RU2335505C2 - Белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях - Google Patents
Белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2335505C2 RU2335505C2 RU2006123414/13A RU2006123414A RU2335505C2 RU 2335505 C2 RU2335505 C2 RU 2335505C2 RU 2006123414/13 A RU2006123414/13 A RU 2006123414/13A RU 2006123414 A RU2006123414 A RU 2006123414A RU 2335505 C2 RU2335505 C2 RU 2335505C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- nmb0928
- polysaccharide
- vaccine
- neisseria
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims 2
- 101100431363 Neisseria meningitidis serogroup B (strain MC58) NMB0928 gene Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 101150110907 NMB0928 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 55
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 25
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 24
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000034762 Meningococcal Infections Diseases 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 4
- 108010031133 Transferrin-Binding Protein A Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 3
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229940124731 meningococcal vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 2
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000529650 Neisseria meningitidis Z2491 Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- TXWRERCHRDBNLG-UHFFFAOYSA-N cubane Chemical compound C12C3C4C1C1C4C3C12 TXWRERCHRDBNLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101710167887 Major outer membrane protein P.IA Proteins 0.000 description 1
- 206010058858 Meningococcal bacteraemia Diseases 0.000 description 1
- 241000988233 Neisseria gonorrhoeae FA 1090 Species 0.000 description 1
- 241000432851 Neisseria meningitidis FAM18 Species 0.000 description 1
- 241000529648 Neisseria meningitidis MC58 Species 0.000 description 1
- 241000947238 Neisseria meningitidis serogroup C Species 0.000 description 1
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150093941 PORA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001948 anti-meningococcal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N bromo chloro 1h-indol-2-yl phosphate Chemical compound C1=CC=C2NC(OP(=O)(OBr)OCl)=CC2=C1 XJMXIWNOKIEIMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 1
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 1
- OGEROIBRQCWGOI-UHFFFAOYSA-N hexanedioic acid;hydrazine Chemical compound NN.NN.OC(=O)CCCCC(O)=O OGEROIBRQCWGOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010436 membrane biogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010030416 proteoliposomes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/626—Diabody or triabody
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан белок из N.meningitidis, названный NMB0928, представляющий собой антиген, способный вызывать в организме реципиента защитный ответ против инфекций, вызываемых бактериями из рода Neisseria, и имеющий установленную аминокислотную последовательность. Представлен ген, кодирующий описанный белок. Настоящее изобретение может использоваться для получения композиций, обладающих расширенным иммунным диапазоном и, тем самым, расширить диапазон их действия против различных патогенов. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл.
Description
Предшествующий уровень техники
Данное изобретение относится к области медицины, в частности к развитию новых вакцинных композиций превентивного или терапевтического применения, которые позволяют улучшать качество иммунной реакции против вакцинных антигенов заболеваний из различных источников.
Neisseria meningitidis, грамотрицательный диплококк, единственным известным хозяином которого является человек, является возбудителем менингококкового менингита. Обычно эта бактерия обнаруживается у бессимптомных носителей среди здоровой популяции и эта ниша является наиболее обычным источником для ее микробиологического выделения.
В мировом масштабе маленькие дети в возрасте менее двух лет являются наиболее чувствительной популяцией для заражения менингококковым менингитом, однако молодая взрослая и обычная взрослая популяция может быть также поражена.
В отсутствие лечения менингококковое заболевание имеет летальный исход для большинства пораженных индивидуумов, и вакцинация могла бы предотвращать эту ситуацию путем остановки развития событий на ранней фазе бактериальной колонизации.
Несколько стратегий было разработано с целью получения вакцины, удовлетворяющей необходимым требованиям для индукции защиты против указанного заболевания во всей популяции. Для этой цели внимание было обращено на капсульные антигены, так как их иммунологическая специфичность дала возможность произвести классификацию этого микроорганизма на серологические группы. Было определено, что пять из этих серологических групп ответственны за большинство клинических случаев менингококкового заболевания по всему миру. Серогруппа А является главной причиной эпидемий в зонах Африки ниже Сахары. Серогруппы В и С ассоциированы в большинстве случаев со случаями в развитых странах. Серогруппы Y и W135 являются обычными в большинстве рецидивирующих случаев этого заболевания, и они преобладают в некоторых областях США, с явным увеличением в последние несколько лет. Из этой информации является очевидной необходимость применения, исследования и оценки капсульных полисахаридов в качестве вакцинных кандидатов. Тетравалентная вакцина на основе капсульных полисахаридов, сообщающая защиту против серогрупп А, С, Y и W-135, была лицензирована в Соединенных Штатах. Индуцируемые антитела после вакцинации являются специфическими в отношении серогруппы (Rosenstein N. et al., 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med. 344, 1378-1388).
Серогруппа В, которая отличается от остальных, продолжает быть важной причиной эндемического и эпидемического менингококкового заболевания и это обусловлено в основном полным отсутствием эффективных вакцин против нее. Отмечалось, что капсульный полисахарид является слабоиммуногенным, а кроме того, теоретически существует риск, заключающийся в том, что вакцина на основе этого соединения будет индуцировать иммунотолерантность и аутоиммунную реакцию вследствие его структурного сходства с олигосахаридными цепями, которые присутствуют в нервных структурах плода человека (Finne J. et al., 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol., 138: 4402-4407). Таким образом, развитие вакцин против серогруппы В сосредоточивается на использовании субкапсулярных антигенов.
Белки наружной мембраны и везикулярные вакцины
Начальные попытки получения вакцин в 70-х годах на основе белков наружной мембраны были основаны на истощении LPS препаратов белков наружной мембраны детергентом (Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in guinea pig model. J. Exp. Med. 147(3):629-44). Затем белки наружной мембраны, ОМР, осаждали для получения агрегатов, суспендированных в хлориде натрия. Несмотря на обещающие успех результаты в исследованиях на животных, эти вакцины не могли индуцировать бактерицидное антитело ни у взрослых, ни у детей (Zollinger WD, et al., 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39). Слабое действие этих вакцин в значительной степени приписывали потере третичной структуры, которая сопутствовала осаждению. Таким образом, следующей логической стадией было получение вакцины с применением белков, проявляющих их нативную конформацию в форме пузырьков (везикул) наружной мембраны (Zollinger WD, et al., 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY and Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immun, 46(2):408-14136).
Эти вакцины из везикул наружной мембраны были значимо более иммуногенными, чем агрегаты ОМР, и было показано, что иммуногенность дополнительно усиливалась в результате адсорбции на адъюванте гидроксиде алюминия (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immunol. 46(2):408-14136).
Ряд испытаний эффективности проводили с применением растворимых вакцин везикул наружной мембраны различных составов. Две наиболее интенсивно исследованные вакцины были разработаны в 1980-х годах в ответ на вспышки эпидемии на Кубе (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210) и Норвегии (Bjune G. et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775):1093-6) соответственно. OMV-вакцина, полученная в Институте Finlay на Кубе (коммерчески продаваемая как VA-MENGOC-BC), получена из штамма B:4:P1.19,15 с полисахаридом серогруппы С и препаратом высокомолекулярных ОМР и адсорбирована на гидроксиде алюминия (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). Эта вакцина способствовала быстрому спаду эпидемии на Кубе (Rodrigues AP, et al. The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. 1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40).
