RU2550955C1 - Method for electrochemical immunoassay for detecting viruses/viral antigens - Google Patents
Method for electrochemical immunoassay for detecting viruses/viral antigens Download PDFInfo
- Publication number
- RU2550955C1 RU2550955C1 RU2013155056/15A RU2013155056A RU2550955C1 RU 2550955 C1 RU2550955 C1 RU 2550955C1 RU 2013155056/15 A RU2013155056/15 A RU 2013155056/15A RU 2013155056 A RU2013155056 A RU 2013155056A RU 2550955 C1 RU2550955 C1 RU 2550955C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- signal
- immunocomplex
- formation
- antibodies
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Заявляемое изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов в различных объектах и может быть использовано для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний.The claimed invention relates to biology and medicine, namely to immunoassay, in particular to electrochemical methods for determining the content of viruses / antigens of viruses in various objects and can be used for differential diagnosis of infectious diseases.
Недостатками используемых в настоящее время способов иммуноанализа являются: необходимость создания специальных условий для их проведения, например способы анализа, основанные на полимеразной цепной реакции, а также высокая стоимость используемых реагентов и оборудования, например иммуноферментный анализ.The disadvantages of the currently used immunoassay methods are: the need to create special conditions for their implementation, for example, methods of analysis based on polymerase chain reaction, as well as the high cost of the reagents and equipment used, for example enzyme immunoassay.
Из уровня техники известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях, испускающими долгоживущую флуоресценцию, добавление к смеси микрочастиц исследуемого образца и биоспецифического проявляющего реагента, меченного детектирующим флуорохромом, проведение реакции для образования биоспецифических комплексов, возбуждение флуорохромов и измерение в режиме временного разрешения количества долгоживущей эмиссии флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и количества эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома для измерения количества искомых аналитов, при этом образовавшиеся биоспецифические комплексы осаждают на твердосплавный носитель, эмиссию флуоресценции всех флуорохромов возбуждают источниками излучения в двух спектральных диапазонах, для мечения биоспецифического проявляющего реагента используют детектирующий флуорохром с короткоживущей флуоресценцией, область возбуждения и эмиссии флуоресценции которого находится вне областей возбуждения и эмиссии флуоресценции флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией, при этом соотношение концентраций флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией в микрочастицах для определения одного вида аналита постоянно, а для определения разных видов аналитов соотношение концентраций различается по крайней мере в два раза (см. патент РФ №2379691 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц», дата приоритета 07.07.2008 г., опубликовано 20.01.2010 г.)A method is known from the prior art for a multi-analytic immunoassay using microparticles, comprising mixing various categories of microparticles coated with biospecific reagents to bind various desired analytes and labeled with one or more fluorochromes at various concentrations emitting long-lived fluorescence, adding the test sample and biospecific microparticles to the mixture labeled with a detecting fluorochrome, conducting a reaction to form biospecific of complexes, excitation of fluorochromes, and measurement in the time resolution mode of the amount of long-lived fluorescence emission to identify microparticle categories and the amount of fluorescence emission of detecting fluorochrome for measuring the number of analytes sought, while the biospecific complexes formed are deposited on a carbide carrier, all fluorescence emission is emitted by fluorescence ranges, for labeling biospecific developing reagent use de a projecting fluorochrome with short-lived fluorescence, the region of excitation and emission of fluorescence of which is outside the areas of excitation and emission of fluorescence of fluorochromes with long-lived fluorescence, while the ratio of the concentrations of fluorochromes with long-lived fluorescence in microparticles is analyzed to determine the same type for microparticles to determine the ratio of species at least twice (see RF patent No. 2379691 for the invention "Method of multi-assay immunoassay using microparticles", priority date 07/07/2008, published 01/20/2010)
Недостатки способа обусловлены необходимостью многостадийного проведения процесса, а также сложностью получения аналитического сигнала.The disadvantages of the method are due to the need for a multi-stage process, as well as the difficulty of obtaining an analytical signal.
Известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий нанесение на поверхность пористой мембраны реакционной смеси, содержащей аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубирование смеси для образования биоспецифического комплекса, отмывание реакционной смеси от несвязавшихся реагентов и детектирование аналита в образце по световому сигналу детектирующего вещества, связанного с биоспецифическим комплексом, при этом используют, по крайней мере, два вида специфичных к искомым аналитам первых и вторых связывающих молекул, при этом каждый вид тех и других молекул специфичен только к одному искомому аналиту, каждый вид первой связывающей молекулы связан, по крайней мере, с двумя длительно люминесцирующими детектирующими веществами, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному искомому аналиту, регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах эмиссии детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ, и определяют искомый аналит по соотношению фосфоресцентных сигналов, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ (µ2) определяют из следующего соотношения:A known method of multi-analytic immunoassay using microparticles, including applying to the surface of a porous membrane a reaction mixture containing an analyte, the first binding molecules associated with a detecting substance and specific for the analyte, the test sample and particles that are unable to pass through the pores of the membrane coated with second binding molecules, also specific to the analyte, incubating the mixture to form a biospecific complex, washing the reaction mixture from unbound reagents and detectors the analyte in the sample according to the light signal of the detecting substance associated with the biospecific complex, at least two types of the first and second binding molecules specific for the desired analytes are used, while each type of those and other molecules is specific to only one desired analyte, each type of the first binding molecule is associated with at least two long-luminescent detecting substances, the concentration ratio of which in each first binding molecule is selected in advance and corresponds to EFINITIONS desired analyte, recorded under the temporary permission signals phosphorescence in the spectral range of emission of the detection of substances corresponding to the time constant of damping of these substances, and determine the desired analyte ratio phosphorescent signal, wherein the spatial resolution of the detection system Δ (μ 2) is determined from the following relation:
Δ≤S/10Nµ2, гдеΔ≤S / 10Nµ 2 , where
S - площадь адсорбции частиц на мембране, µ2;S is the adsorption area of particles on the membrane, µ 2 ;
N - заданное число латексных частиц в анализируемой пробе (см. патент РФ №2339953 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использование микрочастиц», дата подачи 13.06.2007 г., опубликовано 27.11.2008 г).N is the specified number of latex particles in the analyzed sample (see RF patent No. 2339953 for the invention “Method of multi-analytic immunoassay using microparticles”, filing date June 13, 2007, published November 27, 2008).
Данный способ позволяет обнаружить и количественно детектировать низкие концентрации биологических аналитов в пробах при проведении исследований на твердой поверхности. Необходимость использования мембраны предъявляет высокие требования к составу пробы.This method allows to detect and quantitatively detect low concentrations of biological analytes in samples when conducting research on a solid surface. The need to use a membrane places high demands on the composition of the sample.
