PT92210B - Processo para a producao de uma nova enzima de glucose isomerase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a novas glucose isomerases que são apropriadas para aplicação em processos industriais especialmente na transformação de glucose em frutose. A invenção refere-se também ao uso destas novas enzimas na pro dução de xaropes de frutose, em particular xaropes de cereais com alto teor de frutose.

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO

A glucose isomerase catalisa a isomeração reversível de glucose com obtenção de frutose. A frutose é actual mente correntemente aplicada como substituto do açúcar devido

N.

ao seu maior poder edulcorante em comparação com, por exemplo, sacarose e glucose. Sabe-se que muitos microrganismos produzem glucose isomerase; ver, por exemplo, os artigos de revisão por Wen-Pin Chen em Process Biochemistry, 15, Junho/Julho (1980)

- 41 e Agosto/Setembro (1980) 36 - 41, em que figura uma lis ta com um grande número de microrganismos capazes de produzir glucose isomerase.

Diversos microorganismos têm sido aplicados industrialmente. O artigo de Wen-Pin Chen descreve as condições de cultura dos microrganismos e o processo de recuperação e purificação da glucose isomerase produzida.

A produção de glucose isomerase, que é uma en zima intracelular, é relativamente cara. Desenvolveram-se formu lações especiais para permitir a contínua e repetida utilização da enzima. Imobilizando a enzima, usualmente sob a forma insolú vel em água, ela pode ser utilizada tanto em processos descontí nuos por cargas como em processos contínuos (por exemplo, em reactores com leito com enchimento). Um dos inconvenientes mais importantes da imobilização de glucose isomerase é a diminuição essencial da sua actividade específica devido ã presença de material inerte. A situação torna-se ainda pior durante a aplicação porque a glucose isomerase é inactivada a elevadas temperaturas. Uma perda irreversível de actividade será o resultado da deterioração provocada pelo calor.

Não obstante os esforços realizados no sentido de se manter a estabilidade da enzima, ainda se verifica per da de actividade nas condições normais de aplicação. Há portanto uma contínua necessidade de obtenção de novas enzimas como glucose isomerase com melhores propriedades. A melhor termoesta bilidade da glucose isomerase permite tomar vantagem do facto de o equilíbrio se deslocar no sentido da formação da frutose a temperaturas mais altas. A maior parte das glucose isomerases são aplicadas a pH 7,5. No entanto, a frutose não é estável a este pH. Há portanto a necessidade de obter glucose isomerase que podem ser aplicadas a valores de pH inferiores a 7,5.

Ê possível desenvolver ou encontrar enzimas com propriedades aperfeiçoadas de diversas maneiras, por exem pio, por métodos de escolha clássicos, por modificação química de proteínas existentes ou usando técnicas de engenharia genética e de proteínas modernas.

A escolha de organismos ou de microrganismos que possuem a actividade enzimática pretendida pode realizar-se por exemplo isolando e purificando a enzima de um microrganismo ou do sobrenadante de uma cultura desse microrganismo, deter minando as suas propriedades bioquímicas e verificando se essas propriedades bioquímicas satisfaçam as exigências para a aplicação.

Se não se pode obter a enzima identificada a partir do seu microrganismo produtor natural, é possível empre gar o gene que codifica a enzima, expressar o gene noutro organismo, isolar e purificar a enzima expressada e ensaiar se é apropriada para a aplicação pretendida.

É possível conseguir a modificação de enzimas inter alia por métodos de modificação química. Ver, por exemplo I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44 (1976), 237 - 291. Em geral, estes métodos são demasiadamente não específicos na medi da em que modificam todos os resíduos acessíveis com cadeias la terais comuns ou dependem da presença de aminoácidos apropriados para serem modificados e muitas vezes são incapazes de modi ficar os aminoácidos difíceis de atingir, a não ser que a molécula da enzima esteja não dobrada.

A modificação da enzima por mutagênese do gene codificante não sofre os aspectos específicos acima menciona dos e, por consequência, pensa-se que seja superior. A mutagénese pode conseguir-se ou por mutagênese ao acaso ou por mutagénese dirigida no sítio.

A mutagênese ao acaso, realizada por tratamen to de microrganismos completos com mutagéneses químicos ou com

radiação que provoca a mutagénese, pode evidentemente ter como resultado a obtenção de enzimas modificadas mas então são neces sários protocolos de selecção fortes para se obterem mutantes com as propriedades desejadas. Pode conseguir-se uma maior probabilidade de se isolar enzimas mutantes pretendidas por mutagé nese ao acaso clonado o gene codificante, mutagenizando-o in vitro ou in vivo e expressando a enzima codificada reclonando o gene mutado numa célula hospedeira apropriada. Também neste caso se tem de dispor de protocolos de selecção biológica apropriada a fim de escolher as enzimas mutantes pretendidas. Estes protocolos de selecção biológica não seleccionam especificamente enzimas apropriadas para aplicação na produção de frutose.

A mutagénese dirigida no sítio (SDM) é a maneira mais específica de se obter enzima modificada, permitindo a substituição específica de um ou mais aminoácidos por qualquer outro aminoácido pretendido.

SUMÃRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, proporcionam-se novas flucose isomerases mutantes, obti das por expressão de genes que codificam as referidas enzimas tendo sequências de aminoácidos que diferem em pelo menos, um aminoácido em relação às correspondentes glucose isomerases de tipo nativo e que possuem propriedades aperfeiçoadas.

De acordo com outro aspecto da presente inven ção, proporciona-se um processo para a preparação dessas novas glucose isomerases mutantes, baseadas em modificações das inter acções intermoleculares e intramoleculares das correspondentes enzimas naturais.

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para seleccionar enzimas com propriedades aperfeiçoadas durante a aplicação industrial .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa a cinética da inactivação pelo calor de glucose isomerase isenta de metais de EcoAmi (DSM) GI em MOPS 50 mM, pH igual a 7,2, a 25°C. Não se adicionou metal.

A Figura 2 representa ção pelo calor em condições semelhantes 2+ nando 10 mM de Mg a cinética da inactivaà Figura 1 mas adicioção pelo cionando calor 10 mM em de

A Figura 3 representa condições semelhantes Co²⁺.

a cinética da inactivaãs da Figura 1 mas adiA Figura 4 é uma representação gráfica de Arrhenius da dependência da temperatura da inactivação pelo calor de EcoAmi (DSM) GI em MOPS 50 mM, a pH 7,2 a 25°C.

A Figura 5 representa a dependência do pH da inactivação pelo calor de EcoAmi (DSM) GI a 72°C na ausência de metal adicionado. CHES = ácido 2-(ciclo-hexilamino)-etano-sulfónico.

A Figura 6 representa o efeito da força iónica sobre a cinética da inactivação pelo calor de EcoAmi (DSM)

GI isenta de metais em 50 mM de MOPS, pH 6,7, 72°C. Não se adiciona metal.

A Figura 7 representa o efeito da força iónica sobre a cinética da inactivação pelo calor de EcoAmi (DSM)

GI isenta de metal em 50 mM de MOPs, pH 7,6, 72°C. Ausência de metal adicionado.

A Figura 8 representa o resultado do ensaio de SEC-HPLC de EcoAmi (DSM) depois de incubação prolongada de EcoAmi(DSM) GI em ureia 7 M a 25°C.

A Figura 9A representa os resultados do ensaio de SEC-HPLC de EcoAmi (DSM) GI pré-tratada com cianato a 25°C na ausência de ureia. 0 tampão de eluição era Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NaN₃ a 0,02 %.

A Figura 9B representa os resultados de PAGE natural de EcoAmi(DSM) GI tratada com cianato a 25°C na ausência de ureia.

A Figura 10A representa os -HPLC de EcoAmi (DSM) GI tratada previamente sença de ureia 5 M a 25^UC.

A Figura 10B representa os saio PAGE natural de EcoAmi (DSM) GI tratada sença de ureia 5 M a 25°C.

resultados de SECcom cianato na pre resultados com cianato do enna pre

A Figura II representa a reacçao de glicação de EcoAmi (DSM) GI em 50 mM de MOPS, pH 7,7 a 6o°C.

Círculos abertos: sem glucose adicionada. Círculos com o interior enegrecido: +250 mM de glucose. Triângulos: a incubação com glucose (250 mM) foi seguida por diálise extensiva para ensaiar a reversibilidade.

A Figura 12 representa a cinética da inactividade pelo calor da mutante K253Q de EcoAmi (DSM) GI.

A Figura 13 representa a cinética da dissociação tetrâmero-dímero a 25°C em ureia 5 M de mutante K253R de EcoAmi (DSM) GI.

A Figura 14 representa a cinética da inactivação provocada por glicação da mutante K253R de EcoAmi (DSM)

GI a 60°C em fosfato de potássio 12,5 mM, pH 7,7.

A Figura 15Arepresenta a estrutura de pMa/ /c5-8.

No vector de tipo pMa, o nucleõtido 3409 é alterado de A para G, enquanto no vector do tipo pMc o nucleõtido 2238 é alterado de G para C, criando codões de interrupção âmbar no gene de cio ranfenicol acetil transferase e o gene de /3-lactamase, respectivamente, tornando os genes inactivos (P. Stanssens et al. (1987) em Oligonucleotide-directed construction of mutations by the gapped duplex DNA method using the pMa/c plasmid vectors, manual usado no curso laboratorial EMBO, Directed Mutagenesis and Protein Engineering realuzado no Max Planck Institut fíir Biochemie, Martinsried, Julho 4 - 18, 1987).

A sequência representada na Figura é a de pMa5-8.

A Figura 15B representa a sequência do promotor p tal como se encontra presente no vector de expressão pMa/c5p„ (substituindo os nucleótidos 3754 a 3769 de pMa/c5-8).

A Figura 15C representa a sequência tac promotora tam como se encontra presente no vector de expressão pMa/c5T (substituindo os nucleótidos 3754 a 3769 de pMa/c5-8).

A Figura 16 representa a sequência de genes completa e a sequência de aminoácidos de glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis de tipo natural.

A Figura 17 representa um mapa físico da unidade de expressão de glucose isomerase (GI) em pMa/c-Ι. As posições de sítios de restrição relevantes, o promotor p_R e a região de codificação da proteína estão indicadas. Os asteriscos indicam os sítios de restrição introduzidos pela mutagénese dirigida no sítio.

A Figura 18 representa as propriedades da mutante de glucose isomerase a vários valores de pH.

AmiWT : glucose isomerase do tipo natural de A, missouriensis produzida a partir do plasmídeo pMa-1.

AmiK253R: mutante K253R de glucose isomerase produzida a partir de plasmídeo pMa-I.K253R mutado.

Estão representados graficamente valores determinados de pa7

ra AmiWT ([]) e AmiK253R (o). Pode ver-se que AmiK253R tem um valor de mais conveniente ao longo de um largo intervalo de pH.

A Figura 19 representa a sequência completa do genes e a sequência de aminoácidos derivada de glucose isomerase do tipo natural de Streptomyces murinus.

A Figura 20 representa o mapa físico da unida de de expressão de glucose isomerase (GI) em pMa/c-GIsmul. As posições dos sítios de restrição relevantes, o promotor Tac e a região de codificação de proteína estão indicados.

A Figura 21 representa o alinhamento de sequências de aminoácidos de glucose isomerases de diferentes ori gens. Refere-se a sequência completa para a glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis, enquanto para as glucose isomerases de outras origens apenas se mostram os resíduos de aminoá eidos diferentes dos de glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis . A sequência da glucose isomerase de Ampullariella é diferente da sequência publicada (Saari, J. Bacteriol., 169 (1987) 612) por meio de um resíduo: a Prolina 177 da sequência publicada verificou-se ser uma Arginina.