Вакцина, полученная Norwegian National Institute for Public Health (NIPH) подобным образом, была сначала предназначена для применения во время периода гиперэндемического заболевания, вызываемого другим организмом из клона ЕТ-5 (B:15:P1.7,16). Она была также моновалентной вакциной, полученной из очищенных везикул наружной мембраны, адсорбированной на гидроксид алюминия (Bjune G, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775):1093-6).
Вакцины везикул наружной мембраны, по-видимому, эффективно презентируют белки наружной мембраны в достаточно природной конформации, чтобы сделать возможным генерирование функциональных бактерицидных антител по меньшей мере у подростков и взрослых. Было также показано, что генерируемые реакции в виде антител увеличивали опсонофагоцитоз менингококков. Точный состав вакцин (т.е. содержание ОМР, содержание LPS и присутствие или отсутствие адъюванта) имел важное значение для иммуногенности (Lehmann AK, et al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opconin response in vaccines as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72, Gomez JA, et al. 1998. Effect of adjuvants in the idotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrib-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine. 16(17); 1633-8, Steeghs L, et al. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immunol. 67(10):4988-93).
Профиль антигенов изолятов заболевания также быстро изменяется, и вакцина с охватом только ограниченного числа выбранных штаммов становится, по-видимому, неэффективной в пределах немногих лет, пока состав вакцины не будет изменен для отображения локальной эпидемиологии.
В настоящее время вакцины OMV используются более широко, чем любая другая вакцина серогруппы В, и они потенциально применимы в контексте вспышек заболевания, вызываемого единственным типом PorA.
Иммуногены, которые генерируют перекрестную реактивность между штаммами, пока еще не определены полностью. Исследования сывороток после вакцинации как из испытаний вакцины в Институте Finlay, так и из испытаний вакцины NIPH позволили предположить, что антитела против PorA (P1, белок серотипа класса 1) и OpcA (другой основной ОМР, ранее известный как Opc) (Wedege E, et al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccines and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infect Immun. 66(7): 3223-31), оба, были важными в опосредовании сывороточной бактерицидной активности (причем PorA был наиболее иммуногенным), и оба эти антигена обнаруживают явную вариабельность от штамма к штамму.
Выдающееся положение белка PorA и значительный уровень вариабельности в этом белке, который, по-видимому, подвергается непрерывному изменению как между эпидемиями, так и во время эпидемий (Jelfa J, et al. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5) в эпитопах, на которые направлена большая часть бактерицидной активности после вакцинации (и после заболевания), усиливали беспокойство в отношении того, что защита, предоставляемая вакцинами на основе единственного штамма OMV (моновалентные), может быть серо-подтип-рестриктированной (т.е. зависимой от типа PorA).
В попытке преодоления этой потенциальной проблемы в Нидерландах в RIVM была разработана вакцина OMV, которая содержала белки PorA из шести различных преобладающих патогенных изолятов (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infect Immun. 60(8):3156-61, Claassen I, et al. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membhane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14(10):1001-8). В этом случае вакцинные пузырьки (везикулы) экстрагировали из двух вариантов хорошо охарактеризованного штамма Н44/76, который был получен генной инженерией для экспрессии трех раздельных белков PorA.
Поиск универсального антигена
Ясно, что белки наружной мембраны (ОМР) могу индуцировать функциональную иммунную реакцию против заболевания серогруппы В, но что ни одна из разработанных до сих пор вакцин не является универсально защитной вследствие большой гетерогенности экспонированных на поверхности районов белков наружной мембраны. Умеренный перекрестно-реактивный иммунитет, индуцированный вакцинами везикул наружной мембраны, способствовал поиску антигена (или группы антигенов наружной мембраны), который индуцирует функциональные антитела и который присутствует на всех менингококковых штаммах. Такие антигены, если они присутствуют на всех штаммах, независимо от серологической группы, могут образовать основу истинно универсальной менингококковой вакцины, которая могла бы устранить потенциальную проблему капсульного запуска патогенных штаммов после вакцинации полисахаридами.
Как только стало очевидным, что вариабельность иммунодоминантного белка PorA могла бы ограничивать его применение в качестве универсальной вакцины, ряд других основных белков наружной мембраны были рассмотрены в отношении их вакцинного потенциала, и несколько из них исследуются дополнительно. Белки, которые были рассмотрены, включают в себя белки класса 5 (OpcA), NspA и регулируемые железом белки (TbpA и В, FbpA, FetA). TbpA образует часть трансферринсвязывающего комплекса с TbpA. Недавнее исследование предполагает, что TbpA играет важную функциональную роль в связывании железа (Pintor M, et al. 1998. Analysis of TbpA and TbpA functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbiol 47(9): 757-60) и является более эффективным иммуногеном, чем TbpB.
Высококонсервативный минорный белок наружной мембраны был обнаружен при помощи нового способа, использующего комбинации препаратов белков наружной мембраны из различных менингококковых штаммов для иммунизации мышей (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). В-клетки этих мышей использовали для получения гибридом, которые затем подвергали скринингу на перекрестную реактивность против множественных штаммов менингококков. Было обнаружено, что одно моноклональное антитело с высокой перекрестной реактивностью связывается с белком наружной мембраны в 22 кДа, и оно было названо NspA. Было показано, что иммунизация рекомбинантным белком NspA индуцирует перекрестную бактерицидную реакцию у мышей против штаммов серогрупп А-С. Вакцинация также защищает мышей от летальной менингококковой инфекции (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J. Exp. Med 185 (7): 1173-83). Сравнение последовательностей NspA среди генетически дивергентных менингококковых штаммов демонстрирует, что этот белок является высококонсервативным (97% гомология) (Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9).
Присутствие NspA было детектировано при помощи ELISA на 99,2% испытанных штаммов из серогрупп А-С с применением моноклональных анти-NspA-антител (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Было показано, что эти моноклональные антитела являются бактерицидными против многочисленных штаммов менингококков и способны уменьшать менингококковую бактериемию в мышиной модели (Cadieux N, et al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9). Хотя эти данные, по-видимому, предполагают, что NspA является многообещающим вакцинным кандидатом, который способен защищать во всех эпитопных микроокружениях серологических групп, поликлональная сыворотка против рекомбинантного NspA из мышей не связывается с поверхностью приблизительно 35% менингококковых штаммов серогруппы В, несмотря на присутствие гена nspA в этих организмах (Moe GR et al. 1999. Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infec Immun 67 (11): 5664-75).
Презентация антигенов и приготовление вакцин
Более ранние исследования предполагали, что форма, в которой презентируются антигены, является, вероятно, решающей. Эпитопы на мембраносвязанных белках часто зависят от сохранения точной третичной структуры, а оно, в свою очередь, зависит от гидрофобных мембраносвязанных доменов. Было показано, что препараты белков наружной мембраны индуцируют иммунитет у человека при презентации в форме везикул (Zollinger WD, et al., 1979. Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Zollinger WD, et al., 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39).
