Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

RU2460800C2 - Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose - Google Patents

Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose Download PDF

Info

Publication number
RU2460800C2
RU2460800C2 RU2010132799/10A RU2010132799A RU2460800C2 RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2 RU 2010132799/10 A RU2010132799/10 A RU 2010132799/10A RU 2010132799 A RU2010132799 A RU 2010132799A RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nodc
gene
escherichia coli
mesorhizobium loti
acetylglucosaminyl transferase
Prior art date
Application number
RU2010132799/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2010132799A (en
Inventor
Елена Анатольевна Долгих (RU)
Елена Анатольевна Долгих
Вячеслав Васильевич Долгих (RU)
Вячеслав Васильевич Долгих
Ирина Викторовна Леппянен (RU)
Ирина Викторовна Леппянен
Валерий Петрович Варламов (RU)
Валерий Петрович Варламов
Сергей Александрович Лопатин (RU)
Сергей Александрович Лопатин
Original Assignee
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии)
Елена Анатольевна Долгих
Вячеслав Васильевич Долгих
Ирина Викторовна Леппянен
Валерий Петрович Варламов
Сергей Александрович Лопатин
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии), Елена Анатольевна Долгих, Вячеслав Васильевич Долгих, Ирина Викторовна Леппянен, Валерий Петрович Варламов, Сергей Александрович Лопатин filed Critical Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии)
Priority to RU2010132799/10A priority Critical patent/RU2460800C2/en
Publication of RU2010132799A publication Critical patent/RU2010132799A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2460800C2 publication Critical patent/RU2460800C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method involves biosynthesis of penta-N-acetylchitopentaose in vivo from N-acetylglucosamine precursor in the high-density bacterial culture Escherichia coli DH5α with the use of recombinant enzyme of N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 expressed in cells of said bacteria. The biosynthesis in vivo is enabled by recovery, cloning and expression in Escherichia coli DH5αa of the gene NodC Mesorhizobium loti 1803 coding N-acetylglucosaminyl transferase; the gene NodC is amplified with the use of specific primers and Pfu-polymerase; a matrix for amplification of the gene NodC is presented by DNA recovered from the strain Mesorhizobium loti 1803 deposited in the collection of All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology; it results in preparing an amplification product sized 1300 base pairs; the amplified gene NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in the vector pUC19 in sites BamH EcoRl with preserving a reading frame so that to produce the plasmid pUC19-NodC that is used for expression of the gene NodC in the bacteria Escherichia coli DH5α; N-acetylglucosaminyl transferase (NodC) is expressed in the strain Escherichia coli DH5a after induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside in cultivation of the bacteria Escherichia coli DH5α bearing the plasmid pUC19-NodC with the built-in gene NodC Mesorhizobium loti 1803; neHTa-N-acetylpentachitopentaose is synthesised in the presence of the N-acetylglucosamine precursor; the amount of neHTa-N-acetylpentachitopentaose synthesised by the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 makes about 0.1-0.5 gram per one litre of the bacterial culture; the synthesised substance is analysed by mass spectrometry to prove that the synthesised substance is penta-N-acetylchitopentaose.
EFFECT: technique improvement.
5 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биохимического синтеза, а непосредственно к способу получения хитоолигосахаридов. Известен способ получения хитоолигосахаридов путем фрагментации биополимера хитина, выделенного из природных источников (панцири ракообразных, кутикула насекомых, клеточные стенки грибов) (Cabrera J.C., Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan // Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). Недостатками известного способа являются его высокая стоимость и трудоемкость, поскольку он предполагает очистку, фракционирование и последующее определение структуры полученных продуктов. Известен способ получения хитоолигосахаридов посредством химического синтеза (Boons G.J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). Недостатками известного способа являются многоэтапность процесса синтеза, а также необходимость стабилизировать полученные промежуточные продукта синтеза, что делает нецелесообразным получение хитоолигосахаридов со степенью полимеризации более трех остатков N-ацетилглюкозамина. Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения хитоолигосахаридов, заключающийся в биосинтезе с помощью генетически модифицированных бактерий Escherichia coli, несущих плазмиду с клонированным геном NodC, который кодирует рекомбинантный фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу бактерий Azorhizobium caulidans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, который принимается за прототип (US №20090082307, Мкл A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). Недостатком известного способа является невозможность получения олигомеров хитина, состоящих более чем из четырех остатков N-ацетилглюкозамина.The invention relates to the field of biochemical synthesis, and directly to a method for producing chitooligosaccharides. A known method for producing chitooligosaccharides by fragmentation of a chitin biopolymer isolated from natural sources (crustacean shell, insect cuticle, fungal cell walls) (Cabrera JC, Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan / / Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). The disadvantages of this method are its high cost and complexity, since it involves purification, fractionation and subsequent determination of the structure of the obtained products. A known method of producing chitooligosaccharides by chemical synthesis (Boons G. J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). The disadvantages of this method are the multi-stage synthesis process, as well as the need to stabilize the obtained intermediate synthesis product, which makes it impractical to obtain chitooligosaccharides with a polymerization degree of more than three residues of N-acetylglucosamine. Closest to the present invention is a method for producing chitooligosaccharides, which consists in biosynthesis using genetically modified bacteria Escherichia coli, carrying a plasmid with a cloned NodC gene, which encodes the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase of bacteria Azorhizobium caulidans, Rharobium melum 20090082307, μL A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). The disadvantage of this method is the inability to obtain chitin oligomers consisting of more than four residues of N-acetylglucosamine.

