RU2193413C2 - Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии - Google Patents
Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2193413C2 RU2193413C2 RU98118184/14A RU98118184A RU2193413C2 RU 2193413 C2 RU2193413 C2 RU 2193413C2 RU 98118184/14 A RU98118184/14 A RU 98118184/14A RU 98118184 A RU98118184 A RU 98118184A RU 2193413 C2 RU2193413 C2 RU 2193413C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bsw17
- gly
- leu
- ser
- trp
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 230000007815 allergy Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title abstract description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 16
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 40
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract 1
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 49
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 37
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 30
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 14
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 9
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 6
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 6
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 101710128966 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 5
- 102100038006 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N n,n'-dihexylmethanediimine Chemical compound CCCCCCN=C=NCCCCCC TXOUDPQJASQYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000878611 Homo sapiens High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- -1 for example Chemical compound 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000009121 systemic therapy Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/528—CH4 domain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Сущность изобретения составляют иммуногенные молекулы, включающие по крайней мере один фрагмент пептида, имитирующего естественный эпитоп на поверхности человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом ВSW17 к человеческому IgE, и фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид. Они пригодны для включения в фармацевтические композиции или для изготовления фармацевтических композиций, в частности предназначенных для лечения опосредуемых IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, например, для изготовления вакцин против аллергии. Технический результат - расширение арсенала иммуногенных средств для вакцинации. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 15 ил., 5 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к пептидным иммуногенам и касается ингибирования взаимодействий, которые обычно вызывают стимуляцию тучных клеток и базофилов, индуцированную связыванием с клеткой аллергена, сшитого с IgE, что приводит к выделению фармакологически активных медиаторов, а также к синтезу de novo цитокинов, вовлеченных в регуляцию аллергических и воспалительных реакций. Оно относится к иммуногенным молекулам, включающим фрагмент BSW17-мимеотопного пептида, и к их применению.
Аллергические симптомы вызываются выделением из клеток в окружающую ткань и в сосудистые структуры фармакологически активных медиаторов, таких, как гистамин, лейкотриены и ферменты. Эти медиаторы в норме запасаются или синтезируются de novo в специализированных клетках, называемых тучными клетками и базофильными гранулоцитами. Тучные клетки распределены в ткани животного, а базофилы циркулируют в сосудистой системе. Эти клетки синтезируют и накапливают медиаторы внутри клетки до тех пор, пока не происходит определенная последовательность событий, стимулирующая их выделение.
Роль антител в виде иммуноглобулина Е (IgE) в опосредовании аллергических реакций хорошо известна. IgE представляет собой сложную, состоящую из полипептидных цепей структуру, которая так же, как и у других иммуноглобулинов, состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, сшитых вместе дисульфидными связями в виде Y-образной конфигурации. Каждая легкая цепь имеет две области, при этом одна область - вариабельная (VL) - сшита с областью, которая имеет относительно постоянную аминокислотную последовательность и которая называется константной областью (СL). В отличие от этого тяжелые цепи имеют одну вариабельную область (VH), а в случае IgE - четыре константных области (CH1, СH2, СH3, СH4, также известные как Сε1, Сε2, Сε3, Сε4). Два "плеча" антитела, ответственные за связывание антигена, имеют области с вариабельной полипептидной структурой, и их называют Fab'-фрагментами или F(ab')2, которые представляют собой два Fab'-антигенсвязывающих плеча, сшитых вместе дисульфидными связями. "Хвост", или центральная ось антитела, содержит фиксированную или постоянную последовательность пептидов, и его называют Fc-фрагментом. Fc-фрагмент содержит интерактивные сайты, которые дают возможность антителу взаимодействовать с другими молекулами или клетками иммунной системы, связывая его с их Fc-рецепторами.
Fc-рецепторы представляют собой молекулы, которые специфически связываются с активными молекулярными сайтами внутри Fc-областей иммуноглобулина. Fc-рецепторы могут существовать в виде связанных с мембраной протеинов в наружной плазматической мембране клетки или могут существовать в виде свободных "растворимых" молекул, которые свободно циркулируют в плазме крови или в других жидкостях тела. В организме человека высокоаффинное связывание IgE с рецептором FcεRI происходит в результате сложного взаимодействия протеин-протеин, в котором участвуют различные части домена третьей константной области тяжелой цепи (Сε3) IgE и ближайший к мембране иммуноглобулинподобный домен (α2) субъединицы FcεRIα.
Хотя было установлено, что остатки внутри Сε3-домена константной области тяжелой цепи IgE и областей, принадлежащих к α2-домену рецептора FcεRIα, имеют большое значение для связывания, детальный механизм процесса связывания пока остается неясным. Экспериментальные данные, полученные с помощью измерений переноса флуоресцентной энергии, а также с помощью рассеивания рентгеновских лучей и нейтронов, показали, что человеческий IgE принимает изогнутую форму, которая, как предполагается, придает исключительно высокую аффинность IgE к FcεRI (Кd~10-10M). Кроме того, считается, что эта изогнутая форма также ответственна за образование эквимолярного комплекса между IgE и связанным с клеткой или растворимым FcεRIα, хотя на молекуле IgE могут образовываться идентичные эпитопы на двух Сε3-доменах, ответственных за связывание с рецептором. Эта моновалентность является функционально необходимой, если требуется избежать стимуляции рецептора в отсутствии аллергена (фиг. 1). Интерактивные сайты в зависимости от их функции могут уже быть доступными и, следовательно, способны связываться с клеточными рецепторами. Альтернативно этому они могут быть скрыты до момента связывания антитела с антигеном, после чего антитело может изменить строение, и вследствие этого будут доступными другие активные сайты, которые далее могут стимулировать специфическую иммунную активность. Основываясь на данных о спектре кругового дихроизма, было сделано предположение о том, что конформационное преобразование, оказывающее воздействие на связывание Сε3 с рецептором, является причиной стехиометрического соотношения 1:1 комплекса Fcε/FcεRI на поверхности клетки.
Для аллергического (иммунологического) выделения гистамина в организм из тучных клеток и базофилов молекула IgE должна присоединиться или прикрепиться с помощью своего Fc-фрагмента к сайту клеточного Fc-рецептора, прикрепляя, таким образом, молекулу IgE к тучной клетке или базофилу. Fab'-фрагменты связанных с клеткой молекул IgE должны быть перекрестно сшиты с определенным совместимым антигеном (аллергеном). Когда происходит такое взаимодействие, в тучной клетке или в базофиле автоматически стимулируется выделение гистамина в локальную окружающую среду, вызывая известные симптомы аллергии. В последней фазе реакции происходят другие биохимические процессы, которые приводят к синтезу de novo и выделению цитокинов и других медиаторов [J.V. Ravetch и J.P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991)457-492].
Общепринятые подходы к лечению аллергии включают системную терапию с использованием антигистаминных или стероидных препаратов или десенсибилизацию пациентов; эти подходы не направлены на вмешательство в основное взаимодействие IgE - тучная клетка/базофил. Другие подходы основаны на получении полипептидных цепей, способных блокировать связывание антитела в виде IgE с Fc- рецепторами на поверхностях клеток, и на вытеснении IgE из сайтов связывания, с которыми IgE уже связан. Кроме того, были проведены исследования с целью выяснения природы предполагаемого "эффекторного" сайта внутри Fc-области IgE, который, вероятно, создает иммунологический сигнал, стимулирующий выделение медиатора тучными клетками/базофилами.
Также были сделаны попытки применения рекомбинантных IgE-фрагментов в качестве иммуногенов для получения защитной анти-IgE вакцины, и они оказались эффективными. Основной аргумент против такой вакцины обусловлен опасением того, что использование для иммунизации больших фрагментов IgE может инициировать не только производство ингибиторных антител, но также приводить к поперечному связыванию и тем самым продуцировать анафилактогенные антитела у пациентов (фиг.2).
Целью стратегии, позволяющей преодолеть эту проблему, является выявление наименьших возможных IgE-фрагментов, которые в идеальном случае состоят только из сайта связывания рецептора и которые после связывания оказываются скрытыми внутри комплекса IgE/FcεRI и тем самым более не доступны для поперечного связывания при генерируемом вакциной иммунном ответе. Маловероятно, чтобы попытки реконструировать такую сложную молекулярную структуру оказались успешными, учитывая пространственное удаление различных областей Сε3, вовлеченных во взаимодействие IgE/FcεRI.
В настоящее время установлено, что проблемы, присущие "классическому" подходу, основанному на применении вакцин, преодолеваются в результате использования для активной иммунизации BSW17-мимеотопов либо в виде синтезированных химическим путем пептидов, сшитых с соответствующими носителями, либо в виде рекомбинатных слитых конструкций (например, с овальбумином, IgG и т.д.).
BSW17 представляет собой моноклональное антитело, которое распознает конформационный эпитоп на Fcε, по крайней мере ту его часть, которая находится в Сε3. Линия клеток гибридомы, продуцирующая моноклональное антитело BSW17, депонирована 19 декабря 1996 г. в соответствии с Будапештским договором о депонировании микроорганизмов в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 96121916. Это антитело обладает представляющим интерес профилем биологических активностей, что обобщенно представлено на фиг. 3. BSW17 или BSW17-подобные антитела, циркулирующие в сосудистой системе, защищают от аллергических реакций путем
а) ингибирования стимуляции тучных клеток и базофилов с помощью конкурентного ингибирования взаимодействия IgE/IgERI и
б) снижения концентраций IgE в сыворотке с помощью понижающей регуляции синтеза IgE на уровне В-клеток.
а) ингибирования стимуляции тучных клеток и базофилов с помощью конкурентного ингибирования взаимодействия IgE/IgERI и
б) снижения концентраций IgE в сыворотке с помощью понижающей регуляции синтеза IgE на уровне В-клеток.
В настоящее время с помощью скрининга случайной доступной библиотеки фаговых пептидов были выявлены BSW17-"мимеотопные" пептиды, т.е. пептиды, которые имитируют по крайней мере часть сложного конформационного эпитопа на молекуле IgE. Синтезированные химическим путем мимеотопные пептиды, сшитые с иммуногенным носителем-протеином, могут использоваться, например, в качестве вакцин для специфической генерации антител в хозяине-аллергике, которые ингибируют стимуляцию тучных клеток/базофилов путем блокирования связывания IgE/FcεRIα и/или синтеза IgE. В качестве мимеотопов антител к IgE они индуцируют иммунный ответ, приводящий к продуцированию ВSW17-подобных антител в хозяине. Поскольку установлено, что BSW17 являются неанафилактогенными и ингибируют связывание IgE/PcεRI и синтез IgE на поверхности В-клеток, эти антитела, секретируемые в ответ на введение вакцин на основе ВSW17-мимеотопа, обладают аналогичными защитными свойствами. Иммунный ответ является очень специфичным, поскольку в отличие от "классического подхода, основанного на применении вакцин", в этом случае отсутствуют происходящие из IgE протеиновые фрагменты, которые могут генерировать поперечное связывание антител у иммунизированных пациентов (фиг.4).
Таким образом, изобретение относится к иммуногенным молекулам, включающим
(а) по крайней мере один фрагмент BSW17-мимеотопного пептида и
(б) фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид, далее кратко называемым в контексте настоящего описания "иммуногенами по изобретению".
(а) по крайней мере один фрагмент BSW17-мимеотопного пептида и
(б) фрагмент, способный вызвать иммунный ответ на этот пептид, далее кратко называемым в контексте настоящего описания "иммуногенами по изобретению".
Компонент (а) предпочтительно состоит максимум из пяти, предпочтительно из одного или двух, особенно предпочтительно из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида. Компонент (б) предпочтительно является обычным иммунногенным носителем, представленным далее в настоящем описании, предпочтительно БСА или гемоцианином лимфы улитки (KLH).
BSW17-мимеотопный пептид в компоненте (а) предпочтительно в целом включает примерно до 15 аминокислот, и он представлен, например, одной из приведенных ниже последовательностей (А)-(С) (SEQ ID NO: 1-17). Однако при необходимости он может включать дополнительные компоненты для связывания гаптена с носителем, например, для облегчения сшивания с компонентом (б) или дальнейшего процессинга. Так, в частности, в том случае, когда BSW17-мимеотопный пептид является циклическим, два конца могут, например, соединяться вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, образующих дисульфидный мостик, или концы могут быть химически поперечно сшиты, например, с помощью лизина; или, когда BSW17-мимеотопный пептид является линейным, С-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем амидирования, и/или N-концевая аминокислота может быть блокирована общепринятым способом путем ацетилирования. Кроме того, фрагменты BSW17-мимеотопного пептида в компоненте (а), например, представленные ниже предпочтительные фрагменты (А) - (С), могут быть фланкированы в иммуногенах по изобретению несколькими, предпочтительно одной или двумя дополнительными вспомогательными группами, такими, как ацетил, цистеин или лизин, и/или дополнительной сшивающей группой, такой, как DC или BSS, как это, например, описано для конкретных иммуногенов по изобретению, приведенных далее в примере 8 в виде конъюгатов (2)-(4), (6)-(11), (13) и (14).
