PT2630159T - Anticorpos estáveis e solúveis - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ESTÁVEIS E SOLÚVEIS"

Campo da Invenção A invenção refere-se a métodos de redução da propensão para a agregação de anticorpos, e a anticorpos que são modificados para reduzir a propensão para agregação. A invenção refere-se também a anticorpos que ligam o fator de necrose tumoral alfa (TNFa) . Em particular, a invenção refere-se a anticorpos estáveis e solúveis que compreendem uma modificação de redução da agregação, incluindo anticorpos scFv e fragmentos Fab, que compreendem sequências especificas de cadeia leve e cadeia pesada que são otimizadas para estabilidade, solubilidade e baixa imunogenicidade. Além disso, a invenção refere-se a métodos para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por TNF.

Antecedentes da Invenção 0 fator de necrose tumoral alfa (TNFa, também conhecido como caquetina) é uma citocina de mamífero natural produzida por numerosos tipos de células, incluindo monócitos e macrófagos em resposta a endotoxinas ou outros estímulos. 0 TNFa é um mediador importante de reações inflamatórias, imunológicas e fisiopatológicas (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802). 0 TNFa solúvel forma-se pela dissociação de uma proteína precursora transmembranar (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53) e os polipéptidos de 17 kDa segregados assemelham-se a complexos homotriméricos solúveis (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para revisões sobre o TNFA, ver Butler, et al. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). Estes complexos ligam-se em seguida a recetores que se encontram numa variedade de células. A ligação produz uma matriz de efeitos pró-inflamatórios, incluindo (i) libertação de outras citocinas pró-inflamatórias tais como interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1, (ii) libertação de metaloproteinases da matriz e (iii) regulação positiva da expressão de moléculas de adesão endotelial, amplificando ainda mais a cascata inflamatória e imunológica atraindo leucócitos para os tecidos extravasculares.

Um grande número de distúrbios está associado a níveis elevados de TNFa, muitos deles com importância médica significativa. Foi demonstrado que o TNFa está regulado positivamente num número de doenças humanas, incluindo doenças crónicas tais como artrite reumatoide (RA), distúrbios inflamatórios do intestino incluindo doença de Crohn e colite ulcerosa, septicemia, insuficiência cardíaca congestiva, asma brônquica e esclerose múltipla. Os murganhos transgénicos para o TNFa humano produzem níveis altos de TNFa constitutivamente e desenvolvem uma poliartrite destrutiva espontânea, que se assemelha a RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10,4025-4031). Por conseguinte, o TNFa é referido como uma citocina pró-infla-matória. O TNFa está agora bem estabelecido como sendo chave na patogénese da RA, a qual é uma doença progressiva e debilitante crónica, caracterizada por inflamação e destruição de articulações poliarticulares, com sintomas sistémicos de febre e mal-estar e fadiga. A RA também leva a inflamação sinovial crónica, com progressão frequente para a cartilagem articular e destruição de osso. Encontra-se níveis aumentados de TNFa tanto no líquido sinovial como no sangue periférico de doentes que sofrem de RA. Quando se administra agentes bloqueadores de TNFa a doentes que sofrem de RA, aqueles reduzem a inflamação, melhoram os sintomas e retardam o dano das articulações (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).

Fisiologicamente, o TNFa está também associado à proteção de infeções particulares (Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28) . O TNFa é libertado por macrófagos que foram ativados por lipopolissacáridos de bactérias Gram-negativas. Como tal, o TNFa parece ser um mediador endógeno de importância crucial envolvido no desenvolvimento e patogénese de choque endotóxico associado a septicemia bacteriana (Michie, et al. (1989), Br. J.Surg, 76:670-671.; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463- 466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47;

Waage et al. (1987) . Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets, et al. (1989) , Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990) , J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988),

Arch. Surg. 123:162-170).

Como com outros sistemas de órgãos, foi também demonstrado que o TNFa desempenha um papel chave no sistema nervoso central, em particular nos distúrbios inflamatórios e autoimunes do sistema nervoso, incluindo esclerose múltipla, sindrome de Guillain-Barre e miastenia grave, e nos distúrbios degenerativos do sistema nervoso, incluindo doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. O TNFa está também envolvido em distúrbios de sistemas relacionados da retina e do músculo, incluindo nevrite ótica, degenerescência macular, retinopatia diabética, dermatomiosite, esclerose lateral amiotrófica e distrofia muscular, assim como em lesões do sistema nervoso, incluindo lesão cerebral traumática, lesão da medula espinal aguda e acidente vascular cerebral. A hepatite é outro distúrbio inflamatório relacionado com o TNFa que, entre outros estímulos, pode ser provocada por infeções virais, incluindo Epstein-Barr, citomegalovírus e vírus da hepatite A-E. A hepatite provoca inflamação hepática aguda na região portal e lobular, seguida de fibrose e progressão para tumor. O TNFa pode mediar também a caquexia no cancro, a qual provoca a maioria da morbidade e mortalidade no cancro (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305). O papel chave desempenhado pelo TNFa na inflamação, nas respostas imunológicas celulares e na patologia de muitas doenças conduziu à pesquisa de antagonistas de TNFa. Uma classe de antagonistas de TNFa concebidos para o tratamento de doenças mediadas por TNFa são os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que ligam especificamente o TNFa e bloqueiam, desse modo, a sua função. A utilização de anticorpos anti-TNFa mostrou que um bloqueio do TNFa pode inverter os efeitos atribuídos ao TNFa incluindo diminuições na IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adesão e destruição de tecidos (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350). Entre os inibi- dores específicos de TNFa que ficaram comercialmente disponíveis no passado redente incluem-se um anticorpo monoclonal de murganho-humano quimérico dirigido contra TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) que demonstrou eficácia clínica no tratamento de RA e doença de Crohn. Apesar destes avanços, permanece uma necessidade para novas formas eficazes de anticorpos ou outros anticorpos para o tratamento de distúrbios associados a TNFa tais como RA. Em particular, há uma necessidade urgente de anticorpos com ótimas propriedades funcionais para o tratamento eficaz e contínuo de artrite e outros distúrbios mediados por TNFa.

Sumário da Invenção A invenção proporciona anticorpos que compreendem pelo menos uma mutação de redução da agregação e métodos de produção de tais anticorpos.

Num aspeto, a invenção proporciona um método de redução da propensão para agregação de um anticorpo, em que o método compreende a introdução de uma ou mais modificações de redução da agregação numa posição de resíduo que participa na interface entre a cadeia leve variável e a cadeia pesada variável de um anticorpo, em que a substituição reduz a energia livre entre a cadeia leve variável e cadeia pesada variável em pelo menos 0,5 kcal/mol, reduzindo, desse modo, a propensão para agregação do anticorpo modificado em comparação com a de um anticorpo parental que carece da(s) modificação/modificações de redução da agregação.

Num aspeto, um método da invenção compreende a introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos na interface de uma cadeia leve variável (VL) e uma cadeia pesada variável (VH) do anticorpo, em que a uma ou mais substituições estão em posições de resíduos selecionadas para reduzir a energia livre entre a VL e a VH em pelo menos 10%, reduzindo, desse modo, a propensão para agregação do anticorpo em comparação com um anticorpo parental. Num aspeto particular, a sequência da cadeia leve variável do anticorpo tem pelo menos 65% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 1. Noutros aspetos, a sequência variável da cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 3 ou a sequência de SEQ ID NO: 4 .

Em certos aspetos, um método da invenção compreende a modificação do resíduo na posição AHo 50 e/ou o resíduo na posição AHo 47 na cadeia leve variável de um anticorpo, reduzindo, desse modo, a propensão para agreqação do anticorpo em comparação com um anticorpo parental. Noutros aspetos, o método da invenção compreende ainda resíduos de modificação na posição AHo 12, 103 e 144 da cadeia pesada variável. A invenção também proporciona anticorpos com propensão reduzida para agregação que compreendem uma ou mais modificações de redução da agregação. Em certos aspetos, um anticorpo da invenção é um Fab, Fab', um F(ab)'2, Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento Fv ou um anticorpo linear. Noutros aspetos, a invenção proporciona uma molécula biespecífica ou bivalente que compreende um anticorpo da invenção.

Noutros aspetos, a modificação de redução da agregação encontra-se na posição AHo 50 da cadeia leve variável. Num aspeto particular, a modificação de redução da agregação compreende uma arginina (R) na posição AHo 50 da cadeia leve variável. Ainda noutro aspeto, a modificação de redução da agregação compreende uma substituição de lisina (K) por arginina (R) na posição AHo 50 da cadeia leve variável.

Ainda noutros aspetos, a modificação de redução da agregação encontra-se na posição AHo 47 da cadeia leve variável. Num aspeto particular, a modificação de redução da agregação compreende uma arginina (R) na posição AHo 47 da cadeia leve variável. Ainda noutro aspeto, a modificação de redução da agregação compreende uma substituição de lisina (K) por arginina (R) na posição AHo 47 da cadeia leve variável. A invenção também proporciona anticorpos estáveis e solúveis específicos para TNFa, que compreendem sequências específicas de cadeia leve e cadeia pesada que são otimizadas para estabilidade, solubilidade, ligação in vitro e in vivo de TNFa e baixa imunogenicidade. Os referidos anticorpos são concebidos para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios mediados por TNFa. São também divulgados os ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão dos anticorpos recombinantes, as cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis da invenção, os métodos para isolá-los e a utilização dos referidos anticorpos em medicina. A invenção também proporciona métodos de tratamento de um distúrbio mediado por TNFa que compreendem administrar a um indivíduo que o necessita a composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-TNFa da invenção. Em certos aspetos, o distúrbio mediado por TNFalfa é uma afeção ocular selecionada do grupo que consiste em uveite, doença de Bechet, retinite, olho seco, glaucoma, sindrome de Sjõrgen, neuropatia diabética, esclerite, degenerescência macular relacionada com a idade e queratite.

Formas de realização preferidas especificas da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição mais detalhada de certas formas de realização preferidas e das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra curvas de titulação das posições de resíduos VL47 (linhas continuas) e VL50 (linhas tracejadas) em duas moléculas scFv diferentes, 34rFWl.4 (preto) e 578rFWl.4 (cinzento). A Figura 2A mostra estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 2B mostra a estabilidade de 34rFWl.4 _VLK50R_DHP sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 3A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 40 mg/mL. A Figura 3B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_VLK50R_DHP sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 40 mg/mL. A Figura 4A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL. A Figura 4B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_VLK50R_DHP sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL. A Figura 5A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 5B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_VL_K50R sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 6A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 40 mg/mL. A Figura 6B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_VLK50R sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 40 mg/mL. A Figura 7A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL. A Figura 7B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_VLK50R sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL. A Figura 8A mostra a estabilidade de 34rFW1.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 8B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_K47R sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 60 mg/mL. A Figura 9A mostra a estabilidade de 34rFWl.4 sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL. A Figura 9B mostra a estabilidade de 34rFWl.4_K47R sob condições aceleradas determinada através de análise por SE-HPLC após 2 semanas de incubação a 40 °C e utilizando uma concentração de 20 mg/mL.

Descrição Detalhada da Invenção É um objetivo geral da invenção proporcionar anticorpos estáveis e solúveis com propensão reduzida para se agregar em solução. Numa forma de realização preferida, o referido anticorpo é um anticorpo scFv ou fragmento Fab. Os anticorpos da invenção compreendem preferencialmente uma cadeia leve e pesada como aqui divulgadas.

As caracteristicas aqui apresentadas são apenas a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das formas de realização preferidas da presente invenção e são apresentadas pela razão de proporcionar, o que se julga que seja, a descrição mais útil e facilmente entendida dos princípios e aspetos conceptuais de várias formas de realização da invenção. A este respeito, não é feita qualquer tentativa para apresentar pormenores estruturais da invenção em mais detalhe do que é necessário para a compreensão fundamental da invenção, tornando a descrição, em conjunto com os desenhos e/ou exemplos, evidente para os especialistas na técnica como as várias formas da invenção podem ser materializadas na prática. A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos serão definidos como se segue. Outras definições encontram-se estabelecidas ao longo da descrição detalhada. As seguintes definições e explicações entendem-se e destinam-se a controlar em qualquer construção futura, a menos que sejam modificadas clara e inequivocamente nos exemplos a seguir ou quando a aplicação do significado torne qualquer construção sem sentido ou essencialmente sem sentido. Nos casos em que a construção do termo o tornaria sem sentido ou essencialmente sem sentido, a definição deve ser tirada do Webster's Dictionary, 3rd Edition ou um dicionário conhecido pelos especialistas na técnica, tal como o Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004). O termo "anticorpo" como aqui utilizado inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antigénio (i.e., "porção de ligação a antigénio," "poli-péptido de ligação a antigénio" ou "imunoligante") ou cadeia simples dos mesmos. Um "anticorpo" inclui uma glico-proteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissul-fureto, ou uma porção de ligação a antigénio da mesma. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como Vh) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é constituída por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões Vh e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada Vh e Vl é constituída por três CDRs e quatro FRs, organizadas da extremidade amino para a extremidade carboxilo pela seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (e.g., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo") refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio (e.g., TNF) . Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios Vl e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento de um único domínio ou dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544- 546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem estar opcionalmente unidas por uma unidade de ligação sintética. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e Vh, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por uma unidade de ligação sintética que os torna capazes de ser preparados como uma única cadeia de proteína em que as regiões Vl e Vh emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver e.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883).

Tais anticorpos de cadeia simples destinam-se também a estar abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. As porções de ligação a antigénio podem ser produzidas por técnicas de ADN recombinante, ou por dissociação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem ser de isotipo diferente, por exemplo, um anticorpo de IgG (e.g., um de subtipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgAl, IgA2, IgD, IgE ou IgM. 0 termo "regiões estruturais" refere-se às porções reconhecidas na técnica de uma região variável do anticorpo que existem entre as regiões CDR mais divergentes. Tais regiões estruturais são tipicamente referidas como regiões estruturais 1 a 4 (FRl, FR2, FR3 e FR4) e proporcionam uma armação para manter, no espaço tridimensional, as três CDRs presentes numa região variável do anticorpo de cadeia pesada ou leve, pelo que as CDRs podem formar uma superfície de ligação a antigénio. Tais regiões estruturais podem ser também referidas como armações, já que proporcionam um suporte para a apresentação das CDRs mais divergentes. Outras CDRs e regiões estruturais da superfamília de imunoglobulinas, tais como as repetições de anquirina e a fibronectina, podem ser utilizadas como moléculas de ligação a antigénio (ver também, por exemplo, Patentes U.S. N.° 6,300,064, 6,815,540 e Pub. U.S. N.° 20040132028). O termo "epítopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um sítio num antigénio ao qual se liga especificamente uma imunoglobulina ou anticorpo (e.g., TNF). Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos numa conformação espacial única. Ver, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996) .

