PT92807B - Processo para a preparacao de uma vacina de proteina de membrana externa meningococia classe 1 - Google Patents

Description

DESCR1CÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 92.807

REQUERENTE: PRAXIS BIOLOGICS INC e DE STAAT DER

NEDERLANDEN VERTEGENEWOORIDG NOOR DE MINISTE VAN WELZIJN, VOLKSGEZONDHEID EN CULTUUR

EPÍGRAFE: Processo para a preparação de uma vacina de proteína de membrana externa meningocócica Classe I

INVENTORES: Robert C. Seid, Jr., Dr. Ian Nicholas

Peter R. Paradiso, .

„ _ . tiarK

Jan T. Poolman,

Peter Hoogerhout,

Emmanuel J. H. J. Wiertz,

Peter van der Ley,

Dr. John Edward Heckels,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Holanda em 06 de Janeiro de 1989 sob o Ns 8900036 e em 26 de Junho de 1989 sob ο N2 8901612 inpi w:

PEAXIS_BIOLOGIÇS_INÇ_i=e_DE_STAAT₌DER_NEDERLANDEN_VERTEGENEWOORIDG

NOOR_DE₌MINISTER₌V^₌^LZIJN₌VOLKSGEZOroHEID₌EN₌ÇULTUUR

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA DE PROTEÍNA DE MEMBRANA

EXTERNA MENINGOCÓCICA CLASSE I

Antecedentes da Invenção

A meningite bacteriana é uma doença inflamatória do sistema nervoso central provocada pelo desenvolvimento de uma bactéria nas e adjacentes âs leptomeninges. A meningite é uma doença infecciosa aguda que atinge as crianças e os adultos jovens e é provocada pela Neisseria meningitidis, entre ou tros agentes, incluindo agentes patogénicos bacterianos e virais.

Os meningococcus estão divididos em grupos serológicos que dependem da presença de cápsulas ou de antigenios da parede celular. Reconhecidos correntemente são os serogrupos que incluem A, B, C, D, W-135, X, Y, Z e 29E como segregados por seroaglutinação. Foram purificados os polissacáridos responsáveis pela espe cificidade dos serogrupos do grupo A, B, C, X, W-135 e Y.

A taxa portadora de meningpcoccus é muito mais elevada do que a incindên cia da doença. Algumas pessoas sao temporariamente portadores, embora outras sejam portadores crónicos, descarregando meningococcus com mais ou menos continuidade ou de uma forma esporádica. 0 estado de portador meningocócico constitui um processo de imunização e em duas semanas de colonização pode identificar

-se a produção de anticorpos para meningococcus. Parece que os anticorpos bacte ricidas sao dirigidos contra os polissacáridos capsulares e contra outros antigenios da parede celular.

-2ζAs investigações demonstraram que as membranas mais externas meningo cócicas têm três a cinco proteínas principais, com predominância das proteínas 41 000 Mr ou de 38 000 Mr transportando os determinantes específicos de serotipo. Existe um grau considerável de heterogeneidade de interestirpes nos perfis das proteínas da membrana mais externa, sobre géis de electroforese de docecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). De acordo com a definição dos estudos de cartografia peptídica, as proteínas constituem cinco classes designadas por 1 a 5, com base nas estruturas peptídicas comuns. Os anticor pos monoclonais bacterianos são produzidos contra as proteínas de 46 000 Mr Classe I que, em certa extensão, são compartilhados por estirpes de diferentes serotipos (Frasch, C. E. et al., New Developments in Meningococcal Vacines, in G. K. Schoolnik et al. (ed.) The Pathogenic Nisseriae, Washington, D. C., American Society for Microbiology, 1985, p. 633).

Utilizou-se o polissacárido capsular.dos grupos A, C, W-135 e Y dos meningococcus para desenvolver vacinas contra este organismo. Embora estas va cinas se tenham mostrado eficazes a curto prazo, elas não induzem memória imunulogica e os indivíduos devem revacinar-se aproximadamente dentro de três anos para manter a sua resistência. 0 polissacarido do grupo B e fracamente imunogénico e as vacinas produzidas nao tiveram sucesso. Uma explicação pos sível para a actividade baixa pode ser a tolerância do polissacárido do grupo B induzida por antigéneiós de reacção cruzada encontrados nos tecidos humanos, como, por exemplo, no cérebro. Além disso, os estudos demonstraram que a maior parte dos anticorpos bacterianos nos soros dos doentes em convalescença, que transportaram a doença proveniente dos meningococcus do grupo B são dirigidos contra as proteínas da membrana mais externa.

Prepararam-se vacinas para a protecção da doença provocada por meningo coccus B, consistindo na administração de complexos não covalentes de proteí-3/

nas da membrana mais externa (OMP) e polissacârido do grupo B. Beuvery, et al., Infect. Immun. 40 (1983); 369-380. Contudo, sabe-se que o polissacârido B induz uma resposta transitória de anticorpos IgM que não confere imunoprotecção. Além disso, existe uma grande diversidade antigénica e grande varia_ bilidade nas proteínas da membrana externa meningocócica de estirpe para estirpe. Também estão presentes polissacãridos nas OMP que exibem igualmente variabilidade antigénica.

Existe a necessidade de vacinas seguras e eficazes contra a doença me ningocócica que proporciona imunidade ã infecção, particularmente nas crianças e nos idosos.

Resumo da Invenção

A presente invenção refere-se à proteína da membrana externa de Cias stí I substancialmente purificada (OMP) de Neisseria meningitidis, a fragmentos de OMP Classe I e a oligopeptidos provenientes de OMP de Classe I que con têm contínua ou descontinuamente epítopes celulares B imunogénicos e protecto res isolados das vesículas da membrana externa (OMVs) (Beuvery et al (1983) loc. cit.), reactivos com anticorpos bacterianos contra N. meningitidis e ã utilização das OMVs isoladas, a fragmentos de OMP meningocócica Classe I ou a oligopéptidos para vacinação contra N. meningitidis.

As OMVs meningocócicas Classe I isoladas, os fragmentos ou os oligopé£ tidos derivados destes podem utilizar-se em subunidades de vacinas univalentes ou multivalentes, isoladamente ou em misturas ou sob a forma de conjugados qui_ micos ou produtos de fusão genética. Nas vacinas preferidas, são utilizados epítopes provenientes de estirpes meningocócicas epidemiologicamente importantes diferentes. Além disso, as OMVs isoladas de OMP Classe I, fragmentos ou oligopépt

dos podem ser também utilizados em conjunto (com misturas, fusão ou conjugados) com outros antigénios de N. meningitidis. Por exemplo, podem-se utilizar conjuntamente com polímeros capsulares ou oligomeros capsulares (ou seus frag mentos) de N. meningitidis ou com proteínas da membrana externa de Classe I (ou seus epítopes), de subtipos diferentes. Alem disso, podem-se utilizar com antigénios ou outras bactérias, vírus, fungos ou parasitas infecciosos. Estão ainda definidos epítopes de OMP Classe I e de células T e podem-se utilizar conjuntamente com outros componentes da vacina para reforçar a resposta imunitária protectora às vacinas.

A presente invenção também se refere a métodos de produção de OMVs iso ladas de OMP de Classe I, a fragmentos e oligopéptidos e a diversas composições de vacinas contendo estes. As OMVs de OMP de Classe I isoladas podem ser produzidas por estirpes meningococicas mutantes que nao exprimem as proteínas da membrana externa das Classes 2/3. Os fragmentos podem ser produzidos por cisão com brometo de cianogénio e purificação subsequente. As OMVs de OMP de Classe I isoladas, os seus fragmentos ou oligopéptidos podem produzir-se mediante aplicaçao de técnicas de recombinaçao de DNA, por síntese química ou por cisão química ou enzimãtica. Estes materiais, por sua vez, podem conjugar-se ou fundir-se com peptidos veiculares ou com proteínas veiculares, com outros antigénios de N. meningitidis ou com antigénios de outros microorganismos me diante técnicas de acoplamento químico ou genético para produzirem-se conjuga dos antigénios polivalentes e peptidos ou proteínas de fusão. Podem ser modificados para conjugação mediante adiçao de aminoácidos ou de outros grupos de acoplamento. Para a vacinaçao, as OMVs Classe I OMP isoladas, fragmentos ou oligopéptidos, em qualquer das formulas descritas podem ser formuladas com veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico e eventualmente aditivos, tal como os adjuvantes.

A presente invenção também diz respeito a ácidos nucleicos isolados que codificam OMP Classe I, fragmentos ou oligopéptidos. Os ácidos nucleicos podem incorporar-se em sistemas de expressão apropriados para a produção de OMVs isoladas de OMP de Classe I, fragmentos ou quaisquer oligopéptidos deri. vados destas. Podem ser modificados os ácidos nucleicos como produtos de fusão genética para conterem sequências codificadoras de polipéptidos adicionais utilizáveis para reforçarem a resposta imunológica ãs composições das vacinas que contem os polipéptidos de fusão expressos. Além disso, a OMP Classe I de N. meningitidis é homóloga na sequência de aminoácidos e na estrutura com as proteínas de porina ou de outros agentes patogénicos gram ne gativos e, portanto, a OMP Classe I, fragmentos e oligopéptidos da presente invenção permitem o desenvolvimento de vacinas para outros agentes patogénicos gram negativos.

Breve descrição das figuras

Figura 1. Esquema para ampliaçao de genes codificadores da proteína da membrana mais externa Classe I meningococica por RCP (Reacção de Cadeia Polimerase).

Figura 2. Sequências do gene 5' codificadoras de VR1 (primeira região variável) de proteínas da membrana mais externa de Classe I de diversos subtipos de N. meningitidis.

Figura 3. Sequências geneticas 3' codificadoras de VR2 (segunda região variã vel) de proteínas da membrana mais externa Classe I de diversos subtipos de N. meningitidis.

Figura 4. Varrimentos (Scanning) do epítope por reacção de anticorpos mono

-⁶-Z i

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura clonais com decapeptidos de fase sólida abarcando as sequências de aminoácidos previstas de proteínas de Classe I das estirpes Pl.7,16, P1.16 e P1.15. Os decapeptidos adjacentes diferem por cinco restos de aminoácidos. As anotaçoes mostram a estirpe a partir da qual foi derivada a sequência, o mAb utilizado e a especificidade do seu sub tipo.

5. Reacçao de anticorpos monoclonais com series de decapeptidos de envolvimento que correspondem ãs regiões variáveis VR1 e VR2, com péptidos adjacentes que diferem por um único resto de aminoácido. As anotações mostram a estirpe a partir da qual foi derivada a sequência, o mAb utilizado e a especificidade do seu subtipo.

6. Construção de flagelinas recombinantes que exprimem epítopes de região variavel de OMP de Classe I de N. meningitidis do subtipo

Pl.6,16.

7. Estrutura de flegelinas recombinantes que exprimem epítopes de região variável de OMP de Classe I de N. meningitidis do subtipo Pl.6,16.

8. Cromatograma da cromatografia líquida de alta resolução representativo de uma flagelina recombinante.

9. Análise por SDS-PAGE de uma flagelina recombinante representativa.

10. Analise de mancha de Western representativa de um conjugado consti tuído por um epítope de N. meningitidis de OMP de Classe I conjuga

197' do com CRM

Figura 11. Conformação putativa de OMP de Classe I de N. meningitidis do subtipo P1.16.

Descrição Pormenorizada da Invenção

A presente invenção refere-se a vacinas que contêm OMVs isoladas de OMP meningocócica de Classe I, seus fragmentos, (por exemplo, preparados por aplicaçao de brometo de cianogenio) e oligopeptidos contendo epítopes de OMP; ã preparação de OMVs isoladas puras de proteínas da membrana mais externa de Classe I utilizando-se estirpes mutantes que nao exprimem proteínas da membrana mais externa das Classes 2/3; ã preparaçao de OMVs isoladas puras de proteg nas da membrana mais externa de Classe I com o auxílio de DNA clonado em vect£ res de expressão de DNA recombinante.

A presente invenção também diz respeito ã aplicaçao da engenharia gené tica com o objectivo de produção de OMVs isoladas de OMP de Classe I ou das suas fracções, fusões geneticas de OMP de Classe I, suas porçoes ou seus epíto pes; e à preparaçao de vacinas da membrana mais externa de Classe I polivalentes através da síntese peptídica, uma vez que os epítopes com uma cadeia peptídica curta se podem preparar sinteticamente.

Resultou que as proteinas da membrana mais externa meningocócicas de Classe I induzem uma resposta imunitária bactericida forte para estirpes que contêm os epítopes do subtipo apropriado, independentemente de estes serem de estirpes do grupo A, B, C, W-135 e Y. Podem-se reforçar as vacinas polissacarí. dicas ou substituirem-se por uma vacina de acordo com a presente invenção, como uma vacina com larga e grande acçao contra a maior parte dos serotipos. Os anti corpos monoclonais bactericidas protectores específicos para a proteína da membrana mais externa de Classe I reagem fortemente com fragmentos que foram sepa-8ςrados ou com péptidos sintéticos pequenos que foram preparados utilizando-se a sequência de aminoacidos de proteína da membrana mais externa de Classe I.

Dado que a doença meningocócica é causada habitual e principalmente pelos meningococcus do grupo B e uma vez que as proteínas da membrana mais externa de Classe I que ocorrem nos meningococcus do grupo B também aparecem nos meningococcus dos grupos A, C, W-135 e Y, as vacinas da presente invenção que contêm um ou mais epítopes de OMP de Classe I derivados de N. meningitidis do grupo B devem ser eficazes na prevenção da doença provocada pelos grupos A, C, W-135 e Y. De preferência, a preparaçao destas vacinas inicia-se com, pelo menos, dois epítopes imunogénicos protectores diferentes que foram escolhidos nos campos epidemiológicos. As vacinas de acordo com a presente invenção contêm, por exemplo, pelo menos uma proteína que se obteve quer numa composição OMV, por purifi cação de estirpes mutantes produtoras de uma ou mais OMP de Classe I quer, pelo menos, dois fragmentos preparados por fragmentação com brometo de cianogénio quer, pelo menos dois péptidos sintéticos, escolhidos entre cerca de 10 epítopes principais ou produtos obtidos por expressão genética através da tecnologia de recombinaçao de DNA, que contém os epítopes necessários. Para aumentar a eficácia para um largo espectro de estirpes meningococicas, é preferível um maior numero de diferentes epítopes protectores na vacina. Além disso, as vaci nas de acordo com a presente invenção podem conter vantajosamente polissacáridos meningocócicos A e C ou, eventualmente, W-135 e Y e/ou agentes detergentes.

De preferência, os polissacáridos A e C sao ligados por covalência a uma proteí na ou a um polipeptido veiculares. Estes veículos incluem, por exemplo, OMVs isoladas, a proteína OMP de Classe I, epítopes auxiliares-T, toxinas bacterianas, toxoides, mutantes nao tóxicas (CRMs), flagelina de Salmonelia recombinante e partículas virais tais como a proteina VP6 de retrovírus, antigenio de superfície de Hepatite B ou proteínas VP1 e VP2 de parvovírus. Podem-se utilizar de tergentes Zwitterionogénicos, cationogénico, amionogénicos e não ionogénicos. Exemplos destes detergentes são os Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-14 (N-tetra

Λ» decil-N, N-dimetil-3-amonio-l-propano-sulfonato), Tween-20, desoxicolato de sódio, colato de sodio e octilglucósido. As vacinas de acordo com a presente invenção podem conter ainda um agente absorvente como o hidróxido de alumínio, o fosfato de cálcio ou vantajosamente o fosfato de alumínio. Os fragmentos, proteínas, péptidos podem também processar-se em complexos imunoestimulantes (ISCOMS), lipossomas ou micro-esferas para libertação e/ou aplicaçao como um adjuvante ou ainda em ligação com outros agentes adjuvantes de modo a obter-se uma imunogenicidade superior.

A presente invenção abrange OMV isolada substancialmente pura das proteínas da membrana mais externa de meningocócicas de Classe I ( de qualquer subtipo) e fragmentos de proteínas que contêm os seus epítopes. Os fragmentos podem ser constituídos por quaisquer fracções de peso molecular de 25 KD ou menos, que contém epitopes que estão ligados por anticorpos bactericidas protecto res contra N. meningitidis. Estes incluem os fragmentos proteoliticos e oligopeptidos sintéticos que sao constituídos por sequências de aminoácidos que cor respondem, pelo menos em parte, a epitopes de OMP de Classe I. As OMVs isoladas de OMP de Classe I, fragmentos ou oligopeptidos que contêm epitopes provenientes destes podem incluir sequências de aminoácidos diferentes mas que sao essencial e biologicamente equivalentes as sequências naturais. Estas sequências podem incluir sequências em que os restos de aminoácidos substituiram restos funcional.

mente equivalentes na sequência, resultando numa alteraçao silenciosa. Por exemplo, um ou mais restos de aminoácidos da sequencia pode ser substituído por outro aminoácido com uma polaridade similar que actua como um equivalente funcional, re sultando numa alteraçao silenciosa. Podem escolher-se substitutos de um aminoacido na sequência entre os outros membros da Classe a que o aminoácido pertence.

Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofobos) incluem a glicina, a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fenilalanina, o triptofano e a metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem a serina, a treonina, a cis-10-

teína, a tirosina, a asparagina e a glutamina. Os aminoácidos com carga (básicos) incluem a arginina, a lisina e ahistidina. Os aminoácidos com cargas negativas (ácidos) incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico.

Além disso, as OMVs isoladas de OMP de Classe I, os fragmentos ou os oligopéptidos podem modificar-se por conjugação com outras moléculas (por exem pio, por ligação de grupos de ligação tais como os aminoácidos cisteína e/ou lisina ou outros grupos de ligação e/ou grupos espaçadores) incluindo outra OMP de Classe I de um subtipo diferente, epítopes de células T, epítopes de células B, peptidos ou proteínas veiculares, ou moléculas adjuvantes.

Tal como se descreve pormenorizadamente em seguida, a OMP de Classe I, os fragmentos ou oligopéptidos podem utilizar-se em muitas formas diferentes (por exemplo, isoladamente, em misturas, ou conjugadas ou em fusões genéticas produzidas por vectores de DNA recombinante) em vacinas. Para estes fins os materiais podem produzir-se por isolamento a partir de N. meningitidis, por di gestão proteolítica, por síntese química ou por expressão como moléculas recom binantes. Os métodos de preparação e aplicação das OMVs isoladas de OMP de Classe I e os fragmentos oligopéptidos de OMP de Classe I são descritos a seguir.

