Claims (45)
1. Тройной комплекс, включающий одноцепочечный зонд, связанный с мишенью из двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причем зонд представляет собой гетерополимерную нуклеиновую кислоту или аналог гетерополимерной нуклеиновой кислоты, а все триплеты оснований этого комплекса являются представителями группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C.1. A triple complex comprising a single-stranded probe coupled to a double-stranded nucleic acid target, the probe being a heteropolymer nucleic acid or an analog of a heteropolymer nucleic acid, and all triplets of the bases of this complex are representatives of the group consisting of A-T-A, T- AT, UAT, TAU, AUA, UAU, GCG and CGC.
2. Комплекс по п.1, в котором значение рН среды, в которой находится этот комплекс, больше 7,6.2. The complex according to claim 1, in which the pH value of the medium in which this complex is located is greater than 7.6.
3. Комплекс по п.1, в котором одноцепочечная нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты имеет длину от 5 до 30 оснований, а двухцепочечная нуклеиновая кислота-мишень имеет длину от 8 до 3,3×109 пар оснований.3. The complex according to claim 1, in which the single-stranded nucleic acid or nucleic acid analog has a length of from 5 to 30 bases, and the double-stranded nucleic acid target has a length of from 8 to 3.3 × 10 9 base pairs.
4. Комплекс по п.1, в котором последовательность-мишень содержит от 25 до 75% пуриновых оснований и от 75 до 25% пиримидиновых оснований в любом порядке.4. The complex according to claim 1, in which the target sequence contains from 25 to 75% purine bases and from 75 to 25% pyrimidine bases in any order.
5. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с агентом, расщепляющим двухцепочечные нуклеиновые кислоты.5. The complex according to claim 1, in which the probe is covalently linked to an agent that cleaves double-stranded nucleic acids.
6. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с химиотерапевтическим средством.6. The complex according to claim 1, in which the probe is covalently linked to a chemotherapeutic agent.
7. Комплекс по п.1, в котором зонд ковалентно связан с меткой.7. The complex according to claim 1, in which the probe is covalently linked to the label.
8. Комплекс по п.7, в котором метка представляет собой мультимолекулярный сигнальный комплекс, окислительно-восстановительную пару, хемилюминесцентный агент или электрохемилюминесцентный агент.8. The complex according to claim 7, in which the label is a multimolecular signal complex, a redox pair, a chemiluminescent agent or an electrochemiluminescent agent.
9. Комплекс по п.7, в котором метка представляет собой флуорофор.9. The complex according to claim 7, in which the label is a fluorophore.
10. Комплекс по п.9, в котором интенсивность флуоресценции указанного комплекса прямо коррелирует со сродством связывания между указанным зондом и последовательностью-мишенью.10. The complex according to claim 9, in which the fluorescence intensity of the specified complex directly correlates with the affinity of binding between the specified probe and the target sequence.
11. Способ анализа связывания, включающий обеспечение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность-мишень, которая содержит как минимум одно пуриновое основание и как минимум одно пиримидиновое основание; обеспечение зонда, включающего нуклеотидную последовательность или последовательность аналога нуклеиновой кислоты; обеспечение катиона; внесение указанных зонда, последовательности-мишени и катиона в среду для получения тестируемого образца, содержащего тройной комплекс, включающий указанный зонд, связанный с указанной последовательностью-мишенью, причем все триплеты оснований этого комплекса являются представителями группы, состоящей из А-Т-А, Т-А-Т, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G и C-G-C; облучение тестируемого образца возбуждающим излучением, чтобы вызвать испускание флуоресценции тестируемым образцом; регистрация интенсивности флуоресцентного излучения, причем указанная интенсивность коррелирует со сродством связывания между указанными зондом и последовательностью-мишенью; определение по этой интенсивности степени соответствия между зондом и последовательностью-мишенью.11. A method for analyzing binding, comprising providing a double stranded nucleic acid comprising a target sequence that contains at least one purine base and at least one pyrimidine base; providing a probe comprising a nucleotide sequence or nucleic acid analog sequence; providing a cation; introducing the indicated probe, target sequence and cation into the medium to obtain a test sample containing a triple complex, including the specified probe associated with the specified target sequence, and all triplets of the bases of this complex are representatives of the group consisting of A-T-A, T -A-T, UAT, TAU, AUA, UAU, GCG and CGC; irradiating the test sample with excitation radiation to cause emission of fluorescence by the test sample; registration of the intensity of fluorescent radiation, and the specified intensity correlates with the affinity of binding between the probe and the target sequence; determination by this intensity of the degree of correspondence between the probe and the target sequence.
