RU2142998C1 - Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты), кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты) - Google Patents
Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты), кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2142998C1 RU2142998C1 RU96113114A RU96113114A RU2142998C1 RU 2142998 C1 RU2142998 C1 RU 2142998C1 RU 96113114 A RU96113114 A RU 96113114A RU 96113114 A RU96113114 A RU 96113114A RU 2142998 C1 RU2142998 C1 RU 2142998C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- expression
- promoter
- agrobacterium tumefaciens
- synthase
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 174
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 141
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 15
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 178
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims abstract description 66
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 43
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 28
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 28
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 claims description 26
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 17
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 13
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N Mannopine Natural products NC(=O)CCC(C(O)=O)NCC(O)C(O)C(O)C(O)CO VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VPRLICVDSGMIKO-SZWOQXJISA-N mannopine Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO VPRLICVDSGMIKO-SZWOQXJISA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 139
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 145
- 101150029798 ocs gene Proteins 0.000 description 84
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 63
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 30
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 30
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 14
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 14
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 13
- 101150085302 MAS2 gene Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 12
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 10
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 7
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- 208000000291 Nematode infections Diseases 0.000 description 4
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 2
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101150060916 MAS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000243786 Meloidogyne incognita Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- -1 peroxidases Chemical class 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKHXKQJMUZVCJM-QRPNPIFTSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;azane Chemical compound N.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 QKHXKQJMUZVCJM-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- JIHQDMXYYFUGFV-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine Chemical compound C1=NC=NC=N1 JIHQDMXYYFUGFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100289989 Drosophila melanogaster alpha-Man-Ia gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000663222 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 1 Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101150021286 MAS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 229910003177 MnII Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000693242 Mus musculus Paternally-expressed gene 3 protein Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 101000579646 Penaeus vannamei Penaeidin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100037044 Serine/arginine-rich splicing factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000723811 Soybean mosaic virus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000723677 Tobacco ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 241001002356 Valeriana edulis Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000007940 bacterial gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 101150077062 pal gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений может быть использована в селекции растений. Химерные регуляторные участки нуклеотидных последовательностей и генные конструкции на основе генов опин-синтазы Agrobacterium fumefaciens обеспечивают повышенные уровни экспрессии чужеродных генов в растениях. Для увеличения экспрессии генов различные "upstream"-расположенные активирующие последовательности, например, из генов маннопин- и октопин-синтазы операбельно соединяют с промоторами, которые, в свою очередь, операбельно соединяют с чужеродным геном. Конструкции вводят в растительные клетки с помощью плазмид. 19 с. и 13 з.п.ф-лы, 9 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к химерным регуляторным участкам, применяемым для контроля экспрессии генов в растениях. Эти химерные регуляторные участки выделены из генов опин-синтазы патогена растений Agrobacterium tumefaciens.
A. tumefaciens - грамотрицательная почвенная бактерия, которая инфицирует большинство двудольных и ряд однодольных растений. Инфекция A. tumefaciens часто приводит к образованию корончатых галлов на инфицированных растениях. В процессе инфекции A. tumefaciens определенный сегмент ДНК (Т-ДНК) большой плазмиды, индуцирующей опухоли (Ti), переносится в клетку чувствительного растения и интегрируются в ядерный геном растения. При этом происходит экспрессия генов Т-ДНК. Некоторые гены Т-ДНК кодируют ферменты, участвующие в синтезе гормонов, активных в растениях. Эти гормоны могут вызывать образование опухоли у инфицированных растений. Другие гены Т-ДНК направляют синтез и секрецию уникальных производных аминокислот и сахаров, называемых опинами. A. tumefaciens может использовать эти опины в качестве источников углерода и (иногда) азота. См. Gelvin, Plant Physiol. 92: 281-85 (1990); Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993); Ream, Ann. Rev. Phytopathol. 27: 583-618 (1989; Zambryski, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-90 (1992).
Гены Т-ДНК содержат участки, работающие в растениях и обладающие сходством с регуляторными участками растений. Например, большинство промоторов растений содержат цис-действующие элементы, такие как расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности (UAS) (часто называемые энхансерами), которые, связывая транс-действующие факторы, определяют или влияют на силу промотора и тканеспецифичную экспрессию. Atchison, Annu. Rev. Cell Biol. 4:127-53 (1988). Общая сила промотора, а также экспрессия соответствующего ему гена может определяться комбинацией и пространственной ориентацией цис-действующих элементов, а также наличием ядерных факторов, взаимодействующих с этими элементами. Dynan, Cell 58:1-4 (1989). Изначально находясь на прокариотной плазмиде, гены Т-ДНК сохраняют все элементы последовательности (промоторы и UAS), необходимые для транскрипции в растениях. Например, гены Т-ДНК содержат области ТАТА, которые находятся в сайте инициации транскрипции и содержат расположенные перед ними элементы на расстоянии более ста пар осн. от сайта инициации транскрипции, что модулирует уровни транскрипции. См. Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993).
Два гена, которые содержат расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, представлены генами октопин-синтазы (ocs) и маннопин-синтазы (mas). Ген ocs кодирует продукт, который конденсирует аргинин и пируват с образованием октопина. Hack and Kemp, Plant Physiol. 65:949-55 (1980). Палиндром из 16 пар оснований, расположенный перед геном ocs, активирует гетерологичный промотор кукурузы adhl в временной экспрессирующей системе. Ellis et al., EMBO J. 6:11-16 (1987); Ellis et al., EMBO J. 6:3203-08 (1987). Этот палиндром также важен для активности промотора ocs в стабильно трансформированном каллюсе табака. Leisner and Gelvin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner and Gelvin, Plant Cell 1: 925-36 (1989).
Гены mas 1' и 2' делят двойной двунаправленный промотор и интергенный участок из 479 пар осн. Эти гены кодируют ферменты двустадийного пути синтеза маннопина Ellis et al., Mol. Gen. Genet. 195:466-73 (1984); Komro et al., Plant Mol. Biol. 4: 253-63 (1985). Транскрипция генов mas является дивергентной, а интергенный участок содержит все цис-действующие элементы, необходимые для транскрипции обоих генов. DiRita and Gelvin, Mol. Gen. Genet. 207: 233-41 (1987); Fox et al. Plant Mol. Biol. 20: 219-33 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991); Guevara-Garcia et al., Plant J. 4: 495-505 (1993).
Промоторы генов ocs и mas использовали для направления экспрессии связанных генов в трансгенных растениях. Однако применение этих промоторов было ограничено низким уровнем экспрессии в определенных тканях трансгенных растений. DiRita and Gelvin, supra; Harpster et al., Mol. Gen. Genet. 212: 182-90 (1988); Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14: 433-43 (1990). Например, промотор ocs направляет определенную, специфичную для клеток экспрессию в трансгенном табаке. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27(1992). Ген mas отличается слабой экспрессией в листьях и стеблях при более сильной экспрессии в корнях. Он проявляет повышенную экспрессию в повреждениях и индуцируется ауксином. Langridge et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci 86: 7890-94 (1989); Teeri et al., EMBO J., 8: 343-50 (1989); Saito et al., Planta 184: 40-46 (1991) Guevara-Garcia et al., loc. cit.
Поскольку промоторы и другие регуляторные участки имеют различную силу и тканевую специфичность, были разработаны определенные рекомбинантные регуляторные участки. Например, энхансерные элементы, которые специфично связывают определенные транс-действующие факторы, могут модулировать активность транскрипции и экспрессию, специфичную для клеток. Bienz and Pelham, Cell 45: 753-60 (1986).
Известно также применение определенных конститутивных промоторов, например 35S конструкций вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Промотор CaMV 35S имеет активаторы с множественными доменами, которые активируют промотор 35S в зависимости от стадии развития и тканевой специфичности. См. Benfey et al. , EMBO J. 8: 2195-2202 (1989); Benfey et al., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990): Benfey et al., EMBO J. 9: 1685-96.
Публикация Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-199 (1993) относится к промоторам, применяемым в конструкциях, получаемых для тканеспецифичной стимуляции гетерологичного гена. Koziel предлагает конструкцию системы экспрессии гена, которая содержит усеченный ген crylA(b) (фрагмент гена, кодирующий первые 648 аминокислот инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis, состоящего из 1155 аминокислот), связанный с промотором CaMV 35S или комбинацией 2-х тканеспецифичных промоторов, выделенных из кукурузы (промотор фосфоенолпируват-карбоксилазы (PEPC) и промотор, специфичный для пыльцы). Koziel отмечает высокие уровни экспрессии при использовании любой промоторной конфигурации. Koziel et al. также использовали (1) промотор PEPC, который, как известно, вызывает специфичную для зеленых тканей экспрессию, и (2) промотор, специфичный для пыльцы кукурузы. Полученная экспрессия инсектицидного белка на уровне 1500 - 4000 нг/мг является достаточно высоким уровнем экспрессии. Кроме того, применение промоторов PEPC/специфичных к пыльце приводило к тканеспецифичной экспрессии.
Известны также попытки получить рекомбинантную экспрессию иными способами. Изобретение Bevan et al., PCT/GB92/00566 (1992) в основном относится к применению единственного промотора, отличного от промотора, описанного Koziel et al., для получения тканеспецифичной экспрессии гетерологичного гена. Это применение связано с использованием промотора фенилаланин-аммоний-лиазы бобов (PAL) для получения тканеспецифичной экспрессии. Был сконструирован гибридный ген, в котором слиты участки регуляции транскрипции геномного клона PAL (клона, содержащего в дополнение к кодирующим последовательностям, промежуточные последовательности, являющиеся частью последовательностей гена PAL) и открытая рамка считывания (ORF), содержащая 68 аминокислот N-конца белка PAL с полной ORF бета-глюкуронидазы (GUS) после участка полиаденилирования и терминации транскрипции нопалин-синтазы (слияние двух последних элементов типично для большинства экспрессирующих векторов эукариотных растений и обеспечивает эффективную экспрессию). Поскольку исходная конструкция обладала сильной активностью в ряде растений, исследователи создали делеции в участках промотора PAL гибридного гена. Минимальный промотор PAL, необходимый для полной экспрессии, как было показано, состоит из 253 пар осн. стартового сайта (инициации) транскрипции PAL. Варьированием участков делеции, главным образом в этом минимальном участке, исследователи установили возможность модификации степени тканеспецифичной экспрессии.
Патент США N 5034322 в основном относится к применению промоторов нопалин-синазы с малой субъединицей гена рибулоза-1,5-бис-фосфат-карбоксилазы.
Было также показано, что химерный промотор, названный "Mac", который содержит участок от +65 до -301 mas и участок от -90 до -941 энхансера 35S, обладает активностью GUS на уровне, в несколько раз превышающем уровень двойного промотора CaMV 35S в трансгенных растениях табака Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990).
Описанные выше конструкции имеют ряд ограничений в плане эффективности и контролируемости экспрессии. Например, известные подходы не обеспечивают сильную конститутивную экспрессию в условиях, когда она желательна.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является получение химерных регуляторных участков для улучшенной экспрессии генов в растениях.
Целью настоящего изобретения является получение химерных регуляторных участков для улучшенной экспрессии генов в растениях.
Изобретение также позволяет получать химерные регуляторные участки, которые содержат промоторы и находящиеся против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.
Согласно изобретению также возможно получение генных кластеров, содержащих гены, экспрессирующиеся под контролем химерных регуляторных участков, которые содержат промоторы и находящиеся против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.
Еще одним объектом изобретения является способ получения индуцибельной экспрессии чужеродных генов в растениях.
И, наконец, получение плазмид и трансгенных растений, содержащих генные кластеры, также предусмотрено настоящим изобретением.
В соответствии этим, согласно изобретению представлены химерные регуляторные участки для экспрессии генов в растениях, которые содержат указанную активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанную с промотором, выделенным из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens, отличного от первого гена опин-синтазы A. tumefaciens. Первый и второй гены опин-синтазы A. tumefaciens предпочтительно представлены генами маннопин-синтазы или октопин-синтазы.
Также представлены химерные регуляторные участки для экспрессии генов в растениях, содержащие по меньшей мере две активирующие последовательности опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанные с промотором опин-синтазы A. tumefaciens. Указанные активирующие последовательности могут быть выделены из одного и того же или различных генов опин-синтазы A. tumefaciens, например маннопин-синтазы и октопин-синтазы. Дополнительно одна или обе активирующие последовательности и промотор могут быть выделены из одного и того же гена опин-синтазы A. tumefaciens.
В соответствии с изобретением предложены также генные кластеры, содержащие экспрессируемый ген, оперативно связанный с химерным регуляторным участком, как описано выше. Генный кластер может содержать также терминаторы транскрипции и сигналы полиаденилирования, например сигнал полиаденилирования нопалин-синтазы.
Кроме того, предложен кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена, который содержит чужеродный ген, оперативно связанный с регуляторным участком, который содержит промотор, выделенный из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens. Регуляторный участок может также содержать активирующие последовательности, выделенные из гена октопин-синтазы A. tumefaciens.