Антитела, секретируемые в ответ на иммуногены по изобретению, в отличие от антител, продуцируемых гибридомой BSW17, должны быть эндогенными, и, следовательно, они могут использоваться для профилактического лечения больных людей. Они могут быть получены путем соответствующего сшивания компонентов (а) и (б), как описано выше.
Иммуногены по изобретению представлены, например, в форме полимерного пептида или рекомбинантного слитого протеина, причем мономерный компонент полимерного пептида или одна составляющая слитого протеина представляет собой фрагмент BSW17-мимеотопного пептида (а), а другая часть полимерного пептида или слитого протеина представляет собой фрагмент (б), способный вызвать иммунный ответ.
Предпочтительно они находятся в форме конъюгата, состоящего по крайней мере из одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида (а) и фрагмента иммуногенного носителя (б).
Предпочтительные фрагменты ВSW17-мимеотопного пептида, т.е. компонент (а), иммуногенов по изобретению в основном состоят из аминокислот или имеют аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (SEQ ID NO:1),
Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б) (SEQ ID NO:2),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (B) (SEQ ID NO:3),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г) (SEQ ID NO:4),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д) (SEQ ID NO:5),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E) (SEQ ID NO:6),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж) (SEQ ID NO:7),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З) (SEQ ID NO:8),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И) (SEQ ID NO:9),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K) (SEQ ID NO:10),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л) (SEQ ID NO:11),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M) (SEQ ID NO:12),
GIn-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H) (SEQ ID NO:13),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (О) (SEQ ID NO:14),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П) (SEQ ID NO:15),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (SEQ ID NO:16)
или
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (С) (SEQ ID NO:17).
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (SEQ ID NO:1),
Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б) (SEQ ID NO:2),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (B) (SEQ ID NO:3),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г) (SEQ ID NO:4),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д) (SEQ ID NO:5),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E) (SEQ ID NO:6),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж) (SEQ ID NO:7),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З) (SEQ ID NO:8),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И) (SEQ ID NO:9),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K) (SEQ ID NO:10),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л) (SEQ ID NO:11),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M) (SEQ ID NO:12),
GIn-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H) (SEQ ID NO:13),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (О) (SEQ ID NO:14),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П) (SEQ ID NO:15),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (SEQ ID NO:16)
или
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (С) (SEQ ID NO:17).
Более предпочтительными являются представленные выше последовательности (А), (Г) и (Ж), прежде всего (А) и (Г).
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, в частности вакцинам, содержащим иммуногенные молекулы, как они определены выше, и адъювант.
Изобретение также относится к лигандам, т.е. к антителам к BSW17-мимеотопным пептидам или происходящим из них фрагментам, применяемым для "пассивной иммунизации" (см. ниже), причем антитело или его фрагмент также распознает натуральный эпитоп для BSW17 на человеческом IgE, a именно, изобретение относится к лигандам, включающим домен антитела, специфический по отношению к фрагменту BSW17-мимеотопного пептида, как он определен выше, причем домен антитела является реактивным по отношению к последовательности аминокислот тяжелой цепи IgE, которая включает натуральный эпитоп, распознаваемый BSW17. Такие лиганды могут быть получены у млекопитающих в виде поли- или моноклональных антител; предпочтительно они находятся в форме моноклональных антител, предпочтительно в форме их Fab'-фрагмента или F(аb')2-фрагмента,
Изобретение также относится к способу получения иммуногена по изобретению, включающему ковалентное сшивание
(а) по крайней мере одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида с
(б) фрагментом, способным вызвать иммунный ответ на этот пептид.
Изобретение также относится к способу получения иммуногена по изобретению, включающему ковалентное сшивание
(а) по крайней мере одного фрагмента BSW17-мимеотопного пептида с
(б) фрагментом, способным вызвать иммунный ответ на этот пептид.
Изобретение далее относится к иммуногенным молекулам, как они определены выше, предназначенным для использования в качестве фармацевтических препаратов, например, при лечении опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергия и атопический дерматит. Кроме того, изобретение относится к применению иммуногенных молекул, как они определены выше, при изготовлении фармацевтических композиций, в частности вакцин, предназначенных для лечения опосредованных IgE заболеваний, в частности аллергии и атопического дерматита.
Далее, изобретение относится к способу профилактической или лечебной иммунизации против опосредованных IgE заболеваний, таких, как аллергии и атопический дерматит, включающему введение терапевтически эффективного количества иммуногенных молекул, как они определены выше, пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Иммуногены по изобретению, будучи практически неспособными вызывать нецитолитическое выделение гистамина, способны вызывать появление антител, обладающих сильной серологической перекрестной реактивностью по отношению к аминокислотным последовательностям-мишеням Fc-фрагмента IgE. Таким образом, они пригодны для включения в вакцины или для применения в качестве вакцин.
Начальную дозу иммуногена (например, от приблизительно 0,2 мг до приблизительно 5 мг, предпочтительно приблизительно 1 мг) вводят, например, внутримышечно, после чего через 14-28 дней вводят повторные (бустерные) дозы этого же препарата. Дозировка, как очевидно, должна зависеть в определенной степени от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента. Иммунизация может быть "активной" или "пассивной".
При "активной" иммунизации пациент получает иммуноген по изобретению, и при этом анти-h IgE -ответ активно индуцируется иммунной системой пациента.
"Пассивную" иммунизацию получают при введении пациенту, страдающему опосредованным IgE заболеванием, предпочтительно путем инъекции либо поликлональных, либо моноклональных антител к BSW17-мимеотопу.
Поликлональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть получены путем введения иммуногена по изобретению, предпочтительно с использованием адъюванта, животному из класса млекопитающих и отбора образовавшейся в результате иммунной сыворотки. Улучшенные титры могут быть получены при повторных инъекциях через определенный промежуток времени. Не существует особых ограничений в отношении видов млекопитающих, которые могут быть использованы для получения антител; обычно предпочтительно использовать кроликов или морских свинок, однако также могут использоваться лошади, кошки, собаки, козы, свиньи, крысы, коровы, овцы и т.д. Для получения антител определенное количество иммуногена по изобретению разбавляют до требуемой концентрации, например, физиологическим раствором и полученный разбавленный раствор смешивают с полным адъювантом Фрейнда с получением суспензии. Суспензию вводят млекопитающим, например, внутрибрюшинно, например, кролику, используя на одно введение от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2500 мкг иммуногена по изобретению. Для иммунизации суспензию предпочтительно вводят приблизительно каждые две недели в течение примерно 2-3 месяцев, предпочтительно примерно в течение 1 месяца. Антитело получают, беря кровь иммунизированного животного по истечении 1-2 недель после последней обработки, центрифугируя кровь и выделяя сыворотку из крови.
Моноклональные антитела к BSW17-мимеотопу могут быть, например, человеческими или мышиными. Предпочтительно пациента следует лечить препаратом, содержащим Fab'-фрагмент мышиного моноклонального антитела или химерного человеческого-мышиного антитела (которое содержит человеческую Fc-область и мышиную Fab'-область), с целью минимизации любой вредной реакции на чужеродный животный иммуноглобулин. Мышиные моноклональные антитела могут быть получены согласно методу Köhler и Milstein (Köhler G. и Milstein С., Nature 256 [1975] 495), например, путем слияния клеток селезенки гипериммунизированных мышей с пригодной линией клеток миеломы мыши. Для получения человеческих моноклональных антител могут использоваться многочисленные методы, включая получение с использованием:
(1) трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV) B-клеток;
(2) линии клеток для гибридизации В-лимфоцитов;
(3) человеческих-мышиных гибридом;
(4) человеческих-человеческих гибридом;
(5) человеческих • человеческих-мышиных гетерогибридом; и
(6) репертуарного клонирования (в доступном фаге).
(1) трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV) B-клеток;
(2) линии клеток для гибридизации В-лимфоцитов;
(3) человеческих-мышиных гибридом;
(4) человеческих-человеческих гибридом;
(5) человеческих • человеческих-мышиных гетерогибридом; и
(6) репертуарного клонирования (в доступном фаге).
Наиболее предпочтительными являются человеческие • человеческие-мышиные гетерогибридомы, и они включают объединенные предпочтительные характеристики обоих человеческих и мышиных родительских типов клеток. Линии клеток человеческой-мышиной гетерогибридомы считаются пригодными для В-клеточного слияния (Teng N.N.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 [1983] 7308).
С целью иммунизации антитело может вводиться хозяину в основном с помощью внутримышечной инъекции. Может применяться любой общепринятый жидкий или твердый носитель, который является приемлемым для хозяина и не оказывает вредных побочных воздействий на хозяина и не оказывает отрицательных воздействий на вакцину. В качестве носителя может использоваться забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) с физиологическим значением рН, например со значением рН приблизительно 6,8-7,2, предпочтительно приблизительно 7,0, индивидуально либо с приемлемым адъювантом, таким, как адъювант на основе гидроксида алюминия. Концентрация иммуногенного антигена может варьироваться от приблизительно 50 мкг до приблизительно 500 мкг, предпочтительно от приблизительно 200 мкг до приблизительно 300 мкг на инъекцию, в объеме растворителя, обычно составляющем от приблизительно 0,25 мл до приблизительно 1 мл, предпочтительно 0,5 мл. После первоначальной инъекции могут потребоваться многократные инъекции, и они могут быть сделаны, например, с ежегодными интервалами.
Касательно "активной" иммунизации следует отметить, что ее предпочтительно применять для человека, однако другие виды млекопитающих, например собаки, могут быть обработаны аналогичным образом с использованием аналогичных мимеотопов, соответствующих IgE данного вида. Понятие "иммуногенный носитель" в контексте настоящего описания включает такие материалы, которые обладают способностью независимо вызывать иммуногенный ответ у животного-хозяина и которые могут быть ковалентно сшиты с полипептидом либо непосредственно путем образования пептидных или сложноэфирных связей между свободной карбоксильной, амино- или гидроксильными группами в полипептиде и соответствующими группами на материале иммуногенного носителя, либо в альтернативном варианте путем связи через обычные бифункциональные сшивающие группы, либо в виде слитого протеина.
Примеры таких носителей включают: альбумины, такие, как БСА; глобулины; тироглобулины; гемоглобулины; гемоцианины (в частности гемоцианин лимфы улитки [KLH] ); протеины, экстрагируемые из аскарид, например, экстракты аскарид, описанные в J. Immun. III [1973] 260-268, J. Immun. 122 [1979] 302-308, J. Immun. 98 [1967] 893-900 и в Am. J. Physiol. 199 [1960] 575-578, или их очищенные продукты; полилизин; полиглутаминовую кислоту; сополимеры лизина и глутаминовой кислоты; сополимеры, содержащие лизин или орнитин, и т.д. В настоящее время вакцины производятся с использованием в качестве материала иммуногенного носителя токсоида двукрылых или столбнячного токсина (Lepow M.L. и др., J. of Infectious Diseases 150 [1984] 402-406; Coen Beuvery E. и др., Infection and Immunity 40 [1983] 39-45), и эти токсоидные материалы также могут применяться в настоящем изобретении. Очищенное протеиновое производное туберкулина (PPD) является особенно предпочтительным для использования в схеме "активной" иммунизации, поскольку (1) оно не индуцирует сам Т-клеточный ответ (т.е. оно является в действительности "Т-клеточным гаптеном"), но еще ведет себя как полностью процессированный антиген и поэтому распознается Т-клеткой; (2) известно, что оно является одним из наиболее сильных гаптеновых "носителей" с точки зрения механизма распознавания; и (3) оно может применяться для человека без дополнительного тестирования.
В качестве агентов, связывающих гаптен-носитель, могут использоваться также обычно применяемые в препаратах антигены, например, описанные выше или приведенные далее в примерах.
Процесс по изобретению ковалентного сшивания компонента (а) с фрагментом (б) может быть осуществлен известным способом. Так, например, для непосредственного ковалентного сшивания предпочтительно использовать в качестве сшивающего агента производные бис-N-сукцинимидила, более предпочтительно бис(сульфосукцинимидил)суберат (БСС). Глутаровый альдегид или карбодиимид, более предпочтительно дициклогексилкарбодиимид (ДК) или 1 -этил-3 -(3-диметиламинопропил)карбодиимид также могут использоваться для ковалентного сшивания пептида (а) с материалом иммуногенного носителя (б).
