RU2108386C1

RU2108386C1 - Recombinant granulocyte-colony-stimulating factor (g-csf) without additional methionine residue at n-terminus

Info

Publication number: RU2108386C1
Application number: RU95121597A
Authority: RU
Inventors: Ф.Мейер Томас; Полнер Йоханнес; Шумахер Гюнтер; Доню Карола
Original assignee: Макс-Планк-Гезельшафт Цур Фердерунг дер Виссеншафтен е.ф.
Priority date: 1990-02-03
Filing date: 1991-02-01
Publication date: 1998-04-10
Also published as: DE4039415A1; LTIP1543A; LT4034B; ZA91752B

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to methods of proteins splitting using IgA-proteases, in part, to methods of production of recombinant proteins or polypeptides in procaryotic organisms with possibility the following removal of N-terminal sequence. Recombinant granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF) with additional methionine residue at N-terminus is prepared by splitting the fused protein with IgA-protease. G-CSF is expressed in E. coli cells and this protein has recognition site located between N-terminal methionine and amino acid sequence of G-CSF. EFFECT: improved method of protein splitting.

Description

Изобретение относится к способам специфического расщепления полученных биотехнологией протеинов с применением IgA-протеаз (называемых также игазами) и особенно к способам получения в прокариотах рекомбинантных протеинов или полипептидов с возможностью последующего удаления N-концевой последовательности. The invention relates to methods for specific cleavage of proteins obtained by biotechnology using IgA proteases (also called igases), and especially to methods for producing recombinant proteins or polypeptides in prokaryotes with the possibility of subsequent removal of the N-terminal sequence.

Получение протеинов методом биотехнологии осуществляют с применением микроорганизмов, которые легко культивируются и позволяют простым путем получать протеин. Подходящими микроорганизмами являются для этого, например, грамотрицательная бактерия Escherichia coli, грамположительная бактерия Streptococcus carnosus и хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Однако, экспрессия аутентичных чужеродных генов в таких микроорганизмах часто имеет недостатки. Например в E. coli условия трансляции приводят к появлению аминоконцевого остатка метионина, который у гомологичных протеинов в большинстве случаев эффективно отщепляется. Однако при получении чужеродных белков это отщепление первого остатка метионина проводится в большинстве случаев дополнительно. Подходящим методом является получение таких протеинов сначала в форме слитых протеинов и затем их расщепление при помощи определенной последовательно-специфической протеазы. Obtaining proteins by biotechnology is carried out using microorganisms that are easily cultivated and allow a simple way to obtain protein. Suitable microorganisms are, for example, the gram-negative bacterium Escherichia coli, the gram-positive bacterium Streptococcus carnosus and the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the expression of authentic foreign genes in such microorganisms often has drawbacks. For example, in E. coli, translation conditions lead to the appearance of an amino-terminal methionine residue, which in homologous proteins is effectively cleaved in most cases. However, upon receipt of foreign proteins, this cleavage of the first methionine residue is carried out additionally in most cases. A suitable method is to obtain such proteins first in the form of fusion proteins and then their cleavage using a specific sequentially specific protease.

Кроме того, в противоположность аутентичным протеинам такие слитые протеины имеют то преимущество, что они укрупняются в клетке микроорганизма и образуют плотные тела включения ("Inclusion Bodies"), которые легко можно отделить от других частей клетки и тем самым облегчить выделение и очистку желаемого протеина. С другой стороны, протеины-носители, которые при помощи способов генной инженерии прежде всего сливаются с собственно желательным протеином, придают слитому с ними партнеру особую устойчивость против неспецифического протеолитического расщепления; проблема расщепления полипептидов, являющихся чужеродными для клетки, особенно важна при биотехнологическом получении малых пептидов. Некоторые протеины-носители позволяют распределять желательные протеины в определенных участках клеток, из которых их можно особенно легко очищать и где они особенно стабильны и/или где они доступны для испытательных целей. Наконец, протеины-носители могут иметь также специальные свойства, которые позволяют проводить эффективную очистку, например, хроматографией сродства. Для многих целей применения предпочитают слившиеся протеины, которые несут протеин-носитель на аминоконце и желательный протеин на карбоксильном конце. Но в определенных случаях может быть также желательным обратный вариант или связывание желательного протеина с двумя партнерами слияния. Может быть выгодным также обратное повторение желательного протеина в пределах слияния. In addition, in contrast to authentic proteins, such fusion proteins have the advantage of being enlarged in a microorganism cell and forming dense inclusion bodies ("Inclusion Bodies") that can be easily separated from other parts of the cell and thereby facilitate the isolation and purification of the desired protein. On the other hand, carrier proteins, which, using genetic engineering methods, primarily merge with the desired protein itself, give the partner fused with them a special resistance against non-specific proteolytic cleavage; the problem of cleavage of polypeptides that are foreign to the cell is especially important in the biotechnological production of small peptides. Some carrier proteins make it possible to distribute the desired proteins in certain areas of the cells from which they can be especially easily purified and where they are particularly stable and / or where they are available for testing purposes. Finally, carrier proteins may also have special properties that allow efficient purification, for example, by affinity chromatography. For many uses, fusion proteins that carry a carrier protein at the amino terminus and a desired protein at the carboxyl end are preferred. But in certain cases, the inverse or binding of the desired protein to two fusion partners may also be desirable. It may also be advantageous to reverse the desired protein within the fusion.

Для получения желательного протеина в свободной форме из подобного слияния необходимо отщепление ковалентно связанных партнеров друг от друга. В принципе, этого можно достигнуть при помощи химических или биохимических (ферментативных) способов. Однако при этом в большинстве случаев имеют место ограничения, связанные с тем, что для получения желательного протеина важно, чтобы подобное расщепление происходило в последовательности между партнерами слияния, т. е. в переходной области, но ни в коем случае дополнительно внутри самого желательного протеина. Поэтому расщепление партнеров слияния должно быть высокоспецифичным. To obtain the desired free-form protein from such a fusion, covalently bound partners are to be cleaved from each other. In principle, this can be achieved using chemical or biochemical (enzymatic) methods. However, in most cases, there are limitations associated with the fact that, in order to obtain the desired protein, it is important that such cleavage occurs in the sequence between the fusion partners, i.e., in the transition region, but in no case additionally inside the desired protein itself. Therefore, the cleavage of the merger partners must be highly specific.

Применяемыми до сих пор химическими способами для специфического в отношении определенной последовательности разделения слившихся протеинов являются, например, расщепление бромцианом по аминокислоте метионину внутри протеина и расщепление между аминокислотами Asp• ! • Pro в кислой среде с применением муравьиной кислоты. Но эти способы пригодны только в том случае, если специфическое место расщепления в желательном протеине имеется только в переходной области и не повторяется второй раз. Однако, в общем, биохимические способы расщепления следует предпочитать химическим способам, так как первые в большинстве случаев можно осуществлять при физиологических или по крайней мере при химически мягких условиях реакции, которые не причиняют ущерба желательному протеину. The chemical methods used so far for a sequence-specific separation of fused proteins are, for example, cleavage of amino acid bromine with methionine inside a protein and cleavage between amino acids Asp •! • Pro in an acidic environment using formic acid. But these methods are only suitable if the specific cleavage site in the desired protein is only in the transition region and is not repeated a second time. However, in general, biochemical methods of cleavage should be preferred to chemical methods, since the former can in most cases be carried out under physiological or at least chemically mild reaction conditions that do not prejudice the desired protein.

Биохимические способы расщепления слитых протеинов основываются на применении по возможности специфических протеаз. Например, трипсин расщепляют следующие за аминокислотами аргинин или лизин пептидные связи внутри протеинов. Повышение специфичности может быть достигнуто предшествующей химической модификацией аминокислоты Lys, в результате чего специфическое распознавание можно ограничить аминокислотой аргинин. Другой примененной в биотехнологии протеазой является Клострипаин; этот фермент расщепляет пептидные связи между аминокислотой аргинин и любой следующей за ним аминокислотой. Обзор о применяемых до сих пор ферментативных способах для расщепления слитых протеинов был составлен F. A. O. Marston (В [D.M. Glover, E.]: DNA cloning III, IRL PRESS Оксфорд и Вашингтон DC, 1987). Ферментативные способы расщепления ограничены тем, что специфическая для точки расщепления аминокислота (аминокислоты) могут встречаться одновременно также в самом желательном протеине. Поэтому для биохимического расщепления слияний протеинов пригодны особенно ферменты, которые при расщеплении распознают не только аминокислоту, но и последовательность аминокислот; при этом вероятность того, что определенная последовательность аминокислот кроме нахождения в точке расщепления между партнерами слияния встречается еще раз в самом желательном протеине тем незначительнее, чем больше число аминокислот, необходимых для распознавания и расщепления. Biochemical methods for the breakdown of fusion proteins are based on the use of specific proteases, if possible. For example, trypsin cleaves peptide bonds following the amino acids arginine or lysine within proteins. An increase in specificity can be achieved by the previous chemical modification of the Lys amino acid, as a result of which specific recognition can be limited to the amino acid arginine. Another protease used in biotechnology is Clostripain; this enzyme cleaves peptide bonds between the amino acid arginine and any amino acid that follows it. A review of the enzymatic methods used so far for cleavage of fusion proteins was prepared by F. A. O. Marston (In [D.M. Glover, E.]: DNA cloning III, IRL PRESS Oxford and Washington DC, 1987). Enzymatic cleavage methods are limited in that the cleavage point-specific amino acid (s) can occur simultaneously also in the most desirable protein. Therefore, enzymes are especially suitable for biochemical cleavage of protein fusions, which upon cleavage recognize not only an amino acid, but also a sequence of amino acids; the probability that a certain amino acid sequence, besides being at the cleavage point between the fusion partners, is found once again in the most desirable protein, the smaller the greater the number of amino acids necessary for recognition and cleavage.

