PT98332B

PT98332B - Metodo para a producao de uma proteina biologicamente activa por processamento in vitro de proteinas de fusao

Info

Publication number: PT98332B
Application number: PT98332A
Authority: PT
Inventors: Jutta Heim; Kenji Takabayashi; Peter Seeboth
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1999-01-29
Also published as: AU8046391A; EP0467839A1; DE69121489T2; JP3140488B2; DE69121489D1; IE73209B1; NO303132B1; NZ238989A; ZA915579B; DK0467839T3; JPH04229188A; NO912803D0; FI913405A0; CA2047119C; CA2047119A1; SG49863A1; PT98332A; EP0467839B1; FI106720B; AU651830B2

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 98.332

REQUERENTE: ciba-geigy ag . , suiça, sede em Klybeckstrasse 141, 4002 Basel industrial, - SUIÇA com

EPÍGRAFE: METODP para a produção de uma PROTEÍNA

BIOLOGICAMENTE ACTIVA POR PROCESSAMENTO IN VITRO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO ' —. --

INVENTORES: JUTTA HEIM e KENJI TAKABAYASHI

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.® da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. 1 8 de Julho de 1990 sob o No.

9015825.4 no Reino Unido

-ϊ

CIBA-BEIBY AG

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ACTIVA POR PROCESSAMENTO IN VITRO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO”

MEMÓRIA DESCRITIVA

RESUMO

O presente invento dis respeito s um novo método para a produção ds proteina biologicamente activa, compreendendo o tratamento de uma proteina. de fusão consistindo ems

í. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo na. referida, proteína biologicamente activa, o aminoácido C~terminal do qual está ligado a uma sequência polipeptídica ligante L e um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido u-termi.” nsl dos referidos sucessivos seqmencos de proteína ou consistindo em

1. um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-térmi2. múltiplos segmentos sucessivos de proteína, cada um consistindo numa sequência polipeptidica ligante L e na referida proteína biologicamente activa» ί

com sndoprotea.se solúvel de solúvel de levedura yscói h i o1oq i oamente activa» levedura ysct s com Ca.r taoxipeptida.se e isolamento da referida proteína.

r ι

presente invente está relacionado com um método para a produção ds proteínas maduras através de um processamento in vitro das proteínas de fusão e com meios necessários para a ão íSb ta.is proteínas ds Tusáo»

A produção de proteínas farmaceuticamente aplicáveis ou erisimaticamente activas é uma área chave na industria da biotecnologia em rápido desenvolvimento» Desde o inicio da era da tecnologia de DNA recombinante foram expressas muitas proteínas heterólogas importantes em células hospedeiras procsrióticas e eucarióticas gue foram transformadas com vectores de expressão adequados contendo sequências ds DNA codificadoras da.s referidas proteínas. No entanto em muitos casos foram encontradas grandes dificuldades na produção ds quantidades suficientes de produtos puros. Frequentemente observa-se, especialmente no caso de proteínas de baixo peso molecular, que o produto é impuro devido á presença de quantidades variáveis ds produtos secundários degradas, principalmente degradados no extremo C, que baixam o rendimento e tornam díficil a purificação. Noutros casos o rendimento global na proteína pretendida não satisfaz e não pode ser significativamente aumentado pela modificação do processo Ce»g, escolha de vectores particulares e estirpes hospedeiras, condições de cultura). Ainda, a purificação de proteína não é uma questão trivial, Frequentemente, a mistura de isolamento primário contem apenas uma quantidade infima da proteína pretendida enquanto que as proteínas específicas do hospedeiro são as dominantes, ft separação destas proteínas específicas do hospedeiro ao mesmo tempo que se mantém a actividade biolóqica e a integridade estrutural da proteína pretendida pode causar graves problemas» dades referidas

Uma. abordagem conhecida para ultrapassar estas dificulé expressar a proteína pretendida, como uma proteína de fusão., i»e. ao extremo C ou. especialmente ao extremo N da proteína pretendida liga-se urn polipeptídeo estabilizador e/ou protector. Este polipeptídeo ê escolhido de acordo com os problemas a serem resolvidos tdegradação$ purzficaçso_? etc,) e do hospedeiro usado para a expressão da proteína de fusão, Tais proteínas de fusão mostraram-se eficazes na prevenção da degradação de proteínas pretendidas e na facilitação do processo de purificação,. Foram descritos numerosos polipeptídeos que foram usados como parceiros de fusão nas proteínas de fusão_s ver por exemplo H»M» Sassefeld₅ Trends in Bíotschnology 8,, 88-9.3 CÍ990>,

São exemplos de polipeptídeos a β-galactosidase, proteína A e cloranfsnicol-acetíItransferase» Tal como na maioria dos casos e por razões óbvias (antigénioidade etc,) a proteína de fusão não tem utilidade prática como tal e ê necessário remover o parceiro de fusão da proteína pretendida após expressão e purificação (como alternativa, a proteína de fusão pode ser uma outra proteína heteróloga e a separação conduz a duas proteínas pretendidas)» Isto è geralmente conseguido por meio de uma sequência de ligação que liga a proteína pretendida ao parceiro de fusão e contem um sítio ds clivagem que pode ser clivada selectivamente por meios químicos ou. enzimáticos, Tais sítios de clivagem incluem, por exemplo, um radical mstionilo que é susceptível de ser atacado com brometo de cianogénio, ou uma cadeia polipeptídica que inclui o radical tetrapeptidilo Asp—Asp-Asp—Lis que é clivado por enteroquina.se a seguir a L.is, é óbvio que tais subsequências de aminoácidos não devem ocorrer na superfície das proteínas pretendidas, Como a remoção conveniente do parceiro da fusão ainda é o problema mais significativo a ser resolvido existe uma necessidade de meios alternativos que permitam a libertação específica e suave da proteína pretendida do parceiro de fusão. Constitui um objectivo do invento proporcionar tais meios»

.A protease yscF (ou endoprotease codificada por KEX2) e a peptidass ysc# (ou carboxípeptidase codificada por KEXi> foram identificados como sendo responsáveis pela maturação do factor de conjugação íç na levedura para dar a feromona factor « maduro. A protease yscF é uma endoprotease ligada a membranas que é activa na gama de pH neutro e está complelamente dependente dos iSes Ca^J . Ela possuí perto do extremo C uma região hidrofóbica que foi identificada como sendo responsável pela ligação á membrana. A remoção deste domínio ds ligação à membrana dá um derivado de yscF solúvel que ainda retem a sua actividade enzimátics e especificidade, vis,·, clivagem no lado C-terminal de um par de aminoácidos básicos, tais como Lis-,Arg ou Arg-Arg Ec.f» R.S. Fui ler et al., Proc. Natl» Acad» Sei» USA 86, 1434-1438 (1989)3Por outro lado, a protease yscet é uma. carboxi-exopeptidase que é altamente activa nos aminoácidos básicos do extremo C (Arg, Lis) a um pH entre 6 e 7,5. Tal como yscF, yseu contem um segmento hidrofóbico de ligação a membrana na vizinhança do extremo C» A remoção deste domínio de ligação a. ffleínfarsns conduz a um derivado solúvel de ysca que retem actividade enzimática e especificidade

EA. Cooper e H. Bussey, Encontrou-se agora gue as

Mo1.Ce11. Biol.

(1989)3. poosm Vantajosa* _í..

mente ser usadas em combinação para, a preparação de proteínas maduras por processamento in vitro de proteínas de fusão cortadas adequadamente»

Assim, o presente invento diz respeito a um método para a produção de uma proteína, biologicamente activa compreendendo o tratamento de uma proteína ds fusão consistindo em

í. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada, um consistindo na referida proteína biologicamente activa cujo aminoácido do extremo C está ligado a um,a sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais e no l·

A* caso ds múltiplos segmentos sucessivos de proteína, também o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica ds liagação sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e ftrq, e

2» um polipeptidso ds ligação ligado ao aminoácido do extremo C dos referidos segmentos sucessivos de proteína, ou consistindo em

1. um polipeptídeo de de gação ligado ao aminoácido N-terminal

2. múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L o primeiro ε segundo resíduos de aminoácidos hl-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos da referida sequência polipeptídica ds liqação L sendo aminoácidos básicos ds referida sequência polipeptídica de ligação L sendo proteína proteína biologicamente activa, iqados a referida com endoprotsass solúvel de levedura yscF e com carboxípeptidase solúvel de levedura yscs e isolamento da referida proteína biologicamente activa»

A proteína de fusão pode ser representada pela fórmula

CF-L) -T m

T—CL—P) n

Cl) ou CU), em que P é a proteína biologicamente activa, L é uma sequência polipeptídica de liqação conforme definido atrás, T é um polipeptídeo de identificação,

m é um inteiro entre 1 e 10 e n é um inteiro entre 2 e lík

A proteína biologicamente activa pod π'ρ ser qualquer proteína de interesse biológico e de origem procariótica ou especialmente eucariótica, em particular de eucariotas superiores tais como mamíferos {incluindo animais e humanos), e é por exemplo uma. enzima que pode ser usada, por exemplo, para a produção de nutrientes e para a realização de reacções enzimãtica sem química ou biologia molecularou uma proteína que é útil e importante para o tratamento de doenças humanas e de animais ou para a sua prevenção, por exemplo um polipeptídeo hormona, com propriedades imunomoduladoras, anti-virais e anti-tumorais, um anticorpo, antigénio virai, factor de coagulação do sangue, um agente fibrinolítico, um factor regulador do crescimento, um .alimento e similares.

São exemplos ds tais proteínas e.g» hormonas tais como secretina, timosina, relaxina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona da partiróide, adrenocorticotropina, hormona estimuladora de melanócitos, β—1ipotropina, urogastrons, insulina, factores de crescimento, tais como factor de crescimento epidérmico CE6F), factor de crescimento tipo insulina (IGF), e.g. IGF-I e ISF-TI, factor de crescimento de mastócitos, factor de crescimento das células nervosas, factor de crescimento das células nervosas derivadas da glia, factor de crescimento derivado de plaquetas CPDSF) ou factor de crescimento transformante CTSF), como seja IGFfs, hormonas de crescimento, tais como hormonas de crescimento humanas ou bovinas, interleuquina, tais como interleuquina-í ou -2, factor inibidor da migração de macrófaqos humano CMIF), interferões, como seja interferão a humano, por exempla interferao-aA, aB, «D ou ah, interferão B, interferão gama ou um inter— ferão híbrido, por exemplo ura interferão híbrido «A-«D ou aB-aD,

espscialmente o interferão híbrido BDBB, inibi d ores ds proteína:omo -antitripsina, BLPI símilares.s antiqènio:

dí

S feito i-fetX vírus da hepatite5 tai nuoleóide do vírus da hepatite B ou antigénio do vírus da hepatite A ou antigénio da hepatite não A não B, activadores do plasminogénio, tsis como activador do plasminogénio tipo tecido, tais como K._,tuPA, psptídeo antieoagulanie de de carraças CTAP), factor it de necrose tumoral, somatostatina, rsnína, imunoglobulinas, tais como as cadeias leve e/ou pesadas da imunoglobulina D,· E ou G, ou imunoglobulinas híbridas humano-murganho, factores de ligação a imunoglobulinas, tais como factor dia ligação à imunoglobulina a calcitonina humana, factores peptídso relacionado

5ffi como sntigénio de superfície ou do t:.

coagulação do sangue, tais como factor J.X ou VIIlc, factor 4 de plaquetas, eritropoiatina, eqlina dessulfato-hirudina, como seja dessulfato-hirudina variante HVí, HV2 ou PA, corticostatina.

equistatina, cistatinas, superóxido dismutase humana, quinase virai, ii-lactama.se ou glucose-isomerase, São os qenes codificadores um interferão a humano e t1 m ϊ d i n a p referidos interferão tipo urocina.se de cadeia do plasminogénio híbrido dB ou interferão híbrido, particularmente interferão híbrido BDBB íver EP 205,404), activador do plasminogénio tipo tecido humano (t-PA), activador do plasminogénio simples humano (scu-PA), activador

K._>tuPA (ver EP 277,313) , factor ds crescimento tr-ansformante fí,

X.

calcitonina humana, factor de crescimento I e II tipo insulina e dessulfato-hirudina, e«g. variante HVí, As proteínas contendo um par de aminoácidos básicos, tais como Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e Arg-Lis, expostos na superfície da proteína e portanto susceptíveis è. clivagem proteolítica, não são adequados para o processo de acordo com o invento a terão de ser mutagenízadas de forma a que um dos aminoácidos. básicos constitutivos seja substituído por um outro aminoãcido não básico sem afectar a actividade biológica, Proteínas tendo um aminoãcido C—terminal básico que seja essencial para a actividade biológica não podem ser produzidos por um processa de acordo com o invento Cpois este básico ê removido pela yscd solúvel) a menos que um protector não básico seja adicionado ao extremo C de aminoácido aminoácido t a 4. s ρ r o t e χ

A sequência do polipeptídeo ligante L compreende entre 2 e cerca de 20 aminoácidos, especial mente entre 2 s 12 resíduos; de aminoácidos e contem um ou mais, especialmente 1 a 5, pares de aminoácidos; básicos, tais como Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis ou Arg-Lis, desde que nos compostos da fórmula I Cm>í> e II os primeiro e segundo resíduos; de aminoácidos N~terminais assim como o penúltimo e último aminoácidos do extremo C representem um par de amino,ácidos básicas enquanto que nos compostos da fórmula I Cm=l> basta que os primeiro e segundo aminoácidos M-terminais representem tal par de aminoácidos básicos. A escolha dos resíduos de aminoácidos qua ligam os pares de aminoácidos básicos e/ou união dos pares de resíduos de aminoácidos básicos ac; polipeptídeo etiqueta (cf. compostos da fórmula I com m—1) não é crucial, Por exemblo« qualquer um dos aminoácidos neutros codifidos geneticamente pode ser escolhido esta finalidade. A sequência de ligação mais simples L a um radical dipeptídilo seleccionado de entre Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e Arg-Lis,

Uma vec que a extensão de uma proteína de tamanha médio biologicamente activa demonstrou, influenciar de forma favorável a estabilidade, o polipeptídeo terminal T pode, em principio, ser qualquer polipeptídeo sintético imaginável ou qualquer polipeptítíeo natural ou parte dele. De preferência o polipeptídeo terminal T consiste em cerca de i© a csrca de 1000, em particular 30 a 30®, resíduos de aminoácidos e representa um polipeptídeo de tamanho completo que è bem expresso no hospedeiro usado para a expressão da proteína da fusão íver abaixo) ou uma parte dele, Se o principal objectivo for facilitar a purificação é preferível usar um polipeptideo etiqueta que seja susceptível a cromatografia de afinidade Co polipeptideo etiqueta é, per exemplo, reconhecido por um anticorpo monoclonal ou policlonal ou é ligado por um material específico como seja a celulose) ou cromatografia de permuta iónica

Co polipeptideo etiqueta compreende um grande A- í tais polipeptideos etiqueta incluem por exemplo, fosfatase ácida de levedura PH05, invertase de levedura ou carboxipeptida.se Y de levedura especialmente quando a levedura é usada como hospedeiro, polimerase do fago MS2, β—galactosidase ou fosfatase ácida de 1Ξ« coli especialmente quando E« coli é usada como hospedeiro, neomicina, fosfotransferase, desidrofolatQ--redu.ta.se, uma imunoglobulina ou uma lectina especialmente são usadas células hospedeiras de mamífero, também dessulfato—hirudina, eglina C, quimo— sina, interleuquina í, a proteína Exg de Cellulomonas fimi e similares, sendo também possível usar fragmentos destes polipep— txdeos»

De preferência m é um inteiro entre í e 5 e n é um inteiro entre

A endoprotease solúvel de levedura yscF e a carboxipeptidase de levedura yscn são muteínas de yscF e ds ysc« em que os sítios hidrofóbices de an.coraqem à membrana foram eliminados, A í»equ’sncxa de amxnoácidosda protese-s :F de Si4 resíduos conhecida de K„ liízuno st al. EBiochem,. Biophvs, Res,

Jommun=,

Ibò, 246-254 (1988)3,. 0 sítio de ancoragem à membrana esta situado na região Tir^{oz z} a Met^6<y9„ Nas endoproteases yscF solúveis de acordo com o invento o sítio de ancoraqem â membrana foi selectxvaraente removido e portanto o extremo C começando por exemplo no ssiincâcido 700 (Lis) ainda está presente ou todo o extremo C incluindo o sitio de ancoragem à membrana, i.e. 136 a aproximadamente 20® aminoácidos a nartir do extremo C foram removidos„ Tais muteínas de delação solúveis derivadas ds yscF estão descritas por exemplo em EP 327,-377 ou em E„S„ Fuiler et al,, (supra). A sequência de aminoácidos da peptidase de 729 resíduos ysc# é igualmente conhecida EA, Dmochowska et al,, Cell 50, 573-584 (1987)3, 0 sítio de ancoragem à membrana está situado na região Ala^- * a Tir^'” , Como atrás, na carboxipeptidase ysca solúvel de acordo com o invento o sitio de ancoragem à membrana foi selectivamente removido deixando portanto o começo do extrema C por exemplo no aminoácido 638 (Asp) iniaeto ou todo o extremo C incluindo o sítio de ancoragem à membrana, i.e, 93 a aproximadamente 110 aminoácidos a partir do extremo C, foi removido,. Uma dessas muteínas solúveis da carboxipeptidase ysca foi descrita por A. Coopere H, Bussey (supra),, A carboxipeptidase yscF solúvel preferida de acordo com o invento tem a sequência descrita na listagem de sequências em SEQ 1D N21 enquanto a carboxipeptidase ysca solúvel preferida tem -a sequência descrita na listagem de sequências em SEQ ID SMS2.

