RU2460800C2 - Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose - Google Patents
Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460800C2 RU2460800C2 RU2010132799/10A RU2010132799A RU2460800C2 RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2 RU 2010132799/10 A RU2010132799/10 A RU 2010132799/10A RU 2010132799 A RU2010132799 A RU 2010132799A RU 2460800 C2 RU2460800 C2 RU 2460800C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nodc
- gene
- escherichia coli
- mesorhizobium loti
- acetylglucosaminyl transferase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- DPTYILOGADPXRZ-RXDSZOQSSA-N Penta-N-acetylchitopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@@H]([C@H](O)[C@H](C=O)NC(=O)C)[C@H](O)CO)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 DPTYILOGADPXRZ-RXDSZOQSSA-N 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 claims abstract description 33
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims abstract description 19
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 13
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000894008 Azorhizobium Species 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000970829 Mesorhizobium Species 0.000 description 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биохимического синтеза, а непосредственно к способу получения хитоолигосахаридов. Известен способ получения хитоолигосахаридов путем фрагментации биополимера хитина, выделенного из природных источников (панцири ракообразных, кутикула насекомых, клеточные стенки грибов) (Cabrera J.C., Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan // Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). Недостатками известного способа являются его высокая стоимость и трудоемкость, поскольку он предполагает очистку, фракционирование и последующее определение структуры полученных продуктов. Известен способ получения хитоолигосахаридов посредством химического синтеза (Boons G.J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). Недостатками известного способа являются многоэтапность процесса синтеза, а также необходимость стабилизировать полученные промежуточные продукта синтеза, что делает нецелесообразным получение хитоолигосахаридов со степенью полимеризации более трех остатков N-ацетилглюкозамина. Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения хитоолигосахаридов, заключающийся в биосинтезе с помощью генетически модифицированных бактерий Escherichia coli, несущих плазмиду с клонированным геном NodC, который кодирует рекомбинантный фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу бактерий Azorhizobium caulidans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, который принимается за прототип (US №20090082307, Мкл A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). Недостатком известного способа является невозможность получения олигомеров хитина, состоящих более чем из четырех остатков N-ацетилглюкозамина.The invention relates to the field of biochemical synthesis, and directly to a method for producing chitooligosaccharides. A known method for producing chitooligosaccharides by fragmentation of a chitin biopolymer isolated from natural sources (crustacean shell, insect cuticle, fungal cell walls) (Cabrera JC, Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan / / Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). The disadvantages of this method are its high cost and complexity, since it involves purification, fractionation and subsequent determination of the structure of the obtained products. A known method of producing chitooligosaccharides by chemical synthesis (Boons G. J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). The disadvantages of this method are the multi-stage synthesis process, as well as the need to stabilize the obtained intermediate synthesis product, which makes it impractical to obtain chitooligosaccharides with a polymerization degree of more than three residues of N-acetylglucosamine. Closest to the present invention is a method for producing chitooligosaccharides, which consists in biosynthesis using genetically modified bacteria Escherichia coli, carrying a plasmid with a cloned NodC gene, which encodes the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase of bacteria Azorhizobium caulidans, Rharobium melum 20090082307, μL A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). The disadvantage of this method is the inability to obtain chitin oligomers consisting of more than four residues of N-acetylglucosamine.
Решаемая изобретением задача - биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном NodC почвенной бактерии Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы бактерии Mesorhizobium loti 1803.The problem solved by the invention is the biological synthesis of longer chitin oligomers using the N-acetylglucosaminyltransferase enzyme encoded by the NodC gene of the soil bacterium Mesorhizobium loti 1803. The claimed method allows biosynthesis of chitin oligomers with a specific chemical structure - penta-N-acetylchitopentase - in vivo acetylglucosamine in Escherichia coli DH5α cells using the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase of the bacterium Mesorhizobium loti 1803.
