PT1830833E

PT1830833E - Combinação de um inibidor do transportador da glicina (glyt1) e um antipsicótico para o tratamento de sintomas de esquizofrenia, bem como a sua preparação e sua utilização

Info

Publication number: PT1830833E
Application number: PT05849954T
Authority: PT
Inventors: John Allen Moyer; David Ashton; Peter Kalivas; Mark Klitenick
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2010-03-12
Also published as: CY1110617T1; EP1830833A2; SI1830833T1; WO2006066121A2; DE602005019203D1; DK1830833T3; ES2338346T3; US20060154919A1; EP1830833B1; PL1830833T3; WO2006066121A3; ATE456366T1; CA2590287A1

Description

DESCRIÇÃO "COMBINAÇÃO DE UM INIBIDOR DO TRANSPORTADOR DA GLICINA (GLYTl) E UM ANTIPSICÓTICO PARA O TRATAMENTO DE SINTOMAS DE ESQUIZOFRENIA, BEM COMO A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO"

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do Pedido N° 60/636575 apresentado a 16 de Dezembro de 2004.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à prevenção e tratamento de sintomas da esquizofrenia. Mais particularmente, a invenção refere-se a composições farmacêuticas e tratamentos compreendendo um antipsicótico e um inibidor da GlyTl para o tratamento de sintomas da esquizofrenia associados com distúrbios, tais como esquizofrenia, demência, depressão, Alzheimer, ADHD, abuso de substâncias e ansiedade.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO

Os modelos tradicionais de esquizofrenia e distúrbio bipolar estão focados nos sistemas dopaminérgicos. Os antagonistas da dopamina e/ou lesões das vias da dopamina reduzem os efeitos da fenciclidina (PCP) em duas medidas 1 comportamentais que se pensa terem relevância para a sintomatologia clínica da esquizofrenia: as tarefas cognitivas envolvendo memória de trabalho e actividade locomotora. (Adams et al., 1998). Adams et al. divulgaram descobertas que indicam que a activação da neurotransmissão da dopamina não é suficiente para manter a locomoção induzida pela PCP e insuficiência da memória de trabalho e que a hiperestimulação glutamatérgica pode ter influência nos efeitos psicotomiméticos e de insuficiência cognitiva da PCP. A PCP induz um estado psicótico que se assemelha em muito à esquizofrenia, ao bloquear a neurotransmissão mediada nos receptores do glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA). (Javitt et al., 1997). Os agentes semelhante à PCP reproduzem, de modo único, os sintomas negativos, cognitivos e positivos da esquizofrenia. Os sintomas positivos são excessos comportamentais geralmente considerados psicóticos (e. g., alucinações, delírios, comportamento bizarro), enquanto os sintomas negativos indicam uma deficiência do comportamento normal (e. g., uma falta de reactividade social normal, afecto apático). As disfunções cognitivas incluem insuficiência na memória de trabalho, funções de execução, atenção prolongada, processamento básico de estímulos sensoriais, memória episódica verbal e movimentos oculares de seguimento lento. Os modelos mais recentes de esquizofrenia postulam agora que a esquizofrenia está associada com disfunção ou desregulação da neurotransmissão mediada nos receptores de glutamato do tipo NMDA no cérebro. 0 modelo NMDA da esquizofrenia suscitou a possibilidade de que os agentes que aumentam a neurotransmissão mediada pelo receptor NMDA podem ser terapeuticamente benéficos na esquizofrenia. 0 glutamato é o principal neurotransmissor que actua nos receptores NMDA. No entanto, a actividade do receptor NMDA é também modulada pelo aminoácido glicina que se liga a um local modulador selectivo 2 que é um componente integral do complexo do receptor NMDA. A Patente U.S. N° 5854286 divulga a utilização de glicina administrada oralmente, em quantidades dietárias, para o tratamento de esquizofrenia. A glicina é considerada um agonista total no local de ligação da glicina associado ao NMDA (McBain et al., 1989). A D-serina, tal como a glicina, está presente no cérebro em concentrações elevadas e pode funcionar como um ligando endógeno para o local de ligação da glicina do complexo do receptor NMDA (Schell et al., 1995). A Patente U.S. N° 6162827 divulga a utilização da D-serina no tratamento de sintomas de psicose.

