PT1791561E - Calicivírus felino hemorrágico, vacina contra calicivírus e método para prevenir a infeção ou doença por calicivírus - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "CALICIVÍRUS FELINO HEMORRÁGICO, VACINA CONTRA CALICIVÍRUS E MÉTODO PARA PREVENIR A INFEÇÃO OU DOENÇA POR CALICIVÍRUS"

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS U.S. RELACIONADOS

Este pedido não provisório reivindica o beneficio sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório U.S. N.° 60/609.480, depositado em 1 de Setembro de 2004. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da invenção A presente invenção refere-se a uma estirpe nova isolada e purificada de calicivírus felino hemorrágico, virulento, vacinas produzidas dos mesmos e o uso das vacinas para proteger gatos da infeção ou doença por calicivírus.

Descrição da arte relacionada O calicivírus felino (FCV) causa com frequência uma crise aguda em ambientes com múltiplos gatos, particularmente hospitais veterinários e, em menor medida, abrigos para animais. Tipicamente, a infeção por FCV apresenta sinais que se parecem à rinotraqueíte virai (FVR) afetando o trato respiratório superior e, ocasionalmente, produzindo dores nas articulações e claudicação. Além disso, o gato infetado desenvolverá úlceras na língua e na região da boca. Vesículas e erosões das passagens nasais, o palato e a língua duros parecem prevalentes. Outros sintomas da doença por FCV incluem febre alta, perda de pelo, ulcerações da pele e edema (inchaço) nas pernas e à volta da face. Dependendo da virulência da estirpe infetante, a infeção por FCV pode tornar-se fatal. O principal método de transmissão é através da via oral da infecção, mas os gatos também podem ser infetados por inalação do vírus infecioso presente na saliva, fezes ou urina de gatos infetados. 2 A infeção por FCV pode afetar tanto gatos domésticos como algumas espécies de felinos selvagens. Uma vez que o FVR e o FCV compreendem quase 90% de todas as infeções respiratórias felinas, a diponibilidade de vacinas eficazes para prevenir estas duas doenças é de grande significado. FCV é um vírus ARN de cadeia simples capaz de se transformar por mutação em novas estirpes (J. N. Burroughs et al., "Physiochemical evidence for the re-classification of the caliciviruses, " Journal Gen. Virol. 22:281-286 (1974)). Existem mais de 65 calicivírus felinos em todo o mundo, o que faz com que a proteção adequada por vacinação, quando esta compreende apenas uma vacina, seja altamente incompleta e difícil. Porque o vírus é capaz de mutação, as vacinas monovalentes baseadas numa única estirpe do FCV podem não ser suficientemente protetoras contra outras estirpes do FCV (ver, geralmente, N. C. Pedersen et al., "Mechanisms for persistence of acute and chronic feline calicivírus infections in the face of vaccination," Veterinary Microbiol. 47(1-2):141-156 (Nov. 1995); A. Lauritzen et al., "Serological analysis of feline calicivírus isolates from the United States and United Kingdom," Veterinary Microbiol. 56(1-2):55-63 (May 1997); T. Hohdatsu et al., "neutralizing feature of commercially available feline calicivírus (FCV) vaccine immune sera against FCV field isolates," Journal of Veterinary Medicine Sei., 61(3):2 99-301 (Mar. 1999); A. D. Radford et al., "Comparison of serological and sequence based methods for typing feline calicivírus isolates from vaccine failures," Vet. Rec. 146(5):117-123 (Jan. 29, 2000)).

Outro problema com o FCV é que o vírus é altamente contagioso, os gatos infetados continuarão a excretar o vírus durante longos períodos de tempo após a infeção e os gatos que recuperam podem permanecer portadores do vírus infecioso para toda a vida. Os gatos assintomáticos podem mesmo disseminar a doença fatal a outros gatos saudáveis. 3

Foram relatados surtos recentes no norte da Califórnia e Nova Inglaterra de duas estirpes geneticamente diversas de calicivírus hemorrágicos, altamente virulentas que foram particularmente fatais para a população felina em abrigos para animais, denominados FCV-Ari e FCV-Diva, respetivamente (N. C. Pedersen et al., "An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent estirpe of feline calicivírus," Veterinary Microbiol. 73:281-300 (Maio de 2000); E. M. Schorr-Evans et al., An epizootic of highly virulent feline calicivírus disease in a hospital setting in New England," Journal of Feline Medicine and Surgery 5:217-226 (2003)).

