PT2343975E - Composições anti-incrustantes de espinosina, métodos de utilização das mesmas e artigos protegidos da fixação de organismos de incrustação biológica - Google Patents

Description

COMPOSIÇÕES ΑΝΤΙ—INCRUSTANTES DE ESPINOSINA, MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DAS MESMAS E ARTIGOS PROTEGIDOS DA FIXAÇÃO DE ORGANISMOS DE INCRUSTAÇÃO BIOLÓGICA

Este pedido reivindica prioridade em relação ao Pedido de Patente US No. 61/099,053, depositado em 22 de Setembro de 2008 . A presente invenção refere-se a composições de revestimento de espinosina que conferem propriedades anti-incrustantes no mar e em água doce.

As composições de revestimento conferem protecção às superfícies revistas com as mesmas, impedindo a fixação de vários organismos de incrustação biológica. Estas composições têm a vantagem de serem utilizadas em tinta, verniz, primário e formulações vedantes.

Os biocidas são geralmente usados numa variedade de materiais de revestimento com várias aplicações. Em tintas marinhas, por exemplo, os biocidas protegem estruturas subaquáticas contra a fixação de uma vasta gama de organismos de incrustação biológica, tais como algas, cracas, vermes de navios e outras espécies aquáticas incómodas. Nos lagos e rios, os biocidas são utilizados para proteger estruturas subaquáticas de organismos de água doce, tais como os mexilhões zebra. Verificou-se que os microorganismos, a sua viscosidade, o produto bio-orgânico e a matéria orgânica absorvida constituem um lodo tenaz que se forma nas superfícies de estruturas submersas. Os primeiros organismos nesta sequência de incrustação são as bactérias, seguidas pela progressão biótica de diatomáceas, hydridos, algas, briozoários, protozoários e finalmente os macros incrustantes Os macros incrustantes tendem a ser rugofílicos, isto é, 1 fixando-se de preferência em superfícies rugosas, em vez de superfícies lisas. 0 casco de um navio está constantemente imerso em água durante vários anos e a acumulação destes mesmos organismos marinhos pode implicar uma resistência hidrodinâmica significativa ao navio. Esta resistência no navio dificulta a sua passagem através da água, resultando num acréscimo de consumo de combustível, fazendo com que os custos operacionais e ambientais sejam superiores. Estima-se que, a ausência de tratamento dos cascos do navio custaria, anualmente, à indústria naval mais 3 bilhões de dólares em combustível. Os custos adicionais ocorrem quando o navio é colocado em doca seca. Estes custos, estimados em 2,7 bilhões de dólares anualmente, incluem a limpeza do casco e o tempo que o navio está parado. Para além disso, os custos ambientais não resultam apenas do aumento do consumo de combustíveis fósseis (um recurso não renovável), mas também do aumento da quantidade de dióxido de carbono (um gás de efeito estufa) e outros poluentes atmosféricos (óxidos de nitrogénio, óxidos de enxofre, hidrocarbonetos não queimados, ozono, etc.). Rouhi, A. Maureen; The Squeeze on Tributyltins. Chem. Eng. News 27 de Abril de 1998, 41-42.

Contudo, o problema da incrustação não está limitado aos navios, mas estende-se também a outras estruturas subaquáticas. As bóias podem desviar-se devido ao peso excessivo de organismos incrustantes. A incrustação nas telas de entrada dos sistemas municipais de abastecimento de água pode levar a taxas de fluxo reduzido e corrosão acelerada. As estruturas em betão ou cimento armado, por exemplo, barragens também são afectadas negativamente pela incrustação biológica de organismos. 2

Um biocida de incrustação biológica ideal deve ser eficaz, mostrar actividade de largo espectro, e deve ser estável no produto final formulado. Para além disso, o biocida ideal deve ter as seguintes caracteristicas ambientais: i) degradação rápida no ambiente, ii) separação rápida no ambiente, o que resulta em biodisponibilidade limitada para organismos não-alvo, iii) um mínimo de toxicidade para organismos não-alvo em relação às concentrações presentes no ambiente, iv) bioacumulação mínima de compostos tóxicos significativos. A protecção do ambiente é uma questão importante, considerando que o volume de tintas anti-incrustantes utilizadas a nível mundial, é muito elevado. De acordo com o GEFSEC PROJECT ID 2932 (Alternativas ao consumo de DDT na produção de tintas anti-incrustação), a China, por exemplo, consome anualmente cerca de 65.000 toneladas de tinta anti-incrustante. Devido a preocupações ambientais, a aplicação de tintas à base de triorganoestanho foram proibidas. As tintas à base de triorganoestanho (TBT) representam um risco significativo de toxicidade e podem ter um impacto crónico sobre espécies, habitats e ecossistemas. Óxido cuproso e de óxido de zinco, que são outros anti-incrustantes utilizadas comercialmente, funcionam libertando metais pesados, isto é, cobre e zinco; infelizmente o cobre está referenciado como uma toxina prejudicial, especialmente no ambiente marinho. Assim sendo, biocidas mais seguros devem ser seleccionados o mais cedo possível para precaver problemas ambientais graves. Os fabricantes de tais produtos estão confrontados com a perspectiva de alterar as formulações existentes para incluir agentes alternativos que são, ao mesmo tempo, eficazes na prevenção da fixação e crescimento de organismos de incrustação biológica e ambientalmente benignos. Outros 3 critérios que devem ser levados em conta no desenvolvimento de substitutos aceitáveis para os biocidas ecologicamente prejudiciais incluem a compatibilidade química com outros componentes na composição de revestimento, compatibilidade física com a película seca e substrato ao qual o revestimento é aplicado, a segurança daqueles que manipulam ou utilizam os agentes substituídos ou materiais de revestimento contendo os mesmos e o custo da sua produção.

Dependendo da estrutura marítima ou de água doce a ser protegida, as composições da presente invenção podem ser incorporados directamente na estrutura, aplicados directamente à estrutura como num revestimento.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona uma composição de revestimento marinho ou de água doce compreendendo pelo menos uma espinosina ou derivado ou sal do mesmo, e um transportador, em que tal composição é eficaz na prevenção da fixação a organismos aquáticos aos quais é aplicada a composição. A espinosina ou um derivado ou um sal da mesma está presente na composição numa quantidade eficaz para inibir a fixação de organismos de incrustação biológica sobre uma superfície à qual a composição é aplicada como um revestimento.

De acordo com a presente invenção, a composição de revestimento anti-incrustante pode compreender um agente formador de película.

De acordo com esta invenção, também são proporcionados métodos de utilização das composições anti-incrustantes e de materiais de revestimento, incluindo pelo menos uma 4 espinosina. Um desses métodos envolve a protecção de uma superfície exposta a um meio aquoso contra organismos incrustantes presentes no meio aquoso, aplicando à tal superfície uma composição de revestimento incluindo pelo menos uma espinosina. Noutro aspecto da presente invenção, são apresentados artigos com o revestimento de composição aqui descrita em, pelo menos, uma parte da superfície dos mesmos, que fornece protecção contra a exposição aos efeitos deletérios dos organismos de incrustação biológica. A composição de revestimento acima descrita satisfaz um ou mais dos critérios acima mencionados para um produto de revestimento aceitável em termos ambientais, e numa incorporação, satisfaz todos os critérios acima mencionados, na medida em que proporciona uma protecção eficaz contra a fixação e crescimento de organismos de incrustação biológica e ao mesmo tempo, não produze qualquer efeito conhecido que seja ecologicamente prejudicial. Embora as espinosinas e o spinosade em particular possam ser tóxicos para uma ampla gama de organismos aquáticos, o risco ambiental do espinosinas é mínimo, uma vez que apenas os organismos em contacto com o casco do navio são expostos a níveis tóxicos. 0 espinosade é estável como parte do revestimento num navio, mas, mesmo se for libertado (espalhado) lentamente a partir do casco do navio, rapidamente degrada-se em compostos que são essencialmente não tóxicos. A Dow AgroSciences LLC, o principal produtor de espinosinas, foi premiada, no passado, pela Agência de Protecção Ambiental dos EUA, com o Prémio "Presidential Green Chemistry Challenge" pelo espinosade e também em 2008 pelo espinetorame, já que ambos os produtos aderem aos princípios da química verde e é importante encontrar soluções que também contribuem para a preservação do nosso planeta. Tal como descrito no pedido de Patente dos 5 EUA No. 2008/0188427 as espinosinas e espinosades, em particular, foram consideradas eficazes no controlo de infestações ectoparasitas na aquicultura de peixe, resultando na produção melhorada de peixe, provando assim o perfil vantajoso de espinosinas mesmo quando usados em ambiente aquático.