Объектами изобретения являются также способы экспрессии генов в растениях, которые предусматривают стадии связывания гена с химерным регуляторным участком, соответствующим изобретению, инсерцию гена и химерного регуляторного участка в растение и обеспечение экспрессии гена в растении.
Кроме того, представлены плазмиды и трансгенные растения, несущие описанные в изобретении химерные регуляторные участки и генные кластеры.
Иные объекты, отличия и преимущества настоящего изобретения будут рассмотрены при обсуждении экспериментальных данных и чертежей.
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 схематически представлена структура химерных регуляторных участков на основе mas и ocs. Стрелки указывают на ориентацию расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей относительно промоторов mas и ocs. Цифры означают положение нуклеотидов относительно сайтов инициации транскрипции. Тример активирующей последовательности ocs был использован в конструкциях 3 и 4. Мономер или тример активирующей последовательности ocs был использован в конструкциях 5 и 6.
На фиг. 2 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "
". A - активирующая последовательность, P - промотор, (Aocs)3 - тример активирующей последовательности ocs.
На фиг. 3 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Различные конструкции указаны внизу графиков. Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "
". A - активирующая последовательность, P - промотор, AocsAmasPmas - мономер активирующей последовательности ocs, связанной с активирующей последовательностью mas и промотором; (Aocs)3AmasPmas - тример активирующей последовательности ocs, связанной с активирующей последовательностью mas и промотором.
На фиг. 4 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "
". A - активирующая последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.
На фиг. 5 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. Активность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. А), стеблей (граф. Б) или корней (граф. В). Каждый столбец представляет активность отдельного трансформанта. Различные конструкции указаны внизу графиков. Число отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". Средняя активность GUS для каждой конструкции обозначена "
". A - активирующая последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.
На фиг. 6 представлены приблизительные уровни экспрессии активности GUS двойных промоторов CaMV 35S и Mac в листьях (двойной 35SL, MacL), стеблях (двойной 35SS, MacS) и корнях (двойной 35SR, MacR) нескольких трансгенных растений табака.
На фиг. 7 схематично представлены конструкции, использованные при изучении индуцибельной экспрессии. UAS - расположенная против хода транскрипции активирующая последовательность, pmas - промотор mas, GUS - ген β -глюкуронидазы, NOS - сигналы полиаденилирования нопалин-синтазы.
На фиг. 8 представлен уровень активности GUS в выделенных зрелых яйцах нематод. Анализы проводили при pH 5,5 и 7,5 для проверки активности GUS бактериального и животного происхождения.
На фиг. 9 представлена активность индуцированной нематодами GUS в различных трансгенных растениях. На панели А представлены трансгенные растения, имеющие промотор Pmas, но не имеющие активирующих последовательностей, на панели Б - трансгенные растения, имеющие промотор AmasPmas, на панели В - трансгенные растения, имеющие промотор AocsAmasPmas.
Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения.
Настоящее изобретение относится к химерным регуляторным участкам, содержащим различные расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности и промоторы из генов опин-синтазы A. tumefaciens, которые применяют для контроля экспрессии чужеродных генов. Чужеродный ген содержит любую ДНК, планируемую для экспрессии в трансгенном растении. В данном контексте ген, независимо от его происхождения, вводят в геном растения, и он, таким образом, является чужеродным растению в локализации инсерции даже в случае, когда ген выделен из трансформируемого растения. Изобретенные конструкции в соответствии с настоящим изобретением также описаны в патентной заявке США N 08/155067, заявлено 19.11.93, включенной в настоящее описание путем ссылки.
Все типы продуктов, кодируемых генами, можно получить с помощью настоящего изобретения. Чужеродные гены, экспрессируемые в трансгенных растениях, согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются β -глюкуронидазой, генами, кодирующими инсектицидные и фунгицидные токсины, соединениями, обусловливающими устойчивость к патогенам, соединениями, обусловливающими сверхчувствительную реакцию, например пероксидазами, глюканазами и хитиназами, а также фитоалексинами; генами устойчивости к пестицидам, гербицидам и фунгицидам; ферментами растений, например связанными с содержанием белков, крахмала, сахаров и жиров; ингибиторами ферментов растений, например ингибиторами протеазы и амилазы; гормонами растений; гормонами и феромонами насекомых; фармацевтическими и пищевыми соединениями, например бета-каротином; витаминами и антителами, в том числе фрагментами и одноцепочечными производными антител, и антисмысловыми транскриптами, нарушающими нуклеотидные последовательности, присутствующие в растениях. См., например, Kung and Wu, Transgenic Plants, vol. 1 (Academic Press 1993).
В общем, природный промотор маннопин-синтазы с активирующей последовательностью или природный промотор октопин-синтазы с активирующей последовательностью являются относительно слабыми в тканях трансгенных растений табака (активность GUS, обусловленная связанными репортерными генами gusA, составляет несколько сотен, несколько тысяч единиц активности GUS). В соответствии с настоящим изобретением сочетание UAS из этих генов с промотором с активирующей последовательностью заметно повышает активность GUS связанного гена gusA (на два порядка), приводя к активностям порядка сотен тысяч единиц активности GUS. Гистохимическое исследование ткани трансгенных растений табака экспрессирующих эти слитые гены промотор-gusA показывает, что новые комбинации промотора и активирующей последовательности, представленные в изобретении, работают в большинстве типов клеток растений. Таким образом, эти комбинации (химерные регуляторные участки) могут быть более конститутивными по сравнению с известными промоторами.
Изобретение относится к улучшенным регуляторным участкам растений, обеспечивающим сильную и постоянную стимуляцию экспрессии генов. Дополнительно может быть получена тканенеспецифичная и/или повышенная в определенных тканях экспрессия. Выбор активирующих последовательностей и промоторов в соответствии с изобретением обусловливает желаемый тип экспрессии.
Представленные химерные регуляторные участки характеризуются более сильной экспрессией в табаке, чем любой другой известный регуляторный участок. Табак является широко используемой моделью для трансформации растений. Дополнительно описанные регуляторные участки могут быть близкими к конститутивным (постоянно включающимися) и потенциально могут быть использованы в большем числе тканей растений, чем известные регуляторные участки.
Изобретение относится к химерному регуляторному участку для экспрессии генов в растениях. Он может содержать расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно связанную с последовательностью промотора, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens или с расположенной против хода транскрипции активирующей и промоторной последовательностью, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens.
Химерные регуляторные участки, согласно изобретению, могут быть оперативно связаны с последовательностью чужеродного гена, которая может быть оперативно связана с работающей в растении терминаторной последовательностью и далее оперативно связана с работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилирования. Химерный регуляторный участок в соответствии с изобретением может быть высоко конститутивным во многих случаях.
Расположенная против хода транскрипции активирующая последовательность является последовательностью, естественное положение которой обычно, по меньшей мере, на сто пар оснований предшествует положению природного сайта инициации транскрипции и которая может оказывать влияние на экспрессию. UAS генов октопин- и маннопин-синтазы используют, в частности, с этой целью. Эти UAS могут быть затем оперативно связаны с последовательностью промотора или с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью и промотором, выделенными из иного гена опин-синтазы A. tumefaciens.
Термин "выделены", применяемый в отношении таких участков ДНК, как промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, описывает ситуации, когда "выделенный" участок ДНК получают из участка ДНК или он имеет основой природный участок ДНК или участок ДНК из иного источника. "Выделенный" участок ДНК может отличаться мутацией от природного участка ДНК или участка ДНК, полученного из иного источника.
Выражение "оперативно связанные" относится к первой(ым) последовательности(ям), помещенной(ым) достаточно близко ко второй(ым) последовательности(ям) для того, чтобы первая(ые) последовательность(и) оказывала(и) влияние в области второй(ых) последовательности(ей) или участка, находящегося под контролем этой второй последовательности. Например, UAS может быть оперативно связана с промотором, при этом она повышает транскрипционную силу промотора. В такой ситуации типично 5'-расположение UAS относительно промотора. UAS и промотор, в свою очередь, могут быть оперативно связаны с генами, при этом экспрессия гена будет находиться под контролем комбинации UAS/промотор, для которой также типично 5'-положение относительно гена. Обычно промотор содержит 30 - 50 пар оснований от стартового сайта транскрипции и до нескольких сотен пар оснований от стартового сайта трансляции. Активирующая последовательность обычно составляет несколько сот пар оснований промотора. Например, большинство активирующих последовательностей содержат 300 - 400 пар оснований усиливаемого промотора. В вариантах изобретения, где используется более одной активирующей последовательности, они обычно содержат 100 - 200 пар оснований одна другой.
В сконструированном согласно изобретению химерном регуляторном участке источники генов опин-синтазы различны и предпочтительно выбраны из группы генов опин-синтазы, содержащей гены маннопин-, октопин-, нопалин- и агропин-синтазы.
Экспрессия активности GUS, направляемая промоторами mas и ocs с активирующими последовательностями, ограничена определенными типами клеток. Оперативное связывание активирующей последовательности ocs с промотором mas и с активирующей последовательностью, а также оперативное связывание активирующей последовательности mas с промотором ocs и с активирующей последовательностью показывает модуляцию экспрессии в сравнении с нативными конструкциями. Так, экспрессия GUS, а также иных генов может быть получена в большом числе типов клеток, включая сосуды ксилемы и эпидермальные клетки листьев. С другой стороны, ограниченные образцы экспрессии также могут быть получены в другом варианте изобретения. Химерный регуляторный участок, оперативно связывающий UAS ocs и минимальный промотор mas, дает сниженную экспрессию в сосудистой ткани листьев и экспрессию в стеблях, связанную с тканями флоэмы.
Изобретение также относится к рекомбинантному кластеру генов, кодирующему чужеродный полипептид. Рекомбинантный кластер генов может содержать находящуюся против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens и последовательность промотора или активирующую и промоторную последовательность, выделенные из иного, второго гена опин-синтазы A. tumefaciens. Все указанные последовательности оперативно связаны с последовательностью чужеродного гена. В конструкции последовательность чужеродного гена может быть оперативно связана с работающей в растении последовательностью терминатора и/или работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилирования. При этом последовательность терминатора и сигнал полиаденилирования могут оказывать влияние на ген или транскрипт гена. Последовательность терминатора и сигнал полиаденилирования имеют 3'-положение относительно гена.
Следующий аспект изобретения относится к комбинациям промотора и расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности (регуляторным участкам), которые индуцируются повреждениями или вредителями. Первая из разработанных комбинаций (AmasPmas) предпочтительно экспрессируется в тканях корней и индуцируется патогенами, тогда как другая (AocsAmasPmas) экспрессируется во всем растении, но индуцируется вредителями. Эти экспрессирующие системы применимы для генов, направленных на корневых вредителей, например на нематоды или грибы, и могут использоваться против вредных насекомых и патогенов листьев. Например, гены, кодирующие нематоцидные токсины и белки, которые нарушают репродуктивный цикл нематод, могут быть применены в рамках настоящего изобретения.
Заражение патогенами индуцирует химерные регуляторные участки, в которых использован промотор маннопин-синтазы с активирующими последовательностями mas или ocs, как описано выше. Ряд генов, используемых для получения устойчивости против патогенов, описан Keen, Plant Molec. Biol. 19: 109-22 (1992).
Транскрипционные элементы, например промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности генов опин-синтазы, могут быть получены на основе имеющейся информации о последовательностях. Например, транскрипционные элементы генов октопин-синтазы описаны Leisner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner et al., Plant Cell 1: 925-36 (1989). Транскрипционные элементы генов маннопин-синтазы описаны DiRita and Gelvin, supra, Fox et al., Plant Molec. Biol. 20: 219-33(1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230:463-74 (1991); Langridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 86: 3219-23 (1989). Транскрипционные элементы генов нопалин-синтазы Ha et al., Nucl. Acids Res. 17: 215-23 (1989); Mitra et al., Mol. Gen. Genet. 215: 294-99 (1989); Ebert et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 84: 57-49 (1987); An et al. , Mol. Gen. Genet. 203: 245-50 (1986). Элементы контроля транскрипции гена агропин-синтазы описаны Bandyopadhyay et al., J. Biol. Chem. 264: 19399-406 (1989). Дополнительно, полная последовательность Т-ДНК описана Barker et al., Plant Molec. Biol. 2: 335-50 (1983).
Различные уровни и образцы экспрессии были получены следующими приведенными способами. Количество и образец экспрессии оценивают с помощью маркерных систем, например, описанных здесь gusA. Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают его.
Пример 1
Добавление расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей mas или ocs к промотору mas или ocs и активирующей последовательности значительно увеличивает экспрессию GUS.
Добавление расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей mas или ocs к промотору mas или ocs и активирующей последовательности значительно увеличивает экспрессию GUS.
