RU2164148C1 - Vaccine against influenza virus and method of its preparing - Google Patents
Vaccine against influenza virus and method of its preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2164148C1 RU2164148C1 RU2000120902/14A RU2000120902A RU2164148C1 RU 2164148 C1 RU2164148 C1 RU 2164148C1 RU 2000120902/14 A RU2000120902/14 A RU 2000120902/14A RU 2000120902 A RU2000120902 A RU 2000120902A RU 2164148 C1 RU2164148 C1 RU 2164148C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- influenza virus
- vaccine
- carrier
- antigens
- derivatives
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в иммунологии, в частности, для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. The invention relates to medicine and can be used in immunology, in particular for the prevention of influenza and acute respiratory viral diseases.
Наиболее применяемые при гриппозных вакцинациях живые аттенуированные или инактивированные гриппозные вакцины (1), представляя собой цельновирионные препараты, являются достаточно реактогенными и небезопасными для массовой вакцинопрофилактики. Известные препараты субъединичных вакцин менее реактогенны, но и менее эффективны, поэтому для достижения необходимого иммунного ответа требуют, как минимум двукратного, с интервалом 2-3 недели введения достаточно больших доз, что значительно затрудняет выполнение программ массовой вакцинации против гриппа. Для повышения антигенной активности субъединичные вакцины готовят с добавлением сорбентов или интактных вирионов, что также отрицательно влияет на выполнение условий безопасности и реактогенности препарата. The live attenuated or inactivated influenza vaccines most commonly used in influenza vaccinations (1), being whole-virion preparations, are quite reactogenic and unsafe for mass vaccine prophylaxis. Well-known preparations of subunit vaccines are less reactogenic, but also less effective, therefore, to achieve the necessary immune response, they require at least two times, with an interval of 2-3 weeks, administration of sufficiently large doses, which greatly complicates the implementation of mass vaccination programs against influenza. To increase antigenic activity, subunit vaccines are prepared with the addition of sorbents or intact virions, which also negatively affects the fulfillment of the safety and reactogenicity conditions of the drug.
Наиболее близкой из известных вакцин к описываемой является вакцина против вируса гриппа (2), включающая соединение полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа. The closest known vaccine to the described one is the influenza virus vaccine (2), comprising combining a polymer carrier with influenza vaccine antigens.
Однако вакцинные белки в известной вакцине, привитые на полимерный носитель с низкой молекулярной массой, недостаточно стабильны при применении и хранении препарата, а потому известная вакцина не всегда удовлетворяет жестким требованиям к срокам годности даже при выполнении особых условий, ее хранения. Известная вакцина обладает также относительно низкой иммуногенной активностью и для получения необходимого иммунного ответа требует введения достаточно высоких доз препарата. However, the vaccine proteins in the known vaccine, grafted onto a polymer carrier with a low molecular weight, are not stable enough when using and storing the drug, and therefore the known vaccine does not always meet the stringent requirements for shelf life even under special conditions, its storage. The known vaccine also has relatively low immunogenic activity and, in order to obtain the necessary immune response, requires the introduction of sufficiently high doses of the drug.
Кроме того, указанный полимерный носитель с низкой молекулярной массой не может образовывать с вакцинными антигенами устойчивых в физиологических условиях электростатических комплексов, а потому исключается возможность использования несложных, безопасных и экономичных технологий комплексообразования для производства вакцины против вируса гриппа. In addition, the indicated polymer carrier with a low molecular weight cannot form electrostatic complexes that are stable under physiological conditions with vaccine antigens, and therefore the possibility of using simple, safe and economical complexation technologies for the production of influenza virus vaccines is excluded.
Известен способ получения вакцины против вируса гриппа (2) путем взаимодействия вакцинных антигенов вирусы гриппа с полимерным носителем. Использование токсичного сукцинимидного эфира в известном способе создает экологически неблагоприятные условия его осуществления и требует специальных мер по проведению тонкой очистки, что усложняет технологию производства вакцины, повышает требования к условиям труда и технике безопасности. Недостаточная технологичность известного способа получения вакцины против вируса гриппа сопровождается значительным расходом материальных и трудовых ресурсов, в то же время выход целевого продукта не превышает 20-30%. При этом, известный способ получения вакцины против вируса гриппа не обеспечивает оперативного и объективного контроля на всех этапах производства вакцины, что отрицательно сказывается на воспроизводимости параметров препарата. A known method of obtaining a vaccine against influenza virus (2) by the interaction of vaccine antigens of influenza viruses with a polymer carrier. The use of toxic succinimide ether in the known method creates environmentally unfavorable conditions for its implementation and requires special measures for fine cleaning, which complicates the vaccine production technology, increases the requirements for working conditions and safety. The lack of manufacturability of the known method of obtaining a vaccine against influenza virus is accompanied by a significant expenditure of material and labor resources, at the same time, the yield of the target product does not exceed 20-30%. Moreover, the known method of obtaining a vaccine against influenza virus does not provide operational and objective control at all stages of vaccine production, which negatively affects the reproducibility of the parameters of the drug.
Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, заключается в создании безопасной для населения всех возрастных категорий вакцины против вируса гриппа, повышение ее профилактической эффективности при значительном снижении вакцинирующей дозы препарата, а также повышение технологичности процесса получения вакцины, расширение технологических возможностей за счет использования новых методов образования соединений полимерного носителя с вакцинными антигенами, снижение требований к технике безопасности и экологическим условиям производства, повышение качества препарата. Thus, the technical result obtained by the implementation of the described invention consists in creating a vaccine against influenza virus that is safe for the population of all age categories, increasing its prophylactic effectiveness with a significant reduction in the vaccinating dose of the drug, as well as improving the manufacturability of the vaccine production process, expanding technological capabilities due the use of new methods for the formation of compounds of the polymer carrier with vaccine antigens, reducing the requirements for technology b zopasnosti and environmental conditions of production, improve the quality of the drug.
Указанный технический результат достигается тем, что в вакцине против вируса гриппа, включающей соединение полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, при этом соединение имеет соотношение антиген-носитель 1:5-30 и общую формулу
где R - протективные антигены вируса гриппа;
n = 400-1000 - количество элементарных звеньев,
q = (0,2-0,4)п - количество алкилированных звеньев,
z = (0,4-0,8)п - количество окисленных звеньев,
x = 2 или 4; у = 1 или 2; А=CH или N.The specified technical result is achieved in that in a vaccine against influenza virus, including the connection of a polymer carrier with vaccine antigens of the influenza virus, heterogeneous chain polyamines with a molecular weight of 50,000-15,000 D are used as a polymer carrier, the compound having a carrier antigen ratio of 1: 5 -30 and the general formula
where R is the protective antigens of the influenza virus;
n = 400-1000 - the number of elementary links,
q = (0.2-0.4) p is the number of alkylated units,
z = (0.4-0.8) p is the number of oxidized units,
x is 2 or 4; y = 1 or 2; A = CH or N.
В качестве производных гетероцепных полиаминов могут быть использованы, например, сополимер N-oкиcи -1,4-этилeнпипepaзинa и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида с общей формулой
либо сополимер N-окиси-1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпипередина бромида с общей формулой
В качестве вакцинных антигенов вируса гриппа целесообразно использовать поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА).As derivatives of heterochain polyamines, for example, a copolymer of N-oxide -1,4-ethylene piperazine and (N-carboxyethyl) -1,4-ethylene piperazinium bromide with the general formula
or a copolymer of N-oxide-1,2-ethylene piperidine and (N-carboxyethyl) -1,2-ethylene piperidone bromide with the general formula
It is advisable to use the surface proteins of the influenza virus hemagglutinin (HA) and neuraminidase (HA) as vaccine antigens of the influenza virus.