No passado, foram descritas vacinas virais monovalentes e várias foram fabricadas para prevenir doenças felinas usando uma variedade de antígenos tais como a estirpe F9 do calicivírus felino (Patente U.S. N.° 3 944 469 (J. L. Bittle et al.)), Chlamydia psittaci felina (Patentes U.S. N.° 5 972 350 e 5 242 686 (H.-J. Chu et al.)), vírus da leucemia felina (Patente U.S. N.° 4 264 587 (N. C. Pedersen et al.)) e afins. Outras estirpes de calicivírus tais como a FCV-M8 e FCV-255 e vírus da rinotraqueíte felina também foram previamente isolados e descritos para uso em vacina (E. V. Davis et al., "Studies on the safety and efficacy of an intranasal feline rhinotracheitis-calicivirus vaccine," VM-SAC 71:1405-1410 (1976); D. E. Kahn et al., "Induction of immunity to feline caliciviral disease," Infect. Immun. 11:1003-1009 (1975); D. E. Kahn, "Feline viruses: pathogenesis of picornavirus infection in the cat," Am. J. Vet. Research 32:521-531 (1971)). Além disso, a Patente U.S. N.° 4 522 810 (N. C. Pedersen) descreve uma vacina contra o calicivírus felino que contém a estirpe FCV-2280. A Patente U.S. N.° 6 231 863 (D. Colau et al.) descreve sequências nucleotídicas do genoma da estirpe FCV-2280 e vacinas usando as sequências nucleotídicas do gene da cápside para prevenir a doença do 4 calicivírus felino. A Patente U.S. N.° 5 106 619 (G. P. Wiesehahn et al.) revela a preparação de vacinas virais desativadas que incluem calicivírus felino entre outros. A Patente U.S. N.° 6 051 239 (L. Simpson et al. ) descreve vacinas orais que usam uma toxina do botulismo modificada em conjunto com antígenos tais como o calicivírus.

Mais recentemente, foi identificada uma estirpe de FCV-Kaos (K. F. Hurley et al, "An Outbreak of virulent systemic feline calicivírus disease, J. Am. Vet. Med. Assoe. 224(2):241-249 (15 Janeiro, 2004)) e, subsequentemente, ambas estirpes FCV-Kaos e FCV-Ari foram isoladas (Pedido de Patente U.S. N.° 20040180064 Al, Calicivírus felino hemorrágico, publicado em 16 de Setembro de 2004). As estirpes do calicivírus sistémico virulentas isoladas (VS-FCV), incluindo FCV-Kaos, FCV-Ari e FCV-Bellingham, foram descritas como compreendendo uma proteína da cápside incluindo um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em lisina (K) na posição 448 do aminoácido; ácido glutâmico (E) na posição 452 do aminoácido; lisina (K) na posição 581 do aminoácido; e ácido aspártico (D) na posição 581 do aminoácido (Pedido de Patente U.S. N.° 20040259225 Al, Calicivírus felino sistémico virulento, publicada em 23 de Dezembro de 2004).

Foram preparadas ou descritas vacinas multivalentes para conter misturas de muitos antígenos virais tais como Chlamydophila felis (outrora conhecido por Chlamydia psittaci felina) em combinação com um ou mais patógenos compreendendo vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina, calicivírus felino, vírus da rinotraqueíte felina, vírus da imunodeficiência adquirida felina, raiva, peritonite infeciosa felina, Borrelia burgdorferi e afins (Patente U.S. N.° 6 004 563 (H.-J. Chu et al.) ) . Outra mistura de isolado Rickard do vírus da leucemia felina, vírus da rinotraqueíte felina, calicivírus felino e vírus da panleucemia felina foi, da mesma forma, 5 revelada como uma vacina (Patente U.S. N.° 5 374 424 (W. H.

Kelsey et al.)) ·

Infelizmente, nenhuma das anteriores vacinas que contêm estirpes previamente usadas do calicivirus felino protege adequadamente o felino das estirpes emergentes de calicivirus felino hemorrágico. Nos surtos recentes do calicivirus felino hemorrágico, houve um número significativo de mortes apesar do facto dos gatos terem recebido vacinações contra o calicivirus.