A dogestão das proteínas de fusão com yscF solúvel e ysco solúvel foi realizada usando condições que se sabe serem óptimas para yscF e ysca, i.e. numa solução tamponada a um pH entre cerca de 6,0 e cerca da 7,5, de preferência a cerca de 7,0 numa gama de temperaturas entre cerca de 25‘^:‘C e cerca de 37^;:;C e durante cerca de 1 a 4 horas, de preferência até a digestão estar completa conforme avaliado pelo controle por HPLC. Como yscF é fortemente dependente da iSes Ca^⁴, um sal de cálcio, como seja cloreto de cálcio, é adicionado á mistura de digestão. As proporções molares da proteína de fusão: vscF solúvelsysca solúvel na qama de 1:1:1 ,-,4 ,

2+ na gama de ©,ímM a 1© mrf= Facultativamente, pode ser adicionado Lima concentração baixa (<1X> de Lim detergente ruão iónico, como seja Triton X—IGO, pois sabe-se que yscF pode assim ser activado. A proteína da fusão pode ser tratada com uma mistura de digestão •i ~·

contendo yscF e ysca solúveis ou a proteína de fusão pode ser primeiro tratada com tempo suficiente ou p re f e r's'n cia ι n passo de digestão.

:-í_í Sw a iúve s quando digestão decorreu o está completa, então com ysca solúvel, de i.s= sem isolamento do produto do primeiro

A proteína biologicamente activa pode ser isolada a partir da mistura de digestão usando meios convencionais. Passos incluem, por exemplo,, remoção do sal, tais como cromatografia de permuta filtração em gel, cromatografia de de purificação adequadas processos c ramafcog réf icos iónica, cromatografia de partição, HPLC, HPLC em electroforese em qel, electroforese sem veículo, cromatografia de afinidade como seja cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais acoplados a uma matrix insolúvel s similares, ou qualquer combinação destes.

No caso da proteína pretendida não -assumir a estrutura tridimensional correcta devido por exemplo, a uma formação incorrecta de pontes dissulfureto Cse estiverem presentes resíduos císteina), pode ser necessário solubilizá-la em condições que sejam adequadas à sua manutenção numa forma desnaturada e subsequentemente realizar o enrolamento com concomitante formação de ligações dissulfureto Cse estiverem presentes resíduos císteina). São conhecidos métodos adequados para um grande número de proteínas. De outra forma é necessário adaptar métodos conhecidos aos problemas-; específicos encontrados.

Conforme referido atrás algumas muteínas solúveis de delação de yscr e ysca são conhecidas da literatura. Outras muteínas de deleção de accrdo com o Invento podem ser preparadas usando métodos conhecidos, ρο-r exemplo através da preparação ds um DIMA correspondente codificador da referida muteína, sua inserção num DNA vector adequado sob o controle ds uma sequência

da contraia da expressão, transformação de microorganismos hospedeiros adequados com o vector de expressão formado, cultura da microorganisma hospedeiro transformado num meio de cultura adequado e isolamento da muteína produzida» 0 DNA codificador ds qualquer uma das referidas muteínas pode ser produzido por exemplo, usando um plasmídeo contendo o DNA codificador de yscF (KEX2) ou ysca (KEX1) e i» digerindo-o com uma enzima de restrição que cliva dentro do DNA da região codificadora do sítio de ancoragem á membrana ou 3’ relativamente a ela (por exemplo EcoRI, BstXl ou NarI no caso ds KEX2 e HgiAI, Taqll ou Ciai no caso de KEXi), digestão do DNA clivado com uma endonuclease de restrição adequada, por exemplo Bal3í, de tal forma que a referida região do DNA é removida e dá-se a recircularização do plasmídeo linearizada por ligação dos extremos cerses ou similares, ou 2» escolhendo ou criando (por exemplo por mutsgénese dirigida) um sítio de restrição 5’ e um sítio de restrição 3’ relativamente ao

DNA da região codificadora d-o sítio de ancoragem à membrana (por exemplo PvuII e NarI ou EcoRI no caso de ΚΞΧ2, Xhcl, Stul ou Xcal no caso de KEX1; o sítio de restrição 3⁵ pode também estar situada dentro do plasmídeo adjacente ao sinal de paragem da tradução do gene KEX2 ou KEX1), digerindo o plasmídeo com duas enzimas de restrição que reconhecem os referidos sítios de restrição e recircularizaçãodo plasmídeo linearizado por ligação de extremos cerses ou similares, ou 3. deleção do DNA da região codificadora do sitio de ancoragme à membrana usando mutagênese por remoção de ansas ou 4» eliminando totalmente o extremo C por digestão com PvuII no caso de KEX2 e com Xhol, Stul ou Scil no caso de KEXl, respectivamente e recircularização do plasmídeo linearizado por ligação de extremos cerses ou similares» Como as sequências de DNA KEX2 ε KEX1 são conhecidas íf<» Mizumo et al»,, A» umochow-ska et al., supra) pode—se projectar facilmente um oiigonucleótido mutagênico adequado e usado para eliminar a referida região do DNA aplicando o sistema de clonagem em M13.

Deve-se tomar cuidado para que os genes KEX2 é KEXí muta.genizados incluam um sinal de paragem da tradução ÍTAA., TAG ou TGAl- Se necessário, tal sinal de paragem pode ser introduzido no lugar pretendido através de um DNA adaptador sintético ou pode ser proporcionado por DNA vector adjacente- Assim, os genes KEX e KEX1 podem incluir nos seus extremos 3⁵ codSes derivados do DNA vector que codificam alguns Ccomo seja 2 a 2©> aminoácidos adicionais no extrema C das muteínas solúveis de yscF e yscce. Todos estes métodos utilizam técnicas convencionais.

□

Preparação da proteína de fusão

As proteínas de fusão de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo a cultura de um hospedeiro transformado em condições que permitam a sua expressão e isolamento da proteína de fusão- Mais especificamente, os compostos pretendidos são produzidos por

a) obtenção de um vector de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência ds DNA codificadora da referida proteína de fusão.

b) transferência do vector recipiente, ds expressão para um hospedeiro

c) cultura do hospedeiro transformad a expressão da proteína de fusão e em condiçSes que permitam

d) isolamento da proteína de fusãoproteínas de cutidos mais

Os passos envolvidos na prep.

fusão pela técnica de DNA recombinante

ação das serão dis detalhadaments abaixo.

Vectores de expressão invento está relacionado com vectores de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína de fusão consistindo em 1. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminaí está ligado a uma sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N~terminais e no caso de múltiplos segmentos de proteína sucessivos, também o penúltimo s o último resíduos de aminoácidos da referida sequência do polipeptídeo de ligação sendo aminoácidos básicas seleccionados entre Lis e Arg e 2„ um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal doCs) referido(s) segmentais) sucessivoís) de proteína ou consistindo em i« um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de 2» múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminsis assim como os penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica de ligação Lsendo aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e Arg e os últimos aminoácidos básicas da referida sequência polipeptídica de ligação L estando ligados à referida proteína biologicamente activa e um método para a sua preparação.

:assets de expre pode ier epresen tada pela fórmula

em que Pr é a sequência de controle ds expressão, S é uma ligação ou. representa uma sequência ds DNA codificadora ds um peptídeo sinal, Dp representa uma sequência de DNA codificadora de uma proteína biologicamente activa, ê uma sequência de DNA codificadora do polipeptídeo de ligação L em que o primeiro e segundo codSes adiacentes ao extremo 5’ de D_s_. e, se m for diferente de 1, também o penúltimo e último codSes -adjacentes ao extremo 5’ de Decodificam aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e Arg, Dy representa uma sequência ds- DNA codificadora de um polipeptídeo etiqueta e T representa uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição, em que S, D_p, D_{ e mesma grelha de leitura em é um inteiro de í a ~í ormu 1 a estão uu pela

P r-S- C D_-D, “D-,) -T T L F n

CIv) em qu.e P.

r·'

Dy, Ep ^s T têm o significado atribuído atrás e em que b, i,y, inteiro de 2 a ÍS

D.

D, e Dp estão na mesma grelha de leitura e n é um kj bao preTerias sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal as construções em que b representa uma

A selecção do vector depende das células hospedeiras que são usadas na transformação. Em principio, são adequados todos os vectores que se repliquem e expressem o gene de acordo com o inventa no hospedeiro escolhido. SSo exemplos ds hospedeiros adequados procariotas e eucariotas, os quais não possuem ou têm poucas enzimas de restrição ou enzimas de modificação e que não têm actividade yscF ou relacionada, com yscF, como sejam bactérias, por exemplo Escherichia coli ou Bacillus subtil is.

X

leveduras, par exempla Saccharomyces cerevisiae, especialmente mutantes kex.2 e ainda células de mamífero em particular linhas estabelecidas de células humanas ou animais, e.g, células de mieloma, fibroblastos de pulmão embrionário humano L-Í32, células L.TK de murganho, células humanas do melanoma maligno de Bowes, células HeLa, células de rim do macaco verde africano COS-7 transformadas com o vírus SV40 ou células de ovário de hamster chinês ÍCHD) e suas variantes, As células de ovário de hamster chinês e estirpes de E, coli e de Sacc haromyces cerevisiae são as preferidas como microorganísmo hospedeiro.

Vectores usados em levedura e em E. coli.

São exemplos de vectores adequados para a expressão do gene da proteína de fusão numa estirpe de E. coli bacteriofagos, par exempla derivados do bacteriofaga lambda ou plasmídeos tais como o plasmídeo coíEí e seus derivadas, por exemplo pMB9, pSF2124, pBR317 ou pBR322» Vectores adequadas contêm um replicão completo e um gene de uma marca., a qual torna possível a selecção e identificação dos micoarganismos transformados pelos plasmídeos CíG θ .--i pC&cõcõêlO pOv~ iT:^!32.Q O cê LííBê?. Co.CêíC terística fenotípica, Genes de marcas adequadas conferem ao microorganísmo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos tais como ampicilina, tetraciclina e similares.

Podem ser usadas várias sequências de controle da expressão P . .

r para a reguiaçâo da cassete oe expressão em fcx—ep~íi.

São usados especialmente promotores de genes fortemente expressos, São promotores adequados os promotores lac, tac, trp e Ipp, ainda os promotores N e pL do fago lambda e outros. No presente

PL, trp s lac,

Vectores adequados para replicação e expressão em

W p uma que cerevisiae contêm uma origem de replicação de levedura, e marca genética selectiva para Isvedura. Os vectores híbridos contêm uma origem de replicação de levedura, por exemplo o segmento de replicação autónoma cromossómico ÍARS) sSo retidos fora, do cromossoma dentro da célula de levedura após transformação e são replicadas autonomamente durante a mitose» Também podem ser usados os vectores híbridos que contêm sequências homólogas do DNA do plasmídeo 2 μ de levedura ou que contêm ARS s uma sequência, de um centrómero, por exemplo CEN4« São genes de marcas adequadas para levedura especíalmente os que conferem resistência a. antibióticos ao hospedeiro ou no caso de mutantes auxotróficos de leveduras, genes que complementem as lesSes do hospedeiro» Genes correspondentes conferem por exemplo resistência ao antibiótico ciclo-heximida. ou proporcionam prototrofia. num mutante auxotrófico de levedura, por exemplo o gene URA3, LEU2, HIS5 ou TRP1„

De preferência, os vectores híbridos de levedura contêm uma origem de replicação e um gene de uma marca para um hospedeiro bacteriano, especialmente E» coli, de forma que a construção e a. clonagem dos vectores híbridos © seus precursores pode ser rea. 1 içado ©m E„ coli, As sequências Pr de controle da expressão adequadas à expressão em levedura. s-So, por exmplo, as do gene CYC1, GAL1/10 ou PHQ5 e também promotores envolvidos na qlicóli— se, por exemplo o promotor GAP -C incluindo GAP truncado em 5*), ainda o promotor do factor <a e os promotores híbridos, tais como promotores híbridos ΡΗ05-ΘΑΡ»

Α sequência de DNA codificadora de ura peptídeo sinal S (sequência sinal) deriva de um gene do hospedeiro microbiano codificador de um polipeptídeo que geralmente é secretado» Quando se usa E, coli como organismo hospedeiro pode ser escolhida a sequência sinal de ompA, Ipp, proteína de ligação à maltose, receptor de lambda,, fosfatase ácida ou fl-í actamase»SSo sequênciassinal S adequadas para usar com leveduras, por exemplo, as sequências sinal e prepro dos genes da invertase de levedura, fe-romona peptidase (KE.X1), toxina, assassina e fosfatase ácida reprímivel (PH05), a sequência líder do factor a e a sequência sinal da glucoamila.se derivadas de Asperqi 11 uzs awam-or i» Como alternativa, podem ser construídas sequências sinal fundidas através da ligação de parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligado ao promotor usado (por exem o 1 oF‘HD5), com parte da sequência sinal da proteina biologicamente activa. (se presente)» São favorecidas as combinações que permitam uma clivagem precisa entre o peptídeo sinal e a sequência de aminoácidos da proteína de fusão»

A sequência de DNA contendo sinais de terminação da. transcrição T é preferencialmente a sequência delimitante 3^?de um gene derivado do hospdeíro microbiano seleccionado que contem sinais adequados para a terinação da transcrição» São sequências delimitantes 3^? adequadas as do gene naturalmente ligado ao promotor usado»

Vectores para usar em células de mamífero

Os vectores para replicação s expressão em células de mamífero são frequentemente proporcionados com DNA de origem virai, e«g = derivado de vírus símio 4© (SV4©)« vírus do sarcoma de Rous í RSV) mutante BK do

, adenovirus 2, vírus do papiloma papovavírus CBKV) ou ou citomegalov bovino CBPV), írus de murganho ou humano C11CMV e HMCV, respecti .mente),

Sequências- Pr de controle ds expressão que são adequadas para usar εηι células de mamífero incluem, inter alia, os promotores precoce s tardio do SV40, o principal promotor tardio do adenovírus, o promotor do gene da metalotioneina siurina e a região do potenciador-promotor do principal gene precoce imediata do citoroegalovírus humano, a região do potenciador—promotor da imunoglobulina humana, o promotor da a-globina humana facultativaments combinado com o potenciador do SV40 e promotores derivados de genes do choque térmico, As sequências sinal S para usar em células de mamífero são, por exemplo, as sequências sinal derivadas da hemaglutinina da sulina.