Как показано на фиг. 1, были созданы новые комбинации промоторов mas и ocs. Были проанализированы различные субдомены UAS mas, поскольку предварительный делеционный анализ показал, что последовательности из 138 пар оснований, находящиеся перед сайтом инициации транскрипции, являются достаточными для точной инициации транскрипции слитого гена mas2'/nptll в тканях корончатых галл подсолнечника. Последовательности от -138 до -318, однако, могут также участвовать в регуляции количественного уровня активности промотора mas2'. DiRita and Gelvin, Mot. Gen. Genet. 207; 233-41 (1987). Проанализированные UAS mas представлены: (i) UAS от -318 до -138; (ii) UAS' от -318 до -213; (iii) UAS'' от -318 до -111. См. фиг. 1.
Первая группа химерных регуляторных участков была сконструирована и связана в качестве транскрипционных слияний с геном uidA (gusA) с помощью двух делеций -318 и -138 пар оснований от сайта инициации транскрипции (конструкции 1-6 фиг. 1) промотора mas. Первый сет химерных регуляторных участков содержит (в любой ориентации) мономер или тример активирующей последовательности ocs (от-116 до -333) перед делецией -138 промотора mas (конструкции 3 и 4 фиг. 1). Второй сет химерных регуляторных участков содержит подобные мономеры или тримеры активирующих последовательностей ocs перед делецией -318 промотора mas (конструкции 5 и 6 фиг. 1). Этот участок ocs содержит палиндром из 16 пар оснований, а также 5'- и 3'-последовательности модулятора, которые важны для активирования промотора ocs в каллюсе и растениях табака при стабильной инкорпорации в геном растений. Leisner and Gelvin, 1988 and 1989 supra; Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992).
Вторая группа химерных регуляторных участков была сконструирована в виде трансляционных слияний с геном uidA на основе двух делеций ocs в положениях -333 и -116 от сайта инициации транскрипции (конструкция 8-16 фиг. 1). Было создано два участка расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности mas. Короткий участок mas, содержащий последовательность от -213 до -318, был использован в конструкциях 9-12 фиг. 1. Длинный участок mas, содержащий последовательность от -111 до -318, был использован в конструкциях 13-16 фиг. 1. Короткий или длинный участки mas были введены перед двумя делециями ocs.
Химерные конструкции были получены следующим образом. Основой всех конструкций был бинарный вектор pBl101.2 из Clontech. Плазмида pBl101.2 имеет основой репликон pRK290. Плазмида pBl101.2 содержит границы Т-ДНК, химерный ген nos-nptll для селекции на фоне канамицина у растений и не имеющий промотора ген GUS после сигнала полиаденилирования. Регион промотора mas был получен из фрагмента EcoRV-XbaI, который содержит участок от -138 до +65, соответствующий сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20343) из pKan2-138. Barker et al., Plant Mol. Biol. 2: 335-50 (1983): DiRita and Gelvin, supra. Активирующая последовательность и промоторный участок mas от -318 до +65, соответствующие сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20513) из pKan2-318, были изначально клонированы в сайты SmaI-XbaI CUp31 (производное pUC13, имеющее основу pUC13, но содержащее полилинкер, считываемый в направлении 5' - 3' как HindIII, PstI, SstI, SmaI, BamH1, XbaI). Полученные фрагменты рестрикции HindIII-XbaI из CUp31 были последовательно реклонированы в сайты HindIII-XbaI мультилинкера pBl101.2, с образованием плазмид pNi1 и pNi2 (конструкции 1 и 2 соответственно).
Фрагмент энхансера ocs из плазмиды pEN Δ 1 (Leisner and Gelvin (1988) supra) был получен с помощью линкеров HindIII. Этот фрагмент соответствует от -333 до -116 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 -13991, Barker et al., supra). Он был клонирован как тример в сайт HindIII pNi1 перед промотором mas в обеих ориентациях, что дало конструкции 3 и 4 (см. фиг. 1). Для создания конструкций 5 и 6 этот же фрагмент активирующей последовательности ocs был клонирован как тример или как мономер в сайт HindIII pNi2 перед активирующей последовательностью и промотором mas.
Фрагмент BamH1-EcoRI, содержащий участок промотора ocs с частью структурного гена ocs, который соответствует от -116 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 - 13362) и фрагмент XbaI-EcoRI, содержащий активирующую последовательность и промоторный участок ocs, соответствующий участку от -333 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13991 - 13362) из pEN1 (Leisner and Gelvin (1988), supra) были клонированы в сайты BamH1-EcoRI и XbaI-EcoRI соответственно, pBluescriptll SK+ (Стратаген). Фрагменты XbaI-EcoRV из полученных производных pBluescript были последовательно клонированы в сайты XbaI-SmaI pBl101.2 с созданием трансляционных слияний GUS в плазмидах pLH3 (конструкция 7) и pNi3 (конструкция 8). Фрагмент XhoI-HaeIII, содержащий короткую активирующую последовательность mas, соответствующую участку от -318 до -213 сайта инициации транскрипции (пары оснований 20513 - 20407) из pKan2-318, был клонирован в сайты XhoI-HincII pUX13 (производное pUC13 содержащее основу pUC13, но с сайтом SmaI, превращенным в сайт XhoI). Полученный XhoI-HindIII фрагмент был сделан непосредственно из фрагмента Klenow при введении линкеров XnaI. Фрагмент клонирован в обеих ориентациях в сайты XbaI pLH3 (конструкции 9 и 19) и pNi3 (конструкции 11 и 12). Аналогично длинный фрагмент активирующей последовательности masXhoI-MnII, соответствующей сайту инициации транскрипции (пары оснований 20513-20305) из pKan2-318, был сделан при непосредственном использовании фрагмента Klenow. Были введены линкеры XbaI и фрагмент был клонирован в обеих ориентациях в сайты XbaI pLH3 (конструкции 13 и 14) и pNi3 (конструкции 15 и 16).
Каждой из описанных конструкций последовательно трансформировали E. coli DH5a, выращенную при 37oC в среде LB с канамицином. Ориентации инсерций были определены рестрикционным картированием. Плазмида pBl121 (Clontech), содержащая фрагмент HindIII-BamHI из 800 пар оснований с промотором CaMV 35S была использована в качестве контроля для сравнения относительных длин химерных регуляторных участков.
Рекомбинантные плазмиды, содержащие инсерций, были введены в A. tumefaciens LBA4404 способом скрещивания с участием трех родителей с использованием E. coli MM294, несущей мобилизующую плазмиду pRK2013. Hoekema et al., Nature 303: 179-80 (1983); Ditta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 77: 7347-51 (1980). В LBA4404 рекомбинантные плазмиды сохраняются как независимые репликоны (бинарные векторы), которые могут быть перенесены в растения с последующей интеграцией в ядерную ДНК растения. Иные способы, например электропорация, также могут быть использованы для трансформации клеток A. tumefaciens плазмидами.
Трансконьюганты A. tumefaciens были отселектированы на чашках с минимальной средой AB, содержащей 0,5% глюкозы, 10 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл канамицина. Lichtenstein and Draper, DNA Cloning: a practical approach (Glover ed. , Oxford-IRL Press 1986). Интродукция мобилизованной плазмиды в реципиентный штамм A. tumefaciens была определена блоттингом ДНК.
Диски, вырезанные из листьев шестинедельных стерильных культур Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38, были трансформированы с помощью A. tumefaciens несущей конструкции, с использованием способа трансформации листовых дисков. Horsh et al., Science 227: 1229-31 (1985). Инфицированные листовые диски в течение трех дней выращивали на среде MS3+ без антибиотиков, затем диски перенесли на свежую среду, индуцирующую образование проростков, которая содержала 1250 мг/л карбенициллина и 200 мг/л канамицина. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992). Через 4 - 5 недель по одному побегу с каждого листового диска перенесли в среду, индуцирующую образование корней, которая содержала 500 мг/л карбенициллина и 50 мг/л канамицина. Через две недели растения перенесли в среду BGS (среда MS, содержащая 1 мг/л фолиевой кислоты, 10 мг/л индол-уксусной кислоты и 30 мг/л кинетина), содержащую 50 мг/л канамицина, с целью поддержания культур каждой линии in vitro.
Регенерированные трансгенные растения табака, содержащие каждую из описанных конструкций, были проверены на активность GUS. Маленькие кусочки ткани растения были выделены из четвертого или пятого полностью развернувшегося листа, около стеблей и из активно растущих молодых корней, когда растения сформировали по 10 - 12 листьев. Ткани были растерты в 200 мкл экстракционного буфера и сохранялись при -70oC. Jefferson and Wilson, Plant Molecular Biology (Gelvin & Schilperoot eds., Kluwer Acad. Press 1991). Активность GUS определяли по Jefferson and Wilson, используя 10 мкл экстракта (20 - 30 мкг белка) и MUG (4-метилумбеллиферил -β- D-глюкуронид) в качестве субстрата. Концентрацию белка определяли по Patterson, Analyt Biochem. 83: 346-56 (1977).
Отдельные трансгенные растения, содержащие одну и ту же конструкцию, имели различия в активности GUS (см. фиг. 2 - 5). Однако, при определении активности GUS у большого числа растений, несущих одну и ту же конструкцию, можно установить относительную силу каждого химерного регуляторного участка. Поскольку не были установлены различия в уровне активности GUS при использовании конструкций, в которых элементы активирующих последовательностей были клонированы в противоположных ориентациях, данные по каждой двучленной подгруппе конструкций были суммированы (3 и 4, 5 и 6, 9 и 10, 11 и 12, 13 и 14, 15 и 16).
Во всех исследованных тканях экспрессия, направляемая делецией -138 mas, имела минимальный уровень активности GUS (фиг. 2 конструкция 1). Добавление природной активирующей последовательности mas к минимальному промотору mas приводило к образованию конструкции 2, которая обусловливала низкий уровень активности GUS в тканях листьев и стеблей. Он составлял около тысячи единиц (фиг. 2, граф. А и Б). Для этой конструкции была отмечена относительно высокая активность GUS в тканях корней. Она составляла около 12 тысяч единиц (фиг. 2, граф. В). Эти результаты показывают, что данные промотор и активирующий участок mas обеспечивают предпочтительную экспрессию в корнях промотора mas2', описанного выше. Замена активирующей последовательности mas гетерологичной активирующей последовательностью ocs (в виде тримера) перед делецией -138 mas (конструкции 3 и 4) практически не изменяет уровень активности GUS относительно комбинаций гомологичной активирующей последовательности mas и промотора mas в тканях листьев и стеблей (фиг. 2, граф. А и Б). Вместе с результатами, которые показывают, что экспрессия активирующей последовательности ocs и промотора незначительно выше в корнях, чем в листьях (см. ниже конструкция 8), данные результаты позволяют предположить, что предпочтительная экспрессия в корнях промотора mas обусловлена элементом из 138 пар оснований сайта инициации транскрипции mas. Количественный уровень тканеспецифичной экспрессии может быть еще более повышен активирующими последовательностями ocs или mas.
Идентифицирован гомолог тандемного повтора AS-1 (Lam et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 86: 7890-94 (1989) в участке промотора mas в положении -66. Этот элемент, находясь в промоторе CaMV 35S, взаимодействует с транс-действующим фактором ASF-1 (Lam et al., loc. cit.) и направляет тканеспецифичную экспрессию с высокой активностью в корнях (Benfey et al., supra).
Активность GUS, направляемую химерными конструкциями, сравнили с активностью, полученной при использовании промотора CaMV 35S (-800 pBl121). Большинство трансформантов 35S GUS имели активность, близкую или ниже таковой у растений, содержащих конструкции активирующей последовательности mas и промотора (фиг. 2). Lam et al., supra показана предпочтительная для корней экспрессия промотора 35S.
Результаты показывают, что промоторы ocs и mas содержат цис-элементы, которые направляют транскрипцию тканеспецифичным образом. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991). В свете этих результатов был проведен анализ комбинаций гетерологичных активирующих последовательностей с целью установления, может ли комбинация менять образец экспрессии, направляемый одним промотором ocs или mas, и повышать или снижать активность промотора в определенных тканях растения. Для проверки этой гипотезы конструкции 5 и 6 (см. фиг. 1), которые содержат тример или мономер активирующей последовательности ocs, расположенный перед активирующей последовательностью mas и промотором, были интродуцированы в табак. Активность GUS при этом была измерена в различных тканях (фиг. 3). Новые химерные участки, содержащие мономер активирующей последовательности ocs, повышали экспрессию активности GUS в 6,6 раза в листьях, в 3,0 раза в стеблях и в 3,4 в корнях в сравнении с промотором и активирующей последовательностью mas2' (см. фиг. 2 и 3). Конструкции, содержащие тример активирующей последовательности ocs, сильно повышали экспрессию активности GUS в листьях (в 22 раза), в стеблях (1,7 раза) и корнях (в 9 раз) в сравнении с промотором и активирующей последовательностью mas2' (конструкция 2 на фиг. 1 и 2), не содержащими дополнительной активирующую последовательность ocs. Эти результаты показывают, что по меньшей мере в тканях листьев и корней введение множественных копий активирующей последовательности ocs дает неожиданно мощный усиливающий эффект на соответствующую активность промотора и активирующей последовательности mas2'.