Список последовательно-специфических протеаз, которые применяются в настоящее время для расщепления слитых протеинов, содержит в настоящее время фактор Ха. Эта протеаза расщепляет специфически последовательность Ile-Glu-Gly-Arg• ! •X, где • ! • показывает точку расщепления, а Х обозначает любую аминокислоту. Однако оказывается, что и эту протеазу нельзя применять универсально для расщепления слитых протеинов, которые несут соответствующую последовательность расщепления в своей переходной области;часто такие субстраты (т. е. слитые протеины, которые содержат желательный протеин, ковалентно связанный с протеином-носителем) либо вообще не расщепляются, либо гидролизуются только в очень небольшой степени, либо только в растворимой форме. The list of sequentially specific proteases that are currently used to cleave fusion proteins currently contains factor Xa. This protease cleaves the specific sequence of Ile-Glu-Gly-Arg •! • X, where •! • indicates the cleavage point, and X denotes any amino acid. However, it turns out that this protease cannot be used universally for the cleavage of fusion proteins that carry the corresponding cleavage sequence in their transition region; often such substrates (i.e., fusion proteins that contain the desired protein covalently linked to a carrier protein) or in general they do not cleave or hydrolyze only to a very small extent, or only in soluble form.

Особенно важным является эффективное расщепление слитых протеинов при получении рекомбинантных протеинов в прокариотах, поскольку там требуется введение ДНК-последовательности, которая содержит AUG в качестве начального кодона перед началом собственной ДНК- последовательности. Как результат этого в прокариотах, как например E. coli, экспрессируется рекомбинантный протеин, который содержит дополнительный остаток метионина на N-конце. Of particular importance is the efficient cleavage of fusion proteins in the preparation of recombinant proteins in prokaryotes, since it requires the introduction of a DNA sequence that contains AUG as the initial codon before starting its own DNA sequence. As a result of this, in prokaryotes, such as E. coli, a recombinant protein is expressed that contains an additional methionine residue at the N-terminus.

Однако во многих случаях требуется получение не содержащих метионина 1 рекомбинантных протеинов. Получение таких протеинов из прокариотов можно осуществлять например через метионин-специфическую пептидазу, которая отщепляет N-концевой метионин. Однако этот способ связан с очень большими затратами, так как отщепление можно проверить только путем анализа последовательности протеинов. Кроме того, разделение содержащего и не содержащего метионин протеина по причине почти идентичного молекулярного веса является очень трудным и тем самым может быть достигнуто только частично. However, in many cases, the production of methionine-1-free recombinant proteins is required. The production of such proteins from prokaryotes can be carried out, for example, through methionine-specific peptidase, which cleaves the N-terminal methionine. However, this method is associated with very high costs, since cleavage can only be verified by analyzing the sequence of proteins. In addition, the separation of the methionine-containing and non-methionine-containing protein due to the almost identical molecular weight is very difficult and thus can only be achieved in part.

РСТ-заявка W084/02351 раскрывает отщепление N-концевых аминокислот от слитого протеина. При этом аминокислоты протеина от N- конца, благодаря постепенному отщеплению экзопептидазой, предпочтительно лейцинпептидазой, могут быть удалены вплоть до последовательности X-Pro. Последовательность X-Pro отщепляют из этого продукта или в две стадии, или в 1 стадию с применением постпролин- дипептидил-аминопептидазы (ЕС 3.4.14.). Этот способ имеет тот недостаток, что вследствие постепенного отщепления аминокислот от N- конца протеина, должен образовываться не единый продукт, а всегда смесь продуктов, которая, наряду с желательным продуктом, содержит и не полностью освобожденные конечные продукты. PCT application W084 / 02351 discloses the cleavage of N-terminal amino acids from a fusion protein. Moreover, amino acids of the protein from the N-terminus, due to the gradual cleavage of exopeptidase, preferably leucine peptidase, can be removed up to the X-Pro sequence. The X-Pro sequence is cleaved from this product in either two steps or 1 step using postproline dipeptidyl aminopeptidase (EC 3.4.14.). This method has the disadvantage that due to the gradual cleavage of amino acids from the N-terminus of the protein, not a single product should be formed, but always a mixture of products, which, along with the desired product, also contains not completely liberated final products.

Другой способ для ферментативного расщепления слитого протеина известен из европейского патента N 0020290. При этом способе для отщепления желательного протеина применяют фермент Коллагеназу с определенной последовательностью распознавания. Another method for the enzymatic cleavage of a fusion protein is known from European patent N 0020290. In this method, the enzyme Collagenase with a specific recognition sequence is used to cleave the desired protein.

Однако было установлено, что Коллагеназа, как и другие эндопептидазы, имеет лишь небольшую специфичность (см. Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). Кроме того Коллагеназы активны только в отношении протеинов, которые имеют специфическую пространственную структуру. However, it was found that Collagenase, like other endopeptidases, has only a small specificity (see Biochim. Biophys. Acta 271 (1972), 133-144). In addition, Collagenases are active only against proteins that have a specific spatial structure.

Применение уже упомянутого фактора Ха для отщепления N-концевой части слияния протеинов известно. Однако этот способ наряду с уже упомянутыми проблемами эффективности расщепления имеет другие недостатки, а именно то, что, по всей вероятности, распознаются и расщепляются также внутренние последовательности целевого протеина. Кроме того, фактор Ха выделяют из сыворотки крови крупного рогатого скота, вследствие чего требуется связанная с большими затратами очистка и аналитика, чтобы обнаруживать возможные имеющиеся факторы патогенности или вирусы. The use of the already mentioned factor Xa to cleave the N-terminal portion of the protein fusion is known. However, this method, along with the already mentioned problems of cleavage efficiency, has other disadvantages, namely that, in all likelihood, the internal sequences of the target protein are also recognized and cleaved. In addition, factor Xa is isolated from the blood serum of cattle, which requires cleaning and analytics associated with high costs in order to detect possible pathogenicity factors or viruses.

Различные виды патогенных бактерий (например рода Neisseria, в частности Neisseria gonorrhoea и Neisseria meningititis, или рода Haemophilus, в частности Haemophilus influenzae и Haemophilus aegyptious), которые развиваются на слизистой оболочке человека, выделяют протеазы, по расщепляемой последовательности близкие родственным протеазам, которые специфичны для IgAI человека, и поэтому, обозначаются как IgA-протеазы или игазы. Иммуноглобулин IgAI является важной компонентой секреторного иммунного ответа, который должен защищать против инфекций таких патогенных организмов (Обзор: Korfeld и Plaut, Rev, Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). Наряду c этим lgA-протеаза расщепляет также свой собственный протеин-предшественник в результате аутопротеолиза. Получение IgA-протеазы из Neisseria gonorrhoea MSll в аутентичном штамме бактерий и в грамотрицательных клетках хозяина уже было подробно описано ранее (патент ФРГ N 3622221.6). Various types of pathogenic bacteria (for example, the genus Neisseria, in particular Neisseria gonorrhoea and Neisseria meningititis, or the genus Haemophilus, in particular Haemophilus influenzae and Haemophilus aegyptious), which develop on the human mucosa, secrete proteases that are similar in sequence to the related proteases that are specific for related proteases Human IgAIs, and therefore, are referred to as IgA proteases or igases. IgAI immunoglobulin is an important component of the secretory immune response that should protect against infections of such pathogenic organisms (Review: Korfeld and Plaut, Rev, Infect. Dis. 3 (1981), 521-534). In addition, the lgA protease also cleaves its own protein precursor as a result of autoproteolysis. Obtaining an IgA protease from Neisseria gonorrhoea MSll in an authentic strain of bacteria and in gram-negative host cells has already been described in detail previously (German Federal Patent No. 3622221.6).