Решаемая изобретением задача - биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном NodC почвенной бактерии Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы бактерии Mesorhizobium loti 1803.The problem solved by the invention is the biological synthesis of longer chitin oligomers using the N-acetylglucosaminyltransferase enzyme encoded by the NodC gene of the soil bacterium Mesorhizobium loti 1803. The claimed method allows biosynthesis of chitin oligomers with a specific chemical structure - penta-N-acetylchitopentase - in vivo acetylglucosamine in Escherichia coli DH5α cells using the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase of the bacterium Mesorhizobium loti 1803.

Поставленная задача решается тем, что способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличается тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации генов NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой.The problem is solved in that the method for the enzymatic production of chitin oligomers, which involves the biosynthesis of these compounds in vivo from the precursor of N-acetylglucosamine in a bacterial culture of high density Escherichia coli DH5α bacteria, using the recombinant N-acetylglucosaminyl transferase enzyme expressed in the cells of these bacteria, Mesorhizobium lot different that during in vivo biosynthesis, chitin oligomers consisting of five N-acetylglucosamine residues are obtained; for the in vivo biosynthesis of chitin oligomers, the NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 encoding N-acetylglucosaminyl transferase is expressed and expressed in Escherichia coli DH5α, the NodC gene is amplified using specific primers and Pfu polymerase (suitable for the NodC gene sequence), DNA isolation is used as a template for amplification strain Mesorhizobium loti 1803, deposited in the collection of VNIISKhM, the result is an amplification product of 1300 bp, the amplified NodC gene Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in pUC19 vector at the BamH and EcoR1 sites with maintaining the reading frame, Thus, the plasmid pUC19-NodC containing the full-sized NodC gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is obtained, and the obtained plasmid is used to express the NodC gene in Escherichia coli DH5α bacteria; in the pUC19 vector, the NodC gene is under the control of the β-galactotoside promoter the expression of N-acetylglucosaminyl transferase (NodC) is carried out in the Escherichia coli strain DH5α after induction of isopropyl-β-D-thiogalactoside by culturing Escherichia coli DH5α bacteria carrying the pUC19-NodC plasmid with the built-in NodC Mesorhizobium loti gene before the presence of Penta-N-acetylchitopentaose is synthesized with N-acetylglucosamine, the amount of synthesized penta-N-acetylchitopentaose using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 is about 0.1-0.5 grams per liter of bacterial culture, using the mass spectrometry method synthesized substance, which confirms that the synthesized substance is penta-N-acetylchitopentaose.

