PT2318029T

PT2318029T - Polipéptidos de g-csf bovino modificados e suas utilizações

Info

Publication number: PT2318029T
Application number: PT98009319T
Authority: PT
Inventors: Maria A Hays Putnam Anna; C Canning Peter; Knudsen Nick; Norman Thea; Koder Alan; Kraynov Vadim; Ho Lillian
Original assignee: Ambrx Inc; Lilly Co Eli
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2018-01-10
Also published as: JP2011529060A; BRPI0916515B8; IL210265A; WO2010011735A2; AU2009274076C1; EP3225248B1; EP2318029B1; CN102159230A; WO2010011735A3; US20230348547A1; BRPI0916515B1; CA2729851C; MX2011000859A; CN106928339A; EP3225248A1; EA019968B1; ES2963062T3; AR072967A1; ZA201101166B; US11542310B2

Description

DESCRIÇÃO

"POLIPÉPTIDOS DE G-CSF BOVINO MODIFICADOS E SUAS UTILIZAÇÕES"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a polipéptidos do fator de estimulação de colónias de granulócitos bovino (bG-CSF) opcionalmente modificados com pelo menos um aminoácido não codificado naturalmente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O impacto económico de doenças infecciosas na produção de animais produtores de alimentos encontra-se bem documentado. As doenças infecciosas reduzem os lucros, aumentam os custos de produção e colocam em risco os produtos alimentares, assim como afetam o desempenho, saúde e bem-estar do animal. As doenças podem reduzir o rendimento e qualidade do leite, que resultam em grandes perdas económicas para os produtores de leite e produtores de carne bovina, particularmente quando em alguns casos as doenças microbianas infecciosas provocam morbidade e mortalidade de animais recém-nascidos, jovens (e.g., animais de substituição) ou adultos. Duas dessas doenças, a mastite e a doença respiratória bovina (BRD), podem ter efeitos devastadores na produção de animais produtores de alimentos. A mastite é definida como uma inflamação da glândula mamária. Pode afetar qualquer mamífero, por exemplo vacas, ovelhas e cabras. A mastite bovina é uma infeção do úbere de ruminantes tais como vacas, principalmente provocada por bactérias gram-positivas e gram-negativas e, especialmente, em vacas em unidades de produção de leite intensivas. A infeção bacteriana resulta na inflamação da glândula mamária (i.e. tetos e úbere). Os animais podem tornar-se mais suscetíveis a mastite devido a uma função microbicida de neutrófilos enfraquecida durante o período periparturiente. A doença é particularmente problemática e de importância económica considerável, porque o agente patogénico é facilmente transferido de um animal para outro durante o processo de ordenha. Frequentemente, desenvolve-se nas primeiras semanas em torno da parturição e pode recorrer com cada lactação. Alguns dos microrganismos patogénicos principais que originam mastite bovina são Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis,

Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. Ver também Bovine Mastitis, editado por Glenys Bloomfield, V&O Publications 1987. Estes microrganismos invadem o úbere através do canal do teto e produzem inflamação do tecido produtor de leite, que origina a formação de tecido cicatricial que, uma vez formado, pode originar uma redução permanente na produção de leite da vaca. Uma infeção pode alterar também a composição, quantidade, aspeto e qualidade do leite. Os agentes patogénicos que provocam mastite dividem-se em duas categorias, nomeadamente, contagiosos e ambientais. As bactérias contagiosas, tais como streptococcus agalactiae e staphylococcus aureus, colonizam principalmente sítios de tecido hospedeiro tais como glândulas mamárias, canais dos tetos e lesões da pele do teto; e são espalham-se de uma vaca infetada para outra durante o processo de ordenha. As bactérias ambientais, frequentemente estreptococos, enterococos e organismos coliformes, estão geralmente presentes nas zonas circundantes da vaca a partir de fontes tais como fezes de vaca, solo, material vegetal, camas ou água; e infetam por contacto oportunista casual com um animal. A distinção entre agentes patogénicos contagiosos e ambientais, embora não seja exclusiva, é de importância prática, uma vez que são necessárias diferentes medidas de manutenção do rebanho leiteiro para os diferentes grupos de microrganismos. Em todos os casos de mastite bovina, qualquer que seja o microrganismo causador, a via de transmissão do agente patogénico invasor para a glândula interna do úbere é através do orifício do teto e canal do teto. As fontes comuns de microrganismos prejudiciais incluem equipamento de ordenha não higienizado, o ordenhador, outros animais mastíticos, um ambiente de estábulo insalubre e os processos de eliminação (defecação/micção) dos próprios animais.

Existe uma variedade de formas ou tipos de mastite bovina, com gravidade e sintomatologia variáveis, incluindo os seguintes: (1) Infeção do úbere: A invasão da cavidade do úbere por microrganismos que se multiplicam dentro da glândula e provocam inflamação; (2) Mastite não clinica ou subclínica; A forma de mastite em que não há tumefação da glândula ou anomalia observável no leite, embora existam alterações no leite que podem ser detetadas por testes específicos. Este tipo de mastite é de longe a mais prevalecente e provoca a maior perda total na maioria das manadas. É frequentemente referida como mastite "oculta": (3) Mastite clínica; A forma de mastite em que são observáveis condições anormais do úbere e secreção. A mastite clínica ligeira envolve alterações no leite tais como flocos, coágulos e um aspeto aguado ou invulgar. 0 calor e sensibilidade do úbere são ligeiros ou estão ausentes, mas podem haver sinais de tumefação. A mastite clínica grave envolve um aparecimento súbito com tumefação do quarto infetado que está quente, duro e sensível. 0 leite parece anormal e produção de leite cai. Por vezes, além dos efeitos locais no úbere, a própria vaca fica doente. Existem sinais de febre, pulsação rápida, depressão, fraqueza e perda de apetite. A combinação destas condições é frequentemente referida como mastite sistémica aguda, porque não só o úbere, mas o todo o animal está afetado; e (4) Mastite crónica; A forma de mastite provocada por uma infeção persistente do úbere que existe a maioria das vezes na forma não clínica, mas pode ocasionalmente desenvolver-se numa forma clínica ativa. Após estes "surtos" a forma não clínica regressa geralmente de forma temporária. (Ver, em geral, Current Concepts of Bovine Mastitis, publicado por The National Mastitis Council, Inc., 2nd Ed. 1978 na p.5.) A mastite continua a originar grandes perdas económicas à indústria de laticínios. A mastite afeta a rentabilidade de uma rebanho de várias maneiras, tanto direta como indiretamente, incluindo: (1) perda de produção de leite; (2) maiores taxas de abate de vacas infetadas; (3) menor valor do leite; (4) leite rejeitado após tratamento com antibiótico; (5) custos veterinários (antibióticos e visitas do veterinário); e (6) mortes. (Bovine Mastitis, Glenys Bloomfield, supra, na p.33.)

Outra doença comum que afeta a indústria de gado bovino é a febre dos transportes (doença respiratória bovina ou BRD). A BRD tem sido referida por alguns como um "complexo patológico" por duas razões: é geralmente provocada por uma variedade de agentes patogénicos, tanto virais como bacterianos, que interagem entre si para produzir doença totalmente desenvolvida, e porque o comportamento dos agentes patogénicos pode seguir um processo sequencial que, passo a passo, resulta em animais doentes. Os agentes patogénicos bacterianos são uma das causas melhor conhecidas da sindrome aguda. Os agentes patogénicos bacterianos podem invadir o aparelho respiratório bovino depois de este ter sido comprometido por uma infeção virai e outros fatores, tais como o stress de desmame, transporte, alteração de alimentação e variação na temperatura e humidade ambiente, podem preceder e contribuir para a infeção. Em muitos casos, isto acumula com a exposição do gado a agentes patogénicos durante o transporte quando é misturado com gado de outra origem em camiões, currais e estábulos de leilão, o que resulta numa alta incidência da doença em gado fornecido ao parque de engorda. Várias espécies de bactérias foram isoladas e associadas a BRD, e algumas das mais comuns são Mannhemia haemolytica, Pasteurella multocida e (ou) Histophilus somni. A Haemophilus somnus é um agente patogénico virulento que provoca septicemia no gado bovino e, por vezes, as manifestações resultantes são referidas como "complexo de Haemophilus somnus," do qual uma forma é a doença respiratória, podendo vírus tais como rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), diarreia virai bovina (BVD) e vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) estar também envolvidos no aparecimento de um complexo de BRD, abrindo frequentemente a porta para infeções bacterianas secundárias.

Uma vez que é praticamente impossível eliminar estes organismos do ambiente, o complexo de BRD deve ser abordado do ponto de vista da prevenção de que estes agentes causadores de doenças se instalem, e da deteção e tratamento de casos clínicos de forma tão rápida e eficaz quanto possível. As doenças respiratórias são uma causa importante de perda por doença no gado bovino para abate. E geralmente reconhecido que a causa final de morte na maioria dos casos de febre dos transportes é uma pneumonia bacteriana (geralmente pasteurella). A Pasteurella haemolytica, particularmente do tipo IA, é a bactéria mais comum isolada a partir de casos de doença respiratória na América do Norte. A vacinação contra alguns dos agentes infecciosos envolvidos na febre dos transportes é, por vezes, útil, mas as vacinas disponíveis e eficazes destina-se apenas a um número reduzido dos agentes que se sabe que estão implicados no complexo patológico. A terapia com antibióticos tem sido uma componente importante da estratégia de controlo da mastite e BRD. A Patente U.S. N.° 7,182,948, aqui na sua totalidade, indica que foi demonstrado que os banhos medicamentosos antimicrobianos para tetos que contêm iodo são eficazes contra infeções mamárias e bactérias causadoras de mastite (Pankey, J. W. et al., (1983) J. Dairy Sei. 66 (1), 161 167). Estas composições são geralmente administradas ao teto mergulhando ou pulverizando o teto antes da ordenha, assim como após remoção da tetina de ordenha. Para reduzir a mastite, têm sido desenvolvidos banhos medicamentosos para tetos comerciais que contêm uma variedade de agentes antimicrobianos incluindo iodóforos, compostos de amónio quaternário, compostos de libertação de cloro (e.g. hipocloritos de alcalis), compostos oxidantes (e.g. peróxido de hidrogénio, perácidos), ácidos carboxilicos protonados (e.g. ácidos heptanoico, octanoico, nonanoico, decanoico, undecanoico), aniónicos ácidos (e.g. ácidos alquilarilsulfónicos), dióxido de cloro (a partir de clorito) e bisbiguanidas tais como clorexidina. Estes agentes, que têm graus de eficácia variáveis, limitam a transmissão de mastite através da redução das populações de agentes patogénicos no teto. No entanto, existem problemas associados à utilização de antimicrobianos. Os mais prevalecentes são a irritação do teto e o gretamento do teto. Para aliviar estes problemas, têm sido incluídos aditivos emolientes tais como glicerina e lanolina nessas composições. No entanto, mesmo com a utilização destes emolientes continua a haver irritação cutânea. A Patente U.S. N.° 6,790,867 indica que podem ser utilizadas injeções subcutâneas de formulações que combinam um fármaco anti-inflamatório não esteroide (NSAID) tal como flunixina, com um antibiótico derivado de cloranfenicol ou tiamfenicol fluorado tal como florfenicol, para tratar a BRD. A Publicação de Pedido de Patente U.S. N.° 20070155799 divulga novos compostos de fenicol que podem ser utilizados como pró-fármacos antibióticos e em associação com NSAIDs ou outros antibióticos. O NMC (antigamente o National Mastitis Council), uma organização sem fins lucrativos dedicada à redução mastite e aumento da qualidade do leite, realça a importância da higienização apropriada do teto, mas também do cuidado apropriado do teto para a prevenção de mastite. 0 prejuízo económico provocado pela mastite levou a muita investigação sobre o seu controlo. Os stresses físicos, assim como as condições ambientais foram descritos como sendo grande contribuintes para a infeção da mastite. Ver Publicação de Patente U.S. N.°: 20020051789. Desde que foi documentado que a mastite subclínica estava diretamente relacionada com uma má condição do teto (Neijenhuis, P. et al., (2001) J. Dairy Sei. (84) 2664 2672), foi desenvolvido um número de soluções comerciais para banhos medicamentosos para o teto que incorporam agentes de condicionamento (National Mastitis Council, Summary of Peer-Reviewed Publications on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since 1980; janeiro de 2002) . Foi demonstrado que a calosidade e a rugosidade da extremidade do teto têm uma relação direta com a mastite clínica (Neijenhuis, F. et al., (2001) J. Dairy Sci. (84) 2664 2672). A redução do gretamento e irritação dos tetos, assim como a manutenção do teto flexível é muito importante no controlo de infeções mamárias. A glicerina tem sido também utilizada como um condicionador do teto em soluções para banhos medicamentosos para o teto. No entanto, estudos indicam que não há uma diminuição significativa nas bactérias causadoras de mastite tais como staphylococcus aureus, streptococcus agalactiae ou coliformes quando o teor de glicerina é aumento de 2% para 10% numa solução para banho medicamentoso para o teto com 1% de iodo (National Mastitis Council, Summary of Peer-Reviewed Publications on Efficacy of Premilking and Postmilking Teat

Disinfectants Published Since 1980; janeiro de 2002). Assim, embora se encontrem disponíveis produtos tais como soluções para banhos medicamentosos para o teto, ainda há uma necessidade não satisfeita de modular a incidência, recorrência e/ou gravidade de mastite. A Patente U.S. N.° 5,849,883, divulga um número de antibióticos utilizados no tratamento de mastite, incluindo, mas não se limitando a, antibióticos de beta-lactama tais como penicilinas (ampicilina, cloxacilina, hetacilina, nafcilina, penicilina G (benzilpenicilina), procaína penicilina) e cefalosporinas (cefoperazona, cefuroxima, cefalónio, cefapirina, cefoxazole, cefracetrila); antibióticos de aminoglicósidos (framicetina, neomicina, novobiocina, estreptomicina); antibióticos macrólidos (eritromicina); tetraciclinas (clortetraciclina, oxitetraciclina); e antibióticos polipeptídicos (Polimixina B) . O tratamento com antibióticos para a mastite é geralmente administrado por meio de infusões intramamárias, quer em vacas lactantes quando é detetada mastite clínica, ou na secagem (terapia de vaca seca). (Bovine Mastitis, supra, na p.69.) Nos casos em que está presente doença clínica grave, os antibióticos devem ser administrados por via parentérica, uma vez que as infusões intramamárias são ineficazes devido ao bloqueio dos duetos). A esperança inicial de que os antibióticos permitiriam um controlo completo da doença não foi concretizada. Nenhum dos antibióticos supramencionados utilizados até à data foi totalmente satisfatório. Além disso, constatou-se que é muito desejável substituir o tratamento com antibióticos por tratamento com compostos farmacológicos quimioterapêuticos não antibióticos, pelas seguintes razões: (1) Os antibióticos eficazes na medicina humana não devem ser utilizados em medicina veterinária, para não desenvolver estirpes resistentes de bactérias que surgem em doenças humanas; (2) Os antibióticos devem ser reservados para aquelas doenças para as quais não estejam disponíveis compostos farmacológicos quimioterapêuticos, já que foi provado que as estirpes bacterianas desenvolvem resistência a um antibiótico após utilização prolongada desse antibiótico; e (3) 0 Staphylococcus aureus, um dos agentes patogénicos supramencionados, já desenvolveu uma resistência contra a maioria dos antibióticos utilizados no tratamento de mastite bovina.

Um tal método de tratamento com um composto farmacológico quimioterapêutico não antibiótico é descrito na Pat. U.S. N.° 4, 610, 993, que reivindica um método de tratamento de animais contra a mastite bovina com uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de dissulfureto de N-óxido de piridina. Outro método dos mesmos inventores é descrito na Pat. U.S. N.° 4,401, 666, que reivindica um método de tratamento de animais contra a mastite bovina com uma quantidade eficaz de pelo menos um sal metálico de 2-tiona-N-óxido de piridina. Apesar destes vários métodos publicados, permanece muito importante encontrar métodos rentáveis que utilizem compostos não antibióticos que superem substancialmente as desvantagens dos antibióticos utilizados até à data e mesmo assim sejam eficazes no tratamento e prevenção de mastite.

Outra doença comum que afeta a indústria de gado bovino é a febre dos transportes (doença respiratória bovina). As doenças respiratórias são uma causa importante de perda por doença no gado bovino para abate. 0 termo "febre dos transportes" é utilizado para descrever o complexo de doenças respiratórias observado no gado bovino com 6 meses de idade ou mais após transporte quer para parques de engorda quer para pastagem. Os stresses do desmame, castração, descornamento, jejum, sobrelotação, exposição a agentes infecciosos, alterações da dieta, transporte, extremos de temperatura ambiental e outros fatores causadores de stress combinados com infeções virais, bacterianas, micoplásmicas e/ou por clamidia contribuem para o complexo de febre dos transportes. A mistura de vitelos de diferentes explorações e/ou estábulos de venda facilita muito a exposição aos agentes infecciosos. A Patente U.S. N.° 6,497,869, descreve alguns dos agentes infecciosos iniciais que podem afetar o gado bovino. A mistura de populações pode ser o fator de predisposição mais importante para a febre dos transportes, do que os fatores causadores de stress, embora a doença possa ocorrer sem mistura e os fatores causadores de stress piorem geralmente de forma dramática a doença respiratória. As tentativas para reduzir o stress por desmame, castração, descornamento, etc. e a aclimatação do gado bovino às novas dietas, dias ou semanas antes do transporte são, por vezes, bem-sucedidas (mas podem não ser rentáveis) na redução da incidência da febre dos transportes. A vacinação contra alguns dos agentes infecciosos envolvidos na febre dos transportes é por vezes útil, mas as vacinas disponíveis e eficazes destina-se apenas a um número reduzido dos agentes que se sabe que estão implicados no complexo patológico. É geralmente reconhecido que a causa final de morte na maioria dos casos de febre dos transportes é uma pneumonia bacteriana (geralmente Pasteurella). A Pasteurella haemolytica, particularmente do tipo IA, é a bactéria mais comum isolada a partir de casos de doença respiratória na América do Norte. As tentativas para reproduzir experimentalmente a pneumonia bacteriana no gado bovino geralmente não têm êxito, sem que haja um stress severo e dano predisponente no aparelho respiratório. Em geral, acredita-se que durante momentos de stress, os vírus, micoplasma e/ou clamídia proporcionam muito frequentemente o dano inicial no aparelho respiratório que o predispõe a infeção bacteriana grave e doença.

Um surto típico de doença respiratória clínica começa geralmente dentro de horas ou dias da chegada do gado ao parque de engorda. Gado recentemente despachado na gama de 400 a 500 libras de peso tem 10 a 80% de morbidade ela 10% de mortalidade, ou mais, para a doença do aparelho respiratório. Quando o soro do gado é analisado para um aumento de anticorpos de quatro vezes (seroconversão) e o aparelho respiratório e as suas secreções são submetidos a isolamentos microbiológicos, pode identificar-se uma miríade de agentes etiológicos. Pode demonstrar-se que muitos animais, os doentes e aqueles aparentemente saudáveis, sofreram infeção por um ou mais agentes (provavelmente a doença do aparelho respiratório é raramente devida a apenas um agente infeccioso). Embora o complexo de doença respiratória bovina seja reconhecido clinicamente no parque de engorda após a chegada, as infeções que dão origem a doença clínica começam provavelmente nos estábulos de venda, onde o gado de diferentes explorações é reunido pela primeira vez. Ver também Bovine Respiratory Disease, Loan, R. W. Texas A & M University Press, 1984. A administração de um composto que tratasse ou modulasse a incidência, recorrência, duração e/ou gravidade de mastite ou doença respiratória no gado bovino ou outras infeções em animais não humanos, incluindo mas não se limitando a, gado bovino, aves domésticas, suínos, cavalos, cães e gatos seria útil em medicina veterinária. Os exemplos de tais infeções incluem, mas não se limitam a, septicemia neonatal em cavalos, pleuropneumonia em porcos e pneumonia em animais não humanos. Tais compostos podem restabelecer ou modular a função de neutrófilos no animal. A família do supergene da hormona de crescimento (GH) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1991); Mott, H. R. e Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, 0. e Ihle, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) representa um conjunto de proteínas com caracteristicas estruturais semelhantes. Cada membro desta família de proteínas compreende um emaranhado de quatro hélices. Embora ainda existam mais membros da família que não foram identificados, alguns membros da família incluem os seguintes: hormona de crescimento, prolactina, lactogénio placentário, eritropoietina (EPO) , trombopoietina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibidor de leucemia, interferão alfa, interferão beta, interferão gama, interferão omega, interferão tau, interferão épsilon, fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) ("a família do supergene da GH") . Os membros da família do supergene da GH têm estruturas secundárias e terciárias semelhantes, apesar do facto de terem geralmente identidade de sequências de aminoácidos ou ADN limitada. As características estruturais compartilhadas permitem a identificação imediata de novos membros da família de genes. Os polipéptidos de emaranhados de quatro hélices são descritos em WO 2005/074650 intitulada "Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses,".

Um membro da família do supergene da GH é o fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF). 0 fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) é um de vários fatores de crescimento glicoproteicos conhecidos como fatores de estimulação de colónias (CSFs) porque suportam a proliferação de células progenitoras hematopoiéticas. 0 G-CSF estimula a proliferação de células precursoras de medula óssea específicas e a sua diferenciação em granulócitos. Distingue-se de outros CSFs pela sua capacidade em estimular a formação de colónias de granulócitos neutrofílicos em ágar semissólido e para induzir a diferenciação terminal de células leucémicas mielomonocíticas murídeas in vitro. 0 Fator de Estimulação de Colónias de Granulócitos é um estímulo potente para a proliferação e maturação de neutrófilos in vivo (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 1987; 84: 2484-2488 ver também Heidari et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 2001; 81:45-57) . O G-CSF é também capaz de induzir a ativação ou o "condicionamento" funcional de neutrófilos maduros in vitro (Weisbart, R. H., Gasson, C. G., e D. W. Golde. Annals of Internal Medicine 1989; 110:297-303). Foi demonstrado que o G-CSF condiciona os granulócitos humanos e aumenta a libertação de superóxido estimulada pelo péptido quimiotático, N-formil-metionil-leucil-fenalalanina (S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144:1143-1146, e C. F. Nathan, Blood 1989; 74:301-306), e ativa fagocitose mediada por IgA de neutrófilos humanos (Weisbart, R. H., et al., Nature 1988; 332: 647-649).

Os neutrófilos são um componente crítico dos mecanismos de defesa do hospedeiro contra infeções bacterianas e fúngicas. 0 G-CSF é capaz de induzir um aumento no número absoluto de neutrófilos circulantes e melhora a função dos neutrófilos.

Foram descritas a clonagem e a expressão de ADNc do G-CSF humano recombinante (hG-CSF), e confirmou-se que o hG-CSF recombinante apresenta a maioria, se não todas, as propriedades biológicas da molécula nativa (Souza, L. et al. Science 232, 61-65 (1986)). A análise da sequência do ADNc e os clones de ADN genómico permitiram deduzir a sequência de aminoácidos e revelam que a proteína tem 204 aminoácidos de comprimento com uma sequência sinal de 30 aminoácidos. A proteína madura tem 174 aminoácidos de comprimento e não possui sítios de glicosilação ligados a N potenciais, mas vários sítios possíveis para glicosilação ligada a N.

A clonagem e a expressão de ADNc que codifica o G-CSF humano foram descritas por dois grupos (Nagata, S. et al., Nature 319, 415-418 (1986); Souza, L. M. et al., Science 232, 61-65 (1986)). O primeiro relatório de um clone de ADNc para G-CSF sugeriu que a proteína madura tinha 177 aminoácidos de comprimento. Os autores relataram que também tinham identificado um clone de ADNc para G-CSF que codificava uma proteína que carecia de um segmento de três aminoácidos. Esta forma mais curta do ADNc para G-CSF expressa a atividade G-CSF esperada. 0 segundo relatório descreve uma sequência de ADNc idêntica a esta forma curta e não refere outras variantes. Uma vez que estes autores confirmaram que o ADNc curto expressa o G-CSF com o perfil esperado de atividade biológica, é provável que esta seja a forma importante do G-CSF e que a forma mais longa seja uma variante de excisão-união minoritária ou o resultado de um artefacto de clonagem.

Matsumoto et al., em Infection and Immunity, Vol. 55, N.° 11, p. 2715 (1987) discutem o efeito protetor de G-CSF humano sobre a infeção microbiana em murganhos neutropénicos.

As seguintes publicações de patentes referem-se ao G-CSF: WO 8703689, descreve hibridomas que produzem anticorpos monoclonais específicos para o G-CSF humano e a sua utilização na purificação de G-CSF; WO 8702060, divulga polipéptidos semelhantes a G-CSF humano e métodos de produção daqueles; Pat. U.S. N.° 4, 810, 643, divulga polipéptidos semelhantes a G-CSF humano, sequências que os codificam e métodos para a sua produção; e WO 8604605 e WO 8604506, divulgam um gene que codifica o G-CSF humano e inibidores de infeção que contêm o G-CSF humano. O isolamento de h-GCSF e a produção de G-CSF em células hospedeiras tais como E. coli são descritos em, e.g., Patentes U.S. N.° 4,810,643; 4,999,291; 5,580,755; e 6, 716, 606. 0 G-CSF é uma proteína farmaceuticamente ativa que regula a proliferação, diferenciação e ativação funcional de granulócitos neutrofílicos (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan, et al. Blood 84(3): 795-799 (1994);

Bensinger, et al. Blood 81(11): 3158-3163 (1993); Roberts, et al., Expt'1 Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben, et

al. Blood 81(7): 1960-1967 (1993); Welte et al. PNAS-USA 82: 1526-1530 (1985); Souza et al. Science 232: 61-65 (1986) e Gabrilove, J. Seminars in Hematology 26:2 1-14 (1989)). O G-CSF foi purificado até à homogeneidade a partir dos sobrenadantes de culturas de células da linha de células de carcinoma da bexiga humano 5637 (Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sei (1985) 82:1526-30). A sequência do ADNc que codifica o hG-CSF nativo é conhecida de Souza et al., Science (1986) 232:61-65. Como uma consequência de excisão-união alternativa no segundo intrão existem duas formas naturais de hG-CSF com 204 ou 207 aminoácidos, dos quais os primeiros 30 representam um péptido sinal (Lymphokines, IRL Press, Oxford, Washington D.C., Editors D. Male e C. Rickwood) . Foi demonstrado que a proteína madura tem um peso molecular de cerca de 19 kDa e tem 5 resíduos de cisteína que podem formar pontes dissulfureto intermoleculares ou intramoleculares. Estudos de ligação demonstraram que o hG-CSF liga-se a granulócitos neutrofílicos. Observa-se pouca a nenhuma ligação com linhas de células eosinofílicas linfoides, eritroides, assim como com macrófagos.

Nos humanos, o G-CSF endógeno é detetável no plasma sanguíneo (Jones et al. Bailliere's Clinical Hematology 2:1 83-111 (1989)). 0 hG-CSF é produzido por fibroblastos, macrófagos, células T, trofoblastos, células endoteliais e células epiteliais e é o produto de expressão de um gene de cópia única constituído por quatro exões e cinco intrões localizados no cromossoma dezassete. A transcrição deste lócus produz uma espécie de ARNm que é processada de forma diferenciada, resultando em duas formas de ARNm de hG-CSF, uma versão que codifica uma proteína de 177 aminoácidos, codificando a outra uma proteína de 174 aminoácidos (Nagata et al. EMBO J 5: 575-581 (1986)), e constatou-se que a forma constituída por 174 aminoácidos tem a maior atividade biológica específica in vivo. 0 hG-CSF reage de forma cruzada entre espécies, pelo que quando o G-CSF humano é administrado a outro mamífero, tal como um murganho, cão ou macaco, é desencadeada leucocitose de neutrófilos sustentada (Moore et al. PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987)). 0 G-CSF pode ser obtido e purificado de um número de fontes. 0 G-CSF humano natural (nhG-CSF) pode ser isolado a partir dos sobrenadantes de linhas de células tumorais humanas cultivadas. 0 desenvolvimento de tecnologia de ADN recombinante, ver, por exemplo, Pat. U.S. N.° 4,810,643 (Souza), tem permitido a produção de quantidades à escala industrial de G-CSF na forma glicosilada como um produto da expressão de células hospedeiras eucarióticas e de G-CSF na forma não glicosilada como um produto da expressão de células hospedeiras procarióticas.

Constatou-se que o G-CSF é útil no tratamento de indicações onde um aumento nos neutrófilos proporcione benefícios. 0 G-CSF pode mobilizar células estaminais e precursoras de medula óssea e é utilizado para tratar doentes cujos granulócitos foram esgotados por quimioterapia, ou como um prelúdio para transplantes de medula óssea. Por exemplo, para doentes com cancro, o G-CSF é benéfico como um meio de estimular seletivamente a produção de neutrófilos para compensar défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapia ou terapia de radiação. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e condições relacionadas, tais como septicemia, a qual é tipicamente provocada por um metabolito das bactérias. 0 G-CSF é também útil sozinho ou em associação com outros compostos, tais como outras citocinas, para o crescimento ou expansão de células em cultura, por exemplo, para transplantes de medula óssea. 0 recetor de G-CSF (G-CSFR) é um membro da família dos recetores hematopoiéticos/de citocinas/de fatores de crescimento, a qual inclui vários outros recetores de fatores de crescimento, tais como os recetores de interleucina (IL)-3, -4 e -6, o recetor do fator de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) , o recetor de eritropoietina (EPO), assim como os recetores de prolactina e da hormona de crescimento. Ver, Bazan, Proc. Natl. Acad. Sei USA 87: 6934-6938 (1990) . Os membros da família dos recetores de citocinas contêm quatro resíduos de cisterna conservados e um motivo triptofano-serina-X-triptofano-serina posicionado de forma imediatamente exterior a região transmembranar. Julga-se que as sequências conservadas estão envolvidas em interações proteína-proteína. Ver, e.g., Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992). O recetor de G-CSF consiste numa única cadeia peptídica com um peso molecular de cerca de 150 kD (Nicola, Immunol. Today 8 (1987), 134). O hG-CSF glicosilado foi comparado com o hG-CSF desglicosilado, preparado por digestão enzimática in vitro com neuraminidase e endo-a-N-acetilgalactosaminidase, relativamente à sua estabilidade como uma função do pH e temperatura (Oheda et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (20) : 11432-35). O hG-CSF desglicosilado, dissolvido numa concentração de 1 yg/mL em tampão de fosfato 20 mM contendo NaCl 0,2 M e 0,01% de Tween 20 foi rapidamente inativado dentro da gama de pH desde cerca de pH 7 a cerca de pH 8 após uma incubação de dois dias a 37 °C. Pelo contrário, o hG-CSF glicosilado reteve mais de 80% da sua atividade nas mesmas condições. Além disso, a avaliação da estabilidade térmica de ambas as formas de hG-CSF, medida por um ensaio biológico e análise calorimétrica, indicou que o hG-CSF desglicosilado era termicamente menos estável do que a forma nativa de hG-CSF.

Foi encetado um número de abordagens para proporcionar composições de G-CSF farmaceuticamente aceitáveis, estáveis. Uma abordagem para melhorar a estabilidade da composição de G-CSF envolve a síntese de derivados da proteína. A Pat. U.S. N.° 5,665,863 divulga a formação de proteínas quiméricas recombinantes que compreendem G-CSF acoplado com albumina, as quais têm novas propriedades farmacocinéticas. A Pat. U.S. N.° 5,824,784 e a Pat. U.S. N.° 5,320,840 divulgam a ligação química de polímeros solúveis em água com proteínas para melhorar a estabilidade e proporcionar proteção contra a degradação proteolítica e, mais especificamente, moléculas de G-CSF modificadas na posição N-terminal que têm polímeros ligados quimicamente, incluindo polietileno glicol.

As estruturas de um número de citocinas, incluindo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412 (1992)), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)) e IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) foram determinadas por estudos de difração de raios X e RMN e apresentam uma conservação impressionante com a estrutura da GH, apesar de uma falta de homologia de sequência primária significativa.

Uma abordagem alternativa para aumentar a estabilidade de G-CSF na composição envolve a alteração da sequência de aminoácidos da proteína. A Pat. U.S. N.° 5,416,195 divulga análogos geneticamente modificados de G-CSF que têm estabilidade de composição melhorada, em que o resíduo de cisteína normalmente presente na posição 17 da cadeia polipeptídica madura, o resíduo de ácido aspártico presente na posição 27 e pelo menos um dos resíduos de prolina tandem presentes nas posições 65 e 66, são todos substituídos por um resíduo de serina. A Pat. U.S. N.° 5,773,581 divulga os análogos de G-CSF geneticamente modificados de G-CSF que foram conjugados covalentemente com um polímero solúvel em água.

As várias formas de G-CSF humano, incluindo a sua preparação e purificação, úteis num método de tratamento ou prevenção de mastite são descritas em pormenor na Pat. U.S. N.° 4,810,643. A Pat. U.S. N.° 4,810,643 descreve e reivindica novos segmentos de gene, plasmídeos recombinantes biologicamente funcionais e vetores de ADN virai e células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, que contêm um gene de G-CSF ou uma variante geneticamente modificada de um gene de G-CSF. As células hospedeiras expressam G-CSF biologicamente ativo ou uma variante geneticamente modificada de G-CSF. A Patente U.S. N.° 5,849,883 e a WO 89/10932 descrevem vários estudos com G- CSF humano em gado bovino. Os estudos realizados avaliaram doenças respiratórias (Pasteurella hemolytica) , as respostas a exposições bacterianas (Klebsiella pneumonia), ou mastite coliforme (E. coli) em gado bovino. A Patente U.S. N.° 5,849,883 apresenta o polinucleótido e a sequência polipeptídica do G-CSF bovino maduro (bG-CSF) e descreve métodos para clonar, isolar e purificar o polipéptido e análogos do mesmo. 0 b-GCSF maduro tem 174 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 1) que tem 82% de homologia com o hG-CSF. Um polipéptido de bG-CSF com um resíduo de aminoácido de metionina inicial é mostrado como SEQ ID NO: 2. A sequência polinucleotídica que codifica a SEQ ID NO: 1 é mostrada como SEQ ID NO: 3. A sequência polinucleotídica que codifica a SEQ ID NO: 2 é mostrada como SEQ ID NO: 4. Heidari et al. descrevem a expressão, purificação e atividades biológicas de bG-CSF em Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81:45-57. A ligação covalente do polímero hidrófilo poli (etileno glicol), abreviado PEG, é um método para aumentar a solubilidade em água, a biodisponibilidade, aumentar a semivida no soro, aumentar a semivida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica ou prolongar o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, péptidos e, em particular, de moléculas hidrófobas. O PEG tem sido utilizado exaustivamente em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e noutras aplicações onde a biocompatibilidade, a ausência de toxicidade e a ausência de imunogenicidade são importantes. A fim de maximizar as propriedades desejadas do PEG, o peso molecular total e o estado de hidratação do polímero ou polímeros de PEG ligados à molécula biologicamente ativa devem ser suficientemente altos para conferir as características vantajosas tipicamente associadas à ligação do polímero de PEG, tal como aumento da solubilidade em água e semivida circulante, ao mesmo tempo que não afetam desfavoravelmente a bioatividade da molécula parental.

Os derivados de PEG são frequentemente ligados às moléculas biologicamente ativas através de funcionalidades químicas reativas, tais como resíduos de lisina, cisteína e histidina, a extremidade N-terminal e unidades de hidrato de carbono. As proteínas e outras moléculas têm frequentemente um número limitado de sítios reativos disponíveis para ligação do polímero. Frequentemente, os sítios mais adequados para modificação através da ligação de polímeros desempenham um papel significativo na ligação ao recetor e são necessários para a retenção da atividade biológica da molécula. Como consequência, a ligação indiscriminada de cadeias do polímero a esses sítios reativos numa molécula biologicamente ativa leva frequentemente a uma redução significativa ou mesmo à perda total de atividade biológica da molécula modificada com polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados que possuam um peso molecular de polímero suficiente para transmitir as vantagens desejadas a uma molécula alvo, as abordagens da técnica anterior envolviam tipicamente a ligação aleatória de um grande número de braços poliméricos à molécula, aumentando, desse modo, o risco de uma redução ou mesmo perda total da bioatividade da molécula parental.

Os sítios reativos que formam os loci para ligação dos derivados de PEG às proteínas são ditados pela estrutura da proteína. As proteínas, incluindo enzimas, são constituídas por várias sequências de alfa-aminoácidos, que têm a estrutura geral H2N--CHR--COOH. A unidade amino alfa (H2N--) de um aminoácido une-se à unidade carboxilo (--COOH) de um aminoácido adjacente para formar ligações amida, as quais podem ser representadas como --(NH--CHR--C0)n--, em que o índice "n" pode ser igual a centenas ou milhares. 0 fragmento representado por R pode conter sítios reativos para a atividade biológica da proteína e para a ligação de derivados de PEG.

Por exemplo, no caso do aminoácido lisina existe uma unidade --NH2 na posição épsilon, assim como na posição alfa. 0 --NH2 épsilon está livre para reação em condições de pH básico. Muita da técnica no campo da derivatização de proteínas com PEG foi dirigida para o desenvolvimento de derivados de PEG para ligação à unidade --NH2 épsilon de resíduos de lisina presentes nas proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. No entanto, estes derivados de PEG têm todos a limitação comum, de que não podem ser instalados seletivamente entre os frequentemente numerosos resíduos de lisina presentes nas superficies de proteínas. Isto pode ser uma limitação significativa em casos onde um resíduo de lisina é importante para a atividade da proteína existente, por exemplo, num sítio ativo da enzima ou em casos onde um resíduo de lisina desempenha um papel na mediação da interação da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso de sítios de ligação ao recetor.

Uma segunda e igualmente importante complicação dos métodos existentes para a PEGuilação de proteínas é que os derivados de PEG podem sofrer reações secundárias indesejadas com resíduos diferentes daqueles desejados. A histidina contém uma unidade imino reativa, representada estruturalmente como -N(H)mas muitas espécies quimicamente reativas que reagem com ο --NH2 épsilon podem reagir também com -N(H). De forma semelhante, a cadeia lateral do aminoácido cisteína tem um grupo sulfidrilo livre, representado estruturalmente como -SH. Nalguns casos, os derivados de PEG dirigidos ao grupo --NH2 épsilon de lisina também reagem com cisteína, histidina ou outros resíduos. Isto pode criar misturas heterogéneas, complexas de moléculas bioativas derivatizadas com PEG e arrisca destruir a atividade da molécula bioativa que é visada. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitissem que fosse introduzido um grupo funcional químico num único sítio dentro da proteína que permitisse em seguida o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à molécula bioativa em sítios específicos sobre a superfície da proteína que fossem bem definidos e previsíveis.

Além dos resíduos de lisina, um esforço considerável na técnica foi dirigido para o desenvolvimento de reagentes de PEG ativados dirigidos a outras cadeias laterais de aminoácidos, incluindo cisteína, histidina e a extremidade N-terminal. Ver, e.g., Pat. U.S. N.° 6,610,281 e "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido de forma seletiva em relação ao sítio na estrutura de proteínas utilizando mutagénese específica de um lócus e outras técnicas conhecidas na matéria, e a unidade sulfidrilo livre resultante pode ser feita reagir com derivados de PEG que têm grupos funcionais reativos tiol. No entanto, esta abordagem é complicada, na medida em que a introdução de um grupo sulfidrilo livre pode complicar a expressão, dobragem e estabilidade da proteína resultante. Assim, seria desejável ter um meio para introduzir um grupo funcional químico em moléculas bioativas que permitisse o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à proteína, e que fosse simultaneamente compatível com (i.e., que não se envolvesse em reações secundárias indesejadas com) grupos sulfidrilo e outros grupos funcionais químicos tipicamente presentes nas proteínas.

Como se pode ver a partir de uma amostra da técnica, muitos destes derivados que foram desenvolvidos para ligação às cadeias laterais de proteínas, em particular, a unidade --NH2 na cadeia lateral do aminoácido lisina e a unidade -SH na cadeia lateral da cisteína, provaram que são problemáticos na sua síntese e utilização. Alguns formam ligações instáveis com a proteína que são sujeitas a hidrólise e, portanto, decompõem-se, degradam-se, ou são de outro modo instáveis em meios aquosos, tais como na corrente sanguínea. Alguns formam ligações mais estáveis, mas são sujeitos a hidrólise antes de se formar a ligação, o que significa que o grupo reativo sobre o derivado de PEG pode ser inativado antes de a proteína se poder ligar. Alguns são um pouco tóxicos e são, portanto, menos adequados para utilização in vivo. Alguns são demasiado lentos a reagir para serem úteis em termos práticos. Alguns resultam numa perda de atividade da proteína ao ligaram-se a sítios responsáveis pela atividade da proteína. Alguns não são específicos para os sítios onde se ligam, o que pode também resultar numa perda de atividade desejável e numa falta de reprodutibilidade dos resultados. A fim de superar os desafios associados à modificação de proteínas com unidades de poli(etileno glicol), foram desenvolvidos derivados de PEG que são mais estáveis (e.g., Patente U.S. 6,602,498,) ou que reagem seletivamente com unidades tiol nas moléculas e superfícies (e.g., Patente U.S. 6,610,281). Há claramente uma necessidade na técnica de derivados de PEG que sejam quimicamente inertes em meios fisiológicos até que sejam chamados a reagir seletivamente para formar ligações químicas estáveis.

Foi divulgada a utilização de conjugados de hidroxialquilamido e, em particular, a utilização de hidroxietilamido (HES), ligados covalentemente a um polipéptido para alterar potencialmente a imunogenicidade e/ou alergenicidade de um polipéptido. A HESilação é uma tecnologia alternativa que foi divulgada numa série de pedidos de patente concedidos a Fresenius Kabi AB incluindo as Publicações de Patente U.S. Números 20050063943, 20060121073, 20010100163, 20050234230, 20050238723, 20060019877, 20070134197, 20070087961, assim como a Patente U.S. Número 7,285,661. O HES é um polímero natural modificado que foi clinicamente utilizado como um expansor de volume do plasma e a HESilação representa a tecnologia de acoplamento de substâncias farmacológicas com derivados de HES para modificar as características dos fármacos, tais como farmacocinética ou solubilidade em água. Isto inclui também o prolongamento da circulação da proteína no plasma através de um aumento da estabilidade da molécula e uma depuração renal reduzida, que resulta num aumento da atividade biológica. Além disso, a imunogenicidade ou alergenicidade pode ser reduzida. Através da variação de diferentes parâmetros, tais como o peso molecular do HES, pode ser personalizada uma grande gama de conjugados de HES. Não obstante, o hidroxietilamido compartilha uma desvantagem comum com todos os outros polímeros presentemente disponíveis: a sua polidispersidade. Os conjugados de polímeros são uma mistura de moléculas que têm pesos moleculares distribuídos em torno de um valor médio. Esta falta de homogeneidade resulta num nível baixo de caracterização química e bioquímica e poderia impedir que o componente farmaceuticamente ativo atingisse o seu sítio de ação (recetor, enzima, etc.). Nestes casos, o fármaco para ser ativo requer a sua administração na forma não conjugada original e, desse modo, é necessária a dissociação do polímero por reações metabólicas para a sua eficácia farmacêutica.

Recentemente foi reportada uma tecnologia completamente nova nas ciências das proteínas, a qual promete superar muitas das limitações associadas às modificações específicas de um sítio das proteínas. Especificamente, foram adicionados novos componentes à maquinaria biossintética de proteínas do procariota Escherichia coli (E. coli) (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) e do eucariota Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que permitiu a incorporação de aminoácidos não codificados geneticamente em proteínas in vivo. Um número de novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou biológicas, incluindo etiquetas de fotoafinidade e aminoácidos fotoisomerizáveis, aminoácidos de fotorreticulação (ver, e.g., Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 99:11020-11024; e, Chin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), cetoaminoácidos, aminoácidos que contêm átomos pesados e aminoácidos glicosilados foram incorporados eficientemente e com alta fidelidade em proteínas em E. coli e em levedura em resposta ao codão âmbar, TAG, utilizando esta metodologia. Ver, e.g., J. W. Chin et al., (2002), Journal do American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Estes estudos demonstraram que é possível introduzir seletiva e rotineiramente grupos funcionais químicos, tais como grupos cetona, grupos alcino e unidades azida, que não se encontram em proteínas, que são quimicamente inertes a todos os grupos funcionais presentes nos 20 aminoácidos comuns, codificados geneticamente e que podem ser utilizados para fazer reagir eficiente e seletivamente para formar ligações covalentes estáveis. A capacidade para incorporar aminoácidos não codificados geneticamente em proteínas permite a introdução de grupos funcionais químicos que podem proporcionar alternativas valiosas aos grupos funcionais naturais, tais como o -NH2 épsilon da lisina, o sulfidrilo -SH da cisteína, o grupo imino da histidina, etc. Certos grupos funcionais químicos são conhecidos por serem inertes aos grupos funcionais presentes nos 20 aminoácidos codificados geneticamente, comuns, mas reagirem de forma limpa e eficiente para formar ligações estáveis. Os grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na técnica por sofrerem uma reação de cicloadição de Huisgen [3+2] em condições aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-30 64; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Por exemplo, ao introduzir uma unidade azida numa estrutura proteica, pode-se incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte a aminas, sulfidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo presentes em proteínas, mas que reage também de forma suave e eficaz com uma unidade acetileno para formar um produto de cicloadição. É importante referir que, na ausência da unidade acetileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteínas e nas condições fisiológicas. A US 5849883 ensina um método de purificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) a partir de um microrganismo que produz G-CSF. São também divulgados polipéptidos codificados pelo G-CSF bovino e variantes dos mesmos. É também divulgado um método de tratamento ou prevenção de infeções em animais. A presente invenção resolve, entre outras coisas, os problemas associados à atividade e produção de polipéptidos de bG-CSF e também resolve a produção de um polipéptido de bG-CSF com propriedades biológicas ou farmacológicas melhoradas e/ou semivida terapêutica melhorada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção é proporcionado um polipéptido de bG-CSF que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1 ou SEQ.ID.NO: 2 em que o aminoácido na posição 133 da SEQ.ID.N0:1, ou o aminoácido correspondente da SEQ.ID.N0:2, está substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente para-acetilfenilalanina, em que o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água que compreende uma unidade de poli(etileno) glicol; e o polímero solúvel em água tem um peso molecular de 20 KDa.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção é proporcionada uma formulação farmacêutica que compreende o polipéptido de bG-CFS de acordo com a presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

De acordo com outra forma de realização da presente invenção, é proporcionada uma composição que compreende o polipéptido de bG-CSF de acordo com a presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Preferencialmente, a composição da presente invenção é para utilização no tratamento ou prevenção de uma infeção num animal ou para tratamento de um animal que tem mastite.

Preferencialmente, o polímero solúvel em água da presente invenção está ligado ao polipéptido de bG-CSF por uma ligação oxima.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma ou mais modificações pós-tradução. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF está ligado a uma unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF está ligado a um polímero bifuncional, unidade de ligação bifuncional ou pelo menos um polipéptido de bG-CSF adicional.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição, que modula a afinidade do polipéptido de bG-CSF para um recetor ou parceiro de ligação, que inclui mas não se limita a, uma proteína, polipéptido, molécula pequena ou ácido nucleico. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a estabilidade do polipéptido de bG-CSF quando comparada com a estabilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição. A estabilidade e/ou solubilidade pode ser medida utilizando um número de ensaios diferentes conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Esses ensaios incluem mas não se limitam a SE-HPLC e RP-HPLC. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a imunogenicidade do polipéptido de bG-CSF quando comparada com a imunogenicidade do bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a semivida no soro ou o tempo de circulação do polipéptido de bG-CSF quando comparada com a semivida no soro ou tempo de circulação do bG-CSF correspondente sem a substituição.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a solubilidade aquosa do polipéptido de bG-CSF quando comparada com a solubilidade aquosa do bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a solubilidade do polipéptido de bG-CSF produzido numa célula hospedeira quando comparada com a solubilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a expressão do polipéptido de bG-CSF numa célula hospedeira ou aumenta a sintese in vitro quando comparada com a expressão ou sintese do bG-CSF correspondente sem a substituição. 0 polipéptido de bG-CSF que compreende esta substituição mantém a atividade agonista e mantém ou melhora os níveis de expressão numa célula hospedeira.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a resistência à protease do polipéptido de bG-CSF quando comparada com a resistência à protease do bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a atividade de transdução de sinal do recetor quando comparada com a atividade do recetor após interação com o polipéptido de bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a sua ligação a outra molécula tal como um recetor quando comparada com a ligação do polipéptido de bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a hematopoiese em comparação com a hematopoiese do polipéptido de bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a proliferação de neutrófilos em comparação com a proliferação de neutrófilos do polipéptido de bG-CSF correspondente sem a substituição. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que modula a maturação de neutrófilos em comparação com a maturação de neutrófilos do polipéptido de bG-CSF correspondente sem a substituição.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF compreende uma substituição que aumenta a compatibilidade do polipéptido de bG-CSF com os conservantes farmacêuticos (e.g., m-cresol, fenol, álcool benzilico) quando comparada com a compatibilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição. Esta maior compatibilidade permitiria a preparação de uma formulação farmacêutica conservada que mantém as propriedades físico-químicas e a atividade biológica da proteína durante a conservação.

Nalgumas formas de realização é criada uma ligação geneticamente manipulada com um aminoácido não natural. A ligação intramolecular pode ser criada de muitas maneiras, incluindo mas não se limitando a, uma reação entre dois aminoácidos na proteína sob condições adequadas (um ou ambos os aminoácidos podem ser um aminoácido não natural) ; uma reação com dois aminoácidos, cada um dos quais pode ser codificado naturalmente ou não codificado naturalmente, com uma unidade de ligação, polímero ou outra molécula sob condições adequadas; etc.

Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonilo. Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente tem a estrutura:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído ou arilo substituído; R2 é H, um alquilo, arilo, alquilo substituído e arilo substituído; e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um dos grupos de modificação da extremidade carboxilo.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido é um agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de um polipéptido de bG-CSF. Nalgumas formas de realização, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de um polipéptido de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água. Nalgumas formas de realização, o polímero solúvel em água compreende uma unidade de poli(etileno glicol). Nalgumas formas de realização, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de um polipéptido de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente e uma ou mais modificações pós-tradução, unidades de ligação, polímeros ou moléculas biologicamente ativas. A divulgação também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que hibrida sob condições restringentes com as SEQ ID NOs: 3, 4 ou os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos de SEQ ID NOs: 1, 2. A divulgação também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que hibrida sob condições restringentes com a SEQ ID NO: 3, 4 ou polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes com polinucleótidos que codificam os polipéptidos apresentados como SEQ ID NOs: 1, 2 em que o polinucleótido compreende pelo menos um codão seletor. A divulgação também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que codifica os polipéptidos apresentados como SEQ ID NOs.: 1, 2. A divulgação também proporciona ácidos nucleicos isolados que compreendem um polinucleótido que codifica os polipéptidos apresentados como SEQ ID NOs.: 1, 2 com um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que um número de polinucleótidos diferentes pode codificar qualquer polipéptido da presente invenção.

Nalgumas formas de realização, o codão seletor é selecionado do grupo que consiste num codão âmbar, codão ocre, codão opalino, um codão único, um codão raro, um codão de cinco bases e um codão de quatro bases. A divulgação também proporciona métodos de preparação de um polipéptido de bG-CSF ligado a um polímero solúvel em água. Nalgumas formas de realização, o método compreende pôr em contacto um polipéptido de bG-CSF isolado que compreende um aminoácido não codificado naturalmente com um polímero solúvel em água que compreende uma unidade que reage com o aminoácido não codificado naturalmente. Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF é reativo para um polímero solúvel em água que é de outro modo não reativo para qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF é reativo para uma unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativa para qualquer um dos 2 0 aminoácidos comuns.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado fazendo reagir um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém carbonilo com uma molécula de poli (etileno glicol) que compreende um grupo aminooxilo, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Nalgumas formas de realização, o grupo aminooxilo, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação amida. Nalgumas formas de realização, o grupo aminooxilo, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação carbamato.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado fazendo reagir uma molécula de poli(etileno glicol) que compreende um grupo carbonilo com um polipéptido que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que compreende um grupo aminooxilo, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado fazendo reagir um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém alcino com uma molécula de poli(etileno glicol) que compreende uma unidade azida.

Nalgumas formas de realização, o grupo azida ou alcino está ligado à molécula de poli (etileno glicol) através de uma ligação amida.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado fazendo reagir um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém azida com uma molécula de poli(etileno glicol) que compreende uma unidade alcino. Nalgumas formas de realização, o grupo azida ou alcino está ligado à molécula de poli(etileno glicol) através de uma ligação amida.

Nalgumas formas de realização, a molécula de poli(etileno glicol) é um polímero ramificado. Nalgumas formas de realização, cada ramo do polímero de poli(etileno glicol) ramificado tem um peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa.

Nalgumas divulgações, o polímero solúvel em água ligado ao polipéptido de bG-CSF compreende uma unidade de polialquileno glicol. Nalgumas divulgações, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxilo, um grupo hidrazida, uma hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino. Nalgumas divulgações, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF compreende uma unidade carbonilo e o polímero solúvel em água compreende uma unidade aminooxilo, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida. Nalgumas divulgações, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF compreende uma unidade alcino e o polímero solúvel em água compreende uma unidade azida. Nalgumas divulgações, o resíduo de aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF compreende uma unidade azida e o polímero solúvel em água compreende uma unidade alcino. A presente invenção também proporciona composições que compreendem um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. São também divulgadas células que compreendem um polinucleótido que codifica o polipéptido de bG-CSF que compreende um codão seletor. Nalgumas divulgações, as células compreendem uma ARN-sintetase ortogonal e/ou um ARNt ortogonal para substituir um aminoácido não codificado naturalmente no polipéptido de bG-CSF. São também divulgados métodos de preparação de um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente. Nalgumas divulgações, os métodos compreendem cultivar células que compreendem um polinucleótido ou polinucleótidos que codificam um polipéptido de bG-CSF, uma ARN-sintetase ortogonal e/ou um ARNt ortogonal sob condições que permitam a expressão do polipéptido de bG-CSF; e a purificação do polipéptido de bG-CSF a partir das células e/ou meio de cultura. São também divulgados métodos para aumentar a semivida terapêutica, semivida no soro ou tempo de circulação dos polipéptidos de bG-CSF e métodos de modulação de imunogenicidade dos polipéptidos de bG-CSF. Nalgumas divulgações, os métodos compreendem a substituição de qualquer um ou mais aminoácidos nos polipéptidos de bG-CSF naturais por um aminoácido não codificado naturalmente e/ou a ligação do polipéptido de bG-CSF a uma unidade de ligação, um polímero, um polímero solúvel em água ou uma molécula biologicamente ativa. São também divulgados métodos de tratamento de um doente que necessita desse tratamento com uma quantidade eficaz de uma molécula de bG-CSF da presente invenção. Tais métodos compreendem a administração ao doente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Nalgumas divulgações, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Nalgumas divulgações, o polipéptido de bG-CSF está glicosilado. Nalgumas divulgações, o polipéptido de bG-CSF não está glicosilado. A divulgação também proporciona polipéptidos de bG-CSF que compreendem uma sequência que se mostra na SEQ ID NO: 1, 2, ou qualquer outra sequência de polipéptido de bG-CSF, exceto que pelo menos um aminoácido está substituído com um aminoácido não codificado naturalmente. A divulgação também proporciona polipéptidos de bG-CSF que compreendem uma sequência que se mostra como SEQ ID NO: 1, 2. Na presente invenção, o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Nalgumas divulgações, o polímero solúvel em água compreende uma unidade de poli(etileno glicol). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonilo, um grupo aminooxilo, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipéptido de bG-CSF que compreende a sequência que se mostra na SEQ ID NO: 1, 2, ou qualquer outra sequência de polipéptido de bG-CSF, em que pelo menos um aminoácido está substituído com um aminoácido não codificado naturalmente. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável e um polipéptido de bG-CSF que compreende a sequência que se mostra na SEQ ID NO: 1, 2. Nalgumas divulgações, o aminoácido não codificado naturalmente compreende uma unidade sacarídea. Nalgumas

divulgações, o polímero solúvel em água está ligado ao polipéptido através de uma unidade sacarídea. Nalgumas divulgações, uma unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa está ligado ao polipéptido de bG-CSF através uma unidade sacarídea. É também divulgado um polipéptido de bG-CSF que compreende um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipéptido de bG-CSF num único aminoácido. Nalgumas divulgações, o polímero solúvel em água compreende uma unidade de poli(etileno glicol). Nalgumas divulgações, o aminoácido ligado covalentemente ao polímero solúvel em água é um aminoácido não codificado naturalmente presente no polipéptido.

Nalgumas divulgações, um polipéptido de bG-CSF que compreende um HES ligado por uma ligação covalente ao polipéptido de bG-CSF está ligado num único aminoácido. Nalgumas divulgações, o único aminoácido ligado covalentemente ao HES é um aminoácido não codificado naturalmente presente no polipéptido. Nalgumas divulgações, um polipéptido de bG-CSF compreende múltiplos aminoácidos não codificados naturalmente que podem estar ligados a múltiplas moléculas de HES e/ou PEG. É também divulgado um polipéptido de bG-CSF que compreende pelo menos uma unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que a referida unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa está ligado ao polipéptido através de um grupo funcional de um aminoácido não codificado naturalmente incorporado por ribossomas no polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido estás monoPEGuilado. A divulgação também proporciona um polipéptido de bG-CSF que compreende uma unidade de ligação, polímero ou molécula biologicamente ativa que está ligado a um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente em que o referido aminoácido não codificado naturalmente é incorporado por ribossomas no polipéptido em sítios pré-selecionados.

Encontra-se incluída na invenção a sequência líder ou sinal de bG-CSF unida a uma região codificante de bG-CSF, assim como uma sequência sinal heteróloga unida a uma região codificante de bG-CSF. A sequência líder ou sinal heteróloga selecionada deve ser uma que seja reconhecida e processada, e.g. pelo sistema de secreção da célula hospedeira para segregar e possivelmente dissociar por uma peptidase sinal, pela célula hospedeira. Um método de tratamento de uma condição ou distúrbio com o bG-CSF da presente invenção destina-se a incluir o tratamento com bG-CSF com ou sem um péptido sinal ou líder. A divulgação proporciona um método de tratamento e prevenção de infeções em animais e também proporciona um método de tratamento e prevenção de mastite e febre dos transportes em animais bovinos. A divulgação também proporciona um método de tratamento de infeções em animais sem desenvolver estirpes resistentes de bactérias. Da mesma forma, a divulgação proporciona um polipéptido purificado e isolado que tem parte ou a totalidade da confirmação estrutural primária e uma ou mais das propriedades biológicas do G-CSF bovino natural, e as sequências de ADN que codificam esse G-CSF bovino.

Pode administrar-se um ou mais fatores de estimulação de colónias adicionais administrados ao animal infetado com G-CSF, incluindo mas não se limitando a, GM-CSF, M-CSF e multi-CSF (IL-3). Os CSFs são administrados em conjunto ou separadamente. As infeções de animais podem ser tratadas administrando G-CSF com um ou mais de: interferões, incluindo, mas não se limitando a, interferão a, IL2 e TNF, ou com antibióticos tradicionais, incluindo, mas não se limitando a, penicilinas, cefalosporinas e amino-glicósidos.

Noutra forma de realização, o tratamento com bG-CSF é utilizado de uma maneira profilática. 0 bG-CSF pode ser utilizado como uma terapia profilática para aumentar a defesa hospedeira de animais que estão em risco de adquirir uma infeção bacteriana, por leveduras ou fúngica. Por exemplo, o bG-CSF pode ser utilizado como uma terapia profilática em animais normais em risco de adquirir uma infeção, incluindo, mas não se limitando a, pneumonia. 0 termo "normal" como aqui utilizado significa um animal que tem função imunológica normal e contagem e diferencial de glóbulos brancos normais. 0 gado bovino é tratado profilaticamente antes do transporte ou outras ocorrências que possam debilitar o gado bovino, a fim de reforçar e preparar a sua capacidade para combater as infeções. A administração do bG-CSF pode ser efetuada no momento em que o gado bovino é processado, i.e. vacinado, marcado, etc. 0 tratamento com bG-CSF pode ser também efetuado durante a terapia de vaca seca e/ou imediatamente antes de uma vaca dar à luz a fim de reduzir a probabilidade de infeções intrauterinas pós-parto e de mastite durante as etapas iniciais de lactação. Ver Kehrli et al., Am. J. Vet. Res., 50, No.2, 207 (1989); Oliver et al., J. Dairy Sei. 71:2584-2606 (1988); e Kehrli et al., J Dairy Sei. 74:4399-4412 (1991) para uma descrição da função dos neutrófilos bovinos durante o período periparturiente. Convencionalmente, não há tratamento com antibióticos imediatamente antes parto, uma vez que os resíduos que surgiriam no leite de vaca torná-lo-iam impróprio para utilização.

Noutra forma de realização, a conjugação do polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não natural com o PEG, proporciona bG-CSF substancialmente purificado devido à reação química única utilizada para a conjugação com o aminoácido não natural. A conjugação de bG-CSF pode ser realizada com outras técnicas de purificação realizadas antes ou após o passo de conjugação para proporcionar bG-CSF substancialmente puro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 - É mostrado um plasmídeo utilizado para a expressão de bG-CSF.

Figura 2 - São mostrados pormenores sobre uma linha de células hospedeiras utilizada para expressar bG-CSF.

Figura 3 - É mostrada a análise por SDS-PAGE da expressão de polipéptidos de bG-CSF da presente invenção.

Figura 4 - É mostrada a análise por SDS-PAGE de frações do pico da coluna CM FF de bG-CSF antes da PEGuilação.

Figura 5 - É mostrada a análise por SDS-PAGE de frações do pico da coluna SP HP de bG-CSF-Tl33pAF PEGuilado.

Figura 6 - É mostrada a análise por SDS-PAGE de b-GCSF antes e após PEGuilação.

Figura 7a - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF de tipo selvagem com tripsina/Glu-C (Deteção a 214 nm) .

Figura 7b - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF Tl33pAF com tripsina/Glu-C (Deteção a 214 nm).

Figura 8a - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF de tipo selvagem com tripsina/Glu-C (Deteção a 250 nm) .

Figura 8b - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF Tl33pAF com tripsina/Glu-C (Deteção a 250 nm).

Figura 9a - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF de tipo selvagem com Glu-C (Deteção a 214 nm).

Figura 9b - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF Tl33pAF com Glu-C (Deteção a 214 nm).

Figura 10a - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF de tipo selvagem com Glu-C (Deteção a 250 nm).

Figura 10b - É mostrado o produto de digestão de bG-CSF Tl33pAF com Glu-C (Deteção a 250 nm).