IgA-протеаза согласно данных Pohlner и др. расщепляет следующие последовательности распознавания (Nature 325 (1987), 458-462):
1. Pro-Ala-Pro• ! • Ser-Pro
2. Pro-Pro• ! • Ser-Pro
3. Pro-Pro• ! • Ala-Pro
4. Pro-Pro• ! • Thr-Pro
Символ • ! • обозначает точку разрыва IgA-протеазой. Клонирование последовательности, кодирующей IgA-протеазу описано у Pohlner и др., 1987.IgA protease according to Pohlner et al. Cleaves the following recognition sequences (Nature 325 (1987), 458-462):
1. Pro-Ala-Pro •! • Ser-Pro
2. Pro-Pro •! • Ser-Pro
3. Pro-Pro •! • Ala-Pro
4. Pro-Pro •! • Thr-Pro
Symbol •! • indicates the breakpoint of the IgA protease. Cloning of an IgA protease encoding sequence is described by Pohlner et al., 1987.

Задачей настоящего изобретения была разработка усовершенствованного способа для биохимического (ферментативного) расщепления слитых протеинов, чтобы полученные методом генной технологии слитые протеины, состоящие из любых партнеров слияния и специфической последовательности расщепления в переходной области, можно было применять как субстрат для получения полезных протеинов, например G- CSF, по возможности с высоким выходом и в оптимальное для последующего использования форме, в частности без дополнительного Met. The objective of the present invention was to develop an improved method for the biochemical (enzymatic) cleavage of fusion proteins, so that the fusion proteins obtained by the method of genetic technology, consisting of any fusion partners and a specific cleavage sequence in the transition region, can be used as a substrate for obtaining useful proteins, for example G- CSF, if possible with a high yield and in an optimal form for subsequent use, in particular without additional Met.

Эту задачу решали методом генной технологии путем введения точки распознавания или последовательности расщепления Pro• ! • X-Pro в переходную область слитого белка и путем специфического расщепления этой последовательности IgA-протеазой в обозначенной символом • !• точке расщепления, Х обозначает преимущественно аминокислоты Ser, Thr и Ala, и особенно предпочтительно Ser и Thr, но может обозначать также другие аминокислоты. This problem was solved by the method of genetic technology by introducing a recognition point or a cleavage sequence Pro •! • X-Pro into the transition region of the fusion protein and by specific cleavage of this sequence with an IgA protease at the symbolized •! • cleavage point, X denotes mainly amino acids Ser, Thr and Ala, and particularly preferably Ser and Thr, but may also denote other amino acids .

Под понятие "IgA-протеазы" по настоящему изобретению подпадают протеазы, которые специфически расщепляют IgA, которые описаны, например, в Rev. Infekt. Dis 3 (1981) 521-534. Но пригодны также и рекомбинантные IgA-протеазы, которые описаны, например, в заявке на патент ФРГ N 3622221 Proc. Natl. Acad. Sci. США 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad. Sci. США 80 (1983) 2681-2685, Nature 325 (1987) 458-462 и EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601. The term “IgA proteases” of the present invention includes proteases that specifically cleave IgA, which are described, for example, in Rev. Infekt. Dis 3 (1981) 521-534. But suitable are also recombinant IgA proteases, which are described, for example, in the patent application of Germany N 3622221 Proc. Natl. Acad Sci. US 79 (1982) 7881-7885, Proc. Natl. Acad Sci. U.S. 80 (1983) 2681-2685; Nature 325 (1987) 458-462; and EMBO Jour. 3 (1984) 1595-1601.

После расщепления IgA-протеазой аминоконец протеина содержит последовательность X-Pro. Эта последовательность как часть желательного протеина может быть выгодной, невыгодной или же незначительной. Выгодна эта последовательность, в общем, тогда, когда полученный методом генной технологии желательный протеин и в своей природной форме содержит на своем аминоконце обе соответствующие аминокислоты X-Pro. Охарактеризованные аминоконцевыми X-Pro протеины, которые имеют важное значение в биотехнологии, встречаются в природе. After cleavage with an IgA protease, the amino terminus of the protein contains the X-Pro sequence. This sequence, as part of the desired protein, may be beneficial, disadvantageous, or negligible. This sequence is advantageous, in general, when the desired protein obtained by the method of genetic technology and in its natural form contains both corresponding amino acids X-Pro on its amino terminal. Characterized by amino-terminal X-Pro proteins, which are important in biotechnology, are found in nature.

Способ по изобретению, в противоположность всем другим известным способам для расщепления слияний протеинов, имеет те преимущества, что его оказалось возможным применять универсально к слившимся протеинам, которые в своей переходной области несут указанную последовательность расщепления и что его можно применять также к нерастворимым, растворимым, соединенным с мембраной и связанным с клеткой слитым белкам. Кроме того, в качестве особого преимущества способ дает возможность расщеплять слитые протеины в форме тел включения, какими они получаются в микроорганизмах. Другое преимущество способа состоит в том, что примененный расщепляющий фермент, игазу, можно получать с небольшими затратами из питательных сред непатогенных бактерий. The method according to the invention, in contrast to all other known methods for splitting protein fusions, has the advantages that it was possible to apply universally to fused proteins that carry the indicated cleavage sequence in their transition region and that it can also be applied to insoluble, soluble, joined with a membrane and cell-related fusion proteins. In addition, as a particular advantage, the method makes it possible to break down fusion proteins in the form of inclusion bodies, as they are obtained in microorganisms. Another advantage of the method is that the cleavage enzyme used, Igase, can be obtained at low cost from nutrient media of non-pathogenic bacteria.

Встраивание последовательности расщепления для IgA в переходную область слияния протеинов осуществляют средствами генной технологии. Так, последовательность нуклеотидов, которая кодирует последовательность расщепления или часть его, можно синтезировать химическим путем и встраивать при помощи известных средств генной технологии между ДНК-отрезками для протеина-носителя и желательного протеина. Соответственно можно встраивать также природную последовательность нуклеотидов, которая кодирует подходящую последовательность расщепления или часть ее. Кодирующий слияние протеинов ген ставится преимущественно под контроль надлежащих (преимущественно индуцируемых) сигналов экспрессии, так что становится возможным продуцирование клеткой слитых протеинов. В качестве клеток- хозяев для производства слияний протеинов можно применять прокариотические и эукариотические (как растительные, так и животные) клетки. Примененные при этом протеины-носители могут иметь любые функции, в зависимости от того, какие свойства они должны придавать слиянию протеинов, как определенные функции переноса, функции, которые улучшают очистку слияния протеинов или их устойчивость и многое другое. Предпочтительные протеины-носители объяснены ниже. The insertion of the cleavage sequence for IgA in the transition region of the fusion of proteins is carried out by means of gene technology. Thus, a nucleotide sequence that encodes a cleavage sequence or part of it can be chemically synthesized and inserted using known genetic technology between DNA segments for a carrier protein and a desired protein. Accordingly, you can also embed a natural nucleotide sequence that encodes a suitable cleavage sequence or part of it. The gene encoding the fusion of proteins is placed primarily under the control of appropriate (predominantly inducible) expression signals, so that it becomes possible for the cell to produce fusion proteins. As host cells for the production of protein fusions, prokaryotic and eukaryotic (both plant and animal) cells can be used. The carrier proteins used for this can have any function, depending on what properties they should give to protein fusion, as certain transfer functions, functions that improve the purification of protein fusion or their stability, and much more. Preferred carrier proteins are explained below.

Особенно предпочтительным применением способа по изобретению является получение рекомбинантных протеинов или пептидов без N- концевого остатка метионина из слившихся протеинов или пептидов с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro• ! •X-Pro-A, где Х обозначает любую аминокислоту, преимущественно Thr, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот, которая преимущественно, если Х обозначает Thr или Ala, оканчивается Pro или, если Х обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro-Ala или Pro-Pro, и A обозначает любую последовательность аминокислот. При этом расщепляют слившийся протеин или пептид при помощи IgA-протеазы и получают продукт расщепления с последовательностью аминокислот X-Pro-A. Например, этот способ для получения рекомбинантных протеинов из прокариотных клеток без N- концевого остатка метионина включает следующие стадии:
(1) трансформация прокариотической клетки геном, который кодирует протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro• ! •X-Pro-A, где X, Y и A имеют вышеназванные значения,
(2) культивирование трансформированной клетки в подходящей среде и экспрессию трансформированного гена,
(3) расщепление продукта экспрессии из трансформированной клетки с последовательностью аминокислот Met-Y-Pro• ! •X-Pro-A IgA- протеазой и
(4) выделение получающегося продукта расщепления с последовательностью аминокислот X-Pro-A без N-концевого остатка метионина.A particularly preferred application of the method of the invention is to produce recombinant proteins or peptides without the N-terminal methionine residue from fused proteins or peptides with the amino acid sequence Met-Y-Pro •! • X-Pro-A, where X is any amino acid, preferably Thr, Ala, or Ser, Y is one or more amino acids, which preferably, if X is Thr or Ala, ends with Pro or, if X is Ser, ends with Pro -Ala or Pro-Pro, and A denotes any amino acid sequence. In this case, the fused protein or peptide is cleaved using an IgA protease and a cleavage product with the amino acid sequence X-Pro-A is obtained. For example, this method for producing recombinant proteins from prokaryotic cells without an N-terminal methionine residue comprises the following steps:
(1) transformation of a prokaryotic cell with a gene that encodes a protein or peptide with the amino acid sequence Met-Y-Pro •! • X-Pro-A, where X, Y and A have the above meanings,
(2) culturing the transformed cell in a suitable medium and expressing the transformed gene,
(3) cleavage of the expression product from the transformed cell with the amino acid sequence Met-Y-Pro •! • X-Pro-A IgA-protease and
(4) isolation of the resulting cleavage product with an amino acid sequence of X-Pro-A without an N-terminal methionine residue.