Количество гаптена и агента, связывающего гаптен-носитель [т.е. компонента (а)], и носителя [т.е. компонента (б) ] может быть легко оценено общепринятым способом. Предпочтительно, чтобы применяемое соотношение по массе между носителем и гаптеном составляло от приблизительно 1 до приблизительно 6, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 5, а соотношение молярных эквивалентов агента, связывающего гаптен-носитель, и гаптена составляло от приблизительно 5 до приблизительно 10. После взаимодействия носитель связывают с гаптеном с помощью агента, связывающего гаптен-носитель, получая требуемую композицию антигена в виде комплекса пептид-носитель. Полученный иммуноген по изобретению может быть легко выделен общепринятыми методами, например, диализом, гель-фильтрацией, фракционированием методом осаждения и т.д.
Получение исходных материалов может осуществляться обычным способом. Пептиды, пригодные для использования в качестве компонента (а), могут, например, быть выделены путем скрининга случайных доступных библиотек фаговых пептидов и легко синтезированы, например, с помощью обычных методов с использованием твердых фаз, например, для циклических пептидов с помощью метода твердых фаз с использованием хорошо известного способа "F-mос", или в альтернативном варианте могут быть выявлены с использованием пептидомиметической стратегии путем скрининга случайным образом синтезированных пептидов.
Фиг. 1. Взаимодействие между IgE и рецептором IgERI, обладающим высокой аффинностью к нему.
Фиг.2. "Классической" подход, основанный на применении анти-IgE-вакцины.
Фиг.3. Профиль биологической активности BSW17.
Фиг.4. Иммунотерапия, основанная на применении BSW17-мимеотопа.
Фиг.5. Специфичное распознавание BSW17 BSW17-мимеотопами фага.
Фиг.6. Ингибирование связывания IgE/BSW17 BSW17-мимеотопами фага.
Фиг. 7. Связывание синтезированного химическим путем BSW17-мимеотопного пептида с BSW17.
Фиг. 8а. Распознавание BSW17 конъюгата циклический BSW17-мимеотоп GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС) (SDS 236) и конъюгата Fcε (500-509)-KLH (БСС) (SDS 237).
Фиг.8б. Распознавание BSW17 различных конъюгатов BSW17-мимеотопа.
Фиг. 9а. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [БСА (ДК)] и конъюгата Fcε (500-509) [KLH (глутаральдегид)]
Фиг. 9б. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [KLH (ДК); Lys].
Фиг. 9б. Специфическое распознавание BSW17 конъюгатов BSW17-мимеотопа [KLH (ДК); Lys].
Фиг. 10а. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (1).
Фиг. 10б. Иммунный ответ на человеческий IgE, индуцированный у кроликов после иммунизации конъюгатами BSW17-мимеотопа (2).
Фиг. 11. Титры антител к BSW17-мимеотопу, вырабатываемых в сыворотке у кроликов после иммунизации.
Фиг.12. Изотипическая специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопом.
Фиг.13. Конкуренция за связывание IgE между сывороткой к BSW17-мимеотопу и BSW17.
Фиг. 14. Связывание с hIgE очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу.
Фиг. 15. Исследование анафилактогенности в отношении клеток крови человека иммунной сыворотки кролика к BSW17-мимеотопу и очищенных с помощью аффинной хроматографии антител к BSW17-мимеотопу:
- R2/0, R4/0: предиммунная сыворотка кроликов R2 и R4 до вакцинации BSWn-мимеотопом;
- R2/SDS214, R4/SDS213: сыворотка кроликов R2 и R4 через 65 дней после первичной иммунизации BSW17;
- антиSDS213, антиSDS214: очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к BSW17-мимеотопу;
- R2/0 PC, R4/0 PC: положительная контрольная стимуляция (PC) в присутствии сыворотки кролика.
- R2/0, R4/0: предиммунная сыворотка кроликов R2 и R4 до вакцинации BSWn-мимеотопом;
- R2/SDS214, R4/SDS213: сыворотка кроликов R2 и R4 через 65 дней после первичной иммунизации BSW17;
- антиSDS213, антиSDS214: очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к BSW17-мимеотопу;
- R2/0 PC, R4/0 PC: положительная контрольная стимуляция (PC) в присутствии сыворотки кролика.
Концентрации образцов:
А = 0,1 мкг антител к ВSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
В = 1,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
С = 5,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл.
А = 0,1 мкг антител к ВSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
В = 1,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл,
С = 5,0 мкг антител к BSW17-мимеотопу (или эквивалентов в полной сыворотке кролика) на 1 мл.
Сокращения
Ас - ацетил;
СА - сульфат аммония;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
БСС - бис(сульфосукцинимидил)суберат;
BSW17 - моноклональное антитело в виде IgG к СН3- эпитопу нативного IgE (J. Knutti-Müller и др., Allergy 41 [1986] 457-465; S. Miescher и др., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 [1994] 75);
BSW17-мимеотопный пептид - пептид, имитирующий природный эпитоп человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом BSW17 к человеческому IgE;
КОЕ - колониеобразующие единицы;
(DK) - дигексилкарбодиимид;
EBV - вирус Эпштейна-Барра;
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ;
FcεRI - рецептор I, обладающий высокой аффинностью к константной области IgE;
ФТС - фетальная телячья сыворотка;
gam - козий антимышиный;
gar - козий антикроличий;
h - человеческий;
HEPES - N-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота;
HRP - пероксидаза из хрена (= РОХ);
HSA - человеческий сывороточный альбумин;
IgE - иммуноглобулин Е;
ИПТГ - изопропил-β-D-тиогалактозид;
KLH - гемоцианин лимфы улитки;
Le27 - моноклональное антитело к человеческому IgE (Allergy [1986], см. выше; Int. Arch. Allergy Immunol. [1994], см. выше;
LB-планшеты - планшеты со средой Луриа-Бертани;
мимеотопный пептид - пептид, который имитирует по крайней мере часть конформационного эпитопа молекулы антитела;
ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РОХ - пероксидаза из хрена (= HRP);
PPD - очищенное протеиновое производное туберкулина;
rhIL-3 - рекомбинантный человеческий интерлейкин-3;
РИА-планшеты - планшеты для радиоиммунного анализа;
RPMI1640 - стандартная среда для культуры клеток (фирма Sigma, St. Louis, США);
SB-среда - натрийсодержащая среда Бакто (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция);
SLt - растворимый лейкотриен;
ЗТФР - забуференный трис физиологический раствор;
VCS - фаг-хелпер VCS M13 (фирма Stratagen, США).
Ас - ацетил;
СА - сульфат аммония;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
БСС - бис(сульфосукцинимидил)суберат;
BSW17 - моноклональное антитело в виде IgG к СН3- эпитопу нативного IgE (J. Knutti-Müller и др., Allergy 41 [1986] 457-465; S. Miescher и др., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 [1994] 75);
BSW17-мимеотопный пептид - пептид, имитирующий природный эпитоп человеческого IgE, распознаваемый моноклональным антителом BSW17 к человеческому IgE;
КОЕ - колониеобразующие единицы;
(DK) - дигексилкарбодиимид;
EBV - вирус Эпштейна-Барра;
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ;
FcεRI - рецептор I, обладающий высокой аффинностью к константной области IgE;
ФТС - фетальная телячья сыворотка;
gam - козий антимышиный;
gar - козий антикроличий;
h - человеческий;
HEPES - N-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота;
HRP - пероксидаза из хрена (= РОХ);
HSA - человеческий сывороточный альбумин;
IgE - иммуноглобулин Е;
ИПТГ - изопропил-β-D-тиогалактозид;
KLH - гемоцианин лимфы улитки;
Le27 - моноклональное антитело к человеческому IgE (Allergy [1986], см. выше; Int. Arch. Allergy Immunol. [1994], см. выше;
LB-планшеты - планшеты со средой Луриа-Бертани;
мимеотопный пептид - пептид, который имитирует по крайней мере часть конформационного эпитопа молекулы антитела;
ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РОХ - пероксидаза из хрена (= HRP);
PPD - очищенное протеиновое производное туберкулина;
rhIL-3 - рекомбинантный человеческий интерлейкин-3;
РИА-планшеты - планшеты для радиоиммунного анализа;
RPMI1640 - стандартная среда для культуры клеток (фирма Sigma, St. Louis, США);
SB-среда - натрийсодержащая среда Бакто (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция);
SLt - растворимый лейкотриен;
ЗТФР - забуференный трис физиологический раствор;
VCS - фаг-хелпер VCS M13 (фирма Stratagen, США).
5. Примеры
В следующих примерах, которые иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем, температура указана в градусах Цельсия (oС).
В следующих примерах, которые иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его объем, температура указана в градусах Цельсия (oС).
Пример 1. Антиаллергический потенциал моноклонального антитела BSW17 к hIgE
В качестве модели для тестирования антиаллергической способности BSW17 и BSW17-пoдoбныx антител, вырабатывающихся у больных людей при активной иммунизации BSW17-мимеотопными пептидами, показано воздействие BSW17 на выделение гистамина базофилподобными клетками человека, полученными из клеток костного мозга, культивируемых вместе с rhIL-3.
В качестве модели для тестирования антиаллергической способности BSW17 и BSW17-пoдoбныx антител, вырабатывающихся у больных людей при активной иммунизации BSW17-мимеотопными пептидами, показано воздействие BSW17 на выделение гистамина базофилподобными клетками человека, полученными из клеток костного мозга, культивируемых вместе с rhIL-3.
Одноядерные клетки получают из костного мозга пациентов, нуждающихся в замене головки бедренной кости, с помощью осаждения в градиенте плотности в растворе Ficoll-Hypaque (1,077 г/мл; 400 г). 5•105 клеток/мл культивируют в среде RPMI1640, содержащей 15% ФТС и 2 нг/мл человеческого rhIL-3. После 6-дневного культивирования при 37o С в 5% СО2 добавляют равный объем среды, содержащей rhIL-3. На 12-й день клетки собирают и используют для пассивной сенсибилизации и определяют выделение гистамина. Приблизительно 5•105 культивируемых клеток костного мозга инкубируют в НА-буфере (20мМ HEPES; рН = 7,4; 0,3 мг/мл HSA) с добавлением 500 нг/мл человеческого IgE в общем объеме 1 мл в присутствии 50-кратного избытка моноклонального антитела к IgE или без него. После инкубации в течение 2 ч при 37o С клеточные супернатанты используют для измерения содержания гистамина в процессе пассивной сенсибилизации. Для стимуляции выделения гистамина используют клеточные дебрисы. Для определения степени непосредственного выделения гистамина пассивно сенсибилизированные клетки костного мозга ресуспендируют в 0,3 мл НСМ-буфера (НА-буфер, содержащий 0,6М СаСl2 и 1мМ MgCl2) и инкубируют с 0,1 мкг/мл анафилактогенного моноклонального антитела Le27 к IgE. Количество гистамина в супернатанте и в осажденных клетках измеряют с помощью анализатора типа Technicon Autoanalyzer II (фирма Technicon, Tarrytown, New York, США). Подсчитывают процент выделения гистамина [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте)/(количество гистамина в супернатанте + количество гистамина в клеточном дебрисе) •100]. Подсчитывают процент выделения гистамина в процессе пассивной сенсибилизации [по следующей формуле: выделение гистамина (%) = (количество гистамина в супернатанте (после пассивной сенсибилизации))/(количество гистамина в супернатанте (после стимуляции) + количество гистамина в супернатанте (после сенсибилизации) + количество гистамина в клеточном дебрисе)} •100]. Оценивают воздействие антитела к IgE на специфическое выделение гистамина [по следующей формуле: специфическое выделение гистамина (%) = % общего выделения гистамина минус % спонтанного выделения гистамина].
Результаты трех независимых экспериментов обобщены в табл. 1.
Из данных, приведенных в таблице 1, очевидно, что в клетках костного мозга, инкубированных с IgE и BSW17, в процессе сенсибилизации не происходит выделения гистамина, но происходит ингибирование стимуляции при использовании Le27. Клетки костного мозга, инкубированные с IgE и Le27, стимулируются уже в процессе пассивной сенсибилизации до такой степени, что уже более не может происходить выделение гистамина в процессе вторичной инкубации с использованием этого анафилактогенного моноклонального антитела. В клетках костного мозга, пассивно сенсибилизированных без какого-либо моноклонального антитела к IgE, происходит эффективное выделение гистамина после последующей стимуляции с использованием Le27.