Embora as descobertas com a glicina e D-serina suporte a utilização de agonistas totais do local da glicina, outros propuseram que os agonistas parciais do local da glicina, tais como o fármaco D-ciclosserina, deverão ser mais eficazes que os agonistas totais no tratamento da esquizofrenia (ver, e. g., Patente U.S. N° 5187171). Os agonistas parciais ligam-se ao mesmo local que os agonistas totais (i. e., local de reconhecimento da glicina do complexo do receptor NMDA), mas potenciam a abertura do canal numa percentagem mais reduzida (tipicamente, 40-70% da activação observada com agonistas totais, McBain et al., 1989). Estudos clínicos com D-ciclosserina proporcionaram suporte para o conceito de que os antagonistas parciais do local da glicina podem ser eficazes no tratamento da esquizofrenia (revisão em D'Souza et al., 1995), e o nivel de melhoria observado em estudos da D-ciclosserina (revisão em D'Souza et al., 1995) foram comparáveis, em algumas circunstâncias, com o nivel de melhoria observado após estudos com glicina (revisão em D'Souza et al., 1995) ou D-serina (Tsai et al., 1998) . 3

Uma segunda potencial abordagem para aumentar a neurotransmissão mediada pelo receptor NMDA é a administração de agentes que inibem os transportadores da glicina no cérebro, prevenindo, assim, a remoção da glicina dos locais activos do SNC. É conhecido, há muitos anos, que o cérebro contém sistemas de transporte activo para a glicina que podem regular os níveis cerebrais (D'Souza, 1995). Estudos mais recentes demonstraram que os transportadores de glicina são expressos, de um modo diferencial, em diferentes regiões do cérebro (Liu et al, 1993; Zafra et al., 1995) e podem estar co-localizados com os receptores de NMDA (Smith et al., 1992). No entanto, é também conhecido, há muitos anos, que os níveis intracelulares de glicina estão abaixo do nível necessário para saturar o local de ligação da glicina associado ao NMDA, tornando-se incerto se os transportadores de glicina são, na realidade, capazes de manter nível subsaturantes de glicina na proximidade imediata dos receptores NMDA. Este é um aspecto crucial pelo facto de, se os níveis de glicina já estão aos níveis de saturação ou abaixo, a glicina adicional não conseguiria, em teoria, ser capaz de estimular o funcionamento do NMDA (Wood, 1995). Como a glicina, tal como o glutamato, é um co-agonista obrigatório no receptor de NMDA, foi sugerido que o Gly-Tl funciona para manter os níveis de subsaturação na fenda sináptica. (Bergeron et al. 1998) . Se sob condições fisiológicas, o local de ligação da glicina do receptor NMDA está, na realidade, não saturado, então a modulação das concentrações sinápticas de glicina, utilizando um inibidor do Gly-Tl, seria um método para potenciar a função do receptor NMDA. (Slassi et al. 2004). Esta abordagem é atractiva porque poderá evitar os efeitos tóxicos dos agonistas que actuam, directamente, no receptor NMDA. 4 A esquizofrenia é um distúrbio cognitivo e comportamental que afecta até 1% da população humana. Outros estados de doença exibem sintomas também observados na esquizofrenia. A compreensão actual da etiologia dos sintomas da esquizofrenia e estados de doença semelhantes permanece vaga, mas aponta para uma combinação de factores genéticos e ambientais. A procura de medicamentos para tratar a esquizofrenia e estados de doença semelhantes focam-se, tradicionalmente, nos antagonistas do receptor da dopamina e, mais recentemente, em fármacos que combinam o bloqueio do receptor da dopamina com acções antagonista/agonista noutros receptores. Com base no trabalho com modelos animais e no facto de que o bloqueio dos receptores do glutamato NMDA em humanos normais, produz sintomas semelhantes à esquizofrenia, foi postulado que a hipofunção do sistema do glutamato, especificamente no receptor NMDA, está na base de alguns sintomas na esquizofrenia (Goff e Coyle, 2001) . No entanto, os fármacos que inibem ou estimulam directamente os receptores do NMDA provaram não ser seguros para a rotina dos cuidados básicos do doente em modelos animais e ensaios clínicos iniciais. Felizmente, o receptor NMDA é um canal heteromérico complexo que pode ser modulado farmacologicamente de modo mais subtil que o simples bloqueio ou estimulação do local de ligação do glutamato (Nakanishi et al., 1998). A glicina é o co-agonista obrigatório na subunidade NRl do complexo receptor do glutamato do tipo NMDA. Deste modo, o aumento do tónus no local de ligação da glicina (i. e., aumentando a glicina extracelular) potência a capacidade do glutamato para abrir o canal NMDA. Considerando a redução proposta na actividade do NMDA na esquizofrenia, foi postulado que o aumento da glicina extracelular pode aumentar a condutâncias no NMDA e, assim, aliviar alguns sintomas da 5 esquizofrenia e estados de doença semelhantes. Parsons et al. (1998) e Danysz et al. (1998) proporcionaram revisões dos dados relacionados com a função do receptor NMDA numa vasta gama de distúrbios no SNC. A Patente U.S. N° 6355681 divulga a utilização de glicina e precursores no tratamento de sintomas de psicose. 0 Pedido U.S. N° 20020161048 divulga a utilização de substitutos e precursores de glicina no tratamento de sintomas de psicose. O Pedido U.S. N° 20020183390 divulga um método e composição para aumentar a transmissão mediada pelo receptor NMDA, envolvendo a utilização de um inibidor do transporte da D-serina. O Pedido U.S. N° 20020183390 divulga que o método e composição podem ser utilizados no tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos, tal como esquizofrenia.