Поставленная задача решается тем, что способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличается тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации генов NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой.The problem is solved in that the method for the enzymatic production of chitin oligomers, which involves the biosynthesis of these compounds in vivo from the precursor of N-acetylglucosamine in a bacterial culture of high density Escherichia coli DH5α bacteria, using the recombinant N-acetylglucosaminyl transferase enzyme expressed in the cells of these bacteria, Mesorhizobium lot different that during in vivo biosynthesis, chitin oligomers consisting of five N-acetylglucosamine residues are obtained; for the in vivo biosynthesis of chitin oligomers, the NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 encoding N-acetylglucosaminyl transferase is expressed and expressed in Escherichia coli DH5α, the NodC gene is amplified using specific primers and Pfu polymerase (suitable for the NodC gene sequence), DNA isolation is used as a template for amplification strain Mesorhizobium loti 1803, deposited in the collection of VNIISKhM, the result is an amplification product of 1300 bp, the amplified NodC gene Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in pUC19 vector at the BamH and EcoR1 sites with maintaining the reading frame, Thus, the plasmid pUC19-NodC containing the full-sized NodC gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is obtained, and the obtained plasmid is used to express the NodC gene in Escherichia coli DH5α bacteria; in the pUC19 vector, the NodC gene is under the control of the β-galactotoside promoter the expression of N-acetylglucosaminyl transferase (NodC) is carried out in the Escherichia coli strain DH5α after induction of isopropyl-β-D-thiogalactoside by culturing Escherichia coli DH5α bacteria carrying the pUC19-NodC plasmid with the built-in NodC Mesorhizobium loti gene before the presence of Penta-N-acetylchitopentaose is synthesized with N-acetylglucosamine, the amount of synthesized penta-N-acetylchitopentaose using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 is about 0.1-0.5 grams per liter of bacterial culture, using the mass spectrometry method synthesized substance, which confirms that the synthesized substance is penta-N-acetylchitopentaose.
Заявителем не выявлены источники информации, содержащие сведения о технических решениях, идентичных заявленному изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».The applicant has not identified sources of information containing information about technical solutions identical to the claimed invention, which allows us to conclude that it meets the criterion of "novelty."
Предлагаемый способ ферментативного получения олигомеров хитина обеспечивает биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α. Поставленная задача решается тем, что ферментативный синтез олигомеров хитина осуществляют из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений. Сущность заявленного способа поясняется с помощью рисунков:The proposed method for the enzymatic production of chitin oligomers provides the biological synthesis of longer chitin oligomers using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803. The claimed method allows the biosynthesis of chitin oligomers with a specific chemical structure - penta-N-acetylchitopentose - in vivo from the precursor N cell from the precursor Escherichia coli DH5α. The problem is solved in that the enzymatic synthesis of chitin oligomers is carried out from the precursor of N-acetylglucosamine in a culture of high density Escherichia coli bacteria using the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803, which controls the synthesis of these compounds. The essence of the claimed method is illustrated using the drawings:
рисунок 1. Амплификация гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (А). Клонирование в векторе pUC19 и рестрикционный анализ полученных клонов (Б), рисунок 2. Экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 в клетках Escherchia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC, рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции, катализируемой N-ацетилглюкозаминилтрансферазой Mesorhizobium loti 1803 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, рисунок 4. Анализ структуры продукта, синтезированного с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF), рисунок 5. Название и структура олигомера хитина, синтезированного с помощью фермента Mesorhizobium loti 1803.Figure 1. Amplification of the NodC Mesorhizobium loti 1803 gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase (A). Cloning in pUC19 vector and restriction analysis of the obtained clones (B), Figure 2. Expression of the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 in Escherchia coli DH5α cells carrying the plasmid pUC19-NodC, Figure 3. Analysis of the products of the enzymatic reaction catalyzed by N-acetylsyltransylmethyl glucose 1803 by high performance liquid chromatography, Figure 4. Analysis of the structure of the product synthesized using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803, by mass spectrometry (MALDI-TOF), Figure 5. Name and page Chitin oligomer structure synthesized using the enzyme Mesorhizobium loti 1803.