As espinosinas e, mais especificamente, os espinosades, foram considerados particularmente eficazes como agentes anti-incrustações, tal como descrito em pormenor infra.

As espinosinas são conhecidas como produtos de fermentação derivados de ocorrência natural das bactérias Saccharopolyspora esspinosa. A família de compostos derivados desta bactéria são geralmente conhecidos como as espinosinas e têm sido referidos como factores ou componentes A, B, C, D, E, F, G, Η, I, J, K, L, Μ, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, Y, e outros semelhantes, tal como descrito na Patente dos EUA nos 5.362.634, e 6.821.526 e nos pedidos publicados WO 93/09126 e WO 94/20518. Os compostos de espinosina compreendem um sistema de anel 5,6,5-tricíclico, fundido a uma lactona macrociclica de 12 membros, um açúcar neutro (ramnose) , e um açúcar de amino (forosamine) (ver Kirst et al "Unique Fermentation-derived Tetracyclic macrolides" Tetrahedon Leffers A83543A-D, 32:4839-4842, (1991)). Conforme aqui utilizado, o termo "espinosina" refere-se a uma classe de compostos que são baseadas nos produtos de fermentação das bactérias que ocorrem naturalmente, Saccharopolyspora espinosa (espécies e subespécies) ou uma forma biologicamente modificada desta bactéria ou suas combinações. Os compostos de espinosinas naturais podem ser produzidos através de fermentação de culturas depositadas como NRRL 18719, 18537, 18538, 18539, 18743, 18395 e 18823 da colecção da cultura-mãe 6 do Centro Regional de Pesquisa do Zona Norte do Centro-Oeste, o Serviço de Pesquisa Agrícola e Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, 1815 North University Street, Peoria, III. 61604. Os compostos de espinosina são igualmente descritos nas Patentes dos EUA, nos. 5,496,931, 5,670,364, 5.591,606, 5,571,901, 5,202,242, 5,767,253, 5,840,861, 5,670,486 e 5,631,155. Tal como aqui utilizado, o termo "espinosina" destina-se a incluir factores naturais e derivados semi-sintéticos dos factores produzidos naturalmente. Foram feitas várias modificações químicas a estes compostos de espinosina, por vezes referidas como spinosoides e são descritos na Patente dos EUA, no. 6.001,981. O termo "espinosina" também inclui os compostos novos biologicamente activos, tal como descrito na Patente dos EUA no. 2006/0040877 produzidos por métodos, utilizando o DNA híbrido sintase de policétido para alterar os produtos feitos por estirpes produtoras de espinosina. Finalmente, o termo "espinosina" inclui novos derivados de espinosina produzidos usando o DNA clonado de Saccharopolyspora espinosa, tal como descrito na Patente dos EUA No. 7.015.001. Diferentes padrões de controlo podem ser conseguidos por intermediários biossintéticos das espinosinas ou pelos seus derivados produzidos in vivo, ou por seus derivados resultantes da sua modificação química in vitro. Tais intermediários biossintéticos das espinosinas são considerados como pertencendo à classe de "espinosinas" tal como aqui descrito para utilização na presente invenção.

As espinosinas e seus derivados também podem existir sob a forma de sais. Os sais são preparados pelo contacto da forma de base livre com uma quantidade suficiente do ácido desejado de forma a produzir um sal. A título de exemplo não limitativo, as espinosinas podem formar sais com os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, 7 benzóico, cítrico, malónico, salicílico, málico, fumárico, oxálico, succínico, tartárico, láctico, glucónico, ascórbico, maleico, aspártico, benzenossulfónico, metanossulfónico, etanossulfónico, hydroximethanesulfonic e hidroxietanossulfónico. Adicionalmente, a título de exemplo não limitativo, uma função ácida pode formar sais, incluindo aqueles derivados de metais alcalinos ou alcalino-terrosos e os derivados de amoníaco e aminas. Exemplos de catiões incluem sais de sódio, potássio, magnésio, e catiões de amínio. 0 termo espinosina também inclui todos os isómeros dos compostos, incluindo os estereoisómeros individuais, isto é, diastereómeros e enantiómeros geométricos, bem como misturas racémicas, misturas opticamente activas e as suas combinações.

Além disso, o termo "espinosina" tal como aqui utilizado, refere-se às espinosinas produzidas por quaisquer estirpes de fungos capazes de produzir espinosinas, ou seja, as estirpes de fungos pertencentes ao género Aspergillus, tal como descrito no pedido de patente WO/2009/054003. 0 espinosade é um insecticida produzido pela Dow AgroSciences (Indianapolis, Ind.), que compreende principalmente cerca de 85% de espinosina A e cerca de 15% de espinosina D. 0 espinosade é um ingrediente activo em várias formulações de insecticidas disponíveis comercialmente na Dow AgroSciences LLC, incluindo, por exemplo, aqueles comercializados sob os nomes comerciais TRACER®, SUCCESS®, SPINTOR®, LASER®, e ENTRUST®. 0 produto TRACER®, por exemplo, é composto por cerca de 44% a cerca de 48% de Espinosade (w/v) , enquanto o ENTRUST® é um pó sólido branco a esbranquiçado contendo cerca de 80% de Espinosade. 8 0 Espinosade é também disponibilizado comercialmente pela empresa Sigma-Aldrich para fins de I&D, como um padrão analítico, com uma pureza de aproximadamente 98% e é composta principalmente por cerca de 70% de espinosina A e 30% de espinosina D. O espinetorame é uma espinosina semi-sintético, disponível comercialmente na Dow AgroSciences LLC em diversas formulações de insecticidas, incluindo, por exemplo, aquelas comercializados sob o nome comercial DELEGATE® e RADIANT®. Espinetorame é o nome comum para uma mistura de 50-90% de (2R, 3a R, 5a R, 5β S, 9S, 13S, 14R, 16a S, 16β R) -2- (6-desoxi-3-O-etil -2,4-di-O-metil-a-L-manopiranosiloxi) -13- [ (2R, 5S, 6R)-5-(d imethylamino)tetra-hidro-6-metilpiran-2-iloxi]-9-etil-2,3,3a,4,5,5α5β,6,9,10,11,12,13,14,16a, ββ-hexadecahydro-14-metil-lH-as-indaceno-[3,2-d]oxacyclodo decine-7,15-diona,e 50-10% de (2R,3a R, 5a S, 5β S,9S, 13S, 14R, 16 a S, 16 β S)-2-(6-desoxi-3-0-etil-2-,4-di-O-metil-a-L-mannopyrano syloxy) -13- [ (2R,5S,6R)-5-(dimetilamino) tetra-hidro-6-metilpiran-2-γοχί]-9-οίί1-2,3,3α,5α,5β,6,9,10,11,12,13,14,16α, 16β- tetradecahydro-4,14-dimetil-lH-as-indaceno-[3,2-d] oxacyclododecine-7,15-diona. A síntese dos componentes da espinetorame é descrita na Patente dos EUA No. 6, 001, 981. Insecticidas macrólidos relacionados com as espinosinas também foram isoladas a partir de Saccharopolyspora pogona. LW107129 (NRRL 30141 e seus mutantes). Estes compostos são descritos na Patente dos EUA no. 6,800,614. Estes compostos são caracterizados pela presença de grupos funcionais reactivos, que tornam possível outras modificações em locais onde tais modificações não eram viáveis em espinosinas anteriormente divulgados. Derivados naturais e semi-sintéticos das espinosinas butenilo são descritos na Patente dos EUA no. 6, 919, 464. O termo "butenil-espinosina", também 9 conhecida como pogonin-, tal como aqui utilizado, pretende incluir factores naturais e derivados semi-sintéticos dos factores produzidos naturalmente ou suas combinações, e são considerados como pertencendo à mesma classe de "espinosinas" tal como aqui descrito para utilização na presente invenção. 0 espinosade demonstrou ser altamente eficaz no controlo de determinados ácaros e insectos, incluindo, mas não limitado a espécies das ordens de Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Thysanoptera, e alguns Coleoptera. Acresce que formulações que incluem espinosade demonstraram ser altamente eficazes quando utilizadas na agricultura, horticultura, estufas, campos de golfe, jardins, casas, e outros. 0 espinosade age como um estômago e veneno de contacto. Geralmente, o efeito imediato de ingestão implica a cessação da alimentação, e após 24 horas, por paralisia e morte. Este composto é uma neurotoxina com uma nova forma de acção envolvendo o receptor de acetilcolina nicotinico e os receptores GABA.