A modelação e a análise de estrutura da proteína das OMPs de Classe I rea lizou-se aplicando-se os princípios para várias proteínas da membrana mais externa de E. coli (Vogel, H. et al., J. Mol. Bio. , 190 (1986) 191; Ference, T. et al., J. M01. Bio., 201 (1988) 493 e Tommassen, J. Membrane Biogenesis in Nato Asi Series H16, New York, Springer-Verlag, 1988, (pp 351). A sequência de amin£ ácidos derivada das OMPs de Classe I foi utilizada para estudos de modelação e comparação. A homologia da sequência de aminoácido foi comparada com outras pro teínas de porina bacterianas gram-negativas e identicamente estabeleceu-se a es_ trutura da proteína. As ansas da superfície expostas e a estrutura de transmembrana

eram muito semelhantes as destas proteínas de porina. Com a informação revela da respeitante a epítopes protectores da região constante e da região variável de N. meningitidis e a sua estrutura e possivel prever, com base na sequência de aminoácidos, onde podem estar situados os epitopes protectores para outras bactérias gram-negativas patogenicas a considerar e incluir nas vacinas para o mesmo fim.

Produção de OMVs Isoladas

Podem produzir-se OMVs, quer a partir do sobrenadante da cultura, quer a partir de células bacterianas após fragmentação como descrito por Beuvery et al (1983) loc. cit.

As proteínas que vinculam OMVs de mais do que um meningococcus podem-se isolar a partir das estirpes manipuladas para exprimir proteínas heterólogas.

Produção e purificação de OMP de Classe I e seus fragmentos de CNBr

As proteínas da membrana mais externa de Classe I e Classe 3 podem-se isolar como descrito por Beuvery, E. C. et al., Antonie Wan Leeuvenhoek J. Microbiol. 52 (1986) 232. A produção de OMP de Classe I substancialmente pura isenta de OMPs de Classe 2 ou 3 obtem-se por este método utilizando estirpes meningocócicas mutantes que nao exprimem OMPs de Classe 2/3. Uma estirpe preferida para a produção da OMP de Classe I é a estirpe HIII5 depositada como CBS

636.89.

Podem-se preparar os fragmentos por cisão com brometo de cianogénio como descrito por Teelink T. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 63 para uma proteína gonocócica. 0 fragmento N-terminal é referido como CB-1 e o fragmento

-12- a

*

C-terminal é referido como CB-2. Estes fragmentos CNBr podem ser purificados TM TM por HPLC de fase inversa numa coluna Vydax C4 ou numa coluna Aquapor R-300 utilizando-se um gradiente de água/acetonitrilo. Alternaiivamente, o fragmento pode verificar-se por precipitação múltiplas com acido tricloroacético arrefecido. Estes processos eliminam mais do que 95£ dos contaminantes que interferem (por exemplo, sais tampão, detergentes e fragmentos contaminantes).

Preparação de fragmentos e oligopéptidos contendo epítopes de OMP de Classe I

A. Preparação por digestão proteolítica.

Os oligopéptidos que contem epítopes reactivos com anticorpos bactéria nos contra N. meningitidis podem produzir-se por digestão de OMP de Classe I, fragmentos CB-1 ou CB-2 com proteínases tais como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C e estafilococcina V8-proteiase. Os fragmentos digeridos podem purificar-se, por exemplo, mediante técnicas de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).

B. Preparaçao por síntese química.

Os oligopéptidos da presente invenção podem sintetizar-se mediante síntese peptídica sólida convencional (Barany, G. e Merrified , R. Β., The Peptides 2_-, 1-284, Gross, E. e Meienhofer, J., Eds. , New York, Academic Press) utilizando-se resinas de aminoácidos terc-butiloxicarbonílicos e resinas fenilacetamidometílicas (Mitchell, A. R. et al., J. Org. Chem. 43 (1978) 2845-2852) ou aminoácidos 9-fluoroenilmetiloxicarbonilicos num suporte de poliamida (Dryland, A. e Sheppard, R. C., J. Chem. So. Perkin Trans. I (1986), 125-137). Alternativamen te, podem preparar-se péptidos sintéticos por síntese de pepscar (Geysen, Η. M. et al., J. Immunol. Methods 03 (1987) 259; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984)

3998), Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, U. K. ou por síntese peptí dica de fase líquida convencional. A delecção ou substituição de aminoácidos (e incluindo extensões e adições de aminoácidos) por outras vias que nao deteriorem substancialmente as propriedades imunologicas do oligopeptido.

C. Preparação por meio de técnicas de recombinação de DNA.

A OMP de Classe I, os fragmentos e os oligopéptidos que exibem epitopes de OMP de Classe I podem produzir-se por técnicas de recombinação de DNA.

Em geral, estas incluem a obtenção de sequências de DNA que codificam a OMP necessária (Barlow et al,, Mol. Micro., 3 (1989) 131), o fragmento ou as sequências oligopéptidicas e a introdução em um vector apropriado/sistema de expressão hospedeiro de uma ou mais sequências de DNA diferentes ou similares ãs OMPs de Classe I em que aquela e expressa. 0 DNA pode constituir um gene codificador de OMP de Classe I ou qualquer segmento do gene que codifica um epíto pe funcional da OMP·· Pode fundir-se o DNA com DNA que codifica outros antigénios de N, meningitidis (tais como outras proteínas da membrana mais externa de Classe igual ou diferente) ou antigénios de outras bactérias, vírus, parasitas ou fungos para criar por via genética antigénios fundidos plurivalentes compartilhando uma estrutura peptídica comum. Por exemplo, os fragmentos da OMP de Classe I podem fundir-se com outra proteína de membrana externa de Classe 1 de um subtipo diferente (ou seus fragmentos ou epítopes) de N. meningitidis para se obter proteínas de fusão contendo múltiplos determinantes de subtipo de proteína de membrana mais externa de Classe 1.

As técnicas de engenharia genética podem-se utilizar também para caracterizar, modificar e/ou adaptar os péptidos ou as proteínas codificadas. Por exemplo, a mutagenese de sítio dirigido para modificar um fragmento de OMP na região externa dos domínios protectores, por exemplo, para aumentar a solubili-

dade do subfragmento permitindo uma purificação mais fácil. Pode ainda manipu lar-se o DNA para efectuar a superprodução de fragmentos de OMP ou suas associações em organismos diversos.

Pode sintetizar-se o DNA que codifica uma OMP de Classe I, fragmentos ou oligopéptidos ou isolar-se e sequenciar-se como descrito por Barlow, A. K. et al., Infect. Immune 55 (1987) 2734-2740 e Barlow, A. K. et al, Mol. Micro. Ç (1989) 131. Os genes de OMP de Classe I podem ampliar-se a partir de DNA bactéria no de acordo com os métodos de Mullis e Faloona, Method. Enzym. 155 (1987) 335-350, utilizando-se as sequências iniciadoras aí descritas. As sequências de DNA relacionadas com OMP de Classe 1 de diferentes subtipos podem obter-se por processos descritos e deduzirem-se as sequências de aminoácidos.

Pode-se utilizar uma diversidade de sistemas de vectores hospedeiros para exprimir os oligopéptidos da presente invenção. Principalmente, o sistema de vectores tem que ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Sistemas de vectores hospedeiros incluem, mas nao estão limitados aos seguintes: bactérias transformadas com DNA bacteriofágico, DNA plasmídico ou DNA cosmídico; microrganismos tais como leveduras contendo vectores de levedura; sistemas de cé lulas de mamiferos infectadas com vírus (por exemplo, vírus da vaccínia, adenovírus, etc.); sistemas celulares de insectos infectados com vírus (por exemplo, baculovírus). Os elementos de expressão destes vectores variam na força e especificidade. Dependendo do sistema vector hospedeiro utilizado, poder-se-á utilizar uma diversidade de elementos de transcrição e traduçao apropriados.

Para se obter a expressão eficiente do DNA clonado, deve estar presente no vector de expressão um promotor. A RNA polimerase normalmente liga-se ao pro motor e inicia a transcrição de um gene ou de um grupo de genes ligados e elemen tos reguladores (designados por operon). Os promotores variam na sua força isto

-15é, na sua capacidade para promover a transcrição. É conveniente utilizar pro motores fortes a fim de se obter um nível elevado de transcrição e, deste modo, um nível elevado de expressão de DNA. Dependendo do sistema de célula hos pedeiro poder-se-á utilizar um promotor qualquer entre os promotores apropriados. Por exemplo, para E. coli podem-se utilizar os seus promotores bacterio lógicos ou plasmídicos, tais como o promotor lac, o promotor trp, o promotor recA, o promotor RNA ribossonal e os promotores P ou P do colifago lamda e outros incluindo mas não limitados aos lacUV5, ompF, bla, 1pp e semelhantes , para dirigir níveis elevados de transcrição de segmentos de DNA adjacentes . Adicionalmente pode- se utilizar um promotor híbrido trp-lacUV5- (tac) ou outros promotores de E. coli produzidos por recombinação de DNA ou por outras técnucas de DNA sintético para proporcionar a transcrição do DNA inserido.

As células bacterianas hospedeiras e os vectores de expressão podem escolher-se de modo a que inibam a acção do promotor, a menos que induzidos especificamente. Em certos operons a adição de indutores específicos é neces sária para a transcrição eficiente da inserção do DNA; por exemplo, o operon lac é induzido pela adição de lactose ou de IPTG (isopropiltio-beta-D-galacto sido). Uma diversidade de outros operons, tal como trp etc., estão sob controlos diferentes. 0 operon trp é induzido quando na ausência de triptofan no meio de crescimento; e o promotor P^ de lambda pode ser induzido por um aumento de temperatura nas células hospedeiras que- contêm um repressor lamda sensível ã temperatura, por exemplo C1857. Deste modo, pode ser inibida mais que 95£ da transcrição dirigida pelo promotor, nas células não induzidas. Por tanto, a expressão do péptido ou da proteína recombinante pode ser controlada. Este facto é importante se o produto de expressão do DNA é letal ou é prejudi ciai para as células hospedeiras. Nestes casos, as transformantes podem cultivar-se sob condições de modo a não induzir o promotor; então quando as cél_u las alcançam uma densidade no meio de crescimento, pode ser induzido o promotor para a produção da proteína.

-16ζ\

Um tal sistema promotor/operador e o sistema tac ou trp-lac de promotor/operador (Russell e Bennett Gene 20 (1982) 2312-243; De Boer, pedido de patente de invenção europeia n2 67.540 depositado a 18 de Maio de 1982). Este promotor híbrido é construído pela associaçao de -35 p. b. (região -35) do promotor trp e -10 p. b. (região -10 ou Pribnow box) do promotor lac (as sequên cias de DNA que sao o sitio de ligaçao de RNA polimerase). Alem disso, para a manutenção das caracteristicas de promotor forte do promotor triptofano, tac é ainda controlado pelo repressor lac.

Quando clonando numa célula hospedeira eucariotica as sequências refor çadoras (por exemplo, a repetição em série de 72 pb de DNA de SV40 ou as repeti, ções de terminal longo retrovirais ou LTRs, etc.) podem ser inseridas para aumentar a eficiência da transcrição. As sequências reforçadoras são um conjunto de elementos DNA eucariótico que parece aumentar a eficiência transcricional de um modo relativamente independente da sua posição e orientação no que se re fere ã vizinhança de um gene. Diferentemente dos elementos de promotor clássico (por exemplo, o sítio de ligaçao de polimerase e a sequência TATA Goldberg-Hogness box) que devem estar localizados na vizinhança da extremidade 5' do gene, as sequências reforçadoras têm uma capacidade notável para funcionarem a montante de, dentro ou a jusante dos genes eucarióticos; portanto, a posição da sequencia reforçada no que se refere ao DNA inserido é menos crítica.

Os sinais de iniciaçao específicos sao ainda necessários para a transcrição e tradução eficiente em células procarióticas. Estes sinais de iniciaçao de transcrição e traduçao podem variar na força avaliada pela quantidade de RNA mensageiro específico do gene e da proteína sintetizados, respectivamente. 0 vector de expressão de DNA, que contem um promotor pode ainda conter qual quer associaçao de sinais de iniciaçao de transcrição e/ou traduçao de força diversa. Por exemplo, a traduçao eficiente em E. coli requere uma sequência

Shine-Dalgarno (SD) com cerca de 7 a 9 bases de 5' para o codão de iniciação (ATG) proporcionar um sítio de ligação ribossónico. Portanto, poderá utilizar-se qualquer associação SD-ATG que possa ser utilizada pelos ribossomas da célula hospedeira. Estas combinações incluem, mas não estão limitadas à associação SD-ATG do gene cro ou do gene N do colifago lambda ou dos genes triptofano E, D, C, B ou A de E. coli.

Também se pode utilizar qualquer associação SD-ATG produzida por recombinaçao de DNA ou por outras técnicas que envolvem a incorporação de nucleõtidos sintéticos.

Qualquer dos métodos descritos para a inserção de DNA num vector de ex pressião pode ser utilizado para ligar um promotor e outros elementos de contro lo genético nos sítios específicos do vector. As sequências de N. meningitidis para expressão podem ligar-se em um vector de expressão num sítio específi_ co em relação ao promotor do vector e aos elementos de controlos, de modo a que quando a molécula de DNA recombinante for introduzida numa célula hospedeira a sequencia genética estranha possa ser expressa, (isto é, transcrita e traduzida) pela célula hospedeira.

vector de DNA de recombinação pode ser introduzido em células hospedeiras apropriadas (bactérias, vírus, leveduras, células de mamíferos ou semelhantes) por transformação, transdução ou transfecção, dependendo do sistema vector/celula hospedeira). As células hospedeiras que contêm um vector são escolhidas com base na expressão de um ou mais marcadores genéticos apropriados presentes normalmente no vector, tal como a resistência à ampicilina ou a resistência ã tetraciclina em pBR322, ou ã actividade timidina quinase em sistemas hospedeiros eucariõtjí cos. Os vectores de expressão podem ser derivados de vectores de clonagem que usualmente contêm uma função marcadora. Estes vectores de clonagem podem in<ζ

-18cluir, mas não estão limitados aos seguintes: SV40 e adenovírus, vectores de vírus da vaccinia, vírus de insectos como os baculovírus, vectores de le veduras, vectores bacteriofágicos como lambda gt-WESlambda B, Charon 28,

Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda gt-l-lambda Β, M13 mp7, M13 mp8, M13 mp9, ou os vectores de DNA plasmídico como pBR 322, pAC 105, pVA51, pACYC 177, pKH47, pACYC 184, pUB 110, pMB9, pBR 325,Col El, pSClOl, pBR 313, pML 21, RSF 2124, pCRl, RP4, pBR 328 e semelhantes.

Os vectores de expressão que contem inserções de DNA podem ser identificados por tres vias gerais:

(1) hibridaçao DNA-DNA usando-se sondas que contem sequências que são homó Iogas das do gene inserido;

(2) presença ou ausência de funções do gene marcador (por exemplo, resistência aos antibióticos, fenótipo de transformaçao, actividade timidina guinase, etc.); e (3) expressão de sequências inseridas baseadas em propriedades imunolõgicas físicas ou funcionais do produto genético.

Logo que um clone de recombinaçao putativo que exprime uma sequência de aminoácidos de OMP de Classe I requerida é identificada, o produto genético pode analisar-se do seguinte modo. A analise imunológica é especialmente importante porque o ultimo objectivo e utilizar os produtos genéticos em com posiçoes de vacinas e/ou como antigénios em imunoensaios de diagnostico. 0 péptido expresso ou a proteína deve ser imunoreactiva com anticorpos bactericidas para N. meningitidis. Esta reactividade pode ser demonstrada por técnicas imunolõgicas convencionais, tais como por exemplo, a radioimunoprecipita-1 çào, radioimunocompetiçao, ELISA ou imunomanchas.

Logo que o produto gene está identificado como um fragmento de OMP de Classe I ou um oligopeptido que contem um seu epítope funcional, ele pode ser isolado e purificado de acordo com métodos convencionais incluindo a cromatografia [por exemplo, de permuta ionica, de afinidade e de cromatografia em co luna de exclusão (sizing)], centrifugação, diferenças de solubilidade ou por quaisquer outras técnicas convencionais para a purificação de proteínas. Existem diversas técnicas de purificação de proteínas heteróloga proveniente de células procarióticas. Consultar por exemplo, Olson, patente de invenção norte-americana n° 4 518 526, Wetzel, patente de invenção norte-americana n2 4 599 197 e Hung et al., patente de invenção norte-americana n9 4 734 362. Seja como for, a preparação purificada produzida deve ser substancialmente isen ta de toxinas do hospedeiro que devem ser nocivas para os seres humanos. Em especial, quando expressa em células hospedeiras bacterianas gram-negativas, como por exemplo E. coli ou Salmonella, o péptido purificado ou a proteína devem ser substancialmente isentos de endotoxinas contaminantes.

A OMP de Classe I, os fragmentos e os oligopéptidos da presente invenção podem ser formulados sob a forma de vacinas uni ou polivalentes. Estes materiais podem ser utilizados quando produzidos e isolados pelos métodos descritos antes. Podem ser misturados, conjugados ou fundidos com outros antigénios, incluindo epítopes de células B ou de células T de outros antigénios.Além disso, podem ser conjugados com uma proteina veicular como descrito posteriormente para os oligopéptidos.

Quando se utiliza um oligopeptido hapténico, (isto é, um péptido que reage com anticorpos afins, mas que ele próprio nao pode provocar uma resposta imunológica),este pode ser conjugado com uma molécula imunogénica veículo.

A conjugação com um veículo imunogénico pode tornar o oligopéptido imunogénico. A conjugação pode realizar-se de acordo com métodos convencionais. As proteínas veiculares preferidas para oligopéptidos hapténicos são as toxinas, os toxoides ou qualquer material de reacção cruzada mutante (SRM) sde toxina tetânica, diftérica, pertussis, Pseudodomonas, E. coli, Staphylococcus e Streptococcus. Um veículo particularmente preferido é CRM^? de toxina diftérica, proveniente de uma estirpe P. diphteriae C7 ( 197) que produz a proteína CRM . Esta estirpe tem o número de aceitação na ATCC 53 281. Alternativamente, pode utilizar-se um fragmento ou um epítope de uma proteína veicular ou outra proteína veicular ou outra proteína imunogénica. Por exemplo, o hapteno pode ser liga do a um epítope de célula T de uma toxina bacteriana, toxõide ou CRM. Cônsul tar o pedido de patente de invenção norte-americana série n2 150 688 deposita da a 1 de Fevereiro de 1988, intitulado Synthetic Peptides Representing a T. Cell Epítope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines, cujos ensinamen tos se incluem aqui. Outros veículos incluem partículas virais compostos de Rotavírus VP6, antigenios de superfície de Hepatite B ou parvovírus VP1 e

VP2.