Tuenza, t-PA humano e prepro-in-

Senes de marcas adequadas para células de mamífero são por exemplo os genes neo e ble do trasnposão TnSque conferem resistência ao antibiótico 8418 e a antibióticos do tipo bleomicina, respectivamente, o gene de E, coli que altera o fenótipo de células DHFR para células DHFR' e/ou confere resistência ao metotrexato e o gene da timidina quinase do vírus herpes simplex que torna as células TK em células fetotipicamente TK⁺„

De preferência os vectores híbridos para as células de mamífero contêm contendo sinais ρα11aden iIação a região -5^? não traduzida de um gene de mamífero para uma. terminação correcta da transcriçãoe ÍT), como seja a região flanqueanie 3’ do gene da {1-globina, Com vantagem, codificadora do polipeptídeo tendo sinais de splicing adições são necessárias pois as regiões flanquesntes da região incluem um ou mais intrões nativas adequados nos seus extremos. Tais os cDNAs e DNAs procarióticos tais

corno os gs?nes de selecção referidos atrás geral mente não possuem tais sinais de transcrição e processamento»

De referência, tais vectores contêm uma origem ds replicação e um gene ds resistência a antibióticos para a propagação em E. coli» Uma origem de replicação de mamífero pode ser proporcionada pela inclusão na construção do vector uma origem eucariótica, como seja a derivada de SV40 ou de uma outra fonte virai ou pode ser proporcionada pelo cromossoma da célula hospedeira quando da integração do vector no cromossoma da célula hospedeira.

As sequências de DNA Dp e Dy codificadoras da proteína biologicamente activa e o polipeptídeo etiqueta são conhecidas, ou casa não α sejam podem ser deduzidas de sequências de aminoácidos conhecidas e produzidas por via. sintética, aplicando métodos conhecidos per se» A sequência de DNA D₍ codificadora do polipep— tídeo de ligação L é de preferência uma sequência de DNA sintética contendo um ou mais pares, aminoácidos básicos conforme descrito atrás e são preparados sintéticamente usando métodos de síntese convencionais»

Na cassete de expressão de acordo com o invento as às sequências codificadoras e Dy são ligadas outras numa grelha de leitura ininterrupta começando com um ATS no extremo 5^? e terminando com um sinal de paragem da tradução (TAA, TAS ou TSA) no extremo 3’. As sequências codificadoras S-íD_p-D_L-Dy>_ffl e S-(D_T-D_L-Dp)_n estão operacionalmente ligadas à sequência de controle da expressão Pr.

Os vectores de expressão de acordo com o invento são sreparados por métodos conhecidos aplicam :do térn nnvsanr · expressão (preparada previamente) como tal ou os componentes da cassete ds expressão sucessivamente na ordem predeterminada ao

DNA vector» Os componentes dos vectores de expressão são ligados através de sítios de restrição comuns e/ou por meio de moléculas sintéticas de ligação e/ou por ligação de extremos cerses»

Hospedeiros transformados

Um outro aspecto do presente invento envolve células hospedeiras transformadas com um vector de expressão compreendendo uma cassete de expressão contendo uma sequência de DNA codificadora de uma proteína ds fusão consistindo em í = um ou mais segmentos ds proteína sucessivos cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminal está ligado a uma sequência polipeptídica de ligação L o primeiro e segunda resíduos de aminoácidos M-terminais e no caso de múltiplos segmentos de proteína sucessivos, também os penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência de ligação L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e 2» um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos de proteína sucessivos- ou consistindo em 1» um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de múltiplos segmentos de proteína sucessivos de 2» cada um deles consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L cujos primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C—terminais da referida sequência polipeptídica de ligação L são aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e o último aminoácido básico da referida sequência de ligação L f efef iua pr>_jte5.na biologicamente activa e um preparação» estando ligado à método para a sua

São exemplos de hospedeiros adequados incluindo hospedeiros procarióticos ’ e eucarióticos os especificados atrãs. 0 método para a preparação de células hospedeiras transformadas compreende a transformação de células hospedeiras com o vector de expressão atrás referido,

A transformação das células hospedeiras procarióticas é conseguida por métodos conhecidos» Por exemplo, a transformação de levedura com os vectores híbridos pode ser conseguida de acordo com o método descrito por Hinnen et

CProc» Natl

Acad, Sei, USA 75, Í9Í9 (1978)3. Este método pode ser dividido em três passos s íi> Remoção da parede celular de levedura, ou partes dela» (2) Tratamento das células de levedura “nuas” (esferoplastos) com o vector de expressão na presença de PESípolíetilenoglicol) e 04iSes Ca » (3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada sólida de aqar»

A introdução de vectores de expressão em células de mamífero é feita por transfecção na presença de compostos auxiliares, e.g, dietilaminodextrano, dimetilsulfóxido, glicerol, políetilenoglicol ou. similares ou como coprecipitados do DNA vector e fosfato de cálcio» Outros métodos adequados incluem microinjecção directa do DNA vector no núcleo celular e electropo ração, i.e. a introdução de DNA através de um pequeno pulso eléctrico que fas aumentar a permeabilidade das membranas celulares» A selecção subsequente das células transfectadas pode ser feita usando uma marca selectiva que está covalentemente integrada no vector de expressão ou é adicionada como uma entidade separada» As siiarcss selectivas incluem genes que conferem

resistência a antibióticos ou. genes que complementem uma lesão genética da célula hospedeira (supra)os v© ί=?Χ©5Πρ

A transformação ds estirpes hospedeiras bacterianas com ctores de expressão de acordo com o invento é realizada, por lo, como descrito na literatura para B- subtil is CAnagnosto-

poulos et al», J. Bacteriol- 81, 741 (1961)3 e E- coli EM» Mandei et al», 3- Mol» Biol- 53, 159 <1970)3» O isolamento das células hospedeiras transformadas é efectuado com vantagem a partir de um meio nutritivo selectivo ao qual foi adicionado, por exemplo, o biocida contra o qual a marca genética contida no plasmídeo de expressão confere resistência» Se por exemplo, os· vectoresR híbridos contêm o gene amp , adiciona-se pois ampicilina ao meio nutritivo» As células que não contêm o vector híbrido são destruídas em tal meio.

Cultura de células hospedeiras transf ormad-as invento diz ainda respeito a um método para a produção de uma proteína de fusão consistindo em 1 - um ou mais segmentos de proteína sucessivos- cada um deles consistindo numa proteína biologicamente activa cujo aminoácido C-terminal está ligado a

uma sequência	ρο 1 i. pep t í d ic a	de ligação L	o	primeiru e
resíduos de	aminoácidos N-	terminais e	no	caso de
segmentos de	proteína suces	sivos, também	os	penúltimo ;
resíduos de	aminoácidos C-	terminais da	ref	erida sequ'

último :ia de ligação L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e 2- um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos de proteína sucessivos ou consistindo em 1« um polipeptídeo etiqueta, ligado ao aminoácido FM-terminal de múltiplos segmentos de proteína sucessivos de 2« cada um deles ϊ

consistindo numa sequência polipeptídica de ligação L cujos primeiro e segundo resíduos de aminoãcidos N-terminais assim como o penúltimo e último resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica de ligação L são aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg e o último aminoácido básico da referida sequência de ligação L estando ligado á referida proteína biologicamente activa, caracterizado por serem cultivadas em condições nutritivas adequadas células hospedeiras contendo um vector de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificadora da referida proteína de fusão e isolamento da referida proteína da fusão.

As células hospedeiras transformadas foram cultivadas por métodos conhecidos num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos. Podem ser usadas várias fontes de carbono para a cultura das células de E. coli e de levedura transformadasde acordo com o invento. São exemplos de fontes de carbono preferidas os açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose, ou um acetato, o qual pode ser usado por si só ou em misturas adequadas. São exemplos de fontes adequadas de azoto os aminoãcidos, tais como casaminoácidos, peptídeos e proteínas e seus produtos de degradação, tais como triptona, peptona ou extractos de carne, extractos de levedura, extracto de malte e também sais de amónio, por exemplo cloreto, sulfato ou nitrato de amónio, os quais podem ser usados por si sós ou em misturas adequadas. Os sais inorgânicas que também podem ser usados são por exemplo sulfatos, cloretos, fosfates e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. 0 meio contem ainda, por exemplo, substâncias promotoras do crescimento, tais como micronutrientes, por exemplo ferro, zinco, manganês e similares e preferencialmente substâncias que exercem uma pressão selectiva e evitam o crescimento das células que perderam o plasmídeo de expressão. Assim, por exemplo, se uma

estirpe de levedura que é auxotrófica, per exemple num aminoácido essencial, fôr usada como microorganismo hospedeiro, o plasmídeo preferencialmente contem um gene codificador de uma encima que complementa o defeito do hospedeiro, A cultura da estirpe de levedura é realizada num meio mínimo deficiente no referida aminoácido.

A cultura é realizada por processos que são conhecidos. As condições de cultura, tais como temperatura, valor do pH do meio e tempo de fermentação, são escolhidos de modo a obter-se um título máximo das proteínas do inventa. Assim, a estirpe de levedura è preferencialmente cultivada em condições aeróbicas em cultura submersa com agitação a uma temperatura de aproximadamente 2© a 40°C, de preferência a cerca de 3©*C e a um valor de pH entre 5 e 8, de preferência a cerca de pH 7, durante aproximadamente 4 a 3© horas, de preferência até se obterem rendimentos máximos das proteínas do invento, As células de mamífero são cultivadas em condições de cultura de tecidos usando meios comerciais facultativamente suplementados com substâncias promotoras do crescimento e/ou soros de mamífero. As células foram cultivadas ligadas a um suporte sólido, e,g, um microveículo ou fibras de vidro poroso ou livres em vasos de cultura adequados, 0 meio de cultura é seleccionado de forma a que seja exercida pressão selectiva e apenas sobrevivam as células que contenham o DMA do vector híbrido incluindo a marca genética, Assim, por exemplo, adiciona—se um antibiótico ao meio quando o vector híbrido inclui o correspondemte gene de resistência a antibiótic os»

Quando a densidade celular atingiu um valor suficiente a cultura é interrompida e isolada a proteína, Se a cassete de expressão compreender uma sequência sinal a proteína de fusão pode ser secretada para o meio, 0 meio contenda o produto é

separado das células ás quais pode ser fornecido mais meio fresco para serem usadas na produção contínua» Quando se usa células de levedura ou células de E» coli a proteína pode acumular-se dentro das células, espeeialmente no espaço peripl&smático» Neste último caso o primeiro passo para a recuperação da proteína de fusão consiste na libertação da proteína a partir do interior da célula» A parede celularé primeiro removida por digestão enzimática com glucosidases (supra) ou como alternativa, a parede celular é removida por tratamento com agentes químicos, i.e» reagentes de tiol ou EDTA, os quais danificam a parede celular permitindo que a proteína produzida seja libertada» A mistura resultante é enriquecida na proteína de fusão por meios convencionais, como seja a remoção da maior parte do material não proteico por tratamento com polietileneimina, precipitação das proteínas usando sulfato de amónio, electroforese em gel, diálise, cromatografia, por exemplo, cromatografia d© permuta tónica (espeeialmente preferido quando o polipeptídeo etiqueta da proteína de fusão inclui um grande número de aminoácidos ácidos ou básicos), cromtaografia de exclusão por tamanho numa coluna de R

Sephadex ' ou similares» A purificação final do produto pré—purificado é conseguida por exemplo por meio de cromatografia de afinidade por exemplo por cromatografia de afinidade com anticorpos, espeeialmente cromatografia de afinidade com anticorpos usando anticorpos fixados a uma matrix insolúvel através de métodos conhecidos, anticorpos esses que reconhecem por exemplo epitopos situados dentro do polipeptídeo etiqueta da proteína de fusão» □ invento diz ainda respeito a proteínas de fusão de acordo com o invento per se que são importantes para a produção de proteínas biologicamente activas in termediários

□ invento diz respeito especialmente a vectores de expressão, aos hospedeiros transformados, às proteínas de fusão e aos métodos para a sua preparação de uma proteína biologicamente ac e ao método para a preparação iva como descrito nos exemplos..

Os -exemplos que se seguem servem para ilustrar o invento mas não devem ser pensados como limitantes do mesmo»

Exemplo í s Construção de um gene KEX encurtado codificador da variante solúvel de yscF gene KEX2 de levedura codifica uma endoprotease designada yscF, a qual é uma proteína ligada à membrana localizada no aparelho de Bolgi» A proteína yscF consiste num domínio catalítico N-terminal um íomínio rico em Ser/Tre, uma domínio que atravessa a membrana e uma cauda C—terminal responsável pela localização no Golgi da proteína yscF» A enzima mutante yscF sem 2®<3 aminoácidos C— terminais, incluindo o domínio rico em Ser/Tre, a cauda C-terminal ainda mantém actividade de protease CFuller Acad» Sei» 86, 1434-1438, Fuiler et

482—4853. Para se ter uma actividade construiu-se um gene mutante KEX2 sem 6O0 pb, codificador dos 200 aminoácidos C—terminais» D pene truncado está sob o controle do o domínio que atravessa a membranan e ef al», 1989, Proc» Natl» al», 1989, Science 249, de protease yscF solúvel, promotor KEX2 indo desde

-502» A tradução terminou num codão de paragem CTAA5 derivado do poli-adaptador de pUCIS,

Detalhadamente, o plasmídeo pUC19 CBoehringer Mannheim GmbH, FRB'1 foi digerido totalmente com HindiII e isoado o fragmenta de 2686 pb» £3s extremos foram preenchidos e o fragmento religado» Uma amostra da mistura de liqação foi adicionada a células das com E» coli competentes cálcio Elnv resistentes

para a transformaç trogen, San Diego, á ampicilina foram

So de E» coli JM101 trataUSAI» 12 transformantesds cultivados na presença de

100 pg/ml	de-	ampicilina. 0	DNA de plasmídeo	foi	preparada
analisado	por	digestão com	HindiII assim como	com	Bam Hl»	0
plasmídeo	sem	o sítio Hindi11	foi designado pUCí	9woH„

pb de KEX2 (obtido a > foi dotado nos dois uma digestão completa

Um fragmento BalI-AhaIXI de 3207 partir ds DNA genómico total de levedura extremos com adaptadores BamHI seguido de com BamHI» 0 plasmídeo pUC19woH foi totalmsnte cortado com BamHI, o fragmento linear ds 26-90 pb foi isolado s ligado ao fragmento BamHI de KEX2 como descrito atrás» Uma amostra da mistura de células E»_coli JM1O1» 12 cultivadas ligação foi usada parai trtansformar colónias transformadas resistentes à ampicilina foram em meio LB contendo ampicilina í100 pg/ml?, o DNA de plasmídeo foi extraído e analisado por digestão com BamHI» Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e designado pKS3@lb„ □ vector 2gm de levedura pAB24 que corresponde essencial mente ao plasmídeo pDP34 foi cortado totalmente com BamHI e o fragmento linear de pAB24 foi isolado» 0 plasmídeo pKS301b foi digerida com BamHI e o fragmento contendo o gene KEX2 completo foi isolado e ligado ao vector de levedura linearizado pAB24» Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar colÍJM101 e o DNA de plasmídeo de doze clones positivos examinado por digestão com BamHI» Um clone com restrição esperados foi referido como pAB226«