A sequência de Streptomyces thermovulgaris foi estabelecida até ao aminoãcido 346; os resíduos indeterminados são indicados por um bloco (').

Um traço (-) indica a ausência de um resíduo de aminoãcido nesta posição em comparação com qualquer das outras sequências.

As diferentes espécies são indicadas pelos seguintes símbolos:

Ami : Actinoplanes missouriensis DSM 4643

Amp : Ampullariella species 31351

Art : Arthrobacter species

Smu : Streptomyces murinus DSM 40091

Svn : Streptomyces violaceoniger CBS 409.73

Svr : Streptomyces violaceoruber LMG 7183

Sth : Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, as enzimas mutantes de glucose isomerase podem designar-se com base num exame cuidadoso da estrutura das glucose isomerases de tipo natural em combinação com uma cuidadosa investigação bioquímica do processo que conduz à inactivação das glucose isomerases ori ginais, sob as condições de aplicação, seguida por uma modificação racional da sequência genética do tipo natural. A investi gação aprofundada de mutantes modificadas sob condições de apli cação industrial teve como resultada a identificação de mutantes com propriedades aperfeiçoadas.

Pela expressão propriedades aperfeiçoadas, tal como é utilizada na presente memória descritiva em ligação com as presentes enzimas de glucose isomerase, pretende-se significar que se obtém um maior rendimento de transformação e/ ou melhor estabilidade, em especial estabilidade ao calor, relativamente âs correspondentes enzimas do tipo natural. Além disso, um aumento da estabilidade a diferentes valores de pH co mo tal ou em combinação com maior estabilidade térmica é também considerado como incluído dentro do significado da pressão propriedades melhoradas.

A presente invenção baseia-se na descoberta de que a actividade de certas enzimas é óptima quando a enzima está numa forma multimérica (dimérica, trimérica, tetramérica, etc.) e a mencionada actividade pode diminuir devido ã perda de interacção entre as subunidades. Por exemplo, verificou-se que a actividade enzimática glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis é única na estrutura tetramérica. Esta actividade é substancialmente perdida mediante dissociação da estrutura do tetrâmero natural com obtenção de dímeros.

Portanto, a presente invenção proporciona novas glucose isomerases mutantes em que a interacção entre subunidades (monómeros, dímeros, etc.) é melhorada obtendo-se como resultado propriedades aperfeiçoadas das enzimas, especial9

mente sob condições de aplicação. A invenção proporciona também métodos para aumentar as interacções entre sub-unidades de glucose isomerase.

De acordo com uma realização preferida, a estabilização da estrutura tetramérica de glucose isomerase é con seguida fortalecendo a interacção entre os dímeros no tetrâmero.

Um método apropriado para aumentar a estabili dade da estrutura tetramérica consiste, por exemplo, em introdu zir pontes iónicas. Sabe-se que os efeitos electrostáticos desempenham um papel fundamental na função e estruturas das enzimas (veja-se J. A. Matthew et al, CRC Criticai Reviews in Biochemistry, 18 (1985) 91 - 197). Elas são responsáveis por exemplo da dependência do pH da catálise por enzimas visto que o va lor óptico para uma determinada proteína é determinada pela pre sença de grupos ionizáveis que rodeiam o sítio activo. As inter acções electrostáticas envolvidas nas ligações de hidrogénio e nas pontes iónicas (sais) são importantes para estabilizar a es trutura global da proteína (veja-se A. J. Russell e A. R.

Fersht, Nature 36 (1987) 496 - 500). De acordo com a hipótese de que a dissociação dos tetrâmeros de glucose isomerase com obtenção de dímeros é principalmente responsável pela desnaturação da enzima, este processo pode ser evitado introduzindo nas interfaces interacções de estabilização adicionais tais como pontes de sais suplementares.

Para introduzir as novas pontes de sais numa dada proteína, uma possibilidade consiste em substituir dois resíduos vizinhos em aminoácidos com cargas opostas como, por exemplo, Asp e Arg e, em seguida verificar, por exemplo, por meio de mapa de cálculos de energia que se podia formar uma interacção iónica. Esta introdução de uma nova ponte necessita de mutações em dois pontos. Como variante, pode criar-se uma ponte de sal substituindo um resíduo perto de um aminoácido carregado isolado criando assim um par iónico por meio de uma mutação num único ponto.

Um outro método apropriado para aumentar a es tabilidade da estrutura trimérica é a introdução de pontes de dissulfureto. As ligações de dissulfureto são uma característica comum de muitas proteínas extracelulares, sendo este efeito um dos melhor compreendidos. É vulgarmente explicada por uma di minuição da entropia no estado desdobrado mas diversos factos continuam por explicar por uma tal tão simples descrição. T. E. Creighton, Bioessays J3 (1988) 57 - 63 mostra que a perturbação introduzida no estado natural também precisa de ser tomada em consideração.

Muitas tentativas foram feitas e descritas na literatura para realizar as pontes de dissulfureto, com sucesso variável. Pantoliano et al., Biochemistry 26 (1987) 2077 -2082, tendo introduzido dois resíduos de cisteína em subtilisina por meio de mutações pontuais no gene, obtêm um aumento de 3°C da temperatura de fusão. J. E. Villafranca et al. , Biochemistry 26 (1987) 2182 - 2189, introduziram um resíduo de cisteína por mu tação pontual em di-hidrofolato redutase e aproveitaram a vanta gem da presença de uma cisteína livre na enzima natural para formar uma ponte de dissulfureto. Esta ligação de dissulfureto, no entanto, tem um efeito inesperado, visto que a enzima mutante não tem resistência aumentada à desnaturação térmica mas é mais resistente ã desnaturação por cloridrato de guanidina. Nes tes dois casos, as enzimas mutadas não são tão estáveis como se esperava.

Estas duas maneiras de proceder usuais são apropriadas para fazer uma mutação ou de um ponto duplo ou de um ponto único, como se referiu acima. Para proteínas multiméri cas (enzimas) constituídas por unidades monoméricas relacionadas por um eixo de simetria, pode existir uma terceira possibilidade: criar uma ponte de dissulfureto por meio de uma mutação de ponto único sem qualquer necessidade de um resíduo Cys livre. Este método foi utilizado com êxito por Sauer et al., Biochemis try 25 (1986) 5992 - 5998, no repressor lambda: eles conseguiram um aumento de 10°C da temperatura de fusão, um aumento de 60% da resistência em relação â desnaturação por ureia e além

disso a constante de ligação foi melhorada.

Como um requisito prévio para este último método, é necessário um eixo de simetria entre pelo menos dois monómeros. Como um eixo de simetria é também um eixo de rotação uma das propriedades destes eixos é que a distância entre um ponto e o eixo durante a realização de rotações se mantém. Assim, uma mutação pontual introduzida perto do eixo de simetria de uma estrutura multimérica é reproduzida muito perto deste ponto. Este método oferece a vantagem de se introduzir uma ponte de dissulfureto intermonomérica por uma mutação de um ponto único.

De acordo com outra forma de realização prefe rida da presente invenção, consegue-se obter uma estabilidade aperfeiçoada da estrutura tetramérica de glucose isomerase estabilizando a estrutura dimérica. Isso pode ser considerado como se a desnaturação da enzima seja uma reacção pelo menos par cialmente reversível de transformação do tetrâmero nos dímeros e uma subsequente dissociação dos dímeros em dois monómeros, ca da um deles. Estabilizando a estrutura dimérica, a desnaturação do dímero prossegue mais lentamente e por consequência melhora a reassociação com formação de tetrâmeros. As substituições que diminuem a susceptibilidade da estrutura monomérica e/ou diméri ca por modificação química pode ter também um efeito de estabilização visto que contrariam a irreversibilidade do desdobramen to da proteína.

De acordo ainda com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, a estrutura tetramérica é estabelecida indirectamente estabilizando a estrutura dimérica ou mesmo a estrutura monomérica da glucose isomerase por meio de mutações especiais. Alterando o empacotamento das estruturas monomérica e/ou dimérica, a liberdade conformacional de cada uma das partes da estrutura tetramérica é diminuída o que provoca um efeito de estabilização.

É evidente que mutações que estabilizam as

interacções entre subunidades de enzimas é também capaz de estabilizar interacções entre domínios (que se dobram) dentro de uma proteína monomérica. Para se ter uma ideia sobre a significação mais pormenorizada dos termos subunidades” e domínios, faz-se referência ao pedido de patente de invenção copendente ............que também foi depositado em 17 de Julho de 1989.

Ê também evidente aos peritos no assunto que, caso se pretenda proporcionar glucose isomerase com estabilidade diminuída, as forças de estabilização como se descrevem acima podem ser enfraquecidas aplicando processos semelhantes. Mutantes com essas propriedades e processos para a obtenção dessas mutantes fazem também parte do âmbito da presente invenção.

Na presente memória descritiva, utiliza-se pa ra os aminoácidos tanto o código de três letras como o código de uma letra. Este código figura na seguinte Tabela 1.

Tabela 1

Alanina	Ala	A	Leucina	Leu	L
Arginina	Arg	R	Lisina	Lys	K
Asparagina	Asn	N	Metionina	Met	M
Acido aspártico	Asp	D	Fenilalanina	Phe	F
Cisteína	Cys	C	Prolina	Pro	P
Acido glutãmico	Glu	E	Serina	Ser	S
Glutamina	Gly	G	Triptofano	Trp	W
Histidina	His	H	Tirosina	Tyr	Y
Isoleucina	Ile	I	Valina	Vai	V

A invenção proporciona também um processo para aperfeiçoar a interacção entre subunidades de glucose isomerase que se baseia na obtenção de uma estrutura tridimensional (3D) das moléculas. A informação da estrutura 3D da enzima (ou complexo da enzima) é de grande importância paraser possível fazer previsões relativamente ãs mutações que podem ser in- 13 -

troduzidas.

Foram indicados dados estruturais de glucose isomerase de Streptomyces rubiginosus (Carell et al., J. Biol. Chem. 259 (1984) 3230 - 3236), de Streptomyces olivochromogenes (Farber et al. , Protein Eng. 1^ (1987) 459 - 466) e de Arthrobacter (Henrick et al♦ , Protein 1_· (1987) 467 - 475) .

Muito embora não haja ã disposição dados sobre a sequência dos aminoácidos para estas enzimas, a homologia estrutural 3D com glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis é muito grande (veja-se F. Rey et al. , Protein (1988)

165 - 172) . Para mostrar a aplicabilidade geral do método referido na presente memória descritiva, clonaram-se e sequenciaram-se os genes que originam glucose isomerase de várias espécies. As sequências de aminoácidos de glucose isomerases deduzidas dos genes de Streptomyces violaceoruber, streptomyces murinus, Arthrobacter spec. e Streptomyces thermovulgaria verificou-se que são homólogos. As sequências de aminoácidos publicadas para as glucose isomerases de Ampullariella sp. (Saari, ibid.) e de Streptomyces violaceoniger (Nucl. Acids Res. 16 (1988) 9337), deduzidas a partir de sequências de nucleótidos dos respectivos genes apresentam uma apertada homologia com a glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis. Além disso, a memória descritiva do Pedido de Patente da Organização Mundial da Propriedade industrial WO 89/01520 refere que a sequência de aminoácidos da glucose isomerase de Streptomyces rubiginosus é homóloga da glucose isomerase de Ampullariella sp.

A despeito da ausência dos dados estruturais 3D para a maior parte das glucose isomerases, pode concluir-se que todas as glucose isomerases de Actinomycetales têm uma organização tetramérica semelhante.