Заявителем не выявлены источники информации, содержащие сведения о технических решениях, идентичных заявленному изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».The applicant has not identified sources of information containing information about technical solutions identical to the claimed invention, which allows us to conclude that it meets the criterion of "novelty."

Предлагаемый способ ферментативного получения олигомеров хитина обеспечивает биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α. Поставленная задача решается тем, что ферментативный синтез олигомеров хитина осуществляют из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений. Сущность заявленного способа поясняется с помощью рисунков:The proposed method for the enzymatic production of chitin oligomers provides the biological synthesis of longer chitin oligomers using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803. The claimed method allows the biosynthesis of chitin oligomers with a specific chemical structure - penta-N-acetylchitopentose - in vivo from the precursor N cell from the precursor Escherichia coli DH5α. The problem is solved in that the enzymatic synthesis of chitin oligomers is carried out from the precursor of N-acetylglucosamine in a culture of high density Escherichia coli bacteria using the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803, which controls the synthesis of these compounds. The essence of the claimed method is illustrated using the drawings:

рисунок 1. Амплификация гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (А). Клонирование в векторе pUC19 и рестрикционный анализ полученных клонов (Б), рисунок 2. Экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 в клетках Escherchia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC, рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции, катализируемой N-ацетилглюкозаминилтрансферазой Mesorhizobium loti 1803 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, рисунок 4. Анализ структуры продукта, синтезированного с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF), рисунок 5. Название и структура олигомера хитина, синтезированного с помощью фермента Mesorhizobium loti 1803.Figure 1. Amplification of the NodC Mesorhizobium loti 1803 gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase (A). Cloning in pUC19 vector and restriction analysis of the obtained clones (B), Figure 2. Expression of the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 in Escherchia coli DH5α cells carrying the plasmid pUC19-NodC, Figure 3. Analysis of the products of the enzymatic reaction catalyzed by N-acetylsyltransylmethyl glucose 1803 by high performance liquid chromatography, Figure 4. Analysis of the structure of the product synthesized using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803, by mass spectrometry (MALDI-TOF), Figure 5. Name and page Chitin oligomer structure synthesized using the enzyme Mesorhizobium loti 1803.

Предлагаемый способ включает биосинтез in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений, отличается тем, что при биосинтезе in vivo используют фермент, контролирующий синтез олигомеров, состоящих из пяти остатков N-ацетилглюкозамина. Для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti CIAM 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о. (рисунок 1), амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (рисунок 2), при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу (рисунок 3), количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества (рисунок 4), который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой (рисунок 5).The proposed method involves in vivo biosynthesis from the precursor of N-acetylglucosamine in high-density Escherichia coli DH5α bacteria culture using the recombinant Mesorhizobium loti 1803 N-acetylglucosaminyl transferase enzyme that controls the synthesis of these compounds, characterized in that the enzyme is used for in vivo biosynthesis using the enzyme consisting of five N-acetylglucosamine residues. To carry out the biosynthesis of in vivo chitin oligomers, NodC Mesorhizobium loti 1803 gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is isolated, cloned and expressed in Escherichia coli DH5α, amplification of the NodC gene is carried out using specific (suitable for the sequence of the NodC polymerase primer) matrices for amplification of the NodC gene use DNA isolated from the strain Mesorhizobium loti CIAM 1803, deposited in the collection of VNIISM, the result is an amplification product with a size of 1300 bp (Figure 1), the amplified NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in the pUC19 vector at the BamH and EcoR1 sites with preservation of the reading frame, thus, the plasmid pUC19-NodC containing the full-sized NodC gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is obtained, and a plasmid for the expression of the NodC gene in Escherichia coli DH5α bacteria, in the pUC19 vector, the NodC gene is under the control of the b-galactosidase promoter (lacZ gene promoter), N-acetylglucosaminyl transferase (NodC) expression is carried out in the Escherichia coli strain DH5α-β-D from induction thiogalactoside (Figure 2), during the cultivation of Escherichia coli DH5α bacteria carrying the pUC19-NodC plasmid with the integrated NodC gene Mesorhizobium loti 1803, penta-N-acetylchitopentaose is synthesized in the presence of the N-acetylglucosamine precursor (Figure 3), the amount of synthesized penta-N-acetylchitol using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 is about 0.1-0.5 grams per liter of bacterial culture, using the method of mass spectrometry, the analysis of the synthesized substance is carried out (Figure 4), which confirms that the synthesized substance is penta-N-acetylchitopentaose (Figure 5).

