RU2446172C1 - Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) - Google Patents
Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2446172C1 RU2446172C1 RU2011111096/10A RU2011111096A RU2446172C1 RU 2446172 C1 RU2446172 C1 RU 2446172C1 RU 2011111096/10 A RU2011111096/10 A RU 2011111096/10A RU 2011111096 A RU2011111096 A RU 2011111096A RU 2446172 C1 RU2446172 C1 RU 2446172C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon alpha
- yeast
- pro
- human interferon
- saccharomyces cerevisiae
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 title claims description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 31
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 26
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 23
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 22
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100162340 Anguilla japonica l-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150079981 HSP150 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100425745 Rattus norvegicus Ngfr gene Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа увеличения секреции рекомбинантных белков клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae.The invention relates to the field of biotechnology and relates to a method for increasing the secretion of recombinant proteins by Saccharomyces cerevisiae yeast cells.
Под секретируемыми белками понимаются такие целевые растворимые белки, биосинтез которых в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae сопровождается их экскрецией во внеклеточную среду. Под секрецией белка понимают такую совокупность внутриклеточных процессов, которые приводят к экскреции синтезируемого белка во внеклеточную среду.By secreted proteins are meant such soluble target proteins whose biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae yeast cells is accompanied by their excretion into the extracellular medium. Under the secretion of protein is understood such a combination of intracellular processes that lead to the excretion of the synthesized protein in the extracellular environment.
Известно, что эффективность секреции в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae зависит от выбора лидерных полипептидов (лидерных областей), направляющих секрецию белков [Romanes et al., 1992, Yeast 8: 423-488]. Необходимой частью лидерного полипептида является сигнальный пептид (пре-область), дополнительной - про-область. Каждая из частей лидерного полипептида, входящих в состав секретируемого белка на этапе его биосинтеза, в процессе секреции удаляется из его состава по мере выполнения своей функции.It is known that the efficiency of secretion in Saccharomyces cerevisiae yeast cells depends on the choice of leader polypeptides (leader regions) that direct protein secretion [Romanes et al., 1992, Yeast 8: 423-488]. A necessary part of the leader polypeptide is the signal peptide (pre-region), an additional part is the pro-region. Each of the parts of the leader polypeptide that make up the secreted protein at the stage of its biosynthesis is removed from its composition during secretion as it performs its function.
Основная функция сигнального пептида заключается в обеспечении процесса транслокации белка, т.е. пересечения секретируемым белком мембранного слоя, отделяющего область клетки, в которой осуществляется синтез белка, от области ретикулума, в которой происходит сворачивание секретируемого белка и его пост-трансляционная модификация. Сигнальный пептид удаляется из состава секретируемого белка непосредственно в процессе транслокации. Про-область может выполнять двоякую функцию: с одной стороны про-область обеспечивает удлинение белков, в особенности коротких белков, влияющее на их транслокацию. Вторая известная функция про-области реализуется на этапе транспорта белков из ретикулума и заключается во взаимодействии последовательности про-области с транспортными рецепторами, которые опосредуют включение секретируемых белков в секреторные гранулы, в которых секретируемые белки перемещаются внутри клетки. На одном из заключительных этапов внутриклеточного транспорта в комплексе Гольджи происходит ферментативное отщепление (процессинг) про-области от зрелой части секретируемого белка, который в дальнейшем направляется к плазматической мембране и выходу из клетки.The main function of the signal peptide is to facilitate the process of protein translocation, i.e. the secreted protein intersects the membrane layer separating the region of the cell in which the protein is synthesized from the region of the reticulum, in which the secreted protein is folded and its post-translational modification. The signal peptide is removed from the composition of the secreted protein directly in the process of translocation. The pro-region can fulfill a twofold function: on the one hand, the pro-region provides an elongation of proteins, especially short proteins, affecting their translocation. The second known function of the pro-region is realized at the stage of protein transport from the reticulum and consists in the interaction of the sequence of the pro-region with transport receptors, which mediate the incorporation of secreted proteins into secretory granules in which secreted proteins move within the cell. At one of the final stages of intracellular transport in the Golgi complex, enzymatic cleavage (processing) of the pro-region from the mature part of the secreted protein takes place, which is then sent to the plasma membrane and exit the cell.
В дрожжах S.cerevisiae в качестве лидерных областей обычно используются лидерные области дрожжевых секретируемых белков. Одной из наиболее широко применяемых лидерных областей дрожжевого происхождения, используемых для секреции гетерологичных белков в клетках S.cerevisiae, является лидерная пре-про область предшественника α-фактора (MFα-1) - полового фактора, секретируемого дрожжевыми клетками α-типа спаривания. Эффективность этой лидерной области продемонстрирована многократно, в том числе в отношении секреции таких белков, как инсулиноподобный фактор роста I [Bayne et al., 1988, Gene, 66: 235-244], гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека [Ernst, 1988, DNA, 7: 355-360], лизоцимы человека и курицы [Oka et al., 1999, Biosci.Biotechnol.Biochem., 63: 1977-1983; Hashimoto et al., 1998, Protein Engineering, 11: 75-77].In S. cerevisiae yeast, leader regions of yeast secreted proteins are commonly used as leader regions. One of the most widely used leader regions of yeast origin used for the secretion of heterologous proteins in S. cerevisiae cells is the leader pre-pro region of the α-factor (MFα-1) precursor, a sex factor secreted by α-type mating yeast cells. The effectiveness of this leader region has been demonstrated many times, including in relation to the secretion of proteins such as insulin-like growth factor I [Bayne et al., 1988, Gene, 66: 235-244], granulocyte colony-stimulating human factor [Ernst, 1988, DNA, 7 : 355-360], human and chicken lysozymes [Oka et al., 1999, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63: 1977-1983; Hashimoto et al., 1998, Protein Engineering, 11: 75-77].