Вакцины единственного белка использовали в этой области десятилетиями и обычно обнаруживали хорошую стабильность. Если презентация в форме везикул необходима для того, чтобы антигены оставались мембраносвязанными, то стабильность и воспроизводимость, возможно, трудно гарантировать. Иммуногенность и реактогенность везикул наружной мембраны могут варьироваться с изменениями количества белка и LPS, удаленных в процессах очистки. Значительный опыт в получении вакцин был накоплен в приготовлении вакцины OMV, однако, и получаемые в настоящее время вакцины являются предметом тщательного контроля качества. Конструирование полностью синтетических липосомных везикул может сделать возможной дополнительную оптимизацию и стандартизацию таких вакцин (Christodoulides M, et al. 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposoms and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144(Pt 11):3027-37). Иными словами, белки наружной мембраны были представлены как в виде везикул, так и в виде чистых экспрессируемых белков, и развитие реакций в виде антител было умеренным. Основные усилия до сих пор сосредоточивались на внутримышечной инъекции менингококковой вакцины, приводящей к продуцированию системного IgG. Однако при менингококковом заболевании, где инвазия хозяина происходит через назальный эпителий, может быть также важным продуцирование секреторного IgA.
Геномная последовательность N. meningitidis
Геномные последовательности МС58 (серогруппы В менингококка) (Tettelin H, et al. 2000/ Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain VC58. Science 287 (5459): 1809-15172) и Z2491 (штамм серогруппы А) (Parkhill J, et al. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (5777):502-6173) были выяснены и опубликованы в течение 2000 года. Доступность опубликованных генных последовательностей должны оказать разительное влияние на исследование менингококковых вакцин. В то время как секвенирование генома МС58 находилось в процессе развития, Pizza et al. начали идентифицировать открытые рамки считывания, которые, как было предсказано, кодируют либо мембраносвязанные, экспонированные на поверхности, либо экспортируемые белки. Они идентифицировали 570 таких рамок считывания (ORF), амплифицировали их с применением полимеразной цепной реакции и клонировали их в Escherichia coli для экспрессии кодируемых белков в виде либо His-меченых, либо слитых с глутатион-S-трансферазой белков (Pizza M, et al., 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). 61% (350) выбранных ORF были успешно экспрессированы, ORF, которые не могли экспрессироваться, часто были ORF, содержащими более, чем один, гидрофобный трансмембранный домен (возможно, исключающий ряд белков, связанных с наружной мембраной). Эти рекомбинантные белки очищали и использовали для вакцинации мышей. Затем иммунные сыворотки оценивали на поверхностное связывание с множественными менингококковыми штаммами при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и проточной цитометрии и на бактерицидную активность против двух штаммов с применением сывороточного бактерицидного анализа. Наконец, семь белков отбирали для дополнительного исследования на основании положительной реакции во всех трех анализах. Было показано, что вакцинные композиции испытания с применением ряда из этих белков в комбинации с адъювантами индуцировали значительные бактерицидные титры против гомологичного менингококкового штамма (МС58) в мышах, но ни один из этих белков не индуцировал титры SBA такие высокие, как везикулярная вакцина наружной мембраны МС58 (Giuliani MM, et al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p.22). С другой стороны, есть определенные основания полагать, что комбинации этих белков могут проявлять более высокую иммуногенность в мышах, чем отдельные белки (Santini L. et al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p.25). Многочисленные открытые рамки считывания, которые были исключены во время этого исследования, возможно, из-за неуспешности экспрессии белка или модификации их иммунологических свойств, могут также иметь вакцинный потенциал и требуют дополнительного исследования.
Вакцинные компоненты могут быть выбраны более эффективно после достижения понимания вклада индивидуальных антигенов в патогенез N. meningitidis. Эти антигены могут сами быть эффективными вакцинными кандидатами или, альтернативно, аттенуированные мутанты могли бы рассматриваться в качестве вакцинных компонентов. В этом направлении применение вакцинных кандидатов с высокой степенью консервативности последовательности среди нескольких видов патогенных микроорганизмов могло бы обеспечить решение в отношении множественных заболеваний, которые они могут вызывать в случае, если эти кандидаты индуцируют подходящую реакцию через действие иммунной системы.
Технической целью, которую преследует данное изобретение, является развитие вакцинных композиций, способных увеличивать и/или расширять индуцированную иммунную реакцию против различных патогенов или против широкого диапазона индивидуальных вариантов патогенов, которыми являются патогены ракового, бактериального, вирусного или любого другого происхождения.
Описание изобретения
В реализуемом предмете данного изобретения сообщается, впервые, применение белка NMB0928 в качестве компонента вакцинной композиции с терапевтическим или превентивным характером против менингококкового заболевания или любой инфекции, вызываемой членом рода Neisseria.
Новый признак данного изобретения состоит в применении, ранее не сообщаемом, белка NMB0928 в препаратах с новыми свойствами, способных индуцировать системную и мукозную иммунную реакцию защиты широкого спектра, обусловленную консервативным характером этого белка в различных изолятах Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Клонирующий вектор рМ100, используемый в клонировании и экспрессии белка NMB0928. pTrip, промотор триптофана; N-term P64k, N-концевой фрагмент Р-64k; Т4 termibator, терминатор транскрипции фага Т4.
Фигура 2. Конечная конструкция нуклеотидной последовательности гена NMB0928 в векторе рМ100.
Фигура 3. Анализ электрофореза в ДСН-ПААГ фракций, полученных из разрушения клеток; Дорожка 1, супернатант; Дорожка 2, осадок клеток.
Фигура 4. Анализ с применением электрофореза в ДСН-ПААГ процесса солюбилизации белка NMB0928, начинающийся с осадка разрушения клеток: (А) дорожка 1, осадок разрушения клеток; дорожка 2, осадок после промывания 1Х ТЭ-буфером, содержащим 3 М мочевину; дорожка 3, растворимая фракция, полученная из этого промывного раствора; (В) дорожка 1, супернатант солюбилизации 1Х ТЭ-буфером, содержащим 6 М мочевину; дорожка 2, осадок солюбилизации.
Фигура 5. Уровни антител (IgG) против рекомбинантного белка NMB0928, полученные после иммунизации мышей одним и тем же антигеном интраназальным или внутрибрюшинным путем. Представлены результаты ELISA, которые были выражены в виде обратной величины наивысшего разведения, которое удваивает величину неиммунной сыворотки.
Фигура 6. Узнавание посредством Вестерн-блоттинга белка NMB0928, присутствующего в OMV N. meningitidis, с применением сывороток из мышей, иммунизированных рекомбинантным белком: стрелка указывает полосу, соответствующую иммуно-идентифицированному белку NMB0928.
Фигура 7. Реакция в виде антитела IgA против рекомбинантного белка NMB0928, на уровне слизистой оболочки, в мышах, иммунизированных этим антигеном интраназальным путем. Результаты выражены в виде обратной величины наивысшего разведения, которое удваивает величину неиммунной сыворотки. (А) реакция в виде антитела IgA в слюне. (В) реакция антитела IgA в промывках легкого.
Фигура 8. Результаты поисков гомологии между белком NMB0928 ("guery", запрашиваемый белок) и опубликованными последовательностями в геномах из различных серологических групп Neisseria meningitidis ("Sbjct") с применением программы BLAST.
Фигура 9. Узнавание белка NMB0928 в различных штаммах N. meningitidis, с применением сывороток, индуцированных против рекомбинантного антигена. В виде диаграмм показаны только результаты, полученные при использовании полуочищенного белка внутрибрюшинным путем, но подобное поведение наблюдали и в остальных из этих случаев. Результаты выражены в виде обратной величины наивысшего разведения, которое удваивает величину неиммунных сывороток.