Um mecanismo para aumentar a glicina extracelular é prevenir a sua eliminação do espaço extracelular por absorção através do transportador 1 da glicina (GlyTl) (Javitt e Frusciante, 1997). Aragon et al. , (2003) é uma revisão na localização, mecanismo de transporte, estrutura, regulação e farmacologia dos inibidores do transporte da glicina. Javitt (2002) divulga que a disfunção do receptor NMDA pode desempenhar uma função na patofisiologia da esquizofrenia. Javitt (2002) divulga, também, que os inibidores do GlyTl podem representar uma abordagem de "geração futura" para o tratamento dos sintomas negativos e cognitivos persistentes da esquizofrenia. 6 A Patente U.S. N° 5837730 divulga que o inibidor do transporte da glicina, glicildodecilamida (GDA), é capaz de exercer efeitos comportamentais semelhantes à glicina em roedores.

Nenhuma das referências citadas divulgam ou sugerem o inibidor GlyTl e combinação antipsicótica da invenção.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Um objecto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um antipsicótico e um inibidor GlyTl, de acordo com a reivindicação 1. É aqui divulgado, apenas com objectivo de informação, um método para o tratamento de sintomas de esquizofrenia que compreende a administração de uma combinação de um antipsicótico e um inibidor GlyTl. É aqui divulgado, apenas com objectivo de informação, um método para aumentar os níveis extracelulares de glicina num mamífero, que compreende a administração de um antipsicótico em combinação com um inibidor GlyTl. É aqui divulgado, apenas com objectivo de informação, um método para aumentar os níveis extracelulares de dopamina num mamífero, que compreende a administração de um antipsicótico em combinação com um inibidor GlyTl. 7

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras Comparativas 1A-1D: Experiência N° 1, Efeitos da risperidona na glicina extracelular (painéis superiores) e dopamina (painéis inferiores) no estriado de rato. As doses são apresentadas na ordem ascendente, como indicado pelas setas. Os dados nos painéis da direita foram normalizados para a variação na percentagem relativamente à média dos três valores de linha de base (i. e., os dados obtidos antes da primeira seta) . Os dados são apresentados como média ± sem e foram avaliados estatisticamente utilizando uma ANOVA unilateral com determinações repetidas ao longo do tempo.

Figuras Comparativas 2A-2D: Experiência N° 2, Efeitos do COMPOSTO N° 1 na glicina extracelular (painéis superiores) e dopamina (painéis inferiores) no estriado de rato. As doses são apresentadas na ordem ascendente, como indicado pelas setas. Os dados nos painéis da direita foram normalizados para a variação na percentagem relativamente à média dos três valores de linha de base (i. e., os dados obtidos antes da primeira seta). Os dados são apresentados como média ± sem e foram avaliados estatisticamente utilizando uma ANOVA unilateral com determinações repetidas ao longo do tempo.

Figuras 3A-3D: Experiência 3: Efeitos de uma combinação de risperidona e COMPOSTO N° 1 na glicina extracelular no estriado. A seta indica quando foi efectuada a co-administração de fármacos. Os dados nos painéis da direita foram normalizados para a variação na percentagem relativamente à média dos três valores de linha de base (i. e., os dados obtidos antes da primeira seta). Os dados são apresentados como média ± sem e foram avaliados estatisticamente utilizando uma ANOVA unilateral 8 com determinações repetidas ao longo do tempo. Efeitos de uma combinação de risperidona e COMPOSTO N° 1 na dopamina extracelular no estriado. A seta indica quando foi efectuada a co-administração de fármacos. Os dados nos painéis da direita foram normalizados para a variação na percentagem relativamente à média dos três valores de linha de base (i. e., os dados obtidos antes da primeira seta). Os dados são apresentados como média ± sem e foram avaliados estatisticamente utilizando uma ANOVA unilateral com determinações repetidas ao longo do tempo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS

Foi agora verificado que a combinação de um antipsicótico com um inibidor GlyTl no tratamento de sintomas de esquizofrenia resulta num aumento inesperado na glicina extracelular. A presente invenção refere-se a uma combinação de antipsicótico/GlyTl, de acordo com a reivindicação 1. 0 antipsicótico e o inibidor GlyTl da combinação podem, cada, ser administrados separadamente ou podem estar em conjunto numa única composição farmacêutica. A combinação de antipsicótico/inibidor GlyTl pode ser utilizada no tratamento de sintomas de esquizofrenia associados com distúrbios, tais como esquizofrenia, demência, depressão, Alzheimer, ADHD, abuso de substâncias e ansiedade. Vários compostos, incluindo o COMPOSTO N° 1 e Composto N° 2, ligam-se a e inibem a absorção de glicina através do GlyTl. Os inibidores do GlyTl que podem ser utilizados de acordo com a invenção incluem, deste modo: 9

Composto N° 1, que é divulgado nas Patentes U.S. N° 6426364; 6525085; e 6579987.

Composto N° 2, que é divulgado nas Patentes U.S. N° 6426364; 6525085; e 6579987.