Os termos "ligação específica," "ligação seletiva," "liga seletivamente" e "liga especificamente," referem-se à ligação do anticorpo a um epítopo num antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de ΙΟ-8 Μ, 10~9 M ou 10_1° M ou mesmo menor, como determinada utilizando tecnologia de ressonância plasmónica de superfície (SPR) num instrumento BIACORE. O termo "Kd, " refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. Em certas formas de realização, alguns anticorpos da invenção ligam-se ao TNF com uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) inferior a aproximadamente 10-7 M, tal como inferior a aproximadamente ΙΟ-8 Μ, 10-9 M ou 10_1° M ou mesmo inferior, por exemplo, como determinada utilizando tecnologia de ressonância plasmónica de superfície (SPR) num instrumento BIACORE.

Como aqui utilizado, "identidade" refere-se à correspondência de sequência entre dois polipéptidos, moléculas ou entre dois ácidos nucleicos. Quando uma posição em ambas as sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de ADN é ocupada por adenina, ou uma posição em cada um dos dois polipéptidos é ocupada por uma lisina), então as respetivas moléculas são idênticas nessa posição. A "percentagem de identidade" entre duas sequências é uma função do número de posições coincidentes compartilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são coincidentes, então as duas sequências têm 60% de identidade. A título de exemplo, as sequências de ADN CTGACT e CAGGTT compartilham 50% de identidade (3 das 6 posições totais são coincidentes). Geralmente, faz-se uma comparação quando duas sequências são alinhadas para dar máxima identidade. Esse alinhamento pode ser proporcionado utilizando, por exemplo, o método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas de computador tais como o programa Align (DNAstar, Inc.). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser também determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de ponderação de resíduos PAM120, uma penalização de comprimento de lacuna de 12 e uma penalização de lacuna de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com) , utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Sequências "semelhantes" são aquelas que, quando alinhadas, compartilham resíduos de aminoácidos idênticos e semelhantes, em que os resíduos semelhantes são substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos correspondentes numa sequência de referência alinhada. A este respeito, uma "substituição conservadora" de um resíduo numa sequência de referência é uma substituição por um resíduo que é física ou funcionalmente semelhante ao resíduo de referência correspondente, e.g., que tem um tamanho, forma, carga elétrica, propriedades químicas semelhantes, incluindo a capacidade para formar ligações covalentes ou de hidrogénio, ou semelhantes. Assim, uma sequência "modificada por uma substituição conservadora" é uma que difere de uma sequência de referência ou uma sequência de tipo selvagem por estarem presentes uma ou mais substituições conservadoras. A "percentagem de semelhança" entre duas sequências é uma função do número de posições que contêm resíduos coincidentes ou substituições conservadoras compartilhadas pelas duas sequências divididos pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são coincidentes e 2 de 10 posições contêm substituições conservadoras, então as duas sequências têm 80% de semelhança positiva.

Como aqui utilizado, o termo "modificações de sequência conservadoras" destina-se a referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram negativamente as caracteristicas de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações de sequência conservadoras incluem substituições, adições e supressões de nucleótidos e aminoácidos. Por exemplo, as modificações podem ser introduzidas por técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como mutagénese específica de um lócus e mutagénese mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido está substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, tripto-fano), cadeias laterais apoiares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas na posição beta (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto num anticorpo particular é preferencialmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Os métodos de identificação de substituições conservadoras de nucleótidos e aminoácidos que não eliminam a ligação ao antigénio são bem conhecidos na técnica (ver, e.g., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:412-417 (1997)). "Sequência consenso de aminoácidos" como aqui utilizada refere-se a uma sequência de aminoácidos que pode ser gerada utilizando uma matriz de pelo menos duas, e preferencialmente mais, sequências de aminoácidos alinhadas, e que permite lacunas no alinhamento, de forma que é possível determinar o resíduo de aminoácido mais frequente em cada posição. A sequência consenso é a sequência que compreende os aminoácidos que estão representados mais frequentemente em cada posição. No caso de dois ou mais aminoácidos estarem igualmente representados numa única posição, a sequência consenso inclui ambos ou todos esses aminoácidos. A sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser analisada a vários níveis. Por exemplo, a conservação ou variabilidade pode ser apresentada ao nível de um único resíduo, ao nível de múltiplos resíduos, múltiplos resíduos com lacunas etc. Os resíduos podem exibir conservação do resíduo idêntico ou podem ser conservados ao nível da classe. Os exemplos de classes de aminoácidos incluem grupos R polares mas não carregados (Serina, Treonina, Asparagina e Glutamina); grupos R carregados positivamente (Lisina, Arginina e Histidina); grupos R carregados negativamente (Ácido glutâmico e Ácido aspártico); grupos R hidrófobos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptofano, Valina e Tirosina); e aminoácidos especiais (Cisteina, Glicina e Prolina). Outras classes são conhecidas por um especialista na técnica e podem ser definidas utilizando determinações estruturais ou outros dados para avaliar a aptidão para substituição. Nesse sentido, um aminoácido substituível pode referir-se a qualquer aminoácido que possa ser substituído e manter conservação funcional nessa posição.

No entanto, reconhecer-se-á que aminoácidos da mesma classe podem variar em grau pelas suas propriedades biofísicas. Por exemplo, reconhecer-se-á que certos grupos R hidrófobos (e.g., Alanina, Serina ou Treonina) são mais hidrófilos (i.e., de hidrofilicidade superior ou hidro-fobicidade inferior) do que outros grupos R hidrófobos (e.g., Valina ou Leucina). A hidrofilicidade ou hidro-fobicidade relativa pode ser determinada utilizando métodos reconhecidos na técnica (ver, e.g.. Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) e Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).

Como aqui utilizado, quando uma sequência de aminoácidos (e.g., uma primeira sequência VH ou VL) é alinhada com uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais (e.g., uma ou mais sequências VH ou VL numa base de dados), uma posição de aminoácido numa sequência (e.g., a primeira sequência Vh ou Vl) pode ser comparada com uma "posição correspondente" na uma ou mais sequências de aminoácidos adicionais. Como aqui utilizada, a "posição correspondente" representa a posição equivalente na(s) sequência(s) que é/são comparada(s) quando as sequências são alinhadas de maneira ótima, i.e., quando as sequências são alinhadas para se conseguir a percentagem de identidade ou percentagem de semelhança mais alta. 0 termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a moléculas de ADN e moléculas de ARN. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou cadeia dupla, mas preferencialmente é ADN de cadeia dupla. Um ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou potenciador está ligado operacionalmente a uma sequência codificante se afeta a transcrição da sequência. Em certas formas de realização, a invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um anticorpo da invenção, uma cadeia leve variável da invenção e/ou uma cadeia pesada variável da invenção. Em certas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico da invenção codifica: um polipéptido que compreende uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 97% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14; um polipéptido que compreende uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 5; ou um anticorpo que tem pelo menos 96% de identidade com a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 17. O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual se ligou. Um tipo de vetor é um "plasmídeo, " o qual refere-se a uma ansa de ADN de cadeia dupla circular na qual se podem ligar segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que se podem ligar segmentos de ADN adicionais no genoma virai. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (e.g., vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissómicos). Outros vetores (e.g., vetores mamíferos não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão. As células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, vegetais ou animais. As bactérias que são suscetíveis a transformação incluem membros das entero-bactérias, tais como estirpes de Escherichia coli ou Sal-monela; Bacilos, tais como Bacillus subtilis; Pneumococos; Estreptococos e Haemophilus influenzae. Os micróbios adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhas de células hospedeiras animais adequadas incluem células CHO (linhas de Ovário de Hamster

Chinês) e NSO.

Os termos "tratar," "tratando" e "tratamento" referem-se a medidas terapêuticas ou preventivas aqui descritas. Os métodos de "tratamento" utilizam a administração a um indivíduo, que necessita desse tratamento, de um anticorpo da presente invenção, por exemplo, um indivíduo que tem um distúrbio mediado por TNFa ou um indivíduo que, em última análise, pode adquirir um tal distúrbio, para prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas do distúrbio ou distúrbio recorrente, ou a fim de prolongar a sobrevivência de um indivíduo além do esperado na ausência desse tratamento. 0 termo "distúrbio mediado por TNF" refere-se, em geral, a estados patológicos e/ou sintomas associados ao TNF, incluindo qualquer distúrbio, cujo aparecimento, progressão ou persistência dos sintomas requer a participação de TNF. Os exemplos de distúrbios mediados por TNF incluem, mas não se limitam a, degenerescência macular relacionada com a idade, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolenticular, carcinomas da mama, carcinomas do pulmão, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorretais, carcinomas do fígado, carcinomas ovarianos, os comas, arrenoblastomas, carcinomas do colo do útero, carcinoma do endométrio, hiperplasia do endométrio, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, cancro da cabeça e do pescoço, carcinoma nasofaringeo, carcinomas laringeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas da pele, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas do pâncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwanoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiossarcomas, carcinomas do aparelho urinário, carcinomas da tireoide, tumor de Wilm, carcinoma das células renais, carcinoma da próstata, proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (tal como o associado a tumores cerebrais), sindrome de Meigs, artrite reumatoide, psoriase e aterosclerose. Os distúrbios mediados por TNF incluem também olho seco e condições inflamatórias relacionadas com TNFa, tais como inflamação ocular, conjuntivite alérgica, dermatite, rinite e asma, por exemplo, e incluem aquelas alterações celulares que resultam da atividade de TNFa que conduz direta ou indiretamente à condição inflamatória relacionada com TNFa. Além disso, os distúrbios mediados por TNF incluem também a angiogénese ocular, doença de Bechet, retinite, glaucoma, sindrome de Sjõrgen, neuropatia diabética, esclerite, queratite e uveite. 0 termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para conseguir ou pelo menos conseguir parcialmente o efeito desejado. 0 termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a doença e as suas complicações num doente que já sofre da doença. As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade do distúrbio a ser tratado e do estado geral do sistema imunitário do próprio doente. 0 termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo com um distúrbio mediado por TNF. 0 sistema de numeração como aqui utilizado para identificar as posições de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo corresponde àquele como definido por A. Honegger, J.Mol.Biol, 309 (2001) 657-670 (o sistema AHo). As tabelas de conversão entre o sistema AHo e o sistema mais comummente utilizado como definido por Rabat et al. (Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N.° 91-3242) são proporcionadas em A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.

Como aqui utilizado, o termo "agregação" refere-se ao processo de interações/associações intermoleculares entre moléculas monoméricas em solução líquida que conduzem à formação de espécies oligoméricas. A agregação pode ser avaliada sob condições de stress utilizando estudos de estabilidade acelerada numa solução concentrada. Os estudos de estabilidade acelerada são concebidos para aumentar a velocidade de degradação, agregação ou modificação química de um composto utilizando condições de armazenamento extremas. Os estudos de estabilidade acelerada, também conhecidos como estudos de stress, são tipicamente realizados a 40 °C e à temperatura ambiente. Estes estudos de estabilidade proporcionam informação valiosa relativamente ao efeito de exposição a condições ambientais fora das condições normais de armazenamento do rótulo, também conhecidas como condições de stress. As soluções de concentração alta de proteína são amplamente utilizadas na indústria farmacêutica. O comportamento em solução de proteínas a concentrações altas pode ser acentuadamente diferente daquele previsto com base na análise de soluções diluídas devido à não-idealidade termodinâmica nestas soluções. A não-idealidade observada nestes sistemas refere-se às interações proteína-proteína (PPI). Diferentes tipos de forças desempenham um papel chave na determinação da natureza global e grandeza destas PPI e as suas contribuições relativas são afetadas pelas propriedades do soluto e do solvente. O papel das PPI é conduzido por estas forças intermoleculares para governar as características da solução, incluindo estabilidade física e autoassociação e agregação de proteínas. As soluções concentradas são aquelas soluções em que a PPI afeta as proteínas em solução aumentando a taxa de oligomerização. Uma solução concentrada pode ter, por exemplo, uma concentração de proteína de pelo menos 10 mg/mL.

Os produtos solúveis deste processo podem ser detetados com métodos analíticos, tais como SE-HPLC. 0 termo "modificação de redução da agregação" como aqui utilizado refere-se a uma modificação, tal como uma substituição de aminoácidos, que reduz uma propensão do anticorpo para se agregar numa solução líquida em comparação com um anticorpo parental como aqui descrito. Um anticorpo "parental" é um anticorpo que compreende essencialmente a mesma sequência que o anticorpo correspondente que tem modificações de redução da agregação. Por exemplo, o anticorpo parental pode ter as mesmas CDRs que o anticorpo modificado, e pode ter exatamente a mesma sequência que o anticorpo modificado exceto para os resíduos na posição AHo 47 e/ou 50 na sequência variável da cadeia leve, e pode diferir ainda nas posições AHo 12, 103 e 144 na sequência variável da cadeia pesada. Podem estar também presentes outras diferenças, desde que o anticorpo parental não contenha as modificações de redução da agregação presentes no anticorpo modificado de acordo com um método da invenção. O termo "interface" como aqui utilizado refere-se à interação entre os dois domínios variáveis (domínios variáveis pesado e leve) de um anticorpo. A interface inclui os resíduos de aminoácidos que participam direta ou indiretamente na interação entre os domínios variáveis. Essa interação inclui, mas não está limitada a, todos os tipos de interações não ligadas, por exemplo forças de van der Waals, ligação de hidrogénio, termos eletrostáticos e interações hidrófobas entre os dois domínios. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comummente entendido por um especialista com conhecimentos médios na matéria à qual esta invenção pertence. Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos na prática ou avaliação da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir. No caso de conflito, a presente descrição, incluindo as definições, controlarão. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Vários aspetos da invenção são descritos em mais pormenor nas subsecções seguintes. Entende-se que as várias formas de realização, preferências e gamas podem ser combinadas à vontade. Além disso, dependendo da forma de realização específica, as definições, formas de realização ou gamas selecionadas podem não se aplicar.