В качестве вакцинных антигенов вируса гриппа применимы также внутренние белки вируса гриппа матриксный белок (М-белок) и нуклеопротеид (НП-белок). The influenza virus vaccine antigens also include the internal proteins of the influenza virus, matrix protein (M protein) and nucleoprotein (NP protein).
В качестве протективных антигенов вируса гриппа может быть использована смесь поверхностных и внутренних белков вируса гриппа
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения вакцины против вируса гриппа, включающем взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами вируса гриппа осуществляют азидным методом при весовом соотношении антиген-носитель 1:5-30.A mixture of surface and internal proteins of the influenza virus can be used as protective antigens of the influenza virus.
The specified technical result is also achieved by the fact that in the method of producing a vaccine against influenza virus, comprising the interaction of vaccine antigens of the influenza virus with a polymer carrier, derivatives of hetero-chain polyamines with a molecular weight of 50,000-15,000 D are used as a polymer carrier, and its interaction with influenza vaccine antigens carry out the azide method with a weight ratio of carrier antigen 1: 5-30.
Целесообразно производные гетероцепных полиаминов предварительно активировать путем введения гидразидных групп. It is advisable to pre-activate derivatives of heterochain polyamines by introducing hydrazide groups.
Упомянутый выше технический результат достигается также тем, что в способе получения вакцины против вируса гриппа, включающем взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами осуществляют посредством реакции комплексообразования при соотношении антиген-носитель 1:5-30. The above-mentioned technical result is also achieved by the fact that in the method for producing a vaccine against influenza virus, comprising the interaction of vaccine antigens of the influenza virus with a polymer carrier, derivatives of hetero-chain polyamines with a molecular weight of 50,000-150,000 D are used as a polymer carrier, and its interaction with vaccine antigens through a complexation reaction with a carrier antigen ratio of 1: 5-30.
При этом реакцию комплексообразования предпочтительно проводить между противоположно заряженными макромолекулами производных гетероцепных полиаминов и вакцинных антигенов вируса гриппа. In this case, the complexation reaction is preferably carried out between oppositely charged macromolecules of derivatives of heterochain polyamines and vaccine antigens of influenza virus.
В случае использования в качестве производных гетероцепных полиаминов сополимера N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксилэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида, а в качестве вакцинных антигенов - поверхностных белков вируса гриппа реакцию комплексообразования осуществляют в условиях фосфатного буферы с pH = 5,8 при температуре 2-4oC.In the case of the use of 1,4-ethylene piperazine and (N-carboxylethyl) -1,4-ethylene piperazinium bromide copolymer as heterochain polyamine derivatives, and the complexation reaction is carried out as vaccine antigens - surface proteins of the influenza virus under phosphate buffered pH = 5.8 at a temperature of 2-4 o C.
Таким образом, описываемая вакцина против вируса гриппа представляет собой либо конъюгат с прочной ковалентной связью между вакцинными антигенами вируса гриппа и водорастворимыми производными гетероцепных полиаминов, либо комплексный препарат с устойчивой электростатической связью между этими компонентами. Thus, the described influenza vaccine is either a conjugate with a strong covalent bond between vaccine antigens of the influenza virus and water-soluble derivatives of heterochain polyamines, or a complex preparation with a stable electrostatic bond between these components.
Вакцина против вируса гриппа является высокомолекулярным соединением с молекулярной массой порядка 1-3 млн Дальтон и размером молекулы в диаметре 50-80 нм и имеет изоэлектрическую точку 7,25. The influenza virus vaccine is a high molecular weight compound with a molecular weight of the order of 1-3 million Daltons and a molecule size in diameter of 50-80 nm and has an isoelectric point of 7.25.
Традиционно в гриппозных вакцинах используются поверхностные антигены вируса гриппа гемагглютинин (ГА) с молекулярной массой 77000 Д и нейраминидаза (НА) с молекулярной массой 220000 Д, которые представляют собой поверхностные белки (субъединицы суперкапсида) вириона и имеют изоэлектрические точки, соответственно, 6,9 и 7,1. Эти антигены отвечают за процесс формирования антительного иммунного ответа и обеспечивают защиту против заражения гомологичным вирусом, поскольку антитела к ГА обладают вируснейтрализующей активностью. Traditionally, influenza vaccines use the surface antigens of the influenza virus hemagglutinin (GA) with a molecular weight of 77,000 D and neuraminidase (HA) with a molecular weight of 220,000 D, which are surface proteins (supercapsid subunits) of the virion and have isoelectric points, respectively, 6.9 and 7.1. These antigens are responsible for the process of forming an antibody-based immune response and provide protection against infection with a homologous virus, since antibodies to GA have a neutralizing activity.
Используемые для получения описываемой вакцины внутренние антигены вируса гриппа (субъединицы нуклеокапсида) - нуклеопротеид (НП-белок) с молекулярной массой 170000 Д и изоэлектрической точкой 6,5 и матриксный (или М-белок) с молекулярной массой 64000 Д и изоэлектрической точкой 6,8 - также играют важную роль в инфекционном процессе. Установлено, что у переболевших гриппом или привитых от него цельновирионными вакцинами вырабатываются антитела как к поверхностным антигенам ГА и НА, так и к внутренним М-белкам и НП-белкам. The internal antigens of the influenza virus (nucleocapsid subunit) used are the nucleoprotein (NP protein) with a molecular weight of 170,000 D and an isoelectric point of 6.5 and a matrix (or M-protein) with a molecular weight of 64,000 D and an isoelectric point of 6.8 - also play an important role in the infectious process. It has been established that in patients who have been ill or vaccinated with whole-virion vaccines, antibodies are produced both against the surface antigens GA and HA, as well as to internal M-proteins and NP-proteins.
Для выделения вакцинных антигенов из вируса соответствующего штамма используют технологии с применением неионных детергентов. Вирусы гриппа выращивают в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов, очищают и концентрируют в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. To isolate vaccine antigens from the virus of the corresponding strain, technologies using non-ionic detergents are used. Influenza viruses are grown in the allantoic cavity of 10-day-old chicken embryos, purified and concentrated in a stepwise gradient of sucrose density.
Производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д представляют собой водорастворимые, нетоксичные, вполне биогенные соединения, обладающие выраженными иммунностимулирующими свойствами. Derivatives of hetero-chain polyamines with a molecular weight of 50,000-150000 D are water-soluble, non-toxic, completely biogenic compounds with pronounced immunostimulating properties.
Получение водорастворимых производных гетероцепных полиаминов осуществляют путем синтеза гетероцепных полиаминов методом "живой" катионной полимеризации с последующим их окислением и алкилированием. Полученные таким образом вещества обладают собственной физиологической и фармакологической активностями. The preparation of water-soluble derivatives of hetero-chain polyamines is carried out by synthesis of hetero-chain polyamines by the method of "live" cationic polymerization, followed by their oxidation and alkylation. The substances thus obtained have their own physiological and pharmacological activities.