Недостатками способа являются необходимость многостадийного проведения процесса, а также сложность получения аналитического сигнала.The disadvantages of the method are the need for a multi-stage process, as well as the difficulty of obtaining an analytical signal.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ, осуществляемый с использованием электрохимического иммуносенсора, разработанного для обнаружения поверхностного антигена гепатита В. Сначала биотинилированные антитела к гепатиту В иммобилизируются на покрытых стрептавидином магнитных наночастицах. Затем добавляют антиген гепатита вируса B и после этого этапа вводят вторичные антитела, конъюгированные с сигналообразующей меткой, в качестве которой используют пероксидазу хрена. В результате происходит образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич». После этого добавляют рабочий субстрат, в качестве которого применяют буферный раствор Бриттона-Робинсона,содержащий перекись водорода и ортоаминофенол, при этом пероксидаза хрена катализирует окисление аминофенола до 3-аминофеноксазона. Затем берут аликвоту пробы, переносят ее в электрохимическую ячейку и регистрируют циклическую вольтамперограмму. Величина тока пика окисления пропорциональна количеству 3-аминофеноксазона, которое, в свою очередь, пропорционально содержанию меченных пероксидазой хрена «сэндвич»-структур, а следовательно, и содержанию антигена вируса гепатита В. Данный способ иммуноанализа позволяет определить от 0,001 до 0,015 нг/мл антигена, предел обнаружения 0,9 мкг/мл при отношении сигнал/шум 1/3 (см. Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis В surface antigen / Sara Nourani, Hedayatollah Ghourchian, Seyed Mehdi Boutorabi // Analytical Biochemistry, 2013, V.441, P.1-7).The closest technical solution to the claimed invention, selected as a prototype, is a method carried out using an electrochemical immunosensor designed to detect hepatitis B surface antigen. First, biotinylated antibodies to hepatitis B are immobilized on streptavidin-coated magnetic nanoparticles. Then the virus B hepatitis antigen is added and after this stage secondary antibodies are introduced conjugated to a signal-forming label using horseradish peroxidase. As a result, an immunocomplex is formed according to the “sandwich” scheme. After this, a working substrate is added, which is used as a Britton-Robinson buffer solution containing hydrogen peroxide and orthaminophenol, while horseradish peroxidase catalyzes the oxidation of aminophenol to 3-aminophenoxazone. An aliquot of the sample is then taken, transferred to an electrochemical cell, and a cyclic voltammogram recorded. The magnitude of the oxidation peak current is proportional to the amount of 3-aminophenoxazone, which, in turn, is proportional to the content of “sandwich” structures labeled with horseradish peroxidase and, consequently, to the content of hepatitis B virus antigen. This immunoassay method allows determination of 0.001 to 0.015 ng / ml antigen , detection limit of 0.9 μg / ml at 1/3 signal-to-noise ratio (see Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis B surface antigen / Sara Nourani, Hedayatollah Ghourchian, Seyed Mehdi Boutorabi // Analytical Biochemistry, 2013, V.441, P.1-7).
К недостаткам данного способа следует отнести многостадийность процесса анализа (предварительное биотинилирование антител, конъюгация антител с пероксидазой хрена), высокую трудоемкость процесса, большие временные затраты, а также высокие требования, предъявляемые к квалификации специалистов-операторов.The disadvantages of this method include the multi-stage analysis process (preliminary biotinylation of antibodies, conjugation of antibodies with horseradish peroxidase), the high complexity of the process, the large time costs, as well as the high requirements for the qualification of specialist operators.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое к защите техническое решение, является упрощение процесса анализа, увеличение экспрессности и воспроизводимости.The technical result, the achievement of which the proposed technical solution for protection is aimed at, is to simplify the analysis process, increase expressivity and reproducibility.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляемый способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов, включающий образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой с целью определения наличия и концентрации вируса/антигена вируса путем получения электрохимического отклика за счет использования сигналообразующей метки, входящей в состав «сэндвич»-структуры, согласно изобретению в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса (антитело - вирус/антиген вируса - антитело с сигналообразующей магнитной меткой) осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса, при этом в качестве переходного металла используют железо, а в качестве твердофазного химически инертного носителя - толстопленочный графитсодержащий электрод.The specified technical result is achieved by the fact that the claimed method of electrochemical immunoassay for determining viruses / antigens of viruses, including the formation of the immunocomplex according to the "sandwich" between antibodies and the virus / antigen of the virus, followed by the addition of a conjugate of antibodies with a signal-forming label in order to determine the presence and concentration of the virus / antigen virus by obtaining an electrochemical response by using a signal-forming label that is part of the "sandwich" structure, according to As a signal-forming label, magnetic nanocomposite particles are used, which, before the stage of formation of the immunocomplex, are obtained by creating a silicon oxide oxide coating on the surface of the magnetic nanoparticles of the transition metal oxide followed by the formation of an conjugate with antibodies, and the formation of the immunocomplex (antibody - virus / virus antigen - antibody with signal-forming magnetic label) is carried out by concentrating it on a solid-phase chemically inert carrier due to exposure to magnetic m field with the subsequent removal of this immunocomplex from the medium formed on the carrier, and the determination of the presence and concentration of the virus / antigen of the virus is carried out by the signal generated by transition metal ions resulting from the acid treatment of the immunocomplex, while iron is used as the transition metal, and as a solid-phase chemically inert carrier, a thick-film graphite-containing electrode.