Фигура 10. Сравнение среди сывороток, индуцированных иммунизацией белком, полученным двумя способами, введенным внутрибрюшинным путем, в экспериментах с пассивным иммунитетом против менингококковой инфекции, на модели детенышей крыс.
Фигура 11. Узнавание белка NMB0928 и панели неродственных антигенов генерируемыми mAb (mAb Е45-8-15, 2G23-12). Р1, белок класса 1 штамма Neisseria meningitidis В:4:Р1.15; Р64k, субъединица Е3 пируватдегидрогеназы из Neisseria meningitidis; Т.Т., столбнячный токсоид; HBsAg, поверхностный антиген гепатита В.
Фигура 12. Узнавание белка 92 сывороткой реконвалесцентов человека из выживших пациентов с менингококковым заболеванием. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки здоровых доноров. Результаты показаны в виде оптической плотности в анализе типа ELISA.
Фигура 13. Титры антител против пептида JY1 из сывороток животных, иммунизированных либо свободным пептидом (JY1), либо рекомбинантным белком (NMB0928), либо конъюгатом JY1-NMB0928.
Примеры
Пример 1
Детектирование белка NMB0928 в препаратах везикул наружной мембраны Neisseria meningitidis серогруппы В
С целью исследования белков, которые присутствуют в везикулах наружной мембраны Neisseria meningitidis серогруппы В (штамма В:4:Р1.19.15) проводили двумерный электрофорез в соответствии со способом, описанным в другом месте (Gorg A, et al. 1985. Electrophoresis 6:599-604). Затем выполняли ферментативное расщепление на экстрагированных из геля белках с применением трипсина (Promega, Madison, WI, U.S.). Генерируемые после расщепления пептиды экстрагировали в раствор с применением микроколонок (ZipTips, Millipore, MA, U.S.). Для масс-спектрометрического анализа пептиды элюировали из микроколонок 60% ацетонитрилом, 1% муравьиной кислотой с последующим немедленным нанесением в нанонаконечники (Protana, Denmark).
Измерения проводили в масс-спектрометре смешанного типа на основе квадруполя и времени полета (Q Tof-2™, Manchester, United Kingdom), снабженном источником ионизации (nanoESI). Данные масс-спектрометрии получали в диапазоне w/z 400-2000 в 0,98 сек и с применением 0,02 сек между сканами. Получение данных и обработку данных проводили с применением программы MassLynx (Version 3.5, Micromass).
Идентификацию белков на основе данных масс-спектра проводили с применением программы ProFound (Zhang W and Cgait BT. 2000. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). Поиск был адресован генам и полученным последовательностям белков, содержащимся в базе данных (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) и NCBI (http://www.ncbi.nim.nih.gov/), c учетом окисления метионинов, дезамидирования и карбоксиамидометилирования цистеинов в качестве возможных модификаций, которые могут встречаться.
Идентификацию белков на основе масс-спектров проводили с применением программы MASCOT (Perkins DN, et al. 1999. Probability-based protein identification by serching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567. Параметры поиска включали в себя модификации цистеина, а также окисления и дезамидирования.
Начиная от анализа результатов, полученных из индентификации белков, присутствующих в препаратах везикул наружных мембран, белок NMB0928 отбирали для оценки в качестве возможного вакцинного кандидата, из которого один пептид идентифицировали при помощи масс-спектрометрии.
Пример 2
Идентификация продукта гена NMB0928 как липопротеина-34 Neisseria meningitidis
Для идентификации белка NMB0928 выполняли поиск гомологии последовательности в базе данных NCBI с применением программы BLAST (Altschul SF et al. 1990. Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215:403-410, http:/www.ncbi.nlm,nih.gov/BLAST/). Результаты этой процедуры показали гомологию, наряду с соответствующим белком в других серотипах Neisseria, с одним белком в нескольких микроорганизмах, в том числе липопротеином-34, кодируемым геном nipB из Escherichia coli, идентифицированным в 1991 году. Это показывает, что этот белок фракционируется в протеолипосомах наружной мембраны (Bouvier J, Pugsley A.P. and Stragier P. 1991. A gene for new lipoprotein in the dapA-purC interval of E.coli chromosome. J Bacteriol 173(17):5523-31).
Сохранение (консервация) этих белков в геноме нескольких микробных родов привело к их включению в виде группы ортологичных белков в консервативном домене, сообщенном NCBI [gni|CDD|12651, COG3317, NipB, Неохарактеризованный липопротеин (биогенез оболочки клетки, наружная мембрана), которое указывает на существование общего филогенетического предка.
Анализ окружения этих генов, использующий базу данных MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome database for comparative analysis. Nucleic Acids Res. 31, 58-62), выявил существенное сходство в организации этого гена, приведшее к идентификации белка NMB0928 как липопротеина-34 (NipB) Neisseria meningitidis.
Пример 3
Клонирование и экспрессия гена NMB0928, кодирующего белок NMB0928 из N. meningitidis, в Escherichia coli
Для клонирования и экспрессии гена NMB0928 использовали клонирующий вектор рМ-100. Этот вектор позволяет проведение клонирования с применением различных рестрикционных ферментов (рестриктаз) и генерирование высоких уровней экспрессии гетерологичных белков в форме телец включения в E.coli.
Вектор рМ-100 (фигура 1) имеет следующие элементы: промотор тритофана, сегмент гена, кодирующий стабилизирующую последовательность из 47 аминокислот из Nt-фрагмента белка Р64 кДа из штамма N. meningitidis В:4:Р1.19, 15, последовательность терминатора транскрипции бактериофага Т4 и последовательность гена, придающего устойчивость к ампициллину в качестве маркера отбора.
Из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок NMB0928 (пример 1), конструировали два праймера (7740 и 7741) для амплификации этого сегмента данного гена без последовательности, которая кодирует предсказанный сигнальный пептид, из геномной ДНК штамма В:4:Р1.19, 15.
BglII
(SEQ ID NO: 1)
EcoRV
(SEQ ID NO: 2)
Для предсказания сигнального пептида использовали сервер World Wide Web SignalP (http://www.matrixscience.com/)http://www.cbs,dtu.dk/services/SignalP-2.0).
После амплификации гена NMB0928 при помощи ПЦР (Randall K, et al. 1988. Science 42394:487-491) с применением праймеров 7740 и 7741 продукт ПЦР расщепляли рестриктазами BglI и EcoRI и клонировали в предварительно расщепленный клонирующий вектор рМ-100. Конечная конструкция показана на фигуре 2, и белок NMB0928 экспрессируется в виде белка, слитого с Nt-сегментом белка Р64 кДа. Секвенирование клонированного гена NMB0928 проводили с применением автоматического секвенатора ALFexpress (Termo SequenaseТМCyТМ(5 Terminator Kit, Amersham Biosciences) и олигонуклеотидов 1573 (SEQ ID NO:8) и 6795 (SEQ ID NO:9), которые связывают последовательность стабилизатора Р64 и терминатор транскрипции Т4 соответственно. Генерируемая здесь плазмида была названа рМ-242 для ее последующего применения.