(CanHatNQaíPM 371,44))

Os antipsicóticos que podem ser utilizados de acordo com a invenção são antipsicóticos atípicos. Os antipsicóticos atípicos incluem a Risperidona, 3-[2-[4-(6-fluoro-l,2-benzisoxazol-3-il)piperidino]etil]-2-meti1-6,7,8,9-tetra-hidro-4H-pirido-[1,2— a]pirimidin-4-ona, e a sua utilização no tratamento de doenças psicóticas é descrito na Pat. U.S. N° 4804663.

Estão também incluídos os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, seus ésteres farmaceuticamente aceitáveis e formas enantioméricas dos antipsicóticos atípicos. 10

EXEMPLOS

SUMÁRIO DOS RESULTADOS

Os estudos de microdiálise de transmissão de dopamina foram efectuados para determinar se o COMPOSTO N° 1 afecta a transmissão de dopamina no cérebro. Os fármacos que inibem a transmissão de dopamina são, até à data, os medicamentos mais eficazes contra a esquizofrenia. Do mesmo modo, é conhecido que a maioria dos fármacos eficazes na esquizofrenia antagoniza os autoreceptores D2 da dopamina e, deste modo, elevam a dopamina extracelular (Ferre et al., 1995). Para determinar se o COMPOSTO N° 2 foi sinérgico com esta acção, o COMPOSTO N° 1 foi combinado com o antipsicótico risperidona e os efeitos na glicina e dopamina foram quantificados no estriado. A curva de dose-resposta cumulativa para o COMPOSTO N° 1 revelou o aumento esperado dependente da dose, nos niveis extracelulares de glicina no estriado. Enquanto a dose mais baixa (0,63 mg/kg) não teve efeito, a dose mais elevada de COMPOSTO N° 1 (10 mg/kg) provocou um aumento de 2,5 vezes na glicina. Embora sem afectar a glicina, a dose mais baixa de COMPOSTO N° 1 produziu uma redução significativa na dopamina extracelular e, após administração de 2,5 mg/kg, os niveis de dopamina foram normalizados e permaneceram inalterados mesmo com a dose mais elevada do COMPOSTO N° 1. A risperidona produziu um aumento dependente da dose na dopamina e glicina extracelular. Enquanto o efeito na dopamina foi esperado devido ao bloqueio dos autorreceptores D2, o aumento acentuado na glicina não era esperado. De um modo semelhante à dopamina, o aumento na glicina ocorreu a uma dose 11 limite de 0,16 mg/kg de risperidona. Na realidade, a risperidona, tal como o COMPOSTO N° 1, foi, igualmente, eficaz na produção de um aumento na glicina extracelular, como indicado por um aumento de 2,5 vezes na glicina, após 2,5 mg/kg de risperidona.

Os efeitos de cada fármaco isolado foram cumulativos quando os fármacos foram administrados em conjunto. Isto é, a combinação do COMPOSTO N° 1 e risperidona produziu um aumento superior na glicina relativamente a qualquer um dos fármacos isolado, atingindo um aumento de 6 vezes após uma combinação de 1 mg/kg de risperidona e 10 mg/kg de COMPOSTO N° 1. Também, de forma proporcional com a redução bifásica na dopamina pelo COMPOSTO N° 1, verificou-se que a combinação de baixa dose de COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg) tendeu a inibir o aumento produzido por 1 mg/kg de risperidona, enquanto a dose mais elevada do COMPOSTO N° 1 não alterou os aumentos induzidos pela risperidona na dopamina.

PROCESSOS EXPERIMENTAIS

Os compostos (como um sal de Na) foram armazenados, dissolvidos e administrados de acordo com as instruções detalhadas que acompanham cada composto. Os compostos foram dissolvidos num solvente consistindo em 10% de BCD (ciclodextrina beta) e administrados subcutaneamente.

Os ratos Sprague Dawley machos, pesando 275-325 g no inicio da experiência, foram alojados individualmente numa sala de colónia, com temperatura controlada, com um ciclo de luz/escuro de 12 h. A comida e água estava disponível ad libitum ao longo 12 de toda a experiência. As condições de alojamento e cuidado dos animais estavam de acordo com o "Guide for the Care e Use of Laboratory Animais" (Institute of Laboratory Animal Resources on Life Sciences, National Research Council, 1996) .