Для обеспечения взаимодействия между магнитными наночастицами и антителами магнитные наночастицы могут быть модифицированы аминопропилтриэтоксисиланом, формируя, тем самым, оксидкремниевое покрытие.To ensure the interaction between magnetic nanoparticles and antibodies, magnetic nanoparticles can be modified with aminopropyltriethoxysilane, thereby forming a silicon oxide coating.
Для кислотной обработки, способствующей химическому разрушению иммунокомплекса, используют смесь азотной и серной кислот.For acid treatment, contributing to the chemical destruction of the immunocomplex, a mixture of nitric and sulfuric acids is used.
Время образования иммунокомплекса значительно сокращается за счет применения магнитного концентрирования иммунокомплекса на твердофазном носителе, что, в свою очередь, позволяет ускорить процедуру иммуноанализа. Кроме того, увеличивается чувствительность.The formation time of the immunocomplex is significantly reduced due to the use of magnetic concentration of the immunocomplex on a solid-phase carrier, which, in turn, allows you to speed up the immunoassay procedure. In addition, sensitivity increases.
Концентрацию вируса/антигена вируса определяют путем получения электрохимического отклика регистрируемого от ионов Fe3+, полученных в результате кислотной обработки углеродной подложки с иммобилизированным иммунокомплексом.The concentration of the virus / antigen of the virus is determined by obtaining an electrochemical response recorded from Fe 3+ ions obtained by acid treatment of a carbon substrate with an immobilized immunocomplex.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».Technical solutions that coincide with the totality of the essential features of the claimed invention have not been identified, which allows us to conclude that the claimed invention meets such a patentability condition as “novelty”.
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».The claimed essential features that predetermine the receipt of the specified technical result, do not explicitly follow from the prior art, which allows us to conclude that the claimed invention meets such a patentability condition as "inventive step".
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примере конкретного осуществления.The patentability condition "industrial applicability" is confirmed by the example of a specific implementation.
Заявляемое изобретение поясняется чертежами, гдеThe invention is illustrated by drawings, where
Фиг.1Figure 1
а) вид спереди углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);a) front view of the carbon substrate is a thick film graphite-containing electrode (TSE);
б) - вид сбоку углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);b) is a side view of the carbon substrate - a thick film graphite-containing electrode (TGE);
Фиг.2 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в модельных растворах, содержащих (а, 4-6) и не содержащих (б, 4-6) антиген вируса кори (NovO/96), где 4 - вольтамперограмма фонового электролита, 5 - вольтамперограмма модельного раствора, 6 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в модельный раствор добавки ионов Fe3+;Figure 2 - cyclic voltammograms recorded in model solutions containing (a, 4-6) and not containing (b, 4-6) measles virus antigen (NovO / 96), where 4 - voltammogram of background electrolyte, 5 - voltammogram of model solution, 6 - voltammogram recorded after the addition of Fe 3+ ions into the model solution;
Фиг.3 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 7-9), и не содержащих (б, 7-9) вирус кори, где 7 - вольтамперограмма фонового электролита, 8 - вольтамперограмма пробы, 9 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe3+.Figure 3 - cyclic voltammograms recorded in samples containing (a, 7-9) and not containing (b, 7-9) measles virus, where 7 is the voltammogram of the background electrolyte, 8 is the voltammogram of the sample, 9 is the voltammogram recorded after introducing Fe 3+ ions into the sample.