Модификация вакцинных антигенов указанным высокомолекулярным водорастворимым носителем-иммуностимулятором позволяет усилить иммуногенную активность субъединиц. За счет образованных устойчивых ковалентных или электростатических (в зависимости от поставленной задачи и способа получения соединения) связей описанных производных гетероцепных полиаминов с вакцинными антигенами вируса гриппа обеспечивается высокая стабильность последних и усиление их иммуногенности, что позволяет снизить прививочную дозу антигенов. При этом, имеет место более эффективное формирование иммунологической памяти к антигенам вируса гриппа. Одновременно повышаются защитные свойства организма к другим инфекциям, а следовательно, повышение общей профилактической эффективности вакцины. Кроме того, использование нетоксичного водорастворимого носителя способствует безопасности вакцины, делая пригодным ее применение для вакцинации детей с 6-ти месячного возраста. Modification of vaccine antigens with the indicated high-molecular weight water-soluble immunostimulant carrier enhances the immunogenic activity of subunits. Due to the formation of stable covalent or electrostatic (depending on the task and the method for producing the compound) bonds of the described derivatives of heterochain polyamines with vaccine antigens of influenza virus, the latter are highly stable and their immunogenicity is enhanced, which allows to reduce the vaccination dose of antigens. At the same time, there is a more effective formation of immunological memory for influenza antigens. At the same time, the protective properties of the body to other infections increase, and consequently, an increase in the overall preventive effectiveness of the vaccine. In addition, the use of a non-toxic water-soluble carrier contributes to the safety of the vaccine, making it suitable for vaccination of children from 6 months of age.
Способ получения вакцины против вируса гриппа на основе конъюгата производных гетероцепных полиаминов с протективными антигенами вируса гриппа осуществляют следующим образом. A method of obtaining a vaccine against influenza virus based on a conjugate of derivatives of heterochain polyamines with protective antigens of influenza virus is as follows.
В описании возможности осуществления способов получения вакцины против вируса гриппа по настоящему изобретению для определенности в качестве исходного производного гетероцепного полиамина выбран выпускаемый промышленностью "полиоксидоний" - сополимер N-окиси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4- этиленпиперазиний бромида (СПЛ). In the description of the feasibility of the methods for producing the influenza virus vaccine of the present invention, for the sake of definiteness, the polyoxydonium, a copolymer of N-oxide-1,4-ethylene piperazine and (N-carboxyethyl) -1,4-ethylene piperazine bromide (CPF).
Предварительно получают активированную форму производного гетероцепного полиамина СПЛ, с этой целью исходный СПЛ модифицируют гидразин гидратом. The activated form of the heterochain polyamine derivative of CPL is preliminarily obtained; for this purpose, the initial CPL is modified with hydrazine hydrate.
Полученный после активации гидразид СПЛ смешивают с протективными антигенами вируса гриппа в соотношении 10-30:1 и проводят реакцию их взаимодействия азидным методом, в результате чего происходит ковалентное связывание вакцинных антигенов вируса гриппа с высокомолекулярным синтетическим носителем с образованием устойчивой ковалентной амидной связи между карбоксильной группой полимерного носителя и первичной аминогруппой лизинового остатка молекул белков. The SPL hydrazide obtained after activation is mixed with protective antigens of the influenza virus in a ratio of 10-30: 1 and their interaction is carried out by the azide method, as a result of which the vaccine antigens of the influenza virus are covalently bound to a high molecular weight synthetic carrier with the formation of a stable covalent amide bond between the carboxyl group of the polymer the carrier and the primary amino group of the lysine residue of the protein molecules.
Описываемый синтез проводится в строго контролируемых условиях и дает возможность получать препараты с заранее заданной структурой и соотношением белок-полимер. Использование азидного метода при тщательном соблюдении условий реакции позволяет полностью избежать межмолекулярных и внутримолекулярных сшивок, сохранить активные центры и получать целевой продукт с высоким выходом и качеством. The described synthesis is carried out under strictly controlled conditions and makes it possible to obtain preparations with a predetermined structure and protein-polymer ratio. Using the azide method with careful observance of the reaction conditions allows you to completely avoid intermolecular and intramolecular crosslinking, maintain active centers and obtain the target product with high yield and quality.
Способ получения вакцины против вируса гриппа на основе комплексного соединения высокомолекулярного полимерного носителя из класса водорастворимых производных гетероцепных полиаминов с протективными антигенами вируса гриппа осуществляют следующим образом. A method of obtaining a vaccine against influenza virus based on a complex compound of a high molecular weight polymer carrier from the class of water-soluble derivatives of hetero-chain polyamines with protective antigens of the influenza virus is as follows.
СПЛ растворяют в фосфатном буфере при pH 5,8. К полученному раствору добавляют раствор вакцинных антигенов вируса гриппа в том же буфере. В зависимости от выбора конкретных производных гетероцепных полиаминов и протективных антигенов, вступающих в реакцию прочность комплекса варьирует. При этом выбирают допустимо высокие соотношения компонентов в растворах для образования прочных электростатических связей. Реакцию комплексообразования проводят медленным добавлением раствора белка к раствору полимера в соотношениях антиген-носитель 1:5-30. При указанном значении pH макромолекулы полимерного носителя СПЛ и поверхностных антигенов вируса гриппа заряжены противоположно и в результате описываемой реакции образуют устойчивую электростатичекую связь. CPL is dissolved in phosphate buffer at pH 5.8. To the resulting solution add a solution of vaccine antigens of influenza virus in the same buffer. Depending on the choice of specific derivatives of heterochain polyamines and protective antigens that enter into the reaction, the strength of the complex varies. In this case, admissible high ratios of components in solutions are chosen for the formation of strong electrostatic bonds. The complexation reaction is carried out by slowly adding a protein solution to a polymer solution in a carrier antigen ratio of 1: 5-30. At the indicated pH value, the macromolecules of the polymer carrier of CPL and surface antigens of the influenza virus are charged opposite and form a stable electrostatic bond as a result of the described reaction.
Выделение препаратов осуществляют хроматографическимческим методом. The selection of drugs is carried out by chromatographic method.
Анализ состава полученных соединений и их специфических свойств с использованием таких методик, как SDS-электрофореэ в ПААГ, электронная и флуоресцентная микроскопия, методы кругового дихроизма, позволил количественно оценить степень связывания белка с носителем, определить локализацию связи и подтвердить конформационную стабильность белка в составе конъюгата. An analysis of the composition of the obtained compounds and their specific properties using methods such as SDS-electrophorea in PAGE, electron and fluorescence microscopy, and circular dichroism methods allowed us to quantify the degree of protein binding to the carrier, determine the localization of the bond, and confirm the conformational stability of the protein in the conjugate.
Оценка иммуногенных и протективных свойств полученных соединений проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на экспериментальных животных, а также путем испытания вакцины на добровольцах. Evaluation of the immunogenic and protective properties of the obtained compounds was carried out by studying the reaction of the immune system and the body as a whole on experimental animals, as well as by testing the vaccine on volunteers.