Embora as espinosinas tenham-se mostrado eficazes quando ingeridas por insectos e ácaros, assim causando a excitação rápida do sistema nervoso, a sua utilização como um agente anti-incrustante não foi ainda investigada e/ou proposta até ao momento. Além disso, conforme referido na Patente dos EUA No. 7.285.653 "as espinosinas apresentam uma actividade insecticida forte, mas nenhuma actividade antibacteriana". 0 presente inventor descobriu que a espinosina e mais especificamente o espinosade, apresenta significativas propriedades antibacterianas contra algumas bactérias associadas com a comum incrustante, Balanus amphitrite 10 pertencente à espécie vibrio sp., flavobacterium sp., alcaligenes sp. e aeromonas sp. Estas bactérias derivam de microflora bacteriana associada com cracas. Estes isolados são caracterizados por testes morfológicos e bioquímicos somente até ao nível de géneros.

Além disso, o presente inventor descobriu que a espinosina e em particular o spinosade, exibem uma actividade anti-incrustante excelente sobre as colónias de cracas cyprids em superfícies com uma concentração efectiva de EC50 de 7 x 10 mg/ml na ausência de qualquer outra forma de mortalidade contra cyprids. O presente inventor tem criado algumas composições de revestimento que se têm mostrado ser muito eficazes quando utilizadas como um revestimento anti- incrustante marinho ou de água doce.

Conforme aqui usado, os termos "eficaz", "eficazes no controle de" e "eficaz para o controlo" ou "controlo" são todos utilizados de forma indiscriminada e todos referem-se à capacidade da composição activa de reduzir o grau de aderência de pelo menos uma espécie de organismos, ao longo de um determinado período de tempo, em comparação com uma composição que não contém o composto activo.

Conforme aqui usada, a expressão "agente anti-incrustante" é um agente utilizado para controlar o crescimento e depósito de organismos incrustantes (micróbios e formas superiores de espécies de plantas ou animais) em navios, equipamento de aquicultura e outras estruturas utilizadas na água.

Conforme aqui usado, o termo "organismos de incrustação biológica" refere-se a todos e quaisquer organismos que participam na sequência de incrustação, tanto em ambientes de 11 água doce como de água salgada, incluindo, sem limitação, bactérias, diatomáceas, hidróides, algas, briozoários, protozoários, ascidians, vermes, moluscos, mexilhões zebra e cracas. Geralmente as cracas, vermes tubulares, algas, e briozoários castanhos e vermelhos são os organismos que causam a maior preocupação em águas salgadas e águas salobras Os mexilhões zebra são os organismos que causam os maiores problemas de nivel de incrustação em água doce em climas temperados e subtropicais.

As cracas pertencem ao filo Arthropoda, subfilo Crustacea, Sessilia ordem, Balanidae família, Balanus gênero. São exclusivamente marinhos e, ao contrário de outros crustáceos, são todos sésseis. Existem mais de 600 espécies em todo o mundo, e muitos são animais coloridos, por exemplo, vermelho, laranja, roxo, rosa e listrados. A maioria tem alguns centímetros de diâmetro, sendo alguns, consideravelmente maiores. A maioria é encontrada na zona de variação de marés. Aqueles que vivem em comunidades em águas rasas são incrustantes típicos balanids ou comensais.

No Oceano Indico foram reportados inte e duas espécies de cracas. Exemplos, não limitativos, são os Balanus amphitrite, Balanus uariegatus, Megabalanus antillensis, Chthamalus malayensis, Chthamalus withersi, e Lapas anatifera. Todas estas espécies têm amplas variações geográficas. Todas as espécies Chthamalus, Lepas, e Anfitrite Balanus preferem águas salinas praticamente normais.

As algas marinhas variam em tamanho desde organismos unicelulares com poucos milímetros de diâmetro, a plantas altamente organizados que podem atingir um comprimento de 30 metros. Todas as algas com actividade fotossintética contêm o 12 pigmento de clorofila, pigmento esse que se encontra na inclusão de células chamados cloroplastos. Uma única célula de algas pode conter um ou mais cloroplastos. Microalgas (diatomáceas) são componentes importantes das películas formados na superfície de uma estrutura marítima, à medida que se torna incrustada e pode desempenhar um papel na ecologia destas películas.

Diatomáceas pertencem à classe Bacillariophyceae. Uma característica importante de muitas diatomáceas bentónicas é a sua capacidade de se afixarem permanentemente às superfícies. Isto é importante do ponto de vista ecológico e económico uma vez que as diatomáceas constituem pelo menos uma parte dos organismos incrustados nas estruturas marítimas. Por exemplo, é importante controlar as diatomáceas dos seguintes géneros (Dunaliella, Nitzschia, Skeletonema,

Chaetoceros) e espécies (isto é, Dunaliella tertiolecta, Skeletonema costatum).

De acordo com uma incorporação, pelo menos uma espinosina pode ser adicionada a um material de construção para a produção de artigos marinhos. Essa espinosina pode ser misturada com um transportador e/ou incorporada directamente nos materiais de construção, por exemplo, cimento, plástico, polímero, borracha, material elastomérico, ou fibra de vidro, para a protecção de objectos sujeitos a incrustação biológica. Estruturas tais como estacas de madeira e redes de pesca podem ser protegidas através da incorporação directa, na própria estrutura, das composições da presente invenção. Por exemplo, uma composição da presente invenção, que compreende ainda um transportador, pode ser aplicada à madeira utilizada para as estacas, por meio de um tratamento sob pressão ou 13 impregnação a vácuo. Estas composições podem igualmente ser incorporadas numa fibra de rede de pesca durante o fabrico.

Os revestimentos marinhos contendo as composições da presente invenção podem ser aplicados a uma estrutura a ser protegida por diversos meios convencionais, tais como, por exemplo, por pulverização, com rolo, escovagem, impregnação e imersão.

Por exemplo, as redes de pesca, podem ser protegidas por meio de imersão numa composição que compreende as composições da presente invenção e um transportador, ou pela pulverização das redes de pesca com a composição. As spinosinas podem ser utilizadas com solventes tanto aquosos como orgânicos, como é bem conhecido no estado da técnica.