Figura 11 - É mostrada a análise por SEC-HPLC do polipéptido de bG-CSF PEGuilado.

Figura 12 - É mostrada a análise por SEC-HPLC do polipéptido de bG-CSF.

Figura 13 - São mostrados os valores de EC50 em bruto do ensaio de proliferação em M-NFS60 de G-CSF bovino Tl33pAF PEGuilado 20K e de tipo selvagem.

Figura 14 - São mostradas as diferenças em vezes da EC50 no ensaio de proliferação em M-NFS60 de G-CSF bovino Tl33pAF PEGuilado 20K vs. tipo selvagem.

Figura 15 - São mostrados os resultados de uma experiência que analisa os neutrófilos bovinos revelados com anticorpo CDllb.

Figura 16 - São mostrados os resultados da administração de bG-CSF PEGuilado sobre ANC.

Figura 17 - Um gráfico de linhas que mostra as contagens absolutas de neutrófilos (média ± erro padrão) em vitelos tratados com tampão de formulação de bG-CSF PEGuilado após uma única injeção subcutânea a 40 yg/kg.

Figura 18 - Um gráfico de linhas que mostra a produção de leite diária média de vacas do exemplo de 40 yg/kg.

Figura 19 - Um gráfico de barras que mostra as diferenças nas contagens de células somáticas aos 3, 5, 7 e 10 dias após parturição entre quatro grupos de vacas que incluem um grupo de controlo, um grupo tratado diariamente com bG-CSF não PEGuilado, um grupo injetado com bG-CSF

PEGuilado a 40 yg/kg e um grupo injetado com bG-CSF PEGuilado a 20 yg/kg

DEFINIÇÕES

Deve entender-se que esta invenção não se limita à metodologia, aos protocolos, às linhas de células, às construções e aos reagentes particulares aqui descritos e como tal podem variar. Deve entender-se também que a terminologia aqui utilizada é apenas para o fim de descrição de formas de realização particulares e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações apensas.

Como aqui utilizado e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um," "uma," "o" e "a" incluem a referência plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um "bGCSF" "G-CSF bovino," "bG-CSF," "bG-CSF," "polipéptido de G-CSF bovino" ou "polipéptido de bG-CSF" e várias formas hifenadas e não hifenadas é uma referência a uma ou mais dessas proteínas e inclui os seus equivalentes conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, e outros mais. A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comummente entendido por um especialista com conhecimentos médios na matéria à qual esta invenção pertence. Embora possam ser utilizados quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos na prática ou avaliação da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. 0 termo "substancialmente purificado" refere-se a um polipéptido de bG-CSF que pode estar substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína como se encontra no seu ambiente natural, i.e. uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de polipéptidos de bG-CSF produzidos de forma recombinante. 0 polipéptido de bG-CSF que pode estar substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteína que contêm menos de cerca de 30%, menos de cerca de 25%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipéptido de bG-CSF ou variante do mesmo é produzido de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente a cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1% ou menos do peso seco das células. Quando o polipéptido de bG-CSF ou variante do mesmo é produzido de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura a cerca de 5 g/L, cerca de 4 g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 2 g/L, cerca de 1 g/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 10 mg/L ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Assim, polipéptido de bG-CSF "substancialmente purificado" como produzido pelos métodos da presente invenção pode ter um nivel de pureza de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, especificamente, um nivel de pureza de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, e mais especificamente, um nivel de pureza de pelo menos cerca de 90%, um nivel de pureza de pelo menos cerca de 95%, um nivel de pureza de pelo menos cerca de 99% ou mais como determinado por métodos apropriados tais como análise por SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC e eletroforese capilar.

Uma "célula hospedeira recombinante" ou "célula hospedeira" refere-se a uma célula que inclui um polinucleótido exógeno, independentemente do método utilizado para inserção, por exemplo, captação direta, transdução, conjugação f- ou outros métodos conhecidos na técnica para gerar células hospedeiras recombinantes. O polinucleótido exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmideo ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.

Como aqui utilizado, o termo "meio" ou "meios" inclui qualquer meio de cultura, solução, sólido, semissólido ou suporte rígido que possa suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras vegetais, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamífero, células CHO, células hospedeiras procarióticas, E. colir ou células hospedeiras de Pseudomonas, e conteúdos celulares. Assim, o termo pode abranger o meio em que a célula hospedeira foi cultivada, e.g., meio para o qual o polipéptido de bG-CSF foi segregado, incluindo o meio antes ou após um passo de proliferação. 0 termo pode abranger também tampões ou reagentes que contêm lisados de células hospedeiras, tal como no caso em que o polipéptido de bG-CSF é produzido intracelularmente e as células hospedeiras são sujeitas a lise ou rompidas para libertar o polipéptido de bG-CSF. "Agente de redução," como aqui utilizado em relação à redobragem de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que mantém os grupos sulfidrilo no estado reduzido e reduz as ligações dissulfureto intra- ou intermoleculares. Os agentes de redução adequados incluem, mas não se limitam a, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol) e glutationa reduzida. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que uma grande variedade de agentes de redução é adequada para utilização nos métodos e composições da presente invenção. "Agente oxidante," como aqui utilizado em relação à redobragem de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que é capaz de remover um eletrão de um composto a ser oxidado. Os agentes oxidantes adequados incluem, mas não se limitam a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigénio. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que uma grande variedade de agentes oxidantes é adequada para utilização nos métodos da presente invenção. "Agente desnaturante" ou "desnaturante," como aqui utilizado, é definido como qualquer composto ou material que originará uma desdobragem reversível de uma proteína. A força de um agente desnaturante ou desnaturante será determinada tanto pelas propriedades como pela concentração do agente desnaturante ou desnaturante particular. Os agentes desnaturantes ou desnaturantes adequados podem ser caótropos, detergentes, solventes orgânicos, solventes miscíveis com água, fosfolípidos ou uma combinação de dois ou mais desses agentes. Os caótropos adequados incluem, mas não se limitam a, ureia, guanidina, e tiocianato de sódio. Os detergentes úteis podem incluir, mas não se limitam a, detergentes fortes tais como dodecilsulfato de sódio ou éteres de polioxietileno (e.g. detergentes Tween ou Triton), Sarcosilo, detergentes não iónicos suaves (e.g., digitonina), detergentes catiónicos suaves tais como N->2,3-(Dioleioxi)-propil-N,N,N-trimetilamónio, detergentes iónicos suaves (e.g. colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwitteriónicos, incluindo, mas não se limitando a, sulfobetaínas (Zwittergent) , sulfato de 3-(3- clolamidopropil)dimetilamónio-1-propano (CHAPS) e sulfonato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamónio-2-hidroxi-l-propano (CHAPSO). Os solventes orgânicos, misciveis com água tais como acetonitrilo, alcanóis inferiores (especialmente alcanóis C2 - C4, tais como etanol ou isopropanol) ou alcanodióis inferiores (especialmente alcanodióis C2 - C4 tais como etileno-glicol) podem ser utilizados como desnaturantes. Os fosfolípidos úteis na presente invenção podem ser fosfolípidos naturais tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, e fosfatidilinositol, ou derivados ou variantes de fosfolípidos sintéticos tais como di-hexanoilfosfatidilcolina ou di-heptanoilfosfatidilcolina. "Redobragem," como aqui utilizado descreve qualquer processo, reação ou método que transforma polipéptidos que contêm ligações dissulfureto de um estado dobrado incorretamente ou desdobrado numa conformação nativa ou dobrada corretamente em relação às ligações dissulfureto. "Codobragem," como aqui utilizado, refere-se especificamente a processos, reações ou métodos de redobragem que utilizam pelo menos dois polipéptidos que interagem entre si e resultam na transformação de polipéptidos desdobrados ou dobrados incorretamente em polipéptidos nativos, dobrados corretamente.

Como aqui utilizado, "fator de estimulação de colónias de granulócitos" ou "G-CSF" deve incluir aqueles polipéptidos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de G-CSF (tais como aqueles descritos na Patente U.S. N.° 6,716,606; 6,689,351; 6,565,841; 6,162,426; 5,811,301; 5,776,895; 5,718,893; 5,580,755; 5,536,495; 5,202,117; 5,043,156; 4,999,291; 4,810,643; e 4,968,618 para o hG-CSF), assim como análogos de G-CSF, isoformas de G-CSF, miméticos de G-CSF, fragmentos de G-CSF, proteínas de G-CSF híbridas, proteínas de fusão, oligómeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica dos mesmos, e ainda independentemente do método de síntese ou fabrico dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a, métodos recombinantes (quer produzidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético ou outra forma de ácido nucleico), sintéticos, transgénicos e ativados por genes. Os exemplos específicos de G-CSF incluem, mas não se limitam a, pegfilgrastim (NEULASTA®), filgrastim (NEUPOGEN®), análogo de G-CSF, mutantes de G-CSF, G-CSF glicosilado alterado e análogos de G-CSF conjugado com PEG. Os exemplos específicos de linhas de células modificadas para a expressão de G-CSF humano endógeno são descritos em Devlin et al., J. Leukoc. Biol. 41:306 (1987); Patente U.S. N.° 6,716,606; 6,379,661; 6,004,548; 5,830,705; 5,582,823; 4,810,643; e 6,242,218.

Como aqui utilizado, "fator de estimulação de colónias de granulócitos bovino," "G-CSF bovino" ou "bG-CSF" deve incluir aqueles polipéptidos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de bG-CSF, assim como análogos de bG-CSF, isoformas de bG-CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG-CSF híbridas, proteínas de fusão, oligómeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica dos mesmos, e ainda independentemente do método de síntese ou fabrico dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a, métodos recombinantes (quer produzidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético ou outra forma de ácido nucleico), sintéticos, transgénicos e ativados por gene. Os exemplos específicos de G-CSF incluem, mas não se limitam a, mutantes de bG-CSF, G-CSF glicosilado alterado e análogos de G-CSF conjugado com PEG. 0 termo "G-CSF bovino (bG-CSF)" ou "polipéptido de bG-CSF" refere-se ao fator de estimulação de colónias de granulócitos ou G-CSF bovino como descrito acima, assim como um polipéptido que mantém pelo menos uma atividade biológica do bG-CSF natural. Os polipéptidos de bG-CSF incluem os sais e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisómeros do G-CSF bovino natural, assim como variantes agonistas, miméticas e antagonistas do G-CSF bovino natural e fusões de polipéptidos dos mesmos. Os exemplos de polipéptidos de bG-CSF e miméticos incluem aqueles descritos em WO 89/10932, Patentes U.S. N.° 5,849,883 e 6,497,869 na sua totalidade.

As fusões que compreendem aminoácidos adicionais na extremidade amino, extremidade carboxilo ou ambas, são abrangidas pelo termo "polipéptido de bG-CSF." As fusões ilustrativas incluem, mas não se limitam a, e.g., metionil bG-CSF em que uma metionina está ligada à extremidade N-terminal do bG-CSF (tal como o polipéptido na SEQ ID NO: 2) que resulta da expressão recombinante da forma madura de bG-CSF, fusões para o fim de purificação (que incluem, mas não se limitam a, poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com péptidos de ligação de albumina sérica e fusões com proteínas séricas tais como albumina sérica. As sequências de ácido nucleico e aminoácidos do bG-CSF natural para as formas de comprimento total e madura são conhecidas, assim como são as variantes tais como as variantes de um único aminoácido e as variantes de excisão-união. Para a sequência de aminoácidos do bG-CSF maduro, assim como para uma sequência de aminoácidos de metionil bG-CSF, ver SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respetivamente, no presente documento. São também conhecidas moléculas de ácido nucleico que codificam mutantes de hG-CSF e polipéptidos de hG-CSF mutante. 0 fator de estimulação de colónias de granulócitos bovino ou bG-CSF tem uma variedade de atividades biológicas, incluindo, mas não se limitando à ligação ao seu recetor, originar a dimerização do seu recetor, estimulação da produção de neutrófilos e estimulação da proliferação e diferenciação de células. Os exemplos de algumas das atividades biológicas do fator de estimulação de colónias de granulócitos e do hG-CSF são descritos acima e na Patente U.S. N.° 6,676,947; 6,579,525; 6,531,121; 6, 521,245; 6, 489,293; 6, 368,854; 6, 316, 254; 6, 268,336; 6, 239, 109; 6, 165,283; 5, 986, 047; 5, 830, 851; 5,043,156; e 5,773,569.

Como aqui utilizado, "polipéptido de G-CSF bovino," "polipéptido de bG-CSF," "G-CSF bovino" ou "bG-CSF" e formas hifenadas e não hifenadas dos mesmos devem incluir os polipéptidos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de um CSF, análogos de bG-CSF, mutantes de bG-CSF, bG-CSF glicosilado alterado, bG-CSF conjugado com PEG, isoformas de bG-CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG-CSF híbridas, proteínas de fusão, oligómeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação, variantes, variantes de excisão-união, e muteínas dos mesmos, independentemente da atividade biológica do mesmo, e ainda independentemente do método de síntese ou fabrico dos mesmos, incluindo, mas não se limitando aos métodos recombinantes (quer produzidos a partir de ADNc, ADN genómico, ADN sintético ou outra forma de ácido nucleico) , in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucleico, sintéticos, transgénicos e ativados por gene. O termo "polipéptido de G-CSF bovino," "polipéptido de bG-CSF," "G-CSF bovino" ou "bG-CSF" abrange polipéptidos de bG-CSF que compreendem uma ou mais substituições, adições ou supressões de aminoácidos. Ver Patente U.S. N.° 5,849,883, para análogos de G-CSF bovino.

Foram descritas substituições numa grande variedade de posições de aminoácidos no bG-CSF. As substituições incluem, mas não se limitam àquelas que modulam a estabilidade farmacêutica, aumentam a atividade agonista, aumentam a resistência à protease, convertem o polipéptido num antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo "polipéptido de bG-CSF," "polipéptido de G-CSF bovino," "G-CSF bovino" ou "bG-CSF."

Num aspeto adicional, a invenção proporciona ácidos nucleicos recombinantes que codificam a proteínas variantes, vetores de expressão que contêm os ácidos nucleicos variantes, células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos variantes e/ou vetores de expressão, e métodos de produção das proteínas variantes. Num aspeto adicional, a invenção proporciona o tratamento de uma infeção administrando a um animal uma proteína variante, geralmente com um veículo farmacêutico, numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Os mutantes de bG-CSF discutidos na Patente U.S. N.° 5,849,883, incluem polipéptidos concebidos com otimização do codão para E. coli e proteínas híbridas geradas com sequências de G-CSF bovino e humano. A Pat. U.S. N.° 5,416,195, na sua totalidade, descreve mutantes de hG-CSF em que foi efetuada pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos (a numeração de aminoácidos é relativamente à proteína madura; por conseguinte, quando está presente uma metionina N-terminal, é-lhe atribuída a posição -1 ou 0): Cysl7 da sequência nativa substituída por um resíduo Serl7, Asp27 da sequência nativa substituído por um resíduo Ser27, Leul5 da sequência nativa substituída por um resíduo Glul5, Lys23 da sequência nativa substituída por um resíduo Arg23, Gly28 da sequência nativa substituída por um resíduo Ala28, Lys40 da sequência nativa substituída por um resíduo Arg40, Pro44 da sequência nativa substituída por um resíduo Ala44, Leu49 da sequência nativa substituída por um resíduo Lys49, Gly55 da sequência nativa substituída por um resíduo Ala55, Cys60 da sequência nativa substituída por um resíduo Ser60, Prolll da sequência nativa substituída por um resíduo Glulll, Thrll5 da sequência nativa substituída por um resíduo Serll5 e Tyrl65 da sequência nativa substituída por um resíduo Argl65. Muitos destes resíduos estão presentes na sequência de bG-CSF e uma ou mais destas substituições podem encontrar-se num polipéptido de bG-CSF da invenção. Carter et al. Biologicals (2004) 32:37 descrevem um hG-CSF mutado que carece de sítios de glicosilação. Pode encontrar-se mutações semelhantes nos polipéptidos de bG-CSF da invenção.

Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF da invenção são substancialmente idênticos às SEQ ID NOs: 1, 2, ou qualquer outra sequência de um polipéptido de bG-CSF. As moléculas de ácido nucleico que codificam os polipéptidos de bG-CSF incluindo mutantes e os métodos para expressar e purificar polipéptidos de bG-CSF são bem conhecidos. 0 termo "polipéptido de bG-CSF" inclui também os sais e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisómeros do bG-CSF natural, assim como variantes agonistas, miméticas e antagonistas do bG-CSF natural e fusões de polipéptidos do mesmo. As fusões que compreendem aminoácidos adicionais na extremidade amino, extremidade carboxilo, ou ambas, são abrangidas pelo termo "polipéptido de bG-CSF." As fusões ilustrativas incluem, mas não se limitam a, e.g., metionil bG-CSF, em que uma metionina está ligada à extremidade N-terminal de bG-CSF, que resulta da expressão recombinante da forma madura de bG-CSF que carece do péptido lider ou sinal ou parte do mesmo (uma metionina encontra-se ligada à extremidade N-terminal do bG-CSF que resulta da expressão recombinante), fusões para o fim de purificação (que incluem, mas não se limitam a poli-histidina ou epítopos de afinidade) , fusões com péptidos de ligação de albumina sérica e fusões com proteínas séricas tais como albumina sérica. A Patente U.S. N.° 5,750,373, descreve um método para selecionar novas proteínas tais como variantes de hormonas de crescimento e de fragmentos de anticorpo que possuem propriedades de ligação modificadas para as suas respetivas moléculas recetoras. O método compreende fundir um gene que codifica uma proteína de interesse com o domínio carboxi-terminal da proteína de revestimento do gene III do fago filamentoso M13. As moléculas quiméricas compreendem bG-CSF e uma ou mais outras moléculas. A molécula quimérica pode conter regiões ou fragmentos específicos de um ou ambos de bG-CSF e da(s) outra(s) molécula(s). Qualquer um desses fragmentos pode ser preparado a partir das proteínas por métodos bioquímicos padrão ou por expressão de um polinucleótido que codifica o fragmento. 0 bG-CSF, ou um fragmento do mesmo, pode ser produzido como uma proteína de fusão que compreende albumina de soro humano (HSA), Fc ou uma porção do mesmo. Tais construções de fusão são adequadas para aumentar a expressão do bG-CSF, ou fragmento do mesmo, numa célula hospedeira eucariótica. As porções de HSA ilustrativas incluem o polipéptido N-terminal (aminoácidos 1-369, 1-419, e comprimentos intermédios que começam com o aminoácido 1), como divulgado na Pat. U.S. N.° 5,766,883, e publicação WO 97/24445. Outros polipéptidos quiméricos podem incluir uma proteína HSA com bG-CSF, ou fragmentos do mesmo, ligados a cada uma das extremidades C-terminal e N-terminal da HSA. Outras fusões podem ser geradas pela fusão de bG-CSF com a) a porção Fc de uma imunoglobulina; b) um análogo da porção Fc de uma imunoglobulina; e c) fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina. Várias referências divulgam a modificação de polipéptidos por conjugação de polímeros ou glicosilação. 0 termo "polipéptido de bG-CSF" inclui polipéptidos conjugados com um polímero tal como PEG e pode ser constituído por uma ou mais derivatizações adicionais de resíduos de cisteína, lisina ou outros. Além disso, o polipéptido de bG-CSF pode compreender uma unidade de ligação ou polímero, em que o aminoácido ao qual a unidade de ligação ou polímero é conjugado pode ser um aminoácido não natural de acordo com a presente invenção ou pode ser conjugado com um aminoácido codificado naturalmente utilizando técnicas conhecidas na matéria tais como acoplamento a lisina ou cisteína.

Foi descrita a modificação de polipéptidos com polímeros. 0 IFNp é mencionado como um exemplo de um polipéptido que pertence à superfamília da hormona de crescimento. A WO 00/23114 divulga IFNp glicosilado e peguilado. A WO 00/23472 divulga proteínas de fusão de IFN3. A Pat. U.S. N.° 4,904,584 divulga polipéptidos empobrecidos em lisina PEGuilados, em que pelo menos um resíduo de lisina foi suprimido ou substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido. A WO 99/67291 divulga um processo para conjugar uma proteína com PEG, em que é suprimido pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína e a proteína é posta em contacto com PEG sob condições suficientes para conseguir conjugação com a proteína. A WO 99/03887 divulga variantes PEGuiladas de polipéptidos que pertencem à superfamília da hormona de crescimento, em que um resíduo de cisteína foi substituído por um resíduo de aminoácido não essencial localizado numa região especificada do polipéptido. A WO 00/26354 divulga um método de produção de uma variante de polipéptido glicosilada com alergenicidade reduzida, a qual em comparação com um polipéptido parental correspondente compreende pelo menos um sítio de glicosilação adicional. A Pat. U.S. N.° 5,218,092 divulga a modificação do fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) e outros polipéptidos de forma a introduzir pelo menos uma cadeia de hidrato de carbono adicional em comparação com o polipéptido nativo. O termo "polipéptido de bG-CSF" inclui também bG-CSF glicosilado, tal como mas não se limitando a, polipéptidos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas ligadas a N ou ligadas a O do polipéptido. As variantes que contêm modificações de um único nucleótido são também consideradas como variantes biologicamente ativas do polipéptido de bG-CSF. As variantes que contêm modificações de um único nucleótido são também consideradas como variantes biologicamente ativas de bG-CSF. Além disso são também incluídas as variantes de excisão-união. O termo "polipéptido de bG-CSF" inclui também heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros ou homomultímeros de bG-CSF de qualquer um ou mais bG-CSF ou qualquer outro polipéptido, proteína, hidrato de carbono, polímero, molécula pequena, unidade de ligação, ligando ou outra molécula ativa de qualquer tipo, ligados por meios químicos ou expressos como uma proteína de fusão (ver Patente U.S. N.° 6,261,550; 6,166,183; 6,204,247; 6,261,550; 6,017,876), assim como análogos de polipéptidos que contêm, por exemplo, supressões ou outras modificações específicas que mantêm contudo a atividade biológica (Patente U.S. N.° 6,261,550; 6,004,548; 6,632,426).

Todas as referências a posições de aminoácidos na bG-CSF aqui descritas baseiam-se na posição na SEQ ID NO: 1, salvo indicação em contrário (i.e., quando é especificado que a comparação se baseia na SEQ ID NO: 2, ou outra sequência de bG-CSF). Por exemplo, o aminoácido na posição 1 de SEQ ID NO: 1 é uma treonina e a treonina correspondente está localizada na SEQ ID NO: 2 na posição 2. Os especialistas na técnica entenderão que as posições de aminoácidos correspondentes às posições na SEQ ID NO: 1 podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de bG-CSF tal como na SEQ ID NO: 2. Os especialistas na técnica entenderão que as posições de aminoácidos correspondente às posições na SEQ ID NO: 1, 2, ou qualquer outra sequência de bG-CSF podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de bG-CSF, tal como fusões, variantes, fragmentos, etc. de bG-CSF. Por exemplo, os programas de alinhamento de sequências, tais como o BLAST, podem ser utilizados para alinhar e identificar uma posição particular numa proteína que corresponde a uma posição na SEQ ID NO: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF. As substituições de aminoácidos aqui descritas relativamente à SEQ ID NO: 1, 2 ou outra sequência de bG-CSF pretendem também referir-se a substituições em posições correspondentes nas fusões, variantes, fragmentos, etc. de bG-CSF aqui descritos ou conhecidos na técnica e são expressamente abrangidas pela presente invenção. 0 termo "polipéptido de bG-CSF" ou "bG-CSF" abrange polipéptidos de bG-CSF que compreendem uma ou mais substituições, adições ou supressões de aminoácidos. Foi descrita uma substituição de aminoácido nos polipéptidos de bG-CSF naturais que modula a estabilidade farmacêutica, que modula uma ou mais atividades biológicas do polipéptido de bG-CSF tal como, mas não limitada a, aumenta a atividade agonista, aumenta a solubilidade do polipéptido, diminui a suscetibilidade a proteases, converte o polipéptido num antagonista, etc. e são abrangidas pelo termo "polipéptido de bG-CSF." Nalgumas formas de realização, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente numa região de ligação ao recetor da molécula de bG-CSF.

Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF compreendem ainda uma adição, substituição ou supressão que modula a atividade biológica do polipéptido de bG-CSF. Nalgumas divulgações, o polipéptidos de bG-CSF compreendem ainda uma adição, substituição ou supressão que modula a proliferação de neutrófilos, função e/ou diferenciação do polipéptido de bG-CSF. Por exemplo, as adições, substituições ou supressões podem modular uma ou mais propriedades ou atividades do bG-CSF. Por exemplo, as adições, substituições ou supressões podem modular a afinidade para um recetor, modular a semivida circulante, modular a semivida terapêutica, modular a estabilidade do polipéptido, modular a dissociação por proteases, modular a dose, modular a libertação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação, ou melhorar ou alterar uma via de administração particular. De forma semelhante, os polipéptidos de bG-CSF podem compreender sequências de dissociação por proteases, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (que incluem, mas não se limitam a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afinidade (que incluem, mas não se limitam a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (que incluem, mas não se limitam a, biotina) que melhoram a deteção (que inclui, mas não se limita a, GFP), purificação ou outras particularidades do polipéptido. 0 termo "polipéptido de bG-CSF" também abrange homodimeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros que se ligam, incluindo mas não se limitando àqueles que se ligam diretamente através de cadeias laterais de aminoácidos não codificados naturalmente, quer a cadeias laterais de aminoácidos não codificados naturalmente iguais ou diferentes, a cadeias laterais de aminoácidos codificados naturalmente, ou indiretamente através de uma unidade de ligação. As unidades de ligação ilustrativa incluem, mas não se limitam a, compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos tais como poli(etileno glicol) ou polidextrano, ou polipéptidos de vários comprimentos.

Um "aminoácido não codificado naturalmente" refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteina. Outros termos que podem ser utilizados como sinónimos do termo "aminoácido não codificado naturalmente" são "aminoácido não natural," "aminoácido não natural," "aminoácido que não ocorre naturalmente," e versões hifenadas e não hifenadas de forma diversa dos mesmos. O termo "aminoácido não codificado naturalmente" inclui também, mas não está limitado a, aminoácidos que ocorrem por modificação (e.g. modificações pós-tradução) de um aminoácido codificado naturalmente (que inclui, mas não se limita aos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteina) mas não são eles mesmo incorporados naturalmente numa cadeia polipeptídica em crescimento pelo complexo de tradução. Os exemplos desses aminoácidos não naturais incluem, mas não se limitam a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.

Um "grupo de modificação da extremidade amino" refere-se a qualquer molécula que possa ser ligada à extremidade amino de um polipéptido. De forma semelhante, um "grupo de modificação da extremidade carboxilo" refere-se a qualquer molécula que possa ser ligada à extremidade carboxilo de um polipéptido. Os grupos de modificação da extremidade incluem, mas não se limitam a, vários polímeros, péptidos ou proteínas solúveis em água tais como albumina sérica, ou outras unidades que aumentem a semivida sérica de péptidos.

Os termos "grupo funcional", "unidade ativa", "grupo de ativação", "grupo de saída", "sítio reativo", "grupo quimicamente reativo" e "unidade quimicamente reativa" são utilizados na técnica e aqui para se referir a porções ou unidades determináveis, distintas de uma molécula. Os termos são mais ou menos sinónimos nas técnicas químicas e são aqui utilizados para indicar as porções de moléculas que realizam alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas. 0 termo "ligação" ou "unidade de ligação" é aqui utilizado para referir-se a grupos ou ligações que se formam normalmente como consequência de uma reação química e são tipicamente ligações covalentes. Ligações estáveis hidroliticamente significa que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com a água a valores de pH úteis, incluindo, mas não se limitando às condições fisiológicas durante um intervalo de tempo prolongado, talvez até mesmo indefinidamente. Ligações instáveis ou degradáveis hidroliticamente significa que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo por exemplo, sangue. Ligações instáveis ou degradáveis enzimaticamente significa que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como entendido na técnica, o PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo de ligação entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polímero. Por exemplo, as ligações éster que se formam pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool num agente biologicamente ativo geralmente hidrolisam sob condições fisiológicas para libertar o agente. Outras ligações degradáveis hidroliticamente incluem, mas não se limitam a, ligações carbonato; ligações imina que resultam da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster de fosfato que se formam fazendo reagir um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto da reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reação de um formato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, mas não se limitando a, um grupo amina na extremidade de um polímero tal como PEG e um grupo carboxilo de um péptido; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não se limitando a, um grupo fosforamidita na extremidade de um polímero e um grupo hidroxilo 5' de um oligonucleótido. 0 termo "molécula biologicamente ativa", "unidade biologicamente ativa" ou "agente biologicamente ativo" quando aqui utilizado significa qualquer substância que possa afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula ou interação referente a um organismo, incluindo, mas não se limitando a, vírus, bactérias, bacteriófagos, transposões, priões, insetos, fungos, plantas, animais e humanos. Em particular, como aqui utilizado, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não se limitam a, qualquer substância que se destina ao diagnóstico, cura, alívio, tratamento ou prevenção de doença em humanos ou outros animais, ou de outro modo à melhoria do bem-estar físico ou mental de humanos ou animais. Os exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não se limitam a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequena, vacinas, imunogénios, fármacos duro, fármacos suaves, hidratos de carbono, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lípidos, nucleósidos, radionuclídeos, oligonucleótidos, toxoides, toxinas, células procarióticas e eucarióticas, vírus, polissacáridos, ácidos nucleicos e porções dos mesmos obtidos ou derivados de vírus, bactérias, insetos, animais ou qualquer outra célula ou tipo de células, lipossomas, micropartículas e micelas. Os polipéptidos de bG-CSF podem ser adicionados numa formulação micelar. As classes de agentes biologicamente ativos que são adequadas para utilização com a invenção incluem, mas não se limitam a, fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de contraste, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedade, hormonas, fatores de crescimento, agentes esteroides, toxinas derivadas de micróbios e semelhantes.

Um "polímero bifuncional" refere-se a um polímero que compreende dois grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras unidades (que incluem, mas não se limitam a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Uma unidade de ligação bifuncional que tem um grupo funcional reativo com um grupo num componente biologicamente ativo particular e outro grupo reativo com um grupo num segundo componente biológico pode ser utilizada para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente ativo, a unidade de ligação bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. São conhecidos muitos procedimentos e moléculas de ligação para fixação de vários compostos em péptidos. Ver, e.g.,

Pedido de Patente Europeia N.° 188,256; Patentes U.S. N.° 4, 671, 958, 4, 659, 839, 4,414, 148, 4, 699, 784; 4, 680,338; e 4,569,789. Um "polímero multifuncional" refere-se a um polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras unidades (que incluem, mas não se limitam a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ser de qualquer comprimento ou peso molecular desejado, e pode ser selecionado para proporcionar um espaçamento ou conformação particular desejado entre uma ou mais moléculas ligadas ao bG-CSF e seu recetor ou bG-CSF.

Quando os grupos substituintes são especificados pelas suas fórmulas quimicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, aqueles abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam de escrever a estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura -CH2O- é equivalente à estrutura -OCH2-. 0 termo "substituintes" inclui mas não está limitado a "substituintes não interferentes". "Substituintes não interferentes" são aqueles grupos que produzem compostos estáveis. Os substituintes ou radicais não interferentes adequados incluem, mas não se limitam a, halo, alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, alcinilo C2-C10, alcoxilo C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloalcenilo C3-C12, fenilo, fenilo substituído, toluoílo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulf inilo C1-C6, alquilsulf onilo C1-C10, -- (CH2) (alquilo C1-C10) em que m é desde 1 a 8, arilo, arilo substituído, alcoxilo substituído, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquilo, --NO2, --CN, --NRC (0)--(alquilo C1-C10) , --C (0)--(alquilo C1-C10) , alquiltioalquilo C2-C10, --C(0)0-- (alquilo C1-C10) , --0H, --SO2, =S, --C00H, --NR2, carbonilo, --C (0)--(alquil C1-C10) -CF3, -C(0)-CF3, --C(0)NR2, --(aril C1-C10)-S--(arilo C6-Cio) , --C (0)--(arilo C1-C10) , --(CH2)m-- 0- (--(CH2) m--0--(alquilo C1-C10) em que cada m é desde 1 a 8, —C(0)NR2, —C(S)NR2, —S02NR2, —NRC(O) NR2, —NRC(S)NR2, sais dos mesmos, e semelhantes. Cada R como aqui utilizado é H, alquilo ou alquilo substituído, arilo ou arilo substituído, aralquilo ou alcarilo. 0 termo "haloqéneo" inclui flúor, cloro, iodo e bromo. 0 termo "alquilo," por si mesmo ou como parte de outro substituinte, siqnifica, salvo indicação em contrário, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical hidrocarboneto cíclico, ou combinação dos mesmos, o qual pode ser totalmente saturado, mono- ou poli-insaturado e pode incluir radicais di- e multivalentes, que tem o número de átomos de carbono designado (i.e. Ci-Cio significa um a dez carbonos). Os exemplos de radicais hidrocarboneto saturados incluem, mas não se limitam a, grupos tais como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclo-hexilo, (ciclo-hexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por exemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo e semelhantes. Um grupo alquilo insaturado é um que tem uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Os exemplos de grupos alquilo insaturados incluem, mas não se limitam a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4- pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- e 3-propinilo, 3-butinilo, e os homólogos e isómeros superiores. 0 termo "alquilo," salvo disposição em contrário, destina-se também a incluir aqueles derivados de alquilo definidos em mais pormenor abaixo, tais como "heteroalquilo." Os grupos alquilo que estão limitados a grupos hidrocarboneto são denominados "homoalquilo". 0 termo "alquileno" por si mesmo ou como parte de outro substituinte significa um radical bivalente derivado de um alcano, como exemplificado, mas não limitado, pelas estruturas -CH2CH2- e -CH2CH2CH2CH2-, e inclui ainda os grupos descritos abaixo como "heteroalquileno." Tipicamente, um grupo alquilo (ou alquileno) terá desde 1 a 24 átomos de carbono, sendo os grupos com 10 ou menos átomos de carbono uma forma de realização particular dos métodos e composições aqui descritos. Um "alquilo inferior" ou "alquileno inferior" é um grupo alquilo ou alquileno de cadeia mais curta, que tem geralmente oito ou menos átomos de carbono.

Os termos "alcoxilo," "alquilamino" e "alquiltio" (ou tioalcoxilo) são utilizados no seu sentido convencional e referem-se aos grupos alquilo ligados ao resto da molécula através de um átomo de oxigénio, um grupo amino ou um átomo de enxofre, respetivamente. O termo "heteroalquilo," por si mesmo ou em combinação com outro termo, significa, salvo indicação em contrário, uma cadeia linear ou ramificada estável, ou radical hidrocarboneto ciclico, ou combinações dos mesmos, que consiste no número especificado de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em 0, N, Si e S, e em que os átomos de azoto e enxofre podem estar opcionalmente oxidados e o heteroátomo de azoto pode estar opcionalmente quaternizado. 0(s) heteroátomo(s) 0, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interior do grupo heteroalquilo ou na posição em que o grupo alquilo está ligado ao resto da molécula. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S (0) -CH3, -CH2-CH2-S (0) 2-CH3, -ch=ch-o-ch3, -Si (CH3) 3, -CH2-CH=N-OCH3 e -CH=CH-N (CH3) -CH3. Podem estar consecutivos até dois heteroátomos tais como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-0-Si(CH3)3. De forma semelhante, o termo "heteroalquileno, " por si mesmo ou como parte de outro substituinte, significa um radical bivalente derivado de heteroalquilo, como exemplificado por, mas não limitado a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para os grupos heteroalquileno, heteroátomos iguais ou diferentes podem ocupar também qualquer uma ou ambas as extremidades da cadeia (incluindo, mas não se limitando a, alquilenooxilo, alquilenodioxilo, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno e semelhantes). Ainda além disso, para os grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, não é sugerida qualquer orientação do grupo de ligação pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula - C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(C»2-.

Os termos "cicloalquilo" e "heterocicloalquilo", por si mesmos ou em combinação com outro termos, representam, salvo indicação em contrário, versões cíclicas de "alquilo" e "heteroalquilo", respetivamente. Assim, um cicloalquilo ou heterocicloalquilo inclui ligações de anel saturado, parcialmente insaturado e totalmente insaturado. Além disso, para o heterocicloalquilo, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo está ligado ao resto da molécula. Os exemplos de cicloalquilo incluem, mas não se limitam a, ciclopentilo, ciclo-hexilo, 1-ciclo-hexenilo, 3-ciclo-hexenilo, ciclo-heptilo e semelhantes. Os exemplos de heterocicloalquilo incluem, mas não se limitam a, 1-(1,2,5,6-tetra-hidropiridilo), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetra-hidrofuran-2-ilo, tetra-hidrofuran-3-ilo, tetra-hidrotien-2-ilo, tetra-hidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo e semelhantes. Além disso, o termo abrange estruturas bicíclicas e tricíclicas em anel. De forma semelhante, o termo "heterocicloalquileno" por si mesmo ou como parte de outro substituinte significa um radical bivalente derivado de heterocicloalquilo e o termo "cicloalquileno" por si mesmo ou como parte de outro substituinte significa um radical bivalente derivado de cicloalquilo.

Como aqui utilizado, o termo "polímero solúvel em água" refere-se a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a polipéptidos de bG-CSF podem resultar em alterações, incluindo, mas não se limitando a, semivida no soro aumentada ou modulada, ou semivida terapêutica aumentada ou modulada relativamente à forma não modificada, imunogenicidade modulada, caracteristicas de associação física moduladas tais como agregação e formação de multímeros, ligação ao recetor alterada, ligação alterada a um ou mais parceiros de ligação, e dimerização ou multimerização do recetor alterada. 0 polímero solúvel em água pode ter ou pode não ter a sua própria atividade biológica, e pode ser utilizado como uma unidade de ligação para unir o bG-CSF a outras substâncias, incluindo, mas não se limitando a, um ou mais polipéptidos de bG-CSF, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Os polímeros adequados incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol, polietileno glicol propionaldeído, derivados de mono alcoxilo C1-C10 ou ariloxilo do mesmo (descritos na Patente U.S. N.° 5,252,714), monometoxi-polietileno glicol, polivinil-pirrolidona, poli(álcool vinílico), poliaminoácidos, anidrido maleico de éter divinílico, N-(2-Hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano que incluem o sulfato de dextrano, polipropileno glicol, copolímero de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacáridos, oligossacáridos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, mas não se limitando a, metilcelulose e carboximetilcelulose, amido e derivados de amido, polipéptidos, polialquileno glicol e seus derivados, copolímeros de polialquileno glicóis e seus derivados, poli(éteres vinílicos e etílicos), e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e semelhantes, ou misturas dos mesmos. Os exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol e albumina sérica. A WO 03/074087 e a WO 03/074088 descrevem a conjugação de proteínas ou moléculas pequenas a hidroxialquilamido (HAS). Os exemplos de hidroxialquil-amidos incluem, mas não se limitam a, hidroxietilamido. Por exemplo, os conjugados de hidroxialquilamido e outra molécula podem compreender uma ligação covalente entre grupos aldeído terminais do HAS e grupos reativos da outra molécula.

Como aqui utilizado, o termo "polialquileno glicol" ou "poli(alceno glicol)" refere-se a polietileno glicol (poli(etileno glicol)), polipropileno glicol, polibutileno glicol e seus derivados. O termo "polialquileno glicol" abrange tanto polímeros lineares como ramificados e pesos moleculares médios entre 0,1 kDa e 100 kDa. Outras formas de realização ilustrativas são listadas, por exemplo, nos catálogos de fornecedores comerciais, tais como o catálogo da Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).

O termo "arilo" significa, salvo indicação em contrário, urn substituinte hidrocarboneto poli-insaturado, aromático que pode ter um único anel ou múltiplos anéis (que incluem, mas não estão limitados a, desde 1 a 3 anéis) que estão fundidos em conjunto ou ligados covalentemente. O termo "heteroarilo" refere-se a grupos arilo (ou anéis) que contêm desde um a quatro heteroátomos selecionados de N, O e S, em que os átomos de azoto e enxofre estão opcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s) de azoto estão opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarilo pode estar ligado ao resto da molécula através de um heteroátomo. Os exemplos não limitativos de grupos arilo e heteroarilo incluem fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3- isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4- tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo e 6-quinolilo. Os substituintes para cada um dos sistemas de anel arilo e heteroarilo assinalados acima são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis descritos abaixo.

Para abreviar, o termo "arilo" quando utilizado em combinação com outros termos (que incluem, mas não se limitam a, ariloxilo, ariltioxilo, arilalquilo) inclui tanto anéis arilo como heteroarilo, como definidos acima. Assim, o termo "arilalquilo" destina-se a incluir aqueles radicais em que um grupo arilo está ligado a um grupo alquilo (que incluem, mas não se limitam a, benzilo, fenetilo, piridilmetilo e semelhantes) que inclui os grupos alquilo em que um átomo de carbono (que inclui, mas não se limitado a, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigénio (que incluem, mas não se limitam a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3 —(1 — naftiloxi)propilo e semelhantes).

Cada um dos termos anteriores (que incluem, mas não se limitam a, "alquilo," "heteroalquilo," "arilo" e "heteroarilo") destina-se a incluir tanto formas substituídas como não substituídas do radical indicado. A seguir são proporcionados os substituintes ilustrativos para cada tipo de radical.

Os substituintes para os radicais alquilo e heteroalquilo (que incluem os grupos frequentemente referidos como alquileno, alcenilo, heteroalquileno, heteroalcenilo, alcinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalcenilo e heterocicloalcenilo) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados de, mas que não se limitam a: -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -halogéneo, -SiR,R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R", -0C(O)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"' , -NR"C(0) 2R' , -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S (0) R' , -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN e -N02 num número que varia desde zero a (2m'+l), em que m' é o número total de átomos de carbono num tal radical. R', R", R" ' e R"" referem-se, cada, independentemente a grupos hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo, mas não se limitando a, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo ou tioalcoxilo, ou grupos arilalquilo. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como o são cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando está presente mais do que um destes grupos. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, aqueles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" destina-se a incluir, mas não está limitado a, 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. Da discussão anterior de substituintes, um especialista na técnica entenderá que o termo "alquilo" se destina a incluir grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos diferentes de grupos hidrogénio, tais como haloalquilo (que incluem, mas não se limitam a, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (que incluem, mas não se limitam a, -C(0)CH3, -C (0) CF3, -C (0) CH2OCH3 e semelhantes).

De forma semelhante aos substituintes descritos para o radical alquilo, os substituintes para os grupos arilo e heteroarilo são diversos e são selecionados de, mas que não se limitam a: halogéneo, -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -halogéneo, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S (0) R' , -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', -CN e -NO2, -R', -N3, -CH (Ph) 2, f luoroalcoxilo (C1-C4) e f luoroalquilo (C1-C4) , num número que varia desde zero até ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e em que R', R", R" ' e R"" são independentemente selecionados de hidrogénio, alquilo, heteroalquilo, arilo e heteroarilo. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como o são cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando está presente mais do que um destes grupos.

Como aqui utilizado, o termo "semivida no soro modulada" significa a alteração positiva ou negativa na semivida circulante de um bG-CSF modificado relativamente à sua forma não modificada. A semivida no soro é medida por colheita de amostras de sangue em vários pontos no tempo após administração de bG-CSF, e determinação da concentração dessa molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite o cálculo da semivida no soro. De modo desejável, o aumento da semivida no soro é de pelo menos cerca de duas vezes, mas um aumento mais pequeno pode ser útil, por exemplo quando possibilita um regime posológico satisfatório ou evita um efeito tóxico. Nalgumas formas de realização, o aumento é de pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes. 0 termo "semivida terapêutica modulada" como aqui utilizado significa a alteração positiva ou negativa na semivida da quantidade terapeuticamente eficaz de bG-CSF, relativamente à sua forma não modificada. A semivida terapêutica é medida pela medição das propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos no tempo após administração. De modo desejável, o aumento da semivida terapêutica possibilita um regime posológico benéfico particular, uma dose total benéfica particular ou evita um efeito indesejado. Nalgumas formas de realização, o aumento da semivida terapêutica resulta do aumento da potência, aumento ou diminuição da ligação da molécula modificada ao seu alvo, aumento ou diminuição da degradação da molécula por enzimas tais como proteases, ou de um aumento ou diminuição noutro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um aumento ou diminuição na depuração da molécula mediada pelo recetor. 0 termo "isolado," quando se aplica a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína está isento de, pelo menos, alguns dos componentes celulares com os quais está associado no estado natural, ou que o ácido nucleico ou proteína foi concentrado até um nível superior à concentração da sua produção in vivo ou in vitro. Pode estar num estado homogéneo. As substâncias isoladas podem estar num estado seco ou semisseco, ou em solução, incluindo, mas não se limitando a, uma solução aquosa. Pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando técnicas químicas analíticas, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que é a espécie predominante presente numa preparação está substancialmente purificada.

Em particular, um gene isolado é separado de grelhas de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. 0 termo "purificado" denota que um ácido nucleico ou proteína dá origem essencialmente a uma banda num gel eletroforético. Particularmente, pode significar que o ácido nucleico ou proteína é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 99% puro, ou mais. O termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos ou ribonucleótidos, e polímeros dos mesmos na forma de cadeia simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos de nucleótidos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleótidos naturais. A menos que especificamente limitado de outro modo, o termo refere-se também a análogos de oligonucleótidos que incluem PNA (ácido peptidonucleico), análogos de ADN utilizados em tecnologia antissentido (fosforotioatos, fosforoamidatos e semelhantes). Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente variantes modificadas de forma conservadora daquela (que incluem, mas não se limitam a, substituições de codões degeneradas) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de codões degeneradas podem ser conseguidas gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) codões selecionados está substituída por resíduos de bases misturadas e/ou desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Os termos "polipéptido," "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indistintamente para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Isto é, uma descrição dirigida a um polipéptido aplica-se igualmente a uma descrição de um péptido e a uma descrição de uma proteína, e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos naturais, assim como polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um aminoácido não codificado naturalmente. Como aqui utilizado, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas covalentes. O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e não naturais, assim como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira semelhante aos aminoácidos naturais. Os aminoácidos codificados naturalmente são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirrolisina e selenocisteina. Análogos de aminoácidos refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, i.e., um carbono α que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, tal como homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfónio de metionina. Esses análogos têm grupos R modificados (tais como, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido natural. A referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogénicos naturais; D-aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados tais como variantes e derivados de aminoácidos; aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc.; e compostos sintetizados quimicamente que têm propriedades conhecidas na técnica como sendo características de aminoácidos. Os exemplos de aminoácidos não naturais incluem, mas não se limitam a, a-metil-aminoácidos (e.g., α-metil-alanina), D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes a histidina (e.g., 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homo-histidina, a-fluorometil-histidina e a-metil-histidina), aminoácidos que têm um metileno extra na cadeia lateral ("homo" aminoácidos) e aminoácidos em que um grupo funcional ácido carboxílico na cadeia lateral está substituído por um grupo ácido sulfónico (e.g., ácido cisteico). A incorporação de aminoácidos não naturais, que incluem aminoácidos não nativos sintéticos, aminoácidos substituídos ou um ou mais D-aminoácidos nas proteínas da presente invenção pode ser vantajosa num número de maneiras diferentes. Os péptidos que contêm D-aminoácidos, etc., exibem uma estabilidade in vitro ou in vivo aumentada em comparação com os homólogos que contêm L-aminoácidos. Assim, a construção de péptidos, etc., que incorporam D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando for desejada ou necessária maior estabilidade intracelular. Mais especificamente, os D-péptidos, etc., são resistentes às peptidases e proteases endógenas, proporcionando desse modo uma biodisponibilidade melhorada da molécula e tempos de vida prolongados in vivo quando essas propriedades são desejáveis. Além disso, os D-péptidos, etc., não podem ser processados de forma eficaz para apresentação, restringida ao complexo principal de histocompatibilidade classe II, às células T auxiliares e têm, portanto, menor probabilidade de induzir respostas imunológicas humorais em todo o organismo.

Os aminoácidos podem ser aqui referidos pelos seus símbolos de três letras comummente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Do mesmo modo, os nucleótidos podem ser referidos pelos seus códigos de uma letra comummente aceites. "Variantes modificadas de forma conservadora" aplica-se tanto a sequências de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácidos nucleicos particulares, "variantes modificadas de forma conservadora" refere-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou, quando o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam uma determinada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em todas as posições em que uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser modificado para qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas," que são uma espécie de variações modificadas conservadoramente. Aqui, todas as sequências de ácido nucleico que codificam um polipéptido também descrevem todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Um especialista com conhecimentos médios na matéria reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (exceto AUG, o qual é normalmente o único codão para metionina, e TGG, o qual é normalmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita em cada sequência descrita.

No que se refere às sequências de aminoácidos, um especialista com conhecimentos médios na matéria reconhecerá que substituições, supressões ou adições particulares a uma sequência de ácido nucleico, péptido, polipéptido ou proteína que altere, adicione ou suprima um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada conservadoramente" quando a alteração resulte na supressão de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituições conservadoras que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Tais variantes modificadas de forma conservadora acrescem e não excluem variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos da invenção.

As tabelas de substituições conservadoras que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Os seguintes oito grupos contêm, cada, aminoácidos que são substituições conservadoras uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteina (C), Metionina (M) (ver, e.g., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (dezembro de 1993) 0 termo "idêntico" ou percentagem de "identidade, " no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. As sequências são "substancialmente idênticas" se têm uma percentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são iguais (i.e., cerca de 60% de identidade, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% de identidade ao longo de uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada como medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências (ou outros algoritmos disponíveis para os especialistas com conhecimentos médios na matéria) ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição refere-se também ao complemento de uma sequência de ensaio. A identidade pode existir ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento, ou ao longo de uma região que tem 75-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência de um polinucleótido ou polipéptido. Um polinucleótido que codifica um polipéptido da presente invenção, incluindo homólogos de espécies diferentes do ser humano, pode ser obtido por um processo que compreende os passos de triagem de uma biblioteca sob condições de hibridação restringentes com uma sonda marcada que tem uma sequência polinucleotídica da invenção ou um fragmento da mesma, e isolamento do ADNc de comprimento total e de clones genómicos que contêm a referida sequência polinucleotidica. Essas técnicas de hibridação são bem conhecidas pelo especialista.

Para a comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual são comparadas as sequências de ensaio. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de ensaio e referência são introduzidas num computador, são designadas as coordenadas das subsequências, se for necessário, e são definidos os parâmetros do programa de algoritmo de sequências. Podem ser utilizados os parâmetros por defeito do programa ou podem ser designados parâmetros alternativos. 0 algoritmo de comparação de sequências calcula em seguida as percentagens de identidade de sequência para as sequências de ensaio relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como aqui utilizada, inclui a referência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas selecionadas do grupo que consiste em desde 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas depois de as duas sequências terem sido alinhadas de forma ótima. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. 0 alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, incluindo mas não se limitando a, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia of Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, e.g., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respetivamente. O software para realizar as análises BLAST encontra-se publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information disponível na Rede Mundial de Computadores em ncbi.nlm.nih.gov. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X, determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como parâmetros por defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como parâmetros por defeito um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST é tipicamente realizado com o filtro de "baixa complexidade" desligado. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, e.g., Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787). Uma medição de semelhança proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade de uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos ocorrer por causas aleatórias. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma numa comparação do ácido nucleico de ensaio com o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,2, ou inferior a cerca de 0,01 ou inferior a cerca de 0,001. A frase "hibrida seletivamente (ou especificamente) com" refere-se à ligação, formação de hélices duplas ou hibridação de uma molécula apenas com uma sequência de nucleótidos particular sob condições de hibridação restringentes, quando essa sequência está presente numa mistura complexa (que inclui, mas não se limita a, ADN ou ARN celular total ou de bibliotecas). A frase "condições de hibridação restringentes" refere-se à hibridação de sequências de ADN, ARN, PNA ou outros miméticos de ácido nucleico, ou combinações dos mesmos sob condições de baixa força iónica e alta temperatura como é conhecido na técnica. Tipicamente, sob condições restringentes uma sonda hibridará com a sua subsequência alvo numa mistura complexa de ácido nucleico (que inclui, mas não se limita a, ADN ou ARN celular total ou de bibliotecas) mas não hibrida com outras sequências na mistura complexa. As condições restringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As sequências mais compridas hibridam especificamente a temperaturas mais altas. Um guia extenso sobre a hibridação de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Em geral, as condições restringentes são selecionadas de modo a serem 5-10 °C abaixo do ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica a um pH de força iónica definida. O Tm é a temperatura (sob força iónica, pH e concentração de nucleico definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio (uma vez que as sequências alvo estão presentes em excesso, ao Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). As condições restringentes podem ser aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de ião sódio, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de ião sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (que incluem, mas não se limitam a, 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (que incluem, mas não se limitam a, maiores do que 50 nucleótidos). As condições restringentes podem ser também conseguidas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Para hibridação seletiva ou especifica, um sinal positivo pode ser pelo menos duas vezes a hibridação de base, opcionalmente 10 vezes a hibridação de base. Condições de hibridação restringentes ilustrativas podem ser as seguintes: 50% de formamida, SSC 5X e 1% de SDS, incubação a 42 °C, ou SSC 5X, 1% de SDS, incubação a 65 °C, com lavagem em SSC 0,2X, e 0,1% de SDS a 65 °C. Tais lavagens podem ser realizadas durante 5, 15, 30, 60, 120 ou mais minutos.

Como aqui utilizado, o termo "eucariota" refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya tais como animais (que incluem, mas não se limitam a, mamíferos, insetos, répteis, aves, etc.), ciliados, plantas (que incluem, mas não se limitam a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc.

Como aqui utilizado, o termo "não eucariota" refere-se a organismos não eucarióticos. Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (que inclui, mas não se limita a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.) ou ao domínio filogenético Archaea (que inclui, mas não se limita a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii e espécies Halobacterium NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furíosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.). 0 termo "indivíduo" como aqui utilizado, refere-se a um animal, em algumas formas de realização, um mamífero e noutras formas de realização um humano, que é o objeto de tratamento, observação ou experiência. Um animal pode ser um animal de companhia (e.g., cães, gatos e semelhantes), animal de exploração pecuária (e.g., vacas, ovelhas, porcos, cavalos e semelhantes) ou um animal de laboratório (e.g., ratazanas, murganhos, porquinhos-da-índia e semelhantes). 0 termo "quantidade eficaz" como aqui utilizado refere-se à quantidade de polipéptido de aminoácido não natural modificado a ser administrada que aliviará, em certa medida, um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio a ser tratado. As composições que contêm o polipéptido de aminoácido não natural modificado aqui descrito podem ser administradas para tratamentos profiláticos, de melhoria e/ou terapêuticos.

Os termos "melhorar" ou "melhoria" significa aumentar ou prolongar em potência ou duração um efeito desejado. Assim, no que se refere à melhoria do efeito de agentes terapêuticos, o termo "melhoria" refere-se à capacidade para aumentar ou prolongar, em potência ou duração, o efeito de outros agentes terapêuticos num sistema. Uma "quantidade eficaz para melhorar," como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade adequada para aumentar o efeito de outro agente terapêutico num sistema desejado. Quando utilizado num animal, as quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade e evolução da doença, distúrbio ou condição, terapia anterior, do estado de saúde do animal e resposta aos fármacos, e da avaliação do veterinário assistente. 0 termo "modificado," como aqui utilizado, refere-se a quaisquer alterações feitas num determinado polipéptido, tais como alterações ao comprimento do polipéptido, à sequência de aminoácidos, estrutura química, modificação cotradução ou modificação pós-tradução de um polipéptido. A forma "(modificado)" do termo significa que os polipéptidos em discussão estão opcionalmente modificados, isto é, os polipéptidos em discussão podem ser modificados ou não modificados. 0 termo "modificado pós-tradução" refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre nesse aminoácido depois de ter sido incorporado numa cadeia polipeptídica. 0 termo abrange, apenas a título de exemplo, modificações cotradução in vivo, modificações cotradução in vitro (tais como num sistema de tradução sem células), modificações pós-tradução in vivo e modificações pós-tradução in vitro.

Nas aplicações profiláticas, as composições que contêm o polipéptido de bG-CSF são administradas a um animal suscetível a, ou de outro modo em risco de, uma doença, distúrbio ou condição particular. Uma tal quantidade é definida como sendo uma "quantidade profilaticamente eficaz." Nesta utilização, as quantidades exatas dependem também do estado de saúde, peso, e semelhantes, do animal. Considera-se que a determinação dessas quantidades profilaticamente eficazes por experiências de rotina (e.g., um ensaio clínico de aumento progressivo da dose) se encontra bem dentro da perícia na técnica. 0 termo "protegido" refere-se à presença de um "grupo de proteção" ou unidade que impede a reação do grupo funcional quimicamente reativo em certas condições reacionais. 0 grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo que é protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) e 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo de proteção pode ser dissulfureto de ortopiridilo. Se o grupo quimicamente reativo é um ácido carboxilico, tal como ácido butanoico ou propiónico, ou um grupo hidroxilo, o grupo de proteção pode ser benzilo ou um grupo alquilo tal como metilo, etilo ou terc-butilo. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica podem ser também utilizados em, ou com, os métodos e composições aqui descritos, incluindo os grupos fotossensiveis tais como Nvoc e MeNvoc. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica podem ser também utilizados em, ou com, os métodos e composições aqui descritos.

Apenas a titulo de exemplo, os grupos de bloqueio/proteção podem ser selecionados de:

Outros grupos de proteção são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999.

Nas aplicações terapêuticas, as composições que contêm o polipéptido de aminoácido não natural modificado são administradas a um animal que já sofre de uma doença, condição ou distúrbio, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da doença, distúrbio ou condição. Uma tal quantidade é definida como sendo uma "quantidade terapeuticamente eficaz," e dependerá da gravidade e evolução da doença, distúrbio ou condição, terapia anterior, do estado de saúde do animal e resposta aos fármacos, e da avaliação do veterinário assistente. Considera-se que a determinação de tais quantidades terapeuticamente eficazes por experiências de rotina (e.g., um ensaio clínico de aumento progressivo da dose) se encontra bem dentro da perícia na técnica. 0 termo "tratamento" é utilizado para referir-se ao tratamento profilático e/ou terapêutico.

Os polipéptidos de aminoácidos não codificados naturalmente aqui apresentados podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo que tem uma massa atómica ou um número de massa diferente da massa atómica ou do número de massa que geralmente se encontra na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36C1, respetivamente. Certos compostos marcados isotopicamente aqui descritos, por exemplo aqueles em que são incorporados isótopos radioativos tais como 3H e 14C, podem ser úteis em ensaios de distribuição de fármacos e/ou substratos no tecido. Além disso, a substituição com isótopos tais como deutério, i.e., 2H, podem proporcionar certas vantagens terapêuticas que resultam da maior estabilidade metabólica, por exemplo maior semivida in vivo ou menores requisitos de dosagem.

Todos os isómeros incluindo, mas não se limitando a, diastereómeros, enantiómeros e misturas dos mesmos são considerados como parte das composições aqui descritas. Em formas de realização adicionais ou noutras formas de realização, os polipéptidos de aminoácidos não codificados naturalmente são metabolizados, após administração a um organismo que o necessita, para produzir um metabolito que é então utilizado para produzir um efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Noutras ou em formas de realização adicionais, encontra-se os metabolitos ativos dos polipéptidos de aminoácidos não codificados naturalmente.

Nalgumas situações, os polipéptidos de aminoácidos não codificados naturalmente podem existir como tautómeros. Além disso, os polipéptidos de aminoácidos não codificados naturalmente aqui descritos podem existir em formas não solvatadas, assim como em formas solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol e semelhantes. Considera-se que as formas solvatadas estão também aqui divulgadas. Os especialistas com conhecimentos médios na matéria reconhecerão que alguns dos compostos neste documento podem existir em várias formas tautoméricas. Considera-se que todas essas formas tautoméricas são parte das composições aqui descritas.

Salvo indicação em contrário, utiliza-se os métodos convencionais de espetroscopia de massa, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e farmacologia, dentro da perícia na técnica.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução

Na invenção são proporcionadas moléculas de b-GCSF que compreendem um aminoácido não natural. Em certas divulgações da invenção, o polipéptido de b-GCSF com pelo menos um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós-tradução. Numa divulgação, a pelo menos uma modificação pós-tradução compreende a ligação de uma molécula, incluindo, mas não se limitando a, hidroxialquilamido (HAS), hidroxietilamido (HES), uma etiqueta, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotorreticulante, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma etiqueta de afinidade, uma etiqueta de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metais, um cofator, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um ADN, um ARN, um polinucleótido antissentido, um sacárido, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícuia, uma etiqueta de spin, um fluoróforo, uma unidade que contém metal, uma unidade radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, uma unidade fotoativável, uma unidade excitável por radiação actínica, uma unidade fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma unidade que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente dissociável, um grupo fotodissociável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente ativo redox, um aminotioácido, uma unidade tóxica, uma unidade marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em eletrões, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, uma etiqueta detetável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleótido, um radiotransmissor, um agente de captura de neutrões, ou qualquer combinação dos anteriores ou qualquer outro composto ou substância desejável, que compreende um segundo grupo reativo com pelo menos um aminoácido não natural que compreende um primeiro grupo reativo utilizando metodologia química que é conhecida por um especialista com conhecimentos médios na matéria como sendo adequada para os grupos reativos particulares. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é uma unidade alcinilo (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargilo é também por vezes referido como uma unidade acetileno) e o segundo grupo reativo é uma unidade azido, e utiliza-se metodologias químicas de cicloadição [3+2]. Noutro exemplo, o primeiro grupo reativo é a unidade azido (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a unidade alcinilo. Em certas divulgações do polipéptido de b-GCSF modificado da presente invenção, utiliza-se pelo menos um aminoácido não natural (que inclui, mas não se limita ao aminoácido não natural que contém um grupo funcional ceto) que compreende pelo menos uma modificação pós-tradução, em que a pelo menos uma modificação pós-tradução compreende uma unidade sacarídea. Em certas formas de realização, a modificação pós-tradução é feita in vivo numa célula eucariótica ou numa célula não eucariótica. Uma unidade de ligação, polímero, polímero solúvel em água ou outra molécula pode ligar a molécula ao polipéptido. A molécula pode ser ligada diretamente ao polipéptido.

Em certas formas de realização, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula hospedeira, em que a modificação pós-tradução não é normalmente feita por outro tipo de célula hospedeira. Em certas formas de realização, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que a modificação pós-tradução não é normalmente feita por uma célula não eucariótica. Os exemplos de modificações pós-tradução incluem, mas não se limitam a, glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lípidos, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação da ligação glicolipídica e semelhantes.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente para glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lípidos, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação ou modificação da ligação glicolipídica do polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente para glicosilação do polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos codificados naturalmente para glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lípidos, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação ou modificação da ligação glicolipídica do polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende um aminoácido codificado naturalmente para glicosilação do polipéptido.

Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende uma substituição de aminoácido não codificado naturalmente que melhora a glicosilação do polipéptido. Nalgumas divulgações, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais supressões que melhoram a glicosilação do polipéptido. Nalguma divulgação, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos não codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido diferente no polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais supressões que melhoram a glicosilação num aminoácido diferente no polipéptido. Nalgumas divulgações, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos não codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido não codificado naturalmente no polipéptido. Nalgumas divulgações, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos não codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido codificado naturalmente no polipéptido. Nalgumas divulgações, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido diferente no polipéptido. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos não codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido codificado naturalmente no polipéptido. Nalgumas divulgações, o polipéptido de b-GCSF compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácidos não codificados naturalmente que melhoram a glicosilação num aminoácido não codificado naturalmente no polipéptido.

Numa divulgação, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um oligossacárido a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (que inclui, mas não se limita a, em que o oligossacárido compreende (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc e semelhantes). Noutra forma de realização, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um oligossacárido (que inclui, mas não se limita a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina, uma GalNAc-treonina, uma GlcNAc-serina ou uma GlcNAc-treonina. Numa certa divulgação, uma proteína ou polipéptido da invenção pode compreender uma sequência de secreção ou localização, uma etiqueta de epitopo, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de poli-histidina, uma fusão de GST e/ou semelhantes. Os exemplos de sequências sinal de secreção incluem, mas não se limitam a, uma sequência sinal de secreção procariótica, uma sequência sinal de secreção eucariótica, uma sequência sinal de secreção eucariótica com 5' otimizado para expressão bacteriana, uma nova sequência sinal de secreção, sequência sinal de secreção de pectato-liase, sequência sinal de secreção de Omp A e uma sequência sinal de secreção fágica. Os exemplos de sequências sinal de secreção incluem, mas não se limitam a, STII (procariótica) , Fd GUI e M13 (fago), Bgl2 (levedura) e a sequência sinal bla derivada de um transposão. Qualquer uma destas sequências pode ser modificada para proporcionar um resultado desejado com o polipéptido, incluindo, mas não se limitando à substituição de uma sequência sinal por uma sequência sinal diferente, substituição de uma sequência lider por uma sequência lider diferente, etc. A presente invenção proporciona métodos e composições com base em b-GCSF que compreendem um aminoácido não codificado naturalmente. A introdução de um aminoácido não codificado naturalmente no b-GCSF pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas, incluindo, mas não se limitando a, com um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, enquanto não reage com os 20 aminoácidos que ocorrem comummente. Nalgumas formas de realização, o b-GCSF que compreende o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água, tal como polietileno glicol (PEG), através da cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Esta divulgação proporciona um método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, que envolve a incorporação seletiva de aminoácidos não codificados geneticamente, incluindo, mas não se limitando a, aqueles aminoácidos que contêm grupos funcionais ou substituintes que não se encontram nos 20 aminoácidos incorporados naturalmente, incluindo mas não se limitando a uma cetona, uma azida ou unidade acetileno, nas proteínas em resposta a um codão seletor e a modificação subsequente daqueles aminoácidos com um derivado de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporadas, as cadeias laterais de aminoácidos podem ser em seguida modificadas utilizando metodologias químicas conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria como sendo adequadas para os grupos funcionais ou substituintes particulares presentes no aminoácido não codificado naturalmente. Metodologias químicas conhecidas de uma grande diversidade são adequadas para serem utilizadas na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína. Tais metodologias incluem, mas não se limitam a, uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (ver, e.g., Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) com, incluindo mas não se limitando a, derivados de acetileno ou azida, respetivamente .

Uma vez que o método de cicloadição [3 + 2] de Huisgen envolve uma cicloadição em vez de uma reação de substituição nucleófila, as proteínas podem ser modificadas com uma seletividade extremamente alta. A reação pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(I) à mistura reacional. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-30 64; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; e WO 03/101972. Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui praticamente qualquer molécula com um grupo funcional ou substituinte adequado, incluindo, mas não se limitando a, um derivado de azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo, mas não se limitando a, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, mas não se limitando a, p-azido-fenilalanina, respetivamente. 0 anel de cinco membros que resulta da cicloadição [3+2] de Huisgen não é geralmente reversível em ambientes redutores e é estável à hidrólise por períodos prolongados em meios aquosos. Consequentemente, as caracteristicas físicas e químicas de uma grande variedade de substâncias podem ser modificadas sob condições aquosas exigentes com os derivados de PEG ativos da presente invenção. É ainda mais importante referir que, uma vez que as unidades azida e acetileno são específicas uma para a outra (e, por exemplo, não reagem com qualquer um dos 20 aminoácidos codificados geneticamente, comuns), as proteínas podem ser modificadas em um ou mais sítios específicos com seletividade extremamente alta. A invenção também proporciona derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e polímeros hidrófilos relacionados que têm uma ou mais unidades acetileno ou azida. Os derivados do polímero de PEG que contêm unidades acetileno são altamente seletivos para acoplamento com unidades azida que foram introduzidas seletivamente nas proteínas em resposta a um codão seletor.

De forma semelhante, os derivados do polímero de PEG que contêm unidades azida são altamente seletivos para acoplamento com unidades acetileno que foram introduzidas seletivamente nas proteínas em resposta a um codão seletor.

Mais especificamente, as unidades azida compreendem, mas não se limitam a, alquilazidas, arilazidas e derivados destas azidas. Os derivados das alquil- e arilazidas podem incluir outros substituintes desde que seja mantida a reatividade específica para o acetileno. As unidades acetileno compreendem alquil- e arilacetilenos e derivados de cada uma delas. Os derivados dos alquil- e arilacetilenos podem incluir outros substituintes desde que seja mantida a reatividade específica para a azida. A presente divulgação proporciona conjugados de substâncias que têm uma grande variedade de grupos funcionais, substituintes ou unidades, com outras substâncias, incluindo, mas não se limitando a, hidroxialquilamido (HAS); hidroxietilamido (HES); uma etiqueta; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; um fotorreticulante; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; uma etiqueta de afinidade; uma etiqueta de fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metais; um cofator; um ácido gordo; um hidrato de carbono; um polinucleótido; um ADN; um ARN; um polinucleótido antissentido; um sacárido; um dendrimero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucleico inibidor; um biomaterial; uma nanopartícula; uma etiqueta de spin; um fluoróforo, uma unidade que contém metal; uma unidade radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas; uma unidade fotoativável; uma unidade excitável por radiação actínica; uma unidade fotoisomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma unidade que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente dissociável; um grupo fotodissociável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente ativo redox; um aminotioácido; uma unidade tóxica; uma unidade marcada isotopicamente; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo denso em eletrões; um grupo magnético; um grupo intercalante; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; uma etiqueta detetável; uma molécula pequena; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleótido; um radiotransmissor; um agente de captura de neutrões; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. A presente invenção inclui também conjugados de substâncias que têm unidades azida ou acetileno com derivados do polímero de PEG que têm as unidades acetileno ou azida correspondentes. Por exemplo, um polímero de PEG que contém uma unidade azida pode ser acoplado a uma molécula biologicamente ativa numa posição na proteína que contém um aminoácido não codificado geneticamente que tem uma funcionalidade acetileno. A ligação através da qual o PEG e a molécula biologicamente ativa são acoplados inclui, mas não se limita ao produto de cicloadição [3+2] de Huisgen.

Encontra-se bem estabelecido na técnica que o PEG pode ser utilizado para modificar as superficies de biomateriais (ver, e.g., Patente U.S. 6,610,281; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3(1):125-136 (2000)). A invenção inclui também biomateriais que compreendem uma superfície que tem um ou mais sítios azida ou acetileno reativos e um ou mais dos polímeros que contêm azida ou acetileno da invenção acoplados à superfície através da ligação de cicloadição [3+2] de Huisgen. Os biomateriais e outras substâncias podem ser também acoplados aos derivados de polímeros ativados com azida ou acetileno através de uma ligação diferente da ligação azida ou acetileno, tal como através de uma ligação que compreende uma unidade de ácido carboxílico, amina, álcool ou tiol, para deixar a unidade azida ou acetileno disponível para reações posteriores. A invenção inclui um método de síntese dos polímeros que contêm azida e acetileno da invenção. No caso do derivado de PEG que contém azida, a azida pode estar ligada diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG que contém azida pode ser preparado unindo um agente de ligação que tem a unidade azida numa extremidade a um polímero ativado convencional para que o polímero resultante tenha a unidade azida na sua extremidade. No caso do derivado de PEG que contém acetileno, o acetileno pode estar ligado diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG que contém acetileno pode ser preparado unindo um agente de ligação que tem a unidade acetileno numa extremidade a um polímero ativado convencional para que o polímero resultante tenha a unidade acetileno na sua extremidade.

Mais especificamente, no caso do derivado de PEG que contém azida, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma unidade hidroxilo ativa sofre uma reação para produzir um polímero substituído com uma unidade mais reativa, tal como um grupo de saída mesilato, tresilato, tosilato ou halogéneo, na mesma. A preparação e a utilização de derivados de PEG que contêm halogenetos ácidos de sulfonilo, átomos de halogéneo e outros grupos de saída são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. 0 polímero substituído resultante sofre em seguida uma reação para substituir por uma unidade mais reativa, uma unidade azida, na extremidade do polímero. Alternativamente, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma unidade nucleófila ou eletrófila ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem uma azida numa extremidade para que se forme uma ligação covalente entre o polímero de PEG e o agente de ligação, e a unidade azida se posicione na extremidade do polímero. As unidades nucleófilas e eletrófilas, que incluem aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, álcoois, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e semelhantes, são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria.

Mais especificamente, no caso do derivado de PEG que contém acetileno, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma unidade hidroxilo ativa sofre uma reação para substituir um halogéneo ou outro grupo de saída ativado de um precursor que contém uma unidade acetileno. Alternativamente, um polímero solúvel em água que tem pelo menos uma unidade nucleófila ou eletrófila ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem um acetileno numa extremidade para que se forme uma ligação covalente entre o polímero de PEG e o agente de ligação, e a unidade acetileno se posicione na extremidade do polímero. A utilização de unidades de halogéneo, grupos de saída ativados, unidades nucleófilas e eletrófilas no contexto de síntese orgânica, e a preparação e utilização de derivados de PEG estão bem estabelecidas para os praticantes na técnica. A invenção também proporciona um método para a modificação seletiva de proteínas para adicionar outras substâncias à proteína modificada, incluindo a polímeros solúveis em água tais como PEG e derivados de PEG que contêm uma unidade azida ou acetileno. Os derivados de PEG que contêm azida e acetileno podem ser utilizados para modificar as propriedades de superfícies e moléculas onde a biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e ausência de imunogenicidade sejam importantes, proporcionando ao mesmo tempo um meio mais seletivo para ligar os derivados de PEG a proteínas do que era anteriormente conhecido na técnica. II. GCSF Bovino

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser utilizados para melhorar ou prevenir infeções em animais. As atividades biológicas, assim como os ensaios para caracterizar as atividades biológicas do G-CSF bovino e humano são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Os ensaios que envolvem uma avaliação do número de neutrófilos e da função de neutrófilos são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria. III. Métodos Gerais de Ácidos Nucleicos Recombinantes Para utilização Com A invenção

Em numerosas formas de realização da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam um polipéptido de bG-CSF de interesse serão isolados, clonados e frequentemente alterados utilizando métodos recombinantes. Tais formas de realização são utilizadas, incluindo mas não se limitando a, para a expressão de proteínas ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão ou outras sequências derivadas de um polipéptido de bG-CSF. Nalgumas formas de realização, as sequências que codificam os polipéptidos da invenção estão operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo. 0 isolamento de hG-CSF e a produção de G-CSF em células hospedeiras são descritos, e.g., nas Patentes U.S. N.° 4,810,643; 4,999,291; 5,580,755; e 6,716,606.

Uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente pode ser sintetizada com base na sequência de aminoácidos do polipéptido parental, que tem a sequência de aminoácidos que se mostra na SEQ ID NO: 1, 2 e modificando em seguida a sequência de nucleótidos de forma a efetuar a introdução (i.e., incorporação ou substituição) do(s) resíduo(s) de aminoácido(s) relevante(s). A sequência de nucleótidos pode ser convenientemente modificada por mutagénese específica de um lócus de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleótidos pode ser preparada por síntese química, incluindo, mas não se limitando à utilização de um sintetizador de oligonucleótidos, em que os oligonucleótidos são concebidos com base na sequência de aminoácidos do polipéptido desejado, e selecionando preferencialmente aqueles codões que são favorecidos na célula hospedeira onde o polipéptido recombinante será produzido. Por exemplo, vários oligonucleótidos pequenos que codificam porções do polipéptido desejado podem ser sintetizados e montados por PCR, ligação ou reação em cadeia de ligações. Ver, e.g., Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 189-193 (1991); Patente U.S. 6,521,427.

Esta invenção utiliza técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Os textos básicos que divulgam os métodos gerais de utilização nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene TRansfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

Os textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (com suplementos ao longo de 1999) ("Ausubel")). Estes textos descrevem a mutagénese, a utilização de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados com, incluindo, mas não se limitando à geração de genes ou polinucleótidos que incluem codões seletores para a produção de proteínas que incluem aminoácidos não naturais, ARNts ortogonais, sintetases ortogonais, e pares dos mesmos. Vários tipos de mutagénese são utilizados na invenção para uma variedade de finalidades, incluindo, mas não se limitando a, para produzir novas sintetases ou ARNts, para mutar moléculas de ARNt, para mutar polinucleótidos que codificam sintetases, para produzir bibliotecas de ARNts, para produzir bibliotecas de sintetases, para produzir codões seletores, para inserir codões seletores que codificam aminoácidos não naturais numa proteína ou polipéptido de interesse. Aqueles incluem mas não estão limitados a mutagénese específica de um lócus, de ponto aleatório, recombinação homóloga, recombinação aleatória de ADN ou outros métodos de mutagénese recursivos, construção quimérica, mutagénese que utiliza cadeias molde que contêm uracilo, mutagénese dirigida a oligonucleótidos, mutagénese de ADN modificado com fosforotioato, mutagénese utilizando ADN de hélice dupla com lacunas ou semelhantes, mutagénese mediada por PCT ou qualquer combinação dos mesmos. Os métodos adequados adicionais incluem a reparação de erro de emparelhamento pontual, mutagénese utilizando estirpes hospedeiras com reparação deficiente, seleção por restrição e purificação por restrição, mutagénese de supressão, mutagénese por síntese total de genes, reparação de quebra de cadeia dupla e semelhantes. A mutagénese, incluindo, mas não se limitando ao envolvimento de construções quiméricas, está também incluída na presente invenção. Numa forma de realização, a mutagénese pode ser orientada por informação conhecida sobre a molécula natural ou molécula natural alterada ou mutada, incluindo, mas não se limitando à sequência, comparações de sequências, propriedades físicas, estrutura secundária, terciária ou quaternária, estrutura cristalina ou semelhantes.

Os textos e exemplos que se encontram neste documento descrevem estes procedimentos. Informação adicional encontra-se nas seguintes publicações e referências citadas em: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overiew, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann.

Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle,

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Os oligonucleótidos, e.g., para utilização na mutagénese da presente invenção, e.g., bibliotecas mutantes de sintetases ou ARNts de alteração, são tipicamente sintetizados quimicamente de acordo com o método de triéster de fosforamidita em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981) e.g., utilizando um sintetizador automatizado, como descrito em Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984). A invenção refere-se também a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural através de pares de ARNt ortogonal/RS. As células hospedeiras são geneticamente modificadas (incluindo, mas não se limitando a, transformadas, transduzidas ou transfetadas) com os polinucleótidos da invenção ou construções que incluem um polinucleótido da invenção, incluindo, mas não se limitando a, um vetor da invenção, o qual pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões codificantes para o ARNt ortogonal, o ARNt ortogonal-sintetase e a proteína a ser derivatizada são operacionalmente ligados aos elementos de controlo da expressão de genes que são funcionais na célula hospedeira desejada. 0 vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, uma bactéria, um vírus, um polinucleótido nu ou um polinucleótido conjugado. Os vetores são introduzidos nas células e/ou microrganismos por métodos padrão que incluem eletroporação (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 5824 (1985)), infeção por vetores virais, penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucleico quer na matriz de pequena esférulas ou partículas, quer na superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), e/ou semelhantes. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico nas células in vitro incluem a utilização de lipossomas, microinjeção, fusão de células, DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. As técnicas de transferência de genes in vivo incluem, mas não se limitam a, transfeção com vetores virais (tipicamente retrovirais) e transfeção mediada por proteínas do revestimento viral-lipossomas [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993)]. Nalgumas situações pode ser desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que vise as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície celular ou da célula alvo, um ligando para um recetor na célula alvo, etc. Quando se utiliza lipossomas, as proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície celular associada à endocitose podem ser utilizadas para direcionar e/ou para facilitar a captação, e.g. proteínas da cápside ou fragmentos das mesmas típicos para um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na circulação, proteínas que visam uma localização intracelular e aumentam a semivida intracelular.

As células hospedeiras geneticamente manipuladas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados consoante apropriado para atividades tais como, por exemplo, passos de triagem, promotores de ativação ou transformantes de seleção. Estas células podem ser opcionalmente cultivadas em organismos transgénicos. Outras referências úteis, incluindo, mas não se limitando a, para o isolamento e a cultura de células (e.g., para isolamento posterior de ácido nucleico) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, terceira edição, Wiley-Liss, New York e as referências citadas no mesmo; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg e Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Atlas e Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Estão disponíveis vários métodos bem conhecidos de introdução de ácidos nucleicos alvo em células, qualquer um dos quais pode ser utilizado na invenção. Estes incluem: fusão das células recetoras com protoplastos bacterianos que contêm o ADN, eletroporação, bombardeamento com projéteis e infeção com vetores virais (discutida em mais pormenor, abaixo), etc. As células bacterianas podem ser utilizadas para amplificar o número de plasmídeos que contêm as construções de ADN desta invenção. As bactérias são cultivadas até à fase log e os plasmídeos dentro das bactérias podem ser isolados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook). Além disso, estão comercialmente disponíveis kits para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias, (ver, e.g., EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene; e, QIAprep™ de Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são em seguida adicionalmente manipulados para produzir outros plasmídeos, utilizados para transfetar células ou incorporados em vetores relacionados para infetar organismos. Os vetores típicos contêm sequências de terminação da transcrição e tradução, sequências de iniciação da transcrição e tradução, e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucleico alvo particular. Os vetores compreendem opcionalmente cassetes de expressão genéricas que contêm pelo menos uma sequência de terminação independente, sequências que permitem a replicação da cassete em eucariotas ou procariotas, ou ambos, (incluindo, mas não estando limitado a, vetores veículos) e marcadores de seleção para sistemas procarióticos e eucarióticos. Os vetores são adequados para replicação e integração em procariotas, eucariotas ou ambos. Ver, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987);

Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Um catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem é proporcionado, e.g., pela ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado pela ATCC. Procedimentos básicos adicionais para sequenciação, clonagem e outros aspetos de biologia molecular e considerações teóricas subjacentes encontram-se também em Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second

Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico (e praticamente qualquer ácido nucleico marcado, quer padrão ou não padrão) pode ser pedido personalizado ou padrão a partir de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, tais como a Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponível na Rede Mundial de Computadores em mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível na Rede Mundial de Computadores em genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponível na Rede Mundial de Computadores em expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras.

CODÕES SELETORES

Os codões seletores da invenção expandem a estrutura de codões genéticos da maquinaria biossintética de proteínas. Por exemplo, um codão seletor inclui, mas não se limita a, um codão de três bases único, um codão sem sentido, tal como um codão de terminação, incluindo, mas não se limitando a, um codão âmbar (UAG), um codão ocre, ou um codão opalino (UGA), um codão não natural, um codão de quatro ou mais bases, um codão raro ou semelhantes. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que há uma grande gama no número de codões seletores que podem ser introduzidos num gene ou polinucleótido desejado, incluindo, mas não se limitando a, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais num único polinucleótido que codifica pelo menos uma porção do polipéptido de bG-CSF.

Numa forma de realização, os métodos envolvem a utilização de um codão seletor que é um codão de terminação para a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, é produzido um O-ARNt que reconhece o codão de terminação, incluindo, mas não se limitando a, UAG, e é aminoacilado por uma O-RS com um aminoácido não natural desejado. Este O-ARNt não é reconhecido pelas aminoacil-ARNt-sintetases naturais do hospedeiro. A mutagénese específica de um lócus convencional pode ser utilizada para introduzir o codão de terminação, incluindo, mas não se limitando a, TAG, no sítio de interesse num polipéptido de interesse. Ver, e.g., Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Quando a O-RS, o O-ARNt e o ácido nucleico que codifica o polipéptido de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao codão UAG para dar um polipéptido que contém o aminoácido não natural na posição especificada. A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser efetuada sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, uma vez que a eficiência de supressão para o codão UAG depende da competição entre o O-ARNt, incluindo, mas não se limitando a, o ARNt supressor âmbar, e um fator de libertação eucariótico (incluindo, mas não se limitando a, eRF) (o qual se liga a um codão de terminação e inicia a libertação do péptido de crescimento a partir do ribossoma), a eficiência de supressão pode ser modulada, incluindo, mas não se limitando a, pelo aumento do nivel de expressão de O-ARNt e/ou do ARNt supressor.

Os aminoácidos não naturais podem ser também codificados por codões raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina numa reação de síntese de proteínas in vitro é reduzida, o codão de arginina raro, AGG, provou ser eficaz para a inserção de Ala por um ARNt sintético acilado com alanina. Ver, e.g., Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). Neste caso, o ARNt sintético compete com o ARNtArg natural, que existe como uma espécie menor em Escherichia coli. Alguns organismos não utilizam todos os codões tripleto. Um codão AGA não especificado em Micrococcus luteus foi utilizado para a inserção de aminoácidos num extrato de transcrição/tradução in vitro. Ver, e.g., Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Podem ser gerados componentes da presente invenção para utilizar estes codões raros in vivo.

Os codões seletores também compreendem codões prolongados, incluindo, mas não se limitando a, codões de quatro ou mais bases, tais como, codões de quatro, cinco, seis ou mais base. Os exemplos de codões de quatro bases incluem, mas não se limitam a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU e semelhantes. Os exemplos de codões de cinco bases incluem, mas não se limitam a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e semelhantes. Uma característica da invenção inclui a utilização de codões prolongados com base na supressão do deslocamento de grelha. Os codões de quatro ou mais bases podem inserir, incluindo, mas não se limitando a, um ou múltiplos aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-ARNts mutados, incluindo, mas não se limitando a, um ARNt supressor de deslocamento de grelha especial, com ansas anticodão, por exemplo, com ansas anticodão com pelo menos 8-10 nt, o codão de quatro ou mais bases é lido como um único aminoácido. Noutras formas de realização, as ansas anticodão podem descodificar, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um codão de quatro bases, pelo menos um codão de cinco bases, ou pelo menos um codão de seis bases ou mais. Uma vez que existem 256 possíveis codões de quatro bases, múltiplos aminoácidos não naturais podem ser codificados na mesma célula utilizando um codão de quatro ou mais bases. Ver, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769.

Por exemplo, os codões de quatro bases têm sido utilizados para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas utilizando métodos biossintéticos in vitro. Ver, e.g., Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; e Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. CGGG e AGGU foram utilizados para incorporar simultaneamente 2-naftilalanina e um derivado NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois ARNts supressores de deslocamento de grelha acilados quimicamente. Ver, e.g., Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. Num estudo in vivo, Moore et al. examinaram a capacidade de derivados de ARNtLeu com NCUA anticodões para suprimir codões UAGN (N pode ser U, A, G ou C) e constataram que o quadrupleto UAGA pode ser descodificado por um ARNtLeu com um anticodão UCUA com uma eficiência de 13 a 26% com pouca descodificação na grelha 0 ou -1. Ver, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. Numa forma de realização, os codões prolongados com base em codões raros ou codões sem sentido podem ser utilizados na presente invenção, os quais podem reduzir a transleitura de perda de sentido e a supressão do deslocamento de grelha noutros sítios indesejados.

Para um dado sistema, um codão seletor pode incluir também um dos codões de três bases naturais, quando o sistema endógeno não utiliza (ou raramente utiliza) o codão de base natural. Por exemplo, este inclui um sistema que carece de um ARNt que reconhece o codão de três bases natural, e/ou um sistema em que o codão de três bases é um codão raro.

Os codões seletores incluem opcionalmente pares de bases não naturais. Estes pares de bases não naturais expandem ainda mais o alfabeto genético existente. Um par de bases extra aumenta o número de codões tripleto de 64 para 125. As propriedades dos terceiros pares de bases incluem o emparelhamento de bases estável e seletivo, incorporação enzimática eficiente no ADN com alta fidelidade por uma polimerase e o prolongamento contínuo eficiente do iniciador após síntese do par de bases não natural nascente. As descrições de pares de bases não naturais que podem ser adaptadas para métodos e composições incluem, e.g., Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Ver, também, Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630. Outras publicações relevantes são listadas mais abaixo.

Para utilização in vivo, o nucleósido não natural tem permeabilidade membranar e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Além disso, a informação genética aumentada é estável e não é destruída por enzimas celulares. Esforços anteriores por Benner e outros tiraram partido dos padrões de ligação de hidrogénio que são diferentes daqueles em pares de Watson-Crick canónicos, cujo exemplo mais notável é o par iso-C:iso-G. Ver, e.g., Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; e

Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000)

Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Em geral, estas bases emparelham, em certa medida, incorretamente com as bases naturais e não podem ser replicadas enzimaticamente. Kool e colaboradores demonstraram que as interações de empacotamento hidrófobo entre bases podem substituir a ligação de hidrogénio para levar a formação de pares de bases. Ver, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; e Guckian e Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. Num esforço para desenvolver um par de bases não natural que satisfizesse todos os requisitos anteriores, Schultz, Romesberg e colaboradores sintetizaram e estudaram sistematicamente uma série de bases hidrófobas não naturais. Determinou-se que um autopar PICS:PICS é mais estável do que os pares de bases naturais e pode ser incorporado de forma eficiente no ADN pelo fragmento de Klenow da ADN-polimerase I de Escherichia coli (KF) . Ver, e.g., McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. Um autopar 3MN:3MN pode ser sintetizado pelo KF com eficiência e seletividade suficientes para funcionamento biológico. Ver, e.g., Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. No entanto, ambas as bases atuam como uma sequência de terminação de cadeia para replicação adicional. Uma ADN-polimerase mutante foi recentemente desenvolvida que pode ser utilizada para replicar o autopar PICS. Além disso, um autopar 7AI pode ser replicado. Ver, e.g., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. Um novo par de metalobases, Dipic:Py, foi também desenvolvido, o qual forma um par estável ao ligar Cu (II). Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Uma vez que os codões prolongados e os codões não naturais são intrinsecamente ortogonais aos codões naturais, os métodos da invenção podem tirar partido desta propriedade para gerar ARNts ortogonais para aqueles.

Um sistema de contorno da tradução pode ser também utilizado para incorporar um aminoácido não natural num polipéptido desejado. Num sistema de contorno da tradução, uma sequência grande é incorporada num gene, mas não é traduzida em proteína. A sequência contém uma estrutura que serve como um sinal para induzir o ribossoma a saltar a sequência e retomar a tradução a jusante da inserção.

Em certas formas de realização, a proteína ou polipéptido de interesse (ou porção do mesmo) nos métodos e/ou composições da invenção é codificado por um ácido nucleico. Tipicamente, o ácido nucleico compreende pelo menos um codão seletor, pelo menos dois codões seletores, pelo menos três codões seletores, pelo menos quatro codões seletores, pelo menos cinco codões seletores, pelo menos seis codões seletores, pelo menos sete codões seletores, pelo menos oito codões seletores, pelo menos nove codões seletores, dez ou mais codões seletores.

Os genes que codificam as proteínas ou os polipéptidos de interesse podem ser mutados utilizando métodos conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria e aqui descritos para incluir, por exemplo, um ou mais codões seletores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucleico para uma proteína de interesse é mutado para incluir um ou mais codões seletores, que proporcionam a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui qualquer variante desse tipo, incluindo, mas não se limitando a, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, que incluem pelo menos um aminoácido não natural. De forma semelhante, a invenção inclui também ácidos nucleicos correspondentes, i.e., qualquer ácido nucleico com um ou mais codões seletores que codifica um ou mais aminoácidos não naturais.

As moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de interesse tal como um polipéptido de bG-CSF podem ser facilmente mutadas para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipéptido. A cisteína é amplamente utilizada para introduzir moléculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas ou uma grande variedade de outras moléculas, numa proteína de interesse. Os métodos adequados para a incorporação de cisteína numa posição desejada de um polipéptido são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, tais como aqueles descritos na Patente U.S. N.° 6,608,183. IV. Aminoácidos Não Codificados Naturalmente

Uma variedade muito grande de aminoácidos não codificados naturalmente é adequada para ser utilizada na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos não codificados naturalmente pode ser introduzido num polipéptido de bG-CSF. Em geral, os aminoácidos não codificados naturalmente introduzidos são substancialmente inertes em termos químicos para os 20 aminoácidos codificados geneticamente, comuns (i.e., alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisterna, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Nalgumas formas de realização, os aminoácidos não codificados naturalmente incluem grupos funcionais na cadeia lateral que reagem eficaz e seletivamente com grupos funcionais que não estão presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando aos grupos azido, cetona, aldeído e aminooxilo) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipéptido de bG-CSF que inclui um aminoácido não codificado naturalmente que contém um grupo funcional azido pode ser feito reagir com um polímero (incluindo, mas não se limitando a, poli (etileno glicol) ou, alternativamente, um segundo polipéptido que contém uma unidade alcino para formar um conjugado estável que resulta da reação seletiva dos grupos funcionais azida e alcino para formar um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen. A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada como se segue (Fórmula I):

Um aminoácido não codificado naturalmente é tipicamente qualquer estrutura que tem a fórmula indicada acima em que o grupo R é qualquer substituinte diferente de um utilizado nos vinte aminoácidos naturais e pode ser adequado para utilização na presente invenção. Uma vez que os aminoácidos não codificados naturalmente da invenção diferem tipicamente dos aminoácidos naturais apenas na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos não codificados naturalmente formam ligações amida com outros aminoácidos, incluindo, mas não se limitando a, naturais ou não codificados naturalmente, da mesma maneira que se formam nos polipéptidos naturais. No entanto, os aminoácidos não codificados naturalmente têm grupos na cadeia lateral que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R compreende opcionalmente um grupo alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alcenilo, alcinilo, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, grupo amino ou semelhantes, ou qualquer combinação dos mesmos. Outros aminoácidos não naturais de interesse que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, aminoácidos que compreendem um agente de reticulação fotoativável, aminoácidos marcados com etiqueta de spin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação de metais, aminoácidos que contêm metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos fotoativáveis e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos que compreendem biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tais como uma serina substituída com açúcar, outros aminoácidos modificados com hidratos de carbono, aminoácidos que contêm ceto, aminoácidos que compreendem polietileno glicol ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomos pesados, aminoácidos quimicamente dissociáveis e/ou fotodissociáveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação com os aminoácidos naturais, incluindo, mas não se limitando a, poliéteres ou cadeia hidrocarbonetos longas, incluindo, mas não se limitando a, maior do que cerca de 5 ou maior do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos que contêm carbonos ligados a açúcares, aminoácidos ativos em redox, aminoácidos que contêm aminotioácidos e aminoácidos que compreendem uma ou mais unidades tóxicas.

Os aminoácidos não codificados naturalmente ilustrativos que podem ser adequados para utilização na presente invenção e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, aqueles com grupos reativos carbonilo, aminooxilo, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alcino. Nalgumas formas de realização, os aminoácidos não codificados naturalmente compreendem uma unidade sacarídea. Os exemplos desses aminoácidos incluem N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, 2\7-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Os exemplos desses aminoácidos incluem também exemplos em que a ligação com B ou 0 que ocorre naturalmente entre o aminoácido e o sacárido está substituída por uma ligação covalente não comummente presente na natureza - incluindo, mas não se limitando a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Os exemplos desses aminoácidos incluem também sacáridos que não se encontram comummente em proteínas que ocorrem naturalmente tais como 2-desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e semelhantes.

Muitos dos aminoácidos não codificados naturalmente aqui proporcionados estão comercialmente disponíveis, e.g., de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha) ou Peptech (Burlington, MA, EUA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como aqui proporcionado ou utilizando métodos padrão conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Para as técnicas de síntese orgânica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Massa.); Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Third Edition, Partes A e B, 1990, Plenum Press, New York). Ver, também, Patentes U.S. N.° 7,045,337 e 7,083,970. Além dos aminoácidos não naturais que contêm novas cadeias laterais, os aminoácidos não naturais que podem ser adequados para utilização na presente invenção compreendem também estruturas da cadeia principal opcionalmente modificadas, incluindo, mas não se limitando a, como ilustrado pelas estruturas de Fórmula II e III:

em que Z compreende tipicamente OH, NH2, SH, NH-R' ou S-R'; X e Y, os quais podem ser iguais ou diferentes, compreendem tipicamente S ou O, e R e R', os quais são opcionalmente iguais ou diferentes, são tipicamente selecionados da mesma lista de constituintes para o grupo R descrito acima para os aminoácidos não naturais que têm a Fórmula I, assim como hidrogénio. Por exemplo, os aminoácidos não naturais da invenção compreendem opcionalmente substituições no grupo amino ou carboxilo, como ilustrado pelas Fórmulas II e III. Os aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não se limitam a, a-hidroxi-ácidos, α-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluindo, mas não se limitando a, com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais. Além disso, as substituições no carbono a incluem opcionalmente, mas não se limitam a, L-, D- ou aminoácidos α-α-dissubstituídos tais como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutirico e semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina, assim como análogos de prolina com anéis de 3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros, β- e γ-aminoácidos tais como β-alanina e ácido γ-amino-butírico substituídos.

Muitos aminoácidos não naturais baseiam-se em aminoácidos naturais, tais como tirosina, glutamina, fenilalanina e semelhantes, e são adequados para utilização na presente invenção. Os análogos de tirosina incluem, mas não se limitam a, tirosinas substituídas na posição para, tirosinas substituídas na posição orto e tirosinas substituídas na posição meta, em que a tirosina substituída compreende, incluindo, mas não se limitando a, um grupo ceto (incluindo, mas não se limitando a, um grupo acetilo), um grupo benzoilo, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carboxilo, um grupo isopropilo, um grupo metilo, um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado Ce ~ C20, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metilo, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alcinilo ou semelhantes. Além disso, são também considerados os anéis arilo substituídos de forma múltipla. Os análogos de glutamina que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, derivados com a-hidroxilo, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos e derivados de glutamina substituídos com amida. Os análogos de fenilalanina ilustrativos que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, fenilalaninas substituídas em posição para, fenilalaninas substituídas em posição orto e fenilalaninas substituídas em posição meta, em que o substituinte compreende, incluindo, mas não se limitando a, um grupo hidroxilo, um grupo metoxilo, um grupo metilo, um grupo alilo, um aldeído, um azido, um iodo, um bromo, um grupo ceto (incluindo, mas não se limitando a, um grupo acetilo) , um benzoilo, um grupo alcinilo ou semelhantes. Os exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, uma p-acetil-L-fenilalanina, uma O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma 0-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, uma ^ί-0-3θθ^1-01σΝΑοβ-3θηίη3, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p- azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfosserina, uma fosfonosserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropil-L-fenilalanina e uma p-propargiloxi-fenilalanina, e semelhantes. Os exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais que podem ser adequadas para utilização na presente invenção são proporcionados, por exemplo, na WO 2002/085923 intitulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids." Ver também Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, o qual é aqui incorporado por referência, para análogos de metionina adicionais. O Pedido Internacional N.° PCT/US06/47822 intitulado "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides," descreve a alquilação redutiva de uma unidade amina aromática, incluindo, mas não se limitando a, p-amino-fenilalanina e a aminação redutiva.

Numa forma de realização, são proporcionadas composições de um polipéptido de bG-CSF que inclui um aminoácido não natural (tal como p-(propargiloxi)-fenilalanina). São também proporcionadas várias composições que compreendem p-(propargiloxi)-fenilalanina e, incluindo, mas não se limitando a, proteínas e/ou células. Num aspeto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p-(propargiloxi)-fenilalanina, inclui ainda um ARNt ortogonal. 0 aminoácido não natural pode ser ligado (incluindo, mas não se limitando a, covalentemente) ao ARNt ortogonal, incluindo, mas não se limitando a, ligado covalentemente ao ARNt ortogonal através de uma ligação aminoacilo, ligado covalentemente a um 3' OH ou um 2'OH de um açúcar de ribose terminal do ARNt ortogonal, etc.

As unidades químicas que podem ser incorporadas através de aminoácidos não naturais nas proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína. Por exemplo, a reatividade única de um grupo funcional ceto permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer um de um número de reagentes que contêm hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural com um átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para o faseamento dos dados estruturais de raios X. A introdução específica num sítio de átomos pesados utilizando aminoácidos não naturais também proporciona seletividade e flexibilidade na escolha das posições para os átomos pesados. Os aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo, mas não se limitando a, aminoácidos com cadeias laterais de benzofenona e arilazidas (incluindo, mas não se limitando a, fenilazida)), por exemplo, permitem a fotorreticulação eficiente da proteína in vivo e in vitro. Os exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, mas não se limitam a, p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina. A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode ser em seguida reticulada, consoante pretendido, por excitação controlada no tempo do grupo fotorreativo. Num exemplo, o grupo metilo de um amino não natural pode estar substituído com um grupo marcado isotopicamente, incluindo, mas não se limitando a, grupo metilo, como uma sonda de estrutura e dinâmica local, incluindo, mas não se limitando a, com a utilização de ressonância magnética nuclear e espetroscopia vibracional. Os grupos funcionais alcinilo ou azido, por exemplo, permitem a modificação seletiva de proteínas com moléculas através de uma reação de cicloadição [3+2].

Um aminoácido não natural incorporado num polipéptido na extremidade amino pode ser constituído por um grupo R que é qualquer substituinte diferente de um utilizado nos vinte aminoácidos naturais e um 2o grupo reativo diferente do grupo NH2 normalmente presente em a-aminoácidos (ver Fórmula I). Um aminoácido não natural semelhante pode ser incorporado na extremidade carboxilo com um 2o grupo reativo diferente do grupo COOH normalmente presente em α-aminoácidos (ver Fórmula I).

Os aminoácidos não naturais da invenção podem ser selecionados ou concebidos para proporcionar características adicionais indisponíveis nos vinte aminoácidos naturais. Por exemplo, o aminoácido não natural pode ser opcionalmente concebido ou selecionado para modificar as propriedades biológicas de uma proteína, e.g., na qual é incorporado. Por exemplo, as seguintes propriedades podem ser opcionalmente modificadas por inclusão de um aminoácido não natural numa proteína: toxicidade, biodistribuição, solubilidade, estabilidade, e.g., térmica, hidrolítica, oxidativa, resistência à degradação enzimática e semelhantes, facilidade de purificação e processamento, propriedades estruturais, propriedades espetroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, atividade catalítica, potencial redox, semivida, capacidade para reagir com outras moléculas, e.g., covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes.

ESTRUTURA E SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS: GRUPOS CARBONILO, SEMELHANTES A CARBONILO, CARBONILO MASCARADOS, CARBONILO PROTEGIDOS, E GRUPOS HIDROXILAMINA

Nalgumas formas de realização a presente invenção proporciona bG-CSF ligado a um polímero solúvel em água, e.g., um PEG, por uma ligação oxima.

Muitos tipos de aminoácidos não codificados naturalmente são adequados para a formação de ligações oxima. Estes incluem, mas não se limitam a, aminoácidos não codificados naturalmente que contêm um grupo carbonilo, dicarbonilo ou hidroxilamina. Tais aminoácidos são descritos nas Publicações de Patentes U.S. N.° 2006/0194256, 2006/0217532, e 2006/0217289 e WO 2006/069246 intitulada "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides,". Aminoácidos não codificados naturalmente são também descritos na Patente U.S. N.° 7,083,970 e Patente U.S. N.° 7, 045,337.

Algumas formas de realização da invenção utilizam polipéptidos de bG-CSF que estão substituídos em uma ou mais posições com um aminoácido para-acetilfenilalanina. A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Outros aminoácidos que contêm carbonilo ou dicarbonilo podem ser preparados de forma semelhante por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Além disso, as sínteses de aminoácidos não naturais ilustrativas, não limitativas que são aqui incluídas são apresentadas nas FIGS. 4, 24-34 e 36-39 da Patente U.S. N.° 7,083,970.

Os aminoácidos com um grupo reativo eletrófilo permitem uma variedade de reações para ligar moléculas através de reações de adição nucleófila entre outras. Tais grupos reativos eletrófilos incluem um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo), um grupo semelhante a carbonilo (que tem reatividade semelhante a um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo) e é estruturalmente semelhante a um grupo carbonilo), um grupo carbonilo mascarado (que pode ser facilmente convertido num grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo)) , ou um grupo carbonilo protegido (que tem reatividade semelhante a um grupo carbonilo (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonilo) após desproteção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (IV):

em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C (0)0-, -S (O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N (R ' ) C (S) N (R ' ) -, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; J é

R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído; cada R" é independentemente H, alquilo, alquilo substituído ou um grupo de proteção, ou quando está presente mais do que um grupo R", dois R" formam opcionalmente um heterocicloalquilo;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogéneo, alquilo inferior ou alquilo inferior substituído, ou R3 e R.4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; ou os grupos -A-B-J-R formam em conjunto um cicloalquilo ou heterocicloalquilo biciclico ou triciclico que compreende pelo menos um grupo carbonilo, incluindo um grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluindo um grupo dicarbonilo protegido, ou grupo carbonilo mascarado, incluindo um grupo dicarbonilo mascarado; ou o grupo -J-R forma em conjunto um cicloalquilo ou heterocicloalquilo monociclico ou biciclico que compreende pelo menos um grupo carbonilo, incluindo um grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluindo um grupo dicarbonilo protegido, ou grupo carbonilo mascarado, incluindo um grupo dicarbonilo mascarado; com a condição de que quando A é fenileno e cada R3 é Η, B esteja presente; e que quando A é -(CH2)4~ e cada R3 é Η, B não seja -NHC(O) (CH2CH2) -; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não seja metilo.

Além disso, são incluídos os que têm a estrutura de Fórmula (V):

em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é uma unidade de liqação selecionada do qrupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON (R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R') ", -N (R')C(0)N(R')-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R')S (0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C (R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; com a condição de que quando A é fenileno, B esteja presente; e que quando A é -(CH2)4_, B não seja -NHC(O) (CH2CH2) -; e que quando A e B estão ausentes, R não seja metilo.

Além disso, são incluídos os aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (VI):

em que: B é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, — S —, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R')-, -N (R' ) C (0)N (R' )-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N (R') 2, -C(0)kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -OR' e -S(0)kR', em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:

em que tais compostos estão opcionalmente protegidos no grupo amino, protegidos no carboxilo ou são um sal dos mesmos. Além disso, qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado num polipéptido de aminoácido não natural.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (VII):

em que B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C (0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, —C(S)— (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R')-, -N (R' ) C (0)N (Rr )-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R ' ) =N-N (R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N(R')2, -C (0) kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, _0R' e -S(0)kR'/ em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; e n é 0 a 8; com a condição de que quando A é -(CH2)4_, B não seja -NHC (0) (CH2CH2)

Além disso, são incluídos os sequintes aminoácidos:

em que tais compostos estão opcionalmente protegidos no amino, opcionalmente protegidos no carboxilo, opcionalmente protegidos no amino e protegidos no carboxilo, ou são um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos aminoácidos não naturais seguintes podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (VIII):

em que A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k— em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, —C(0)—, -C(0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R') ", -N (R' ) C (0)N (R' )-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R*)-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (IX):

B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C (0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R')-, -N (R' ) C (0)N (R' )-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; em que cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N (R' ) 2, -C(0)kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -OR', e -S(0)kR', em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:

em que tais compostos estão opcionalmente protegidos no amino, opcionalmente protegidos no carboxilo, opcionalmente protegidos no amino e protegidos no carboxilo, ou são um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais podem ser incorporados num polipéptido de aminoácido não natural.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (X):

em que B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C (0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R') -(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R') ", -N (R ' ) C (0)N (R ' )-, -N (R ' ) C (S) N (R ' ) -, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N (R' ) 2, -C(0)kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -OR' e -S(0)kR', em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; e n é 0 a 8.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:

Além de estruturas monocarbonilo, os aminoácidos não naturais aqui descritos podem incluir grupos tais como os grupos dicarbonilo, semelhante a dicarbonilo, dicarbonilo mascarado e dicarbonilo protegido.

Por exemplo, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XI):

em que A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k— em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C(0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0 , -S (O)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N (R ' ) C (S) N (R ' ) -, -N(R')S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R ' ) =N-N (R ' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XII):

B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C (0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S (O)kN(R')-, -N (R' ) C (0)N (R' )-, -N (R' ) C (S) N (R' )-, -N(R') S (O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XIII):

em que B é opcional e, quando presente, é uma unidade de ligação selecionada do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -0-, -0- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(0)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S (0) k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)-, -C (0)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-/ -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C0-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N (R' ) C (S) N (R* ) -N (R ' ) S (0) kN (R' )-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' )-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- e -C(R')2-N(R')-N(R')-, em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N (R' ) 2, -C(0)kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -OR' e -S(0)kR'f em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído; e n é 0 a 8.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos:

em que tais compostos estão opcionalmente protegidos no amino, opcionalmente protegidos no carboxilo, opcionalmente protegidos no amino e protegidos no carboxilo, ou são um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais podem ser incorporados num polipéptido de aminoacido não natural.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XIV):

em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido;

Xi é C, S, ou S(0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), em que R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XIV-A):

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N (R' ) (alquileno substituído), em que R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XIV-B):

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído .

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XV):

Xi é C, S ou S (0) ; e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, alcoxilo, alquilamina, halogéneo, alquilo, arilo, ou quaisquer R8 e R9 podem formar em conjunto =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos R8 adjacentes podem formar em conjunto um cicloalquilo.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XV-A):

Ri é opcional e, quando presente, é H, um qrupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, alcoxilo, alquilamina, halogéneo, alquilo, arilo, ou quaisquer R8 e R9 podem formar em conjunto =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos R8 adjacentes podem formar em conjunto um cicloalquilo.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XV-B):

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, alcoxilo, alquilamina, halogéneo, alquilo, arilo, ou quaisquer R8 e R9 podem formar em conjunto =0 ou um cicloalquilo, ou quaisquer dois grupos R8 adjacentes podem formar em conjunto um cicloalquilo.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XVI): em que:

A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Xi é C, S ou S (0); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R')(alquileno substituído), em que R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XVI-A):

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XVI-B):

I em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; L é alquileno, alquileno substituído, N(R')(alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído.

Além disso, são incluídos os aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XVII):

em que: A é opcional e, quando presente, é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alcenileno inferior, alcenileno inferior substituído, alcinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; M é -C (R3) -,

em que (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respetivos grupos carbonilo, R3 e R4 são independentemente escolhidos de H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; r é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído; T3 é uma ligação, C (R) (R) , 0 ou S, e R é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R.2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido.

Além disso, são incluídos os aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XVIII):

em que: M é -C(Rs)-,

em que (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respetivos grupos carbonilo, R3 e R4 são independentemente escolhidos de H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído, ou R3 e FU ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 formam opcionalmente um cicloalquilo ou um heterocicloalquilo; r é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído; T3 é uma ligação, C (R) (R) , 0 ou S, e R é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído ;

Ri é opcional e, quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; e R2 é opcional e, quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipéptido ou polinucleótido; cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, -N (R') 2, -C(0)kR' em que k é 1, 2 ou 3, -C(0)N(R')2, -OR', e -S(0)kR', em que cada R' é independentemente H, alquilo ou alquilo substituído.

Além disso, são incluídos os aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XIX):

em que: R é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído; e T3 é 0 ou S.

Além disso, são incluídos os aminoácidos que têm a estrutura de Fórmula (XX):

em que: R é H, halogéneo, alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído.

Além disso, são incluídos os seguintes aminoácidos que têm estruturas de Fórmula (XXI):

Nalgumas formas de realização, um polipéptido que compreende um aminoácido não natural é modificado quimicamente para gerar um grupo funcional carbonilo ou dicarbonilo reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para as reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade que tem grupos amino e hidroxilo adjacentes. Por exemplo, quando a molécula biologicamente ativa é um polipéptido, pode utilizar-se uma serina ou treonina N-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta por digestão química ou enzimática) para gerar uma funcionalidade aldeído sob condições suaves de dissociação oxidativa utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994) . No entanto, os métodos conhecidos na técnica restringem-se ao aminoácido na extremidade N-terminal do péptido ou proteína.

Na presente invenção, um aminoácido não natural que tem grupos hidroxilo e amino adjacentes pode ser incorporado no polipéptido como uma funcionalidade aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidroxilisina tem um grupo hidroxilo adjacente à amina épsilon. As condições reacionais para gerar o aldeído envolvem tipicamente adição de um excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar oxidação noutros sítios dentro do polipéptido. O pH da reação de oxidação é tipicamente de cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 excesso molar de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipéptido, seguido de incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Ver, e.g. Patente U.S. N.° 6,423,685. A funcionalidade carbonilo ou dicarbonilo pode ser feita reagir seletivamente com um reagente que contém hidroxilamina sob condições suaves em solução aquosa para formar a ligação oxima correspondente que é estável sob condições fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além do mais, a reatividade única do grupo carbonilo ou dicarbonilo permite uma modificação seletiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácidos. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. &

Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997).

Estrutura e Síntese de Aminoácidos Nâo Naturais: Aminoácidos que Contêm Hidroxilamina O Pedido de Patente Provisório U.S. N.°

60/638,418 é incorporado por referência na sua totalidade. Assim, as divulgações proporcionadas na Secção V (intitulada "Non-natural Amino Acids"), Parte B (intitulada "Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids"), no Pedido de Patente Provisório U.S. N.° 60/638,418 aplicam-se totalmente aos métodos, composições (incluindo Fórmulas X- XXXV) , técnicas e estratégias para preparar, purificar, caracterizar e utilizar aminoácidos não naturais, polipéptidos de aminoácidos não naturais e polipéptidos de aminoácidos não naturais modificados aqui descritos na mesma medida como se essas divulgações fossem totalmente aqui apresentadas. Publicações de Patentes U.S. N.° 2006/0194256, 2006/0217532 e 2006/0217289 e WO 2006/069246 intituladas "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides,".

SÍNTESE QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para serem utilizados na presente invenção estão comercialmente disponíveis, e.g., de Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, WI, EUA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como aqui proporcionado ou como proporcionado em várias publicações ou utilizando métodos padrão conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Para técnicas de síntese orgânica, ver, e.g., Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Third Edition, Partes A e B, 1990, Plenum Press, New York). Publicações adicionais que descrevem a síntese de aminoácidos não naturais incluem, e.g., WO 2002/085923 intitulada "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; and, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver também, Publicação de Patente U.S. N.° US 2004/0198637 intitulada "Protein Arrays,". A. Grupos reativos carbonilo

Os aminoácidos com um grupo reativo carbonilo permitem uma variedade de reações para unir moléculas (incluindo, mas não se limitando a, PEG ou outras moléculas solúveis em água) através de adição nucleófila ou reações de condensação aldólica entre outros.

Os aminoácidos ilustrativos que contêm carbonilo podem ser representados como se segue:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído ou arilo substituído; R2 é H, alquilo, arilo, alquilo substituído e arilo substituído; e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade carboxilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo e R2 é um alquilo simples (i.e., metilo, etilo ou propilo) e a unidade cetona está posicionada na posição para relativamente à cadeia lateral alquilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo e R2 é um alquilo simples (i.e., metilo, etilo ou propilo) e a unidade cetona está posicionada na posição meta relativamente à cadeia lateral alquilo. A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-( + /-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Outros aminoácidos que contêm carbonilo podem ser preparados de forma semelhante por um especialista com conhecimentos médios na matéria.

Nalgumas formas de realização, um polipéptido que compreende um aminoácido não codificado naturalmente é modificado quimicamente para gerar um grupo funcional carbonilo reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade que tem grupos amino e hidroxilo adjacentes. Por exemplo, quando a molécula biologicamente ativa é um polipéptido, pode ser utilizada uma serina ou treonina ZV-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta através de digestão química ou enzimática) para gerar uma funcionalidade aldeído sob condições suaves de dissociação oxidativa utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al. , J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994) . No entanto, os métodos conhecidos na técnica restringem-se ao aminoácido na extremidade N-terminal do péptido ou proteína.

Na presente invenção, um aminoácido não codificado naturalmente que tem grupos hidroxilo e amino adjacentes pode ser incorporado no polipéptido como uma funcionalidade aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidroxilisina tem um grupo hidroxilo adjacente à amina épsilon. As condições reacionais para gerar o aldeído envolvem tipicamente a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar a oxidação noutros sítios dentro do polipéptido. 0 pH da reação de oxidação é tipicamente de cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 excesso molar de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipéptido, seguido de incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Ver, e.g. Patente U.S. N.° 6,423,685. A funcionalidade carbonilo pode ser feita reagir seletivamente com um reagente que contém hidrazina, hidrazida, hidroxilamina ou semicarbazida sob condições suaves em solução aquosa para formar as ligações hidrazona, oxima ou semicarbazona correspondentes, respetivamente, que são estáveis sob condições fisiológicas. Ver, e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e

Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além do mais, a reatividade única do grupo carbonilo permite a modificação seletiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácidos. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. &

Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997). B. Grupos reativos hidrazina, hidrazida ou semicarbazida

Os aminoácidos não codificados naturalmente que contêm um grupo nucleófilo, tal como uma hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, permitem a reação com uma variedade de grupos eletrófilos para formar conjugados (incluindo, mas não se limitando a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água).

Os aminoácidos que contêm hidrazina, hidrazida ou semicarbazida ilustrativos podem ser representados como se segue:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído ou arilo substituído ou não está presente; X é O, N ou S ou não está presente; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido, ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade carboxilo.

Nalgumas formas de realização, n é 4, Ri não está presente e X é N. Nalgumas formas de realização, n é 2, Ri não está presente e X não está presente. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X é O e o átomo de oxigénio está posicionado para relativamente ao grupo alifático no anel arilo.

Os aminoácidos que contêm hidrazida, hidrazina e semicarbazida são disponíveis a partir de fontes comerciais. Por exemplo, a L-glutamato-Y-hidrazida é disponível de Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outros aminoácidos que não sejam comercialmente disponíveis podem ser preparados por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Ver, e.g., Pat. U.S. N.° 6,281,211.

Os polipéptidos que contêm aminoácidos não codificados naturalmente que têm funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida podem ser feitos reagir eficaz e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Ver, e.g., Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reatividade única dos grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida torna-os significativamente mais reativo para aldeídos, cetonas e outros grupos eletrófilos em comparação com os grupos nucleófilos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando ao grupo hidroxilo da serina ou treonina, ou os grupos amino de lisina e a extremidade N-terminal). C. Aminoácidos que contêm aminooxllo

Os aminoácidos não codificados naturalmente que contêm um grupo aminooxilo (também chamado uma hidroxilamina) permitem a reação com uma variedade de grupos eletrófilos para formar conjugados (incluindo, mas não se limitando a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Como com as hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a melhor nucleofilicidade do grupo aminooxilo permite-o reagir eficaz e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Ver, e.g., Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang e C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). No entanto, enquanto o resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, uma oxima resulta geralmente da reação de um grupo aminooxilo com um grupo que contêm um carbonilo tal como uma cetona.

Os aminoácidos ilustrativos que contêm grupos aminooxilo podem ser representados como se segue:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído ou arilo substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10; Y = C(O) ou não está presente; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade carboxilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X é 0, m é 1, e Y está presente. Nalgumas formas de realização, n é 2, Ri e X não estão presentes, m é 0, e Y não está presente.

Os aminoácidos que contêm aminooxilo podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos prontamente disponíveis (homosserina, serina e treonina). Ver, e.g., M. Carrasco e R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) . Certos aminoácidos que contêm aminooxilo, tais como o ácido L-2-amino-4-(aminooxi)butírico), foram isolados a partir de fontes naturais (Rosenthal, G., Life Sei. 60: 1635-1641 (1997). Outros aminoácidos que contêm aminooxilo podem ser preparados por um especialista com conhecimentos médios na matéria. D. Grupos reativos azida e alcino A reatividade única dos grupos funcionais azida e alcino torna-os extremamente úteis para a modificação seletiva de polipéptidos e outras moléculas biológicas. As azidas orgânicas, em particular as azidas alifáticas, e os alcinos são geralmente estáveis em condições químicas reativas comuns. Em particular, tanto os grupos funcionais azida como os alcino são inertes para as cadeias laterais (i.e., grupos R) dos 20 aminoácidos comuns presentes nos polipéptidos que ocorrem naturalmente. No entanto, quando colocados muito próximos, a natureza "tipo mola tensionada" dos grupos azida e alcino é revelada e estes reagem seletiva e eficazmente através de uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen para gerar o triazole correspondente. See, e.g., Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

Uma vez que a reação de cicloadição de Huisgen envolve uma reação de cicloadição seletiva (ver, e.g., Padwa, A., em COMPREHENSIVE SÍNTESE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. em 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) em vez de uma substituição nucleófila, a incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente portadores de cadeias laterais que contêm azida e alcino permite que os polipéptidos resultantes sejam modificados seletivamente na posição do aminoácido não codificado naturalmente. A reação de cicloadição que envolve o polipéptido de bG-CSF que contém azida ou alcino pode ser realizada à temperatura ambiente sob condições aquosas pela adição de Cu (II) (incluindo, mas não se limitando a, na forma de uma quantidade catalítica de CuSCh) na presença de um agente de redução para reduzir Cu(II) a Cu(I), in situ, em quantidade catalítica. Ver, e.g., Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Os agentes de redução ilustrativos incluem, incluindo, mas não se limitando a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+, e um potencial elétrico aplicado.

Nalguns casos, quando é desejada uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen entre uma azida e um alcino, o polipéptido de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente que compreende uma unidade alcino e o polímero solúvel em água a ser ligado ao aminoácido compreende uma unidade azida. Alternativamente, pode ser também realizada a reação contrária (i.e., com a unidade azida no aminoácido e a unidade alcino presente no polímero solúvel em água). 0 grupo funcional azida pode ser também feito reagir seletivamente com um polímero solúvel em água que contém um éster de arilo e apropriadamente funcionalizado com uma unidade de arilfosfina para gerar uma ligação amida. 0 grupo arilfosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage em seguida eficazmente com uma ligação éster próxima para gerar a amida correspondente. Ver, e.g., E. Saxon e C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). O aminoácido que contém azida pode ser uma alquilazida (incluindo, mas não se limitando a, ácido 2-amino-6-azido-1-hexanoico) ou uma arilazida (p-azido-fenilalanina).

Os polímeros solúveis em água ilustrativos que contêm um éster de arilo e uma unidade fosfina podem ser representados como se segue:

em que X pode ser 0, N, S ou não está presente, Ph é fenilo, W é um polímero solúvel em água e R pode ser os grupos H, alquilo, arilo, alquilo substituído e arilo substituído. Os grupos R ilustrativos incluem mas não se limitam a -CH2, -0(0¾) 3, -OR', -NR'R", -SR', -halogéneo, -C(0)R', -CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -ON e -NO2. R', R", r"' e R"" referem-se, cada, independentemente aos grupos hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo, mas não se limitando a, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo ou tioalcoxilo, ou grupos arilalquilo. Por exemplo, quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como o são cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando estão presentes mais que um destes grupos. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, aqueles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" destina-se a incluir, mas não se limita a, 1-pirrolidinilo e 4- morfolinilo. A partir da discussão anterior de substituintes, um especialista na técnica entenderá que o termo "alquilo" destina-se a incluir grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos diferentes de grupos hidrogénio, tais como haloalquilo (incluindo, mas não se limitando a, -CF3 e - CH2CF3) e acilo (incluindo, mas não se limitando a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH20CH3 e semelhantes). 0 grupo azida funcional pode ser também feito reagir seletivamente com um polímero solúvel em água que contém um tioéster e apropriadamente funcionalizado com uma unidade de arilfosfina para gerar uma ligação amida. 0 grupo arilfosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage em seguida eficazmente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente. Os polímeros solúveis em água ilustrativo que contêm um tioéster e uma unidade fosfina podem ser representados como se segue:

em que n é 1-10; X pode ser O, N, S ou não está presente, Ph é fenilo, e W é um polímero solúvel em água.

Os aminoácidos que contêm alcino ilustrativos podem ser representados como se segue:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, ou arilo substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10, R2 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade carboxilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X não está presente, m é 0 e a unidade acetileno está posicionada na posição para relativamente à cadeia lateral alquilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X é 0, m é 1 e o grupo propargiloxilo está posicionado na posição para relativamente à cadeia lateral alquilo (i.e., 0- propargil-tirosina). Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri e X não estão presentes e m é 0 (i.e., proparilglicina).

Aminoácidos que contêm alcino estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, a propargilglicina está comercialmente disponível de Peptech (Burlington, MA). Alternativamente, os aminoácidos que contêm alcino podem ser preparados de acordo com métodos padrão. Por exemplo, a p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, como descrito em Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e a 4-alcinil-L-fenilalanina pode ser sintetizada como descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos que contêm alcino podem ser preparados por um especialista com conhecimentos médios na matéria.

Os aminoácidos que contêm azida ilustrativos podem ser representados como se segue:

em que n é 0-10; Ri é um alquilo, arilo, alquilo substituído, arilo substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0-10; R2 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipéptido ou um grupo de modificação da extremidade carboxilo. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, X não está presente, m é 0 e a unidade azida está posicionada para relativamente à cadeia lateral alquilo. Nalgumas formas de realização, n é 0-4 e Ri e X não estão presentes, e m=0. Nalgumas formas de realização, n é 1, Ri é fenilo, XéO, mé2ea unidade β-azidoetoxilo está posicionada na posição para relativamente à cadeia lateral alquilo.