Указанные обстоятельства, по мнению заявителя, подтверждают соответствие заявленного технического решения критерию «изобретательский уровень».These circumstances, according to the applicant, confirm the conformity of the claimed technical solution with the criterion of "inventive step".

Возможность реализации предлагаемого изобретения подтверждается проведенными экспериментами и иллюстрируется следующими примерами.The feasibility of the invention is confirmed by experiments and is illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1

1.1. Конструирование экспрессионной плазмиды.1.1. Construction of expression plasmids.

Для конструирования экспрессионной плазмиды pUC19-NodC последовательность гена NodC Mesorhizobium loti 1803 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoR1. Для амплификации использовали ризобиальную ДНК штамма ризобий Mesorhizobium loti 1803. Продукты амплификации очищали с помощью набора GIAEX II Gel Extraction Kit и клонировали в плазмиду pUC19 с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы.To construct the expression plasmid pUC19-NodC, the sequence of the NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 was amplified by the polymerase chain reaction using specific primers, into which the recognition sites of BamHI and EcoR1 restriction endonucleases were introduced. The rhizobial DNA of the rhizobia strain Mesorhizobium loti 1803 was used for amplification. The amplification products were purified using the GIAEX II Gel Extraction Kit and cloned into pUC19 plasmid using the corresponding restriction endonucleases and T4 DNA ligase.

1.2. Условия для экспрессии фермента в клетках Escherichia coli DH5α1.2. Conditions for expression of the enzyme in Escherichia coli DH5α cells

Экспрессию рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Клетки штамма Escherichia coli DH5α трансформировали плазмидой pUC19-NodC. Несколькими свежими рекомбинантными колониями инокулировали 100-500 мл среды LB - 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 7.0), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и растили при температуре 37°С, 220 об/мин на орбитальном шейкере до достижения культурой оптической плотности OD600=0,6. Экспрессию генов рекомбинантных белков индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 1 мМ.The expression of the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 was carried out in Escherichia coli DH5α cells. The cells of the Escherichia coli strain DH5α were transformed with the plasmid pUC19-NodC. Several fresh recombinant colonies were inoculated with 100-500 ml of LB medium - 10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl (pH 7.0) containing ampicillin (100 μg / ml) and grown at 37 ° C C, 220 rpm on an orbital shaker until the culture reaches an optical density of OD 600 = 0.6. Gene expression of recombinant proteins was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactoside to a final concentration of 1 mM.

Пример 2.Example 2

2.1. Синтез хитоолигосахаридов in vivo.2.1. Synthesis of chitooligosaccharides in vivo.