Предлагаемый способ включает биосинтез in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений, отличается тем, что при биосинтезе in vivo используют фермент, контролирующий синтез олигомеров, состоящих из пяти остатков N-ацетилглюкозамина. Для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti CIAM 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о. (рисунок 1), амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (рисунок 2), при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу (рисунок 3), количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества (рисунок 4), который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой (рисунок 5).The proposed method involves in vivo biosynthesis from the precursor of N-acetylglucosamine in high-density Escherichia coli DH5α bacteria culture using the recombinant Mesorhizobium loti 1803 N-acetylglucosaminyl transferase enzyme that controls the synthesis of these compounds, characterized in that the enzyme is used for in vivo biosynthesis using the enzyme consisting of five N-acetylglucosamine residues. To carry out the biosynthesis of in vivo chitin oligomers, NodC Mesorhizobium loti 1803 gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is isolated, cloned and expressed in Escherichia coli DH5α, amplification of the NodC gene is carried out using specific (suitable for the sequence of the NodC polymerase primer) matrices for amplification of the NodC gene use DNA isolated from the strain Mesorhizobium loti CIAM 1803, deposited in the collection of VNIISM, the result is an amplification product with a size of 1300 bp (Figure 1), the amplified NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 (NodC) is cloned in the pUC19 vector at the BamH and EcoR1 sites with preservation of the reading frame, thus, the plasmid pUC19-NodC containing the full-sized NodC gene encoding N-acetylglucosaminyl transferase is obtained, and a plasmid for the expression of the NodC gene in Escherichia coli DH5α bacteria, in the pUC19 vector, the NodC gene is under the control of the b-galactosidase promoter (lacZ gene promoter), N-acetylglucosaminyl transferase (NodC) expression is carried out in the Escherichia coli strain DH5α-β-D from induction thiogalactoside (Figure 2), during the cultivation of Escherichia coli DH5α bacteria carrying the pUC19-NodC plasmid with the integrated NodC gene Mesorhizobium loti 1803, penta-N-acetylchitopentaose is synthesized in the presence of the N-acetylglucosamine precursor (Figure 3), the amount of synthesized penta-N-acetylchitol using the enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 is about 0.1-0.5 grams per liter of bacterial culture, using the method of mass spectrometry, the analysis of the synthesized substance is carried out (Figure 4), which confirms that the synthesized substance is penta-N-acetylchitopentaose (Figure 5).
Указанные обстоятельства, по мнению заявителя, подтверждают соответствие заявленного технического решения критерию «изобретательский уровень».These circumstances, according to the applicant, confirm the conformity of the claimed technical solution with the criterion of "inventive step".
Возможность реализации предлагаемого изобретения подтверждается проведенными экспериментами и иллюстрируется следующими примерами.The feasibility of the invention is confirmed by experiments and is illustrated by the following examples.
Пример 1.Example 1
1.1. Конструирование экспрессионной плазмиды.1.1. Construction of expression plasmids.
Для конструирования экспрессионной плазмиды pUC19-NodC последовательность гена NodC Mesorhizobium loti 1803 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoR1. Для амплификации использовали ризобиальную ДНК штамма ризобий Mesorhizobium loti 1803. Продукты амплификации очищали с помощью набора GIAEX II Gel Extraction Kit и клонировали в плазмиду pUC19 с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы.To construct the expression plasmid pUC19-NodC, the sequence of the NodC gene of Mesorhizobium loti 1803 was amplified by the polymerase chain reaction using specific primers, into which the recognition sites of BamHI and EcoR1 restriction endonucleases were introduced. The rhizobial DNA of the rhizobia strain Mesorhizobium loti 1803 was used for amplification. The amplification products were purified using the GIAEX II Gel Extraction Kit and cloned into pUC19 plasmid using the corresponding restriction endonucleases and T4 DNA ligase.