Анализы показывают, что активность промотора CaMV 35S в листьях трансгенных растений (в среднем 200 пмол/мин/мг белка) была сравнима с данными Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990). Дупликация энхансера 35S привела к двукратному повышению активности GUS в листьях. Сравнивая результаты, приведенные Comai et al., loc. cit., с данными, полученными для предложенных конструкций, можно сказать, что химерные участки конструкций 5 и 6 обеспечивали соответственно 156- и 26-кратное усиление экспрессии GUS в листьях по сравнению с промотором 35S и усиленным двойным промотором 35S соответственно.
Были также проверены семена генерации T2 растений табака, содержащие конструкции двойной 35S-GUS или Mac-GUS. Определения активности GUS в листьях этих трансгенных растений подтвердили
относительные силы промоторов, как указано выше. В таблице 1 представлена средняя активность GUS в листьях трансгенных растений табака, несущих различные варианты слияний промотор-uidA.
относительные силы промоторов, как указано выше. В таблице 1 представлена средняя активность GUS в листьях трансгенных растений табака, несущих различные варианты слияний промотор-uidA.
В таблице 2 приведена средняя активность GUS в листьях в поколении F1 трансгенных растений табака, несущих различные варианты слияний промотор-uidA.
Серия химерных конструкций на основе минимального промотора ocs (от -116 до +296) была проанализирована с целью оценки силы и образцов тканеспецифичной экспрессии, как показано на фиг. 4, активирующая последовательность ocs и промотор определяют низкий и относительно универсальный уровень активности GUS (200 - 400 пмол/мин/мг белка) в тканях листьев, стебля и корней трансгенных растений табака. Замещение активирующей последовательности ocs коротким вариантом активирующей последовательности mas (от -213 до -318, конструкции 9 и 10) приводило к образованию химерной конструкции, определяющей низкий уровень активности GUS во всех исследованных тканях.
Длинный вариант активирующей последовательности mas (от -111 до -318), расположенный перед минимальным промотором ocs (конструкции 13 и 14), был также проанализирован. Эти конструкции обусловливали несколько повышенный уровень активности GUS, но только в тканях корней. В дополнение к гомологу AS-1 в положении -66 последовательность, близкая к элементу AS-1, была обнаружена в положении -290. Хотя эта последовательность присутствует в коротком варианте активирующей последовательности mas, иные последовательности между положениями -213 и -103 необходимы для предпочтительной экспрессии в корнях.
Короткий вариант активирующей последовательности mas (от -318 до -213, конструкции 11 и 12) был помещен перед активирующей последовательностью ocs и промотором. В сравнении с конструкцией, содержащей только активирующую последовательность ocs и промотор (конструкция 8), эти конструкции обеспечивали 6-, 2,5- и 15-кратное повышение активности GUS в тканях листьев, стебля и корней соответственно (см. фиг. 5). Экспрессия этих конструкций была несколько более предпочтительной в корнях, что предполагает возможность взаимодействия элемента, подобного AS-1, с активирующей последовательностью ocs. Конструкции, содержащие длинный вариант UAS mas (связанные с активирующей последовательностью ocs и промотором (конструкции 15 и 16)), обусловливали незначительно более низкий уровень активности GUS по сравнению с конструкциями 11 и 12, содержащими короткую активирующую последовательность mas (см. фиг. 5). Связывание активирующих последовательностей ocs и mas по 5'-концу с промотором mas приводило к значительному увеличению силы промотора по сравнению с конструкцией, состоящей из активирующей последовательности ocs и промотора.
Пример 2
Корреляция между числом копий Т-ДНК и активностью GUS в трансгенных растениях табака.
Корреляция между числом копий Т-ДНК и активностью GUS в трансгенных растениях табака.
Для установления связи между числом копий Т-ДНК и активностью GUS была проанализирована геномная ДНК из 16 трансгенных растений, содержащих конструкцию 5 или 11. Геномную ДНК экстрагировали из тканей растений и расщепляли полностью с помощью HindIII. Rogers and Bendich, PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin and Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992). 10 мкг ДНК обрабатывали HindIII, фрагменты разделяли электрофоретически в 1,0% агарозном геле и элюировали ДНК на нейлоновую мембрану способом капиллярного переноса. Maniatis et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor 1982). Нуклеиновые кислоты фиксировали на мембране нагреванием при 80oC под вакуумом в течение 2 часов. Предварительную гибридизацию проводили в течение 2 - 4 часов при 65oC в 1,5xSSC (раствор хлорида и цитрата натрия) (1xSSC - 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия), 1,0% SDS (додецилсульфат натрия), 0,5% Blotto и 0,5 мг/мл ДНК измельченной молоки лосося.
Гибридизацию проводили при 65oC в течение ночи в свежем растворе с зондом, содержащим участок кодирующей последовательности GUS (рестрикционный фрагмент XbaI-SstI из pBl101.2) и меченным 32P-dCTP. После окончания гибридизации мембрану промывали в течение 15 минут при комнатной температуре следующими растворами: 2х SSC/0,1% SDS, 0,5х SSC/0,1% SDS, 0,1х SSC/0,1% SDS. Окончательное промывание проводили в течение 30 минут при 50oC 0,1х SSC/1,0% SDS.
С помощью этой комбинации рестриктаз и гибридизационного зонда число копий Т-ДНК устанавливали по числу и интенсивности гибридизационных бэндов. Число интегрированных копий варьировало от одного до нескольких в отдельных трансформантах. Активность GUS не коррелировала с числом интегрированных генов uidA. Например, растение, содержащее единственный интегрированный ген uidA, в ряде случаев обладало значительно более высокой активностью GUS в листьях, чем растение, содержащее множественные интегрированные копии гена uidA.
Пример 3
Корреляция между активностью GUS и мРНК uidA в трансгенных растениях табака.
Корреляция между активностью GUS и мРНК uidA в трансгенных растениях табака.
Поскольку активность GUS была использована как мера силы экспрессии, было необходимо удостовериться, что эта активность отражает существующий уровень мРНК uidA. Эта корреляция является важной, потому, что существуют данные, что активность GUS не коррелируют с количеством мРНК uidA при использовании промотора mas2' и репортерного гена uidA. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992).
В соответствии с этим был изучен уровень мРНК uidA, выделенной из листьев отдельных трансгенных растений, содержащих 4 различных конструкции (конструкции 2, 5, 8, 11). Сначала выделили общую РНК по de Vries et al., PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin and Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992). Образцы по 5 мг были фракционированы электрофорезом в формальдегидном геле через 1,2% агарозный гель в буфере МПСК/ЭДТА (50 мМ МПСК, 1 мМ ЭДТА, pH 7,0) с последующим блоттингом на нейлоновой мембране. Цельность РНК была проверена электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием этидий-бромидом. Флюоресценция нуклеиновых кислот также служила для подтверждения того, что каждая дорожка содержала равные количества РНК. Условия гибридизации были описаны выше для анализа геномной ДНК. После окончания гибридизации мембрану промывали в течение 15 минут при комнатной температуре следующими растворами: 2х SSC/0,1% SDS, 0,5х SSC/0,1% SDS, 0,1х SSC/0,1% SDS. Окончательное промывание проводили в течение 30 минут при 60oC 0,1х SSC/1,0% SDS.
При блоттинг-анализе РНК с помощью гибридизационного зонда, выделенного из кодирующей последовательности GUS, был получен транскрипт ожидаемого размера (приблизительно 2300 нуклеотидов). Была отмечена тесная корреляция между активностью GUS и уровнем мРНК uidA, что противоречит данным Hensgens et al.
Пример 4
Модуляция специфичной для клеток экспрессии GUS различными комбинациями промоторов и активирующих последовательностей ocs и mas.
Модуляция специфичной для клеток экспрессии GUS различными комбинациями промоторов и активирующих последовательностей ocs и mas.
Гистологические исследования тканей трансгенного табака были проведены для установления специфичной для клеток активности GUS. Такие образцы экспрессии были получены при гистохимическом окрашивании тонких срезов тканей растения X-gluc.
Эти гистохимические исследования проводились по Jefferson and Wilson, supra. Растительные материалы предварительно фиксировали в течение 20-40 минут 0,1-0,3% формальдегидом, 0,1 М Тритоном Х-100, 0,1 М фосфатным буфером (pH 7,0), промывали 0,1 М фосфатным буфером и окрашивали 1 - 2 мМ X-gluc (в 0,1 М Тритоне Х-100, 0,01 М ЭДТА, 0,1 М фосфатном буфере) в течение 2 - 14 часов. После повторной фиксации в течение двух часов с использованием 3-5% формальдегида в 0,1 М фосфатном буфере образцы обрабатывали 70% этанолом, помещали в парафин и делали срезы (12 - 18 мм) на роторном микротоме. Срезы тканей контрастно окрашивали 1,0% периодной кислотой - 0,5% реактивом Шиффа ("PAS").
Ни в одной из исследованных типах клеток тканей листьев растений, несущих промотор mas, но не имеющих активирующую последовательность (конструкция 1), не было обнаружено активности GUS. Растения, содержащие химерный ген uidA под контролем природной активирующей последовательности mas и промотора (конструкция 2), имели средний уровень активности GUS в клетках мезофилла листьев (включая столбчатую и губчатую паренхиму) и замыкающих клетках, но не имели активности GUS в клетках эпидермиса. В тканях сосудов было отмечено умеренное окрашивание трахеид ксилемы при относительно более слабом окрашивании флоэмы и клеток лучевой паренхимы. Близкие значения активности GUS были отмечены в листовых пластинках, несущих тример активирующей последовательности ocs и промотора mas (конструкция 3 и 4). Однако в сосудистых тканях листьев активность GUS была сильно снижена во всех типах клеток. Связывание тримера активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6) обусловило сильную активность GUS не только в мезофилле и замыкающих клетках листьев, но и в эпидермальных клетках. Это означает, что дистальная и проксимальная гетерологичные активирующие последовательности взаимодействуют, модулируя экспрессию. В сосудистых тканях листьев экспрессия не зависела от наличия тримерных активирующих последовательностей, связанных с активирующей последовательностью mas с промотором.
Активность GUS не была отмечена в тканях листьев, содержащих минимальный промотор ocs (конструкция 7). Экспрессия активности GUS, определяемой активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкция 8), была близка к таковой, обусловленной активирующей последовательностью mas с промотором в поперечных срезах листовой пластинки. Этот образец активности GUS был отмечен в листовых пластинках растений, в которых ген uidA находился под контролем химерного промотора, состоящего из короткой активирующей последовательности mas и активирующей последовательности ocs с промотором (конструкции 11 и 12). В сосудистой ткани черешков листьев активирующая последовательность ocs с промотором также направляла экспрессию GUS, но только в трахеидах. В отличие от активирующей последовательности mas с промотором, активирующая последовательность ocs с промотором определяла умеренный уровень экспрессии активности GUS в клетках флоэмы и очень слабую экспрессию в трахеидах паренхимы и ксилемы в основных сосудистых тканях листьев. Близкий образец активности GUS был получен в сосудистой ткани листьев независимо от добавления короткой активирующей последовательности mas к активирующей последовательности ocs с промотором. Хотя активность была значительно более высокой в паренхиме, лучевых клетках и клетках флоэмы, активность GUS не определялась в растениях, содержащих активирующую последовательность mas, связанную с промотором ocs (конструкции 9 и 10).
Активирующая последовательность mas с промотором (конструкция 2) определяла слабую экспрессию активности GUS в ножках железистых трихом, но сильную экспрессию в головках. Оперативное связывание тримера активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6) приводило к близкому образцу экспрессии. Однако относительный уровень активности GUS был сильно повышен в клетках ножек. Экспрессия активности GUS в трихомах, направляемая конструкциями, содержащими короткую активирующую последовательность mas связанную с активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкции 11 и 12), была сильной в головках железистых трихом, но слабой в клетках ножек.
В стеблях трансгенных растений активирующая последовательность mas с промотором (конструкция 2) определяла слабую экспрессию активности GUS в корковых клетках. Сильная активность GUS была отмечена в лучевых клетках и клетках флоэмы, но экспрессия в трахеидных клетках ксилемы была относительно слабой. Этот образец экспрессии не изменялся даже при использовании тримера активирующей последовательности ocs перед активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6). Когда активирующая последовательность mas была заменена тримером активирующей последовательности ocs (конструкции 3 и 4), был отмечен иной образец экспрессии. Экспрессия активности GUS оставалась сильной в клетках флоэмы, но была слабой в лучевых клетках и клетках трахеид ксилемы. В отличие от активирующей последовательности mas с промотором активирующая последовательность ocs с промотором (конструкция 8) определяла относительно более слабую экспрессию в лучевых клетках и клетках флоэмы при сильной экспрессии в клетках трахеид. Когда короткий промотор mas был введен перед активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкция 11), образец экспрессии в основном сохранялся.