Aminoácidos que contêm azida estão disponíveis de fontes comerciais. Por exemplo, a 4-azidofenilalanina pode ser obtida de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) . Para aqueles aminoácidos que contêm azida que não estão comercialmente disponíveis, o grupo azida pode ser preparado de forma relativamente fácil utilizando métodos padrão conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, incluindo, mas não se limitando a, através de substituição de um grupo de saída adequado (incluindo, mas não se limitando a, halogeneto, mesilato, tosilato) ou através da abertura de uma lactona adequadamente protegida. Ver, e.g., Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York). E. Grupos reativos aminotiol A reatividade única de grupos funcionais aminotiol substituídos em posição beta torna-os extremamente úteis para a modificação seletiva de polipéptidos e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeído através da formação de tiazolidina. Ver, e.g., J. Shao e J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. Nalgumas formas de realização, os aminotiol aminoácidos substituídos em posição beta podem ser incorporados nos polipéptidos de bG-CSF e, em seguida, feitos reagir com polímeros solúveis em água que compreendem uma funcionalidade aldeído. Nalgumas formas de realização, um polímero solúvel em água, fármaco conjugado ou outra carga pode ser acoplado a um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminotiol aminoácido substituído em posição beta através da formação da tiazolidina. F. Grupos reativos adicionais

Grupos reativos e aminoácidos não codificados naturalmente adicionais que incluem, mas não se limitam a para-amino-fenilalanina, que podem ser incorporados nos polipéptidos de bG-CSF da invenção são descritos nos seguintes pedidos de patente: Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0194256, Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0217532, Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0217289, Patente Provisória U.S. N.° 60/755,338; Patente Provisória U.S. N.° 60/755,711; Patente Provisória U.S. N.° 60/755,018; Pedido Internacional de Patente N.° PCT/US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S. N.° 60/743,041; Patente Provisória U.S. N.° 60/743,040; Pedido Internacional de Patente N.° PCT/US06/47822; Patente Provisória U.S. N.° 60/882,819; Patente Provisória U.S. N.° 60/882,500; e Patente Provisória U.S. N.° 60/870,594. Estes pedidos também discutem grupos reativos que podem estar presentes no PEG ou noutros polímeros, incluindo, mas não se limitando a, grupos hidroxilamina (aminooxilo) para conj ugação.

CAPTAÇÃO CELULAR DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS A captação de aminoácidos não naturais por uma célula é um problema que é tipicamente considerado quando se concebe e seleciona aminoácidos não naturais, incluindo, mas não se limitando a, para incorporação numa proteína. Por exemplo, a alta densidade de carga de a-aminoácidos sugere que estes compostos têm pouca probabilidade de ter permeabilidade celular. Os aminoácidos naturais são captados para a célula eucariótica através de uma coleção de sistemas de transporte à base de proteínas. Pode ser efetuada uma triagem rápida, a qual avalia que aminoácidos não naturais, se houver algum, são captados pelas células. Ver, e.g., os ensaios de toxicidade, e.g., na Publicação de Patente U.S. N.° US 2004/0198637 intitulada "Protein Arrays"; e Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Embora a captação seja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa à conceção de aminoácidos não naturais que são adequados para as vias de captação celular consiste em proporcionar vias biossintéticas para gerar aminoácidos in vivo.

BIOSSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS Já existem muitas vias biossintéticas em células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Embora um método biossintético para um aminoácido não natural particular possa não existir na natureza, incluindo, mas não se limitando a, numa célula, a invenção proporciona esses métodos. Por exemplo, as vias biossintéticas para aminoácidos não naturais são opcionalmente geradas na célula hospedeira adicionando novas enzimas ou modificando vias existentes na célula hospedeira. As novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas naturais ou enzimas desenvolvidas artificialmente. Por exemplo, a biossíntese de p-aminofenilalanina (como apresentada num exemplo na WO 2002/085923 intitulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids") baseia-se na adição de uma combinação de enzimas conhecidas de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos numa célula eucariótica transformando a célula com um plasmídeo que compreende os genes. Os genes, quando expressados na célula, proporcionam uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Os exemplos de tipos de enzimas que são opcionalmente adicionados são proporcionados nos exemplos mais abaixo. As sequências das enzimas adicionais encontram-se, por exemplo, no Genbank. As enzimas desenvolvidas artificialmente são também opcionalmente adicionadas numa célula da mesma maneira. Desta maneira, a maquinaria celular e os recursos de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não naturais.

Encontra-se disponível uma variedade de métodos para produzir novas enzimas para utilização em vias biossintéticas ou para a evolução de vias existentes. Por exemplo, a recombinação recursiva, incluindo, mas não se limitando àquela como desenvolvida por Maxygen, Inc. (disponível na Rede Mundial de Computadores em maxygen.com) é opcionalmente utilizada para desenvolver novas enzimas e vias. Ver, e.g., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4) :389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. De forma semelhante o DesignPath™ desenvolvido pela Genencor (disponível na Rede Mundial de Computadores em genencor.com) é opcionalmente utilizado para manipulação genética das vias metabólicas, incluindo, mas não se limitando a, para manipular geneticamente uma via para gerar 0-metil-L-tirosina numa célula. Esta tecnologia reconstrói vias existentes em organismos hospedeiros utilizando uma combinação de novos genes, incluindo, mas não se limitando àqueles identificados através de genómica funcional, e evolução e conceção molecular. A Diversa Corporation (disponível na Rede Mundial de Computadores em diversa.com) também proporciona tecnologia para triar rapidamente bibliotecas de genes e vias de genes, incluindo, mas não se limitando a, para gerar novas vias.

Tipicamente, o aminoácido não natural produzido por uma via biossintética geneticamente manipulada da invenção é produzido numa concentração suficiente para a biossintese eficiente de proteínas, incluindo, mas não se limitando a, uma quantidade celular natural, mas num grau que não afete a concentração dos outros aminoácidos ou esgote os recursos celulares. As concentrações típicas produzidas in vivo desta maneira são de cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Assim que uma célula é transformada com um plasmídeo que compreende os genes utilizados para produzir enzimas desejadas para uma via específica e é gerado um aminoácido não natural, as seleções in vivo são opcionalmente utilizadas para otimizar ainda mais a produção do aminoácido não natural tanto para a síntese ribossómica de proteínas como para o crescimento celular.

POLIPÉPTIDOS COM AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS A incorporação de um aminoácido não natural pode ser efetuada para uma variedade de finalidades, incluindo, mas não se limitando ao ajustamento de modificações na estrutura e/ou função da proteína, modificação do tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação de hidrogénio, hidrofobicidade, acessibilidade de sítios alvo para proteases, direcionamento para uma unidade (incluindo, mas não se limitando a, para uma matriz proteica), adição de uma molécula biologicamente ativa, ligação de um polímero, ligação de um radionuclídeo, modulação da semivida no soro, modulação da penetração no tecido (e.g. tumores), modulação do transporte ativo, modulação do tecido, especificidade ou distribuição na célula ou órgão, modulação da imunogenicidade, modulação da resistência à protease, etc. As proteínas que incluem um aminoácido não natural podem ter propriedades catalíticas ou biofísicas aumentadas ou até mesmo totalmente novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas por inclusão de um aminoácido não natural numa proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espetroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, semivida (incluindo, mas não se limitando a, semivida no soro), capacidade para reagir com outras moléculas, incluindo, mas não se limitando a, covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes. As composições incluindo proteínas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, incluindo, mas não se limitando a, novas terapêuticas, novos diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos), e incluindo, mas não se limitando ao estudo da estrutura e função de proteínas. Ver, e.g., Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.

Numa divulgação, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes e podem existir, incluindo, mas não se limitando a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Noutra divulgação, uma composição inclui uma proteína em que pelo menos um, mas menos do que a totalidade, de um aminoácido particular presente na proteína está substituído pelo aminoácido não natural. Para uma determinada proteína com mais do que um aminoácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser idênticos ou diferentes (incluindo, mas não se limitando a, a proteína pode incluir dois ou mais tipos diferentes de aminoácidos não naturais ou pode incluir dois aminoácidos não naturais iguais) . Para uma determinada proteína com mais de dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de uma multiplicidade de aminoácidos não naturais do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido não natural diferente.

As proteínas ou polipéptidos de interesse com um aminoácido não natural são uma característica da invenção. A invenção inclui também polipéptidos ou proteínas com um aminoácido não natural produzidos utilizando as composições e métodos da invenção. Um excipiente (incluindo, mas não se limitando a, um excipiente farmaceuticamente aceitável) pode estar também presente com a proteína.

Ao produzir proteínas ou polipéptidos de interesse com um aminoácido não natural em células eucarióticas, as proteínas ou os polipéptidos incluirão tipicamente modificações pós-tradução eucarióticas. Em certas formas de realização, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que a modificação pós-tradução não é efetuada por uma célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, incluindo, mas não se limitando a, acetilação, acilação, modificação de lípidos, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação da ligação glicolipídica, glicosilação e semelhantes. Num aspeto, a modificação pós-tradução inclui a ligação de um oligossacárido (incluindo, mas não se limitando a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina. Ver a Tabela 1 que lista alguns exemplos de oligossacáridos ligados a N de proteínas eucarióticas (podem estar também presentes resíduos adicionais, os quais não são mostrados). Noutro aspeto, a modificação pós-tradução inclui a ligação de um oligossacárido (incluindo, mas não se limitando a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina, ou uma ligação GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina.

TABELA 1: EXEMPLOS DE OLIGOSSACÁRIDOS ATRAVÉS DE LIGAÇÃO DE

GlcNAc

Ainda noutro aspeto, a modificação pós-tradução inclui o processamento proteolítico de precursores (incluindo, mas não se limitando ao precursor de calcitonina, precursor do péptido relacionado com o gene da calcitonina, hormona preproparatireoide, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, pro- opiomelanocortina e semelhantes) , montagem numa proteína de múltiplas subunidades ou montagem macromolecular, translação para outro sítio na célula (incluindo, mas não se limitando a, para organitos, tais como o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, o núcleo, lisossomas, peroxissomas, mitocôndrias, cloroplastos, vacúolos, etc., ou através da via secretora) . Em certas formas de realização, a proteína compreende uma sequência de secreção ou localização, uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta de poli-histidina, uma fusão de GST ou semelhantes.

Uma vantagem de um aminoácido não natural é que apresenta unidades químicas adicionais que podem ser utilizadas para adicionar moléculas adicionais. Estas modificações podem ser feitas in vivo numa célula eucariótica ou não eucariótica, ou in vitro. Assim, em certas formas de realização, a modificação pós-tradução é através do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós-tradução pode ser através de uma reação nucleófilo-eletrófilo. A maioria das reações atualmente utilizadas para a modificação seletiva de proteínas envolve a formação de ligações covalentes entre os parceiros de reação nucleófilos e eletrófilos, incluindo, mas não se limitando à reação de α-halocetonas com histidina ou cadeias laterais de cisteina. Nestes casos, a seletividade é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos de nucleófilos na proteína. Nas proteínas da invenção, podem ser utilizadas outras reações mais seletivas tais como a reação de um ceto-aminoácido não natural com hidrazidas ou compostos de aminooxilo, in vitro e in vivo. Ver, e.g., Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 27 6:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; e Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7'. Isto permite a marcação seletiva de praticamente qualquer proteína com um hospedeiro de reagentes que incluem fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacáridos e moléculas citotóxicas. Ver também, Patente U.S. N.° 6,927,042 intitulada "Glycoprotein synthesis,"'. As modificações pós-tradução, incluindo, mas não se limitando a, através de um azido aminoácido, pode ser também efetuada através da ligação de Staudinger (incluindo, mas não se limitando a, com reagentes de triarilfosfina). Ver, e.g., Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24.

Esta invenção proporciona outro método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas, o qual envolve a incorporação genética de aminoácidos não naturais, incluindo, mas não se limitando a, contendo uma unidade azida ou alcinilo em proteínas em resposta a um codão seletor. Estas cadeias laterais de aminoácidos podem ser em seguida modificadas por, incluindo, mas não se limitando a, uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen (ver, e.g., Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) com, incluindo, mas não se limitando a, derivados de alcinilo ou azida, respetivamente. Uma vez que este método envolve uma cicloadição, em vez de uma substituição nucleófila, as proteínas podem ser modificadas com uma seletividade extremamente alta. Esta reação pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(I) à mistura reacional. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-30 64; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Outro método que pode ser utilizado é a troca de ligando num composto bisarsénico com um motivo de tetracisteína, ver, e.g., Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272.

Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui praticamente qualquer molécula com um derivado de azida ou alcinilo. As moléculas incluem, mas não se limitam a, corantes, fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacáridos, polímeros (incluindo, mas não se limitando a, derivados de polietileno glicol), fotorreticulantes, compostos citotóxicos, etiquetas de afinidade, derivados de biotina, resinas, esférulas, uma segunda proteína ou polipéptido (ou mais), polinucleótido(s) (incluindo, mas não se limitando a, ADN, ARN, etc.), quelantes de metais, cofatores, ácidos gordos, hidratos de carbono e semelhantes. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo alcinilo, incluindo, mas não se limitando a, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, mas não se limitando a, p-azido-fenilalanina, respetivamente. V. Geração in vivo de polipéptidos de bG-CSF que compreendem aminoácidos não codificados naturalmente

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser gerados in vivo utilizando ARNt modificado e ARNt-sintetases para adicionar ou substituir aminoácidos que não são codificados nos sistemas naturais.

Os métodos para gerar ARNts e ARNt-sintetases que utilizam aminoácidos que não são codificados em sistemas naturais são descritos em, e.g., Patentes U.S. N.° 7,045,337 e 7,083,970'. Estes métodos envolvem a geração de uma maquinaria de tradução que funciona independentemente das sintetases e dos ARNts endógenos ao sistema de tradução (e são, portanto, por vezes referidos como "ortogonais"). Tipicamente, o sistema de tradução compreende um ARNt ortogonal (0-ARNt) e uma aminoacil-ARNt-sintetase ortogonal (O-RS). Tipicamente, a 0-RS aminoacila preferencialmente o O-ARNt com pelo menos um aminoácido não natural no sistema de tradução e o O-ARNt reconhece pelo menos um codão seletor que não é reconhecido por outros ARNts no sistema. Assim, o sistema de tradução insere o aminoácido não codificado naturalmente numa proteína produzida no sistema, em resposta a um codão seletor codificado, "substituindo" desse modo um aminoácido numa posição do polipéptido codificado.

Na técnica foi descrita uma grande variedade de ARNts e aminoacil-ARNt-sintetases ortogonais para inserir aminoácidos sintéticos particulares em polipéptidos e são geralmente adequados para serem utilizados na presente invenção. Por exemplo, O-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetases específicos para o ceto são descritos em Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003). As O-RS ilustrativas, ou porções das mesmas, são codificadas por sequências polinucleotidicas e incluem as sequências de aminoácidos divulgadas nas Patentes U.S. N.° 7,045,337 e 7,083,970'. As moléculas de O-ARNt correspondentes para utilização com as O-RSs são também descritas nas Patentes U.S. N.° 7,045,337 e 7,083,970'. Exemplos adicionais de pares de O-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetase são descritos em WO 2005/007870, WO 2005/007624; e WO 2005/019415.

Um exemplo de um sistema de O-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetase especifico para a azida é descrito em Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). As sequências de O-RS ilustrativas para p-azido-L-Phe incluem, mas não se limitam às sequências de nucleótidos SEQ ID NOs: 14-16 e 29-32 e sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 46-48 e 61-64 como divulgadas na Patente U.S. N.° 7,083,970. As sequências de O-ARNt ilustrativas adequadas para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, sequências de nucleótidos SEQ ID NOs: 1-3 como divulgadas na Patente U.S. N.° 7,083,970. Outros exemplos de pares de O-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetase específicos para aminoácidos não codificados naturalmente particulares são descritos na Patente U.S. N.° 7,045,337. O-RS e O-ARNt que incorporam aminoácidos que contêm tanto ceto como azida em S. cerevisiae são descritos em Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003).

Foram descritos vários outros pares ortogonais. Foram descritos sistemas de glutaminilo (ver, e.g., Liu, D. R. e Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 96:4780-4785), aspartilo (ver, e.g., Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) e tirosilo (ver, e.g., Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124:1065-1068; e Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl.

Acad. Sei. U. S. A. 98:2268-2273) derivados de ARNts e sintetases de S. cerevisiae para a incorporação potencial de aminoácidos não naturais em E. colí. Foram descritos sistemas derivados de glutaminil- (ver, e.g., Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98:2268-2273) e tirosil-sintetases (ver, e.g., Edwards, H., e Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) de E. coli para utilização em S. cerevisiae. 0 sistema de tirosilo de E. coli foi utilizado para a incorporação de 3-iodo-L-tirosina in vivo, em células de mamífero. Ver, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692- 4699. A utilização de 0-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetases envolve a seleção de um codão específico que codifica o aminoácido não codificado naturalmente. Embora se possa utilizar qualquer codão, é geralmente desejável que se selecione um codão que é raramente ou nunca utilizado na célula em que o O-ARNt/aminoacil-ARNt-sintetase é expresso. Por exemplo, os codões ilustrativos incluem codões sem sentido tais como os codões de terminação (âmbar, ocre e opalino), codões de quatro ou mais bases e outros codões de três bases naturais que são raramente ou nunca utilizados. 0(s) codão seletor/codões seletores específicos podem ser introduzidos em posições apropriadas na sequência codificante do polinucleótido de bG-CSF utilizando métodos de mutagénese conhecidos na técnica (incluindo, mas não se limitando a, mutagénese específica de um lócus, mutagénese de cassete, mutagénese de seleção de restrição, etc.). Métodos para gerar componentes da maquinaria biossintética de proteínas, tais como O-RSs, O-ARNts, e pares O-ARNt/O-RS ortogonais que podem ser utilizados para incorporar um aminoácido não codificado naturalmente são descritos em Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) ; Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) . Métodos e composições para a incorporação in vivo de aminoácidos não codificados naturalmente são descritos na Patente U.S. N.° 7,045,337. Métodos para selecionar um par ARNt-ARNt-sintetase ortogonal para utilização no sistema de tradução in vivo de um organismo são também descritos nas Patentes U.S. N.° 7,045,337 e 7,083,970. A Publicação PCT N.° W0 04/035743 intitulada "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins," descreve pares de RS e ARNt ortogonais para a incorporação de ceto aminoácidos. A Publicação PCT N.° WO 04/094593 intitulada "Expanding the Eukaryotic Genetic Code," descreve pares de RS e ARNt ortogonais para a incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente em células hospedeiras eucarióticas.

Os métodos de produção de pelo menos uma aminoacil-ARNt-sintetase (O-RS) ortogonal recombinante compreendem: (a) geração de uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de pelo menos uma aminoacil-ARNt-sintetase (RS) de um primeiro organismo, incluindo, mas não se limitando a, um organismo procariótico, tal como Methanococcus j annaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhantes, ou um organismo eucariótico; (b) seleção (e/ou triagem) da biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para membros que aminoacilem um ARNt ortogonal (Ο-ARNt) na presença de um aminoácido não codificado naturalmente e um aminoácido natural, proporcionando, desse modo, um acervo de RSs ativas (opcionalmente mutantes); e/ou (c) seleção (opcionalmente através de seleção negativa) do acervo para RSs ativas (incluindo, mas não se limitando a, RSs mutantes) que aminoacilem preferencialmente o Ο-ARNt na ausência do aminoácido não codificado naturalmente, proporcionando, desse modo, a pelo menos uma O-RS recombinante; em que a pelo menos uma O-RS recombinante aminoacila preferencialmente o O-ARNt com o aminoácido não codificado naturalmente.

Numa forma de realização, a RS é uma RS inativa. A RS inativa pode ser gerada mutando uma RS ativa. Por exemplo, a RS inativa pode ser gerada mutando pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, ou pelo menos cerca de 10 ou mais aminoácidos para aminoácidos diferentes, que incluem, mas não se limitam a, alanina.

As bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas utilizando várias técnicas conhecidas na matéria, incluindo, mas não se limitando à conceção racional com base na estrutura tridimensional da proteína RS, ou mutagénese de nucleótidos de RS numa técnica de conceção aleatória ou racional. Por exemplo, as RSs mutantes podem ser geradas por mutações específicas de loci, mutações aleatórias, mutações de recombinação geradoras de diversidade, construções quiméricas, conceção racional e por outros métodos aqui descritos ou conhecidos na técnica.

Numa forma de realização, a seleção (e/ou triagem) da biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para membros que são ativos, incluindo, mas não se limitando a, que aminoacilam um ARNt ortogonal (O-ARNt) na presença de um aminoácido não codificado naturalmente e um aminoácido natural, inclui: a introdução de um marcador de seleção ou triagem positiva, incluindo, mas não se limitando a, um gene de resistência a antibióticos, ou semelhantes, e da biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) numa multiplicidade de células, em que o marcador de seleção e/ou triagem positiva compreende pelo menos um codão seletor, incluindo, mas não se limitando a, um codão âmbar, ocre ou opalino; o cultivo da multiplicidade de células na presença de um agente de seleção; a identificação de células sobreviventes (ou que exibem uma resposta especifica) na presença do agente de seleção e/ou triagem que suprime o pelo menos um codão seletor no marcador de seleção ou triagem positiva, proporcionando, desse modo, um subconjunto de células selecionadas positivamente que contém o acervo de RSs ativas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, a concentração do agente de seleção e/ou triagem pode ser modificada.

Num aspeto, o marcador de seleção positiva é um gene de cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) e o codão seletor é um codão de terminação âmbar no gene CAT. Opcionalmente, o marcador de seleção positiva é um gene de β-lactamase e o codão seletor é um codão de terminação âmbar no gene de β-lactamase. Noutro aspeto, o marcador de triagem positiva compreende um marcador de triagem fluorescente ou luminescente, ou um marcador de triagem baseado em afinidade (incluindo, mas não se limitando a, um marcador da superfície celular).

Numa forma de realização, a seleção ou triagem negativa do acervo para RSs ativas (opcionalmente mutantes) que aminoacilam preferencialmente o O-ARNt na ausência do aminoácido não codificado naturalmente inclui: a introdução de um marcador de seleção ou triagem negativa com o acervo de RSs ativas (opcionalmente mutantes) da seleção ou triagem positiva numa multiplicidade de células de um segundo organismo, em que o marcador de seleção ou triagem negativa compreende pelo menos um codão seletor (incluindo, mas não se limitando a, um gene de resistência a antibióticos, incluindo, mas não se limitando a, um gene de cloranfenicol-acetiltransferase (CAT)); e a identificação de células sobreviventes ou que exibem uma resposta de triagem especifica num primeiro meio suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente e um agente de triagem ou seleção, mas não conseguem sobreviver ou exibir a resposta especifica num segundo meio não suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente e o agente de seleção ou triagem, proporcionando, desse modo, células sobreviventes ou células triadas com a pelo menos uma O-RS recombinante. Por exemplo, um protocolo de identificação de CAT atua opcionalmente como um seleção positiva e/ou uma triagem negativa na determinação de recombinantes de O-RS apropriados. Por exemplo, um acervo de clones é opcionalmente replicado em placas de crescimento que contêm CAT (que compreende pelo menos um codão seletor) com ou sem um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. As colónias que crescem exclusivamente nas placas que contêm aminoácidos não codificados naturalmente são assim consideradas como contendo O-RS recombinante. Num aspeto, a concentração do agente de seleção (e/ou triagem) é modificada. Nalguns aspetos, o primeiro e segundo organismos são diferentes. Assim, o primeiro e/ou segundo organismos compreende opcionalmente: um procariota, um eucariota, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma eubactéria, uma planta, um inseto, um protista, etc. Noutras formas de realização, o marcador de triagem compreende um marcador de triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de triagem baseado em afinidade.

Noutra forma de realização, a triagem ou seleção (incluindo, mas não se limitando a, seleção negativa) do acervo para RSs ativas (opcionalmente mutantes) inclui: isolamento do acervo de RSs mutantes ativas do passo de seleção positiva (b); introdução de um marcador de seleção ou triagem negativa, em que o marcador de seleção ou triagem negativa compreende pelo menos um codão seletor (incluindo, mas não se limitando a, um gene marcador tóxico, incluindo, mas não se limitando a, um gene da ribonuclease barnase, que compreende pelo menos um codão seletor), e do acervo de RSs ativas (opcionalmente mutantes) numa multiplicidade de células de um segundo organismo; e a identificação das células sobreviventes ou que exibem uma resposta de triagem específica num primeiro meio não suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente, mas não conseguem sobreviver ou exibir uma resposta de triagem específica num segundo meio suplementado com o aminoácido não codificado naturalmente, proporcionando, desse modo, a células sobreviventes ou triadas com a pelo menos uma O-RS recombinante, em que a pelo menos uma O-RS recombinante é especifica para o aminoácido não codificado naturalmente. Num aspeto, o pelo menos um codão seletor compreende cerca de dois ou mais codões seletores. Tais formas de realização podem incluir opcionalmente aquelas em que o pelo menos um codão seletor compreende dois ou mais codões seletores e em que o primeiro e segundo organismos são diferente (incluindo, mas não se limitando a, cada organismo é opcionalmente, incluindo, mas não se limitando a, um procariota, um eucariota, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma eubactéria, uma planta, um inseto, um protista, etc.). Além disso, alguns aspetos incluem aquele em que o marcador de seleção negativa compreende um gene de ribonuclease barnase (que compreende pelo menos um codão seletor). Outros aspetos incluem aqueles em que o marcador de triagem compreende opcionalmente um marcador de triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de triagem baseado em afinidade. Nas formas de realização neste documento, as triagens e/ou seleções incluem opcionalmente a variação da restringência da triagem e/ou seleção.

Numa forma de realização, os métodos de produção de pelo menos uma aminoacil-ARNt-sintetase ortogonal recombinante (O-RS) podem compreender ainda: (d) o isolamento da pelo menos uma O-RS recombinante; (e) a geração de um segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutadas) derivadas da pelo menos uma O-RS recombinante; e, (f) a repetição dos passos (b) e (c) até se obter uma O-RS mutada que compreende uma capacidade para aminoacilar preferencialmente o O-ARNt. Opcionalmente, os passos (d)-(f) são repetidos, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos cerca de duas vezes. Num aspeto, o segundo conjunto de O-RS mutadas derivadas de pelo menos uma O-RS recombinante pode ser gerado por mutagénese, incluindo, mas não se limitando a, mutagénese aleatória, mutagénese especifica de um lócus, recombinação ou uma combinação dos mesmos. A restringência dos passos de seleção/triagem, incluindo, mas não se limitando ao passo de seleção/triagem positiva (b) , ao passo de seleção/triagem negativa (c) ou ambos os passos de seleção/triagem positiva e negativa (b) e (c) , nos métodos descritos acima, inclui opcionalmente a variação da restringência de seleção/triagem. Noutra forma de realização, o passo de seleção/triagem positiva (b) , o passo de seleção/triagem negativa (c) ou ambos os passos de seleção/triagem positiva e negativa (b) e (c) compreendem a utilização de um repórter, em que o repórter é detetado por separação de células ativada com fluorescência (FACS) ou em que o repórter é detetado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é apresentado numa superfície celular, numa apresentação em fago ou semelhantes e selecionado com base na afinidade ou atividade catalítica que envolve o aminoácido não codificado naturalmente ou um análogo. Numa forma de realização, a sintetase mutada é apresentada numa superfície celular, numa apresentação de fago ou semelhantes.

Os métodos de produção de um ARNt ortogonal (0-ARNt) recombinante incluem: (a) a geração de uma biblioteca de ARNts mutantes derivados de pelo menos um ARNt, incluindo, mas não se limitando a, um ARNt supressor, de um primeiro organismo; (b) a seleção (incluindo, mas não se limitando a, seleção negativa) ou triagem da biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-ARNt-sintetase (RS) de um segundo organismo na ausência de uma RS do primeiro organismo, proporcionando, desse modo, um acervo de ARNts (opcionalmente mutantes); e, (c) a seleção ou triagem do acervo de ARNts (opcionalmente mutantes) para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (0-RS) introduzida, proporcionando, desse modo, pelo menos um 0-ARNt recombinante; em que o pelo menos um 0-ARNt recombinante reconhece um codão seletor e não é reconhecido eficazmente pela RS do segundo organismo e é preferencialmente aminoacilado pela 0-RS. Nalgumas formas de realização o pelo menos um ARNt é um ARNt supressor e/ou compreende um codão de três bases único de bases naturais e/ou não naturais, ou é um codão sem sentido, um codão raro, um codão não natural, um codão que compreende pelo menos 4 bases, um codão âmbar, um codão ocre, ou um codão de terminação opalino. Numa forma de realização, o 0-ARNt recombinante possui uma melhoria da ortogonalidade. Entender-se-á que nalgumas formas de realização, 0-ARNt é opcionalmente importado num primeiro organismo a partir de um segundo organismo sem a necessidade de modificação. Em várias formas de realização, o primeiro e segundo organismos são iguais ou diferentes e são opcionalmente escolhidos de, incluindo, mas não se limitando a, procariotas (incluindo, mas não se limitando a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, etc.), eucariotas, mamíferos, fungos, leveduras, arqueobactérias, eubactérias, plantas, insetos, protistas, etc. Além disso, o ARNt recombinante é opcionalmente aminoacilado por um aminoácido não codificado naturalmente, em que o aminoácido não codificado naturalmente é biossintetizado in vivo quer naturalmente ou através de manipulação genética. 0 aminoácido não codificado naturalmente é opcionalmente adicionado a um meio de cultura para, pelo menos, o primeiro ou segundo organismo.

Num aspeto, a seleção (incluindo, mas não se limitando a, seleção negativa) ou triagem da biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-ARNt-sintetase (passo (b)) inclui: a introdução de um gene marcador tóxico, em que o gene marcador tóxico compreende pelo menos um dos codões seletores (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático ou um gene essencial ao organismo em que esse gene marcador compreende pelo menos um codão seletor) e a biblioteca de ARNts (opcionalmente mutantes) numa multiplicidade de células do segundo organismo; e a seleção de células sobreviventes, em que as células sobreviventes contêm o acervo de ARNts (opcionalmente mutantes) que compreende pelo menos um ARNt ortogonal ou ARNt não funcional. Por exemplo, as células sobreviventes podem ser selecionadas utilizando um ensaio de comparação da razão de densidade celular.

Noutro aspeto, o gene marcador tóxico pode incluir dois ou mais codões seletores. Noutra forma de realização dos métodos, o gene marcador tóxico é um gene de ribonuclease barnase, em que o gene de ribonuclease barnase compreende pelo menos um codão âmbar. Opcionalmente, o gene de ribonuclease barnase pode incluir dois ou mais codões âmbar.

Numa forma de realização, a seleção ou triagem do acervo de ARNts (opcionalmente mutantes) para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida pode incluir: a introdução de um gene marcador de seleção ou triagem positiva, em que o gene marcador positivo compreende um gene de resistência a fármaco (incluindo, mas não se limitando a, gene de β-lactamase, que compreende pelo menos um dos codões seletores, tais como pelo menos um codão de terminação âmbar) ou um gene essencial ao organismo, ou um gene que leva à desintoxicação de um agente tóxico, juntamente com a O-RS, e do acervo de ARNts (opcionalmente mutantes) numa multiplicidade de células do segundo organismo; e a identificação de células sobreviventes ou tríadas cultivadas na presença de um agente de seleção ou triagem, que inclui, mas não se limita a, um antibiótico, proporcionando, desse modo, um acervo de células que tem o pelo menos um ARNt recombinante, em que o pelo menos um ARNt recombinante é aminoacilado pela O-RS e insere um aminoácido num produto de tradução codificado pelo gene marcador positivo, em resposta ao pelo menos um codão seletor. Noutra forma de realização, a concentração do agente de seleção e/ou triagem é modificada. São proporcionados métodos para gerar pares 0-ARNt/O-RS específicos. Os métodos incluem: (a) a geração de uma biblioteca de ARNts mutantes derivados de pelo menos um ARNt de um primeiro organismo; (b) a seleção ou triagem negativa da biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por uma aminoacil-ARNt-sintetase (RS) de um segundo organismo na ausência de uma RS do primeiro organismo, proporcionando, desse modo, um acervo de ARNts (opcionalmente mutantes); (c) a seleção ou triagem do acervo de ARNts (opcionalmente mutantes) para membros que são aminoacilados por uma RS ortogonal (O-RS) introduzida, proporcionando, desse modo, pelo menos um 0-ARNt recombinante. 0 pelo menos um 0-ARNt recombinante reconhece um codão seletor e não é reconhecido eficazmente pela RS do segundo organismo e é preferencialmente aminoacilado pela O-RS. 0 método inclui também (d) a geração de uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de pelo menos uma aminoacil-ARNt-sintetase (RS) de um terceiro organismo; (e) a seleção ou triagem da biblioteca de RSs mutantes para membros que aminoacilam preferencialmente o pelo menos um O-ARNt recombinante na presença de um aminoácido não codificado naturalmente e um aminoácido natural, proporcionando, desse modo, um acervo de RSs (opcionalmente mutantes) ativas; e (f) a seleção ou triagem negativa do acervo para RSs (opcionalmente mutantes) ativas que aminoacilam preferencialmente o pelo menos um O-ARNt recombinante na ausência do aminoácido não codificado naturalmente, proporcionando, desse modo, o pelo menos um par O-ARNt/O-RS especifico, em que o pelo menos um par 0-ARNt/O-RS especifico compreende pelo menos uma 0-RS recombinante que é especifica para o aminoácido não codificado naturalmente e o pelo menos um O-ARNt recombinante. São incluídos os pares O-ARNt/O-RS específicos produzidos pelos métodos. Por exemplo, o par 0-ARNt/O-RS específico pode incluir, incluindo, mas não se limitando a, um par muARNtTyr-mutTyrRS, tal como um par muARNtTyr-SS12TyrRS, um par muARNtLeu-mutLeuRS, um par muARNtThr-mutThrRS, um par muARNtGlu-mutGluRS ou semelhantes. Além disso, tais métodos incluem aqueles em que o primeiro e o terceiro organismo são o mesmo (incluindo, mas não se limitando a, Methanococcus jannaschii).

Os métodos para selecionar um par ARNt-ARNt-sintetase ortogonal para utilização num sistema de tradução in vivo de um segundo organismo são também incluídos na presente invenção. Os métodos incluem: a introdução de um gene marcador, um ARNt e uma aminoacil-ARNt-sintetase (RS) isolados ou derivados de um primeiro organismo num primeiro conjunto de células do segundo organismo; a introdução do gene marcador e do ARNt num conjunto de células duplicado de um segundo organismo; e a seleção para células sobreviventes no primeiro conjunto que não conseguem sobreviver no conjunto de células duplicado ou a pesquisa de células que exibem um resposta de triagem específica que não têm sucesso em dar essa resposta no conjunto de células duplicado, em que o primeiro conjunto e o conjunto de células duplicado são cultivados na presença de um agente de seleção ou triagem, em que as células sobreviventes ou tríadas compreendem o par ARNt-ARNt-sintetase ortogonal para utilização no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Numa forma de realização, a comparação e a seleção ou triagem incluem um ensaio de complementação in vivo. A concentração do agente de seleção ou triagem pode ser modificada.

Os organismos da presente invenção compreendem uma variedade de organismos e uma variedade de combinações. Por exemplo, o primeiro e o segundo organismos dos métodos da presente invenção podem ser iguais ou diferentes. Numa forma de realização, os organismos são opcionalmente um organismo procariótico, incluindo, mas não se limitando a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhantes. Alternativamente, os organismos compreendem opcionalmente um organismo eucariótico, incluindo, mas não se limitando a, plantas (incluindo, mas não se limitando a, plantas complexas tais como monocotiledóneas ou dicotiledóneas), algas, protistas, fungos (incluindo, mas não se limitando a, levedura, etc), animais (incluindo, mas não se limitando a, mamíferos, insetos, artrópodes, etc.) ou semelhantes. Noutra forma de realização, o segundo organismo é um organismo procariótico, incluindo, mas não se limitando a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus ou semelhantes. Alternativamente, o segundo organismo pode ser um organismo eucariótico, incluindo, mas não se limitando a, uma levedura, uma célula animal, uma célula vegetal, um fungo, uma célula de mamífero ou semelhantes. Em várias formas de realização, o primeiro e segundo organismos são diferentes.

VI. Localização de aminoácidos não naturais nos polipéptidos de bG-CSF A presente invenção considera a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais nos polipéptidos de bG-CSF. Um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados numa posição particular que não interrompa a atividade do polipéptido. Isto pode ser conseguido efetuando substituições "conservadoras" que incluem, mas não se limitam à substituição de aminoácidos hidrófobos por aminoácidos hidrófobos, aminoácidos volumosos por aminoácidos aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrófilos por aminoácidos hidrófilos e/ou à inserção do aminoácido não natural numa localização que não é necessária para a atividade.

Pode utilizar-se uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais para selecionar os sítios desejados para substituição com um aminoácido não codificado naturalmente dentro do polipéptido de bG-CSF. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que qualquer posição da cadeia polipeptídica é adequada para seleção para incorporar um aminoácido não codificado naturalmente e a seleção pode ser com base em conceção racional ou por seleção aleatória para qualquer uma ou nenhuma finalidade particular desejada. A seleção de sítios desejados pode ser para produzir um molécula de bG-CSF que tem qualquer propriedade ou atividade desejada, incluindo, mas não se limitando a, agonistas, superagonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores da ligação ao recetor, moduladores da atividade do recetor, formação de dímeros ou multímeros, nenhuma alteração à atividade ou propriedade em comparação com a molécula nativa ou manipulação de qualquer propriedade física ou química do polipéptido tal como solubilidade, agregação ou estabilidade. Por exemplo, as localizações do polipéptido necessárias para a atividade biológica dos polipéptidos de bG-CSF podem ser identificadas utilizando métodos de análise de mutação pontual, varrimento de alanina, mutagénese de saturação e pesquisa de atividade biológica ou varrimento de homólogos conhecidos na técnica. Podem ser utilizados outros métodos para identificar residuos para modificação dos polipéptidos de bG-CSF que incluem, mas não se limitam a, caracterização do perfil de sequências, seleções de bibliotecas de rotâmeros, potenciais de pares de residuos e conceção racional utilizando a tecnologia Protein Design Automation®. (Ver Pat. U.S. N.° 6, 188, 965; 6, 269, 312; 6,403,312; WO98/47089). Os residuos que são críticos para a bioatividade do bG-CSF, os resíduos que estão envolvidos na estabilidade farmacêutica, epítopos de anticorpos ou resíduos de ligação ao recetor podem ser mutados. As Patentes U.S. N.° 5,580,723; 5,834,250; 6,013,478; 6,428,954; e 6,451,561 descrevem métodos para a análise sistemática da estrutura e função de polipéptidos tais como bG-CSF, identificando domínios ativos que influenciam a atividade do polipéptido com uma substância alvo. Estudos de mutagénese de varrimento de alanina do G-CSF são descritos em Reidhaar-Olson JF et al., Biochemistry (1996) Jul 16,-35(28):9034-41, Young DC et al. Protein Sei. (1997) Jun; 6 (6) : 1228-36, e Layton et al. (1997) JBC 272(47):29735-29741. Os resíduos diferentes daqueles identificados como críticos para a atividade biológica por mutagénese de varrimento de alanina ou homólogo podem ser bons candidatos para substituição por um aminoácido não codificado naturalmente, dependendo da atividade desejada procurada para o polipéptido. Alternativamente, os sítios identificados como críticos para a atividade biológica podem ser também bons candidatos para substituição por um aminoácido não codificado naturalmente, dependendo novamente da atividade desejada procurada para o polipéptido. Outra alternativa seria simplesmente preparar substituições sucessivas em cada posição da cadeia polipeptidica por um aminoácido não codificado naturalmente e observar o efeito sobre as atividades do polipéptido. É imediatamente evidente para os especialistas com conhecimentos médios na matéria que qualquer meio, técnica ou método para selecionar uma posição para substituição por um aminoácido não natural em qualquer polipéptido é adequada para utilização na presente invenção. A estrutura e a atividade de mutantes dos polipéptidos de bG-CSF que contêm supressões podem ser também examinadas para determinar reqiões da proteína que tenham probabilidade de serem tolerantes à substituição por um aminoácido não codificado naturalmente. De uma maneira semelhante, a diqestão por proteases e os anticorpos monoclonais podem ser utilizados para identificar reqiões de bG-CSF que são responsáveis pela ligação ao seu recetor. Layton et al. (2001) JBC 276 (39) 36779-36787 descrevem estudos de anticorpos com hG-CSF e o seu recetor. Assim que forem eliminados os resíduos que têm probabilidade de serem intolerantes à substituição por aminoácidos não codificados naturalmente, pode ser examinado o impacto das substituições propostas em cada uma das restantes posições. Podem ser gerados modelos a partir das estruturas cristalinas tridimensionais de outros membros da família de CSF e dos recetores de CSF. A Protein Data Bank (PDB, disponível na Rede Mundial de Computadores em rcsb.org) é uma base de dados centralizada que contém dados estruturais tridimensionais de grandes moléculas de proteínas e ácidos nucleicos. Os modelos podem ser preparados investigando a estrutura secundária e terciária dos polipéptidos, caso não se encontrem disponíveis os dados estruturais tridimensionais. As estruturas cristalográficas de raios X e RMN do hG-CSF estão disponíveis no Protein Data Bank com ID do PDB: 1CD9, 1PGR, 1RHG, 1GNC, assim como na Patente U.S. N.° 5,581,476; e 5,790,421. Assim, os especialistas com conhecimentos médios na matéria podem identificar rapidamente posições de aminoácidos que podem ser substituídas por aminoácidos não codificados naturalmente.

Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF da invenção compreendem um ou mais aminoácidos não naturais posicionados numa região da proteína que não perturba a estrutura do polipéptido.

Os resíduos ilustrativos para a incorporação de um aminoácido não codificado naturalmente podem ser aqueles que são excluídos de potenciais regiões de ligação ao recetor, podem estar total ou parcialmente expostos ao solvente, têm interações mínimas ou nenhuma interação por ligação de hidrogénio com resíduos próximos, podem estar minimamente expostos a resíduos reativos próximos, podem estar em uma ou mais das faces expostas, podem ser um sítio ou sítios que estão justapostos a um segundo bG-CSF, ou outra molécula ou fragmento do mesmo, podem estar em regiões que são altamente flexíveis, ou estruturalmente rígidas, como previsto pela estrutura tridimensional, secundária, terciária ou quaternário do bG-CSF, ligados ou não ligados ao seu recetor, ou acoplados ou não acoplados a outra molécula biologicamente ativa, ou podem modular a conformação do próprio bG-CSF ou de um dímero ou multímero que compreende um ou mais bG-CSF, alterando a flexibilidade ou rigidez da estrutura total conforme desejado.

Um especialista com conhecimentos médios na matéria reconhece que uma tal análise do bG-CSF permite determinar que resíduos de aminoácidos estão expostos na superfície em comparação com os resíduos de aminoácidos que estão enterrados dentro da estrutura terciária da proteína. Por conseguinte, é uma forma de realização da presente invenção a substituição de um aminoácido, que é um resíduo exposto na superfície, por um aminoácido não codificado naturalmente.

Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições no bG-CSF: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF).

Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação das mesmas de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação das mesmas de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 62, 133, e uma combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, urn ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados na posição 62 de bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados na posição 133 de bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o polipéptido da invenção compreende uma ou mais substituições, adições ou supressões de aminoácidos naturais. Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados numa sequência líder ou sinal que está N- ou C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF. Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 2) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc. Nalgumas formas de realização, o aminoácido incorporado na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2, é um aminoácido diferente de histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteina, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc.

Nalgumas divulgações, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados por ribossomas em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteina, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados por ribossomas em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 2) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteina, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc. Nalgumas formas de realização, o aminoácido incorporado por ribossomas na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou a posição correspondente na SEQ ID NO: 2, é um aminoácido diferente de histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteina, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogénicos naturais tais como β-alanina, ornitina, etc. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) em que o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente tem ou têm um grupo ou grupos funcionais não reconhecidos por uma RS endógena. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 2) em que o um ou mais aminoácidos ou ácidos não codificados naturalmente tem ou têm um grupo ou grupos funcionais não reconhecidos por uma RS endógena. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção tem um aminoácido incorporado na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido tem um grupo ou grupos funcionais não reconhecidos por uma RS endógena. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção tem uma para-acetilfenilalanina incorporada na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2. Nalgumas formas de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção tem uma para- aminofenilalanina incorporada na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2.

Nalgumas divulgações, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, nas posições: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N- terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF).

Nalgumas divulgações, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, nas posições: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalqumas divulgações, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, nas posições: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas divulgações, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, nas posições: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas divulgações, o aminoácido não codificado naturalmente em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, 62, 133, e uma combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas divulgações, o aminoácido não codificado naturalmente na posição 62 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente na posição 133 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural na sequência sinal ou líder N- ou C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF está ligado a um polímero solúvel em água.

Um exame da estrutura cristalina do bG-CSF ou de membro(s) da família de bG-CSF e da sua interação com o recetor de G-CSF pode indicar que resíduos de aminoácidos têm cadeias laterais que estão total ou parcialmente acessíveis ao solvente. A cadeia lateral de um aminoácido não codificado naturalmente nestas posições pode apontar afastando-se da superfície da proteína e para o interior do solvente.

Uma determinada posição num polipéptido de bG-CSF pode ser substituída por, ou incorporar, uma grande variedade de aminoácidos não codificados naturalmente. Em geral, um aminoácido não codificado naturalmente particular é selecionado para incorporação com base num exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipéptido de bG-CSF ou outro membro da família de G-CSF com o seu recetor, numa preferência para substituições conservadoras (i.e., substituição de Phe, Tyr ou Trp por aminoácidos não codificados naturalmente baseados em arilo, tais como p-acetilfenilalanina ou O-propargiltirosina) e na conjugação química específica que se deseja introduzir no polipéptido de bG-CSF (e.g., a introdução de 4-azidofenilalanina se se pretende efetuar uma cicloadição [3+2] de Huisgen com um polímero solúvel em água portador de uma unidade alcino ou a formação de uma ligação amida com um polímero solúvel em água que é portador de um éster de arilo que, por sua vez, incorpora uma unidade fosfina).

Numa forma de realização, o método inclui ainda a incorporação do aminoácido não natural na proteína, em que o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reativo; e a colocação em contacto da proteína com uma molécula (incluindo, mas não se limitando a, hidroxialquilamido (HAS), hidroxietilamido (HES), uma etiqueta, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotorreticulante, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma etiqueta de afinidade, uma etiqueta de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metais, um cofator, um ácido gordo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um ADN, um ARN, um polinucleótido antissentido, um sacárido, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícuia, uma etiqueta de spin, um fluoróforo, uma unidade que contém metal, uma unidade radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, uma unidade fotoativável, uma unidade excitável por radiação actínica, uma unidade fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma unidade que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente dissociável, um grupo fotodissociável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente ativo redox, um aminotioácido, uma unidade tóxica, uma unidade marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso em eletrões, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, uma etiqueta detetável, uma molécula pequena, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleótido, um radiotransmissor, um agente de captura de neutrões, ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável) que compreende um segundo grupo reativo. 0 primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para ligar a molécula ao aminoácido não natural através de uma cicloadição [3+2]. Numa forma de realização, o primeiro grupo reativo é uma unidade alcinilo ou azido e o segundo grupo reativo é uma unidade azido ou alcinilo. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é a unidade alcinilo (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina) e o segundo grupo reativo é a unidade azido. Noutro exemplo, o primeiro grupo reativo é a unidade azido (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a unidade alcinilo.

Nalguns casos, a(s) substituição/substituições por aminoácidos não codificados naturalmente será/serão combinada(s) com outras adições, substituições ou supressões no polipéptido de bG-CSF para afetar outras características biológicas do polipéptido de bG-CSF. Nalguns casos, as outras adições, substituições ou supressões podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas não se limitando a, a resistência à degradação proteolítica) do polipéptido de bG-CSF ou aumentar a afinidade do polipéptido de bG-CSF para o seu recetor. Nalguns casos, as outras adições, substituições ou supressões podem aumentar a estabilidade farmacêutica do polipéptido de bG-CSF. Nalguns casos, as outras adições, substituições ou supressões podem aumentar a atividade biológica do polipéptido de bG-CSF. Nalguns casos, as outras adições, substituições ou supressões podem aumentar a solubilidade (incluindo, mas não se limitando a, quando expressado em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipéptido de bG-CSF. Nalgumas formas de realização, as adições, substituições ou supressões podem aumentar a solubilidade do polipéptido de bG-CSF após expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Nalgumas formas de realização, são selecionados sítios para substituição por um aminoácido codificado naturalmente ou não natural, além de outro sitio para a incorporação de um aminoácido não natural que resulte num aumento da solubilidade do polipéptido após expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF compreendem uma outra adição, substituição ou supressão que modula a afinidade para um recetor, proteínas de ligação ou ligando associado, modula a transdução de sinal após ligação a um recetor, modula a semivida circulante, modula a libertação ou biodisponibilidade, facilita a purificação, ou melhora ou altera uma via de administração particular. Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF compreendem uma adição, substituição ou supressão que aumenta a afinidade da variante de bG-CSF para o seu recetor. De forma semelhante, os polipéptidos de bG-CSF podem compreender sequências de dissociação química ou por enzimas, sequências de dissociação de proteases, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base na afinidade (incluindo, mas não se limitando a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não se limitando a, biotina) que melhoram a deteção (incluindo, mas não se limitando a, GFP), purificação, transporte através de tecidos ou membranas celulares, libertação ou ativação de pró-fármacos, redução do tamanho de bG-CSF ou outras características do polipéptido.

Nalgumas formas de realização, a substituição de um aminoácido não codificado naturalmente gera um antagonista de bG-CSF. Nalgumas formas de realização, um aminoácido não codificado naturalmente é substituído ou adicionado numa região envolvida na ligação ao recetor. Nalgumas formas de realização, os antagonistas de bG-CSF compreendem pelo menos uma substituição que faz com que o bG-CSF atue como um antagonista. Nalgumas formas de realização, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente numa região de ligação ao recetor da molécula de bG-CSF.

Nalgumas formas de realização, a substituição de um aminoácido não codificado naturalmente gera um antagonista de bG-CSF. Nalgumas formas de realização, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente numa região de ligação ao recetor da molécula de bG-CSF.

Nalguns casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos são substituídos por um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. Nalguns casos, o polipéptido de bG-CSF inclui ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de um ou mais aminoácidos naturais por aminoácidos não codificados naturalmente. Por exemplo, nalgumas formas de realização, um ou mais resíduos no bG-CSF estão substituídos por um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. Nalguns casos, o um ou mais resíduos não codificados naturalmente estão ligados a um ou mais PEGs lineares ou ramificados de peso molecular mais baixo, aumentando, desse modo, a afinidade de ligação e semivida no soro comparável relativamente à espécie ligada a um único PEG de peso molecular mais alto.

Nalgumas formas de realização, até dois dos seguintes resíduos de bG-CSF estão substituídos por um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente. VII. Expressão em Não eucariotas e Eucariotas

Para se obter um nível de expressão alto de um polinucleótido de bG-CSF clonado, faz-se tipicamente a subclonagem de polinucleótidos que codificam um polipéptido de bG-CSF da invenção num vetor de expressão que contém um promotor forte para dirigir a transcrição, uma sequência de terminação da transcrição/tradução e, para um ácido nucleico que codifica uma proteína, um sítio de ligação de ribossoma para iniciação da tradução. Os promotores bacterianos adequados são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e descritos, e.g., em Sambrook et al. e Ausubel et al.

Os sistemas de expressão bacterianos para expressar polipéptidos de bG-CSF da invenção estão disponíveis em, incluindo, mas não se limitando a, E. coli, Bacillus sp.r Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e Salmonella (Paiva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Os kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Os sistemas eucarióticos de expressão para células de mamífero, levedura e células de insetos são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e estão também comercialmente disponíveis. Nos casos em que são utilizados ARNts ortogonais e aminoacil-ARNt-sintetases (descritos acima) para expressar os polipéptidos de bG-CSF da invenção, as células hospedeiras para expressão são selecionadas com base na sua capacidade para utilizar os componentes ortogonais. As células hospedeiras ilustrativas incluem bactérias Gram-positivas (incluindo, mas não se limitando a B. brevis, B. subtilis ou Streptomyces) e bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), assim como levedura e outras células eucarióticas. As células que compreendem pares O-ARNt/O-RS podem ser utilizadas como aqui descrito.

Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção proporciona a capacidade para sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Num aspeto, a composição inclui opcionalmente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos um grama ou mais da proteína que compreende um aminoácido não natural, ou uma quantidade que pode ser conseguida com métodos de produção de proteínas in vivo (são aqui proporcionados pormenores sobre a produção e purificação de proteínas recombinantes). Noutro aspeto, a proteína está opcionalmente presente na composição a uma concentração de, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro, ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, incluindo, mas não se limitando a, um lisado celular, um tampão, um tampão farmacêutico, ou outra suspensão líquida (incluindo, mas não se limitando a, num volume de, incluindo, mas não se limitando a, qualquer um desde cerca de 1 nL a cerca de 100 L ou mais). A produção de grandes quantidades (incluindo, mas não se limitando a, maiores do que aquelas tipicamente possíveis com outros métodos, incluindo, mas não se limitando a, tradução in vitro) de uma proteína numa célula eucariótica que inclui pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção.

Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção proporciona a capacidade para biossintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, as proteínas que compreendem um aminoácido não natural podem ser produzidas a uma concentração de, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 yg/litro, pelo menos 50 yg/litro, pelo menos 75 yg/litro, pelo menos 100 yg/litro, pelo menos 200 yg/litro, pelo menos 250 yg/litro, ou pelo menos 500 yg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mg/litro, pelo menos 6 mg/litro, pelo menos 7 mg/litro, pelo menos 8 mg/litro, pelo menos 9 mg/litro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteína num extrato de células, lisado celular, meio de cultura, um tampão e/ou semelhantes.

Um número de vetores adequados para expressão de bG-CSF está comercialmente disponível. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, incluem mas não estão limitados a, vetores que compreendem sequências de controlo da expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovirus e citomegalovírus. Tais vetores incluem pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Calif., EUA) e pCI-neo (Stratagene, La Jolla, Calif., EUA). Podem ser utilizados plasmídeos bacterianos, tais como plasmídeos de E. coli, incluindo pBR322, pET3a e pETl2a, plasmídeos para uma gama de hospedeiros mais lata, tais como RP4, ADNs de fagos, e.g., os numerosos derivados de fago lambda, e.g., NM989, e outros fagos de ADN, tais como M13 e fagos filamentosos de ADN de cadeia simples. O plasmídeo 2μ e seus derivados, o vetor POTl (Pat. U.S. N.° 4,931,373), o vetor pJS037 descrito em (Okkels, Ann. New York Aced. Sei. 782, 202 207, 1996) e pPICZ A, B ou C (Invitrogen) podem ser utilizados com células hospedeiras de levedura. Para células de insetos, os vetores incluem, mas não se limitam a, pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685 98 (1986), pBluebac 4.5 e pMelbac (Invitrogen,

Carlsbad, CA). A sequência de nucleótidos que codifica urn polipéptido de bG-CSF pode, ou não, incluir também a sequência que codifica um péptido sinal. 0 péptido sinal está presente quando o polipéptido é para ser segregado a partir das células em que é expresso. Tal péptido sinal pode ser qualquer sequência. 0 péptido sinal pode ser procariótico ou eucariótico. Coloma, M (1992) J. Imm.

Methods 152:89 104) descrevem um péptido sinal para utilização em células de mamífero (péptido sinal da cadeia leve kappa de Ig muridea). Outros péptidos sinal incluem, mas não se limitam a, o péptido sinal do fator α de S. cerevisiae (Patente U.S. N.° 4,870,008), o péptido sinal da amilase salivar de murganho (0. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646), um péptido sinal de

carboxipeptidase modificado (L. A. Vails et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), o péptido sinal BARl de levedura (WO 87/02670) e o péptido sinal da protease aspártica 3 (YAP3) de levedura (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137).

Os exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Tais células hospedeiras podem ser células de ovário de hamster Chinês (CHO), (e.g. CHO-Kl; ATCC CCL-61), células de Macaco Verde (COS) (e.g. COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de murganho (e.g. NS/O) , linhas de células de Rim de Cria de Hamster (BHK) (e.g. ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10), e células humanas (e.g. HEK 293 (ATCC CRL-1573)), assim como células vegetais em cultura de tecidos. Estas linhas de células e outras encontram-se disponíveis a partir de depositários públicos tais como o American Type Culture Collection, Rockville, Md. A fim de proporcionar uma glicosilação melhorada do polipéptido de bG-CSF, uma célula hospedeira de mamífero pode ser modificada para expressar a sialiltransferase, e.g. 1,6-sialiltransferase, e.g. como descrito na Pat. U.S. N.° 5,047,335.

Os métodos para a introdução de ADN exógeno em células hospedeiras de mamífero incluem, mas não se limitam a, transfeção mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, transfeção mediada por DEAE-dextrano, transfeção mediada por lipossomas, vetores virais e os métodos de transfeção descritos por Life Technologies Ltd, Paisley, UK que utilizam Lipofectamin 2000 e Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, EUA que utiliza FuGENE 6. Estes métodos são bem conhecidos na técnica e são descritos por Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, EUA. A cultura de células de mamífero pode ser realizada de acordo com métodos estabelecidos, e.g. como divulgado em (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., EUA e

Harrison Massa, e Rae IF, Geral Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997). I. Sistemas de Expressão, Cultura e Isolamento

Os polipéptidos de bG-CSF podem ser expressos em qualquer número de sistemas de expressão adequados que incluem, por exemplo, levedura, células de insetos, células de mamífero e bactérias. A seguir é proporcionada uma descrição de sistemas de expressão ilustrativos.

Levedura Como aqui utilizado, o termo "levedura" inclui qualquer uma das várias leveduras capazes de expressar um gene que codifica um polipéptido de bG-CSF. Tais leveduras incluem, mas não se limitam a, leveduras ascosporógenas (Endomycetales), leveduras basidiosporógenas e leveduras pertencentes ao grupo dos Fungos imperfeitos (Blastomycetes). As leveduras ascosporógenas são divididas em duas famílias, Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae. A última é constituída por quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (e.g., género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (e.g., géneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces) . As leveduras basidiosporógenas incluem os géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. As leveduras pertencentes ao grupo dos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes) estão divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (e.g., géneros Sporobolomyces e Bullera) e Cryptococcaceae (e.g., género Candida).

De particular interesse para utilização com a presente invenção são as espécies dentro dos géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis e Candida, incluindo, mas não se limitando a, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyverí, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa e H. polymorpha. A seleção de leveduras adequadas para a expressão de polipéptidos de bG-CSF encontra-se dentro da perícia de um especialista com conhecimentos médios na matéria. Ao selecionar hospedeiros de levedura para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que se demonstrou que têm, por exemplo, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica, boa capacidade de secreção, boa produção de proteína solúvel e robustez global. As leveduras estão geralmente disponíveis de uma variedade de fontes incluindo, mas não se limitando a, o Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA), e o American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). 0 termo "hospedeiro de levedura" ou "célula hospedeira de levedura" inclui levedura que pode ser, ou foi, utilizada como um recetor para vetores recombinantes ou outro ADN de transferência. 0 termo inclui a descendência da célula hospedeira de levedura original que recebeu os vetores recombinantes ou outro ADN de transferência. Entende-se que a descendência de uma única célula parental não tem de ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total ao parente original, devido a mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que é suficientemente semelhante ao parente que é caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de bG-CSF, inclui-se na descendência pretendida por esta definição.

Os vetores de expressão e transformação, incluindo replicões extracromossómicos ou vetores de integração foram desenvolvidos para transformação em muitos hospedeiros de levedura. Por exemplo, foram desenvolvidos vetores de expressão para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pastoris (Patentes U.S. N.° 5,324,639; 4, 929,555; e 4,837,148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300:706); e Y. lipolytica; A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al. , GENE (1983) 26:205-221; e

Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470- 74); A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234) ; e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357).

As sequências de controlo para vetores de levedura são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e incluem, mas não se limitam a, regiões promotoras de genes tais como álcool-desidrogenase (ADH) (EP 0 284 044); enolase; glucocinase; glicose-6-fosfato-isomerase; gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase (GAP ou GAPDH); hexocinase; fosfofructocinase; 3-fosfoglicerato-mutase; e piruvato cinase (PyK) (EP 0 329 203) . O gene PH05 de levedura, que codifica a fosfatase ácida também pode proporcionar sequências promotoras úteis (Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Outras sequências promotoras adequadas para utilização com os hospedeiros de levedura podem incluir os promotores para 3-fosfoglicerato-cinase (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073); e outras enzimas glicoliticas, tais como piruvato- descarboxilase, triosefosfato-isomerase e fosfoglicose- isomerase (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900;

Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149). Os promotores de levedura induzíveis que têm a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2; isocitocromo C; fosfatase ácida; metalotioneína; gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase; enzimas degradativas associadas ao metabolismo de azoto; e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores adequados para utilização na expressão em levedura são adicionalmente descritos em EP 0 073 657.

Os potenciadores de levedura podem ser também utilizados com os promotores de levedura. Além disso, os promotores sintéticos podem funcionar também como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências de ativação a montante (UAS) de um promotor de levedura podem ser unidas com a região de ativação da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Os exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora de ADH ligada à região de ativação da transcrição GAP. Ver Patentes U.S. N.° 4,880,734 e 4,876,197. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem nas sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PH05, combinadas com a região de ativação da transcrição de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK. Ver EP 0 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores naturais de origem distinta da levedura que têm a capacidade para ligar ARN-polimerase de levedura e iniciar a transcrição.

Outros elementos de controlo que podem constituir parte dos vetores de expressão de levedura incluem sequências de terminação, por exemplo, dos genes de GAPDH ou enolase (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Além disso, a origem de replicação da origem do plasmideo 2μ é adequada para levedura. Um gene de seleção adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmideo de levedura. Ver Tschumper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141. O gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma estirpe mutante de levedura que carece da capacidade para crescer em triptofano. De forma semelhante, as estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20 622 ou 38 626) são complementadas por plasmideos conhecidos que têm o gene Leu2.

Os métodos de introdução de ADN exógeno em hospedeiros de levedura são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e incluem tipicamente, mas não se limitam a, a transformação de esferoplastos ou de células hospedeiras de levedura intactas tratadas com catiões de alcalis. Por exemplo, a transformação de levedura pode ser realizada de acordo com o método descrito em Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 e Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. No entanto, outros métodos de introdução de ADN em células, tais como por injeção nuclear, eletroporação ou fusão de protoplasto podem ser também utilizados como descrito geralmente em SAMBROOK ET AL. , MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). As células hospedeiras de levedura podem ser em seguida cultivadas utilizando técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria.