Благодаря способу по изобретению неожиданно можно получать с высоким выходом и хорошей специфичностью в одной стадии протеины без N-концевого остатка метионина, которые имеют N-концевую последовательность Х-Рго, причем Х обозначает преимущественно Thr, Ala или Ser. Thanks to the method according to the invention, it is surprisingly possible to obtain proteins with no N-terminal methionine residue with high N yield and good specificity in one step, which have an N-terminal X-Prgo sequence, wherein X is preferably Thr, Ala or Ser.

Часть носителя Y слившегося протеина обозначает последовательность аминокислот по меньшей мере l, преимущественно до 100, особенно преимущественно от 1 до 50 аминокислот, которая оканчивается распознаваемой IgA-протеазой последовательностью расщепления. Если Х обозначает аминокислоту серин,то Y оканчивается преимущественно последовательностью Pro-Ala или Pro. Если Х обозначает Thr или Ala, то Y оканчивается преимущественно Pro, особенно преимущественно Arg-Pro, Pro-Arg-Pro или Ala-Pro-Arg-Pro. Part of the carrier Y of the fused protein denotes an amino acid sequence of at least l, preferably up to 100, especially preferably from 1 to 50 amino acids, which ends with a recognized IgA protease cleavage sequence. If X denotes the amino acid serine, then Y ends predominantly with the sequence Pro-Ala or Pro. If X is Thr or Ala, then Y ends predominantly Pro, especially predominantly Arg-Pro, Pro-Arg-Pro or Ala-Pro-Arg-Pro.

В особенно предпочтительном варианте осуществления Y обозначает по меньшей мере 5 аминокислот, которые оканчиваются последовательностью Pro-Ala-Pro-Arg-Pro. Однако для способа по изобретению применяются все распознаваемые IgA-протеазой точки расщепления. In a particularly preferred embodiment, Y is at least 5 amino acids that end with the sequence Pro-Ala-Pro-Arg-Pro. However, for the method of the invention, all IgA protease recognized cleavage points are used.

Часть носителя Y может содержать еще другие любые аминокислоты, преимущественно до 100, особенно преимущественно до 50 аминокислот. Однако для этого применяют преимущественно такие последовательности аминокислот, которые на уровне ДНК улучшают экспрессию протеина Met-Y- Pro• ! •Х-Pro-A и/или на уровне аминокислот облегчают ее очистку из клетки. Part of the carrier Y may contain any other amino acids, preferably up to 100, especially preferably up to 50 amino acids. However, for this, predominantly amino acid sequences are used which, at the DNA level, improve the expression of Met-Y-Pro •! • X-Pro-A and / or at the amino acid level facilitate its purification from the cell.

Экспрессию протеина Met-Y-Pro• ! •X-Pro-A на уровне ДНК можно улучшить, например, слиянием с фрагментами гена β -галактозидазы, тогда Y включает часть протеина β -галактозидазы. Известны специалисту и другие возможности, чтобы повышать экспрессию протеина Met-Y-Pro• ! •X-Pro-A. Слиянием с другими полипептидами, особенно с высокозаряженными (например поли-Lys, Arg) или со связывающими определенные вещества с высоким сродством (например стрептавидин), можно облегчать очистку и отделение продукта экспрессии (см. например европейский патент А 0089626, европейский патент А 0 306 610). Met-Y-Pro protein expression •! • X-Pro-A at the DNA level can be improved, for example, by fusion with fragments of the β-galactosidase gene, then Y includes a portion of the β-galactosidase protein. Other possibilities are known to the skilled person for increasing the expression of Met-Y-Pro protein! • X-Pro-A. By fusion with other polypeptides, especially highly charged ones (e.g. poly-Lys, Arg) or with binding agents with high affinity (e.g. streptavidin), the purification and separation of the expression product can be facilitated (see, for example, European Patent A 0089626, European Patent A 0 306 610).

Рекомбинантную ДНК, кодирующую слитый протеин, можно получать известным специалисту в области молекулярной биологии способом. Обычно для этого носитель, который содержит кодирующую последовательность аминокислот А ДНК-последовательность, расщепляют ограничительными эндонуклеазами в области 5¹-конца этого гена и повторно связывают с олигонуклеотидами, которые содержат желательную последовательность. При этом олигонуклеотид должен содержать последовательность, которая кодирует точку расщепления IgA-протеазы или часть ее.Recombinant DNA encoding a fusion protein can be obtained by a method known to the person skilled in the field of molecular biology. Typically, for this, a carrier that contains the coding sequence of amino acids A of the DNA sequence is cleaved with restrictive endonucleases at the 5 ¹ -end of this gene and re-linked to oligonucleotides that contain the desired sequence. Moreover, the oligonucleotide must contain a sequence that encodes a cleavage point of an IgA protease or part of it.

Подходящие для экспрессии протеина в прокариотических организмах основные носители известны специалисту. Целесообразным носителем является такой носитель, который обеспечивает высокую экспрессию рекомбинантной ДНК по изобретению. Рекомбинантная ДНК находится преимущественно под контролем индуцируемого сигнала экспрессии (например, λ, tac, lac или trp просмотр). Suitable carriers for protein expression in prokaryotic organisms are known to those skilled in the art. A suitable carrier is one which provides high expression of the recombinant DNA of the invention. Recombinant DNA is predominantly controlled by an inducible expression signal (e.g., λ, tac, lac or trp scan).

Носитель по изобретению может быть как внехромосомным (например плазмид), так и интегрированным (например бактериофаг ламбда) в геноме организма-хозяина. Преимущественно носитель по изобретению представляет плазму. Примерами носителей, пригодных для экспрессий ДНК по изобретению в прокариотах, являются имеющиеся в продаже pUC- и pUR- носители. The carrier of the invention can be either extrachromosomal (e.g. plasmids) or integrated (e.g. bacteriophage lambda) in the genome of the host organism. Advantageously, the carrier of the invention is plasma. Examples of carriers suitable for expression of the DNA of the invention in prokaryotes are commercially available pUC and pUR carriers.

Примерами протеинов, которые имеют N-концевую последовательность X-Pro, причем X обозначает Thr, Ala или Ser, и которые можно получать по способу изобретения в одной стадии, являются эритропоэтин человека, β - цепь Т-клеточного рецептора человека и особенно гранулоцит стимулирующий фактор человека (G-CSF). Examples of proteins that have an N-terminal sequence of X-Pro, wherein X is Thr, Ala or Ser, and which can be obtained by the method of the invention in one step, are human erythropoietin, β is the human T-cell receptor chain and especially granulocyte stimulating factor human (G-CSF).

G-CSF синтезируют как лимфокин активированных моноцитов, макрофагов, а также ряда других клеточных линий. Лимфокины участвуют в созревании клеток иммунной системы или системы клеток крови. Они стимулируют созревание основных клеток костного мозга до раздифференцированных клеток. Так, например, G-CSF индуцирует образование нейтрофилов и гранулоцитов. G-CSF is synthesized as a lymphokine of activated monocytes, macrophages, as well as a number of other cell lines. Lymphokines are involved in the maturation of cells of the immune system or blood cell system. They stimulate the maturation of major bone marrow cells to differentiated cells. For example, G-CSF induces the formation of neutrophils and granulocytes.

Так как G-CSF может значительно повышать популяцию нейтрофильных клеток в течение короткого срока, для G-CSF получаются широкие возможности применения в области терапии. Так G-CSF можно было бы применять, например, после химиотерапии при раке, при которой разрушаются клетки иммунной системы. Далее, G-CSF можно было бы применять при пересадках костного мозга, при тяжелых ожоговых ранах, при обусловленных слабым иммунитетом врожденных инфекциях и при лейкемии. Since G-CSF can significantly increase the population of neutrophilic cells in a short period of time, there are wide application possibilities in the field of therapy for G-CSF. So G-CSF could be used, for example, after chemotherapy for cancer, in which the cells of the immune system are destroyed. Further, G-CSF could be used for bone marrow transplants, for severe burn wounds, for congenital infections caused by weak immunity, and for leukemia.