Отсюда может быть сделано заключение о том, что a) BSW17 само по себе является неанафилактогенным и б) BSW17 предотвращает выделение человеческими базофилами гистамина, индуцируемое стимулирующими агентами. Таким образом, можно ожидать, что продуцирование BSW17- подобных антител у страдающих аллергией пациентов путем активной иммунизации с использованием BSWn-мимеотопных пептидов должно защищать иммунизированных хозяев от развития аллергических реакций.
Пример 2. Скрининг доступной библиотеки случайных фаговых пептидов и отбор позитивных клонов
Бактериофаговые частицы, специфически распознаваемые BSW17, идентифицируют с помощью биопэннинга библиотек фагов, дающих линейные или кольцевые случайные пептиды длиной 6-15 аминокислотных остатков, слитые с фаговыми пептидами р11 и pVIII соответственно. Для амплификации библиотек фагов 2 мл жидкой культуры штамма E.coli XL-1-голубой, выращенной в SB-среде до оптической плотности ОП600, равной 1,0,инкубируют с 10 фагов в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 10 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл карбенициллина, и 10 мкл, 1 мкл и 0,1 мкл соответственно высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. Культуры инкубируют при 37oС при интенсивном встряхивании в течение 1 ч, затем добавляют 100 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, и инкубацию продолжают в течение 1 ч. Добавляют 1012 КОЕ фага-хелпера VCS М13. После интенсивного встряхивания при 37oС в течение 2 ч добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. После центрифугирования при 4000•g в течение 20 мин при 4oС супернатанты смешивают с 38 мл охлажденного на льду стерильного профильтрованного раствора, содержащего 12% NaCl и 16% ПЭГ 8000, охлаждают на льду в течение 30 мин и центрифугируют в течение 30 мин при 10000•g при 4oС. Фаговый дебрис растворяют в 2 мл ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, и хранят при 4oС. Для биопэннинга РИА-планшеты типа Costar (Costar 3690) покрывают (сенсибилизируют) 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и выдерживают в течение ночи при 4oС, после чего блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина. Добавляют 2•10 КОЕ фагов и инкубируют при 37oС в течение 2 ч, затем десятикратно промывают смесью ЗФР/0,1%-ный Твин 20. Лунки промывают водой и связанные фаги элюируют 0,1М НС1, рН 2,2, общим объемом 200 мкл в течение 10 мин. Элюированные фаги нейтрализуют 2М щелочным раствором трис и амплифицируют, как описано выше.
Бактериофаговые частицы, специфически распознаваемые BSW17, идентифицируют с помощью биопэннинга библиотек фагов, дающих линейные или кольцевые случайные пептиды длиной 6-15 аминокислотных остатков, слитые с фаговыми пептидами р11 и pVIII соответственно. Для амплификации библиотек фагов 2 мл жидкой культуры штамма E.coli XL-1-голубой, выращенной в SB-среде до оптической плотности ОП600, равной 1,0,инкубируют с 10 фагов в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют 10 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл карбенициллина, и 10 мкл, 1 мкл и 0,1 мкл соответственно высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. Культуры инкубируют при 37oС при интенсивном встряхивании в течение 1 ч, затем добавляют 100 мл SB-среды, содержащей 10 мг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, и инкубацию продолжают в течение 1 ч. Добавляют 1012 КОЕ фага-хелпера VCS М13. После интенсивного встряхивания при 37oС в течение 2 ч добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. После центрифугирования при 4000•g в течение 20 мин при 4oС супернатанты смешивают с 38 мл охлажденного на льду стерильного профильтрованного раствора, содержащего 12% NaCl и 16% ПЭГ 8000, охлаждают на льду в течение 30 мин и центрифугируют в течение 30 мин при 10000•g при 4oС. Фаговый дебрис растворяют в 2 мл ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, и хранят при 4oС. Для биопэннинга РИА-планшеты типа Costar (Costar 3690) покрывают (сенсибилизируют) 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и выдерживают в течение ночи при 4oС, после чего блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина. Добавляют 2•10 КОЕ фагов и инкубируют при 37oС в течение 2 ч, затем десятикратно промывают смесью ЗФР/0,1%-ный Твин 20. Лунки промывают водой и связанные фаги элюируют 0,1М НС1, рН 2,2, общим объемом 200 мкл в течение 10 мин. Элюированные фаги нейтрализуют 2М щелочным раствором трис и амплифицируют, как описано выше.
Для выделения позитивных клонов 50 мкл культуры штамма E.coli XL-I-голубой, выращенной в SB-среде до ОП600, равной 1,0, инкубируют с 1 мкл амплифицированных фагов с титром 10-8 после трех циклов пэннинга в течение 15 мин при комнатной температуре, затем высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина, и выращивают в течение ночи. Колонии отбирают случайным образом и высевают на LB-планшеты, содержащие 100 мкг/мл карбенициллина. После инкубации в течение 4 ч при 37oС на них сверху помещают нитроцеллюлозные фильтры, пропитанные 10мМ ИПТГ, и инкубацию продолжают в течение ночи при 32oС. Фильтры удаляют и инкубируют при 37oС в течение 30 мин в атмосфере СНС1з. Бактериальные дебрисы удаляют путем инкубирования фильтров в течение 1 ч в смеси, в 100 мл которой содержится 50мМ трис, рН 8, 150мМ NaCl, 5мМ MgCl2, 3%-ный БСА, 100 ед. ДНКазыI и 40 мг лизозима, блокируют в ЗТФР, 25 содержащем 1,5% казеина, и инкубируют в течение ночи с BSW17-POX (BSW17, сшитый с РОХ) в ЗТФР, содержащем 1,5% казеина. Фильтры промывают каждый раз по 10 мин ЗТФР, смесью ЗТФР/0,5% Твин 20 и затем ЗТФР. Для окрашивания полосы инкубируют в ЗТФР, содержащем в 600 мкг 4-хлор-1-нафтола на 1 мл и 0,042% перекиси водорода.
Пример 3. Характеристика фаговых частиц, дающих пептиды, которые имитируют пептид природного эпигона BSW17 (BSW17-мимеотопные пептиды)
Было обнаружено, что различные фаговые частицы, дающие кольцевые пептиды, состоящие из семи, восьми или девяти аминокислот, или линейные пептиды, состоящие из 10 и 15 аминокислотных остатков соответственно, связываются с BSW17. Определяли нуклеотидную последовательность ДНК, которая кодирует эти пептиды. На основе их гомологии друг с другом, а также с гомологичными областями в Feε было выявлено три группы фагов, дающих пептиды, распознаваемые BSW17. Обобщенные данные приведены в табл. 2.
Было обнаружено, что различные фаговые частицы, дающие кольцевые пептиды, состоящие из семи, восьми или девяти аминокислот, или линейные пептиды, состоящие из 10 и 15 аминокислотных остатков соответственно, связываются с BSW17. Определяли нуклеотидную последовательность ДНК, которая кодирует эти пептиды. На основе их гомологии друг с другом, а также с гомологичными областями в Feε было выявлено три группы фагов, дающих пептиды, распознаваемые BSW17. Обобщенные данные приведены в табл. 2.
Как можно видеть из табл. 2, С-концевые части пептидов группы А являются высококонсервативными, a N-концевые части, хотя они и являются более вырожденными, содержат положительно заряженные полярные аминокислоты. Это распределение заряда, по-видимому, является существенным для распознавания BSW17, поскольку один клон, который имеет отличающийся по этой характеристике N-конец, обладает только очень слабой способностью связываться с BSW17. В Fcε не удалось обнаружить ни одного непрерывного участка аминокислот, обладающего значительной гомологией последовательности. Однако проведенный сравнительный анализ сходства последовательностей позволяет определить место этих пептидов на участке аминокислот, расположенном от положения 500 до 508 в Сε4-домене. По данным Stanworth и др. [Lancet 336 (1990) 1279], декапептид Fcε, состоящий из аминокислот, находящихся в положениях 500-509, участвует в стимуляции тучной клетки при связывании IgE с рецептором.
Пептиды, принадлежащие к группе Б. также обладают высокой гомологией друг с другом. Кроме того, их N-концевая часть практически идентична аминокислотам, находящимся в положениях 370-375 Fcε. Эта последовательность является частью Сε3 и содержит область, которая, как было установлено, участвует в связывании IgE с рецептором, обладающим высокой аффинностью к нему, или является последовательностью, соседней с этой областью. Это открытие объясняет ингибирование BSW17 взаимодействия IgE/IgERL.
Можно заключить, что сложный конформационный эпитоп, распознаваемый BSW17, содержит конформационные структуры, представленные аминокислотными участками 500-508 (внутри Сε4) и 370-375 (внутри Сε) молекулы IgE [нумерация дана в соответствии с публикацией Е.А. Padlan и D.R. Davies, Molecul. Immunol. 23 (1986) 1063]. Таким образом, антитела, вырабатываемые организмом при иммунизации мимеотопами из вышеуказанных групп А и Б, сшитыми с молекулой иммуногенного носителя, должны защищать от аллергических реакций путем блокирования связывания IgE с рецептором, обладающим высокой аффинностью к нему, и/или путем стимуляции дегрануляции клеток мишени.
Пептиды, представленные в группе В таблицы, не обладают значительной гомологией ни друг с другом, ни с Fcε. Следовательно, они представляют собой "истинные мимеотопы", имитирующие трехмерную структуру, распознаваемую BSW17. Таким образом, применение этих мимеотопов в качестве иммуногенов, также может привести к продуцированию антиаллергических BSW17-подобных антител в иммунизированном хозяине.
В приведенных ниже примерах 4-6 для отобранных мимеотопов показано получение иммунного ответа, подобного ответу на BSW17, специфически направленного по отношению к BSW17 эпитопу в составе человеческого IgE.
Пример 4. Специфическое распознавание BSW17 бактериофагов, дающих BSW17-мимеотопные пептиды
Связывание мимеотопных пептидов, даваемых фаговыми частицами (группа А таблицы 2: первый клон обозначает клон 1 на фиг. 5= Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=SEQ ID NO:18; второй клон обозначает клон 18 на фиг. 5= Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys= SEQ ID NO:19), с антигенспецифичными гипервариабельными участками BSW17 подтверждено с помощью анализа ELISA. 10 мкг BSW17 и различными моноклональными антителами сенсибилизируют лунки планшетов типа COSTAR, следуя стандартным процедурам ELISA. После блокирования с помощью БСА лунки инкубируют с 100 мкл стандартного для ELISA буфера для инкубации, содержащего бактериофаговые частицы, полученные из супернатантов бактериалных культур, зараженных фагом, с титром фага 109 КОЕ/мл. После промывки планшеты инкубируют с 5 мкг сшитой с пероксидазой из хрена (HRP) иммунной сыворотки к М13 (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция) в буфере для инкубации. Все инкубации проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. После последней промывки фаговые частицы, связанные с пленкой из антител, визуализируют путем связывания конъюгата HRP-сыворотка к М13 хромогенным субстратом, что определяют в соответствии со стандартной процедурой ELISA. На фиг. 5 показано, что мимеотопные фаги очень специфично связываются с BSW17, но не связываются ни с другими антителами, такими, как 8ЕС, 3G9 и 5Н10, которые также являются моноклональными антителами к Сε3 и которые также продуцировались при использовании рекомбинантного Сε3 в качестве иммуногена, ни с 5H5/F8, который представляет собой другое моноклональное антитело, направленное против экстраклеточного участка человеческого FcεRIα. В качестве отрицательного контроля без антител в эксперименте использовали рекомбинантную Fcε RIα-цепь и в качестве положительного контроля лунки, сенсибилизированные иммунной сывороткой к поликлональному М13.
Связывание мимеотопных пептидов, даваемых фаговыми частицами (группа А таблицы 2: первый клон обозначает клон 1 на фиг. 5= Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=SEQ ID NO:18; второй клон обозначает клон 18 на фиг. 5= Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys= SEQ ID NO:19), с антигенспецифичными гипервариабельными участками BSW17 подтверждено с помощью анализа ELISA. 10 мкг BSW17 и различными моноклональными антителами сенсибилизируют лунки планшетов типа COSTAR, следуя стандартным процедурам ELISA. После блокирования с помощью БСА лунки инкубируют с 100 мкл стандартного для ELISA буфера для инкубации, содержащего бактериофаговые частицы, полученные из супернатантов бактериалных культур, зараженных фагом, с титром фага 109 КОЕ/мл. После промывки планшеты инкубируют с 5 мкг сшитой с пероксидазой из хрена (HRP) иммунной сыворотки к М13 (фирма Pharmacia, Uppsala, Швеция) в буфере для инкубации. Все инкубации проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. После последней промывки фаговые частицы, связанные с пленкой из антител, визуализируют путем связывания конъюгата HRP-сыворотка к М13 хромогенным субстратом, что определяют в соответствии со стандартной процедурой ELISA. На фиг. 5 показано, что мимеотопные фаги очень специфично связываются с BSW17, но не связываются ни с другими антителами, такими, как 8ЕС, 3G9 и 5Н10, которые также являются моноклональными антителами к Сε3 и которые также продуцировались при использовании рекомбинантного Сε3 в качестве иммуногена, ни с 5H5/F8, который представляет собой другое моноклональное антитело, направленное против экстраклеточного участка человеческого FcεRIα. В качестве отрицательного контроля без антител в эксперименте использовали рекомбинантную Fcε RIα-цепь и в качестве положительного контроля лунки, сенсибилизированные иммунной сывороткой к поликлональному М13.