Фиг.4 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 10-12), и не содержащих (б, 10-12) вирус кори, где 10 - вольтамперограмма фонового электролита, 11 - вольтамперограмма пробы, 12 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe3+.Figure 4 - cyclic voltammograms recorded in samples containing (a, 10-12) and not containing (b, 10-12) measles virus, where 10 is the voltammogram of the background electrolyte, 11 is the voltammogram of the sample, 12 is the voltammogram recorded after introducing Fe 3+ ions into the sample.
Толстопленочный графитсодержащий электрод - твердосплавный носитель состоит из углеродной подложки 1 (электрода), выполненной из стеклотекстолита, на которой размещена дорожка из токопроводящего материала 2, в качестве которого используют, например, графитовую композицию, углеродные чернила. На дорожку 2 нанесен слой изолятора 3 или цементита.A thick-film graphite-containing electrode - a carbide support consists of a carbon substrate 1 (electrode) made of fiberglass, on which a track of
Заявляемое изобретение подтверждается примерами конкретного выполнения.The claimed invention is confirmed by examples of specific performance.
Пример 1.Example 1
Модельный раствор с антигеном вируса кори (NovO/96) инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3O4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1), модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для последующего разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий антигена вируса (NovO/96) (фиг.2). В модельном растворе обнаружено 8×10-2 мг/мл антигена.A model solution with measles antigen (NovO / 96) is incubated for 30 minutes at 37 ° C with magnetic nanocomposite particles of Fe 3 O 4 -SiO 2 on the surface of which polyclonal measles virus IgG is immobilized. After incubation, the TSE (Fig. 1) modified with IgG is placed in the solution and incubated for 20 minutes at a temperature of 37 ° C. A magnetic field is used to accelerate the delivery of nanocomposite particles with the immunocomplex immobilized to the surface of the thermoelectric element. Then the electrode is washed with a buffer solution containing normal horse serum (NLS) and tween-20. An electrode extracted from the analyzed solution is placed in a mixture of nitric and sulfuric acids (0.36 M H 2 SO 4 and 0.28 M HNO 3 ) for subsequent destruction of the sandwich and dissolution of the nanocomposite particles. As a signal characterizing the content of viruses / virus antigens in the analyzed sample, use the electrochemical response of iron, which passed into the solution during the acid destruction of the "sandwich". For a blank experiment using phosphate buffer that does not contain the antigen of the virus (NovO / 96) (figure 2). 8 × 10 -2 mg / ml antigen was detected in the model solution.
Пример 2.Example 2
Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3SO4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.3). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 3×10-3 мг/мл антигена.A sample containing swabs from the nasopharynx of a patient infected with measles virus is incubated for 30 minutes at a temperature of 37 ° C with magnetic nanocomposite particles Fe 3 SO 4 -SiO 2 on the surface of which polyclonal measles IgG are immobilized. After incubation, the TSE (Fig. 1) modified IgG was placed in the solution and incubated for 20 minutes at a temperature of 37 ° C. A magnetic field is used to accelerate the delivery of nanocomposite particles with the immunocomplex immobilized to the surface of the thermoelectric element. Then the electrode is washed with a buffer solution containing normal horse serum (NLS) and tween-20. An electrode extracted from the analyzed solution is placed in a mixture of nitric and sulfuric acids (0.36 M H 2 SO 4 and 0.28 M HNO 3 ) to break the “sandwich” and dissolve the nanocomposite particles. As a signal characterizing the content of viruses / virus antigens in the analyzed sample, use the electrochemical response of iron, which passed into the solution during the acid destruction of the "sandwich". To conduct a blank experiment using a sample containing swabs from the nasopharynx of a healthy patient (figure 3). In a sample taken from an infected patient, a virus concentration corresponding to 3 × 10 −3 mg / ml antigen was detected.