Os péptidos de proteínas da presente invenção podem ser administrados sob a forma de subunidades de vacinas multivalentes em associação com antigenios de N. meningitidis ou antigenios de outros organismos. Alguns dos outros organismos incluem bactérias patogénicas H. inf luenzae, N. meningitidis, B_.

catarrhalis, N. gonorrheae, E. coli, S. pneumoniae, etc. Por exemplo, podem dministrar-se em conjunto com componentes oligo ou polissacarídicos capsulares de N. meningitidis. Os componentes capsularespodem ser derivados de qual quer dos grupos serológicos, A, B, C, D, X, Y, Ζ, 29E e Wt35.

Podem-se utilizar as proteínas da membrana externa de Classe I de dife rentes subtipos. Estas podem ser associadas para provocarem anticorpos bacteri_ cidas contra N. meningitidis. Por exemplo, uma fragmento proveniente da proteína

1da membrana mais externa de classe I do subtípo Pl.7.16 pode utilizar-se conjuntamente com proteínas da membrana mais externa ou fragmentos de proteínas de mem brana mais externa de outros subtipos, tais como Pl.l, Pl.1.16; P1.2; P1.6;

P1.9; P1.15, P1.16 ou Pl.4 (Abdillahi, H. et al. Micro. Pathog. 4: (1988) 27 ou com polissacáridos meningocõcicos em mistura ou como conjugados químicos. Para administraçao associada com epítopes de outras proteínas da membrana externa , aquelas podem ser administradas separadamente, como uma mistura ou como um con jugado ou como um péptido ou proteina de fusão genética. Os conjugados podem ser formados de acordo com técnicas padrão para a ligação de materiais proteicos ou técnicas para a ligaçao de polímeros sacaridicos ãs proteínas. As fusões podem ser expressas por contruçoes de genes fundidos preparados por técni cas de recombinaçao de DNA, como descrito.

Como mencionado, a OMP de Classe I, o fragmento ou quaisquer oligopéptidos seus derivados podem ser utilizados em conjugação com antigénios (por exemplo, capsulas de polímeros ou unidades sacarídicas, proteínas de invólucro ou de superfície), de outros organismos patogénicos [ por exemplo, bactérias (encapsuladas ou nao encapsuladas), vírus, fungos e parasitas]. Outros exemplos de outros organismos incluem os vírus sinciciais respiratórios, rotavírus, para sitas da malária e Cryptococcus neoformans.

Na formulação das composições da vacina com o péptido ou a proteína isoladamente ou nas diversas associações descritas, o imunogenio é ajustado para a concentração apropriada e formulado com qualquer adjuvante de vacina apropriado. Os adjuvantes apropriados incluem, mas estão limitados a: substâncias activasde superfície (por exemplo, hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de octadecilaminoácidos, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamónio), met£ xi-hexadecilglicerol e polióis plurónicos; poliaminas, por exemplo, pirano, sul. fato de dextrano, poli Ic, carbopol; péptidos, por exemplo, dipéptido muramíli-22Sr co e derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsões oleosas e géis minerais , por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, etc., linfocinas e complexos de estimulação imunologicas (ISCOMS). Pode ser incorporado imunogé nio nos lipossomas, microsferas ou conjugados com polissacáridos e/ ou outros polímeros para a aplicação numa composição de uma vacina.

As vacinas podem ser administradas a seres humanos ou animais por uma diversidade de vias. Estas vias de administração incluem a intradérmica, a in tramuscular, a intraperitoneal, a endovenosa, a subcutânea, a oral e a intranasal.

Vacinas Vivas

Os péptidos e as proteínas da presente invenção podem-se administrar sob a forma de vacinas vivas. Para esta finalidade, os microrganismos recombi nantes preparam-se de modo a exprimirem os péptidos ou as proteínas. 0 recipiente da vacina é inoculado com um microrganismo recombinante que se multipli ca no recipiente, exprime a OMP de Classe I, o seu fragmento ou o seu oligopép tido e provoca uma resposta imunolõgica para o N. meningitidis. Os vectores de vacinas vivas incluem: adenovírus, citomegalovírus e de preferência, por vírus tais como o virus da vaccinia (Paoletti e Panicali, patente de invenção norte-americana ηθ 4.603.112 e estirpes de Salmonella atenuadas [Stocker, pa tente de invenção norte-americana n° 4.550.081 e Curtiss et al., Vaccine 6 : (1988) 155-160]. Também os epítopes de OMP de Classe I se podem incorporar nos flagelos de estirpes bacterianas atenuadas.

As vacinas vivas são particularmente vantajosas porque conduzem a um e£ tímulo prolongado que pode conferir imunidade substancialmente mais longa. Quando a resposta imunolõgica é protectora contra a protecção subsequente por

N. meningitidis, a própria vacina viva pode ser utilizada como uma vacina pre_ ventiva para a N. meningitidis

As vacinas vivas polivalentes podem preparar-se a partir de um único ou de uns poucos microrganismos recombinantes que exprimem diferentes epitopes de N. meningitidis (por exemplo, outras proteínas da membrana externa de outros subtipos ou dos seus epitopes). Além disso, os epitopes de outros microrganismos patogénicos também podem ser incorporados na vacina. Por exemplo, o vírus da vacina pode ser preparado por via genética para conter sequências codificado ras para outros epitopes alem dos epitopes de N. meningitidis. Estes vírus re combinantes podem ser, eles proprios, utilizados como imunogénios em uma vacina polivalente. Alternativamente, uma mistura de vaccinia ou de outros vírus, cada um expressando um gene diferente que codifica diferentes epitopes de proteínas da membrana externa de N. meningitidis e/ou epitopes de outros organismos causadores da doença podem ser formulados sob a forma de uma vacina polivalente .

Pode preparar-se uma vacina de vírus inactivados. As vacinas inactivadas sao mortas, isto é, foi destruída a infectividade, usualmente por meio de tratamento químico (por exemplo, por tratamento com formaldeído). Idealmente a infectividade do vírus é destruída sem atingir as proteínas que transportam a imunogenicidade virai. Para se preparar vacinas inactivadas desenvolveram-se grandes quantidades de vírus recombinantes que exprimem os epitopes requeridos, em cultura, para proporcionar a quantidade necessária dos antigénios com importância. Pode ser utilizada uma mistura de vírus inactivados que exprimem diferentes epitopes para a composição de vacinas polivalentes. Em certos ca sos, estas vacinas polivalentes inactivadas podem ser preferíveis ãs composições com vacinas vivas devido ãs dificuldades potenciais provenientes de interferências mútuas dos vírus vivos administrados em conjunto. Em qualquer dos ca

sos, os vírus inactivados ou a mistura de vírus podem ser formulados com um agente adjuvante apropriado para reforçar a resposta imunológica aos antigénios. Os adjuvantes apropriados incluem: substâncias activas de superfície , por exemplo, hexadecilamina, ésteres de octadecilaminoácido, octadecilamina , lisolecitina, brometo de dimetil-dioctadecilamónio, N,N-dicoctadecil-N', N'bis (2-hidroxietil-propano-diamina), metoxi-hexadecilglicerol e polióis plurónicos; poliaminas, por exemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC; carbopol; péptidos, por exemplo, dipéptido muramílico e seus derivados, dimetilglicina, tuftsi na; emulsões oleosas e géis minerais, por exemplo hidróxido de alumínio, fosfa to de alumínio e linfocinas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Anticorpos monoclonais contra OMPs de Classe I e sua actividade biológica

Prepararam-se anticorpos monoclonais de tipo específico contra várias pro teínas da membrana exterior de meningococcus de Classe 1. Estes anticorpos monoclonais reconhecem os subtipos seguintes: Pl.l; P1.2; P1.6; P1.7; P1.9; Pl.10; P1.15; P1.16 e P1.17 (actualmente designado por P1.14). Os anticorpos monoclo nais estão disponíveis como Monoclonal Kit Serotyping Meningococci de RIVM , Bilthoven, Holanda. Todos estes anticorpos monoclonais reagem com proteína des naturada SDS (dodecilsulfato de sódio) quando analisados por mancha de Western. Também acontece que um numero destes anticorpos monoclonais reagem com um fragmento de 25 Kd CNBr da proteína da membrana exterior de Classe 1 de 42Kd (ver em seguida). Estes resultados implicam que os epítopes proteicos da membrana exterior sao principalmente do tipo linear e podem portanto ser copiados com péptidos sintéticos. Os resultados epidemiologicos de testes realizados pelos

inventores demonstraram que os anticorpos monoclonais referidos podem ser a maior parte do grupo meningocócico A, B, C o que sugere uma heterogenidade limitada. Cada proteína da membrana exterior de Classe 1 também parece conter dois epítopes de tipo específico individuais (Abdillahi e Poolman; Microb. Pathogen, 4: (1988) 27-32; idem FEMS Microbiol. Immunol. 47: 139-144).

A proteina da membrana exterior de Classe 1 purificada ( ver a seguir), subtipo Pl.7,16, proveniente da cultura da mutante livre Classe 2/3 (HIII5) parece induzir uma resposta de anticorpo bactericida na diluição de soro de 1:64 numa dose de 2,5 ^ug, no murganho. Os anticorpos monoclonais contra as proteínas da membrana exterior de Classe 1, proteínas da membrana exterior de Classe 1, proteínas da membrana exterior Classes 2/3 e lipopolissacãridos foram compa rados quanto ao efeito bactericida. Os anticorpos monoclonais contra as proteí nas da membrana exterior de Classe 1 parecem possuir a mais forte actividade bac tericida (ver Quadro 1). A resposta bacteriana determinou-se de acordo com Poolman, J. T. , em Schoolmick, G. J. et al., editores The Pathogenic Neisseriae, Washington, D. C. ASM Publications, 1985, p. 562.

—zo— z

QUADRO 1

Actividade bactericida de uma colecção de anticorpos monoclonais dirigidos contra a Classe 1 (cl 1), Classe 2/3 (cl 2/3) e lipopolissacáridos (LPS) de meningococcus. (ND-nao determinado)

Actividade bacteriana da mistura

Estirpe ensaiada	de anticorpos ( título )
estirpe	(serotipo: GP:	mistura de mistura de	mistura d
subtipo:	tipo LPS)	CL 2/3 Cl 1	Cl LPS

3006 (B:26:P1.2:L2)	1000	8000	ND
M981 (B:4P1.-:L5)	10	ND	2000
M990 (B:6:P1.6:L/)	10	2000	ND
M978 (B:8:P1.1:L1.8)	ND	8000	1000
M982 (B:9:P!.9:L3.7)	500	2000	1000
H355 (B:15:P1.15:L1.8)	1000	8000	1000
H44/76 (B:15:P1.7.16:L3.7)	1000	8000	4000

A actividade bactericida destes anticorpos monoclonais parece relacionar -se bem com a actividade protectora in vivo avaliada de acordo com a experiência de meningite no rato de Saukkonen et al., Microbiol Pathogen Ç: (1987) 261.

·²⁷-/

Exemplo la : Construção de estirpes meningocócicas que comportam genes de Classe 1 múltiplos

A substituição de genes cromossómicos por clones, em versões ligeiramen te diferentes foi descrita para Neisseria gonorreia. [Stein, D. C. Clin. Micro biol. Rev. 2 ( Suppl. ), (1989) 5146-5149] . Verificámos que este método se pode aplicar ao gene de Classe 1 da Neisseria meningitidis. Isto realizou-se do seguinte modo:

(i) 0 gene de Classe 1 da estirpe 2.996 (subtipo P1.2) clonou-se no vector pTZ19R. [Mead, D. A. et al., Protein Engineering 1 (1986), 67]. 0 gene completo está localizado num fragmento Xbal de 2,2 kb que foi ligado ao vector de DNA digerido de XbAI.

(ii) 0 plasmídeo resultante foi utilizado para a transformação da es tirpe H44/76 ( subtipo Pl.7,16). As células da estirpe aceitante incubaram-se com DNA plasmídico na presença de Mg. e meio para meningococcus normal. Em seguida, foram diluídas e plaquea das e as colonias resultantes ensaiaram-se para determinação da capacidade para se ligarem ao anticorpo monoclonal específico

P1.2. Estas transformantes encontraram-se com uma frequência de -3 aproximadamente 10 . A caracterizaçao pelo exterior demonstrou que a substituição do gene de Classe 1 H44/76 tinha de facto ocorrido.

Um aspecto essencial do método é a presença no gene da dor numa molécula de DNA plasmídico circular, dado que não está apto a replicar-se na N. meningitidis , desde que se utilize a DNA linearizada nao produz quaisquer trans formantes.

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A construção de uma estirpe com dois genes de Classe 1 realizou-se por uma modificação do método anteriormente descrito. Para este fim, o gene P1.2 Classe 1 inseriu-se em clones de um gene Classe 5. A família de genes de Cla£ se 5 tem dois aspectos que o tornam particularmente apropriado para esta construção. ( Meyer, T. F. e Van Putten, J. Ρ. Μ., Clin. Microbiol. Rev. 2 ( su£ pl. ) (1989), S139-S145: (i) existem quatro ou cinco genes Classe 5 presentes no genoma do meningococcus e (ii) a expressão destes genes não é necessária para o crescimento sob condiçoes laboratoriais. Um gene de Classe 5 foi clonado a partir da estirpe H44/76 e o gene P1.2 inseriu-se em um sítio Sphl localizado em ou muito perto do gene de Classe 5. 0 plasmídeo híbrido resultan te, pMC22, foi utilizado para a transformação da estirpe HIII5, um mutante de H44.76 deficiente Classe 3. As colónias que reagem com o anticorpo monoclonal específico P1.2 foram isoladas e caracterizadas. De cada 10 destas transforman tes, verificaram-se que nove tinham perdido o epítope P1.16 da estirpe aceitante. Este facto indica que em todos estes casos a recombinaçao ocorrera somente entre os genes de Classe 1, resultando numa substituição do subtipo. Contudo , encontrou-se uma transformante com ambos os subtipos de Classe 1 isto é, Pl.7,16 e P1.2, sugerindo que a recombinaçao entre as sequências do gene de Classe 5 no plasmídeo e no cromossomas devem ter ocorrido. Este facto confirmou-se por mancha de Western, revelando-se a presença de ambos os tipos de proteína de Classe 1 e por mancha de Southern, demonstrando a aquisiçao de um segundo ge ne de Classe 1.

Pela continuação desta construção com outros subtipos de Classe 1 é pos sível construir uma estirpe com quatro ou cinco genes de Classe 1 diferentes .

mesmo gene de Classe 5 pode utilizar-se em cada fase de transformação subsequente, os genes de Classe 5 diferentes podem ser clonados e utilizados sepa radamente. Estas estirpes recombinantes podem ser utilizadas para preparar misturas de diferentes OMPs de Classe I purificadas.

Exemplo lb : Purificação de OMVs isoladas de culturas bacteriológicas

A purificação realizou-se de acordo com o método de Beuvery et al. (1983) loc. cit.

Pode realizar-se esta cultura com as estirpes de tipo selvagem desejadas, estirpes meningococicas mutantes sem as proteínas da membrana exterior de Classe 2/3 e/ou microrganismos recombinantes homólogos ou heterólogos que exprimem uma ou mais das proteínas da membrana exterior de Classe I meningocó cicas pretendidas e/ou epitopes, por superprodução de vectores eventualmente através de cadeias de leitura abertas existentes e/ou cadeias de leitura mani puladas de forma a que as proteínas de fusão ou as proteínas com epitopes alteradas possam ser preparadas.

As estirpes naturais facilmente disponíveis são: H44/76 (B:15:P1, 7,16) (Holten E., Noruega, depositada sob o n° CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne J., França); M1080 (B:1:P1,1.7) (Frasch C. EUA); Swiss4 (B:4:Pl,15) (Hirschel B., Suíça); B2106I (B:4:P1,2) (Berger U., Alemanha Ocidental); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Islândia): M990 (B:6:P1,6) (Frasch C., EUA);

2996 (B:2b:Pl,2) RIVM. Os holandeses; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C., EUA);

S3446 (B:14:P1,6) (Frasch C., EUA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E., Noruega); 6557 (B:17:P1,17) (ZOllinger W., EUA) e B40 (A:4:P1,1O) (Achtman M., Alemanha Ocidental). Um exemplo de uma mutante de Classe 3 negativa é a HIII5 (B:—:P1.16) depositada sob o número CBS 636.89.

Estas estirpes foram inoculadas a partir de pré-culturas ã temperatu ra de -70°C em frascos de agitaçao e transferidas destes para culturas de fer mentaçao de 40, 150 ou 350 litros. 0 meio semi-sintético tinha a composição seguinte: ácido L-glutãmico 1.3 g/1, L-cistaína. HC1 0,02 g/1, Na₂HPO^-2H₂O

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g/1, KC1 0,09 g/1, NaCl 6 g/1, NH Cl 1,25 g/1, MgSO₄-7H₂O 0,6 g/1, gluco se 5 g/1 Fe(NO^)^ 100 ^iM, yeast dialysate.

Durante a cultura no fermentador, foram controlados o pH e a presença de P0₂ e regulados automaticamente para o pH 7,0-7,2 e saturaçao de ar de 10%. As células desenvolveram-se até ao início da fase estacionária, colheram-se por meio de centrifugação e lavaram-se com solução estéril de cloreto de sódio 0,lM conservando-se a uma temperatura de -20°C ou liofilizadas.

Exemplo 2 : Purificação de proteínas da membrana exterior de Classe 1 a partir de culturas bacteriológicas

Pode realizar-se esta cultura com a de estirpes de tipo selvagem preten didas, estirpes meningocócicas mutantes sem proteínas da membrana exterior de Classe 2/3 e/ou microrganismos homologos ou heterólogos recombinantes que expri mam uma ou mais das proteínas da membrana exterior de Classe 1 meningocócicas pretendidas e/ou epítopes, por vectores de superprodução eventualmente através de cadeias de leitura abertas existentes e/ou cadeias de leitura manipuladas de forma a que possam ser preparadas as proteínas de fusão ou as proteínas com epítopes modificados.