As cânulas de guia foram armazenadas em 95% de etoh antes da cirurgia, enquanto as ferramentas cirúrgicas foram submetida a esterilização térmica (250 °C) imediatamente antes de cada cirurgia. Os ratos foram anestesiados utilizando uma mistura de cloridrato de cetamina (100 mg/kg, IP) xilazina (12 mg/kg). Após ter sido determinada a anestesia adequada (utilizando os processos de picada na cauda e dedo da pata), os ratos foram colocados num instrumento esterotáxico. A região do crânio foi lavada com uma solução de Betadine a 2% e foi efectuada uma incisão rostrocaudal para expor a superfície do crânio. As cânulas de guia bilaterais (calibre 20, Plastics One) foram implantadas cronicamente sob o estriado médio (A/P: +0,5, M/L: ±2,5, D/V: -2,0; Paxinos & Watson, 1998) e fixadas utilizando quatro parafusos cranianos e cimento cranioplástico. A cânula necessita de ser implantada num ângulo para obter a distância inter-cânula minima necessária para a sonda utilizada durante a recolha de amostras na microdiálise. Após cirurgia, a temperatura corporal foi mantida utilizando uma almofada de aquecimento e os ratos foram monitorizados até estarem completamente conscientes. Os ratos foram depois alojados individualmente e avaliados diariamente através da monitorização da actividade geral, peso corporal e fezes. Os ratos foram monitorizados para sinais de uma infecção e a cefazolina (100 mg/kg; intramuscular) estava disponível, consoante necessário. Foi efectuado o registo de cada antibiótico administrado aos animais. 13

Foram dados, pelo menos, cinco dias para os ratos recuperarem antes da recolha de amostra para microdiálise. Aproximadamente 18 h antes da recolha de amostras, foi inserida uma sonda de microdiálise (calibre 24; membrana exposta de 2-3 mm; 13000 MWCO), incluída numa trela de mola e ligada a uma cabeça de injecção liquida ligada a um braço de compensação, numa cânula de guia, num rato acordado. A sonda foi fixa no lugar através de parafusos colocados numa porção de rosca da trela da sonda no interior da cânula de guia. O rato foi depois colocado numa câmara comportamental (Omnitech, Columbus OH) equipada com um ventilador e uma luz (10 W) e a comida e água estava disponível ad libitum. No dia da experiência, o tampão de diálise, consistindo em glucose 5 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 1,4 mM, MgCl2 1,2 mM e solução salina de tampão de fosfato a 0,15%, pH 7,4, foi perfundida através da sonda (2,0 pL/min) durante, pelo menos, duas horas antes da recolha de amostras. Foram depois recolhidas as amostras de diálise de 20 minutos durante duas horas para determinar os níveis de glicina basais. Os ratos foram depois injectados (intraperitonealmente) com veículo ou com uma dose do composto de teste e foram recolhidas as amostras de 30 min durante 10 horas. As amostras foram divididas para avaliação cromatográfica separada da glicina e dopamina e congeladas (-80 °C) até serem analisadas.

Aos ratos, com as sondas de diálise colocadas, foi administrada uma overdose de pentobarbiral e os cérebros fixos por infusão intracardíaca de PBS-formalina. As secções de cérebro coronal tinham 100 pm de espessura e coradas com violeta de cresilo para verificar a colocação da sonda. As sondas foram deixadas no lugar à medida que o animal foi perfundido de modo a verificar a presença de sangue no tracto da sonda. 14

As concentrações de glicina e dopamina nas amostras de diálise foram determinadas utilizando um sistema de HPLC Waters Alliance 2690 com detecção fluorimétrica ou um sistema de HPLC com detecção electroquimica colométrica ESA, respectivamente. As amostras de diálise foram divididas entre os dois sistemas, permitindo que a dopamina e glicina sejam quantificadas em cada amostra. Foi utilizada uma coluna Waters Spherisorb ODS2 (5 μΜ, 4, 6 x 250 mm) para separar os aminoácidos. A glicina foi detectada utilizando um Detector de Fluorescência Waters 474 com um comprimento de onda de excitação de 320 nm e um comprimento de onda de emissão de 400 nm. A fase móvel consistiu em 80% de H20, 20% de acetonitrilo, Na2HPC>4 0,1 M e ácido etilenodiamina-tetraacético 0,1 mM (pH para 5,8 com ácido fosfórico; filtro de 0,2 pm) com um fluxo de 0,75 mL/min. As amostras foram colocadas num injector automático refrigerado (4 °C) e a derivatização da pré-coluna dos aminoácidos com o-ftaldeido foi efectuada utilizando o Sistema Waters Alliance. No total, foram injectados 15 pL (5 pL de amostra mais 15 pL de OPA) na coluna. Foram analisadas todas as amostras recolhidas 2 h antes e depois do tratamento. Para as amostras recolhidas durante o pós-tratamento 2-24 horas, foi analisada uma amostra de 20-min/hora; as outras duas amostras foram mantidas para análise do composto contido na amostra. As alturas do pico da glicina foram comparadas com uma curva de padrão externa para quantificação. Foi preparada uma nova curva padrão todos os dias.

Para a análise da dopamina, as amostras foram colocadas num autoinjector ESA modelo 540 (Chelmsford, MA) ligado a uma sistema de HPLC com detecção electroquimica. A separação foi efectuada por bombagem das amostras através de uma coluna de fase reversa Ci8 de 15 cm (ESA, Inc.) e, depois, as amostras foram reduzidas/oxidadas utilizando a detecção colorimétrica. 15

Foram utilizados três eléctrodos: uma célula de guarda (+400 mV), um eléctrodo analítico de redução (-150 mV) e um eléctrodo analítico de oxidação (+250 mv) . Os picos foram registados e a área sob a curva determinada num computador com o software ESA Chromatography Data System. Estes valores foram normalizados por comparação com uma curva padrão interna para o isoproteronol e quantificados por comparação com uma curva padrão externa.