Outros métodos para expressar proteínas heterólogas em células hospedeiras de levedura são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Ver, em geral, Publicação de Patente U.S. N.° 20020055169, Patentes U.S. N.° 6,361,969; 6,312,923; 6, 183, 985; 6, 083,723; 6,017,731; 5, 674,706; 5, 629, 203;

5,602,034; e 5,089,398; U.S. Patentes Reexaminadas N.° RE37,343 e RE35,749; Pedidos de Patente PCT Publicados WO 99/07862; WO 98/37208; e WO 98/26080; Pedidos de Patente Europeia EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO

90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; e EP 0 164 55 6. Ver também Gellissen et al., ANTONIE VAN

LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2) :79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8(6):423-488,- Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7.

As estirpes hospedeiras de levedura podem ser cultivadas em fermentadores durante a etapa de amplificação utilizando métodos de fermentação descontínuos alimentados padrão conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Os métodos de fermentação podem ser adaptados para ter em conta diferenças numa via de utilização de carbono ou modo de controlo da expressão do hospedeiro de levedura particular. Por exemplo, a fermentação de um hospedeiro de levedura Saccharomyces pode exigir uma única alimentação de glicose, uma fonte de azoto complexa (e.g., hidrolisados de caseína) e suplementação com múltiplas vitaminas. Pelo contrário, a levedura metilotrófica P. pastoris pode exigir glicerol, metanol e alimentações de oligoelementos, mas apenas sais de amónio (azoto) simple para crescimento e expressão ótimos. Ver, e.g., Patente U.S. N.° 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; e Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113.

No entanto, esses métodos de fermentação podem ter certas características comuns independentes da estirpe hospedeira de levedura utilizada. Por exemplo, pode ser adicionado um nutriente limitante do crescimento, tipicamente carbono, ao fermentador durante a fase de amplificação para permitir crescimento máximo. Além disso, os métodos de fermentação utilizam geralmente um meio de fermentação concebido para conter quantidades adequadas de carbono, azoto, sais basais, fósforo e outros nutrientes menores (vitaminas, oligoelementos e sais, etc.). Os exemplos de meios de fermentação adequados para utilização com Pichia são descritos nas Patentes U.S. N.° 5,324,639 e 5,231,178. Células de Insetos Infetadas por Baculovírus O termo "hospedeiro de inseto" ou "célula hospedeira de inseto" refere-se a um inseto que pode ser, ou foi, utilizado como um recetor para vetores recombinantes ou outro ADN de transferência. 0 termo inclui a descendência da célula hospedeira de inseto original que foi transfetada. Entende-se que a descendência de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total ao parente original, devido a mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que é suficientemente semelhante ao parente que é caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de bG-CSF, incluiu-se na descendência pretendida por esta definição.

[0362] A seleção de células de insetos adequadas para a expressão de polipéptidos de bG-CSF é conhecida pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Várias espécies de insetos são bem descritas na técnica e estão comercialmente disponíveis incluindo Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Ao selecionar hospedeiros de insetos para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que se demonstrou que têm, inter alia, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e robustez global. Os insetos estão geralmente disponíveis de uma variedade de fontes incluindo, mas não se limitando a, o Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); e o American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA).

Em geral, os componentes de um sistema de expressão de inseto infetado por baculovirus incluem um vetor de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém tanto um fragmento do genoma de baculovirus como um sítio de restrição conveniente para inserção do gene heterólogo a ser expresso; um baculovirus de tipo selvagem com sequências homólogas ao fragmento específico para o baculovirus no vetor de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovirus); e células hospedeiras de inseto apropriadas e meios de cultura. Os materiais, métodos e técnicas utilizados na construção de vetores, transfeção de células, seleção em placas, crescimento de células em cultura, e semelhantes são conhecidos na técnica e estão disponíveis manuais que descrevem estas técnicas.

Após inserção do gene heterólogo no vetor de transferência, o vetor e o genoma virai de tipo selvagem são transfetados numa célula hospedeira de inseto onde o vetor e o genoma virai recombinam. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para sistemas de expressão de células de inseto/baculovírus estão comercialmente disponíveis na forma de kit a partir de, por exemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas são geralmente conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e totalmente descritas em SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION

BULLETIN N.° 1555 (1987. Ver também, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL. , CURRENT PROTOCOLOS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING E POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); e O'REILLY ET AL. , BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).

Na realidade, a produção de várias proteínas heterólogas utilizando sistemas de expressão de células de inseto/baculovírus é conhecido pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Ver, e.g., Patentes U.S. N.° 6, 368,825; 6, 342,216; 6, 338,846; 6,261,805; 6, 245, 528, 6, 225, 060; 6, 183, 987; 6, 168, 932; 6, 126, 944; 6, 096, 304; 6, 013,433; 5, 965, 393; 5, 939,285; 5, 891, 676; 5, 871, 986; 5,861,279; 5,858,368; 5,843,733; 5,762,939; 5,753,220;

5, 605, 827; 5, 583, 023; 5, 571,709; 5, 516, 657; 5,290, 686; WO

02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO

00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO

99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO

96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO

93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO

90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082.

Na técnica são conhecidos vetores que são úteis em sistemas de expressão de células de inseto/baculovírus e incluem, por exemplo, vetores de expressão e de transferência para insetos derivados do baculovírus vírus da poliedrose nuclear Autographacalifornica (AcNPV), o qual é um vetor de expressão virai independente de auxiliar. Os vetores de expressão virais derivados deste sistema utilizam geralmente o promotor forte do gene de poliedrina virai para dirigir a expressão de genes heterólogos. Ver, em geral, O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).

Antes de inserir o gene estranho no genoma de baculovirus, os componentes descritos acima, que compreendem um promotor, lider (caso se pretenda), sequência codificante de interesse e sequência de terminação da transcrição, são tipicamente montados numa construção de translocalização intermediária (vetor de transferência). As construções de translocalização intermediárias são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extracromossómico (e.g., plasmídeos) capaz de manutenção estável num hospedeiro, tal como bactérias. 0 replicão terá um sistema de replicação, permitindo assim que seja mantido num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação. Mais especificamente, o plasmideo pode conter o sinal de poliadenilação da poliedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) e urn gene de resistência a ampicilina procariótico (amp) e origem de replicação para seleção e propagação em E. coli.

Um vetor de transferência comummente utilizado para introduzir genes estranhos em AcNPV é o pAc373. Foram também concebidos muitos outros vetores, conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo, por exemplo, pVL985, que altera o codão de iniciação da poliedrina de ATG para ATT, e que introduz um sítio de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT. Ver Luckow e Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Após inserção do gene heterólogo, o vetor de transferência e o genoma baculoviral de tipo selvagem são cotransfetados num hospedeiro de células de inseto. Na técnica são conhecidos métodos de introdução de ADN heterólogo no sítio desejado do vírus baculovírus. Ver SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN N.° 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow e Summers, VIROLOGY (1989) 170:31.

Por exemplo, a inserção pode ser num gene tal como o gene de poliedrina, por recombinação cruzada dupla homóloga; a inserção pode ser também num sítio de enzima de restrição geneticamente manipulado no gene do baculovírus desejado. Ver Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4):91. A transfeção pode ser conseguida por

eletroporação. Ver TROTTER E WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann e King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativamente, os lipossomas podem ser utilizados para transfetar as células de insetos com o vetor de expressão recombinante e o baculovírus. Ver, e.g., Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36,- Graves et al. , BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998)

273(22):13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376,- Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10,- Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2):766,- e Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274.

Os lipossomas comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Cellfectin® e Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) . Além disso, pode ser utilizada transfeção com fosfato de cálcio. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19):5667,- e

Mann e King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501.

Os vetores de expressão de baculovírus contêm geralmente um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é qualquer sequência de ADN capaz de ligar uma ARN-polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (e.g., gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada próxima à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um sítio de ligação de ARN-polimerase e um sítio de iniciação da transcrição. Um promotor de baculovírus pode ter também um segundo domínio chamado de potenciador, o qual, se presente, é geralmente distai ao gene estrutural. Além do mais, a expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos em alturas tardias do ciclo de infeção, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína poliédrica viral (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 e 0 155 476) e o gene que codifica a proteína plO (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765). 0 vetor de expressão de baculovirus recém-formado é empacotado num baculovirus recombinante infeccioso e as placas subsequentemente cultivadas podem ser purificadas por técnicas conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Ver Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11 (4): 91,- SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) .

Foram desenvolvidos vetores de expressão de baculovirus recombinantes para infeção em várias células de insetos. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovirus recombinantes para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC N.° CCL-125), Bombyx mori (ATCC N.° CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC N.° 1963), Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Ver Wright, NATURE (1986) 321:718;

Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Ver, em geral, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Mais especificamente, as linhas de células utilizadas para os sistemas de vetores de expressão de baculovirus incluem comummente, mas não se limitam a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC N.° CRL-1711), Sf21 (Spodoptera ftugiperda) (Invitrogen Corp., N.° Cat. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni) e High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).

Estão comercialmente disponíveis células e meios de cultura tanto para a expressão direta como para a expressão de fusão de polipéptidos heterólogos num baculovírus/expressão e a tecnologia de cultura de células é geralmente conhecida pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. E. Coli, espécies de Pseudomonas e outros Procariotas As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Uma grande variedade de vetores está disponível para utilização em hospedeiros bacterianos. Os vetores podem ser vetores de uma única cópia ou de múltiplas cópias baixas ou altas. Os vetores podem servir para clonagem e/ou expressão. Face à ampla literatura no que se refere a vetores, à disponibilidade comercial de muitos vetores e mesmo de manuais que descrevem vetores e os seus mapas de restrição e características, não é aqui necessária uma discussão extensa. Como é bem conhecido, os vetores envolvem normalmente marcadores que permitem seleção, marcadores esses que podem proporcionar resistência a agentes citotóxicos, prototrofia ou imunidade. Frequentemente, está presente uma multiplicidade de marcadores, os quais proporcionam diferentes caracteristicas.

Um promotor bacteriano é qualquer sequência de ADN capaz de ligar a ARN-polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (e.g. gene estrutural) em ARNm. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada proximal à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um sitio de ligação de ARN-polimerase e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano pode ter também um segundo domínio chamado de operador, que pode sobrepor um sítio de ligação de ARN-polimerase adjacente no qual se inicia a síntese de ARN. 0 operador permite transcrição regulada (induzível) negativa, uma vez que uma proteína repressora de genes se pode ligar ao operador e, desse modo, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser conseguida por uma sequência de ligação de proteína ativadora de genes, a qual, se presente está geralmente proximal (5') à sequência de ligação da ARN-polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora de genes é a proteína ativadora do catabolismo (CAP), a qual ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]. Por conseguinte, a expressão regulada pode ser positiva ou negativa, aumentando ou reduzindo, desse modo, a transcrição.

As sequências que codificam enzimas da via metabólica proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056] e maltose. Os exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como triptofano (trp) [Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; Pat. U.S. N.° 4,738,921; Pub. EP N.° 036 776 e 121 775]. O sistema promotor de β-galactosidase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." No Interferão 3 (Ed. I. Gresser)], os sistemas promotores lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] e T5 [Pat. U.S. N.° 4,689,406] de bacteriófagos também proporcionam sequências promotoras úteis. Os métodos preferidos da presente invenção utilizam promotores fortes, tais como o promotor T7 para induzir polipéptidos de bG-CSF em níveis altos. Os exemplos de tais vetores são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e incluem a série pET29 de Novagen e os vetores pPOP descritos em WO99/05297. Tais sistemas de expressão podem produzir níveis altos de polipéptidos de bG-CSF no hospedeiro sem comprometer a viabilidade de células hospedeiras ou os parâmetros de crescimento. 0 pETl9 (Novagen) é outro vetor conhecido na técnica.

Além disso, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, as sequências de ativação da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser unidas com as sequências operão de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, gerando um promotor híbrido sintético [Pat. U.S. N.° 4,551,433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor trp-lac híbrido, constituído pelas sequências do promotor trp e do operão lac, que é regulado pelo repressor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores naturais de origem não bacteriana que têm a capacidade para ligar a ARN-polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor natural de origem não bacteriana pode ser também acoplado com uma ARN-polimerase compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema ARN-polimerase T7/promotor de bacteriófago é um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sei. (1985) 82:1074]. Além disso, um promotor híbrido pode ser também constituído por um promotor bacteriófago e uma região operadora de E. coli (EP Pub. N.° 267851).

Além de uma sequência promotora funcional, um sitio de ligação de ribossoma eficaz é também útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o sitio de ligação de ribossoma é chamado de sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Julga-se que a sequência SD promove a ligação de ARNm ao ribossoma por emparelhamento das bases entre a sequência SD e a 3' e ARNr 16S de E. coli [Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com urn sitio de ligação de ribossomas fraco [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]. 0 termo "hospedeiro bacteriano" ou "célula hospedeira bacteriana" refere-se a uma bactéria que pode ser, ou foi, utilizada como um recetor para vetores recombinantes ou outro ADN de transferência. 0 termo inclui a descendência da célula hospedeira bacteriana original que foi transfetada. Entende-se que a descendência de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total ao parente original, devido a mutação acidental ou deliberada. A descendência da célula parental que é suficientemente semelhante ao parente que é caracterizado pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de bG-CSF, inclui-se na descendência pretendida por esta definição. A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptidos de bG-CSF é conhecida pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Ao selecionar hospedeiros bacterianos para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que se demonstrou que têm, inter alia, boa capacidade de formação de corpos de inclusão, baixa atividade proteolitica e robustez global. Os hospedeiros bacterianos são geralmente disponíveis de uma variedade de fontes que incluem, mas não se limitam a, o Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA); e o American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . A fermentação industrial/farmacêutica utiliza geralmente bactérias derivadas de estirpes K (e.g. W3110) ou bactérias derivadas de estirpes B (e.g. BL21). Estas estirpes são particularmente úteis porque os seus parâmetros de crescimento são extremamente bem conhecidos e robustos. Além disso, estas estirpes não são patogénicas, o que é comercialmente importante por razões de segurança e ambientais. Outros exemplos de hospedeiros de E. coli adequados incluem, mas não se limitam a, as estirpes de BL21, DH10B ou seus derivados. Noutra forma de realização dos métodos da presente invenção, o hospedeiro de E. coli é uma estirpe protease-menos que inclui, mas não se limita a, OMP- e LON-. A estirpe de células hospedeiras pode ser uma espécie de Pseudomonas que inclui, mas não se limita a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. A Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada estirpe MB101, é conhecida por ser útil para produção recombinante e está disponível para processos de produção de proteínas terapêuticas. Os exemplos de um sistema de expressão de Pseudomonas incluem o sistema disponível de The Dow Chemical Company como uma estirpe hospedeira (Midland, MI disponível na Rede Mundial de Computadores em dow.com).

Assim que se tiver estabelecido uma estirpe de células hospedeiras recombinantes (i.e., a construção de expressão tiver sido introduzido na célula hospedeira e as células hospedeiras com a construção de expressão apropriada tiverem sido isoladas), a estirpe de células hospedeiras recombinante é cultivada sob condições apropriadas para a produção de polipéptidos de bG-CSF. Como será evidente para um especialista na técnica, o método de cultura da estirpe de células hospedeiras recombinante será dependente da natureza da construção de expressão utilizada e da identidade da célula hospedeira. As estirpes hospedeiras recombinantes são normalmente cultivadas utilizando métodos que são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. As células hospedeiras recombinantes são tipicamente cultivadas em meio líquido que contém fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos e que contém, opcionalmente, vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento e outros suplementos de cultura proteica conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Os meios líquidos para cultura de células hospedeiras podem conter opcionalmente antibióticos ou antifúngicos para prevenir o crescimento de microrganismos indesejáveis e/ou compostos que incluem, mas não se limitam a, antibióticos para selecionar células hospedeiras que contêm o vetor de expressão.

As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas nos formatos descontínuos ou contínuos, com a colheita de células (no caso do polipéptido de bG-CSF se acumular intracelularmente) ou colheita do sobrenadante da cultura nos formatos descontínuos ou contínuos. Para a produção em células hospedeiras procarióticas, a cultura descontínua e a colheita de células são preferidas.

Os polipéptidos de bG-CSF da presente invenção são normalmente purificados após expressão em sistemas recombinantes. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser purificado a partir de células hospedeiras ou do meio de cultura por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A Patente U.S. N.° 5,849,883 e WO 89/10932 descrevem a clonagem de b-GCSF e análogos do mesmo em células hospedeiras e métodos de isolamento e purificação. Os polipéptidos de bG-CSF produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser pouco solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão) . Numa forma de realização da presente invenção, podem ser facilmente efetuadas substituições de aminoácidos no polipéptido de bG-CSF que são selecionadas para aumentar a solubilidade da proteína produzida de forma recombinante utilizando os métodos aqui divulgados, assim como aqueles conhecidos na técnica. No caso de uma proteína insolúvel, a proteína pode ser colhida dos lisados de células hospedeiras por centrifugação e pode ser ainda seguida de homogeneização das células. No caso de uma proteína pouco solúvel, podem ser adicionados compostos, incluindo, mas não se limitando a, polietilenoimina (PEI) para induzir a precipitação da proteína parcialmente solúvel. A proteína precipitada pode ser em seguida convenientemente colhida por centrifugação. As células hospedeiras recombinantes podem ser rompidas ou homogeneizadas para libertar os corpos de inclusão de dentro das células utilizando uma variedade de métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. A rutura ou homogeneização de células hospedeiras pode ser realizada utilizando técnicas bem conhecidas que incluem, mas não se limitam a, rutura enzimática de células, aplicação de ultrassons, homogeneização de retorno ou rutura de libertação a alta pressão. Numa forma de realização do método da presente invenção, é utilizada a técnica de libertação a alta pressão para romper as células hospedeiras de E. colii, para libertar os corpos de inclusão dos polipéptidos de bG-CSF. Quando se manuseia corpos de inclusão do polipéptido de bG-CSF, pode ser vantajoso minimizar o tempo de homogeneização nas repetições a fim de maximizar o rendimento de corpos de inclusão sem perdas devido a fatores tais como solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise. 0 polipéptido de bG-CSF insolúvel ou precipitado pode ser em seguida solubilizado utilizando qualquer um de um número de solubilizantes adequados conhecidos à técnica. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser solubilizado com ureia ou cloridrato de guanidina. 0 volume do polipéptido de bG-CSF solubilizado deve ser minimizado para que possam ser produzidos grandes lotes utilizando tamanhos de lotes convenientemente manipuláveis. Este fator pode ser significativo num contexto de grande escala industrial onde o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em lotes que têm milhares de litros em volume. Além disso, quando se fabrica o polipéptido de bG-CSF num contexto de grande escala industrial, em particular para utilizações farmacêuticas humanas, a evasão de produtos químicos agressivos que possam danificar a maquinaria e o recipiente, ou o próprio produto proteico, deve ser evitada, se possível. Foi demonstrado no método da presente invenção que o agente desnaturante mais suave ureia pode ser utilizado para solubilizar os corpos de inclusão do polipéptido de bG-CSF, em vez do agente desnaturante mais agressivo cloridrato de guanidina. A utilização de ureia reduz significativamente o risco de danificar o equipamento de aço inoxidável utilizado no processo de fabrico e purificação do polipéptido de bG-CSF, enquanto solubiliza eficazmente os corpos de inclusão do polipéptido de bG-CSF.

No caso de proteína bG-CSF solúvel, o bG-CSF pode ser segregado para o espaço periplasmático ou para o meio de cultura. Além disso, o bG-CSF solúvel pode estar presente no citoplasma das células hospedeiras. Pode ser desejado que se concentre o bG-CSF solúvel antes da realização dos passos de purificação. Podem ser utilizadas técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria para concentrar o bG-CSF solúvel, por exemplo, a partir de lisados celulares ou meio de cultura. Além disso, podem ser utilizadas técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria para romper células hospedeiras e libertar o bG-CSF solúvel a partir do citoplasma ou espaço periplasmático das células hospedeiras.

Quando o polipéptido de bG-CSF é produzido como uma proteína de fusão, a sequência de fusão pode ser retirada. A remoção de uma sequência de fusão pode ser efetuada por dissociação enzimática ou química. A remoção enzimática de sequências de fusão pode ser realizada utilizando métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. A escolha da enzima para remoção da sequência de fusão será determinada pela identidade da fusão, e as condições reacionais serão especifiçadas pela escolha da enzima como será evidente para um especialista com conhecimentos médios na matéria. A dissociação química pode ser realizada utilizando reagentes conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, incluindo, mas não se limitando a, brometo de cianogénio, protease TEV e outros reagentes. 0 polipéptido de bG-CSF dissociado pode ser purificado da sequência de fusão dissociada por métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Tais métodos serão determinados pela identidade e propriedades da sequência de fusão e do polipéptido de bG-CSF, como será evidente para um especialista com conhecimentos médios na matéria. Os métodos de purificação podem incluir, mas não se limitam a, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia de troca iónica ou diálise, ou qualquer combinação dos mesmos. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser também purificado para remover ADN da solução da proteína. 0 ADN pode ser removido por qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como precipitação ou cromatografia de troca iónica, mas pode ser removido por precipitação com um agente de precipitação de ácidos nucleicos, tal como, mas não se limitando a, sulfato de protamina. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser separado do ADN precipitado utilizando métodos padrão bem conhecidos que incluem, mas não se limitam a, centrifugação ou filtração. A remoção de moléculas de ácido nucleico do hospedeiro é um fator importante num contexto em que o polipéptido de bG-CSF é para ser utilizado para tratar animais ou humanos e os métodos da presente invenção reduzem o ADN da célula hospedeira a níveis farmaceuticamente aceitáveis.

Podem ser também utilizados métodos para fermentação em pequena escala ou grande escala na expressão de proteínas, os quais incluem, mas não se limitam a, fermentadores, balões de agitação, biorreatores de leito fluidizado, biorreatores de fibra oca, sistemas de cultura em frascos rotativos e sistemas de biorreator de tanque agitado. Cada um destes métodos pode ser realizado num processo descontínuo, descontínuo com alimentação ou contínuo.

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser geralmente recuperados utilizando métodos padrão na técnica. Por exemplo, o meio de cultura ou lisado celular pode ser centrifugado ou filtrado para remover detritos celulares. 0 sobrenadante pode ser concentrado ou diluído até um volume desejado ou diafiltrado para um tampão adequado para preparar a preparação para purificação adicional. A purificação adicional do polipéptido de bG-CSF da presente invenção inclui a separação de formas desamidadas e cortadas da variante do polipéptido de bG-CSF da forma intacta.

Qualquer um dos seguintes procedimentos ilustrativos pode ser utilizado para a purificação dos polipéptidos de bG-CSF da invenção: cromatografia de afinidade; cromatografia de troca aniónica ou catiónica (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, DEAE SEPHAROSE); cromatografia sobre sílica; cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC); HPLC de fase inversa; filtração em gel (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrófoba; cromatografia de exclusão molecular; cromatografia de quelato de metal; ultrafiltração/ diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amónio; cromatofocagem; cromatografia de substituição; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não se limitando a focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas não se limitando a precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE ou extração.

As proteínas da presente invenção, incluindo, mas não se limitando a, proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, péptidos que compreendem aminoácidos não naturais, anticorpos contra proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, parceiros de ligação para proteínas que compreendem aminoácidos não naturais, etc., podem ser purificadas, parcialmente ou substancialmente até à homogeneidade, de acordo com procedimentos correntes conhecidos e utilizados pelos especialistas na técnica. Por conseguinte, os polipéptidos da invenção podem ser recuperados e purificados por qualquer um de um número de métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, incluindo, mas não se limitando a, precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extração ácido ou base, cromatografia em coluna, cromatografia em coluna de afinidade, cromatografia de troca aniónica ou catiónica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia sobre hidroxilapatite, cromatografia sobre lectina, eletroforese em gel e semelhantes. Os passos de redobragem da proteína podem ser utilizados, consoante desejado, na preparação de proteínas maduras corretamente dobradas. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) , cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados podem ser utilizados nos passos de purificação final onde é desejada alta pureza. Numa forma de realização, os anticorpos gerados contra aminoácidos não naturais (ou proteínas ou péptidos que compreendem aminoácidos não naturais) são utilizados como reagentes de purificação, incluindo, mas não se limitando a, para purificação com base em afinidade de proteínas ou péptidos que compreendem um ou mais aminoácido (s) não natural/naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, consoante desejado, os polipéptidos são opcionalmente utilizados para uma grande variedade de utilidades, incluindo, mas não se limitando a, como componentes de ensaios, agentes terapêuticos, agentes profiláticos, agentes de diagnóstico, reagentes de investigação e/ou como imunogénios para a produção de anticorpos. Os anticorpos gerados contra polipéptidos da presente invenção podem ser obtidos administrando os polipéptidos ou fragmentos portadores de epítopo, ou células a um animal, preferencialmente um animal não humano, utilizando protocolos de rotina. Um especialista com conhecimentos médios na matéria poderia gerar anticorpos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas. Da mesma forma, murganhos transgénicos, ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, podem ser utilizados para expressar anticorpos humanizados. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para isolar ou para identificar clones que expressam o polipéptido ou para purificar os polipéptidos. Os anticorpos contra polipéptidos da presente invenção podem ser também utilizados para tratar doenças.

Os polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção podem ser também utilizados como vacinas. Por conseguinte, num aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imunológica num mamífero que compreende inocular o mamífero com um polipéptido da presente invenção, adequado para produzir uma resposta imunológica de anticorpos e/ou de células T, incluindo, por exemplo, células T produtoras de citocinas ou células T citotóxicas, para proteger o referido animal de doença, quer essa doença já esteja estabelecida no indivíduo, ou não. Uma resposta imunológica num mamífero pode ser também induzida por um método que compreende administrar um polipéptido da presente invenção através de um vetor que dirige a expressão do polinucleótido e codifica o polipéptido in vivo, a fim de induzir uma tal resposta imunológica para produzir anticorpos que protejam o referido animal de doenças da invenção. Uma maneira de administrar o vetor é acelerando-o para dentro de células desejadas como um revestimento sobre partículas ou de outro modo. Esse vetor de ácido nucleico pode compreender ADN, ARN, um ácido nucleico modificado ou um ADN/ARN híbrido.

Para utilização como uma vacina, um polipéptido ou um vetor de ácido nucleico será normalmente proporcionado como uma formulação de vacina (composição). A formulação pode compreender ainda um veiculo adequado. Uma vez que um polipéptido pode ser dissociado no estômago, aquele pode ser administrado por via parentérica (por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções injetáveis estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recetor; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão ou espessantes. A formulação de vacina pode incluir também sistemas adjuvantes para aumentar a imunogenicidade da formulação, os quais são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. A dosagem dependerá da atividade especifica da vacina e pode ser facilmente determinada por experiências de rotina.

Além de outras referências aqui assinaladas, uma variedade de métodos de purificação/dobragem de proteína são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, incluindo, mas não se limitando a, aqueles estabelecidos em R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris e Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson e Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; e Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências citadas nos mesmos.

Uma vantagem de produzir uma proteína ou polipéptido de interesse com um aminoácido não natural numa célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica é que tipicamente as proteínas ou polipéptidos estarão dobrados nas suas conformações nativas. No entanto, em certas formas de realização da invenção, os especialistas na técnica reconhecerão que, após síntese, expressão e/ou purificação, as proteínas ou péptidos podem possuir uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipéptidos relevantes. Num aspeto da invenção, a proteína ou polipéptido expressado é opcionalmente desnaturado e, em seguida, renaturado. Isto é realizado utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, a adição de uma chaperonina à proteína ou polipéptido de interesse, solubilizando as proteínas num agente caotrópico tal como guanidina HC1, utilizando dissulfureto de proteina-isomerase, etc.

Em geral, é pontualmente desejável desnaturar e reduzir polipéptidos expressados e, em seguida, fazer com que os polipéptidos se redobrem na conformação preferida. Por exemplo, pode ser adicionada guanidina, ureia, DTT, DTE e/ou uma chaperonina a um produto de tradução de interesse. Os métodos de redução, desnaturação e renaturação de proteínas são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria (ver, as referências acima, e Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; e Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., por exemplo, descrevem a desnaturação e redução de proteínas de corpos de inclusão em guanidina-DTE. As proteínas podem ser redobradas num tampão redox que contém, incluindo, mas não se limitando a, glutationa oxidada e L-arginina. Os reagentes de redobragem podem ser transferidos como uma corrente ou deslocados de outro modo para ficar em contacto com o um ou mais polipéptidos ou outros produtos de expressão, ou vice-versa.

No caso da produção procariótica do polipéptido de bG-CSF, o polipéptido de bG-CSF assim produzido pode estar dobrado incorretamente e, desse modo, carecer ou ter uma atividade biológica reduzida. A bioatividade da proteína pode ser restabelecida por "redobragem". Em geral, o polipéptido de bG-CSF dobrado incorretamente é redobrado solubilizando (quando o polipéptido de bG-CSF é também insolúvel), desdobrando e reduzindo a cadeia polipeptídica utilizando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (e.g. ureia e/ou guanidina) e um agente de redução capaz de reduzir ligações dissulfureto (e.g. ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). A uma concentração moderada de caótropo, é em seguida adicionado um agente oxidante (e.g., oxigénio, cistina ou cistamina), que permite que se formem novamente as ligações dissulfureto. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser redobrado utilizando métodos padrão conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Pat. U.S. N.° 4,511,502, 4,511,503 e 4,512,922,. O polipéptido de bG-CSF pode ser também codobrado com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros.

Após redobragem, o bG-CSF pode ser purificado adicionalmente. A purificação de bG-CSF pode ser realizada utilizando uma variedade de técnicas conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, incluindo cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de troca iónica, cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa, cromatografia de afinidade, e semelhantes ou qualquer combinação das mesmas. A purificação adicional pode incluir também um passo de secagem ou precipitação da proteína purificada.

Após purificação, o bG-CSF pode ser trocado para diferentes tampões e/ou concentrado por qualquer de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, diafiltração e diálise. 0 bG-CSF que é proporcionado como uma única proteína purificada pode ser submetido a agregação e precipitação. 0 bG-CSF purificado pode ser pelo menos 90% puro (como medido por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa, RP-HPLC, ou eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio, SDS-PAGE) ou pelo menos 95% puro, ou pelo menos 98% puro, ou pelo menos 99% puro ou mais. Independentemente do valor numérico exato da pureza do bG-CSF, o bG-CSF é suficientemente puro para ser utilizado como um produto farmacêutico ou para processamento adicional, tal como conjugação com um polímero solúvel em água tal como PEG.

Certas moléculas de bG-CSF podem ser utilizadas como agentes terapêuticos na ausência de outros ingredientes ativos ou proteínas (diferentes de excipientes, veículos e estabilizantes, albumina sérica e semelhantes), ou podem ser complexados com outra proteína ou um polímero. Métodos Gerais de Purificação Pode ser realizado qualquer um de uma variedade de passos de isolamento sobre o lisado celular, extrato, meio de cultura, corpos de inclusão, espaço periplasmático das células hospedeiras, citoplasma das células hospedeiras ou outro material, que compreenda o polipéptido de bG-CSF ou sobre quaisquer misturas do polipéptido de bG-CSF que resultem de quaisquer passos de isolamento que incluem, mas não se limitam a, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia de filtração em gel, cromatografia liquida de alta eficiência ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorção em leito expandido, ou qualquer combinação e/ou repetição dos mesmos e por qualquer ordem apropriada. 0 equipamento e outros materiais necessários utilizados na realização das técnicas aqui descritas estão comercialmente disponíveis. Bombas, coletores de frações, monitores, registadores e sistemas completos encontram-se disponíveis, por exemplo, de Applied Biosystems (Foster City, CA), BioRad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), e Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ) . Os materiais cromatográf icos que incluem, mas não se limitam a, materiais de matriz de troca, meios e tampões estão também disponíveis a partir dessas empresas. 0 equilíbrio, e outros passos dos processos de cromatografia em coluna aqui descritos tais como lavagem e eluição, podem ser realizados mais rapidamente utilizando equipamento especializado, tal como uma bomba. As bombas comercialmente disponíveis incluem, mas não se limitam a, Bomba P-50 HILOAD®, Bomba Peristáltica P-1, Bomba P-901 e Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Os exemplos de coletores de frações incluem o

Coletor de Frações RediFrac, Coletores de Frações FRAC-100 e FRAC-200, e o Coletor de Frações SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Estão também disponíveis misturadores para produzir gradientes de pH e concentração linear. Os misturadores comercialmente disponíveis incluem o Misturador de Gradiente GM-1 e os Misturadores em Linha (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 0 processo cromatográfico pode ser monitorizado utilizando qualquer monitor comercialmente disponível. Tais monitores podem ser utilizados para reunir informação como UV, pH e condutividade. Os exemplos de detetores incluem Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 e Monitor de Condutividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Na realidade, estão comercialmente disponíveis sistemas completos que incluem os vários sistemas AKTA® da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Numa forma de realização da presente invenção, por exemplo, o polipéptido de bG-CSF pode ser reduzido e desnaturado, desnaturando em primeiro lugar o polipéptido de bG-CSF purificado resultante em ureia, seguido de diluição em tampão TRIS que contém um agente de redução (tal como DTT) a um pH adequado. Noutra forma de realização, o polipéptido de bG-CSF é desnaturado em ureia numa gama de concentração entre cerca de 2 M a cerca de 9 M, seguido de diluição em tampão de TRIS a um pH na gama de cerca de 5,0 a cerca de 8,0. A mistura de redobragem desta forma de realização pode ser depois incubada. Numa forma de realização, a mistura de redobragem é incubada à temperatura ambiente durante quatro a vinte e quatro horas. A mistura do polipéptido de bG-CSF reduzido e desnaturado pode ser em seguida adicionalmente isolado ou purificado.

Como aqui especificado, o pH da primeira mistura do polipéptido de bG-CSF pode ser ajustado antes da realização de quaisquer passos de isolamento subsequentes. Além disso, a primeira mistura do polipéptido de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente do mesmo pode ser concentrada utilizando técnicas conhecidas na matéria. Além do mais, o tampão de eluição que compreende a primeira mistura do polipéptido de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente do mesmo pode ser trocado por um tampão adequado para o passo de isolamento seguinte utilizando técnicas conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria.

Cromatografia de Troca Iónica Numa forma de realização, e como um passo adicional, opcional, pode ser realizada uma cromatografia de troca iónica sobre a primeira mistura do polipéptido de bG-CSF. Ver, em geral, ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (N.° de Cat. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). As colunas de troca iónica comercialmente disponíveis incluem as Colunas HITRAP®, HIPREP® e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Tais colunas utilizam permutadores de aniões fortes tais como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance e Q SEPHAROSE® XL; permutadores de catiões fortes tais como SP SEPHAROSE® High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow e SP SEPHAROSE® XL; permutadores de aniões fracos tais como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; e permutadores de catiões fracos tais como CM SEPHAROSE® Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A cromatografia em coluna de troca aniónica ou catiónica pode ser realizada sobre o polipéptido de bG-CSF em qualquer etapa do processo de purificação para isolar polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado. 0 passo de cromatografia de troca catiónica pode ser realizado utilizando qualquer matriz de troca catiónica adequada. As matrizes de troca catiónica úteis incluem, mas não se limitam a, materiais de matriz de troca catiónica fibrosos, porosos, não porosos, microgranulares, em esférulas ou reticulados. Tais materiais de matriz de troca catiónica incluem, mas não se limitam a, celulose, agarose, dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílica, poliéter, ou compósitos de qualquer um dos anteriores. A matriz de troca catiónica pode ser qualquer permutador de catiões adequado incluindo permutadores de catiões fortes e fracos. Os permutadores de catiões fortes podem permanecer ionizados sobre uma grande gama de pH e, desse modo, podem conseguir ligar o bG-CSF sobre uma grande gama de pH. Os permutadores de catiões fracos, contudo, podem perder a ionização em função do pH. Por exemplo, um permutador de catiões fraco pode perder a carga quando o pH cai abaixo de cerca de pH 4 ou pH 5. Os permutadores de catiões fortes adequados incluem, mas não se limitam a, grupos funcionais carregados tais como sulfopropilo (SP), metilsulfonato (S) ou sulfoetilo (SE) . A matriz de troca catiónica pode ser um permutador de catiões forte, que tem preferencialmente uma gama de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 2,5 a cerca de 6,0. Alternativamente, o permutador de catiões forte pode ter uma gama de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,5. A matriz de troca catiónica pode ser um permutador de catiões forte que tem um pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 3,0. Alternativamente, a matriz de troca catiónica pode ser um permutador de catiões forte, que tem preferencialmente uma gama de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. A matriz de troca catiónica pode ser um permutador de catiões forte que tem preferencialmente uma gama de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 8,0 a cerca de 12,5. Alternativamente, o permutador de catiões forte pode ter uma gama de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de pH 8,0 a cerca de pH 12,0.

Antes de carregar o bG-CSF, a matriz de troca catiónica pode ser equilibrada, por exemplo, utilizando vários volumes de coluna de um ácido fraco diluído, e.g., quatro volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3. Após equilíbrio, o bG-CSF pode ser adicionado e a coluna pode ser lavada uma a várias vezes, antes da eluição do bG-CSF substancialmente purificado, utilizando também uma solução de ácido fraco tal como uma solução de ácido acético ou ácido fosfórico fraco. Por exemplo, aproximadamente 2-4 volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3, podem ser utilizados para lavar a coluna. Podem ser também utilizadas lavagens adicionais utilizando, e.g., 2-4 volumes de coluna de acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5, ou acetato de sódio 0,05 M misturado com cloreto de sódio 0,1 M, pH 5,5. Alternativamente, utilizando métodos conhecidos na técnica, a matriz de troca catiónica pode ser equilibrada utilizando vários volumes de coluna de uma base fraca diluída.

Alternativamente, o bG-CSF substancialmente purificado pode ser eluido pondo em contacto a matriz do permutador de catiões com um tampão que tem um pH ou força iónica suficientemente baixo para deslocar o bG-CSF da matriz. O pH do tampão de eluição pode variar desde cerca de pH 2,5 a cerca de pH 6,0. Mais especificamente, o pH do tampão de eluição pode variar desde cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,0. O tampão de eluição pode ter um pH de cerca de 3,0. Além disso, a quantidade de tampão de eluição pode variar muito e estará geralmente na gama de cerca de 2 a cerca de 10 volumes de coluna.

Após adsorção do polipéptido de bG-CSF à matriz do permutador de catiões, o polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado pode ser eluido pondo em contacto a matriz com um tampão que tem um pH ou força iónica suficientemente alto para deslocar o polipéptido de bG-CSF da matriz. Os tampões adequados para serem utilizados na eluição a pH alto do polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado podem incluir, mas não se limitam a, tampões de citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES e MES que variam em concentração desde pelo menos cerca de 5 mM a pelo menos cerca de 100 mM.

Cromatografia de Fase Inversa A RP-HPLC pode ser realizada para purificar proteínas seguindo protocolos adequados que são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Ver, e.g., Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al. , J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. A RP-HPLC pode ser realizada sobre o polipéptido de bG-CSF para isolar o polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado. A este respeito, podem ser utilizadas resinas derivatizadas de sílica com funcionalidades alquilo com uma grande variedade de comprimentos, incluindo, mas não se limitando a, resinas de pelo menos cerca de C3 a pelo menos cerca de C30, pelo menos cerca de C3 a pelo menos cerca de C20, ou pelo menos cerca de C3 a pelo menos cerca de Cis. Alternativamente, pode ser utilizada uma resina polimérica. Por exemplo, pode ser utilizada a resina Amberchrome CGlOOOsd da TosoHaas, a qual é uma resina de polímero de estireno. Podem ser também utilizadas resinas ciano ou poliméricas com uma grande variedade de comprimentos da cadeia alquilo. Além disso, a coluna de RP-HPLC pode ser lavada com um solvente tal como etanol. A coluna RP Source é outro exemplo de uma coluna de RP-HPLC.

Um tampão de eluição adequado que contém um agente de par iónico e um modificador orgânico tal como metanol, isopropanol, tetra-hidrofurano, acetonitrilo ou etanol, pode ser utilizado para eluir o polipéptido de bG-CSF a partir da coluna de RP-HPLC. Os agentes de par iónico mais comummente utilizados incluem, mas não se limitam a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutirico, trietilamina, tetrametilamónio, tetrabutilamónio e acetato de trietilamónio. A eluição pode ser realizada utilizando um ou mais condições de gradiente ou isocráticas, sendo as condições de gradiente preferidas para reduzir o tempo de separação e para diminuir a largura do pico. Outro método envolve a utilização de dois gradientes com diferentes gamas de concentração de solvente. Os exemplos de tampões de eluição adequados para serem aqui utilizados podem incluir, mas não se limitam a, soluções de acetato de amónio e acetonitrilo. Técnicas de Purificação por Cromatografia de Interação Hidrófoba A cromatografia de interação hidrófoba (HIC) pode ser realizada sobre o polipéptido de bG-CSF. Ver, em geral, HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (N.° de Cat. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). As matrizes de HIC adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a, matrizes substituídas com alquilo ou arilo, tais como matrizes substituídas com butilo, hexilo, octilo ou fenilo incluindo matrizes de agarose, agarose reticulada, sepharose, celulose, sílica, dextrano, poliestireno, poli(metacrilato) e resinas de modo misto, incluindo, mas não se limitando a, uma resina de polietilenoamina ou uma matriz de poli(metacrilato) substituído com butilo ou fenilo. As fontes comercialmente disponíveis para a cromatografia de interação hidrófoba em coluna incluem, mas não se limitam a, as colunas HITRAP®, HIPREP® e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Resumidamente, antes da carga, a coluna de HIC pode ser equilibrada utilizando tampões padrão conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, tais como uma solução de ácido acético/cloreto de sódio ou HEPES contendo sulfato de amónio. 0 sulfato de amónio pode ser utilizado como o tampão para carga na coluna de HIC. Depois de carregar o polipéptido de bG-CSF, a coluna pode ser em seguida lavada utilizando tampões e condições padrão para remover materiais indesejados, mas reter o polipéptido de bG-CSF na coluna de HIC. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser eluído com cerca de 3 a cerca de 10 volumes de coluna de um tampão padrão, tal como um tampão de HEPES contendo EDTA e uma concentração de sulfato de amónio menor do que a do tampão de equilíbrio, ou um tampão de ácido acético/cloreto de sódio, entre outros. Um gradiente salino linear decrescente utilizando, por exemplo, um gradiente de fosfato de potássio, pode ser também utilizado para eluir as moléculas de bG-CSF. O eluente pode ser em seguida concentrado, por exemplo, por filtração tal como diafiltração ou ultrafiltração. A diafiltração pode ser utilizada para remover o sal utilizado para eluir o polipéptido de bG-CSF.

Outras Técnicas de Purificação Ainda outro passo de isolamento que utiliza, por exemplo, filtração em gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (N.° de Cat. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), cromatografia sobre hidroxiapatite (as matrizes adequadas incluem, mas não se limitam a, HA-Ultrogel, Alta Resolução (Calbiochem), Hidroxiapatite Cerâmica CHT (BioRad) , Hidroxiapatite HTP Bio - Gel (BioRad) ) , HPLC, adsorção em leito expandido, ultrafiltração, diafiltração, liofilização e semelhantes, pode ser realizado sobre a primeira mistura do polipéptido de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente dos mesmos, para remover qualquer excesso de sais e para substituir o tampão por um tampão adequado para o passo de isolamento seguinte ou mesmo para a formulação do produto farmacológico final. O rendimento do polipéptido de bG-CSF, incluindo do polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado, pode ser monitorizado em cada passo aqui descrito utilizando técnicas conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Tais técnicas podem ser também utilizadas para avaliar o rendimento do polipéptido de bG-CSF substancialmente purificado após o último passo de isolamento. Por exemplo, o rendimento do polipéptido de bG-CSF pode ser monitorizado utilizando qualquer uma de várias colunas de cromatografia liquida de alta pressão de fase inversa, que têm uma variedade de comprimentos da cadeia alquilo tal como RP-HPLC ciano, RP-HPLC Cia; assim como HPLC de troca catiónica e HPLC de filtração em gel.

Em formas de realização especificas da presente invenção, o rendimento de bG-CSF após cada passo de purificação pode ser de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,9%, ou pelo menos cerca de 99,99%, do bG-CSF no material de partida para cada passo de purificação. A pureza pode ser determinada utilizando técnicas convencionais, tais como SDS-PAGE ou medindo o polipéptido de bG-CSF utilizando ensaios de transferência de Western e ELISA. Por exemplo, podem ser gerados anticorpos policlonais contra proteínas isoladas da fermentação de levedura de controlo negativo e recuperação em troca catiónica. Os anticorpos podem ser também utilizados para pesquisar para a presença de proteínas contaminantes da célula hospedeira. 0 material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste em partículas de sílica gel, cujas superfícies têm cadeias alquilo-C4. A separação do polipéptido de bG-CSF das impurezas proteicas baseia-se em diferenças na força das interações hidrófobas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. A HPLC preparativa é realizada utilizando uma coluna em aço inoxidável (cheia com 2,8 a 3,2 litros de sílica gel Vydac C4). 0 eluato de Hidroxiapatite Ultrogel é acidificado adicionando ácido trifluoroacético e carregado na coluna Vydac C4. Para a lavagem e eluição é utilizado um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. As frações são recolhidas e imediatamente neutralizadas com tampão de fosfato. As frações do polipéptido de bG-CSF que estão dentro dos limites da IPC são agrupadas. 0 material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste em grupos dietilaminoetilo (DEAE) que estão ligados covalentemente à superfície de esférulas de Sepharose. A ligação do polipéptido de bG-CSF aos grupos DEAE é mediada por interações iónicas. 0 acetonitrilo e o ácido trifluoroacético passam através da coluna sem serem retidos. Depois de estas substâncias terem sido eliminadas por lavagem, as impurezas vestigiais são removidas lavando a coluna com tampão de acetato a um pH baixo. Em seguida, a coluna é lavada com tampão neutro de fosfato e o polipéptido de bG-CSF é eluído com um tampão com força iónica aumentada. A coluna é empacotada com DEAE Sepharose Fast Flow. 0 volume da coluna é ajustado para assegurar uma carga do polipéptido de bG-CSF na gama de 3-10 mg de polipéptido de bG-CSF/mL de gel. A coluna é lavada com água e tampão de equilíbrio (fosfato de sódio/potássio). As frações agrupadas do eluato de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com tampão de equilíbrio. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão de acetato de sódio), seguido de lavagem com tampão de equilíbrio. Subsequentemente, o polipéptido de bG-CSF é eluído da coluna com tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/potássio) e recolhido numa única fração de acordo com o perfil de eluição mestre. O eluato da coluna de DEAE Sepharose é ajustado para a condutividade especificada. A substância farmacológica resultante é esterilizada por filtração para frascos de Teflon e armazenada a -70 °C.

Os métodos adicionais que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, passos para remover endotoxinas. As endotoxinas são lipopolissacáridos (LPSs) que estão localizados na membrana externa de células hospedeiras Gram-negativas, tais como, por exemplo, Escherichia coli. Os métodos para reduzir os níveis de endotoxinas são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria e incluem, mas não se limitam a, técnicas de purificação utilizando suportes de sílica, vidro em pó ou hidroxiapatite, fase inversa, afinidade, exclusão molecular, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de interação hidrófoba, uma combinação destes métodos, e semelhantes. Podem ser necessárias modificações ou métodos adicionais para remover contaminantes tais como proteínas coeluídas do polipéptido de interesse. Os métodos para medir os níveis de endotoxina são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria e incluem, mas não se limitam a, ensaios com Lisados de Limulus Amebocyte (LAL). 0 ensaio Endosafe™-PTS é um sistema colorimétrico, de tubo único que utiliza cartuchos pré-carregados com reagente LAL, substrato cromogénico e endotoxina padrão de controlo conjuntamente com um espetrofotómetro portátil. Os métodos alternativos incluem, mas não se limitam a, um método LAL Kinetic que é turbidimétrico e utiliza um formato de 96 poços.

Pode ser utilizada uma grande variedade de métodos e procedimentos para avaliar o rendimento e pureza de uma proteína bG-CSF que compreende um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, que incluem, mas não se limitam a, o ensaio de Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE revelado com prata, SDS-PAGE revelado com Coomassie, espetrometria de massa (incluindo, mas não se limitando a, MALDI-TOF) e outros métodos para caracterizar proteínas conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria.

Os métodos adicionais incluem, mas não se limitam a: SDS-PAGE acoplado com métodos de revelação de proteínas, imunotransferência, dessorção/ionização por laser assistida pela matriz-espetrometria de massa (MALDI-MS), cromatografia líquida/espetrometria de massa, focagem isoelétrica, troca aniónica analítica, cromatofocagem e dicroismo circular. VIII. Expressão em Sistemas Alternativos Têm sido utilizadas várias estratégias para introduzir aminoácidos não naturais em proteínas em células hospedeiras não recombinantes, células hospedeiras mutadas, ou em sistemas sem células. Estes sistemas são também adequados para serem utilizados na preparação dos polipéptidos de bG-CSF da presente invenção. A derivatização de aminoácidos com cadeias laterais reativas, tais como Lys, Cys e Tyr resultou na conversão da lisina em N2-acetil-lisina. A síntese química também proporciona um método direto para incorporar aminoácidos não naturais. Com o recente desenvolvimento da ligação enzimática e da ligação química nativa de fragmentos de péptido, é possível preparar proteínas maiores. Ver, e.g., P. E. Dawson e S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). A ligação química de péptidos e a ligação química nativa são descritas na Patente U.S. N.° 6,184,344, Publicação de Patente U.S. N.° 2004/0138412, Publicação de Patente U.S. N.° 2003/0208046, WO 02/098902 e WO 03/042235. Um método biossintético in vitro geral, em que um ARNt supressor quimicamente acilado com o aminoácido não natural desejado é adicionado a um extrato in vitro capaz de suportar a biossíntese de proteínas, foi utilizado para incorporar de forma específica em relação ao sítio mais de 100 aminoácidos não naturais numa variedade de proteínas de praticamente qualquer tamanho. Ver, e.g., V. W. Cornish, D. Mendel e P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); e, J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Uma grande gama de grupos funcionais foi introduzida em proteínas para estudos de estabilidade de proteínas, dobragem de proteínas, mecanismo de enzimas e transdução de sinal.

Foi desenvolvido um método in vivo, denominado incorporação por pressão seletiva, para explorar a promiscuidade das sintetases de tipo selvagem. Ver, e.g., N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder e R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999). Uma estirpe auxotrófica, na qual a via metabólica relevante que fornece a célula com um aminoácido natural particular é desligada, é cultivada em meio mínimo que contém concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene alvo é reprimida. No início de uma fase de crescimento estacionária, o aminoácido natural é esgotado e substituído pelo aminoácido não natural análogo. A indução da expressão da proteína recombinante resulta na acumulação de uma proteína que contém o análogo não natural. Por exemplo,

utilizando esta estratégia, as o, me p-fluorofenilalaninas foram incorporadas em proteínas, e exibem dois ombros característicos no espetro de UV que podem ser facilmente identificados, ver, e.g. , C. Minks, R. Huber, L. Moroder e N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); a trifluorometionina foi utilizada para substituir a metionina na lisozima T4 de bacteriófagos para estudar a sua interação com ligandos de quitooligossacáridos por RMN de 19F, ver, e.g., H. Duewel, E. Daub, V. Robinson e J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); e a trifluoroleucina foi incorporada no lugar da leucina, o que resultou numa estabilidade térmica e química aumentada de uma proteína de fecho de leucina. Ver, e.g., Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado e D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Além do mais, a selenometionina e telurometionina são incorporadas em várias proteínas recombinantes para facilitar a resolução de fases em cristalografia de raios X. Ver, e.g., W. A. Hendrickson, J. R. Horton e D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda e M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann e R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); e, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder e R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997) . Os análogos de metionina com funcionalidades alceno ou alcino foram também incorporados eficazmente, o que permitiu a modificação adicional de proteínas por meios químicos. Ver, e.g., J. C. van Hest e D. A. Tirrell, FEBS

Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick e D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000); e, K. L. Kiick e D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente U.S. N.° 6,586,207; Publicação de Patente U.S. 2002/0042097. O sucesso deste método depende do reconhecimento dos aminoácidos não naturais análogos pelas aminoacil-ARNt-sintetases, as quais, em geral, requerem alta seletividade para assegurar a fidelidade da tradução em proteínas. Uma maneira de alargar o âmbito deste método consiste em relaxar a especificidade para o substrato das aminoacil-ARNt-sintetases, o que foi conseguido num número limitado de casos. Por exemplo, a substituição de Ala294 por Gly na fenilalanil-ARNt-sintetase (PheRS) de Escherichia coli aumenta o tamanho da cavidade de ligação ao substrato e resulta na acilação de ARNtPhe pela p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe). Ver, M. Ibba, P. Kast e H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Uma estirpe de Escherichia coli que alberga esta PheRS mutante permite a incorporação de p-Cl-fenilalanina ou p-Br-fenilalanina em vez de fenilalanina. Ver, e.g., M. Ibba e H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); e, N. Sharma, R. Furter, P. Kast e D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). De forma semelhante, foi demonstrado que uma mutação pontual Phel30Ser próxima do sítio de ligação de aminoácidos da tirosil-ARNt-sintetase de Escherichia coli permite que a azatirosina seja incorporada mais eficientemente do que a tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y.

Monden, M. Kitabatake, D. Soil e S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000) .

Outra estratégia para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas in vivo consiste em modificar sintetases que têm mecanismos de correção de defeitos. Estas sintetases não conseguem discriminar e, portanto, ativam aminoácidos que são estruturalmente semelhantes aos aminoácidos naturais cognatos. Este erro é corrigido num sítio separado, que desacila o aminoácido incorretamente introduzido do ARNt para manter a fidelidade da tradução da proteína. Se a atividade de correção de defeitos da sintetase é desativada, os análogos estruturais que são ativados incorretamente podem escapar à função de edição e serem incorporados. Esta abordagem foi demonstrada recentemente com a valil-ARNt-sintetase (ValRS) . Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel e P. Marliere, Science, 292:501 (2001). A ValRS pode aminoacilar incorretamente o ARNtVai com Cys, Thr ou aminobutirato (Abu); estes aminoácidos não cognatos são subsequentemente hidrolisados pelo domínio de edição. Após mutagénese aleatória do cromossoma de Escherichia coli foi selecionada uma estirpe de Escherichia coli mutante que tem uma mutação no sítio de edição da ValRS. Esta ValRS deficiente na edição carrega incorretamente o ARNtVal com Cys. Uma vez que o Abu assemelha-se estericamente à Cys (o grupo -SH da Cys está substituído por -CH3 no Abu), a ValRS mutante também incorpora Abu nas proteínas quando esta estirpe de

Escherichia coli mutante é cultivada na presença de Abu. A análise por espetrometria de massa mostra que cerca de 24% das valinas estão substituídas por Abu em cada posição de valina na proteína nativa.

Os métodos de síntese em fase sólida e semissintéticos permitiram também a síntese de um número de proteínas contendo novos aminoácidos. Por exemplo, ver as seguintes publicações e referências citadas nas mesmas, as quais são como se segue: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacement on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Proteins engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); e Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994). A modificação química tem sido utilizada para introduzir uma variedade de cadeias laterais não naturais, que incluem cofatores, etiquetas de spin e oligonucleótidos em proteínas in vitro. Ver, e.g., Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); e Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988).

Alternativamente, os métodos biossintéticos que utilizam aminoacil-ARNts modificados quimicamente foram utilizados para incorporar várias sondas biofísicas em proteínas sintetizadas in vitro. Ver as seguintes publicações e referências citadas nas mesmas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); e Krieg, U.C., Walter, P.,

Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986).

Foi anteriormente demonstrado que os aminoácidos não naturais podem ser incorporados de forma especifica em relação ao sitio em proteínas in vitro pela adição de ARNts supressores aminoacilados quimicamente às reações de síntese de proteínas programadas com um gene que contém uma mutação sem sentido âmbar desejada. Utilizando estas abordagens, pode substituir-se um número dos vinte aminoácidos comuns por homólogos estruturais próximos, e.g., fenilalanina por fluorofenilalanina, utilizando estirpes auxotrópicas para um aminoácido particular. Ver, e.g., Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al. , FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); e Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed

Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).

Por exemplo, foi preparado um ARNt supressor que reconhecia o codão de terminação UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não natural. Foi utilizada mutagénese especifica de um lócus convencional para introduzir o codão de terminação TAG, no sitio de interesse no gene da proteína, ver, e.g., Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988). Quando o ARNt supressor acilado e o gene mutante foram combinados num sistema de transcrição/tradução in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao codão UAG que deu uma proteína que continha esse aminoácido na posição especificada. Experiências utilizando [3H]-Phe e experiências com a-hidroxiácidos demonstraram que apenas o aminoácido desejado é incorporado na posição especificada pelo codão UAG e que este aminoácido não é incorporado em qualquer outro sítio na proteína. Ver, e.g., Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432,- e Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).

Um ARNt pode ser aminoacilado com um aminoácido desejado por qualquer método ou técnica, incluindo, mas não se limitando a, aminoacilação química ou enzimática. A aminoacilação pode ser realizada por aminoacil-ARNt-sintetases ou por outras moléculas enzimáticas, incluindo, mas não se limitando a, ribozimas. 0 termo "ribozima" é intermutável com "ARN catalítico." Cech e colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demonstraram a presença de ARNs naturais que podem atuar como catalisadores (ribozimas). No entanto, embora se tivesse apenas demonstrado que estes catalisadores de ARN naturais atuam em substratos de ácido ribonucleico por dissociação e excisão-união, os desenvolvimentos recentes sobre a evolução artificial de ribozimas alargou o reportório de catálise a várias reações químicas. Estudos identificaram moléculas de ARN que podem catalisar ligações de aminoacil-ARN nas suas próprias extremidades (2')3'- (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647) e uma molécula de ARN que pode transferir um aminoácido de uma molécula de ARN para outra (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444). A Publicação de Pedido de Patente U.S. 2003/0228593, a qual é aqui incorporada por referência, descreve métodos para construir ribozimas e a sua utilização na aminoacilação de ARNts com aminoácidos codificados naturalmente e não codificados naturalmente. As formas imobilizadas em substratos de moléculas enzimáticas que possam aminoacilar ARNts, incluindo, mas não se limitando a, ribozimas, podem permitir a purificação por afinidade eficaz dos produtos aminoacilados. Os exemplos de substratos adequados incluem agarose, sepharose e esférulas magnéticas. A produção e a utilização de uma forma imobilizada em substrato de ribozima para aminoacilação são descritas em Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2003/0228593

Os métodos de aminoacilação química incluem, mas não se limitam a, aqueles introduzidos por Hecht e colaboradores (Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) e por Schultz, Chamberlin, Dougherty e outros (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, Μ. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), para evitar a utilização de sintetases na aminoacilação. Tais métodos ou outros métodos químicos de aminoacilação podem ser utilizados para aminoacilar moléculas de ARNt.

Os métodos para gerar ARN catalítico podem envolver a geração de agrupamentos separados de sequências de ribozimas aleatorizadas, a realização de evolução dirigida nos agrupamentos, a triagem dos agrupamentos para a atividade de aminoacilação desejada e a seleção de sequências daqueles ribozimas que exibem a atividade de aminoacilação desejada.

As ribozimas podem compreender motivos e/ou regiões que facilitam a atividade de acilação, tais como um motivo GGU e uma região rica em U. Por exemplo, foi reportado que as regiões ricas em U podem facilitar o reconhecimento de um substrato de aminoácido e um motivo GGU pode formar pares de bases com as extremidades 3' de um ARNt. Em combinação, o motivo GGU e a região rica em U facilitam o reconhecimento simultâneo tanto do aminoácido como do ARNt simultaneamente, e facilitam, desse modo, a aminoacilação da extremidade 3' do ARNt.

As ribozimas podem ser geradas por seleção in vitro utilizando um r24mini parcialmente aleatorizado conjugado com ARNtAsncccG, seguido de manipulação genética sistemática de uma sequência consenso que se encontra nos clones ativos. Uma ribozima ilustrativa obtida por este método é denominada "ribozima Fx3" e é descrita na Pub. de Pedido U.S. N.° 2003/0228593, atua como um catalisador versátil para a síntese de vários aminoacil-ARNts carregados com aminoácidos não naturais cognatos. A imobilização num substrato pode ser utilizada para permitir a purificação por afinidade eficaz dos ARNts aminoacilados. Os exemplos de substratos adequados incluem, mas não se limitam a, agarose, sepharose e esférulas magnéticas. As ribozimas podem ser imobilizadas sobre resinas tirando partido da estrutura química do ARN, tal como o 3'-cis-diol na ribose do ARN pode ser oxidado com periodato para produzir o dialdeído correspondente para facilitar a imobilização do ARN sobre a resina. Podem ser utilizados vários tipos de resinas incluindo resinas de hidrazida económicas em que a aminação redutiva torna a interação entre a resina e a ribozima uma ligação irreversível. A síntese de aminoacil-ARNts pode ser significativamente facilitada por esta técnica de aminoacilação na coluna. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 descreve um sistema de aminoacilação com base em colunas. O isolamento dos ARNts aminoacilados pode ser realizado de várias maneiras. Um método adequado consiste em eluir os ARNts aminoacilados de uma coluna com um tampão, tal como uma solução de acetato de sódio com EDTA 10 mM, um tampão que contém N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 3-propanossulf ónico) 50 mM, KC1 12,5 mM, pH 7,0, EDTA 10 mM ou, simplesmente, água tamponada com EDTA (pH 7,0) .

Os ARNts aminoacilados podem ser adicionados às reações de tradução a fim de incorporar o aminoácido com o qual o ARNt foi aminoacilado numa posição de eleição num polipéptido preparado pela reação de tradução. Os exemplos de sistemas de tradução em que os ARNts aminoacilados da presente invenção podem ser utilizados incluem, mas não se limitam aos lisados celulares. Os lisados celulares proporcionam os componentes reacionais necessários para a tradução in vitro de um polipéptido a partir de um ARNm de entrada. Os exemplos de tais componentes reacionais incluem, mas não se limitam a, proteínas ribossómicas, ARNr, aminoácidos, ARNts, GTP, ATP, fatores de iniciação da tradução e alongamento, e fatores adicionais associados à tradução. Além disso, os sistemas de tradução podem ser de tradução em lote ou tradução compartimentada. Os sistemas de tradução em lote combinam componentes reacionais num único compartimento, enquanto os sistemas de tradução compartimentada separam os componentes reacionais de tradução dos produtos de reação que podem inibir a eficiência da tradução. Tais sistemas de tradução estão comercialmente disponíveis.

Além disso, pode ser utilizado um sistema acoplado de transcrição/tradução. Os sistemas acoplados de transcrição/tradução permitem a transcrição de um ADN de entrada num ARNm correspondente, o qual é, por sua vez, traduzido pelos componentes reacionais. Um exemplo de um sistema acoplado de transcrição/tradução comercialmente disponível é o Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.). 0 sistema inclui uma mistura que contém um lisado de E. coli para proporcionar componentes de tradução tais como ribossomas e fatores de tradução. Além disso, é incluída uma ARN-polimerase para a transcrição do ADN de entrada numa cadeia molde de ARNm para utilização na tradução. 0 RTS pode utilizar a compartimentalização dos componentes reacionais por meio de uma membrana interposta entre os compartimentos reacionais, incluindo um compartimento de fornecimento/resíduos e um compartimento de transcrição/tradução. A aminoacilação de ARNt pode ser realizada por outros agentes, incluindo, mas não se limitando a, transferases, polimerases, anticorpos catalíticos, proteínas multifuncionais e semelhantes.