Для синтеза хитоолигосахаридов in vivo бактериальные культуры выращивали в среде LB при температуре 37°С с добавлением ампициллина в концентрации 100 мг/л до достижения оптической плотности OD600=0,6, затем производили индукцию экспрессии белка посредством добавления изопропил-β-D-тиогалактозида. Далее в качестве источника углерода добавляли глицерол в концентрации 160 г/л и N-ацетилглюкозамин в концентрации 1 г/л в качестве субстрата для синтеза хитоолигосахаридов. Синтез хитоолигосахаридов осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Выделение и очистку хитоолигосахаридов проводили из 100 мл 24- или 48-часовой бактериальной культуры. Клетки были осаждены в течение 20 минут при 3000 g, затем ресуспендированы в маленьком объеме (2 мл) и подвергнуты кипячению в течение 30 минут. При этом происходил выход синтезированных хитоолигосахаридов в культуральную среду. Хитоолигосахариды были адсорбированы на активированном угле в течение 20 минут. Смыв хитоолигосахаридов с угля проводили этиловым спиртом 50% и 70%.For the synthesis of chitooligosaccharides in vivo, bacterial cultures were grown in LB medium at a temperature of 37 ° C with the addition of ampicillin at a concentration of 100 mg / L until an optical density of OD 600 = 0.6 was reached, then protein expression was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactoside . Then, glycerol at a concentration of 160 g / L and N-acetylglucosamine at a concentration of 1 g / L were added as a substrate for the synthesis of chitooligosaccharides. The synthesis of chitooligosaccharides was carried out in Escherichia coli DH5α cells. The isolation and purification of chitooligosaccharides was carried out from 100 ml of a 24- or 48-hour bacterial culture. Cells were pelleted for 20 minutes at 3000 g, then resuspended in a small volume (2 ml) and boiled for 30 minutes. In this case, the synthesized chitooligosaccharides were released into the culture medium. Chitooligosaccharides were adsorbed on activated carbon for 20 minutes. The washing of chitooligosaccharides from coal was carried out with ethyl alcohol of 50% and 70%.

2.2. Разделение и идентификация хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Идентификацию и разделение хитоолигосахаридов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с аминофазой SUPELCOSIL™ LC-NH2 с использованием в качестве жидкой фазы системы ацетонитрил:вода (70%:30%). Структуру полученных соединений проверяли с помощью метода масс-спектрометрии.2.2. Separation and identification of chitooligosaccharides by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. Chitooligosaccharides were identified and separated by high performance liquid chromatography (HPLC) on an SUPELCOSIL ™ LC-NH2 amine phase column using the acetonitrile: water system (70%: 30%) as the liquid phase. The structure of the obtained compounds was checked using mass spectrometry.

Claims (1)

Способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5a высокой плотности, с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличающийся тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5a гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находятся под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой. A method for the enzymatic production of chitin oligomers, which involves the in vivo biosynthesis of these compounds from the N-acetylglucosamine precursor in a high-density Escherichia coli DH5a bacteria culture, using the recombinant N-acetylglucosaminyl transferase enzyme Mesorhizobium loti 1803 expressed in vivo in cells of these bacteria. chitin oligomers are prepared, consisting of five N-acetylglucosamine residues; for in vivo biosynthesis, chitin oligomers are isolated, cloned and expressed in Escherichia coli DH5 a NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 encoding N-acetylglucosaminyl transferase, amplification of the NodC gene is carried out using specific primers and Pfu polymerase (suitable for the NodC gene sequence); DNA isolated from m3 lotor strain 3 is used as a template for amplification of the NodC gene, in the VNIISKhM collection, the result is an amplification product of 1300 bp in size, the amplified NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in the pUC19 vector from the BamH EcoR1 sites with preservation of the reading frame, thus obtaining the plasmid pUC19-NodC, containing the full-sized NodC gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase, and the obtained plasmid is used to express the NodC gene in Escherichia coli DH5α bacteria, in the pUC19 vector, the NodC gene is controlled by the b-galactosidase promoter (lacZ gene promoter), N-acetylglurase expresses in the Escherichia coli DH5α strain, after induction with isopropyl-β-D-thiogalactoside, when culturing Escherichia coli DH5α bacteria carrying the pUC19-NodC plasmid with the integrated NodC gene Mesorhizobium loti 1803, in the presence of the N-acetylglucosamine precursor, I synthesize penta-N-acetylchitopentaose, the amount of synthesized penta-N-acetylchitopentaose using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 is about 0.1-0.5 grams per liter of bacterial culture, using the method of mass spectrometry, an analysis of the synthesized substance is carried out, which confirms that the synthesized substance is penta-N-acetylchitopentaose.
RU2010132799/10A 2010-08-04 2010-08-04 Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose RU2460800C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) 2010-08-04 2010-08-04 Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) 2010-08-04 2010-08-04 Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012105975/10A Division RU2517620C2 (en) 2012-02-17 2012-02-17 Method for enzymatic production of penta-n-acetylchitopentaose and hexa-n-acetylchitohexaose