De acordo com um aspecto da presente invenção é possível introduzir pontes iónicas em glucose isomerase proce dendo da seguinte maneira. O tetrâmero de glucose isomerase é * seleccionado atendendo a que os resíduos carregados negativamen

te (Asp e Glu, ionizados a valores de pH como os usados nas con dições de aplicação em questão) cujos agrupamentos de carboxila to estão pelo menos distanciados δδ de possíveis átomos carrega dos positivamente (átomos de azoto distantes de Lys e de Arg). Verificou-se que catorze resíduos satisfazem este critério. Entre estes candidatos, escolhem-se os resíduos que participam nas interfaces e, além disso, estão situados no interior da proteína. Esta última condição é introduzida com o fim de se eliminar a possibilidade de formação de pontes de sais na superfície da proteína que se espera tenham menores efeitos sobre a estabilidade global (resíduos carregados expostos podem na realidade ser envolvidos na ligação de hidrogénio a moléculas de água e interactuar com contra-iões). Por conseguinte, a criação de nova ponte de sal que envolve um resíduo enterrado combina duas contribuições estabilizantes: primeiramente, a remoção da existência (desfavorável) de uma carga isolada enterrada e, em segundo lugar, a criação de um par iónico protegido contra a influência do substrato ou do dissolvente.

Entre os 14 resíduos carregados negativamente e isolados em glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis, estão situados nas interfaces: Asp 146, Glu 221 e Asp 264.

Eles estão relativamente enterrados (respectivas superfícies acessíveis no tetrâmero: 46,9 e 42 8²). De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, criam-se novas pontes de sais, usando processos descritos anteriormente na pre sente memória. Ê possível introduzir mutações semelhantes noutras glucose isomerases, por exemplo, as obtidas a partir das origens anteriormente referidas.

Usando as técnicas acima descritas ou outras técnicas conhecidas pelos peritos no assunto, podem-se fazer vá rios outros mais mutações pontuais a fim de melhorar a estabili dade da estrutura de glucose isomerase tetramérica. (Para os dados estruturais da glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis , veja-se F. Rey et al., ibid.). Entre elas, as seguintes mutações referem-se à estabilidade de uma subunidade monomérica:

- substituição dos resíduos de Gly noutros re síduos (hélice B) com o objectivo de diminuir a entropia do estado desdobrado;

- excisão de um laço flexível (entre hélice

G e cadeia φ H) para reduzir a superfície hidrofóbica exposta;

- introdução de um resíduo de Pro no começo da cadeia /3 E (diminuição de entropia no estado desdobrado);

- mutação em Phe (hélice Λ G) com o fim de formar um arranjo aromático para colocar uma contribuição extra na estabilização da estrutura da proteína.

De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção a substituição da arginina por lisina efectua-se em sítios na molécula de glucose isomerase, cuja estabilidade se procura aumentar. Ambos os resíduos têm de se acomodar estericamente na estrutura 3D da proteína.

Nas proteínas, os resíduos de lisina mas não os de arginina são aptos a sofrer modificação química. Assim, sabe-se que o grupo épsilon amino na lisina reage com aldeídos e cetonas para originar aductos de bases de Schiff e outros pro dutos de modificação que eventualmente tem como resultado a per da de actividade biológica (veja-se, por exemplo, P. Higgins e H. Bunn, J. Biol. Chem. 256 (1981) 5204 - 5208) . De maneira par ticular, nas aplicações de glucose isomerase em que se encontram presentes altas concentrações de glucose e de frutose a elevadas temperaturas, essas modificações químicas são um factor importante na inactivação da enzima. Quando ocorrem resíduos de lisina dentro das interfaces entre domínios e/ou subuni dades, a modificação química nesses sítios tem provavelmente a provocar a dissociação do domínio ou da sununidade e/ou embaraçar a reassociação correcta das subunidades e/ou domínios que consequentemente são irreversivelmente capturados no estado dis sociado. Nesses sítios, as mutações de resíduos de lisina com obtenção de resíduos de arginina eliminam as modificações quími cas que envolvem o grupo épsilon amina da lisina. A este respeito, menciona-se como referência o pedido de patente da Re16

querente copendente, também depositado em 17 de Julho de 1989.

Substituindo os resíduos de lisina em glucose isomerase por resíduos de arginina, a extensão da modificação e o seu efeito sobre a actividade enzimática e/ou estabilidade é reduzido. Por consequência, uma substituição de um resíduo de arginina por lisina melhora a estabilidade da glucose isomerase durante a aplicação.

Também nos sítios que acomodam as mutações de arginina por lisina, uma substituição dos resíduos de lisina pe los resíduos de arginina têm como efeito um aumento da estabili dade da proteína. Como a flexibilidade da cadeia lateral para a arginina é menor do que para a lisina, devido à presença do grupo guanidínio, a mutação da lisina por arginina é favorecida por razões de entropia. Além disso, o grupo guanidínio é capaz de formar mais ligações hidrogénio com resíduos vizinhos na pro teína o que provoca também uma melhor estabilidade.

De acordo ainda com uma forma de realização preferida da presente invenção, particularmente quando se procura realizar a melhoria da estabilidade térmica de glucose isomerase, pelo menos um resíduo que ocorre inicialmente e de maneira particular numa localização do tipo definido mais adian te na presente memória descritiva é trocado por arginina. A substituição de arginina por lisina aumenta as interacções electrostáticas em que o resíduo de arginina substituto então participa, particularmente interacções no interior da interface en tre subunidades e/ou domínios. Nesta forma de realização, o resíduo de lisina a ser substituído devia preferivelmente satisfa zer os seguintes requisitos relativamente â conformação da proteína natural dobrada:

1. 0 resíduo a ser substituído devia ser directamente envolvido nas interacções electrostáticas, preferivelmente na interface entre subunidades e/ou domínios.

2. A mutação devia ocorrer num sítio que pode estericamente acomodar o resíduo de aminoácido que é introduzido.

3. 0 resíduo devia ocorrer num sítio de pequena acessibilidade e preferivelmente ser parte de uma interface entre subunida des e/ou domínios.

Preferivelmente devia procurar colocarem-se resíduos de aminoácidos em glucose isomerase que, enquanto satisfazem os critérios (1) e (2), tem a mínima área superficial acessível (ASA) na proteína, requerendo simultaneamente que a ASA tenha um valor mais baixo do que a média determinada para os dados resíduos. Em sítios que satisfazem estes requisitos prévios, a arginina, em comparação com a lisina, proporciona uma interacção electrostãtica devido ãs propriedades fisicoquímicas do seu grupo de guanidínio da cadeia lateral (veja-se, por exemplo, D. Wigley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.

149 (1987) 927 - 929) .

Pretende-se geralmente reter uma quantidade substancial de actividade enzimática das glucose isomerases mu tantes, modificadas como se refere na presente invenção. Para reter essa actividade enzimática, os resíduos de aminoácidos que devem ser substituídos deviam preferivelmente não ser aque les que foram identificados como resíduos catalíticos ou como sendo substancialmente envolvidos na ligação do cofactor.

É evidente que uma substituição específica do aminoãcido de acordo com a presente invenção pode modificar a estabilidade da glucose isomerase por meio dos efeitos combinados acima mencionados, por exemplo, efeitos tais como a alteração da intensidade de uma interacção electrostãtica, alteração do número de ligações de hidrogénio com resíduos vizinhos, alterando a entropia conformacional da enzima ou influenciando a extensão da modificação química.

Uma glucose isomerase mutante de acordo com a presente invenção pode obter-se de acordo com a seguinte maneira de proceder geral. Em primeiro lugar realiza-se uma cuidadosa análise do mecanismo ou dos mecanismos envolvido ou envolvidos na inactivação da glucose isomerase sob as condições

específicas de desnaturação. Utilizando os conhecimentos obtidos na referida análise, pode então identificar-se os resíduos específicos de lisina ou de arginina que são candidatos para a substituição. Isto faz-se por cuidadoso exame da estrutura 3D da enzima, determinada por processos tais como cristalogrãficos (H. Wyckoff et al., (1985) Difraction Methods for Biologi cal Macromolecules, Meth. Enzymol. Volumes 114 - 115, Acad. Press), de análise de ressonância magnética nuclear (K. Wuthrich, (1986) em MNR of Proteins and Nucleic Acids, J. Wiley and Sons) ou, como variante, a partir de previsão da estrutura baseadas em análise da estrutura primária (para uma revisão, veja-se W. Taylor, Protein Engineering 2 (1988) 77) ou derivações da estrutura baseadas nas estruturas 3D disponíveis a partir de proteínas homólogas (veja-se, por exemplo, T. Blundell et al., Nature 326 (1987) 347) .

Finalmente, a substituição do resíduo de aminoácido situado num sítio preferido pode realizar-se por proces sos conhecidos, particularmente mutagénese dirigida para o sitio da sequência de ADN que codifica a glucose isomerase, usando por exemplo os vectores e os procedimentos descritos por Stanssens et al. (ibid.) e as estirpes de bactérias descritas por Zell e Fritz (EMBO J. (1987) 1809) .

As mutações acima mencionadas são apenas indicadas a título de ilustração da presente invenção sem pretensão de limitação do seu âmbito. A invenção é ilustrada pelos se guintes exemplos não limitativos.

A não ser que se especifique de outra maneira nos exemplos, todos os procedimentos para a obtenção e manipula ção de ADN recombinante foram realizados de acordo com as manei ras de proceder estandardizados descritas por Maniatis et al. (1982).

Os seguintes plasmídeos, vectores e estirpes de bactérias, utilizados ou preparados nos exemplos foram depositados na Deutsche Sammlung fíir Mikroorganismen, Gõttingen,

Alemanha Ocidental, de acordo com as prescrições do Tratado de Budapeste ou no Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS),

Holanda:
pMc5-8	DSM	4566
pMa5-8	DSM	4567
pECOR251	DSM	4711
E. coli K527	CBS	471.88

Exemplo 1

Isolamento e clonagem do gene de glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis (DSM 43046) e produção de D-glucose isomerase em E. coli

D-glucose isomerase (GI) é usado sinonimamente para D-xilose isomerase (D-xilose cetol isomerase, EC 5.3.1. .5), uma enzima que transforma D-xilose em D-xilulose. A D-glucose isomerase de Actinopianes missouriensis por estirpes de E. coli modificadas é designada como EcoAmi (DSM) GI. Para distinguir o gene de Actinopianes missouriensis que codifica GI a par tir do gene análogo de E. coli xylA é designado como GI.

ADN total de Actinopianes missouriensis DSM 43046 foi particularmente digerido com Sau3A. O produto da digestão foi fraccionado num gradiente de sacarose e ligaram-se os fragmentos com comprimentos compreendidos entre 2 e 7 quilobases (kb) no sítio único BglII de plasmídeo pECOR251. Transformou-se a estirpe E. coli AB 1886 deficiente em xilose isomerase - como descrito em Howard-Flanders et al. (Genetics 53 (1966) 1119) e derivada da estirpe E. coli AB 1157 (DSM 1563) com a mistura de ligação e subsequentemente desenvolveu-se em chapas de agar mínimo (Miller (1972) em Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Estados Unidos da América) suplementado com 100 mg/litro de ampicilina e 0,2% (peso/volume) de xilose (MMX) Recuperaram-se trinta e sete clones (designados pAMIl-137) e desenvolveram-se em meio LB contendo 100 mg/litro de ampicilina

Isolou-se ADN de plasmídeo recombinante e analisou-se por digestão de restrição. Foi possível reconhecer dois grupos de plasmídeos, um (por exemplo, pAMI7) contendo um inserto de 2,8 kb e a outra contendo um inserto de 4,0 kb. Uma análise de restriç-ao extensiva mostrou que ambos os tipos de insertos tinham uma região com cerca de 2,0 kb em comum. A determinação desta região pelo processo de degradação química (A. Maxam e W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 560) revelou uma estrutura de leitura aberta com um comprimento de 1182 nucleótidos que foi identificada com a região de identificação de GI. A sequência de nucleótidos de GI, em conjunto com a sequência de aminoácidos derivada, é representada na Figura 15. Em seguida, a numeração dos aminoácidos refere-se à Figura 15.