Пример 5. Конкурентное ингибирование связывания BSW17 с IgE бактериофагами, дающими BSW17-мимеотопные пептиды
Специфичность взаимодействия BSW17-мимеотоп дополнительно подтверждается данными о том, что присоединение фаговых частиц, дающих мимеотоп, препятствует связыванию BSW17/IgE. Бактериальные клетки выращивают в SB-среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, до ОП600, равной 0,4, затем добавляют фаг-хелпер VCS M13 и инкубацию продолжают при 37oС в течение 2 ч. Затем добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. Фаговые частицы осаждают полиэтиленгликолем. Мягкие РИА-планшеты сенсибилизируют 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и затем блокируют с помощью ЗТФР, содержащим 1,5% казеина. Человеческий IgE метят 125I с помощью хлорамин-Т-метода и применяют его из расчета 1000000 имп./мин на лунку для связывания с BSW17, нанесенным на РИА-планшеты, в присутствии возрастающих концентраций немеченого IgE (стандартная кривая) или фаговых частиц соответственно. Все эксперименты проводят при комнатной температуре и планшеты промывают трижды 0,9% NaCl + 0,05% Твин 20, разрезают на кусочки и радиоактивность в каждой лунке подсчитывают с помощью γ счетчика в течение 1 мин.
Специфичность взаимодействия BSW17-мимеотоп дополнительно подтверждается данными о том, что присоединение фаговых частиц, дающих мимеотоп, препятствует связыванию BSW17/IgE. Бактериальные клетки выращивают в SB-среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл карбенициллина, до ОП600, равной 0,4, затем добавляют фаг-хелпер VCS M13 и инкубацию продолжают при 37oС в течение 2 ч. Затем добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубацию продолжают в течение ночи. Фаговые частицы осаждают полиэтиленгликолем. Мягкие РИА-планшеты сенсибилизируют 20 мкг/мл BSW17 в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, и затем блокируют с помощью ЗТФР, содержащим 1,5% казеина. Человеческий IgE метят 125I с помощью хлорамин-Т-метода и применяют его из расчета 1000000 имп./мин на лунку для связывания с BSW17, нанесенным на РИА-планшеты, в присутствии возрастающих концентраций немеченого IgE (стандартная кривая) или фаговых частиц соответственно. Все эксперименты проводят при комнатной температуре и планшеты промывают трижды 0,9% NaCl + 0,05% Твин 20, разрезают на кусочки и радиоактивность в каждой лунке подсчитывают с помощью γ счетчика в течение 1 мин.
Мимеотопные фаги (PhBSW.6-9 на фиг. 6 соответствуют клону 1 на фиг. 5= CRRHNYGFWVC = SEQ ID NO:18; PhBSW.29-8 на фиг. 6 соответствуют клону 18 на фиг. 5= CINHRGYWVC = SEQ ID NO:19) (см. пример 4, выше) ингибируют связывание BSW17 с IgE. На фиг. 6 показано связывание с BSW17 меченного с помощью 125I IgE в присутствии клонов фага, дающих BSW17-мимеотоп. Закрашенными кружочками обозначена стандартная кривая ингибирования при использовании немеченого IgE, что позволяет оценить ингибирование связывания IgE в присутствии 1011 КОЕ/мл фаговых частиц. Ингибирование, достигнутое при использовании клонов фага, соответствует концентрациям немеченого IgE 1 мкг/мл и 1,7 мкг/мл соответственно.
Пример 6. Индукция эпитопспецифической иммунной реакции путем иммунизации кроликов клонами фага, дающими мимеотоп
Для оценки возможности создания вакцины на основе BSW17-мимеотопные кроликов иммунизируют фаговыми частицами, дающими BSW17-мимеотопные пептиды, и фагом-хелпером VCS M13 в качестве контроля соответственно. 1012 КОЕ свежеприготовленных фаговых частиц подвергают диализу в противотоке ЗФР при 4oС. Для первой иммунизации 1 мл эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда или в в 1 мл неполного адъюванта Фрейнда для повторной иммунизации. Иммунизацию повторяют подкожно каждые 14 дней. После третьей повторной иммунизации отбирают 12 мл крови, коагулируют в течение 4 ч при комнатной температуре в стеклянных пробирках и центрифугируют в течение 10 мин при 2000•g. Супернатанты тестируют на присутствие антител к человеческому IgE с помощью ELISA. Человеческий IgE трех различных пациентов (SUS11-IgE; PS-IgE; WT-IgE) разбавляют ЗФР до концентрации 50 мкг/мл и аликвоты объемом 1 мкл наносят в виде капель на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозу блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, в течение 1 ч. Сыворотку кролика разбавляют в соотношении 1: 200 ЗТФР, содержащем 1,5% казеин, и инкубируют в течение ночи. Промывку проводят каждый раз по 10 мин в ЗТФР, смеси ЗТФР-0,05% Твин 20 и ЗТФР. Образующийся конъюгат козлиное антикроличье антитело-HRP разбавляют в соотношении 1: 1000 ЗТФР, содержащим 1,5% казеина, и инкубируют в течение 4 ч. Промывку и окрашивание проводят аналогично тому, как это описано ранее. Как видно из табл. 3, контрольные кролики, иммунизированные фагом VCS M13, а также неиммунизированные кролики, дают слабую реакцию на человеческий IgE, присутствующий в их сыворотке, что, вероятно, отражает встречающееся в естественных условиях поперечное связывание аутоантител к кроличьему IgE с человеческим IgE. Однако в дополнение к интенсивному иммунному ответу на сенсибилизированный протеин бактериофага pVIII сыворотка кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопами фага, также содержит значительно возросшие концентрации антител, которые специфично распознают человеческий IgE.
Для оценки возможности создания вакцины на основе BSW17-мимеотопные кроликов иммунизируют фаговыми частицами, дающими BSW17-мимеотопные пептиды, и фагом-хелпером VCS M13 в качестве контроля соответственно. 1012 КОЕ свежеприготовленных фаговых частиц подвергают диализу в противотоке ЗФР при 4oС. Для первой иммунизации 1 мл эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда или в в 1 мл неполного адъюванта Фрейнда для повторной иммунизации. Иммунизацию повторяют подкожно каждые 14 дней. После третьей повторной иммунизации отбирают 12 мл крови, коагулируют в течение 4 ч при комнатной температуре в стеклянных пробирках и центрифугируют в течение 10 мин при 2000•g. Супернатанты тестируют на присутствие антител к человеческому IgE с помощью ELISA. Человеческий IgE трех различных пациентов (SUS11-IgE; PS-IgE; WT-IgE) разбавляют ЗФР до концентрации 50 мкг/мл и аликвоты объемом 1 мкл наносят в виде капель на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозу блокируют с помощью ЗТФР, содержащего 1,5% казеина, в течение 1 ч. Сыворотку кролика разбавляют в соотношении 1: 200 ЗТФР, содержащем 1,5% казеин, и инкубируют в течение ночи. Промывку проводят каждый раз по 10 мин в ЗТФР, смеси ЗТФР-0,05% Твин 20 и ЗТФР. Образующийся конъюгат козлиное антикроличье антитело-HRP разбавляют в соотношении 1: 1000 ЗТФР, содержащим 1,5% казеина, и инкубируют в течение 4 ч. Промывку и окрашивание проводят аналогично тому, как это описано ранее. Как видно из табл. 3, контрольные кролики, иммунизированные фагом VCS M13, а также неиммунизированные кролики, дают слабую реакцию на человеческий IgE, присутствующий в их сыворотке, что, вероятно, отражает встречающееся в естественных условиях поперечное связывание аутоантител к кроличьему IgE с человеческим IgE. Однако в дополнение к интенсивному иммунному ответу на сенсибилизированный протеин бактериофага pVIII сыворотка кроликов, иммунизированных BSW17-мимеотопами фага, также содержит значительно возросшие концентрации антител, которые специфично распознают человеческий IgE.
Специфичность этой иммунной сыворотки по отношению к эпитопу BSW17 может быть показана с помощью конкурентного анализа ELISA: нитроцеллюлозные полоски получают по описанной выше методике и инкубируют в течение ночи с сывороткой кролика, разбавленной в соотношении 1:50 ЗТФР, содержащим 1,5% казеина. После промывки МАт BSW17, меченное пероксидазой из хрена (BSW17-HRP), добавляют при разбавлении 1:50000 в ЗТФР, содержащем 1,5% казеина, в течение 4 ч. Последующие промывку и окрашивание проводят по описанной выше методике. Как видно из таблицы 4, связывание конъюгата BSW17-HRP с препаратами IgE из различных источников ингибируется сывороткой из кроликов, иммунизированных BSWn-мимеотопами фага, в то время как сыворотка из кроликов, иммунизированных фагом-хелпером, не обладает никаким ингибирующим действием.
В следующих примерах 7 и 8 подтверждается возможность использования в качестве иммуногенов синтезированных химическим путем мимеотопных пептидов, сшитых с протеином-носителем, для получения антиаллергической вакцины.
Пример 7. Синтезированный химическим путем ВSW17-мимеотопный пептид связывается с высокой аффинностью с BSW17
Для подтверждения того, что происходящая из бактериофага часть фагового BSW17-мимеотопа может быть исключена без нарушения биологической активности последовательности мимеотопного пептида, химическим путем синтезируют нижеприведенный пептид, содержащий циклический BSW17-мимеотопный октапептид (А) [приведен в линейной форме в таблице 2, группа А, второй клон такой же, как и у пептида (А) с добавлением двух остатков Cys (SEQ ID NO: 19) и содержащий в данном случае 7 дополнительных соседних происходящих из бактериофага аминокислотных остатков Gly-Glu-Phe- и -Gly-Asp-Pro-Ala в качестве фланкирующих последовательностей, включенных для обеспечения правильной складчатости кольцевого мимеотопного пептида]: Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (SEQ ID NO:27)
После стандартной процедуры синтеза этот пептид подвергают циклизации с помощью двух остатков цистеина или флуоресцентно метят с помощью красителя Rhodol Green. Связывание с возрастающими концентрациями BSW17, иммобилизованного в лунках микротитрационного планшета в соответствии с условиями проведения ELISA, определяют измерением флуоресценции (результаты приведены на фиг. 7).
Для подтверждения того, что происходящая из бактериофага часть фагового BSW17-мимеотопа может быть исключена без нарушения биологической активности последовательности мимеотопного пептида, химическим путем синтезируют нижеприведенный пептид, содержащий циклический BSW17-мимеотопный октапептид (А) [приведен в линейной форме в таблице 2, группа А, второй клон такой же, как и у пептида (А) с добавлением двух остатков Cys (SEQ ID NO: 19) и содержащий в данном случае 7 дополнительных соседних происходящих из бактериофага аминокислотных остатков Gly-Glu-Phe- и -Gly-Asp-Pro-Ala в качестве фланкирующих последовательностей, включенных для обеспечения правильной складчатости кольцевого мимеотопного пептида]: Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (SEQ ID NO:27)
После стандартной процедуры синтеза этот пептид подвергают циклизации с помощью двух остатков цистеина или флуоресцентно метят с помощью красителя Rhodol Green. Связывание с возрастающими концентрациями BSW17, иммобилизованного в лунках микротитрационного планшета в соответствии с условиями проведения ELISA, определяют измерением флуоресценции (результаты приведены на фиг. 7).
Пример 8. Синтезированные химическим путем BSW17-мимеотопные пептиды, сшитые с протеином-носителем, специфически распознаются BSW17
Синтезируют химическим путем различные мимеотопные пептиды и сшивают с иммуногенными протеинами-носителями. Реакции сшивания проводят при массовом соотношении пептида к протеину-носителю 1:1 согласно стандартным методикам (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press [1993] ). Получают конъюгаты, образованные в соответствии со следующими вариантами сшивания:
- сшивание с помощью глутаральдегида,
- сшивание с помощью ДК (дигексилкарбодиимида),
- сшивание с помощью БСС [бис(сульфосукцинимидил)суберата],
- поперечное сшивание с помощью лизина.