As estirpes selvagens facilmente obtidas são: H44/76 (B:15:P1,7.16) (bolten E., Noruega, depositada sob o n2 CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne J., França); M1080 (Β:1:Pl,1.7) (Frasch C., EUA); Swiss4 (B:4:P1,15) (Hirschel B., Suíça); B2106I (B:4:P1,2) (Berger U., Alemanha Ocidental); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Islândia): M990 (B:6:P1,6) (Frasch C., EUA); 2996 (B:2b:Pl,2) RIVM. Os holandeses; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C., EUA); S3446 (B:14:Pl,6) (Frasch C., EUA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E., Noruega); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger W., EUA) e B40 (A:4:pl,10) (Achtman M., Alemanha Ocidental). Um-31-

exemplo de uma mutante negativa de Classe 3 é HIII5 (B:-:P1,16) depositada sob o número CBS 636.89.

Estas estirpes foram inoculadas a partir de pré-culturas ã temperatu ra de -70°C em frascos de agitação e transferidos destes para culturas de fer mentação de 40, 150 ou 350 litros. 0 meio semi-sintético tinha a composição seguinte:

Ácido L-glutãmico 1,3 g/1, L-cisteína. HC1 0^02 g/1, Na^HPO^. 2Η^0 10 g/1, KC1 0,09 g/1, NaCl 6 g/1, NH₄C1 1.25 g/1, MgSO^ 7H₂0 0,6 g/1, glucose 5 g/1 FeíNO^)^ 100 ^iM, yeast dialysate.

Durante a cultura no fermentador, controlaram-se o pH e o P0₂ e regulou-se automaticamente para pH 7,0-7,2 e saturaçao de ar de 10%. As células desenvolveram-se rapidamente para a fase estacionária, colheram-se por meio de centrifugação e lavaram-se com cloreto de sódio 0,lM estéril e con servadas ã temperatura de -20°C ou liofilizadas.

A massa bacteriana foi extraída por exemplo com o auxílio de cloreto de cálcio 0,5M, de Zwittergent a 1% (w/v) 3-14 (Zw 3-14) e cloreto de sódio 0,14M, pH 4,0, com 100 ml por grama de massa bacteriana liofilizada. Agitou-se a suspensão durante 1 hora ã temperatura ambiente e, em seguida, centri fugou-se (1 hora, 3.000 x g), após oque se recolheu o sobrenadante em condições estereis. Adicionou-se etanol a 20% (v/v) ao sobrenadante e após agita ção durante 30 minutos centrifugou-se o produto (30 minutos, 10.000 x g), apos o que se recolheu em condiçoes assépticas o sobrenadante. Em seguida con centrou-se o sobrenadante por diafiltração em um sistema Amicon Hollow Fiber [HID x 50, com uma extinção (cut off) de 50.000] e eliminou-se o cloreto de cálcio e o etanol. Diluiu-se o concentrado com acetato de sódio 0,lM

-32/ ζ*’' [EDTA 25 mM, Zw3-14 a 0,05% com um pH de 6,0, até ao volume original e, em seguida, concentrou-se novamente por diafiltraçao. Repetiu-se este procedimento cinco vezes. 0 pH do concentrado final ajustou-se para um valor de 4,0. Adicionou-se etanol a 20% (v/v) ao concentrado e, após agitaçao durante 30 minutos, centrifugou-se o produto (30 minutos, 10.000 x g). Purificaram-se as proteínas completas com o auxílio de cromatografia em coluna na presença de um detergente, por exemplo Zw3-14. Aplica-se frequentemente filtração por gele sobre Sephacryl S-300 assim como permuta iónica com Sepharose DEAE [Beuvery et al. supra (1986)]. 0 método de extracção utilizado, detergentes, coluna cromatografica nao sao os únicos métodos aplicáveis, uma vez que apenas servem como exemplos e nao devem ser considerados como restritivos.

Exemplo 3 : Preparação e caracterização de fragmentos peptídicos de OMP de

Classe I

Utilizou-se brometo de cianogénio para preparar fragmentos de proteínas da membrana exterior de Classe I meningococicas. As proteínas da membrana exterior de Classe I ou misturas de Classe 1 e 3 purificadas foram retomadas em ácido fórmico a 70% (v/v) e tratadas com um excesso de 10 vezes de CNBr durante 16 horas a temperatura ambiente. Eliminou-se o brometo de cianogénio e o ácido fórmico por evaporaçao e substituiu-se por Tris-HCL 0,2M, solução de ureia 6M, pH 7,2. Pré-purificou-se o sobrenadante por meio de filtração por gele sobre Sepharyl S-200 e em seguida purificou-se com o auxílio de fiJtração por gele TSK-2.000 por HPLC. Beuvery et al., supra (1986).

Digestão enzimãtica de fragmentos CB2

Para melhor delinear os epítopes, submeteu-se o fragmento meningocócico CB2, a digestão com EndoArg-C, EndoGlu-C ou V-8 e isolaram-se por HPLC

os fragmentos resultantes. Resumidamente, 20 nMoles do fragmento CB2 em 1 ml de fosfato de 25 mM/tampao Tris 0,1 mM (pH 8,0) contendo ureia 3M foi digeri do a temperatura de 37°C com 0,2 mmoles de EndoArg-C (1 mg/ml de água destilada) ou 0,22 nMoles de EndoGlu-C ou V-8 (lmg/ml em agua destilada) durante 14-18 horas. Os fragmentos digeridos resultantes separaram-se por HPLC de fa se inversa utilizando-se uma coluna de Vydac-C4 e um gradiente de acido trifluoroacético-acetonitrilo. 0 pico principal eluiu na digestão com EndoArg-C apresentando um peso molecular aparente de 7-9 Kdal embora o pico principal observado após EndoGlu-C ou V-8 apresentasse um peso molecular aparente de 4-6 Kdals. Os picos isolados foram subsequentemente revelados por mancha de Western para reagirem com uma mistura de anticorpos monoclonais (Adam I, 62-D12-8; MN5-C11G e MN14-C116).

epítope P1.16 parece estar presente no fragmento de CNBr C-terminal da proteína da membrana exterior de Classe 1 da estirpe H44/76 (B:15:P1,7.16). A caracterização posterior do epítope Pl,16 realizou-se por determinação da sequência de aminoácidos de 17 Kd (N-terminal) e 25 Kd (C-terminal) dos fragmentos CNBr. 0 fragmento C-terminal com 25Kd foi ainda fragmentado com V8 pro tease, endoLysC. endoGlu-C e endoArg-C. Os fragmentos positivos com o anticorpo monoclonal P1.16 foram sequenciados tanto quanto possível. As sequências que se obtiveram foram as seguintes:

extremidade Nda proteína completa:

DVSLYGEIKAGVEDRNYQLQLTEAQUAAGN.. .

extremidade N do fragmento com 25 Kd, C-terminal-CNBr:

(M) PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIONSKSAYTPAYYTKDTNNN...

ί

Os fragmentos que reagiram com os anticorpos monoclonais P1.16 isolaram-se utilizando-se V8 protease e fragmentação por endoArg-C com um peso molecular de 7-9 Kd e 4-6 Kd, respectivamente. As sequências N-terminais correspondentes sao as seguintes:

fragmento de V8 com 7-9 Kd: FSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTKDTN...

fragmento de Arg-C com 4-6 Kd: PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTK...

Exemplo 4 : Sequências de DNA de genes OMP de Classe I

Deduziram-se as sequências de aminoacidos de OMP de Classe I a partir da sequência nucleotídica dos genes estruturais de quatro OMPs de Classe I me ningococicas com subtipos diversos. A comparaçao com quatro sequências de ami noácidos permitiu a previsão da composição e localizaçao destes epítopes. Con firmaram-se ainda, os epítopes P1.7 e P1.16 com o auxílio de síntese peptídica e a demonstração da ligaçao dos anticorpos monoclonais respectivos.

Clonaram-se os genes de OMP de Classe I num lambda gtll (como descri to para P1.16 em Barlow et al., Infect. Immun. 55: (1987) 2743-2740) e subclo naram-se em vectores de sequenciaçao M13 determinando-se a sequência de DNA por técnicas de terminação de cadeia didesoxinucleotídica convencionais.

As sequências de aminoácidos completas derivadas para as proteínas

Pl. 16; P1.15; Pl.7,16 e P1.2 são as seguintes:

20 30 40 50

Ρ1.16: DVSLYGEIKAGVEGRNIQAQLTEQPQVTNGVQGNQV—KVTKAKSRIRTKIS

ΑΑΑΑΑΑΑAΑΑΑΑAAAA Α ΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

Ρ1.15: DVSLYGEIKAGVEGRNFQLQLTEPP-SKSQP---QV—KVTKAKSRIRTKIS **************** * **** *************

Pl.7,16: DVSLYGEIKAGVEGRNYQLQLTEAQAANGGASGQVKVTKVTKAKSRIRTKIS

ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ A ΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

Ρ1.2: DVSLYGEIKAGVEGRNIQLQLTEPLQNIQQPQ-------VTKAKSRIRTKIS **************** * **** *************

70 80 90 100 110

DFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQDVSVAGGGASQWGNRESFIGLAGEFGTLRAGRVA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

DFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQOVSVAGGGATQWGNRESFVGLAGEFGTLRAGRVA *************** ******************* ******* ***************

DFGSFIGFKGSEDLGDGLKAVWQLEQDVSVAGGGATQWGNRESFIGLAGEFGTLRAGRVA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

DFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQDVSVAGGGATRWGNRESFVGLAGEFGTLRAGRVA *************** ******************* ******* ***************

120 130 140 150 160 170

NQFDDASQAINPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPAQNSKS ΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑ

NQFDDASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPDFSGFSGSVQFVPIQNSKS ΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑ

NQFDDASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNSKS ΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑ

NQFDDASKAIDPWDSNNVVASQLGIFKRMDDMPVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPAQNSKS ******* ** ****************************** ************ *****

-36-,

180 190 200 210 220 230

AYKPAYYTKDTNNNLTLVPAVVGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRNAF ** ** ************************** ************* **

AYTPAHYTRQNNTDV-FVPAVVGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGSYAFKYARHANVGRDAF AA AA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA AA

AYTPAYYTKNTNNNLTLVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRNAF ** ** ************************** ************* **

AYTPAHFVQQTPQQPTLVPAVVGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYAKHANVGRDAF AA AA S4- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA AA

240 250 260 270 280 290

ELFLIGSATSDEAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAKTKNSTT **** ** ** ************************************* * *******

ELFLLGS-TSDEAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAKTKNSTT AAAA AA AA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A AAAAAAA

ELFLIGS-GSDQAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGD—KTKNSTT **** ** ** ************************************* * *******

ELFLLGS-GSDEAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENAD—KTKNSTT AAAA AA AA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A AAAAAAA

300 310 320 330 340 350

EIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDLIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

EIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDLIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

EIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

EIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

360 370

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF ************************

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF ************************

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF ************************ * Refere o aminoãcido 15 localizado entre A.A.S. 184 e 185 destas sequências.

Exemplo 5: Sequenciagão de DNA dos genes de OMP da Classe 1 a partir de diferentes serosubtipos de N. meningitidis

Utilizou-se a técnica de reacçao de cadeia de polimerase (PCR) de Mullis e Faloona [ Methods in Enzymol. 155: (1987) 335-50 ], para ampliar os genes de OMP da Classe I completo e os fragmentos específicos de acordo com os esquemas representados na Figura 1.

Sintetizaram-se iniciadores num sintetizador Applied Biosystems 380B de DNA e utilizaram-se em reacções de ampliaçao convencionais PCR de 30 ciclos utilizando-se Taq polimerase num Thermal Cycler (perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT ) de acordo com as recomendações do fabricante. Os fragmentos ampliados com cerca de 1300, 900 e 450 bp foram gerados a partir da preparação de DNA genomico de cada sero-subtipo a partir das associações de iniciadores represen tadas na Figura 1. Os iniciadores utilizados apresentavam as sequências seguintes :

PR1: (41 bases com iniciadores universais de extensão)

TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTG AAG ACG TAT CGG GRG TTT GC

PR2: (42 bases com iniciadores universais de extensão) <

TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGC GAA TTC CGT ACG CTG CGC GCC

PR3: (42 bases com iniciadores universais de extensão)

TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAT CAG GTA CAC CGC CTG ACG GGC

PR4: (40 bases com iniciadores universais de extensão)

TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA GAT TGG CAG TCA GAT-TGC A

%

PR5 : (40 bases com iniciadores universais de extensão)

TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGG ATC GGT ACC TTT GGG TTG A

PR6: (40 bases com iniciadores universais de extensão)

TGT AAA ACG ACG GCC AGT AAG TGA TTC GCA ACG CGA CCG G

WD: (24 bases)

TTG AAG GAC GTA TCG GGT GTT TCG

REV: (23 bases)

GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC TT

A matriz de cadeia simples em excesso, para a sequenciação foi sintetizada numa ampliação por PCR assimétrica aplicando-se um excesso de 100X de iniciador comportando uma extensão de 18 bases na extremidade 5' corresponden—o aos iniciadores de sequenciação fluorescentes universais utilizados com um sequenciador de DNA automático modelo 37OA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Utilizou-se taq polimerase na reacção de sequenciação de terminação da cadeia didesoxinucleotida padrão com os fragmentos do gene de Classe I de cadeia simples gerados por PCR como matrizes. As sequências derivadas para os segmentos do gene das estirpes H-4/76 (Pl.7,16), M1080 (Pl.1,7), H355 (P1.15), 6940 (P1.6) 6557 (P1.14), 870227 (P1.10) e B40 (P1.10) representam-se nas Figuras 2 e 3.

Exemplo 6: Confirmação das sequências de aminoacidos de epitopes de subtipo de OMP da Classe I

Destas sequências genéticas confirmadas por sequenciação directa dos ge_ nes de OMP de Classe I, deduziu-se que as sequências que correspondem aos amiζ

-39noácidos 24-34 e 176-187 de P1.16 sao acentuadamente variáveis nas quatro sequências de OMP da Classe I. As sequências de três aminoácidos N-terminais ou C-terminais destas posiçoes devem também considerar-se para inclusão possível nestes epítopes para permitir a apresentação de estabilidade de epítope máxima e inserções ou delecçoes inesperadas na sequência da proteína natural. Além disso, o DNA e as sequências de aminoácidos de outras OMP de Classe I devem com parar-se com a sequência de Pl.7,16 para permitir o alinhamento máximo e a previsão do epítope. 0 epítope da primeira região variável e o epítope da segunda região variável são designados por VR1 e VR2, respectivamente. Estas regiões codificam os epítopes de subtipo como se confirmou com o auxílio de síntese peptídica e a reacçao de P1.2; P1.7; P1.15 e P1.16 com anticorpos monoclonais específicos.

Preparou-se um conjunto completo de decapeptidos de sobreposição nao coincidente (staggered) em 5 aminoácidos utilizando-se a sequência da proteí na P1.16. 0 anticorpo monoclonal anti-P1.16 reagiu com decapéptido YYTKDTNNNL de P1.16, como esperado e com nenhum outro decapeptido. (Figura 4).

Decapéptidos de sobreposição providos de uma sequência de aminoácidos (1) alterada nas regiões 24-34 e 176-187 da OMP de Classe I das estirpes H44/76 (Pl.7,16) MC50 (P1.16) e MC51 (P1.15), mais do que um péptido reagiu com o sub tipo do anticorpo monoclonal específico. Na maior parte dos casos um ou mais dos grupos dos peptidos de sobreposição reagiu com o subtipo do anticorpo mo noclonal especifico mais fortemente do que com outros (Figura 5).

Estes péptidos sao designados como epítopes VR1 e VR2. Na estirpe Pl.7,16, a sequência YYTKNTNNNL está presente, a alteraçao de D para N no resí duo 180 provoca algum efeito na redução da ligação de anticorpo. A sequência HYTRQNNTDVF em P1.15, na mesma posição relativa na proteina como no epítope /

-4Ó-

de P1.16 é responsável pela ligação com o anticorpo monoclonal anti-P1.15. A sequência AQAANGGASG evidencia alguma ligação e os aminoacidos 1-3 dos pépti dos a jusante demonstram maior ligação ao anticorpo monoclonal P1.7. A sequência HFVQQTPQSQP de VR2 e responsável pela ligaçao do anticorpo monoclonal anti-P1.2. É provável que as sequências QPQVTNGVQGN e PPSKSQP nas proteínas de P1.16 e P1.15 também representam epítopes.

Exemplo 6B: Identificação de epítopes da região constante de OMP da Classe I

As ansas de superfície que formam os péptidos foram preparadas e conjugadas com toxoide tetânico. Utilizou-se um sintetizador peptídico automático Biolynx 4170 (Pharmacia/LKB) para sintese em fase solida de fluxo contínuo com a excepçâo a seguir referida. No último ciclo da síntese (0,5 mmole) de SAMA-OPfp (Drijfhout, J. W. Ri. D.Thesis, Liden, Holanda,(1989), ligou-se na pre sença de 0,5 mmole de 1-hidroxibenzotriazol durante 30 minutos, utilizando-se um protocolo habitual com omissão do tratamento com piperidina [isto é passo de desbloqueamento de Fnoc Fnoc-deblocking step] que neste caso provocaria uma S-desacetilaçao indesejável. Estes foram referidos como SAMA-péptidos.