Num aspeto, a presente invenção proporciona anticorpos que ligam o TNFa e são assim adequados para bloquear a função do TNFa in vivo.

Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são otimizados com uma modificação/modificações de redução da agregação relativamente a um anticorpo parental, pelo que um anticorpo da invenção tem uma propensão reduzida para agregar em comparação com um anticorpo parental/não modificado. Tal modificação/Tais modificações incluem substituições de aminoácidos de residuos particulares que participam na interface da cadeia leve variável (VL) e da cadeia pesada variável (VH) . Nalgumas formas de realização, a modificação de redução da agregação compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos que reduz a energia livre da interface VL-VH em comparação com a energia livre da interface VL-VH do anticorpo parental numa abordagem de modelação in silico, como aqui descrita. Tais modificações incluem substituições de aminoácidos de residuos particulares que contribuem para a energia livre da interface VL-VH.

Em certas formas de realização, uma modificação de redução da agregação da invenção compreende uma substituição na posição AHo 50 na cadeia VL. Numa forma de realização, a substituição é uma arginina (R) na posição AHo 50. Noutra forma de realização, a arginina (R) na posição AHo 50 substitui uma lisina (K).

Noutras formas de realização, uma modificação de redução da agregação da invenção compreende uma substituição na posição AHo 47 na cadeia VL. Numa forma de realização, a substituição é uma arginina (R) na posição AHo 47. Noutra forma de realização, a arginina (R) na posição AHo 47 substitui uma lisina (K). 0 sistema de numeração AHo é descrito em pormenor em Honegger, A. e Plu"ckthun, A. (2001) J Mol. Biol. 309:657-670). A posição AHo 50 na cadeia leve variável corresponde à posição 42 de Rabat. A posição AHo 47 na cadeia leve variável corresponde à posição 39 de Rabat. O sistema de numeração de Rabat é descrito em mais detalhe em Rabat et al. (Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N.° 91-3242) . As tabelas de conversão entre o sistema AHo e o sistema utilizado mais comummente como definido por Rabat et al. são proporcionadas em A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.

As seguintes tabelas de conversão são proporcionadas para dois sistemas de numeração diferentes utilizados para identificar posições de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo. O sistema de numeração de Rabat é descrito em mais detalhe em Rabat et al. (Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N.° 91-3242). O sistema de numeração AHo é descrito em mais detalhe em Honegger, A. e Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).

Numeração da Região Variável da Cadeia Pesada

Tabela 1: Tabela de conversão para as posições de resíduos no Domínio Variável da Cadeia Pesada

Numeração da Região Variável da Cadeia Leve

Tabela 2: Tabela de conversão para as posições de resíduos no Domínio variável da Cadeia Leve

Os anticorpos da invenção podem compreender modificações adicionais, consoante desejado. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode compreender substituições de aminoácidos para reduzir a sua imunogenicidade in vivo de acordo com os métodos descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US N.° 12/973,968 e/ou substituições para aumentar a solubilidade do anticorpo, como descrito na WO 09/155725. Assim, numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende Serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo); Serina (S) ou Treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e/ou Serina (S) ou Treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo) . Adicionalmente, o anticorpo pode compreender Serina (S) ou Treonina (T) na posições 97, 98 e/ou 99 da cadeia pesada (numeração AHo). Preferencialmente, o anticorpo compreende Serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo), Treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e Treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo).

Numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a cadeia leve variável: SEQ ID NO: 1

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X)n=i-so WYQQKPGRAPKLLIY (X) n=i-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-so FGQGTKLTVLG

Numa forma de realização preferida, um anticorpo da invenção compreende a cadeia leve variável (as CDRs estão sublinhadas): SEQ ID NO: 2:

EIVMTQSPSTLSASVGDRyiITCQSBQSVYCWtlWMAWYQQKPGRAPKLLIYQASKIA

SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGITgWTGDRYAFGQGTKhTVLG

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a cadeia pesada variável: SEQ ID NO. 3: região estrutural da cadeia pesada variável

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n=i-50 WVRQAPGKGLEWVG (X) n=i-so RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n=i-50 WGQGTLVTVSS

Ainda noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a região estrutural da cadeia pesada variável SEQ ID NO: 4: região estrutural da cadeia pesada variável

EVQLVÈSGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n=i-so WVRQAPGKGLEWVG (X) n=1.50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X)n=i-so WGQGTLVTVSS

Numa forma de realização preferida, o anticorpo da invenção compreende a cadeia pesada variável (as CDRs estão sublinhadas): SEQ ID NO: 5:

VES ©GG&VQgiSG SE RLS CT ITFLYANWAKGR FT1SRDTS KNTVYLQMN SLRAE DTATYYCARLGYAPYAYDLKGQC-TTVTV3S ........

Como aqui utilizado, os resíduos X são sitios de inserção de CDR. X pode ser qualquer aminoácido natural; podem estar presentes pelo menos três e até 50 aminoácidos.

Numa forma de realização, a região estrutural da cadeia leve variável de um anticorpo da invenção compreende a SEQ ID NO: 1 e a região estrutural da cadeia pesada variável compreende a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

Noutra forma de realização, a região estrutural da cadeia leve variável de um anticorpo da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% de identidade, com a SEQ ID NO: 1. Muito preferencialmente, a referida sequência tem uma arginina (R) na posição AHo 50. Noutra forma de realização, a referida sequência tem uma arginina (R) na posição AHo 47.

Noutra forma de realização, a região estrutural da cadeia pesada variável de um anticorpo da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% de identidade, com a SEQ ID N.° 3. Preferencialmente, o referido anticorpo compreende Serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo), Treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e Treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo).

Noutra forma de realização, a região estrutural da cadeia leve variável de um anticorpo da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 97%, 98%, mais preferencialmente 99% de identidade, com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14.

Noutra forma de realização, a região estrutural da cadeia pesada variável de um anticorpo da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% de identidade, com a SEQ ID NO: 5.

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende uma sequência que tem pelo menos 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% de identidade, com a SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 17.

Noutra forma de realização, a região estrutural da cadeia leve variável de um anticorpo da invenção compreende a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14, e a região estrutural da cadeia pesada variável compreende a SEQ ID NO: 5.

Numa forma de realização, os anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção são anticorpos de cadeia simples (scFv) ou fragmentos Fab. No caso de anticorpos scFv, um domínio VL pode ser ligado a um domínio VH em qualquer orientação por uma unidade de ligação flexível. Uma unidade de ligação do estado da técnica adequada consiste em sequências de aminoácidos GGGGS repetidas (SEQ ID NO: 6) ou variantes das mesmas. Numa forma de realização preferida da presente invenção é utilizada uma unidade de ligação (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 7) ou um seu derivado, mas são também possíveis variantes de 1-3 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448). Outras unidades de ligação que podem ser utilizadas para a presente invenção são descritas por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. O arranjo pode ser VL-unidade de ligação-VH ou VH-unidade de ligação-VL, sendo a primeira orientação a preferida. No caso de fragmentos Fab, os domínios variáveis da cadeia leve VL selecionados são fundidos com a região constante de uma cadeia kappa de Ig humana, enquanto os domínios variáveis da cadeia pesada VH adequados são fundidos com o primeiro domínio constante CHI (N-terminal) de uma IgG humana. Na extremidade C-terminal, forma-se uma ponte dissulfureto intercadeia entre os dois domínios constantes.

Assim, numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 8

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=i-5oWYQQKPGRAPKLLIY (X) n=i-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n=i-50 WVRQAPGKGLEWVG (X) n=i-soRFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR (X) n=1-50WGQGTLVTVSS

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 9

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n«i-soWYQQRPGKAPKLLIY (X) n=i_50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-soFGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n«1-50 WVRQAPGKGLEWVG (X) n«i-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR AEDTAVYYCAR (X) n»i-5oWGQGT'LVTVSS

Numa forma de realização preferida, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 10 (34rFWl.4_VL_K50R_DHP):

SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFSTGDRYAFGQGTKLTVLGGG :GG:$:GGpSÍGG:Í!GÕGG$Mgi^ESS;G£STO QAFGKGLEWGCIYGDNDlTPLYAlSIWAKGRFTISRDTSKlSiTVYLQMNSLRAEDTATy

YCAREGmDYlYDEPSÉGTTVTVSiS

Numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a cadeia leve variável: SEQ ID NO. 11: região estrutural da cadeia leve variável de FW1.4 (KI27)

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=l-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=l-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=l-50 FGQGTKLTVLG

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a cadeia leve variável: SEQ ID NO. 12: região estrutural da cadeia leve variável substituída de FWl.4

EIVMTQS PSTLSASVGDRVIITC(X)n=l-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=l-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=l-50 FGQGTKLTVLG

Ainda noutra forma de realização preferida, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 13

EIVMTQS PSTLSASVGDRVI ITC (X) n=i-soWYQQRPGKAPKLLIY (X) n=i-so GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X)n=i-so FGQGTKLTVLG

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a cadeia leve variável (as CDRs estão sublinhadas): SEQ ID NO: 14:

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCOSSQgvyamMfcWYQQRPGKAPKLLiyQIMgaA

SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGamm^RYAFGQGTKLTVL

Assim, numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 15:

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n-i-soWYQQRPGKAPKLLIY (X) n~x~sc GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n-i-soFGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n=i-50 WVRQAPGKGLEWVG (X> n-i-soRFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR (X) n-i_5oWGQGTLVTVSS

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 15:

í X) n» : -so FGQGT KLTVLG GGGGSÒGGGSGGÓGSGGGGSE^ShSFSÔSGD^QBGfSÊRL&GT'#S (X;;

«VRQA PGRGIiíEíff G (X;) ft=iw.gôRFTl:SKDI SDR ;AE:pTA¥YYCftR Ç:X) Λ«.^.5#000ΤΒ¥Ι¥:$.3

Numa forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 17 (34rFWl.4_VL_K47R_DHP):

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQRPGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVR QAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATY YCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVS S

Ainda noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende a sequência: SEQ ID NO: 18 (34rFWl.4)

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVR QAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYANWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATY YCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS

Numa forma de realização, a VL de um anticorpo parental é ou compreende a SEQ ID NO: 11 ou a SEQ ID NO: 12 ou uma sequência que tem pelo menos 65% de identidade, mais preferencialmente, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Noutra forma de realização preferida, a VH do anticorpo parental é ou compreende a SEQ ID NO: 3 ou a SEQ ID NO: 4 uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

Um anticorpo da invenção que compreende uma modificação de redução da agregação compreende preferencialmente uma ou mais CDRs de um anticorpo de coelho. Como conhecido na técnica, as CDRs de coelho são diferentes das CDRs humanas ou de roedor: podem conter resíduos de cisteína que ficam ligadas por dissulfureto à região estrutural ou formam pontes S-S interCDR. Além do mais, frequentemente, as CDRs de coelho não pertencem a qualquer estrutura canónica anteriormente conhecida. A presente invenção também apresenta moléculas bivalentes e biespecíficas que compreendem um anticorpo anti-TNFa, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação a antigénio do mesmo, podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula funcional, e.g., outro péptido ou proteína (e.g., outro anticorpo ou ligando para um recetor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. O anticorpo da invenção pode ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multies-pecíficas que se ligam a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multies-pecíficas destinam-se também a estar abrangidas pelo termo "molécula biespecífica" como aqui utilizado. Os exemplos não limitativos de moléculas biespecíficas incluem um diacorpo, uma diacorpo de cadeia simples e um anticorpo tandem, como conhecido pelos especialistas na técnica. A fim de gerar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (e.g., por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, antigénios específicos de tumores ou específicos de agentes patogénicos, mimético de péptido ou ligação, de forma que resulte uma molécula biespecífica. Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira molécula de ligação que tem especificidade para TNFa e uma segunda molécula de ligação que tem especificidade para um ou mais epítopos alvo adicionais.

Numa forma de realização, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem uma especificidade de ligação de pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, e.g., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode ser também um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples como descrita em Ladner et al. Patente U.S. N.° 4,946,778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.

Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser utilizados nas moléculas biespecificas da invenção são os anticorpos monoclonais de murideo, quiméricos e humanizados.

As moléculas biespecificas da presente invenção podem ser preparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecifica pode ser gerada separadamente e, em seguida, conjugadas entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, pode utilizar-se uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação para conjugação covalente. Os exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), 3- (2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) e 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de sulfossuccini-midilo (sulfo-SMCC) (ver e.g., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de ligação sulfidrilo, por exemplo, através das regiões charneira da extremidade C-terminal das duas cadeias pesadas ou outros sítios, quer introduzidos natural ou artificialmente. Numa forma de realização particularmente preferida, a região charneira é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrilo, preferencialmente um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressadas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia simples que compreende um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Além disso, uma molécula biespecífica pode ser um scFv que se liga especificamente ao primeiro alvo, em que a VH e a VL do referido scFv são ligadas por uma unidade de ligação flexível que compreende um domínio que proporciona ligação específica a um segundo alvo. As unidades de ligação adequadas são descritas, por exemplo, no Pedido Internacional de Patente WO 2010/006454. Os métodos de preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5,260,203; Patente U.S. Número 5,455,030; Patente U.S. Número 4,881,175; Patente U.S. Número 5,132,405; Patente U.S. Número 5,091,513; Patente U.S. Número 5,476,786; Patente U.S. Número 5,013,653; Patente U.S. Número 5,258,498; e Patente U.S. Número 5,482,858. A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise por FACS, bioensaio (e.g., inibição do crescimento) ou por ensaio de imunotransferência. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse utilizando um reagente marcado (e.g., um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de TNF-anticorpo podem ser detetados utilizando e.g., um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a enzima que reconhece e liga-se especificamente aos complexos de anticorpo-TNF. Alternativamente, os complexos podem ser detetados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioativamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) ( ver, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, o qual é aqui incorporado por referência) . O isótopo radioativo pode ser detetado por meios tais como a utilização de um contador γ ou um contador de cintilação ou por autorradiografia.