Проведенные исследования показали, что полученная в соответствии с описываемым изобретением вакцина против вируса гриппа в виде коньюгированиого или комплексного препарата обладает следующими преимуществами:
- иммуногенная активность в 10 раз выше по сравнению с субъединичными вакцинами,
- оптимум pH активности равен 7,25, что является близким к значениям pH физиологических жидкостей и обеспечивает высокую биодоступность,
- полностью безопасен в применении, поскольку используются только высокоочищенные вакцинные антигены вируса гриппа, а вакцинирующая доза по белкам в 3-5 раз ниже по сравнению с 11 традиционными вакцинами,
- вакцина эффективна при однократной иммунизации в течение всего эпидемиологического сезона,
- стабильность вакцинных антигенов в составе конъюгированного или комплексного препарата более чем в 100 раз превышает стабильность нативных белков,
- полимерные носители на основе высокомолекулярных водорастворимых производных гетероцепных полиаминов обладают выраженной собственной иммуностимулирующей активностью, благодаря чему достигается резкое повышение иммуногенности и профилактической эффективности вакцины.Studies have shown that the vaccine against influenza virus obtained in accordance with the described invention in the form of a conjugation or complex preparation has the following advantages:
- immunogenic activity is 10 times higher compared to subunit vaccines,
- the optimum pH of activity is 7.25, which is close to the pH values of physiological fluids and provides high bioavailability,
- completely safe to use, since only highly purified vaccine antigens of the influenza virus are used, and the vaccinating dose for proteins is 3-5 times lower compared to 11 traditional vaccines,
- the vaccine is effective in a single immunization during the entire epidemiological season,
- the stability of vaccine antigens in the conjugated or complex preparation is more than 100 times higher than the stability of native proteins,
- polymeric carriers based on high molecular weight water-soluble derivatives of hetero-chain polyamines have a pronounced intrinsic immunostimulating activity, due to which a sharp increase in the immunogenicity and prophylactic effectiveness of the vaccine is achieved.
Исследования на добровольцах проводили в период сезонного подъема заболеваемости гриппом и ОРЭ при однократной вакцинации. Из анализа заболеваемости гриппом и ОРЗ у взрослых очевидно, что в группе внешнего контроля показатель заболеваемости гриппом (92,3 на тысячу наблюдений) существенно выше по сравнению с группой привитых вакциной по описываемому изобретению (26,7 на тысячу привитых) и группой внутреннего контроля (36 на тысячу наблюдений). Была проведена серологическая расшифровка этиологического диагноза гриппа. Studies on volunteers were carried out during the period of a seasonal increase in the incidence of influenza and REM with a single vaccination. From an analysis of the incidence of influenza and acute respiratory infections in adults, it is obvious that in the external control group, the incidence of influenza (92.3 per thousand cases) is significantly higher compared with the vaccine vaccinated group according to the described invention (26.7 per thousand vaccinated) and the internal control group ( 36 per thousand observations). A serological decoding of the etiological diagnosis of influenza was carried out.
Установленные по материалам эпидоопыта показатели позволили определить по соответствующим формулам наиболее важные характеристики препарата, как вакцины, а именно:
- индекс эффективности равен 3,4,
- коэффициент профилактической эффективности - 77%,
- при наличии 50% иммунной прослойки в коллективе коэффициент противоэпидемической защиты составляет 68%.The indicators established by the materials of the epidemiological experience allowed us to determine the most important characteristics of the drug, like vaccines, according to the appropriate formulas, namely:
- the efficiency index is 3.4,
- coefficient of preventive effectiveness - 77%,
- in the presence of 50% of the immune layer in the team, the coefficient of anti-epidemic protection is 68%.
Ниже представлены примеры реализации описываемого изобретения, где в примерах 1-12 показаны конкретные варианты осуществления способов получения вакцины против вируса гриппа, а в примерах 13-16 приведена экспериментальная оценка эффективности препаратов, полученных в примерах 1-12. Результаты оценки эффективности препаратов отражены в таблицах 1-4. Below are examples of the implementation of the described invention, where examples 1-12 show specific embodiments of the methods for producing a vaccine against influenza virus, and examples 13-16 provide an experimental evaluation of the effectiveness of the preparations obtained in examples 1-12. The results of evaluating the effectiveness of the drugs are shown in tables 1-4.
Пример 1. Получение вакцины на основе конъюгата СПЛ с поверхностными белками вируса гриппа ГА и НА посредством азидного метода конъюгации. Example 1. Obtaining a vaccine based on conjugate of CPF with surface proteins of the influenza virus HA and HA through the azide conjugation method.
Первая стадия - синтез активированной формы носителя - гидразида СПЛ. The first stage is the synthesis of the activated form of the carrier - SPL hydrazide.
500 мг СПЛ (n=700; q=02; z=0,8, ММ 80000; ММР 1,33) растворяют в 25 мл метилового спирта. При температуре 20oC добавляют 0,2 мл (2·10-3) гидразин-гидрата. Реакцию ведут в течение 24 часов, после чего отгоняют метанол на роторном испарителе, остаток растворяют в воде и проводят эфирную экстракцию. Готовый продукт выделяют методом ультрафильтрации с использованием мембран фирмы "Миллипор" с последующей лиофилизацией.500 mg of CPL (n = 700; q = 02; z = 0.8, MM 80,000; MMP 1.33) are dissolved in 25 ml of methyl alcohol. At a temperature of 20 o C add 0.2 ml (2 · 10 -3 ) hydrazine hydrate. The reaction is carried out for 24 hours, after which methanol is distilled off on a rotary evaporator, the residue is dissolved in water and ether extraction is carried out. The finished product is isolated by ultrafiltration using Millipor membranes, followed by lyophilization.
Содержание гидразидных групп определяют стандартным методом титрования первичных аминогрупп - 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой. Содержание гидразидных групп составляет 10-15%. The content of hydrazide groups is determined by the standard method of titration of primary amino groups - 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid. The content of hydrazide groups is 10-15%.
Вторая стадия - получение конъюгата по реакции конденсации гидразида СПЛ с ГА и НА. The second stage is the preparation of a conjugate by the condensation reaction of CPL hydrazide with HA and HA.
100 мг гидразида СПЛ растворяют в 4 мл 1N HCl. Раствор охлаждают до 0-2oC. Затем при перемешивании и охлаждении добавляют 1,15 мл 3-х процентного раствора нитрита натрия. Через 15 минут доводят pH раствора до 8,5 добавлением 2N NaOH.100 mg of CPL hydrazide was dissolved in 4 ml of 1N HCl. The solution is cooled to 0-2 ° C. Then, with stirring and cooling, 1.15 ml of a 3% sodium nitrite solution are added. After 15 minutes, the pH of the solution was adjusted to 8.5 by the addition of 2N NaOH.
Раствор 20 мг смеси белков ГА и НА (соотношение 95:5) в 10 л 0,05 М фосфатного буфера при pH 8,5 добавляют к раствору гидразида СПЛ. Поддерживают pH реакционной смеси равным 8,5 добавлением 2N NaOH. Реакцию проводят в течение 12 часов при перемешивании и охлаждении до 0-2oC. Для выделения и очистки конъюгата реакционную смесь наносят на колонку (2,6х90), заполненную Сефадекс Г-100, в качестве элюента используют фосфатный буфер 0,05М pH 7,5, содержащий 0,05м NaCI. Выход конъюгата контролируют с помощью проточного спектрофотометра при λ = 226 нм. Определение содержания антигенов и анализ конъюгата проводят методами флуоресцентной спектроскопии и электрофореза в ПААГ. Мольный состав конъюгата белки-СПЛ составляет 1:5. Выход конъюгата 97%.A solution of 20 mg of a mixture of HA and HA proteins (95: 5 ratio) in 10 L of 0.05 M phosphate buffer at pH 8.5 is added to the SPL hydrazide solution. Maintain the pH of the reaction mixture at 8.5 by adding 2N NaOH. The reaction is carried out for 12 hours with stirring and cooling to 0-2 ° C. To isolate and purify the conjugate, the reaction mixture is applied to a column (2.6 × 90) filled with Sephadex G-100; phosphate buffer 0.05
Состав сополимера определяют методами ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии, молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение устанавливают методом малоуглового лазерного светорассеяния. The composition of the copolymer is determined by NMR spectroscopy, IR spectroscopy, molecular weight and molecular weight distribution are determined by small-angle laser light scattering.