Активность GUS, определяемая активирующей последовательностью mas с промотором (конструкция 2) в тканях корней, была различной. Было получено регенерированное растение, в котором активность GUS определяли в клетках корневого чехлика, эпидермальных клетках, корневых волосках, корковых клетках корней, в клетках флоэмы и ксилемы зоны созревания корня. Однако, в зоне удлинения корня была зарегистрирована низкая активность GUS. Активность GUS часто, но не всегда определяли в каждом типе клеток зоны созревания корня в случае, когда тример активирующей последовательности ocs был добавлен к активирующей последовательности mas с промотором (конструкции 5 и 6). Замена активирующей последовательности mas тримером активирующей последовательности ocs (конструкции 3 и 4) обусловливала активность GUS только в корковых и эндодермальных клетках зоны удлинения периферических корней. Подобные образцы активности GUS были отмечены, когда промотор ocs и активирующая последовательность (конструкция 8) или короткая активирующая последовательность mas с активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкции 11 и 12) направляли экспрессию гена uidA.
Пример 5
Сравнение предлагаемых химерных регуляторных участков с иными регуляторными участками.
Сравнение предлагаемых химерных регуляторных участков с иными регуляторными участками.
Активность активирующей последовательности mas с промотором является наивысшей в тканях корней. Введение тримера активирующей последовательности ocs к активирующей последовательности mas с промотором повышало уровень активности GUS в 2-23 раза. Это повышение активности максимально в тканях листьев, но также отмечается в тканях стебля и корня. Активность активирующей последовательности ocs с промотором приблизительно одинакова в листьях, стеблях и корнях трансгенных растений табака. Введение короткого варианта активирующей последовательности mas к активирующей последовательности ocs с промотором повышало уровень экспрессии GUS в 2-20 раз. Это повышение активности было наиболее значительным в тканях листьев. Сочетание множественных копий активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором приводило к образованию транскрипционного регуляторного элемента, который в листьях был примерно в 156 раз сильнее, чем промотор 35S, в 26 раз сильнее, чем усиленный двойной промотор CaMV 35S и в 4,2 раза сильнее, чем промоторы "Mac" и "Big Mac", описанные Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990) (см. фиг. 2 и 3 и табл. 1). Данные относительно двойного промотора 35S и промотора mas для листьев (L), стеблей (S) и корней (R) представлены на фиг. 6. Следует отметить, что большая активность химерных промоторов, представленная конструкциями 5 и 6 относительно двойного промотора CaMV 35S и промоторов Mac и Big Mac, оценивается минимально. Дополнительно гистохимический анализ клеток трансгенных растений, несущих эти конструкции, показал, что эти дополнительные активирующие последовательности направляли экспрессию активности GUS почти во всех типах клеток. Например, сильная экспрессия активности GUS была отмечена в ксилеме и эпидермальных клетках листьев, а также в мезофилле, замыкающих клетках, трихомах и клетках флоэмы листьев. В стебле активность была отмечена в клетках флоэмы и паренхимы, а также в корковых клетках. В корнях активность GUS была обнаружена в корневом чехлике и корневых волосках, а также в большинстве клеток зрелых частей корня.
Возможное влияние условий роста растений на различные химерные конструкции промотор-uidA должно быть принято во внимание. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992) показали, что активность GUS у растений, выращенных in vitro (укорененных в стерильном агаре), была в три раза больше, чем у растений, выращенных в почве в теплице. Дополнительно было показано, что листья растений, выращенных в почве в условиях внешней среды, экспрессировали активность GUS на более низком уровне, чем растения, выращенные in vitro. Однако относительные уровни активности GUS, определяемые различными регуляторными участками, не зависели от условий выращивания растений (табл. 2, supra). Дополнительно, относительная сила различных химерных регуляторных участков в листьях поколения F1 самоопыленных трансгенных растений табака была близка к таковой трансформированных и регенерированных растений (табл. 2).
Была обнаружена тесная корреляция между уровнем мРНК и активностью GUS у растений. Этот результат подтверждает достоверность использования данных анализа активности GUS как меры силы экспрессии. Эти данные противоречат таковым Hensgens et al., supra. Эти противоречия могут объясняться неудачным выбором условий денатурации для блоттинг-анализа РНК указанным автором.
Comai et al., supra показали, что, когда растения выращиваются в почве, участок активирующей последовательности mas2' и промотора короче, чем в наших исследованиях (-301 в сравнении с -318) и направляет только 10% активности GUS относительно силы промотора CaMV 35S. Введение последовательностей перед -301 повышало относительную активность GUS до 40% от активности промотора 35S. Comai et al. считают, что участок, расположенный против хода транскрипции, но близко к -300, необходим для реализации полной активности промотора mas2'. Активность этого промотора (-318), используемая в приведенных экспериментах, была несколько выше, чем активность, определяемая промотором 35S.
Langridge et al., supra показали, что активность слитого гена mas2'-lux может повышаться в несколько раз с помощью гормонов. Хотя были проведены исследования на растениях, выращенных in vitro в присутствии гормонов, эти условия роста не оказывали сильного влияния на результаты, которые продемонстрировали близкие относительные уровни активности GUS, полученные для растений, выращенных в почве.
Langridge et al. также показали, что в стеблях трансгенного табака активность промотора mas2' максимально экспрессируется в сосудистых тканях. Saito et al., supra продемонстрировали сильное окрашивание в корневом чехлике при более слабом окрашивании клеток флоэмы корней табака. Наши данные хорошо коррелируют с указанными. Однако Saito et al. определили активность GUS в сосудах, но не в клетках мезофилла листьев. В наших экспериментах активность GUS была обнаружена в клетках мезофилла листьев трансгенных растений, несущих химерный ген mas2'-uidA. Многие представленные нами результаты также коррелируют с результатами Leung et al. касательно экспрессии промотора mas2' в различных тканях трансгенных растений табака. Однако Leung et al. не отметили активность GUS в сосудистых клетках стеблей при использовании их конструкций.
Комбинирование гетерологичных активирующих последовательностей ocs или mas с активирующими последовательностями mas или ocs с промотором сильно повышало уровень активности GUS во всех исследованных тканях табака. Эти данные показывают, что повышенная экспрессия химерных регуляторных участков обусловлена совместным синергическим взаимодействием, а не аддитивными эффектами между положительными регуляторными элементами, которые находятся в химерных регуляторных участках.
Пример 6
Использование химерных регуляторных участков в индуцибельной экспрессии.
Использование химерных регуляторных участков в индуцибельной экспрессии.
Другой аспект изобретения относится к комбинациям промотора с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью, индуцируемым повреждениями или вредителями. Одна из полученных комбинаций (AmasPmas) предпочтительно экспрессируется в тканях корней и индуцируется патогеном, тогда как другая (AocsAmasPmas) экспрессируется более генерализованно, но индуцируется вредителями. Эти экспрессирующие системы применяют для генов с направленностью на вредителей корней, например нематод и грибы, они могут быть использованы против вредных насекомых и иных патогенов листьев.
Химерные регуляторные участки были сконструированы с использованием ядра участка промотора маннопин-синтазы с делецией до -138. Этот промотор был слит с кодирующей последовательностью GUS и терминирован сигналами полиаденилирования нопалин-синтазы (NOS). См. фиг. 7, конструкция 1.
UAS от -318 до -138 промотора маннопин-синтазы использовали в сочетании с ядром промотора маннопин-синтазы для создания конструкции 2 фиг. 7. Конструкции 5 и 6 фиг. 7 содержат тример UAS из гена октопин-синтазы от -333 до -116 в обеих ориентациях. Эти конструкции были введены в табак с помощью A. tumefaciens. Активность GUS определяли в листьях, стеблях и корнях большого числа отдельных трансгенных растений. Активность промотора mas и активирующей последовательности (фиг. 7 конструкция 2) сильнее в корнях и значительно слабее в листьях и стеблях. Введение активирующей последовательности ocs к активирующей последовательности mas и промотору (фиг. 7 конструкции и 6) повышали активность GUS в 10 раз в корнях и в 50 - 100 раз в стеблях и листьях по сравнению с конструкцией 2. Ориентация активирующей последовательности ocs эффекта не оказывала.
Индуцибельность повреждениями промотора mas с активирующей последовательностью возрастает до 30 раз в листьях, 17 раз в стеблях и до 3 раз в корнях трансгенных растений табака.
Для проверки индуцибельности различных химерных регуляторных участков патогенами отдельные трансгенные растения, содержащие конструкции 1, 2, 5 и 6, инфицировали нематодами, а затем проводили мониторинг индукции активности GUS. Чтобы удостовериться в отсутствии эндогенной экспрессии активности GUS в нематодах, были проанализированы очищенные препараты развитых яиц нематод. Были использованы нематоды Meloidogyne incognita расы 3, выделенные из корней томатов. Зрелые яйца получали, помещая зараженные корни в 10% раствор хлорокса на 4 мин при постоянном перемешивании. Затем раствор отмывали через ячеистое сито 200 для удаления корневого дебриса, а яйца собирали на ячеистом сите 500. Яйца промывали и подсчитывали с использованием Устройства для подсчета нематод Nematode Counting Slide (Olympic Equine Products). В качестве контроля для определения эндогенной активности GUS у нематод яйца анализировали при pH 5,5 и 7,5. Активность GUS при pH 5,5 обусловлена эндогенной экспрессией животных форм гена, которая дает фоновую активность. Активность GUS при pH 7,5 обусловлена бактериальной экспрессией гена. Активность GUS в зрелых яйцах нематод была минимальной при указанных значениях pH (фиг. 8). Таким образом, Meloidogyne incognita не несла бактериальной и животной активности GUS, которые могли бы создать проблемы фоновой активности в анализах с использованием яиц нематод.
Трансгенные растения были инфицированы 10000 очищенных яиц нематод и выращены на песчаной почве в тепличных условиях в течение нескольких месяцев. Были собраны корни зрелых растений, в которых визуально определили места нематодной инфекции по образованию корневых узелков, содержащих нематод и кладки яиц, тогда как неинфицированные места имели нормальный вид. Эти корневые узелки использовали для измерения активности GUS в инфицированных участках, а нормальные участки корней использовали в качестве контроля. Инфицированные и неинфицированные корни сравнивали у одного и того же растения, поэтому результаты не зависели от положения растения и вариаций экспрессии гена в различных растениях. Индукция активности GUS была определена в конструкции 1 с использованием растения номер 7 (1-7) при pH 5,5 и 7,5 (фиг. 9, панель А).
Уровни экспрессии были низкими в сравнении с трансгенными растениями, несущими конструкции 2, 5, 6. Это указывает на то, что один промотор Pmas экспрессирует только базовый уровень активности и не индуцируется инфекцией нематод.
Когда промотор Pmas содержит активирующую последовательность mas, Amas (конструкция 2), экспрессия активности GUS высокая и индуцируется нематодной инфекцией (фиг. 9, панель Б). Введение UAS промотора ocs (Aocs) дает подобную индукцию при нематодной инфекции (фиг. 9, панель В). Одно растение (5-5) не проявляло индуцибельную экспрессию. Это объясняется возрастом ткани корня или инсерцией гена в место на хромосоме, которое вызывало изменения в экспрессии, поскольку другой трансформант (5-2) давал реакцию индукции.
Эти результаты демонстрируют, что патоген индуцирует химерные регуляторные участки с помощью промотора маннопин-синтазы с активирующими последовательностями mas или ocs. Эти участки могут быть использованы для экспрессии генов нематоцидных токсинов или гормональных соединений, которые нарушают питание и размножение нематод. Например, ряд токсинов из Bacillus thuringiensis (токсины Bt) эффективны в отношении нематод. См. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131-45 (1993). Аминокислотные последовательности этих токсинов и нуклеотидные последовательности кодирующих их генов представлены в Патентах США N 5281530 и 5322932, публикации PCT WO 92/04453 и Европейской патентной публикации 0517367 A1.
Применение этих индуцибельных регуляторных участков не ограничивается применением против нематод. Эти участки могут быть равно эффективными против иных патогенов, вызывающих повреждения.
Пример 7
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию инсектицидных токсинов.
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию инсектицидных токсинов.
Представленные в настоящем изобретении химерные регуляторные участки могут быть использованы для контроля экспрессии инсектицидных токсинов в трансгенных растениях. В качестве предпочтительного применения токсины Bt могут быть помещены под контроль представленных регуляторных участков.
С целью повышения уровней экспрессии в трансгенных растениях были разработаны модифицированные гены, кодирующие токсины Bt. Perlak et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 3324-28 (1991) предложил модификации гена CryIA для замены последовательностей, которые не работают в растениях. Эти модификации повышают уровень активного токсина CryIA. Аналогично Adang et al., supra предложили модификации гена cryIIIA для улучшения экспрессии. Другие гены семейства токсина Bt также могут быть подвергнуты модификациям и использованы с настоящим изобретением. Возможно также применение генов, связанных с гиперчувствительной реакцией. См. Keen, supra. Настоящее изобретение не ограничено никаким специфичным типом токсина или соединения. Инсектицидные токсины или соединения любого типа, кодируемые генами или образуемые ферментами или иными веществами, кодируемыми генами, могут быть использованы с настоящим изобретением.
Пример 8
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к гербицидам.
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к гербицидам.