Os péptidos e a sua localizaçao na região superficial que foram conjugados com TT são os seguintes:

-41- (

Nome

Péptido

Região

LBV

017

018

024

025a

176 185

XGGYYTKDTNNNL

33

XGGAQAANGGASG

276 291

XGGLSENGDKAKTKNSTTE

245

XGGNAFELFLIGSATSDEAKG

223

025b XANVGRNAFELPLIGSATSDEAKG

026

124 137

XGGDSNNDVASQLQIFK

027 XADLNTDAERVAVNTANAGHPV

028a

028b

329

XGGGKKEGENTSYDO

317

XGGERGKKGENTSYDO

029 XGGVKDAGTYKAQGGKSKTATQ

030

031

90

XGGWSVAEGGASQVGN

352 366

XURNTGIGNYTQINAA

34

XGGNIQAQLTEQPQVTNGVQGN

P1. 16 , ansa 4

P1.7, ansa 1

P1 . 16 , ansa 6

P1. 16 , ansa 5

P1. 16, ans a 5

P1. 16, ansa 3

Classe 2, ansa 5

Classe 1, ansa 7

Classe 1, ansa 7

Classe 2, ansa 1

P1. 16, ansa 2

P1 ,16 , ansa 8

P1 ,16 , ansa 1

032

-42A conjugação de péptidos SAMA com o toxóide tetânico realizou-se do modo descrito a seguir. Misturou-se uma solução de 4,7 mg (10 mmole) de bro moacetato de N-succinimidilo em 100jil de dimetilformarnida com uma solução de 20 mg de toxóide tetânico (TT) em tampão de fosfato de sódio O,1M, pH 7,8 (3,5 ml). Após 1 hora submeteu-se 1,8 ml da mistura reaccional a filtração por gele utilizando-se uma coluna Sephadex PD-10 (Pharmacia), equilibrada com fosfato de sódio O,1M, contendo EDTA 5 mM (tampão PE), pH 6,1. Eluiu-se o toxóide tetânico bromoacetilado com o mesmo tampão e recolheu-se em 3,5 ml. A solução detoxóide tetânico bromoacetilado, (1,2 ml) foi adicionada ao péptido SAMA (4,5 mg, 3 pmoles) e desarejado com hélio. Em seguida, adicionaram-se 150 ^il de hidroxilamina 0,2M (tampão PE, pH 6,1). Após 16 horas, bloquearam-se os restantes grupos bromoacetilo por adição de cloridrato de 2-aminoetanotiol (4 ^imoles) em tampão, pH 6,1 (150 ^il) . Após mais um período de 16 horas, o peptido conjugado com toxóide tetânico purificou-se por filtraçao por gele utilizando-se uma coluna PD-10 com um tampão PE, pH 6,1 como eluente. Reuniram-se as fracções apropriadas e armazenaram-se â temperatura de 4°C.

Para determinar a actividade imunologica (proteína total) por dose de um conjugado de péptido-toxóide tetânico injectaram-se 25 ^ig por via sub cutãnea âs semanas zero e 4 a ninhadas de murganhos NIHde 6-8 semanas de idade (Nota: as vacinas LBVO17-TT e LBVO18-TT utilizaram-se na relacção de 10 jig de proteína total/dose). Os soros foram recolhidos âs 6 semanas após a primeira dosagem e avaliados reiativamente â resposta anticorpos através de um ensaio Elisa [Beuvery, E. C. et al., Infect. and Immun. 40 (1983)

3690380]. Os antigenios seguintes foram revestidos em cavidades de placas microtituladoras: A proteína de membrana externa (OMP), a OMP da Classe I pu rificada [Poolman, J. T. et al., Infect. and Immun. 57 (1989) 1005] e os péptidos conjugados.

A actividade bactericida (BC) do soro também foi avaliada [Poolman, J.T. et al., supra (1985)]. Os resultados são apresentados no Quadro 2.

QUADRO 2

Teste

Vacina	OMC	Classe 1 OMP	Sínt.	Péptido	Bactericida
LBV 018-TT	1:900 (0.05)*	1:2700	ND		Zl:64
LBV 017-TT	1:900 (1)	1:900	ND		<1:64
LBV 024-TT	1:100	1:100	1:900	(homol.)	<1:64
LBV 025a-TT	-	1:100	1:2700	(homol.)	<1:64
LBV 025b-TT	1:2700 (4)	1:300	1:8100	(homol.)	<1:64
LBV 026-TT	-	-	-	(homol.)	<1:64
LBV 027-TT	-	1:300	1:300	(homol.)	<1:64
LBV 028a-TT	1:100	-	1:2700	(homol.)	<1:64
LBV 028b-TT	1:100	1:100	1:900	(homol.)	<1:64
LBV 029-TT	-	1:100	1:8100	(homol.)	<1:64
LBV 030-TT	-	1:100	1:2700	(homol.)	<1:64
LBV 031-TT	-	1:100	-	(homol.)	<1:64
LBV 032-TT	-	1:100	1:900	(homol.)	<1:64
* Os	numeros em ( )	indicam o valor	da D.O.	demonstrado	por este

título.

Estes dados sugerem que as ansas de superfície constantes testadas das OMPs das Classes 1 e 2 de N. meningitidis, a ansa 5 parece representar pelo menos uma região que produz anticorpos que apresentam reacção cruzada com as OMP da Classe 1 e Classe 2 de muitas estirpes de N. meningitidis.

-Μ-

Construção de flagelinas recombinantes que exprimem epítopes m£ ningócicos

Exemplo 7:

Para criar flagelos híbridos contendo epítopes provenientes de epíto pes meningocicos da Classe I, designou-se uma serie de oligonucleótidos com base nos dados da sequência da proteína principal e nos resultados de cartografia de epítope. Dois oligonucleótidos baseados em epítopes VRl ou VR2 da membrana exterior de Pl.7,16 designaram-se de modo a que pudessem ser clonados em cópias simples ou múltiplas numa região de clonagem no gene para a flagelina de S. muenchen. Incluíram-se sinais de terminação da tradu çao numa cadeia nao codificadora do oligonucleôtido para facilitar a sondagem de expressão das inserções clonãveis.

Modificou-se o vector plasmídico pPX1650 contendo a região codificado ra completa e as regiões do promotor no gene estrutural para a flagelina Hl-d de Salmonela meunchen, (depositada na ATCC com o numero de aceitaçao 67685) z

a fim de conter vários sítios de clonagem unica apropriados apara a inserção de oligonucleótidos ou de fragmentos genetícos em cada uma das tres cadeias de leitura do gene da flagelina (Figura 6). Primeiro digeriu-se o pPX1650 com EcoRV que cinde duas vezes o pPX1650, a uma distância de 48 pares de bases e religado para produzir um plasmideo , pPX1651, que tem um único sítio de clonagem EcoRV e que resulta numa delecção de 16 aminoácidos da proteína da flagelina. 0pPX165Lfoíidentifiçado por sondagem de recombinantes de E. coli em manchas Western sondadas com anticorpo policlonal dirigido contra Hl-de fia gelina. 0 pPX1651 foi identificado entre diversos candidatos apresentando fia gelinas mais pequenas do que a flagelina do tipo selvagem (de 1650) e verificado por sequenciação. Em segundo lugar, o pPX1651 foi restringido com BamHl e religado após enchimento das extremidades em enzima de Klenow para remover o

sítio da enzima de restrição BamHl único na região do poliadaptador do vector. Na fase final, o vector resultante foi digerido com EcoRV e inserido o adaptador oligonucleotídico seguinte:

í.

5' ATG ATC GAT GGA TTC 3'

3’ TAG TAG CTA CCT AAG 5'

Os candidatos foram sondados para os novos sítios BamH criados e vários candidatos comportandosí tios BamHl foram sondados para a orientação do adaptador por método de sequenciaçao de DNA de cadeia dupla. Reservou-se um candidato comportando adaptador na orientação citada como pPXl647:

5' .... GAT ATC ATC GAT GGA TTC ATC ....

EcoRV Clal BamHl plasmídeo pPX1647 (Figura 7), foi digerido com BamH e clonaram-se os oligonucleotidos VR1 ou VR2 em células de E. coli. A sondagem dos recombinantes pretendidos realizou-se por digestão de DNA minilisado plasmídico com as enzimas de restrição de diagnostico apropriadas e sondagem para a expressão de flagelos híbridos, com mobilidade diminuída em géis de SDS-PAGE com anti-soros flagelados específicos (Hl-d). Um numero de clones resultantes demonstrou mobilidade diminuída em SDS-PAGE, indicando a inserção apropriada de um ou mais dos oligonucleótidos para VR1 ou VR2. Diversos destes reservaram-se para análise por sequenciaçao de DNA. 0 clone CB1-2 resulta da inserção em série de duas cópias de oligonucleótidos VR1 e o clone CB1-4 resulta da inserção, de quatro oligonucleótidos. Identicamente CB2P continha uma inserção única do oligonucleótido VR2 e CB2 W apresentando a inserção trimérica esperada, o clone CB2P continha um único par de bases modificado, de que resultava uma alteração de Leu para Phe na proteína de fusão VR2 expressa e nao foi reservado para es-46- Ζ

Ζ ί

tudo posterior. Os clones de flagelina recombinantes em E. coli foram son dados com anticorpos monoclonais (Abdillahi e Poolman, Microbiol. Pathogenesis 4: (1988) 27-32; RIVM, Holanda ) que se sabe reagirem com os epitopes VRlouVR2. Os monoclonais Adam-1 (P1.7) e Mnl4-Cll-6 (P1.7) reagem com flage lina híbrida contendo 2 a 4 inserções em série de VR1, mas não reagem com clones que contêm VR2. A reacçao mais fraca de ambos os monoclonais com

CB1-2 do que com CB1-4 é provavelmente devida ã densidade do epítope. Do mes mo modo os monoclonais 62 (PI,16) e Mn5-cll-G (Pl,16 (reagem com o clone CB2 W, mas nao reagem com as inserções de VR1. 0 clone CB2 P não reage com anticorpos VR2 provavelmente devido ãs alterações de Leu para Phe.

Cada um destes clones transformou-se na estirpe aroA dublin (SL5927), comportando uma inserção Tn 10 nolocus Hl-d, para examinar o funcionamento dos flagelos híbridos. Cada um dos quatro clones resultou em bactérias móveis ; a mobilidade das transformantes foi inibida para o anticorpo monoclonal corres pondente, incluindo o clone CB2 Ρ, o que indica a afinidade do monoclonal VR2 para o epítope nos flagelos intactos. Este resultado indica que os epitopes estão expostos na superfície celular e sao acessíveis aos anticorpos.

A flagelina híbrida contendo epitopes VR1 e VR2 foi criada por clivagem de CB1-2, CB1-4 ou de CB2 W com BamHl e clonagem do epítope heterólogo. Os clones CB12-7 e CB12-10 resultam de uma inserção na estrutura de uma cópia sim pies do oligonucleótido VR2 depois de 2 ou 4 inserções em serie de VR1, respec tivamente; o clone CB21-F provem da inserção de uma copia do epitope VR1 depois de 3 cópias em serie de VR2. Os CB12-7 e CB12-10 sao reconhecidos somente pelo anticorpo monoclonal VR1 e o CB21-F é reconhecido apenas pelo VR2 monoclonal. Estes resultados, considerados conjuntamente com a analise de DNA, revelaram as sequências previstas e indicam que a densidade do epítope é demasiado baixa nos híbridos combinados. Para criar uma flagelina híbrida com densidade acrescida dos epítopes VR1 e VR2 digeriu-se CB12-10 com BamHl e inseriu-se VR2 que codifica oligonucleôtidos. 0 clone 12-10-6 contém ainda duas inserções em série do epítope VR2, resultando numa molécula de flagelina híbrida em que quatro cópias em série de VR1 são seguidas por três cópias de VR2. Como se mostra nas Figuras 3a e b, três das candidatas a vacina de flagelina híbrida apresentam as propriedades moleculares esperadas. A flagelina (pCBlx4) conten do quatro cópias de VR1 reage com os anticorpos monoclonais anti-Hl-d (anti-flagelina) e anti-VRl, mas não reage com os anticorpos monoclonais anti-VR2; a flagelina (pCB2-W) contendo tres cópias em série de VR2 reage com anticorpos anti-Hl-d e anti-Vr2, mas não reage com anti-VRl; o híbrido combinado contendo cópias de VR1 e três cópias de VR2 reage com ambos os anticorpos monoclonais anti-VRl e anti-VR2. 0 híbrido combinado particulariza a mobilidade quando introduzido num recipiente nao movei da estirpe dublin.

Como uma vacina subunitaria, o objectivo é a obtenção de candidatos de vacina iniciais apropriadas em .grande quantidade e com grande pureza. Um candi dato de vacina apropriada deve escolher-se entre as construções do tipo citado anteriormente baseadas na reactividade com anticorpos monoclonais e funci£ namento de flagelos em estirpes hospedeiras de Salmonela não móveis. Uma vacina de flagelina subunitaria pode nao ter a necessidade de reter todos os aspectos funcionais de uma flagelina parental, mas deve pelo menos reter a localizaçao superficial para fins de purificação. Diversas vacinas meningocócicas de flagelinas subunitárias escolheram-se entre as moléculas híbridas descritas anteriormente com base na reactividade para anticorpos monoclonais e im plicavam localização superficial com base na restauraçao da mobilidade bacte riana.

Três candidatas de vacinas de flagelina continham 4 inserções em série

-48A k

---------de VR1, 3 inserções em série de VR2 ou 4 inserções de VR1 seguidas por 3 in serções de VR2. Dado que a flagelina e uma proteína principal da Salmonela é possível purificar facilmente material suficiente para estudos de vacinação mediante técnicas estabelecidas para a purificação de flagelos (Logan et al., J. Bacteriol. 169, (1987) 5072-5077).

Exemplo 8: Purificação inicial de moléculas de flagelina recombinantes

As três candidatas de vacina de flagelina híbrida e um tipo selvagem (derivado de pPX1650) foram inoculadas em frascos de Pernbach de 4 litros , com chicanas contendo 1 litro de caldo L3. As culturas bacterianas incubaram-se ã temperatura de 37°C sob agitação (200 rpm) durante 22-24 horas. Sob estas condiçoes de cultura, a massa dos flagelos desprendeu-se da superfície da célula bacteriana e localizou-se no meio de cultura sobrenadante. Para se obter o material, apropriado isolaram-se os flagelos provenientes de 6 a 8 litros de meio de cultura. Para se obter as preparações de flagelina purificada para os estudos de vacinaçao, os filamentos flagelares foram recolhidos dos sobrenadantes da cultura bacteriana do seguinte modo. Adicionou-se sulfa to de amónio ao sobrenadante da cultura de modo a obter uma solução final com uma saturaçao de 50Z; agitou-se a solução cuidadosamente ã temperatura de 4°C durante várias horas e recolheu-se por centrifugação o material precipi. tado num rotor GSA a 5.000 rpm durante 30 minutos. 0 material recolhido precipitado pelo sulfato de amónio foi reconstituído em meio PBS e dialisado con tra PBS ã temperatura de 4°C durante 12 a 15 horas. Submeteu-se o material dialisado a uma centrifugação de alta velocidade, de 100 000 x g durante 1 ho ra, num rotor SW-27 para aglomerar filamentos flagelados. 0 material aglomera do, constituído principalmente por flagelina, foi submetido a uma subsequente purificação de acordo com o método descrito a seguir.

-49Exemplo 9: Purificação por HPLC de flagelinas recombinantes

Para preparar flagelinas altamente purificadas, as construções expressas pela Salmonelia, em particular pCBl2-10-6, desenvolveram-se como descrito anteriormente e aglomeraram-se as células a 10 000G. Em seguida, precipitou-se o sobrenadante da cultura com sulfato de amónio a 50% , centrifugou-se a 10 000 G e ressuspendeu-se em 30 ml de PBs. O material ressuspenso dialisou-se contra tampao Tris 10 mM (pH = 8,0) contendo ureia 6 M PMSF 1 mM NEM 2 mM e EDTA mM, durante uma noite ã temperatura de 4°C. Fez-se passar o material dialisado através de duas minicolunas de sefarose DEAE (3,0 ml de volume, 4,0 ml de eluente para cada). Eluiram-se as colunas(5x) com cloreto de sódio 50 mM em Tris 10 mM (pH = 8,0) contendo ureia 6 M e em seguida com cloreto de sódio 1 M em Tris 10 mM (pH = 8,0) contendo ureia 6 M. As primeiras quatro recolhas de eluição (20 ml) de NaCl 50 mM reuniram-se e dialisaram-se contra 1,0 litros de tampao de acetato 10 mM (pH = 4,0) em ureia 6 M ã temperatura ambiente. Em seguida, impregnaram-se as fracçoes dialisadas numa coluna de HPLC de permuta cationica TSK SP PW (75 mm x 300 mm). Eluíu-se a coluna com uma fase móvel constituída por acetato 10 mM (pH = 4,0) contendo ureia 6 M. Estabeleceu-se um gradiente de zero a 300 mM de NaCL em acetato 10 mM (pH = 4,0) contendo ureia

M durante o intervalo de 5 a 30 minutos. Apos 30 minutos, o gradiente passou de 300 mM para 1M de NaCl em 10 mM de acetato em ureia 6 M durante os 5 minutos seguintes. A flagelina construída recolheu-se aproximadamente aos 24 minutos, o que corresponde a cerca de 200 mM de NaCl. Dialisou-se a fracção contra PBS, e determinou-se o grau de pureza do material por manchas de Western utilizando-se anti-corpo anti-flagelina. Uma análise de HPLC representativa e de SDS-PAGE estã representada nas Figuras 8 e 9 respectivamente.

Exemplo 10: Preparação de gliconjugados meningócicos-flagelina

Os polissacáridos capsulares meningocicos do grupo C (GCM cPS : lote n9 86 NM 01) foi preparado essencialmente de acordo com o método descrito por Bundel et al., J. Biol. Chem. 249: (1974) 4797-801.

Obteve-se a estirpe de Neisseria meningitidis Cll do Walter Reed Army Institute (Washington, DC). A estirpe foi pré-cultivada duas vezes em placas de agar com sangue de carneiro e em seguida utilizada para a inoculação de um meio de cultura de sementeira líquido de Neisseria quimicamente definido como NCDM [Kenney et al., Buli. W. H. 0. 37, (1967) 469-73]. Finalmente, inocularam-se 40 litros do meio contido num fermentador (NCDM) com o líquido da pré-cultu ra. A pureza da estirpe foi verificada em cada estádio. Após centrifugação , precipitou-se o sobrenadante por adiçao de Cetavlon a uma concentração final de

0,1% e redissolveu-se o complexo insolúvel em cloreto de cálcio 1M arrefecido (CaC^) [Gotschlich et al. , J. Exp. Med. 129 (1969), 1349-65]. Adicionou-se etanol a 96% até uma concentração final de 25% (v/v). Após 1 hora, centrifugou-se a suspensão (1 h, 50 000 g), recolheu-se o sobrenadante e aumentou-se a sua concentração em etanol para 80% (v/v). Após 1 hora, a centrifugação (20 mi nutos, 5 000 g) forneceu um precipitado que se lavou sucessivamente com etanol absoluto, acetona e eter dietilico e em seguida se secou num exsicador sob vazio com pentoxido de fosforo (P₂ θ^) ate peso constante. Este CPS impuro con servou-se ã temperatura de -20°C.