Пример 2. Получение вакцины на основе комплекса СПЛ с поверхностными белками вируса гриппа ГА и НА. Example 2. Obtaining a vaccine based on a complex of CPF with surface proteins of the influenza virus HA and HA.
100 мг СПЛ (n=1000; q=0,4; z=0,4; MM 145000; ММР 1,7) растворяют в 10 мл 0,05М фосфатного буфера pH=5,8. При температуре 2-4oC добавляют 10 мг раствор смеси ГА и НА (соотношение 95:5) в 2 мл того же буфера. При данном значении pH макромолекулы полимерного носителя и антигенов заряжены противоположно. Реакцию комплексообразования проводят медленным введением раствора антигенов к раствору полимера, не допуская выпадения осадка. Реакционную смесь выдерживают при температуре 2-4oC в течение 24 часов. По окончании реакции доводят pH раствора до значения 7,1 добавлением раствора гидроксида натрия. Мольное соотношение комплекса белки-СПЛ составляет 1:10. Выход целевого продукта 96%. Определение содержания белка и анализ соединения проводят методами флуоресцентной спектроскопии и электрофореза в ПААГ.100 mg SPL (n = 1000; q = 0.4; z = 0.4; MM 145000; MMP 1.7) was dissolved in 10 ml of 0.05 M phosphate buffer pH = 5.8. At a temperature of 2-4 o C add a 10 mg solution of a mixture of HA and HA (95: 5 ratio) in 2 ml of the same buffer. At this pH, the macromolecules of the polymer carrier and antigens are oppositely charged. The complexation reaction is carried out by slowly introducing a solution of antigens to the polymer solution, preventing precipitation. The reaction mixture was kept at a temperature of 2-4 o C for 24 hours. At the end of the reaction, the pH of the solution was adjusted to 7.1 by the addition of sodium hydroxide solution. The molar ratio of the protein-CPL complex is 1:10. The yield of the target product is 96%. Determination of protein content and analysis of the compounds is carried out by methods of fluorescence spectroscopy and electrophoresis in SDS page.
Пример 3. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя антигенов используют СПЛ с характеристиками:
n=400, q=0,3; z=0,7; MM 60000, ММР 1,1, а в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют внутренние белки вируса гриппа М-белок и НП-белок. Мольное соотношение белок- СПЛ составляет 1:6. Анализ белка в конъюгате проводят по методу Лоури.Example 3. The process is carried out analogously to example 1, while, as a carrier of antigens, CPF is used with the characteristics:
n = 400, q = 0.3; z is 0.7; MM 60000, MMP 1.1, and the internal proteins of the influenza virus M protein and NP protein are used as influenza virus vaccine antigens. The molar ratio of protein to CPL is 1: 6. Protein analysis in the conjugate is performed according to the Lowry method.
Пример 4. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя используют СПЛ с характеристиками:
n=800; q=0,35; z=0,65; MM 100000, ММР 1,6, а в качестве вакцинных антигенов - смесь поверхностных ГА и НА белков и внутренних М-белка и НП-белка вируса гриппа. Мольное, соотношение белок-СПЛ составляет 1:5. Определение содержания белка проводят по методу Бредфорда.Example 4. The process is carried out analogously to example 1, in this case, as a carrier use CPF with the characteristics:
n is 800; q = 0.35; z is 0.65; MM 100000, MMP 1.6, and as vaccine antigens, a mixture of surface GA and HA proteins and internal M protein and NP protein of influenza virus. The molar ratio of protein-CPF is 1: 5. Determination of protein content is carried out according to the method of Bradford.
Пример 5. Процесс проводят аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ с характеристиками:
n= 540; q=0,25; z=0,75; MM 78000, ММР 1,8, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние белки вируса грипа М-белок и НП-белок. Мольное соотношение белки-СПЛ составляет 1:30. Анализ содержания белка в препарате проводили по методу Бредфорда
Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ с характеристиками:
n=900; q=0,3; z=0,7; ММ 135000;, ММР 1,7, а качестве вакцинных антигенов - смесь поверхностных ГА и НА белков и внутренних М-белка и НП-белка вируса гриппа. Мольное соотношение белки-СПЛ составляет 1:25.Example 5. The process is carried out analogously to example 2, while used as a carrier of CPF with the characteristics:
n is 540; q = 0.25; z is 0.75; MM 78000, MMP 1.8, and as vaccine antigens, the internal proteins of the influenza virus M-protein and NP-protein. The molar ratio of protein-CPF is 1:30. Analysis of protein content in the preparation was carried out according to the method of Bradford
Example 6. The process is carried out analogously to example 2, in this case, is used as a carrier of the CPF with the characteristics:
n is 900; q = 0.3; z is 0.7; ММ 135000 ;, ММР 1.7, and the quality of vaccine antigens is a mixture of surface GA and HA proteins and internal M-protein and NP-protein of influenza virus. The molar ratio of protein-CPF is 1:25.
Пример 7. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя вакцинных антигенов вируса гриппа используют сополимер N-окиси 1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпиперидиний бромида (СПЛ-А) с характеристиками:
n= 1000; q=0,4; z=0,4, MM 145000; MMP 1,7, а в качестве вакцинных антигенов используют ГА и НА. Соотношение антиген-носитель составляет 1:10. Анализ белка проводили по методу Лоури.Example 7. The process is carried out analogously to example 1, while, as a carrier of vaccine antigens of the influenza virus, a copolymer of N-
n is 1000; q = 0.4; z = 0.4, MM 145000; MMP 1.7, and GA and HA are used as vaccine antigens. The ratio of carrier antigen is 1:10. Protein analysis was performed according to the Lowry method.
Пример 8. Процесс проводят аналогично примеру 1, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:
n=400: q=0,3: z=0,7: MM 60000, MMP 1,1, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние белки вируса гриппа матриксный М-белок и НП-белок. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:8. Анализ белка проводят по методу Лоури.Example 8. The process is carried out analogously to example 1, while using SPL-A as a carrier with the characteristics:
n = 400: q = 0.3: z = 0.7: MM 60,000, MMP 1.1, and the internal proteins of the influenza virus are the matrix M protein and NP protein as vaccine antigens. The molar ratio of antigen-carrier is 1: 8. Protein analysis is performed according to the Lowry method.
Пример 9. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:
n= 900: q= 0,35: z=0,65: MM 110000, MMP 1,6, а в качестве вакцинных антигенов используют смесь поверхностных ГА- и НА- белков с внутренними М-белком и НП-белком вируса гриппа. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:5. Определение содержания белка проводили по методу Бредфорда.Example 9. The process is carried out analogously to example 1, while using SPL-A as a carrier with the characteristics:
n = 900: q = 0.35: z = 0.65: MM 110000, MMP 1.6, and a mixture of surface HA and HA proteins with the internal M protein and NP protein of the influenza virus is used as vaccine antigens. The molar ratio of antigen-carrier is 1: 5. Determination of protein content was carried out according to the Bradford method.