Предложенные в настоящем изобретении химерные регуляторные участки могут быть использованы для экспрессии в трансгенных растениях генов, несущих устойчивость к гербицинам. Эта устойчивость определяется тремя первичными подходами: (i) связанная с растениями детоксикация гербицидов, (ii) повышенная экспрессия мишеней гербицидов и (iii) мутация сайтов связывания гербицидов. См. Schulz et al., Crit. Rev. Plant Sci. 9: 1-15 (1990). Любой из описанных подходов может быть использован с настоящим изобретением, хотя первые два подхода более соответствуют ему.
Известно несколько ферментов-детоксификаторов многих обычно применяемых гербицидов. Например, глутатион-S-трансферазы обусловливают устойчивость к s-триазиновым и хлорацетамидным гербицидам. См. например Schulz et al., supra; Shah et al., Plant Molec. Biol. 6:203-11 (1986); Weigand et al., Plant Molec. Biol. 7: 235-43 (1986). Фосфинотрицин был инактивирован с помощью гена из Streptomyces hygroscopicus. De Block et al., EMBO J. 6: 2513-18 (1987); Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Было показано, что гены нитрилазы детоксифицируют бромоксинил. Stalker et al., Science 242: 419-23 (1988). Остальные детоксифицирующие ферменты также могут быть использованы с настоящим изобретением.
Другой подход к первичной устойчивости основан на повышенной экспрессии мишеней гербицида. Например, глиофосфат является конкурентным ингибитором 5-енол-пирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSP-синтазы). Устойчивость к глиофосфату преодолевается повышенной экспрессией EPSP-синтазы, которую получают при использовании сильных конститутивных промоторов настоящего изобретения для контроля экспрессии последовательностей EPSP-синтазы. Дополнительно множественные копии последовательностей EPSP-синтазы с промоторами, предложенными в настоящем изобретении, могут быть помещены в трансгенные растения для получения еще более высоких уровней экспрессии. Известны последовательности, кодирующие EPSP-синтазу из различных источников. См. Duncan et al. , FEBS Lett. 170: 59 (1984); Stalker et al., J. Biol. Chem. 260: 4724-28 (1985); Shah et al., Science 233: 478-81 (1986).
И, наконец, изменение сайта связывания гербицида также может быть использовано для получения устойчивости к гербицидам. Stalker et al. и Shah et al. показали, что изменение аминокислот в EPSP-синтазе может определять устойчивость к глиофосфату. Аналогично, изменение в синтазе ацетогидроксикислот может обусловливать устойчивость к сульфанилмочевинам и имидазолинонам. См. Schulz et al., supra и Wek et al., Nucl. Acid. Res. 13: 3995-4010 (1985).
Пример 9
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к вирусам.
Химерные регуляторные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к вирусам.
Устойчивость к вирусам в растениях может быть обусловлена экспрессией вирусных генов или антисмысловых последовательностей вирусных генов. Первичными подходами для получения устойчивости к вирусам являются: (i) устойчивость, связанная с белками, обычно белками оболочки и (ii) устойчивость, связанная с антисмысловой РНК. Beachy et al., Annu. Rev. Phytopathol. 28: 451-74 (1990) предложили обзор обоих указанных подходов. Трансгенные растения, экспрессирующие белок оболочки вируса, имеют большую устойчивость к вирусам, чем растения, содержащие антисмысловую РНК. Beachy et al., supra; Cuozzo et al., Bio/technology 6: 549-57 (1988).
Регуляторные участки, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы для экспрессии любого гена, определяющего устойчивость трансгенных растений к вирусам. Например, известны аминокислотные последовательности многих белков оболочки вирусов растений, что позволяет определить их нуклеотидные последовательности. Дополнительно известны нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки оболочки вирусов, что позволяет осуществить синтез точных последовательностей антисмысловых РНК. Возможна экспрессия этих последовательностей в трансгенных растениях с целью получения устойчивости.
Cuozzo et al., supra предложили последовательности белка оболочки вируса мозаики огурца. Были сконструированы трансгенные растения, содержащие иные вирусные последовательности, например Anderson et al. , Phytopath. 79: 1284-90 предложили трансгенные растения, которые экспрессируют белки оболочки вируса табачной мозаики и вируса мозаики люцерны. Hemenway et al., EMBO J. 7: 1273-80 (1988) предложили трансгенные растения, которые экспрессируют белок оболочки и антисмысловую РНК вируса X картофеля. Huisman et al., J. Gen. Biol. 69: 1789-98 (1988) описали последовательность этого вируса. Gerlach et al. , Nature 328: 802-05 (1987) представили трансгенные растения, которые экспрессируют сателлитную РНК вируса кольцевой пятнистости табака. Эта сателлитная РНК ослабляет симптомы кольцевой пятнистости. Eggenberger et al. , J. Gen. Virol. 70: 1853-60 представили последовательность из вируса мозаики сои. Однако применение настоящего изобретения не ограничено определенными типами вирусов. Последовательность из любого типа вируса может быть использована с настоящим изобретением.
Следует отметить, что описание, примеры, фиг. 1 - 9 и данные, представляющие предпочтительное использование, даны как иллюстрация и в качестве примеров, а не для ограничения настоящего изобретения. Различные изменения и модификации в рамках изобретения станут очевидными исследователю из приведенных дискуссии и открытия.
Claims (32)
1. Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях, отличающийся тем, что содержит расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно связанную с промотором, выделенным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
2. Кластер для экспрессии гена, отличающийся тем, что содержит ген, оперативно связанный с химерным регуляторным участком, содержащим расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно связанную с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
3. Кластер по п.2, отличающийся тем, что содержит сигнал полиаденилирования нопалин-синтазы.
4. Химерный регуляторный участок для экспрессии генов у растений, отличающийся тем, что содержит, по меньшей мере, две расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из иного, чем промотор, гена опин-синтазы.
5. Химерный регуляторный участок по п.4, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
6. Химерный регуляторный участок по п.4, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из тех же генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
7. Химерный регуляторный участок по п.4, отличающийся тем, что одна из расположенных против хода транскрипции последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
8. Кластер для экспрессии гена, отличающийся тем, что содержит ген, оперативно связанный с химерным регуляторным участком, содержащим не менее двух расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно связанных с промотором, полученным из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из гена опин-синтазы, иного, чем промотор.
9. Кластер по п. 8, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности получены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
10. Кластер по п.8, отличающийся тем, что одна из расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
11. Кластер по п. 8, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности получены из одних и тех же генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
12. Кластер по п.8, отличающийся тем, что содержит сигнал полиаденилирования нопалин-синтазы.
13. Кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена, отличающийся тем, что содержит чужеродный ген, оперативно связанный с регуляторным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens путем делеции нуклеотида в положении -138, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
14. Кластер по п.13, отличающийся тем, что содержит сигнал полиаденилирования нопалин-синтазы.
15. Кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена, отличающийся тем, что содержит чужеродный ген, оперативно связанный с регуляторным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
16. Способ экспрессии гена в растении, отличающийся тем, что включает связывание гена с химерным регуляторным участком, содержащим расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно связанную с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию гена и химерного регуляторного участка в растение, последующую экспрессию гена в растении.
17. Способ экспрессии гена в растении, отличающийся тем, что включает связывание гена с химерным регуляторным участком, содержащим не менее двух расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно связанного с промотором, полученным из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из гена опин-синтазы, иного, чем промотор, инсерцию гена и химерного регуляторного участка в растение, последующую экспрессию гена в растении.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что расположенные против хода транскрипции последовательности получены из одних и тех же генов Agrobacterium tumefaciens.
20. Способ по п.17, отличающийся тем, что одна из расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
21. Способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении, отличающийся тем, что включает связывание чужеродного гена с регуляторным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens путем делеции нуклеотида в положении -138, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию чужеродных гена и регуляторного участка в растение, индукцию экспрессии чужеродного гена.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что индукция вызывается воздействием насекомых или нематод на растение.
23. Способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении, отличающийся тем, что включает связывание чужеродного гена с регуляторным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию чужеродного гена и регуляторного участка в растение, индукцию экспрессии чужеродного гена.
24. Плазмида, отличающаяся тем, что содержит химерный регуляторный участок по п.1.
25. Плазмида, отличающаяся тем, что содержит химерный регуляторный участок по п.4.
26. Плазмида, отличающаяся тем, что содержит кластер по п.2.
27. Плазмида, отличающаяся тем, что содержит кластер по п.8.
28. Химерный регуляторный участок для экспрессии генов у растений, отличающийся тем, что содержит не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно связанных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
29. Химерный регуляторный участок для экспрессии генов у растений, отличающийся тем, что содержит не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно связанных с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью, полученной из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, которая оперативно связана с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
30. Кластер для экспрессии гена, отличающийся тем, что содержит ген, оперативно связанный с химерным регуляторным участком, содержащим не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из генов октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно связанных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
31. Способ экспрессии гена в растении, отличающийся тем, что включает связывание гена с химерным регуляторным участком, содержащим не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно связанных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию гена и химерного регуляторного участка в растение, осуществление экспрессии гена в растении.
32. Плазмида, отличающаяся тем, что содержит кластер по п. 30.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15506793A | 1993-11-19 | 1993-11-19 | |
| US08/155067 | 1993-11-19 | ||
| PCT/US1994/012946 WO1995014098A1 (en) | 1993-11-19 | 1994-11-17 | Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96113114A RU96113114A (ru) | 1998-10-10 |
| RU2142998C1 true RU2142998C1 (ru) | 1999-12-20 |
Family
ID=22554000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96113114A RU2142998C1 (ru) | 1993-11-19 | 1994-11-17 | Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты), кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты) |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5955646A (ru) |
| EP (1) | EP0729514B1 (ru) |
| JP (1) | JP3347736B2 (ru) |
| KR (1) | KR960705939A (ru) |
| CN (1) | CN1061376C (ru) |
| AT (1) | ATE317445T1 (ru) |
| AU (1) | AU687961B2 (ru) |
| BR (1) | BR9408093A (ru) |
| CA (1) | CA2174954C (ru) |
| DE (1) | DE69434624T2 (ru) |
| RU (1) | RU2142998C1 (ru) |
| WO (1) | WO1995014098A1 (ru) |
Families Citing this family (173)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU687961B2 (en) * | 1993-11-19 | 1998-03-05 | Biotechnology Research And Development Corporation | Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants |
| GB9516241D0 (en) * | 1995-08-08 | 1995-10-11 | Zeneca Ltd | Dna constructs |
| GB9524395D0 (en) * | 1995-11-29 | 1996-01-31 | Nickerson Biocem Ltd | Promoters |
| CA2257719C (en) * | 1996-06-11 | 2005-05-31 | Wesley B. Bruce | A synthetic plant core promoter and upstream regulatory element |
| US6072050A (en) | 1996-06-11 | 2000-06-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic promoters |
| RU2226215C2 (ru) | 1997-04-04 | 2004-03-27 | Борд Оф Риджентс Оф Юниверсити Оф Нибраска | Молекула днк, кодирующая дикамба-разрушающую оксигеназу, и ее применение |
| FR2766206A1 (fr) * | 1997-07-11 | 1999-01-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies |
| FR2766207B1 (fr) | 1997-07-11 | 2000-12-08 | Rhone Poulenc Agrochimie | Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies |
| ZA9811228B (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-14 | Mogen Int | New constitutive plant promoters |
| AR014491A1 (es) * | 1998-01-29 | 2001-02-28 | Dow Agrosciences Llc | Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum. |
| BR9909258A (pt) | 1998-03-11 | 2000-11-28 | Novartis Ag | Expressão de genes biossintéticos de trealose em plantas |
| FR2791699B1 (fr) * | 1999-03-29 | 2004-10-29 | Meristem Therapeutics | Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant, et methodes de leur obtention |
| US7135282B1 (en) | 1999-10-14 | 2006-11-14 | The Dow Chemical Company | Viral particles with exogenous internal epitopes |
| US6620986B1 (en) | 1999-11-23 | 2003-09-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Transformation of Ricinus communis, the castor plant |