Синтезируют химическим путем различные мимеотопные пептиды и сшивают с иммуногенными протеинами-носителями. Реакции сшивания проводят при массовом соотношении пептида к протеину-носителю 1:1 согласно стандартным методикам (Shan S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press [1993] ). Получают конъюгаты, образованные в соответствии со следующими вариантами сшивания:
- сшивание с помощью глутаральдегида,
- сшивание с помощью ДК (дигексилкарбодиимида),
- сшивание с помощью БСС [бис(сульфосукцинимидил)суберата],
- поперечное сшивание с помощью лизина.
Полученные в результате мимеотопные конъюгаты представляют собой:
(1) P1= линейный KTKGSGFFVF-БСА (глутаральдегид),
(2) Р4= линейный AcINHRGYWVC-БСА (ДК),
(3) Р5= линейный AcRSRSGGYWLWC-БСА (ДК),
(4) SAF1-KLH = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (ДК),
(5) SAF2-KLH = линейный KTKGSGFFVF-KLH (ДК),
(6) SAF3-KLH = линейный VNLPWSFGLE-KLH (ДК),
(7) SAF3-Lys = линейный VNLPWSFGLE-лизин, поперечное сшивание,
(8) SAF4-KLH = линейный VNLTWSRASG-KLH (ДК),
(9) SAF5-KLH = линейный VNLTWS-KLH (ДК),
(10) SDS214 = циклический GEFCRRHNYGFWVCGDPA-KLH (БСС),
(11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS252 = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС),
(12) SDS237, SDS253 = линейный KTKGSGFFVF-KLH (БСС),
(13) SDS242, SDS254 = линейный VNLPWSFGLE-KLH (БСС) и
(14) SDS243 = линейный VNLTWSRASG-KLH (БСС),
причем (1), (5) и (12) представляют собой эталонные молекулы иммуногена, полученные соответственно путем сшивания с помощью глутаральдегида, ДК и БСС следующим образом:
(1), т. е. Р1, представляет собой аминокислоты в положениях 500-509 человеческого IgE, SEQ ID N0:28, см. The Lancet [1990], выше, сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента глутаральдегида;
(5), т. е. SAF2-KLH, представляет собой такой же пептид, SEQ ID N0:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК; и
(12), т. е. SDS237 и SDS253, представляет собой такой же пептид, SEQ ID NO:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.
(1) P1= линейный KTKGSGFFVF-БСА (глутаральдегид),
(2) Р4= линейный AcINHRGYWVC-БСА (ДК),
(3) Р5= линейный AcRSRSGGYWLWC-БСА (ДК),
(4) SAF1-KLH = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (ДК),
(5) SAF2-KLH = линейный KTKGSGFFVF-KLH (ДК),
(6) SAF3-KLH = линейный VNLPWSFGLE-KLH (ДК),
(7) SAF3-Lys = линейный VNLPWSFGLE-лизин, поперечное сшивание,
(8) SAF4-KLH = линейный VNLTWSRASG-KLH (ДК),
(9) SAF5-KLH = линейный VNLTWS-KLH (ДК),
(10) SDS214 = циклический GEFCRRHNYGFWVCGDPA-KLH (БСС),
(11) SDS213, SDS227, SDS236, SDS252 = циклический GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH (БСС),
(12) SDS237, SDS253 = линейный KTKGSGFFVF-KLH (БСС),
(13) SDS242, SDS254 = линейный VNLPWSFGLE-KLH (БСС) и
(14) SDS243 = линейный VNLTWSRASG-KLH (БСС),
причем (1), (5) и (12) представляют собой эталонные молекулы иммуногена, полученные соответственно путем сшивания с помощью глутаральдегида, ДК и БСС следующим образом:
(1), т. е. Р1, представляет собой аминокислоты в положениях 500-509 человеческого IgE, SEQ ID N0:28, см. The Lancet [1990], выше, сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента глутаральдегида;
(5), т. е. SAF2-KLH, представляет собой такой же пептид, SEQ ID N0:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК; и
(12), т. е. SDS237 и SDS253, представляет собой такой же пептид, SEQ ID NO:28, сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.
Другие пептиды представляют собой иммуногены по изобретению, а именно:
- (2) (Р4) представляет собой N-ацетилированный пептид (A) (SEQ ID NO:1) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:29), сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (3) (Р5) представляет собой N-ацетилированный пептид (В) (SEQ ID NO:3) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:30), сшитый с БСА при использовании в качестве' сшивающего агента ДК;
- (4) (SAF1-KLH) представляет собой пептид из примера 7 (SEQ ID NO:31), циклизованный через дисульфидный мостик, образованный двумя фланкирующими остатками Cys, и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (6) (SAF3-KLH) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (7) (SAF3-Lys) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с помощью поперечного сшивания с лизином;
- (8) (SAF4-KLH) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (9) (SAF5-KLH) представляет собой пептид (С) (SEQ ID NO:17), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (10) (SDS214) представляет собой первый пептид группы А в таблице 2 с такими же семью соседними аминокислотными остатками, происходящими из бактериофага, что и у пептида в примере 7 (SEQ ID NO:32), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) представляет собой тот же пептид, что и (4), выше, (SEQ ID NO:31), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (13) (SDS242, SDS254) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС; и
- (14) (SDS243) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.
- (2) (Р4) представляет собой N-ацетилированный пептид (A) (SEQ ID NO:1) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:29), сшитый с БСА при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (3) (Р5) представляет собой N-ацетилированный пептид (В) (SEQ ID NO:3) с дополнительным остатком Cys на С-конце (SEQ ID NO:30), сшитый с БСА при использовании в качестве' сшивающего агента ДК;
- (4) (SAF1-KLH) представляет собой пептид из примера 7 (SEQ ID NO:31), циклизованный через дисульфидный мостик, образованный двумя фланкирующими остатками Cys, и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (6) (SAF3-KLH) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (7) (SAF3-Lys) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с помощью поперечного сшивания с лизином;
- (8) (SAF4-KLH) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (9) (SAF5-KLH) представляет собой пептид (С) (SEQ ID NO:17), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента ДК;
- (10) (SDS214) представляет собой первый пептид группы А в таблице 2 с такими же семью соседними аминокислотными остатками, происходящими из бактериофага, что и у пептида в примере 7 (SEQ ID NO:32), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (11) (SDS213, SDS227, SDS236, SDS252) представляет собой тот же пептид, что и (4), выше, (SEQ ID NO:31), циклизованный и сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС;
- (13) (SDS242, SDS254) представляет собой пептид (Ж) (SEQ ID NO:7), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС; и
- (14) (SDS243) представляет собой пептид (Г) (SEQ ID NO:4), сшитый с KLH при использовании в качестве сшивающего агента БСС.
На фиг. 8а показано, что как конъюгат циклический BSW17-мимеотоп-KLH (БСС) (11), т.е. SDS236, так и происходящий из Fcε "оригинальный" эпитопный мотив (12), т.е. SDS237, т.е. Fcε (500-509), сшитый в виде
линейного пептида с KLH (БСС), распознаются BSW17 в зависимости от дозы, в то время как для свободного KLH не обнаружено связывания. Лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 1 мкг каждого из SDS236, SDS237 или свободного KLH и инкубируют с возрастающими концентрациями BSW17. Связанное антитело выявляют с помощью конъюгата козлиный-мышиный IgG-HRP (gamIgG-HRP). Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками.
линейного пептида с KLH (БСС), распознаются BSW17 в зависимости от дозы, в то время как для свободного KLH не обнаружено связывания. Лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 1 мкг каждого из SDS236, SDS237 или свободного KLH и инкубируют с возрастающими концентрациями BSW17. Связанное антитело выявляют с помощью конъюгата козлиный-мышиный IgG-HRP (gamIgG-HRP). Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками.
На фиг. 8б обобщены данные ELISA, полученные с различными конъюгатами, включающими BSW17-мимеотоп, сшитый с протеином-носителем с использованием нескольких способов химического сшивания. Лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 5 мкг каждого из мимеотопных конъюгатов или свободного KLH и инкубируют с 10 мкг BSW17. Связанное антитело выявляют с помощью gamIgG-HRP. Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками. Было обнаружено, что в отличие от свободного KLH каждый конъюгат, включающий BSW17-мимеотопами, распознается BSW17. Однако из повторных экспериментов, проведенных через несколько недель, стало ясно, что KLH-конъюгаты, сшитые посредством ДК, менее стабильны и постепенно теряют свою связывающую способность по отношению к BSW17. В отличие от этого конъюгаты, включающие BSW17-мимеотоп, сшитый посредством БСС, оказались стабильными даже при +4oС.
На фиг. 9а и 9б показано, что BSW17-мимеотопы, сшитые с KLH или БСА, специфически распознаются BSW17 и не распознаются неродственными моноклональными антителами 3G9 (антитело к человеческому Сε3 и 5H5/F8 (антитело к человеческому RIα). В этом случае лунки микротитрационного планшета сенсибилизируют 5 мкг каждого из приведенных мимеотопных конъюгатов и инкубируют с 10 мкг соответствующего моноклонального антитела. Связанное антитело выявляют с помощью gamIgG-HRP. Приведенные данные представляют собой средние значения, полученные по двум повторностям, минус величина фонового связывания с несенсибилизированными (блокированными с помощью БСА) лунками.
Пример 9. Иммунизация кроликов с помощью конъюгатов, включающих В SW17-мимеотоп, приводит к продуцированию in vivo антител к человеческому IgЕ
Для подтверждения специфичности иммуногенности конъюгатов, включающих BSW17-мимеотопы, кроликов иммунизируют представленным ниже набором препаратов мимеотоп/носитель (см. табл. 5).
Для подтверждения специфичности иммуногенности конъюгатов, включающих BSW17-мимеотопы, кроликов иммунизируют представленным ниже набором препаратов мимеотоп/носитель (см. табл. 5).
Кроликов иммунизируют с помощью 200 мкг соответствующего препарата конъюгата, растворенного в общем объеме 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (обозначенного ЗФР), путем подкожной инъекции. Для первой инъекции образцы смешивают в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (кролики R1-R4) или с TiterMax (фирма Sigma; кролики 1-20). Перед начальной иммунизацией отбирают образцы крови объемом 5 мл. Повторную иммунизацию проводят на 21-й и 28-й день после первой инъекции с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Образцы крови берут на 28-й и 49-й день и из всех образцов получают сыворотку.
Возникновение иммунного ответа на человеческий IgE у иммунизированных кроликов определяют с помощью ELISA: лунки микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 5 мкг человеческого IgE (SUS-11; JW8) и инкубируют с 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с иммобилизованным человеческим IgE, определяют путем инкубации с конъюгатом козлиное антикроличье IgG-HRP (garIgG-HRP). Измеренные значения 011405 корректируют с учетом данных, полученных для предиммунной сыворотки каждого соответствующего кролика, разбавленной в соотношении 1: 50. Данные, приведенные на фиг. 10а и 10б, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. На фиг. 10а и 10б хорошо видна индукция антител к человеческому IgE у кроликов, иммунизированных различными BSW17-мимеотопными конъюгатами.
Аналогичным образом с помощью метода ELISA определяют сывороточные титры только что полученных антител по отношению к носителю KLH, пептиду, применяемому в качестве иммуногена, и человеческому IgE соответственно, используя серийные разбавления сыворотки для инкубации с иммобилизованным KLH, конъюгатом мимеотопный пептид-БСА и человеческим IgE соответственно. Два примера определения указанного сывороточного титра приведены на фиг. 11 для (11), т. е. SDS213, и для (10), т.е. SDS214 соответственно.
Вышеприведенные примеры демонстрируют применимость конъюгатов, включающих BSW17-мимеотоп, в качестве иммуногенов для индукции ответа на человеческий IgE.
Пример 10. Ответ на hIgE. индуцированный у кроликов, иммунизированных ВSW17-мимеотопными конъюгатами, является изотипспецифическим и конкурирует с BSW17 за связывание с IgE
Изотипическую специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у иммунизированных кроликов определяют с помощью ELISA, при этом каждую лунку микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 3 мкг человеческого IgE (SUS-11), IgA, IgG и IgM соответственно и инкубируют с 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с иммобилизованным человеческими антителами, определяют путем инкубации с козлиным garIgG-HRP. Измеренные значения 011405 корректируют с учетом данных, полученных для предиммунной сыворотки каждого соответствующего кролика, разбавленной в соотношении 1:50. Данные, приведенные на фиг. 12, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. Видно, что иммунный ответ, полученный у кроликов, иммунизированных с помощью мимеотопных конъюгатов BSW17, является специфическим по отношению к IgE в отличие от частичного распознавания человеческого IgM сывороткой кроликов, иммунизированных с помощью (10), т.е. SDS214.