Другим известным секреторным лидером дрожжевого происхождения является пре-про-область гликопротеина HSP150 S. cerevisiae, положительное влияние которой на секрецию гетерологичных белков в клетках дрожжей установлено, например, для β-лактамазы [Simonen et al., 1994, JBiol Chem, 269: 13887-92] и внеклеточного домена рецептора фактора роста нервов крысы [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].Another well-known secretory leader of yeast origin is the pre-pro-region of the S. cerevisiae HSP150 glycoprotein, whose positive effect on the secretion of heterologous proteins in yeast cells has been established, for example, for β-lactamase [Simonen et al., 1994, JBiol Chem, 269: 13887 -92] and the extracellular domain of rat nerve growth factor receptor [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].
Примером последовательности искусственного происхождения, эффективно выполняющей в клетках дрожжей функции лидерного полипептида, является фрагмент белка интерлейкина-1-бета [Lee J et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890].An example of a sequence of artificial origin that effectively performs the functions of a leader polypeptide in yeast cells is a fragment of the interleukin-1-beta protein [Lee J et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890].
Увеличение эффективности секреции белков в клетках дрожжей является одним из приоритетных направлений исследований в области биотехнологии. Проводимые исследования, в том числе, касаются модификации про-областей лидерных полипептидов, которые обеспечивают улучшение процессинга [Kjeldsen Т. et al., 1996, Gene, 170: 107-112] и секреторной активности [Kjeldsen Т., 2000, Appi Microbiol Biotechnol, 54: 277-286]. В частности некоторые искусственно сконструированные про-пептиды обеспечивают 4-кратное увеличение секреции инсулина человека по сравнению со стандартным вариантом пре-про-области α-фактора дрожжей [Kjeldsen Т., 2000, Appi Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].Increasing the efficiency of protein secretion in yeast cells is one of the priority areas of research in the field of biotechnology. The studies being carried out include the modification of pro-regions of leader polypeptides that provide improved processing [Kjeldsen T. et al., 1996, Gene, 170: 107-112] and secretory activity [Kjeldsen T., 2000, Appi Microbiol Biotechnol 54: 277-286]. In particular, some artificially engineered pro-peptides provide a 4-fold increase in human insulin secretion compared to the standard version of the pre-pro-region of the yeast α-factor [Kjeldsen T., 2000, Appi Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].
К интерферону альфа-2 человека (IFN-α2) относятся два аллельных варианта интерферон альфа-2b и интерферон альфа-2а, отличающихся в кодирующей области одиночной нуклеотидной заменой в позиции 137 (2а:А, 2b:G). [Kaluz et al., 1993, Acta Virol, 37: 97-100; Kaluz et al., 1994, Acta Virol, 38: 101-104; Lee et al., 1995, J Interferon Cytokine Res, 15: 341-349], которая приводит к аминокислотной замене (2а: Lys, 2b:Arg).The human interferon alpha-2 (IFN-α2) includes two allelic variants of interferon alpha-2b and interferon alpha-2a, which differ in the coding region by a single nucleotide substitution at position 137 (2a: A, 2b: G). [Kaluz et al., 1993, Acta Virol, 37: 97-100; Kaluz et al., 1994, Acta Virol, 38: 101-104; Lee et al., 1995, J Interferon Cytokine Res, 15: 341-349], which leads to amino acid substitution (2a: Lys, 2b: Arg).
Интерфероны альфа-2 человека относятся к классу цитокинов, обладающих антивирусной активностью, и являются представителями семейства альфа-интерферонов, секретируемых практически всеми типами вирус-инфицированных клеток человека [Pfeffer et al., 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499].Human alpha-2 interferons belong to the class of cytokines with antiviral activity and are members of the alpha interferon family secreted by almost all types of virus-infected human cells [Pfeffer et al., 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499].
Рекомбинантные IFN-α2 применяют для терапии вирусных и опухолевых заболеваний [Samuel, 2001.Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Schadendorf et al., 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et al., 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499], в том числе для лечения твердых опухолей, таких как рак мочевого пузыря, рак почки, ВИЧ-индуцированная саркома Капоши и др. [Torti et al., 1988, J din Oncol, 6: 476-483; Vugrin et al., 1985, Cancer Treat Rep, 69: 817-820; Rios et al., 1985, J din Oncol, 3: 5 06-512]. IFN-a2 являются основными терапевтическими средствами, используемыми для лечения хронических форм гепатитов В и С [dark & Nelson, 2009, din Liver Dis, 13: 351-363].Recombinant IFN-α2 is used to treat viral and tumor diseases [Samuel, 2001. Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Schadendorf et al., 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et al., 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499], including for the treatment of solid tumors such as bladder cancer, kidney cancer, HIV-induced Kaposi’s sarcoma and others [Torti et al., 1988, J din Oncol, 6: 476-483; Vugrin et al., 1985, Cancer Treat Rep, 69: 817-820; Rios et al., 1985, J din Oncol, 3: 5 06-512]. IFN-a2 are the main therapeutic agents used to treat chronic forms of hepatitis B and C [dark & Nelson, 2009, din Liver Dis, 13: 351-363].