E»_ foi de js fragmentai plasmídeo pKS301b foi Pvu.II e Seal» 0 fragmento Sphl sequências de KEX2 desde -502 digerido totalmente com Sphl, Pvull de 2,37 Kb contendo as até -1-1843 a uma parte do poli--adaptador foi isolado» 0 plasmídeo pUCIS CBoehringer Marinheira, FRB3 foi totalmente cortado cora Sphl e Sraal. 0 fragmento Sphl-Smal de 266© pb do pUCÍS foi ligado ao fragmento Sphl-PvuII ds 2,37 Kb do K.EX2 por ligação Sphl/Sphl e PvulI/Sma. A ligação PvuII/Sraal resulta na fusão da ORF nas sequências ds pUCIS que codificam mais 7 aminoácidos do extremo C C-S-V-P-S-S-N-S) e é seguida de um codão de paragem CTAA)= Uma amostra da mistura de ligação foi usada para transformar E» coli JM101» 0 DNA de plasmídeo foi isolado a partir das colónias transformantes resistentes à ampicilina e analisado por digestão com Sphl e EcoRI assim como HindIII» Um clone com o padrão de restrição esperado ê referido como plSkexp» Na listagem de sequências SEO ID NS í está apresentada a ORF codificadora de yscF solúvel com DMA derivado de KEX2» plasmídeo plSkexp foi totalment® cortado com PvuJI, Sall e Seal» Isolou-se o fragmento SalI-PvuII de 2552 pb contendo as sequências KEX5 que vão desde -502 até *1843 assim como 2Oó pb das sequências de pUCÍS» 0 plasmídeo pDP34 foi digerido com BamHI e os extremos do plasmídeo linearizado foram preenchidos» Após inactivação da polimerase de T4 o plasmídeo linearizada e preenchido foi cortado com Sall e isolado o fragmento ds íí»7S Kb» Q fragmento BamHIf— Sall foi ligado ao fragmento Sall—Pvu.II de 2552 pb por ligação Sal.I//SalI e BamHIÍ/PvuII CBamHI&s BamHI preenchido)» Uma amostra da mistura de ligação foi usado para transformar células competentes de E» coli JMÍ01» 0 DMA ds plasmídeo foi extraído a partir das células resistentes à ampicilina e analisado por análise de restrição com Sall, Ncol, Smal, Xbal, EcoRI» Um clone com cs fragmento de restrição esperados foi designado pDPkexp»

Exemplo 2s Ensaio da actividade de sndoprotee.se

As células foram cultivadas como descrito no Exemplo 3. Q caldo de cultura foi centrifugado e separado em células e meio de cultura» A actividade de endoprotea.se foi determinada no meio de cultura, na superfície de células intactas e em células ”permeabili2®das“. As células foram lavadas uma vez com um volume de ©,2M HEPES (ácido 4~í2-Hidroxietil)-piperasina-í-etanossulfónico) pH 7,0 e resuspsnso em um volume de €*,2M HEPES pH 7,0 para medição em células intactas cu ressuspensas em 0_S2M HEPES contendo 0,1% Triton X-100 para produzir células permeabilizadas. A actividade de endopratease foi medida como se segues pl de mistura de ensaio í=,2M HEPES pH 7,0, 1 mMCaCl^, 0,5 mM

PMSF Cpara medição da actividade de células permeabiliçadas contendo 0,1% Triton X-1&03) foi incubado com 50 μΐ de amostra a

37'^:’C durante 2 minutos e determinou-se espectrofotometricamente o _m durante este período de incubação» Mão se aumento de Af405nm observou alteração de Α_ΛΛβ.„ durante esta pré-incubação sem 4v?5nm substrato» A reacção foi iniciada pela adição de substrato· C50 μΐ de benci1ox icarboni1-L-1i rosi1-L-1isi1-L-arginina-4-πi troanilida mM, Bachem, Bubendot

Switzerland) e um aumento da

A. .-_<Γ- foi 405nm anotado para cálculo da actividade de endopratease» 1U de actividade de endoprotease é definida como 1 ymole de 4—nitroanilida produzida por minuto nas condiçSes de ensaia descritas» Cerca de 90‘X da actividade de yscF foi encontrada no meio de cultura»

Exemplo 3; Transformação de S« cerevisiae estirpe ABilO

Saccharomyces cerevisiae es transformada com os plasmídeos pDP34, protocolo de transformação descrito tirpe ABI10 CAlDj 20/96Ϊ foi pAB22ó s pDPkexp usando o por Dohmenet

ECurr

•ΖΑ·

Genet, 15, 3ί9--3253« As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura suplementado com uma mistura de aminoácidos/nucleótidos deficiente em uracilo (mistura de aminoácidos/nucleótidos suplementa o meio de cultura com adenina 12 mg/l, arginina 4® mg/l, histidína 40 mg/l, isoleu™ cina 6® mg/l, leucina 6® mg/l, lisina 6® mg/l, metiorsina 4® mg/l, fenilallanina 50 mg/l, treonina 6® mg/l, triptofano 4® mg/l, tirosina 15 isolados de mq/1 uracilo 4® mg/l, vaiina fe® mq/1) leveduras transformadas foram designados;

Sacc haromycss Sacc harofliyces Sac c ha r omy ces cerevisíae ceravisiae cerevisíae

ABli®/pDP34 ABlí®/pAB22ó ABI1®/pBPkexp

Clones

Exemplo 4; t-ermentação de estirpes de leveduras transformadas numa escala laboratorial

Células de S, cerevisíae ABll®/pBP34, 5. cerevisíae ABI í ®/pAB'226 e S. cerevisíae ABI 10/pBPkexp foram cultivadas em 1® ml de pré-cultura composta por

Difco Yeast Nitrogen Base sem Aminoácidos glucose

HEPES ô,7 g/1 2®,€í g/1 24,® g/1 meio de cultura, foi suplementado com uma mistura de aminoácidos/nucleótidos deficviente em leucina (descrito no Exemplo 3) e o pH foi ajustado a 7,®»

As pré-culturas 3®°C e 18® rpm» foram -cultivadas durante 48 horas

il é composto por?

meio de cultura

Difco Yeast Nitrogen Base sem Aminoácido glucose arginina

Casaminoácidos Difco

HEPES pH ajustado a 7,0=

As culturas principais foram inoculad

6,7	g/1
40 ₅ 0	g/I
8,0	g/1
8,5	g/i
24,0	g/1

com cerca de i% v/v de pré-cuIturs e incubadas a 30‘^:'C e 180 rpm alturas durante a fermentação retiraram-se amostras analisou-se a densidade celular, o pH do caldo de actividade de endoprotease. A Figura 1 mostra as = Efíi várias de cultura e cultura e a.

actividadss intracelular e extracelular de yscF sintetizadas pelo transformante S. cerevisiae ABI10/pDPkexp desde que uma variante de yscF solúvel secretaria seja expressa -em comparação com o transformante AB110/pDP34 que é portador apenas do vector de levedura e o transformante AB110/pAB226 que expressa toda a proteína yscF.

Exemplo 5; Demonstração ímunolágica de uma proteína yscF solúvel truncada no meio de cultura de transformantes 8. cerevisiae

ABI10/pDPkexp

As estirpes de 5. cerevisiae ABÍ10/pDP34 foram cultivadas como descrito caldos de cultura foram separados em células cultura por centrifugação. Gs sobrenadantes

AB110/pDPks xp e no exemplo 4. Os e sobrenadantes de de cultura foram concentrados usando filtros Centricon 30Θ00 (Amicon) para 1/5 do volume original. Quantidades diferentes dos sobrenadantes concentrados foram reduzidas com 1,4-ditio-DL-treitol e separadas num gel de 8% de poliacrilamida em condições desnaturantes. As

proteínas foram coradas com azul Coomassie brilhante ou transferidas para filtro de nitrocelulose Ctransferência Western)» Os métodos para PASE e transferências Western estão descritos em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2â Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York» 0 filtro de nitrocelulose foi incubado a 37°C durante 2 horas em 2mM NaH._,FO^, 15® mM NaCl, IX BSA, pH 7,2 seguido de uma segunda incubação nas mesmas condições na mesma solução que agora contem mais anticorpos policlonaís induzidos em coelhos contra uma proteína de fusão lacZ-yscF» (A produção e purificação de anticorpos está descrita em Sambrook et al», 1989, Molecular cloning, 2ã edição, Cold Spring Harbor três vezes

17.

durante 3® minutos a T rit on X-í ®®, ®, 1 XBSA

Laboratory Press, New York») □ filtro foi lavado

37°C em 1® mM NaH_oF'D„, 15® mM NaCl

X- » pH 7,2« Ests lavagens foram seguidas de uma reacção de hibridação com um soro ds cabra anti-Igs de coelho conjugado com fosfatase alcalina» A transferência foi lavada três vezes durante 3® minutos em í® mM NaH^PO^, 15® mM NaCl, ®,®ÍX Tween 2®, Ô,1X BSA, pH 7,2. A vizualização da ligação específica ocorre por incubação da transferência numa solução composta por: ®,ÍM Tris-HCl pH 8,8, 1®® mM NaCl, 2 mM MgCl^, 1® mg/1®® ml de 5—Bromo—4—clorindolil—fosfato CBCIP) ε 1®® mg/í®® ml de Nitro— blue-Tetrazolium—Chloride CNBT). Uma proteína adicional de de 68 -tDa foi encontrada nos sobrersadant.es de cultura de S. cerevisiae ABIí®/pDPkexp comparado com os sobrenadantes de cultura de S» :srevisiae AB11 ®/pDP34.

•ta proteína de 68 KDa reage com os anticorpos induzidos contra uma parte da proteína yscF,

Exemplo 6s Processamento in vitro de pre—pro—IGF1

1BF1 é expresso em S» cer e visiae como uma proteína de fusão intracelular composta por IShl maduro fundido com

sequência líder do precursor do factor «· de 5. cerevisiae., A proteína de fusão tem a seguinte estruturas

N-Clíder do factor «>-IGFl~C

A sequência de aminoácidos Tir-Lis-Arq é o extremo C-terminal da sequência líder de 89 aminoácidos do factor a EKurjan, J_a e Herskowitx, I, 1982, Cell 3Q_;, 933-9431 e um substrato para a endoprotease yscF. A proteína de fusão é clivada pela protease yscF solúvel truncado«a que conduz aos produtos de digestão N-pre-pro-factor «-C e IGF1 maduro.

Amostras de extracto bruto de S, cerevisiae cada uma contendo 5ô pmoles da proteína de fusão líder do factor a-IGFl foram incubadas com amostras do sobrenadante de cultura de S„ cerevisiae ABÍ10/pDPkexp cada uma contendo actividade de endoprotease yscF solúvel 5 mM (calculado a partir do ensaio de actividade de endoprotease descrita no Exempla 2). As reacções foram realizadas em 10 pl de tampão Na-fosfato 5© mM, pH 7,5 durante diferentes períodos de tempo. IGF1 maduro derivado do processo de processamento in vitro foi detectado por análise de transferência Western”. Este método está descrito no exemplo 5. A hibridação foi realizada usando anticorpos policlonais induzidos em coelhos contra I8Fí maduro. A detecção ds ligação específica está descrita no Exemplo 5» A análise de transferências Western mostra que o processamentode pre-pro~I8Fl com um sobrenadante de cultura contendo a variante solúvel da protease yscF secretada pelo transformante S. cerevisi ae ABI10/pDPkexp. A proteína pre—pro— IBF1 foi processada para dar a proteína IGFÍ fflâdurs dentro de 30 a 120 minutos usando as condições de ensaio descritas

Exemplo 7; Construção de um gene híbrido contendo o promotor BAPFL e o gene estrutural KEXI

Conforme divulgado no Pedido de Patente Europeia N2 341,215 o gene KEXí de tamanho completo foi isolado a partir de DNA genómico total de Sac c ha romyc es c e rev is i ae num fragmento de 3,1 Kb. Este fragmento foi clonado num sítio único HindIII do plasmídeo de levedura pJDB207 CBeggs, J.D., 1981, em D» von Wettstein et al., Ced»), Molecular Benetics in Yeasts, Alfred Benzon Symposium 16» Munsgaard, Copenhagenl» E. coli HBlÔl foi transformado com o plasmídeo resultante pJDB207/KEXl. A estirpe transformada de E» coli foi designada E» coli HB101/KEX1.

Para se obter um nível elevado de expressão de uma forma solúvel secretada de ysco: (a proteína codificada por KEXi), o promotor muito fraco de KEXí presente no fragmento HindIII foi trocado pelo elemento promotor constitutiva forte (BAPFL) do promotor da gliceraldeído—3—fosfato—desidrogenase ds levedura (Pedido de Patente Europeia N2 225,633)» Uma vez que o promotor BAPFL está contido num fragmento Sall-EcoRI de 478 pb, primeiro um sítio EcoRI na região codificadora de KEXI é eliminado por mutagênese in vitro, seguido da introdução de um novo sítio EcoRI directamente 5^? relativamente ao codão de iniciação ATE de KEXI para permitir a fusão corrscta do promotor BAPFL à região codificadora de KEX1»

Detalhadamente, o fragmento HindIII de 3,1 Kb contendo KEXÍ foi subclonado no sítio HindIII do vector derivado de M13 pBlusscript KS+ CStratagene, La -Jolla, Ca» USA) para dar KS*/-KEX1. Para remover o sítio interno EcoRI situado 42@ pb a montante do sítio HindIII 5⁵, sintetizou-se o seguinte oligonucleótidos

5⁵-CCTTTTABBBTCAATTCABACSBT-3^!

A mutagénese dirigida in vitro foi realizada como descrito (kit Bio-Rad Muta-Gene M13, Bio-Rad, Riehmond, Ca» USA). Primeiro, KS-f-ZKEXl foi usado para transfectar E. coli CJ 236 para incorporar uracilo (kit Muta-Gene, supra). DNA de cadeia simples de E» coli CJ 236 transfectado foi isolado usando o fago auxiliar M13 (Stratagene, supra).