1.2. Условия для экспрессии фермента в клетках Escherichia coli DH5α1.2. Conditions for expression of the enzyme in Escherichia coli DH5α cells
Экспрессию рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Клетки штамма Escherichia coli DH5α трансформировали плазмидой pUC19-NodC. Несколькими свежими рекомбинантными колониями инокулировали 100-500 мл среды LB - 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 7.0), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и растили при температуре 37°С, 220 об/мин на орбитальном шейкере до достижения культурой оптической плотности OD600=0,6. Экспрессию генов рекомбинантных белков индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 1 мМ.The expression of the recombinant enzyme N-acetylglucosaminyl transferase Mesorhizobium loti 1803 was carried out in Escherichia coli DH5α cells. The cells of the Escherichia coli strain DH5α were transformed with the plasmid pUC19-NodC. Several fresh recombinant colonies were inoculated with 100-500 ml of LB medium - 10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl (pH 7.0) containing ampicillin (100 μg / ml) and grown at 37 ° C C, 220 rpm on an orbital shaker until the culture reaches an optical density of OD 600 = 0.6. Gene expression of recombinant proteins was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactoside to a final concentration of 1 mM.
Пример 2.Example 2
2.1. Синтез хитоолигосахаридов in vivo.2.1. Synthesis of chitooligosaccharides in vivo.
Для синтеза хитоолигосахаридов in vivo бактериальные культуры выращивали в среде LB при температуре 37°С с добавлением ампициллина в концентрации 100 мг/л до достижения оптической плотности OD600=0,6, затем производили индукцию экспрессии белка посредством добавления изопропил-β-D-тиогалактозида. Далее в качестве источника углерода добавляли глицерол в концентрации 160 г/л и N-ацетилглюкозамин в концентрации 1 г/л в качестве субстрата для синтеза хитоолигосахаридов. Синтез хитоолигосахаридов осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Выделение и очистку хитоолигосахаридов проводили из 100 мл 24- или 48-часовой бактериальной культуры. Клетки были осаждены в течение 20 минут при 3000 g, затем ресуспендированы в маленьком объеме (2 мл) и подвергнуты кипячению в течение 30 минут. При этом происходил выход синтезированных хитоолигосахаридов в культуральную среду. Хитоолигосахариды были адсорбированы на активированном угле в течение 20 минут. Смыв хитоолигосахаридов с угля проводили этиловым спиртом 50% и 70%.For the synthesis of chitooligosaccharides in vivo, bacterial cultures were grown in LB medium at a temperature of 37 ° C with the addition of ampicillin at a concentration of 100 mg / L until an optical density of OD 600 = 0.6 was reached, then protein expression was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactoside . Then, glycerol at a concentration of 160 g / L and N-acetylglucosamine at a concentration of 1 g / L were added as a substrate for the synthesis of chitooligosaccharides. The synthesis of chitooligosaccharides was carried out in Escherichia coli DH5α cells. The isolation and purification of chitooligosaccharides was carried out from 100 ml of a 24- or 48-hour bacterial culture. Cells were pelleted for 20 minutes at 3000 g, then resuspended in a small volume (2 ml) and boiled for 30 minutes. In this case, the synthesized chitooligosaccharides were released into the culture medium. Chitooligosaccharides were adsorbed on activated carbon for 20 minutes. The washing of chitooligosaccharides from coal was carried out with ethyl alcohol of 50% and 70%.