В недавних работах [Shi et al., 2007, Protein Expr Purif, 54: 220-6; Ghosalkar et al., 2008, Protein Expr Purif, 60: 103-109; Salunkhe et al 2010, Protein Expr Purif, 71: 139-46] показано, что пре-про область α-фактора дрожжей эффективно направляет секрецию зрелого интерферона альфа-2b в клетках дрожжей Pichia pastoris. Уровень накопления биологически активного интерферона в среде культивирования составляет до 300 мг/л. В условиях высокоплотного культивирования Р. pastoris получают до 600 мг/л зрелого IFN-α2 [Ayed et al., 2008, Enzyme Microb Technol, 42: 173-180].In recent papers [Shi et al., 2007, Protein Expr Purif, 54: 220-6; Ghosalkar et al., 2008, Protein Expr Purif, 60: 103-109; Salunkhe et al 2010, Protein Expr Purif, 71: 139-46] showed that the pre-pro region of the yeast α-factor effectively directs the secretion of mature interferon alpha-2b in Pichia pastoris yeast cells. The accumulation level of biologically active interferon in the culture medium is up to 300 mg / L. Under conditions of high-density cultivation of P. pastoris receive up to 600 mg / l of mature IFN-α2 [Ayed et al., 2008, Enzyme Microb Technol, 42: 173-180].
Возможность использования дрожжей S.cerevisiae для получения до 280 мг/л биологически активного интерферона альфа-2а показана в работе Cbu et al. [2003].The possibility of using S. cerevisiae yeast to produce up to 280 mg / l biologically active interferon alpha-2a is shown in Cbu et al. [2003].
Задача заявляемой группы изобретений является расширение арсенала лидерных полипептидов, направляющих секрецию целевых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae в культуральную среду, и конструирование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцентов секретируемого интерферона альфа-2 человека, обладающих повышенной продукцией этих белков.The objective of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of leader polypeptides directing the secretion of target proteins in Saccharomyces cerevisiae yeast into the culture medium, and the construction of strains of Saccharomyces cerevisiae yeast, producers of secreted human interferon alpha-2, with increased production of these proteins.
Задача решена путемThe problem is solved by
- конструирования генов, кодирующих новые лидерные полипептиды, в состав которых вместо уникальной про-области α-фактора дрожжей вводят две или более последовательностей про-областей α-фактора дрожжей;- designing genes encoding new leader polypeptides, in which instead of a unique pro-region of the yeast α-factor, two or more sequences of pro-regions of the yeast α-factor are introduced;
- конструирования векторов, несущих гены зрелого интерферона альфа-2 человека, слитые в одной рамке считывания с генами новых лидерных полипептидов;- construction of vectors carrying the genes of mature interferon alpha-2 human, fused in the same reading frame with the genes of new leader polypeptides;
- конструирования штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3582 и ВКПМ Y-3581 - продуцентов зрелого интерферона альфа-2b человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно, секреция которых направляется лидерным полипептидом, сконструированным на основе удвоенной про-области α-фактора дрожжей S. cerevisiae.- designing yeast strains of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3582 and VKPM Y-3581 - producers of mature human interferon alpha-2b or mature human interferon alpha-2a, respectively, the secretion of which is directed by a leader polypeptide constructed on the basis of the doubled pro-region of yeast α-factor S. cerevisiae.
В основу заявляемой группы изобретений положен установленный авторами факт, заключающийся в том, что амплификация (удвоение, утроение и т.д.) последовательности про-области α-фактора дрожжей в составе лидерного полипептида, направляющего секрецию целевого белка в клетках S. cerevisiae, приводит к увеличению секреции этого целевого белка.The claimed group of inventions is based on the fact established by the authors that the amplification (doubling, tripling, etc.) of the pro-region of the yeast α-factor in the leader polypeptide that directs the secretion of the target protein in S. cerevisiae cells leads to increase the secretion of this target protein.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Этап 1 - конструируют варианты генов, кодирующих новые лидерные полипептиды, заключающих в своем составе последовательности, кодирующие эффективный сигнальный пептид и комбинацию про-областей α-фактора дрожжей. Под комбинацией понимают мультипликацию уникальной про-области α-фактора дрожжей. Новые лидерные полипептиды на С-конце содержат уникальный сайт узнавания процессирующей протеиназы КЕХ2.Stage 1 - construct variants of genes encoding new leader polypeptides that comprise sequences encoding an effective signal peptide and a combination of pro-regions of yeast α-factor. By combination is meant the multiplication of a unique pro-region of the yeast α-factor. The new leader polypeptides at the C-terminus contain a unique recognition site for the KEX2 processing proteinase.
Этап 2 - конструируют варианты экспрессионных векторов, каждый из которых содержит в своем составе ген, кодирующий целевой белок, прецизионно слитый с одним из вариантов новых лидерных полипептидов, содержащих в своем составе комбинацию про-областей. При этом в области слияния целевого белка и лидерного полипептида локализован сайт узнавания протеиназы КЕХ2, что позволяет в ходе секреции в результате ферментативного процессинга слитого белка с участием внутриклеточной протеиназы КЕХ2 высвобождать из его состава зрелый целевой белок, содержащий корректный N-концевой аминокислотный остаток.Stage 2 - design variants of expression vectors, each of which contains a gene encoding a target protein, precision fused with one of the variants of new leader polypeptides containing a combination of pro-regions. At the same time, the KEX2 proteinase recognition site is localized in the area of the fusion of the target protein and leader polypeptide, which allows secretion of enzymatic processing of the fusion protein with the participation of intracellular KEX2 proteinase to release the mature target protein containing the correct N-terminal amino acid residue.
Этап 3 - полученными вариантами экспрессионных векторов трансформируют реципиентные штаммы дрожжей S. cerevisiae, после чего, анализируя в подходящих условиях секреторную активность полученных трансформантов, выбирают тот вариант штамма с новым лидерным полипептидом, который демонстрирует наибольшую эффективность секреции целевого белка.Stage 3 - the recipient strains of S. cerevisiae yeast are transformed with the obtained variants of expression vectors, after which, analyzing the secretory activity of the obtained transformants under suitable conditions, choose the variant variant with the new leader polypeptide that shows the highest secretion efficiency of the target protein.
Этап 4 - с использованием выбранного штамма дрожжей и ферментационного оборудования в оптимизированных условиях проводят биосинтез целевого белка.Stage 4 - using the selected strain of yeast and fermentation equipment in optimized conditions, the biosynthesis of the target protein is carried out.