12. Способ по п.11, в котором указанное определение проводится путем калибровки указанной интенсивности относительно интенсивностей флуоресценции, испускаемой другими зондами в сочетании с указанной последовательностью-мишенью и данным катионом, причем как минимум один из этих других зондов отличается от данного зонда по меньшей мере одним основанием.12. The method according to claim 11, in which the specified definition is carried out by calibrating the specified intensity relative to the fluorescence intensities emitted by other probes in combination with the specified target sequence and this cation, and at least one of these other probes differs from this probe at least one reason.
13. Способ по п.12, в котором по отношению к указанной последовательности-мишени данный зонд и каждый из указанных других зондов являются различными представителями группы, состоящей из полной комплиментарности, мисматчей по одному основанию, по двум основаниям, по трем основаниям, делеций одного основания, двух оснований, трех оснований.13. The method according to item 12, in which, with respect to the specified target sequence, this probe and each of these other probes are different representatives of the group consisting of complete complementarity, mismatches on one base, on two bases, on three bases, deletions of one bases, two bases, three bases.
14. Способ по п.11, дополнительно включающий количественное определение сродства связывания.14. The method of claim 11, further comprising quantifying binding affinity.
15. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без обеспечения тушителя сигнала на последовательности-мишени или зонде.15. The method according to claim 11, which is a homogeneous analysis conducted without providing a signal quencher on the target sequence or probe.
16. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без предварительной денатурации указанной последовательности-мишени.16. The method according to claim 11, which is a homogeneous analysis carried out without prior denaturation of the specified target sequence.
17. Способ по п.11, представляющий собой гомогенный анализ, проводимый без ПЦР-амплификации последовательности-мишени.17. The method according to claim 11, which is a homogeneous analysis carried out without PCR amplification of the target sequence.
18. Способ по п.11, в котором указанная последовательность-мишень представляет собой двухцепочечную ДНК и указанный зонд специфически связывается с указанной последовательностью-мишенью с образованием тройного комплекса.18. The method of claim 11, wherein said target sequence is double-stranded DNA and said probe specifically binds to said target sequence to form a triple complex.
19. Способ по п.18, в котором указанный зонд представляет собой одноцепочечную ДНК или РНК.19. The method of claim 18, wherein said probe is single stranded DNA or RNA.
20. Способ по п.11, в котором зонд имеет частично заряженный остов.20. The method according to claim 11, in which the probe has a partially charged skeleton.
21. Способ по п.11, в котором зонд имеет незаряженный остов.21. The method according to claim 11, in which the probe has an uncharged skeleton.
22. Способ по п.21, в котором зонд включает последовательность ПНК.22. The method according to item 21, in which the probe includes a PNA sequence.
23. Способ по п.11, в котором указанный зонд представляет собой оцДНК, полученную путем параллельного синтеза.23. The method according to claim 11, wherein said probe is ssDNA obtained by parallel synthesis.
24. Способ по п.23, в котором указанные зонд и последовательность-мишень имеют одинаковую длину.24. The method of claim 23, wherein said probe and target sequence are of the same length.
25. Способ по п.11, в котором зонд имеет длину от 5 до 30 нуклеотидов.25. The method according to claim 11, in which the probe has a length of from 5 to 30 nucleotides.
26. Способ по п.11, в котором возбуждающее излучение исходит от аргонового лазера при длине волны от 200 нм до 1000 нм.26. The method according to claim 11, in which the exciting radiation comes from an argon laser at a wavelength of from 200 nm to 1000 nm.
27. Способ по п.11, осуществляемый при температурах в диапазоне от 5 до 85°С.27. The method according to claim 11, carried out at temperatures in the range from 5 to 85 ° C.
28. Способ по п.11, осуществляемый при температурах ниже 25°С.28. The method according to claim 11, carried out at temperatures below 25 ° C.
29. Способ по п.11, в котором надежность указанного метода не зависит от последовательности оснований зонда, последовательности оснований мишени, содержания гуанина в указанных зонде и последовательности-мишени и содержания цитозина в указанных зонде и последовательности-мишени.29. The method according to claim 11, in which the reliability of the specified method does not depend on the sequence of the bases of the probe, the sequence of the bases of the target, the guanine content in the specified probe and the target sequence and the cytosine content in the specified probe and the target sequence.
30. Способ по п.11, в котором тестируемый образец имеет объем около 20 мкл и содержит около 10 фемтомоль последовательности-мишени около 10 фемтомоль зонда.30. The method according to claim 11, in which the test sample has a volume of about 20 μl and contains about 10 femto moles of the target sequence of about 10 femto moles of the probe.
31. Способ по п.11, в котором концентрация указанной последовательности-мишени в образце составляет не более 5×10-10 М.31. The method according to claim 11, in which the concentration of the specified target sequence in the sample is not more than 5 × 10 -10 M.
32. Способ по п.31, в котором концентрация указанного зонда в указанном образце составляет не более 5×10-10 М.32. The method according to p, in which the concentration of the specified probe in the specified sample is not more than 5 × 10 -10 M.
33. Способ по п.11, осуществляемый на биочипе.33. The method according to claim 11, carried out on a biochip.
34. Способ по п.11, в котором указанный катион представляет собой интеркалирующий флуорофор и указанная интенсивность прямо коррелирует с указанным сродством связывания.34. The method according to claim 11, wherein said cation is an intercalating fluorophore and said intensity directly correlates with said binding affinity.
35. Способ по п.34, в котором указанный интеркалирующий флуорофор ковалентно связан с указанным зондом.35. The method according to clause 34, wherein said intercalating fluorophore is covalently bonded to said probe.
36. Способ по п.34, в котором указанный интеркалирующий флуорофор добавляют в указанную среду в виде, свободном от указанного зонда и свободном от указанной последовательности-мишени.36. The method according to clause 34, wherein said intercalating fluorophore is added to said medium in a form free of said probe and free of said target sequence.
37. Способ по п.34, в котором указанный интеркалирующий флуорофор является представителем группы, состоящей из YOYO-1, ТОТО-1, бромида этидия, гомодимера-1 этидия, гомодимера-2 этидия и акридина.37. The method according to clause 34, wherein said intercalating fluorophore is a member of the group consisting of YOYO-1, TOTO-1, ethidium bromide, ethidium homodimer-1, ethidium homodimer-2, and acridine.
38. Способ по п.34, в котором длина волны, на которой флуоресцирует указанный интеркалирующий флуорофор, сдвигается на другую длину волны при интеркаляции, причем разность между этой указанной длиной волны и второй указанной длиной волны показывает, является ли комплекс между указанным зондом и мишенью двойным или тройным и что представляет собой указанная мишень - ДНК или РНК.38. The method according to clause 34, in which the wavelength at which the specified intercalating fluorophore fluoresces, shifts to a different wavelength during intercalation, the difference between this specified wavelength and the second specified wavelength indicates whether the complex between the specified probe and the target double or triple and what the specified target is - DNA or RNA.
39. Способ по п.11, в котором указанный зонд ковалентно мечен неинтеркалирующим флуорофором, а указанная интенсивность обратно коррелирует с указанным сродством связывания.39. The method according to claim 11, wherein said probe is covalently labeled with a non-intercalating fluorophore, and said intensity is inversely correlated with said binding affinity.
40. Способ по п.39, в котором указанный неинтеркалирующий флуорофор является представителем группы, состоящей из биотина, родамина и флуоресцеина.40. The method according to § 39, wherein said non-intercalating fluorophore is a member of the group consisting of biotin, rhodamine and fluorescein.
41. Способ по п.11, в котором один цитозин в каждом из триплетов оснований С-G-C и G-C-G положительно заряжен.41. The method according to claim 11, in which one cytosine in each of the triplets of the bases C-G-C and G-C-G is positively charged.
42. Способ по п.11, в котором указанный катион является по меньшей мере одним из представителей группы, состоящей из катионов щелочных металлов, катионов щелочноземельных металлов, катионов переходных металлов, Co(NH3) , трехвалентного спермидина и четырехвалентного спермина.42. The method according to claim 11, wherein said cation is at least one of the representatives of the group consisting of alkali metal cations, alkaline earth metal cations, transition metal cations, Co (NH 3 ) , trivalent spermidine and tetravalent spermine.
43. Способ по п.11, в котором указанным катионом является Na+ находящийся в концентрации от 50 до 125 мМ.43. The method according to claim 11, in which the specified cation is Na + in a concentration of from 50 to 125 mm.
44. Способ по п.11, в котором указанным катионом является Mn2+, находящийся в концентрации от 10 до 30 мМ, Mg2+ в концентрации от 15 до 20 мМ, или Ni2+ в концентрации 20 мМ.44. The method according to claim 11, wherein said cation is Mn 2+ in a concentration of 10 to 30 mM, Mg 2+ in a concentration of 15 to 20 mM, or Ni 2+ in a concentration of 20 mM.
45. Способ по п.11, в котором указанный катион включает Mg2+ и Mn2+ находящиеся в концентрации по 10 мМ, по 15 мМ или по 20 мМ каждого.45. The method according to claim 11, wherein said cation comprises Mg 2+ and Mn 2+ in concentrations of 10 mM, 15 mM, or 20 mM each.