Для экспрессии гена NMB0928 штамм E.coli GC366 трансформировали химическим способом плазмидой рМ-242 (фигура 2). Эксперимент по экспрессии проводили в минимальной среде (М9) (Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA), дополненной 1% глицерином, 1% гидролизатом казеина, 0,1 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4 и 50 мкг/мл ампициллина. Бактериальные культуры инкубировали 12 часов при 37°С и 250 об/мин. Выращенные культуры центрифугировали и выполняли разрушение ультразвуком клеточного осадка (IKA LABORTECHNIK). Фракции из осадка и супернатанта анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ (Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 277:680) и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250. Процент экспрессии определяли проведением денситометрии геля (LKB Bromma 2202 Ultrascan laser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, United Kingdom). Белок NMB0928 получали из фракции осадка, и он составлял приблизительно 60% общего содержания белка этой фракции (фигура 3). Осадок промывали 1xТЭ-буфером (10 мМ Трис-гидроксиметиламинометан, 1 мМ этилдиаминотетрауксусная кислота, рН 8), содержащим 2 М мочевину, и некоторые примеси переходили в супернатант, а белок NMB0928 оставался в осадке (фигура 4А). Затем этот осадок солюбилизировали 1xТЭ-буфером, содержащим 6 М мочевину, и этот рассматриваемый белок переходил в растворимую фракцию, которую диализовали против 1х ТЭ-буфера с получением конечного препарата с чистотой 70%, как это можно видеть на фигуре 4В.
Пример 4
Оценка иммунной реакции, индуцируемой после иммунизации белком NMB0928 внутрибрюшинным и интраназальным путями
Для оценки иммуногенности белка NMB0928 проектировали и проводили эксперимент по иммунизации на мышах, где один и тот же белок вводили двумя различными способами. Первый состоял в экстракции полосы из полиакриламидного геля (Castellanos L, et al. 1996. A procedure for protein elution from reverse-stained polyacrylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electroforesis 17: 1564-1572), а второй был описан в примере 3, и этот продукт был назван полуочищенным белком.
Этими препаратами иммунизировали самок мышей Balb/c (8-10-недельных) после разделения на 4 группы из 8 мышей каждая. Три иммунизации выполняли интраназальным или внутрибрюшинным путем с 15-дневным интервалом между ними. Белок, вводимый внутрибрюшинным путем, был эмульгирован адъювантом Фрейнда. В таблице 1 описана композиция для этих групп.
| Таблица 1 | |||
| Группы мышей Balb/с, используемых для иммунизации | |||
| Группы | Белок, экстрагированный из геля | Полуочищенный белок | Путь |
| 1 | 50 мкг | -- | в/н |
| 2 | -- | 50 мкг | в/н |
| 3 | 10 мкг | -- | в/б |
| 4 | -- | 10 мкг | в/б |
Титры антител (IgG) против рекомбинантного белка и гомологичного белка, присутствующего в бактерии, определяли при помощи ELISA в пробах сыворотки, взятых после третьей инокуляции. На фигуре 5 показаны титры антител против рекомбинантного белка отдельных животных. Уровни антител определяли после второй инокуляции, хотя они были более высокими после третьей инокуляции. Кроме того, выполняли иммуноидентификацию при помощи Вестерн-блоттинга, где узнавали полосу соответствующего белка. Группы, иммунизированные внутрибрюшинным путем, имели титры, значимо более высокие, чем титры, индуцируемые интраназальным путем.
Для статистического анализа этих результатов использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса вследствие негомогенности дисперсии в этих группах в соответствии с критерием Бартлетта. Критерий множественного сравнения Дунна использовали для сравнения средних значений каждой обработки.
Сыворотки, полученные после иммунизации рекомбинантным белком, узнавали природный белок, присутствующий в препарате белка наружной мембраны (ОМР) штамма CU385. Эти результаты представлены на фигуре 6.
Для анализа реакции слизистой оболочки оценивали пробы слюны и промывки легких. Фигура 7 показывает только группы, иммунизированные интраназальным путем. Наблюдали увеличение титра IgA в группе, получавшей полуочищенный белок.
Пример 5
Характеристика последовательности гена, кодирующего белок NMB0928, в различных штаммах N. meningitidis
Для анализа сохранения последовательности гена, кодирующего белок NMB0928, в патогенных видах рода Neisseria выполняли поиск сходства с геномами Neisseria meningitidis (сергруппами А, В и С) и Neisseria gonorrhoeae, опубликованными в базе данных NCBI (NC 003116.1, NC 003112.1, NC 003221, NC 002946 SANGER 135720|Contig1), с применением программы BLAST (Altschul SF et al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Фигура 8 показывает результаты сравнения последовательности для этих последовательностей, которые дают значимое сопоставление в каждом из анализируемых генов. Эти последовательности имеют 98% идентичность в серогруппах А и С, 99% идентичность в серогруппе В и 96% идентичность с Neisseria gonorrhoeae с последовательностью, полученной для гена, которая кодирует белок NMB0928 (SEQ ID NO:3). Кроме того, последовательность указанного гена определяли для 3 Кубинских изолятов (SEQ ID NO:5-7), которые принадлежат к серогруппе В (В:4:Р1. 19,15), и сопоставление последовательностей выполняли с применением программы ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Результаты этого сопоставления показывают, что имеется высокое сохранение (консервативность) в нуклеотидной последовательности гена NMB0928 среди анализируемых штаммов.
Применение белка NMB0928 в качестве вакцинного кандидата, с учетом высокой степени сходства, существующей среди вышеупомянутых последовательностей, позволило бы вызывать эффективную иммунную реакцию с защитой широкого спектра (вследствие перекрестной реактивности) против менингококкового заболевания.
Пример 6
Характеристика иммунной реакции с широким спектром действия, индуцируемой иммунизацией мышей Balb/с белком NMB0928
Для оценки, индуцирует ли иммунизация белком NMB0928 реакцию, широко перекрестно-реактивную с другими штаммами Neisseria, выполняли анализ ELISA. Полистироловые планшеты покрывали целыми клетками 7 штаммов Neisseria, которые принадлежат к различным серологическим типам и серологическим подтипам. Эти планшеты инкубировали с объединенными сыворотками, полученными против белка NMB0928, двумя способами иммунизации, как описано в примере 4.
Фигура 9 показывает результаты, полученные с сыворотками, индуцированными против полуочищенного белка, вводимого внутрибрюшинным путем. Как видно, эти иммунные сыворотки узнавали белок, присутствующий в различных штаммах, причем уровни были сходными с уровнем, обнаруженным в штамме CU385. Остальные сыворотки имели сопоставимую реакцию в этом анализе.
Пример 7
Защита, индуцированная мышиными сыворотками, специфическими в отношении белка NMB0928, против гомологичного и гетерологичного штаммов, на модели детенышей крыс
Для определения функциональной активности полученных антисывороток анализ защиты проводили на модели менингококковой инфекции детенышей крыс. Двадцать четыре крысы (5-6-дневные) делили на группы по 6 крыс каждая.
Определяли, защищали ли сыворотки, вводимые внутрибрюшинным путем, крыс от инфекции, вызываемой бактериями (штамма CU385), инокулированными тем же самым путем спустя один час. Сыворотки каждой группы объединяли и разводили 1/10 (в стерильном ЗФР) перед инокуляцией их крысам-детенышам. Спустя четыре часа у животных брали пробы и подсчитывали жизнеспособные бактерии в их крови.