Noutro aspeto, a invenção proporciona um método de produção dos anticorpos aqui descritos. Os métodos de produção de anticorpos com propensão reduzida para se agregar em solução como aqui proporcionados baseiam-se na observação surpreendente de que através da modulação da interação dos domínios de anticorpo entre a cadeia leve e cadeia pesada, se pode reduzir a propensão para agregação dos anticorpos, e que se pode prever de forma fidedigna as mutações de redução da agregação determinando a energia livre da interface VL/VH definida como a diferença entre a energia do anticorpo (tal como um scFv) e os domínios variáveis individuais. Como se mostra aqui, as substituições de redução da agregação que modulam a interação dos domínios de anticorpo através da diminuição da energia livre entre os domínios variáveis podem ser efetuadas sem afetar a estabilidade ou atividade de ligação do anticorpo.

Numa forma de realização, um método da invenção compreende os passos de: (i) proporcionar um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável (VL) e uma cadeia pesada variável (VH) ; (ii) identificar uma ou mais posições de resíduos que participa na interface entre a cadeia leve variável (VL) e a cadeia pesada variável (VH) do anticorpo; e (iii) modificar o anticorpo através da introdução de uma substituição na posição/posições de resíduo(s) identificada(s) de forma que a(s) substituição/ substituições reduzam a energia livre entre a VL e os domínios VH em pelo menos 0,5 kcal/mol, preferencialmente pelo menos 1,0 kcal/mol, e muito preferencialmente pelo menos 2,0 kcal/mol (i.e., a energia livre entre os domínios VL e VH com a substituição é pelo menos 0,5 kcal/mol menor do que a energia livre entre os domínios VL e VH correspondentes que não compreendem a substituição de amino-ácidos), reduzindo, desse modo, a propensão para agregação do anticorpo modificado em comparação com a de um anticorpo parental.

Como delineado acima, o anticorpo pode ser, por exemplo, um Fab, Fab', um F(ab) '2, Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento Fv, um diacorpo, um diacorpo de cadeia simples, um anticorpo tandem ou um anticorpo linear; numa forma de realização preferida, o anticorpo é um Fv de cadeia simples (scFv).

Numa forma de realização preferida, a identificação da uma ou mais posições de resíduos que participam na interface entre a cadeia leve variável e a cadeia pesada variável do anticorpo (i.e. passo (i i)) envolve a determinação da energia livre entre a interface VL-VH. Isto pode ser realizado utilizando programas de bioinformática comummente conhecidos. Um exemplo de um programa de bioinformática adequado é o CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics). A fim de determinar a energia livre entre a interface VL-VH, tipicamente, é proporcionada uma apresentação molecular completamente atómica da proteína. A energia livre da interface é a diferença de energia entre o anticorpo inteiro que compreende ambos os domínios variáveis VL e VH e a soma das energias dos domínios individuais no contexto de um método de solvente implícito. Isto envolve o cálculo de três energias únicas, (1) no anticorpo G(a); (2) na VL G (b) ; e (3) na VH G(c). Por conseguinte, a energia livre da interface é G interface = G(a) - G(b) - G(c)

Numa forma de realização, o método de solvente implícito é GBMV ou PBSA, como se conhece na técnica. A determinação de energia livre pode compreender ainda o passo de simulação de distribuição da carga da proteína. A referida distribuição da carga pode ser simulada com base em forças eletrostáticas ou de van der

Waals. A fim de determinar uma modificação adequada, pode escolher-se um ou mais resíduos de aminoácidos que participam na interface para substituição. Por exemplo, um modelo molecular da proteína que compreende a uma ou mais substituições (e.g., trocando um ou mais resíduos para alanina) nas posições selecionadas é gerado e é determinada a energia livre da interface da apresentação molecular substituída. Se a energia livre da interface do modelo molecular substituído é menor do que a energia livre da interface do modelo molecular inicial, o resíduo de aminoácido é selecionado para substituição. Dentro do contexto de CHARMm, as mutações podem ser construídas, por exemplo, com o protocolo Build Mutants. A uma ou mais substituições no modelo molecular podem ser nas posições que se sabe que estão, ou se suspeita que estejam, envolvidas na interface VL/VH.

Numa forma de realização é realizado um passo adicional de minimização de energia do modelo molecular que compreende a uma ou mais substituições na(s) posição/po-sições selecionada(s) na área em torno da(s) muta-ção/mutações. A referida área pode ser fixada em 10 Angstroms.

Numa forma de realização, uma posição de resíduo identificada para substituição é ocupada por um aminoácido carregado.

Um anticorpo produzido por um método da invenção pode compreender qualquer cadeia leve ou cadeia pesada variável adequada como conhecida na técnica, e compreende preferencialmente pelo menos uma CDR de um anticorpo de coelho. São aqui descritas certas cadeias leves e pesadas variáveis preferidas. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode compreender: uma região estrutural de anticorpo VL que tem pelo menos 65% de identidade, mais preferencialmente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, que compreende ainda arginina (R) na posição AHo 47 e/ou na posição AHo 50 da cadeia leve variável; e uma região estrutural de anticorpo VH que tem pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 3. A modificação da uma ou mais posições de resíduos é preferencialmente feita de acordo com os ensinamentos da PCT/CH2008/000285, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Resumidamente, para um determinado subtipo de anticorpo, certos aminoácidos estão presentes em posições de resíduos específicas da região estrutural de anticorpo. Por exemplo, a) para uma região variável da cadeia pesada da família VH3 humana, os aminoácidos preferidos são: (i) glutamina (Q) na posição de aminoácido 1 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (ii) glutamina (Q) na posição de aminoácido 6 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (iii) treonina (T) ou alanina (A) na posição de aminoácido 7 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (iv) alanina (A), valina (V) ou fenilalanina (F) na posição de aminoácido 89 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 78 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (v) arginina (R) , glutamina (Q) , isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) ou fenilalanina (F) na posição de aminoácido 103 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 89 utilizando a numeração de Kabat); b) para uma região variável da cadeia pesada da família VHla humana, os aminoácidos preferidos são: (i) ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 1 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (ii) ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 6 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (iii) leucina (L) na posição de aminoácido 12 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 11 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (iv) metionina (M) na posição de aminoácido 13 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 12 utilizando o sistema de numeração de Kabat) : (v) ácido glutâmico (E) ou glutamina (Q) na posição de aminoácido 14 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 13 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (vi) leucina (L) na posição de aminoácido 19 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 18 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (vii) isoleucina (I) na posição de aminoácido 21 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 20 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (viii) fenilalanina (F) , serina (S) , histidina (H) ou ácido aspártico (D) na posição de aminoácido 90 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 79 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (ix) ácido aspártico (D) ou glutamina (Q) na posição de aminoácido 92 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 81 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (x) glicina (G) , asparagina (N) ou treonina (T) na posição de aminoácido 95 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 82b utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (xi) treonina (T) , alanina (A) , prolina (P) ou fenilalanina (F) na posição de aminoácido 98 utilizando a numeração AHo (posição de aminoácido 84 utilizando a numeração de Kabat); c) para uma região variável da cadeia pesada da família VHlb humana, os aminoácidos preferidos são: (i) ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 1 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (ii) treonina (T) , prolina (P) , valina (V) ou ácido aspártico (D) na posição de aminoácido 10 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 9 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (iii) leucina (L) na posição de aminoácido 12 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 11 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (iv) valina (V) , arginina (R) , glutamina (Q) ou metionina (M) na posição de aminoácido 13 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 12 utilizando o sistema de numeração de Kabat): (v) ácido glutâmico (E) , arginina (R) ou metionina (M) na posição de aminoácido 14 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 13 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (vi) arginina (R), treonina (T) ou asparagina (N) na posição de aminoácido 20 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 19 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (vii) isoleucina (I), fenilalanina (F) ou leucina (L) na posição de aminoácido 21 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 20 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (viii) lisina (R) na posição de aminoácido 45 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 38 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (ix) treonina (T) , prolina (P) , valina (V) ou arginina (R) na posição de aminoácido 47 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 40 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (x) lisina (R) , histidina (H) ou ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 50 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 43 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (xi) isoleucina (I) na posição de aminoácido 55 utilizando a numeração AHo (posição de aminoácido 48 utilizando a numeração de Rabat); (xii) lisina (R) na posição de aminoácido 77 utilizando a numeração AHo (posição de aminoácido 66 utilizando a numeração de Rabat); (xiii) alanina (A), leucina (L) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 78 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 67 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (xiv) ácido glutâmico (E), treonina (T) ou alanina (A) na posição de aminoácido 82 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 71 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (xv) treonina (T) , serina (S) ou leucina (L) na posição de aminoácido 86 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 75 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (xvi) ácido aspártico (D), asparagina (N) ou glicina (G) na posição de aminoácido 87 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 76 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (xvii) asparagina (N) ou serina (S) na posição de aminoácido 107 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 93 utilizando o sistema de numeração de Kabat); d) para uma região variável da cadeia leve da família Vkappal humana, os aminoácidos preferidos são: (i) ácido glutâmico (E) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 1 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (ii) valina (V) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 3 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (iii) valina (V), leucina (L) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 4 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (iv) glutamina (Q) na posição de aminoácido 24 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (v) arginina (R) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 47 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 39 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (vi) arginina (R) , ácido glutâmico (E) treonina (T), metionina (M) ou glutamina (Q) na posição de aminoácido 50 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 42 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (vii) histidina (H) , serina (S) ou fenilalanina (F) na posição de aminoácido 57 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 49 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (viii) fenilalanina (F) na posição de aminoácido 91 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 73 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (ix) valina (V), serina (S), glicina (G) ou isoleucina (I) na posição de aminoácido 103 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 85 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e) para uma região variável da cadeia leve da família Vkappa3 humana, os aminoácidos preferidos são: (i) treonina (T) na posição de aminoácido 2 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (ii) treonina (T) na posição de aminoácido 3 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (iii) isoleucina (I) na posição de aminoácido 10 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (iv) tirosina (Y) na posição de aminoácido 12 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (v) serina (S) na posição de aminoácido 18 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (vi) alanina (A) na posição de aminoácido 20 utilizando o sistema de numeração AHo ou de

Kabat; (vii) metionina (M) na posição de aminoácido 56 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 48 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (viii) valina (V) ou treonina (T) na posição de aminoácido 74 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 58 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (ix) asparagina (N) na posição de aminoácido 94 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 76 utilizando o sistema de numeração de Kabat); (x) tirosina (Y) ou serina (S) na posição de aminoácido 101 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 83 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (xi) leucina (L) ou alanina (A) na posição de aminoácido 103 utilizando a numeração AHo (posição de aminoácido 85 utilizando a numeração de Kabat) ; f) para uma região variável da cadeia leve da família Vlambdal humana, os aminoácidos preferidos são: (i) leucina (L) , serina (S) ou ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 1 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (ii) alanina (A), prolina (P), isoleucina (I) ou tirosina (Y) na posição de aminoácido 2 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Kabat; (iii) valina (V) ou metionina (M) na posição de aminoácido 4 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (iv) ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 7 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (v) alanina (A) na posição de aminoácido 11 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (vi) treonina (T) ou serina (S) na posição de aminoácido 14 utilizando o sistema de numeração AHo ou de Rabat; (vii) histidina (H) na posição de aminoácido 46 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 38 utilizando o sistema de numeração de Rabat) ; (viii) treonina (T) , serina (S), asparagina (N), glutamina (Q) ou prolina (P) na posição de aminoácido 53 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 45 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (ix) arginina (R) ou glutamina (Q) na posição de aminoácido 82 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 66 utilizando o sistema de numeração de Rabat); (x) glicina (G) , treonina (T) ou ácido aspártico (D) na posição de aminoácido 92 utilizando o sistema de numeração AHo (posição de aminoácido 74 utilizando o sistema de numeração de Kabat); e/ou (xi) valina (V), treonina (T) , histidina (H) ou ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 103 utilizando a numeração AHo (posição de aminoácido 85 utilizando a numeração de Kabat).

Por conseguinte, as substituições efetuadas no presente método seguem preferencialmente os ensinamentos da PCT/CH2008/000285. A determinação do subtipo é conhecida pelo especialista na técnica.

Numa forma de realização, um método da invenção compreende a modificação de um anticorpo na posição AHo 47 e/ou 50 da cadeia leve variável, em particular de uma cadeia leve variável Vkappal. Preferencialmente, o anticorpo é modificado para compreender arginina (R) na posição AHo 47 e/ou na posição AHo 50 da cadeia leve variável. Nalgumas formas de realização, a lisina (K) está substituída por arginina (R) na posição AHo 47 e/ou posição AHo 50 da cadeia leve variável. Como os anticorpos da invenção podem compreender modificações adicionais, com-soante desejado, os métodos da invenção podem compreender o passo adicional de modificar o anticorpo tal como para compreender Serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo); Serina (S) ou Treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e/ou Serina (S) ou Treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo). Adicionalmente, o anticorpo pode ser modificado para compreender Serina (S) ou Treonina (T) na posições 97, 98 e/ou 99 da cadeia pesada (numeração AHo). Preferencialmente, o método compreende o passo de modificar o anticorpo para compreender Serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo), Treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e Treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo). A invenção proporciona ainda um método para gerar um anticorpo humanizado com uma propensão baixa para se agregar em solução, em que o método compreende a seleção de uma região estrutural da cadeia leve variável que compreende arginina (R) na posição AHo 47 e/ou na posição AHo 50. O método pode compreender ainda a seleção de uma região estrutural da cadeia pesada variável que compreende uma serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo); serina (S) ou treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e/ou serina (S) ou treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo). Numa forma de realização, uma região estrutural identificada com base em critérios de seleção escolhidos pode ser ainda modificada com uma modificação de redução da agregação da invenção. Por exemplo, se é identificada uma região estrutural da cadeia leve variável que tem uma arginina (R) na posição 50, o resíduo na posição AHo pode estar substituído com um aminoácido diferente, tal como arginina (R), ou se é identificada uma cadeia pesada variável que tem uma serina (S) na posição AHo 12, os resíduos nas posições AHo 103 e 144 podem estar substituídos com treoninas.