G-CSF представляет молекулу секреторного протеина. Поэтому первичный продукт трансляции содержит N-концевую сигнальную последовательность, которая при секреции отщепляется, так что последовательность зрелого G-CSF начинается с аминокислот Thr(+l)- Pro(+2) (положения аминокислот +1 и +2). При продуцировании G-CSF в прокариотах этот сигнальный пептид отщепляется либо плохо, либо совсем не отщепляется, так что для получения G-CSF без сигнальной последовательности из прокариотов необходимо клонировать AUC(Met) в качестве инициирующего кодона перед началом кодирующей зрелый G-CSF последовательности ДНК, которая начинается на уровне протеина Thr(+1)- Pro(+2). В результате этого в прокариотах, например E.coli, экспрессируют G-CSF, который содержит метионин в первом положении аминокислотной последовательности. G-CSF is a secretory protein molecule. Therefore, the primary translation product contains an N-terminal signal sequence that is cleaved during secretion, so that the sequence of mature G-CSF begins with amino acids Thr (+ l) - Pro (+2) (amino acid positions +1 and +2). When producing G-CSF in prokaryotes, this signal peptide is either poorly cleaved or not cleaved at all, so to obtain G-CSF without a signal sequence from prokaryotes, it is necessary to clone AUC (Met) as an initiation codon before starting the mature G-CSF coding DNA sequence that starts at the level of the protein Thr (+1) - Pro (+2). As a result, G-CSF is expressed in prokaryotes, for example E. coli, which contains methionine in the first position of the amino acid sequence.

По способу изобретения можно простым путем получать не содержащий метионина 1-положении G-CSF из прокариотов, который начинается с аминокислот Thr(+l)-Pro(+2). According to the method of the invention, it is possible in a simple way to obtain methionine-free 1-position G-CSF from prokaryotes, which begins with amino acids Thr (+ l) -Pro (+2).

Это происходит в результате того, что получают производное G-CSF из прокариотов, которое в положении +1 и +2 последовательности аминокислот содержит аминокислоты Thr(+l)-Pro(+2) и перед этим, начиная с положения -l последовательности аминокислот, содержит такую последовательность аминокислот, которая распознается IgA-протеазой, которая начинается с Thr(+l)-Pro(+2). This is due to the fact that a derivative of G-CSF is obtained from prokaryotes, which at the positions +1 and +2 of the amino acid sequence contains Thr (+ l) -Pro (+2) amino acids and before that, starting from the -l position of the amino acid sequence, contains an amino acid sequence recognized by the IgA protease that begins with Thr (+ l) -Pro (+2).

В предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -l и-2 по Pro, в положении от -3 до -l последовательность аминокислот Arg-Pro-Pro, в положении от -4 до -l последовательность аминокислот Pro-Arg-Pro-Pro или в положении от -5 до -l последовательность аминокислот Ala-Pro-Arg-Pro-Pro. In a preferred embodiment, the derivative contains, at the -l and -2 position of Pro, at the -3 to -l position, the Arg-Pro-Pro amino acid sequence, at the -4 to -l position, the amino acid sequence Pro-Arg-Pro-Pro or at position -5 to -l, the amino acid sequence of Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.

В особенно предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении от -6 до -l последовательность аминокислот

Под G-CSF в смысле предмета изобретения понимают рекомбинантный G-CSF, из прокариотических хозяев последовательность которого раскрыта, например, в Science 232 (1986) 61, а также образованные от него производные со стимулирующей гранулоциты активностью, у которых последовательности аминокислот начинаются с X(+1)-Pro(+2). X обозначает Thr, Ser или Ala, особенно предпочтительно Thr.In a particularly preferred embodiment, the derivative contains, from -6 to -l, an amino acid sequence

By G-CSF in the sense of the subject invention is meant a recombinant G-CSF, from prokaryotic hosts, the sequence of which is disclosed, for example, in Science 232 (1986) 61, as well as derivatives derived from it with granulocyte-stimulating activity, in which amino acid sequences begin with X ( +1) -Pro (+2). X is Thr, Ser or Ala, particularly preferably Thr.

G-CSF-производное по изобретению после экспрессии в прокариотах можно расщеплять обработкой IgA-протеазой между положением +1 и -1 (между Thr(+1) и Pro(-1)). Тем самым в результате единственной стадии гидролиза получают не содержащий метионина в положении -1 G-CSF, последовательность аминокислот которого на N-конце начинается с аминокислот Thr(+1)-Pro(+2) встречающегося в природе G-CSF. After expression in prokaryotes, the G-CSF derivative of the invention can be cleaved by treatment with an IgA protease between position +1 and -1 (between Thr (+1) and Pro (-1)). Thus, as a result of a single hydrolysis step, methionine-free G-CSF at position -1 is obtained, the amino acid sequence of which at the N-terminus begins with Thr (+1) -Pro (+2) naturally occurring G-CSF amino acids.

При экспрессии G-CSF в прокариотах образуются труднорастворимые агрегаты (refractile bodies), которые неактивны. Прежде чем применять протеин, например для терапевтических целей, его следует перевести в его активную форму. При известных специалисту способах (ср. например европейский патент А 0219874; европейский патент А 0114506; WO 84/03711) сначала осуществляют растворение добавкой денатурирующих средств, к которому присоединяют затем ренатурирование и, в случае необходимости, дальнейшие стадии очистки. Обработку протеина по изобретению IgA- протеазой можно проводить перед растворением, после растворения или лишь после ренатурирования. В случае, если обработка IgA-протеазой должна проводиться непосредственно после растворения, следует перед добавкой IgA-протеазы отделять растворитель (например гидрохлорид гуанидина или мочевину) диализом. Однако обработку IgA-протеазой проводят преимущественно после ренатурирования, так как в этом случае выходы G-CSF особенно высокие. Expression of G-CSF in prokaryotes results in the formation of refractile bodies that are inactive. Before using the protein, for example for therapeutic purposes, it should be converted to its active form. With methods known to the person skilled in the art (cf. for example, European patent A 0219874; European patent A 0114506; WO 84/03711), the dissolution is first carried out by the addition of denaturing agents, to which then the renaturation and, if necessary, further purification steps are added. The treatment of the protein of the invention with an IgA protease can be carried out before dissolution, after dissolution, or only after renaturation. If treatment with the IgA protease is to be carried out immediately after dissolution, the solvent (e.g. guanidine hydrochloride or urea) should be separated by dialysis before the IgA protease is added. However, treatment with an IgA protease is carried out mainly after renaturation, since in this case the yields of G-CSF are particularly high.

Условия для обработки G-CSF IgA-протеазой сами по себе не являются критическими. Однако предпочтительно применять при этом G-CSF (или другой протеин) относительно IgA-протеазы в весовом отношении 1:1 до 100:1. Превращение происходит предпочтительно в буферном водном растворе с pH от 6,5 до 8,5. Концентрация буферного раствора лежит преимущественно в области между 50 и 300 ммол/л, в случае необходимости при добавке 20 - 100 ммол/л хлористого натрия. Преимущественно расщепление происходит при комнатной температуре свыше 20 - 60 мин. The conditions for treating G-CSF with an IgA protease alone are not critical. However, it is preferable to use G-CSF (or another protein) relative to the IgA protease in a weight ratio of 1: 1 to 100: 1. The conversion takes place preferably in a buffered aqueous solution with a pH of from 6.5 to 8.5. The concentration of the buffer solution lies mainly in the region between 50 and 300 mmol / L, if necessary, with the addition of 20-100 mmol / L sodium chloride. Mostly cleavage occurs at room temperature over 20-60 minutes.

После растворения, ренатурирования и расщепления IgA-протеазой полученный таким путем продукт расщепления очищают преимущественно с использованием ионообменника и фракционирования. Загрязнение полученного таким путем и не содержащего метионина в положении -l G- CSF другими протеинами составляет менее 0,1%, преимущественно менее 10^-3%.After dissolution, renaturation and cleavage of the IgA protease, the cleavage product thus obtained is purified predominantly using an ion exchanger and fractionation. Contamination of other proteins obtained in this way and not containing methionine at the -l G-CSF position is less than 0.1%, preferably less than 10 ^-3 %.

Следовательно, не содержащий метионина в положении -l G-CSF расщеплением IgA-протеазой можно отделять или очищать практически количественно от содержащего метионин слитого протеина. Therefore, the methionine-free G-CSF position at the -l position by IgA protease cleavage can be separated or purified almost quantitatively from the methionine-containing fusion protein.

По способу изобретения из прокариотов можно получать рекомбинантный G-CSF, который менее чем на 0,1%, преимущественно менее чем на 10^-3% загрязнен другими протеинами и количественно не содержит G-CSF из прокариотов, который в положении -1 содержит метионин.According to the method of the invention, recombinant G-CSF can be obtained from prokaryotes, which is less than 0.1%, mainly less than 10 ^-3 % contaminated with other proteins and does not quantitatively contain G-CSF from prokaryotes, which at position -1 contains methionine.

Предметом изобретения является также лекарственное средство на основе полученного по способу изобретения G-CSF из прокариотов в качестве активного вещества, в случае необходимости вместе с обычными фармацевтическими веществами-носителями, наполнителями и вспомогательными веществами. Такое лекарственное средство особенно пригодно для лечения заболеваний, при которых следует стимулировать образование гранулоцитов, особенно нейтрофилов. A subject of the invention is also a medicament based on G-CSF obtained from the prokaryotes as an active substance, if necessary, together with conventional pharmaceutical carrier substances, excipients and excipients. Such a drug is particularly suitable for the treatment of diseases in which the formation of granulocytes, especially neutrophils, should be stimulated.