Pode obter-se uma muito alta expressão de GI em E. coli colocando os genes sob o controle de transcrição do promotor para a direita (P_D) do bacteriófago lambda procedendo como se descreve em seguida.

Primeiro, modificou-se plasmídeo pLK94 (J. Botterman e M. Zabeau, DNA 6 (1987) 583) para eliminar o sítio PstI no gene de /9-lactamase. Isso fez-se isolando o fragmento EcoRI/PstI com 880 bp de pLK70-70p (Bottermann e Zabeau, ibid.) contendo a parte N-terminal do gene de -lactamase e o fragmen to EcoRI/PstI de 1700 pares de base (bp) de pLK94 contendo a parte C terminal do gene de -lactamase assim como a origem de replicação. A subsequente ligação destes fragmentos originou pLK94p.

Clivou-se pAMI7 com PstI e ligou-se uma mistu ra de dois fragmentos purificados com cerca de 1800 bp de comprimento, um dos quais contém o gene GI no sítio de PstI de pLK94p. Usou-se a mistura de ligação para transformar a estirpe E. coli AB 1886. Obtiveram-se transformantes GI⁺ resistentes a ampacilina por cultura em MMX.

Isolou-se ADN plasmídeo de alguns transformantes escolhidos e caracterizou-se por análise de restrição.

ϊ^?ϊ:

s

Ο plasmídeo GI que contém pLK94p abrigando o fragmento de PstI foi designado pLK94GI. A orientação de GI é tal que o sítio único de BamHI fica situado cerca de 470 bp a montante do codão de iniciação GTG.

Clivou-se pLK70-70p com PstI, tornou-se insensível na extremidade por meio de polimerase I de ADN (fragmento de Klenow) e subsequentemente digeriu-se com Xbal.

Linearizou-se pLK94GI com BamHI e digeriu-se com exonuclease Bal31. Tomaram-se amostras em vários momentos - interrompeu-se a reacção etilenodiamina-tetracetato de dissódio - clivou-se com Xbal e analisou-se por electroforese em gel para determinar o tamanho médio dos fragmentos de BamHI-Xbal ressectados. Eluíram-se do gel fragmentos com tamanho compreendido entre 1350 e 1450 bp. Ligaram-se os fragmentos de maneira a obter-se pLK70-70p. Transformou-se E. coli K514 (C. Colson et al. , Genetics 52 (1965) 1043) com a mistura de ligação e seleccionaram-se os transformantes resistentes à ampicilina a 37° C. Caracterizou-se o plasmídeo de ADN, isolado a partir de diversos transformantes, por análise de restrição. Retiveram-se vinte e quatro clones contendo plasmídeos com GI intacta e ensaiaram-se relativamente à produção de EcoAmi (DSM) GI. Desenvolveram-se as culturas durante a noite a 37°C depois do que os extractos celulares totais forma faccionados por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em dodecil-sulfato de sódio (SDS) a 12,5% (U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680). Quando se comparou com uma cultura de controle de K514 não transformada, um dos clones verificou-se que originava um elevado nível de síntese directa de uma nova proteína de peso molecular igual a 42 quilodalton (kd) que foi identificada como EcoAmi (DSM) GI por manchamento de Western usando um soro policronal cultivado contra Actinoplanes missourienensis GI purificada. O plasmídeo que confere elevada produção de EcoAmi (DSM) GI em E. coli K514 foi designado como pLK70GI.

Foi possível excisar a unidade transcripcional P_r-GI como um fragmento EcoRI-Xbal, cuja sequência é indi22

cada na Figura 16. Depois da eluição de um gel de agarose, este fragmento foi ligado em albos pMa5-8 e pMc5-8 que foram digeridos com EcoRI e Xbal, originando pMa-5-GI e pMc5-GI, respectiva mente. Verificou-se que ambos estes vectores dirigem uma síntese igual e eficiente de EcoAmi (DSM) GI, enquanto o nível de ex pressão não diferiu significativamente do obtido com pLK70GI.

Foi possível aumentar ainda mais a expressão de GI alterando o codão de iniciação GTG num tripleto ATG. Isto fez-se por mutagénese dirigida ao sítio como se descreve no Exemplo 4 usando a seguinte sequência de oligonucleótidos de iniciação

5'-GGACAGACATGGTTACC-3'

Enzimas GI do tipo natural e mutantes foram produzidas na estirpe E. coli K 514 desenvolvida num meio cons tituido por 1% de triptona, 1% de NaCl, 0,5% de extracto de levedura e ou ampicilina (100 mg/litro) para o vector do tipo pMA ou cloranfenicol (25 mg/litro) para o vector do tipo pMC.

As células foram desenvolvidas durante a noite a 37°C e separadas por centrifugação. A enzima EcoAmi (DSM) GI pôde ser purificada procedendo da seguinte maneira. Ressuspendeu-se a pelete de células num volume mínimo de Tris (hidroximetil)aminometano 0,05 M (Tris/HCl), CoCl₂ o,l mM, MgCl₂ 10 mM, KC1 0,2 M, glicerol 5% e EDTA 5 mM, pH 8,0 e adicionou-se lisózima até uma concentração final igual a 1,0 mg/ml. Depois de deixar repousar du rante 20 minutos a 0°C, procedeu-se â lise das células usando uma prensa francesa, centrifugou-se (30 minutos a 23 000 g) e diluiu-se o sobrenadante com um volume igual de solução de sulfato de estreptomicina a 5%. Manteve-se a incubação durante 3 horas a 4°C e realizou-se depois a centrifugação (30 minutos a 23 000 g). Aqueceu-se o líquido sobrenadante a 70θΟ (com excepção das mutantes K253Q e K100R que foram aquecidas apenas a 50° C) durante 30 minutos e centrifugou-se de novo. A fase solúvel superior foi regulada de maneira a conter 80% de sulfato de amó nio. Colectou-se por centrifugação o precipitado que continha a ’ maior parte da actividade enzimática e em seguida dissolveu-se • em Tris/HCl 0,02 M, EDTA 5 mM, sulfato de amónio 0,85 M. As ope

rações cromatográficas subsequentes incluíram Fenil-Superose, Defacril S-200 HR e por fim HR 10/10. Como precaução importante, foi necessário proceder à adição de EDTA 5 mM a todos os tampões para cromatografia a fim de eliminar os iões metálicos. Antes de utilização, dialisou-se a enzima resultante 3 vezes com 200 volumes de trietanolamina 10 mM, pH 7,2, contendo EDTA mM (o pH é igual a cerca de 5,2) e de novo com 200 volumes de ácido (2-N-morfolino)-etano-sulf+onico (MES) 5 mM, pH 6, com 3 mudanças de tampão. Determinou-se o teor de metais da preparação final de enzima por espectrometria de absorção atómica com SpectrAA 30/40 Varian e verificou-se que EcoAli (DSM) GI estava isenta de metal; como exemplo, foi possível mostrar que o teor de iões de cobalto que se ligam à enzima com uma muito ele

- + -4 vada eficiência, era apenas igual a - 1 x 10 mole por mole de EcoAmi (DSM) GI monomérica (quando se omitiu EDTA nos tampões de cromatografia, este último valor subiu para 0,5 mole de cobalto por mole de monómero de enzima). A pureza da EcoAmi (DSM) GI foi demonstrada por SDS-PAGE e manchamento com prata e também por cromatografia em fase líquida de elevado rendimento em fase inversa (HPLC) numa coluna Vydac C4.

A actividade enzimática de glucose isomerase foi ensaiada como se descreve mais abaixo (1 unidade de activi dade enzimática produz 1,0 micromole de D-xilulose ou de D-fru tose por minuto; portanto a actividade específica - spa - é ex pressa como unidades por miligrama de enzimas GI).

O ensaio com cloreto de trifenil-tetrazõlio (TTC) foi previamente descrita para visualização de D-xilose isomerases na electroforese em disco (K. Yamanaka, Buli. Yamaguchi Med. School 18 (1971) 1). Este processo de manchamento baseia-se na reacção de açúcares com o sal de tetrazólio para formar formazano à temperatura ambiente; a reacção é específica para cetose à temperatura ambiente visto que a aldose reage apenas a 100°C. Em geles, a xilose isomerase pode ser assim identificada como uma mancha vermelha rosada. Com modificações • mínimas, este teste de actividade foi adaptado para ser usado . no Phast System Pharmaci. Em resumo, a seguir à electroforese,

o gel de PAGE natural foi transferido para a câmara de manchamento PhastSystem e incubou-se durante 15 minutos a 50°C em Tris/HCl 20 mM, de pH 7,2, com xilose 50 mM, MgC^lO mM, CoCl₂ 0,1 mM; depois de se lavar com água desmineralizada durante 0,5 minutos a 4°C, mergulhou-se o gel durante 3 minutos a 20°C em solução 0,1% de cloreto de trifenil-tetrazólio recentemente preparada em NaOH 1 N; interrompeu-se a reacção por incubação do gel em HC1 2 normal durante 15 minutos a 20°C; a lavagem fez -se com água (0,5 minutos a 4°C).

A actividade de GI pode também ser ensaiada directamente medindo o aumento de absorvância a 278 nm da xilu lose produzida a 35°C por isomerização de xilose por glucose isomerase. Este ensaio realizou-se em tampão de trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo MgSO^ 10 mM, na presença de xilose 0,1 Μ. A concentração de glucose isomerase final no ensaio era igual a - 0,01 mg/ml e foi determinada precisamente, antes da diluição com a mistura de ensaio enzimático por espectroscopia de absorção usando um coeficiente de extinção igual a 1,08 a 278 nm para uma solução de enzima de 1,0 mg/ml.

No ensaio de D-sorbitol e desidrogenase acoplados , realizou-se a determinação enzimática de D-xilulose a 35°C como se descreveu previamente (Kersters-Hilderson et al., Enzyme Microbiol. Technol. 9 (1987) 145) em trietanolamina 50 mM, pH 7,5, MgSO. 10 mM e xilose 0,1 M, na presença de - 2 x — 8

M de D-sorbitol desidrogenase (L-iditol : NAD oxido-redutase, EC 1.1.14) e NADH nM, com a excepção de que o tampão de incubação também ácido etileno-bis-(oxietilenonitrilo)-tetracético (EGTA). A concentração final de glucose isomerase neste en + -3 ^_ saio era igual a - 2,5 x 10 mg/ml e foi determinada precisamente como se descreveu acima.

Com glucose como substrato, a actividade de GI pode ensaiar-se por medição da D-frutose produzida durante a reacção de isomerização usando o processo de cisteína-carbazol (CCM) que se baseia na reacção de ceto-açúcares com carbazol em meio ácido para originar um produto de cor púrpura (Dische e

Borenfreund, 1951) .

Exemplo 2

Cinética da inactivagão pelo calor de EcoAmi (DSM) GI

Realizaram-se experiências de cinética da inactivação pelo calor com glucose isomerase isenta de metal com as adições referidas em cada caso específico. Em resumo, a enzima purificada foi equilibrada no tampão pretendido e a solução foi aspirada para dentro de uma seringa de Hamilton estanque a gases com uma agulha de Teflon que tinha sido previamente inserida numa camisa de vidro ligada a um banho maria de circulação (lauda, RM6) regulado â temperatura indicada. Experiências prévias mostraram que o equilíbrio de temperatura da solução de enzima de 25 até 85°C se atinge em menos de um minu to. Em intervalos de tempo apropriados, retiraram-se alíquotas para tubos de Eppendorf e o processo de desnaturação pelo calor foi interrompido arrefecendo as amostras a 0°C.