Para se obter uma preparaçao mais pura, dissolveu-se em seguida o CPS em tampao de acetato de sódio (1:10 de diluição de uma solução saturada , pH 7,0) e extraíu-se quatro vezes com fenol quente [Westphal et al., Z. Naturfosch. 7b_ (1952) N8-55 ]_ Após a diãlise das fases aquosas reunidas, contra CaCl₂ 0,1 M seguida de centrifugação (3-5 h, 100 000 g), realizou-se uma precipita

ção final com etanol no sobrenadante límpido e o precipitado resultante lavou-se com dissolventes orgânicos e secou-se como descrito anteriormente. Em se guida manteve-se o CPS purificado à temperatura de -20°C.

Em cada estádio do processo de purificação, analisou-se um CPS relativamente ao teor em hidrato de carbono, ácido N-acetilneuramínico, (NANA) [ Sven nerhold, Biochem. Biophys. Acta 24 (1957) 604 ], 0-acetilo (Hestrin, J. Biol.

Chem. 180 (1949) 249 ] e proteína (detecção a 260 nm) e verificou-se o peso mo lecular por filtração por gele.

Opolissacárido capsular meningocócico do grupo C (GCM CPS) foi despolilerizado simultaneamente e activado por meio de oxidação com periodato de sódio (NalO^) em tampão aquoso (Anderson et al., J. Immuno 137 (1986): 1181-1) 86; et al., Pediat. Res. 20 (1986) 308A, Anderson et al., J. Pediatr. 111(5) (1987)644-50 Anderson, patente de invenção norte-americana n° 4 762 713, 1988 ]. A reacção controlou-se por cromatografia de impregnação em gele de alta resolução (HPGPC) com eluente aquoso, utilizando para detecção ultravioleta (UV) e índice de refracçao (RI). Interrompeu-se a reacção dessalinizaram-se os oligossacãridos activados (GCM OS) por impregnação em gele de baixa pressão (GPC) em ãgua e em seguida liofilizaram-se . Preparou-se uma solução em agua e congelou-se em seguida armazenando-se temporariamente. Misturaram-se GCMOS e flagelina pCB12-10-6 em tampao neutro aquoso e iniciou-se a conjugação por adiçao de cianoboro-hidreto de sódio (NaBH^CN) (Anderson, patente de invenção norte-americana n° 4 762 713, 1988; patente de invenção norte-americana n9 4 673 574, 1987; patente de invenção norte-americana ηθ 4 761 283, 1988). A reacção realizou-se durante 5 dias, sendo entretanto controlada por HPGPC. Finalmente, interrompeu-se a reacção por diálise e concentração em microconcentradores de centrífuga.

A preparação final foi conservada sob arrefecimento na presença de timerosal para impedir o desenvolvimento bacteriano. 0 glicoconjugado resultante não só propor-52-

ciona o mecanismo para apresentar os epítopes meningocõcicos de VR1 e VR2 expressos ao sistema imunitário mas também serve como uma molécula veículo para a apresentação de um oligossacãrido meningocócico.

Na preparaçao do conjugado, utilizaram-se as condiçoes seguintes. Dis solveu-se flagelina purificada pCB12-10-6 em sacarose a 15% (3,5 mg/ml) e em seguida conservou-se ã temperatura de -20°C ; GCM CPS (9,7 mg, numa concentra ção final de 5 mg/ml) oxidada por 100 mM de NalO^ em tampão de fosfato de sódio a 0,05 M (pH 6,2-6,5) ã temperatura ambiente, na ausência de luz, sob agi. taçao. Retiraram-se alíquotas de 100 jil com intervalos regulares, e interrom peu-se a reacçao por adição de 10 jil de etileno-glicol, realizanso-se a análi TM se por HPGPC num Waters (Milford, MA) Ultrahidrogel 250+120 ( 2 colunas li gadas, 2 x 300 mm x 7,8 mm), em tampão de cloreto de sódio e fosfato 0,2 M (PBS, fosfato de sodio 0,2 M, NaCl a 0,9%, pH 7,8) com um caudal de 0,8 ml/mi nuto, utilizando-se para detecçao UV a 206 nm e IR. Após 2 h e 30 min interrompeu-se a reacção por adiçao de etilenoglicol (1/10 de volume reaccional)

R e dessalinizaram-se os GCM OS por GPC num Bio-Rad (Richmond, CA), Bio-gel P-2 malhas 200-400, 30 cm x 1,5 cm) em água, a cerca de 18 ml/hora. Recolheram-se as fracções de 1,2 ml e analisaram-se relativamente ã presença de NANA, o hidrato de carbono ácido N-acetilneuramínico (NANA) [ Barry et al., J. Gen. Microbiol.

(1962):335-52 ] e aldeídos [ Porro et al., Anal. Biochem. 118 (1981) 301-306]. Jn iram-se as fracções positivas e liofilizaram-se. Dessalinizou-se os GCM OS (4,7 mg) e em seguida dissolveu-se em água (10 mg/ml) e conservou-se a -20°C.

As soluçoes de GCM e pCB12-10-6 analisaram-se por HPGPC (UV a 206 e 280 nm, respectivamente), antes de se liofilizarem e antes da conjugação.

Nao se observou a ocorrência de degradaçao durante a armazenagem como se determinou por observação dos perfis de eluição com similaridade exacta.

X

Os GCM OS (2 mg, concentração final de 2,6 mg/ml) e a flagelina PCB12-10-6 (2,3 mg, concentração final de 3 mg/ml) misturaram-se num tubo de polipropileno com tampao de fosfato de sódio 0,4M (pH 7,0) e adicionaram-se 12 ^violes de NaBH^CN para iniciar a conjugação (Anderson, patente de invenção norte-americana ηθ 4 762 713, 1988; patente de invenção norte-americana ηθ 4 673 574; patente de invenção norte-americana ηθ 4 761 283). Mantem-se a mis tura reaccional um dia ã temperatura ambiente, e depois durante 4 dias ã tem peratura de 35°C, sem agitaçao. Controlou-se a reacção por HPGPC (UV a 280 nm), nos diferentes estádios e finalmente interrompeu-se por diálise e concentração em microconcentrador. A preparação final foi analisada relativamente a NANA [Barry et al., J, Gen. Microbiol. 29 (1962) 335-353], (0,09 mg a 0,12 mg/ml) e relativamente ãs proteínas [Lowry et al., J. Biol. Chem., 193 (1951) 265-275], (1,12 mg, 1,45 mg/ml). Em seguida, conservou-se ã temperatura de 4°C na presença de timerosal (0,01%, P/V) para impedir o desenvolvimento bacteriano.

A preparação de conjugado também foi verificada por SDS-PAGE (coloração com nitrato de prata) e por análise de mancha de Western. Apareceram diver sas bandas de peso molecular elevado no gele acima da banda de pCB12-10-6 puro e próximo da cavidade limite, a evidência da existência de ligação cruzada ocorrida durante a conjugação. As análises de manchas de Western demonstraram que cada uma das bandas era reactiva para os anti-soros utilizados (GCM, anti-VR1 e anti-VR2), proporcionando a covalência das ligações conjugadas.

Exemplo 11 : Conjugação de péptidos meningocócicos com CRM e albumina de soro bovino

Os péptidos designados como M20 e M21 produziram-se num sintetizador de péptidos modelo ABI por síntese da fase sólida utilizando-se tBoc ligado a CRM₁₉₇ (preparado como descrito por Anderson, patente de invenção norte-americana ηθ 4 762 713), utilizando-se um agente reticulante bifuncional (4-iodoacetil)-amino-benzoato de sulfo-succinimidilo (sulfo SIAB, fornecido por Pierce) de acordo com a modificação de um processo publicado[Weltman, J. K. et al.,

Bio. Techniques 1 (1983) 148-152]. Resumidamente, activou-se CRM,_n-, por sulfoi y /

-SIAB resultando a formação de uma ligaçao amida entre SIAB e os grupos amino de CRM^^. Após a remoção do agente reticulante que não reagiu do CRM^? medi, ante filtração por gele, o peptido (M20 ou M21) contendo o espaçador de ligação (representado por letras sublinhadas) com resto de cisteína carboloxi ter minai misturou-se com o CRM activado e incubou-se durante 2 a 4 horas ã temperatura ambiente. A seguir ã reacção o material conjugado dializou-se extensivamente contra PBS ã temperatura de 4°C. A sequência do peptido M20 (epítope VR2) é a seguinte:

H-Tyr-Tyr-Thr-Lys-Asp-Thr-Asn-Asn-Asn-Leu-T.hr-Leu-Val-Pro-Ala-Gly-Ala-Cys-OH

A sequência do peptido M21 (epítope VR1), é a seguinte: H-Ala-Gln-Ala-Ala-Asn-Gly-Gl·y-Ala-Ser-Gly-Gln-Val·-L,ys-Ala-Gly-Al·a-Cys-OH

Os materiais conjugados submeteram-se a SDS-PAGE, transferiram-se para membranas PVDF (Immobilon, Millipore) e fizeram-se reagir com anti-corpos mono clonais específicos que reconhecem os epítopes VR1 e VR2. As Figuras 10a e 10b mostram a analise por mancha de Western de M20 e M21 conjugados com CRM^?, con tra uma mistura de anticorpos monoclonais específicos de VR1 e VR2 [Adam I,

G2-D12-8 (P1.7), MN5-C11-G (P1.16) e MN14-C11-6 (P1.7)].

Para se analisar deu-se a um imunoensaio mediante a aplicação de tato de N-succinimidilo a resposta do anticorpo aos peptidos M20 e M21 prodede ligaçao com o enzima, prepararam-se conjugados BSA um agente reticulante bifuncional diferente, bromoace como descrito por Bernatowicz e Matsueda, Anal. Biochem.

155 (1986) 95-102.

i

A ligaçao covalente do péptido com a proteína confirmou-se por mancha de Western das amostras submetidas a electroforese como descrito para os conjugados de CRM^?.

Exemplo 12 : Retengao da actividade de células T por conjugados M20 e M21-CRM^g-,

Para se verificar se os conjugados dos epítopes VR1 eVR2 com CRM^? afectaram nocivamente o reconhecimento de células T da proteína CRM^? realizou-se um ensaio proliferativo de células T como descrito anteriormente por Bixler e Atassi Immuno1. Commun, 12 (1983) 593. Resumidamente, murganhos SJL/j imunizaram-se com 50 yug de CRM^? natural emulsionado em CFA. Decorridos sete dias, retiraram-se os nódulos linfáticos, cultivaram-se em RPMI e provoca ram-se com concentrações diversas de proteínas e péptidos (0,05-10,0 yjg/ml).

_ 3

Apos tres dias de incubaçao, marcaram-se as culturas com [ H]-timidina durante 16 horas e em seguida recolheram-se para contagem.

Quadro 3

Quadro 3. Respostas das células T aos conjugados de péptido meningocócico-CRM^-,

Desafio in vitro	Incorporação	maxima	observada	de [3H]
jug/ml	ACPM		SI
Toxóide diftérico	5	27	510	57
CRM197	50	108	631	221
CRM197 - conjugado de imitação	100	1 16	326 '	236
VR1-CRM197	100	182	499	370
VR2-CRM197	10	89	972	183
CON A	1	34	316	70
LPS	50	61	579	126
Toxóide titânico	'10		515	2
Fugido (cpm)	-		494	1

Como se mostra no Quadro 3, a comparaçao de CR^? com o conjugado de imitação CRM^g^ demonstra que o procedimento de conjugação não altera o reconhecimento de células T da proteína. As respostas das células T induzidas pe los conjugados M20 e M21-CRM^^ foram essencialmente equivalentes ou superiores ãs respostas provocadas pelo próprio CRM , o que indica que o reconhecimento do epítopes de células T no CRM^^ nao é prejudicado pela conjugação peptídica. As respostas aos materiais de controlo Con A, LPS e toxóide tetãni co foram as esperadas.

Exemplo 13: Imunogecinicidade de vacinas de conjugado e de meningococcus recombinantes

A flagelina recombinante que exprime os epítopes VR1 e/ou VR2 meningocó cicos prepararam-se e purificaram-se de acordo com o método descrito no Exemplo 10. Além disso, sintetizaram-se os péptidos sintéticos que representam os epítopes VR1 e VR2 meningocócicos, ligaram-se por covalência à molécula veículo CRM e purificaram-se de acordo com o métocb descrito no Exemplo 12. Formularam-se as vacinas com cada um deses materiais com uma concentração de proteínas compreendida entre 10 e 100 ^ig/ml de cada componente. As composiçoes da vacina também incluíam fosfato de aluminio a 1 mg/ml com excepçao dos casos em que eram compostas com adjuvante completo de Freund ou eram isentas de material suplementar.

Para avaliar a imunogenicidade, imunizaram-se murganhos Swiss Webster por via intramuscular nas semanas zero e dois com 1 ou 10 ^g de proteína por dose. Recolheram-se os soros com intervalos de duas semanas, misturaram-se para ensaio, sondaram-se para a actividade de anticorpos por ELISA, para o complexo da membrana exterior (OMC), para OMP purificada (P1.16), para o péptido VR1 ligado ã albumina de soro bovino (B21-BSA), para o péptido VR2 ligado a BSA (M20-57r

Ç.¾

-BSA) , para flagelina de tipo selvagem e para CRM^?. Os resultados de ELISA realizados com os soros obtidos ãs 6 semanas apresentam-se no Quadro 4.

Alternativamente, avaliaram-se as diversas vacinas relativamente ã imu nogenicidade com murganhos NIH de 6 a 8 semanas de idade. Os murganhos imunizaram-se com 10 ^ig (proteína total) por dose, por via subcutânea nas semanas a

zero e quatro com a vacina e recolheram-se os soros na 6 semana. Avaliaram-se os soros por ensaio ELISA e utilizaram-se antigénios de acordo com o método descri to no Exemplo 6. Determinou-se a actividade bactericida como descrito no Exemplo 6. Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro 5.

Quadro 5

Vacina_OMC_Classe IOMP_Ensaio bactericida

CRM 197 — —

M20-CRM197 1:100 1:8100 Zl:64 <1:64

M21-CRM197

1:300

1:8100

-58Quadro 4

Imunogenicidade de vacinas CRM

197 recombinante ou conjugado contendo epítopes VR1 e VR2 de Pl.16 meningocócico.

Dose	, . 0 Títulos de ELISA 4 semanas apos o 2	desafio
OMC	P1.16	M21-BSA	M20-BSA	FLAGELINA	CRM
pPX1650 (Flagelina de	tipo selvagem de controlo)
1	<150	<100	171	100	427,781	ND
10	<150	100	154	<100	468,385	ND
pCBl-4
1	532	4,376	4,525	ND	787,120	ND
10	2,034	12,387	17,565	ND	887,861	ND
pCB2-W
1	150	308	ND	501	263,143	ND
10	1,350	12,190	ND	5,476	1,493,216	ND
pCB12-10-6	isento de fosfato de alumínio
1	615	3,374	4,651	824	299,889	ND
10	1,423	3,666	3,882	2,253	497,622	ND
pCB12-10-6
1	409	739	505	597	139,147	ND
10	450	1,533	817	1,611	358,033	ND
M20-CRM197
1	< 150	4 100	217	< 100	ND	42,27
10	50	<100	150	<100	ND	95,31
M21-CRM197
1	68	249	10,494	100	ND	17,41
10	110	311	26,807	191	ND	20,92
Mistura de	conjugados 1	M20 e M21
1	50	100	40,000	187	ND	37,32
10	50	227	15,539	132	ND	184,27
OMP P1.16
1	12,630	17,714	100	764	ND	ND
10	23,178	67,565	162	3,276	ND	ND

pCBl-4 em CFA

10	1,665	10,606	19,945 ND	1,841,852	ND
pCB2-W em CFA
10	1,157	6,869	ND 17,749	1,217,063	ND
1. Todos os	valores de	pré-sangria	no Limite superior ou	inferior do	ensaio de

diluição a 1/100.

2. Todas as vacinas foram formuladas com fosfato de alumínio a 1 mg/ml excepto nos casos assinalados.

As flagelinas recombinantes contendo VRL ou VR2 ou uma cassete de ambos, foram eficazes para provocar uma resposta de anticorpos que apresentavam reacção cruzada com P1.16 purificada e, em menor extensão com OMC. Os soros dos animais imunizados com 10 ^ig de pCBl-4 ou de pCB2-W induziram anticorpos que se ligaram aos conjugados respectivos péptidos-BSA, e reagiram ainda de forma cruzada com a P1.16 e OMC. Obtiveram-se resultados semelhantes com pCB12-10-6 construída que continha ambos os epítopes meningõcicos. Além disso, cada construção também induzia títulos anti-flagelina significativos. Em con traste, a flagelina de tipo selvagem que constituía o controlo apenas induziu uma resposta de anticorpos- para a própria flagelina. Os soros recolhidos antes da imunização nao evidenciaram a pré-existência de resposta aos materiais em avaliação.

Os dados também demonstram o benefício da formulação das flagelinas recombinantes com alúmen ou com outros adjuvantes como CFA. A construção de pCB12-10-6 foi formulada com ou sem a adiçao de fosfato de alumínio. Como se mostra no Quadro 2, pCB12-10-6 isoladamente foi capaz de induzir uma resposta de anticorpos que reage com os conjugados peptídicos, assim como com P1.16 pu rifiçada e ainda com OMC. Em comparaçao, a mesma construção quando formulada com alumínio é capaz de provocar uma maior resposta de anticorpos para uma do se equivalente. Identicamente, as flagelinas recombinantes de pCBl-4 e pCB2-W foram formuladas com CFA. Mais uma vez, observaram-se títulos de anticorpos equivalentes ou superiores na presença de CFA.

Os resultados de estudos de imunogenicidade com os conjugados meningo cicos VR1 e VR2 também estão representados no Quadro 2. Ambos os conjugados M20 e M21-CRM^g^, assim como uma sua mistura contendo iguais quantidades de ambos os conjugados, foram capazes de induzir uma resposta anti-CRM^g^ assim como uma resposta anti-OMP da Classe I.

Estes resultados preliminares indicam que os epítopes de região variá vel de OMP da Classe I, quer conjugados quimicamente com um veículo quer fun didos geneticamente com um veículo, provocam uma resposta imunitária. Os no vos conjugados epítope-veículo podem ser preparados por meio de técnicas con vencionais de forma a reforçar a resposta imunitária ã vacina, por exemplo utilizando 1) epítopes maiores, 2) peptidos com múltiplas réplicas de epítopes e/ou 3) diferentes veículos.

