Bru, Mac, and UTMB-10P were classified as Type II. The sequence alignment of strain M129 (SEQ ID NO: 7) and strain FH (SEQ ID NO: 8), as typical strains, are presented in Figures 4-10.
На основании результатов считали, что полученные антитела не показывали различий в реактивности по генотипу, месту получения и времени получения, поскольку гены DnaK полностью (100%) соответствовали друг другу, даже из штаммов, в которых различались типы гена P1, и не обнаружено вариаций нуклеотидной последовательности среди штаммов, полученных из различных мест и на протяжении последних 50 лет.Based on the results, it was believed that the antibodies obtained showed no differences in reactivity by genotype, place of production, and time of receipt, since the DnaK genes were completely (100%) consistent with each other, even from strains in which the types of the P1 gene differed, and no nucleotide variations were detected sequences among strains obtained from various places and over the past 50 years.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY
Согласно настоящему изобретению, Mycoplasma pneumoniae и/или Mycoplasma genitalium можно специфически обнаружить с высокой чувствительностью в образцах, таких как образцы мазков со слизистой оболочки рта, образцы мазков со слизистой оболочки носовой полости, образцы мочи, образцы тканей, или жидкостей организма, или образцы, полученные из культуры. В частности, настоящее изобретение важно для постановки диагноза атипичной пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae, или диагноза негонококкового уретрита и заболевания, передаваемого половым путем, вызванного Mycoplasma genitalium, и промышленно применимо для производства лекарственных препаратов.According to the present invention, Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium can be specifically detected with high sensitivity in samples, such as smear samples from the oral mucosa, smear samples from the nasal mucosa, urine samples, tissue samples, or body fluids, or samples, derived from culture. In particular, the present invention is important for the diagnosis of SARS caused by Mycoplasma pneumoniae, or the diagnosis of non-gonococcal urethritis and sexually transmitted disease caused by Mycoplasma genitalium , and is industrially applicable for the manufacture of drugs.
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, возможны различные изменения и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, не нарушающие объем прилагаемой формулы изобретения.Although the present invention has been described with reference to specific embodiments, various changes and modifications are possible, obvious to those skilled in the art, without violating the scope of the attached claims.
Claims (7)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009276115 | 2009-12-04 | ||
| JP2009-276115 | 2009-12-04 | ||
| JP2010023102 | 2010-02-04 | ||
| JP2010-023102 | 2010-02-04 | ||
| PCT/JP2010/071652 WO2011068189A1 (en) | 2009-12-04 | 2010-12-03 | Method for detecting microorganisms belonging to mycoplasma pneumoniae and/or mycoplasma genitalium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012127809A RU2012127809A (en) | 2014-01-10 |
| RU2575075C2 true RU2575075C2 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799416C1 (en) * | 2022-12-13 | 2023-07-05 | Исаев Сергей Александрович | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the dna fragment of the 16s ribosomal rna gene of ureaplasma genus of mycoplasmataceae family of mycoplasmatales order (ureaplasma spp.) of mollicutes class for the detection of pathogenic ureaplasmas of cats and dogs |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005236969A (en) * | 2004-01-20 | 2005-09-02 | Nec Corp | Under-travel mobile terminal non-use prevention system, on-vehicle apparatus and mobile terminal device |
| JP2008048051A (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-28 | Denso Corp | Communication system |
| JP2009035024A (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-19 | Fujitsu Ten Ltd | On-board electronic system and device |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005236969A (en) * | 2004-01-20 | 2005-09-02 | Nec Corp | Under-travel mobile terminal non-use prevention system, on-vehicle apparatus and mobile terminal device |
| JP2008048051A (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-28 | Denso Corp | Communication system |
| JP2009035024A (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-19 | Fujitsu Ten Ltd | On-board electronic system and device |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GIRALDO P. et al., "Detection of the human 70-kD and 60-kD heat shock proteins in the vagina: relation to microbial flora, vaginal pH, and method of contraception", Infect Dis Obstet Gynecol. 1999;7(1-2):23-5. GIRALDO P. et al., "Vaginal heat shock protein expression in symptom-free women with a history of recurrent vulvovaginitis", Am J Obstet Gynecol. 1999 Mar;180(3 Pt 1):524-9. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2799416C1 (en) * | 2022-12-13 | 2023-07-05 | Исаев Сергей Александрович | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for the dna fragment of the 16s ribosomal rna gene of ureaplasma genus of mycoplasmataceae family of mycoplasmatales order (ureaplasma spp.) of mollicutes class for the detection of pathogenic ureaplasmas of cats and dogs |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5712140B2 (en) | Method for detecting microorganisms belonging to Mycoplasma pneumoniae and / or Mycoplasma genitalium | |
| Skakni et al. | Detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples from pediatric patients by polymerase chain reaction | |
| EP3037822B1 (en) | Mycoplasma pneumoniae immunological detection method and kit | |
| Gosting et al. | Identification of a species-specific antigen in Legionella pneumophila by a monoclonal antibody | |
| EP1238279B1 (en) | Helicobacter pylori antigens in blood | |
| JP5442641B2 (en) | Method for measuring all Haemophilus influenzae | |
| JP2012006968A (en) | Antibody for detecting mycoplasma pneumoniae | |
| JP6080850B2 (en) | Improved vaccine diagnostics | |
| JP2012017334A (en) | Antibody for detecting chlamydia pneumoniae | |
| EP0699688A2 (en) | Chlamydia pneumoniae specific monoclonal antibodies and their diagnostic use | |
| JP5183635B2 (en) | In vitro diagnostic method for PVL-producing Staphylococcus aureus | |
| JP2011160809A (en) | Diagnosis of whipple's disease | |
| RU2575075C2 (en) | Method of detection of microorganisms belonging to species of mycoplasma pneumoniae mind and/or mycoplasma genitalium | |
| Cao et al. | Detection of spiral and coccoid forms of Helicobacter pylori using a murine monoclonal antibody | |
| Sillis | Modern methods for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae pneumonia | |
| RU2808590C1 (en) | Method of differentiating virulent listeria monocytogenes strains from avirulent strains using polyclonal antibodies against pathogenicity factors internalin a (inla) and internalin b (inlb) | |
| US20090068218A1 (en) | Antigens for Vaccination Against and Detection of Mycoplasma Suis | |
| Zheng et al. | Preparation and evaluation of monoclonal antibodies against chlamydial protease-like activity factor to detect Chlamydia pneumoniae antigen in early pediatric pneumonia | |
| Shukla et al. | P394 Evaluation of diagnostic potential of recombinant secretory aspartyl proteinase 2 (Sap2) protein from Candida parapsilosis for use in systemic candidiasis | |
| JP2001286295A (en) | Antibody for detecting chlamydia trachomatis | |
| Ivaschenko et al. | Development and testing of an enzyme immunoassay-based monoclonal test system for the detection of the Yersinia pestis V antigen | |
| JP2021156810A (en) | Method and kit for performing immunological detection on mycoplasma pneumoniae | |
| Schibrowski | Mycoplasma bovis in Australian feeder cattle | |
| Wellehan | Infectious disease diagnostics in reptiles: what do they mean? | |
| JP2000041674A (en) | Antibacterial monoclonal antibody |