De acordo com outra incorporação, as espinosinas podem ser incluídos numa composição de tinta convencional como o único agente anti-incrustante, ou adicionado em combinação com outros microbicidas, agentes anti-incrustantes, fungicidas, herbicidas, insecticidas, antibióticos, agentes anti-inscrustantes não tóxicos, e produtos naturais ou extractos para produzir um efeito aditivo ou sinérgico sobre a fixação de organismos de incrustação biológica. Os microbicidas adequados que podem ser adicionados em combinação com a espinosina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: 5-cloro-2-metil-3-isotiazolona; 2-metil-3- isothiazolone, 2-n-octil-3-isotiazolona; 4,5-dicloro-2-n-octil-3-isotiazolona, 3-iodo-2-propinil butil carbamato, 1 ,2-dibromo-2,4-dicianobutano; metileno-bis-tiocianato; 2- thiocyanomethylthiobenzothiazole; tetracloroisoftalonitrilo; 5-bromo-5-nitro-l,3-dioxano; 2-bromo-2-nitopropanediol; 2,2- dibromo-3-nitrilopropionamida; N,N'-dimethylhydroxyl-5, 5 ' -dimetil-hidantoína; bromochlorodimethylhydantoin; 1,2- benzisotiazolin-3-ona; 4,5-trimetileno-2-metil-3-isotiazolona; 14 5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)-fenol e 3,4,4'-triclorocarbanilida. Os agentes marítimos anti-incrustantes adequados que podem ser adicionados em combinação com as espinosinas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: etilenobisditiocarbamato de manganês; dimetil ditiocarbamato de zinco, 2-metil-4-t-butilamino-6-ciclopropilamino-s-triazina; 2,4,5,6-tetracloroisoftalonitrilo, N,N-dimetil-ureia diclorofenilo; etilenobisditiocarbamato de zinco; tiocianato de cobre; 4,5-dicloro-2-n-octil-3-isotiazolona; N-(fluorodiclorometiltio)-ftalimida; N,N-dimetil-N'-feni-N'-fluorodiclorometiltio-sulfa mide; zinco de 2-piridinetiol-l-óxido; dissulfureto tetrametiltiuram; 2, 4,6-trichlorophenylmaleimide; 2,3,5,6-tetra-cloro-4-(metilsulfonil) -piridina; 3-iodo-2-propinil butil carbamato; diiodometil p-tolil-sulfona; bis dimetil dithiocarbamoyl etilenobisditiocarbamato de zinco; fenil (bispyridil) bismuto, dicloreto de 2-(4-tiazolil)-benzimidazole; piridina trifenil borano; fenilamidas; compostos de halopropargyl, ou 2-haloalkoxyaryl-3-isotiazolonas. Adequados haloalkoxyaryl-2-3-isotiazolonas incluem, mas não estão limitados a, 2 - (4-trifluorometoxifenil)-3-isotiazolona, 2-(4- trifluorometoxifenil) -5-cloro-3-isothiazoIone, e 2 —(4 — trifluorometoxifenil)-4,5-dicloro-3-isotiazolona, anti-incrustantes organometálicos, tais como tributil-estanho ou trifenil estanho, ou anti-incrustantes inorgânicos tais como, por exemplo, óxido de zinco, cobre, óxido de cobre, ou oxido de dicobre e dióxido de enxofre. Fungicidas agrícolas adequados que podem ser adicionados em combinação com a espinosina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: ditiocarbamato e seus derivados, tais como ferbam, ziram, maneb, mancozebe, zineb, propinebe, metham, thiram, o complexo de zineb e dissulfureto de polietileno 15 thiuram, dazomet, e misturas destes com sais de cobre; derivados de nitrofenol, tais como dinocap, binapacril, e 2-sec-butil-4,6-dinitrofenil isopropil carbonato; estruturas heterociclicas tais como captan folpete, glyodine, ditianona, thioquinox, benomyl, thiabendazole, vinolozolin, iprodiona, procimidona, triadimenol, triadimefon, bitertanol, fluoroimide, triarimol, cicloheximida, etirimol, dodemorfe, dimetomorfe, thifluzamide, e, quinomethionate; diversos fungicidas halogenados tais como: cloranil, dichlone, chloroneb, tricamba, dicloran, e polychloronitrobenzenes, antibióticos fungicidas tais como: griseofulvina, casugamicina e estreptomicina; fungicidas variados, tais como difenil-sulfona, dodina, metoxilo, l-tiociano-2,4-dinitrobenzeno, 1-phenylthiosemicarbazide, tiofanato-metilo, e cimoxanil; bem como acylalanines tais como, furalaxil, cyprofuram, ofurace, benalaxil, e oxadixil; fluazinam, flumetover, derivados de fenilbenzamida tais como aqueles divulgados na EP 578586 Al, derivados de aminoácido tais como derivados de valina descritos na EP 550788A1, methoxiacrilatos tal como metilo (E)-2-(2-(6-(2-cianofenoxi) pirimidin-4-iloxi)fenil)-3-met oxiacrilato; benzo(1,2,3) tiadiazole-7-carbotióico do ácido S-metil éster: propamocarb; imazalil ; carbendazim; miclobutanil; fenbuconazol; tridemorfe; pirazofos; fenarimol; fenpiclonil e pirimetanilo. Herbicidas adequados que podem ser adicionados em combinação com a espinosina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: derivados de ácido carboxilico, incluindo ácidos benzóicos e seus sais; fenoxi e fenilo substituídos de ácidos carboxílicos e seus sais, e ácido tricloroacético e seus sais derivados de ácido carbâmico, incluindo etilo de N,N-di(n-propil) tiolcarbamato e pronamide; ureias substituídas, triazinas substituídas, derivados de éter difenílico tais como oxifluorfeno e fluoroglicofeno, anilidas tais como 16 propanilo, herbicidas oxifenoxi, uracilos, nitrilos, e outros herbicidas orgânicos tais como ditiopi e, tiazopir.