Фармацевтические препараты по изобретению применяются преимущественно как растворы для инъекций и вливаний. Это можно осуществлять в результате того, что имеется в распоряжении уже готовый для впрыскивания раствор, который содержит состав по изобретению. Однако возможно также использование фармацевтических препаратов в форме лиофилизатов. Последние образуются при помощи известных, подходящих для целей инъекций средств или растворов. В качестве среды для инъекций применяют преимущественно воду, которая содержит обычные в растворах для инъекций добавки, как стабилизаторы, агенты растворения, буферные растворы и изотонические добавки, например, физиологический раствор хлористого натрия. Подобными добавками являются, например, маннит, буферный раствор тартрата или цитрата, этанол, комплексообразователь, как например этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксичные соли, а также высокомолекулярные полимеры, такие как жидкая окись полиэтилена для регулирования вязкости. Жидкие вещества-носители для инъекционных растворов должны быть стерильными и разливаются преимущественно в ампулы. The pharmaceutical preparations according to the invention are mainly used as solutions for injection and infusion. This can be done as a result of the fact that a solution is already ready for injection that contains the composition of the invention. However, it is also possible to use pharmaceutical preparations in the form of lyophilisates. The latter are formed using known, suitable for injection purposes, agents or solutions. The injection medium used is mainly water, which contains additives conventional in injection solutions, such as stabilizers, dissolution agents, buffer solutions and isotonic additives, for example, physiological saline solution. Such additives are, for example, mannitol, a buffer solution of tartrate or citrate, ethanol, a complexing agent, such as ethylenediaminetetraacetic acid and its non-toxic salts, as well as high molecular weight polymers such as liquid polyethylene oxide to control viscosity. Liquid substances carriers for injection solutions should be sterile and poured mainly into ampoules.

Наконец, настоящее изобретение включает также применение не содержащего метионина в положении -1 G-CSF из прокариотов для получения фармацевтических препаратов по изобретению. Finally, the present invention also includes the use of methionine-free at position -1 G-CSF from prokaryotes to produce pharmaceutical preparations of the invention.

Способ по изобретению включает биотехнологическое получение желательных протеинов. Под биотехнологией подразумевают в этой связи, что желательный протеин или его промежуточный продукт получают с применением геннотехнологических средств и других биотехнологических способов (например ферментация микроорганизмов). The method according to the invention includes biotechnological production of the desired proteins. By biotechnology is meant in this regard that the desired protein or its intermediate product is obtained using genetic technology and other biotechnological methods (for example, fermentation of microorganisms).

Желательный протеин представляет промежуточный продукт или конечный продукт, который может найти применение например в области медицины, исследования, в защите окружающей среды или в промышленных процессах или продуктах. The desired protein is an intermediate product or end product that may find application, for example, in the field of medicine, research, environmental protection, or industrial processes or products.

Способ по изобретению подразумевает, что желательный протеин образуется из слитого протеина (обозначенного также как слияние протеинов), причем слитый протеин или слияние протеинов составляется из несколько ковалентно связанных друг с другом партнеров слияния. При этом по меньшей мере, один из партнеров слияния представляет желательный протеин. Последовательность партнеров слияния и степень их повторения в слитом протеине любая; однако преимущественно она состоит из аминоконцевого протеина-носителя и карбоксиконцевого желательного протеина. The method of the invention assumes that the desired protein is formed from a fusion protein (also referred to as a protein fusion), wherein the fusion protein or protein fusion is composed of fusion partners covalently linked together. In this case, at least one of the fusion partners represents the desired protein. The sequence of fusion partners and the degree of their repetition in a fusion protein is any; however, it predominantly consists of an amino-terminal carrier protein and a carboxy-terminal desired protein.

Протеин-носитель или часть носителя служит для того, чтобы придавать желательному протеину в форме слитого протеина особенные свойства. Подобные свойства могут выражаться, например, в повышенной устойчивости слитых протеинов, которая основывается на структурных особенностях и тем самым в значительной степени на более высокой резистентности в противоположность клеточным протеазам или же на переносе слитых протеинов в окружающую среду с небольшой протеолитической активностью. Кроме того, в протеине-носителе могут содержаться свойства, которые обеспечивают эффективную очистку слитых протеинов. Сюда относятся например связывание определенных лигандов для метода афинной хроматографии, отложение слитых протеинов в отделяемых с небольшими затратами осажденных телах и перенос протеинов в легко доступные места. The carrier protein or part of the carrier serves to impart special properties to the desired protein in the form of a fusion protein. Such properties can be expressed, for example, in the increased stability of fusion proteins, which is based on structural features and, thereby, largely on higher resistance as opposed to cellular proteases, or on the transfer of fusion proteins to the environment with little proteolytic activity. In addition, the carrier protein may contain properties that provide for the efficient purification of fusion proteins. These include, for example, the binding of certain ligands for the affinity chromatography method, the deposition of fusion proteins in precipitated bodies separated at low cost, and the transfer of proteins to easily accessible places.

Области внутри слитого протеина, в которых компоненты (протеины- носители и желательные протеины) слитого протеина соединяются друг с другом, называют переходными областями. The regions within the fusion protein in which the components (carrier proteins and desired proteins) of the fusion protein are connected to each other are called transition regions.

Каждая переходная область может быть определена одной или несколькими последовательностями аминокислот. Последовательности аминокислот (как и все прочие последовательности аминокислот и протеинов) изображают в направлении от аминоконцевой (слева) к карбоксиконцевой (справа). Each transition region can be defined by one or more amino acid sequences. Amino acid sequences (like all other amino acid and protein sequences) are depicted in the direction from the amino terminal (left) to the carboxy terminal (right).

В пределах способа изобретения все те последовательности аминокислот в переходных областях, которые должны быть расщеплены IgA- протеазами, содержат последовательность расщепления или последовательность распознавания по способу изобретения. Within the scope of the method of the invention, all those amino acid sequences in the transition regions that are to be cleaved by IgA proteases comprise a cleavage sequence or recognition sequence according to the method of the invention.

То место между двумя аминокислотами последовательности аминокислот, в котором происходит расщепление слитых протеинов или слияний протеинов, называют точкой расщепления. The place between the two amino acids of the amino acid sequence in which the fusion of proteins or the fusion of proteins occurs is called the cleavage point.

Способ по изобретению включает ферментативное расщепление слитого протеина в переходных областях IgA-протеазой. Под IgA-протеазой или игазой в пределах способа изобретения понимают IgA-протеазу штамма Neisseria gonorrhoeae MS 11 и все другие ферменты, родственные с этой протеазой на уровне нуклеотида и по процессу ее образования. Сюда причисляют также особенно IgA-протеазы рода Neisseria и Haemophilus. The method of the invention comprises enzymatic cleavage of a fusion protein in transition regions by an IgA protease. Under the IgA protease or igase within the method of the invention is meant the IgA protease of the strain Neisseria gonorrhoeae MS 11 and all other enzymes related to this protease at the nucleotide level and the process of its formation. IgA proteases of the genus Neisseria and Haemophilus are also ranked here.

Микроорганизм E.coli ED 8654 был депонирован под номером DSM 2102 в Немецком Центре микроорганизмов, Гризебахштрассе 8,3400 Геттинген. The microorganism E. coli ED 8654 was deposited under the number DSM 2102 at the German Center for Microorganisms, Grisebachstrasse 8.3400 Göttingen.

Пример 1. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина G-CSF. Example 1. Construction of a plasmid for the expression of methionine-free G-CSF.

Конструирование производят при изменении носителя экспрессии pPZ07-mgllac (WO. 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPZ07- mgllac расщепляют с Nco I и удаляют выступающие концы с Mung bean- нуклеазой. Затем расщепляют носитель Bam H1. Последовательность распознавания IgA на уровне ДНК получают через следующие олигонуклеотиды. Construction is carried out by changing the expression carrier pPZ07-mgllac (WO. 88/09373). For this, the expression carrier pPZ07 mgllac is cleaved with Nco I and the protruding ends with Mung bean nuclease are removed. The Bam H1 carrier is then cleaved. The DNA recognition sequence of IgA is obtained through the following oligonucleotides.

Олигонуклеотид A:
5' AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA
CCA CTG GGC CCT G 3¹
Олигонуклеотид B:
5' GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT
TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3'
Оба олигонуклеотида добавляют в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPZ07-mgllac. После повторного перекрестного связывания трансформируют обычным образом компетентные клетки E.coli К12. Известными методами выделяют ДНК из клеток и расщепляют ApaI и Bam HI. Фрагмент G-CSF длиной приблизительно 520 п. о. выделяют при применении ограничительных эндонуклеаз ApaI и BamHI из G-CSF- последовательности (Science 232 (1986), 61-65). Этот фрагмент вводят в расщепленный так же ApaI и BamHI носитель.Oligonucleotide A:
5 'AAT TCG GAG GAA AAA TTA ATG ACA CCA CTG CGA CCT CCT ACA
CCA CTG GGC CCT G 3 ¹
Oligonucleotide B:
5 'GAT CC AGG GCC CAG TGG TGT AGG AGG TCG CAG TGG TGT CAT
TAA TTT TTC CTC CGA ATT 3 '
Both oligonucleotides are added in equimolar amounts and introduced in approximately 100-fold excess into the cleaved, as described above, carrier pPZ07-mgllac. After re-cross-linking, competent E. coli K12 cells are transformed in the usual manner. Known methods are used to isolate DNA from cells and cleave ApaI and Bam HI. Fragment G-CSF with a length of approximately 520 p. isolated using restrictive endonucleases ApaI and BamHI from the G-CSF sequence (Science 232 (1986), 61-65). This fragment is introduced into the same cleaved ApaI and BamHI media.