Stephan em Scientist 2005 Oct 10; páginas 30-33 descreve métodos adicionais para incorporar aminoácidos não codificados naturalmente em proteínas. Lu et al. em Mol Cell. 2001 Oct; 8 (4): 759-69 descrevem um método em que uma proteína é ligada quimicamente a um péptido sintético que contém aminoácidos não naturais (ligação de proteína expressada).

As técnicas de microinjeção foram também utilizadas para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas. Ver, e.g., M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, Μ. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); e, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000) . Um oócito de Xenopus foi coinjetado com duas espécies de ARN preparadas in vitro: um ARNm que codifica a proteína alvo com um codão de terminação UAG na posição do aminoácido de interesse e um ARNt supressor âmbar aminoacilado com o aminoácido não natural desejado. A maquinaria de tradução do oócito insere em seguida o aminoácido não natural na posição especificada pelo UAG. Este método permite estudos estrutura-função in vivo de proteínas da membrana integrais, as quais geralmente não são adequadas para sistemas de expressão in vitro. Os exemplos incluem a incorporação de um aminoácido fluorescente no recetor de neurocinina-2 taquicinina para medir distâncias através de transferência de energia por ressonância de fluorescência, ver, e.g., G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel e A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); a incorporação de aminoácidos biotinilados para identificar resíduos expostos na superfície em canais iónicos, ver, e.g., J. P. Gallivan, H. A. Lester e D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); a utilização de análogos de tirosina retidos para monitorizar alterações conformacionais num canal iónico em tempo real, ver, e.g., J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); e a utilização de alfa-hidroxiaminoácidos para mudar as estruturas dos canais iónicos para pesquisar os seus mecanismos de controlo. Ver, e.g., P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); e, T.

Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz e J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001). A capacidade para incorporar aminoácidos não naturais diretamente nas proteínas in vivo oferece um grande variedade de vantagens incluindo, mas não se limitando a, altos rendimentos de proteínas mutantes, facilidade técnica, o potencial para estudar as proteínas mutantes em células ou provavelmente em organismos vivos e a utilização destas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos e utilizações em diagnóstico. A capacidade para incluir aminoácidos não naturais com vários tamanhos, acidezes, nucleofilicidades, hidrofobicidades e outras propriedades em proteínas pode alargar muito a nossa capacidade para manipular racional e sistematicamente as estruturas de proteínas, tanto para pesquisar a função da proteína como para gerar novas proteínas ou organismos com novas propriedades.

Numa tentativa para incorporar de forma específica em relação ao sítio a para-F-Phe foi utilizado um par ARNtPheCUA supressor âmbar/fenilalanil-ARNt-sintetase de levedura numa estirpe Phe auxotrófica de Escherichia coli resistente a p-F-Phe. Ver, e.g., R. Furter, Protein Sei., 7:419 (1998).

Pode ser também possível que se obtenha a expressão de um polinucleótido de bG-CSF da presente invenção utilizando um sistema de tradução (in-vitro) sem células. Os sistemas de tradução podem ser celulares ou sem células, e podem ser procarióticos ou eucarióticos. Os sistemas de tradução celulares incluem, mas não se limitam a, preparações de células inteiras, tais como células permeabilizadas ou culturas de células em que uma sequência de ácido nucleico desejada pode ser transcrita em ARNm e o ARNm traduzido. Os sistemas de tradução sem células estão comercialmente disponíveis e são bem conhecidos muitos tipos e sistemas diferentes. Os exemplos de sistemas sem células incluem, mas não se limitam a, lisados procarióticos tais como lisados de Escherichia coli, e lisados eucarióticos tais como extratos de gérmen de trigo, lisados de células de insetos, lisados de reticulócitos de coelho, lisados de oócitos de coelho e lisados de células humanas. Os extratos ou lisados eucarióticos podem ser preferidos quando a proteína resultante está glicosilada, fosforilada ou modificada de outro modo, porque muitas dessas modificações são apenas possíveis em sistemas eucarióticos. Alguns destes extratos e lisados estão comercialmente disponíveis (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Estão também disponíveis extratos membranosos, tais como os extratos pancreáticos caninos que contêm membranas microssómicas, que são úteis para traduzir proteínas secretoras. Nestes sistemas, os quais podem incluir ARNm como uma cadeia molde (tradução in vitro) ou ADN como uma cadeia molde (transcrição e tradução in vitro combinadas) , a síntese in vitro é dirigida pelos ribossomas. Tem sido aplicado um esforço considerável ao desenvolvimento de sistemas de expressão de proteínas sem células. Ver, e.g., Kim, D.M. e J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001) ; Kim, D.M. e J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., e J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., e J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); e Patnaik, R. e J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente U.S. N.° 6,337,191; Publicação de Patente U.S. N.° 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785. Outra abordagem que pode ser aplicada à expressão de polipéptidos de bG-CSF que compreendem um aminoácido não codificado naturalmente inclui a técnica de fusão ARNm-péptido. Ver, e.g., R. Roberts e J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sei. (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry and Biology 10:1043-1050 (2003). Nesta abordagem, uma cadeia molde de ARNm ligada a puromicina é traduzida num péptido no ribossoma. Se tiverem sido modificadas uma ou mais moléculas de ARNt, os aminoácidos não naturais podem ser também incorporadas no péptido. Depois de o último codão de ARNm ter sido lido, a puromicina captura a extremidade C-terminal do péptido. Se se constatar que o conjugado ARNm-pépt ido resultante tem propriedades interessantes num ensaio in vitro, a sua identidade pode ser facilmente revelada a partir da sequência de ARNm. Desta maneira, pode-se pesquisar bibliotecas de polipéptidos de bG-CSF que compreendem um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente para identificar polipéptidos que têm propriedades desejadas. Mais recentemente, foram reportadas traduções em ribossomas in vitro com componentes purificados que permitem a síntese de péptidos substituídos com aminoácidos não codificados naturalmente. Ver, e.g., A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sei. (USA) 100:6353 (2003) .

Podem ser também utilizados sistemas de tradução reconstituídos. Foram também utilizadas com sucesso misturas de fatores de tradução purificados para traduzir ARNm numa proteína, assim como combinações de lisados ou lisados suplementados com fatores de tradução purificados, tais como o fator de iniciação-1 (IF-1), IF-2, IF-3 (a ou β) , fator de alongamento T (EF-Tu) ou fatores de terminação. Os sistemas sem células podem ser também sistemas acoplados de transcrição/tradução em que o ADN é introduzido no sistema, transcrito em ARNm e o ARNm traduzido como descrito em Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editores, Wiley Interscience, 1993). O transcrito de ARN no sistema de transcrição eucariótico pode estar na forma de ARN heteronuclear (ARNhn) ou ARNm maduro terminado com proteções 5' (7-metil-guanosina) e poli A na extremidade 3', o qual pode ser uma vantagem em certos sistemas de tradução. Por exemplo, ARNms de extremidade protegida são traduzidos com alta eficiência no sistema de lisado de reticulócitos.

IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos de bG-CSF

Podem ser efetuadas várias modificações aos polipéptidos de aminoácidos não naturais aqui descritos utilizando as composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas. Estas modificações incluem a incorporação de funcionalidade adicional no aminoácido não natural constituinte do polipéptido, incluindo, mas não se limitando a, hidroxialquilamido (HAS), hidroxietilamido (HES); uma etiqueta; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; um fotorreticulante; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; uma etiqueta de afinidade; uma etiqueta de fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipéptido ou análogo de polipéptido; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metais; um cofator; um ácido gordo; um hidrato de carbono; um polinucleótido; um ADN; um ARN; um polinucleótido antissentido; um sacárido; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucleico inibidor; um biomaterial; uma nanopartícula; uma etiqueta de spin; um fluoróforo, uma unidade que contém metal; uma unidade radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas; uma unidade fotoativável; uma unidade excitável por radiação actínica; uma unidade fotoisomerizável; biotina; um derivado de biotina; um análogo de biotina; uma unidade que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente dissociável; um grupo fotodissociável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente ativo redox; um aminotioácido; uma unidade tóxica; uma unidade marcada isotopicamente; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo denso em eletrões; um grupo magnético; um grupo intercalante; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; uma etiqueta detetável; uma molécula pequena; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleótido; um radiotransmissor; um agente de captura de neutrões; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. Como um exemplo ilustrativo, não limitativo das composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas, a descrição que se segue focar-se-á na adição de polímeros macromoleculares ao polipéptido de aminoácido não natural com o entendimento de que as composições, métodos, técnicas e estratégias descritas para esse fim são também aplicáveis (com modificações apropriadas, se for necessário, e as quais um especialista na técnica pode preparar com as divulgações neste documento) à adição de outras funcionalidades, incluindo, mas não se limitando àquelas listadas acima.

Um grande variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas pode ser ligada aos polipéptidos de bG-CSF da presente invenção para modular as propriedades biológicas do polipéptido de bG-CSF e/ou proporcionar novas propriedades biológicas à molécula de bG-CSF. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipéptido de bG-CSF através de um aminoácido codificado naturalmente, através de um aminoácido não codificado naturalmente, ou qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou não natural, ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não natural. 0 peso molecular do polímero pode ser de uma grande gama, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100 000 Da, 95 000 Da, 90 000 Da, 85 000 Da, 80 000 Da, 75 000 Da, 70 000 Da, 65 000 Da, 60 000 Da, 55 000 Da, 50 000 Da, 45 000 Da, 40 000 Da, 35 000 Da, 30 000 Da, 25 000 Da, 20 000 Da, 15 000 Da, 10 000 Da, 9 000 Da, 8 000 Da, 7 000 Da, 6 000 Da, 5 000 Da, 4 000 Da, 3 000 Da, 2 000 Da, 1 000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 50 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 1 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 5 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do polímero é entre cerca de 10 000 Da e cerca de 40 000 Da. A presente invenção proporciona preparações substancialmente homogéneas de conjugados polímero:proteína. "Substancialmente homogénea" como aqui utilizado significa que se verifica que as moléculas de conjugado de polímero:proteína constituem mais de metade da proteína total. 0 conjugado de polímero:proteína tem atividade biológica e as presentes preparações de polipéptido de bG-CSF PEGuilado "substancialmente homogéneas" aqui proporcionadas são aquelas que são suficientemente homogéneas para apresentar as vantagens de uma preparação homogénea, e.g., facilidade na aplicação clínica na previsibilidade da farmacocinética de lote para lote.

Pode também escolher-se a preparação de uma mistura de moléculas de conjugado de polímero:proteína e a vantagem aqui proporcionada é a de se poder selecionar a proporção de conjugado de mono-polímero:proteína a incluir na mistura. Assim, caso se pretenda, pode preparar-se uma mistura de várias proteínas com vários números de unidades de polímeros ligadas (i.e., di-, tri-, tetra-, etc.) e combinar os referidos conjugados com o conjugado de mono-polímero :proteína preparado utilizando os métodos da presente invenção, e ter uma mistura com uma proporção predeterminada de conjugados de mono-polímero:proteína. 0 polímero selecionado pode ser solúvel em água para que a proteína ao qual está ligado não precipite num meio aquoso, tal como um meio fisiológico. 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para utilização terapêutica da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

Os exemplos de polímeros incluem mas não estão limitados a éteres de polialquilo e análogos terminados com alcoxilo dos mesmos (e.g., polioxietileno glicol, polioxietileno/propileno glicol, e análogos terminados com metoxilo ou etoxilo dos mesmos, em especial polioxietileno glicol, o último é também conhecido como polietileno glicol ou PEG); polivinilpirrolidonas; éteres de polivinilalquilo; polioxazolinas, polialquiloxazolinas e poli-hidroxialquiloxazolinas; poliacrilamidas, polialquilacrilamidas e poli-hidroxialquiacrilamidas (e.g., poli-hidroxipropilmetacrilamida e seus derivados); poli-hidroxialquilacrilatos; poli(ácidos siálicos) e análogos dos mesmos; sequências peptídicas hidrófilas; polissacáridos e seus derivados, incluindo dextrano e derivados de dextrano, e.g., carboximetildextrano, sulfatos de dextrano, aminodextrano; celulose e seus derivados, e.g., carboximetilcelulose, hidroxialquilceluloses; quitina e seus derivados, e.g., quitosano, succinilquitosano, carboximetilquitina, carboximetilquitosano; ácido hialurónico e seus derivados; amidos; alginatos; sulfato de condroitina; albumina; pululano e carboximetilpululano; poliaminoácidos e seus derivados, e.g., poli(ácidos glutâmicos), polilisinas, poli(ácidos aspárticos), poliaspartamidas; copolímeros de anidrido maleico tais como: copolímero de estireno-anidrido maleico, copolímero de éter diviniletílico-anidrido maleico; poli(álcoois vinílicos); copolímeros dos mesmos; terpolímeros dos mesmos; misturas dos mesmos; hidroxialquilamido (HAS), incluindo, mas não se limitando a, hidroxietilamido (HES); e derivados dos anteriores. A proporção de moléculas de polietileno glicol para moléculas de proteína variará, assim como as suas concentrações na mistura reacional. Em geral, a proporção ótima (em termos de eficiência de reação para que exista um excesso mínimo de proteína ou polímero por reagir) pode ser determinada pelo peso molecular do polietileno glicol selecionado e pelo número de grupos reativos disponíveis. No que se refere ao peso molecular, tipicamente quanto mais alto o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas de polímero que podem ser ligadas à proteína. De forma semelhante, a ramificação do polímero deve ser tida em consideração quando se otimiza estes parâmetros. Em geral, quanto maior o peso molecular (ou quanto mais ramificações), mais alta a proporção de polímero:proteína.

Como aqui utilizado, e quando se considera os conjugados de PEG:polipéptido de bG-CSF, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que dá o benefício desejado a um animal. A quantidade variará de um indivíduo para outro e dependerá de um número de fatores, incluindo a condição física global do doente e a causa subjacente à condição a ser tratada. A quantidade de polipéptido de bG-CSF utilizada para terapia dá uma taxa aceitável de alteração e mantém a resposta desejada a um nível benéfico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente apurada por um especialista com conhecimentos médios na matéria utilizando materiais e procedimentos disponíveis publicamente. 0 polímero solúvel em água pode ter qualquer forma estrutural incluindo, mas não se limitando a linear, bifurcado ou ramificado. Tipicamente, o polímero solúvel em água é um poli(alquileno glicol), tal como poli(etileno glicol) (PEG), mas podem ser também utilizados outros polímeros solúveis em água. A título de exemplo, o PEG é utilizado para descrever certas formas de realização desta invenção. 0 PEG é um polímero solúvel em água, bem conhecido que está comercialmente disponível ou pode ser preparado através de polimerização por abertura do anel de etileno glicol de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria (Sandler e Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161) . 0 termo "PEG" é utilizado de forma ampla para abranger qualquer molécula de polietileno glicol, independentemente do tamanho ou modificação numa extremidade do PEG, e pode ser representado como ligado ao polipéptido de bG-CSF pela fórmula:

XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y em que n é 2 a 10 000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo, mas não se limitando a, um alquilo Ci-4, um grupo de proteção, ou um grupo funcional terminal.

Nalguns casos, um PEG utilizado na invenção termina numa extremidade com hidroxilo ou metoxilo, i.e., X é H ou CH3 ("metoxilo PEG") . Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, formando desse modo um polímero bifuncional. Os grupos reativos típicos podem incluir aqueles grupos reativos que são comummente utilizados para reagir com os grupos funcionais que se encontram nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando a, grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não se limitando a, éster de p-nitrofenilo), ésteres ativados (incluindo, mas não se limitando a, N-hidroxissuccinimida, éster de p-nitrofenilo) e aldeídos) assim como grupos funcionais que são inertes para os 20 aminoácidos comuns, mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes nos aminoácidos não codificados naturalmente (incluindo, mas não se limitando a, grupos azida, grupos alcino). Assinale-se que a outra extremidade do PEG, a qual se mostra na fórmula acima por Y, ligar-se-á direta ou indiretamente a um polipéptido de bG-CSF através de um aminoácido natural ou não codificado naturalmente. Por exemplo, Y pode ser uma ligação amida, carbamato ou ureia a um grupo amina (incluindo, mas não se limitando a, a amina épsilon da lisina ou a extremidade N-terminal) do polipéptido. Alternativamente, Y pode ser uma ligação maleimida a um grupo tiol (incluindo, mas não se limitando a, o grupo tiol de cisteina). Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comummente acessível através dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser feito reagir com um grupo alcino no polipéptido de bG-CSF para formar um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen. Alternativamente, um grupo alcino no PEG pode ser feito reagir com um grupo azida presente num aminoácido não codificado naturalmente para formar um produto semelhante. Nalgumas formas de realização, um nucleófilo forte (incluindo, mas não se limitando a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser feito reagir com um grupo aldeído ou cetona presente num aminoácido não codificado naturalmente para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, consoante aplicável, a qual, nalguns casos, pode ser adicionalmente reduzida por tratamento com um agente de redução apropriado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipéptido de bG-CSF através de um aminoácido não codificado naturalmente e utilizado para reagir preferencialmente com um grupo cetona ou aldeído presente no polímero solúvel em água.

Pode ser utilizada qualquer massa molecular para um PEG, consoante desejado em termos práticos, incluindo, mas não se limitando a, desde cerca de 100 Daltons (Da) a 100 000 Da ou mais, consoante desejado (incluindo, mas não se limitando a, por vezes 0,1-50 kDa ou 10-40 kDa). O peso molecular do PEG pode ser de uma grande gama, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da ou mais. O PEG pode ter entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100 000 Da, 95 000 Da, 90 000 Da, 85 000 Da, 80 000 Da, 75 000 Da, 70 000 Da, 65 000 Da, 60 000 Da, 55 000 Da, 50 000 Da, 45 000 Da, 40 000 Da, 35 000 Da, 30 000 Da, 25 000 Da, 20 000 Da, 15 000 Da, 10 000 Da, 9 000 Da, 8 000

Da, 7 000 Da, 6 000 Da, 5 000 Da, 4 000 Da, 3 000 Da, 2 000

Da, 1 000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400

Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Nalgumas formas de realização, o PEG tem entre cerca de 100 Da e cerca de 50 000 Da. Nalgumas formas de realização, o PEG tem entre cerca de 100 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o PEG tem entre cerca de 1 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o PEG tem entre cerca de 5 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o PEG tem entre cerca de 10 000 Da e cerca de 40 000 Da. Podem ser também utilizados PEGs de cadeia ramificada, incluindo, mas não se limitando a, moléculas de PEG possuindo cada cadeia um PM que varia de 1-100 kDa (incluindo, mas não se limitando a, 1-50 kDa ou 5-20 kDa) . O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode situar-se, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 1 000 Da e cerca de 100 000 Da ou mais. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode situar-se entre cerca de 1 000 Da e cerca de 100 000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100 000 Da, 95 000 Da, 90 000 Da, 85 000 Da, 80 000 Da, 75 000 Da, 70 000 Da, 65 000 Da, 60 000 Da, 55 000 Da, 50 000 Da, 45 000 Da, 40 000 Da, 35 000 Da, 30 000 Da, 25 000 Da, 20 000 Da, 15 000 Da, 10 000 Da, 9 000 Da, 8 000 Da, 7 000 Da, 6 000 Da, 5 000 Da, 4 000 Da, 3 000 Da, 2 000 Da, e 1 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada situa-se entre cerca de 1 000 Da e cerca de 50 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada situa-se entre cerca de 1 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada situa-se entre cerca de 5 000 Da e cerca de 4 0 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada situa-se entre cerca de 5 000 Da e cerca de 20 000 Da. Uma grande gama de moléculas de PEG é descrita no, incluindo, mas não se limitando a, catálogo da Shearwater Polymers, Inc., catálogo da Nektar Therapeutics.

Em geral, pelo menos uma extremidade da molécula de PEG está disponível para reação com o aminoácido não codificado naturalmente. Por exemplo, os derivados de PEG portadores de unidades alcino e azida para reação com cadeias laterais de aminoácidos podem ser utilizados para ligar o PEG a aminoácidos não codificados naturalmente, como aqui descrito. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreende uma azida, então o PEG conterá tipicamente uma unidade alcino para efetuar a formação do produto de cicloadição [3+2] ou uma espécie de PEG ativada (i.e., éster, carbonato) que contém um grupo fosfina para efetuar a formação da ligação amida. Alternativamente, se o aminoácido não codificado naturalmente compreende um alcino, então o PEG conterá tipicamente uma unidade azida para efetuar a formação do produto de cicloadição [3+2] de Huisgen. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonilo, o PEG compreenderá tipicamente um nucleófilo potente (incluindo, mas não se limitando a, uma funcionalidade hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida) a fim de efetuar a formação das ligações hidrazona, oxima e semicarbazona correspondentes, respetivamente. Noutras alternativas, pode ser utilizada uma orientação contrária dos grupos reativos descritos acima, i.e., uma unidade azida no aminoácido não codificado naturalmente pode ser feita reagir com um derivado de PEG que contém um alcino.

Nalgumas formas de realização, a variante do polipéptido de bG-CSF com um derivado de PEG contém uma funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente.

Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona derivados de polímeros que contêm azida e acetileno que compreendem um esqueleto de um polímero solúvel em água que tem um peso molecular médio desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da. O esqueleto polimérico do polímero solúvel em água pode ser poli(etileno glicol). No entanto, deve ser entendido que uma grande variedade de polímeros solúveis em água, incluindo, mas não se limitando a, poli(etileno)glicol e outros polímeros relacionados, incluindo poli(dextrano) e poli(propileno glicol), é também adequada para utilização na prática desta invenção e que a utilização do termo PEG ou poli(etileno glicol) destina-se a abranger e incluir todas essas moléculas. 0 termo PEG inclui, mas não se limita a, poli(etileno glicol) em qualquer uma das suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG com múltiplos braços, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (i.e. PEG ou polímeros relacionados que têm um ou mais grupos funcionais pendentes do esqueleto do polímero), ou PEG com ligações degradáveis no mesmo. 0 PEG é tipicamente transparente, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não hidrolisa ou deteriora, e é geralmente não tóxico. 0 poli(etileno glicol) é considerado como sendo biocompatível, o que quer dizer que o PEG é capaz de coexistência com tecidos ou organismos vivos sem lhes provocar dano. Mais especificamente, o PEG é substancialmente não imunogénico, o que quer dizer que o PEG não tem tendência a produzir uma resposta imunológica no corpo. Quando ligado a uma molécula que tem alguma função desejável no corpo, tal como um agente biologicamente ativo, o PEG tem tendência a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imunológica para que um organismo possa tolerar a presença do agente. Os conjugados de PEG não têm tendência a produzir uma resposta imunológica substancial ou a provocar coagulação ou outros efeitos indesejáveis. 0 PEG que tem a fórmula --CH2CH2O-- (CH2CH2O) n--CH2CH2--, em que n é desde cerca de 3 a cerca de 4000, tipicamente desde cerca de 20 a cerca de 2000, é adequado para utilização na presente invenção. Nalgumas formas de realização da presente invenção, o PEG que tem um peso molecular desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da é particularmente útil como o esqueleto do polímero. O peso molecular do PEG pode ser de uma grande gama, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da ou mais. O peso molecular do PEG pode situar-se entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100 000 Da, 95 000 Da, 90 000 Da, 85 000 Da, 80 000 Da, 75 000 Da, 70 000 Da, 65 000 Da, 60 000 Da, 55 000 Da, 50 000 Da, 45 000 Da, 40 000 Da, 35 000 Da, 30 000 Da, 25 000 Da, 20 000 Da, 15 000 Da, 10 000 Da, 9 000 Da, 8 000

Da, 7 000 Da, 6 000 Da, 5 000 Da, 4 000 Da, 3 000 Da, 2 000

Da, 1 000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do PEG situa-se entre cerca de 100 Da e cerca de 50 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do PEG situa-se entre cerca de 100 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do PEG situa-se entre cerca de 1 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do PEG situa-se entre cerca de 5 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular do PEG situa-se entre cerca de 10 000 Da e cerca de 40 000 Da. 0 esqueleto do polímero pode ser linear ou ramificado. Os esqueletos de polímeros ramificados são geralmente conhecidos na técnica. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma unidade nuclear ramificada central e uma multiplicidade de cadeias de polímero linear ligadas ao núcleo ramificado central. 0 PEG é comummente utilizado em formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A unidade ramificada central pode ser também derivada de vários aminoácidos, tais como lisina. 0 poli(etileno glicol) ramificado pode ser representado na forma geral como R (-PEG-OH) m em que R é derivado de uma unidade nuclear, tal como glicerol, oligómeros de glicerol ou pentaeritritol, e m representa o número de ramos. As moléculas de PEG com múltiplos braços, tais como aquelas descritas em Pat. U.S. N.° 5,932,462; 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Pedido Pat. U.S. 2003/0143596; WO 96/21469; e WO 93/21259 podem ser também utilizadas como o esqueleto do polímero. O PEG ramificado pode estar também na forma de um PEG bifurcado representado pela PEG (-YCHZ2) n, em que Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.

Ainda noutra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reativos, tais como carboxilo, junto do esqueleto de PEG em vez da extremidade das cadeias de PEG.

Além destas formas de PEG, o polimero pode ser também preparado com ligações fracas ou degradáveis no esqueleto. Por exemplo, o PEG pode ser preparado com ligações éster no esqueleto do polimero que são sujeitas a hidrólise. Como se mostra abaixo, esta hidrólise resulta na dissociação do polímero em fragmentos de menor peso molecular: -PEG-CO2-PEG-+H2O - PEG-CO2H+HO-PEG- É entendido pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria que o termo poli(etileno glicol) ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na técnica incluindo, mas não se limitando àquelas aqui divulgadas.

Muitos outros polímeros são também adequados para utilização na presente invenção. Nalgumas formas de realização, os esqueletos de polímeros que são solúveis em água, com desde 2 a cerca de 300 extremidades, são particularmente úteis na invenção. Os exemplos de polímeros adequados incluem, mas não se limitam a, outros poli(alquileno glicóis), tais como poli(propileno glicol) ("PPG"), copolímeros do mesmo (incluindo, mas não se limitando a copolímeros de etileno glicol e propileno glicol), terpolímeros dos mesmos, misturas dos mesmos, e semelhantes. Embora o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero possa variar, situa-se tipicamente na gama desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da, frequentemente desde cerca de 6 000 Da a cerca de 80 000 Da. O peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero pode situar-se entre cerca de 100 Da e cerca de 100 000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100 000 Da, 95 000 Da, 90 000 Da, 85 000 Da, 80 000 Da, 75 000 Da, 70 000 Da, 65 000 Da, 60 000 Da, 55 000 Da, 50 000 Da, 45 000 Da, 40 000 Da, 35 000 Da, 30 000 Da, 25 000 Da, 20 000 Da, 15 000 Da, 10 000 Da, 9 000 Da, 8 000 Da, 7 000 Da, 6 000 Da, 5 000 Da, 4 000 Da, 3 000 Da, 2 000 Da, 1 000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero situa-se entre cerca de 100 Da e cerca de 50 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero situa-se entre cerca de 100 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero situa-se entre cerca de 1 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero situa-se entre cerca de 5 000 Da e cerca de 40 000 Da. Nalgumas formas de realização, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero situa-se entre cerca de 10 000 Da e cerca de 40 000 Da.

Os especialistas com conhecimentos médios na matéria reconhecerão que a lista anterior de esqueletos substancialmente solúveis em água é, em hipótese alguma, exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos que têm as qualidades descritas acima são considerados como sendo adequados para utilização na presente invenção.

Nalgumas formas de realização da presente invenção os derivados de polímeros são "multifuncionais", o que significa que o esqueleto do polímero tem pelo menos duas extremidades, e possivelmente tantas quantas cerca de 300 extremidades, funcionalizadas ou ativadas com um grupo funcional. Os derivados de polímeros multifuncionais incluem, mas não se limitam a, polímeros lineares que têm duas extremidades, estando cada extremidade ligada a um grupo funcional que pode ser igual ou diferente.

Numa forma de realização, o polímero derivado tem a estrutura:

em que: N=N=N é uma unidade azida; B é uma unidade de ligação, a qual pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigénico solúvel em água; A é uma unidade de ligação, a qual pode estar presente ou ausente e que pode ser a mesma que B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.

Os exemplos de uma unidade de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo alquilo multifuncionalizado que contém até 18, e pode conter entre 1-10 átomos de carbono. Um heteroátomo tal como azoto, oxigénio ou enxofre pode ser incluído na cadeia alquilo. A cadeia alquilo pode estar também ramificada num heteroátomo. Outros exemplos de uma unidade de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo arilo multifuncionalizado, que contém até 10 e pode conter 5-6 átomos de carbono. 0 grupo arilo pode estar substituído com um mais átomos de carbono, átomos de azoto, oxigénio ou enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos em Pat. U.S. N.° 5,932,462; 5,643,575; e Publicação de Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596. Os especialistas com conhecimentos médios na matéria reconhecerão que a lista anterior para ligar unidades é, em hipótese alguma, exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todas as unidades de ligação que têm as qualidades descritas acima são consideradas como sendo adequadas para utilização na presente invenção.

Os exemplos de grupos funcionais adequados para serem utilizados como X incluem, mas não se limitam a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster ativo, tal como ésteres de N-hidroxissuccinimidilo e ésteres de 1-benzotriazolilo, carbonato ativo, tal como carbonatos de N-hidroxissuccinimidilo e carbonatos de 1-benzotriazolilo, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alcenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxilo, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxilico, ácido carboxilico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona e azida. Como é entendido pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, a unidade X selecionada deve ser compatível com o grupo azida para que a reação com o grupo azida não ocorra. Os derivados de polímeros que contêm azida podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (i.e., X) é também uma unidade azida, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente. 0 termo "protegido" refere-se à presença de um grupo de proteção ou unidade que impede a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições reacionais. 0 grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo que é protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo de proteção pode ser o dissulfureto de ortopiridilo. Se o grupo quimicamente reativo é um ácido carboxilico, tal como ácido butanoico ou propiónico, ou um grupo hidroxilo, o grupo de proteção pode ser benzilo ou um grupo alquilo tal como metilo, etilo ou terc-butilo. Na presente invenção podem ser também utilizados outros grupos de proteção conhecidos na técnica.

Os exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não se limitam a, carbonato de N-succinimidilo (ver e.g., Pat. U.S. N.° 5, 281, 698, 5, 468,478), amina (ver, e.g., Buckmann et al.

Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Ver, e.g., Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionato de succinimidilo e butanoato de succinimidilo (ver, e.g., Olson et al. em Poly(ethylene glycol) Chemistry &

Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; ver também Pat. U.S. N.° 5,672,662), succinato de succinimidilo (Ver, e.g.,

Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e

Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), éster de succinimidilo (ver, e.g., Pat. U.S. N.° 4,670,417), carbonato de benzotriazole (ver, e.g., Pat. U.S. N.° 5,650,234), éter de glicidilo (ver, e.g., Pitha et al. Eur. J Biochem. 94 : 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl.

Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazole (ver, e.g.,

Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (ver, e.g., Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem.

Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (ver, e.g., Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Pat. U.S. N.° 5,824,784, Pat. U.S. N.° 5,252,714), maleimida (ver, e.g.,

Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. em Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), e

Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), dissulfureto de ortopiridilo (ver, e.g., Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (ver, e.g., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver, e.g.,

Pat. U.S. N.° 5, 900,461) .

Em certas formas de realização da presente invenção, os derivados de polímeros da invenção compreendem um esqueleto de polímero que tem a estrutura:

em que: X é um grupo funcional como descrito acima; e n é de cerca de 20 a cerca de 4000.

Noutra forma de realização, os derivados de polímero da invenção compreendem um esqueleto de polímero que tem a estrutura:

em que: W é uma unidade de ligação alifática ou aromática que compreende entre 1-10 átomos de carbono; n é de cerca de 20 a cerca de 4000; e X é um grupo funcional como descrito acima, m é entre 1 e 10.

Os derivados de PEG que contêm azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e/ou aqui divulgados. Num método, apresentado abaixo, um esqueleto de um polímero solúvel em água que tem um peso molecular médio desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da, possuindo o esqueleto do polímero uma primeira extremidade ligada a um primeiro grupo funcional e uma segunda extremidade ligada a um grupo de saída adequado, é feito reagir com um anião azida (que pode ser emparelhado com qualquer um de um número de contraiões adequados, que incluem sódio, potássio, terc-butilamónio e outros mais). O grupo de saída sofre uma substituição nucleófila e é substituído pela unidade azida, proporcionando o polímero de PEG que contém azida desejado.

Como se mostra, um esqueleto de polímero adequado para ser utilizado na presente invenção tem a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli (etileno glicol) e X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado. Os exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não se limitam a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alcenilo, amina, aminooxilo, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina e vinilpiridina, e cetona. Os exemplos de grupos de sarda adequados incluem, mas não se limitam a, cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato.

Noutro método para a preparação de derivados de polímeros que contêm azida da presente invenção, um agente de ligação portador de uma funcionalidade azida é posto em contacto com um esqueleto de um polímero solúvel em água que tem um peso molecular médio desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da, em que o agente de ligação é portador de uma funcionalidade química que reagirá seletivamente com uma funcionalidade química no polímero de PEG, para formar um produto derivado de um polímero que contém azida em que a azida está separada do esqueleto do polímero por um grupo de ligação.

Um esquema reacional ilustrativo é apresentado a seguir:

X-PEG-M + N-unidade de ligação-N=N=N -> PG-X-PEG-unidade de ligação-N=N=N em que: PEG é poli(etileno glicol) e X é um grupo de terminação tal como alcoxilo ou um grupo funcional como descrito acima; e M é um grupo funcional que não é reativo com a funcionalidade azida mas que reagirá eficaz e seletivamente com o grupo funcional N.

Os exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não se limitam a, em que M é um ácido carboxilico, carbonato ou éster ativo, se N é uma amina; em que M é uma cetona, se N é uma hidrazida ou unidade aminooxilo; em que M é um grupo de saída, se N é um nucleófilo. A purificação do produto em bruto pode ser realizada por métodos conhecidos que incluem, mas não se limitam a, precipitação do produto, seguido de cromatografia, se for necessário.

Um exemplo mais específico é apresentado abaixo no caso de PEG diamina, em que uma das aminas está protegida com uma unidade de grupo de proteção tal como terc-butil-Boc e a PEG diamina monoprotegida resultante é feita reagir com uma unidade de ligação que é portadora da funcionalidade azida: bochn-peg-nh2 + HO2C- (ch2) 3-n=n=n

Neste caso, o grupo amina pode ser acoplado ao grupo ácido carboxilico utilizando uma variedade de agentes de ativação tais como cloreto de tionilo ou reagentes de carbodiimida e N-hidroxissuccinimida ou N- hidroxibenzotriazole para criar uma ligação amida entre o derivado de PEG monoamina e a unidade de ligação portadora de azida. Após formação de ligação amida bem-sucedida, o derivado que contém azida protegida com N-terc-butil-Boc resultante pode ser utilizado diretamente para modificar moléculas bioativas ou pode ser adicionalmente elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser hidrolisado por tratamento com ácido forte para gerar uma omega-amino-PEG-azida. A amina resultante pode ser utilizada como uma alavanca sintética para instalar outra funcionalidade útil, tal como grupos maleimida, dissulfuretos ativados, ésteres ativados e outros para a criação de reagentes heterobifuncionais valiosos.

Os derivados heterobifuncionais são particularmente úteis quando se deseja ligar moléculas diferentes a cada uma das extremidades do polímero. Por exemplo, o omega-N-amino-N-azido-PEG permitiria a ligação de uma molécula que tem um grupo eletrófilo ativado, tal como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e outros mais, a uma extremidade do PEG e uma molécula que tem um grupo acetileno a outra extremidade do PEG.

Noutra forma de realização da invenção, o derivado de polímero tem a estrutura:

em que: R pode ser H ou um grupo alquilo, alceno, alquiloxilo ou arilo ou arilo substituído; B é uma unidade de ligação, a qual pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigénico solúvel em água; A é uma unidade de ligação, a qual pode estar presente ou ausente e que pode ser igual a B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.

Os exemplos de uma unidade de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo alquilo multifuncionalizado que contém até 18, e pode conter entre 1-10, átomos de carbono. Um heteroátomo tal como azoto, oxigénio ou enxofre pode ser incluído na cadeia alquilo. A cadeia alquilo pode ser também ramificada num heteroátomo. Outros exemplos de uma unidade de ligação para A e B incluem, mas não se limitam a, um grupo arilo multifuncionalizado, que contém até 10 e pode conter 5-6 átomos de carbono. 0 grupo arilo pode estar substituído com um mais átomos de carbono, átomos de azoto, oxigénio ou enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem os grupos de ligação descritos nas Pat. U.S. N.° 5,932,462 e 5,643,575 e Publicação de Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596. Os especialistas com conhecimentos médios na matéria reconhecerão que a lista anterior de unidades de ligação é, em hipótese alguma, exaustiva e destina-se a ser meramente ilustrativa, e que se considera que uma grande variedade de unidades de ligação que têm as qualidades descritas acima é útil na presente invenção.

Os exemplos de grupos funcionais adequados para serem utilizados como X incluem hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster ativo, tal como ésteres de N-hidroxissuccinimidilo e ésteres de 1-benzotriazolilo, carbonato ativo, tal como carbonatos de N-hidroxissuccinimidilo e carbonatos de 1-benzotriazolilo, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alcenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxilo, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno, cetona, e acetileno. Como se entenderia, a unidade X selecionada deve ser compatível com o grupo acetileno para que não ocorra reação com o grupo acetileno. Os derivados de polímeros que contêm acetileno podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (i.e., X) é também uma unidade acetileno, ou heterobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

Noutra forma de realização da presente invenção, os derivados de polímeros compreendem um esqueleto de polímero que tem a estrutura:

em que: X é um grupo funcional como descrito acima; n é de cerca de 20 a cerca de 4000; e m é entre 1 e 10.

Os exemplos específicos de cada um dos polímeros de PEG heterobifuncionais são apresentados a seguir.

Os derivados de PEG que contêm acetileno da invenção podem ser preparados utilizando métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e/ou aqui divulgados. Num método, um esqueleto de um polímero solúvel em água que tem um peso molecular médio desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da, possuindo o esqueleto do polímero uma primeira extremidade ligada a um primeiro grupo funcional e uma segunda extremidade ligada a um grupo nucleófilo adequado, é feito reagir com um composto que é portador tanto de uma funcionalidade acetileno como de um grupo de saída que é adequado para reação com o grupo nucleófilo sobre o PEG. Quando o polímero de PEG que tem a unidade nucleófila e a molécula portadora do grupo de saída são combinados, o grupo de saída sofre uma substituição nucleófila e é substituído pela unidade nucleófila, proporcionando o polímero que contém acetileno desejado.

Como se mostra, um esqueleto de polímero preferido para ser utilizado na reação tem a fórmula X-PEG-Nu, em que PEG é poli (etileno glicol) , Nu é uma unidade nucleófila e X é um grupo funcional que não reage com Nu, L ou a funcionalidade acetileno.

Os exemplos de Nu incluem, mas não se limitam a, grupos amina, alcoxilo, ariloxilo, sulfidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxilo que reagem principalmente através de um mecanismo tipo SN2. Os exemplos adicionais de grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que reagem principalmente através de uma reação de adição nucleófila. Os exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato e outros grupos que se espera que sofram substituição nucleófila, assim como cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos carbonilo alfa-beta insaturados, carbonatos e outros grupos eletrófilos que se espera que sofram adição por nucleófilos.

Noutra forma de realização da presente invenção, A é uma unidade de ligação alifática de entre 1-10 átomos de carbono ou um anel arilo substituído de entre 6-14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado

Noutro método para a preparação dos derivados de polímeros que contêm acetileno da invenção, um polímero de PEG que tem um peso molecular médio desde cerca de 800 Da a cerca de 100 000 Da, portador de um grupo funcional protegido ou um agente de terminação numa extremidade e um grupo de saída adequado na outra extremidade é posto em contacto com um anião acetileno.

Um esquema reacional ilustrativo é apresentado a seguir:

em que: PEG é poli (etileno glicol) e X é um grupo de terminação tal como alcoxilo ou um grupo funcional como descrito acima; e R' é H, um grupo alquilo, alcoxilo, arilo ou ariloxilo ou um grupo alquilo, alcoxilo, arilo ou ariloxilo substituído.

No exemplo anterior, o grupo de saída L deve ser suficientemente reativo para sofrer substituição tipo SN2 quando posto em contacto com uma concentração suficiente do anião acetileno. As condições reacionais necessárias para realizar a substituição SN2 de grupos de saída por aniões acetileno são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. A purificação do produto em bruto pode ser geralmente realizada por métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, precipitação do produto, seguido de cromatografia, se for necessário.

Podem ser ligados polímeros solúveis em água aos polipéptidos de bG-CSF da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados através de um aminoácido não codificado naturalmente incorporado no polipéptido de bG-CSF ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido não codificado naturalmente ou codificado naturalmente, ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido não codificado naturalmente ou codificado naturalmente. Alternativamente, os polímeros solúveis em água são ligados a um polipéptido de bG-CSF que incorpora um aminoácido não codificado naturalmente através de um aminoácido natural (incluindo, mas não se limitando a, cisteína, lisina ou o grupo amina do resíduo N-terminal). Nalguns casos, os polipéptidos de bG-CSF da invenção compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos não naturais, em que um ou mais aminoácido(s) não codificado (s) naturalmente estão ligados ao(s) polímero(s) solúvel/solúveis em água (incluindo, mas não se limitando a, PEG e/ou oligossacáridos) . Nalguns casos, os polipéptidos de bG-CSF da invenção compreendem ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácido(s) codifiçado(s) naturalmente ligado(s) a polímeros solúveis em água. Nalguns casos, o polipéptidos de bG-CSF da invenção compreendem um ou mais aminoácido(s) não codifiçado(s) naturalmente ligado(s) a polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos naturais ligados a polímeros solúveis em água. Nalgumas formas de realização, os polímeros solúveis em água utilizados na presente invenção aumentam a semivida no soro do polipéptido de bG-CSF relativamente à forma não conj ugada. 0 número de polímeros solúveis em água ligados a um polipéptido de bG-CSF (i.e., a extensão de PEGuilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para proporcionar uma característica farmacológica, farmacocinética ou farmacodinâmica alterada (incluindo, mas não se limitando a, aumentada ou diminuída) tal como semivida in vivo. Nalgumas formas de realização, a semivida do bG-CSF é aumentada pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, 2 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes em relação a um polipéptido não modificado.

Derivados de PEG que contêm um grupo nucleófilo forte (i.e., hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida)

Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém carbonilo não codificado naturalmente é modificado com um derivado de PEG que contém uma unidade hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida terminal que está ligada diretamente ao esqueleto de PEG.

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com hidroxilamina terminal terá a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2)m-0-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000 (i.e., peso molecular médio é entre 5-40 kDa).

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG que contém hidrazina ou hidrazida terá a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2)m-X-NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000 e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente.

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG que contém semicarbazida terá a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000.

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém carbonilo é modificado com um derivado de PEG que contém uma unidade hidroxilamina, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida terminal que está ligada ao esqueleto de PEG por meio de uma ligação amida.

Nalgumas formas de realização, os derivados de PEG com hidroxilamina terminal têm a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) m-0-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000 (i.e., peso molecular médio é entre 5-40 kDa).

Nalgumas formas de realização, os derivados de PEG que contêm hidrazina ou hidrazida têm a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2)m-X-NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, n é 100-1 000 e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente.

Nalgumas formas de realização, os derivados de PEG que contêm semicarbazida têm a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2)m-NH-C (O) -NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.)/ m é 2-10 e n é 100-1 000 .

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém carbonilo é modificado com um derivado de PEG ramificado que contém uma unidade hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida terminal, possuindo cada cadeia do PEG ramificado um PM que varia de 10-40 kDa e pode ser de 5-20 kDa.

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente é modificado com um derivado de PEG que tem uma estrutura ramificada. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com hidrazina ou hidrazida terminal terá a seguinte estrutura: [RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2)m-X-NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000, e X é opcionalmente um grupo carbonilo (C=0) que pode estar presente ou ausente.

Nalgumas formas de realização, os derivados de PEG que contêm um grupo semicarbazida terá a estrutura: [RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) 2-C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-NH-C (O) - NH-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.) ; X é opcionalmente NH, 0, S, C (0) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1 000.

Nalgumas formas de realização, os derivados de PEG que contêm um grupo hidroxilamina terão a estrutura: [RO- (CH2CH2O) n-0_ (CH2) 2 — C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2)m-0-NH2 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C (O) ou não está presente, m é 2-10 e n é 100-1 000. O grau e sitios em que o(s) polímero (s) solúvel/solúveis em água estão ligados ao polipéptido de bG-CSF podem modular a ligação do polipéptido de bG-CSF a um recetor. Nalgumas formas de realização, as ligações são organizadas de tal forma que o polipéptido de bG-CSF liga o recetor com uma Kd de cerca de 400 nM ou menor, com uma Kd de 150 nM ou menor, e nalguns casos com uma Kd de 100 nM ou menor, como medida por um ensaio de ligação em equilíbrio, tal como o descrito em Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988).

Os métodos e química para a ativação de polímeros, assim como para a conjugação de péptidos são descritos na literatura e são conhecidos na técnica. Os métodos comummente utilizados para a ativação de polímeros incluem, mas não se limitam a, ativação de grupos funcionais com brometo de cianogénio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloridrina, divinilsulfona, carbodiimida, halogenetos de sulfonilo, triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

Encontram-se disponíveis várias revisões e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG. Ver, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Micron. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995).

Podem encontrar-se também métodos para a ativação de polímeros em WO 94/17039, Pat. U.S. N.° 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. U.S. N.° 5, 219,564, Pat. U.S. N.° 5,122,614, WO 90/13540, Pat. U.S. N.° 5,281,698, e WO 93/15189, e para a conjugação entre polímeros ativados e enzimas incluindo, mas não se limitando ao Fator de Coagulação VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula transportadora de oxigénio (Pat. U.S. N.° 4,412,989), ribonuclease e superóxido-dismutase (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). A PEGuilação (i.e., adição de qualquer polímero solúvel em água) de polipéptidos de bG-CSF que contêm um aminoácido não codificado naturalmente, tal como p-azido-L-fenilalanina, é realizada por qualquer método conveniente. Por exemplo, o polipéptido de bG-CSF é PEGuilado com um derivado de mPEG terminado em alcino. Resumidamente, um excesso de mPEG(5000)-0-CH2-C=CH sólido é adicionado, sob agitação, a uma solução aquosa de polipéptido de bG-CSF que contém p-azido-L-Phe à temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão que tem um pKa próximo do pH ao qual a reação vai ser realizada (geralmente cerca de pH 4-10) . Os exemplos de tampões adequados para PEGuilação a pH 7,5, incluem, mas não se limitam a, por exemplo, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS e TES. O pH é continuamente monitorizado e ajustado, se for necessário. A reação é tipicamente deixada prosseguir durante entre cerca de 1-48 horas.

Os produtos de reação são subsequentemente submetidos a cromatografia de interação hidrófoba para separar as variantes do polipéptido de bG-CSF PEGuilado do mPEG(5000)-0-CH2-C=CH livre e de quaisquer complexos de alto peso molecular do polipéptido de bG-CSF peguilado que se possam formar quando o PEG não bloqueado é ativado em ambas as extremidades da molécula, reticulando desse modo as moléculas de variantes do polipéptido de bG-CSF. As condições durante a cromatografia de interação hidrófoba são de tal forma que o mPEG (5000) -O-Ctb-C^CH livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos de variantes do polipéptido de bG-CSF PEGuilado reticulados eluem após as formas desejadas, que contêm uma molécula de uma variante do polipéptido de bG-CSF conjugada com um ou mais grupos PEG. As condições adequadas variam em função dos tamanhos relativos dos complexos reticulados contra os conjugados desejados e são facilmente determinadas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. O eluente que contém os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalinizado por diafiltração.

Se for necessário, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado obtido a partir da cromatografia hidrófoba pode ser adicionalmente purificado por um ou mais procedimentos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria que incluem, mas não se limitam a, cromatografia de afinidade; cromatografia de troca aniónica ou catiónica (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, DEAE SEPHAROSE); cromatografia sobre silica; HPLC de fase inversa; filtração em gel (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrófoba; cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de quelato de metal; ultrafiltração/ diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amónio; cromatofocagem; cromatografia de substituição; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não se limitando a focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas não se limitando a precipitação com sulfato de amónio) ou extração. 0 peso molecular aparente pode ser estimado por GPC comparando os padrões de proteína globular (Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). A pureza do conjugado de bG-CSF-PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo, mas não se limitando a, dissociação com tripsina), seguida de análise por espetrometria de massa. Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):109-66 (2001).

Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipéptido de bG-CSF da invenção pode ser adicionalmente derivatizado ou substituído sem limitação.

Derivados de PEG que contêm azida

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF é modificado com um derivado de PEG que contém uma unidade azida que reagirá com uma unidade alcino presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio que varia desde 1-100 kDa e, nalgumas formas de realização, desde 10-40 kDa.

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com azida terminal terá a estrutura: RO- (CH2CH20) n~0- (CH2)m-N3 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000 (i.e., peso molecular médio é entre 5-40 kDa).

Noutra forma de realização, o derivado de PEG com azida terminal terá a estrutura: RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2)m-NH-C (O) - (CH2)P-N3 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10 e n é 100-1 000 (i.e., peso molecular médio é entre 5-40 kDa).

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém alcino é modificado com um derivado de PEG ramificado que contém uma unidade azida terminal, possuindo cada cadeia do PEG ramificado um PM que varia de 10-40 kDa e pode ser de 5-20 kDa. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com azida terminal terá a seguinte estrutura: [RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2)m-X— (CH2) PN3 em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10, e n é 100-1 000, e X é opcionalmente um grupo O, N, S ou carbonilo (C=0), que pode estar presente ou ausente em cada caso.

Derivados de PEG que contêm alcino

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF é modificado com um derivado de PEG que contém uma unidade alcino que reagirá com uma unidade azida presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente.

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com alcino terminal terá a seguinte estrutura:

RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) m-C=CH em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10 e n é 100-1 000 (i.e., peso molecular médio é entre 5-40 kDa).

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que contém alcino é modificado com um derivado de PEG que contém uma unidade azida terminal ou alcino terminal que está ligada ao esqueleto de PEG por meio de uma ligação amida.

RO- (CH2CH2O) n-0- (CH2)m-NH-C (0) - (CH2)p-C=CH em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10 e n é 100-1 000.

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém azida é modificado com um derivado de PEG ramificado que contém uma unidade alcino terminal, possuindo cada cadeia do PEG ramificado um PM que varia de 10-40 kDa e pode ser de 5-20 kDa. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o derivado de PEG com alcino terminal terá a seguinte estrutura:

[RO- (CH2CH2O) n-O- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2)m-X- (CH2)P C=CH em que R é um alquilo simples (metilo, etilo, propilo, etc.), m é 2-10, p é 2-10, e n é 100-1 000, e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonilo (C=0) , ou não está presente.

Derivados de PEG que contêm fosfina

Noutra forma de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF é modificado com um derivado de PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo, mas não se limitando a, éster, carbonato) que compreende ainda um grupo arilfosfina que reagirá com uma unidade azida presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio que varia de 1-100 kDa e, nalgumas formas de realização, de 10-40 kDa.

Nalgumas formas de realização, o derivado de PEG terá a estrutura:

em que X pode ser O, N, S ou não está presente, Ph é fenilo, W é um polímero solúvel em água e R pode ser os grupos H, alquilo, arilo, alquilo substituído e arilo substituído. Os grupos R ilustrativos incluem mas não se limitam a -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -halogéneo, -C(O)R', -CONR'R", -S (0)2R', -S(0)2NR'R", -CN e -N02. R', R", R" ' e R"" referem-se, cada, independentemente a hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, incluindo, mas não se limitando a, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo substituído ou não substituído, grupos alcoxilo ou tioalcoxilo, ou grupos arilalquilo. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como o são cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando estão presentes mais do que um destes grupos. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, aqueles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros.

Por exemplo, -NR'R" destina-se a incluir, mas não se limita a, 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. A partir da discussão anterior de substituintes, um especialista na técnica entenderá que o termo "alquilo" destina-se a incluir grupos que incluem átomos de carbono ligado a grupos diferentes de grupos hidrogénio, tais como haloalquilo (incluindo, mas não se limitando a, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (incluindo, mas não se limitando a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH20CH3 e semelhantes).

Outros derivados de PEG e Técnicas gerais de PEGuilação

Outras moléculas de PEG ilustrativas que podem ser ligadas aos polipéptidos de bG-CSF, assim como os métodos de PEGuilação incluem, mas não se limitam àqueles descritos em, e.g., Publicação de Patente U.S. N.° 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; Patente U.S. N.° 6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5, 219,564; 5, 629, 384; 5,736, 625; 4, 902,502; 5,281, 698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461, 603; 6, 436, 386; 6, 214, 966; 5, 990,237; 5, 900,461; 5,739,208; 5, 672, 662; 5, 446, 090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6, 201,072; 6, 451,346; 6, 306, 821; 5, 559,213; 5, 747, 646; 5, 834,594; 5, 849, 860; 5, 980, 948; 6, 004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316. Qualquer uma das moléculas de PEG aqui descritas podem ser utilizadas em qualquer forma, que inclui, mas não se limita a, cadeia simples, cadeia ramificada, cadeia com múltiplos braços, funcional simples, bifuncional, multifuncional ou qualquer combinação das mesmas.

Os derivados de polímeros e PEG adicionais que incluem, mas não se limitam a, derivados de hidroxilamina (aminooxil)-PEG, são descritos nos seguintes pedidos de patente: Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0194256, Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0217532, Publicação de Patente U.S. N.° 2006/0217289, Patente Provisória U.S. N.° 60/755,338; Patente Provisória U.S. N.° 60/755,711; Patente Provisória U.S. N.° 60/755,018; Pedido Internacional de Patente N.° PCT/US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S. N.° 60/743,041; Patente Provisória U.S. N.° 60/743,040; Pedido Internacional de Patente N.° PCT/US06/47822; Patente Provisória U.S. N.° 60/882,819; Patente Provisória U.S. N.° 60/882,500; e Patente Provisória U.S. N.° 60/870,594.

Proteínas de Fusão de Fc Heterólogas

Os compostos de bG-CSF descritos acima podem ser fundidos diretamente ou através de uma unidade de ligação peptídica com a porção Fc de uma imunoglobulina. As imunoglobulinas são moléculas que contêm cadeias polipeptídicas mantidas juntas por ligações dissulfureto, que têm tipicamente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Em cada cadeia, um domínio (V) tem uma sequência de aminoácidos variável dependendo da especificidade de anticorpo da molécula. Os outros domínios (C) têm uma sequência bastante constante comum às moléculas da mesma classe.

Como aqui utilizado, a porção Fc de uma imunoglobulina tem o significado comummente dado ao termo no campo da imunologia. Especificamente, este termo refere-se a um fragmento de anticorpo que é obtido removendo as duas regiões de ligação a antigénio (os fragmentos Fab) do anticorpo. Uma maneira de remover os fragmentos Fab consiste em digerir a imunoglobulina com a protease papaina. Assim, a porção Fc é constituída por fragmentos de tamanho aproximadamente igual da região constante de ambas as cadeias pesadas, que se associam através de interações não covalentes e ligações dissulfureto. A porção Fc pode incluir as regiões charneira e prolonga-se através dos domínios CH2 e CH3 até à extremidade C-terminal do anticorpo. As regiões charneira representativas para as imunoglobulinas humanas e de murganho podem encontrar-se em Antibody Engineering, A Praticai Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman e Co., 1992. A porção Fc pode incluir ainda um ou mais sítios de glicosilação. As sequências de aminoácidos de numerosas proteínas Fc representativas que contêm uma região charneira, domínios CH2 e CH3, e um sítio de N-glicosilação são bem conhecidas na técnica.

Existem cinco tipos de regiões Fc de imunoglobulina humana com diferentes funções efetoras e propriedades farmacocinéticas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. A IgG é a imunoglobulina mais abundante no soro. A IgG também tem a semivida mais longa no soro de qualquer imunoglobulina (23 dias). Ao contrário de outras imunoglobulinas, a IgG é recirculada eficazmente após ligação a um recetor de Fc. Existem quatro subclasses de IgG Gl, G2, G3, e G4, cada uma das quais tem diferentes funções efetoras. As Gl, G2 e G3 podem ligar o Clq e fixar o complemento, enquanto a G4 não pode. Ainda que a G3 seja capaz de ligar o Clq mais eficazmente que a Gl, a Gl é mais eficaz na mediação da lise celular dirigida pelo complemento. A G2 fixa o complemento de maneira muito ineficaz. 0 sitio de ligação Clq na IgG está localizado na região carboxi-terminal do domínio CH2.

Todas as subclasses de IgG são capazes de se ligar aos recetores de Fc (CD16, CD32, CD64), sendo as Gl e G3 mais eficazes do que as G2 e G4. A região de ligação ao recetor de Fc da IgG é constituída pelos resíduos localizados tanto na região charneira como na região carboxi-terminal do domínio CH2. A IgA pode existir tanto numa forma monomérica como dimérica mantidas juntas por uma cadeia J. A IgA é a segunda Ig mais abundante no soro, mas tem uma semivida de apenas 6 dias. A IgA tem três funções efetoras. Liga-se a um recetor específico para IgA em macrófagos e eosinófilos, que conduz a fagocitose e desgranulação, respetivamente. Pode também fixar o complemento através de uma via alternativa desconhecida. A IgM é expressa como um pentâmero ou um hexâmero, os quais são ambos mantidos juntos por uma cadeia J. A IgM tem uma semivida no soro de 5 dias. Liga-se fracamente ao Clq através de um sitio de ligação localizado no seu domínio CH3. A IgD tem uma semivida de 3 dias no soro. É incerto que funções efetoras são atribuíveis a esta Ig. A IgE é uma Ig monomérica e tem uma semivida no soro de 2,5 dias. A IgE liga-se a dois recetores de Fc que conduzem a desgranulação e resultam na libertação de agentes pró-inflamatórios .

Dependendo do efeito in vivo desejado, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem conter qualquer um dos isotipos descritos acima ou podem conter regiões Fc mutadas em que as funções de ligação do complemento e/ou recetor de Fc foram alteradas. Assim, as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção podem conter a porção Fc completa de uma imunoglobulina, fragmentos da porção Fc de uma imunoglobulina, ou análogos da mesma fundidos com um composto de bG-CSF.

As proteínas de fusão da presente invenção podem consistir em proteínas de cadeia simples ou como polipéptidos de múltiplas cadeias. Duas ou mais proteínas de fusão de Fc podem ser produzidas de maneira a que interajam através de ligações dissulfureto que se formam naturalmente entre as regiões Fc. Estes multímeros podem ser homogéneos em relação ao composto de bG-CSF ou podem conter diferentes compostos de bG-CSF fundidos na extremidade N-terminal da porção Fc da proteína de fusão.

Independentemente da estrutura final da proteína de fusão, a região Fc ou semelhante a Fc pode servir para prolongar a semivida no plasma in vivo do composto de bG-CSF fundido na extremidade N-terminal. Da mesma forma, o componente de bG-CSF de um composto de proteína de fusão deve reter pelo menos uma atividade biológica de bG-CSF. Um aumento na semivida terapêutica ou circulante pode ser demonstrado utilizando o método aqui descrito ou conhecido na técnica, em que a semivida da proteína de fusão é comparada com a semivida do composto de bG-CSF sozinho. A atividade biológica pode ser determinada por métodos in vitro e in vivo conhecidos na técnica.

Uma vez que a região Fc de IgG produzida por proteólise tem a mesma semivida in vivo que a molécula de IgG intacta e os fragmentos Fab são rapidamente degradados, julga-se que a sequência relevante para prolongar a semivida reside nos domínios CH2 e/ou CH3. Além disso, foi demonstrado na literatura que as taxas catabólicas das variantes de IgG que não ligam o recetor de Fc de alta afinidade ou o Clq são indistinguíveis da taxa de depuração do anticorpo de tipo selvagem parental, o que indica que o sítio catabólico é distinto dos sítios envolvidos na ligação ao recetor de Fc ou Clq. [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221]. Estudos de mutagénese específica de um lócus utilizando uma região Fc de IgGl murídea sugeriram que a sítio da região Fc de IgGl que controla a taxa catabólica se encontra localizada na interface dos domínios CH2-CH3. As regiões Fc podem ser modificadas no sítio catabólico para otimizar a semivida das proteínas de fusão. A região Fc utilizada para as proteínas de fusão da presente invenção pode ser derivada de uma região Fc de IgGl ou um IgG4, e pode conter tanto regiões CH2 como CH3, incluindo a região charneira.

Proteínas de Fusão de Albumina Heterólogas 0 bG-CSF aqui descrito pode ser fundido diretamente ou através de uma unidade de ligação peptídica, polímero solúvel em água ou unidade de ligação de pró-fármaco a albumina ou um análogo, fragmento ou derivado da mesma. Em geral, as proteínas de albumina que pertencem às proteínas de fusão da presente invenção podem ser derivadas de albumina clonada de qualquer espécie, incluindo humana. A albumina de soro humano (HSA) consiste em uma única cadeia polipeptídica não glicosilada de 585 aminoácidos com um peso molecular de fórmula de 66 500. A sequência de aminoácidos da HSA humana é conhecida [Ver Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747]. Foi descrita uma variedade de variantes polimórficas, assim como análogos e fragmentos de albumina. [Ver Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Por exemplo, na EP 322,094, várias formas mais curtas de HSA. São divulgados alguns destes fragmentos de HSA, incluindo HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(l-389), HSA(l-369) eHSA(l-419) e fragmentos entre 1-369 e 1-419. A EP 399,666 divulga fragmentos de albumina que incluem HSA(1-177) e HSA(1-200) e fragmentos entre HSA(1-177) e HSA(l-200).

Entende-se que as proteínas de fusão heterólogas da presente invenção incluem compostos de bG-CSF que estão acoplados a qualquer proteína de albumina que inclui fragmentos, análogos e derivados em que essa proteína de fusão é biologicamente ativa e tem uma semivida no plasma mais longa do que o composto de bG-CSF sozinho. Assim, a porção de albumina da proteína de fusão não tem necessariamente uma semivida no plasma igual àquela da albumina humana nativa. São conhecidos ou podem ser gerados fragmentos, análogos e derivados que têm semividas mais longas ou têm semividas intermédias relativamente às da albumina humana nativa e do composto de bG-CSF de interesse.