Insecticidas adequados que podem ser adicionados em combinação com a espinosina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: abamectina, bifentrina, ciflutrina, ci-hexaestanho, cipermetrina, cifenotrina, clotianidina, deltametrina; endosulfan;-óxido; fenoxicarbe; fensulfothion; fenvalerato; flucicloxuron; flufenoxurão; fluvalinato; furatiocarbe; imidacloprid, isazophos; isofenfos; Isoxatião; metiocarbe; metomil; mexacarbate; nicotina; permetrina e resmetrina. Exemplos não limitativos de agentes anti- incrustantes não-tóxicas e naturais incluem decalactona, alantolactone, ácido zosteric e capsaicina. Um exemplo típico de um antibiótico apropriado é a tetraciclina, que é um anti-incrustante registado. Composições anti-incrustantes descritas no pedido de patente US 2008/0095737, também podem ser combinadas com, pelo menos, um agente de espinosina anti-incrustante da presente invenção. O componente transportador combinado com pelo menos uma espinosina pode ser um componente formador de película, um material termoplástico, fibra de vidro, um componente de elastómero, borracha vulcanizada, ou de um componente de cimento. O componente transportador pode ser qualquer componente ou combinação de componentes que incorpora o agente anti-incrustante ou então é aplicado facilmente à superfície a ser protegida e adere à superfície a ser protegida quando a superfície é submersa. Os compostos de cimento são utilizadas para proteger certos tipos de estruturas subaquáticas, assim como os materiais elastoméricos e de borracha vulcanizada. Componentes diferentes terão diferentes propriedades desejadas, dependendo do material que constitui a superfície subaquática, 17 os requisitos de operação da superfície, a configuração da superfície, e o composto anti-incrustante. Após o revestimento protector de uma superfície de acordo com a presente invenção a espinosina que estiver presente no revestimento entra em contacto com os organismos de incrustação biológica, impedindo assim a sua fixação. Revestimentos marinhos compreendem um agente formador de película e solvente e opcionalmente, outros ingredientes. 0 solvente pode ser qualquer solvente orgânico ou água. As composições da presente invenção são adequados para uso em revestimentos marinhos à base de solventes e água. Qualquer agente formador de película convencional, pode ser utilizado no revestimento marinho anti-incrustante que incorpore as composições da presente invenção. Componentes formadores de película podem incluir soluções de resina de polímero. Os exemplos não limitativos de resinas de polímero incluem resinas de poliéster insaturado formadas a partir de (a) ácidos insaturados e anidridos, tais como anidrido maleico, ácido fumárico e ácido itacónico, (b) os ácidos saturados e anidridos, tais como anidrido ftálico, anidrido isoftálico, tereftálico anidrido, anidrido tetra-hidroftálico, anidridos tetrahalophthalic, ácido chlorendic, ácido adípico, ácido sebácico e, (c) glicóis, tais como etileno glicol, 1,2-glicol propileno, glicol dibromoneopentyl, Dianol 33®, e Dianol 22®; e (d) monómeros de vinilo, tais como estireno, vinil-tolueno, cloroestireno, bromoestireno, metilmetacrilato, e dimetacrilato de etileno glicol. Outras resinas adequadas incluem, mas não estão limitados a ésteres de vinilo, acetado de vinilo, e resinas de vinilo à base de cloreto, sistemas de copolímeros de cloreto e acetato de vinilo como dispersões aquosas ou sistemas baseados em solventes, misturas de resina natural e copolímeros de cloreto de vinilo-acetato de vinilo, resinas acrílicas em sistemas à base de solventes ou aquosos, 18 resinas à base de uretano, resinas de copolímero de polimento próprio, resinas abalativas, resinas de lixiviação, componentes elastoméricos, borrachas vulcanizadas, borrachas de butadieno-estireno, borrachas de acrilonitrilo-butadieno borrachas de butadieno-acrilonitrilo-estireno, óleos de secagem, tais como óleo de linhaça, asfalto, epóxis, siloxanos como por exemplo polidimetilsiloxano, silanos tais como alquilo e silanos alcoxi de arilo, os silicones e tecnologias à base de silicone tais como fluorosilicones, acrilatos de silicone, elastómeros de latex de silicone e as suas combinações. A composição de revestimento da presente invenção pode incluir componentes para além das espinosinas e um componente formador de película, de modo a conferir uma ou mais propriedades desejáveis, tais como aumento ou diminuição da dureza, força, rigidez aumentada ou diminuída, o arrasto reduzido, aumento ou diminuição de permeabilidade, ou melhorada resistência à água. A selecção de um componente especifico ou de um grupo de componentes para conferir tais propriedades estão dentro das capacidades daqueles com conhecimentos correntes na arte. Os revestimentos marinhos da presente invenção podem opcionalmente conter um ou mais dos seguintes: pigmentos inorgânicos, pigmentos orgânicos ou corantes, resinas naturais, tais como colofónia, de enchimento, diluentes, agentes de dilatação, agentes molhantes, coalescentes, plastificantes, dispersantes, agente tensioactivo, conservantes, modificadores de reologia ou promotores da adesão, filtros UV, e suas combinações. 0 principal ingrediente activo para utilização na presente invenção compreende pelo menos uma espinosina a partir da classe de espinosinas acima descritas. A percentagem de 19 espinosina na composição de revestimento necessária para a protecção efectiva contra os organismos de incrustação biológica pode variar substancialmente, dependendo da natureza da estrutura marinho ou de água doce às quais a composição de revestimento é aplicada, o fim a que a estrutura se destina, o pH da água e outras condições ambientais a que a estrutura se encontra exposta, e dependendo da própria espinosina, a natureza química do formador de película, assim como de outros aditivos presentes na composição que podem influenciar a eficácia de espinosina. 0 limite superior da actividade pode ser também influenciado pelas características como por exemplo o custo e a toxicidade que seria imediatamente evidente para um especialista na matéria. Um perito na arte reconhecerá que a quantidade de espinosina pode ser reduzida caso esteja presente um segundo ingrediente activo, desde que a composição combinada esteja activa como um produto anti-incrustante.

De acordo com uma incorporação, a espinosina está presente na composição numa quantidade que varia entre 0,001% a 90% em peso. De acordo com outra incorporação, a espinosina está presente numa quantidade que varia entre 0,1% a 10% em peso.

As espinosinas podem ser incluídas numa formulação de tinta durante os processos de fabrico de tinta ou adicionados à tinta no momento da utilização. As espinosinas podem ser simplesmente misturados nos componentes de formação de película ou podem ser covalentemente ligados à resina, conhecido como "revestimento ablativo ou de auto-polimento", que é libertado apenas após a hidrolisação da ligação na água do mar. A hidrólise controlada permite uma taxa lenta de libertação enquanto cria um local hidrofílico sobre a resina. Uma nova 20 camada de espinosina é depois exposta quando a camada hidrolisada é arrastada pela água. Um exemplo não limitativo de composições de auto-polimento anti-incrustantes são mencionados no pedido de patente EUA 200510096407. O agente espinosina, pode ser incluído na composição de revestimento marinho puro com partículas sólidas. Numa forma de partículas encapsuladas, por exemplo, em que as partículas individuais de quelatos são incorporados numa matriz de bentonite ou sílica, em nanopartículas, ou como uma suspensão em um meio líquido. Além disso, as espinosinas podem ser usadas em várias composições de libertação controlada, como por exemplo, os mencionados na Patente dos Estados Unidos no. 6.610.282, no. 6.149.927 e no. 6.676.954. Numa composição de libertação controlada, as espinosinas podem ser incorporados com materiais de libertação lenta que permitem a libertação controlada dos compostos na matriz de revestimento, prolongando assim a eficácia do revestimento e reduzindo a quantidade de compostos necessários para produzir o efeito anti-incrustante. A encapsulação em tais materiais de libertação lenta também pode proteger espinosinas do meio adverso químico do revestimento e reduziria a sua degradação, enquanto presas na resina, se susceptíveis à degradação. Outros métodos tradicionais de encapsulamento podem ser utilizados. Por exemplo, as partículas do agente anti-incrustante podem ser micro revestidas por exemplo, onde as partículas são revestidas com polímeros especialmente concebidos num reactor de leito fluidizado. A espessura do material de revestimento pode ser monitorizada e controlada pelas condições dinâmicas de operação, tais como o fluxo de ar, o fluxo de alimentação, a temperatura, o tamanho do bico, o substrato e similares. Outro método possível é a inclusão molecular, em que um agente anti-incrustante hidrofóbico é encapsulado no interior da "estrutura hidrofóbica" de uma 21 molécula hospedeira, tal como abeta-ciclodextrina. Outro método de encapsulação é a secagem por pulverização e de coacervação dos agentes anti-incrustantes; este método envolve a encapsulação do agente anti-inscrustante numa matriz bem definida vítrea feita de hidratos de carbono e polímeros.

Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria específica quanto aos mecanismos de acção, acredita-se que as espinosinas presentes na composição anti-incrustrante da presente invenção funcionam através da produção de um ambiente hostil na superfície de um substrato revestido ou impregnado que repele ou afecta os organismos de incrustação biológica, prevenindo assim a sua fixação e crescimento na superfície revestida. 0 efeito inibitório sobre os microrganismos pode, contudo, ser produzido por inalação, respiração, digestão ou imbibição do agente activo pelos microorganismos.

Também dentro do âmbito da presente invenção está qualquer artigo que tenha sido incorporado ou que tenha uma superfície revestida com uma composição contendo pelo menos uma espinosina ou um derivado ou sal ou uma combinação destes. Os artigos impregnados e/ou revestidos da invenção podem compreender qualquer material que esteja em contacto com agua fresca, salgada, estuarina, salobra, marinha ou outros corpos de água relativamente aos quais os organismos de incrustação biológica têm tendência a fixarem-se, tais como metal, madeira, betão, plástico, compostos, e pedra. Exemplos representativos de artigos que podem beneficiar com o revestimento que inibe a fixação e crescimento desses organismos incluem barcos e navios, por exemplo, os seus cascos, hélices, lemes, quilhas, barbatanas, "hydrofoils", 22 instalações de atracação, tais como pilares e estacas, superfícies de plataformas, bóias, cais, paredões, redes de pesca, superfícies de sistema de refrigeração industrial, equipamento para refrigeração de água, ou tubos de descarga, instalações dessalinização, faróis, náuticos, faróis flutuantes, quebra-mares, docas, tubos, condutas, tanques, condutas de água de centrais eléctricas, estruturas industriais, estruturas para a conservação de peixe, construções aquáticas, instalações portuárias, pontes, sinos, prumos, rodas, gruas, dragas, bombas, válvulas, fios, cabos, cordas, escadas, pontões, respondedores, antenas, barcaças, periscópios, snorkels, suportes para armas, canos, tubos de lançamento, minas, apetrechamento portuário, telas de entrada para os sistemas de distribuição de água e formações de cimento ou pedra decorativas ou funcionais.

Excepto nos exemplos, ou quando indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reacção, e assim por diante, utilizados na descrição e reivindicações devem ser entendidas como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca". Consequentemente, salvo indicação em contrário, os parâmetros numéricos apresentados na descrição e reivindicações em anexo, são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procuram obter através da presente divulgação. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deverá ser interpretado tendo em vista o número de algarismos significativos e abordagens de arredondamento comum. Não obstante os intervalos numéricos e os parâmetros que se estabelecem o âmbito alargado da invenção, serem aproximações, 23 salvo indicação em contrário, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são apresentados com a maior precisão possível. Contudo, qualquer valor numérico, pode inerentemente conter alguns erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas medições de testes respectivos.

Os exemplos seguintes são proporcionados para descrever a invenção em mais detalhe. Estes exemplos destinam-se meramente a ilustrar incorporações específicas das composições, métodos e artigos da presente invenção, e não devem, de forma alguma, ser considerados como limitativos da invenção. Estes exemplos fornecem o resultado de testes conduzidos para determinar a eficácia de certas espinosinas na inibição da fixação de organismos de incrustação biológica

Breve Descrição dos Desenhos A figura. 1 mostra uma representação gráfica do crescimento de Dunaliella tertiolecta monitorizado através da fases logarítmicas e de latência, na presença de várias concentrações de espinosinas. A figura. 2 mostra uma fotografia de um ensaio de 40 semanas de imersão estática para Painel no. 2, comparando os Painéis ID AA e BB a partir da Tabela 4 (lado A = AA, o lado B = BB). A figura. 3 mostra uma fotografia de um ensaio de 40 semanas de imersão estática para Painel no. 5 comparando os Painéis ID CC e DD a partir da Tabela 4 (lado A = CC, o lado B = DD).

Exemplos

Exemplo 1

Ensaio Antimicrobiano contra Bactérias Marinhas Associados com Amphitrite Balanus 24 0 efeito da espinosina como um composto bacteriostático foi testado contra quatro espécies de bactérias utilizando técnicas padrão de difusão de ágar, tal como descrito por Avelin et al., J. Chem. Ecol., 19 (10), 2155-67 (1993). As bactérias utilizadas no teste foram as seguintes: Aeromonas sp (AE1); Alcaligenes sp (Al); Flavobacterium sp (F) , e Vibrio sp (VI); A técnica de difusão de ágar segue o método original de Acar (1980) . Numa placa de Petri esterilizada com 1 ml de caldo de cultura de nutrientes antigos com 12 horas, que compreende um caldo marinho em água destilada de 3,7 %, foi transferido cada uma das espécies de bactérias marinhas juntamente com 20 ml de meio de ágar com antibiótico.

Discos de papel Esterilizado Whatman No. 1 (6,25 mm de diâmetro) foram carregadas com a solução de teste (2,4% em peso de Tracer em água destilada) em concentrações calculadas de espinosina puro que variam de 1CT1 mg/ΐθμΐ a 10“4 mg/ΐθμΐ. Os discos de controlo foram carregados com apenas o transportador. Após 24 horas de exposição à solução de teste, a zona de inibição, isto é, a área em torno do disco isenta de crescimento de bactérias marinhas foi medida, calculando a distância entre a borda do disco até à borda da área que não apresenta crescimento bacteriano (mm). Os dados referenciados na Tabela 1 infra, demonstram que a solução de espinosade tem um efeito inibidor contra estas bactérias marinhas, mesmo a uma diluição superior: 25

Tabela 1

Concentração 10 mg/ΐθμΐ 10 4 mg/ΐθμΐ 10 " mg/ιθμΐ 10~4 mg/ΐθμΐ (10 0 0 Oppm (lOOOppm (10Oppm (1Oppm Bactéria Controlo espinosade) espinosade) espinosade) espinosade) Ae i 7.5 7 7 5.5 Αθ 2 - - - AI i “ 8 6 6 6 AI 2 — 7 6.5 5.5 5.5 Fi “ 7.5 6 6 6 f2 — 7.5 6 6 6 Vi — 8 5.5 5.5 5.5 V2 8 7 6 6

Exemplo 2

Ensaio sobre a instalação de Cracas Cyprid e determinação EC5q A Craca, Balanus amphitrite Darwin, é o organismo anti— vegetativo mais ubíquo encontrado em todos os ecossistemas marinhos, designadamente nos portos visitados pela navegação comercial. Os métodos utilizados nesta avaliação foram descritos em pormenor em várias publicações (Rittschof D, Clare AS, Gerhart DJ, Avelin Mary, Bonavetura J(1991). Cracas em ensaios in vitro para substâncias biologicamente activas: ensaios de toxicidade e de instalação utilizando a cultura massiva de Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Incrustação 6 :115-122.

As cracas adultas são cultivadas em laboratório e a desova natural é permitida. As larvas são colhidas e cultivadas em sistemas de cultura artificial até atingiram a fase de cyprid, altura em que as larvas tornam-se capazes de se fixarem a superfícies. Uma vez fixadas, os cyprids transformam-se em cracas do tamanho de uma cabeça de alfinete, fixando-se permanentemente à superfície. 26 A solução de amostra testada foi uma solução de 23,2% em peso de Tracer em água destilada (equivalente a 10% em peso w/w em puro espinosade ou 100 mg de espinosad/ml) . A amostra foi agitada antes de fazer as diluições em série.

Os dados encontram-se resumidos nas Tabelas 2 e 3 infra, juntamente com os cálculos para o EC50. Na maior concentração usada (0,lmg de espinosade/ml) , os cyprids mantiveram-se letárgicos durante algumas horas após a exposição à solução de ensaio. No entanto, os cyprids recuperam rapidamente e nenhuma mortalidade foi observada com esta dosagem. Na verdade, não houve mortalidade visível em todas as concentrações testadas. Não houve instalação do cyprid a partir de 1CT1 a 10-4 mg/ml. Depois disso, houve uma instalação dependente da dose a partir de 10”5 e em concentrações mais baixas, somente atingindo valores de controlo a 10”5 mg/ml. O cálculo de EC5o por meio de análise probit mostra uma EC5q de 7 x 10”8 mg/ml. Os resultados mostram que o espinosade é um inibidor eficaz, não tóxico da instalação de cracas cyprids.

Notas adicionais para os dados a seguir indicados: 1. Conjunto significa que o número total de larvas cyprid que se instalaram e fixaram-se à superfície da placa de Petri. "Não fixação" significa o número total de cyprids que permanecem a nadar na água do mar e não fixados à superfície. 3. Os dados são expressos como a percentagem de cyprids que se fixaram na superfície. 4.Os dados encontram-se resumidos e a média, o desvio padrão (DP) e o erro padrão da média (EP) são calculados para amostras. 5. Os testes foram conduzidos em réplicas de três pratos por cada grupo de estudo, cada prato contendo cerca de 75-100 cyprids.