Consequentemente, existe decididamente uma necessidade reconhecida na arte no campo veterinário para produzir uma vacina segura e eficaz contra as infeções pelo calicivirus felino hemorrágico, altamente virulentas. Outra necessidade reconhecida na arte é providenciar uma vacina virai de amplo espectro que proteja os gatos contra infeção e doença sérias causadas tanto pelas estirpes do FCV hemorrágicas como pelas comuns. A nova estirpe do FCV da presente invenção é capaz de satisfazer aquelas necessidades despoletando de forma única e vantajosa uma resposta imune especifica contra a estirpe virulenta do FCV hemorrágico para proteger os gatos da doença virai crónica e aguda. Em combinação com estirpes comuns de calicivirus, a nova estirpe do FCV desta invenção é capaz de conseguir títulos de anticorpos neutralizadores do vírus excelentes e tornar possível a imunização de amplo espectro.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma estirpe do FCV hemorrágico nova, altamente infeciosa, designada FCV-DD1 como definido na reivindicação 1, que é útil como uma estirpe de vacina como definido nas reivindicações 2-13. Uma modalidade adicional da invenção é desenhada para o uso de dita vacina como definido nas reivindicações 14-15. São também descritos métodos para diagnosticar ou detetar o calicivirus felino hemorrágico num hospedeiro suscetível, portador assintomático e afins detetando a presença do 6 calicivírus felino FCV-DD1 ou anticorpos criados ou produzidos contra o antígeno do calicivírus felino FCV-DD1. BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS PERSPECTIVAS DOS DESENHOS Não aplicável.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em concordância com a presente invenção, é providenciada uma nova estirpe do calicivírus felino (FCV) altamente infeciosa e vacinas veterinárias para proteger gatos da infeção virai causada pelo calicivírus. Mais especificamente, a invenção descreve um calicivírus felino "FCV-DD1" hemorrágico isolado e purificado como definido na reivindicação 1 e inclui os clones virais derivados do isolado do FCV-DD1. (Sempre que o isolado do FCV-DD1 é mencionado aqui, entende-se que os clones virais podem substituir o isolado parental em cada instante). São também descritas vacinas que contêm uma quantidade imunogénica de FCV-DD1 como definido nas reivindicações 2-13 e o uso de dita vacina como definido nas reivindicações 14-15. A vacina pode conter opcionalmente um ou mais isolados adicionais do FCV tais como, por exemplo, FCV-255, FCV-2280, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-Bellingham, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8, etc. Desejavelmente, a vacina conterá FCV-DD1 junto com FCV-255, FCV-2280 ou ambos, e, mais preferencialmente, a mistura de FCV-DD1 com FCV-255.

Adicionalmente, a vacina pode conter opcionalmente outros antígenos ou patógenos tais como Chlamydophila felis (C. felis) , vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da panleucopenia felina (FPV), vírus da rinotraqueíte felina (FVR), vírus da imunodeficiência felina, vírus da raiva, vírus da peritonite infeciosa felina, bactéria Bartonella (por exemplo, doença por arranhadura de gato típica), uma combinação das mesmas e afins. Preferencialmente, a mistura de antígenos compreende FCV-DD1 em combinação com C. felis, vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina ou em combinação com C. 7 feliSf vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina. Uma vacina multivalente particularmente preferida compreende FCV-DD1, um calicivírus felino não hemorrágico tal como FCV-255, vírus da rinotraqueíte felina e vírus da panleucopenia felina, com a adição opcional do vírus da leucemia felina e/ou C. felis, ou outras estirpes do FCV.

Conduzindo à descoberta da nova estirpe FCV-DD1 do calicivírus felino hemorrágico, foi obtida uma amostra de cultura de tecido de FCV-Ari do Dr. Neils Pedersen na Escola de Medicina Veterinária, UC Davis, Califórnia (N. C. Pedersen et al., "An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivírus," Veterinary Microbiol. 73:281-300 (May 2040)). A amostra de FCV-Ari foi congelada, derretida e usada para infetar uma cultura de tecidos em frasco cilíndrico de células Crandell de rim felino confluentes (CRFK) (R. A. Crandell et al., "Development, characterization, and virai susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK)," In Vitro 9:176-185 (1973)) . Posteriormente, o frasco cilíndrico foi congelado, derretido e o fluído da cultura foi dividido em aliquotas como cultura de trabalho. A "cultura de trabalho" do FCV-Ari inicial foi usada para inocular gatos de maneira a confirmar que a "cultura de trabalho" do material recebido do Dr. Neils Pedersen continha calicivírus hemorrágico. Os gatos inoculados com a "cultura de trabalho" do FCV-Ari despoletaram sinais clínicos extremos tais como febre elevada, edema, desidratação, e morte confirmando que a "cultura de trabalho" do FCV-Ari continha calicivírus hemorrágico. A "cultura de trabalho" do FCV-Ari foi depois diluída para um título de 105 TCID50 por mL, congelada, derretida, e filtrada em filtro de 0,2 pm. O FCV-Ari filtrado foi usado para subsequente purificação e isolamento da estirpe mais 8 virulenta de calicivírus. 0 FCV-Ari filtrado foi clarificado, diluído em série e usado para infetar pratos de cultura de tecidos de 24 poços confluentes com células CRFK. 0 poço da diluição mais alta que continha um efeito citopático (CPE) nas células CRFK foi colhido, congelado, rapidamente derretido, diluído em série, e usado para infetar outro prato de cultura de tecido de 24 poços confluente com células CRFK. Este procedimento foi repetido duas vezes num total de três rondas de purificação e isolamento.