| US6388170B1 (en) | 2000-04-07 | 2002-05-14 | University Of Kentucky Research Foundation | Bidirectional promoters and methods related thereto |
| US6878861B2 (en) | 2000-07-21 | 2005-04-12 | Washington State University Research Foundation | Acyl coenzyme A thioesterases |
| ATE351902T1 (de) | 2000-11-03 | 2007-02-15 | Univ Michigan | Oberflächentransfektion und expressionsverfahren |
| US6902933B2 (en) | 2000-11-03 | 2005-06-07 | Regents Of The University Of Michigan | Surface transfection and expression procedure |
| US6897067B2 (en) | 2000-11-03 | 2005-05-24 | Regents Of The University Of Michigan | Surface transfection and expression procedure |
| WO2002064804A2 (en) * | 2001-02-13 | 2002-08-22 | University Of Florida | A bi-directional dual promoter complex with enhanced promoter activity for transgene expression in eukaryotes |
| DE10212158A1 (de) | 2002-03-19 | 2003-10-02 | Metanomics Gmbh & Co Kgaa | Population transgener Pflanzen, davon abgeleitetes biologisches Material, entsprechende Plasmidkollektion und Population transformierter Wirtsorganismen, sowie deren Verwendung und Verfahren zu deren Erzeugung |
| CA2490004A1 (en) | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Plastid division and related genes and proteins, and methods of use |
| WO2004043885A2 (en) | 2002-11-12 | 2004-05-27 | Purdue Research Foundation | Benzoate inducible promoters |
| BR0317537A (pt) | 2002-12-20 | 2005-11-22 | Metanomics Gmbh & Co Kgaa | Processo para preparar aminoácidos em organismos transgênicos, construção de ácido nucleico, vetor, organismo procariótico ou eucariótico transgênico, uso dos organismos transgênicos, e, sequencia de aminoácidos |
| KR20060028382A (ko) * | 2002-12-23 | 2006-03-29 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | 식물에서 약학적으로 중요한 단백질의 일시적인 생산 방법 |
| BRPI0407514A (pt) | 2003-02-17 | 2006-02-14 | Metanomics Gmbh | método para preparar um organismo não humano, polinucleotìdeo, método para preparar um vetor, vetor, célula hospedeira, polipeptìdeo, anticorpo, ácido polinucléico de anti-sentido, método para preparar uma planta, célula vegetal, tecido vegetal transgênicos, célula de um animal útil, animal útil ou um microorganismo transgênico organismo não humano, microorganismo transgênico, rendimento ou um material de propagação de uma planta ou de um animal útil, biomassa de um microorganismo, método para preparar produtos quìmicos finos, e, uso de polipeptìdeo |
| WO2005014828A2 (en) | 2003-08-01 | 2005-02-17 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of fine chemicals in plants |
| US7655833B2 (en) | 2003-05-29 | 2010-02-02 | Brookhaven Science Associates, Llc | ADS genes for reducing saturated fatty acid levels in seed oils |
| BRPI0512188A (pt) | 2004-06-16 | 2008-02-19 | Basf Plant Science Gmbh | ácido nucleico da proteìna do metabolismo de lipìdeo ( lmp ) isolado, vetor de expressão, métodos para produzir uma planta transgênica possuindo um nìvel modificado de um composto de armazenamento da semente, e de modulação do nìvel de um composto de armazenamento da semente e do número e/ou do tamanho de um ou mais órgãos de planta em uma planta, e, planta transgênica |
| US20070292490A1 (en) | 2004-06-25 | 2007-12-20 | Valentin Negrouk | Production of tissue factor in plants |
| WO2007087815A2 (en) | 2004-12-17 | 2007-08-09 | Metanomics Gmbh | Process for the control of production of fine chemicals |
| EP2080769A3 (en) | 2004-07-02 | 2010-12-01 | Metanomics GmbH | Process for the production of fine chemicals |
| US20100050296A1 (en) | 2004-07-31 | 2010-02-25 | Metanomics Gmbh | Preparation of organisms with faster growth and/or higher yield |
| US7193135B2 (en) | 2004-12-17 | 2007-03-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Root-preferred, wound- and insect-inducible 2-oxoglutarate-dependent oxygenase promoter from maize and its use |
| US20140199313A1 (en) | 2005-03-02 | 2014-07-17 | Metanomics Gmbh | Process for the Production of Fine Chemicals |
| EP2194140A2 (en) | 2005-03-02 | 2010-06-09 | Metanomics GmbH | Process for the production of fine chemicals |
| EP2166099B1 (en) | 2005-03-08 | 2012-12-19 | BASF Plant Science GmbH | Expression enhancing intron sequences |
| CA2606220A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-12-21 | Basf Plant Science Gmbh | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| US7781648B2 (en) | 2005-05-18 | 2010-08-24 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm |
| US8119858B2 (en) | 2005-07-06 | 2012-02-21 | Cropdesign N.V. | Plant yield improvement by Ste20-like gene expression |
| MX2008000118A (es) | 2005-07-18 | 2008-03-24 | Basf Plant Science Gmbh | Aumento del rendimiento en plantas con sobreexpresion de los genes shsrp. |
| AU2006270321B2 (en) | 2005-07-18 | 2012-03-08 | Basf Plant Science Gmbh | Yield increase in plants overexpressing the ACCDP genes |
| EA201000757A1 (ru) * | 2005-08-24 | 2010-12-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Способы борьбы с сорными растениями на возделываемой посевной площади |
| CN101268193A (zh) | 2005-09-15 | 2008-09-17 | 克罗普迪塞恩股份有限公司 | 通过组3 lea表达的植物产量改良 |
| EP1974024A2 (en) | 2005-12-09 | 2008-10-01 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acid molecules encoding polypeptides involved in regulation of sugar and lipid metabolism and methods of use viii |
| PL1968618T3 (pl) * | 2005-12-30 | 2017-10-31 | Parasite Tech A/S | Kompozycja zawierająca jaja pasożytów oraz sposoby izolowania i przechowywania jaj pasożytów |
| US20080313769A9 (en) | 2006-01-12 | 2008-12-18 | Athenix Corporation | EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance |
| CA2638894A1 (en) * | 2006-02-23 | 2007-08-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plant metabolite exporter gene promoters |
| AU2007223364B2 (en) | 2006-03-02 | 2014-02-13 | Athenix Corporation | Methods and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant |
| ES2390919T3 (es) | 2006-03-31 | 2012-11-19 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento mejorados y un método para elaborar las mismas |
| EP2090662A3 (en) | 2006-04-05 | 2012-10-31 | Metanomics GmbH | Process for the production of a fine chemical |
| CN106222179A (zh) | 2006-05-31 | 2016-12-14 | 梅坦诺米克斯有限公司 | 使用铵转运蛋白或者葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶或者法呢基磷酸合成酶（fpp）的氮代谢操作 |
| CA2649341A1 (en) | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having improved growth characteristics and method for making the same |
| US7977535B2 (en) | 2006-07-12 | 2011-07-12 | Board Of Trustees Of Michigan State University | DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants |
| EP2199394A1 (en) | 2006-08-02 | 2010-06-23 | CropDesign N.V. | Plants transformed with SYT-polypeptide having increased yield under abiotic stress and a method for making the same |
| MX2009007308A (es) | 2007-01-31 | 2009-07-15 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento mejorado y/o resistencia al estres abiotico aumentada y un metodo para obtener las mismas. |
| ATE554174T1 (de) | 2007-02-06 | 2012-05-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verwendung von alanin-racemase-genen zur vermittlung von nematodenresistenz an pflanzen |
| EP2118286B1 (en) | 2007-02-28 | 2016-04-13 | Cropdesign N.V. | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2008110522A1 (en) | 2007-03-15 | 2008-09-18 | Basf Plant Science Gmbh | Use of nematode chitinase genes to control plant parasitic nematodes |
| CN101652480A (zh) | 2007-03-23 | 2010-02-17 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有提高的胁迫耐受性和产量的转基因植物 |
| CA2900183A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Yves Hatzfeld | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2008135467A2 (en) | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Enhancement of seed oil / amino acid content by combinations of pyruvate kinase subunits |
| AU2008252996B2 (en) | 2007-05-22 | 2014-01-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production |
| DE112008001453T5 (de) | 2007-05-22 | 2010-04-29 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Toleranz und/oder Resistenz gegenüber Umweltstress und erhöhter Biomasseproduktion-KO |
| DE112008001326T5 (de) | 2007-05-23 | 2010-07-01 | Cropdesign N.V. | Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| MX2009012452A (es) | 2007-05-29 | 2010-03-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas transgenicas con tolerancia al estres y rendimiento aumentados. |
| DE112008001730T5 (de) | 2007-06-29 | 2010-06-02 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| CN101743314A (zh) | 2007-07-13 | 2010-06-16 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增加的胁迫耐受性和产量的转基因植物 |
| AR067748A1 (es) | 2007-07-31 | 2009-10-21 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas |
| IN2010KN00318A (ru) | 2007-07-31 | 2015-06-12 | Basf Plant Science Gmbh | |
| WO2009016249A2 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Transgenic plants with increased stress tolerance and yield |
| AU2008300478B2 (en) | 2007-09-21 | 2014-11-06 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having increased yield-related traits and a method for making the same |
| EP2594647A3 (en) | 2007-09-21 | 2013-07-24 | BASF Plant Science GmbH | Plants with increased yield |
| AR069107A1 (es) | 2007-10-29 | 2009-12-30 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas con rasgos aumentados relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas mediante la expresion de un acido nucleico que codifica un polipeptido del factor de transcripcion del dominio dof-c2 (adn de union con un dedo, subgrupo c2) o de un polipeptido myb7 (factor de transcripcion c |
| MX2010005697A (es) | 2007-11-26 | 2010-06-11 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas. |
| CA2706799A1 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Basf Plant Science Gmbh | Transgenic plants with increased stress tolerance and yield |
| CA2708093A1 (en) | 2007-12-17 | 2009-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Lipid metabolism protein and uses thereof i (bzip transcription factor) |
| CA2708506A1 (en) | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| AU2008340002A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield (KO NUE) |
| CN101965405B (zh) | 2008-01-25 | 2014-03-05 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| RU2522480C2 (ru) | 2008-01-31 | 2014-07-20 | Нэшнл Инститьют Фо Байолоджикэл Сайенсес | Растения с измененным ростом и/или развитием и способ их создания |
| DE112009000313T5 (de) | 2008-02-27 | 2011-04-28 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit erhöhtem Ertrag |
| UA108597C2 (ru) | 2008-03-04 | 2015-05-25 | Вашингтон Стейт Юніверсіті | Способ регуляции ненасыщенности жирных кислот масла семян |
| AU2009237642A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2009135810A1 (en) | 2008-05-05 | 2009-11-12 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| DE112009001459T5 (de) | 2008-06-20 | 2011-09-29 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben |
| DE112009001405T5 (de) | 2008-06-26 | 2011-07-28 | BASF Plant Science GmbH, 67063 | Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung |
| US8748699B2 (en) | 2008-07-04 | 2014-06-10 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same by overexpressing a polynucleotide encoding a TFL1-like protein |
| CN102099480A (zh) | 2008-07-17 | 2011-06-15 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| EP2669379A3 (en) | 2008-07-31 | 2014-03-19 | BASF Plant Science GmbH | Plants having modified growth characteristics and a method for making the same |
| CA2734347A1 (en) | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof |
| AU2009284260A1 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Basf Plant Science Gmbh | Transgenic plants comprising as transgene a phosphatidate cytidylyltransferase |
| WO2010020555A1 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| DE112009002061T5 (de) | 2008-08-27 | 2011-07-14 | BASF Plant Science GmbH, 67063 | Nematodenresistente transgene Pflanzen |
| US20110195843A1 (en) | 2008-09-23 | 2011-08-11 | Basf Plant Science Gmbh | Plants with Increased Yield (LT) |
| DE112009002213T5 (de) | 2008-09-23 | 2011-07-28 | BASF Plant Science GmbH, 67063 | Transgene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag |
| EP2334797A1 (en) | 2008-09-24 | 2011-06-22 | BASF Plant Science GmbH | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| CN104745624A (zh) | 2008-10-23 | 2015-07-01 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 生产具有增加的γ-氨基丁酸(GABA)含量的转基因细胞的方法 |
| MX2011004270A (es) | 2008-10-23 | 2011-07-13 | Basf Plant Science Gmbh | Plantas con rendimiento aumentado (nue). |
| CN102272309A (zh) | 2008-11-12 | 2011-12-07 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的非生物胁迫耐受性和/或增强的产量相关性状的植物及其制备方法 |
| US9133475B2 (en) | 2008-11-26 | 2015-09-15 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Aphid resistant soybean plants |
| WO2010063033A2 (en) | 2008-11-28 | 2010-06-03 | Merial Limited | Recombinant avian influenza vaccine and uses thereof |
| EA201170752A1 (ru) | 2008-12-03 | 2012-04-30 | Басф Плант Сайенс Гмбх | Растения с повышенной устойчивостью к абиотическому стрессу и/или улучшенными характеристиками урожайности и способ их получения |
| WO2010066600A1 (en) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | Basf Plant Science Gmbh | Plant root-specific nematode resistance |
| EP2199399A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-06-23 | BASF Plant Science GmbH | Production of ketocarotenoids in plants |
| CA2745747A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-06-24 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and/or abiotic stress tolerance and a method for making the same |
| US8362318B2 (en) | 2008-12-18 | 2013-01-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae |
| CN101768213B (zh) | 2008-12-30 | 2012-05-30 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用 |
| WO2010086220A1 (en) | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Basf Plant Science Company Gmbh | Transgenic plants having altered nitrogen metabolism |
| AU2010209843A1 (en) | 2009-01-28 | 2011-08-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Engineering NF-YB transcription factors for enhanced drought resistance and increased yield in transgenic plants |