As proteínas de fusão heterólogas da presente invenção abrangem proteínas que têm substituições conservadoras de aminoácidos no composto de bG-CSF e/ou na porção Fc ou de albumina da proteína de fusão. Uma "substituição conservadora" é a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem a mesma carga eletrónica líquida e aproximadamente o mesmo tamanho e forma. Os aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticas ou alifáticas substituídas têm aproximadamente o mesmo tamanho quando o número total de carbonos e heteroátomos nas suas cadeias laterais diferem em não mais do que cerca de quatro. Aqueles têm aproximadamente a mesma forma quando o número de ramificações nas suas cadeias laterais difere em não mais do que um. Os aminoácidos com grupos fenilo ou fenilo substituídos nas suas cadeias laterais são considerados como tendo aproximadamente o mesmo tamanho e forma. Exceto quando aqui proporcionado especificamente de outro modo, as substituições conservadoras são preferencialmente feitas com aminoácidos naturais.

As proteínas de albumina e imunoglobulina de tipo selvagem podem ser obtidas a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, estas proteínas podem ser obtidas a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido ou células que expressam o ARNm de interesse num nível detetável. As bibliotecas podem ser tríadas com sondas concebidas utilizando a sequência de ADN ou proteína publicada para a proteína de interesse particular. Por exemplo, as regiões constantes da cadeia leve ou pesada de imunoglobulina são descritas em Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7 9:78 62-78 62; Falkner, et al. (1982) Nature 298:286-288; e Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256. Algumas referências que divulgam a sequências de ADN e proteína da albumina incluem Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102- 6114; e Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747.

Caracterização das Proteínas de Fusão Heterólogas da Presente Invenção

Existem numerosos métodos para caracterizar as proteínas de fusão da presente invenção. Alguns destes métodos incluem, mas não se limitam a: SDS-PAGE acoplado com métodos de revelação de proteínas ou imunotransferência utilizando anticorpos anti-IgG ou anti-HSA. Outros métodos incluem, por exemplo, dessorção/ionização por laser assistida pela matriz-espetrometria de massa (MALDI-MS), cromatografia líquida/espetrometria de massa, focagem isoelétrica, troca aniónica analítica, cromatofocagem e dicroísmo circular.

Melhoria da afinidade para a albumina sérica Várias moléculas podem ser também fundidas com os polipéptidos de bG-CSF da invenção para modular a semivida de polipéptidos de bG-CSF no soro. Nalgumas formas de realização, as moléculas são ligadas ou fundidas com polipéptidos de bG-CSF da invenção para aumentar a afinidade para a albumina sérica endógena num animal.

Por exemplo, nalguns casos, é efetuada uma fusão recombinante de um polipéptido de bG-CSF e uma sequência de ligação de albumina. As sequências de ligação de albumina ilustrativas incluem, mas não se limitam a, o domínio de ligação de albumina da proteína estreptocócica G (ver. e.g., Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) e Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997) ), ou péptidos de ligação de albumina tais como aqueles descritos em, e.g., Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) .

Noutras formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF da presente invenção são acilados com ácidos gordos. Nalguns casos, os ácidos gordos promovem a ligação à albumina sérica. Ver, e.g., Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995) .

Noutras formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF da invenção são fundidos diretamente com a albumina sérica (incluindo, mas não se limitando a, albumina de soro humano). Os especialistas na técnica reconhecerão que pode ser também ligada uma grande variedade de outras moléculas ao bG-CSF na presente invenção para modular a ligação à albumina sérica ou outros componentes do soro.

X. Glicosilaçâo dos Polipéptidos de bG-CSF A invenção inclui polipéptidos de bG-CSF que incorporam um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente portadores de resíduos de sacáridos. Os resíduos de sacáridos podem ser naturais (incluindo, mas não se limitando a, N-acetilglucosamina) ou não naturais (incluindo, mas não se limitando a, 3-fluorogalactose) . Os sacáridos podem ser ligados ao saminoácidos não codificados naturalmente por uma ligação glicosidica ligada por N ou 0 (incluindo, mas não se limitando a, N-acetilgalactose-L-serina) ou uma ligação não natural (incluindo, mas não se limitando a, uma oxima ou o glicósido ligado por C ou S correspondente).

As unidades de sacáridos (incluindo, mas não se limitando a, glicosilo) podem ser adicionadas aos polipéptidos de bG-CSF in vivo ou in vitro. Nalgumas formas de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido que contém carbonilo não codificado naturalmente é modificado com um sacárido derivatizado com um grupo aminooxilo para gerar o polipéptido glicosilado correspondente ligado através de uma ligação oxima. Uma vez ligado ao aminoácido não codificado naturalmente, o sacárido pode ser adicionalmente processado por tratamento com glicosil-transferases e outras enzimas para gerar um oligossacárido ligado ao bG-CSF. Ver, e.g., H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).

Nalgumas formas de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que contém carbonilo é modificado diretamente com um glicano com estrutura definida preparado como um derivado de aminooxilo. Um especialista com conhecimentos médios na matéria reconhecerá que podem ser utilizadas outras funcionalidades, incluindo azida, alcino, hidrazida, hidrazina e semicarbazida, para ligar o sacárido ao aminoácido não codificado naturalmente.

Nalgumas formas de realização da invenção, um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que contém azida ou alcinilo pode ser em seguida modificado por, incluindo, mas não se limitando a, uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen com, incluindo, mas não se limitando a, derivados de alcinilo ou azida, respetivamente. Este método permite que as proteínas sejam modificadas com uma seletividade extremamente alta.

XI. Dímeros e Mu.ltim.eros de bG-CSF A presente invenção também proporciona combinações de bG-CSF e análogos de bG-CSF tais como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros (i.e., trímeros, tetrâmeros, etc.) em que o bG-CSF que contém um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente está ligado a outro bG-CSF ou variante de bG-CSF do mesmo ou qualquer outro polipéptido que não é o bG-CSF ou a variante de bG-CSF do mesmo, que diretamente à cadeia polipeptídica principal ou através de uma unidade de ligação. Devido ao seu maior peso molecular em comparação com os monómeros, os conjugados de dímeros ou multímeros de bG-CSF podem exibir novas ou propriedades desejáveis, incluindo, mas não se limitando a diferente farmacologia, farmacocinética, farmacodinâmica, semivida terapêutica modulada ou semivida no plasma modulada relativamente ao bG-CSF monomérico. Nalgumas formas de realização, os dímeros de bG-CSF da invenção modularão a transdução de sinal do recetor de G-CSF. Noutras formas de realização, os dimeros ou multimeros de bG-CSF da presente invenção atuarão como um antagonista, agonista ou modulador do recetor.

Nalgumas formas de realização, uma ou mais das moléculas de bG-CSF presentes num dímero ou multimero que contém bG-CSF compreendem um aminoácido não codificado naturalmente ligado a um polímero solúvel em água.

Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF são ligados diretamente, incluindo, mas não se limitando a, através de uma ligação amida Asn-Lys ou ligação dissulfureto Cys-Cys. Nalgumas formas de realização, os polipéptidos de bG-CSF e/ou a molécula diferente de bG-CSF ligada, compreenderão diferentes aminoácidos não codificados naturalmente para facilitar a dimerização, incluindo, mas não se limitando a, um alcino num aminoácido não codificado naturalmente de um primeiro polipéptido de bG-CSF e uma azida num segundo aminoácido não codificado naturalmente de uma segunda molécula serão conjugados através de uma cicloadição [3+2] de Huisgen. Alternativamente, o bG-CSF, e/ou a molécula diferente de bG-CSF ligada que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que contém cetona podem ser conjugados com um segundo polipéptido que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que contém uma hidroxilamina e os polipéptidos são feitos reagir através da formação da oxima correspondente.

Alternativamente, os dois polipéptidos de bG-CSF, e/ou a molécula diferente de bG-CSF ligada, são ligados através de uma unidade de ligação. Pode ser utilizada qualquer unidade de ligação hetero- ou homobifuncional para ligar as duas moléculas, e/ou as moléculas diferentes de bG-CSF ligadas, as quais podem ter sequências primárias iguais ou diferentes. Nalguns casos, a unidade de ligação utilizada para unir o bG-CSF e/ou as moléculas diferentes de bG-CSF ligadas em conjunto pode ser um reagente de PEG bifuncional. A unidade de ligação pode ter uma grande gama de pesos moleculares ou comprimentos moleculares. Podem ser utilizadas unidades de ligação de peso molecular maior ou menor para proporcionar uma relação ou conformação espacial desejada entre o bG-CSF e a entidade ligada ou entre o bG-CSF e o seu recetor, ou entre a entidade ligada e o seu parceiro de ligação, se houver algum. As unidades de ligação que têm comprimento molecular maior ou menor podem ser também utilizadas para proporcionar um espaço ou flexibilidade desejado entre o bG-CSF e a entidade ligada, ou entre a entidade ligada e o seu parceiro de ligação, se houver algum.

Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona unidades de ligação bifuncionais solúveis em água que têm uma estrutura em haltere que inclui: a) uma unidade que contém uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina ou um carbonilo em, pelo menos, uma primeira extremidade de um esqueleto do polímero; e b) pelo menos um segundo grupo funcional numa segunda extremidade do esqueleto do polímero. 0 segundo grupo funcional pode ser igual ou diferente ao primeiro grupo funcional. Nalgumas formas de realização, o segundo grupo funcional não é reativo com o primeiro grupo funcional. A invenção proporciona, nalgumas formas de realização, compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica.

Nalgumas formas de realização, a invenção proporciona multímeros que compreendem um ou mais polipéptidos de bG-CSF preparados por reação com polímeros ativados solúveis em água que têm a estrutura:

R- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-X em que n é desde cerca de 5 a 3 000, m é 2-10, X pode ser uma unidade que contém uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo aminooxilo, uma hidroxilamina, um acetilo ou carbonilo, e R é um grupo de terminação, um grupo funcional ou um grupo de saída que pode ser igual ou diferente a X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado do grupo que consiste em hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster de N-hidroxissuccinimidilo, éster de 1-benzotriazolilo, carbonato de N-hidroxissuccinimidilo, carbonato de 1-benzotriazolilo, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alcenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxilo, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, e tresilato, alceno e cetona. XII. Medição da Atividade do Polipéptido de bG-CSF e Afinidade do bG-CSF para um Recetor A atividade do polipéptido de bG-CSF pode ser determinada utilizando ensaios in vitro ou in vivo padrão ou conhecidos. Os polipéptidos de bG-CSF podem ser analisados quanto à atividade biológica por métodos adequados conhecidos na técnica. Tais ensaios incluem, mas não se limitam a, aqueles descritos em Hedari et al. Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81:45-57 e ensaios que avaliam as atividades biológicas de hG-CSF.

Os polipéptidos de bG-CSF podem ser analisados quanto à sua capacidade para regular positivamente CDlla, CDllb, CDllc e/ou CD18 nos neutrófilos. A medição desta atividade pode ser efetuada por FACS como descrito por Hedari et al (supra). Ensaios adicionais conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria medem a ativação de neutrófilos, incluindo, mas não se limitando a, ensaios que medem a L-selectina. Outros ensaios que podem ser realizados avaliam a proliferação e/ou diferenciação de células pelos polipéptidos de bG-CSF da invenção.

Os polipéptidos de bG-CSF podem ser analisados quanto à sua capacidade para se ligar a um recetor. Um recetor de G-CSF pode ser preparado utilizando técnicas e métodos que são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria. 0 recetor de hG-CSF pode ser preparado como descrito na Patente U.S. N.° 5,574,136. Por exemplo, células ou linhas de células que funcionam em resposta ao G-CSF ou ligam o G-CSF (incluindo, mas não se limitando a, células que contêm recetores de G-CSF ativos, tais como as células produtoras do recetor de G-CSF recombinante) podem ser utilizadas para monitorizar a ligação ao recetor de bG-CSF. Para um polipéptido de bG-CSF não PEGuilado ou PEGuilado que compreende um aminoácido não natural, a afinidade do bG-CSF para o seu recetor ou para outro recetor de G-CSF pode ser medida utilizando um biossensor BIAcore™ (Pharmacia). Os ensaios de ligação adequados incluem, mas não se limitam a, ensaios BIAcore (Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)) e ensaios AlphaScreen™ (PerkinElmer). 0 AlphaScreen™ é um ensaio de proximidade de luminescência não radioativo baseado em esférulas, onde as esférulas doadoras são excitadas por um laser a 680 nm para libertar oxigénio singleto. O oxigénio singleto difunde-se e reage com o derivado de tioxeno na superfície de esférulas aceitadoras que leva à emissão de fluorescência a ~600 nm. A emissão de fluorescência ocorre apenas quando o doador e as esférulas aceitadoras são postas em estreita proximidade por interações moleculares que ocorrem quando cada um está ligado ao ligando e recetor, respetivamente. Esta interação ligando-recetor pode ser afastada utilizando variantes de ligação ao recetor, enquanto as variantes não ligantes não competirão. A atividade do polipéptido de bG-CSF pode ser determinada utilizando ensaios in vitro ou in vivo padrão ou conhecidos. Por exemplo, as células ou linhas de células que proliferam na presença de hG-CSF ou ligam o hG-CSF (incluindo, mas não se limitando a, células que contêm recetores de G-CSF ativos, tais como células da medula óssea de murganho, WEHI-3B (D+), AML-193 (ATCC) ou células produtoras do recetor de G-CSF recombinante) podem ser utilizadas para monitorizar a ligação ao recetor de bG-CSF. Ver, e.g., King et al., Exp. Hematol. 20:223 (1992); Patente U.S. N.° 6,385,505 Os modelos animais in vivo assim como os ensaios clínicos humanos para testar a atividade de hG-CSF incluem aqueles descritos, e.g., nas Patentes U.S. N.° 6,166,183; 6,565,841; 6,162,426; 5,718,893. Tais modelos podem ser utilizados para avaliar a atividade de bG-CSF.

Independentemente de que métodos são utilizados para gerar os presentes análogos de bG-CSF, os análogos são submetidos a ensaios para a atividade biológica. Podem ser realizados ensaios com timidina tritiada para apurar o grau de divisão celular. No entanto, podem ser utilizados outros ensaios biológicos para apurar a atividade desejada. Os ensaios biológicos tais como a avaliação da capacidade para induzir diferenciação terminal na linha de células leucémicas WEHI-3B (D+) de murganho também proporcionam uma indicação da atividade de G-CSF. Ver Nicola, et al. Blood 54: 614-27 (1979). Podem ser utilizados outros ensaios in vitro para apurar a atividade biológica. Ver Nicola, Ann.Rev. Biochem. 58: 45-77 (1989). Em geral, o teste para a atividade biológica deve proporcionar uma análise para o resultado desejado, tal como um aumento ou diminuição da atividade biológica (em comparação com o G-CSF não alterado), atividade biológica diferente (em comparação com 0 G-CSF não alterado), análise da afinidade de ligação do recetor ou parceiro, alterações conformacionais ou estruturais do próprio bG-CSF ou seu recetor (em comparação com o bG-CSF modificado) ou a análise da semivida no soro.

Foi anteriormente reportado que as células WEHI-3BD+ e as células leucémicas humanas de leucemias recém-diagnosticadas ligarão o G-CSF de murideo marcado com 125I e que esta ligação pode ser sujeita a competição através da adição de G-CSF não marcado ou CSF-β humano. É testada a capacidade do G-CSF natural e bG-CSF para competir com a ligação de 125I-G-CSF às células leucémicas humanas e murideas. 0 G-CSF natural altamente purificado (>95% puro; 1 yg) é iodado [Tejedor, et al., Anal.Biochem., 127, 143 (1982)] e é separado dos reagentes por filtração em gel e cromatografia de troca iónica. A atividade especifica do 125I-G-CSF natural é de aproximadamente 100 yCi/ yg de proteína. A compilação anterior de referências para metodologias de ensaio não é exaustiva e os especialistas com conhecimentos médios na matéria reconhecerão outros ensaios úteis para testar para o resultado final desejado. As alterações a tais ensaios são conhecidas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. XIII. Medição da Potência, Semivida Funcional In Vivo e Parâmetros Faxmacocinéticos

Um aspeto importante da invenção é a semivida biológica prolongada que é obtida pela construção do polipéptido de b-GCSF com ou sem conjugação do polipéptido a uma unidade de polímero solúvel em água. A diminuição rápida após administração das concentrações séricas do polipéptido de bG-CSF fez com que fosse importante avaliar-se as respostas biológicas ao tratamento com o polipéptido de bG-CSF conjugado e não conjugados, e variantes do mesmo. O polipéptido de bG-CSF conjugado e não conjugado, e variantes do mesmo da presente invenção podem ter semividas no soro prolongadas também após administração através de, e.g. administração subcutânea ou i.v., sendo possível medi-la, e.g. pelo método de ELISA ou por um ensaio de triagem primária. Podem ser utilizados kits ELISA ou RIA de fontes comerciais. Outro exemplo de um ensaio para a medição da semivida in vivo de hG-CSF ou variantes do mesmo é descrito na Pat. U.S. N.° 5,824,778. A medição da semivida biológica in vivo é realizada como aqui descrito. A potência e semivida funcional in vivo de um polipéptido de hG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente podem ser determinadas de acordo com o protocolo descrito nas Patentes U.S. N.° 6,646,110; 6,555,660; 6,166,183; 5,985,265; 5,824,778; 5,773,581. Estes protocolos também podem ser utilizados para bG-CSF.

Os parâmetros farmacocinéticos para um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente podem ser avaliados em ratazanas machos Sprague-Dawley normais (N=5 animais por grupo de tratamento) . Os animais receberão uma dose única de 25 ug/ratazana iv ou 50 ug/ratazana sc, e serão colhidas aproximadamente 5-7 amostras de sangue de acordo com um curso de tempo predefinido, que abrange geralmente cerca de 6 horas para um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente não conjugada com um polimero solúvel em água e cerca de 4 dias para um polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente e conjugado com um polímero solúvel em água. Os dados de farmacocinética para o bG-CSF sem um aminoácido não codificado naturalmente podem ser comparados diretamente aos dados obtidos para os polipéptidos de bG-CSF que compreendem um aminoácido não codificado naturalmente.

Podem ser realizados estudos de farmacocinética de polipéptidos de bG-CSF em murganhos, ratazanas ou num primata, e.g., macacos cinomolgos. Tipicamente, é administrada uma única injeção por via subcutânea ou via intravenosa, e os níveis de bG-CSF no soro são monitorizados ao longo do tempo. A Patente U.S. N.° 5,849,883 e a WO 89/10932, descrevem um número de modelos animais que podem ser utilizados para avaliar os polipéptidos de bG-CSF da invenção. Os estudos em animais que podem ser realizados envolvem gado bovino exposto a Pasteurella hemolytica, gado bovino com exposição bacteriana da glândula mamária/exposição a mastite (Klebsiella pneumonia). Outros estudos que podem ser realizados avaliam o controlo, incidência e duração da doença respiratória bovina, ou prevenção de mastite coliforme. Os métodos para avaliar a saúde dos animais, produção de leite, contagem de neutrófilos e outros parâmetros são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Outros modelos que podem ser utilizados para avaliar os polipéptidos de bG-CSF da invenção incluem, mas não se limitam a, modelos animais de infeção ou de exposição à infeção tais como um modelo em hamster de pneumonia por Pseudomonas aeruginosa, um modelo em ratazana de pielonefrite por Candida albicans, modelos que envolvem crias neonatais e modelos que envolvem porcos em crescimento. Alguns destes modelos são descritos na Patente U.S. N.° 5,849,883 e WO 89/10932. Modelos como estes são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria.

Outros exemplos de ensaios para a medição da atividade biológica do hG-CSF in vivo ou variantes do mesmo são descritos nas Pat. U.S. N.° 5, 681,720; 5, 795, 968; 5, 824,778; 5, 985,265; e Bowen et al., Experimental Hematology 27:425-432 (1999. XIV. Administração e Composições Farmacêuticas

Os polipéptidos ou proteinas da invenção (incluindo, mas não se limitando a, bG-CSF, sintetases, proteinas que compreendem um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente usados para utilizações terapêuticas, incluindo, mas não se limitando a, em combinação com um veiculo farmacêutico adequado. Por exemplo, tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um tal veiculo ou excipiente inclui, mas não se limita a, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol e/ou combinações dos mesmos. A formulação é preparada para se adaptar ao modo de administração. Em geral, os métodos de administração de proteinas são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e podem ser aplicados à administração dos polipéptidos da invenção. As composições podem estar numa forma solúvel em água, tal como estar presentes como sais farmaceuticamente aceitáveis, os quais pretendem incluir tanto sais de adição de ácido como de base. A Patente U.S. N.° 6,497,869 discute formulações e a administração de polipéptidos de G-CSF, incluindo, mas não se limitando a, hG-CSF e bG-CSF. Foram discutidos sais que compreendem iões sulfato, tais como sulfato de amónio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio e misturas dos mesmos assim como agentes tampão tais como acetato, citrato, fosfato, HEPES, BES, TAPS, EPPS, TES e misturas dos mesmos.

As composições terapêuticas que compreendem um ou mais polipéptidos da invenção são opcionalmente testadas em um ou mais apropriado modelos animais in vitro e/ou in vivo de doença, para confirmar a eficácia, metabolismo no tecido e para estimar as dosagens, de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medições adequadas dos homólogos não naturais deste documento relativamente aos aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, comparação de um polipéptido de bG-CSF modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais com um polipéptido de bG-CSF de aminoácidos naturais e comparação de um polipéptido de bG-CSF modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais com um tratamento com bG-CSF presentemente disponível), i.e., num ensaio relevante. A administração é através de qualquer uma das vias normalmente utilizadas para introduzir uma molécula em contacto final com o sangue ou as células do tecido. Os polipéptidos de aminoácidos não naturais da invenção são administrados de qualquer maneira adequada, opcionalmente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Encontram-se disponíveis métodos de administração adequados de tais polipéptidos no contexto da presente invenção a um doente e, embora se possa utilizar mais do que uma via para administrar uma composição particular, uma via particular pode proporcionar frequentemente uma ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que outra via.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular que é administrada, assim como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Por conseguinte, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser administrados por qualquer via convencional adequada para proteínas ou péptidos, incluindo, mas não se limitando à via parentérica, e.g. injeções que incluem, mas não se limitam a, por via subcutânea ou por via intravenosa ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. As composições de polipéptido podem ser administradas por um número de vias que incluem, mas não se limitam a meios orais, intravenosos, intraperitoneais, intramusculares, transdérmicos, subcutâneos, tópicos, sublinguais, intravasculares, intramamários ou retais. As composições que compreendem polipéptidos de aminoácidos não naturais, modificados ou não modificados, podem ser também administradas via lipossomas. Tais vias de administração e formulações apropriadas são geralmente conhecidas pelos especialistas na técnica. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser utilizado sozinho ou em combinação com outros componentes adequados tais como um veiculo farmacêutico. 0 polipéptido de bG-CSF pode ser utilizado em associação com outros agentes ou terapêuticas. 0 polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não natural, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser também preparado em formulações de aerossol (i.e., pode ser "nebulizado") para ser administrado por inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluorometano, propano, azoto e semelhantes.

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As formulações adequadas para administração parentérica, tal como, por exemplo, pelas vias intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, incluem soluções injetáveis estéreis isotónicas, aquosas e não aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recetor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações de bG-CSF podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose selados, tais como ampolas e frascos. A administração parentérica e a administração intravenosa são métodos de administração preferidos. Em particular, as vias de administração que já são utilizadas para terapêutica com homólogos de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, aqueles tipicamente utilizados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticorpos, FGFs e/ou qualquer outra proteína administrada farmaceuticamente) , juntamente com formulações em utilização corrente, proporcionam vias de administração e formulações preferidas para os polipéptidos da invenção. A dose administrada a um animal, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica benéfica no animal ao longo do tempo, ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vetor ou formulação particular, e pela atividade, estabilidade ou semivida no soro do polipéptido de aminoácido não natural utilizado e a condição do animal, assim como o peso corporal ou área superficial do animal que é tratado. 0 tamanho da dose é também determinado pela existência, natureza e grau de quaisquer efeitos secundários adversos que acompanhem a administração de um vetor, formulação particular ou semelhantes num animal particular.

Ao determinar a quantidade eficaz do vetor ou formulação a ser administrada no tratamento ou profilaxia de doença, o veterinário avalia os níveis plasmáticos circulantes, as toxicidades da formulação, progressão da doença e/ou, quando relevante, a produção de anticorpos anti-polipéptidos de aminoácidos não naturais. A dose administrada situa-se tipicamente na gama equivalente às dosagens das proteínas terapêuticas presentemente utilizadas, ajustadas para a atividade ou semivida no soro alterada da composição relevante. Os vetores ou formulações farmacêuticas desta invenção podem complementar as condições de tratamento por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipéptidos de aminoácidos naturais, ácidos nucleicos, análogos de nucleótidos, modificadores da resposta biológica e semelhantes.

Para administração, as formulações da presente invenção são administradas a uma taxa determinada pela LD-50 ou ED-50 da formulação relevante e/ou pela observação de quaisquer efeitos secundários dos polipéptidos de aminoácidos não naturais às várias concentrações, incluindo, mas não se limitando a, como aplicado à massa e saúde geral do animal. A administração pode ser realizada através de doses únicas ou divididas.

Se um animal sujeito a infusão de uma formulação desenvolve febres, arrepios ou dores musculares, pode receber a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno ou outro fármaco de controlo da dor/febre apropriado para animais. Os animais que sofrem reações à infusão tais como febre, dores musculares e arrepios são premedicados 30 minutos antes de futuras infusões com aspirina, acetaminofeno ou, incluindo, mas não se limitando a, difenidramina, ou outro fármaco apropriado para animais. A meperidina pode ser utilizada utilizada para arrepios e dores musculares mais graves que não respondem rapidamente a antipiréticos e anti-histaminicos. A infusão celular é abrandada ou descontinuada dependendo da gravidade da reação.

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser administrados diretamente a um indivíduo animal. A administração é por qualquer uma das vias normalmente utilizadas para introduzir o polipéptido de bG-CSF num indivíduo. As composições de polipéptido de bG-CSF de acordo com as formas de realização da presente invenção incluem as adequadas para administração oral, retal, tópica, por inalação (incluindo, mas não se limitando a, via um aerossol), bucal (incluindo, mas não se limitando a, sublingual), vaginal, parentérica (incluindo, mas não se limitando a, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial ou intravenosa), tópica (i.e., tanto na pele como em superficies da mucosa, incluindo superficies das vias aéreas), pulmonar, intraocular, intranasal e transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer caso dependa da natureza e qravidade da condição que é tratada. A administração pode ser local ou sistémica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, tais como ampolas e frascos. Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser preparados numa mistura numa forma injetável de dosaqem unitária (incluindo, mas não se limitando a, solução, suspensão ou emulsão) com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser também administrados por infusão continua (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, minibombas tais como bombas osmóticas), bolus únicos ou formulações de implantes de libertação lenta.

As formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotónicas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, aqentes bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica, e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, espessantes, estabilizantes e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós, granulados e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente. A secagem por congelação é uma técnica comummente utilizada para apresentar proteínas, a qual serve para remover água da preparação de proteína de interesse. A secagem por congelação ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e, em seguida, o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação num ambiente em vácuo. Pode ser incluído um excipiente nas formulações pré-liofilizadas para aumentar a estabilidade durante o processo de secagem por congelação e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado durante o armazenamento. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991). A secagem por pulverização de produtos farmacêuticos é também conhecida pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. Por exemplo, ver Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals, " em Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12) , 1169-1206 (1992). Além de produtos farmacêuticos de molécula pequena, uma variedade de materiais biológicos têm sido secos por pulverização e estes incluem: enzimas, soros, plasma, microrganismos e leveduras. A secagem por pulverização é uma técnica útil porque pode converter uma preparação farmacêutica líquida num pó fino, sem poeiras ou num aglomerado, num processo de um passo. A técnica básica compreende os seguintes quatro passos: a) atomização da solução de alimentação num líquido pulverizado; b) contacto líquido pulverizado-ar; c) secagem do líquido pulverizado; e d) separação do produto seco do ar de secagem. As Patentes U.S. N.° 6,235,710 e 6,001,800 descrevem a preparação de eritropoietina recombinante através de secagem por pulverização.

As composições e formulações farmacêuticas da invenção podem compreender um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular que é administrada, assim como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Por conseguinte, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (que incluem veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais) da presente invenção (ver, e.g.. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)).

Os veículos adequados incluem mas não se limitam a, tampões que contêm succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazole, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem, mas não se limitam a, ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular que incluem, mas não se limitam àqueles com menos de cerca de 10 resíduos; proteínas que incluem, mas não se limitam a, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos que incluem, mas não se limitam a, polivinilpirrolidona; aminoácidos que incluem, mas não se limitam a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamato, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outro hidratos de carbono, que incluem, mas não se limitam a, trealose, sacarose, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes que incluem, mas não se limitam a, EDTA e edentato dissódico; iões metálicos bivalentes que incluem, mas não se limitam a, zinco, cobalto ou cobre; açúcar-álcoois que incluem, mas não se limitam a, manitol ou sorbitol; contraiões que formam sais que incluem, mas não se limitam a, sódio e cloreto de sódio; enchimentos tais como celulose microcristalina, lactose, milho e outros amidos; agentes de ligação; edulcorantes e outros aromatizantes; corantes; e/ou tensioativos não iónicos que incluem, mas não se limitam a Tween™ (que incluem, mas não se limitam a, Tween 80 (polissorbato 80) e Tween 20 (polissorbato 20), Pluronics™ e outros ácidos plurónicos, que incluem, mas não se limitam a, ácido plurónico F68 (poloxâmero 188), ou PEG. Os tensioativos adequados incluem, por exemplo, mas não se limitam a poliéteres com base em poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), i.e., (PEO-PPO-PEO), ou poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), i.e., (PPO-PEO-PPO) , ou uma combinação dos mesmos. O PEO-PPO-PEO e o PPO-PEO-PPO estão comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ e R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) e são descritos em mais detalhe na Pat. U.S. N.° 4,820,352. Outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno podem ser tensioativos adequados. Um tensioativo ou uma combinação de tensioativos pode ser utilizado para estabilizar o bG-CSF PEGuilado contra um ou mais stresses que incluem, mas não se limitam ao stress que resulta da agitação. Alguns dos anteriores podem ser referidos como "agentes de volume." Alguns podem ser também referidos como "modificadores de tonicidade." Podem ser também aplicados conservantes antimicrobianos para estabilidade do produto e eficácia antimicrobiana; os conservantes adequados incluem, mas não se limitam a, álcool benzilico, cloreto de benzalcónio, metacresol, metil/propilparabeno e cresol, e fenol, ou uma combinação dos mesmos. A Patente U.S. N.° 7,144,574 descreve materiais adicionais que podem ser adequados em composições e formulações farmacêuticas da invenção e outras preparações para administração.

Os polipéptidos de bG-CSF da invenção, incluindo aqueles ligados a polímeros solúveis em água tais como PEG, podem ser também administrados por, ou como parte de, sistemas de libertação sustentada. As composições de libertação sustentada abrangem, incluindo, mas não se limitando a, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados que incluem, mas não se limitam a, películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustentada incluem as de materiais biocompatíveis tais como poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., supra) ou poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico (EP 133,988), polilactídeos (poli(ácido láctico)) (Patente U.S. N.° 3,773,919; EP 58,481), poliglicolídeo (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-L-glutamato de etilo (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colagénio, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos gordos, fosfolípidos, polissacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicone. As composições de libertação sustentada incluem também um composto capturado em lipossomas. Os lipossomas que contêm o composto são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; Patente U.S. N.° 4,619,794; EP 143,949; Patente U.S. N.° 5,021,234; Pedido Pat. Japonesa 83-118008; Pat. U.S. N.° 4,485, 045 e 4,544,545; e EP 102,324.

Os polipéptidos de bG-CSF capturados em lipossomas podem ser preparados por métodos descritos em, e.g., DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; Patente U.S. N.° 4,619,794; EP 143,949; Patente U.S. N.° 5,021,234; Pedido Pat. Japonesa 83-118008; Patentes U.S. N.° 4,485,045 e 4,544,545; e EP 102,324. A composição e o tamanho de lipossomas são bem conhecidos ou podem ser facilmente determinados de forma empírica por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Alguns exemplos de lipossomas são descritos em, e.g., Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D e Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF Liposomes (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, em Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003) . Um número de formulações de hG-CSF foi descrito e é conhecido pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria A dose administrada a um animal no contexto da presente invenção deve ser suficiente para originar uma resposta benéfica no indivíduo ao longo do tempo. Em geral, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do polipéptido de bG-CSF da presente invenção administrada por via parentérica por dose situa-se na gama de cerca de 0,01 yg/kg/dia a cerca de 100 yg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, de peso corporal do animal, embora esta esteja sujeita a discrição terapêutica. A frequência de administração é também sujeita a discrição terapêutica, e pode ser mais frequente ou menos frequente do que os produtos de polipéptidos de bG-CSF comercialmente disponíveis aprovados para utilização em animais. Em geral, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração descritas acima. XV. Utilizações Terapêuticas de Polipéptidos de bG-CSF da Invenção

Os polipéptidos de b-GCSF da invenção são úteis para tratar uma grande gama de distúrbios. A administração de produtos de hG-CSF resulta na formação de glóbulos brancos em humanos. Assim, administração de polipéptidos de bG-CSF da presente invenção pode ser útil para prevenir infeção em animais que estejam em risco de infeção. Os polipéptidos de bG-CSF da presente invenção podem ser administrados a animais que têm uma infeção. As infeções que podem ser tratadas com polipéptidos de bG-CSF da invenção incluem mas não estão limitados a, mastite e febre dos transportes. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição.

Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas antes e no dia de expedição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da expedição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes da expedição, e além disso administrado no dia de expedição ou até uma semana após a expedição.

Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal sete dias antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal sete dias antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal sete dias antes da parição, e além disso administrado no dia de parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal sete dias antes da parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal uma semana antes da parição, e além disso administrado no dia de parição ou até uma semana após a parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal uma semana antes da parição, e além disso administrado no dia de parição. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a uma vaca antes ou no dia de parição para prevenir doença no vitelo. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a uma vaca antes ou no dia de parição para prevenir doença no vitelo. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado a uma vaca antes do dia da parição para prevenir doença no vitelo. Numa forma de realização da presente invenção, um polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a uma vaca antes do dia de parição para prevenir doença no vitelo. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,4 6; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é PEGuilado e é administrado numa dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é PEGuilado e é administrado numa dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,01 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,01 yg/kg.

Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é PEGuilado e é administrado numa dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é PEGuilado e é administrado numa dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,1 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,1 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,2 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG_CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,2 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,3 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,3 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,4 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,4 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 0,5 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 0,5 yg/kg.

Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 10 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 10 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 20 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 20 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 30 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 30 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 40 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 40 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose de 50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose de 50 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF da presente invenção é administrado numa dose superior a 0,5 yg/kg. Numa forma de realização, o polipéptido de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado numa dose superior a 0,5 yg/kg.

As composições farmacêuticas que contêm o bG-CSF podem ser formuladas a uma potência eficaz para administração por vários meios a um animal que sofre de distúrbios caracterizados por baixa produção ou produção deficiente de glóbulos brancos, quer sozinhos ou como parte de uma condição ou doença. As quantidades médias do bG-CSF podem variar e, em particular, devem basear-se em recomendações e na prescrição por um veterinário qualificado. A quantidade exata de bG-CSF é uma questão de preferência sujeita a fatores tais como o tipo exato de condição a ser tratada, a condição do animal a ser tratado, assim como dos outros ingredientes na composição. A invenção também proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente ativo. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por um especialista com conhecimentos médios na matéria com base na terapia com bG-CSF. Assim, o bG-CSF da presente invenção pode ser utilizado para estimular a produção de glóbulos brancos e corrigir níveis deprimidos de glóbulos vermelhos. Muito comummente, os níveis de glóbulos brancos são reduzidos devido a cancro, infeção ou quimioterapia. Podem ser também tratadas condições que podem levar a neutropenia num animal sob outros aspetos saudável, tal como um tratamento antecipado com agentes anticancerígenos. Em geral, qualquer condição que possa ser tratada com hG-CSF pode ser também tratada com o bG-CSF e/ou conjugados de PEG:bG-CSF da presente invenção. A invenção também proporciona a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente ativo tal como um agente quimioterapêutico anticancerigeno. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica com base na terapia com bG-CSF.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas de uma maneira convencional.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1

Seleção do sítio para a incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente no bG-CSF

Este exemplo descreve alguns dos muitos conjuntos potenciais de critérios para a seleção de sítios de incorporação de aminoácidos não codificados naturalmente no bG-CSF.

Foi gerado um modelo teórico do GCSF bovino utilizando a estrutura cristalina do GCSF humano ligado a recetores (PDB ID N.° 2D9Q) . As coordenadas para esta estrutura do GCSF humano estão disponíveis a partir do Protein Data Bank (PDB) (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 1997, 112, pp 535). Os resíduos potenciais para substituição incluem, mas não se limitam a, sítios e resíduos para substituição conservadora com a maior acessibilidade de solvente utilizando o programa Cx (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18(7):980-4). Os sítios para substituição conservadora identificados por substituição com para-acetilfenilalanina incluem, mas não se limitam a, resíduos de tirosina, fenilalanina e arginina que contêm um núcleo hidrófobo com ou sem carga. Os resíduos que podem ser estruturalmente relevantes não foram selecionados para substituição, incluindo, mas não se limitando a, glicinas, prolinas e resíduos envolvidos na terminação helicoidal. Os resíduos em regiões conhecidas de ligação ao recetor também não foram selecionados para substituição. As posições 123 (Asp) e 141 (Thr) da SEQ ID NO: 1 podem ser críticas para interação com um recetor. A posição 7 (Arg) pode ser crítica para dobragem do polipéptido. A posição 133 (Thr) é o sítio de glicosilação ligada por O no G-CSF humano.

Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições no bG-CSF: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutros polipéptidos de bG-CSF).

Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação das mesmas de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação das mesmas de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de bG-CSF: 62, 133, e uma combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados na posição 62 de bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados na posição 133 de bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, o polipéptido da invenção compreende uma ou mais substituições, adições ou supressões de aminoácidos naturais. Nalgumas formas de realização, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados numa sequência lider ou sinal que é N- ou C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF.

Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, as posições: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF).

Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, as posições: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, as posições: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, as posições: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente em uma ou mais destas posições está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a, 62, 133, e uma combinação das mesmas (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2) . Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente na posição 62 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não codificado naturalmente na posição 133 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Nalgumas formas de realização, o aminoácido não natural na sequência sinal ou líder N- ou C-terminal relativamente à SEQ ID NO: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF está ligado a um polímero solúvel em água.

Exemplo 2

Clonagem e expressão de um polipéptido de bG-CSF que contém um aminoácido não codificado naturalmente e produzido em E. coli

Este exemplo pormenoriza a clonagem e expressão de um polipéptido de bG-CSF que inclui um aminoácido não codificado naturalmente em E. coli e os métodos para avaliar a atividade biológica de polipéptidos de bG-CSF modificados.

Os métodos para clonagem de bG-CSF são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria. As sequências polipeptídica e polinucleotídica para bG-CSF e a clonagem de bG-CSF em células hospedeiras, assim como a purificação de bG-CSF são detalhadas na Patente U.S. N.° 5,849,883, e Heidari et al. Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81:45-57. O ADNc que codifica o bG-CSF maduro é mostrado como SEQ ID NO: 3. O polipéptido codificado por esta sequência é mostrado como SEQ ID NO: 1. O ADNc que codifica o bG-CSF maduro com uma metionina na extremidade N-terminal é mostrado como SEQ ID NO: 4. O polipéptido codificado por esta sequência é mostrado como SEQ ID NO: 2.

Um sistema de tradução introduzido que compreende um ARNt ortogonal (O-ARNt) e uma aminoacil-ARNt-sintetase ortogonal (O-RS) é utilizado para expressar o bG-CSF que contém um aminoácido não codificado naturalmente. A O-RS aminoacila preferencialmente o O-ARNt com um aminoácido não codificado naturalmente. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido não codificado naturalmente no bG-CSF, em resposta a um codão seletor codificado. As sequências de O-RS e O-ARNt adequadas são descritas na WO 2006/068802 intitulada "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof" (E9--SEQ ID NO: 22 & mutante D286R de E9--SEQ ID NO: 24 neste pedido) e na WO 2007/021297 intitulada "Compositions of tRNA and Uses Thereof" (F13; SEQ ID NO: 23 neste pedido.

Tabela 2: sequências de O-RS e O-ARNt. ARNmt hf SEQ ID NO: 5 * " CUA de M. jannaschii ARNt SEQ ID NO: 6 HLAD03; um ARNt supressor âmbar otimizado ARNt SEQ ID NO: 7 HL325A; um ARNt supressor com deslocamento de ARNt grelha AGGA otimizado SEQ ID NO:8 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-L-fenilalanina p-Az-PheRS (6)

SEQ ID NO: 9 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-benzoil-L-fenilalanina p-BpaRS (1) SEQ ID NO:10 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO:11 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO:12 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de propargil-fenilalanina Propargil-PheRS SEQ ID NO:13 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (1) SEQ ID NO:14 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (3) SEQ ID NO:15 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (4) SEQ ID NO:16 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina p-Az-PheRS (2)

SEQ ID NO:17 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-acetil-fenilalanina (LW1)___

SEQ ID NO:18 Amínoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-acetil-fenilalanina (LW5)_

SEQ ID NO:19 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-acetil-fenilalanina (LW6)_

SEQ ID NO:20 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina (AzPheRS-5)_ SEQ ID NO:21 Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação RS de p-azido-fenilalanina (AzPheRS-6)_ A transformação de E. coli com plasmideos que contêm a sequência polinucleotídica de bG-CSF modificada e o par aminoacil-ARNt-sintetase/ARNt ortogonal (especifico para o aminoácido não codificado naturalmente desejado) permite a incorporação especifica em relação ao sítio do aminoácido não codificado naturalmente no polipéptido de bG-CSF. O plasmídeo utilizado para a expressão de bG-CSF é mostrado como Figura 1. O gene de interesse mostrado como um exemplo é bG-CSF com um codão seletor (âmbar) que substitui o codão que codifica a T133. O polipéptido com para-acetilfenilalanina na posição 133 é referido como bG-CSF Tl33pAF. Plpp - promotor constitutivo de E. coli; aglomerado de Pro - cópias tandem de ARNt de prolina de E. coli; aglomerado de F13 - cópias tandem de um ARNt de tirosina de Methanococcus jannaschi modificado da WO 2007/021297; E9 RS (D286R) tirosil-ARNt-sintetase de Methanococcus jannaschi da WO 2006/068802; T7 pro promotor T7; T7 sequência de terminação; ori - origem de replicação; sequência bla (ap) - gene de resistência a ampicilina.

Os polinucleótidos que codificam o bG-CSF de tipo selvagem ou um dos 15 polipéptidos mutantes foram clonados e subsequentemente subclonados no vetor pVK6 por Codon Devices, Inc. Cada construção gerada tinha um codão seletor, um codão âmbar, numa posição diferente. Os polipéptidos de bG-CSF resultantes tinham o aminoácido codificado naturalmente substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente, para-acetilfenilalanina (pAF; pAcF) , em uma das seguintes posições: L3, R7, E33, H43, Q58, S 62, Q67, L69, L99, D123, L124, T133, Q134, T141 e R166 (números das posições referem-se à SEQ ID NO: 1). Uma vez que cada um dos polipéptidos de b-GCSF mutantes gerados tinha, cada, uma metionina na extremidade N-terminal (ver SEQ ID NO: 2 para a sequência de tipo selvagem de G-CSF bovino com a metionina na extremidade N-terminal), os polipéptidos de b-GCSF expressados tinham a substituição de aminoácido não natural na posição número +1 (por exemplo, um mutante tinha a leucina na posição 4 de SEQ ID NO: 2 substituída por pAF). Após verificação da sequência, os plasmídeos foram transformados em células W3110 B2 e as colónias cultivadas em placas com ampicilina. A informação sobre a linha de células de E. coli é mostrada como Figura 2. Estas colónias foram utilizadas para inocular 5 mL de LB com uma diluição 1:1000 de culturas de ampicilina, que foram cultivadas a 37 °C a uma O.D.600 = 0,8. A pAF (para-acetilfenilalanina) foi em seguida adicionada às 15 culturas diferentes a uma concentração final de 4 mM. Após aproximadamente 30 minutos, as culturas foram induzidas com L-arabinose a uma concentração final de 0,2%, e as culturas foram incubadas a 37 °C durante mais 5 horas. Nesta altura, foi retirada uma amostra de 500 pL de cada cultura e centrifugada a 13 000 rpm durante 4 minutos. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi ressuspenso em 150 pL de B-PER com 1 pL de DNAse e incubado à temperatura ambiente de um dia para o outro. Na manhã seguinte, foi adicionado Tampão de Amostra LDS 4X (Invitrogen, Carlsbad, CA), as amostras foram aquecidas a 95 °C durante 5 minutos, e foi adicionado Agente de Redução de Amostra 10X (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As amostras foram em seguida resolvidas por SDS-PAGE em geles com um gradiente de 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) em tampão de MES e visualizadas utilizando Simply Blue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA) . A Figura 3 mostra as amostras geradas a partir das culturas de tipo selvagem e de mutante de bG-CSF após análise em geles com um gradiente de 4-12% e revelação com Coomassie.

Solubilização da Preparação de Corpos de Inclusão A pasta de células foi ressuspensa misturando até um teor final de 10% de sólidos em Tampão I de corpos de inclusão (IB) a 4 °C (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; 4 °C). As células foram sujeitas a lise passando o material ressuspenso através de um microfluidificador um total de duas vezes. As amostras foram centrifugadas a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi decantado. 0 sedimento de corpos de inclusão (IB) foi lavado ressuspendendo num volume adicional de tampão I de IB (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; 4 °C,) e o material ressuspenso foi feio passar através de um microfluidificador um total de duas vezes. As amostras foram em seguida centrifugadas a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi decantado. O sedimento de IB foi ressuspenso num volume de tampão II (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C) . Após ressuspensão, as amostras foram centrifugadas a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi decantado. O sedimento de IB foi em seguida ressuspenso em volume de tampão II (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C) . O IB foi em seguida dividido em aliquotas para recipientes apropriados. As amostras foram centrifugadas a 10 000 g durante 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi decantado. Os corpos de inclusão foram em seguida solubilizados ou armazenados a -80 °C até utilização posterior.

Solubilização dos Corpos de Inclusão

Os corpos de inclusão foram solubilizados a uma concentração final entre 10-15 mg/mL em tampão de solubilização (Tris 20 mM, pH 8,0; Guanidina 8 Μ; β-ΜΕ 10 mM) . Os IB solubilizados foram incubados à temperatura ambiente sob mistura constante durante 1 hora ou até terem sido totalmente solubilizados. A concentração de proteína foi ajustada por diluição com tampão de solubilização adicional, se a concentração de proteína fosse alta.

Redobragem A redobragem foi realizada diluindo as amostras até uma concentração de proteína final de 0,5 mg/mL em Arginina 0,5 M, pH 8,0; 4 °C. As amostras foram deixadas a sofrer redobragem durante 48 a 72 horas a 4 °C.

Purificação

Foi adicionado (NH^SCd sólido às amostras até uma concentração final de 20% sob mistura suave. As amostras foram misturadas suavemente a 4 °C durante 30 minutos. A proteína precipitada (que continha bG-CSF) foi sedimentada por centrifugação a 12 000 g durante 15 minutos. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi ressuspenso em is do volume de redobragem com NaAc 20 mM, pH 4,5. Todo o sedimento não retornou à solução. Apenas o bG-CSF retornou à solução. O material não solubilizado foi sedimentado por centrifugação a 12 000 g durante 15 minutos. As amostras foram decantadas e o sobrenadante foi guardado. O material de bG-CSF foi filtrado através de um filtro de 0,45 ym. O material foi em seguida carregado numa coluna CM FF (GE Healthcare) equilibrada em Tampão A (NaAc 20 mM, pH 4,5) . O material era <10m/S antes da carga na coluna. O bG-CSF foi eluído da coluna com um gradiente linear ao longo de 10 volumes de coluna até 100% de Tampão B (NaAc 20 mM, pH 4,5; NaCl 500 mM) . A Figura 4 mostra a análise por SDS-PAGE revelada com Coomassie das frações de picos da coluna CM FF corrida com com bG-CSF-Tl33pAF. PEGuilação e Purificação 0 pH da mistura de CM foi ajustado a pH 4,0 com ácido acético glacial a 50%. A mistura foi em seguida concentrada até aproximadamente 4,0 mg/mL de proteína. Foi adicionado um excesso molar 12:1 ou 8:1 de hidroxilamina PEG:bG-CSF à mistura. A mistura foi incubada a 28 °C durante 48-72 horas. A mistura foi em seguida diluída 8-10 vezes com água (< 8 m/S) e, em seguida, foi carregada numa coluna SP HP (GE Healthcare) equilibrada com Tampão A (NaAc 20 mM, pH 4,5). O bG-CSF PEGuilado foi eluído com um gradiente linear ao longo de 40 volumes de coluna até 100% de Tampão B (NaAc 20 mM, pH 4,5; NaCl 500 mM). A Figura 5 mostra a análise por SDS-PAGE de frações de picos da coluna SP HP para bG-CSF PEGuilado-Tl33pAF. Por exemplo, pode ser também utilizado 5% de etileno glicol no tampão de eluição.

As frações de bG-CSF PEGuilado foram agrupadas e submetidas a diálise contra Tampão de formulação de bG-CSF (NaAc 4,26 mM, pH 4,0; NaCl 0,565 mM; 0,0033% de Tween 20; 5% de Sorbitol). O material de PEG foi concentrado a entre 6-8 mg/mL de proteína e foi esterilizada por filtração utilizando um filtro de PES de 0,22 ym. A proteína foi armazenada a 4 °C ou congelada instantaneamente e armazenado a -80 °C para armazenamento prolongado. A Figura 6 mostra a análise por SDS-PAGE de b-GCSF antes e após PEGuilação. Faixa 1: bG-CSF-Tl33pAF; Faixa 2: bG-CSF-T133pAF-20KPEG; Faixa 3: marcador de peso molecular SeeBlue Plus 2.

Mapeamento de Péptidos (Tripsina/Endoproteinase Glu-C) de bG-CSF

Foi realizado mapeamento de péptidos para confirmar a incorporação de para-acetilfenilalanina (pAF) num polipéptido de bG-CSF. 0 bG-CSF Tl33pAF purificado antes da PEGuilação e o bG-CSF de tipo selvagem foram diluídos a uma guanidina-HCl 6 M final, Tris 50 mM, pH 7,8 e reduzidos com DTT 10 mM a 37 °C durante uma hora. A amostra foi alquilada com IAA 2 0 mM durante 4 0 minutos no escuro à temperatura ambiente, e a reação foi desativada com a adição de DTT 20 mM final. O material foi submetido a diálise para bicarbonato de amónio 100 mM, pH 7,7 e tratado com tripsina 1:50 (proteína:enzima) durante quatro horas a 37 °C. Esta reação foi seguida da adição de Glu-C 1:20 de um dia para o outro a 25 °C. A digestão foi parada com a adição de TFA até uma concentração final de 0,1%. A amostra foi aplicada numa coluna de fase inversa C8 Grace Vydac em tandem com um espetrómetro de massa de armadilha de iões LCQ Deca da ThermoFinnigan. O gradiente começou a 98% de fase móvel A (0,05% de TFA em água) de forma isocrática durante oito minutos e, em seguida, subiu até 60% de fase móvel B (0,05% de TFA em acetonitrilo) ao longo de 90 minutos com deteção a 214 nm e 250 nm. Foram aplicados um caudal de 0,2 mL/min e uma temperatura da coluna de 40 °C. A tensão do capilar foi fixada a 15V com uma gama de varrimento total de 100-2000 m/z. A tensão de colisão para MS/MS foi de 42% da normalizada. A Figura 7a mostra o produto de digestão com tripsina/Glu-C do bG-CSF de tipo selvagem (Deteção a 214 nm) . A Figura 7b mostra o produto de digestão com tripsina/Glu-C de bG-CSF Tl33pAF (Deteção a 214 nm) . É mostrado o aumento de hidrofobicidade da substituição de treonina por pAF (para-acetilfenilalanina). Para o bG-CSF de tipo selvagem, o tempo de retenção do péptido que continha T133 foi de 42,79 minutos; para o bG-CSF Tl33pAF, o péptido que continha T133pAF foi deslocado e tinha um tempo de retenção de 46,89 minutos. A Figura 8a mostra o produto de digestão com tripsina/Glu-C do bG-CSF de tipo selvagem (Deteção a 250 nm). A Figura 8b mostra o produto de digestão com tripsina/Glu-C do bG-CSF Tl33pAF (Deteção a 250 nm) . Com análise a 250 nm, os sinais de proteínas/péptidos são baixos, mas o sinal devido à pAF é forte. O péptido que continha T133 pAF é indicado na Figura 8b com um tempo de retenção de 46,89 minutos.

Mapeamento de Péptidos (Endoproteinase Glu-C) de

bG-CSF O bG-CSF Tl33pAF purificado antes da PEGuilação foi diluído até uma guanidina-HCl 6 M final, Tris 50 mM, pH 7,8 e reduzido com DTT 10 mM a 37 °C durante uma hora. A amostra foi alquilada com IAA 20 mM durante 40 minutos no escuro à temperatura ambiente e a reação foi parada com a adição de DTT 20 mM final. O material foi submetido a diálise para bicarbonato de amónio 100 mM, pH 7,7 e tratado com Glu-C 1:20 (proteína:enzima) de um dia para o outro a 25 °C. A digestão foi desativada com a adição de TFA até uma concentração final de 0,1%. A amostra foi aplicada sobre uma coluna de fase inversa C8 Grace Vydac em tandem com um espetrómetro de massa de armadilha de iões LCQ Deca da ThermoFinnigan. O gradiente começou a 98% de fase móvel A (0,05% de TFA em água) de forma isocrática durante oito minutos e, em seguida, subiu até 60% de fase móvel B (0,05% de TFA em acetonitrilo) ao longo de 90 minutos com deteção a 214 nm e 250 nm. Foram aplicados um caudal de 0,2 mL/min e uma temperatura da coluna de 40 °C. A tensão do capilar foi ajustada a 15V com uma gama de varrimento total de 100-2000 m/z. A tensão de colisão para MS/MS foi 42% da normalizada. A Figura 9a mostra o produto de digestão com Glu-C do bG-CSF de tipo selvagem (Deteção a 214 nm) . A Figura 9b mostra o produto de digestão com Glu-C do bG-CSF T133pAF (Deteção a 214 nm) . Para o bG-CSF de tipo selvagem, o péptido que continha T133 teve um tempo de retenção de 52,04 minutos; para o Tl33pAF bG-CSF, o péptido que continha Tl33pAF teve um tempo de retenção de 53,95 minutos. A Figura 10a mostra o produto de digestão com Glu-C do bG-CSF de tipo selvagem (Deteção a 250 nm) . A Figura 10b mostra o produto de digestão com Glu-C do bG-CSF Tl33pAF (Deteção a 250 nm). Com análise a 250 nm, os sinais de proteinas/péptidos são baixos, mas o sinal devido à pAF é forte. O péptido que continha T133 pAF é indicado na Figura 10b com um tempo de retenção de 53,95 minutos.

Análise por RP-HPLC e SEC-HPLC dos Polipéptidos

de bG-CSF

Foram utilizadas RP-HPLC e SEC-HPLC para analisar a pureza e determinar a identidade das amostras após purificação. O PEG 20K-bG-CSF Tl33pAF purificado foi diluído até 1 mg/mL com tampão de formulação (acetato de sódio 4,26 mM, pH 4,0, cloreto de sódio 0,565 mM, 0,0033% de Tween-20 e 5% de sorbitol) e foram injetados 10 pL numa coluna de fase inversa de Octilo (C8) de poro largo J.T. Baker (4,6 x 100 mm, 5pm). O gradiente começou com 50% de fase móvel A (0,1% de TFA em água) e subiu até 70% de fase móvel B (0,1% de TFA em acetonitrilo) ao longo de 26 minutos. A coluna foi regenerada com 90% de fase móvel B durante 4 minutos e reequilibrada com 50% de fase móvel A ao longo de 5 minutos. Foram aplicados um caudal de 1,5 mL/min e uma temperatura da coluna de 60 °C, com deteção a 214 nm. A análise foi realizada utilizando o software Chemstation de Agilent. A Tabela 3 mostra o pico principal (PEG 20K-bG-CSF Tl33pAF) com um tempo de retenção de 8,50 minutos. Cálculo de % em área, 91,2% da amostra era b-GCSF PEGuilado.

O bG-CSF que não foi PEGuilado foi também analisado por RP-HPLC. A Tabela 4 mostra o pico principal (bG-CSF Tl33pAF) com um tempo de retenção de 8,893 minutos. Cálculo de % em área, 64,3% da amostra era bG-CSF Tl33pAF.

0 PEG 2 OK-bG-CSF Tl33pAF purificado foi também analisado por SEC-HPLC. A amostra foi injetada pura (2 yL) numa coluna de exclusão molecular TSK Super SW3000 de Tosohaas (4, 6 x 300 mm, 4ym 250À) utilizando um gradiente isocrático de 25 minutos. A fase móvel contém 97% de fosfato de sódio 63 mM, pH 7,0 e 3% de 2-propanol. Foram aplicados um caudal de 0,3 mL/min e uma temperatura da coluna de 25 °C, com deteção a 214 nm. A análise foi realizada utilizando o software Chemstation da Agilent. A Tabela 5 mostra o pico principal com um tempo de retenção de 9,157 minutos. Cálculo de % em área, 98,3% da amostra foi PEG-bG-CSF monomérico. Ver Figura 11 para a análise por SEC-HPLC do polipéptido PEGuilado.

0 bG-CSF que não foi PEGuilado foi também analisado por SEC-HPLC. A Tabela 6 mostra o pico principal com um tempo de retenção de 13,125 minutos. Cálculo de % em área, 99,0% da amostra foi bG-CSF Tl33pAF monomérico. Ver Figura 12 para a análise por SEC-HPLC do polipéptido.

Foi também realizada a análise de alta resolução por ESI-TOF (Agilent Technology) do polipéptido de bG-CSF para confirmar a identidade do polipéptido de bG-CSF. O bG-CSF Tl33pAF purificado foi submetido a diálise para 0,1% de ácido fórmico. A amostra foi aplicada num cartucho de C-18 durante um minuto com água e, em seguida, eluído com 50% de acetonitrilo em água. O tempo de corrida total foi três minutos a um caudal de 0,3 mL/min. A tensão do capilar de ESI foi ajustada a 4 kV e a tensão do fragmentador de MSTOF foi ajustado a 300 V. O envelope de estado de carga varrido foi desconvolucionado para proporcionar um valor MH+. 0 MH+ PM esperado era de 19145. 0 MH+ PM observado foi de 19146.

Ensaio de Proliferação em M-NFS60

Para avaliar a potência das moléculas de bG-CSF, foi realizado um ensaio de proliferação com a linha de células M-NFS60. A linha de células foi adquirida de ATCC (# catálogo CRL-1838). As células foram descongeladas e mantidas em RPMI 1640 + 10% de FBS + penicilina/ estreptomicina + 2-mercaptoetanol 50 uM + 20 ng/mL de mIL-3 (Invitrogen, Carlsbad, CA; mIL3 de BD Pharmingen # cat 554579) . As células foram divididas a cada dois dias e aplicadas a 0,02xl06 células/mL.

No dia antes do ensaio, as células foram divididas em Ο,ΙχΙΟ6 células/mL. Após 16-24 horas, as células foram aplicadas em meio de ensaio em placas de 96 poços de fundo plano pretas a 10 000 células/poço e foram adicionadas, em duplicado, diluições sucessivas dos compostos de bG-CSF. O volume total por poço foi de 100 uL, e o Meio de Ensaio foi RPMI 1640 + 10% de FBS + P/S. Os padrões, tais como Neupogen® e bG-CSF WT, foram também adicionados em duplicado a cada placa. As placas foram em seguida incubadas a 37 °C, 5% de CO2 durante 42 horas. Após esta incubação de 42 horas, foram adicionados 10 uL/poço de Alamar Blue (Biosource # cat: DAL1100) e as placas foram incubadas durante mais 6 horas a 37 °C, 5% de CO2 · As placas foram em seguida centrifugadas a 4000 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente, para se eliminar quaisquer bolhas de ar. As placas foram lidas no fluorómetro Tecan com ajustes de excitação a 535 nm e emissão a 590 nm. As placas foram envolvidas em folha metálica para evitar a exposição à luz do corante sensível à luz Alamar Blue.

Para análise dos dados, foi calculada a média das diluições sucessivas em duplicado para cada composto e foram calculados os valores de EC50 no SigmaPlot. Os valores de EC50 em bruto foram listados para todos os compostos e foram calculadas as diferenças em número de vezes (os compostos de GCSF bovino PEGuilado foram comparados com bG-CSF WT) . As experiências foram corridas várias vezes para estabelecer um CV <20% intraensaio e um CV <30% interensaio. Figura 13/Tabela 7= ensaio de proliferação em M-NFS60 - valores de EC50 em bruto de G-CSF bovino Tl33pAF PEGuilado 20K e de tipo selvagem. Figura 14/Tabela 8= ensaio de proliferação em M-NFS60 - diferenças de EC50 em número de vezes de G-CSF bovino Tl33pAF PEGuilado 20K vs. tipo selvagem.

Foram analisadas outras moléculas de bG-CSF que compreendem uma substituição de aminoácido não codificado naturalmente. A Tabela 9 mostra os valores médios de EC50 obtidos.