Exemplo 14: Preparaçao de glicoconjugados demeningococcus-albumina de soro humano

Os GCM CPS foram despolimerizados mediante hidrólise ácida e os GCM OS obtidos foram subsequentemente activados por oxidação com NalO^ em tampão aquo so. A reacçao controlou-se por HPGPC em eluente aquoso, utilizando-se para detecçao UV e IR. As reacções foram seguidas cada uma delas por dessalinizaçao de GPC em água. OGCM OS e albumina humana (HA) foram misturados e conju gados essencialmente de acordo com o método descrito no Exemplo 10 para o gli coconjugado meningococcus-flagelina. A preparaçao final foi conservada sob arrefecimento na presença de timerosal para impedir o desenvolvimento bactéria no.

Na preparaçao dos conjugados, as condiçoes experimentais utilizadas foram as descritas a seguir. Dissolveu-se a albumina humana (Ha, Sigma ,

St Louis, Mo ) em ( 10 mg/ml ) de sacarose a 15% e em seguida conservada ã temperatura de -20°C. Hidrolisou-se GCM CPS (lote n° 86NM 0,1, 106 mg , concentração final, 10 mg/ml ) em ácido clorídrico 0,1 N ã temperatura de 50°C , sob agitaçao. Retiraram-se alíquotas de ( 25 ^il ) ^com intervalos regulares e interrompeu-se a reacçao por adição de hidróxido de sódio (NaOH)

e reealizou-se a análise por HPGPC como descrito anteriormente. Após 3 h e 40 min, interrompeu-se a reacção por adição de NaOH e dessalinezaram-se o GCM OS por GPC. Recolheram-se fracções de 1,2 ml e analisaram-se como descrito anteriormente. Reuniram-se as fracções positivas e liofilizara-se Os GCM OS dessalinizados (89 mg) foram depois conservados ã temperatura de -20°C. Prepararam-se OS activados por oxidação de GCM OS (11,8 mg, com uma concentração final de 5 mg/ml) com NalO^ 2 mM em tampão de fosfato de sódio 0,05 M (pH 6,2-6,5) ã temperatura ambiente, na ausência de luz, sob agitação. Interrompeu-se a reacçao apos 30 minutos por adição de etilenoglicol. As anã lises por HPGPC demonstraram a ausência de degradaçao do peso molecular do OS durante a activação. Realizaram-se em seguida análises de dessalinização e colorimétricas como descrito anteriormente. Os GCM OS activados resultantes (8,8 mg) dissolveram-se em água (10 mg/ml) e congelaram-se ã temperatura de -20°C.

Ambas as soluçoes de GCM OS e de HA analisaram-se por HPGPC, (UV a 206 e 280 nm, respectivamente) antes de se congelarem e antes da conjugação. Não houve degradaçao durante a armazenagem, como determinado de acordo com os per fis de eluição identicamente exactos.

Misturou-se GCM OS (6 mg, com concentração final de 2,5 mg/ml) e HA (12 mg, com concentração final de 5 mg/ml) num tubo de polipropileno com tampão de fosfato de sódio' 0,4 M (pH7,0) e adicionou-se NaBH^CN (60 yimoles ) para iniciar a conjugação (Anderson, patentes de invenção norte-americanas n°s

762 713, 1988; n° 4 673 574, 1987 e n° 4 761 283, 1988). Manteve-se a mistura reaccional durante um dia ã temperatura ambiente e, em seguida, durante quatro dias entre 15°C e 35°C, sem agitação. Controlou-se a reacção por HPGPC, (ultravioleta a 280 nm) em estádios diferentes e, finalmente , interrompeu-se por diálise/concentração em microconcentradores. Analisou-se a preparação fi

nal para determinar os teores de NANA [Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29 (1962) 335-51] , (2,07 mg a 0,86 mg/ml) e de proteína [Lowry et al., J.

Biol. Chem. 193, (1951) 265-75 ] , (9,51 mg a 3,96 mg/ml). Em seguida, conservou-se ã temperatura de 4°C na presença de trimerosal (0,01%, p/v) para impedir o desenvolvimento bacteriano.

A preparação do conjugado foi também verificada por SDS-PAGE (coloração com nitrato de prata) e análise por mancha de Western. A banda difusa apresentou-se no gel cobrindo um intervalo de pesos moleculares significativamente mais largo do que a proteína humana pura. As análises de mancha de Western mostraram que esta banda reagia com o anti-soro utilizado (anti-GCM), proporcionando ligações por covalência dò conjugado.

Exemplo 15: Imunogenicidade de vacinas oligossacarido meningocõcico-flagelina recombinante

Preparou-se uma vacina oligossacarido meningocócico-flagelina recombinante como descrito anteriormente e formulou-se 100 jig de proteína/ml. Prepararam-se também composiçoes de vacina contendo fosfato de alumínio (mg/ml, ou adjuvante completo de Freund em adiçao ao glico-conjugado.

Para avaliar a imunogenicidade, imunizaram-se murganhos Siwss Webster de especies diferentes (outbred) por via intramuscular com 10 ^ig de proteína nas semanas zero e dois. Recolheram-se os soros nas semanas zero e dois e em seguida com intervalos de uma semana ate à semana seis. Após reco lha, reuniram-se as amostras de soros e analisaram-se para pesquisa de acti vidade de anticorpo por ELISA para conjugado oligossacárido meningocócico C para albumina humana, OMC, P1.16, conjugados M20 e M21-BSA e flagelina.

-63Exemplo 16: Epitopes de células T de OMP d_e Classe I e sua identificação

Uma vacina eficaz deve conter um ou mais epitopes de células T. Po de prever-se epitopes de células T numa proteína como descrito por Margalit et al. , J. Immunol. 138 (1987) 2213, ou Rothbard e Taylor, Embo J. 1_ (1988) 93. Estes métodos de previsão aplicaram-se ã sequência de aminoácidos de OMP de Classe I das estirpes de N. meningitidis Pl.7,16, P1.16 e P1.15. Os segmentos da sequencia contendo epitopes de células T potenciais identifica ram-se por estes métodos como se representa nos Quadros 6 e 7. Os péptidos previstos sintetizaram-se por procedimentos FMOC convencionais, purificaramse por métodos habituais e identificaram-se como se demonstra no Quadro 8.

Para determinar quais os péptidos previstos que continham realmente epitopes de células T, testou-se a sua capacidade para estimular linfócitos de sangue periférico humano(PBL) de acordo com o ensaio proliferativo de linfocitos. Resumidamente, recolheu-se sangue periférico de voluntários normais HLA ou de voluntários previamente imunizados com MPC-2 [Poolman, J.

T. et al., Antonie van Leeuwenhoek, 53 (1987) 413-419] que continha P1.16,

150MP da Classe 4 e polissacárideo do grupo C. Isolaram-se os linfocitos do sangue periférico por meio de Ficoll-Hypague (Pharmacia Fine Chemicals AB ,

Uppsala, Suécia) e cultivaram-se a 1 x 10^ células por cavidade em RPMI

1640 (Gibco Laboratories, Paisly, Escócia) suplementado, contendo soro-AB humano inactivado pelo calor a 102!. As culturas foram provocadas com concen trações diversas dos epitopes de células T previstas (0,05 - 10 jig/ml).

Após o desafio in vitro, incubaram-se as culturas durante 6 dias e em se3 guida pulsaram-se durante (18 horas) com 0,5 ^íCi [ H]-timidina. Em seguida, colheram-se as culturas e contaram-se por meio de cintilação líquida.

Os dados exprimiram-se sob a forma de índices de estimulação que se calcula ram de acordo com a relação entre o CPM obtidona presença de antigénio e o

CPM obtido na ausência de antigégio.

Como se mostra no Quadro 9, 10 dos 16peptidos previstos demonstraram alguma capacidade para estimular as células T. Estes incluem os peptidos identificados como 16-34, 47-59, 78-90, 103-121, 124-137, 151-158, 176-185,

223-245, 276-291 e 304-322. Em alguns casos, os peptidos estimularam uma res posta tanto nos indivíduos imunizados como nos indivíduos não imunizados. A resposta nos indivíduos nao imunizados pode ser atribuída a uma infecção as sintomática anterior.

No caso do epítope de células T identificado como a região 176-185, observou-se um reforço da resposta de células T após a adição do anticorpo monoclonal MN5C11G (P1.16). Resumidamente, estimularam-se PBL in vitro com um peptido sintético que continha a região 175-185 ou com este péptido mistu rado com diversas diluições de MN5C11G. Como se mostra no Quadro 10, a resposta de células T reforçada observou-se após a adiçao de MN5C11G, o que indica que o anticorpo monoclonal reconheceu um epitope de células B na região 176-185 e facilitou a apresentaçao do peptido ao sistema imunitário. Portanto, estabeleceu-se que os epítopes de células T e B ou coincidem ou encontram-se em sequências contíguas na OMP de Classe I.

Em diversos casos, as linhas de células T e os clones estabeleceram-se a partir de indivíduos que respondiam aos vários péptidos. Resumidamen te, as linhas de células T obtiveram-se por cultra de linfócitos isolados em placas de 24 cavidades na concentração de 1 x 10^ de células/ml. 0 meio de cultura, RPMI-1640 suplementado com soro humano a 10%, também continha 12 unidades/ml de IL-2 recombinante (Boehringer). Além disso, também se adicio4 naram a cada cavidade 5 x 10 células (APC) apresentando antigenio irradiado (3 000R) homólogo. Obtiveram-se APC de dadores HLA compatíveis. Isolaram-se

-65clones de células T das linhas por diluição limitante com uma frequência de 0,5 células por cavidade. Mantiveram-se os clones por estimulação bissemanal com antigenio na presença de APC irradiado e IL-2 (2 U/ml). Ensaiaram-se os clones pelo ensaio de proliferação dos linfócitos essencialmente como descrito anteriormente, com a excepçâo de terem cultivado os clones a 1x10 células por cavidade na presença de APC irradiado.

Os clones obtidos como descrito, foram desafiados in vitro com OMP proveniente de sete estirpes diferentes de meningococcus. Como se mostra no Quadro 11, os clones reconheceram epítopes de célula T ou epítopes comuns às sete OMPs examinadas. Embora a reactividade destes clones com os vários péptidos permaneça por determinar, os resultados, no entanto, indicam epítopes de células T comuns ãs diversas estirpes. Agora, confirmados e identificados estes clones, a sua reactividade peptídica, indicará os epíto pes de células T a utilizar para vacinas.

Análise da sequência de OMP P1.16 de N. meningitidis relativamente à presença de hélices anfipáticas de acordo com o méto

Quadro 6

	dc	ι de Margalit et al.,	J. Immunol.	138 (1987) 2213
			Pontos médios
			dos blocos	Ângulos	AS
		P	47-50	85-105	9,4
			69-74	105-135	16,0
	K		79-88	90-120	23,0
			127-135	100-120	22,4
Λ			199-202	90-120	8.4
		P	208-211	85-95	8,7
			260-263	90-125	8,8
		P	265-269	90-120	11,3
			274-277	105-120	9,8
			297-300	100-135	9,1
		P	320-324	80-100	10,9
*			338-342	105-135	12,3
*			346-351	80-115	H,9
*			376-379	85-120	9,5

-67Λ>

Quadro 7 : Presença de motivos (regiões sublinhadas) que representam epítopes de células T potenciais nas sequências de OMP P1.16

N. meningitidis detectados de acordo com o método de Roth bard e Taylor, Embo J. 7

MRKKLTALVLSALPLAAV

QAQLTEQPQVTNGVQGNQ

SFIGFKGSEDLGEGL K A V

N R E S F I G L A G E F G T L R A G

N N D V A S Q L G I F K R H D D Μ P

FVPAQNSKSAYKPAYYTK

DVYYAGLNYKNG G F A G N Y

LIGSATSDEAKGTDPLKN

LAAQLDLSENGDKAKTKN

RISYAHGF D L I E R G Κ K G E

TSAIVSGAWLKRNTGIGN (1988) 93.

ADVSLYGEIKAGVEGRNI

V Κ V T K A KSRIRTKISDFG

W Q LEQDVSVAGGGASQWG R V A N QFDDASQAINPWDS

VSVRYDSPEFSGFSGSVQ

DTNNNLTLVPAVVGKPGS

A F Κ Y A R HANVGRNAFELF

HQVHRLTGGYEEGGLNLA

S T T Ε I A A T ASYRFGNAVP

NTSYDQIIAGVDYDFSKR

YTQINAASVGLRHKF

Quadro 8 : Resumo dos epítopes de células T previstos sintetizados

Número do
	resíduo	Sequência
1.	16-34	NIQAQLTEQPQVTNGVQGN
2.	47-59	TKISDFGSFIGFK
3.	57-71	GFKGSEDLGEGLKAV
4.	78-90	VSVAGGGASQWGN
5.	103-121	TLRAGRVANQFDDASQAIN
6.	124-137	DSNNDVASQLGIFK
7.	151-158	GGFSGFSG
8.	176-185	YYTKDTNNNL
9.	190-202	AVVGKPGSDVYYA
10.	215-228	YAFKYARNAHVGRN
11.	223-245	ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG
12.	241-261	DEAKGTDPLKNHQVHRLTGGY
13.	276-291	LSENGDKAKTKNSTTE
14.	304-322	VPRISYAHGFDLIERGKKG
15.	317-329	ERGKKGENTSYDQ
16.	352-366	KNRTGIGNYTQINAA

ϊ

Quadro 9 : Resumo de respostas de linfócitos a péptidos meningicócicos sin téticos em voluntários tipificados HLA

RESPOSTA AO PÉPTIDO SINTÉTICO

VOLUNTÁRIO/TIPO HLA 1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Voluntários imunizados

1.	DR4.W10.W53	-			+ -	-				-	-
2.	DR3, W52		-	+	+		+
3.	DR3, 7, W52, W53	- -	-		- + -	-	-	-	-	+	-
4.	DR2, W6, W13.W15.W52	+	-		+	-					-
5.	DR5.W11.7.W52.W53 +	-			- + -	-	+	-		+	+

6. DR5.W11.W10.W52

VOLUNTÁRIOS NÃO IMUNIZADOS-CONTROLO

7.	Não tipificados	- -	+ - +	“ + -	- + -	+ - -	-
8.	DRW13.W6.W52
9.	DR2,W15,4,W53	-	-	_ _ _	— + —	-	-
10.	Não tipificados
11.	Não tipificados	-	-	- + -	-	-	-
12.	DR2,W15,3,W52	+	-	_ _ _	- + -	_ _ _	-
13.	DR5.W11.W52	- -	-	+ -	_ _ _	_ _ _	-
14.	DR3.7.W52.W53	- -	-	+ -	_ _ _	- + -	-
15.	DR3.4.W52.W53	- -	- +	_ _ _	_ _ _	_ _ _	-
6.	DR3.W12.5.W52
17.	DR2.W15,7,W53					+
18.	DR1,3,W52
19.	DR3.4.W52.W53			+
20.	DR1.7.W53				+
21.	DR4.W8.W52.W53
22.	DR1,W13,W6,W52
23.	DR2.W16.5.W11,W52 +
24.	DR5.W11.W6.W13.W52
25.	DR1.3 W52			+
26.	DR1.W6.W13.W52	+	+
27.	DRW6.W13.W52
28.	DRW6.W13.W52			+

As respostas foram classificadas do seguinte modo:

SI<2; É 2 <SI(3 e +, SI >3.

-70*

Quadro 10 : Apresentação de um peptido sintético a linfócitos de sangue periférico reforçado por um anticorpo monoclonal reconhecedor da região 179-184 de OMP de Classe I meningocócica

Desafio In Vitro		CPM
GGYYTKDTNNNL		3,017
GGYYTKDTNNNL* + MN5C11G	(1:200)	22,836
GGYYTKDTNNNL + MN5C11G	(1:1000)	12,608
MÉDIOS		330

* A região sublinhada índica a sequencía reconhecida pelo anticorpo mono clonal MN5C11G.

QUADRO 11 : Reconhecimento de OMP de diferentes estirpes meningococicas por clones de células T humanas

Respostas de clones de células T humanos (CPMX 10 ¹)

Estirpe	Subtipo	5-5	5-7	5-9	5-12	5-13	5-14	5-15
H44-76	Pl, 16	6,0	1,2	6,8	2,6 .	2,3	9,5	1,5
Suíça 4	Pl, 15	4,9	1,0	10,1	6,9	3,6	10,5	1,4
395	Pl,9	5,2	1,5	4,8	1,5	6,1	13,1	1,4
2996	Pl,2	5,4	1,0	3,7	2,3	3,4	11,8	1,0
M990	Pl,6	3,6	0,4	3,5	2,5	0,9	4,7	0,6
187	Pl,l	4,4	0,7	4,5	3,1	1,6	6,2	1,4
6557	Pl,17	3,7	2,0	8,2	4,2	1,7	6,2	0,8
MÉDIA	—	<0,1	Z0, 1	/0,1	/0,1	/0,1	/0,1	/0,1

-71Exemplo 17 : Construção de um modelo de proteína para topologia de membrana de OMP da Classe I e comparaçao com outras proteínas de porina de outros agentes patogenicos gram-negativos para desenvolvimento de vacinas modelo construiu-se utilizando-se os princípios reconhecidos para a estrutura de diversas proteínas da membrana externa de Escherichis coli [Vogel, E. et al., (1986). Supra Ferenci, T. et al. , supra (1988) e Tommassen, J. supra (1988)]. 0 pressuposto central era que os segmentos da proteína que abarcam a membrana externa formam as camadas beta. Expecificamente, no caso da proteína da Classe 1, a divisão nos segmentos expostos e da transmembrana, conseguiu-se do seguinte modo:

1. Uma comparaçao da sequência de aminoacidos da proteína de Classe I (subtipo P1.16) com as proteínas gonocócicas PIA e PIB (Carbonetti, N. H. et al) PNAS 84 (1987) 9084; Carbonetti N. H. et al. PNAS 85 (1988) 6841 e Gotschlich,

E. C. et al. PNAS 84 (1987) 8135) revelou 34% de identidade. No modelo, as se quências variáveis formam as partes superficiais expostas embora as regiões conservadas estejam colocadas principalmente na membrana externa e no periplas ma. Portanto, as duas ultimas áreas consistem em 58% dos resíduos que estão conservados em todas as proteínas, embora esta percentagem seja somente 12% na parte exposta.

2. 0 máximo da hidrofilia observou-se num perfil de hidropatia (Kyte, J. et al., J. Mol. Biol. 157 (1982) 105), para corresponder ãs regiões expostas.