Для интерпретации этих результатов выполняли дисперсионный анализ (Anova) с последующим критерием множественного сравнения Дюннета, в котором эти тест-группы сравнивали с отрицательным контролем. Как видно на фигуре 10, группы, которые получали антисыворотки против белка NMB0928, демонстрируют статистически значимые различия с негативным контролем и поэтому они считаются в этой модели защитными.
Подобный анализ выполняли с инфицированием детенышей крыс штаммами М982 и 120/90, выделенными из организма кубинских пациентов, серологическая классификация которых является гомологичной относительно штамма В385. Кроме того, эксперименты по иммунизации проводили с применением штамма 233 (С:2a: P1.5) из серогруппы С и штамма Н44/76 (В:15:P1.7, 16) из серогруппы В. Во всех случаях эти антисыворотки защищали детенышей крыс против менингококковой инфекции.
Пример 8
Генерирование моноклонального антитела против белка NMB0928, способного опосредовать бактерицидную активность против Neisseria meningitidis
Для генерирования моноклональных антител (mAb), специфических против белка NMB0928, и изучения функциональной способности опосредования бактерицидной активности против гомологичного и гетерологичного штамма N. meningitidis проводили схему иммунизации препаратом белка NMB0928 с чистотой, более высокой чем 70% (пример 3). Иммунизацию выполняли в Balb/c (Н-2d, самках, 5-6-недельных) и 4 дозы вводили следующим образом: в дни 0, 15 и 30 обычной иммунизации, 10 мкг антигена NMB0928 на мышь (общий объем 100 мкл) вводили подкожным путем, в виде эмульсии адъювантом Фрейнда; в день 50 10 мкг антигена на мышь в забуференном фосфатом солевом растворе (140 мМ NaCl, 270 мМ KCl, 1,5 мМ КН2РО4, 6,5 мМ Na2НРО4 x2Н2О, рН 7,2) вводили внутрибрюшинным путем. Извлечения крови выполняли в дни 0 и 45.
Спленоциты от животного с наивысшим титром, измеренным непрямым анализом ELISA, с применением белка NMB0928 в качестве антигена покрытия (пример 3), сливали с миеломными мышиными клетками Х63 Ag8 653. Полученные гибридомы выделяли и подвергали скринингу в соответствии со стандартными процедурами (Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoria y Practica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).
Реактивность антител, секретируемых гибридомами, направленными на белок NMB0928, а также их перекрестную реактивность с неродственными антигенами, тестировали непрямым ELISA с применением 5 мкг/мл каждого антигена и одной и той же концентрации каждого из анализируемых mAb. Фигура 11 показывает результаты, полученные в этом эксперименте, где были в целом 2 положительных клона (mAb Е45-8-15 и 2G23-12), которые специфически узнавали белок NMB0928 и не реагировали ни с аминокислотной последовательностью, соответствующей N-концу Р64k, ни с остальными неродственными антигенами.
Для определения способности mAb, генерированных против белка NMB0928, опосредовать бактериальную реакцию против гомологичного и гетерологичного штаммов Neisseria meningitidis, выполняли бактерицидный тест. Титр бактерицидного антитела выражали в виде обратной величины наивысшего разведения тестируемых антител, которое было способно убивать 50% или более бактерий; mAb 2G23-12 имело бактерицидные титры, более высокие чем 1:128, против гомологичного штамма В:4:Р1.19,15 и более высокие чем 1:64 против гетерологичных штаммов В:15:Р1.7,16 и С:2а:Р1.5.
Пример 9
Характеристика районов-мишеней мышиной иммунной реакции против белка NMB0928
Для идентификации районов в белке, которые более часто узнаются мышиными антисыворотками, генерированными против рекомбинантного антигена, выполняли анализ SPOTScan. Ряд перекрывающихся пептидов, которые охватывают последовательность этого белка, синтезировали на целлюлозной мембране, которую инкубировали с объединенными сыворотками, разведенными 1:100. Реакцию антиген-антитело детектировали инкубированием с конъюгатом антимышиный иммуноглобулин G-щелочная фосфатаза с последующим добавлением раствора, который содержал субстрат бромхлориндолилфосфат.
Наблюдали несколько антигенных районов, общих в этом белке, независимо от препарата, который использовали для иммунизации. Однако в группах, иммунизированных белком с адъювантом Фрейнда, была гораздо более широкая картина узнавания.
Пример 10
Узнавание белка NMB0928 сыворотками человека
Коллекцию сывороток человека, происходящих из реконвалесцентных индивидуумов, использовали в этом исследовании, которое выполняли при помощи ELISA. Планшеты покрывали белком NMB0928, полученным препаративным электрофорезом (5 мкг/мл). После блокирования этих планшетов 3% обезжиренным сухим молоком в ЗФР, содержащим Твин-20, эти сыворотки разводили (1:50) в том же самом растворе и инкубировали в планшетах. Этот иммуноанализ продолжали, как это было сообщено ранее. Сыворотки здоровых доноров использовали в качестве отрицательных контролей. Кроме того, объединенные сыворотки из индивидуумов, вакцинированных рекомбинантной вакциной против гепатита В, использовали в качестве неродственного контроля (данные не показаны).
Фигура 12 показывает результаты, полученные с 5 сыворотками реконвалесцентов в этом анализе. Можно видеть, что эти сыворотки человека узнавали этот белок, что свидетельствует о том, что он экспрессируется во время менингококковой инфекции и он является иммуногенным.
Уточненный Пример 11
Пример 11
Белок NMB0928 в качестве носителя для пептида и полисахарида
Чтобы продемонстрировать функциональную активность рекомбинантного белка NMB0928 в качестве переносчика, его сначала конъюгировали с 15-членным синтетическим пептидом, полученным из V3-области белка gp120 ВИЧ-1, изолят JY1. Конъюгирование осуществляли с использованием глутаральдегидного способа.
Свободный пептид JY1, рекомбинантный белок NMB0928 и конъюгат JY1-NMB0928 вводили взрослым мышам по схеме, насчитывающей 3-кратное введение в составе дозировок, где иммуногены эмульгировали с адъювантом Фрейнда. Через две недели после введения третьей дозы у иммунизированных животных получали образцы сыворотки, и их анализировали, используя метод ELISA, с целью определения титров антител против пептидов. Для этого планшеты покрывали свободным пептидом (20 мкг/мл), и осуществляли иммунный анализ, как это было описано прежде. Полученные в данном эксперименте результаты (Фигура 13) свидетельствуют о способности белка NMB0928 функционировать в качестве носителя, способного, после его конъюгации с пептидом JY1, существенно усиливать антительный ответ против указанного пептида.
Кроме того, белок NMB0928 конъюгировали с полисахаридным антигеном, выбранным в качестве модельного вакцинного антигена. Капсулярный полисахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC) был конъюгирован с NMB0928, с использованием дигидразина адипиновой кислоты и карбодиимидного метода. Сразу же по завершении процедуры конъюгирования конъюгат очищали путем гель-фильтрации на колонке, набитой Сефарозой CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech). В полученном в результате конъюгате отношение полисахарида к белку составляло порядка 1,25 мг полисахарида MenC/мг белка NMB0928.