Пример 3.Example 3
Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами Fe3O4-SiO2, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H2SO4 и 0,28М HNO3) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.4). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 4×10-4 мг/мл антигена.A sample containing swabs from the nasopharynx of a patient infected with measles virus is incubated for 30 minutes at 37 ° C with magnetic nanocomposite particles Fe 3 O 4 -SiO 2 on the surface of which polyclonal measles virus IgG is immobilized. After incubation, the TSE (Fig. 1) modified IgG was placed in the solution and incubated for 20 minutes at a temperature of 37 ° C. A magnetic field is used to accelerate the delivery of nanocomposite particles with the immunocomplex immobilized to the surface of the thermoelectric element. Then the electrode is washed with a buffer solution containing normal horse serum (NLS) and tween-20. An electrode extracted from the analyzed solution is placed in a mixture of nitric and sulfuric acids (0.36 M H 2 SO 4 and 0.28 M HNO 3 ) to break the “sandwich” and dissolve the nanocomposite particles. As a signal characterizing the content of viruses / virus antigens in the analyzed sample, use the electrochemical response of iron, which passed into the solution during the acid destruction of the "sandwich". To conduct a blank experiment using a sample containing swabs from the nasopharynx of a healthy patient (figure 4). In a sample taken from an infected patient, a virus concentration corresponding to 4 × 10 -4 mg / ml antigen was detected.
Предложенный способ позволяет значительно снизить материало- и трудозатраты, требуемые для проведения процесса, увеличить производительность и уменьшить себестоимость определения.The proposed method can significantly reduce the material and labor costs required for the process, increase productivity and reduce the cost of determination.
Кроме того, изобретение позволяет упростить процесс иммуноанализа, а также увеличить экспрессность и воспроизводимость, а также использовать его в различных средах.In addition, the invention allows to simplify the process of immunoassay, as well as to increase expressivity and reproducibility, as well as to use it in various environments.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155056/15A RU2550955C1 (en) | 2013-12-11 | 2013-12-11 | Method for electrochemical immunoassay for detecting viruses/viral antigens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155056/15A RU2550955C1 (en) | 2013-12-11 | 2013-12-11 | Method for electrochemical immunoassay for detecting viruses/viral antigens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2550955C1 true RU2550955C1 (en) | 2015-05-20 |
Family
ID=53294213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013155056/15A RU2550955C1 (en) | 2013-12-11 | 2013-12-11 | Method for electrochemical immunoassay for detecting viruses/viral antigens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2550955C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2249217C2 (en) * | 2002-06-18 | 2005-03-27 | Уральский Государственный Экономический Университет (УрГЭУ) | Electrochemical method for determining specific antibodies in blood serum by means of proteins labeled with metals |
| WO2006108405A2 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Magforce Nanotechnologies Ag | Nanoparticle/active ingredient conjugate |
| RU2397243C1 (en) * | 2009-01-19 | 2010-08-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный экономический университет" (УрГЭУ) | Method of detecting pathogenic microorganisms |
| EP2220494A1 (en) * | 2007-11-26 | 2010-08-25 | The Secretary Of State For Innovation, Universities And Skills Of Her Majesty's Britannic Government | Electrochemical detection using silver nanoparticle labelled antibodies |
| CN102782496A (en) * | 2010-01-07 | 2012-11-14 | 药物代谢动力公司 | Method and apparatus for constructing an automated sampling device for detecting Salmonella enterica bacteria using an electrochemical aptamer biosensor |
-
2013
- 2013-12-11 RU RU2013155056/15A patent/RU2550955C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2249217C2 (en) * | 2002-06-18 | 2005-03-27 | Уральский Государственный Экономический Университет (УрГЭУ) | Electrochemical method for determining specific antibodies in blood serum by means of proteins labeled with metals |