As alturas dos picos foram comparadas com uma curva de padrão externo para a quantificação. Os dados foram normalizados para percentagem de variação relativamente à linha de base (média de 3 amostras, 30 min antes do tratamento). Além disso, foram apresentados os dados em bruto e as diferenças foram indicadas juntamente com os dados normalizados. Todos os dados foram avaliados utilizando o ANOVA unilateral com determinações repetidas ao longo do tempo, utilizando o programa Statview num Macintosh G4.

Experiência Comparativa N° 1. Os níveis extracelulares da glicina e da dopamina no estriado de ratos (N = 5) foram avaliados após a administração de risperidona em três (3) doses (ascendentes, 0,16, 0,63 e 2,5 mg/kg). As amostras de diálise foram obtidas a cada 30 minutos, cada dose a ser avaliados durante 2 horas (8 horas no total). As Figuras Comparativas 1A-1D mostram o efeito da risperidona na glicina e dopamina. Os dados são apresentados tanto como a quantidade de analito por amostra, bem como normalizados para a percentagem de variação relativamente à média dos valores da linha de base (í. e., as amostras obtidas antes da primeira injecção de fármaco). A risperdona produziu o aumento esperado na dopamina extracelular, com a menor dose provocando uma elevação limite de, aproximadamente, 50% e as duas doses maiores produzindo um 16 aumento de 3-4 vezes na dopamina. Surpreendentemente, foi observado um aumento semelhante na glicina extracelular após a risperidona. Embora a dose mais baixa não tenha tido efeito, as duas doses mais elevadas de risperidona provocaram um aumento dependente da dose na glicina, até um máximo de 2,5 vezes.

Experiência Comparativa N° 2. Os níveis extracelulares da glicina e da dopamina no estriado do rato (N = 5) foram avaliados após a administração do COMPOSTO N° 1 a 3 (três) doses (ascendentes, 0,63, 2,5 e 10 mg/kg). As amostras de diálise foram obtidas a cada 30 minutos, cada dose a ser avaliada durante 2 horas (8 horas no total) . As FIG Comparativas 2A-2D mostram os resultados desta experiência. Como esperado, o COMPOSTO N° 1 provocou um aumento dependente da dose na glicina extracelular. Foi observado um efeito limite após 0,63 mg/kg e 10 mg/kg produziram um aumento de 2,5 vezes na glicina. O efeito do COMPOSTO N° 1 na dopamina extracelular foi bifásico em relação à dose (N = 7) . A menor dose do COMPOSTO N° 1 produziu uma redução de quase 50% na dopamina extracelular. Os níveis de dopamina regressaram ao normal após uma injecção de 2,5 mg/kg e permaneceram inalterados pela maior dose de COMPOSTO N° 1.

Experiência N° 3. Os dados gerados a partir da experiência N° 1 e N° 2 foram avaliados para determinar a melhor combinação de doses de COMPOSTO N° 1 e risperidona de modo a determinar o antagonismo ou sinergismo entre os dois compostos. Foram identificados dois regimes de dosagem. Para avaliar o efeito da dose mais baixa do COMPOSTO N° 1 na dopamina (ver Figuras Comparativas 2A-2D), foi administrada uma combinação de 0,63 mg/kg de COMPOSTO N° 1 e 1,0 mg/kg de risperidona num bolus único. De modo a avaliar um potencial sinergismo entre o COMPOSTO N° 1 e a risperidona no aumento da glicina extracelular 17 (ver Figuras Comparativas 1A-1D e 2A-2D), foram administradas 10 mg/kg de COMPOSTO N° 1 e 1,0 mg/kg de risperidona num bolus único.

Efeitos na glicina: A dose mais baixa de COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg) e a dose da risperidona examinada produziu um aumento modesto na glicina, quando administrados isoladamente (ver Figuras Comparativas 1A-1D e 2A-2D, respectivamente). Quando as duas doses de fármaco foram co-administradas (N = 5), ocorreu, aproximadamente, uma duplicação da glicina extracelular que foi consistente com o efeito da risperidona isolada. No entanto, a risperidona, combinada com a maior dose de COMPOSTO N° 1 (10 mg/kg), provocou um claro efeito aditivo (N = 6). Assim, embora cada fármaco produza, isoladamente, um aumento de 2-3 vezes na glicina, combinados produzem um aumento de 6 vezes na glicina extracelular.