Пример 10. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:
n=540, q=0,25, z=0,75; MM 78000; MMP 1,8, а в качестве вакцинных антигенов - поверхностные белки вируса гриппа ГА и НА. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:30. Определение содержания белка проводили по методу Лоури.Example 10. The process is carried out analogously to example 2, while using SPL-A as a carrier with the characteristics:
n = 540, q = 0.25, z = 0.75; MM 78000; MMP 1.8, and as vaccine antigens - surface proteins of the influenza virus HA and HA. The molar ratio of antigen-carrier is 1:30. Protein content was determined by the Lowry method.
Пример 11. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:
n= 950, q=0,3; z=0,7; MM 120000; MMP 1,7, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние М-белок и НП-белок. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:25. Определение содержания белка в препарате проводили по методу Лоури.Example 11. The process is carried out analogously to example 2, while using SPL-A as a carrier with the characteristics:
n = 950, q = 0.3; z is 0.7; MM 120000; MMP 1.7, and as vaccine antigens - internal M-protein and NP-protein. The molar ratio of antigen-carrier is 1:25. Determination of protein content in the preparation was carried out according to the Lowry method.
Пример 12. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:
n= 600, q=0,4, z=0,4; MM 90000; MMP 1,7, при этом, в качестве вакцинных антигенов используют смесь поверхностных ГА и НА с внутренними М-белком и НП-белком вируса гриппа. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1: 20. Определение содержания белка проводили по методу Лоури.Example 12. The process is carried out analogously to example 2, while using SPL-A as a carrier with the characteristics:
n = 600, q = 0.4, z = 0.4; MM 90,000; MMP 1.7, in this case, as a vaccine antigen, a mixture of surface GA and HA with the internal M protein and NP protein of the influenza virus is used. The molar ratio of antigen-carrier is 1: 20. Determination of protein content was carried out according to the Lowry method.
Пример 13. Изучение эффективности вакцины против вируса гриппа. Example 13. The study of the effectiveness of the vaccine against influenza virus.
Для установления специфичности и определения нарастания титров специфических антител проводят тест оценки антигенной активности в сыворотке крови мышей и в сыворотке крови добровольцев в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). To establish specificity and determine the increase in titers of specific antibodies, a test is performed to evaluate antigenic activity in the blood serum of mice and in the blood serum of volunteers in the hemagglutination inhibition reaction (RTGA).
После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексиглазового планшета в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,2 мл гомологичного антигена в количестве 4АЕ. Смесь встряхивают и оставляют при температуре 20±2oC на 30 минут, после чего в каждую лунку добавляют 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают и оставляют при температуре 20±2oC в течение 40-45 минут (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции по 4-х крестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов. При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают предельное разведение антигена, вызывающее полную задержку гемагглютинации.After removal of nonspecific inhibitors, double dilutions of serum in the wells of a plexiglas tablet in a volume of 0.2 ml are prepared. To each dilution of serum add 0.2 ml of homologous antigen in the amount of 4AE. The mixture is shaken and left at a temperature of 20 ± 2 o C for 30 minutes, after which 0.4 ml of a 1% suspension of chicken red blood cells are added to each well. The mixture is re-shaken and left at a temperature of 20 ± 2 o C for 40-45 minutes (until the erythrocyte sedimentation in the control), after which the reaction results are recorded on a 4 cross system. For the antigen titer or one agglutinating unit (1AE), the largest dilution of the antigen is taken, giving a distinct agglutination of red blood cells. In the presence of specific antibodies in the serum, erythrocyte agglutination is delayed. The maximum dilution of antigen, causing a complete delay in hemagglutination, is taken as the antibody titer in serum.
В опытах использовали половозрелых мышей линии (CBAxC57B1/6)F1 с массой 18-20 г. В качестве антигенов использовали ГА, НА, М-белок и НП-белок вируса гриппа, выделенные из штамма вируса гриппа соответствующего типа H3N2, H1N1, В, а также препараты, полученные на основе их соединений с полимерными носителями СПЛ и СПЛ-А. In experiments, we used sexually mature (CBAxC57B1 / 6) F1 mice weighing 18–20 g. GA, HA, M protein, and NP protein of influenza virus isolated from the influenza virus strain of the corresponding type H3N2, H1N1, B were used as antigens. as well as preparations obtained on the basis of their compounds with polymer carriers SPL and SPL-A.
Дозу антигена подбирали в предварительных опытах на мышах. Каждая группа состояла из 8-10 мышей. Все препараты вводили внутрибрюшно в объеме 0,5 мл. Мыши контрольной группы получали 0,5 мл физиологического раствора. Использовалась схема двукратной вакцинации с ревакцинацией через две недели. Через 12 дней после второй иммунизации в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) оценивали иммуногенность исследуемых препаратов. The dose of antigen was selected in preliminary experiments on mice. Each group consisted of 8-10 mice. All preparations were administered intraperitoneally in a volume of 0.5 ml. Mice in the control group received 0.5 ml of physiological saline. A double vaccination regimen with revaccination after two weeks was used. 12 days after the second immunization in the reaction of inhibition of hemagglutination (rtga), the immunogenicity of the studied drugs was evaluated.
Полученные результаты представлены в таблице 1, где позиция 13 показывает антигенную активность контрольной группы. The results are presented in table 1, where
Пример 14. Оценка иммуногенности вакцины против вируса гриппа. Example 14. Evaluation of the immunogenicity of a vaccine against influenza virus.
Препараты вводили в различных дозах и схемах инбредным мышам (CBAxC57B1)F1. После этого проводили многопараметровое исследование антигенспецифических иммунных реакций, в том числе определяли содержание специфических к ГА антител в сыворотках иммунизированных животных. Drugs were administered in various doses and regimens to inbred mice (CBAxC57B1) F1. After that, a multi-parameter study of antigen-specific immune reactions was carried out, including the content of HA-specific antibodies in the sera of immunized animals was determined.
Препараты разводили в фосфатном буфере, вводили мышам в дозе от 0,1 до 10 мг/мышь по белку внутрибрюшно или подкожно в область основания хвоста. Для индукции вторичной иммунной реакции делали повторную инъекцию препарата спустя 21 день после первого введения. В определенные сроки после иммунизации проводили декапитацию мышей, собирали кровь и получали сыворотки. The preparations were diluted in phosphate buffer, injected into mice at a dose of 0.1 to 10 mg / mouse protein protein intraperitoneally or subcutaneously in the region of the base of the tail. To induce a secondary immune response, a second injection of the drug was made 21 days after the first injection. At certain times after immunization, mice were decapitated, blood was collected, and serum was obtained.
Содержание специфических к ГА антител в сыворотках определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ проводили в 96-ти луночных полистироловых планшетах по общепринятой методике. The content of GA-specific antibodies in serum was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The analysis was carried out in 96-well polystyrene plates according to the standard method.