С целью иммунизации мышам подкожным путем вводили три дозы MenC (2,5 мкг), NMB0928 (3 мкг) или MenC-NMB0928 (2,5 мкг MenC/дозу), абсорбированных на гидроокиси алюминия. Во всех случаях иммунизацию производили в объеме 100 мкл в дни 0, 14 и 28. Образцы сыворотки отбирали вначале эксперимента и на 15 день после каждой из иммунизации. Эти образцы хранили, а затем подвергали анализу на предмет определения титров антител против MenC. Результаты, которые были получены, суммированы в таблице 2. Из таблицы следует, что уже после введения первой дозы в группе, иммунизированной конъюгатом, достигались более высокие титры. Уровни антител продолжали возрастать после введения второй дозы, и уровень этот стабильно удерживался после введения третьей дозы.
| Таблица 2 | |||
| Титры антител против MenC в суммарных мышиных сыворотках, полученных у иммунизированных мышей | |||
| День взятия образца сыворотки | Иммуноген | ||
| MenC | NMB0928 | MenC-NMB0928 | |
| 14 | 250 | 114 | 450 |
| 28 | 345 | 123 | 5634 |
| 42 | 352 | 170 | 1935 |
Таким образом, суммируя результаты экспериментов по иммунизации, можно смело утверждать, что белок NMB0928 существенно повышал титры антител как против пептидного антигена, так и против полисахаридного антигена.
Пример 12
Присутствие антигена NMB0928 в нескольких бактериях из рода Neisseria и демонстрация их перекрестной реактивности.
Прежде всего было выполнено выравнивание генов NMB0928 Neisserial. Последовательности были взяты из опубликованных данных по геномам Neisseria. Выравнивали следующие последовательности: Neisseria meningitidis MC58, Neisseria meningitidis Z2491, Neisseria meningitidis FAM18, Neisseria gonorrhoeae FA1090. Ниже представлены результаты выравнивания, из которых следует, что высокая степень гомологии наблюдается не только между генами, обнаруживаемыми в нескольких штаммах N.meningitidis, но также и между генами, обнаруживаемыми в штаммах N.meningitidis и N.gonococci. Соответственно, антиген NMB0928 можно расценивать - а также исследовать - в качестве защитного антигена для борьбы с заболеваниями, вызываемыми целым рядом разных штаммов, относящихся к одному и тому же роду бактерий
Кроме того, чтобы подтверить наличие указанного антигена в нескольких штаммах Neisseria, были проведены эксперименты на основе цельноклеточного анализа ELISA [Whole Cell ELISA, (WCE)].
Для экспериментов WCE различные изоляты Neisseria культивировали в системе Brain Heart Infusion agar plates, и собранные в результате культивирования цельные клетки были использованы для покрытия планшетов полученной клеточной суспензией. После запаивания планшеты инкубировали в присутствии суммарной антисыворотки мышей, полученной в результате иммунизации мышей тремя дозами рекомбинантного антигена в сочетании с тремя различными адъювантами. После того как эксперименты по ELISA были завершены, результаты были представлены в виде титров антител, и эти результаты суммированы в представленной ниже Таблице 3. Как видно из таблицы, антисыворотка реагировала с антигенами во всех исследуемых штаммах, включая штамм N.lactamica.
Таблица 3. Распознавание различных изолятов Neisseria в цельноклеточном анализе ELISA, в котором были использованы суммарные антисыворотки из каждой группы.
| Группа | 32Р/92 (В:4:Р1.19,15) | Н44/76 (В:4:Р1.7,16) | N.lactamica | NZ124 (В:4:Р1.7,4) | M982 (B:9:P1.9) | С233 (В:2а:Р1.5) |
| 1 | 17989.05 | 15683.09 | 13453.43 | 15462.80 | 13782.32 | 14386.25 |
| 2 | 20724.00 | 16943.23 | 15354.63 | 16254.54 | 15724.03 | 14927.32 |
| 3 | 24103.05 | 20333.05 | 16472.93 | 17564.02 | 12326.45 | 14623.46 |
Результаты, полученные в исследованиях, проведенных методом WCE, дают возможность сделать заключение, что антиген NMB0928 является консервативным во всех исследованных штаммах Neisseria, которые относятся к роду Neisseria meningitidis и Neisseria lactamica. Более того, антитела против антигена, присутствующего у одного вида, способны перекрестно реагировать с антигеном, присутствующим не только у различных изолятов, но даже и у различных видов-представителей Neisseria.
Пример 13
Получение композиций, содержащих рекомбинантный полипептид NMB0928, отдельно или в сочетании с несколькими антигенами.
Для указанной цели было получено несколько композиций. На основе фармацевтически активного ингредиента были получены две жидкие композиции, содержащие соответственно 20 и 50 мкг NMB0928 на дозу. Эти композиции содержали также 0,5 мг/мл гидроокиси алюминия, 1,12 мг/мл гидрофосфата натрия, 1,10 мг/мл моногидратдигидрофосфата натрия, 8,0 мг/мл хлористого натрия и 0,05 мг/мл тиомерсала (эксципиенты). Третью композицию получали, добавляя 0,5 мг/мл алюминийфосфата вместо гидроокиси алюминия. Четвертую композицию получали, добавляя указанные выше компоненты, а кроме того, менингококковый капсулярный полисахарид из серогруппы С (MenC) в концентрации 50 мкг/мл. Пятую композицию получали, полностью заменяя полисахаридный С-компонент тем же самым сахаридом, конъюгированным с белком P64k, менингококковым антигеном, о котором ранее сообщалось как об эффективном носителе слабых антигенов. MenC конъюгировали с P64k через дигидразид адипиновой кислоты, используя карбодиимидный метод. Концентрацию конъюгата доводили до 2 мкг Р64k/дозу. Шестая композиция содержала, помимо рекомбинантного белка и указанных эксципиентов, пептид с последовательностью IPGVAYTSPEVAWVGETELSAKASA, который содержит Т-клеточный эпитоп белка P64k. Концентрацию пептида поддерживали на уровне 10 мкг на дозу.
В результате получали стабильную лиофилизированную композицию. Композиция содержала NMB0928 (2-5 мг/мл). Композиция содержала также буферную систему на основе фосфата, ацетата, цитрата или цитрат-фосфата с ионной силой от 0,1 до 100 мМ для поддержания рН в интервале от 4,5 до 7,4. Композиция включает в себя эффективное количество ЭДТА в качестве хелатобразующего агента в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл, а также количество сахара, сахарного спирта, неионного детергента или аминокислоты, или их смеси для стабилизации белков в плане поддержания степени их чистоты и биологической активности. Такими ингредиентами могут быть сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, маннит, сорбит, полисорбат 20, полисорбат 80, цистеин, аланин, глицин и гистидин в концентрации от 0,01 до 100 мг/мл. В конце в композицию добавляли эффективное количество наполнителя, выбранного из полиэтиленгликоля (ПЭГ), маннита, декстрана и глицина в концентрации от 1 до 100 мг/моль. В составе этой композиции белок, описанный в настоящем изобретении, обладал стабильностью, определяемой на основании анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии, в течение по меньшей мере 12 месяцев как при 4°С, так и при 28°С.
Вариант лиофилизированной композиции:
Белок NMB0928: 4 мг/мл
ЭДТА Na2×2H2O: 0,5 мг/мл
Сорбит: 10 мг/мл
ПЭГ 6000: 4 мг/мл
Полисорбат 80: 0,02 мг/мл
Na2HPO4: 6,34 мг/мл
NaH2PO4×2H2O: 1,72 мг/мл
Claims (12)
1. Белок N.meningitidis, названный NMB0928, отличающийся тем, что является антигеном, способным вызывать в организме реципиента защитную реакцию против инфекций, вызванных бактериями из рода Neisseria, и имеет аминокислотную последовательность, идентифицируемую в списке последовательностей как SEQ ID NO:4.
2. Ген NMB0928, отличающийся тем, что имеет последовательность оснований, идентифицируемую в списке последовательностей как SEQ ID NO:3, и кодирует белок по п.1.
3. Белок по п.1, полученный с помощью методов рекомбинантной технологии или химического синтеза.
4. Применение белка, идентифицируемого в списке последовательностей как SEQ ID NO:4, или его фрагмента в фармацевтической композиции для профилактики инфекций, вызванных бактериями из рода Neisseria.
5. Применение по п.4 для профилактики заболевания, вызванного Neisseria meningitidis или Neisseria gonorrhoeae.
6. Применение по п.4, где белок NMB0928 комбинируют с антигенами различной антигенной природы, полученными рекомбинантным путем, синтетическим путем или продуцируемыми природным путем.
7. Применение по п.6, где белок NMB0928 комбинируют с полисахаридными антигенами.
8. Применение по п.7, где иполисахаридный антиген является капсулярным полисахаридом N.meningitidis.
9. Применение по п.6, где белок NMB0928 комбинируют с полисахарид-белковыми конъюгатами, полисахаридный фрагмент которых соответствует бактериальному полисахариду.
10. Применение по п.6, где белок NMB0928 комбинируют с пептидными антигенами.
11. Применение по п.4, согласно которому композицию вводят парентеральным путем или через слизистую.
12. Применение белка, идентифицируемого в списке последовательностей как SEQ ID NO:4, в качестве носителя антигенов различной природы.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CUCU2003/0286 | 2003-12-03 | ||
| CU2002008620030286A CU23236A1 (es) | 2003-12-03 | 2003-12-03 | PROTEINA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACéUTICAS P |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006123414A RU2006123414A (ru) | 2008-01-10 |
| RU2335505C2 true RU2335505C2 (ru) | 2008-10-10 |
Family
ID=40091627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006123414/13A RU2335505C2 (ru) | 2003-12-03 | 2004-12-02 | Белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070128230A1 (ru) |
| EP (1) | EP1693379B1 (ru) |
| KR (1) | KR20060124625A (ru) |
| CN (1) | CN100549027C (ru) |
| AR (1) | AR046937A1 (ru) |
| AT (1) | ATE456573T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004294377A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0417334A (ru) |
| CA (1) | CA2547537A1 (ru) |
| CU (1) | CU23236A1 (ru) |
| DE (1) | DE602004025377D1 (ru) |
| NO (1) | NO20063017L (ru) |
| NZ (1) | NZ547521A (ru) |
| RU (1) | RU2335505C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005054282A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200604492B (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CU23549A1 (es) * | 2005-12-29 | 2010-07-20 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composiciones farmacéuticas que contienen la proteína nma0939 |
| CU23575A1 (es) * | 2006-03-31 | 2010-09-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composición farmacéutica que comprende la proteína nmb0606 |
| CU23572A1 (es) * | 2006-03-31 | 2010-09-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composición farmacéutica que comprende la proteína nmb0938 |
| ES2974992T3 (es) | 2016-09-02 | 2024-07-02 | Sanofi Pasteur Inc | Vacuna contra Neisseria meningitidis |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4219821A1 (de) * | 1992-06-17 | 1993-12-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Spezifischer Nachweis von Neisseria Gonorrhoeae |
| CU22559A1 (es) * | 1996-01-17 | 1999-05-03 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión |
| DK1093517T3 (da) * | 1998-05-01 | 2008-06-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseria-meningitidis-antigener og præparater |
| RU2281956C2 (ru) * | 1999-10-29 | 2006-08-20 | Чирон С.Р.Л. | Антигенные пептиды neisseria |
| GB9928196D0 (en) * | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
-
2003
- 2003-12-03 CU CU2002008620030286A patent/CU23236A1/es unknown
-
2004
- 2004-12-01 AR ARP040104482A patent/AR046937A1/es unknown
- 2004-12-02 NZ NZ547521A patent/NZ547521A/xx unknown
- 2004-12-02 DE DE602004025377T patent/DE602004025377D1/de active Active
- 2004-12-02 CA CA002547537A patent/CA2547537A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 WO PCT/CU2004/000016 patent/WO2005054282A1/es active Application Filing
- 2004-12-02 AT AT04802608T patent/ATE456573T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-12-02 US US10/580,888 patent/US20070128230A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 CN CNB2004800358798A patent/CN100549027C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-02 EP EP04802608A patent/EP1693379B1/en active Active
- 2004-12-02 AU AU2004294377A patent/AU2004294377A1/en not_active Abandoned
- 2004-12-02 BR BRPI0417334-1A patent/BRPI0417334A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-12-02 KR KR1020067011597A patent/KR20060124625A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-12-02 RU RU2006123414/13A patent/RU2335505C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-01 ZA ZA200604492A patent/ZA200604492B/en unknown
- 2006-06-28 NO NO20063017A patent/NO20063017L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20070128230A1 (en) | 2007-06-07 |
| NO20063017L (no) | 2006-09-01 |
| CN100549027C (zh) | 2009-10-14 |
| DE602004025377D1 (de) | 2010-03-18 |
| NZ547521A (en) | 2009-07-31 |
| CN1890261A (zh) | 2007-01-03 |
| RU2006123414A (ru) | 2008-01-10 |
| CU23236A1 (es) | 2007-09-26 |
| AR046937A1 (es) | 2006-01-04 |
| BRPI0417334A (pt) | 2007-03-27 |
| KR20060124625A (ko) | 2006-12-05 |
| ATE456573T1 (de) | 2010-02-15 |
| EP1693379A1 (en) | 2006-08-23 |
| CA2547537A1 (en) | 2005-06-16 |
| AU2004294377A1 (en) | 2005-06-16 |
| WO2005054282A1 (es) | 2005-06-16 |
| ZA200604492B (en) | 2007-05-30 |
| EP1693379B1 (en) | 2010-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2335505C2 (ru) | Белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях | |
| EP2011511A2 (en) | Pharmaceutical composition containing the nmb0938 protein | |
| RU2336900C2 (ru) | Белок nmb1125 и его применение в фармацевтических композициях | |
| EP1977761A2 (en) | Pharmaceutical compositions containing protein nma0939 | |
| EP2168595A1 (en) | Pharmaceutical compositions containing the protein nmb1796 | |
| EP2011509A2 (en) | Pharmaceutical composition containing the nmb0606 protein | |
| MXPA06006267A (en) | Protein nmb0928 and use thereof in pharmaceutical formulations | |
| MXPA06006266A (en) | Protein nmb1125 and use thereof in pharmaceutical formulations | |
| MX2008008580A (en) | Pharmaceutical compositions containing protein nma0939 | |
| WO2009056075A1 (es) | Composición farmacéutica que comprende la proteína nmb0873 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20101203 |