Заявляемые штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуценты зрелого интерферона альфа-2b человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно, получают согласно описанному выше способу с использованием генов зрелого интерферона альфа-2b человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно. В результате осуществления способа получают штаммы SCR-2b-FF - продуцент зрелого интерферона альфа-2b человека и SCR-2a-FF - продуцент зрелого интерферона альфа-2а человека. Секреция зрелых интерферонов альфа-2 человека в клетках штаммов SCR-2b-FF и SCR-2a-FF направляется лидерным полипептидом, содержащим удвоенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiae. Полученные штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штаммы Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3582 и ВКПМ Y-3581, соответственно.The inventive yeast strains Saccharomyces cerevisiae - producers of mature human interferon alpha-2b or mature human interferon alpha-2a, respectively, are obtained according to the above method using the mature human interferon alpha-2b genes or mature human interferon alpha-2a, respectively. As a result of the method, strains SCR-2b-FF, a producer of mature human interferon alpha-2b, and SCR-2a-FF, a producer of mature human interferon alpha-2a, are obtained. The secretion of mature human alpha-2 interferons in the cells of the SCR-2b-FF and SCR-2a-FF strains is directed by the leader polypeptide containing the doubled pro-region of S. cerevisiae yeast α-factor. The obtained strains were deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) as strains of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3582 and VKPM Y-3581, respectively.
Характеристика заявляемых штаммовCharacterization of the claimed strains
Генотип заявляемых штаммовThe genotype of the claimed strains
Все заявляемые штаммы характеризуются следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками:All of the claimed strains are characterized by the following cultural-morphological and physiological-biochemical characteristics:
Морфологические признаки:Morphological features:
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YPD следующего состава (в мас.%): пептон-2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, агар -2, вода - остальное, клетки заявляемых штаммов Saccharomyces cerevisiae имеют овальную форму, 3-7 мкм в диаметре. Клетки почкуются. Почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultured at a temperature of 28 ° C for 48 hours on an agarized YPD medium of the following composition (in wt.%): Peptone-2, yeast extract - 1, glucose - 2, agar -2, water - the rest, cells of the claimed strains of Saccharomyces cerevisiae have an oval shape, 3-7 microns in diameter. Cells are budded. The budding is true, many-sided. True mycelium is not formed.
Колонии имеют следующий вид:Colonies are as follows:
1) на агаризованной среде YPD колонии белого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и сметанообразной консистенцией;1) on an agarized YPD medium, colonies of white color with a smooth edge, a matte surface, a lenticular profile and a creamy consistency;
2) на агаризованной среде с крахмалом (состав в мас.%: пептон-2, дрожжевой экстракт - 1, крахмал - 1, агар -2, вода - остальное) колонии белого цвета с узорчатым краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и крупчатой консистенцией.2) on an agar medium with starch (composition in wt.%: Peptone-2, yeast extract - 1, starch - 1, agar -2, water - the rest) of a white colony with a patterned edge, matte surface, lenticular profile and crumbly consistency .
Рост в жидкой среде с крахмалом: при 28°С в течение первых 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, не комкуется, пристеночных пленок не образует.Growth in a liquid medium with starch: at 28 ° C during the first 24 hours of cultivation, the liquid is cloudy, the precipitate is white, does not clump, does not form wall films.
Физико-химические признаки. Все заявляемые штаммы факультативные анаэробы. Температура роста - 20-33°С (оптимум - 28°С). рН культивирования - 3,8-7,4 (оптимум - 5,0).Physico-chemical signs. All claimed strains are optional anaerobes. The growth temperature is 20-33 ° C (optimum is 28 ° C). The pH of the cultivation is 3.8-7.4 (optimum is 5.0).
Ассимиляция источников углерода. Все заявляемые штаммы сбраживают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстрины, крахмал. Не сбраживают лактозу, галактозу, инулин, ксилозу, арабинозу.Assimilation of carbon sources. All the claimed strains ferment glucose, fructose, maltose, sucrose, dextrins, starch. Do not ferment lactose, galactose, inulin, xylose, arabinose.
Ассимиляция источников азота. Все заявляемые штаммы усваивают аминокислоты, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний.Assimilation of nitrogen sources. All claimed strains assimilate amino acids, ammonium sulfate, ammonium nitrate.
Патогенность. Заявляемые штаммы Saccharomyces cerevisiae непатогененны.Pathogenicity. The inventive strains of Saccharomyces cerevisiae are non-pathogenic.
Хранение: Штаммы хранят при температуре -70°С в 20% водном растворе глицерина. Возможно хранение на агаризованной богатой среде с глюкозой в течение 3 месяцев при +4°С.Storage: The strains are stored at a temperature of -70 ° C in a 20% aqueous solution of glycerol. Storage on an agarized rich medium with glucose is possible for 3 months at + 4 ° C.
Стабильность. Стабильность заявляемых штаммов сохраняется при 20 последовательных пересевах на агаризованной среде YPD при температуре 28°С.Stability. The stability of the claimed strains is maintained at 20 consecutive transfers in agarized YPD medium at a temperature of 28 ° C.