Uma porção do assim purificado FCV-Ari foi desativada com formalina e usada para misturar uma vacina monovalente morta. Esta vacina FCV-Ari desativada foi injetada em gatos para medir a resposta serológica à vacinação. Inesperadamente, a vacinou falhou em induzir títulos de anticorpo neutralizadores do vírus mesmo apesar de terem sido induzidos anticorpos contra o vírus como confirmado por ELISA. Além disso, o FCV-Ari (vivo) purificado foi usado para inocular dois grupos de gatos. Estes dois grupos de gatos não exibiram sinais clínicos característicos de uma infeção por calicivírus hemorrágico tais como elevadas temperaturas, edema, pioderma, alopecia, etc. Porque a vacina morta não induziu anticorpos neutralizadores e a estirpe viva purificada da "cultura de trabalho" do FCV-Ari não causou infeção por calicivírus hemorrágico num estudo de desafio controlado, o vírus isolado a partir da primeira purificação da amostra do FCV-Ari foi confirmado não ser o isolado hemorágico; o trabalho adicional e desenvolvimento da vacina desta estirpe cessou. Foi depois presumido que a amostra de vírus original do FCV-Ari continha duas estirpes do FCV ou possivelmente mais, pelo menos uma das quais não era virulenta como demonstrado pela estirpe isolada que foi obtida a partir da primeira purificação.

Numa tentativa de isolar a estirpe virulenta que causou a infeção por calicivírus felino hemorrágico, a 9 amostra original da cultura de tecidos do FCV-Ari foi usada durante três rondas de purificação e isolamento. De maneira a cumprir a tarefa, a amostra do FCV-Ari foi incubada com os anti-soros gerados a partir da vacinação (morta) original do FCV-Ari. 0 vírus foi diluído em série e usado para infetar pratos de cultura de tecido de 24 poços confluentes com células CRFK, e os poços da diluição mais alta que exibiram um efeito citopático (CPE) nas células CRFK foram colhidos. Os clones do vírus colhidos foram avaliados por ensaios padronizados de soro-neutralização do vírus. Cada clone virai foi incubado com os anti-soros gerados a partir da primeira vacina morta de purificação, ou com os anti-soros gerados a partir da inoculação com a "cultura de trabalho" viva. Os resultados deste ensaio de soro-neutralização mostraram, surpreendentemente, que havia mais de uma estirpe de calicivírus na amostra original e confirmaram, ainda, que a estirpe isolada a partir da primeira ronda de purificação não era a estirpe hemorrágica. Os clones virais que não foram selecionados e descartados foram aqueles que foram neutralizados pelos anti-soros específicos para o produto indesejado da primeira purificação. Os clones do vírus selecionados para as rondas subsequentes de purificação foram aqueles que foram neutralizados por anti-soros para o vírus original do Dr. Pedersen no entanto não foram neutralizados por anti-soros específicos para o produto indesejado da primeira purificação. A seleção do clone do vírus por colheita da diluição mais alta causando CPE foi repetida num total de três rondas. 0 isolado do vírus resultante, designado FCV-DD1, foi inoculado em gatos e os gatos exibiram sinais clínicos típicos de calicivírus hemorrágico. Por este processo, a estirpe do FCV-DD1 isolada e purificada foi determinada como sendo uma verdadeira estirpe de calicivírus felino hemorrágico, previamente desconhecida no campo veterinário. 10