3. Os segmentos de transmembrana devem ser, de preferência, capazes de formar cadeias beta-anfipáticas de 9 a 12 resíduos com, pelo menos, um lado cons tituído inteiramente por resíduos hidrofobos. Estas condições são cumpridas

-li/ (

em 12 dos 16 segmentos que abrangem a membrana.

4. 0 número de resíduos no lado periplásmico está minimizado.

A Figura 11 mostra o modelo para a dobragem da proteina de Classe I da membrana externa. A sequencia apresentada é para o subtipo P1.16. A parte supe rior da figura mostra as regiões superficiais expostas embora a parte central indique segmentos que se presume serem de transmembrana cujo cumprimento se fixou em dez. Os aminoácidos demonstraram alternância onde podem formar uma cadeia-beta anfipática. Este modelo contém oito ansas superficiais, embora a primeira e quarta contenham epítopes de região variável de tipo específico e protectores. Estes epítopes, como ficou demonstrado quando introduzidos numa vacina, podem provocar uma resposta imunitária protectora. A ansa 5 é constan te e demonstrou provocar anticorpos com reacçao cruzada com outras OMPs e é utilizável para composiçoes de vacinas.

Uma das duas regiões de epítopes variáveis das proteínas individuais estão localizadas nas chamadas ansas superficiais destas proteínas de membrana. Estas proteínas da membrana externa porina contém mais do que duas ansas superficiais. Isto implica que também existem ansas de superfície que têm uma sequência de aminoácidos quase idêntica nas diferentes proteínas da membrana exterior da Classe I. Este facto abre o caminho para a aplicação de peptidos comuns da proteína da membrana exterior da Classe I para fins de obtenção de vacinas. Mais especialmente, um modelo esquemático e dimensional da proteína P1.16 da membrana exterior da Classe I meningocócica esta representada na Figura 11. Este modelo contem oito ansas de superfície em que a primeira e a quarta contêm os epítopes de tipo especifico como demonstrado com base nos resultados de subtipificação da estirpe. A quinta ansa de superfície representa a região constante citada anteriormente. 0 anticorpo para a região constante

da ansa 5 parece reagir com o complexo OMP da N. meningitidis. A sequência da OMP da Classe I, como derivada, comparou-se com a Classe OMP de N. meningitidis (Murakami, K. et al., Infect. Immun. 57 (1989) 2318) e as proteínas porina PIA e PIB de N, gonorrhoeae. Com o princípio idêntico ao utilizado para a exemplificação da OMP da Classe I as sequências alinharam-se como segue:

LOOP 1

Classe	I
Classe	IB
Classe	IA
Classe	II

DVSLYGEIKAGV ** *** *****

DVTLYGAIKAGV AA AAA *****

DVTLYGTIKAGV ** *** ***** DVTLYGTIKAGV

EGRNIQAQLTEQPQVTNGVQGN

- QTYRSVEHT

- ETSRSVAHH

- EVSRVKDAG

AA AAA AAAA«QVKQTKAKSRIRTK I *

SDFGSTIGFKGSEDLGEGL * ** ***** **** **

DGKVSKVET—GSE IADFGSKIGFKGQEDLGNGL * ** ***** ** * **

GAQADRVKT—ATE IADLGSKIGFKGQEDLGNGL

A AA AAAAA AA A AA

TYKAQGGKSKTATQ IADFGSKIGFKGQEDLGNGL * * ** ***** ** * **

LOOP 2

KAVWQLEQ DVSVAGGGASQ WGNRESFIGLAGEFG ** ***** ***

ΛΑ AA A AA

KAVWQLEQ GASVAGTNTG- WGNKQSFVGLKGGFG ** ***** ***

AA AA A AA

KAIWQLEQ KAYVSGTDTG- WGNRQSFIGLKGGFG

AA AAAAA

AAA

AA AA A AA

KAIWQLEQ KASIAGTNSG- WGNRQSFIGLKGGFG ** ***** *** ** ** * **

-74L00P3

TLRAGRVANQFDD Λ Λ

TIRAGSLNSPL * *

KVRVGRLNSYL

KN

KD ikSQAINPWDSNNDVASQLQITGANVNAWESGKFTGNVLEIS rGGFNPWEGKSYYLPLSNIAQ

TVRAGNLNTVLKDS GDNVNAWE S GSNTEDVLGLG * *

-FKRHDDMPV

GMAQREHRYL

PEERHV-SVRYDSPEFSGFSGSVQ AAAAAAA Λ

SVRYDSPETAGFSGSVQ AAAAAAA AA A

SVRYDSPEFAGFRAV-Q

AAAAAAA AA

LOOP 4

FV

YA

YV

PAQNS * **

PKDNS * **

PNDNS * **

TIGRVESREI

SVRYDSPVFAGFSGSVQ YVPRDNA AAAAAAA AA A A AA

LOOP 5

GLNYKNGGFAGNYA FKYARHANVGRNAPELFLIG * ** * * * **

GLNYQNSGFFAQYA GLFQ^YGEGTKKA AA A A A AA

GFNYKNSGFFVQYA GFYKjRHSYTTEKH****** **

IE

GLKYENAGFFGQYA GSFAKYADLNTD---* ** * * * **

-AE

Ν

SATSDEAKGTDPLKP

DDQTYSIPSLFVEKL

--------------_L

QVHRLTGGYEEGGLNLALA AAAAA Λ A

QVHRLVGGYDNNALYVSVA ***** *** * *

QVHRLVGGYDHDALYASVA ***** *** * *

RVAVNTANAHPVKDY

QVHRVVAGYDANDLYVSVA AAAAA AAA A A

LOOP 6

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As similaridades estruturais estão indicadas na transmembrana e nas regiões de ansa superficial. Com a informação agora obtida para OMP da Classe I e informação baseada na dimensão da ansa superficial, localizaçao, hom£ logia ou heterologia de aminoácidos intra-especies das regiões em uma ansa da proteina porina particular sao possíveis as previsões de epitopes para a incor poração em vacinas para outras bactérias gram-negativas patogénicas incluindo N. gonorrhoeae. Utilizando-se os mesmos métodos que se utilizaram para a OMP da Classe I, estes epitopes podem ser avaliados para inclusão em vacinas.

Depósitos de microrganismos

A N. meningitidis da estirpe H4476 (B: 15: Pl.7,16) foi depositada a de Dezembro de 1989 no Centraal Bureau voor Schimmelculturen (CBS), Baarn,

Holanda e obteve o número de aceitaçao CBS 635.89. A OMP da Classe 2/3 de N.

meningitidis mutante deficiente HIII-5 foi depositada a 11 de Dezembro de 1989 na CBS, Baarn, Holanda com o numero de aceitaçao CBS 636.89.

Equivalentes

Os especialistas na matéria reconhecerão ou serão capazes de determinar a utilização por simples experimentação de rotina de muitos equivalentes aos aspectos específicos desta invenção, descritos anteriormente. Estes equivalentes sao evidentemente abrangidos pelas reivindicações que seguem.

/^89-

Claims (55)

1. REIVINDICAgÕES

   1.- Processo para a preparação de uma vacina eficaz contra doenças provocadas por meningococcus, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz compreendida entre 1 e 100 yjg de pelo menos:

   - OMVs isoladas de meningococcus que exprimem tanto OMP da Cla_s se I homólogos como heterólogos; ou

   - pelo menos uma proteína ou um fragmento ou um oligopeptido, contendo um seu epitopo, da membrana externa meningocõcica

   -90Classe I;

   - com um ou mais agentes auxiliares de formulação apropriados, tais como adjuvantes.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a proteína da membrana externa meningocócica Classe I ser de uma estirpe de meningococcus mutante negativa para a proteína de membrana externa da Classe 2/3.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a proteína de membrana externa, fragmento ou oligopeptido ser produzida por um microrganismo comportando um gene heterólogo que codifica a proteína, fragmento ou oligopeptido de membrana externa Classe I.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido da membrana externa Classe I ser proveniente de um grupo de meningococcus A, B, C, W-135 ou Y.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido da membrana externa Classe I ser proveniente de um grupo de meningococcus B.

   -916. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se incorporar proteínas, fragmentos ou oligopeptidos de membrana externa Classe I de 5-10 grupos de meningococcus B.
6. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se incorporar um fragmento de proteína obtido por meio de tratamento de uma proteína de membrana externa Classe I com brometo de cianogénio.
7. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se obter a proteína da membrana externa menin gocócica Classe I mediante proteólise com uma enzima escolhida no grupo constituído por endo-Lvs-C, endo-Arg-C, endo-Ylu-1 ou Staphilococcus-V8-protease.
8. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o oligopeptido conter pelo menos um anticorpo bactericida que se liga ao epitope de proteínas da mem brana externa meningocócica Classe I.
9. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o oligopeptido conter pelo menos uma sequência de aminoácidos escolhida no grupo constituído por QPQVTNCVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL,

   -92YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP e HYTRQNNTDVF.
10. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o epítope se localizar nas ansas superfi ciais de proteínas de membrana externa meningocócica Classe I na área compreendida pelos aminoácidos 24-34 e 176-187.
11. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, cara£ terizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido de membrana externa Classe I se conjugar a um epítope de célula T através de uma ligação química.
12. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido de membrana externa Classe I conter um polissacãrido meningocócico A, B, C, W-135 e/ou Y sob a forma conjugada com o produto de proteína.
13. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de conter também um agente tensioactivo Zwitteriogénico, cationogénico, anionogénico e/ou não ionogénico.
14. 15,- Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de se escolher o agente detergente no grupo

    -93constituido por Zwittergent ZW 3-10, Zwittergent Zw 3--4, Tween-20, colato de sódio, octil-glicosido e desoxicolato de só dio.
15. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se incorporar também um agente adsorven te escolhido entre fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio e fosfato de cálcio.
16. 17. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se incorporar também um complexo imuno-estimulante (ISCOM).
17. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido de membrana externa Classe I estar contida em um lipossoma.
18. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a proteína, fragmento ou oligopeptido de membrana externa Classe I se ligar a um lípido.
19. 20. - Processo para a preparação de fragmentos de proteina de membrana externa Classe I de Neisseria meningitidis substancialmente purificados, apresentando um peso molecular igual a cerca de 25KD ou menos e contendo epítopes contínuos ou descon-94tínuos reactivos com anticorpos bactericidas contra N. meningitidis , caracterizado pelo facto:

    - de se produzir OMP Classe I, por exemplo por meio de estirpes meningococicas mutantes, que não exprime OMP Classe 2/3, de se cindir OMP Classe I e de se purificar/fraccionar os fragmentos obtidos, ou

    - de se produzir os citados fragmentos por técnicas de ADN recombinante ou mediante síntese química.
20. 21. - Processo de acordo com a reivindicação 20, carac terizado pelo facto de a proteína de membrana externa Classe I ser do subtipo Pl.7.16.
21. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, carac terizado pelo facto de a cisão da proteína de membrana extern^ Classe I de N. meningitidis se realizar com brometo de cianogénio.
22. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 20, carac terizado pelo facto se preparar um oligopeptido que contém um epitope de célula B de uma proteína de membrana externa Classe I que varia na sequência de aminoácidos entre purina-proteínas meningococicas diferentes.
23. 24,- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac terizado pelo facto de se preparar um oligopeptido que contém pelo menos uma das sequências de aminoácidos escolhidas entre o grupo constituído por QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGCASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL,

    HFVQQTPQSQP e/ou HYTRQNNTDVF.
24. 25. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de se preparar um oligopeptido que contém um epitope de uma proteína de membrana externa Classe I que está conservada na sequência de aminoácidos entre purina-proteínas meningococicas diferentes.
25. 26. - Processo de acordo com a reivindicação 20, carac terizado pelo facto de se preparar um oligopeptido que contém um epitope de célula T de uma proteína de membrana .externa Cla_s se I meningocócica.
26. 27. - Processo para a preparação de sequências de ãci_ do nucleico que codifica para OMP meningocócica Classe I ou um seu fragmento, caracterizado pelo facto de se isolar as referidas sequências de ácido nucleico a partir de genes que codificam uma proteína ou um fragmento ou um oligonucleótido de proteína de membrana externa Classe I de Neisseria meningitidis ou de se preparar as referidas sequências de ácido nucleico mediante técnicas de síntese de oligonucleotidos.

    -96f
27. 28.- Processo para a preparação de uma composição de uma vacina capaz de provocar uma resposta imunológica contra Neisseria meningitidis, caracterizado pelo facto de se misturar uma ou mais proteínas ou seus fragmentos de membrana exter na Classe I meningococica com um veículo, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, eventualmente, um agente adjuvante .
28. 29. - Processo de acordo com a reivindicação 28, carac terizado pelo facto de se conjugar ou se fundir o fragmento ge neticamente com um epítope de célula T, epitope de célula B ou peptido ou proteína veicular.
29. 30. - Processo de acordo com a reivindicação 29, carac terizado pelo facto de se conjugar o fragmento através de um resto de cisteína ou de lisina ligado a um seu terminal.
30. 31. - Processo de acordo com a reivindicação 29, carac terizado pelo facto de se utilizar como veículo uma toxina,

    CRM ou Toxoid bacterianos.
31. 32. - Processo de acordo com a reivindicação 28, carac terizado pelo facto de a proteína de membrana externa Classe I ser de subtipo Pl.7.16.

    / -97
32. 33.- Processo para a preparação de uma composição de uma vacina capaz de provocar uma resposta imunológica protectora contra Neisseria meningitidis, caracterizado pelo facto de se misturar pelo menos um oligopeptido comportando um epitope, contínuo ou, descontínuo, de uma proteína de membrana externa Classe I reactiva com anticorpos bactericidas contra Neisseria meningitidis e, facultativamente, um agente adjuvante, com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico .
33. 34. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac terizado pelo facto de o oligopeptido comportar uma sequência de aminoácidos escolhidos entre QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL,

    HFVQQTPQSQP e/ou HYTRQNNTDVF.
34. 35. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac terizado pelo facto de se conjugar ou se fundir geneticamente o fragmento proteolítico com um epitope de célula T, com um epitope de célula B ou com um péptido ou com uma proteína veicular .
35. 36. - Processo de acordo com a reivindicação 33, carac terizado pelo facto de se realizar a conjugação através de um resto cisteína ou lisina ligado a um terminal do fragmento.

    -9837. - Processo de acordo com a reivindicação 35, carac terizado pelo facto de o veículo ser uma toxina bacteriana,

    CRM ou toxoíde.
36. 38. - Processo para a preparação de um conjugado antigénico, caracterizado pelo facto de se conjugar uma proteína, um fragmento ou um oligopeptido de membrana externa meningocócica Classe I comportando um seu epitope conjugado com uma pro teína veicular ou com um seu epitope.
37. 39. - Processo de acordo com a reivindicação 38, carac terizado pelo facto de se escolher o oligopeptido no grupo constituído por QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP e/ou

    HYTRQNNTDVF.
38. 40. - Processo de acordo com a reivindicação 39, carac terizado pelo facto de a proteína veicular antigénica ser uma toxina bacteriana, CRM ou um seu epitope.
39. 41. - Processo de acordo com a reivindicação 40, carac. terizado pelo facto de a proteína veicular ser CRM^^^.
40. 42. - Processo para a preparação de um péptido ou proteína de fusão genética, caracterizado pelo facto de se fundir

    -99um epitope de uma proteína de membrana Classe I meningocócica com uma proteína ou com um peptido veicular ou com um seu epi tope.
41. 43.- Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de se escolher o peptido no grupo cons tituído por QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP e/ou

    HYTRQNNTDVF.
42. 44.- Processo para a preparação de uma proteína de fusão gue contém uma proteína de flagelina, caracterizado pelo facto de se inserir uma sequência de aminoácidos para um epitope de uma proteína de membrana externa Classe I meningocócica.
43. 45.- Processo de acordo com a reivindicação 44, carac terizado pelo facto de se inserir a sequência de aminoácidos na proteína de flagelina em uma região não essencial ã função da proteína de flagelina.
44. 46.- Processo de acordo com a reivindicação 45, cara£ terizado pelo facto de se inserir a sequência de aminoácidos em uma região hiper-variável da proteína de flagelina.

    -100
45. 47. - Processo de acordo com a reivindicação 44, carac terizado pelo facto de se incorporar ainda um oligossacãrido capsular meningocócico ou também um polissacárido conjugado.
46. 48. - Gene recombinante, caracterizado pelo facto de codificar uma proteína de fsuão de acordo com uma qualquer das reivindicações 42 a 47.
47. 49. - Microrganismo recombinante, infeccioso capaz de exprimir uma proteína de membrana externa Classe I de Neisseria meningitidis ou um fragmento ou oligopeptido comportando um epitope contínuo ou descontínuo reactivo com anticorpos bactericidas contra N. meningitidis.
48. 50. - Microrganismo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de se escolher o oligopeptido no grupo constituído por QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG,

    YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP e/ou HYTRQNNTDVF.
49. 51. - Microrganismo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por ser vírus de vacina, adenovírus ou citomegalovírus.
50. 52.- Microrganismo de acordo com a reivindicação 49,

    -101 caracterizado pelo facto de ser uma bactéria do género salmonella.
51. 53.- Microrganismo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de o epitope da proteína da membrana externa Classe I meningocócica ser expressa como uma flagelina recombinante.
52. 54. - Estirpe meningocócica mutante incapaz de produzir proteína de membrana externa Classes 2 e 3.
53. 55. - Estirpe meningocócica mutante, caracterizada pe lo facto de ser HIII5, CBS 636.89.
54. 56. - Estirpe meningocócica mutante, caracterizada pe lo facto de ser incapaz de produzir proteína de membrana externa de Classes 2 e 3 e de ser transformada com um gene bete rólogo que codifica uma proteína de membrana externa Classe I não-natural.
55. 57. - Método para a identificação de epitopos de vacina de uma proteína porina gram-negativa, caracterizado pelo facto:

    a) de se obter uma sequência de aminoácidos da proteína porina;

    -102

    b) de se comparar a sequência de aminoácidos de proteí na porina com a sequência de aminoácidos de uma proteína de membrana externa Classe I meningocócica (OMP) para prever a lo calização, tamanho e sequência de estruturas expostas em ansa de superfície da proteína porina baseado nas estruturas correspondentes conhecidas de OMP Classe I; e

    c) de se identificarem os epitopos de vacinas potenciais nas estruturas em ansa de superfície, com base na locali zação, tamanho e sequência das estruturas previstas.

    Lisboa, 13 de Março de 1991 O Ags íts Oficiai cio Prcpt sacde Ir.clusírial

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