Изотипическую специфичность иммунного ответа на человеческий IgE у иммунизированных кроликов определяют с помощью ELISA, при этом каждую лунку микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 3 мкг человеческого IgE (SUS-11), IgA, IgG и IgM соответственно и инкубируют с 100 мкл образцов сыворотки, разбавленных в соотношении 1:50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с иммобилизованным человеческими антителами, определяют путем инкубации с козлиным garIgG-HRP. Измеренные значения 011405 корректируют с учетом данных, полученных для предиммунной сыворотки каждого соответствующего кролика, разбавленной в соотношении 1:50. Данные, приведенные на фиг. 12, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. Видно, что иммунный ответ, полученный у кроликов, иммунизированных с помощью мимеотопных конъюгатов BSW17, является специфическим по отношению к IgE в отличие от частичного распознавания человеческого IgM сывороткой кроликов, иммунизированных с помощью (10), т.е. SDS214.
С помощью конкурентного анализа ELISA также подтверждено, что иммунная сыворотка кроликов к SDS214 обладает способностью частично конкурировать с BSW17 за связывание с IgE. Каждую лунку микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью 1 мкг человеческого IgE (SUS-11) и либо инкубируют с 5 мкг BSW17, либо инкубируют без BSW17. После промывки добавляют для повторной инкубации 100 мкл иммунной сыворотки к SDS213, разбавленной в соотношении 1: 50 буфером для инкубации ELISA. Антитела кроликов, связанные с необработанным иммобилизованным человеческим IgE и с IgE, предварительно инкубированным с использованием BSW17, определяют путем инкубации с козлиным garIgG-HRP. Данные, приведенные на фиг. 13, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям.
Пример 11. Антитела к hIgE. полученные v кроликов с помощью иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, могут быть очищены аффинной хроматографией с использованием в качестве аффинного реагента мимеотопного пептида, сшитого с сефарозой
В этом примере показано, что ответ на hIgE, индуцированный у кроликов с помощью иммунизации конъюгатами на основе BSWn-мимеотопа, идентичен специфическому ответу на мимеотопный пептид.
В этом примере показано, что ответ на hIgE, индуцированный у кроликов с помощью иммунизации конъюгатами на основе BSWn-мимеотопа, идентичен специфическому ответу на мимеотопный пептид.
Иммуноаффинная очистка крбличьих поликлональных антител к BSW17-мимеотопу:
а) Осаждение сульфатом аммония:
К 22 мл кроличьей иммунной сыворотки (60 мг/мл общего протеина, определенного по методу Bradford, BSA-Standard, фирма BIO-RAD) добавляют 5,5 г твердого сульфата аммония (СА) (25% мас./об.), смесь перемешивают в течение 3 ч и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Осадок удаляют центрифугированием при 18000 об/мин (фирма Sorvall) в течение 45 мин и промывают 25 мл 25%-ного водного раствора СА (мас./об.). Промытый осадок вновь центрифугируют в таких же условиях, растворяют в 10 мл ЗФР, 0,05% NaN3, pH 7,2, и подвергают диализу в противотоке 5 л того же буфера в течение ночи при +4oС.
а) Осаждение сульфатом аммония:
К 22 мл кроличьей иммунной сыворотки (60 мг/мл общего протеина, определенного по методу Bradford, BSA-Standard, фирма BIO-RAD) добавляют 5,5 г твердого сульфата аммония (СА) (25% мас./об.), смесь перемешивают в течение 3 ч и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Осадок удаляют центрифугированием при 18000 об/мин (фирма Sorvall) в течение 45 мин и промывают 25 мл 25%-ного водного раствора СА (мас./об.). Промытый осадок вновь центрифугируют в таких же условиях, растворяют в 10 мл ЗФР, 0,05% NaN3, pH 7,2, и подвергают диализу в противотоке 5 л того же буфера в течение ночи при +4oС.
б) Иммуноаффинная хроматография:
Диализат фильтруют на фильтре типа Millex-GV с диаметром пор 0,2 мкм (фирмы Millipore) и вносят в колонку типа Pharmacia XK16/30, заполненную 10 мл СН-сефарозы 4В, ковалентно сшитой с 5 мг конъюгата SDS227, включающего ВSW 17-мимеотопный пептид, при скорости потока 1 мл/мин с использованием ЗФР, 0,05% NaN3 в качестве подвижного буфера. После внесения и элюирования несвязанной фракции протеина специфически связанное антитело элюируют с помощью буфера 0,1М глицин/HCl, pH 2,8. Элюат (фракции 12-20 в 9 мл) отделяют при перемешивании для немедленной нейтрализации до pH 7,4 с помощью 3,3М трис/НАс, 0,8% NaN3, pH 8,0 (50 мкл/мл) и окончательно подвергают диализу в противотоке 3 л ЗФР, 0,05% NaN3, pH 7,2, в течение ночи при +4oС. Концентрация общего протеина, определенная по методу Bradford, BIgG-Standard (фирма BIO-RAD), составляет приблизительно 1 мг/мл. Выход относительно общего внесенного протеина составляет приблизительно 0,7%.
Диализат фильтруют на фильтре типа Millex-GV с диаметром пор 0,2 мкм (фирмы Millipore) и вносят в колонку типа Pharmacia XK16/30, заполненную 10 мл СН-сефарозы 4В, ковалентно сшитой с 5 мг конъюгата SDS227, включающего ВSW 17-мимеотопный пептид, при скорости потока 1 мл/мин с использованием ЗФР, 0,05% NaN3 в качестве подвижного буфера. После внесения и элюирования несвязанной фракции протеина специфически связанное антитело элюируют с помощью буфера 0,1М глицин/HCl, pH 2,8. Элюат (фракции 12-20 в 9 мл) отделяют при перемешивании для немедленной нейтрализации до pH 7,4 с помощью 3,3М трис/НАс, 0,8% NaN3, pH 8,0 (50 мкл/мл) и окончательно подвергают диализу в противотоке 3 л ЗФР, 0,05% NaN3, pH 7,2, в течение ночи при +4oС. Концентрация общего протеина, определенная по методу Bradford, BIgG-Standard (фирма BIO-RAD), составляет приблизительно 1 мг/мл. Выход относительно общего внесенного протеина составляет приблизительно 0,7%.
Очищенные с помощью аффинной хроматографии фракции IgG тестируют в отношении связывания с hIgE с помощью ELISA. Лунки микротитрационных планшетов сенсибилизируют с помощью возрастающих концентраций человеческого IgE (JW8) и инкубируют с 5 мкг очищенной иммунной сыворотки к SDS213 и иммунной сыворотки к SDS214 соответственно. Связывание антител определяют с помощью garIgG-HRP. Данные, приведенные на фиг. 14, представляют собой средние значения, полученные по двум измерениям. На фиг. 14 видно, что антитела IgG, очищенные на аффинной колонке с антителом к BSWn-мимеотопу, распознаются в зависимости от дозы человеческим IgE. Обнаружена лишь небольшая фоновая активность связывания с образцами, прошедшими через колонку. Эти данные показывают, что индуцированная у кроликов активность по отношению к hIgE идентична таковой антител к мимеотопному пептиду.
Пример 12. Антитела к человеческому IgE, вырабатываемые у кроликов после иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, являются неанафилактогенными по отношению к клеткам крови человека
В настоящем описании показано, что антитела к IgE, вырабатываемые у кроликов при иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, являются неанафилактогенными по отношению к базофилам крови человека. В качестве системы для анализа используют имеющийся в продаже набор Cast sLt ELISA (фирма Buhimann AG, Allschwil, Швейцария). В этом анализе определяют выделение растворимого лейкотриена (sLt) человеческими базофилами в результате стимуляции клеток анафилактогенными агентами в соответствии с протоколом эксперимента, предоставленным поставщиком. Результат анализа получают в виде количества sLt (в пг), присутствующего в 1 мл супернатанта лейкоцитов человека после инкубации клеток с тестируемым образцом на основе сравнения со стандартной кривой. Стандартную кривую получают, используя серийное разбавление стандартного sLt, с помощью конкурентного анализа ELISA. В каждый анализ в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно включают фоновые уровни sLt, полученные при спонтанном выделении sLt из препарата клеток крови (РВ = "необработанный пациент"), и максимальное количество sLt, которое может выделиться из данного препарата клеток крови (PC="контрольный пациент"; после стимуляции образцов клеток поперечным связыванием антитела с IgERIα).
В настоящем описании показано, что антитела к IgE, вырабатываемые у кроликов при иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, являются неанафилактогенными по отношению к базофилам крови человека. В качестве системы для анализа используют имеющийся в продаже набор Cast sLt ELISA (фирма Buhimann AG, Allschwil, Швейцария). В этом анализе определяют выделение растворимого лейкотриена (sLt) человеческими базофилами в результате стимуляции клеток анафилактогенными агентами в соответствии с протоколом эксперимента, предоставленным поставщиком. Результат анализа получают в виде количества sLt (в пг), присутствующего в 1 мл супернатанта лейкоцитов человека после инкубации клеток с тестируемым образцом на основе сравнения со стандартной кривой. Стандартную кривую получают, используя серийное разбавление стандартного sLt, с помощью конкурентного анализа ELISA. В каждый анализ в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно включают фоновые уровни sLt, полученные при спонтанном выделении sLt из препарата клеток крови (РВ = "необработанный пациент"), и максимальное количество sLt, которое может выделиться из данного препарата клеток крови (PC="контрольный пациент"; после стимуляции образцов клеток поперечным связыванием антитела с IgERIα).
Полную сыворотку кроликов, иммунизированных конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, а также очищенными с помощью аффинной хроматографии антителами к BSW17-мимеотопу, описанным в примере 11, тестируют в отношении присутствия стимулированных базофилов и, таким образом, в отношении присутствия анафилактогенных антител к hIgE. В качестве источника базофилов используют свежеполученную цельную кровь здорового донора и подвергают анализу строго в соответствии с протоколом для набора CAST ELISA. Результаты обобщены на фиг. 15 и показывают, что ни неочищенная сыворотка кролика, содержащая антитела к hIgE, полученные после иммунизации конъюгатами на основе BSW17-мимеотопа, не очищенные с помощью аффинной хроматографии антитела к ВSW17-мимеотопу, не обладают способностью стимулировать выделение лейкотриена клетками крови человека; таким образом, они являются неанафилактогенными. Это является абсолютно необходимым условием для применения BSW17-мимеотопов в антиаллергической вакцине для человека.
Claims (7)
1. Иммуногенная молекула, включающая (а) по крайней мере один фрагмент ВSW17 - мимеотопного пептида, общая длина которого достигает вплоть до 15 аминокислот и который также может включать соответствующие компоненты для связывания гаптена с носителем с целью облегчения сшивания с компонентом (б) или дополнительного процессинга, или, когда BSW17 - мимеотопный пептид является циклическим, может иметь два конца, соединенные вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, формирующих дисульфидный мостик, либо концы могут быть химически поперечно сшитыми, или, когда BSW17 - мимеотопный пептид является линейным, может иметь С-концевую аминокислоту, блокированную с получением амидированной формы, и/или N - концевую аминокислоту, блокированную с получением ацетилированной формы, или может быть фланкирован одной или двумя вспомогательными группами и/или дополнительной сшивающей группой; и (б) фрагмент, способный вызывать иммунный ответ на фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида (а), причем компонент (а) не представляет собой Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.
2. Иммуногенная молекула по п. 1 в форме полимерного пептида или рекомбинантного слитого протеина, где одно мономерное соединение полимерного пептида или одна часть слитого протеина представляет собой фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида, а оставшаяся часть полимерного пептида или слитого протеина представляет собой фрагмент, вызывающий иммунный ответ.
3. Иммуногенная молекула по п. 1 в форме конъюгата BSW17 - мимеотопного пептида и иммуногенного носителя.
4. Иммуногенная молекула по п. 1, где фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Ter-Trp-Val (A),
Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Ter-Trp-Leu-Trp (B),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M),
Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (O),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) и
Val-sn-Leu-Thr-Trp-Ser (C).
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Ter-Trp-Val (A),
Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (Б),
Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Ter-Trp-Leu-Trp (B),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Г),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (Д),
Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (E),
Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (Ж),
Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (З),
Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (И),
Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (K),
Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (Л),
Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (M),
Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (H),
Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (O),
Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (П),
Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) и
Val-sn-Leu-Thr-Trp-Ser (C).
5. Иммуногенная молекула по п. 1, где фрагмент BSW17 - мимеотопного пептида (а) имеет аминокислотную последовательность Glu-Glu-Phe-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala- (SEQ ID NO: 27) и является цикличным, а именно представляет собой пептид Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-(A), два конца которого соединены вместе с помощью двух дополнительных остатков цистеина, формирующих дисульфидный мостик, и включает дополнительные компоненты Glu-G1u-Phe- и Gly -Asp-Pro-Ala для связывания гаптена с носителем и облегчения сшивания.