Fixação de Cracas: 27

Tabela 2

Concentração Conjunto (“set") Não fixação ("Non set") Metamorfisado mas "non set" Total % de Conjunto 1 Controlo a 71 22 0 93 76 b 68 25 0 93 73 c 65 12 0 77 84 Total 204 59 0 263 SD 5.82 SE 2.60 2 0,1 mg de espinosade/ml a 0 89 0 89 0 b 0 87 0 87 0 c 0 90 0 90 0 Total 0 275 0 266 SD 0 .00 SE 0 .00 3 10 2 mg espinosade a 0 86 0 86 0 b 0 77 0 77 0 C 0 94 0 94 0 Total 0 257 0 257 SD 0 .00 SE 0 .00 4 10 J mg espinosade a 0 92 0 92 0 b 0 87 0 87 0 c 0 81 0 81 0 Total 0 260 0 260 SD 0 .00 SE 0 .00 5 10 4 mg espinosade a 0 90 0 90 0 b 0 72 0 72 0 c 0 89 0 89 0 Total 0 251 0 251 SD 0 .00 SE 0 .00 6 10 5 mg espinosade a 7 90 1 98 7 b 7 69 3 79 9 c 10 71 2 83 12 Total 24 230 6 260 SD 2.49 28 SE 1 .11 7 10 8 mg espinosade a 9 90 2 101 9 Concentração Conjunte ("set") 5 Não fixação ("Non set") Me t amo r f i s ado mas "non set" Total % de Conjunto b 20 69 1 90 22 C 27 63 6 96 28 Total 56 222 9 287 SD 9.84 SE 4.40 8 10 ' mg espinosade a 28 57 4 89 31 b 29 53 4 86 34 c 32 41 3 76 42 Total 89 151 11 251 SD 5.61 SE 2.51 9 10 8 mg espinosade a 41 31 7 79 52 b 56 37 6 99 57 c 40 33 7 80 50 Total 137 101 20 258 SD 3.38 SE 1.51 10 10 “ mg espinosade a 61 33 3 97 63 b 60 37 1 98 61 c 72 30 1 103 70 Total 193 100 5 2 9 8 SIS SD 4.61 SE 2.06 11 10 iu mg espinosade a 75 22 0 97 77 b 73 20 1 94 78 c 66 26 1 93 71 Total 214 68 2 284 SD 3 . 77 SE 1.69 12 10 11 mg espinosade a 76 22 1 99 77 b 77 18 3 98 79 c 71 23 4 98 72 Total 224 63 8 295 SD 3.15 SE 1.14 CÁLCULOS de EC50 29

Tabela 3

Análise de Probit:

Fixação de cracas

DADOS DE INPUTE

Dose Número Testado Sem resposta 0.000001 287 231 0.0000001 251 162 1E-08 258 111 1E-09 298 105 1E-10 284 70 1E-11 295 71 PROPORÇÃO DE CONTROLES A RESPONDER =.22 INCLINAÇÃO = .5839765 INTERCEPÇÃO = 9.172569 VARIANTE DE INCLINAÇÃO 2.301465E-03 LOG. ED5 0 = -7,145098 INTERVALO DE CONFIANÇA 95% = -6,95896 LOGARÍTMICA DE VARIANTE ED50 = 8.517865E-03 CHI 2 = 2.198044 DF = 4 INTERVALO DE CONFIANÇA A 95% = 1.099107E-07 - 4.711828E -08 ED50 = 7.159825E-08 ED50 = 0,00000007 mg / ml (7 x 10”8mg/ml)

Exemplo 3 A inibição de organismos incrustantes utilizando uma composição de tinta contendo espinosade

Dois painéis quadrados de PVC 15xl5cm foram pintados como se segue: um dos lados com uma composição contendo 11,43% em peso de Tracer (5% de espinosade puro) e 88,57% em peso de tinta acrílica branca convencional (sem qualquer conservante ou outro agente anti-incrustante) e do outro lado somente com a tinta (tinta de controlo). Os painéis revestidos foram 30 submersos num um ambiente contaminado, na marina Olympic em Sounion, Grécia, a uma distância de aproximadamente 60cm da superfície da água para determinar o grau de resistência proporcionada pelo revestimento de teste contra incrustações. Os painéis foram expostos à água do mar durante 10 semanas. No final do período de exposição, os painéis foram inspeccionadas para verificação de incrustação. O lado com tinta de controle continha o numero considerável de incrustações. O lado tratado com composição com 5% de espinosade não continha fixação de incrustantes.

Exemplo 4 A inibição do crescimento de incrustações de microalgas, Dunaliella tertiolecta por emulsão de Espinosade

Uma emulsão de água contendo 23,2% em peso de Tracer® = 10% de espinosade foi utilizada no início deste ensaio. Dunaliella tertiolecta foi mantida em culturas de arranque em tubos de ensaio de 20 ml, como culturas de sementeira e mantido em ciclo de transferência de sete dias. As microalgas marinhas foram inoculadas em frascos cónicos de 250ml contendo lOOml de água do mar filtrada, esterilizada em F/2-Guillard-1975 meio de crescimento. A primeira emulsão de 10% de espinosade (codificado Entarco 8,205 10%), foi novamente dissolvida em água destilada e adicionada em várias concentrações a cada cultura de algas para concentrações finais que variam de 10~2 mg de espinosade/ml a 10~9 mg espinosade/ml. Os controlos compreendem a cultura de algas, sem a solução de teste. Cada grupo de ensaio foi constituído por três frascos. 31 A cultura típica passa por quatro fases. A fase de latência é caracterizada por pouca ou nenhuma multiplicação das células. A fase logarítmica ou na fase exponencial é quando há um rápido aumento na taxa de divisão celular. Durante a fase seguinte, chamada fase estacionária, o número de células vivas permanecem constantes e não há nenhum crescimento. Na fase de declínio, as células começam o processo de morte ou senescência. 0 crescimento das células de algas em cada frasco foi contado diariamente pelo hemocitómetro. Todo o crescimento e declínio da cultura na presença ou ausência de espinosade foi determinada (Targett, 1988 Allelochemistry in Marine organisms: Chemical fouling and antifouling stratgies).

Condições ambientais de cultura em frascos:

Iluminação Ciclo: 12 horas de luz / 12 horas de escuridão Tipo: banco fluorescente: 2-F20T12 Westinghouse branco frio Intensidade: 133-299 uE em /seclcm2 Temperatura: 20° C Agua Tipo: envelhecida, esterilizada Salinidade: 30 ppt Volume total: 250 ml Tamanho do frasco: frasco Erienmeyer de pyrex de vidro de 1 L Concent ração Densidade de cultivo: 2.5-5.0 x 104 células por ml Nutrientes: lml de nutrientes por litro de água do mar Tempo para florescer: 6-7 dias Densidade de florescência: 1 - 3 χ 106 células por mal

Os dados apresentados na Figura 1 mostram que a espinosade tem propriedades significativas inibidoras de microalgas, que são proporcionais à dose. 32

Exemplo 5

TESTE DE IMERSÃO ESTÁTICA DE 40 SEMANAS

Os painéis de ensaio com dimensões aproximadas de 7,6 x 20,4 centímetros foram revestidos e rotulados como se segue: Lado AA foi revestido com uma formulação de tinta que compreende 77,3% em peso de tinta acrílica branca convencional (sem qualquer conservante, ou outro agente anti-incrustante) e 22,7% em peso do produto Tracer® (teor de formulação de espinosade de 10%) . O lado BB foi revestido apenas com o transportador (tinta sem espinosade) como um painel de controlo. O lado CC foi revestido com uma formulação de tinta que compreende de 88,6 em peso de tinta acrílica convencional branca (sem qualquer conservante, ou outro agente anti-incrustante) e 11,4% em peso do produto Tracer® (teor de formulação de espinosade a 5%) . O lado DD não foi revestido com qualquer material. Na superfície rotulada de todos os painéis, não houve revestimento. Os painéis foram colocados nos suportes de uma plataforma flutuante e permaneceram continuamente submersos em Tuticorin Bay, na índia, por um período de 40 semanas. Os painéis foram examinados durante alguns minutos todos os meses e voltarem imediatamente a ser submerso após serem fotografados. Os dados obtidos estão referenciados no quadro 4 infra representados pelas Figuras 2 e 3. Estes dados demonstram claramente que as composições de revestimento contendo as espinosinas e espinosade, em particular, são, durante um longo período de tempo, muito eficazes na prevenção da fixação de organismos incrustantes, especialmente incrustantes duros como cracas, na superfície de estruturas subaquáticas às quais a composição é aplicada. Fotografias de alguns painéis no final deste ensaio encontram-se igualmente anexas ao presente documento. 33

Lisboa, 7 de Dezembro de 2012 34

Tabela 4: teste estático de 40 semanas de emersão Paine 1 no . Id do Paine 1 Lad o No. de cracas isolada s % da superfíci e coberta por cracas No. De cracas na superfíci e rotulada Diâmetr o máximo em mm No . De ostra s No . de vermes tubelare s 1 AA a 13 - 40 10 - - BB b + + + + 80 21 18 5 5 2 AA a 16 - 33 8 1 - BB b + + + + 85 30 18 2 6 3 AA a 6 - 40 18 - - BB b + + + + 70 32 18 1 6 4 CC a - - 27 9 - 3 DD b + + + + 60 20 18 - 1 5 CC a 4 - 30 10 - - DD b + + + + 60 23 18 1 2 6 CC a - 24 6 - - DD b + + + + 60 33 18 - - Nota 1: quando o número de cracas é muito elevado, não permitindo a sua contagem (símbolo: ++++), faz-se referência à percentagem da superfície do painel coberto pelas mesmas, na coluna seguinte.