Como variante, incubaram-se amostras de grandes dimensões como alíquotas em frascos de Reacti (Pierce).

1. Dependência da temperatura e do metal

A cinética da inactivação pelo calor de EcoAmi (DSM) GI em ácido 3-(N-morfolino)- propano-sulfõnico (MOPS) 50 mM, pH igual a 7,2 a 25°C (pK = 7,15 a 25°C; dH/°C=

O.

= -0,001) em função da temperatura é representada na Figura 1 (sem metal adicionado), Figura 2 (+ MgSO^ 10 mM) e Figura 3 (+ C0CI2 10 mM). Todos os pontos representativos dos dados estão acentuadamente bem adaptados às curvas de decomposição que correspondem a um processo de primeira ordem independentemente da temperatura utilizada e da presença ou natureza do ião metálico.

Os dados demonstram também o efeito de estabi lização dos iões magnésio e ainda mais dos iões de cobalto.

A inactivação da enzima pelo calor verificou

-se que era irreversível; por consequência, mostrou-se que o aquecimento provoca a agregação da proteína. Na presença de

2+ * . . , Mg , foi possível demonstrar que a perda de actividade enzima tica estava correlacionada acentuadamente com a extensão da pre cipitação da proteína.

A Figura 4 resume os dados das Figuras 1, 2 e 3 e mostra que, nos intervalos de temperatura usados, a representação gráfica de Arrhenius é linear quer se encontre presen te metal ou não.

Estes resultados indicam que a desnaturação térmica de EcoAmi (DSM) GI resulta do mesmo acontecimento sob todas as condições ensaiadas; não se sabe se a mesma fase limi tativa prevalece na ausência e na presença de metal mas a linea ridade das representações gráficas de Arrhenius serve de suporte à hipótese de que esta fase é única sob um conjunto específico de condições experimentais.

2. Dependência do pH e da força iónica

A afinidade de metais que estabilizam GI é fortemente dependente do pH; em particular, é consideravelmente reduzida para valores de pH menores do que 6. Por consequên cia, estudou-se a influência do pH sobre a estabilidade térmica de EcoAmi (DSM) GI usando a enzima isenta de metal na ausên cia de metais adicionados.

No intervalo de pH de 4,7 a 8,3, a inactivacção de EcoAmi (DSM) GI a 72°C seguiu sempre uma cinética de primeira ordem. A Figura 5 mostra que a constante de velocidade de inactivação, k^, permanecia praticamente inalterada entre pH 5,5 e 6,7 mas que aumentava em qualquer dos dois lados deste intervalo de pH.

A Figura 6 mostra que a cinética da inactiva ção pelo calor da enzima na ausência de metal adicionado aumen

ta em função da força iónica. Este facto, conjuntamente com os dados da dependência do pH, indica fortemente que estão envolvidos resíduos polares na estabilidade térmica de EcoAmi (DSM) GI.

Es facto é ainda suportado pelos dados da Fi gura 7 em que se mostra que um aumento moderado do pH (isto é, pH 6,7 para pH 7,6 a 72°C) amplificou significativamente o efeito de desestabilização do cloreto de sódio.

3. Efeitos da ureia e do cianato

A GI é um tetrãmero feito de quatro subunida des idênticas (F. Rey et al., ibid.).

Estudou-se a influência da ureia e do cianato numa tentativa para identificar alterações estruturais que possam explicar a perda de actividade enzimática em resultado do aquecimento, isto é, dissociação das subunidades e/ou desdobramento .

estado de oligomerização da enzima foi ana lisado por cromatografia em fase líquida de elevado rendimento com exclusão de tamanho (SEC-HPLC) em Superose-12 à temperatura ambiente usando um tampão de eluição que consiste em Tris/ HC1 50 mM de pH 8,0 a 25°C e NaCl 150 mM a seguir a uma incuba ção prolongada da enzima em ureia 7 M à temperatura ambiente.

A GI natural é eluída sob a forma de um tetrâmero no ensaio de SEC-HPLC. A Figura 8 mostra que é necessá rio uma prolongada incubação em ureia para provocar a dissociação do tetrãmero de EcoAmi (DSM) GI natural com formação de dímeros.

Como se sabe que se forma cianato a partir de ureia em solução mediante repouso, especulou-se que a modifica ção química da enzima pelo cianato podia ser responsável pela dissociação em subunidades observada.

Para ensaiar esta hipótese, incubou-se a enzi ma durante 16 a 24 dias ã temperatura ambiente em borato 0,2 M de pH 8,5 e NaCl 150 mM contendo concentrações de cianato compreendidas entre 0 e 200 mM e isso na ausência ou presença de ureia 5,0 M isenta de cianato (uma solução de armazenagem recentemente preparada de ureia 10 M em ãgua Milli-Q foi passada através de uma coluna de resina AG 501-X8 (D) (Bio-Rad) de acor do com as recomendações do fabricante; este tratamento elimina os contaminantes iónicos entre os quais o cianato).

Fizeram-se as seguintes observações:

1. O tratamento com apenas cianato não pôde alterar o perfil de eluição de EcoAmi (DSM) GI no SEC-HPLC (Figura 9a). O PAGE natural revelou a existência de uma modificação química dependente da dose da enzima como é evidenciado pelo aumento da carga negativa (Figura 9B, painel superior) mas sem perda evidente de actividade enzimática como mostra o manchamento do gel em TTC (Figura 9B, painel inferior).

2. Depois de 16 dias de incubação de EcoAmi (DSM) GI em solução 5,0 M de ureia isenta de cianato, não era evidente a formação de dímero por SEC-HPLC (Figura loA). No entanto, observou-se alguma dissociação dímero-dímero de acorco com PAGE natural (Figura 10B, painel superior, O mM de NaCNO) sugerindo que, à concentração de ureia usada (5 molar), o cianato formado originava uma muito pequena modificação química que, muito embora não conduzisse directamente ã dissociação do tetrâmero, enfraquecia a associação dímero-dímero numa extensão tal que a dissociação não podia ser posta em evidência sob a influência do campo eléctrico aplicado durante o PAGE. Como variante, pode propor-se também que a influência combinada de ureia e do campo eléctrico provoca a disso ciação do tetrâmero com formação do dímero.

3. A simultânea adição de cianato a EcoAmi (DSM) GI em ureia 5,0 M provocou facilmente a dissociação do tetrâmero em dímero de uma maneira que depende da concentração. Isso foi demonstrado tanto pelos dados de SEC-HPLC (Figura 10A) como por PAGE natural (Figura 10B, painel superior). O atraso no

PAGE do dímero depois da incubação a elevadas concentrações de cianato é provável que resulte de um desdobramento aumentado da enzima sob estas condições. No PAGE natural, os dímeros não apresentavam actividade de GI depois da coloração com TTC (Figura 10B, painel inferior). Esta constatação sugere que a acti vidade enzimática é perdida por dissociação de GI tetramétrica com obtenção de dímeros e/ou devida a modificação química.

Em conclusão, é necessário a presença tanto de cianato como de ureia para se observar a dissociação de tetrâmero de EcoAmi (DSM) GI com formação de dímeros. Como o cia nato sozinho é ineficaz, o(s) grupo(s) amino quimicamente modi ficado(s) envolvido(s) na estabilização da estrutura de tetrâmero da enzima não são acessíveis ao dissolvente na ausência da ureia. A ureia provavelmente desestabiliza a interacção dímero/dímero, expondo assim aminoácido(s) previamente enterrado (s) dentro da interface dímero/dímero. Estes resíduos possuindo um grupo alfa amino e/ou um grupo épsilon amino ficam assim disponíveis para carbamilação pelo cianato. Por sua vez, a ligação covalente de cianato a resíduo(s) de contacto inter-subunidades estabiliza a forma de dímero da enzima. Pode por conseguinte propor-se que a dissociação de tetrâmeros de EcoAmi (DSM) GI com obtenção de dímeros é provavelmente um dos aconte cimentos primários na termodesnaturação. Como suporte desta hi pótese podia observar-se as maiores concentrações de proteínas estabilizavam a enzima contra a desnaturação pelo calor (dados não apresentados).

4. Glicação

A proteína mostrou ser susceptível de sofrer glicação, isto é, modificação não enzimática de grupos alfa amino e épsilon amino por acção de glucose e de numerosos outros açúcares. Previu-se que, sob as condições de aplicação (elevadas concentrações de glucose, pH 7,5 e utilização prolon gada), a glicação de EcoAmi (DSM) GI provavelmente ocorresse também; de maneira particular, se os tetrâmeros de EcoAmi (DSM) GI se dissociam com formação de dímeros a elevadas temperatu30

ras, poder-se-ia antecipar que o(s) mesmo(s) reagindo com cianato na presença de ureia ficam glicados com a concomitante dis sociação de tetrâmero-dímero e possivelmente perda de activida de catalítica.

Incubou-se EcoAmi (DSM) Cl isenta de metal na ausência de magnésio a 60°C sem ou com D-glucose (250 mM) em MOPS 50 mM, pH 7,7 a 60°C. Em instantes apropriados, retira ram-se amostras alíquotas, arrefeceu-se a 25°C e ensaiou-se re lativamente à sua actividade enzimática residual pelo ensaio de absorvância directo de xilulose a 278 nm.

A Figura 11, Painel A, mostra que a presença de glucose aumentou significativamente a velocidade da inactivação pelo calor da enzima a 60°C. Este efeito não era reversí vel porque a troca extensiva por tampão de MES 50 mM, pH igual a 6,0 a 4°C, não podia restaurar a eficiência catalítica de EcoAmi (DSM) GI (triângulos na Figura 11, Painel A). Além disso, a análise dos produtos da reacção por SEC-HPLC demonstrou claramente que, como se previu, a glicação foi acompanhada por dissociação de tetrâmero com obtenção de dímero de uma maneira que depende do tempo (Figura 11, Painéis B e C), uma descoberta que suporta a hipótese de que a dissociação de tetrâmero ocorre a elevada temperatura. Os dímeros dissociados são escon didos por modificação covalente com glucose de grupos amino reactivos com probabilidade de residir nos contactos interdimé ricos.

A Figura 11, Painel D, mostra que o aquecimento também provocou a formação de um agragado de proteína que tem aproximadamente o tamanho de um hexadecâmero de EcoAmi (DSM) GI (- 700 quilodalton, isto é, quatro moléculas de tetrâmero GI); esta agregação foi muito intensificada na presença de glucose. No entanto, ainda não se sabe se a formação de agregado ocorre ou não independentemente da ou apenas subsequen temente à dissociação de GI com obtenção de dímeros.

Também se reproduziram resultados muito seme

lhantes num sistema de tampão diferente constituído por fosfato de potássio 12,5 mM, de pH 7,7, a 6o°C.

É interessante relembrar que a presença de ureia era necessária para que o cianato produza dímeros estáveis enquanto a glucose apresentava as mesmas propriedades a alta temperatura na ausência de ureia. Portanto, pode concluir -se que tanto a ureia como o aquecimento provocam a dissociação dos tetrâmeros de EcoAmi (DSM) GI com obtenção de dímeros expondo dessa forma resíduos de aminoácidos localizados na interface interdimérica; entre estes, grupos amino previamente inacessíveis ficam disponíveis para reagir com cianato ou glucose agarrando assim a enzima no estado de dímero.

Exemplo 3

Identificação de resíduos de lisina nas interfaces das subunidades de glucose isomerase de Actinoiplanes missouriensis

GI é um tetrâmero que consiste em quatro sub unidades idênticas (A, B, C e D) (Rey et al., ibid.) que podem ser considerados como um conjunto de dois dímeros (AB e CD). Pode por conseguinte distinguir duas categorias de interfaces de subunidades, interfaces entre os monómeros dentro de um dímero (interface intradímeros) e a interface entre dois dímeros (interface inter-dímeros).