6. Фармацевтическая композиция, включающая иммуногенную молекулу по любому из пп. 1-5 и адъювант.
7. Иммуногенная молекула по любому из пп. 1-5, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства при лечении аллергии или атопического дерматита.
Приоритет по пунктам и признакам:
01.03.1996 - по пп. 1-4 - пептиды (А) - (В), п. 5;
22.08.1996 - по п. 4 - пептиды (Г), (Д), (Ж), (З), (И).
01.03.1996 - по пп. 1-4 - пептиды (А) - (В), п. 5;
22.08.1996 - по п. 4 - пептиды (Г), (Д), (Ж), (З), (И).
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9604412.8 | 1996-03-01 | ||
| GBGB9604412.8A GB9604412D0 (en) | 1996-03-01 | 1996-03-01 | Organic compounds |
| GB9617702.7 | 1996-08-22 | ||
| GBGB9617702.7A GB9617702D0 (en) | 1996-08-22 | 1996-08-22 | Organic compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98118184A RU98118184A (ru) | 2000-10-20 |
| RU2193413C2 true RU2193413C2 (ru) | 2002-11-27 |
Family
ID=26308839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98118184/14A RU2193413C2 (ru) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6610297B1 (ru) |
| EP (1) | EP0885244B2 (ru) |
| JP (2) | JP3421970B2 (ru) |
| KR (2) | KR100498198B1 (ru) |
| CN (1) | CN1174998C (ru) |
| AT (1) | ATE230417T1 (ru) |
| AU (1) | AU719609B2 (ru) |
| BR (1) | BR9707819A (ru) |
| CA (1) | CA2245497C (ru) |
| CY (1) | CY2457B1 (ru) |
| CZ (1) | CZ299551B6 (ru) |
| DE (1) | DE69718150T3 (ru) |
| DK (1) | DK0885244T4 (ru) |
| ES (1) | ES2190799T5 (ru) |
| HK (1) | HK1014962A1 (ru) |
| HU (1) | HUP9901109A3 (ru) |
| IL (1) | IL125590A (ru) |
| NO (1) | NO321043B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ331651A (ru) |
| PL (1) | PL187209B1 (ru) |
| RU (1) | RU2193413C2 (ru) |
| SI (1) | SI0885244T2 (ru) |
| SK (1) | SK284856B6 (ru) |
| TR (1) | TR199801722T2 (ru) |
| WO (1) | WO1997031948A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761431C1 (ru) * | 2020-10-26 | 2021-12-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6913749B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| EP1621209A3 (en) * | 1998-11-02 | 2006-04-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
| RU2245163C2 (ru) | 1998-11-30 | 2005-01-27 | Сайтос Байотекнолэджи АГ | Композиция (варианты), способ получения не природной упорядоченной и содержащей повторы антигенной матрицы, способ терапевтического лечения и способ иммунизации |
| MXPA01008612A (es) * | 1999-02-25 | 2003-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Epitopos o mimotopos derivados de los dominos c-epsilon-3 o c-epsilon-4 de ige, antagonistas de los mismos y sus usos terapeuticos. |
| JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ由来の担体を含む免疫原 |
| GB9908533D0 (en) * | 1999-04-14 | 1999-06-09 | Novartis Ag | Organic compounds |
| AU5226201A (en) * | 2000-04-13 | 2001-10-30 | Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh | Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells |
| AU2001252458A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-20 | Martin Bachmann | Molecular antigen arrays and vaccines |
| US6887472B2 (en) | 2000-08-30 | 2005-05-03 | Pfizer Inc. | Anti-IgE vaccines |
| US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| EP1236740B1 (de) * | 2001-02-28 | 2012-07-18 | Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. | Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind |
| EP1239032A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-11 | Société des Produits Nestlé S.A. | Lactic acid bacteria as agents for treating and preventing allergy |
| JP2003047482A (ja) | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| US7604955B2 (en) | 2001-08-13 | 2009-10-20 | Swey-Shen Alex Chen | Immunoglobulin E vaccines and methods of use thereof |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| US20050226894A1 (en) * | 2002-01-15 | 2005-10-13 | Jensen-Jarolim Erika | Oral vaccination |
| EP1532167B1 (en) | 2002-07-17 | 2012-01-25 | Cytos Biotechnology AG | Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein |
| CA2487849A1 (en) | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
| MXPA05000819A (es) | 2002-07-19 | 2005-08-29 | Cytos Biotechnology Ag | Composiciones de vacunas que contienen arreglos de antigeno amiloide beta 1-6. |
| JP4459810B2 (ja) | 2002-08-14 | 2010-04-28 | マクロジェニクス，インコーポレーテッド | ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体とその利用法 |
| US20050065136A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-24 | Roby Russell R. | Methods and compositions for the treatment of infertility using dilute hormone solutions |
| WO2005105106A2 (en) * | 2004-04-21 | 2005-11-10 | Roby Russell R | Hormone treatment of macular degeneration |
| US20060025390A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Roby Russell R | Treatment of hormone allergy and related symptoms and disorders |
| ITMI20052517A1 (it) * | 2005-12-29 | 2007-06-30 | Lofarma Spa | Varianbtio ipoallergeniche dell'allergene maggiore bet v 1 di polline di betula verrucosa |
| PT2029173T (pt) | 2006-06-26 | 2016-11-02 | Macrogenics Inc | Anticorpos específicos fc rib e seus métodos de uso |
| EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
| US8865179B2 (en) * | 2008-01-26 | 2014-10-21 | Swey-Shen Alexchen | Aptameric IgE peptides in a protein scaffold as an allergy vaccine |
| NZ592977A (en) | 2008-12-09 | 2013-01-25 | Pfizer Vaccines Llc | IgE CH3 PEPTIDE VACCINE |
| WO2011154878A1 (en) | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Pfizer Vaccines Llc | Ige ch3 peptide vaccine |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171299A (en) | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| DE2602443A1 (de) | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| DE2861593D1 (en) | 1977-06-29 | 1982-03-11 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| JPS5944399A (ja) | 1982-09-07 | 1984-03-12 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| GB8616166D0 (en) * | 1986-07-02 | 1986-08-06 | Research Corp Ltd | Polypeptide competitor |
| US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| EP0269455A3 (en) | 1986-11-28 | 1989-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Highly purified fused protein comprising human ige fc fragment and production thereof |
| WO1988006040A1 (en) | 1987-02-20 | 1988-08-25 | Imclone Systems, Inc. | Monoclonal antibodies in vaccine formulations |
| CA1336818C (en) | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| ATE152244T1 (de) | 1987-10-13 | 1997-05-15 | Terrapin Tech Inc | Verfahren zur herstellung von imunodiagnose- mitteln |
| GB8727045D0 (en) | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| US5342924A (en) | 1987-12-31 | 1994-08-30 | Tanox Biosystems, Inc. | Extracellular segments of human ε immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| US5449760A (en) | 1987-12-31 | 1995-09-12 | Tanox Biosystems, Inc. | Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils |
| GB8910263D0 (en) | 1989-05-04 | 1989-06-21 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype |
| GB8913737D0 (en) | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
| CA2074089C (en) | 1990-01-23 | 2001-04-10 | Tse-Wen Chang | Extracellular segments of human e immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor |
| ATE126540T1 (de) | 1990-05-25 | 1995-09-15 | Peptide Therapeutics Ltd | Immunodiagnostische probe für gelenkrheumatismus. |
| US5258289A (en) | 1990-09-05 | 1993-11-02 | Davis Claude G | Method for the selecting of genes encoding catalytic antibodies |
| GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| ES2296839T3 (es) * | 1991-08-14 | 2008-05-01 | Genentech Inc. | Variantes de inmunoglobulinas para receptores fc-epsilon especificos. |
| US5965709A (en) * | 1991-08-14 | 1999-10-12 | Genentech, Inc. | IgE antagonists |
| SE9102808L (sv) | 1991-09-26 | 1993-03-27 | Lars T Hellman Inst F Immunolo | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
| GB9125024D0 (en) | 1991-11-25 | 1992-01-22 | Kirby Julian | Rheumatoid arthritus treatment |
| JPH06113881A (ja) | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| EP0708656B1 (en) | 1993-04-27 | 2002-07-31 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| WO1994026723A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | Genentech, Inc. | ras FARNESYL TRANSFERASE INHIBITORS |
| GB9320897D0 (en) | 1993-10-11 | 1993-12-01 | Peptide Therapeutics Ltd | Compounds useful in anti-allergy treatment |
| GB9324013D0 (en) * | 1993-11-22 | 1994-01-12 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides |
| FR2715304B1 (fr) * | 1994-01-26 | 1996-04-26 | Merieux Serums Vaccins Pasteur | Vaccin anti-allergique. |
| EP0811016A1 (en) * | 1994-03-28 | 1997-12-10 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide based immunogens for the treatment of allergy |
| AU3002695A (en) | 1994-07-08 | 1996-02-09 | King's College | Ige antagonists |
| AU4012095A (en) | 1994-10-25 | 1996-05-15 | United Biomedical Inc. | Synthetic ige membrane anchor peptide immunogens for the treatment of allergy |
| AU6532498A (en) | 1996-12-06 | 1998-06-29 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Inhibition of ige-mediated allergies by a human ige-derived oligopeptide |
| EP0955311A3 (en) | 1998-04-09 | 2000-08-16 | Idexx Laboratories, Inc. | Peptide vaccine for canine allergy |
| TWI229679B (en) | 1998-06-20 | 2005-03-21 | United Biomedical Inc | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens |
-
1997
- 1997-02-28 AU AU18796/97A patent/AU719609B2/en not_active Ceased
- 1997-02-28 CZ CZ0277198A patent/CZ299551B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 CA CA002245497A patent/CA2245497C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 NZ NZ331651A patent/NZ331651A/xx unknown
- 1997-02-28 EP EP97905136A patent/EP0885244B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 CN CNB971926719A patent/CN1174998C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 TR TR1998/01722T patent/TR199801722T2/xx unknown
- 1997-02-28 KR KR10-1998-0706845A patent/KR100498198B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 SK SK1181-98A patent/SK284856B6/sk unknown
- 1997-02-28 KR KR1020057005577A patent/KR100584051B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 US US09/125,641 patent/US6610297B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 IL IL12559097A patent/IL125590A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 SI SI9730490T patent/SI0885244T2/sl unknown
- 1997-02-28 ES ES97905136T patent/ES2190799T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 DE DE69718150T patent/DE69718150T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-28 PL PL97328858A patent/PL187209B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 HU HU9901109A patent/HUP9901109A3/hu unknown
- 1997-02-28 AT AT97905136T patent/ATE230417T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 BR BR9707819A patent/BR9707819A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-28 WO PCT/EP1997/001013 patent/WO1997031948A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-28 RU RU98118184/14A patent/RU2193413C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-28 JP JP53063297A patent/JP3421970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-28 DK DK97905136T patent/DK0885244T4/da active
-
1998
- 1998-08-31 NO NO19983999A patent/NO321043B1/no unknown
- 1998-12-31 HK HK98119259A patent/HK1014962A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-26 JP JP2002377664A patent/JP2003231696A/ja active Pending
-
2004
- 2004-06-04 CY CY0400044A patent/CY2457B1/xx unknown
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761431C1 (ru) * | 2020-10-26 | 2021-12-08 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
| RU2761431C9 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии |
| WO2022093065A1 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-05-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства | Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2193413C2 (ru) | Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии | |
| KR0181313B1 (ko) | 면역활성 펜티드 및 항체와 이것들의 항-알레르기 치료에의 이용 | |
| US5512283A (en) | Methods for the selective suppression of an immune response to dust mite der Pi | |
| CZ20013081A3 (cs) | Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití | |
| RU2253655C2 (ru) | Антиидиотипическое антитело к антителам, ингибирующим связывание иммуноглобулина с его высокоаффинным рецептором | |
| CA2172819C (en) | Use of anti-idiotypic antibodies to prevent hyperacute rejection of xenografts | |
| WO2000050460A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US5723582A (en) | Antigen-specific human glycosylation inhibiting factor | |
| US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
| WO1990001066A1 (en) | Porcine polyclonal and monoclonal antibodies | |
| Hannestad et al. | Anti‐idiotypic immune responses against adjuvant‐free isologous IgM monoclonal antibodies and their augmentation by complex formation between IgM and albumin in bovine serum | |
| US20050214285A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| AU707739B2 (en) | Suppressor T-cell hybridoma | |
| WO1992021240A1 (en) | Suppressor t-cell hybridoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110301 |