Продукция интерферона алъфа-2: При выращивании в ферментере клетки заявляемых штаммов Saccharomyces cerevisiae SCR-2b-FF и SCR-2a-FF продуцируют зрелый интерферон IFN-α2.Production of interferon alfa-2: When grown in a fermenter, cells of the claimed Saccharomyces cerevisiae strains SCR-2b-FF and SCR-2a-FF produce mature interferon IFN-α2.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг.1. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости, полученных в результате культивирования штаммов-продуцентов интерферона альфа-2 человека: SCR-2a-F (дор. 1), SCR-2b-F (дор. 2), SCR-2a-FF (дор. 3), SCR-2b-FF (дор. 4), SCR-2a-FFF (дор. 5) и SCR-2b-FFF (дор. 6). На дорожки нанесен белок из 5 мкл культуральной жидкости. На элекрофореграмме представлены маркеры молекулярного веса (дор. М, слева приведены значения молекулярного веса белковых маркеров (в кДа)). В верхней части электрофореграммы приведены данные измерений содержания интерферона альфа-2 в соответствующих образцах культуральной жидкости, полученные с помощью аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (мг/л).Figure 1. Electrophoregram of samples of the culture fluid obtained by culturing the producer strains of human interferon alpha-2: SCR-2a-F (road 1), SCR-2b-F (road 2), SCR-2a-FF (road 3) , SCR-2b-FF (extension 4), SCR-2a-FFF (extension 5) and SCR-2b-FFF (extension 6). A protein of 5 μl of culture fluid was applied to the tracks. The electrophoregram presents molecular weight markers (d. M, on the left are the molecular weight values of protein markers (in kDa)). The upper part of the electrophoregram shows the measurement data for the content of interferon alpha-2 in the corresponding samples of the culture fluid obtained using analytical high-performance liquid chromatography (mg / l).
Пример 1. Конструирование гена лидерного полипептида, содержащего удвоенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiaeExample 1. Construction of a leader polypeptide gene containing a doubled pro-region of S. cerevisiae yeast α-factor
Конструирование гена, кодирующего лидерный полипептид, содержащий удвоенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiae, проводят с использованием плазмиды pUC18x-GALlppI-IFN2b. Ген интерферона альфа-2b человека амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) и N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattgcaagttt). Матрицей служит ДНК плазмы pSX50[RU2319502]. Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК размером 510 п.о. элюируют из агарозного геля с использованием набора Qiagen (Qiagen, cat.JNo 28706), обрабатывают рестриктазами Ncol и Xhol и клонируют в лабораторной плазмиде pUC18x-GALlppI. В результате получают плазмиду pUC18x-GALlppI-IFN2b. Плазмиду pUC18x-GALlppI-IFN2b расщепляют по сайтам Ncol и Xhol. Больший из образовавшихся фрагментов ДНК, заключающий векторную часть плазмиды и последовательность, кодирующую пре-про область α-фактора дрожжей, слитую с последовательностью, кодирующей промоторную область гена GAL1 дрожжей, называют фрагментом-1. Затем, используя для ПЦР праймеры N449 (5'-atatagatctccagtcaacactacaa) и стандартный обратный pUC-праймер, называемый N169 (5'- gagcggataacaatttcacacagg), амплифицируют фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GALlppI-IFN2b, заключающий последовательность про-области α-фактора дрожжей и слитый с ней ген интерферона. Амплифицированный фрагмент ДНК расщепляют по уникальным концевым сайтам BglII и Xhol и называют фрагментом-2. Затем в результате отжига друг на друга двух синтетических олигонуклеотидов N573 (5'-catgttggaattcg) и N574 (5'-gatccgaattccaa) получают синтетический адаптер, называемый фрагментом-3. В результате совместного лигирования трех полученных фрагментов ДНК получают плазмиду pUC18x-GALlpFF-IFN2b.The construction of the gene encoding the leader polypeptide containing the doubled pro-region of the S. cerevisiae yeast α-factor is carried out using the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b. The human interferon alpha-2b gene is amplified by PCR using primers N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) and N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattgcaagttt). The matrix is pSX50 plasma DNA [RU2319502]. A 510 bp DNA fragment obtained as a result of amplification elute from the agarose gel using the Qiagen kit (Qiagen, cat.JNo 28706), digest with restriction enzymes Ncol and Xhol and clone in the laboratory plasmid pUC18x-GALlppI. The result is the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b. Plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b was digested at the Ncol and Xhol sites. The largest of the resulting DNA fragments, comprising the vector part of the plasmid and the sequence encoding the pre-pro region of the yeast α-factor, fused to the sequence encoding the promoter region of the yeast GAL1 gene, is called fragment-1. Then, using N449 primers (5'-atatagatctccagtcaacactacaa) and a standard reverse pUC primer called N169 (5'-gagcggataacaatttcacacagg) for PCR, the DNA fragment of the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b and the α-terminal region containing the yeast-containing sequence are amplified with her interferon gene. The amplified DNA fragment is cleaved at the unique terminal sites of BglII and Xhol and is called fragment-2. Then, as a result of annealing one another of two synthetic oligonucleotides N573 (5'-catgttggaattcg) and N574 (5'-gatccgaattccaa), a synthetic adapter called fragment-3 is obtained. As a result of co-ligation of the three obtained DNA fragments, the plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b is obtained.
Полученная плазмида pUC18x-GALlpFF-IFN2b содержит ген интерферона альфа-2b человека, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, содержащий в своем составе удвоенную про-область α-фактора дрожжей.The resulting plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b contains the human interferon alpha-2b gene fused to a DNA fragment encoding a leader polypeptide containing a doubled pro-region of the yeast α-factor.