Efeitos sobre a dopamina: As Figuras 3A-3D ilustram o efeito de ambas as combinações de fármaco na dopamina extracelular no estriado. Os painéis superiores ilustram o efeito da combinação da dose mais baixa de COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg) com a risperidona (N=6). Esta dose de COMPOSTO N° 1 reduziu a dopamina extracelular e pode ser observado que, apesar de ter sido determinado um aumento significativo, o COMPOSTO N° 1 antagonizou parcialmente o aumento da dopamina esperado, após 1,0 mg/kg de risperidona. Assim, o aumento de 300% esperado na dopamina após esta dose da risperidona (ver Figuras Comparativas 1C-1D) foi reduzido para 150% quando administrada em combinação com COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg). Em contraste, a dose mais elevada do COMPOSTO N° 1 (10 mg/kg) isolado não teve efeito na dopamina (Figuras Comparativas 2C-2D) e quando co-administrado 18 não alterou a capacidade da risperidona para aumentar a dopamina extracelular (N = 6).

Discussão e Conclusões

Estes dados reafirmam a capacidade do antagonista GlyTl COMPOSTO N° 1 para produzir um aumento dependente da dose na glicina extracelular e demonstram que a doses mais baixas, este fármaco reduz a dopamina extracelular. Os presentes dados também afirmam as descobertas de outros de que a risperidona aumenta a dopamina extracelular e permitem fazer a observação importante e surpreendente de que a risperidona produz um aumento dependente da dose na glicina extracelular. Além disso, em conjunto, os dois fármacos parecem aditivos nos seus efeitos na glicina, indicando mecanismos de acção distintos. COMPOSTO N° 1 e dopamina. Foi surpreendente que o COMPOSTO N° 1 reduziu a dopamina extracelular. 0 facto de que isto foi observado somente nas doses mais baixas pode indicar um mecanismo de acção distinto do bloqueio GlyTl. Independente do mecanismo, este efeito é sinergístico com acções terapêuticas conhecidas de medicamentos antipsicóticos. Assim, a redução da transmissão de dopamina no estriado podem ser indicativa de um mecanismo para reduzir o tónus do receptor de dopamina que é distinto do clássico bloqueio do receptor D2 associado à maioria dos fármacos antipsicóticos. Embora este efeito no corpo estriado (estriado ventral, especialmente) seja considerado uma importante acção terapêutica de fármacos antipsicóticos, a redução da transmissão de dopamina no córtex pré-frontal seria esperada para o agravamento da disfunção cognitiva associada à esquizofrenia. No entanto, há casos conhecidos em que os 19 estímulos farmacológicos e ambientais afectam, de modo diferente, a transmissão de dopamina no córtex pré-frontal e no estriado, nomeadamente em relação ao bloqueio do receptor NMDA (Cabib e Puglisi-Allegga, 1996; Moghaddam e Adams, 1998) e os efeitos do COMPOSTO N° 1 na dopamina extracelular no estriado podem não prever os efeitos no córtex pré-frontal, isto seria especialmente verdadeiro se os efeitos na dopamina fossem indirectos, uma vez que a organização sináptica do córtex pré-frontal difere acentuadamente em relação ao corpo estriado. 0 antagonismo ligeiro pela dose baixa do COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg) dos efeitos da risperidona para aumentar a dopamina no estriado é potencialmente importante, especialmente se o efeito do COMPOSTO N° 1 é distinto no corpo estriado e córtex. Assim, o antagonismo da risperidona no estriado, mas não no córtex, poderá ter um impacto terapeuticamente benéfico, tendo em consideração que se pensa que as acções da risperidona no estriado medeiam efeitos secundários motores indesejados. O aumento na glicina pela risperidona foi inesperado. O mecanismo permanece obscuro. Dado que a eliminação da glicina a partir do espaço extracelular é principalmente pela captação de glicina, o antagonismo do transportador é uma opção. Embora seja improvável que a risperidona se ligue directamente ao GlyT (Goff e Coyle, 2001), é possível que o bloqueio dos receptores da dopamina (ou serotonina) possam regular o GlyT.

Independentemente do mecanismo pelo qual a risperidona aumenta a glicina, existe um claro efeito aditivo entre COMPOSTO N° 1 e a risperidona no que diz respeito ao aumento da glicina extracelular. Na medida em que a esquizofrenia pode resultar, em parte, da condutância reduzido de NMDA, o efeito 20 aditivo na glicina extracelular pode proporcionar benefícios terapêuticos ao potenciar, indirectamente, condutâncias NMDA. Assim, se, de facto, elevar a glicina tem um beneficio terapêutico, combinar o COMPOSTO N° 1 com a risperidona pode permitir a utilização de doses mais baixas de risperidona.

Este estudo identificou duas novas acções do COMPOSTO N° 1 e risperidona. As baixas doses de COMPOSTO N° 1 reduziram os niveis de dopamina e a risperidona produziu um aumento dependente da dose na glicina. Embora os mecanismos celulares que medeiam essas acções permaneçam obscuros, estes resultam de interacções potencialmente importantes entre os dois fármacos. Assim, o COMPOSTO N° 1 (0,63 mg/kg), antagonizou ligeiramente a capacidade da risperidona para aumentar a dopamina, enquanto a capacidade de ambos os fármacos para aumentar a glicina foi aditiva. Na medida em que o glutamato e dopamina estão envolvidos na sintomatologia ou etiologia da esquizofrenia, as interacções do COMPOSTO N° 1 com o antipsicótico risperidona conhecido é terapeuticamente relevante.