Como aqui utilizado, um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que compreende CDRs não humanas e sequências estruturais das cadeias pesadas variáveis humanas ou derivadas de humanos e/ou cadeias leves variáveis humanas ou derivadas de humanos. A humanização de anticorpos é bem conhecida na técnica. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende pelo menos um, e preferencialmente seis, CDRs de um anticorpo produzido num coelho ou selecionadas de uma biblioteca de CDRs.

As regiões estruturais de anticorpos variáveis podem ser selecionadas, por exemplo, de uma base de dados (tal como a base de dados de Kabat, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank/), VBASE (http ://vbase.mrc-cpe. cam.ac.uk/), VBASE2 (http://www.vbase2.org/), A Base de Dados de Kabat de Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico (http://www.kabatdatabase.com/index.html), a Fonte de Proteínas Universal (UniProt; http://pir.georgetown.edu/), e a Base de Dados Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abs/), com base na identidade e/ou semelhança com as sequências estruturais variáveis do anticorpo das quais as CDRs provêm, ou com base na(s) sequência(s) estrutu-ral/estruturais preferida(s) de outro modo.

Estão disponíveis vários programas de computador para pesquisar sequências estruturais humanas adequadas que cumprem o(s) requisito(s) selecionado(s). Por exemplo, "KabatMan" é uma versão pesquisável por computador dos dados de sequência de anticorpo de Rabat do livro Sequences of Immunological Interest. 0 programa KabatMan encontra-se descrito no artigo: Martin (1996) Accessing the Rabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25, 130-133, e está disponível em http ://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html e http://www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html. A base de dados Abysis, na http://www.bioinf.org.uk/abysis/, integra dados da sequência de Rabat, IMGT e a PDB com dados estruturais da PDB. Proporciona uma interface aponte-e-clique exaustiva que permite pesquisar os dados de sequência em vários critérios e apresentam resultados em diferentes formatos. Para dados da PDB, as pesquisas de sequências podem ser combinadas com constrangimentos estruturais.

Noutro aspeto, a invenção proporciona um anticorpo gerado pelo método aqui divulgado. Numa forma de realização preferida, o referido anticorpo compreende uma região estrutural de anticorpo VL que tem pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13; preferencialmente, o anticorpo compreende arginina (R) na posição AHo 47 e/ou na posição AHo 50 da cadeia leve variável.

Adicional ou alternativamente, a região estrutural de anticorpo VH é ou compreende a SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, mais preferencialmente 99% com a SEQ ID NO: 3.

Em certas formas de realização, a invenção proporciona ainda: (1) Um método para reduzir a propensão para agregação de um anticorpo que é um complexo heterodimérico que compreende domínios variáveis pesados e leves, em que o método compreende os passos de: (a) proporcionar uma apresentação molecular completamente atomística do anticorpo; (b) determinar a energia livre da interface entre ambos os domínios; (c) escolher um ou mais resíduos de aminoácidos que participam na interface para substituição proporcionando um modelo molecular do anticorpo que compreende a uma ou mais substituições nas posições selecionadas e determinando a energia livre da interface da apresentação molecular substituída; (d) selecionar um resíduo de aminoácido para substituição se a energia livre da interface do modelo molecular substituído é inferior à energia livre da interface do modelo molecular inicial; (2) Um método de (1), em que a energia livre da interface é determinada calculando a diferença de energia entre o complexo e a soma das energias dos domínios individuais no contexto de um método de solvente implícito; (3) 0 método de (2), em que o solvente é GBMV ou PBSA; (4) 0 método de qualquer um dos (1)-(3) anteriores, que compreendem ainda o passo de (i) simular a distribuição de carga da proteína, em que o referido passo é realizado dentro do passo a e b; (5) 0 método de (4) , em que a distribuição de carga é simulada com base em forças eletrostáticas ou de van der Waals; (6) 0 método de qualquer um dos (1)-(5) anteriores, em que o passo (c) compreende o passo adicional de minimização de energia na área em torno da mutação; (7) 0 método de qualquer um dos (1)-(7) anteriores, em que o anticorpo é um fragmento variável de cadeia simples (scFv).

Os anticorpos da invenção podem ser gerados utilizando técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Conhecendo as sequências dos polipéptidos, os ADNcs que as codificam podem ser gerados através de síntese de genes por métodos bem conhecidos na técnica. Estes ADNcs podem ser clonados em plasmídeos vetores adequados.

Pode utilizar-se técnicas de clonagem e mutagénese padrão bem conhecidas pelo especialista na técnica para ligar unidades de ligação, recombinar domínios de forma aleatória ou construir fusões para a produção de fragmentos Fab. Os protocolos básicos gue divulgam os métodos gerais desta invenção são descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed. 2001) e em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999). A sequência de ADN que alberga um gene que codifica um polipéptido scFv, ou no caso de fragmentos Fab, que codifica qualquer um dos dois genes separados ou um operão bicistrónico que compreende os dois genes para as fusões VL-Ck e VH-CHl são clonados num vetor de expressão adequado, preferencialmente um com um promotor induzível. Deve ter-se cuidado para que na frente de cada gene esteja presente um sítio de ligação de ribossoma apropriado que assegure a tradução. Deve entender-se que os anticorpos da presente invenção compreendem as sequências divulgadas, em vez de consistir nas mesmas. Por exemplo, as estratégias de clonagem podem exigir que seja feita uma construção a partir da qual esteja presente um anticorpo com um ou alguns resíduos adicionais na extremidade N-terminal. Especificamente, a metionina derivada do codão de iniciação pode estar presente na proteína final em casos onde não foi dissociada após tradução. A maioria das construções para os anticorpos scFv dá origem a uma alanina adicional na extremidade N-terminal. Numa forma de realização preferida da presente invenção, é escolhido um vetor de expressão para expressão periplasmática em E. coli (Krebber, 1997). 0 referido vetor compreende um promotor na frente de uma sequência sinal dissociável. A sequência codificante para o péptido do anticorpo é em sequida fundida em qrelha com a sequência sinal dissociável. Isto permite o direcionamento do polipéptido expressado para o periplasma bacteriano, onde a sequência sinal é dissociada. 0 anticorpo é em sequida dobrado. No caso dos fraqmentos Fab, ambos os péptidos de fusão VL-Ck e VH-CHl devem ser ligados a um sinal de exportação. A ligação S-S covalente é formada nas cisteinas C-terminais, depois de os péptidos terem atingido o periplasma. Se é preferida a expressão citoplasmática de anticorpos, os referidos anticorpos podem ser geralmente obtidos em altos rendimentos a partir de corpos de inclusão, os quais podem ser facilmente separados de outros fragmentos celulares e proteína. Neste caso, os corpos de inclusão são solubilizados num agente desnaturante tal como e.g. cloridrato de guaridina (GndHCl) e, em seguida, redobrados por procedimentos de renaturação bem conhecidos pelos especialistas na técnica.

Os plasmídeos que expressam os polipéptidos scFv ou Fab são introduzidos num hospedeiro adequado, preferencialmente uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero, muito preferencialmente uma estirpe de E. coli adequada como, por exemplo, JM83 para expressão periplasmática ou BL21 para expressão em corpos de inclusão. 0 polipéptido pode ser colhido do periplasma ou dos corpos de inclusão e purificado utilizando técnicas convencionais, tais como cromatografia de troca iónica, cromatografia de fase inversa, cromatografia de afinidade e/ou filtração em gel, conhecidas pelo especialista na técnica.

Os anticorpos da invenção podem ser caracterizados com respeito ao rendimento, solubilidade e estabilidade in vitro. Por exemplo, as capacidades de ligação para o TNF, preferencialmente para o TNFa humano, podem ser testadas in vitro por ELISA ou ressonância plasmónica de superfície (BIACore), utilizando TNF humano recombinante como se descreve na W09729131, permitindo o último método também determinar a constante de velocidade k0ff, que deveria se preferencialmente inferior a 10_3s_1. São preferidos valores de Kd ^10 nM.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona anticorpos que ligam o TNFa e, desse modo, são adequados para bloquear a função do TNFa in vivo. Numa forma de realização particular, o anticorpo anti-TNFa compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 17.

Para aplicações terapêuticas, os anticorpos anti-TNF da invenção são administrados a um mamífero, preferencialmente um humano, numa forma de dosagem farmaceu-ticamente aceitável, tal como aquelas discutidas acima, incluindo aquelas que podem ser administradas a um humano por via intravenosa como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um intervalo de tempo, por exemplo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica, intraocular, intranasal, ótica, sublingual, trans-dérmica ou por inalação. Os anticorpos também são administrados de modo adequado pelas vias intratumoral, peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais, assim como sistémicos.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definida acima, da gravidade e progressão da doença, se o anticorpo é administrado para fins profiláticos ou terapêuticos, da terapia anterior, dos antecedentes clínicos do doente e da resposta ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao doente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Os anticorpos anti-TNF da invenção são úteis no tratamento de doenças mediadas por TNF. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 yg/kg a cerca de 50 mg/kg (e.g., 0,1-20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao doente, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária ou semanal típica pode variar desde cerca de 1 yg/kg a cerca de 20 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais longas, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas de doença. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. 0 progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais, incluindo, por exemplo, imagiologia radiográfica de tumores.

De acordo com outra forma de realização da invenção, a eficácia do anticorpo na prevenção ou tratamento de doença pode ser melhorada administrando o anticorpo sucessivamente ou em associação com outro agente que é eficaz para aqueles fins, tal como o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), um anticorpo capaz de inibir ou neutralizar a atividade angiogénica do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) ácido ou básico, ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um anticorpo capaz de inibir ou neutralizar as atividades coagulantes do fator tecidular, proteína C ou proteína S (ver Esmon et al., Publicação de Patente PCT N.° WO 91/01753, publicada em 21 de fevereiro de 1991), um anticorpo capaz de se ligar ao recetor HER2 (ver Hudziak et al., Publicação de Patente PCT N.° WO 89/06692, publicada em 27 de julho de 1989), ou um ou mais agentes terapêuticos convencionais tais como, por exemplo, agentes alquilantes, antagonistas de ácido fólico, antimetabolitos do metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatina, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazole ou corticosteroides. Esses outros agentes podem estar presentes na composição a ser administrada ou podem ser administrados separadamente. Da mesma forma, o anticorpo é adequadamente administrado sucessivamente ou em associação com tratamentos radioló-gicos, quer envolvam irradiação ou a administração de substâncias radioativas.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida, tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. 0 anticorpo imobilizado é posto em contacto com uma amostra que contém uma proteína alvo (ou fragmento da mesma) que o anticorpo liga, tal como TNF no caso de anticorpos anti-TNFa, a ser purificada, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto a proteína alvo, a qual se liga ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que libertará a proteína alvo do anticorpo.

Os anticorpos podem ser também úteis em ensaios de diagnóstico para uma proteína alvo, e.g., deteção da sua expressão em células, tecidos ou soros específicos. Tais métodos de diagnóstico podem ser úteis no diagnóstico de cancro.

Para aplicações em diagnóstico, o anticorpo será tipicamente marcado com uma unidade detetável. Encontram-se disponíveis numerosas etiquetas que podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 1:L1In, "Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S. 0 anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando, por exemplo, as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nova Iorque, N.Y., Pubs. (1991) e a radioatividade pode ser medida utilizando contagem por cintilação. (b) Encontram-se disponíveis etiquetas fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho de Texas. As etiquetas fluorescentes podem ser conjugadas com o anticorpo utilizando, por exemplo, as técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, supra. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorómetro. (c) Encontram-se disponíveis várias etiquetas enzima-substrato e a Pat. U.S. N.° 4,275, 149 proporciona uma revisão de algumas daquelas. A enzima catalisa geralmente uma alteração química do substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, a qual pode ser medida espetrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. As técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode em seguida emitir luz que pode ser medida (utilizando, por exemplo, um quimioluminómetro) ou doar energia a um aceitador fluorescente. Os exemplos de etiquetas enzimáticas incluem luciferases (e.g., luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; Pat. U.S. N.° 4,737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato-desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano-silvestre (HRPO), fosfa-tase alcalina, .beta.-galactosidase, glucoamilase, liso-zima, sacárido-oxidases (e.g., glicose-oxidase, galactose-oxidase, e glicose-6-fosfato-desidrogenase) , heterocíclico-oxidases (tais como uricase- e xantina-oxidase) , lactope-roxidase, microperoxidase e semelhantes. As técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym.. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nova Iorque, 73:147-166 (1981). Os exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano-silvestre (HRPO) com hidrogénio-peroxidase como um substrato, em que a hidrogénio-peroxidase oxida um precursor de corante (e.g., ortofenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (e.g., P-nitrofenil-β-Ό-galactosidase) ou substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-.beta.-D-galactosidase.

Encontra-se disponível um grande número de outras combinações enzima-substrato para os especialistas na técnica. Para uma revisão geral daquelas, ver Pat. U.S. N.° 4,275,149 e 4,318,980. Por vezes, a etiqueta está conjugada indiretamente com o anticorpo. O especialista estará consciente de várias técnicas para conseguir isto. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três grandes categorias de etiquetas mencionadas acima pode ser conjugada com avidina ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente à avidina e, desse modo, a etiqueta pode ser conjugada com o anticorpo desta maneira indireta. Alternativamente, para conseguir conjugação indireta da etiqueta com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um hapteno pequeno (e.g., digoxina) e um dos tipos diferentes de etiquetas mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (e.g., anticorpo antidigoxina). Assim, pode conseguir-se uma conjugação indireta da etiqueta com o anticorpo.

Em certas formas de realização, um anticorpo não tem de estar marcado e a presença do mesmo pode ser detetada utilizando um anticorpo marcado, o qual se liga a um anticorpo alvo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como os ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Os ensaios de ligação competitiva baseiam-se na capacidade de um padrão marcado para competir com o analito da amostra de ensaio para se ligar a uma quantidade limitada de anticorpo. Por exemplo, a quantidade de proteína TNF na amostra de ensaio é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, os anticorpos estão geralmente insolubilizados antes ou após a competição, para que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

Os ensaios em sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogénica, ou epítopo, diferente da proteína a ser detetada. Num ensaio em sanduíche, o analito da amostra de ensaio é ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado sobre um suporte sólido e, depois disso, um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo de três partes insolúvel. Ver, e.g., Pat. U.S. N.° 4,376,110. O segundo anticorpo pode estar ele mesmo marcado com uma unidade detetável (ensaios em sanduíche diretos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que estás marcado com uma unidade detetável (ensaio em sanduíche indireto) . Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a unidade detetável é uma enzima.

Para imuno-histoquímica, a amostra de tecido, tal como uma amostra de tumor, pode ser fresca ou congelada ou pode estar embutida em parafina e fixa com um conservante tal como, por exemplo, formalina.

Os anticorpos podem ser também utilizados para ensaios de diagnóstico de tumores in vivo. Em geral, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo (tal como inIn, "Tc, 14C, 1311, 125I, 3H, 32P ou 35S) para que o tumor possa ser localizado utilizando imunocintigrafia.

Um anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado num kit, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar o ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo está marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores necessários pela enzima (e.g., um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detetável). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos tais como estabilizantes, tampões (e.g., um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar muito para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizem substancialmente a sensibilidade do ensaio. Em particular, os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, geralmente liofilizados, incluindo excipientes que ao serem dissolvidos proporcionarão uma solução reagente com a concentração apropriada. A invenção proporciona ainda formulações farmacêuticas que compreendem um ou mais anticorpos da invenção para fins terapêuticos. Numa forma de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-TNF para o tratamento de doenças mediadas por TNF. 0 termo "formulação farmacêutica" refere-se a preparações que estão numa forma de maneira a permitir que a atividade biológica do anticorpo seja inequivocamente eficaz e que não contêm componentes adicionais que sejam tóxicos para os indivíduos aos quais a formulação seria administrada. Excipientes (veículos, aditivos) "farmaceuticamente aceitáveis" são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um indivíduo mamífero para proporcionar uma dose eficaz do ingrediente ativo utilizado.

Uma formulação "estável" é uma em que o anticorpo na mesma retém essencialmente a sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica durante o armazenamento. Na técnica estão disponíveis várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína e são revistas, por exemplo, em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993) . A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada durante um intervalo de tempo selecionado. Preferencialmente, a formulação é estável à temperatura ambiente (cerca de 30 °C) ou a 40 °C durante pelo menos 1 mês e/ou estável a cerca de 2-8 °C durante pelo menos 1 ano, durante pelo menos 2 anos. Além disso, a formulação é preferencialmente estável após congelação (a, e.g., -70 °C) e descongelação da formulação.

Um anticorpo "retém a sua estabilidade física" numa formulação farmacêutica se não apresenta sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação após exame visual da cor e/ou limpidez, ou como medida por dispersão de luz UV ou por cromatografia de exclusão molecular.

Um anticorpo "retém a sua estabilidade química" numa formulação farmacêutica, se a estabilidade química num determinado momento é tal que se considera que a proteína continua a reter a sua atividade biológica como definida abaixo. A estabilidade química pode ser avaliada detetando e quantificando formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver modificação do tamanho (e.g. corte) que pode ser avaliada utilizando, por exemplo, cromatografia de exclusão molecular, SDS-PAGE e/ou dessorção-ionização por laser assistidas pela matriz/espe-trometria de massa de tempo de voo (MALDI/TOF MS). Outros tipos de alteração química incluem alteração da carga (e.g. que ocorre como consequência de desamidação) que pode ser avaliada, por exemplo, por cromatografia de troca iónica.

Um anticorpo "retém a sua atividade biológica" numa formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo num determinado momento se encontra dentro de cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica apresentada no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada, como determinada, por exemplo, num ensaio de ligação de antigénio. Outros ensaios de "atividade biológica" para anticorpos são descritos a seguir.

Por "isotónico" entende-se que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As formulações isotónicas terão geralmente uma pressão osmótica desde cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida utilizando, por exemplo, um osmómetro tipo pressão de vapor ou congelação.

Um "poliol" é uma substância com múltiplos grupos hidroxilo e inclui açúcares (açúcares redutores e não redutores), açúcar-álcoois e açúcar-ácidos. Os polióis aqui preferidos têm um peso molecular que é inferior a cerca de 600 kD (e.g. na gama desde cerca de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é um que contém um grupo hemiacetal que pode reduzir iões metálicos ou reagir covalentemente com lisina e outros grupos amino em proteínas e um "açúcar não redutor" é um que não tem estas propriedades de um açúcar redutor. Os exemplos de açúcares redutores são a frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. Os açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. 0 manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerol são exemplos de açúcar-álcoois. No que se refere a açúcar-ácidos, estes incluem L-gluconato e sais metálicos dos mesmos. Sempre que se pretenda que a formulação seja estável à congelação-descongelação, o poliol é preferencialmente um que não cristaliza às temperaturas de congelação (e.g. -20 °C) de forma que desestabilize o anticorpo na formulação. Os açúcares não redutores incluem, mas não se limitam a, sacarose e trealose.

Como aqui utilizado, "tampão" refere-se a uma solução tamponada que resiste a alterações no pH, pela ação dos seus componentes conjugados ácido-base. O tampão desta invenção tem um pH na gama desde cerca de 4,5 a cerca de 7,0; preferencialmente desde cerca de 4,8 a cerca de 6,5. Os exemplos de tampões que controlarão o pH nesta gama incluem acetato (e.g. acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões à base de ácidos orgânicos. Quando se deseja uma formulação estável à congelação-descongelação, preferencialmente o tampão não é fosfato.

Num sentido farmacológico, no contexto da presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo refere-se a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para cujo tratamento o anticorpo é eficaz. Uma "doença/distúrbio" é qualquer condição que beneficiaria do tratamento com o anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crónicos e agudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

Um "conservante" é um composto que pode ser incluído na formulação para reduzir essencialmente a ação bacteriana na mesma, facilitando, desse modo, a produção de, por exemplo, uma formulação de utilização múltipla. Os exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio em que os grupos alquilo são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como fenol, álcool butílico e benzílico, alquilparabenos tais como metil- ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol. 0 conservante aqui muito preferido é o álcool benzílico. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um ou mais anticorpos, em conjunto com pelo menos um veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, um ou mais de água, tampões (e.g., soro fisiológico tamponado neutro ou soro fisiológico tamponado com fosfato), etanol, óleo mineral, óleo vegetal, dimetilsulfóxido, hidratos de carbono (e.g., glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, adjuvantes, polipéptidos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa e/ou conservantes. Como assinalado acima, outros ingredientes ativos podem ser (mas não têm de ser) incluídos nas composições farmacêuticas aqui proporcionadas.

Um veículo é uma substância que pode ser associada a um anticorpo antes da administração a um doente, frequentemente para controlar a estabilidade ou biodisponibilidade do composto. Os veículos para utilização em tais formulações são geralmente biocompatíveis e podem ser também biodegradáveis. Os veículos incluem, por exemplo, moléculas monovalentes ou multivalentes tais como albumina sérica (e.g., humana ou bovina), albumina de ovo, péptidos, polilisina e polissacáridos tais como aminodextrano e poliamidoaminas. Os veículos incluem também materiais de suporte sólido tais como esférulas e micropartícuias que compreendem, por exemplo, polilactato, poliglicolato, poli(lactídeo-co-glicolídeo) , poliacrilato, látex, amido, celulose ou dextrano. Um veículo pode suportar os compostos de uma diversidade de maneiras, incluindo ligação covalente (quer diretamente ou através de um grupo de ligação), interação não covalente ou mistura.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração apropriada, incluindo, por exemplo, administração ocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica, tópica, oral, nasal, retal ou parentérica. Em certas formas de realização, são preferidas composições numa forma adequada para utilização oral. Essas formas incluem, por exemplo, pílulas, comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou qranulados dispersáveis, emulsão, cápsulas duras ou moles, ou xaropes ou elixires. Ainda dentro de outras formas de realização, as composições aqui proporcionadas podem ser formuladas como um pó liofilizado. 0 termo parentérica como aqui utilizado inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (e.g., intravenosa), intramuscular, espinal, intracraniana, intratecal e intraperitoneal, assim como qualquer técnica de injeção ou infusão semelhante.

Em certas formas de realização, um anticorpo da invenção pode ser administrado diretamente ao olho por injeção no tecido ocular, tal como injeção periocular, conjuntival, subtenon, intracâmera, intravitrea, intrão-cular, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar ou intracanalicular; por aplicação direta ao olho utilizando um cateter ou outro dispositivo de aplicação tal como um pastilha retiniana, inserção intraocular, supositório ou um implante que compreende um material poroso, não poroso ou gelatinoso; por gotas ou pomadas oculares tópicas; ou por um dispositivo de libertação lenta no "fundo do saco" ou implantado adjacente à esclerótica (transesclerotical) ou na esclerótica (intraesclerotical) ou dentro do olho. A injeção intracâmera pode ser através da córnea para a câmara anterior para permitir que o agente atinja a rede trabecular. A injeção intracanalicular pode ser nos canais coletores venosos que drenam o canal de Schlemm ou para o canal de Schlemm.

Para administração oftálmica, um anticorpo da invenção pode ser combinado com conservantes, cossolventes, tensioativos, melhoradores da viscosidade, potenciadores de penetração, tampões, cloreto de sódio ou água oftalmo-logicamente aceitável para formar uma suspensão ou solução aquosa oftálmica estéril. Os produtos oftálmicos tópicos podem ser embalados, por exemplo, na forma de múltiplas doses. Podem ser assim necessários conservantes necessários para prevenir a contaminação microbiana durante a utilização. Os conservantes adequados incluem: clorobu-tanol, metilparabeno, propilparabeno, álcool feniletilico, edetato dissódico, ácido sórbico, poliquatérnio-1 ou outros agentes conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais conservantes são tipicamente utilizados a um nível desde 0,001 a 1,0% p/v. As composições de dose unitária da presente invenção serão estéreis, mas tipicamente não conservadas. Por conseguinte, em geral, essas composições não conterão conservantes.

Em certas formas de realização, as composições que se destinam a ser administradas por via tópica ao olho são formuladas como colírios ou pomadas oftálmicas, em que a quantidade total de anticorpo será de cerca de 0,001 a 1,0% (p/p). Preferencialmente, a quantidade de anticorpo contra o TNFa é de cerca de 0,01 a cerca de 1,0% (p/p).

Em certas circunstâncias, as composições da invenção serão administradas como soluções para administração tópica. As soluções aquosas são geralmente preferidas, com base na facilidade de formulação, assim como na capacidade de um doente administrar facilmente essas composições por meio de instilação de uma a duas gotas das soluções nos olhos afetados. No entanto, as composições podem ser também suspensões, geles viscosos ou semivis-cosos, ou outros tipos de composições sólidas ou semissólidas.

As composições que se destinam a utilização oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para o fabrico de composições farmacêuticas e podem conter um ou mais agentes, tais como edulcorantes, aromatizantes, corantes e conservantes para proporcionar preparações apelativas e agradáveis ao paladar. Os comprimidos contêm o ingrediente ativo em mistura com excipientes fisiologicamente aceitáveis que são adequados para o fabrico de comprimidos. Esses excipientes incluem, por exemplo, diluentes inertes (e.g., carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio) , agentes de granulação e desintegrantes (e.g., amido de milho ou ácido algínico), aglutinantes (e.g., amido, gelatina ou goma-arábica) e lubrificantes (e.g., estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco). Os comprimidos podem não estar revestidos ou podem estar revestidos por técnicas conhecidas por retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, desse modo, proporcionam uma ação sustentada ao longo de um período mais longo. Por exemplo, pode utilizar-se um material de retardamento tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo.

As formulações para utilização oral podem ser também apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (e.g., carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino), ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso (e.g., óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite). As suspensões aquosas contêm o anticorpo em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Esses excipientes incluem agentes de suspensão (e.g., carboxi-metilcelulose sódica, metilcelulose, hidropropilmetilce-lulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanta e goma-arábica); e dispersantes ou humectantes (e.g., fosfatídeos naturais tais como lecitina, produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos tais como estearato de polioxietileno, produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa tais como heptadecaetilenooxicetanol, produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol tais como monooleato de polietileno sorbitano). As suspensões aquosas podem compreender também um ou mais conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de etilo ou n-propilo, um ou mais corantes, um ou mais aromatizantes, e um ou mais edulcorantes, tais como sacarose ou sacarina. Os xaropes e elixires podem ser formulados com edulcorantes, tais como glicerol, propileno glicol, sorbitol ou sacarose. Essas formulações podem compreender também um ou mais demulcentes, conservantes, aromatizantes e/ou corantes.

As suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo os ingredientes ativos num óleo vegetal (e.g., óleo de amendoim, azeite, óleo de sésamo ou óleo de coco) ou num óleo mineral tal como parafina liquida. As suspensões oleosas podem conter um espessante tal como cera de abelha, parafina dura ou álcool cetilico. Podem ser adicionados edulcorantes, tais como aqueles descritos acima, e/ou aromatizantes para proporcionar preparações orais agradáveis ao paladar. Essas suspensões podem ser conservadas pela adição de um antioxidante tal como ácido ascórbico.

Os pós e granulados dispersiveis adequados para preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um dispersante ou humectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. 0 dispersante ou os humectantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles já mencionados acima. Podem estar também presentes excipientes adicionais, por exemplo edulcorantes, aromatizantes e corantes.

As composições farmacêuticas podem estar também na forma de emulsões de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal (e.g., azeite ou óleo de amendoim), um óleo mineral (e.g., parafina liquida), ou uma mistura dos mesmos. Os emulsionantes adequados incluem gomas naturais (e.g., goma-arábica ou goma tragacanta), fosfatídeos naturais (e.g., soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e hexitol), anidridos (e.g., monooleato de sorbitano), e produtos de condensação de ésteres parciais derivados de ácidos gordos e hexitol com óxido de etileno (e.g., monooleato de polioxietileno sorbitano). Uma emulsão pode compreender também um ou mais edulcorantes e/ou aromatizantes. A composição farmacêutica pode ser preparada como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril, na qual o modulador, dependendo do veiculo e concentração utilizados, está suspenso ou dissolvido no veículo. Uma tal composição pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida utilizando dispersantes, humectantes e/ou agentes de suspensão adequados, tais como aqueles mencionados acima. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados encontram-se a água, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, podem ser utilizados óleos fixos estéreis como um solvente ou meio de suspensão. Para este efeito pode ser utilizado qualquer óleo fixo brando, incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Além disso, podem ser utilizados ácidos gordos, tais como ácido oleico, na preparação de composições injetáveis, e podem ser dissolvidos adjuvantes tais como anestésicos locais, conservantes e/ou agentes tampão no veiculo.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações de libertação sustentada (i.e., uma formulação tal como uma cápsula que efetua uma libertação lenta do modulador após administração). Essas formulações podem ser geralmente preparadas utilizando tecnologia bem conhecida e administradas, por exemplo, por implantação oral, retal ou subcutânea, ou por implantação no sitio alvo desejado. Os veículos para utilização nessas formulações são biocompatíveis e podem ser também biodegradáveis; preferencialmente a formulação proporciona um nível relativamente constante de libertação do modulador. A quantidade de um anticorpo contido numa formulação de libertação sustentada depende, por exemplo, do sítio de implantação, da velocidade e duração de libertação esperadas e da natureza da doença/distúrbio a ser tratado ou prevenido.