Пример 2. Дополнительно к последовательности распознавания IgAI слитый протеин может содержать дополнительно пептиды, обеспечивающие облегчение очистки, например, стрептавидин. Для этого стрептавидин-ген (WO 89/03422) клонируют в правильную трансляционную решетку перед последовательностью распознавания IgA-протеазы. Example 2. In addition to the IgAI recognition sequence, a fusion protein may further comprise peptides that facilitate purification, for example, streptavidin. For this, the streptavidin gene (WO 89/03422) is cloned into the correct translation lattice before the IgA protease recognition sequence.

Пример 3. При помощи описанной в примере 1 плазмиды трансформируют E. coli К12-клетки (ED 8654, DSM 2102), трансформанты отбирают на среде с ампициллином и характеризуют плазмиды ограничительным анализом. Положительный клон применяют для культивирования и экспрессии G-CSF. Клетки культивируют в полной среде. Эта среда содержит на 1 л 16 г бактотриптона (Дифко), 10 г дрожжевого экстракта (Дифко) и 5 r хлористого натрия. Клетки оставляют для роста до ОД 546=2,0 и затем индуцируют 10^-3 мол/л IPTG. Еще через 4 ч клетки собирают центрифугированием, растворяют при помощи лизозима/ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и выделяют G-CSF как включенные тела (IB's, ср. европейский патент A 0219874).Example 3. Using the plasmids described in Example 1, E. coli K12 cells were transformed (ED 8654, DSM 2102), transformants were selected on ampicillin medium and plasmids were characterized by restrictive analysis. A positive clone is used for the cultivation and expression of G-CSF. Cells are cultured in complete medium. This medium contains 1 g of 16 g of bactotryptone (Difco), 10 g of yeast extract (Difco) and 5 g of sodium chloride. Cells are allowed to grow to OD 546 = 2.0 and then 10 ⁻³ mol / L IPTG is induced. After another 4 hours, cells were harvested by centrifugation, dissolved with lysozyme / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and G-CSF was isolated as included bodies (IB's, cf. European Patent A 0219874).

Динатурирование или ренатурирование выделенных нерастворимых частиц слияния G-CSF осуществляют, как описано в европейском патенте A 0 219 874. Динатурирование производят диализом относительно 6 мол/л гуанидингидрохлорида. Здесь можно отбирать уже делящуюся без остатка часть и после диализа относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7 применять для расщепления с IgA-протеазой (пример 4). The denaturation or renaturation of the isolated insoluble G-CSF fusion particles is carried out as described in European Patent A 0 219 874. The denaturation is carried out by dialysis with respect to 6 mol / L guanidine hydrochloride. Here you can select the part that is already fissile without residue and after dialysis with respect to 5 mmol / L potassium phosphate buffer solution with pH 7 can be used for cleavage with the IgA protease (Example 4).

В качестве альтернативы после денатурирования в гуанидингидрохлориде осуществляют диализ относительно 5 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7, который содержит 1 ммол/л GSH и 3 ммол/л GSSG. После ренатурирования здесь также происходит диализ относительно 3 ммол/л буферного раствора фосфата калия с pH 7. Alternatively, after denaturing in guanidine hydrochloride, dialysis is carried out against a 5 mmol / L potassium phosphate buffer solution, pH 7, which contains 1 mmol / L GSH and 3 mmol / L GSSG. After renaturation, dialysis with respect to 3 mmol / L potassium phosphate buffer solution with a pH of 7 also occurs here.

Пример 4. Расщепление слитого протеина IgA1-протеазой для получения нативного G-CSF без метионина, в положении - 1. Example 4. The cleavage of the fused protein IgA1-protease to obtain native G-CSF without methionine, at position - 1.

IgAI-протеазу выделяют как описано в EMBO Jour. 3 (1984), 1595- 1601. K 10 μг ренатурированного или денатурированного по примеру 3 G-CSF добавляют 2-5 μг IgA-протеазы и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Через различные ионообменные колонки, такие как Mоно-Q или Моно-S, можно выделять не содержащий метионина G-CSF. Последовательность протеинов аминоконца показывает, что очищенный G-CSF начинается с правильной последовательности аминокислот Thr(+l)-Pro(+2). IgAI protease is isolated as described in EMBO Jour. 3 (1984), 1595-1601. K 10 μg of the renatured or denatured according to Example 3 G-CSF add 2-5 μg of IgA protease and incubated for 30 min at room temperature. Through various ion-exchange columns, such as Mono-Q or Mono-S, methionine-free G-CSF can be isolated. The amino-terminal protein sequence indicates that purified G-CSF begins with the correct amino acid sequence Thr (+ l) -Pro (+2).

Пример 9. Очистка активной игазы из надосадочных жидкостей культуры рекомбинантных E.coli-клеток. Example 9. Purification of active igase from supernatants of a culture of recombinant E. coli cells.

Рекомбинантные E.coli С6ОО-клетки, которые содержат плазмиду pEX1070 патент ФРГ 36 22 221.6) с модифицированным геном IgA-протеазы, выделяют активную игазу в надосадочную жидкость культуры. Фильтрованием через мембрану можно было накапливать фермент в надосадочной жидкости культуры и затем осаждать из раствора сульфатом аммония (0,42 г/мл). После центрифугирования осадок растворяли в Биорекс-буферном растворе (50 ммол фосфата калия, pH 7,0, 8,6% глицерина) (l мл буферного раствора на 1 л надосадочной жидкости культуры), уравновешивали диализом относительно 2 л буферного раствора и затем подвергали катионообменной хроматографии (Биорекс 70). Связанную IgA-протеазу в одной стадии элюировали отмывающим буферным раствором (500 ммол фосфата калия, pH 7,0 8,6% глицерина) с колонки и фракционировали. Затем содержащие IgA-протеазу фракции анализировали электрофорезом на SDS-полиакриламидном-геле (12,5%). В этой точке очистки получали среднюю степень чистоты > 90%. Для получения игазы в чистой форме осуществляли гельфильтрацию с Сефакрилом HR300 в Биорекс-буферном растворе, сопровождаемую последующей катионообменной хроматографией (см. выше). Активность игазы проверяли инкубированием с IgA 1- антителами и разделением образующихся продуктов расщепления в SDS- полиакриламидном геле. Recombinant E. coli C6OO cells that contain plasmid pEX1070 German Federal Patent 36 22 221.6) with a modified IgA protease gene secrete active Igase into the culture supernatant. By filtering through a membrane, the enzyme could be accumulated in the supernatant of the culture and then precipitated from the solution with ammonium sulfate (0.42 g / ml). After centrifugation, the precipitate was dissolved in a Biorex buffer solution (50 mmol of potassium phosphate, pH 7.0, 8.6% glycerol) (l ml of buffer solution per 1 l of culture supernatant), balanced by dialysis against 2 l of buffer solution and then subjected to cation exchange chromatography (Biorex 70). The bound IgA protease in one step was eluted with a wash buffer (500 mmol potassium phosphate, pH 7.0 8.6% glycerol) from the column and fractionated. The fractions containing the IgA protease were then analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (12.5%). At this point of purification, an average degree of purity> 90% was obtained. To obtain Igase in pure form, gel filtration was performed with Sephacryl HR300 in a Biorex buffer solution, followed by subsequent cation exchange chromatography (see above). Igase activity was checked by incubation with IgA 1 antibodies and separation of the resulting cleavage products in SDS polyacrylamide gel.

Пример 10. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 3. Example 10. Construction of a plasmid for the expression of methionine-free interleukin 3.

Конструирование осуществляют с применением носителя экспрессии pPZ07-mglac (WO. 88/09373). Для этого носитель экспрессии pPZ07-mgllac расщепляют при помощи NCOI и выступающие концы удаляют с Mung bean- нуклеазой. Затем дополнительно расщепляют носитель Bam H1. Оптимированную аминоконцевую область слитого протеина получают на уровне ДНК через следующие олигонуклеиды. Construction is carried out using an expression carrier pPZ07-mglac (WO. 88/09373). For this, the expression carrier pPZ07-mgllac is cleaved with NCOI and the protruding ends are removed with a Mung beanuclease. Then, the Bam H1 carrier is further cleaved. The optimized amino-terminal region of the fusion protein is obtained at the DNA level through the following oligonucleides.