Пример 2. Конструирование гена лидерного полипептид а, содержащего утроенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiaeExample 2. Construction of a leader polypeptide a gene containing a triple pro-region of S. cerevisiae yeast α-factor
Конструирование гена лидерного полипептида, содержащего утроенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiae, проводят с использованием плазмиды pUC18x-GALlpFF-IFN2b (пример 1). Для этого плазмиду pUC18x-GALlpFF-IFN2b расщепляют по сайтам Ncol и Xhol. Больший из образовавшихся фрагментов ДНК, заключающий векторную часть плазмиды и последовательность промоторной области гена GAL1 дрожжей, слитую с лидерным полипептидом, заключающим удвоенную про-область α-фактора дрожжей, называют фрагментом-4. В результате совместного лидирования трех фрагментов ДНК, фрагментов 2 и 3 (пример 1) и фрагмента-4 получают плазмиду pUC18x-GALlpFFF-IFN2b.The construction of the leader polypeptide gene containing the triple pro-region of the S. cerevisiae yeast α-factor is carried out using the plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b (example 1). For this, the plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b is cleaved at the Ncol and Xhol sites. The largest of the resulting DNA fragments, comprising the vector part of the plasmid and the sequence of the promoter region of the yeast GAL1 gene, fused to the leader polypeptide containing the doubled pro-region of the yeast α-factor, is called fragment-4. As a result of the co-leading of three DNA fragments, fragments 2 and 3 (example 1) and fragment-4, plasmid pUC18x-GALlpFFF-IFN2b is obtained.
Полученная плазмида pUC18x-GALlpFFF-IFN2b содержит ген интерферона альфа-2b человека, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, содержащий в своем составе утроенную про-область α-фактора дрожжей.The resulting plasmid pUC18x-GALlpFFF-IFN2b contains the human interferon alpha-2b gene fused to a DNA fragment encoding a leader polypeptide containing the triple pro-region of the yeast α-factor.
Пример 3. Конструирование дрожжевых экспрессионных векторов, несущих ген альфа-2b интерферона человекаExample 3. Construction of yeast expression vectors carrying the alpha-2b gene of human interferon
Конструирование проводят с использованием лабораторного вектора pPDX3, отличающегося от вектора pPDX2 одиночной заменой в последовательности сайта NcoI (ccatgg изменен на ccatga), локализованной в области структурного гена URA3 и не приводящей к инактивации этого гена. Конструирование проводят следующим образом. HindIII/XhoI фрагмент ДНК вектора pPDX3 лигируют с HindIII/XhoI фрагментом ДНК плазмиды pUC18x-GAL1ppI-IFN2b или pUC18x-GALlpFF-IFN2b или pUC18x-GALlpFFF-IFN2b, заключающим последовательности промотора GAL1 и гена интерферона альфа-2b человека, слитого с соответствующим лидерным полипептидом. В результате получают экспрессионные вектора pPDX3-F-2b или pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b, соответственно.Construction was performed using the laboratory vector pPDX3, which differs from the vector pPDX2 by a single substitution in the NcoI site sequence (ccatgg changed to ccatga) located in the region of the URA3 structural gene and not leading to inactivation of this gene. The design is as follows. The HindIII / XhoI DNA fragment of the pPDX3 vector is ligated with the HindIII / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1ppI-IFN2b or pUC18x-GALlpFF-IFN2b or pUC18x-GALlpFFF-IFN2b, which encloses the sequences of the GAL1 promoter and the human interferon l-2 gene polyferon gene . The result is expression vectors pPDX3-F-2b or pPDX3-FF-2b or pPDX3-FFF-2b, respectively.
Полученные экспрессионные вектора несут в своем составе ген, кодирующий зрелый интерферон альфа-2b человека, слитый с последовательностями лидерных полипептидов, заключающих в своем составе одиночную, удвоенную или утроенную про-области α-фактора дрожжей, соответственно.The resulting expression vectors contain a gene encoding mature human interferon alpha-2b fused to sequences of leader polypeptides containing single, double or triple pro-regions of yeast α-factor, respectively.
Пример 4. Конструирование дрожжевых экспрессионных векторов, несущих ген альфа-2а интерферона человекаExample 4. Construction of yeast expression vectors carrying the gene of human alpha-2a interferon
Источником гена интерферона альфа-2а человека служит плазмида pUC18x-GALlppI-IFN2a, сконструированная аналогично pUC18x-GALlpFFF-IFN2b, только вместо праймера N466 используют N617 (agcctaggtagccgtcggtaccttgatgctcctggcacagatgcgtaagatctctctttt).The source of the human interferon alpha-2a gene is the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2a, constructed similarly to pUC18x-GALlpFFF-IFN2b, but instead of primer N466, N617 (agcctaggtagccgtcggtaccttgatgctcctctcctagtgctagtgctgctgtgctgctgtgctgctgctactag) is used.
Амплифицированный фрагмент ДНК размером 480 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами XmaJI и Xhol и клонируют в плазмиде pUC18x-GALlppI-IFN2b, расщепленной по тем же сайтам. В ходе конструирования в составе экспрессионных векторов pPDX3-F-2b, pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b ген интерферона альфа-2b человека замещают на ген интерферона альфа-2а человека. Для этого из состава вектора pPDX3-F-2b или pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b выщепляют уникальный NcoI/XhoI фрагмент ДНК, включающий ген интерферона альфа-2b человека, а оставшуюся векторную часть лигируют с NcoI/XhoI фрагментом ДНК плазмиды pUC18x-GALlppI-IFN2a, кодирующим ген интерферона альфа-2а человека. В результате получают экспрессионные вектора pPDX3-F-2a или pPDX3-FF-2a или pPDX3-FFF-2a, соответственно.The amplified DNA fragment size of 480 bp elute from agarose gel, digest with restriction enzymes XmaJI and Xhol and clone in plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b, split at the same sites. During the construction of pPDX3-F-2b, pPDX3-FF-2b or pPDX3-FFF-2b expression vectors, the human interferon alpha-2b gene is replaced with the human interferon alpha-2a gene. For this, a unique NcoI / XhoI DNA fragment including the human interferon alpha-2b gene is excised from the vector pPDX3-F-2b or pPDX3-FF-2b or pPDX3-FFF-2b, and the remaining vector part is ligated with the NcoI / XhoI plasmid DNA fragment pUC18x-GALlppI-IFN2a encoding the human interferon alpha-2a gene. The result is the expression vectors pPDX3-F-2a or pPDX3-FF-2a or pPDX3-FFF-2a, respectively.