Consequentemente, são descritos aqui a nova estirpe do FCV-DD1 isolada e purificada, vacinas do FCV-DD1 e métodos de usar o calicivirus. Gatos inoculados são protegidos da doença e infeção virai sérias causadas pelo calicivirus. O novo método pretege os gatos em necessidade de proteção contra a infeção virai administrando ao gato uma quantidade imunologicamente eficaz de uma vacina aqui descrita, tal como, por exemplo, a vacina que contém FCV-DD1 morto, vivo modificado ou atenuado ou o seu clone. As vacinas podem, ainda, conter antigenos adicionais para promover a proteção imunológica dos gatos contra múltiplas doenças de felinos incluindo, mas não limitadas a, estirpes do calicivirus não hemorrágicas, por exemplo, FCV-255, FCV-2280, etc., outras estirpes do calicivirus hemorrágico, por exemplo, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-F9, etc. e outros antigenos adequados tais como virus da rinotraqueite felina, vírus da panleucopenia felina (cinomose felina), Chlamydophila felis (C. felis) , etc.. Os antigenos adicionais podem ser dados concorrentemente ao gato num produto de combinação ou separadamente de maneira a providenciar um amplo espectro de proteção contra as infeções virais. Mais preferencialmente, a mistura contém FCV-DD1, FCV-255, C. felis, vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueite felina ou, em alternativa, FCV-DD1, FCV-255, vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueite felina, vírus morto, e, opcionalmente, vírus da leucemia felina e/ou C. felis ou outras estirpes do FCV. Para ampliar o âmbito de proteção conferido pela vacina que contém a FCV-DD1 contra a infeção ou doença de modo complementar, é útil que a vacina multivalente contenha duas ou mais estirpes do FCV nas quais a estirpe adicional do FCV pode incluir, mas não está limitada a, FCV-255, FCV2280, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-Bellingham, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8, etc.; e é particularmente benéfico incluir pelo menos uma ou mais estirpes não hemorrágica tal como FCV- 11 255, FCV-2280, etc. Quando certos antígenos do FCV, tais como FCV-F9, são empregues é desejável fabricar uma vacina viva modificada ou atenuada para acomodar a virulência do virus. Uma combinação preferida de antígenos numa vacina é uma na qual o calicivírus felino adicional com FCV-DD1 compreende FCV-255, FCV-2280 ou a combinação de FCV-255 e FCV-2280, em conjunto com pelo menos o vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina.

As vacinas compreendem, por exemplo, a estirpe virai infeciosa como um vírus desativado (morto) , um vírus atenuado, um vírus vivo modificado, etc. em combinação com um veículo fisiologicamente aceitável ou diluente não tóxicos e outros excipientes inertes, adjuvantes ou co-formulantes convencionais que são tolerados pelas espécies de felinos. A estirpe FCV-DD1 isolada e purificada ou o seu clone virai podem ser usados como uma vacina monovalente na qual a proteção recai na sua capacidade para providenciar proteção contra a infeção por outros serotipos através da neutralização cruzada. A inoculação repetida com o mesmo serotipo tipicamente confere proteção contra infeção grave subsequente.

As novas vacinas aqui descritas não estão restritas a nenhum tipo ou método particular de preparação. As vacinas virais incluem, mas não estão limitadas a, vacinas desativadas (mortas), vacinas vivas modificadas, vacinas atenuadas, vacinas de subunidade, vacinas fabricadas por engenharia genética, etc. Estas vacinas são preparadas por métodos padrão conhecidos na arte. As vacinas mais preferidas para entrega da nova estirpe FCV-DD1 para inocular gatos contra a infeção e doença por FCV virulento são as vacinas de vírus desativado (mortas) ou vivo modificado.