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010132799A RU2010132799A (en) 2012-02-10
RU2460800C2 true RU2460800C2 (en) 2012-09-10

Family

ID=45853275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) 2010-08-04 2010-08-04 Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2460800C2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528553B (en) * 2021-07-07 2023-09-12 扬州日兴生物科技股份有限公司 Codon-optimized N-acetylglucosamine transferase gene and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2057760C1 (en) * 1989-08-29 1996-04-10 Таматсукури Корпорейшн Chitin or chitosan oligomer and a method of its synthesis
WO2001004341A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method for producing oligopolysaccharides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2057760C1 (en) * 1989-08-29 1996-04-10 Таматсукури Корпорейшн Chitin or chitosan oligomer and a method of its synthesis
WO2001004341A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Method for producing oligopolysaccharides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Semino С.Е. Chitin oligosaccharides as candidate patterning agents in zebrafish embryogenesis, Int. J. Biol. 44, 2000, p.183-193. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010132799A (en) 2012-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6771644B2 (en) Method for producing N-acetyl-D-glucosamine and / or D-glucosamine salt by microbial fermentation
CN109988799B (en) Application of glycerol-2-alpha-glucosylation enzyme in preparation of 2-alpha-glycerol glucoside
JP2008154495A (en) Method for producing lacto-N-biose I and galacto-N-biose
CN101906449B (en) Method for producing N-acetylneuraminic acid by spore surface display system
CN112592880B (en) Pseudouridine-producing engineering bacterium and application thereof
KR101511361B1 (en) Recombinant microorganism having enhanced heme productivity and biological method of producing heme using the same
CN103184246A (en) Biosynthesis preparation method for L-Ergothioneine
WO2023103578A1 (en) A genetically engineered bacterium and a preparation method and use thereof
CN112375750A (en) Glycosyltransferase mutant and method for catalytically synthesizing rebaudioside A by using same
KR102186997B1 (en) Novel method of protein purification
CN108913641A (en) A kind of recombination bacillus coli and its application
WO2023208146A1 (en) Method and carrier for biosynthesis of ergothioneine
Hu et al. Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase
WO2017174036A1 (en) Method for producing n-acetyl-d-glucosamine and/or d-glucosamine hydrochloride by microbial fermentation
CN108913737B (en) Method for preparing cyclic dinucleotide by using recombinant escherichia coli fermentation
CN102690795B (en) Streptomyces griseochromogenes trehalose synthase and coding gene and application thereof
RU2460800C2 (en) Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose
RU2517620C2 (en) Method for enzymatic production of penta-n-acetylchitopentaose and hexa-n-acetylchitohexaose
US7901912B1 (en) Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine
EP4410973A1 (en) Recombinant yeast and application thereof
KR101957471B1 (en) Enzymatic method for neoagarobiose or neoagarotetraose production from agarose using a new beta-agarase
KR20140048516A (en) Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof
CN107916271A (en) A kind of high-efficiency expression method for recombinating nitrile hydratase
CN113930415A (en) Halogen alcohol dehalogenase mutant and application thereof
CN104059902B (en) Beta-amylase-trehalose synthase fused enzyme and expression gene and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20120805

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20140910

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160805