Um resíduo diz-se que participa nos contactos da interface das subunidades se a sua área superficial acessível (ASA) (B. Lee e F. Richards, J. Richards, J. Mol. Biol. 55 (1971) 379) calculada na subunidade isolada difere da determinada no oligómero. A Tabela 2 reune os valores de ASA para os 20 resíduos de subunidade de lisina tanto no monómero isolado como no tetrâmero GI.

Tabela 2

1 κ	ASAm	ASAm	A, I
1	T	T	b 1 1
1 10	65,4	65,4	ο,ο |
1 42	52,6	52,6	0,0 1
1 76	77,1	77,1	o,o |
| íoo	142,4	142,4	o,o |
| íoo	150,0	0,8	149,2 I
| 118	17,9	6,8	11,1 |
| 132	147,4	147,4	0,0 1
1 149	6,9	3,2	3,7 I
| 183	8,0	0,1	7,9 |
| 239	167,0	167,0	0,0 1
| 240	19,2	18,1	1,1 |
| 253	111,5	1,5	íio.o |
| 294	51,5	28,7	22,8 |
| 309	93,2	93,2	0,0 1
| 319	30,0	30,0	0,0 1
| 323	83,0	83,0	0,0 1
| 339	78,0	50,3	27,7 |
| 344	178,1	125,8	52,3 |
| 375	132,0	119,2	12,8 |
| 381	114,2	67,7	46,5 |
Onze destes	resíduos	vê-se que participam nas
interfaces das subunidades. Só	LYS-100	e Lys-253 enterram uma
área extensa (149 Ά	e 110 82,	respectivamente) nas interfaces
das subunidades e ficam quase	completamente enterrados no te-
trâmero. Por outras	palavras,	ambos estes resíduos têm uma pe-
quena acessibilidade	do dissolvente no	tetrãmero. Também, ne-
nhum resíduo está implicado na	actividade catalítica de EcoAmi
(DSM) GI. Além disso	, LYS-100	e LYS-253	estão envolvidos em

interacgões electrostáticas nas interfaces das subunidades. LYS-100 na subunidade S (A-LYS-100) estabiliza por intermédio de ligação de ponte de hidrogénio da última volta de uma peque33

na hélice perto da posição 373 na subunidade B. LYS-253 na sub unidade A (A-LYS-252) por outro lado está envolvido na interac ção do interdímero com ASP-190 da subunidade C. Usando a técnica de construnão de modelos (como se descreve em P. Delhaise et al. , J. Mol. Graph. (1984) 116), observou-se que não é provável que o ambiente de LYS-100 acomode uma substituição para ARG enquanto a mutação de LYS-253 seria estericamente possível porque eram evidentes contactos físicos não maus e as interacções com ASP-190 se mantinham favoráveis.

Outro resíduo de lisina, K294, fica situado na interface dímero-dímero mas é só parcialmente enterrado no tetrâmero (área da superfície acessível 22,8 8 ^). Este resíduo é estritamente conservado em todas as flucose isomerases (veja-se Exemplo 10 e Figura 21); no entanto, K294 interactua também com N247 e D257, ambos os quais estão envolvidos em ligação metálica. K294 afecta a estabolidade de glucose isomerase por diferentes mecanismos.

Exemplo 4

Substituições de aminoácidos de resíduos específicos de lisina em glucose isomerase de Actinoplanes missouriensis

De acordo com a presente invenção, a substituição de LYS-253 por arginina estabilizaria a interacção electrostática através da interface dímero-dímero e, dessa forma, aumenta a estabilidade de EcoAmi (DSM) GI em relação ã inactiva ção térmica. Além disso, esta substituição evitaria também a modificação química (por glucose ou cianato) na posição 253.

Para avaliar a importância das interacções electrostáticas do par de iões A-LYS-253/C-ASP-190 sobre a estabilidade ao calor de Eco Amí (DSM) GI, mudou-se LYS-253 para se obter glutamina para eliminar o carácter iónico da cadeia de lisina lateral, sendo esta mutação por outro lado razoavelmente conservada.

Realizou-se a mutagénese dirigida para o sítio de acordo com o método de DNA duplex intervalado (gdADN) usando os vectores plasmídeos pMa5-8 e pMc5-8 (P. Stanssens et al. ibid.). Como a mutagénese necessita o uso de sítios de restrição únicos a montante e a jusante da região a ser mutagenizada, introduziram-se dois sítios de clivagem adicionais nas sequências de codificação de GI sem se alterar a sequência de aminoácidos codificada. Criou-se um sítio de Kpnl por troca de base de nucleótido de G na posição 177 em A usando a seguinte sequência de oligonucleótidos para iniciação

5'-CGAAGGGTACCAGG-3'

Criou-se um sítio de Xhol por substituição de um C por um G na posição 825 usando a seguinte sequência de oligonucleótidos pa ra iniciação

5'-GCCGTTCTCGAGGAGGTCG-3'

A transformação de GTG num codão ATG (veja-se Exemplo 1) e a criação do sítio de Kpnl realizaram-se numa experiência de muta génese única em que os oligonucleótidos fosforilados enzimatica mente relevantes foram analisados com obtenção de gdADN derivado de pMc5-GI de cadeia única e do fragmento BamHI-AatlI de grandes dimensões de pMa5-GI.

sítio de Xhol foi introduzido numa experiência separada; o gdADN usado foi construído a partir de pMc5-GI de cadeia única e o fragmento de grandes dimensões Sacl-Smal de pMa5-GI. Reuniram-se as três mutações num único gene combinando os fragmentos apropriados do mutante duplo e do mutante Xhol. 0 mutante triplo resultante foi designado como pMa-I. 0 pMc5-I complementar foi construído por inserção do fragmento de pequenas dimensões EcoRI-Xbal de pMa5-I, contendo o gene híbrido P^-GI entre os sítios EcoRI e Xbal de pMc5-8.

pMa5-I e pMc5-I são os vectores básicos usados para a produção de dois tipos de GI natural e mutante. Em todas as experiências de mutagénese dirigida para o sitio descritas em seguida na presente memória descritiva, fez-se utili

zação de um gdADN a partir da forma de cadeia única de pMa5-I e de um fragmento apropriado de pMc5-I.

1. LISINA-253 —> GLUTAMINA

Para a construção do gdADN, usaram-se o fragmento de grandes dimensões de Sacl-Xhol de pMc5-I e a seguinte sequência de iniciação de oligonucleótidos

5'-CCTGGTCGAACTGCGGGCCG-3'

A enzima mutante foi bem expressada; a actividade específica usando xilose como substrato foi 96% da de EcoAmi (DSM) GI do tipo natural (Tabela 3).

A inactivação por acção do calor a 72°C em MOPS 50 mM, de pH 7,4, a 72°C, na ausência de metal, obedeceu a uma cinética de primeira ordem e mostrou que a mutação provocou um aumento de 60 vezes na constante de velocidade de des

-2 -1 naturaçao igual a 1,4 x 10 mm para o tipo natural para 0,9 min 1 para K253Q (Figura 12, Painel A). Na presença de MgSO^ mM a 85°C em MOPS 50 mM, pH 6,5 a 85°C (Figura 12, Painel B) tendo a constante de velocidade de desaparecimento de primeira ordem um valor igual a 1,2 min para K253Q, cerca de 350 vezes mais alta do que a da enzima de tipo natural (k^ = 3,4 x 10 ³ min 1.

A anãlise da estrutura oligomérica da enzima K253Q por cromatografia de exclusão de tamanho revelou a presen ça de um tetrâmero intacto. A incubação prolongada numa solução de ureia 5 molar, isenta de cianato, em borato 0,2 molar, pH 8,5 e NaCl 0,15 M, no entanto, demonstrou que a mutante K253Q se dissociava facilmente com obrenção de dímeros como se mostra na Figura 13, Painel A; a Figura 13, Painel B, resume os dados que mostram a curva de progresso para a formação de dímero para enzimas do tipo natural e mutantes; os dados representam a dissociação de tetrâmeros em dímeros na enzima mutante mas não na enzima do tipo natural.

As experiências acima descritas demonstram a base estrutural da estabilidade da molécula de EcoAmi (DSM)GI.

A alteração específica do resíduo K253 em glutamina introduz uma mutação sensível à temperatura e também â ureia e, por consequência, identifica um sítio de interacções essenciais. Estabelece-se uma clara correlação entre a susceptibilidade do mutante a inactivação pelo calor e a extensão da dissociação do tetrâmero em dímeros provocado por ureia à temperatura ambiente

2. LISINA-253 —> ARGININA

Para a construção do gdADN, usaram-se o fragmento Sacl-Hhol de grandes dimensões de pMc5-I e a seguinte sequência de iniciação

5'-CCTGGTCGAACCGCGGGCCG-3'

A mutante K253R de EcoAmi (DSM)GI foi bem expressada e apresentava uma actividade de 120% da de tipo natural com xilose como substrato (Tabela 3).

A termoestabilidade desta mutante foi ensaiada em solução 50 mM de ácido N-2-hidroxietil-piperazino-N¹-2-etano-sulfónico (EPPS), pH 7,5 e MgSO^ 5 mM, a temperaturas compreendidas de 82 a 92°C. A Tabela 4 reune uma lista dos perí odos de semitransformação em horas para K253R e enzimas de tipo natural; os resultados demonstram que ao longo deste inyervalo de temperatura a K253R é consistentemente mais estável do que a enzima de tipo natural.

Para avaliar a estabilidade da mutante K253R em relação à inactivação por glucose a altas temperaturas, ambas as enzimas foram incubadas na presença de D-glucose 250 mM a 60°C em tampão de fosfato de potássio 12,5 mM de pH 7,7. Na Figura 14 está representada graficamente a variação em função do tempo da inactivação durante cerca de 70 horas; os dados demonstra claramente a protecção intensificada contra a modificação química de inactivação - irreversível - conseguida na mu37

tante K253R visto que o seu tempo de semitransformação é aumentado 5 vezes em comparação com as do tipo natural.

Como controlo negativo, mudou-se LYS-100 em arginina, caso em que se esperava que, como se mencionou anteriormente, uma má acomodação estérica conduzia a um decréscimo de estabilidade, embora sem afectar a actividade enzimática.

3. LISINA ---> ARGININA

Para a construção do gdADN, utilizaram-se o fragmento de grandes dimensões de ΚρηΙ-AatII de pMc5-I e a seguinte sequência de oligonucleótidos para iniciação.

5'-CCGCCGTCCCGGAACACCGG-3'

A actividade específica de K100R GI era igual a 22 unidades por mg usando xilose como um substrato. É assim comparável ã actividade da EcoAmi (DSM) GI de tipo natural 24,5 unidades por mg). A inactivação pelo calor desta enzima mutante no entanto prosseguiu cerca de 100 vezes mais rapidamente com kp = 0,3 min \ no seio de EPPS 50 mM, pH 7,5 a 84°C e MgSO^ 5 mM.

4. LISINA-294 ---> ARGININA

Para a construção do gdADN, utilizaram-se o fragmento de Xhol-Smal de pMc5-I e a seguinte sequência de oli gonucleótidos de iniciação.

5'-GGGACGGCCGGTAGTCGAAG-3'

A mutante de EcoAmi (DSM) GI, designada por K294R, foi bem expressada e apresentou uma actividade enzimática que era igual a 85% da do tipo natural usando xilose como substrato (Tabela 3).

A termoestabilidade desta mutante foi ensaiada no seio de ácido Ν-2-hidroxietil-piperazino,N'-2-etano-sul38

fónico (EPPS) 50 mM, pH 7,5 e MgSO^ 5 mM, a temperaturas compreendidas entre 82 e 92°C. Os tempos de semitransformação expressos em horas para K294R estão reunidos na Tabela 4; os resultados mostram que, ao longo deste intervalo de temperatura, a mutante K294R tem aproximadamente a mesma estabilidade que a enzima natural.