2®0 pmoles do oligonulcéotido iniciador foram desfosforiladas num volume total de 3© μΐ contendo 3 p.l de 1M Tris-HCl pH Β,©, ©,©3 μΐ de 1M MgCl_o, 0,75 μΐ 0,2M DTT, 0,6 μΐ 2© mM ATP, 4,5 unidades de polinucleótidos-cinase de T4 foram adicionados e a mistura incubada a 37°C durante 45 minutos e a 65°C drante 10 minutos» oligonucleótido fosforilado foi então emparelhado com o DNA molde nas seguintes condições: €3,1 pmoles de DMA contendo uracilo derivado de K3-5-/KEX1 foram incubados com 2 pmoles de iniciador fosforilado num volume total de 10 μΐ de tampão de emparelhamento (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 2mM MgCl^, 5© mM NaCl). A mistura foi aquecida num banho-maria a 80°C ε depois deixada arrefecer lentamente até ser atingida a temperatura ambiente»

Formou-se então acadeia complementar nas seguintescondições-: ί© μΐ da mistura de emparelhamento foram incubados com 4 μΐ de 2mM dNTPs, <0,75 μΐ de ô,5M Tris-HCl pH 7,4, €i,75 μΐ de 0,iM MgCl.-,, 2,15 μΐ de ©,ΞΜ DTT 1 unidade de DNA-polimerase de T4 e 2 unidades de DNA-lígase de T4» A mistura de reaccão foi primeiro incubada em gelo durante 5 minutos e finalmente a 37°C durante 90 minutos» Os DNAs de cadeia duola resultantes foram usados para transformar E. coli JM 101, eficazmente o molde contendo uracilo.

uma estirpe que deixando

Γ*ξ?ίΒΟ Vízí cadeia complementar mutagenisada replicar-se (Bio-Rad, supra). Os plasmídeos foram preparados e analisados na ausência do sítio

EcoRI. A mutagénsse correcta foi ainda confirmada por análise da sequência. Dm plasmídeo com a destruição correcta do sítio interno EcoRI foi designada KS+7KEX1CEcoRI)»

Um novo sítio EcoRI foi agora introduzido em KS-f-ZKtXí(-EcoRI) usando o seguinte oligonucleótido como iniciador?

5^?-AGATAAAGACCTGAATTCAGATGTTTTACAAT-3⁵

A mutagénsse in vitro foi i descrita supra. Os plasmídeos foram restrição quanto â presença ds um novo adjacente ao dodão de iniciação e por salivada exacLamente como testados por análise de sítio EcoRI imediatamente

-análise da sequência» Um plasmídeo com o novo sítio EcoRI correcta foi designado como

KS+/KEX1(EcoRInew)» digerido com EcoRI e HindiII e o foi separado num gel preparatiusando SeneClasn (Bio I©1 Inc»,

KS+/KEX1(EcoRInew) foi fragmento contendo KEX1 de 3,® Kb vo de 0,8% de agarose s isolado La Jolla, CA, USA).

's-Z

Para se obter o fragmento com o promotor BAPFL o plasmídeo pJDB207/GAPFL~HIR (Pedido de Patente Europeia N2

225,633) foi digerido o	nm Sall e	EcoRI e i	solado o fragmento de
478 pb usando o mesmo	processo	como já	desc rito í Genec1ean,
supra)„
o,2 pmoles do	fragmento	promotor	SalI-EcoRI de 478 pb.
®,2 pmoles do fragmento	EuuRI-HindiII contendo o gene estrutural

KEX1 de tamanho completo e ©,1 pmoles do vector de multicópias de levedura pDP34 ícf» Pedido de Patente Europeia N2 340,170) cortado a partir com Sal I-Hind 11 J. de células E» foram 3 igados

coli 3M101. Um plasmídeo correcto foi referido como pDP34/8APFL-KEX1»

Exemplo 8; Construção de um gene KEXÍ encurtado codificador de actividade ysca solúvel

KEXÍ codifica uma carboxipeptidase ligada a membrana ysca - que está localizada dentro de um sistema secretor, mais provavelmente no aparelho de Bolgi. A proteína vsca consiste num domínio catalítico amino-terminal, seguido ds uma região ácida rica em Asp-Slu, um dominio transmembranar e uma cauda C-terminal, Para permitir a secreção para o meio através da via defeituosa, fazer um extremo C truncado ê o método preferido» Um sítio Xhol único adequado está situado imediatamente a montante do domínio transmembranar no fim da região ácida»

KS+/KEXÍ íEcorínew) foi digerido com EcoRI e Xhol e isolado o fragmento de 1,7 Kb contendo o gene KEXÍ truncado no extremo C. Este fragmento codificador de KEXÍ com i,7 Kb e o fragmento SalI/EcoRI de 478 pb contendo o promotor BAPFL (Exemplo 7) foram então ligados ao sítio único Sall de pDP34. 0 plasmídeo resultante foi referido como pDP34/GAPFL~KEXl#, A ORF codificadora de ysca# solúvel com sequências derivadas de KEXÍ está descrita na listagem de sequências em 8EB- ID N52·,

Exemplo 9; Transformação de S

cerevisiae estirpeTr 1176

a. Cruzamento da estirpe 96 de 5« cerevisiae mutante kexl com a estirpe BVS e análise dos esporos relativamente ã capacidade secretora do factor a e carboxipeptidase yscu CKEX1)

A estirpe % de S.cervisiae mutante kexí Ca,kexl, ade2, trel), que foi obtida do Genetic Gtock Center de leveduras, Berkeley, USA, foi cruzada com S. cervisiae estirpe BYS232-31-42 Cu, prbl-1, prcl-1, cpsl-3, lis2, leu2, his7> EAchstetter, T» e Wolf, D.H. C1985) EMBO J. 4, 173-177; Wolf, D.H. e Ehmann, C. C1981) J . Bacteriol» 147, 418-4263 portadora do alelo KEXÍ tipo selvagens. As células heterozigóticas diplóides do genótipo kexl/KEXí foram isoladas a partir deste cruzamento. As tétradas que derivam das células diplóides foram dissecadas de acordo com pocessos convencionais de genética EHawthorne, D.C. e mortimer, R.K» ÍÍ960) Geneíics 45, 1085-1110; Methods in Yeast Genetics 1986 (Sherman, F. et al., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.3.

Os quatro esporos de (μι roHz.

a um£ das tétradas foram testados quanto á sua capacidade para secrstareffl o factor u. Para distinguir entre KEXí tipo selvagem e as colónias mutantes kexi, usou—se a estirpe tete de S» cervisiae super—sensível a feromonas RC629 Ca, sst-2, ade2-í, urai , his-6, meti, eanl, cyh2, rme) CChan, R.K. e Otte, C.K» (1982) Mol» Cell. Biol. 2, 11-20; Chan, R.k. e Otte, C.K. C19S2) htol« Cell. Biol. 2, 21-293. Conforme esperado a partir das características codificadas pelo penes nucleares isolados, de todas as tétradas analisadas, dois esporos de cada tétrada secretam o factor enquanto que os dois outro esporos secretam o factor u. Colónias tipo selvagem KEXí do tipo de conjugação & xnibem o crescimento da estirpe teste num grau

muito maior ε portanto produzem um grande halo à volta delas próprias, uma vez que elas são capazes de processar o precursor do factor a completamente e produzem quatro moléculas de factor α activas a partir de uma molécula precursora» Pelo contrário, as colónias do mutante kexl inibem o crescimento da estirpe teste num grau menor e assim produzem um halo menor à volta delas próprias, pois são capazes de produzir apenas uma molécula de factor a madura a partir de uma molécula precursora»

Os esporas ds várias tétradas completas que foramidentificadas como defectivas no gene kexl pelo ensaio de feromonas abaixo descrito, foram finalmente testadas quanto â especificidade de carboxipeptidase ysca» As células foram cultivadas, as suas membranas foram preparadas e testadas relativamente à activdida.de de carboxipeptidase ysca usando Cbz-Txr-iis-Arg como substrato como descrito EWagnsr, J»C» e Wolf, D«H» (1987) FEBS Lett» 221, 2, 423-4263» 0 facto de não se encontrar actividade da earhoxipep tidase ysca nas células mutantes kexl, indica que KEX1 é o gene estrutural desta enzima» Isto implica que a carboxipeptidase ysca está ds facto envolvida no processamento carboxi-terminal do Tactor a»

b. Classificação dos mutantes kexl confirmados relatívamenté a deficiência adicional na proteases yscB, yscY e yscS

Mutan tes kex í relativamente a deficiênc carboxipeptidase yscY e c de S» cerevisiae foram classificados ia de outras proteases Cproteinase yscB, arboxipeptidase ysc-S) e outras necessidades de factores de crescimento

Material celular dos mutantes kexl cfu'ê-’fdi preparada a partir de uma fase estacionária em meio YPD CDifco) foi ressuspen· so em 2Θ0 μΐ de tampão 2® mM Tris-HCl, pH 7,2 num tubo Eppendorf e adicionadas esferas de vidro <©,4 mm de diâmetro) até dois terços do volume, A suspensão foi agitada fortemente três vezes durante í minuto num misturador vortex com arrefecimento intermitente em gelo.

permite a recuperação tos foram dialisados OylmM ZnCl.- de forma livres a partir dos

A centrifugação durante 5 minutos de extractos do sobrenadante, Estes extrac contra tampão ©,ÍS‘i imidazole-HCl pH 5,2 com a activar proteases e a remover aminoácidos extractos.

As sc tivid-ades de proteinase yscEt foram medidas de acordo com o teste de Azocoll CR.E. Ulane et al», (1976) J. Biol, Chem, 25 í, 3367, E, Cabib et al», (1973) Biochem, Biophys, Res, jommun» SO, 186s T.

>aheki et al (1974) Eur

Biochem, 42.

6213. Após medição daconcentração proteica, uma pequena quantidade de cada uma das amostras foi ajustada a ÍÔ© μΐ com fosfato de sódio 6,1M (íMaPi) pH 7,6 para igualar as quantidades de proteína necessárias» A. solução de proteína adicionou-se uma suspensão de 5&Φ pl de Azocoll (24© mg em í© ml de tampão NaPi, pH 7,©), estas misturas foram incubadas a 3©^OC durante uma hora com agitação. Após a adição de 5©© pl de ácido tricloroacético a !©’£ que pára a reacção, as misturas foram centrifugadas duas vezes e medidas as espectros de absorção dos sobrenadantes a 52© nm.

As actividades de carboxipeptidase yscY e yscS foram medidas usando o substrato cromogénico Cbz-Bln-Leu Ec,f» D.H. Wolf et al,, (Í978) FEBS Lett» 9Í, 5*9; D»H» Wolf et al», (1977) Eu.r, 3. Biochem» 73, 5533» Os extractos dialisados foram divididas em três porções e a duas delas adicionou-se fluoreto de

0,24 mg/ml 0,40 mg/rnl

-.,' <·':·? λ fenil-metilsulfonilo íPMSF) numa concentração final de 5 mM para bloquear selectivamente as duas actividades de protease, Nomeadamente PMSF inibe a actividade de carboxipeptidase yscV e EDTA inibe a da. carboxipeptidase yscS, As misturas com inibidores foram incubadas a 25*C durante uma hora para completar a inibição, Após a determinação da concentração proteica, duas amostras com inibidor e uma amostra sem inibidor como tesemunha de cada amostra foram completadas para 50 μΐ com tampão 0,1M NaPi pH 7,4 para receberam iguais quantidades de proteína, A estas soluções de proteína adicionaram-se as soluções a testar que se seguem»

500 μΐ de solução teste Is

L—afliinoác ido-ox idase peroxidase de rábano silvestre 0,0Í mM MnCl„ em tampão 0,1M NaPi, pH 7,4 50 μΐ de solução teste II o-dianisidina em água

500 μΐ de solução teste III mM Cbz—Gli—Leu em tampão fosfato de potássio 0,2M, pH 7,4»

As misturas foram incubadas a 28 *C durante uma hora e após adição de 100 μΐ de Triton X—100 a 20% para para a reacção, mediram-se as absorvâncias a 405 nm.

mg/ml

Com a finalidade da subsequente transformação, uma marca auxotrófica para o aminoácido leucina foi avaliada através de réplicas para placas de meio mínimo suplementadas com adenina, treonina, lisina e histidina e com ou. sem leucina.

Por meio dos ensaios atrás descritos, isolaram-se mutantes designados -5, cerevisiae BYSkexi, os quais apresentam uma deficiência quádrupla em proteases Ccí, prb-í, prc-t, cps-3, ke*xí) e uma necessidade adicional relativamente a leucina.

c. Produção da estirpe de levedura TR1176 deficiente em ura-3

Tr 1176 é um derivado ura3 da estirpe BYSkexí descrita atrás, A disrupção do gene URA3 em BYSkexí foi realizada como descrito detalhadamente no Pedido de Patente Europeia NS 340,17®. Tr 1176 tem as seguintes marcas genéticass MATa, prb-í, prc-í, cps-i, kex-í, ade-2, leu2, ura3»

S. cere visi ae Tr 1176 foi transformada com os plasmídeos pDP34/SAPFL —KEX1 e pBP34/6APFL—KEX1® usando o protocolo de transformação descrito por Dohmen (supra). As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura suplementado com leucina e adenina e deficientes em uracilo. Colónias individuais de leveduras foram isoladas e designadas;

Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/pDP34/GAPFL-KEXi

Saccharomyces cerevisiae Tr lí76/pDP34/GAPFL-KEXí*

Exemplo 10 g Actividade biológica de ysca solúvel

Células de Saccaromyces cerevisiae Tr 1176/pDP34/8APFLKEX1 e de Saccharomycgs cerevisiae Tr U7ó/pDP34/SAPFL--Kfc.Xl$ foram cultivadas em meio mínimo composto por5

Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos glucose

L-asparagina adenina

8,4 2Θ.0 í©,0 g/1

0,1 g/1 g/1 g/1 durante 48 horas a 30°C ε 180 rpm.

As células foram separadas do meio por centrifugação, ressuspensas em õ»9% de NaCl e testadas relâtivamente á actividade de ysca pela formação de halos numa camada de células a supersensíveis ao factor α CChan, R»K« e Otts, C»K„ C1982) Mol. Cell» Biol» 2, 11-201» A estirpe Tr 1176 sem plasmídeo apresenta apenas um halo muito pequeno na camada ds células a devido á ausência de actividade ysca. Saccharomyces cerevisiae Tríl76/pDP34/GAPFL-KEX.l e Saccharomyces cerevisiae Tr 117ó/pDP34/SAPFI_KEX1$ ambos apresentam a formação de halos,ysca reteve portanto a sua função biológica normal, i.e» maturação do factor a.

Sobrenadantes de fermentações de bacc haromyces_cerevisiae Tr 1176/' pDPó4/GAPF L-KEX1 ί 176/ pDP-34/e.APFL-KEX 1« í supra ?

e Saccharomyces cerevisiae Tr foram então analisados quanto à presença da actividade de ysca no meio usando como substrato o peptídeo sintético Cbz—Tir-Lis—Arg s um ensaio como descrito (Wolf, D.H. e Weiser, U» C1977) Eur, J. Biochem» 73, 553-556)»

Apenas os sobrenadantes de Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/-pDP34/GAPFL~KEXÍ* apresentaram degradação proteolítica do seu substrato enquanto os sobrenadantes de Saccharomyces cerevi s i as

Tr 1176/pBP34/BAPFL~KEXinão apresentaram actividade com Cbz~Tif—

Lis~Arg. Pode concluir-se pois que 1<EX1$ codifica ysc« biologicamente activo que ê libertado para o meio- A nova proteína foi

designada ysc«$»

Exemplo 11s

Purificação de ysc<s$

ml da matrix de permuta iónica Fractogel TSK DEAE 65© (Merck AS, Darmstad, FRG) foram empacotados- numa coluna que se equilibrou com tampão de fosfatas 5© mM, pH 7,©« SC* ml de caldo de cultura de Saccharomyces cerevisiae Tr 1176/pDP34XBAPFL-K.EXÍ (supra)foram ajustados a pH 7,© e aplicados na coluna durante a noite» ysca naquelas condiçSes lig—se à coluna» As proteínas ligadas foram então eluidas com um gradiente combinada de pH/sal (4© ml de tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,© ε 4© ml de tampão fosfato de sódio 5® mM pH 4,© + ÍM NaCl)» Por volta de ©,2M NaCl ysca? elui numa, forma substancialmente pura com um peso molecular aparente de aproximadamente 66 KDa (peso molecular calculado de 65 KDa.) » Quando comparado com carboxipeptidase B do pâncreas de

porco (Boehringer Mannheim, Marinheiro, FRS) ysc«& na mesma concentração proteica, tem a actividade equivalente no substrato CbzTir-Lis-Arg a pH 7,© e actividade ligeiramente superior a pH 4,©»

Exemplo 12: Construção de um peptídeo de fusão recombínante expressando hirudina e caleitonina humana simultgneamente

Construiu-se um peptídeo ds fusão que permite a expressão simultânea de hirudina e de um precursor da caleitonina humana. Entre os dois peptídeos foi introduzido o sítio de reconhecimento Lis-Arg de KEX2/KEX1 para permitir o processamento in vitro com yscF solúvel e yscaS solúvel (supra).