Nota 2: a área rotulada não tem revestimento, portanto, cracas podem aderir a esta área. 35

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de revestimento anti-incrustante marinha ou de água doce que compreende pelo menos uma espinosina ou seu derivado ou um sal e um transportador, em que a referida composição é eficaz para evitar a fixação de organismos aquáticos a artigos em que a referida composição é aplicada.
2. 2. A composição de revestimento anti-incrustante marinha ou de água doce de acordo com a reivindicação 1 em que o referido transportador é seleccionado a partir de um agente formador de película, material de cimento, material termoplástico, fibra de vidro, material elastomérico, e borracha vulcanizada.
3. 3. A composição de revestimento anti-incrustante marinha ou de água doce de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda, pelo menos, um ingrediente activo adicional seleccionado a partir biocidas anti-incrustantes, microbicidas, agentes anti-incrustantes de origem natural, sais de metal anti-incrustações, bactericidas, fungicidas, algicidas, insecticidas e antibióticos, incluindo formas livres ou encapsulados do acima referido ou suas misturas.
4. 4. A composição de revestimento anti-incrustante marinha ou de água doce de acordo com a reivindicação 3 em que pelo menos um biocida anti-incrustante adicional é: a) Isotiazolona, ou b) Seleccionado a partir de um etilenobisditiocarbamato de manganês; dimetil ditiocarbamato de zinco, 2- 1 metil-4-t-butilamino-6-ciclopropilamino-s-triazina; 2,4,5,6- tetracloroisoftalonitrilo,N,N-dimetil-ureia diclorofenilo; etilenobisditiocarbamato de zinco; tiocianato de cobre; 4,5-dicloro-2-n-octil-3-isotiazolona; N-(fluorodiclorometiltio)-ftalimida; N,N-dimetil-N'-feni-N'-fluorodiclorometiltio-sulfa mide; zinco de 2-piridinetiol-l-óxido; dissulfureto tetrametiltiuram; 2,4,6-trichlorophenylmaleimide; 2,3,5, 6-tetra-cloro-4-(metilsulfonil)-piridina; 3-iodo-2-propinil butil carbamato; diiodometil p-tolil-sulfona; bis dimetil dithiocarbamoyl etilenobisditiocarbamato de zinco; fenil (bispyridil) bismuto, dicloreto de 2-(4-tiazolil)-benzimidazole; piridina trifenil borano; fenilamidas; compostos de halopropargyl, ou 2-haloalkoxyaryl-3-isotiazolonas, tais como 2-(4-trifluorometoxifenil)-3-isotiazolona, 2-(4-trifluorometoxifenil)-5-cloro-3-isothiazolone, e 2-(4-trifluorometoxifenil)-4,5-dicloro-3-isotiazolona, anti-incrustantes organometálicos, tais como tributil-estanho ou trifenil estanho, ou anti-incrustantes inorgânicos tais como, por exemplo, óxido de zinco, cobre, óxido de cobre, ou oxido de dicobre e dióxido de enxofre.
5. 5. A composição de revestimento anti-incrustante marinha e de água doce de acordo com a reivindicação 1, em que a espinosina está presente numa percentagem de a) 0,001% a 90%; ou b) 0,1% a 10%.
6. 6. A composição de revestimento anti-incrustante marinha e de água doce de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente pelo menos um aditivo 2 escolhido de entre os pigmentos, diluentes orgânicos, agentes de enchimento, extensores, agentes de inchamento), agentes molhantes, agentes anticongelantes, promotores de adesão, estabilizadores UV, niveladores, conservantes, e suas combinações.
7. 7. A composição de revestimento anti-incrustante marinha e de água doce de acordo com a reivindicação 1 em que a composição é uma composição de libertação controlada.
8. 8. Um método para a protecção de um artigo submerso em água salgada ou água doce, de organismos incrustantes compreendendo a aplicação ao referido artigo da composição de acordo com a reivindicação 1. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8 em que tais organismos anti-incrustantes marinhos ou de água doce, são seleccionados a partir de cracas, mexilhões zebra, algas, diatomáceas, bactérias, hidróides, briozoários, esponjas, tunicados, moluscos, ascidias, vermes tubulares e moluscos asiáticos.
9. 10. O método de acordo com a reivindicação 8 em que a composição compreende pelo menos uma espinosina, compreendendo ainda um ingrediente activo anti-incrustante seleccionado a partir de biocidas anti-incrustantes, microbicidas, agentes anti-incrustantes de origem natural, sais de metal anti-incrustantes, bactericidas, fungicidas, algicidas, insecticidas e antibióticos, incluindo formas livres ou encapsulados do acima referido ou as suas misturas. 3 11. 0 método de acordo com a reivindicação 8 em que a composição de revestimento compreende um polímero formador de película aglutinante.
10. 12. Uma composição de revestimento anti-incrustante marinha ou de água doce de acordo com a reivindicação 1 ou o método de acordo com a reivindicação 11, em que tal revestimento é uma tinta, um verniz, um primário ou um vedante.
11. 13. Um produto compreendendo uma estrutura marinha ou de água doce submersível protegido contra organismos anti-incrustantes em que tal protecção é conseguida através do método de acordo com a reivindicação 8. 14. 0 produto de acordo com a reivindicação 13, em que a protecção é conseguida pela aplicação da composição de revestimento à referida estrutura, composição essa que compreende um polímero formador de película aglutinante. 15. 0 produto de acordo com a reivindicação 13 em que a referida estrutura é um barco, embarcação, equipamento de aquicultura, uma plataforma de petróleo, um cais, uma rede de pesca, um empilhamento, cais ou componentes dos mesmos.
12. 16. Um método para tornar um produto submersível ou seu componente, seleccionado a partir de pelo menos um barco, embarcação, equipamento de aquicultura, uma plataforma de petróleo, um cais, uma rede de pesca, um empilhamento um cais ou componentes dos mesmos, compreendendo a incorporação no referido produto, ou componente do mesmo, de uma composição anti- 4 incrustante compreendendo pelo menos uma espinosina ou um seu derivado ou sal.
13. 17. A composição de revestimento anti-incrustante marinha e de água doce de acordo com a reivindicação 1 ou o método de acordo com as reivindicações 8 ou 16, em que pelo menos uma da espinosinas é seleccionada a partir de um espinosade, espinetorame, e espinosina butenilo.
14. 18. Um produto compreendendo uma estrutura marinha ou de água doce submersível protegida contra organismos anti-incrustantes em que tal protecção é conseguida através do método de acordo com a reivindicação 16.
15. 19. Um método para a inibição do desenvolvimento de bactérias do género vibrio, flavobacterium, alcaligenes, e Aeromonas em um ambiente aquático em que as bactérias entram em contacto com a composição compreendendo pelo menos uma espinosina seleccionada a partir de um espinosade, espinetorame, e espinosina butenilo.
16. 20. O método de acordo com a reivindicação 19 em que o ambiente aquático é uma estrutura de piscicultura. Lisboa, 7 de Dezembro de 2012 5