Tabela 3

Parâmetros catalíticos de EcoAmi (DSM) GI de tipo natural (WT) e mutante com ou D-xilose (ensaio acoplado) ou D-glucose como substratos

Xilose Glucose

	Spa	Vmax	Km	Vmax	Km
WT-GI	24,5	24,2	4,8	34,8	290
K253R	30,0	24,6	5,3	27,2	177
K253Q	23	15,1	4,4	29,2	210
K100R	22,2	ND	ND	ND	ND
K294R	20,5	13,8	4,5	25,8	187
G70S;A73S;G74T	28	24,9	5,3	39,2	235

Spa - actividade específica em micromoles de produto (D-xilulose ou D-frutose) por minuto (unidade) por mg de enzima

Vmax é expressa em unidades por mg de enzima

Km é a constante de Michaelis, expressa em mM

ND = não determinado.

Tabela 4

Inactivação de glucose isomerase do tipo natural e de mutantes especificamente preparadas em EPPS 50 mM, pH 7,5, a 84^C,

MgSO^ 5 mM

Csssau

Temperatura 1°C1	82	84	86	88	90	92
WT-GI	11,85	3,80	1,07	0,25	0,080	0,032
K253R	17,65	4,17	1,11	0,32	0,094	0,037
K294R	9,39	1,57	0,43	0,14	0,056	ND
G70S;A73S;G74T	22,88	4,83	1,21	0,31	0,093	0,032

tempo de semitransformação é o intervalo de tempo necessário para a actividade enzimática total sofrer uma redução de 50%.

Exemplo 5

Estabilização de glucose isomerase por intermédio de mutações dentro do monómero

Muito embora mutações que melhorariam a estabilidade da subunidade do monómero, não tivessem em comparação com o Exemplo 2 probabilidade de afectar a estabilidade do tetrâmero de glucose isomerase, efectuaram-se algumas mutações nesse sentido. Mutaram-se três resíduos de hélice B do conjunto β com 8 cadeias de monómero de glucose isomerase com o objectivo de estabilizar esta hélice ¢( e indirectamente estabilizar o monómero. A Glicina 70 foi mutada em Serina, Alanina 73 foi mutada em Serina e Glicina 74 foi mutada em Treonina.

Para a construção do gdADN, usaram-se o fragmento ΚρηΙ-AatII de grandes dimensões de pMc5-I e a seguinte sequência de oligonucleótidos de iniciação

5'-GCCTTCTTGAAGGTCGAGATGATGGAGTCGCGG-3'

A mutante de Eco(Ami) (DSM) GI designada por G70S;A73S;G74T foi bem expressada e a sua actividade específica era igual a 28 unidades por mg (115% do tipo natural) com xi lose como substrato (Tabela 3).

A termoestabilidade deste mutante foi ensaia40 da em solução 50 mM de ácido N-2-hidroxietil-piperazino-N'-eta no-sulfónico (EPPS), pH 7,5 e 5 mM de MgSO^ a temperaturas com preendidas dentro do intervalo de 82 - 92°C. Os tempos de semitransformação em horas para G70S;A73S;G74T estão reunidos na Ta bela 4; os resultados demonstram que ao longo deste intervalo de temperatura e sob as condições usadas, G7oS; A73S; G74T é mais estável que a enzima do tipo natural e também mais estável do que a mutante K253R.

Exemplo 6

Produção e purificação de glucose isomerase de tipo natural e mutante de A. missouriensis para ensaio de aplicação

Para a produção de glucose isomerase de A. missouriensis em E. coli, fez-se utilização da unidade de expressão sobre o vector do tipo pMa exclusivamente.

Transformantes da estirpe K527 de E, coli deficiente em glucose isomerase (thi, thr, leu, tonA, lacY, SUPE, xylA, r_K~m_K+), colectando o gene de glucose isomerase de A. missouriensis que codifica a proteína do tipo natural ou a pro teína mutante pretendida foram desenvolvidas num meio composto por extracto de levedura (20 g/litro), triptona Bacto (40 g/litro), ácidos casamínicos (4 g/litro), NaCl (10 g/litro) e ampicilina (100 mg/litro) durante 16 horas a 37°C. Depois de centrifugação, as células foram ressuspensas num volume mínimo de Tris 20 mM, EDTA lo mM, glucose 50 mM, pH 8,0. Adicionou-se en tão lisósima a uma concentração final igual a 1,5 g/litro. Depois de incubação a 37°C durante 30 minutos, aqueceu-se a suspensão a 70°C durante 30 minutos. Em seguida, arrefeceu-se a suspensão até â temperatura ambiente e adicionaram-se MgC^ e DNasel até se obterem as concentrações finais 20 mM e 1,5 mg/ litro, respectivamente e incubou-se a 37°C durante mais 30 minutos. Separaram-se os restos celulares por centrigugação e dialisou-se o sobrenadante com Tris 50 mM (pH 7,5) durante a noite.

Exemplo 7

Imobilização de glucose isomerases do tipo natural e mutantes

A solução de enzima pode ser imobilizada numa resina de permuta iónica. Antes de cada experiência, as resinas de permuta de iões são regeneradas por tratamento da res na com uma solução de NaOH 0,5 N ( >10 volumes do leito), uma solução de NaCl ( > 10 volumes do leito) e ãgua ( > 20 volumes do leito). Para a imobilização de glucose isomerase escolheram -se as resinas Lewatit MP500A (Bayer) e Amberlite IRA 904 (Rohm & Haas). A adsorção de enzima nestas resinas de permuta de aniões ocorre com elevada eficiência. Há uma relação linear entre a quantidade adsorvida de enzima e a actividade da coluna de aplicação.

Colocam-se 10 gramas da resina permutadora de aniões (forma de Cl ) em 50 mililitros de tampão (Tris HCl 50 mM pH 7,5). Adicionou-se flucose isomerase purificada e deixa-se ligar durante a noite a 4°C num volume total de 100 mililitros com tampão de Tris.HCl 50 mM (pH 7,5).

Exemplo 8

Ensaio de aplicação de glucose isomerase do tipo natural e mutantes

IHA actividade inicial e a estabilidade da glucose isomerase imobilizada e da sua mutante foram determinadas medindo a velocidade de bombagem a 45% de transformação em função do tempo de acordo com R. van Tilburg (Tese: Engineering Aspects of Biocatalysis in industrial Starch Coversion Technology, Delftse Universitaire Pers, 1983). A partir desta, podem calcular-se K e k,.K , uma constante de velocidade de reacção de pseudo primeira ordem é uma medida para a actividade da enzima. k^, uma constante da reacção de desaparecimento de primei ra ordem, é uma medida para a estabilidade da enzima. Embora o cálculo de k^ tenha sido descrito apenas para glucose isomerase

imobilizada em gelatina (R. van Tilburg, ibid.), os mesmos cál culos podem ser usados para glucose isomerase imobilizada em resina. As condições experimentais foram: temperatura, 70°C;

reactor, leito com enchimento com passagem para baixo; substra to, glucose 3M, MgSO^ 3 mM, Na₂SO₃ 3 mM; conversão, 45% de frutose; pH, 7,5 (medido a 35°C) ; Ca, ^3 ppm. Os resultados do cálculo de k. são indicados na Tabela 5.

d

Tabela 5

e mutante, imobilizada em diferentres	resinas
k^ (χ 10θ seg Lewatit	k^ (x 10θ seg Amberlite

Tipo natural	2,7	2,4
K253R	1,0	0,7
K294R	2,8	2,9
K253Q	n. d.	3,7
(G70S;A73S;G74T)	2,0	2,1

N.B.: Tanto as enzimas do tipo natural como mutantes foram pro duzidas, purificadas e imobilizadas de acordo com a descrição nos Exemplos 6 e 7.

Da Tabela 5, pode concluir-se que ambas as mutantes K253R e G70S;A73G;G74T têm a estabilidade significativamente melhorada no ensaio de aplicação a 70°C. Estes resultados podem ser transformados com um razoável grau de rigor em resultados que são obtidos se os ensaios se realizassem a uma temperatura usual na indústria (R. van Tilburg, ibid.).

O pequeno rendimento da mutante K253Q é uma indicação da importância de um resíduo básico na posição 253, como já se concluiu das experiências in vitro descritas no Exemplo 4. A mutante de Glutamina provavelmente não forma liga43

ções em ponte de hidrogénio que desestabilise o contacto dimero-dímero.

De maneira semelhante, a mutante K294R tem uma estabilidade ligeiramente menor do que a enzima do tipo natural de acordo com os resultados obtidos nas experiências in vitro.

Os resultados acima referidos mostram que se pode obter um aperfeiçoamento do contacto da interface dimero-dímero de glucose isomerase numa enzima com comportamento superior em aplicações industriais. É evidente que outros resíduos envolvidos em contactos de interface podem também ser esco lhidos por um qualquer perito no assunto. Resíduos que são sus ceptíveis ã modificação química ou que não possuem uma ligação de hidrogénio óptima podem ser substituídos por outros aminoácidos de acordo com as indicações da presente memória descriti va.

Surpreendentemente, mutações que têm como ob jectivo a estabilização da subunidade monomérica possuem também um efeito positivo sobre a estabilização do tetrâmero, como é evidenciado pelos valores de observados para a mutante G7OS;A73S;G74/.

Numa tentativa para racionalizar estes resul tados, podia pensar-se que a substituição de resíduos de Glici na numa hélice pode ter como resultado numa diminuição da entropia do estado desdobrado de uma proteína tornando assim a proteína mais resistente a desdobramento reversível e ã desnaturação (Protens, I (1986) 43 - 46). Ao proceder assim, a susceptibilidade de glucose isomerase (e por consequência à desnaturação irreversível) de proteína (parcialmente) desdobrada possa ser significativamente diminuída, obtendo-se como resultado uma enzima mais termoestável. Como variante, pode cOnside rar-se o facto de que as mutações G70S;A73S;G74T são todas de natureza mais hidrofílica e portanto apresentam a probabilidade de serem favorecidas na superfície exposta da hélice B. Isso pode portanto originar uma melhor estabilidade do monómero con44

tra desdobramento reversível. Como se mencionou anteriormente, isso pode diminuir a susceptibilidade da proteína tetramérica contra desnaturação irreversível.

As mutações exemplificadas neste Exemplo podem ser introduzidas de uma maneira semelhante em todas as hélices de flucose isomerase. As regiões da hélice determinadas a partir da estrutura 3D de glucose isomerase de A, missouriensis (F. Rey et al. , ibid.) estão nas posições 0( 1 35 - 47, <*2 64 - 80, 0(3 108 - 128, 0(4 150 - 173, ú(5 195 - 206,

X 6 227 - 239, o(7 264 - 276, 0( 8 300 - 328. Pode encarar-se a substituição de resíduos de Glicina, a introdução de resíduos hidrofóbicos e a introdução de resíduos de Prolina na extremidade aminada de uma hélice .

Ambas as mutações específicas K253R e G70S; A73S; G74/ originam uma estabilização ao calor melhorada em relação a glucose isomerase do tipo natural. No entanto, a mutante K253R parece ser mais estável do que a mutante G70S;

A73S; G74T nos ensaios de aplicação ao contrário das experiências in vitro descritas no Exemplo 4. Isto pode considerar-se como o reflexo do facto de que os resultados obtidos sob condi ções laboratoriais sóa são em certo grau susceptíveis de permitir prever o rendimento de uma enzima em condições de aplicação Possivelmente, as elevadas concentrações de glucose usadas sob as condições de aplicação e o processo de glicação que é depen dente da concentração de glucose são responsáveis por este fenómeno .