| DE112010000838T5 (de) | 2009-01-28 | 2012-11-29 | Basf Plant Science Gmbh | Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben |
| DE112010000887T5 (de) | 2009-02-25 | 2012-09-27 | Basf Plant Science Company Gmbh | Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu deren Herstellung |
| CN101817879A (zh) | 2009-02-26 | 2010-09-01 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 金属硫蛋白及其编码基因与应用 |
| CA2754916A1 (en) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Basf Plant Science Company Gmbh | Transgenic plants with altered redox mechanisms and increased yield |
| US8471107B2 (en) | 2009-04-16 | 2013-06-25 | Schillinger Genetics, Inc. | Soybeans having high germination rates and ultra-low raffinose and stachyose content |
| CN104789573A (zh) | 2009-04-29 | 2015-07-22 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 |
| KR20150046788A (ko) | 2009-04-29 | 2015-04-30 | 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 | 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 |
| MX2011011646A (es) | 2009-05-06 | 2011-11-29 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y/o mejor tolerancia al estres abiotico y un metodo para producirlas. |
| EP2435562A1 (en) | 2009-05-26 | 2012-04-04 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen |
| US20120079627A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-03-29 | Edenspace Systems Corporation | Plant gene regulatory elements |
| AU2010275363A1 (en) | 2009-07-23 | 2012-02-02 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants with increased yield |
| EP2470661A1 (en) | 2009-08-25 | 2012-07-04 | BASF Plant Science Company GmbH | Nematode-resistant transgenic plants |
| US9371537B2 (en) | 2009-09-25 | 2016-06-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits resulted from modulated expression of a SGT1 polypeptide and a method for making the same |
| AU2010309990A1 (en) | 2009-10-22 | 2012-05-24 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| US20120227133A1 (en) | 2009-11-13 | 2012-09-06 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants Having Enhanced Yield-Related Traits and a Method for Making the Same |
| CN102770543A (zh) | 2009-11-17 | 2012-11-07 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增加的产量的植物 |
| CN103260643A (zh) | 2009-12-28 | 2013-08-21 | 梅里亚有限公司 | 重组ndv抗原及其用途 |
| WO2011082253A2 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Board Of Trustees Of Michigan State University | A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush) |
| WO2011104153A1 (en) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Basf Plant Science Company Gmbh | Nematode-resistant transgenic plants |
| US9388423B2 (en) | 2010-02-24 | 2016-07-12 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2011104155A2 (en) | 2010-02-24 | 2011-09-01 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| NZ602278A (en) | 2010-03-12 | 2014-12-24 | Biolex Therapeutics Inc | Bluetongue virus recombinant vaccines and uses thereof |
| MX2012010600A (es) | 2010-03-18 | 2012-10-05 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el redimiento y un metodo para producirlas. |
| CN105063063A (zh) | 2010-06-24 | 2015-11-18 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| KR101429475B1 (ko) | 2010-06-25 | 2014-08-22 | 바스프 플랜트 사이언스 컴퍼니 게엠베하 | 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 |
| PH12012502575A1 (en) | 2010-07-16 | 2013-02-11 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| BR112013011523A2 (pt) | 2010-11-10 | 2019-09-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | método, planta, construto, uso, planta transgênica, partes colhíveis de uma planta, produtos e partes colhíveis de uma planta |
| BR112013015335A2 (pt) | 2010-12-20 | 2019-09-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | plantas transgências resistentes a nematoides |
| MX2013008086A (es) | 2011-01-20 | 2013-10-03 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas. |
| CA2826859A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and producing methods thereof |
| MX2013009749A (es) | 2011-02-28 | 2013-10-01 | Basf Plant Science Co Gmbh | Plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado y metodos para producir los mismos. |
| EP2721160A2 (en) | 2011-06-14 | 2014-04-23 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Compositions and methods for making and biocontaining auxotrophic transgenic plants |
| WO2013024121A2 (en) | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Increase of sucrose transporter activity in the seeds of plants |
| WO2013050593A1 (en) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
| WO2013050318A1 (en) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
| WO2013050611A1 (en) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
| WO2013053686A1 (en) | 2011-10-10 | 2013-04-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
| WO2013053711A1 (en) | 2011-10-10 | 2013-04-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
| MX349486B (es) | 2012-06-22 | 2017-08-01 | Syngenta Participations Ag | Control biologico de plagas de coleopteros. |
| RU2015109129A (ru) | 2012-08-17 | 2016-10-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Применение нетранслируемой области кукурузы для трансэкспрессии гена в растениях |
| AR092564A1 (es) | 2012-09-14 | 2015-04-22 | Bayer Cropscience Lp | Variantes de la enzima 4-hidroxifenil piruvato deoxigenasa (hppd) y metodos de uso para conferir tolerancia a herbicidas en plantas |
| US10253329B2 (en) | 2013-01-04 | 2019-04-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Sources of aphid resistance in soybean plants |
| US9783817B2 (en) | 2013-03-04 | 2017-10-10 | Arkansas State University | Methods of expressing and detecting activity of expansin in plant cells |
| EP2801619A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-12 | Fondazione Edmund Mach | Method of enhancing photosynthesis using Curvature thylakoid 1 (CURT1) polypeptide |
| US11441147B2 (en) | 2013-07-10 | 2022-09-13 | Basf Se | RNAi for the control of phytopathogenic fungi and oomycetes by inhibiting the expression of CYP51 genes |
| US10392629B2 (en) | 2014-01-17 | 2019-08-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Increased caloric and nutritional content of plant biomass |
| US9714429B2 (en) | 2014-01-28 | 2017-07-25 | Arkansas State University | Regulatory sequence of cupin family gene |
| BR112016020889B1 (pt) | 2014-03-11 | 2022-10-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, proteína hppd recombinante, uso do ácido nucleico recombinante e produto de base |
| WO2015193653A1 (en) | 2014-06-16 | 2015-12-23 | Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas | Oxidative resistance chimeric genes and proteins, and transgenic plants including the same |
| WO2016100333A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Syngenta Participations Ag | Pesticidal microrna carriers and use thereof |
| MX2017007904A (es) | 2014-12-23 | 2017-09-05 | Syngenta Participations Ag | Control biologico de plagas de coleopteros. |
| ES2933673T3 (es) | 2015-09-11 | 2023-02-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Variantes de HPPD y métodos de uso |
| WO2017184727A1 (en) | 2016-04-21 | 2017-10-26 | Bayer Cropscience Lp | Tal-effector mediated herbicide tolerance |
| CN110267975B (zh) | 2016-11-23 | 2024-04-19 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | Axmi669和axmi991毒素基因及其使用方法 |
| WO2018119336A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Athenix Corp. | Use of cry14 for the control of nematode pests |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| AR110756A1 (es) | 2017-01-18 | 2019-05-02 | Bayer Cropscience Lp | Uso de bp005 para el control de patógenos de planta |
| WO2018165091A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| WO2019083810A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| CA3157234A1 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Novel insect resistant genes and methods of use |
| BR112022007119A2 (pt) | 2019-10-14 | 2022-07-05 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Molécula de ácido nucleico, ácido nucleico, polipeptídeos, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, composição, métodos para controlar uma população de pragas, para matar uma praga, para produzir um polipeptídeo, para proteger uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta, planta, uso do ácido nucleico e produto básico |
| WO2024137438A2 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Insect toxin genes and methods for their use |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4771002A (en) * | 1984-02-24 | 1988-09-13 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transcription in plants and bacteria |
| US5164316A (en) * | 1987-01-13 | 1992-11-17 | The University Of British Columbia | DNA construct for enhancing the efficiency of transcription |
| US5322932A (en) * | 1987-08-12 | 1994-06-21 | Mycogen Corporation | Nematode-active toxin from a Bacillus thuringiensis isolate |
| US5281530A (en) * | 1987-08-12 | 1994-01-25 | Mycogen Corporation | Genes encoding nematode-active toxins cloned from bacillus thuringiensis isolate PS17 |
| US5196329A (en) * | 1987-12-18 | 1993-03-23 | Lubrizol Genetics Inc. | 780 T-DNA gene transcription activator |
| US5106739A (en) * | 1989-04-18 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same |
| WO1992000566A1 (en) * | 1990-07-02 | 1992-01-09 | Varian Associates, Inc. | Partial fan beam tomographic apparatus and data reconstruction method |
| ES2118089T3 (es) * | 1990-09-10 | 1998-09-16 | Cambridge Advanced Tech | Represion de nematodos parasitos de plantas. |
| NZ242560A (en) * | 1991-05-03 | 1994-01-26 | Mycogen Corp | Toxin effective against nematodes and its use in controlling them. |
| AU687961B2 (en) * | 1993-11-19 | 1998-03-05 | Biotechnology Research And Development Corporation | Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants |
-
1994
- 1994-11-17 AU AU12885/95A patent/AU687961B2/en not_active Expired
- 1994-11-17 EP EP95904058A patent/EP0729514B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 JP JP51449995A patent/JP3347736B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-17 WO PCT/US1994/012946 patent/WO1995014098A1/en active IP Right Grant
- 1994-11-17 RU RU96113114A patent/RU2142998C1/ru active
- 1994-11-17 CA CA002174954A patent/CA2174954C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 BR BR9408093A patent/BR9408093A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 DE DE69434624T patent/DE69434624T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-17 AT AT95904058T patent/ATE317445T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-11-17 KR KR1019960702631A patent/KR960705939A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-11-17 CN CN94194169A patent/CN1061376C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-17 US US08/619,524 patent/US5955646A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Генная инженерия растений. Пер. с англ./Под ред. Дж.Дрейпера и др.-М.: Мир, 1991, с. 11 - 37. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69434624T2 (de) | 2006-12-14 |
| DE69434624D1 (de) | 2006-04-20 |
| KR960705939A (ko) | 1996-11-08 |
| CA2174954C (en) | 2005-03-15 |
| AU1288595A (en) | 1995-06-06 |
| JPH09505205A (ja) | 1997-05-27 |
| CN1136825A (zh) | 1996-11-27 |
| JP3347736B2 (ja) | 2002-11-20 |
| CA2174954A1 (en) | 1995-05-26 |
| ATE317445T1 (de) | 2006-02-15 |
| BR9408093A (pt) | 1997-08-12 |
| US5955646A (en) | 1999-09-21 |
| EP0729514A1 (en) | 1996-09-04 |
| EP0729514B1 (en) | 2006-02-08 |
| AU687961B2 (en) | 1998-03-05 |
| CN1061376C (zh) | 2001-01-31 |
| WO1995014098A1 (en) | 1995-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2142998C1 (ru) | Химерный регуляторный участок для экспрессии генов в растениях (варианты), кластер для экспрессии гена (варианты), кластер для индуцибельной экспрессии чужеродного гена (варианты), способ экспрессии гена в растении (варианты), способ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении (варианты) и плазмида (варианты) | |
| Ni et al. | Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes | |
| US5670349A (en) | HMG2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures | |
| ES2252964T3 (es) | Promotores preferidos de semillas. | |
| NZ291734A (en) | Plant transcription regulators from circovirus; isolated nucleic acid molecules and transgenic plants | |
| Petitot et al. | Promoter analysis of the WRKY transcription factors CaWRKY1a and CaWRKY1b homoeologous genes in coffee (Coffea arabica) | |
| Guevara‐García et al. | Tissue‐specific and wound‐inducible pattern of expression of the mannopine synthase promoter is determined by the interaction between positive and negative cis‐regulatory elements | |
| Franche et al. | Transient gene expression in cassava using high-velocity microprojectiles | |
| CA2204131A1 (en) | Isoflavone reductase promoter | |
| Kawamata et al. | Temporal and spatial pattern of expression of the pea phenylalanine ammonia-lyase genel promoter in transgenic tobacco | |
| Dutt et al. | Comparative expression analysis of five caulimovirus promoters in citrus | |
| US7557264B2 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
| AU764145B2 (en) | Inducible promoters | |
| US6664384B1 (en) | Duplicated cassava vein mosaic virus enhancers and uses thereof | |
| KR101700102B1 (ko) | 감귤 유래의 ＣｕＣＲＴＩＳＯ 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101825960B1 (ko) | 벼 유래 뿌리 특이적 프로모터 및 이의 용도 | |
| JPWO2003004649A1 (ja) | 根と茎頂で外来遺伝子を発現するプロモーター | |
| CA2327534A1 (en) | Translational regulatory elements | |
| Mahmoud et al. | Cloning of a novel antifungal promoter from Phaseolus vulgaris and the determination of its activity in stably transformed Nicotiana tabacum plants | |
| CA2198723C (en) | Plant transcription regulators from circovirus | |
| KR101700103B1 (ko) | 감귤 유래의 ＣｕＣＲＴＩＳＯ 프로모터 및 이의 용도 | |
| KR101170145B1 (ko) | 토마토 유래 뿌리 특이적 알파-디옥시게나아제1 프로모터 및 그 용도 | |
| CN115011600A (zh) | 一种响应缺铁胁迫的诱导型启动子GmbHLH47启动子及其应用 | |
| EP0712273A1 (en) | Hmg2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures | |
| Liu et al. | MULTIPLE COPIES OF THE ACTIVATOR INTERACT WITH A HETEROLOGOUS PROMOTER TO REGULATE GENE EXPRESSION |