Полученные экспрессионные вектора несут в своем составе ген зрелого интерферона альфа-2а человека, слитый с последовательностями лидерных полипептидов, заключающих в своем составе одиночную, удвоенную или утроенную про-области α-фактора дрожжей, соответственно.The resulting expression vectors contain the mature human interferon alpha-2a gene fused to sequences of leader polypeptides containing single, double or triple pro-regions of yeast α-factor, respectively.
Пример 5. Конструирование штаммов дрожжей S. cerevisiae -продуцентов секретируемого альфа-2 интерферона человекаExample 5. Construction of strains of yeast S. cerevisiae-producers of secreted alpha-2 human interferon
Продуценты секретируемого интерферона альфа-2 человека конструируют на базе штамма S. cerevisiae ВКПМ Y-3550. Для этого сначала клетки штамма ВКПМ Y-3550 освобождают от находящегося в них эписомного вектора. Полученный бесплазмидный штамм называют SCR-8G1.The producers of secreted human interferon alpha-2 are constructed on the basis of the S. cerevisiae VKPM Y-3550 strain. For this, first the cells of the VKPM strain Y-3550 are freed from the episomal vector located in them. The resulting plasmid-free strain is called SCR-8G1.
Клетки бесплазмидного реципиентного штамма SCR-8G1 трансформируют плазмидой pPDX3-F-2b, или pPDX3-FF-2b, или pPDX3-FFF-2b, или pPDX3-F-2a, или pPDX3-FF-2a, или pPDX3-FFF-2a. В результате получают штамм SCR-2b-F, или SCR-2b-FF, или SCR-2b-FFF, или SCR-2a-F, или SCR-2a-FF, или SCR-2a-FFF, соответственно.Cells of the plasmid-free recipient strain SCR-8G1 are transformed with the plasmid pPDX3-F-2b, or pPDX3-FF-2b, or pPDX3-FFF-2b, or pPDX3-F-2a, or pPDX3-FF-2a, or pPDX3-FFF. The result is a strain of SCR-2b-F, or SCR-2b-FF, or SCR-2b-FFF, or SCR-2a-F, or SCR-2a-FF, or SCR-2a-FFF, respectively.
Для анализа уровня секреции соматотропина клетки полученных штаммов культивируют на среде YPD. Далее, используя метод электрофореза в ПААГ и стандартный протокол ИФА.To analyze the level of growth hormone secretion, cells of the obtained strains are cultured on YPD medium. Further, using the method of electrophoresis in SDS page and the standard ELISA protocol.
Анализируют уровень продукции соматотропина, секретированного в среду культивирования дрожжей. В качестве отрицательного контроля используют штамм D721W/pPDX2.The level of growth hormone production secreted into the yeast culture medium is analyzed. As a negative control, strain D721W / pPDX2 is used.
Для анализа уровня секреции интерферона альфа-2 человека клетки полученных штаммов SCR-F-2b, SCR-2b-FF, SCR-2b-FFF, SCR-2a-F, SCR-2a-FF и SCR-2a-FFF культивируют на среде YPD следующего состава (в мас.%): пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, агар - 2, вода - остальное, в течение 44 часов при 28°С на роторной качалке со скоростью 250 об/мин. Накопление интерферона в культуральной жидкости анализируют, используя метод электрофореза в ПААГ и метод аналитической обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано в патентной заявке.To analyze the level of secretion of human interferon alpha-2, cells of the obtained strains SCR-F-2b, SCR-2b-FF, SCR-2b-FFF, SCR-2a-F, SCR-2a-FF and SCR-2a-FFF are cultured on medium YPD of the following composition (in wt.%): Peptone - 2, yeast extract - 1, glucose - 2, agar - 2, water - the rest, for 44 hours at 28 ° C on a rotary shaker at a speed of 250 rpm. The accumulation of interferon in the culture fluid was analyzed using a PAGE electrophoresis method and analytical reverse phase high performance liquid chromatography method as described in the patent application.
Результаты анализа (Фиг.1) показывают, что штаммы SCR-2b-FF и SCR-2a-FF, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется новыми лидерными полипептидами, заключающими в своем составе удвоенную про-область α-фактора дрожжей, а также штаммы SCR-2b-FFF и SCR-2a-FFF, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется новыми лидерными полипептидами, заключающими в своем составе утроенную про-область α-фактора дрожжей, превосходят по продуктивности штаммы SCR-2b-F и SCR-2a-F, являющиеся аналогами штаммов-прототипов ВКПМ Y-3550 и ВКПМ Y-3564, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется стандартной пре-про областью α-фактора дрожжей, в 1.3 и 1.2 раза, соответственно.The results of the analysis (Figure 1) show that the strains SCR-2b-FF and SCR-2a-FF, the secretion of interferon alpha-2 in which is directed by new leader polypeptides containing the doubled pro-region of the α-factor of yeast, as well as strains SCR-2b-FFF and SCR-2a-FFF, the secretion of interferon alpha-2 in which is directed by new leader polypeptides containing the triple pro-region of the α-factor of yeast, outperform the strains SCR-2b-F and SCR- 2a-F, which are analogues of the prototype strains VKPM Y-3550 and VKPM Y-3564, secretion of interferon alpha-2 in co which is directed by the standard pre-pro region of the α-factor of yeast, 1.3 and 1.2 times, respectively.
Штаммы SCR-2b-FF и SCR-2a-FF депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штаммы Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3582 и ВКПМ Y-3581, соответственно.Strains SCR-2b-FF and SCR-2a-FF were deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) as strains of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3582 and VKPM Y-3581, respectively.
Пример 6. Микробиологический синтез интерферона альфа-2b человека с использованием штамма ВКПМ Y-3582Example 6. Microbiological synthesis of human interferon alpha-2b using strain VKPM Y-3582
Для получения посевного материала штамм ВКПМ Y-3582 выращивают в среде YPD на качалке (250 об/мин) при температуре 28°С в течение 20-24 ч.To obtain seed, the VKPM strain Y-3582 is grown in YPD medium on a shaker (250 rpm) at a temperature of 28 ° C for 20-24 hours.
50 мл посевного материала используют для засева 3 л ферментера Anglicon, содержащего 950 мл среды YPD. Ферментацию проводят при температуре 28°С, аэрации 1 л/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин. Через 24 ч после засева ферментера начинают подпитку 50% раствором глюкозы со скоростью 2 мл/ч и устанавливают рН-стартирование культуры на уровне рН 6.8, используя для подтитровки растворы 10% серной кислоты и 10% NaOH. Общее время ферментации составляет 72 ч.50 ml of seed is used to seed 3 L of Anglicon fermenter containing 950 ml of YPD medium. Fermentation is carried out at a temperature of 28 ° C, aeration of 1 l / min and a stirring speed of 1000 rpm. 24 hours after inoculation of the fermenter, they start feeding with a 50% glucose solution at a rate of 2 ml / h and set the pH start of the culture at pH 6.8 using solutions of 10% sulfuric acid and 10% NaOH for subtraction. The total fermentation time is 72 hours
Продукция зрелого секретируемого интерферона альфа-2b человека штаммом ВКПМ Y-3582 составляет не менее 550 мг/л. Данный уровень продукции не менее чем на 20% превосходит уровень синтеза интерферона штаммом-прототипом ВКПМ Y-3550.The production of mature secreted human interferon alpha-2b strain VKPM Y-3582 is at least 550 mg / L. This level of production is not less than 20% higher than the level of synthesis of interferon by the strain prototype VKPM Y-3550.
Claims (3)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011111096/10A RU2446172C1 (en) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) |
| PCT/RU2011/000557 WO2012128662A1 (en) | 2011-03-24 | 2011-07-26 | Method for producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast, and an human interferon alpha-2-producing strain (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011111096/10A RU2446172C1 (en) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2446172C1 true RU2446172C1 (en) | 2012-03-27 |
Family
ID=46030867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011111096/10A RU2446172C1 (en) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2446172C1 (en) |
| WO (1) | WO2012128662A1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1551251A3 (en) * | 1984-08-01 | 1990-03-15 | Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма) | Method of producing human w-interferon |
| RU1660388C (en) * | 1989-07-13 | 1995-05-20 | Санкт-Петербургский государственный университет | Recombinant plasmid dna pvgib encoding bovine gamma-interferon, method of its preparing and yeast strain saccharomyces cerevisiae - a producer of bovine gamma-interferon |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
-
2011
- 2011-03-24 RU RU2011111096/10A patent/RU2446172C1/en active IP Right Revival
- 2011-07-26 WO PCT/RU2011/000557 patent/WO2012128662A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1551251A3 (en) * | 1984-08-01 | 1990-03-15 | Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма) | Method of producing human w-interferon |
| RU1660388C (en) * | 1989-07-13 | 1995-05-20 | Санкт-Петербургский государственный университет | Recombinant plasmid dna pvgib encoding bovine gamma-interferon, method of its preparing and yeast strain saccharomyces cerevisiae - a producer of bovine gamma-interferon |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHU J et al. Fermentation process optimization of recombinant Saccharomyces cerevisiae for the production of human interferon-alpha2a// Appl Biochem Biotechnol. 2003 Dec; 111(3):129-38. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012128662A1 (en) | 2012-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200347391A1 (en) | Promoter variants | |
| AU2013382370B2 (en) | Constitutive promoter | |
| JP7061234B2 (en) | Carbon source regulatory protein production in recombinant host cells | |
| US9012367B2 (en) | Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom | |
| CN104066841A (en) | Method for producing expression vector and protein | |
| US20040029252A1 (en) | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone | |
| RU2446172C1 (en) | Method of producing mature human interferon alpha-2 using saccharomyces cerevisiae yeast and human interferon alpha-2 producer strain (versions) | |
| US8691530B2 (en) | Process for obtaining aspart insulin using a Pichia pastoris yeast strain | |
| KR100915670B1 (en) | A novel YlMPO1 gene derived from Yarrowia lipolytica and a process for preparing a glycoprotein not being mannosylphosphorylated by using a mutated Yarrowia lipolytica in which YlMPO1 gene is disrupted | |
| RU2460795C1 (en) | Method for microbiological synthesis of secreted human somatotropin and yeast strain saccharomyces cerevisiae - secreted human somatotropin producer | |
| RU2315105C1 (en) | STRAIN YEAST PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2) AS PRODUCER OF HYBRID PROTEIN CONSISTING OF HUMAN PLASMA BLOOD ALBUMIN AND HUMAN INTERLEUKIN-2, RECOMBINANT PLASMID pPIC9HAbIL-2 AND METHOD FOR ITS CONSTRUCTING | |
| CN1049249C (en) | Secretion expression of precursor gene of insulin in yeast and preparing process for human insulin | |
| WO2020106599A1 (en) | A recombinant yeast cell | |
| US6613547B1 (en) | Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 promoter and terminator | |
| RU2203950C1 (en) | Strain of yeast pichia pastoris as producer of leukocyte human interferon-16, recombinant plasmid dna phin and method for its construction | |
| RU2180687C1 (en) | Yeast strain pichia pastoris as producer of human fibroblast interferon, recombinant plasmid dna phis and method of its construction | |
| CN1954083B (en) | Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom | |
| US6348331B1 (en) | Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 promoter | |
| HK40054115A (en) | Carbon-source regulated protein production in a recombinant host cell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130325 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140720 |