ИФА-титры антител определяли после первичной и вторичной иммунизации в опытных и контрольной группах и расчитывали коэффициент специфической иммунной памяти Кип и коэффициент специфической иммуностамуляции Kсс. У мышей контрольной группы иммунная память не формируется.ELISA antibody titers were determined after primary and secondary immunization in the experimental and control groups, and the specific immune memory coefficient K ip and the specific immunostamulation coefficient K ss were calculated. In mice of the control group, immune memory is not formed.
Данные коэффициенты не зависят от абсолютных значений титров и являются объективными показателями иммуногенных свойств вакцинных препаратов. Результаты анализа представлены в таблице 2. These coefficients do not depend on the absolute values of the titers and are objective indicators of the immunogenic properties of vaccine preparations. The results of the analysis are presented in table 2.
Пример 15. Оценка иммуногенности описываемой вакцины на добровольцах проводилась в соответствии с утвержденным Протоколом испытаний. Для вакцинации отбирали серонегативных (титр РТГА менее 10) лиц среднего возраста (30-40 лет), группы со стояли из 10-12 человек. Вакцинацию проводили внутримышечно, в область дельтовидной мышцы левой руки шприцами одноразового пользования по 0,5 мл однократно. Каждая доза содержала по (5±1) мкг гемагглютинина вируса гриппа типа A (H1N1) и носителя СПЛ-1 в дозе, соответствующей описанному в примерах 1, 2, 4, 6. Лицам, вошедшим в контрольную группу, вводили по 0,5 мл физиологического раствора. Example 15. Evaluation of the immunogenicity of the described vaccine in volunteers was carried out in accordance with the approved Test Protocol. Seronegative (rtga titer less than 10) middle-aged people (30–40 years old) were selected for vaccination; groups consisted of 10–12 people. Vaccination was carried out intramuscularly, into the region of the deltoid muscle of the left hand with 0.5 ml disposable syringes once. Each dose contained (5 ± 1) μg hemagglutinin of type A influenza virus (H1N1) and SPL-1 carrier at a dose corresponding to that described in examples 1, 2, 4, 6. People included in the control group were administered 0.5 ml of physiological saline.
Для оценки иммуногенности изучаемых препаратов парные сыворотки привитых, взятые до вакцинации и через месяц после нее, исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вакцинным штаммом вируса гриппа. Эффективность препаратов оценивали по проценту лиц с защитными титрами антител. Лица считаются иммуннозащищенными, если титр антител в РТГА превышает 1:40. To assess the immunogenicity of the studied drugs, paired vaccinated sera taken prior to vaccination and a month after it were examined in the hemagglutination inhibition test (RTGA) with a vaccine strain of the influenza virus. The effectiveness of the drugs was evaluated by the percentage of individuals with protective titers of antibodies. Persons are considered immune-protected if the antibody titer in rtga exceeds 1:40.
Результаты изучения иммуногенности вакцин представлены в таблице 3. The results of the study of the immunogenicity of vaccines are presented in table 3.
Экспериментальные данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о формировании у лиц, вакцинированных описываемыми препаратами, напряженного иммунного ответа с высоким защитным титром антител. The experimental data shown in table 3 indicate the formation in individuals vaccinated with the described drugs, a tense immune response with a high protective titer of antibodies.
Пример 16. Оценка эффективности вакцины против вируса гриппа в тесте нейтрализации вируса. Example 16. Evaluation of the effectiveness of the vaccine against influenza virus in the test of neutralization of the virus.
Определение титров "защитных" антител проводится по методике вируснейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных описываемыми препаратами. Determination of titers of "protective" antibodies is carried out according to the method of virus-neutralizing activity of the sera of mice immunized with the described drugs.
Постановка эксперимента осуществляется аналогично примеру 14. После двукратного (с интервалом 21 день) введения оптимальной иммуногенной дозы вакцины у мышей собирают сыворотку крови и исследуют ее активность в тесте инактивации живого вируса гриппа. С этой целью различные разведения сыворотки смешивают с суспензией вируса гриппа и по общепринятой методике оценивают титры вируснейтрализующих антител. Вируснейтрализующим титром мышиной сыворотки считают ее максимальное разведение, которое вызывает отмену гемагглютинирующей активности аллантоисной жидкости в 50% эмбрионов. Результаты оценки приведены в таблице 4. The experiment is carried out analogously to example 14. After two (with an interval of 21 days) administration of the optimal immunogenic dose of the vaccine, the blood serum is collected from the mice and its activity is examined in the inactivation test of live influenza virus. For this purpose, various dilutions of the serum are mixed with a suspension of influenza virus and the titers of neutralizing antibodies are evaluated according to the generally accepted method. Virus neutralizing titer of mouse serum is considered its maximum dilution, which causes the abolition of the hemagglutinating activity of allantoic fluid in 50% of embryos. The evaluation results are shown in table 4.
Известно, что титры 1:400 и индекс сероконверсии 40 в тесте нейтрализации вируса гриппа являются надежными показателями эффективности вакцины против вируса гриппа и считаются "защитными" титрами. Приведенные в таблице 3 данные показывают, что сыворотки мышей, иммунизированных препаратами по описываемому изобретению, содержат по меньшей мере в 40 раз больше вируснейтрализующих антител, чем в нормальных мышиных сыворотках. It is known that titers of 1: 400 and a seroconversion index of 40 in the neutralization test of influenza virus are reliable indicators of the effectiveness of the vaccine against influenza virus and are considered "protective" titers. The data shown in table 3 show that the sera of mice immunized with the preparations of the described invention contain at least 40 times more virus-neutralizing antibodies than in normal murine sera.
Источники информации
1. Перадзе Т. В. и др. Противогриппозные профилактические препараты. М.: Медицина, 1986, с. 79, 100, /2/.Sources of information
1. Peradze T. V. and others. Influenza prophylactic drugs. M .: Medicine, 1986, p. 79, 100, / 2 /.
2. Патент РФ N 1580617, МКИ А 61 К 39/145, оп. 1996. 2. RF patent N 1580617, MKI A 61 K 39/145, op. 1996.
Claims (9)
где R - вакцинные антигены вируса гриппа;
n = 350 - 1000 - количество элементарных звеньев;
q = (0,2 - 0,4)n - количество алкилированных звеньев;
z = (0,4 - 0,8)n - количество окисленных звеньев;
x = 2 или 4; y = 1 или 2; А = CH или N.1. A vaccine against influenza virus, comprising a compound of a polymer carrier with vaccine antigens of influenza virus, characterized in that as a polymer carrier using derivatives of hetero-chain polyamines with mol. m. 50,000 - 150,000 D, while the compound has a carrier antigen ratio of 1: 5 - 30 and the general formula
where R - vaccine antigens of influenza virus;
n = 350 - 1000 - the number of elementary links;
q = (0.2 - 0.4) n is the number of alkylated units;
z = (0.4 - 0.8) n is the number of oxidized units;
x is 2 or 4; y is 1 or 2; A = CH or N.