Os anticorpos anti-TNFa aqui proporcionados podem ser administrados numa quantidade que consegue uma concentração num fluido corporal (e.g., sangue, plasma, soro, CSF, líquido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lágrimas ou urina) que é suficiente para se ligar de forma detetável ao TNF e prevenir ou inibir doenças/distúrbios mediados por TNF. Uma dose é considerada eficaz se resulta num benefício discernível para o doente como aqui descrito. As doses sistémicas preferidas variam desde cerca de 0,1 mg a cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por doente por dia), sendo as doses orais geralmente cerca de 5-20 vezes superiores às doses intravenosas. A quantidade de anticorpo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. As formas de unidade de dosagem conterão geralmente entre desde cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.

Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas podem ser embaladas para tratar condições sensíveis a um anticorpo dirigido contra o TNF. As composições farmacêuticas embaladas podem incluir um recipiente que contém uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo como aqui descrito e instruções (e.g., rótulo) que indica que a composição contida é para ser utilizada para tratar uma doença/distúrbio sensível a um anticorpo após administração no doente.

Os anticorpos da presente invenção podem ser também modificados quimicamente. Os grupos de modificação preferidos são polímeros, por exemplo um polímero de polialceno, polialcenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada, opcionalmente substituído, ou um polissacárido ramificado ou não ramificado. Esse grupo efetor pode aumentar a semivida do anticorpo in vivo. Os exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol) (PEG), poli(propilenoglicol), poli (álcool vinílico) de cadeia linear ou ramificada, opcionalmente substituídos, ou seus derivados. Os polímeros naturais particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogénio ou seus derivados. 0 tamanho do polímero pode ser modificado consoante desejado, mas situar-se-á geralmente numa gama de peso molecular médio desde 500 Da a 50 000 Da. Para aplicação local, onde o anticorpo é concebido para penetrar no tecido, um peso molecular preferido do polímero é de cerca de 5000 Da. A molécula de polímero pode ser ligada ao anticorpo, por exemplo à extremidade C-terminal da cadeia pesada de um fragmento Fab através de um péptido charneira ligado covalentemente como descrito na WO0194585. No que se refere à fixação de unidades PEG, faz-se referência a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, New York.

Após preparação do anticorpo de interesse como descrito acima, é preparada a formulação farmacêutica que o compreende. 0 anticorpo a ser formulado não foi submetido a liofilização prévia e a formulação de interesse aqui é uma formulação aquosa. Preferencialmente, o anticorpo na formulação é um fragmento de anticorpo, tal como um scFv. A quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo presente na formulação é determinada tendo em consideração, por exemplo, os volumes de dose e o(s) modo(s) de administração desejados. Uma concentração de anticorpo ilustrativa na formulação é desde cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, preferencialmente desde cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 25 mg/mL e muito preferencialmente desde cerca de 2 mg/mL a cerca de 10 mg/mL. É preparada uma formulação aquosa que compreende 0 anticorpo numa solução a pH tamponado como descrito acima. A concentração de tampão pode ser desde cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, preferencialmente desde cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação.

Um poliol, que atua como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, é incluído na formulação. Em formas de realização preferidas, a formulação não contém uma quantidade tonificante de um sal tal como cloreto de sódio, já que este pode provocar a precipitação do anticorpo e/ou pode resultar em oxidação a pH baixo. Em formas de realização preferidas, o poliol é um açúcar não redutor, tal como sacarose ou trealose. O poliol é adicionado à formulação numa quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Preferencialmente, a formulação aquosa é isotónica, em cujo caso as concentrações adequadas do poliol na formulação situam-se, por exemplo, na gama desde cerca de 1% a cerca de 15% p/v, preferencialmente na gama desde cerca de 2% a cerca de 10% p/v. No entanto, as formulações hipertónicas ou hipotónicas podem ser também adequadas. A quantidade de poliol adicionada pode variar também em função do peso molecular do poliol. Por exemplo, pode ser adicionada uma quantidade menor de um monossacárido (e.g. manitol), em comparação com um dissacárido (tal como trealose).

Pode ser também adicionado um tensioativo à formulação de anticorpos. Os tensioativos ilustrativos incluem tensioativos não iónicos tais como polissorbatos (e.g. polissorbatos 20, 80 etc) ou poloxâmeros (e.g. poloxâmero 188) . Tipicamente, a quantidade de tensioativo adicionada é de tal forma que reduz a agregação do anticorpo/derivado de anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Por exemplo, o tensioativo pode estar presente na formulação numa quantidade desde cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, preferencialmente desde cerca de 0,005% a cerca de 0,2% e muito preferencialmente desde cerca de 0,01% a cerca de 0,1%.

Numa forma de realização, uma formulação contém os agentes identificados acima (i.e. anticorpo, tampão, poliol e tensioativo) e está essencialmente livre de um ou mais conservantes, tais como álcool benzilico, fenol, m-cresol, clorobutanol e Cl de benzetónio. Noutra forma de realização, um conservante pode ser incluído na formulação, particularmente quando a formulação é uma formulação de doses múltiplas. A concentração de conservante pode situar-se na gama desde cerca de 0,1% a cerca de 2%, muito preferencialmente desde cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais de outros veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006), podem ser incluídos na formulação na condição de não afetarem desfavoravelmente as características desejadas da formulação. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os recetores às dosagens e concentrações utilizadas e incluem; agentes tampão adicionais; cossolventes; antioxi-dantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos de metais (e.g. complexos de proteína-Zn); polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; e/ou contraiões que formam sais tais como sódio.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes ou após, preparação da formulação. A formulação é administrada a um mamífero que necessita de tratamento com o anticorpo, preferencialmente um humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolus ou por infusão continua ao longo de um intervalo de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação, ou outras vias como aqui descritas. Em certas formas de realização, a formulação é administrada ao mamífero por administração intravenosa. Para tais fins, a formulação pode ser injetada, por exemplo, utilizando uma seringa ou através de uma linha IV. A dosagem apropriada ("quantidade terapeu-ticamente eficaz") do anticorpo dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da gravidade e curso da condição, se o anticorpo é administrado para fins profiláticos ou terapêuticos, da terapia anterior, dos antecedentes clínicos do doente e resposta ao anticorpo, do tipo de anticorpo utilizado e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao doente de uma única vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrado ao doente em qualquer altura a partir do diagnóstico. 0 anticorpo pode ser administrado como o único tratamento ou em conjunto com outros fármacos ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.

Como uma proposta geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo administrada situar-se-á na gama de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do doente, quer por uma ou mais administrações, sendo a gama típica de anticorpo utilizado, por exemplo, de cerca de 0,3 a cerca de 20 mg/kg, mais preferencialmente cerca de 0,3 a cerca de 15 mg/kg, administrados diariamente. No entanto, outros regimes posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas convencionais.

Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-TNFa da invenção são administradas a um doente que sofre de um distúrbio mediado por TNF.

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um artigo de fabrico que compreende um recipiente que contém a formulação farmacêutica aquosa da presente invenção e proporciona opcionalmente instruções para a sua utilização. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e seringas. O recipiente pode ser constituído por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. Um recipiente ilustrativo é um frasco de vidro de 3-20 cc de utilização única. Alternativamente, para uma formulação de doses múltiplas, o recipiente pode ser um frasco de vidro de 3-100 cc. O recipiente contém a formulação e a etiqueta sobre, ou associada a, o recipiente pode indicar instruções para a utilização. O artigo de fabrico pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de utilização. A menos que requerido de outro modo pelo contexto, os termos no singular aqui utilizados devem incluir multiplicidades e os termos no plural devem incluir o singular.

EXEMPLOS A presente divulgação é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais não devem ser interpretados como adicionalmente limitativos.

Ao longo dos exemplos foram utilizados os seguintes materiais e métodos, salvo indicação em contrário.

Materiais e Métodos Gerais

Em geral, a prática da presente invenção utiliza, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, imunologia (especialmente, e.g., tecnologia de anticorpo), e técnicas convencionais de preparação de polipéptidos. Ver, e.g., Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996);

Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Medições de termoestabilidade

Os espetros de IV com transformadas de Fourier de refletância total atenuada (FTIR-ATR) foram obtidos para várias cadeias simples e moléculas de seguimento utilizando a célula FT-IR Bio-ATR num Tensor Bruker. As moléculas foram concentradas até 3 mg/mL e submetidas a diálise de um dia para o outro a 4 °C contra PBS, pH 6,5 e o fluxo de tampão não retido foi recolhido como branco. Os perfis de desnaturação foram obtidos desafiando termicamente as moléculas com uma grande gama de temperaturas em passos de 5 °C (25 a 95 °C). Todas as manipulações de espetros foram realizadas utilizando o software OPUS. Os fundos do tampão principal e da atmosfera transitória (CO2 e H2O) foram subtraídos do espetro da proteína. 0 espetro de proteína resultante foi em seguida corrigido à linha de base e os espetros de amida I da proteína foram determinados a partir da largura do pico resolvido mais largo na região esperada. Foram obtidos espetros de segunda derivada para os espetros da banda de amida I utilizando uma função polinomial de terceiro grau com uma função de alisamento. As alterações na estrutura da proteína foram estimadas pela análise da segunda derivada da amida I utilizando uma curva de calibração linear para os cálculos de ajuste de curva iniciais assumindo 0% de desnaturação para as 3 medições mais baixas e 100% de desnaturação para as 3 medições mais altas. Os perfis de desnaturação foram utilizados para determinar aproximadamente os pontos médios das transições de desdobramento térmico (TM) para cada variante aplicando o modelo sigmoide de Boltzmann.

Medições de solubilidade A solubilidade relativa de várias moléculas de scFv foi medida depois de melhorar a agregação e precipitação da proteína na presença de sulfato de amónio. O sulfato de amónio foi adicionado à proteína em soluções aquosas para produzir incrementos de 5% de saturação na mistura final sal-proteína. A precipitação na gama dinâmica foi determinada empiricamente e os intervalos de saturação reduzidos nesta gama para intervalos de 2,5% de saturação na mistura final. Após adição de sulfato de amónio, as amostras foram misturadas suavemente e centrifugadas 30 minutos a 6000 rpm. A proteína remanescente nos sobrena-dantes foi recuperada para cada percentagem de sulfato de amónio de saturação. As curvas de solubilidade foram determinadas medindo a concentração de proteína no sobrenadante utilizando o Espetrofotómetro NanoDropTM 1000. As medições da proteína solúvel remanescente nos sobrena-dantes foram normalizadas e utilizadas para estimar os pontos médios de solubilidade relativa para cada variante aplicando o modelo sigmoide de Boltzmann.

Teste de Estabilidade de Curto Prazo A proteína foi examinada, após duas semanas de incubação a 40 °C, para agregados solúveis e produtos de degradação. As proteínas com uma concentração de 10 mg/mL foram submetidas a diálise de um dia para o outro a 4 °C contra PBS com uma grande gama de pHs (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,5). A proteína de controlo com a mesma concentração em tampão PBS padrão (pH 6,5) foi armazenada a -80 °C durante o período de 2 semanas. A determinação das bandas de degradação por SDS-PAGE foi efetuada aos pontos no tempo t=0 e t=14d e os agregados solúveis foram avaliados na SEC-HPLC. A determinação da atividade remanescente após 2 semanas a 40 °C foi efetuada utilizando Biacore. EXEMPLO 1

Otimização do anticorpo scFv anti-TNFa, 34rFW1.4, para reduzir a agregação O anticorpo 34rFWl.4 exibe uma propensão para agregação dependente de pH em solução. O anticorpo 578rFWl.4 (ver Pedido Internacional WO2009155724), que compartilha a mesma estrutura da região estrutural que o 34rFWl.4, não exibe propensão para agregação. Foram gerados modelos de homologia para identificar os resíduos potenciais no 34rFWl.4 que poderiam ser modificados para reduzir a sua propensão para agregação como se segue.

As sequências dos domínios variáveis foram utilizadas para construir modelos de homologia do anticorpo 34rFWl.4 e do anticorpo 578rFWl.4. Para gerar os modelos, foram utilizadas pesquisas baseadas no algoritmo BLAST para identificar estruturas de cadeia molde para as sequências dos domínios variáveis da cadeia leve (VL) e da cadeia pesada (VH) para cada anticorpo separadamente. A BLOSUM80 (matriz para alinhamentos menos divergentes) foi utilizada como a matriz para os alinhamentos devido à alta conservação das regiões estruturais nos anticorpos. Foram selecionadas cadeias molde individuais para cada cadeia (VL/VH) que exibem, mais de 70% de identidade com as sequências de consulta. O programa MODELER do software Discovery Studio versão 2.5.5 (DS 2.5.5) (Accelrys, Inc., San Diego, CA) foi utilizado para gerar 100 modelos de scFv com base nas cadeias molde de domínios variáveis identificados. Os alinhamentos das sequências dos anticorpos de referência para serem modelados com as estruturas das cadeias molde foram utilizados como dados de entrada. Foram gerados 100 modelos que continham todos átomos diferentes de hidrogénio. As estruturas dos melhores modelos foram selecionadas com base numa pontuação de energia física PDF (Função de Densidade de Probabilidade). A orientação relativa do domínio VH e VL foi ajustada para coincidir com a da estrutura da cadeia molde do domínio variável com a homologia mais alta com ambas as sequências (VL e VH) modeladas. As conformações alternativas no modelo foram removidas, foram adicionadas extremidades e foram adicionados os átomos em falta da cadeia lateral. Foi aplicado o CHARMM forcefield aos modelos de scFv e submetidos a 2000 ciclos de minimização de energia utilizando um Gradiente de RMS de 0,01 e o Born Generalizado com Volume Molecular (GBMV) como modelo de solvente implícito.

Foram realizados cálculos de ionização da proteína e pK dos resíduos para cada um dos anticorpos. Os cálculos foram efetuados utilizando a implementação do protocolo incluída no Discovery Studio versão 2.5.5 (DS 2.5.5), com base na teoria desenvolvida por Bashford e Karplus, 1991. Os resultados dos cálculos de ionização da proteína e pK dos resíduos foram comparados para as duas moléculas em termos de pKi/2 das cadeias laterais e curvas de titulação de cada resíduo titulável, incluindo Asp, Glu, Arg, Lys, His, Tyr, Cys, os resíduos N-terminais e C-terminais dos anticorpos.

Foi aplicado o CHARMM forcefield aos modelos de scFv e protonados a pH 7,4, as curvas de titulação e os pKs dos resíduos individuais foram calculados na gama de pH 2 até pH 14 utilizando passos de pH de 0,2. Dois resíduos de Lys conservados nas posições 47 e 50 na cadeia leve do anticorpo 578rFWl.4 diferiam em comparação com a Lys naquelas posições no 34rFWl.4 (ver Figura 1).

Introdução de substituições preferidas 0 software Discovery Studio foi utilizado para realizar simulações de dinâmica molecular para prever mutações que melhoram a afinidade de interação entra a VL e a VH, impedindo desse modo que os domínios se separem e formem oligómeros e ou agregados de ordem superior. A estabilidade da interface VL/VH do anticorpo 34rFWl.4 foi estimada como termos de energia como energia livre G. Foi utilizada uma adaptação do protocolo CHARMM (também incluído no DS 2.5.5) para calcular a diferença de energia entre o complexo heterodimérico scFv completo e a soma das energias de cada um dos domínios variáveis individuais. Os cálculos foram efetuados no contexto de um método de solvente implícito que utiliza a integração de Born Generalizada com Volume Molecular (GBMV). As energias de ambos os domínios e do complexo foram calculadas, e o resultado foi determinado como a diferença em energia entre o complexo e a soma dos domínios individuais de acordo com o seguinte cálculo: G interface = G(a) - G(b) - G(c), em que G(a) é a energia do anticorpo, G(b) é a energia da VL, e G(c) é a energia da VH. A arginina (R) foi selecionada como uma substituição de resíduo possível para lisina (K) nas posições 47 e 50, uma vez que o valor de pKa da cadeia lateral para R (12,5) é superior ao pKa de K (10,5). Foram gerados mutantes K47R e K50R substituindo R por K individualmente nas respetivas posições. Foram realizados 2000 ciclos de minimização de energia para resíduos a 10

Angstroms ou mais próximos da área em torno da mutação para permitir que as novas moléculas modelo se adaptassem à alteração. 0 modelo de solvente implícito para estes ciclos de minimização de energia foi o GBMV. A delta G média prevista para os mutantes foi de -94 kcal/mol. Por conseguinte, estimou-se que a contribuição das mutações era de 4 kcal/mol em comparação com o anticorpo scFv anti-TNF parental.

Exemplo 2

Análise de Estabilidade do Anticorpo 34rFW1.4

Otimizado

Foram gerados o mutante K50R e o mutante K47R no anticorpo 34rFWl.4 (que é divulgado no Pedido Internacional N.° WO2009/155723 apresentado em 25 de junho de 2009). Outro mutante de 34rFWl.4 com substituições adicionais para reduzir a sua imunogenicidade in vivo foi preparado de acordo com os métodos descritos na Patente US US8796425. Em particular, o terceiro mutante, designado 34rFWl.4_VLK50R_DHP, continha uma serina (S) na posição 12 da cadeia pesada (numeração AHo), uma treonina (T) na posição 103 da cadeia pesada (numeração AHo) e uma treonina (T) na posição 144 da cadeia pesada (numeração AHo) . Foram realizados estudos de estabilidade dos anticorpos parental e 34rFW1.4 mutante sob condições aceleradas como se segue. O anticorpo 34rFWl.4, 34rFWl.4_VL_K50R mutante e 34rFWl.4_VLK50R_DHP foram concentrados até 20, 40 e

60 mg/mL em formulação de soro fisiológico tamponado com fosfato (Na2HP04 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) e incubados 2 semanas a 40 °C. Os anticorpos 34rFW1.4 e 34rFWl.4_K47R foram concentrados até 20 e 60 mg/mL em formulação de soro fisiológico tamponado com fosfato (Na2HP04 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) e incubados 2 semanas a 40 °C. Amostras antes e após 14 dias de incubação foram analisadas para a degradação utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com 12,5% de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) sob condições redutoras e não redutoras. A cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-HPLC) foi utilizada para determinar o teor de monómero e de agregados solúveis das amostras antes e após o período de incubação. Os monómeros foram resolvidos das espécies não monoméricas numa coluna TSKgel Super SW2000 (TOSOH Bioscience) e a percentagem de proteína monomérica foi calculada como a área do pico do monómero dividida pela área total de todos os picos de produtos. Os resultados dos estudos para o 34rFWl.4 e o 34rFWl.4_VLK50R_DHP são mostrados nas Figuras 2A-B, 3A-B e 4A-B, respetivamente. Os resultados para o 34rFWl.4_VL_K50R são mostrados nas Figuras 5B, 6B e 7B. Estas experiências demonstraram que o 34rFWl.4_VLK50R_DHP tinha uma propensão reduzida para agregação em comparação com o 34rFWl.4. O 34rFWl.4_K47R mutante também demonstrou uma redução desse tipo como se mostra nas Figuras 8B e 9B.

Além disso, a estabilidade térmica e as afinidades de ligação dos anticorpos 34rFWl.4 e 34rFWl.4_VLK50R_DHP foram comparadas. Os resultados demonstraram que as mutações efetuadas para gerar o anticorpo 34rFWl.4_VLK50R_DHP não afetaram a estabilidade ou atividade de ligação relativamente ao anticorpo 34rFWl.4 parental.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> ESBATech, uma Alcon Biomedical Research Unit LLC Borras, Leonardo Urech, David <120> ANTICORPOS ESTÁVEIS E SOLÚVEIS <130> 3921 US <160> 18 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido Sintético <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> x pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <4 0 0> 1

Glu lie val Met Thr Gin ser Pro Ser Thr teu Ser Ala ser val Gly 15 10 15 asd Arg val He lie Thr Cys Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa 35 40 45

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Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 100 105 110 <210> 3 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (26) . . (75) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (90)..(139) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (172)..(221) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 3

Glu vai Gin Leu Vai Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser cys Thr Ala Ser Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa 20 25 30

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Glu Vai Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu ser Cys Thr Vai Ser Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 3V xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 45

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Glu Vai Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly ser vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

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Glu lie vai Met Thr Gin ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala ser Val Gly 15 10 15

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<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (341)..(390) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (423)..(483) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 9

Glu lie vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

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Gly Leu Gin Trp Val Gly cys rle Tyr Gly Asp Asn Asp lie Thr Pro 180 IS5 190

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Asp Leu Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser 245 250 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <4 0 0> 11

Glu lie vai «et Thr Gin ser Pro ser Thr Leu ser Ala ser vai Gly 1 S 10 15

Asp Arg Vai lie lie Thr cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa ZO 25 30 xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa 35 40 45

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Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 85 90 95 xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 100 105 110

Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa 115 120 125

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly vai Pro ser Arg Phe 130 135 140

Ser Gly Ser Gly ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr ile Ser ser Leu 145 150 155 160

Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175

Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 180 185 190

Xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 195 200 205 xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Phe Gly Gin Gly 210 215 220

Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 225 230 <210> 12 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 12

Glu lie Val Met Thr Gin ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser val Gly 15 10 15

Asp Arg Val lie lie Thr Cys xaa Xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 35 40 45 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 50 55 60

Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly 65 70 75 80

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa 85 90 95

Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa 100 105 110 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 115 120 125

Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Gly val Pro Ser Arg Phe 130 135 140

Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu 145 150 155 160

Gin pro Asp Asp phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa xaa xaa xaa xaa xaa 165 170 175 xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa 180 185 190 xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Phe Gly Gin Gly 210 215 220

Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 225 230 <210> 13 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido Sintético <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 13

Glu lie vai Met Thr Gin ser Pro Ser Thr Leu ser Ala ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg val lie lie Thr cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 45

Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 50 55 60 xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly 65 70 75 80 lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 100 105 110

Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa 115 120 125 xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Gly val Pro Ser Arg Phe 130 135 140

Ser Gly ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie ser Ser Leu 145 150 155 160

Gin Pro A$p Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa 165 170 175

Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa 180 185 190 xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 195 200 205 xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Phe Gly Gin Gly 210 215 220

Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 225 230 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <4 0 0> 14

Glu He val Met Thr Gin ser pro ser Thr Leu ser Ala Ser val Gly 15 10 15

Asp Arg Val lie lie Thr cys Gin ser ser Gin Ser val Tyr Gly Asn 20 25 30 lie Trp Met Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gin Ala ser Lys Leu Ala ser Gly val Pro Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser ser Leu 65 70 75 80

Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gly Asn Phe Asn Thr 85 90 95

Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110 <210> 15 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (277)..(326) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (341)..(390) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (423)..(483) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 15

Glu lie vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg vai lie lie Thr Cys Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 35 40 45

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Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa 165 170 175 xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa xaa 180 185 190

Xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 195 200 205 xaa xaa xa. xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa rhe sly «1» ^ 210 2Vy

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Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 val Tyr Tyr Cys Ala Arg xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa 420 425 430 xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 435 440 445

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Val ser ser <210> 16 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido Sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (24)..(73) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (89)..(138) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (171)..(220) <223> x pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (277)..(326) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (341)..(390) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (423)..(483) <223> X pode ser qualquer aminoácido natural, pode estar presente pelo menos um e até 50 aminoácidos <400> 16

Glu lie Vai Met Thr Gin ser Pro ser Thr teu ser Ala ser vai Gly 15 10 15 asp Arg Vai lie lie Thr Cys Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 45 xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa $0 55 60 xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Trp ryr Gin Gin Arg pro Gly 65 70 75 80

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Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys xaa xaa Xãa xaa xaa xaa 165 170 175 xaa Xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa : ' 180' ' 185....... ' 190

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Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 val Tyr Tyr cys Ala Arg xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 420 425 430 xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 435 440 445 xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 450 455 460 xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr 465 470 475 480

Val Ser Ser <210> 17 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético <4 0 0> 17

Glu He Val Met Thr Gin ser Pro Ser Thr Leu ser Ala ser val Gly 1 5 10 15

Asp Arg val lie lie Thr Cys Gin Ser ser Gin Ser val Tyr Glv Asn 20 25 36 lie Trp Met Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu 35 40 45

Leu He Tyr Gin Ala Ser Lys Leu Ala ser Gly val Pro ser Arq Phe 50 55 60 ser Gly ser Gly ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu 65 70 7$ 80

Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gly Asn phe Asn Thr 85 90 95

Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 100 105 no

Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu val Girt Leu val Glu ser Gly Gly Gly Ser val 130 135 140

Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu ser cys Thr Ala ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 lie ser Arg Ser Tyr Trp lie cys Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys 165 170 175

Gly Leu Glu Trp val Gly cys lie Tyr Gly Asp Asn Asp lie Thr Pro 180 185 190

Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Thr 195 200 205

Ser Lys Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 . 235 240

Asp Leu Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser ser 245 250 <210> 18 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido Sintético

Glu lie vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu ser Ala ser val Gly 1 5 10

Asp Arg val lie He Thr Cys Gin Ser Ser Gin Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 lie Trp Met Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40

Leu lie Tyr Gin Ala ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 ser Gly ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75

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Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 3 115 120 12b

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Ser Val 130 135 140

Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu Ser cys Thr Ala ser Gly Phe Thr" 145 150 ; 155 16U lie Ser Arg ser Tyr Trp lie cys Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 165 . 170 175

Gly Leu Glu Trp Val Gly Cys lie Tyr Gly Asp Asn Asp lie Thr Pro 180 185 3.90

Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr 195 200 205

Ser Lys Asn Thr val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASP 210 215 220

Thr Ala Thr Tyr Tyr cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 235 24

Asp Leu Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val ser ser 245 250

Lisboa, 22 de Fevereiro de 2018

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo que se liga especif icamente ao TNFa humano, que compreende: a) uma cadeia leve variável que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 14; e b) uma cadeia pesada variável que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5.
2. 2. Anticorpo da reivindicação 1, que tem ainda uma unidade de ligação que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7.
3. 3. Anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 17.
4. 4. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Composição farmacêutica da reivindicação 4 para utilização no tratamento de uma doença mediada por TNFa.
6. 6. Composição farmacêutica da reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a doença mediada por TNFa é uma afeção ocular selecionada do grupo que consiste em uveite, doença de Bechet, retinite, olho seco, glaucoma, sindrome de Sjõrgen, neuropatia diabética, esclerite, degenerescência macular relacionada com a idade e queratite.
7. 7. Composição farmacêutica da reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a composição farmacêutica é para ser administrada por administração ocular, intranasal, ótica, sublingual, transdérmica, tópica, oral, nasal, retal ou parentérica.
8. 8. Composição farmacêutica da reivindicação 7 para a utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a composição farmacêutica é para ser administrada numa única ou em doses divididas que compreendem 0,1 a 100 mg do anticorpo.
9. 9. Composição farmacêutica da reivindicação 7 para a utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a doença mediada por TNFa é uveite, e a composição farmacêutica é administrada por via tópica a um olho do indivíduo.
10. 10. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo da reivindicação 1.
11. 11. Vetor que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 10.
12. 12. Célula hospedeira que compreende o vetor da reivindicação 11
13. 13. Anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo é um Fab, Fab', um F(ab) '2, Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento Fv ou um anticorpo linear.
14. 14. Molécula bivalente ou biespecifica que compreende o anticorpo da reivindicação 1. Lisboa, 22 de Fevereiro de 2018