2.2. Разделение и идентификация хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Идентификацию и разделение хитоолигосахаридов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с аминофазой SUPELCOSIL™ LC-NH2 с использованием в качестве жидкой фазы системы ацетонитрил:вода (70%:30%). Структуру полученных соединений проверяли с помощью метода масс-спектрометрии.2.2. Separation and identification of chitooligosaccharides by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. Chitooligosaccharides were identified and separated by high performance liquid chromatography (HPLC) on an SUPELCOSIL ™ LC-NH2 amine phase column using the acetonitrile: water system (70%: 30%) as the liquid phase. The structure of the obtained compounds was checked using mass spectrometry.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012105975/10A Division RU2517620C2 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Method for enzymatic production of penta-n-acetylchitopentaose and hexa-n-acetylchitohexaose |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010132799A RU2010132799A (en) | 2012-02-10 |
RU2460800C2 true RU2460800C2 (en) | 2012-09-10 |
Family
ID=45853275
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010132799/10A RU2460800C2 (en) | 2010-08-04 | 2010-08-04 | Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2460800C2 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113528553B (en) * | 2021-07-07 | 2023-09-12 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | Codon-optimized N-acetylglucosamine transferase gene and application thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2057760C1 (en) * | 1989-08-29 | 1996-04-10 | Таматсукури Корпорейшн | Chitin or chitosan oligomer and a method of its synthesis |
WO2001004341A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method for producing oligopolysaccharides |
-
2010
- 2010-08-04 RU RU2010132799/10A patent/RU2460800C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2057760C1 (en) * | 1989-08-29 | 1996-04-10 | Таматсукури Корпорейшн | Chitin or chitosan oligomer and a method of its synthesis |
WO2001004341A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method for producing oligopolysaccharides |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Semino С.Е. Chitin oligosaccharides as candidate patterning agents in zebrafish embryogenesis, Int. J. Biol. 44, 2000, p.183-193. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2010132799A (en) | 2012-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6771644B2 (en) | Method for producing N-acetyl-D-glucosamine and / or D-glucosamine salt by microbial fermentation | |
CN109988799B (en) | Application of glycerol-2-alpha-glucosylation enzyme in preparation of 2-alpha-glycerol glucoside | |
JP2008154495A (en) | Method for producing lacto-N-biose I and galacto-N-biose | |
CN101906449B (en) | Method for producing N-acetylneuraminic acid by spore surface display system | |
CN112592880B (en) | Pseudouridine-producing engineering bacterium and application thereof | |
KR101511361B1 (en) | Recombinant microorganism having enhanced heme productivity and biological method of producing heme using the same | |
CN103184246A (en) | Biosynthesis preparation method for L-Ergothioneine | |
WO2023103578A1 (en) | A genetically engineered bacterium and a preparation method and use thereof | |
CN112375750A (en) | Glycosyltransferase mutant and method for catalytically synthesizing rebaudioside A by using same | |
KR102186997B1 (en) | Novel method of protein purification | |
CN108913641A (en) | A kind of recombination bacillus coli and its application | |
WO2023208146A1 (en) | Method and carrier for biosynthesis of ergothioneine | |
Hu et al. | Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase | |
WO2017174036A1 (en) | Method for producing n-acetyl-d-glucosamine and/or d-glucosamine hydrochloride by microbial fermentation | |
CN108913737B (en) | Method for preparing cyclic dinucleotide by using recombinant escherichia coli fermentation | |
CN102690795B (en) | Streptomyces griseochromogenes trehalose synthase and coding gene and application thereof | |
RU2460800C2 (en) | Method for enzyme production of penta-n-acetylchitopentaose | |
RU2517620C2 (en) | Method for enzymatic production of penta-n-acetylchitopentaose and hexa-n-acetylchitohexaose | |
US7901912B1 (en) | Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine | |
EP4410973A1 (en) | Recombinant yeast and application thereof | |
KR101957471B1 (en) | Enzymatic method for neoagarobiose or neoagarotetraose production from agarose using a new beta-agarase | |
KR20140048516A (en) | Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof | |
CN107916271A (en) | A kind of high-efficiency expression method for recombinating nitrile hydratase | |
CN113930415A (en) | Halogen alcohol dehalogenase mutant and application thereof | |
CN104059902B (en) | Beta-amylase-trehalose synthase fused enzyme and expression gene and application thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120805 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140910 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160805 |