Detalhadamente. o plasmídeo pJDB2®7/8AF’FL-HIR (supra, Exemplo 7) foi digerido com Sall e BamHI e o fragmento de Kb foi subclonado em SalI-BamHI de pBluescript KS*. 0 gene codificador do precursor com glicina C-terminal da caleitonina humana foi montada a partir de oligonucleótidos individuais como descrito para a hirudina (cf. Pedido de Patente Europeia NS 168342) e subclonado no sítio Pstí ds pUC19. A sequência do precursor da caleitonina humana com uma extensão 5⁵ para proporcionar processamento in vitro está descrita na listagem de sequências em SEQ ID NQ3 (como confirmado pela análise da sequência).

fragmento Pstí de Ío2 pb foi retirado sítio Pstí do vector Bluescript contendo a hirudina mantes foram testados relativamente â orientação inserção e um plasmídeo correcto foi designado j s clonado no Os transforcorrecta da

S+/SAPFL-HIRCALC.

plasmídeo pJDb2€ / -Ui-íF r L—Η Σ h

HindiII e isolado o fragmento grande plasmídeo pJBB207/8APFL-HIR foi digerido se obter o fragmento terminador de PH05 foi diger ds 7,® Kb com BamHI ds 35© pb.

xtío uum CaιI e d o v ec t o r, 0 e Hindi II para

Finalmente o fragmento vector p JDB207, o fragmento terminador e o fragmento SalI-BamHI de ligados numa ligação tripla para dar o

KS*/8APFL-HIR—CALC foram plasmídeo p3DB207/SAPFLHIR-CALC,

Saccharomyces cerevisiae estirpe HT246 íDSM 4084) foi transformada com o plasmídeo pJDB207ZSAPFL-HIR-CALC de acorda com o Exemplo 3« As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para leveduras -deficientes em leucina. Células de levedura transformadas foram isoladas e referidas como 8» cerevisiae HT24ÓZpJDB207ZGAPFL-HIR-CALC.

Para a expressão e secreção da proteína de fusão 5. cerevisiae HT24ó/pJDB207/GAPFL--Hl'R-CALC foi cultivada como descrito no Pedido de Patente Europeia N2 340170 (exemplo 10 aqui)» Após 48 horas e 72 horas de cultura retiraram-se amostras, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante de cultura contendo a proteína de fusão foi retirado para posterior processamento» Primeiro o sobrenadante contendo a proteína de fusão hirudina-calcitonina foi clivado endoproteoliticamente por digestão com a proteína yscF truncada solúvel de acordo com o Exemplo 6» Esta clivagem resulta num precursor de tamnho completo da calcitonina humana e numa variante da hirudina que ainda cantem uma extensão 1isina-arginina no seu extremo C» Esta extensão 1isina-arginina foi removida por digestão com ysca$ usando enzima purificada (ver Exemplo li). A remoção correcta da extensão 1isina-arginina foi demonstrada da mistura de reacção como divulgado no por HPLC de fase reversa Pedido de Patente Euro-

Exemplo ld; Construção de uma proteína ds fusão recombinante expressando eqlina C

Construiu-se um psptídeo de fusão que permite a expressão de uma proteína de fusão de acordo com o invento de acordo com a fórmula P-L-T em que P é o polipeptídeo da eqlina C (Rink H„ et al., Í9S4 Nucl» Acids Res. 12, 6309-6387), L a sequência de ligação Lis-Arg-Slu-Ala-Blu-Ala-Trp-Vâl-Pro e T um domínio de liagação a celulose da proteína Exg de Ce11u1omonas fimi codificada pelo gene cex de Cellulomonas fimi íMeill 6.0. st al., Í986 ©ene 44, 325-330).

Detalhadamente o plasmídeo pEC~í CNeill 6.0. et al.

fragmento de 433 pb codificador do domínio de ligação à celulose do gene de cex de celulomonas foi isolada» 0 plasmídeo plSkexp (exemplo 1) foi cortado com Asp71S e os extremos coesivos foram preenchidos usando polimerase Klenow resultando em extremos cerses. 0 plasmídeo linearizado foi ligado ao fragmento Smal—Stul ds 433 pb de cex e usado para transformar E. coli HB 101. Os clones foram testados quanto à orientação do fragmento cex de 433 pb» Um clone com a orientação que faz a acoplagem da grelha de leitura do gene KEX2 com a grelha de leitura do gene cex foi designado plSkexpcex» plasmídeo pUClv foi cortado com Bali e BamHI e o fragmento SalI—BamHI de 276 pb do pBR322 foi inserido. 0 plasmí— deo resultante pUCiPpBR foi cortado com BamHI e ecoRÍ e ligado na presença do fragmento BamHI-EcoRI contendo o promotor BAPDH resultando no plasmídeo pTMl. pTMJ. foi cortado com EcoRI e inserida a seguinte adaptador

5’-AATTCATGCA TGCATGCABA TCT-3* de tal forma sequências do pTM2» que o sítio EcoRI foi reconstituído adjacente às promotor, 0 plasmídeo resultante foi desigando plasmídeo pML147 (Rink H» et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12, 6369-6387) foi cort-ado totalmente com EcoRI e BamHI» 0 fragmento EcoRI-BamHI da eglinaC foi clonado em pBR322 cortado com EcoRI/BamHI. Um plasmídeo com a sequência pretendida foi designado pML141» Usando os oligonucleótidos

5*—CCGGTACCCA ABCTTCBBCT TCTCTCTTAC CAACATGCGB AACATG3’

5’-CGGGATCCAA GAATTCTGA CTGAATT-3’ (a sequência codificadora da sequência L adaptadora referida atrás está sublinhada) uma reacção de PCR foi realizada em pHLÍ41 usando o kit de PCR da Perkin-Elmer-Cetus e seguindo as estricta— mente as instruções do fornecedor, A reacção de pCR resulta na amplificação de um fragmento de 257 pb contendo o gene da eglinaC ligado à sequência adaptadora L. 0 fragmento foi isolado a partir de um gel de agarose e cortado totalmente com BamHI e Asp7ÍB. O plasmídeo plBkexpcex (ver atrás) foi totalmente cortado com BamHIe Asp71B e isolado o fragmento de 3,1 Kb» O fragmento BamHI-Asp718 de 3,1 Kb do plBkexpcex contendo fragmento do gene cex e as sequências de pUC19 foi ligado ao fragmento BamHI—Asp71S da eglina C obtido por PCR s o plasmídeo resultante foi designado plBeglincex» 0 plasmídeo contem uma grelha de leitura aberta que vai desde o primeiro aminoácido da eglina C até ao último aminoácido da proteína Exg. Ds dois domínios, i.e. eglina C e os 133 aminoácidos C—terminais de Exg (incluindo uma prolina -extra), foram separados pela sequência adaptadora dada atrás» ft sequência de nucleótidos codificadora da proteína de fusão (ver SEQ ID NS4) foi confirmada por sequenciação de DNA» plasmídeo pTÍ12 (ver atrás) foi cortado com EcoRI e os extremos 5^? foram desfosforilados, 0 plasmídeo plGeglincex foi cortada com EcoRI e o fragmenta eglina-cex de 686 pb foi isolado. Este fragmento de 686 pb foi ligado ao vector pTM2 cortado com quanto á orientação do fragmento eglina-cex. Um clone com a orientação pretendida resultando na ordem que sa segue das sequências GAPDH-eglina-cex foi designado pí9/GAF‘DH-EGLIN-CEX, plasmídeo pl9/SAPDH-ESLIN-CEX foi digerido com BamHl e BglU e isolado o fragmento codificador das sequências GAPDHeglin-cex , 0 plasmídeo pDP34 foi cortado com BamHl, os extremos 5⁵ foram desfosforilados e o fragmento resultante foi ligado ao fragmento BamHI-BglII» Os clones foram testados quanto á orientação do fragmento BamHI-BglII ds 1,1 Kb e referidos como pDP348APDH~eglincex—ί e pDP34GAPDH—eglincex—2 em que o índice 1 indica que -a inserção GAPDH-eglxn-cex está orientada no sentido dos ponteiros do relógio no plasmídeo pDP34 enquanto que 2 indica que uma orientação contrária ao sentido dos ponteiros do relógio» pDF'34SAPDH-egl incex-1 foi usado para transformar Saccharomyces cerevisiae estirpe ABI10 (ATCC 2079ó) de acordo com o exemplo 3, As células de ABI10/pDP34SftPDH~eglincex-1 foram cultivadas em 10 ml de meio mínimo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos 6,7 g/l, glucose 40 g/1, mistura de aminoâcidos/nucleótidos de acorda com o Exemplo 3 sem 1-eucina) durante 24 horas a 30“-'C com ÍS0 rpm, As culturas- principais, 250 ml de meio mínimo foram inoculadas com a pré-cultura e cultivadas a 30°C durante 24 horas com 180 rpm» A cultura de produção foi ampliada como se segues As células da cultura principal foram separadas do caldo

de meio 3,4 g/1, acordo 24 horas de cultura por centrifugação, rsssuspensas em 250 ml mínimo duplo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos í glucose 4® g/1, 2x mistura de aminoácidos/nucleótidos de com o exemplo 3 sem leucina? e fermentada a 3®°C durante com 18® rpm»

As células da produção foram separadas do meio de cultura por centrifugação, lavadas primeiro em 200 ml e depois em 40 ml de tampão A (tampão As 5® mM Tris—HCI pH 7.,®, 10® mM NaCl). As células foram rebentadas com esferas de vidro em passos repetidos cada um deles em cerca de 1® ml de tampão A e o extracto bruto de um volume total de 48 ml foi clarificado por centrifugação (2‘588& xg, Í5 minutos, 4°C) » 5q (peso seco) de celulose ÍAvicel ou celulose fibrosa) foi adicionado ao extracto bruto e incubado num agitador durante 1,5 horas a 4^C‘C»

A proteína de fusão ligada à celulose foi eluida com água como uma proteína de fusão e depois digerida com yscF resultando em eglina C com -a extensão C-terminal Lis-Arg» Estes dois aminoácidos- C-terminais foram removidos por digestão com ysc«» Mais detalhadamentes A celulose após incubação no extracto bruto foi colocada numa coluna de cromatografia (1,6 x 2® cm) e lavada na coluna com três volumes de coluna de tampão A» Em seguida aplicou-se um gradiente de tampão A e água» O gradiente é linear e corre entre iôGX do tampão A, ®K de água e de tampão, Í00X de água com três volumes da coluna» As fracçSes foram colhidas e testadas relativamente à proteína de fusão pelo método imunológico como descrito no exemplo 5» As fracções contendo a proteína de fusão foram sujeitas a um tratamento com a protease solúvel yscF como descrito no exemplo 6 resultando no produto de clivagem eglinaC-Lis-Arg que depois foir digerido com ysca® solúvel para, remover a cauda Lis—Arg»

Come alternativa, a proteína de fusão ligada à celulose e uma proteina consistindo em eglina C com a extensão C-terminal Lis-Arg ê liberta» Esta proteína é dpois digerida com yseu* para remover estes dois aminoácidos C-terminais» Detalhamenteu diferentes quantidades íi® mg para 5®® mg) de celulose após incubação com o extracto bruto foram incubadas com a proiease solúvel yscF como descrito no exemplo 6 pelo que é libertada eglina C-Lis-Arg. A eglina C-Lis-Arg é ainda digerida com ysc#.# solúvel para remover a cauda Lis-Arg» A eglina C obtida é idêntica estruturalmente à eglina C natural conforme evidenciado por HPLC»

Depósito de microorganismos

As estirpes de depositadas na Deutsche Mascheroder Weg ib, D-33ÔS microorganismos que se seguem foram Sammlung von Mikroorganismen CDSM), · Braunschweig ísão dadas datas dos depósitos e números de acesso)5

Escherichia coli JMl®9/pDP34: 14 de Março, 1988, DSM 4473. Saccharomyces cerevisiae BYS232-3Í-42: ó de Maio, 1988, DSM 4583» Escherichia coli JMÍ®l/pKS3®íb? 25 de Junho, 199®, DS1Í602S. Escherichia coli HBÍ0Í/KEX1: 25 de Junho, 199®, DSM ó®27. Escherichia coli JMl®l/pl9/BAPDH-EGLIN-CEXs 3 de Junho, 1991,

DSM6546

	SEQ ID	ΝΘ1
	Tipo de	sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo
	Comprimento da sequências Í866 pares de bses
	Tipo de	cadeias dupla
	Topolog	ia; linear
	Fontes
	Fonte e	xperimental imediatas E. coli JMÍ0i/pKS301bíDSM6028)
	Característiuass desde 1 até 1866 região codificadora de yscF
{	™··* solúvel
>	ATG AAA	GTG AGG AAA TAT ATT ACT TTA TGC TTT TGG TGG 39
	Met Lys	Vai Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp
t	1	5 10
]	GCC TTT	TCA ACA TCC GCT CTT GTA TCA TCA CAA CAA ATT 78
	Ala Phe	Ser Thr Ser Ala Leu Vai Ser Ser Gin Gin Ile
j	15	20 25
1	CCA TTG	AAG GAC CAT ACG TCA CGA CAG TAT TTT GCT GTA 117
	Pro Leu	Lys Asp His Thr Ser Arg Gin Tyr Phe Ala Vai
		30 35
'k	GAA AGC	AAT GAA ACA TTA TCC CGC TTG GAG GAA ATG CAT 156
	Glu Ser	Asn Glu Thr Leu Ser Arg Leu Glu Glu Met His
	40	45 50
	CCA AAT	TGG AAA TAT GAA CAT GAT GTT CGA GGG CTA CCA 195
-	Pro Asn	Trp Lys Tyr Glu His Asp Vai Arg Gly Leu Pro
		55 60 65
	AAC CAT	TAT GTT TTT TCA AAA GAG TTG CTA AAA TTG GGC 234
	Asn His	Tyr Vai Phe Ser Lys Glu Leu Leu Lys Leu Gly
		70 75
	AAA AGA	TCA TCA TTA GAA GAG TTA CAG GGG GAT AAC AAC 279
	Lys Arg	Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gin Gly Asp Asn Asn
	80	85 90

GAC CAC ATA TTA

TCT GTC

CAT GAT

TTA TTC CCG CGT AAC'

312

Asp His

Ile

Leu 95

Ser

Vai

His

Asp

Leu 100

Phe

Pro Arg

Asn

GAC

CTA

TTT

AAG

AGA

CTA

CCG

GTG

CCT

GCT

CCA

ATG

351

Asp

Leu

Phe

Lys

Arg

Leu

Pro

Vai

Pro

Ala

Pro

Met

105

110

115

GAC

TCA

AGC

TTG

TTA

CCG

GTA

AAA

GAA

GCT

GAG

GAT

AAA

390

Asp

Ser

Leu

Pro

Vai

Lys

Glu

Ala

Glu

Asp

Lys

120

125

130

CTC

AGC

ATA

AAT

GAT

CCG

CTT

TTT

GAG

AGG

CAG

TGG

CAC

429

Leu

Ser

Ile

Asn

Asp

Pro

Leu

Phe

Glu

Arg

Gin

Trp

His

135

140

TTG

GTC

AAT

CCA

AGT

TTT

CCT

GGC

AGT

GAT

ATA

AAT

GTT

468

Leu

Vai

Asn

Pro

Ser

Phe

Pro

Gly

Ser

Asp

Ile

Asn

Vai

145

150

155

CTT

GAT

CTG

TGG

TAC

AAT

ATT

ACA

GGC

GCA

GGG

GTC

507

Leu

Asp

Leu

Trp

Tyr

Asn

Ile

Thr

Gly

Ala

Gly

Vai

160

165

GTG

GCT

GCC

ATT

GTT

GAT

GGC

CTT

GAC

TAC

GAA

AAT

546

Vai

Ala

Ile

Vai

Asp

Gly

Leu

Asp

Tyr

Glu

Asn

170

175

180

GAA

GAC

TTG

AAG

GAT

AAT

TTT

TGC

GCT

GAA

GGT

TCT

TGG

585

Glu

Asp

Leu

Lys

Asp

Asn

Phe

Cys

Ala

Glu

Gly

Ser

Trp

185

190

195

GAT

TTC

AAC

GAC

•AAT

ACC

AAT

TTA

CCT

AAA

CCA

AGA

TTA

624

Asp

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Asn

Leu

Pro

Lys

Pro

Arg

Leu

200 205 t

d>

TCT GAT Ser Asp

GAC TAC CAT

GGT ACG AGA TGT GCA GGT GAA ATA.