| WO2006108405A2 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Magforce Nanotechnologies Ag | Nanoparticle/active ingredient conjugate |
| EP2220494A1 (en) * | 2007-11-26 | 2010-08-25 | The Secretary Of State For Innovation, Universities And Skills Of Her Majesty's Britannic Government | Electrochemical detection using silver nanoparticle labelled antibodies |
| RU2397243C1 (en) * | 2009-01-19 | 2010-08-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный экономический университет" (УрГЭУ) | Method of detecting pathogenic microorganisms |
| CN102782496A (en) * | 2010-01-07 | 2012-11-14 | 药物代谢动力公司 | Method and apparatus for constructing an automated sampling device for detecting Salmonella enterica bacteria using an electrochemical aptamer biosensor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Low sample volume origami-paper-based graphene-modified aptasensors for label-free electrochemical detection of cancer biomarker-EGFR | |
| Akama et al. | Droplet-free digital enzyme-linked immunosorbent assay based on a tyramide signal amplification system | |
| KR102378388B1 (en) | Improved assay methods | |
| Tang et al. | Hemin/G-quadruplex-based DNAzyme concatamers as electrocatalysts and biolabels for amplified electrochemical immunosensing of IgG1 | |
| Rusling | Nanomaterials‐based electrochemical immunosensors for proteins | |
| Rahmati et al. | An electrochemical immunosensor using SARS-CoV-2 spike protein-nickel hydroxide nanoparticles bio-conjugate modified SPCE for ultrasensitive detection of SARS‐CoV‐2 antibodies | |
| Shen et al. | Electrochemical aptasensor for highly sensitive determination of cocaine using a supramolecular aptamer and rolling circle amplification | |
| Peng et al. | Electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on signal amplification strategy of graphene and Fe3O4/Au NPs | |
| Kheiri et al. | A novel amperometric immunosensor based on acetone-extracted propolis for the detection of the HIV-1 p24 antigen | |
| Dutta et al. | An ultrasensitive enzyme-free electrochemical immunosensor based on redox cycling amplification using methylene blue | |
| Niu et al. | Highly amplified electrochemiluminescence of peroxydisulfate using bienzyme functionalized palladium nanoparticles as labels for ultrasensitive immunoassay | |
| Omidinia et al. | Aptamer-based biosensor for detection of phenylalanine at physiological pH | |
| Yang et al. | Emerging techniques for ultrasensitive protein analysis | |
| Li et al. | Molecularly imprinted electrochemical luminescence sensor based on enzymatic amplification for ultratrace isoproturon determination | |
| Li et al. | Proximity hybridization-regulated electrochemical stripping of silver nanoparticles via nanogold induced deposition for immunoassay | |
| Zitka et al. | Microfluidic tool based on the antibody‐modified paramagnetic particles for detection of 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine in urine of prostate cancer patients | |
| Yasukawa et al. | Highly-sensitive electrochemical immunosensing method based on dual amplification systems | |
| Ding et al. | An electrochemical immunoassay for protein based on bio bar code method | |
| Wu et al. | A novel electrochemiluminescence immunosensor via polymerization-assisted amplification | |
| Shen et al. | Highly sensitive electrochemical stripping detection of hepatitis B surface antigen based on copper-enhanced gold nanoparticle tags and magnetic nanoparticles | |
| Wang et al. | Novel competitive chemiluminescence DNA assay based on Fe 3 O 4@ SiO 2@ Au-functionalized magnetic nanoparticles for sensitive detection of p53 tumor suppressor gene | |
| Li et al. | Click DNA cycling in combination with gold nanoparticles loaded with quadruplex DNA motifs enable sensitive electrochemical quantitation of the tuberculosis-associated biomarker CFP-10 in sputum | |
| Pampalakis et al. | An electrochemical immunosensor based on antibody–nanowire conjugates | |
| Osaki et al. | Optimization of electrochemical analysis for signal amplification in gold nanoparticle-probed immunoassays | |
| Wu et al. | Gold nanoparticle-labeled detection antibodies for use in an enhanced electrochemical immunoassay of hepatitis B surface antigen in human serum |