Revelação de CDllb de Neutrófilos de Bovino

Foram adicionados 50 uL de sangue de bovino a uma placa de 96 poços em poliestireno não tratada (Cal Poly Pomona). As células foram estimuladas adicionando 50 uL de Neupogen®, Neulasta® ou bG-CSF-Tl33pAcF-PEG 20K diluído em PBS (200 ng/mL a 0,001 ng/mL final). A solução foi misturada suavemente e incubada durante 30 minutos a 39 °C numa incubadora de CO2. Foram adicionados 2 0 ug/mL de anticorpo primário às células (Anti-CDllb bovino de murganho: MM12A, VMRD). As células foram incubadas a 4 °C durante 30 minutos. A placa de ensaio foi centrifugada a 800xg durante 2 minutos e o sobrenadante foi rejeitado. Os eritrócitos foram sujeitos a lise durante 1 minuto, adicionando 150 uL de solução de lise fria (fosfato 0,15 M, pH7,2) e a isotonicidade foi restabelecida adicionando 50 uL de solução de restabelecimento (fosfato 0,15 M, NaCl 0,5 Μ, pH7,4). A placa foi novamente centrifugada e o sobrenadante foi rejeitado. O procedimento de lise foi repetido até todos os glóbulos vermelhos que estavam visíveis terem sido removidos. As células foram lavadas duas vezes com 200 uL de tampão de FACS (lxPBS, HEPES 2,5 mM, 0,1% de azida de sódio, 2,0% de FBS) e ressuspensas em 100 uL de tampão de FACS. Foram adicionados 20 ug/mL de anticorpo secundário (Anti-IgGl de murganho de cabra, ads-PE Humano) e incubados a 4 °C durante 30 minutos no escuro. As células foram sedimentadas e lavadas duas vezes e ressuspensas em 200 uL de tampão de FACS. Foi utilizado o instrumento FACS Array de BD para adquiri 50 000 eventos e contras as células positivas para CDllb. A Figura 15 mostra os resultados da experiência em que neutrófilos de bovino foram revelados com anticorpo contra CDllb para avaliar a sua sensibilidade a várias moléculas. Foi utilizada a Intensidade de Fluorescência Média (MFI) para granulócitos para determinar o nível de apresentação de CDllb na superfície celular. A %MFI é um valor normalizado relativamente a um grupo de controlo não estimulado. Foram geradas as curvas dose-resposta e os valores de EC50 para Neupogen, Neulasta e bG-CSF Tl33pAF-PEG 2 0K com base num ajuste de 4 parâmetros. O valor de EC50 para Neupogen® foi de 3,18 ng/mL. Para Neulasta®, o valor de EC50 foi de 2,84 ng/mL e para o bG-CSF Tl33pAF-PEG 20K o valor de EC50 foi de 6,23 ng/mL.

Exemplo 3

Introdução de um aminoácido que contém carbonllo e reação subsequente com um PEG que contém aminooxilo

Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipéptido de bG-CSF que incorpora um aminoácido não codificado naturalmente que contém cetona que é subsequentemente feito reagir com um PEG que contém aminooxilo de aproximadamente 5 000 de PM. Cada um dos resíduos antes da posição 1 (i.e. na extremidade N- terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF) é substituído separadamente por um aminoácido não codificado naturalmente que tem a seguinte estrutura:

As sequências utilizadas para incorporação específica em relação ao sítio de p-acetil-fenilalanina no bG-CSF são a SEQ ID NO: 3 ou 4 (bG-CSF), e a SEQ ID NO: 23 ARNmtT>'r ou 5 (ARNtmut, CTJA de M. jannaschii) , e SEQ ID NOs: 22, 24, 17, 18, 19 (TyrRS LWl, 5 ou 6) descritas no Exemplo 2 acima.

Uma vez modificado, a variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém carbonilo é feita reagir com um derivado de PEG que contém aminooxilo da forma: R-PEG (N) -0- (CH2) n-0-NH2 em que R é metilo, n é 3 e N é aproximadamente 5 000 de PM. O b-GCSF purificado que contém p-acetilfenilalanina dissolvida a 10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0, ou em Acetato de Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, é feito reagir com um excesso de 10 a 100 vezes de PEG que contém aminooxilo e, em seguida, agitado durante 10 - 16 horas à temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475) . O PEG-b- GCSF é, em seguida, diluído em tampão apropriado para purificação e análise imediatas.

Exemplo 4

Conjugação com um PEG gue consiste num grupo hidroxilamina ligado ao PEG através de uma ligação amida

Um reagente de PEG que tem a seguinte estrutura é acoplado a um aminoácido não codificado naturalmente que contém cetona utilizando o procedimento descrito no Exemplo 3: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) n-0-NH2 em que R = metilo, n=4 e N é aproximadamente 20 000 de PM. As condições de reação, purificação e análise são como descritas no Exemplo 3.

Exemplo 5

Introdução de dois noácidos não codificados natnralmente distintos nos polipéptidos de bGCSF

Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipéptido de bG-CSF que incorpora um aminoácido não codificado naturalmente que compreende uma funcionalidade cetona em duas posições entre os seguintes resíduos: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal) , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF). O polipéptido de bG-CSF é preparado como descrito nos Exemplos 1 e 2, exceto que o codão seletor é introduzido em dois sítios distintos dentro do ácido nucleico.

Exemplo 6

Conjugação do polipéptido de bG-CSF com um PEG que contém hidrazida e redução in situ subsequente

Um polipéptido de bG-CSF que incorpora um aminoácido que contém carbonilo é preparado de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos 2 e 3. Uma vez modificado, um PEG que contém hidrazida que tem a seguinte estrutura é conjugado com o polipéptido de bG-CSF: R-PEG (N) -O- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) n-X-NH-NH2 em que R = metilo, n=2 e N = 10 000 de PM e X é um grupo carbonilo (C=0). O b-GCSF purificado que contém p- acetilfenilalanina é dissolvido entre 0,1-10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0, ou em Acetato de Sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, é feito reagir com um excesso de 1 a 100 vezes de PEG gue contém hidrazida, e a hidrazona correspondente é reduzida in situ por adição de solução-mãe de NaCNBH3 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO), dissolvido em H2O, a uma concentração final de 10-50 mM. As reações são realizadas no escuro a 4 °C à TA durante 18-24 horas. As reações são paradas por adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a cerca de pH 7,6 a uma concentração de Tris final de 50 mM ou diluídas em tampão apropriado para purificação imediata.

Exemplo 7

Introdução de vim amino ácido que contém alcino num polipéptido de bG-CSF e derlvatizaçâo com mPEG-azida

Os seguintes resíduos, antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF), são, cada, substituídos com o seguinte aminoácido não codificado naturalmente:

As sequências utilizadas para incorporação específica em relação ao sítio de p-propargil-tirosina no bG-CSF são a SEQ ID NO: 3 ou 4, a SEQ ID NO: 5 (ARNtmut, À D f- .1 y ? cua m. jannaschii) , e 10, 11, 12 descritas no Exemplo 2 acima. O polipéptido de bG-CSF que contém a propargil-tirosina é expresso em E. coli e purificado utilizando as condições descritas no Exemplo 3. O bG-CSF purificado que contém propargil-tirosina dissolvida a entre 0,1-10 mg/mL em tampão PB (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH = 8) e um excesso de 10 a 1000 vezes de um PEG que contém azida é adicionado à mistura reacional. Em seguida são adicionadas quantidades catalíticas de CuS04 e fio de Cu à mistura reacional. Depois de a mistura ter sido incubada (incluindo, mas não se limitando a, cerca de 4 horas à temperatura ambiente ou 37° C, ou de um dia para o outro a 4 °C), é adicionada H2O e a mistura é filtrada através de uma membrana de diálise. A amostra pode ser analisada quanto à adição, incluindo, mas não se limitando a, por procedimentos semelhantes aos descritos no Exemplo 3.

Neste exemplo, o PEG terá a seguinte estrutura: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) n~N3 em que R é metilo, n é 4 e N é 10 000 de PM.

Exemplo 8

Substituição de um aminoácido hidrófobo grande num polipéptido de bG-CSF por propargil-tirosina

Um resíduo de Phe, Trp ou Tyr presente numa das seguintes regiões de bG-CSF: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF) é substituído pelo seguinte aminoácido não codificado naturalmente como descrito no Exemplo 7:

Uma vez modificado, um PEG é ligado à variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém alcino. O PEG terá a seguinte estrutura:

Me-PEG (N) -O- (CH2) 2-N3 e os procedimentos de acoplamento seguirão aqueles no Exemplo 7. Isto gerará um variante do polipéptido de bG-CSF que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que é aproximadamente isostérico a um dos aminoácidos hidrófobos grandes naturais e que está modificado com um derivado de PEG num sitio distinto dentro do polipéptido.

Exemplo 9

Geração de um homodímero, heterodímero,

homomultímero ou heteromultímero do polipéptido de bG-CSF separado por uma ou mais unidades de ligação de PEG A variante do polipéptido de bG-CSF que contém alcino produzido no Exemplo 7 é feita reagir com um derivado de PEG bifuncional da forma: N3- (CH2) n-C (0) -NH- (CH2) 2-0-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) - (CH2) n~N3 em que n é 4 e o PEG tem um PM médio de aproximadamente 5 000, para gerar o homodímero do polipéptido de bG-CSF correspondente, em que as duas moléculas de bG-CSF estão separadas fisicamente pelo PEG. De uma maneira análoga, um polipéptido de bG-CSF pode ser acoplado com um ou mais de outros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultimeros ou heteromultimeros. 0 acoplamento, a purificação e as análises serão realizados como nos Exemplos 7 e 3.

Exemplo 10

Acoplamento de uma unidade sacarídea a voa polipéptido de bG-CSF

Um resíduo dos seguintes está substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente abaixo: antes da posição 1 (i.e. na extremidade N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (i.e., na extremidade carboxilo da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes noutro polipéptido de bG-CSF) como descrito no Exemplo 3.

Uma vez modificado, a variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém carbonilo é feita reagir com um análogo de aminooxilo ligado em β de N-acetilglucosamina (GlcNAc). A variante do polipéptido de bG-CSF (10 mg/mL) e o aminooxil-sacárido (21 mM) são misturados em tampão aquoso de acetato de sódio 100 mM (pH 5,5) e incubados a 37 °C durante 7 a 26 horas. Um segundo sacárido é acoplado ao primeiro por via enzimática, incubando o polipéptido de bG-CSF conjugado com sacárido (5 mg/mL) com UDP-galactose (16 mM) e β-l,4-galacitosil-transferase (0,4 unidades/mL) em tampão de HEPES 150 mM (pH 7,4) durante 48 horas à temperatura ambiente (Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057-5061).

Exemplo 11

Geração de um polipéptido de bG-CSF PEGuilado antagonista

Um resíduo, incluindo, mas não se limitando a, aqueles envolvidos na ligação ao recetor de bG-CSF é substituído pelo seguinte aminoácido não codificado naturalmente como descrito no Exemplo 3.

Uma vez modificado, a variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém carbonilo será feita reagir com um derivado de PEG que contém aminooxilo da forma: R-PEG (N) -O- (CH2) n-0-NH2 em que R é metilo, n é 4 e N é 20 000 de PM para gerar um polipéptido de b-GCSF antagonista que compreende um aminoácido não codificado naturalmente que está modificado com um derivado de PEG num único sitio dentro do polipéptido. O acoplamento, a purificação e as análises são realizados como no Exemplo 3.

Exemplo 12

Geração de van. homodímero, heterodímero, homomul timer o ou heteromultímero do polipéptido de bG-CSF m que as Moléculas de bG-CSF estão Diretamente Ligadas

Uma variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém alcino pode ser acoplada diretamente a outra variante do polipéptido de bG-CSF que compreende o aminoácido que contém azido. De uma maneira análoga, um polipéptido de bG-CSF pode ser acoplado com um ou mais de outros polipéptidos para formar heterodimeros, homomultimeros ou heteromultimeros. O acoplamento, a purificação e as análises são realizados como nos Exemplos 3, 6 e 7.

Exemplo 13

PEG-OH + Br-iCHy)„-C=CR > -> PEG-Q-(CH )„-C^CR9 A B 0 polialquileno glicol (P-OH) é feito reagir com o halogeneto de alquilo (A) para formar o éter (B) . Nestes compostos, n é um número inteiro desde um a nove e R' pode ser um grupo alquilo ou heteroalquilo Cl a C20, saturado ou insaturado de cadeia linear ou ramificada. R' pode ser também um alquilo cíclico ou heteroalquilo cíclico C3 a C7 saturado ou insaturado, um grupo arilo ou heteroarilo substituído ou não substituído, ou um grupo alcarilo (o alquilo é um alquilo saturado ou insaturado Cl a C20) ou heteroalcarilo substituído ou não substituído. Tipicamente, PEG-OH é polietileno glicol (PEG) ou monometoxi-polietileno glicol (mPEG) com um peso molecular de 800 a 40 000 Daltons (Da) .

Exemplo 14

mPEG-OH + Br-CH2-C=CH - mPEG-0-CH2-C=CH mPEG-OH com um peso molecular de 20 000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). Em seguida foram adicionados à solução uma solução de brometo de propargilo, dissolvido como uma solução a 80% peso em xileno (0,56 mL, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich), e uma quantidade catalítica de Kl e a mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 2 horas. Em seguida foi adicionada água (1 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2CI2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca sobre Na2S04 anidro e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH2CI2 foi adicionada a éter dietílico (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi recolhido, lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco para proporcionar propargil-O-PEG.

Exemplo 15

mPEG-OH + Br- (CH2) 3-C=CH -> mPEG-Q- (CH2) 3~C=H O mPEG-OH com um peso molecular de 20 000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL) . Foram em seguida adicionados à mistura, cinquenta equivalentes de 5-bromo-l-pentino (0,53 mL, 5 mmol, Aldrich) e uma quantidade catalítica de ΚΙ. A mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 16 horas. Em seguida foi adicionada água (1 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2CI2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca sobre Na2S04 anidro e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH2CI2 foi adicionada a éter dietílico (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi recolhido, lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco para proporcionar o alcino correspondente. O 5-cloro-l-pentino pode ser utilizado numa reação semelhante.

Exemplo 16

Produção de mPEG-Q-CH2-C6H4Q-CH2-CnCH

(1) m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br- CH2-C=CH - m-H0CH2C6H40-CH2-C=CH

(2) m-H0CH2C6H40-CH2-C=CH + MsCl + N(Et)3 - m-Ms0CH2C6H40-CH2-C=CH

(3) m-Ms0CH2C6H40-CH2-C=CH + LiBr - m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH (4) mPEG-OH + m-Br-CH2C6H40-CH2-C=CH -> mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-

C=CH A uma solução de álcool3-hidroxibenzílico (2,4 g, 20 mmol) em THF (50 mL) e água (2,5 mL) foi primeiro adicionado hidróxido de sódio em pó (1,5 g, 37,5 mmol) e, em seguida, uma solução de brometo de propargilo, dissolvido como uma solução a 80% em peso em xileno (3,36 mL, 30 mmol). A mistura reacional foi aquecida a refluxo durante 6 horas. À mistura foi adicionado ácido cítrico a 10% (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL) , secas sobre MgS04 e concentradas para dar o álcool 3-propargiloxibenzílico.

Foram adicionados cloreto de metanossulfonilo (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) a uma solução de composto 3 (2,0 g, 11,0 mmol) em CH2CI2 a 0 °C e a reação foi colocado no frigorifico durante 16 horas. Um processamento usual proporcionou o mesilato como um óleo amarelo-pálido. Este óleo (2,4 g, 9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e foi adicionado LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). A mistura reacional foi aquecida a refluxo durante 1 hora e foi em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. À mistura foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL) , secas sobre Na2S04 anidro e concentradas para dar o brometo desejado. mPEG-OH 20 kDa (1,0 g, 0,05 mmol, Sunbio) foi dissolvido em THF (20 mL) e a solução foi arrefecida num banho de gelo. Foi adicionado NaH (6 mg, 0,25 mmol) sob agitação vigorosa ao longo de um período de vários minutos, seguido de adição do brometo obtido a partir do anterior (2,55 g, 11,4 mmol) e uma quantidade catalítica de Kl. 0 banho de arrefecimento foi retirado e a mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 12 horas. Foi adicionada água (1,0 mL) à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2CI2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca sobre Na2S04 anidro e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 mL. A adição gota a gota a uma solução de éter (150 mL) resultou num precipitado branco, que foi recolhido para produzir o derivado de PEG.

Exemplo 17 mPEG-NH2 + X-C (O) - (CH2) n-C=CR' -> mPEG-NH-C (O) -(CH2)n-C=CR'

Os polímeros de poli(etileno glicol) que contêm alcino terminal podem ser também obtidos acoplando um polímero de poli(etileno glicol) que contém um grupo funcional terminal com uma molécula reativa que contém a funcionalidade alcino como se mostra acima, n é entre 1 e 10. R' pode ser H ou um grupo alquilo pequena de Cl a C4.

Exemplo 18

Produção de mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C=H

(1) HO2C-(CH2) 2-C=CH + NHS +DCC-» NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH

(2) mPEG-NH2 + NHSO-C (O) - (CH2) 2-C=CH - mPEG-NH-C (O) - (CH2) 2-C=CH Ácido 4-pentinoico (2,943 g, 3,0 mmol) foi dissolvido em CH2C12 (25 mL) . Foram adicionados N-hidroxissuccinimida (3,80 g, 3,3 mmol) e DCC (4,66 g, 3,0 mmol) e a solução foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. 0 éster de NHS em bruto 7 resultante foi utilizado na reação seguinte sem mais purificação. mPEG-NH2 com um peso molecular de 5 000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) foi dissolvido em THF (50 mL) e a mistura foi arrefecida até 4 °C. Foi adicionado em porções o éster de NHS 7 (400 mg, 0,4 mmol) sob agitação vigorosa. A mistura foi deixada agitar durante 3 horas, enquanto era aquecida até à temperatura ambiente. Em seguida foi adicionada água (2 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2CI2 (50 mL) e a camada orgânica foi separada, seca sobre anidro Na2S04 e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH2CI2 foi adicionada a éter (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi recolhido e seco in vacuo.

Exemplo 19

Preparação de metanossulfonato ou mesílato de poli (etileno glicol)

Este exemplo representa a preparação do éster de metanossulfonilo de poli(etileno glicol) , o qual pode ser também referido como metanossulfonato ou mesilato de poli (etileno glicol) . O tosilato e os halogenetos correspondentes podem ser preparados por procedimentos semelhantes. mPEG-OH + CH3SO2CI + N (Et) 3 - mPEG-0-S02CH3 - m.PEG-N3 0 mPEG-OH (PM = 3 400, 25 g, 10 mmol) em 150 mL de tolueno foi destilado azeotropicamente durante 2 horas sob azoto e a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. Foram adicionados à solução, 40 mL de CH2CI2 seco e 2,1 mL de trietilamina seca (15 mmol) . A solução foi arrefecida num banho de gelo e foram adicionados gota a gota 1,2 mL de cloreto de metanossulfonilo (15 mmol) destilado. A solução foi agitada à temperatura ambiente sob azoto de um dia para o outro e a reação foi desativada adicionando 2 mL de etanol absoluto. A mistura foi evaporada sob vácuo para remover os solventes, principalmente aqueles diferentes de tolueno, filtrada, concentrada novamente sob vácuo e, em seguida, precipitada em 100 mL de éter dietilico. 0 filtrado foi lavado com várias porções de éter dietilico frio e seco in vacuo para proporcionar o mesilato. O mesilato (20 g, 8 mmol) foi dissolvido em 75 mL de THF e a solução foi arrefecida até 4 °C. À solução arrefecida foi adicionada azida de sódio (1,56 g, 24 mmol). A reação foi aquecida a refluxo sob azoto durante 2 horas. Os solventes foram em seguida evaporados e o resíduo diluído com CH2CI2 (50 mL) . A fração orgânica foi lavada com solução de NaCl e seca sobre MgS04 anidro. O volume foi reduzido até 20 mL e o produto foi precipitado por adição a 150 mL de éter seco frio.

Exemplo 20

Produção de mPEG-O-CH2- C6H4: N3

(1) N3-C6H4-CO2H - N3-C6H4CH2OH (2) N3-C6H4CH2OH -> Br-CH2-C6H4-N3 (3) mPEG-OH + Br-CH2-C6H4-N3 - mPEG-0-CH2-C6H4-N3 O álcool 4-azidobenzílico pode ser produzido utilizando o método descrito na Patente U.S. 5,998,595. Foram adicionados cloreto de metanossulfonilo (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) a uma solução de álcool 4-azidobenzilico (1,75 g, 11,0 mmol) em CH2CI2 a 0 °C e a reação foi colocada no frigorifico durante 16 horas. Um processamento usual proporcionou o mesilato como um óleo amarelo-pálido. Este óleo (9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e foi adicionado LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). A mistura reacional foi aquecida a refluxo durante 1 hora e foi em seguida arrefecida até à temperatura ambiente. À mistura foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etilo (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas sobre anidro Na2S04 e concentradas para dar o brometo desejado. mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL) e foi adicionado o brometo (3,32 g, 15 mmol) à mistura juntamente com uma quantidade catalítica de Kl. A mistura resultante foi aquecida a refluxo durante 12 horas. Foi adicionada água (1,0 mL) à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Ao resíduo foi adicionado CH2CI2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca sobre anidro Na2S04 e o volume foi reduzido até aproximadamente 2 mL. A adição gota a gota a uma solução de éter (150 mL) resultou num precipitado, que foi recolhido para produzir mPEG-0-CH2-C6H4-N3.

Exemplo 21

NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H + N3-CH2CH2CO2-NHS ^ N3-CH2CH2-C (O) NH-PEG-O-CH2CH2CO2H NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H (PM 3 400 Da, 2,0 g) foi dissolvido numa solução aquosa saturada de NaHCCb (10 mL) e a solução foi arrefecida até 0 °C. Foi adicionado propionato de 3-azido-l-N-hidroxissuccinimido (5 equiv.) sob agitação vigorosa. Após 3 horas, foram adicionados 20 mL de H2O e a mistura foi agitada durante mais 45 minutos à temperatura ambiente. 0 pH foi ajustado a 3 com H2SO4 0,5 N e foi adicionada NaCl a uma concentração de aproximadamente 15% em peso. A mistura reacional foi extraída com CH2CI2 (100 mL x 3), seca sobre Na2S04 e concentrada. Após precipitação com éter dietílico frio, o produto foi recolhido por filtração e seco sob vácuo para produzir o derivado de omega-carboxi-azida-PEG.

Exemplo 22

mPEG-OMs + HC=CLi -> mPEG-0-CH2-CH2-C=C-H A uma solução de acetileto de lítio (4 equiv.)/ preparada como se conhece na técnica e arrefecida até -7 8 °C em THF, é adicionada gota a gota uma solução de mPEG-OMs dissolvido em THF sob agitação vigorosa. Após 3 horas, a reação é deixada aquecer até à temperatura ambiente e desativada com a adição de 1 mL de butanol. Em seguida são adicionados 20 mL de H2O e a mistura foi agitada durante mais 45 minutos à temperatura ambiente. O pH foi ajustado a 3 com H2SO4 0,5 N e foi adicionado NaCl a uma concentração de aproximadamente 15% em peso. A mistura reacional foi extraída com CH2CI2 (100 mL x 3), seca sobre Na2S04 e concentrada. Após precipitação com éter dietílico frio, o produto foi recolhido por filtração e seco sob vácuo para produzir o 1-(but-3-iniloxi)-metoxipolietileno glicol (mPEG).

Exemplo 23

Incorporação de aminoácidos que contêm azida e acetileno

Os aminoácidos que contêm azida e acetileno podem ser incorporados seletivamente em relação ao sítio em proteínas utilizando os métodos descritos em L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137,- J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Assim que os aminoácidos foram incorporados, a reação de cicloadição é realizada com proteína 0,01 mM em tampão de fosfato (PB), pH 8, na presença de derivado de PEG 2 mM, CuSCA 1 mM, e ~1 mg de fio de Cu durante 4 horas a 37 °C.

Exemplo 24 Síntese de p-Acet±l-D,L-fenilalanina (pAF) e derivados de m-PEG-hidroxilamina A pAF racémica é sintetizada utilizando o procedimento anteriormente descrito em Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746.

Para sintetizar o derivado de m-PEG-hidroxilamina, conclui-se os seguintes procedimentos. A uma solução de ácido (N-t-Boc-aminooxi)acético (0,382 g, 2,0 mmol) e 1,3-Diisopropilcarbodiimida (0,16 mL, 1,0 mmol) em diclorometano (DCM, 7 0 mL) , a qual é agitada à temperatura ambiente (TA) durante 1 hora, são adicionados metoxi-polietileno glicol-amina (m-PEG-NEL, 7,5 g, 0,25 mmol, PM 30 K, de BioVectra) e Diisopropiletilamina (0,1 mL, 0,5 mmol) . A reação é agitada à TA durante 48 horas e, em seguida, é concentrada até cerca de 100 mL. A mistura é adicionada gota a gota a éter frio (800 mL) . O produto protegido com t-Boc precipitou e é recolhido por filtração, lavando com éter 3x100 mL. É adicionalmente purificado duas vezes por redissolução em DCM (100 mL) e precipitação em éter (800 mL) . O produto é seco em vácuo produzindo 7,2 g (96%), confirmado por RMN e teste de ninidrina. A desBoc do produto protegido (7,0 g) obtido acima é realizada em 50% de TFA/DCM (40 mL) a 0 °C durante 1 hora e, em seguida, à TA durante 1,5 hora. Depois de remover a maioria do TFA em vácuo, o sal de TFA do derivado de hidroxilamina é convertido no sal de HC1, adicionando HC1 4N em dioxano (1 mL) ao resíduo. O precipitado é dissolvido em DCM (50 mL) e reprecipitado em éter (800 mL). O produto final (6,8 g, 97%) é recolhido por filtração, lavado com éter 3x 100 mL, seco in vácuo, armazenado sob azoto. Outros derivados de hidroxilamina de PEG (5K, 20K) são sintetizados utilizando o mesmo procedimento.

Exemplo 25

Atividade In Vitro e In Vivo de bG-CSF PEGuilado O PEG-bG-CSF, bG-CSF não modificado e solução tampão são administrados a murganhos ou ratazanas. Os resultados mostrarão uma atividade superior e uma semivida prolongada do bG-CSF PEGuilado da presente invenção em comparação com o bG-CSF não modificado que é indicada por quantidades significativamente aumentadas de neutrófilos e um deslocamento do máximo da contagem de glóbulos brancos utilizando a mesma dose por murganho.

Análise farmacocinética

Um polipéptido de bG-CSF da invenção é administrado pela via intravenosa ou subcutânea em murganhos. É colhido sangue dos animais antes e em pontos no tempo após administração. É recolhido o plasma de cada amostra e analisado por radioimunoensaio. A semivida da eliminação pode ser calculada e comparada entre os polipéptidos de bG-CSF que compreendem um aminoácido não codificado naturalmente e o bG-CSF de tipo selvagem ou várias formas de polipéptidos de bG-CSF da invenção. De forma semelhante, os polipéptidos de bG-CSF da invenção podem ser administrados a macacos cinomolgos. É colhido sangue dos animais antes e em pontos no tempo após administração. É recolhido o plasma de cada amostra e analisado por radioimunoensaio.

Os polipéptidos da invenção podem ser administrados a um modelo animal de doença. Podem ser realizados estudos em animais que envolvem gado bovino exposto a Pasteurella hemolytica, gado bovino com exposição bacteriana da glândula mamária/exposição a mastite (Klebsiella pneumonia). Outros estudos que podem ser realizados avaliam o controlo, incidência e duração da doença respiratória bovina ou a prevenção da mastite coliforme. Os métodos para avaliar a saúde dos animais, produção de leite, contagem de neutrófilos e outros parâmetros são conhecidos por um especialista com conhecimentos médios na matéria. Outro modelos que pode ser utilizados para avaliar os polipéptidos de bG-CSF da invenção incluem, mas não se limitam a, modelos animais de infeção ou exposição a infeção tal como um modelo em hamster de pneumonia por Pseudomonas aeruginosa, um modelo em ratazana de pielonefrite por Candida albicans, modelos que envolvem crias neonatais e modelos que envolvem porcos em crescimento. Alguns destes modelos são descritos na Patente U.S. N.° 5,849,883 e WO 89/10932. Modelos como estes são conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria.

Ensaio com 3H-timidina. O ensaio com 3H-timidina é realizado utilizando métodos padrão. A medula óssea é obtida a partir de murganhos Balb C fêmeas sacrificados ou de outros animais. As células da medula óssea são, por breves instantes, suspensas, centrifugadas e ressuspensas num meio de cultura. Uma aliquota de 160 yL qu8e contém aproximadamente 10 000 células é colocada em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. São adicionadas amostras do análogo de G-CSF purificado (como preparado acima) a cada poço e incubadas durante 68 horas. É adicionada timidina tritiada aos poços e deixada incubar durante mais cinco horas. Após o tempo de incubação de cinco horas, as células são colhidas, filtradas e lavadas exaustivamente. Os filtros são adicionados a um frasco que contém liquido de cintilação. As emissões beta são contadas (contador de cintilação Betaplate de LKB) . Os padrões e análogos são analisados em triplicado, e as amostras que ficam substancialmente acima ou abaixo da curva de calibração são reanalisadas com a diluição apropriada. Os resultados são reportados como a médio dos dados em triplicado do análogo relativamente aos resultados do padrão de bG-CSF inalterado. A indução da proliferação de células da medula óssea humana é analisada com base no aumento da incorporação de 3H-timidina. A medula óssea humana de doadores saudáveis é submetida a um corte de densidade com Ficoll-Hypaque (1,077 g/mL, Pharmacia) e as células de baixa densidade são suspensas em meio de Iscove (GIBCO) que contém 10% de soro fetal bovino e glutamina pen-strep. Subsequentemente, 2xl04 células humanas da medula óssea são incubadas com meio de controlo ou o material de bG-CSF derivado de E. coli recombinante em placas de 9 6 poços de fundo plano a 37 °C em 5% de CO2 em ar durante 2 dias. As amostras são analisadas em duplicado e a concentração variou ao longo de uma gama de 10 000 vezes. As culturas são em seguida pulsadas durante 4 horas com 0,5 yCi/poço de 3H-Timidina (New England Nuclear, Boston, Massa.). A captação de 3H-timidina é medida como descrito em Venuta, et al., Blood, 61, 781 (1983).

Indução da Diferenciação em WEHI-3B D+. A capacidade dos polipéptidos de bG-CSF da presente invenção para induzir a diferenciação da linha de células leucémicas mielomonociticas de murideo WEHI-3B D+ é analisada em meio de ágar semissólido como descrito em Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980). O produto de bG-CSF recombinante e os controlos de meios são incubados com cerca de 60 células WEHI-3B D/poço a 37 °C em 5% de CO2 em ar durante 7 dias. As amostras são incubadas em placas de 24 poços de fundo plano e a concentração modificada ao longo de uma gama de 2000 vezes. As colónias são classifiçados como indiferenciadas, parcialmente diferenciadas ou totalmente diferenciadas e as contagens de células das colónias são contadas microscopicamente.

Ensaios CFU-GM, BFU-E e CFU-GEMM. Constatou-se que os isolados naturais de G-CSF humano e hG-CSF originam a proliferam e diferenciação das células da medula óssea humana. Estas atividades são medidas em ensaios CFU-GM [Broxmeyer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)], BFU-E e CFU-GEMM [Lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)] utilizando células da medula óssea não aderentes de baixa densidade de voluntários humanos saudáveis. Podem ser utilizadas células de outras fontes. É realizada uma comparação das atividades biológicas de CFU-GM, BFU-E e CFU-GEMM utilizando 500 unidades de G-CSF ou polipéptidos de bG-CSF da invenção. São realizados ensaios de colónias com células da medula óssea não aderentes de baixa densidade. As células da medula óssea humana são sujeitas a um corte de densidade com Ficoll-Hypaque (densidade, 1,077 g/cm3; Pharmacia). As células de baixa densidade são em seguida ressuspensas em meio de Dulbecco modificado por Iscove que contém soro fetal de vitelo e colocado para aderência em placas de cultura de tecidos Falcon (N.° 3003, Becton Dickinson, Cockeysville, Md.) durante 1 1/2 horas a 37 °C. O controlo de meio consiste em meio de Dulbecco modificado por Iscove mais 10% de FCS, hemina 0,2 mM e 1 unidade de uma eritropoietina recombinante. Para o ensaio CFU-GM, as células alvo são plaqueadas a lxlO5 em 1 mL de meio de cultura de ágar a 0,3% que inclui meio 5A de McCoy suplementado e 10% de soro fetal de vitelo inativado termicamente. As culturas são classificadas quanto às colónias (maior que 40 células por agregado) e a morfologia é avaliada no dia 7 de cultura. O número de colónias é apresentado como a média ± EPM como determinado a partir de placas em quadruplicado.

Para os ensaios BFU-E e CFU-GEMM, células (lxlO5) são adicionados a uma mistura de 1 mL de meio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco), 0,8% de metilcelulose, 30% de soro fetal de vitelo 2-mercaptoetanol 0,05 nM, hemina 0,2 mM e 1 unidade de eritropoietina recombinante. As placas são incubadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e 5% de O2. A baixa pressão de oxigénio é obtida utilizando um oxirredutor de Reming Bioinstruments (Syracuse, N.Y.). As colónias são classificadas após 14 dias de incubação. O número de colónias é determinado como a média ± EPM, como determinado a partir de placas em duplicado. É expectável que todas as colónias que se formam no ensaio CFU-GM sejam positivas para a cloracetato-esterase e negativas para esterases não especificas (alfa-naftilacetato-esterase) , coerente com as colónias serem de tipo granulócito. É expectável que tanto o G-CSF natural como os polipéptidos de bG-CSF da invenção possuam uma atividade especifica de uma proteina pura a aproximadamente lxlO8 U/mg, quando analisada por diluição sucessiva num ensaio CFU-GM. É importante referir que o bG-CSF da invenção pode ser extremamente puro e isento de outros fatores de crescimento de mamífero potenciais em virtude da sua produção em E. coli. Assim, o bG-CSF pode ser capaz de suportar formação de colónias mistas (CFU-GEMM) e BFU-E quando adicionado na presença de eritropoietina recombinante.

Medição da Semivida in vivo de bG-CSF Conjugado e Não conjugado e Variantes dos Mesmos. São utilizadas ratazanas Sprague Dawley macho (cerca de 7 semanas de idade) . No dia de administração, é medido o peso de cada animal. 100 yg por kg de peso corporal de cada uma das amostras de bG-CSF não conjugado e conjugado são injetados por via intravenosa na veia da cauda de três ratazanas. Ao 1 minuto, 30 minutos, 1, 2, 4, 6 e 24 horas após injeção, são retirados 500 yL de sangue de cada ratazana, mantendo sob anestesia com CO2 · As amostras de sangue são armazenadas à temperatura ambiente durante 1,5 horas, seguido de isolamento do soro por centrifugação (4 o C, 18000xg durante 5 minutos). As amostras de soro são armazenadas a -80° C até ao dia de análise. A quantidade de bG-CSF ativo nas amostras de soro é quantificada pelo ensaio de atividade in vitro de bG-CSF depois de descongelar as amostras sobre gelo.

Medição da Atividade Biológica in vivo em Ratazanas Saudáveis de bG-CSF Conjugado e Não conjugado e Variantes dos Mesmos. A medição dos efeitos biológicos in vivo do bG-CSF em ratazanas Sprague Dawley SPF é utilizada para avaliar a eficácia biológica do bG-CSF conjugado e não conjugado e variantes dos mesmos. No dia de chegada as ratazanas são distribuídas aleatoriamente em grupos de 6. Os animais são colocados em repouso durante um período de 7 dias em que os indivíduos em má condição ou com pesos extremos são rejeitados. A gama de peso das ratazanas no começo do período de repouso é de 250-270 g.

No dia de administração, as ratazanas são mantidas em jejum durante 16 horas, seguido da injeção subcutânea de 100 yg por kg de peso corporal de bG-CSF ou uma variante do mesmo. Cada amostra de bG-CSF é injetada num grupo de 6 ratazanas aleatorizadas. Amostras de sangue de 300 yg de sangue estabilizado com EDTA são colhidas da veia da cauda das ratazanas antes da administração e às 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após administração. As amostras de sangue são analisadas quanto aos seguintes parâmetros hematológicos: hemoglobina, contagem de glóbulos vermelhos, hematócrito, volume celular médio, concentração média de hemoglobina celular, hemoglobina celular média, contagem de glóbulos brancos, contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos). Com base nestas medições é avaliada a eficácia biológica do bG-CSF conjugado e não conjugado e de variantes dos mesmos.

Medição da Atividade Biológica in Vivo em Ratazanas com Neutropenia induzida por Quimioterapia do bG-CSF Conjugado e Não conjugado e Variantes dos Mesmos. Nesta análise são utilizadas ratazanas Sprague Dawley SPF. No dia da chegada as ratazanas são distribuídas aleatoriamente em grupos de 6. Os animais são deixados em repouso durante um período de 7 dias, em que os indivíduos em má condição ou com pesos extremos são rejeitados. A gama de peso das ratazanas no início do período de repouso é de 250-270 g. 24 horas antes da administração das amostras de bG-CSF, as ratazanas são injetadas i.p. com 50 mg por kg de peso corporal de ciclofosfamida (CPA) para induzir neutropenia que imita a neutropenia resultante de quimioterapia anticancerígena. No dia 0, 100 yg por kg de peso corporal de bG-CSF ou uma variante do mesmo são injetados s.c. Cada amostra de bG-CSF é injetada num grupo de 6 ratazanas aleatorizadas. Amostras de sangue de 300 yL de sangue estabilizado com EDTA são colhidas da veia da cauda das ratazanas antes da administração e às 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas após administração. As amostras de sangue são analisadas quanto aos seguintes parâmetros hematológicos: hemoglobina, contagem de glóbulos vermelhos, hematócrito, volume celular médio, concentração média de hemoglobina celular, hemoglobina celular média, contagem de glóbulos brancos, contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos). Com base nestas medições é avaliada a eficácia biológica do bG-CSF conjugado e não conjugado e variantes dos mesmos.

Exemplo 26

Um estudo in vivo que avalia o impacto da variante de PEG 20K do bG-CSF-T!33pAF sobre as respostas hematológicas de gado bovino bG-CSF recombinante que contém uma única substituição por pAF na posição T133 (bG-CSF Tl33pAF-PEG 20K) foi produzido em E. coli. Esta proteína tinha uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 2) e a treonina na posição 134 de SEQ ID NO: 2 foi substituída por para-acetilfenilalanina. A proteína foi PEGuilada no sítio de incorporação de pAF utilizando 20 KD de oxiamino-PEG e purificada por cromatografia líquida de troca catiónica até uma pureza >98%. A formulação final continha 7,377 mg/mL de bG-CSF PEGuilado em tampão de formulação constituído por NaAc 4,26 mM; 5% de sorbitol; 0, 0033% de Tween 20; NaCl 0,565 mM; pH 4,0.

Novilhos cruzados de raça Inglesa ou Continental comercial com aproximadamente 150 kg de peso foram adquiridos e transportados para a instalação de investigação, onde foram identificados individualmente com marcas auriculares e aclimatados durante 7 dias antes da admissão no estudo. Não foram administrados antibióticos ou vacinas aos animais durante os períodos de aquisição ou aclimatação. Não foram administradas medicações simultâneas aos animais durante o estudo. Os animais foram alojados em recintos com pisos com ranhuras em betão e foram expostos à temperatura ambiente. Os animais foram alimentados uma vez por dia para satisfazer o apetite com uma ração em pastilhas completa (Rumilab® 5508). O estudo foi realizado utilizando uma conceção de blocos completos aleatorizados, onde os vitelos estavam distribuídos em bloco por recinto. Doze animais foram designados para os grupos tratados ou de controlo negativo (tampão de formulação sem proteína) (6 animais/tratamento). Os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos blocos e pelos tratamentos dentro dos blocos.

No dia -1, os vitelos foram avaliados por um veterinário para sinais clínicos de doença. As avaliações incluíram frequência do pulso, taxa respiratória e temperaturas retais, assim como a condição global. Foram determinados os pesos corporais e as temperaturas retais e foram colhidas amostras de sangue anticoagulado para avaliações hematológicas (amostra de pré-tratamento). Os animais dentro da gama de peso especificada com perfis hematológicos normais com base nas gamas de referência da literatura e sem sinais clínicos de doença foram selecionados para inclusão no estudo.

No dia 0, os vitelos foram tratados com uma única injeção subcutânea de bG-CSF PEGuilado Tl33pAF (40 yg/kg) ou tampão de formulação (1 mL/125 kg). Foram administradas injeções na região pré-escapular no lado esquerdo do pescoço.

Foram colhidas amostras de sangue inteiro venoso (~30 mL) em tubos estéreis que continham EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) para contagens absolutas de leucócitos ou ACD (ácido-citrato-dextrose) para determinação das contagens absolutas de neutrófilos. As contagens absolutas de leucócitos foram determinadas utilizando um utilizando um analisador de sangue Coulter ACTίο™ da Beckman. As contagens absolutas de neutrófilos (ANC) foram determinadas através de avaliação citométrica de fluxo da percentagem de neutrófilos em amostras de sangue inteiro reveladas com CD45 utilizando um bioanalisador FACSarray™ da Becton Dickinson. As contagens absolutas de neutrófilos foram calculadas multiplicando a contagem absoluta de leucócitos pela percentagem de neutrófilos.

Além das amostras de pré-tratamento recolhidas no dia -1, foram recolhidas amostras às 4, 8 e 12 horas no dia 0, 24 e 36 horas após tratamento, e uma vez por dia nos dias 3-14.

Os resultados da administração de bG-CSF PEGuilado na ANC são apresentados na Figura 16. Os animais tratados com tampão de formulação sozinho exibiram valores de ANC relativamente constantes ao longo de toda a duração do estudo. Pelo contrário, os animais que receberam bG-CSF PEGuilado exibiram um aumento acentuado na ANC em menos de 8 horas após tratamento. Os valores máximos de ANC (aproximadamente 10 vezes acima dos niveis de pré-tratamento) foram observados às 72 horas após tratamento. As contagens absolutas de neutrófilos diminuíram até aproximadamente 4 a 5 vezes acima do nivel de pré-tratamento pelo dia 5 após tratamento e permaneceram a este nivel até ao dia 10. Os valores diminuíram ainda mais até cerca de 3,5 vezes acima do nivel de pré-tratamento desde o dia 11 até ao dia 14.

Estes resultados indicam que a PEGuilação específica em relação ao sítio do bG-CSF na posição T133 permitiu-nos obter atividade hematopoiética potente que persistiu durante pelo menos duas semanas em vitelos tratados com uma única injeção de proteína.

Exemplo 27

Resumo do Estudo Hematológico da Variante PEGuilada de bG-CSF T-133

Foi realizado um estudo in vivo para avaliar o impacto da variante com PEG 20K de bG-CSF-Tl33pAF nas respostas hematológicas de gado bovino. bG-CSF recombinante que continha uma única substituição por pAF na posição T133 foi produzido em E. coli. A proteína foi PEGuilada no sítio de incorporação de pAF utilizando oxiamino-PEG 20 KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular até uma pureza >98%. A formulação final continha 7,377 mg/mL de bG-CSF PEGuilado em tampão de formulação constituído por NaAc 4,26 mM; 5% de sorbitol; 0, 0033% de Tween 20; NaCl 0,565 mM; pH 4,0.

Novilhos cruzados de raça Inglesa ou Continental comerciais com aproximadamente 150 kg de peso foram adquiridos e transportados para a instalação de investigação, onde foram identificados individualmente com marcas auriculares e aclimatados durante 7 dias antes da admissão no estudo. Não foram administrados antibióticos ou vacinas aos animais durante os períodos de aquisição ou aclimatação. Não foram administradas medicações simultâneas aos animais durante o estudo. Os animais foram alojados em recintos com pisos com ranhuras em betão e foram expostos à temperatura ambiente. Os animais foram alimentados uma vez por dia para satisfazer o apetite com uma ração em pastilhas completa (Rumilab® 5508). 0 estudo foi realizado utilizando uma conceção de blocos completos aleatorizados, onde os vitelos estavam distribuídos em blocos por recinto. Doze animais foram designados para grupos tratados ou controlo negativo (tampão de formulação sem proteína) (6 animais/grupo de tratamento.). Os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos blocos e pelos tratamentos dentro dos blocos.

No dia -1, os vitelos foram avaliados por um veterinário para sinais clínicos de doença. As avaliações incluíram a frequência do pulso, taxa respiratória e temperaturas retais assim como a condição global. Foram determinados os pesos corporais e as temperaturas retais e foram colhidas amostras de sangue anticoagulado para avaliações hematológicas (amostra pré-tratamento). Os animais dentro da gama de peso especificada com perfis hematológicos normais com base em gamas de referência da literatura e sem sinais clínicos de doença foram selecionados para inclusão no estudo.

No dia 0, os vitelos foram tratados com uma única injeção subcutânea de bG-CSF PEGuilado (40 yg/kg) ou tampão de formulação (1 mL/125 kg). As injeções foram administradas na região pré-escapular no lado esquerdo do pescoço.

Foram colhidas amostras de sangue inteiro venoso (~30 mL) para tubos estéreis que continham EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) para contagens absolutas de leucócitos ou ACD (ácido-citrato-dextrose) para determinação das contagens absolutas de neutrófilos. As contagens absolutas de leucócitos foram determinadas utilizando um analisador de sangue utilizando um Coulter ACTIO™ da Beckman. As contagens absolutas de neutrófilos (ANC) foram determinadas através de avaliação citométrica de fluxo da percentagem de neutrófilos em amostras de sangue inteiro reveladas com CD45 utilizando um bioanalisador FACSarray™ da Becton Dickinson. As contagens absolutas de neutrófilos foram calculadas multiplicando a contagem absoluta de leucócitos pela percentagem de neutrófilos.

Além das amostras de pré-tratamento recolhidas no dia -1, foram recolhidas amostras às 4, 8 e 12 horas no dia 0, 24 e 36 horas no dia 1 e uma vez por dia nos dias 3-14.

Os resultados da administração de bG-CSF PEGuilado sobre a ANC são apresentados na Figura 17. Os animais tratados com tampão de formulação sozinho exibiram valores de ANC relativamente constantes ao longo de toda a duração do estudo. Pelo contrário, os animais que receberam bG-CSF PEGuilado exibiram um aumento acentuado na ANC em menos de 8 horas após tratamento. Os valores máximos de ANC (aproximadamente 10 vezes acima dos níveis de pré- tratamento) foram observados às 72 horas após tratamento. As contagens absolutas de neutrófilos diminuíram até aproximadamente 4 a 5 vezes acima do nível de pré-tratamento pelo dia 5 após tratamento e permaneceram neste nível até dia 10. Os valores diminuíram ainda mais até cerca de 3,5 vezes acima do nível de pré-tratamento desde o dia 11 até ao dia 14 (ver Figura 17).

Entende-se que os exemplos e formas de realização aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e são incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e âmbito das reivindicações apensas.

Exemplo 28

Resvaao do Estudo de Eficácia na Mas ti te da variante PEGuilada de bG-CSF T-133 A eficácia metafilática da variante com PEG 20K do bG-CSF-Tl33pAF contra infeções intramamárias naturais associadas a agentes patogénicos chave da mastite foi avaliada utilizando um modelo de infeção de mastite induzida. bG-CSF recombinante que contém uma única substituição por pAF na posição T133 foi produzido em E. coli. A proteína foi PEGuilada no sítio de incorporação de pAF utilizando oxiamino-PEG 20 KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular. A formulação final continha bG-CSF PEGuilado em tampão de formulação constituído por NaAc 10 mM; 5% de sorbitol e 0,0033% de Tween 20 a pH 4,0. São selecionadas vacas periparturientes Holstein-Friesian multíparas com aproximadamente 600-800 kg de peso a partir de rebanhos de produção comercial. Não são administrados tratamentos antibacterianos às vacas dentro de 30 dias antes da admissão no estudo. Os animais foram alimentados com uma ração para vacas seca apropriada antes da parição e uma ração para vacas de transição que começou no dia de parição e que foi prosseguida durante a duração do estudo. Os animais tiveram acesso ad libitum a água fresca. Foram seguidos procedimentos de criação de gado leiteiro de rotina e as vacas foram ordenhadas duas vezes por dia.

As vacas saudáveis foram envolvidas no estudo aproximadamente sete dias antes da sua data prevista de parição com base no registo de reprodução e uma avaliação da sua prontidão para parir pelos pastores. As vacas foram distribuídas pelos grupos de tratamento utilizando uma conceção completamente aleatorizada. Cada grupo de tratamento continha aproximadamente cinquenta vacas.

As vacas foram tratadas com soro fisiológico estéril (controlo negativo), injeções diárias (dia -7 ao dia 6) de bG-CSF não PEGuilado-Tl33pAF ou várias doses da variante com PEG 20K de bG-CSF-Tl33pAF no dia de admissão e no dia de parição. Os tratamentos foram administrados via injeção subcutânea na região pré-escapular do pescoço.

Os animais foram observados para sinais clínicos de mastite em cada ordenha nos dias 0-28 por um indivíduo cego para os grupos de tratamento. As observações específicas incluíram a atribuição de uma pontuação clínica com base no aspeto do leite e condição da glândula mamária. Se fosse observada alguma anormalidade, era realizado um Teste para Mastite da Califórnia no (s) quarto(s) afetado(s) e era registada a temperatura retal do animal. Quaisquer animais que morreram durante o decorrer do estudo foram autopsiados para determinar a causa de morte, se for possível. O rendimento leiteiro foi registado a cada ordenha nos dias 0-28, e foram recolhidas amostras de leite compósitas dos quartos saudáveis nos dias 3, 5, 7 e 10 para análises da composição do leite incluindo: contagens de células somáticas, gordura no leite, proteína no leite, lactose e sólidos. Foram também recolhidas amostras de leite adicionais de quartos que exibem anormalidades clinicas para a identificação de agentes patogénicos bacterianos.

As percentagens de nascimentos vivos e as taxas de conceção do primeiro serviço após nova reprodução por inseminação artificial foram recolhidas para todas as vacas envolvidas no estudo para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a saúde reprodutiva. Foram também registadas observações de saúde diárias para todos os vitelos durante os primeiros 30 dias de vida e quaisquer anormalidades foram documentadas para avaliar o impacto de tratamentos sobre a saúde dos vitelos. A eficácia foi avaliada comparando as taxas de morbidade entre os grupos de tratamento tanto para as vacas como para os quartos individuais. Os critérios secundários incluíram a avaliação do impacto dos tratamentos sobre a incidência de mortalidades, produção de leite, composição do leite e taxas de conceção do primeiro serviço. O impacto dos vários tratamentos sobre a incidência de mastite clínica e de mortalidades está resumido na Tabela 10.

A administração de doses diárias de bG-CSF T-133 pAF não PEGuilado reduziu significativamente a incidência de novas infeções clínicas de mastite relativamente aos controlos de soro fisiológico. A administração de qualquer dose de bG-CSF Tl33-pAF PEG 20K reduziu significativamente a incidência de novas infeções clínicas de mastite relativamente aos controlos de soro fisiológico ou às injeções diárias de bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado. A administração de qualquer dose de bG-CSF Tl33-pAF-PEG 20K proporcionou uma pequena redução numérica no número de mortalidades relativamente aos controlos de soro fisiológico. 0 impacto dos tratamentos na produção diária de leite por vacas saudáveis está resumido na Figura 18. Os níveis de produção de leite foram semelhantes para vacas tratadas com soro fisiológico estéril, bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado e a dose menor de bG-CSF Tl33-pAF PEG 20K. Estes animais exibiram aumentos na produção de leite ao longo da duração do estudo típicos dos normalmente observados durante o primeiro mês de lactação. Os animais tratados com a dose mais alta de bG-CSF Tl33-pAF PEG 20K exibiram produção de leite diária reduzida de forma não significativa relativamente aos outros tratamentos ao longo de toda a duração do estudo. 0 impacto dos tratamentos nas contagens de células somáticas é resumido na Figura 19. Os animais tratados com bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado ou bG-CSF T133 pAF PEG 20K exibiram contagens de células somáticas que eram semelhantes ou inferiores àquelas observadas nos controlos salinos nos Dias 3, 5 e 7 após parição. Pelo Dia 10 após parição, as contagens de células somáticas para animais tratados com bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado ou bG-CSF T133 pAF PEG 20K foram significativamente inferiores às dos controlos de soro fisiológico, o que sugere que estes tratamentos reduziam provavelmente a incidência de mastite não clinica além de mastite clinica.

Os resultados das análises microbiológicas indicavam que as vacas mórbidas exibiam uma gama típica de agentes patogénicos bacterianos incluindo coliformes, espécies de Streptococcus, espécies de Staphylococcus e espécies de Bacillus. Estes resultados sugerem que a administração de bG-CSF Tl33-pAF PEG 20K foi eficaz na redução da doença contra espécies Gram-positivas e Gram-negativas de bactérias. O impacto dos tratamentos sobre os nascimentos vivos e as taxas de conceção do primeiro serviço são resumidos na Tabela 11. Não existem diferenças significativas nas percentagens de nascimentos vivos entre tratamentos, o que sugere que os tratamentos experimentais não tiveram impacto na viabilidade dos vitelos no útero. Houve uma melhoria numérica nas taxas de conceção do primeiro serviço entre animais tratados com bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado ou bG-CSF T133 pAF PEG 20K e os controlos de soro fisiológico. Estes resultados sugerem que os tratamentos experimentais não tiveram qualquer impacto negativo na saúde reprodutiva.

0 impacto da exposição no útero aos tratamentos na saúde de vitelos nascidos de animais envolvidos no estudo é resumido na Tabela 12. Estes resultados indicam que nenhum dos tratamentos experimentais reduziu a incidência de doença entérica ou respiratória relativamente aos controlos de soro fisiológico durante os primeiros trinta dias de vida. No entanto, tanto o bG-CSF Tl33-pAF não PEGuilado como o bG-CSF T133 pAF PEG 20K reduziram significativamente o número de mortalidades relativamente aos controlos de soro fisiológico. Estes resultados sugerem que os tratamentos experimentais tinham um impacto positivo na gravidade da doença.

Exemplo 29

Variante PEGuilada de bG-CSF T-133 na Doença Respiratória

Resumo do Estudo de Eficácia A eficácia metafilática de várias doses da variante com PEG 20K do bG-CSF-Tl33 pAF contra doença respiratória bovina natural é avaliada sob condições de parque de engorda comerciais. bG-CSF recombinante que contém uma única substituição por pAF na posição T133 é produzido em E. coli. A proteína é PEGuilada no sítio de incorporação de pAF utilizando oxiamino-PEG 20 KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular. A formulação final contém bG-CSF PEGuilado em tampão de formulação constituído por NaAc 10 mM; 5% de sorbitol e 0,0033% de Tween 20 a pH 4,0.

Novilhos cruzados de raça Inglesa ou Continental comerciais com aproximadamente 500 lb. de peso e típicos de vitelos de criadores comerciais são adquiridos em um ou mais estábulos de venda no Sudeste dos EUA. Após chegada ao sítio de mistura, os animais são identificados individualmente e examinados por um veterinário para anomalias clínicas. As temperaturas retais são também registadas e os animais que estão isentos de sinais clínicos de doença e têm temperaturas retais âl04 °F são selecionados para admissão no estudo. Antes do tratamento são obtidas amostras de sangue para contagens de glóbulos brancos totais e diferenciais.

Os vitelos são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de tratamento como se resume na Tabela 13.

Soro fisiológico estéril ou bG-CSF-Tl33 pAF PEG 20K é administrado por injeção subcutânea na região pré-escapular do pescoço.

Na manhã seguinte, os vitelos são carregados em camiões e despachados aproximadamente 1400 milhas até um parque de engorda comercial no Colorado do Norte. À chegada, os vitelos são descarregados para recintos de chegada e é proporcionado acesso a alimentos e água. Dentro de quatro horas após a chegada, os animais são transferidos para uma área de processamento, onde são pesados e os primeiros dez vitelos designados para cada grupo de tratamento são sangrados para se obter amostras para as contagens de glóbulos brancos totais e diferenciais. Estas contagens são utilizadas para confirmar que os animais respondem ao tratamento como evidenciado por um aumento nos números absolutos de neutrófilos. Os vitelos são distribuídos aleatoriamente por recintos de estudo que contêm cinco animais de cada grupo de tratamento para um total de 20 animais por recinto.

Os vitelos são observados diariamente para sinais clínicos de doença durante 14 dias após a chegada por um veterinário cego relativamente às atribuições de tratamento. Cada animal recebe uma pontuação patológica que varia desde 0 (saudável) até 4 (moribundo) . Os animais que apresentam pontuações patológicas >0 são transferidos para uma área de processamento e a sua temperatura retal é registada. Os animais que apresentam pontuações patológicas >0 e temperaturas retais >104 °F são identificados como mórbidos e são tratados com um antibiótico aprovado e retornados para o seu recinto de estudo. As identidades dos animais que morrem durante o decorrer do estudo são registadas e o animal é autopsiado para determinar a causa de morte. O critério primário para determinar a eficácia é as taxas de morbidade relativa entre grupos de tratamento. Os critérios de eficácia secundários incluem as taxas de mortalidade, ganhos de peso médios diários e pontuações patológicas médias diárias para cada grupo de tratamento.

Entende-se que os exemplos e as formas de realização aqui descritas são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria e são incluídas dentro do espirito e alcance dets pedido e âmbito das reivindicações apensas.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Hays Putnam, Anna-Maria Knudsen, Nick Norman, Thea Koder, Alan Kraynov, Vadim Ho, Lillian Canning, Peter <120> Polipéptidos de G-CSF Bovino Modificados e Suas Utilizações

<130> AMBX-0154.00PCT <150> 61/083,132 <151> 2008-07-23 <160> 24 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Bos taurus <4 Ο 0> 1

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Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 15 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met lie Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp lie lie lie 50 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu .Asn Pro 130 .135 140 nys Vjiu vai lie iyt no u« n«u win vai Agn t‘ro Leu His 145 150 155 160

Tyr Gin Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lvs lie 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lvs Val Val Cys lie I-Iis 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala 210 215 220

Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cvs Pro Ala Gly val Val Glu Gly A.sn Pro 225 230 ' 235 240

He Met: Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr He Lys 245 250 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 * 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala val Ala Glu Glu Leu lie Lys He Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 15 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <4 Ο 0> 15

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 15 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met lie Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp lie lie lie 50 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu He Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val lie Tyr Pro He Met Gin Val Asn Pro Val His 145 150 155 160

Tyr Gin Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys He 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe He Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu He Arg Ala 210 215 220

Lys He Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr He Lys 245 250 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu He Lys He Leu Glu Pro He Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 16 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 16

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu He He Ser 1 5 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 ' 30

He Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys He His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met He Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp He He He 50 * 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu He Arg Lys He Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 12Ò 125

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val He Tyr Pro He Met Gin Val Asn Pro Ser His 145 150 * 155 160

Tyr Gin Glv Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys He 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu He Arg Ala 210 215 220

Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 ' 235 240

He Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr lie Lys 245 " 250 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala Vai Ala Glu Glu Leu lie Lys He Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-acetil-fenilalanina <4 0 0> 17

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie He Ser 1 5 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30

He Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys He His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45

He Lys Lys Met He Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp lie He lie 50 " " 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys He Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lvs Thr Thr Leu Lys 115 " 120 " 125

Arq Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val lie Tyr Pro lie Met Gin Val Asn Gly Cys His 145 150 155 " 160

Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys lie 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys lie His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 " 205

Lys Gly Asn Fhe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Lie Arg Ala 210 215 220

Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr lie Lys 245 250 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 18 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-acetilo -fenilalanina <400> 18

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 15 10 15

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu He Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 no

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arq Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 ' 120 125

Arg Ala Arg A.rg Ser Met Glu Leu He Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val He Tyr Pro He Met Gin Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160

Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Giu Gin Arg Lys lie 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys lie His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala 210 215 220

Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 " 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr lie Lys 245 ' 250 ' 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 27 0

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala val Ala Glu Glu Leu lie Lys He Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 19 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-acetil-fenilalanina <400> 19

Met Asp Giu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Giu lie He Ser 15 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 ' 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys He His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met He Asp Leu Gin Asn Ala Giv Phe Asp He He He 50 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phs Glu Ala Met 85 30 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 HO

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu He Ala Arg Glu A.sp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val He Tyr Pro He Met Gin Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160

Tyr Leu Gly Val Asp Val He Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys He 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala 210 215 220

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 20

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 15 10 15

Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val lie Tyr Pro lie Met Gin Val Asn Val He His 145 150 155 160

Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys He 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe He Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Gin He Arg Ala 210 215 220

Lys He Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Lea Glu Tyr Pro Leu Thr lie Lys 245 ’ 250 ' 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lys .230 295 300

Arg Leu 305 <210> 21 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Aminoacil-ARNt-sintetase para a incorporação de p-azido-fenilalanina <400> 21

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 1 5 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 2D 25 ~ 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met lie Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp lie lie lie 50 55 60

Leu Leu Ala A.sp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 " ~ 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys -Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gin Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125

Arq Ala Arq Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140

Lys Val Ala. Glu Val. He Tyr Pro He Piet Gin Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160

Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met. Glu Gin Arg Lys He 165 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 "* 205

Lys Gly Asn Phe He Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu lie Arg Ala 210 215 220

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285

Aan Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys He Leu Glu Pro He Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305 <210> 22 <211> 921 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintetase mutante derivada de sintetase de Methanococcus jannaschii <400> 22 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctgttatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tatatttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtga acatggtctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgggattcat 480 tatgagggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 23 <211> 77 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ARNt mutante derivado de ARNt de Methanococcus j annaschii <400> 23 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccagcccgc cggacca 77 <210> 24 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintetase mutante derivada de sintetase de Methanococcus jannaschii <400> 24

Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie Ser 15 10 15

Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val 20 25 30 lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gin 35 40 45 lie Lys Lys Met lie Asp Leu Gin Asn Ala Gly Phe Asp lie lie lie 50 55 60

Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gin Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80

Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95

Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110

Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125

Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu lie Ala Arg Glu Asp Glu Asn Fro 130 135 140

Lys Val Ala Glu Val lie Tyr Pro He Met Gin Val Asn Gly lie His 145 150 .155 160

Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gin Arg Lys He 165 ~ 170 175

His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys He His 180 185 190

Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205

Lys Gly Asn Phe lie Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu He Arg Ala 210 215 220

Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 lie Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr He Lys 245 " 250 255

Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270

Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285

Jisn Ala Val Ala Glu Glu Leu lie Lys He Leu Glu Pro lie Arg Lys 290 295 300

Arg Leu 305

Lisboa, 04 de janeiro de 2018

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipéptido de bG-CSF que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ.ID.NO: 1 ou SEQ.ID.NO: 2, em que o aminoácido na posição 133 da SEQ.ID.NO: 1, ou o aminoácido correspondente da SEQ.ID.N0:2, é substituído pelo aminoácido não codificado naturalmente para-acetilfenilalanina, em que o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água que compreende uma unidade de poli(etileno)glicol; e o polímero solúvel em água tem um peso molecular de 20 KDa.
2. Formulação farmacêutica que compreende o polipéptido de bG-CFS de acordo com a reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. Composição que compreende o polipéptido de bG-CSF de acordo com a reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição da reivindicação 3 para utilização no tratamento ou prevenção de uma infeção num animal ou para tratamento de um animal com mastite.
5. Polipéptido de bG-CSF da reivindicação 1 em que o polímero solúvel em água está ligado ao referido polipéptido por uma ligação oxima. Lisboa, 03 de janeiro de 2018