663

Asp

iyr

His

Gly

Thr Arg 215

Cys Ala

Gly Glu 220

Ile

210

GCT

GCC

AAA

GGT

AAC

AAT

TTT

TGC

GGT

GTC

GGG

GTA

702

Ala

Lys

Gly

Asn

Phe

Cys

Gly

Vai

Gly

Vai

225

230

GGT

TAC

AAC

GCT

AAA

ATC

TCA

GGC

ATA

AGA

ATC

TTA

TCC

741

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Ile

Ser

Gly

Ile

Arg

Ile

Leu

Ser

235

240

245

GGT

GAT

ATC

ACT

ACG

GAA

GAT

GAA

GCT

GCG

TCC

TTG

ATT

780

Gly

Asp

Ile

Thr

Glu

Asp

Glu

Ala

Ser

Leu

Ile

250

255

260

TAT

GGT

CTA

GAC

GTA

AAC

GAT

ATA

TAT

TCA

TGC

TCA

TGG

819

Tyr

Gly

Leu

Asp

Vai

Asn

Asp

Ile

Tyr

Ser

Cys

Ser

Trp

265

270

GGT

CCC

GCT

GAT

GAC

GGA

AGA

CAT

TTA

CAA

GGC

CCT

AGT

858

Gly

Pro

Ala

Asp

Gly

Arg

His

Leu

Gin

Gly

Pro

Ser

275

280

285

GAC

CTG

GTG

AAA

AAG

GCT

TTA

GTA

AAA

GGT

GTT

ACT

GAG

897

Asp

Leu

Vai

Lys

Ala

Leu

Vai

Lys

Gly

Vai

Thr

Glu

290

295

GGA

AGA

GAT

TCC

AAA

GGA

GCG

ATT

TAC

GTT

TTT

GCC

AGT

936

Gly

Arg

Asp

Ser

Lys

Gly

Ala

Ile

Tyr

Vai

Phe

Ala

Ser

300

305

310

GGA

AAT

GGT

GGA

ACT

CGT

GGT

GAT

AAT

TGC

AAT

TAC

GAC

975

Gly

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Asp

Asn

Cys

Asn

Tyr

Asp

315

320

325

GGC TAT ACT AAT TCC ATA

	Gly	Tyr	Thr	Asn	Ser 330	Ile
	ATT	GAT	CAC	AAA	GAT	CTA
	Ile	Asp 340	His	Lys	Asp	Leu
	TGT	TCC	GCC	GTC	ATG	GCA
	Cys	Ser	Ala	Vai 355	Met	Ala
	GGC	GAA	TAT	ATT	CAT	TCG
	Gly 365	Glu	Tyr	Ile	His	Ser 370
	AGT	AAT	AGC	CAC	GGT	GGA
	Ser	Asn	Ser 380	His	Gly	Gly
	GCT	GCC	GGT	GTT	TAC	ACT
o	Ala	Ala	Gly	Vai	Tyr 395	Thr
	AAC	CTA	ACT	TGG	AGA	GAC
\_z	Asn	Leu 405	Thr	Trp	Arg	Asp
	TCT	GCG	GTA	GGG	TTA	GAA
	Ser	Ala	Vai	Gly 420	Leu	Glu
	AGA	GAT	AGC	GCC	ATG	GGG
	Arg 430	Asp	Ser	Ala	Met	Gly 435

TAT TCT ATT ACT ATT	GGG GCT	1014
Tyr	Ser	Ile	Thr 335	Ile	Gly	Ala
CAT	CCT	CCT	TAT	TCC	GAA	GGT	1053
His 345	Pro	Pro	Tyr	Ser	Glu 350	Gly
GTC	ACG	TAT	TCT	TCA	GGT	TCA	1092
Vai	Thr	Tyr 360	Ser	Ser	Gly	Ser
AGT	GAT	ATC	AAC	GGC	AGA	TGC	1131
Ser	Asp	Ile	Asn	Gly 375	Arg	Cys
ACG	TCT	GCG	GCT	GCT	CCA	TTA	1170
Thr	Ser 385	Ala	Ala	Ala	Pro	Leu 390
TTG	TTA	CTA	GAA	GCC	AAC	CCA	1209
Leu	Leu	Leu	Glu 400	Ala	Asn	Pro
GTA	CAG	TAT	TTA	TCA	ATC	TTG	1248
Vai 410	Gin	Tyr	Leu	Ser	Ile 415	Leu
AAG	AAC	GCT	GAC	GGA	GAT	TGG	1287
Lys	Asn	Ala 425	Asp	Gly	Asp	Trp
AAG	AAA	TAC	TCT	CAT	CGC	TAT	1326
Lys	Lys	Tyr	Ser	His	Arg	Tyr

440

GGC TTT GGT AAA

ATC Ile

GAT GCC CAT AAG TTA ATT GAA ATG

1365

Gly

Phe

Gly 445

Lys

Asp

Ala His 450

Lys

Leu

Ile

Glu

Met 455

TCC

AAG

ACC

TGG

GAG

AAT

GTT

AAC

GCA

CAA

ACC

TGG

TTT

1404

Ser

Lys

Thr

Trp

Glu

Asn

Vai

Asn

Ala

Gin

Thr

Trp

Phe

460

465

TAC

CTG

CCA

ACA

TTG

TAT

GTT

TCC

CAG

TCC

ACA

AAC

TCC

1449

Tyr

Leu

Pro

Thr

Leu

Tyr

Vai

Ser

Gin

Ser

Thr

Asn

Ser

470

475

480

ACG

GAA

GAG

ACA

TTA

GAA

TCC

GTC

ATA

ACC

ATA

TCA

GAA

1482

Thr

Glu

Thr

Leu

Glu

Ser

Vai

Ile

Thr

Ile

Ser

Glu

485

490

AAA

AGT

CTT

CAA

GAT

GCT

AAC

TTC

AAG

AGA

ATT

GAG

CAC

1521

Lys

Ser

Leu

Gin

Asp

Ala

Asn

Phe

Lys

Arg

Ile

Glu

His

495

500

505

GTC

ACG

GTA

ACT

GTA

GAT

ATT

GAT

ACA

GAA

ATT

AGG

GGA

1560

Vai

Thr

Vai

Thr

Vai

Asp

Ile

Asp

Thr

Glu

Ile

Arg

Gly

510

515

520

ACT

ACG

ACT

GTC

GAT

TTA

ATA

TCA

CCA

GCG

GGG

ATA

ATT

1599

Thr

Vai

Asp

Leu

Ile

Ser

Pro

Ala

Gly

Ile

525

530

TCA

AAC

CTT

GGC

GTT

GTA

AGA

CCA

AGA

GAT

GTT

TCA

1638

Ser

Asn

Leu

Gly

Vai

Arg

Pro

Arg

Asp

Vai

Ser

535

540

545

GAG

GGA

TTC

AAA

GAC

TGG

ACA

TTC

ATG

TCT

GTA

GCA

CAT

1677

Glu

Gly

Phe

Lys

Asp

Trp

Thr

Phe

Met

Ser

Vai

Ala

His

550

555

TGG GGT GAG

AAC Asn

GGC Gly

GTA GGT GAT TGG AAA ATC AAG GTT

1716

Trp Gly 560

Glu

Val 565

Gly Asp

Trp Lys

Ile 570

Lys

Val

AAG

ACA

GAA

AAT

GGA

CAC

AGG

ATT

GAC

TTC

CAC

AGT

1755

Lys

Thr

Glu

Asn

Gly

His

Arg

Ile

Asp

Phe

His

Ser

575

580

585

TGG

AGG

CTG

AAG

CTC

TTT

GGG

GAA

TCC

ATT

GAT

TCA

TCT

1794

Trp

Arg

Leu

Lys

Leu

Phe

Gly

Glu

Ser

Ile

Asp

Ser

590

595

AAA

ACA

GAA

ACT

TTC

GTC

TTT

GGA

AAC

GAT

AAA

GAG

1833

Lys

Thr

Glu

Thr

Phe

Val

Phe

Gly

Asn

Asp

Lys

Glu

600

605

610

GTT

GAA

CCA

GGG

GTA

CCG

AGC

TCG

AAT

TCG

TAA

1866

Val

Glu

Pro

Gly

Val

Pro

Ser

Asn

Ser

615 620

f S ΐ

SEQ ID NS2

Tipo de sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo Comprimento da sequências 1797 pares de bses Ti po de cadeias duρIa

Topolog

ias

Iinear

v_z'

Fontes

DNA

genómico

de

1evedura

Fonte e

ΧΠΡΓ

imental

ií?ied

ia ta

<t u- a

col

i HB101ZKtX1(DSM6027

Car ac te

r 4.3 t

.λcs3 π

i &

V7Q7 Ldp x / / /

regi

•zíQ

codi

•f icador

a dg?

solúvel

-

□

ATG TTT

TAC

AAT AGG

TGG

CTC

GGA

ACG

TGG

CTA

GCC

ATG

39

Met Phe

Tyr

Asn Arg

Trp

Leu

Gly

Thr

Trp

Leu

Ala

Met

1

5

10

TCT GCT

TTA

ATA AGG

ATC

TCA

GTA

TCC

CTT

CCG

TCA

TCT

78

Ser Ala

Leu

Ile Arg

Ile

Ser

Vai

Ser

Leu

Pro

Ser

15

20

25

GAG GAG

TAC

AAA GTG

GCA

TAT

GAG

CTG

TTG

CCA

GGG

TTA

117

Glu Glu

Tyr

Lys Vai

Ala

Tyr

Glu

Leu

Pro

Gly

Leu

30

35

O

TCT GAA

GTG

CCA GAC

CCT

TCA

AAT

ATT

CCA

CAG

ATG

CAT

156

Ser Glu

Vai

Pro Asp

Pro

Ser

Asn

Ile

Pro

Gin

Met

His

40

45

50

GCT GGC

CAT

ATT CCT

TTA

CGT

TCC

GAA

GAT

GCG

GAT

GAA

195 '

Ala Gly

His

Ile Pro

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Ala

Asp

Glu

55

60

65

CAG GAT

AGC

TCT GAC

TTG

GAG

TAC

TTT

TGG

AAG

TTT

234

Gin Asp

Ser

Ser Asp

Leu

Glu

Tyr

Phe

Trp

Lys

Phe

⁷⁰

75

ACC AAT

AAC

GAC TCT

AAT

GGC

AAT

GTC

GAC

CGT

CCC

TTA

279

Thr Asn

Asn

Asp Ser

Asn

Gly

Asn

Vai

Asp

Arg

Pro

Leu

í ' €

ATT ATA TGG TTA

AA GGT

GGA CCC GGT TGC TCT TCC ATG.

312

Ile

Trp Leu 95

Asn

Gly

Gly Pro

Gly Cys 100

Ser

Met

GAT

GGT

GCC

TTG

GTC

GAA

TCC

GGC

CCT

TTT

AGG

GTG

AAT

351

Asp

Gly

Ala

Leu

Vai

Glu

Ser

Gly

Pro

Phe

Arg

Vai

Asn

105

110

115

TCA

GAC

GGT

AAA

CTT

TAT

CTA

AAT

GAA

GGG

TCC

TGG

ATA

390

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

Tyr

Leu

Asn

Glu

Gly

Ser

Trp

Ile

120

125

130

TCC

AAA

GGC

GAT

CTT

TTA

TTT

ATC

GAC

CAA

CCT

ACT

GGT

429

Ser

Lys

Gly

Asp

Leu

Phe

Ile

Asp

Gin

Pro

Thr

Gly

135

140

ACT

GGG

TTT

TCT

GTC

GAA

CAA

AAT

AAA

GAC

GAA

GGT

AAA

468

Thr

Gly

Phe

Ser

Vai

Glu

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Gly

Lys

145

150

155

ATC

GAC

AAA

AAC

AAA

TTT

GAC

GAA

GAC

CTA

GAA

GAT

GTG·

507

Ile

Asp

Lys

Asn

Lys

Phe

Asp

Glu

Asp

Leu

Glu

Asp

Vai

160

165

ACC

AAG

CAT

TTT

ATG

GAT

TTT

CTG

GAG

AAC

TAT

TTC

AAG

546

Thr

Lys

His

Phe

Met

Asp

Phe

Leu

Glu

Asn

Tyr

Phe

Lys

170

175

180

ATT

TTT

CCA

GAA

GAC

CTC

ACT

AGG

AAA

ATC

ATA

CTA

TCG

585

Ile

Phe

Pro

Glu

Asp

Leu

Thr

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

185

190

195

GGT

GAA

AGT

TAC

GCT

GGC

CAA

TAC

ATA

CCA

TTC

TTT

GCC

624

Gly

Glu

Ser

Tyr

Ala

Gly

Gin

Tyr

Ile

Pro

Phe

Ala

200 205 ϊ ν’ ί

AAT GCA Asn Ala

ATT TTG

AAC CAT AAC AAA TTT TCA AAG ATC GAC

663

Ile

Leu

Asn His Asn 215

Lys

Phe Ser

Lys

Ile 220

Asp

210

GGG

GAT

ACA

TAC

GAC

TTG

AAG

GCG

CTA

TTG

ATT

GGT

AAC

702

Gly

Asp

Thr

Tyr

Asp

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Gly

Asn

225

230

GGT

TGG

ATT

GAC

CCC

AAT

ACA

CAG

TCC

CTA

TCG

TAC

CTT

741

Gly

Trp

Ile

Asp

Pro

Asn

Thr

Gin

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

235

240

245

CCG

TTT

GCT

ATG

GAG

AAG

AAA

CTG

ATT

GAT

GAA

AGC

AAC

780

Pro

Phe

Ala

Met

Glu

Lys

Leu

Ile

Asp

Glu

Ser

Asn

250

255

260

CCC

AAT

TTC

AAA

CAC

TTA

ACG

AAC

GCA

CAC

GAG

AAT

TGC

819

Pro

Asn

Phe

Lys

His

Leu

Thr

Asn

Ala

His

Glu

Asn

Cys

265

270

CAG

AAT

CTG

ATA

AAC

TCT

GCC

AGT

ACA

GAT

GAG

GCA

GCC

858

Gin

Asn

Leu

Ile

Asn

Ser

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu

Ala

275

280

285

CAT

TTT

TCG

TAT

CAG

GAA

TGT

GAG

AAT

ATT

TTA

AAC

CTT

897

His

Phe

Ser

Tyr

Gin

Glu

Cys

Glu

Asn

Ile

Leu

Asn

Leu

290

295

CTA

TTG

TCT

TAT

ACC

AGG

GAA

TCT

TCG

CAA

AAG

GGA

ACA

936

Leu

Ser

Tyr

Thr

Arg

Glu

Ser

Gin

Lys

Gly

Thr

300

305

310

GCG

GAT

TGC

TTG

AAC

ATG

TAT

AAC

TTC

AAT

TTA

AAA

GAT

975

Ala

Asp

Cys

Leu

Asn

Met

Tyr

Asn

Phe

Asn

Leu

Lys

Asp

315

320

325

1014

AGT

TAT

CCA

TCT

TGT

GGT

ATG

AAT

TGG

CCG

AAA

GAT

ATT

Ser

Tyr

Pro

Ser

Cys

Gly

Met

Asn

Trp

Pro

Lys

Asp =

Ele'