Exemplo 9

Propriedades de mutantes de glucose isomerase a diferentes valores de pH

Realizaram-se ensaios comparativos com a mutante K253R e com glucose isomerase de A. missouriensis do WT a diferentes valores de pH. Imobilizaram-se preparações de enzimas de K253R e de WT em Lewatit como se descreveu no Exemplo

e submeteram-se a um ensaio de isomerização como se descreveu no Exemplo 8. As condições eram como as referidas por R.van Tilburg (ibid.) com xaropes de glicose a vários valores de pH.

A Figura 18 representa os valores de de ambas as enzimas em função do pH. Pode verificar-se que a mutante K263R possui um melhor valor de a valores de pH menores do que 7,5 até um valor de pH igual a 5,8. As medições realizaram-se pelo menos em duplicado. Assim, a mutante K253R possui não só um comportamento superior em aplicações industriais a maiores temperaturas (maior velocidade de conversão) mas também a menor pH (melhor estabilidade da frutose produzida).

Exemplo lo

Clonagem e sequenciamento de genes de glucose isomerase de outras estirpes bacterianas

A fim de se obter informações sobre a sequén cia de aminoácidos relativamente a glucose isomerada de diferen tes bactérias, isolaram-se os genes que codificam a glucose isomerase dos cromossomas das respectivas bactérias por clonagem molecular em E. coli.

Escolheram-se as seguintes bactérias, algumas das quais se sabe que produzem enzimas aplicadas industrialmen te para esta finalidade:

- Arthrobacter species ~Streptomyces violaceoruber LMG 7183

- Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

- Streptomyces murinus DSM 40091

- Ampullariella species ATCC 31351

O ADN cromossõmico para todas as espécies mencionadas foi isolado e purificado essencialmente como descrito por Hopwood (ibid.).

Para Arthrobacter, S. violaceoruber e Ampul46 lariella, a digestão parcial com endonuclease de restrição Sau3AI e clonagem dos fragmentos resultantes em E. coli realizaram-se exactamente como se descreveu para a. missouriensis no Exemplo 1. 0 DNA de S. murinus e de S. thermovulgaris foi digerido completamente com PstI seguido por ligação em pECOR251 co mo se descreveu no Exemplo 1.

Detectaram-se colónias contendo o gene de glucose isomerase pretendido por hibridização ee colónias usan do um fragmento de restrição MluI de 712 bp de gene de glucose isomerase A. missouriensis ou um fragmento de restrição SacII de 853 bp dentro do gene de glucose isomerase de S. violaceoruber .

Os plasmídeos recombinantes contendo os genes de glucose isomerase das diferentes bactérias foram ainda caracterizados por mapeamento de restrição como se descreveu para o gene de glucose isomerase de A. missouriensis. A análise da sequência de nucleótidos das regiões de codificação da proteína realizou-se usando o processo químico de Maxam e Gilbert (ibid.).

clone contendo o gene de glucose isomerase de S. thermovulgaris tornou-se incompleto: só a sequência de codificação até ao aminoãcido 346 (equivalente à posição 351 de glucose isomerase de A. missouriensis) foi por consequência es tabelecida.

Deve notar-se que a sequência de aminoácidos da glucose isomerase da Ampullariella sp. difere da sequência publicada pelo facto de a prolina 177 da sequência publicada se ter verificado ser uma arginina.

Os resultados deste exemplo são resumidos na Figura 21, em que as sequências de aminoácidos, derivadas das sequências de nucleótidos estabelecidas estão alinhadas de modo a mostrarem a homologia mútua.

Exemplo 11

Expressão e mutagénese de glucose isomerase de Ampullariella

Para a expressão de glucose isomerase de ampullariella sp. em E. coli utilizou-se a unidade de expressão eficiente já disponível para glucose isomerase de A. missourien sis.De facto, o vector de expressão de A. missouriensis foi mutado usando fragmentos de restrição do gene de glucose isomerase de Ampullariella sp. cobrindo todas as diferenças de nucleótidos de aminoácidos resultantes das regiões de codificação dos dois genes: formou-se uma molécula duplex intervalada consistin do num ADN de cadeia única de pMa-I e o fragmento BstED/Ncol de 4107 bp de pMc-1, um fragmento BstEII/ApaLI de 124 bp e um fragmento ApaLI/BssHII de 1059 bp, sendo os últimod dois fragmentos derivados do gene de glucose isomerase de ampullariella sp. O procedimento continuou essencialmente como se descreveu no Exemplo 1 incluindo uma determinação da sequência de nucleõ tidos renovada do gene para verificar a presença de alterações indesejadas. Encontrou-se assim o plasmídeo correcto e designou -se pMc-GIampl.

A comparação das sequências de aminoácidos mostrou que a glucose isomerase de Ampullariella, como a glucose isomerase de A. missouriensis, continha um resíduo de lisina na posição 253 equivalente. Portanto, gerou-se uma mutante de glucose isomerase de Ampullariella sp. em que a lisina (K) na posição 253 foi substituída por arginina (R) usando uma molécula duplex intervalada formada anelizando ADN de pMc-GIampl de cadeia única com pMa-GIampl digerido com BamHI7HindIII e o oli gonucleótido mutagénico fosforilado

5'-AGGTCCTGGTCGAACCGCGGGCCGTGCTGG-3'.

A maneira de proceder a seguir à operação de anelização, isto é, a escolha e a análise da mutante resultante realizou-se como se descreveu no Exemplo 1.

Exemplo 12

Expressão e mutagénese dirigida para o sítio de glocose isomerase de Streptomyces murinus

Conseguiu-se a expressão do gene de glucose isomerase de Streptomyces murinus colocando o gene a jusante do promotor Tac de plasmídeo pMaT5. pMaT5 é um derivado de pias mídeo pMa5P_D em que o promotor lambda P_D é substituido pelo promotor Tac regulável (H. de Boer Proc. Natl. Acad. Sei. USA 60 (1983) 21). A estrutura deste vector de expressão é indicado na Figura 15a/c.

Um fragmento de restrição BstXI/MluI com 1280 bp contendo o gene completo de glucose isomerase de Streptomyces murinus foi tratado com ADN polimerase I (fragmento de Klenow) para transformar as fronteiras do fragmento em extremidades abruptas e subsequentemente foi ligado em pUC19. Em seguida, o gene foi novamente cortado usando BamHI e HindIII e inserido em pMc5T digerido com BamHI/HindIII. O plasmídeo resultante foi designado pMc-GIsmuI. A sequência de nucleótidos e de aminoácidos derivada da glucose isomerase de Streptomyces murinus e a estrutura da unidade de expressão são representadas na Figuras 19 e 20, respectivamente.

Também a glucose isomerase de S. murinus tem um resíduo de lisina na sequência da proteína na posição 253, equivalente a K253 em A. missouriensis. A mutação resultante na substituição de lisina 253 (K) por arginina (R) na glucose isomerase de Streptomyces murinus foi introduzida usando uma molécula duplex intervalada que consiste em ADN de pMc-GIsmul de cadeia única, pMa5T digerido com BamHI/HindIII e o oligonucleó tido mutagénico fosforilado

5'-GGTCCTGGTCGTACCGGATGCCGGACTGG-3'

A maneira de proceder a seguir ã operação de anelização, isto é, a escolha e análise da mutante resultante, realizou-se essencialmente como se descreveu no Exemplo 1.

Compreende-se que a invenção não se restringe

ãs mutações acima sugeridas e ilustradas. Muito embora a presen te invenção tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e de exemplo para as finalidades de clareza de compreensão, é óbvio que certas alterações e modificações possam ser efectuadas na prática dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (3)

1. - IS Processo para a produção da nova enzima de glucose isomerase mutante derivada de uma glucose isomerase de partida tendo essencialmente o mesmo tipo de actividade biológica com um efeito de modulação concomitante sobre a estabilida de em comparação com a da glucose isomerase de partida, caracte rizado pelo facto de se escolher a glucose de partida entre as que inicialmente possuem um resíduo de lisina ou um resíduo de arginina situado num sítio que pode estericamente acomodar a substituição de um resíduo de arginina por um resíduo de lisina ou vice-versa sem se alterar substancialmente a actividade biológica da glucose isomerase de partida e se substituir o referi do resíduo de arginina ou vice-versa o mencionado resíduo inicial de arginina por um resíduo de lisina.

   - 23 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de isomerase glu50 cose mutante porexpressão de um gene que codifica a mencionada enzima de glucose isomerase tendo uma sequência de aminoácidos que difere pelo menos num aminoácido de glucose isomerase do ti po natural que possui melhores propriedades nas condições de aplicação.

   - 3ã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a enzima de glucose isomerase mutante que se distingue em relação a uma glucose isomerase que ocorre normalmente e que tem essencialmente a mesma actividade biológi ca ou a uma sua mutante pelo facto de, nesta última, pelo menos um dos seus resíduos de aminoácidos (resíduo de aminoácido substituto) ser arginina em vez de lisina presente na referida glu cose isomerase de ocorrência natural ou sua mutante ou é lisina em vez de arginina na mencionada glucose isomerase ou sua mutan te num sítio da glucose isomerase que ocorre naturalmente que pode, nesta última, acomodar a substituição de um resíduo de ar ginina por um resíduo de lisina ou vice-versa de um resíduo de lisina por um resíduo de arginina sem alterar substancialmente as propriedades biológicas também possuídas pela glucose isomerase que ocorre naturalmente .

   - 4â Processo de acordo com as reivindicações 2 ou

   3, caracterizado pelo facto de a enzima de glucose isomerase mu tante ser

   1) uma enzima monomérica que inclui pelo menos dois domínios ou uma enzima oligomérica que compreende pelo menos duas subuni dades, parte das quais ou todas as quais também contêm opcio nalmente certos domínios e em que
2. 2) os citados domínios ou, quando apropriado, subunidades, compreenderem sítios de pequena acessibilidade do dissolvente e
3. 3) alguns dos referidos sítios incluírem resíduos de aminoácidos que são envolvidos em interacção elebtrostática com outros resíduos de aminoácidos de outros sítios, mas de tal maneira que o mencionado sítio qur contém o citado resíduo de aminoãcido substituto concidir com um dos referidos sítios de pequena axessibilidade do dissolvente.

   _ ₅a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de enzima de glucose iso merase mutante derivar de Actinoplanes missouriensis.

   - 6â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoá eidos da mencionada glucose isomerase possuir pelo menos 65% de homologia com a sequência de aminoácidos da glucose-isomerase derivada de uma estirpe Actinoplanes missouriensis do tipo bravio .

   - 73 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de glucose isomerase de Actinoplanea missouriensis em que Lys 253 está substituido por Arg253 e/ou Gly por Ser e/ou Ala73 por Ser e/ou Gly74 por Thr.

   - 8§ Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de glucose isomerase mutante em que pelo menos Lys253 está substituído por Arg 253.

   - 9â Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de glucose isomerase mutante em que, pelo menos, Gly70, Ala73 e Gly74 são substituídos por Ser, Ser e Thr, respectivamente.

   - 10§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de glucose isomerase mutante que possui uma termoestabilidade melhorada nas condições de aplicação correntes em comparação com a correspondente enzima de tipo natural.

   - llâ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se obter uma enzima de glucose isomerase mutante que possui estabilidade melhorada e vários valores de pH, em comparação com a correspondente enzi ma de tipo natural.

   123

   Processo para a preparação de glucose isomera se imobilizada, caracterizado pelo facto de se imobilizar uma enzima de glucose-isomerase mutante quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11- 133 Processo para a preparação de xaropes de frutose, caracterizado pelo facto de se empregar uma glucose isomerase mutante quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12.

   As requerentes reivindicam a prioridade do pe dido de patente europeia apresentado em 4 de Novembro de 1988, sob o n° 88402789.7.