Referências

Adams et al. 1998. Corticolimbic dopamine neurotransmission is temporarily dissociated from the cognitive and locomotor effects of phencyclidine. J. Neuroscience, 18(14):5545-5554.

Aragon et al. 2003. Structure, function and regulation of glycine neurotransmitters. European Journal of Pharmacology, 479:249-262. 21

Bergeron et al. 1998. Modulation of N-methyl-D-aspartate receptor function by glycine transport. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 95(26):15730-15735.

Cabib S, Publisi-Allegra S. 1996. Stress, depression and the mesolimbic dopamine System. Psychopharmacology, 128: 331-342.

Danysz et ai. 1998. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. D'Souza et al. 1995. Glycine site agonists of the NMDA receptor: a review. CNS Drug Revs., 1:227-260.

Ferre S, et al. 1995. Antagonistic interaction between A2a receptors and D2 receptors: implications for the treatment of schizophrenia. Neuroscience, 63: 765-773.

Goff DC, Coyle JT. 2001. The emerging role of glutamate in the pathophysiology and treatment of schizophrenia. Am J Psychiatry, 158: 1367-1377.

Javitt DC, Frusciante M. 1997. Glycyldodecylamide, a phencyclidine behavioral antagonist, blocked cortical glycine uptake: implications for schizophrenia and substance abuse.

Psychopharmacology, 129: 96-98.

Javitt DC. 2002. Glycine modulators in schizophrenia. Current Opinion in Investigational Drugs, 3(7):1067-1072. 22

McBain et al. 1989. Structural requirements for glycine co-agonist site of N-methyl-D-aspartate receptors expressed in Xenopus oocytes. Mol. Pharmacol., 36:556-65.

Liu et al. 1993. Cloning and expression of a spinal cord - and brain - specific glycine transporter with novel structural features. J. Biol. Chem., 268: 22802-22808.

Moghaddam B, Adams B. 1998. Corticolimbic dopamine transmission is temporally dissociated from the cognitive and locomotor effects of phencyclidine. J. Neuroscience, 18: 5545-5555.

Newcomer et al. 2001. NMDA receptor regulation of memory and behavior in humans. Hippocampus, 11:529-542 (2001).

Nakanishi Y, et al. 2001. Glutamate receptors: brain function and signal transduction. Brain Res Rev, 26: 230-235.

Parsons et al. 1998. Glutamate in CNS disorders as a target for drug development: an update. Drug News Perspect., 11(9):523-579.

Schell MJ, et al. 1995. D-serine, an endogenous synaptic modulator: localization to astrocytes and glutamate-stimulated release. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92:3948-3952.

Slassi et ai. 2004. Recent progress in the use of glycine transporter-1 inhibitors for the treatment of central and peripheral nervous System diseases, Ashley Publications Ltd ISSN 1354-3776:201-214 . 23

Smith et al. 1992. Cloning and expression of a glycine transporter reveal colocalization with NMDA receptors. Neuron, 8: 927-935.

Tsai et al. 1998. D-serine in the treatment of schizophrenia. Biol. Psychiatry, 44:1081-1089.

Zafra et al. 1995. Glycine transporters are differentially expressed among CNS cells. J. Neuroscience, 15: 3952-3969.

Lisboa, 4 de Março de 2010 24

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Produto médico, compreendendo (a) um antipsicótico seleccionado do grupo consistindo de risperidona, paliperidona e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, os seus ésteres farmaceuticamente aceitáveis e os seus formas enantioméricas, e (b) um inibidor GlyTl seleccionado do grupo consistindo de Composto N° 1 Composto N° 2 iO

(QwHzoNNaCMPM 393,42))

(C24H*iN03(PM 371,44)) 1 e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, os seus ésteres farmaceuticamente aceitáveis e as suas formas enantioméricas; como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial no tratamento ou prevenção de sintomas da esquizofrenia associados a distúrbios, tais como esquizofrenia, demência, depressão, ADHD de Alzheimer e abuso de substâncias e ansiedade.
2. Produto médico da reivindicação 1, administrado numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir os referidos sintomas.
3. Produto médico da reivindicação 1, administrado a um mamífero para aumentar a glicina extracelular num mamífero.
4. Produto médico da reivindicação 3, onde a referida glicina extracelular é aumentada para uma quantidade superior relativamente a quando o referido antipsicótico ou o referido inibidor GlyTl são administrados isolados.
5. Produto médico da reivindicação 3, em que o referido inibidor GlyTl tem um efeito mínimo ou nenhum efeito na dopamina extracelular. Lisboa, 4 de Março de 2010 2