330

335

TCC

TTT

GTC

AGT

AAA

TTC

AGC

ACA

CCT

GGT

GTT

ATT

Ser

Phe

Vai

Ser

Lys

Phe

Ser

Thr

Pro

Gly

Vai

Ile

340

345

350

GAT

TCG

TTG

CAT

CTT

GAT

TCT

GAT

AAA

ATT

GAT

CAT

TGG

Asp

Ser

Leu

His

Leu

Asp

Ser

Asp

Lys

Ile

Asp

His

Trp

355

360

AAG

GAA

TGC

ACT

AAT

AGC

GTT

GGA

ACT

AAA

TTG

TCT

AAT

Lys

Glu

Cys

Thr

Asn

Ser

Vai

Gly

Thr

Lys

Leu

‘Ser

Asn

365

370

375

CCT

ATT

TCA

AAG

CCA

TCT

ATC

CAT

TTA

CCT

GGT

CTA

Pro

Ile

Ser

Lys

Pro

Ser

Ile

His

Leu

Pro

Gly

Leu

380

385

390

CTT

GAA

AGT

GGA

ATA

GAG

ATT

GTC

TTG

TTC

AAT

GGT

GAC

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Glu

Ile

Vai

Leu

Phe

Asn

Gly

Asp

395

400

AAA

GAC

TTG

ATT

TGT

AAT

AAC

AAG

GGC

GTA

TTA

GAT

ACT

Lys

Asp

Leu

Ile

Cys

Asn

Lys

Gly

Vai

Leu

Asp

Thr

405

410

415

ATA

GAC

AAT

CTA

AAA

TGG

GGT

GGA

ATA

AAG

GGA

TTT

AGC

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Trp

Gly

Ile

Lys

Gly

Phe

Ser

420

425

GAC

GAT

GCT

GTT

TCG

TTC

GAT

TGG

ATC

CAT

AAA

TCG

AAG

Asp

Ala

Vai

Ser

Phe

Asp

Trp

Ile

His

Lys

Ser

Lys

1053

1092

1131

1170

1248

1287

430

435

440

1209

1326

AGT ACA GAC GAC

AGC GAA GAA TTT AGC GGA TAC GTG.

£AG Lys 455

1365

Ser

Thr

Asp Asp 445

Ser

Glu Glu

Phe 450

Ser

Gly Tyr Val

TAT

GAT

AGA

AAT

TTG

ACG

TTT

GTT

AGC

GTT

TAT

AAT

GCT

1404

Tyr

Asp

Arg

Asn

Leu

Thr

Phe

Val

Ser

Val

Tyr

Asn

Ala

460

465

TCT

CAC

ATG

GTA

CCC

TTC

GAT

AAA

AGT

TTA

GTG

AGT

AGA

1443

Ser

His

Met

Val

Pro

Phe

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Arg

470

475

480

GGC

ATT

GTC

GAT

ATT

TAC

TCG

AAC

GAT

GTT

ATG

ATC

ATT

1482

Gly

Ile

Val

Asp

Ile

Tyr

Ser

Asn

Asp

Val

Met

Ile

485

490

GAC

AAC

AAT

GGG

AAA

AAT

GTT

ATG

ATT

ACT

GAC

1521

Asp

Asn

Gly

Lys

Asn

Val

Met

Ile

Thr

Asp

495

500

505

GAT

AGT

GAT

CAA

GAT

GCT

ACT

GAA

AGC

GGT

GAT

AAG

1560

Asp

Ser

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Glu

Ser

Gly

Asp

Lys

510

515

520

CCA

AAA

GAA

AAC

CTC

GAA

GAG

GAA

CAG

GAA

GCG

CAG

1599

Pro

Lys

Glu

Asn

Leu

Glu

Gin

Glu

Ala

Gin

525

530

AAT

GAG

GAA

GGA

AAG

GAA

AAA

GAA

GGC

AAT

AAA

GAT

AAA

1638

Asn

Glu

Gly

Lys

Glu

Lys

Glu

Gly

Asn

Lys

Asp

Lys

535

540

545

GAT

GGC

GAT

AAC

GAC

AAT

GAT

GAC

GAT

GAA

1677

Asp

Gly

Asp

Asn

Asp

Asn

Asp

Glu

550

555

. 1716

GAC GAT CAC Asp Asp His 560

AAC Asn

TCC GAG GGC GAC GAC GAT GAT GAC GAT

Ser

Glu 565

Gly Asp

Asp Asp

Asp Asp Asp 570

GAC

GAT

GAA

GAC

GAT

AAT

GAA

AAA

CAA

AGT

AAT

Asp

Glu

Asp

Asn

Glu

Lys

Gin

Ser

Asn

575

580

585

CAA

GGC

CTC

GAC

TAC

GTC

GTA

AGG

CCG

TTT

CTG

ACA

GAG

Gin

Gly

Leu

Asp

Tyr

Vai

Arg

Pro

Phe

Leu

Thr

Glu

590

595

1755

1794

TAA

1797

SEQ ID NQ3

Tipo de sequências Polinucleótido com correspondente polipeptídeo Comprimento da sequências 132 pares de bses Tipo de cadeias dupla

Topologias linear

Fonte experimental imediatas S. cerevisiae HT24ó/pJDB207/BAF'FLHIR-CALC

Característicass desde 1 até 7 sequência adaptadora incluindo o sítio de restrição PstI e a região codificadorada sequência de ligação clivâvel por yscF e ysc«$, desde 8 até 127 região codificadora do precursor da calcitonina humanacora glicina C-terminal, desde 125 a 132 sequência incluindo o sítio de restrição PstI

G AAG AGG GTA CAG CTG GAT AAA AGA TGT GGT AAC TTG TCT Lys Arg Vai Gin Leu Asp Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser

10

ACC	TGT	ATG	TTG	GGT	ACC	TAC	ACC	CAA	GAC	TTC	AAC AAG
Thr	Cys	Met	Leu	Gly	Thr	Thr	Thr	Gin	Asp	Phe	Asn Lys
	15					20					25
TTG	CAC	ACC	TTC	CCA	CAA	ACC	GCT	ATC	GGT	GTT	GGT GCT
Phe	His	Thr	Phe	Pro	Gin	Thr	Ala	Ile	Gly	Vai	Gly Ala
			30					35
CCA	GGT	TGA	CTGCA
Pro	Gly
40

118

132

O

SEQ ID NS4

Tipo de Sequências Polipeptídeo

Comprimento da sequências 212 aminoácidos

Topologias Linear

Característicass uesde í até 7i sequência de aminoácidos d eglina C, desde 72 até 79 sequência adaptadora, desde até 21 sequência de aminoácidos do domínio de ligação à celulose d proteína C„ fimi Exg.

Met Thr	Glu	Phe	Gly	Ser	Glu	Leu	Lys	Ser	Phe	Pro	Glu
			5					10
Vai Vai	Gly	Lys	Thr	Vai	Asp	Gin	Ala	Arg	Glu	Tyr	Phe
15					20					25
Thr Leu	His	Tyr	Pro	Gin	Tyr	Asp	Vai	Tyr	Phe	Leu	Pro
		30					35
Glu Gly	Ser	Pro	Vai	Thr	Leu	Asp	Leu	Arg	Tyr	Asn	Arg
40				45					50
Vai Arg	Vai	Phe	Tyr	Asn	Pro	Gly	Thr	Asn	Vai	Vai	Asn
	55					60					65
His Vai	Pro	His	Vai	Gly	Lys	Arg	Glu	Ala	Glu	Ala	Trp
			70					75
Vai Pro	Phe	Gly	Ala	Ser	Pro	Thr	Pro	Thr	Pro	Thr	Thr
80					85					90
Pro Thr	Pro	Thr	Pro	Thr	Thr	Pro	Thr	Pro	Thr	Pro	Thr
		95					100
Ser Gly	Pro	Ala	Gly	Cys	Gin	Vai	Leu	Trp	Gly	Vai	Asn

105

110

115

Gin Trp

Asn 120

Thr

Gly

Phe

Thr

Ala 125

Asn

Vai

Thr

Vai

Lys 130

Asn Thr

Ser

Ala 135

Pro

Vai

Asp

Gly

Trp 140

Thr

Leu

Thr

o·

Phe Ser 145

Phe

Pro

Ser

Gly

Gin 150

Gin

Vai

Thr

Gin

Ala 155

Trp

Ser Ser

Thr

Vai 160

Thr

Gin

Ser

Gly

Ser 165

Ala

Vai

Thr

Vai

Arg Asn 170

Ala

Pro

Trp

Asn 175

Gly

Ser

Ile

Pro

Ala 180

Gly

Thr Ala

Gin 185

Phe

Gly

Phe

Asn

Gly 190

Ser

His

Thr

Gly

Thr 195

Asn Ala

Ala

Pro

Thr

Ala

Phe

Ser

Leu

Asn

Gly Thr

Pro

200 205

Ο

Cys Thr Vai Gly 210 <·

Claims

íê. - Método para a produção ds uma proteína biologicamente activa, caracterizado por compreender o tratamento de uma proteina de fusão consistindo em

1. um ou mais segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo na referida o aminoácido C-terminal sequência ρο1i peρtíd ica proteína b do qua1 ligante «□logicamente activa, está ligado a uma L, os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N-terminais e, no caso de múltiplos segmentos sucessivos de proteína, os penúltimo e último resíduos de aminoácidos e também C—terminais da referida sequência de polipeptídeo ligante L sendo aminoácidos básicos seleccionados de entre Lis e

Arg e um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido C-terminal dos referidos segmentos sucessivos ds proteína, ou consistindo em um polipeptídeo etiqueta ligado ao aminoácido N-terminal de
2» múltiplos segmentos sucessivos de proteína cada um consistindo numa sequência de polipeptídeo ligante L, os primeiro e segundo resíduos de aminoácidos N—terminais assim como os penúltimo e últimpo resíduos de aminoácidos C-terminais da referida sequência polipeptídica ligante L sendo aminoácidos básicos seleccionados entre Lis e Arg a o último aminoácido básico da referida sequência polipeptídica ligante L estando ligado à referida proteína biologicamente activa, com a endoprotease solúvel de levedura yscF e com a carboxipeptidase solúvel de levedura yscu, e isolamento da referida proteína ! biologicamente activa,

2â. - Método de acordo com a reivindicação i, caracterizado por a proteína de fusão ter a fórmula

CP-L) -T m

T-íL-P) (I) ou (II) , em que P é a proteína biologicamente activa, L tem o significado dado na reivindicação í, T é um polipeptídeo etiqueta, m é um inteiro entre 1 e 1© e n é um inteiro entre 2 s 1©.
3ã. - Método de acordo com a reivindicação í, caracterizado por a proteína de fusão ter a fórmula

CP-L) -Τ (I)

ÍH em que P, L e s têm os significados dados atrás e m é í
4sl» - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína biologicamente activa ser ds origem procariética ou eucariótica.
5â. - Método da acordo com rizado por a proteína biologicamente a reivindicação 1, caracteactiva ser de origem mamífera.

í, usracttÍ” hormona, um ti-virais e de c oa q u1a— regulador do
6â. - Método de acordo com a reivindicação rizado por a proteína biologicamente activa ser uma polipeptídeo com propriedades imunomoduladoras, an anti-tumorais, um anticorpo, antigénio virai, factor ção do sangue, uma agente fibrinolítico ou um factor c rescimen to»
7é. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractérizado por a proteína biologicamente activa ser seleccionada do grupo constituido por interferão g humano, um interferão híbrida, um activador do plasminogénio tipo tecido humano, activador do plasminogénio tipo urocinase de cadeia simples humana, u.m activador do plasminogénio híbrido, humano β, calcitonina humana, factor de crescimento transformante factor de crescimento I e II tipo insulina e dessulfato-hirudina.
8â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência polipeptídica ligante L compreender 2 a 20 resíduos de aminoácidos e conter um ou mais pares ds aminoácidos básicos, desde que os primeiro e segundo aminoácidos N—terminais assim como os penúltimo e último aminoácidos C-tsrminais representem um par de aminoácidos básicos» rizado dipept
9â. - Método de acordo com a reivindicação 1, caractepor a sequência polipeptídica ligante L ser um radical dilo seleccionada entre Arg-Arg, Lis-Arg, Lis-Lis e

Arg—Lis»
10ê« — Método de acordo com a reivindicação í« caracte— rizado por o polipetídeo etiqueta T consistir em cerca de 10 a 1000 resíduos de aminoácidos» llã rizado por m ser r usi inteiro entre 1 e

12ã.

Método ds acordo com a reivindicação t-HF* HC IS*“ rizado por n ser um inteiro entre
13®. - Método de acordo com a reivindicação i₅ caracterizado por yscF solúvel ser uma muteína da endoprotes.se de levedura yscF em que o sítio hidrofóbica de ligação à membrana foi eliminado.
14â» rizado por ysca

Método de acordo com a reivindicação 1, caractesolúvel ser uma muteína da carboxipeptidase de levedura ysca em que o sítio hidrofóbico de ligação ã membrana foi eliminado»
15®. - Método ds acordo com a reivindicação í , caracterizado por ser realizado numa solução tamponada a pH entre cerca de e cerca de 7,5 numa gama de temperatura entre cerca ds 25 °C e cerca de 37°C«
16®. - Método de acordo com a reivindicação í. rizado por a digestão com yscF solúvel ser realizada na tíe iSes ΟβΛ ‘ .

caractepresença caractsÍ7â» - Método de acordo com a reivindicação rizado por a proteína de fusão ser tratada com uma mistura ds digestão contendo yscF solúvel e yscct solúvel»

Ζ

-¾^ « rizado por so1ú ve1 e, .,’·’

Λ* - 'ΤΌΤ *iS

HVÇSV. <

Í8â. - Método de acordo com a reivindicação í, caracte a proteína de fusão ser primeiro tratada com ysc quando a digestão está adiantada ou está completa então com ysc« solúvel.

Lisboa, ló de Julho de 1991

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3“ 1200 LISBOA