3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве производных гетероцепных полиаминов используют сополимер N-окиси-1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпиперидиний бромида с общей формулой
4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин и нейраминидазу.2. The vaccine according to claim 1, characterized in that the copolymer of N-oxide 1,4-ethylene piperazine and (N-carboxyethyl) -1,4-ethylene piperazinium bromide with the general formula
3. The vaccine according to claim 1, characterized in that the copolymer of N-oxide-1,2-ethylene piperidine and (N-carboxyethyl) -1,2-ethylene piperidinium bromide with the general formula
4. The vaccine according to claim 1, characterized in that the surface proteins of the influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are used as influenza virus vaccine antigens.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000120902/14A RU2164148C1 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Vaccine against influenza virus and method of its preparing |
| PCT/RU2001/000229 WO2002011758A1 (en) | 2000-08-09 | 2001-06-13 | Vaccine against the influenza virus and method for producing said virus vaccine |
| KR1020037001870A KR100568013B1 (en) | 2000-08-09 | 2001-06-13 | Vaccine against influenza virus and method for producing thereof |
| AU2001269640A AU2001269640B2 (en) | 2000-08-09 | 2001-06-13 | Vaccine against the influenza virus and method for producing said virus vaccine |
| AU6964001A AU6964001A (en) | 2000-08-09 | 2001-06-13 | Vaccine against the influenza virus and method for producing said virus vaccine |
| CN018149448A CN1464789B (en) | 2000-08-09 | 2001-06-13 | Vaccine against the influenza virus and method for producing said virus vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000120902/14A RU2164148C1 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Vaccine against influenza virus and method of its preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2164148C1 true RU2164148C1 (en) | 2001-03-20 |
Family
ID=20238868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000120902/14A RU2164148C1 (en) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | Vaccine against influenza virus and method of its preparing |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100568013B1 (en) |
| CN (1) | CN1464789B (en) |
| AU (2) | AU2001269640B2 (en) |
| RU (1) | RU2164148C1 (en) |
| WO (1) | WO2002011758A1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011162639A1 (en) * | 2010-06-24 | 2011-12-29 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" | Heterochain aliphatic poly-n-oxide copolymers and vaccinating agents and drugs based thereon |
| RU2446824C2 (en) * | 2010-07-20 | 2012-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Influenza vaccine and method for preparing it |
| RU2682752C2 (en) * | 2011-09-30 | 2019-03-21 | Медикаго Инк. | Increasing variable-free particles output in plants |
| RU2740751C1 (en) * | 2019-08-28 | 2021-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Развитие БиоТехнологий" | Method of producing tetravalent subunit influenza vaccine |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1580617A1 (en) * | 1988-05-13 | 1997-02-10 | Институт иммунологии | Method of preparing vaccine against influenza virus |
| RU2073031C1 (en) * | 1990-08-06 | 1997-02-10 | Некрасов Аркадий Васильевич | Derivatives of poly-1,4-ethylenepiperazine showing immunostimulating, antiviral and antibacterial activity |
| RU2112542C1 (en) * | 1997-02-28 | 1998-06-10 | Аркадий Васильевич Некрасов | Preparation for treatment of connective tissue pathological state |
| RU2153354C1 (en) * | 1999-03-31 | 2000-07-27 | Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом | Vaccine against tuberculosis |
-
2000
- 2000-08-09 RU RU2000120902/14A patent/RU2164148C1/en active
-
2001
- 2001-06-13 WO PCT/RU2001/000229 patent/WO2002011758A1/en active IP Right Grant
- 2001-06-13 KR KR1020037001870A patent/KR100568013B1/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 AU AU2001269640A patent/AU2001269640B2/en not_active Ceased
- 2001-06-13 CN CN018149448A patent/CN1464789B/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-13 AU AU6964001A patent/AU6964001A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011162639A1 (en) * | 2010-06-24 | 2011-12-29 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" | Heterochain aliphatic poly-n-oxide copolymers and vaccinating agents and drugs based thereon |
| US9155759B2 (en) | 2010-06-24 | 2015-10-13 | Obchtchestvo S Ogranitchennoi Otvestvennostyou “Npo Petrovaks Farm” | Heterochain aliphatic poly-N-oxide copolymers and vaccinating agents and drugs based thereon |
| RU2446824C2 (en) * | 2010-07-20 | 2012-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Influenza vaccine and method for preparing it |
| RU2682752C2 (en) * | 2011-09-30 | 2019-03-21 | Медикаго Инк. | Increasing variable-free particles output in plants |
| RU2740751C1 (en) * | 2019-08-28 | 2021-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Развитие БиоТехнологий" | Method of producing tetravalent subunit influenza vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6964001A (en) | 2002-02-18 |
| KR20030059096A (en) | 2003-07-07 |
| AU2001269640B2 (en) | 2005-12-22 |
| KR100568013B1 (en) | 2006-04-05 |
| CN1464789A (en) | 2003-12-31 |
| WO2002011758A1 (en) | 2002-02-14 |
| WO2002011758A8 (en) | 2003-07-24 |
| CN1464789B (en) | 2010-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5795582A (en) | Adjuvant properties of poly (amidoamine) dendrimers | |
| US4474757A (en) | Synthetic vaccine and process for producing same | |
| JP6072777B2 (en) | Protein matrix vaccine composition comprising a polycation | |
| JP2010500354A (en) | Protein matrix vaccines and methods for producing and administering such vaccines | |
| US20110206727A1 (en) | Multivalent Vaccines Based on Papaya Mosaic Virus and Uses Thereof | |
| CN104507496B (en) | Including the immunogenic compound with the HIV GP41 peptides of CRM197 carrier protein couplets | |
| CA2705242A1 (en) | Enhancement of immunogenicity of antigens | |
| AU600460B2 (en) | Peptides corresponding to antigenic and immunogenic determinants of major neutralizing proteins of rotaviruses | |
| TW202039556A (en) | Peptide immunogens targeting calcitonin gene-related peptide (cgrp) and formulations thereof for prevention and treatment of migraine | |
| RU2164148C1 (en) | Vaccine against influenza virus and method of its preparing | |
| US20230372466A1 (en) | Universal mammalian influenza vaccine | |
| JP2007505836A (en) | Measles subunit vaccine | |
| Levi et al. | Effects of adjuvants and multiple antigen peptides on humoral and cellular immune responses to gp160 of HIV-1 | |
| JPH05506234A (en) | vaccine composition | |
| KR100341958B1 (en) | Vaccine Composition | |
| Ogrina et al. | Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens | |
| CN113181353B (en) | Antiviral vaccine molecule, preparation method and application thereof | |
| JP4099059B2 (en) | Methods for obtaining antigenic structures that enhance specific cross-reactivity | |
| Habili et al. | Comparative studies on tomato aspermy and cucumber mosaic viruses: IV. Immunogenic and serological properties | |
| Leibl et al. | Adjuvant/carrier activity of inactivated tick-borne encephalitis virus | |
| Weiß et al. | Immunogenic properties of ISCOM prepared with influenza virus nucleoprotein | |
| Murdin et al. | Synthetic peptide vaccines against foot-and-mouth disease. II. Comparison of the response of guinea-pigs, rabbits and mice to various formulations | |
| JP2001505763A (en) | HIV P-17 peptide fragment, composition containing the same, and methods for producing and using the same | |
| TW202140526A (en) | Peptide immunogens targeting pituitary adenylate cyclase-activating peptide (pacap) and formulations thereof for prevention and treatment of migraine | |
| JP2023518427A (en) | Haptenized coronavirus spike protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20040906 |
|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20040906 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20070313 |
|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20071225 |
|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20040906 |
|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20040906 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20080410 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20090406 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20090703 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20100414 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20100625 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20110621 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20100625 Effective date: 20120315 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20120628 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20130221 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20130405 |
|
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20130405 Effective date: 20140324 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20150826 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20170405 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |