RU2094990C1

RU2094990C1 - Strain of bacterium bacillus subtilis - a producer of substance showing antifungal activity

Info

Publication number: RU2094990C1
Application number: RU9393035311A
Authority: RU
Inventors: В.А. Амбросов; Т.К. Крашенинникова; М.К. Кузьмич; М.И. Болезин; В.А. Румянцев
Original assignee: Амбросов Валерий Антонович; Крашенинникова Татьяна Константиновна; Кузьмич Михаил Константинович
Priority date: 1993-07-08
Filing date: 1993-07-08
Publication date: 1997-11-10

Abstract

FIELD: agriculture biotechnology. SUBSTANCE: strain Bacillus subtilis B-40 is obtained by selection method and deposited in Collection of industrial microorganisms in Institute of Genetics and selection at number B-6554. Strain shows antagonistic properties with respect of the following fungi species: Beaweria bassiana, Gliocladium vide, Verticillium nigrescens, Verticillium dahiae, Fusarium graminearum, Sclerotia sclerotium, Phytophtora infestants. New strain produces an agent showing antifungal activity. EFFECT: strain indicated above. 1 tbl

Description

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и касается методов защиты культурных растений от поражений возбудителями грибковых заболеваний. The invention relates to agricultural biotechnology and relates to methods for protecting cultivated plants from damage by pathogens of fungal diseases.

Потери урожая от повреждений сельскохозяйственных растений вредителями и возбудителями заболеваний ощутимы и постоянно проводятся работы, направленные на расширение арсенала средств защиты растений и их совершенствование. Crop losses from damage to agricultural plants by pests and pathogens are palpable, and work is ongoing to expand the arsenal of plant protection products and improve them.

С учетом остро стоящих экологических проблем, наиболее перспективный путь защиты растений изыскание эффективных биологических средств защиты растений, в том числе, от инфекционных болезней. Given the pressing environmental problems, the most promising way to protect plants is to find effective biological plant protection products, including from infectious diseases.

Известен метод защиты растений от болезней, сводящийся к получению отдельных сортов культурных растений, устойчивых к определенным заболеваниям [1]
Практическая реализация этого метода связана с длительными исследовательскими работами и, кроме того, придать устойчивость к конкретным заболеваниям можно только некоторым, наиболее ценным сортам.A known method of protecting plants from diseases, which reduces to obtaining certain varieties of cultivated plants that are resistant to certain diseases [1]
The practical implementation of this method is associated with lengthy research work and, in addition, only some of the most valuable varieties can be given resistance to specific diseases.

Известна возможность повысить устойчивость растений к возбудителям заболеваний в результате предварительной обработки растений несовместимыми расами фитопатогенов или их ослабленными культурами [2]
Использование этого метода, однако, не может полностью исключить возможности возникновения эпифитотий.Known is the ability to increase the resistance of plants to pathogens as a result of preliminary treatment of plants with incompatible races of phytopathogens or their weakened cultures [2]
Using this method, however, cannot completely exclude the possibility of the occurrence of epiphytoties.

Описан способ защиты растений от инфекционных болезней, состоящий в том, что растения обрабатывают липогликопротеидным комплексом, выделенным из мицелия возбудителя фитофтороза и придающим, в частности, картофелю резистентность к этому заболеванию [3]
Относительный недостаток этого способа состоит в необходимости предварительного накопления значительных объемов биомассы фитопатогенного гриба, из которой следует выделять защитный препарат.A method for protecting plants from infectious diseases is described, which consists in treating plants with a lipoglycoprotein complex isolated from the mycelium of the causative agent of late blight and giving, in particular, potato resistance to this disease [3]
The relative disadvantage of this method is the need for preliminary accumulation of significant amounts of biomass of pathogenic fungus from which a protective preparation should be isolated.

Общеизвестно, что многие бактерии образуют комплексы биологически активных веществ, обладающих антибиотической активностью, что делает отдельные штаммы таких бактерий и синтезируемые ими продукты потенциальными средствами защиты растений от фитопатогенов. It is well known that many bacteria form complexes of biologically active substances with antibiotic activity, which makes individual strains of such bacteria and the products synthesized by them potential protectants of plants from phytopathogens.

Ряд бактерий способен синтезировать биологически активные вещества, проявляющие антигрибковую активность, в том числе, в отношении фитопатогенных грибов, вызывающих такие заболевания растений, как корневая гниль, фитофтороз и подобные. A number of bacteria are able to synthesize biologically active substances that exhibit antifungal activity, including against phytopathogenic fungi that cause plant diseases such as root rot, late blight, and the like.

Известен, например, штамм бактерий Bacillus subtilisESC} ИПМ- 215, являющийся ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого штамма, который образует комплекс биологически активных веществ, потенциально применимый для борьбы с возбудителями грибковых заболеваний растений [4]
Однако, этот штамм образует комплекс биологически активных продуктов, не обладающих достаточной для практического использования противогрибковой активностью как по спектру биологической активности, так и по выраженности этого свойства.Known, for example, the bacterial strain Bacillus subtilisESC} IPM-215, which is the closest analogue (prototype) of the proposed strain, which forms a complex of biologically active substances, potentially applicable for the control of pathogens of fungal diseases of plants [4]
However, this strain forms a complex of biologically active products that do not possess antifungal activity sufficient for practical use both in the spectrum of biological activity and in the severity of this property.

Цель изобретения изыскать бактериальный штамм, биосинтезирующий метаболиты, обладающие выраженной противогрибковой активностью по отношению к фитопатогенам растений, который мог бы найти практическое применение в сельскохозяйственной практике. The purpose of the invention is to find a bacterial strain biosynthesizing metabolites with pronounced antifungal activity against plant pathogens, which could find practical application in agricultural practice.

В результате длительной поисковой и селекционной работы заявителем был выделен и идентифицирован штамм Bacillus subtilis B 40, обладающий искомыми свойствами. As a result of a long search and selection work, the applicant isolated and identified a strain of Bacillus subtilis B 40 with the desired properties.

Этот штамм был выделен из почвы Средней Полосы России после проведения многоступенчатого естественного отбора на агаризованной среде. This strain was isolated from the soil of the Middle Strip of Russia after a multi-stage natural selection on an agar medium.

Заявляемый штамм обладает следующими характеристиками. The inventive strain has the following characteristics.

Морфолого-культуральные признаки. Мясопептонный агар. Колонии имеют диаметр 4 6 мм. Светло-серые, матовые, с волнистым краем, плоские, возвышающиеся к центру. По консистенции колонии по краю сухие, в центре - вязкие, тянущиеся при снятии с поверхности среды. Morphological and cultural characteristics. Meat peptone agar. Colonies have a diameter of 4 to 6 mm. Light gray, matte, with a wavy edge, flat, rising to the center. The consistency of the colony on the edge of the dry, viscous in the center, lasting when removed from the surface of the medium.

Картофельный агар. Колоннии достигают в диаметре 5 8 мм. Кремово-бежеватые, со складчатой поверхностью и волнистым краем. Плоские, слегка возвышающиеся над поверхностью. Potato agar. Colonies reach a diameter of 5 to 8 mm. Creamy beige, with a folded surface and a wavy edge. Flat, slightly rising above the surface.

В препарате живой капли под микроскопом представляют собою подвижные палочки овальной формы размером 0,5 0,8 х 1,0 2,0 мкм. Окраска по Граму отрицательная. Располагаются по одной или парами. Споры имеют субтерминальное расположение. In a live droplet preparation under a microscope, oval-shaped moving sticks are 0.5 0.8 x 1.0 2.0 μm in size. Gram stain is negative. They are arranged one by one or in pairs. Disputes have a subterminal location.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Слабо усваивает глюкозу, мальтозу, сахарозу. Poorly assimilates glucose, maltose, sucrose.

Не усваивает сорбит, лактозу, маннит, арабинозу, рамнозу, салицин. Does not absorb sorbitol, lactose, mannitol, arabinose, rhamnose, salicin.

Активен по отношению к эскулину. Active against esculin.

Молоко коагулирует и пептонизирует без образования пигмента, дает зоны просветления на молочном агаре. Milk coagulates and peptones without the formation of pigment, gives zones of enlightenment on milk agar.

Желатин разжижает. Gelatin liquefies.

Не образует лецитиназу на яично-желтковых средах. Does not form lecithinase on egg-yolk media.

Не образует уреазу на среде с мочевиной. Does not form urease on urea medium.

На ломтиках картофеля дает обильный рост без образования пигмента. On potato slices gives abundant growth without the formation of pigment.

На мясопептонном бульоне на третьи сутки образует пленку без образования пигмента. On the meat and peptone broth on the third day forms a film without the formation of pigment.

Культура хранится на скошеном мясопептонном или картофельном агаре в пробирках при температуре от -2 до -4 градусов в течение 2 3 месяцев без пересевов или в лиофилизированном виде в ампулах в течение 1 2 лет. The culture is stored on beveled meat-peptone or potato agar in test tubes at a temperature of from -2 to -4 degrees for 2 3 months without reseeding or in lyophilized form in ampoules for 1 2 years.

Антагонические свойства. Antagonistic properties.

Подавляет рост грибов. Beaweria bassiana возбудителя белой мускардины. Gliocladium vide возбудителя виноградной гнили. Sclerotinia sclerotiorum - возбудителя белой гнили. Verticillium dahliae возбудителя вилта хлопчатника. Phytophtora infestans возбудителя картофельной гнили. Suppresses the growth of mushrooms. Beaweria bassiana of the pathogen of white muscardine. Gliocladium vide of the causative agent of grape rot. Sclerotinia sclerotiorum - the causative agent of white rot. Cotton swab pathogen verticillium dahliae. Phytophtora infestans potato rot pathogen.

Сильно подавляет рост гриба. Fusarium graminearum возбудителя корневой гнили злаков. Strongly inhibits the growth of the fungus. Fusarium graminearum of the root rot pathogen of cereals.

Штамм выделяет в среду комплекс неидентифицированных биологически активных веществ, обладающих противогрибковой активностью. The strain releases a complex of unidentified biologically active substances with antifungal activity on Wednesday.

Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов Hаучно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-6554. The strain was deposited in the Collection of industrial microorganisms of the Scientific Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms under registration number B-6554.

Преимущества предложенного штамма Bacillus subtilis В-40 перед наиболее близким его аналогом вытекают из приводимых в следующей таблице данных сравнительных испытаний этих штаммов. The advantages of the proposed strain of Bacillus subtilis B-40 over its closest analogue arise from the comparative tests given in the following table of these strains.

Кроме того, предложенный штамм, в отличие от известного, синтезирует рестриктазу Bam HI, которая используется в генной инженерии. In addition, the proposed strain, in contrast to the known one, synthesizes the restriction enzyme Bam HI, which is used in genetic engineering.

Более подробно сущность предложения поясняется нижеследующими примерами. The essence of the proposal is explained in more detail in the following examples.

Пример 1. Посевным материалом Bacillus subtilis В-40, полученным смывом культуры с косяка, засеяли жидкую питательную среду, содержащую (мас.) кормовые дрожжи (2,5) и кукурузную муку (1,5). Значение pH среды составляло 7,1. Example 1. The seed material Bacillus subtilis B-40, obtained by flushing the culture from the jamb, seeded with a liquid nutrient medium containing (wt.) Fodder yeast (2.5) and corn flour (1.5). The pH of the medium was 7.1.

Выращивание проводили в колбах на 250 мл, заполненных 40 мл среды, на качалке при скорости ее вращения 350 об/мин при температуре 37 градусов. Cultivation was carried out in 250 ml flasks filled with 40 ml of medium on a rocking chair at a speed of rotation of 350 rpm at a temperature of 37 degrees.

В процессе роста отмечались следующие стадии развития культуры:
прорастание спор 0,6 1,0 ч
вегетативный рост 1,0 10,0 ч
спорообразование 10,0 16,0 ч
созревание спор 16,0 24,0 ч
Полученная на 12 ч роста культуральная жидкость на 95% подавляла развитие тест культуры Phytophtora infectans шт. 216 и шт. 97
Пример 2. Ферментер, объемом 5,0 л был засеян посевным материалом Ваcillus subtilis В-40, полученным путем смыва 0,85% р-ром хлорида натрия культуры с агаризованной средой ("МПА" КА).In the process of growth, the following stages of culture development were noted:
spore germination 0.6 1.0 h
vegetative growth 1.0 10.0 h
spore formation 10.0 16.0 h
spore maturation 16.0 24.0 h
Obtained at 12 hours of growth, the culture fluid 95% inhibited the development of a test culture of Phytophtora infectans pcs. 216 and pcs. 97
Example 2. The fermenter, a volume of 5.0 l was seeded with sowing material of Vacillus subtilis B-40, obtained by washing 0.85% solution of sodium chloride culture with agar medium ("MPA" KA).

Ферментационная среда содержала (мас.) кормовые дрожжи 2,5% кукурузную муку 1,5 и воду. The fermentation medium contained (wt.) Feed yeast 2.5% corn flour 1.5 and water.

Выращивание проводили при температуре 37 + 1 градус и интенсивности аэрации 0,5 1,0 л воздуха/объем среды. Cultivation was carried out at a temperature of 37 + 1 degrees and aeration intensity of 0.5 to 1.0 l of air / volume of medium.

Длительность ферментации составила 16 ч. The fermentation duration was 16 hours.

Фильтрат культуральной жидкости на 90% подавлял развитие тесткультуры Phytophtora infestans. The filtrate of the culture fluid suppressed the development of test culture of Phytophtora infestans by 90%.

Предложенный штамм, исходя из его изученных свойств, может найти практическое применение в двух качествах:
как продуцент комплекса биологически активных веществ или индивидуальных компонентов этого комплекса, обладающих противогрибковой активностью в отношении ряда фитопатогенов;
как активный компонент биологических средств защиты растений, будучи включенным в состав этих средств для непосредственной обработки растений.The proposed strain, based on its studied properties, can find practical application in two qualities:
as a producer of a complex of biologically active substances or individual components of this complex, which have antifungal activity against a number of phytopathogens;
as an active component of biological plant protection products, being included in the composition of these funds for the direct treatment of plants.

Представленные результаты свидетельствуют о достаточно высоком уровне накопления предложенным штаммом субстанций с противогрибковой активностью и о возможности его успешного выращивания в производственных условиях. The presented results indicate a sufficiently high level of accumulation of the proposed strain of substances with antifungal activity and the possibility of its successful cultivation in production conditions.

Claims

The bacterial strain Bacillus subtilis VKPM B-6554 is a producer of a substance with antifungal activity.