Первичный 1A:
5' AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAACATGT
CGACCATGGAG 3'
Первичный 1B:
5' GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAA
TTTTTCCTCCGAATT 3'
Оба олигонуклеотида добавляют вместе в эквимолярных количествах и вводят приблизительно в 100-кратном избытке в расщепленный, как описано выше, носитель pPZ07-mgllac. После лигирования сделанные обычным путем компетентными клетки E. coli К12 трансформируют. Известными методами выделяют из клеток ДНК, расщепляют при помощи Sa1I/Bam H1 и перевязывают с ДНК-фрагментом, который содержит кодирующую область интерлейкина 3 без сигнальной последовательности (описано ниже).Primary 1A:
5 'AATTCGGAGGAAAAATTAATGAAAGCCAAACGTTTTAAAAAAACATGT
CGACCATGGAG 3 '
Primary 1B:
5 'GGATCCTCCATGGTCGACATGTTTTTTTAAAACGTTTGGCTTTCATTAA
TTTTTCCTCCGAATT 3 '
Both oligonucleotides are added together in equimolar amounts and introduced at approximately a 100-fold excess into the cleaved, as described above, carrier pPZ07-mgllac. After ligation, E. coli K12 cells made in the usual way competent are transformed. Known methods are used to isolate DNA from cells, cleave with Sa1I / Bam H1 and bind to a DNA fragment that contains the coding region of interleukin 3 without a signal sequence (described below).

Получение кодирующей области интерлейкина 3 с областью распознавания для IgA-протеазы на уровне ДНК осуществляют через известную технику PCR, причем проводят PCR-реакцию с к-ДНК интерлейкина 3 и с нижеописанными первичными олигонуклеотидами. Obtaining the coding region of interleukin 3 with a recognition region for IgA protease at the DNA level is carried out using the known PCR technique, and the PCR reaction is carried out with the interleukin 3 c-DNA and with the primary oligonucleotides described below.

Первичный 2A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3'
Первичный 2B:
5'TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3'
Получающийся PCR-фрагмент дополнительно разрезают ферментами Sal 1 и Bam H1, после чего его можно вставлять непосредственно в вышеописанный носитель ДНК и связывать ковалентно при помощи лигазы.Primary 2A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC 3 '
Primary 2B:
5'TTCGTTGGATCCCTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT 3 '
The resulting PCR fragment is further cut with Sal 1 and Bam H1 enzymes, after which it can be inserted directly into the above-described DNA carrier and bound covalently using ligase.

После трансформации рекомбинантной ДНК соответствующего хозяина, например E.coli K12 C600, можно синтезировать Il 3 в E.coli в форме Rb's и затем выделять. Как описано для G-CSF, осуществляют денатурирование и ренатурирование протеина и расщепляют ренатурированный протеин при помощи IgA-протеазы. Полученный таким путем не содержащий метионина Il 3 после дальнейших стадий очистки можно применять для терапии. After transformation of the recombinant DNA of the appropriate host, for example E. coli K12 C600, Il 3 can be synthesized in E. coli in the form of Rb's and then isolated. As described for G-CSF, the protein is denatured and renatured and the renatured protein is cleaved by the IgA protease. Obtained in this way not containing methionine Il 3 after further stages of purification can be used for therapy.

Пример 11. Конструирование плазмиды для экспрессии не содержащего метионина интерлейкина 2. Example 11. Construction of a plasmid for the expression of methionine-free interleukin 2.

Конструирование можно осуществлять с применением носителя экспрессии pPZ07-mgllac (W088/09373), который после включения первичных 1A и 1B олигонуклеотидов, как описано в примере 10, расщепляли с Sal1/Bam H1. Получение кодирующей области интерлейкина 2 с областью распознавания lgA-протеазы на уровне ДНК осуществляют методом PCR, причем проводят PCR-реакцию с к-ДНК интерлейкина 2 и первичными последовательностями ЗA и 3B, которые так же кодируют область распознавания для IgA-протеазы. Construction can be carried out using the expression carrier pPZ07-mgllac (W088 / 09373), which, after incorporation of the primary 1A and 1B oligonucleotides, as described in Example 10, was digested with Sal1 / Bam H1. Obtaining the coding region of interleukin 2 with the recognition region of the lgA protease at the DNA level is carried out by PCR, and a PCR reaction is carried out with the c-DNA of interleukin 2 and primary sequences ZA and 3B, which also encode the recognition region for the IgA protease.

Первичный 3A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3'
Первичный ЗB:
5'TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3'
Полученный таким путем PCR-фрагмент дополнительно разрезают ферментами Sal1 и Bam H1, после чего его можно непосредственно вставлять в вышеописанный носитель ДНК. Дальнейшее происходит, как описано для IL 3. В предыдущем примере было описано, как соответствующим применением точки распознавания IgA-протеазы и последующим способом можно получать не содержащие метионина терапевтические протеины, которые начинаются с последовательности кислот AIa-Pro. Другие протеины, которые аналогично вышеописанным примерам можно получать без метионина, а именно при применении олигонуклеотидов, которые содержат область распознавания для IgA- протеазы и область, которая по аналогии соответствует 5' или 3' концу опубликованной последовательности и может быть получена через PCR- увеличение. Ниже приведены другие соответствующие терапевтические протеины, которые в зрелой встречающейся в природе форме начинаются с AIa-Pro и поэтому могут быть получены аналогичным образом по способу изобретения:
Cathepsin L (ЕС 3.4.22.15), Mason, R.W. et al. Biochem. J. 240,373-377, 1986.Primary 3A:
5'AAGCTTGTCGACCCACGTCCACCAGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3 '
Primary ST:
5'TTCGTTGGATCCTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGCTTT 3 '
The PCR fragment obtained in this way is further cut with Sal1 and Bam H1 enzymes, after which it can be directly inserted into the above-described DNA carrier. Further occurs as described for IL 3. In the previous example, it was described how, using the IgA protease recognition point and the subsequent method, methionine-free therapeutic proteins that start with the sequence of AIa-Pro acids can be obtained using the following method. Other proteins, which, similarly to the examples described above, can be obtained without methionine, namely, using oligonucleotides that contain a recognition region for IgA protease and a region that, by analogy, corresponds to the 5 'or 3' end of the published sequence and can be obtained via PCR magnification. The following are other relevant therapeutic proteins that, in a mature, naturally occurring form, start with AIa-Pro and therefore can be obtained in a similar manner by the method of the invention:
Cathepsin L (EC 3.4.22.15), Mason, RW et al. Biochem. J. 240.373-377, 1986.

Эритропойетин, Lai,P.H.et al. J. Biol. Chem. 261, 3116-3121, 1986. Erythropoietin, Lai, P. H. et al. J. Biol. Chem. 261, 3116-3121, 1986.

Интерлейкин-1 бета, Zsebo, K.M. et al. Blood 71, 962-968, 1988. Interleukin-1 Beta, Zsebo, K.M. et al. Blood 71, 962-968, 1988.

Остеонектин Fisher, L.W. et al. J. Biol. Chem. 262, 9702-9708, 1987. Osteonectin Fisher, L.W. et al. J. Biol. Chem. 262, 9702-9708, 1987.

Тип IV коллагеназы, Collier I.E. et al., J. Biol. Chem. 263, 6579-6587, 1988. Type IV Collagenase, Collier I.E. et al., J. Biol. Chem. 263, 6579-6587, 1988.

Далее таким путем можно получать протеины, которые в зрелой форме начинаются последовательностью аминокислот Ser, Pro. В качестве примера здесь следует назвать:
Альфа-1 антитрипсин, Hill, R.E. et al., Nature 311, 175-177, 1984.Further, in this way, it is possible to obtain proteins that in mature form begin with the amino acid sequence Ser, Pro. An example here is:
Alpha-1 Antitrypsin, Hill, RE et al., Nature 311, 175-177, 1984.

Atrial natriuretic factor, Kambayashi, Y. et al., FEBS Lett. 259, 341-345, 1990. Atrial natriuretic factor, Kambayashi, Y. et al., FEBS Lett. 259, 341-345, 1990.

Другими примерами для протеинов, которые в своей зрелой форме начинаются с Thr-Pro и могут быть соответственно терапевтическими, являются например:
Complement factor B, Campell.R.D. et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 80, 4464-4468, 1983.Other examples for proteins that, in their mature form, start with Thr-Pro and can be therapeutic, for example, are:
Complement factor B, Campell.RD et al., Proc.Nat.Acad.Sci. 80, 4464-4468, 1983.

Аполипопротеин A, Eaton, D.L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 3224-3228. 1987. Apolipoprotein A, Eaton, D.L. et al., Proc. Nat. Acad Sci. 84, 3224-3228. 1987.

Claims

Recombinant granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) having an N-terminal Thr-Pro sequence and substantially free of G-CSF form with methionine at the N-terminus, obtained by IgA protease cleavage of a fusion protein expressed in E. coli cells and containing an IgA protease recognition site between the N-terminal methionine and the G-CSF amino acid sequence.