Para preparar vacinas de vírus desativado, por exemplo, a propagação do vírus é feita por métodos conhecidos na arte ou descritos aqui. A desativação do 12 vírus é conseguida por protocolos geralmente conhecidos dagueles com habilidade comum na arte. As vacinas de vírus desativado podem ser preparadas tratando o vírus com agentes desativadores tais como a formalina ou solventes hidrofóbicos, ácidos, beta-propiolactona, etilenoimina binária, etc. A formalina é o agente desativador mais preferido. A desativação é conduzida de uma maneira compreendida na arte. Por exemplo, para conseguir desativação química, uma amostra de vírus adequada ou amostra de soro contendo o vírus é tratada durante uma duração de tempo suficiente com uma quantidade suficiente ou concentração de agente desativador a uma temperatura ou pH suficientemente altos ou baixos, dependendo do agente desativador, para desativar o vírus. 0 vírus é considerado desativado se é incapaz de infetar uma célula suscetível à infeção. A preparação de vacinas de subunidades difere tipicamente da preparação de uma vacina viva modificada ou de uma vacina desativada. Antes da preparação de uma vacina de subunidade, têm que ser identificados os componentes protetores ou antigénicos da vacina. Tais componentes protetores ou antigénicos incluem, por exemplo, as proteínas imunogénicas ou proteínas da cápside da estirpe do vírus. Estes componentes imunogénicos são identificados por métodos conhecidos na arte. Uma vez identificados, as porções protetoras ou antigénicas do vírus (isto é, a subunidade) são subsequentemente purificadas através de procedimentos padrão e/ou clonadas através de técnicas de ADN recombinante padrão (ver, por exemplo, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA., 1989). A vacina de subunidade providencia uma vantagem sobre outras vacinas baseadas no vírus vivo uma vez que a subunidade, tais como subunidades altamente purificadas do vírus, é menos tóxica do que o vírus completo. 13

Para preparar vacinas atenuadas a partir de clones virais virulentos, a cultura de tecido adaptada, o FCV patogénico vivo é primeiro atenuado através de métodos conhecidos na arte, tipicamente feitos por passagem em série através de culturas celulares. A atenuação dos clones patogénicos também pode ser feita introduzindo mutações de ponto, resultando em deleções de genes no genoma do vírus.

Uma quantidade imunologicamente eficaz ou imunogénica da vacina aqui descrita é administrada a um felino em necessidade de proteção contra a infeção virai, normalmente com 8 a 10 semanas de idade ou mais velho. A quantidade imunologicamente eficaz ou imunogénica que inocula o gato contra a infeção e doença por FCV pode ser facilmente determinada ou prontamente titulada através de testes de rotina por aqueles com habilitação comum no campo veterinário. Uma quantidade eficaz é uma em que uma resposta imunológica suficiente à vacina é atingida para proteger o gato exposto ao vírus felino virulento. Esta resposta imunológica ao FCV é geralmente mostrada pela capacidade da vacina de induzir títulos de anticorpo neutralizador de vírus. Preferencialmente, o gato é protegido até um ponto em que um para todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos do estado de doença virai são significativamente reduzidos, melhorados ou totalmente prevenidos. A vacina é tipicamente administrada numa única dose ou em doses repetidas ao longo do tempo. As doses oscilam, por exemplo, de cerca de 0,25 mL a cerca de 3,5 mL, normalmente cerca de 0,5 mL a cerca de 2,5 mL, preferencialmente de cerca de 0,8 mL a cerca de 1,2 mL, e mais preferencialmente, a cerca de 1,0 mL, dependendo da concentração do componente imunogénico da vacina, mas não deveria conter uma quantidade de antígeno baseado em vírus suficiente para resultar numa reação ou em sintomas fisiológicos adversos da infeção virai. Os métodos são bem 14 conhecidos na arte para determinar ou titular doses adequadas de agente antigénico ativo para encontrar doses mínimas eficazes baseadas no peso do gato, concentração do antígeno e outros fatores típicos. Para imunização ótima, um gato saudável é vacinado com uma dose de aproximadamente 1 mL usando técnica asséptica e depois uma segunda dose de 1 mL é dada entre cerca de duas a quatro semanas depois. A revacinação annual com uma única injeção de reforço da vacina é útil para manter uma boa imunidade contra a infeção. A vacina pode convenientemente ser administrada por via intranasal, transdérmica (isto é, aplicada em ou à superfície da pele para absorção sistémica), parentérica, oral, etc., ou uma combinação tal como oronasal em que parte da dose é dada oralmente e parte é dada dentro das narinas. A via de administração parentérica inclui, mas não se limita a, via intramuscular, subcutânea, intradérmica (isto é, injetada ou de outra forma colocada debaixo da pele), intravenosa e afins. As vias de administração intramuscular, subcutânea e oronasal são as mais preferidas.

Quando administrada como um líquido, a presente vacina pode ser preparada na forma convencional de uma solução aquosa, xarope, elixir, infusão e afins. Tais formulações são conhecidas na arte e são tipicamente preparadas por dissolução ou dispersão do antígeno e outros aditivos no veículo apropriado ou sistemas solventes para administração a gatos. Solventes ou veículos fisiologicamente aceitáveis não tóxicos adequados incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina, etilenoglicol, glicerol, etc. A vacina também pode ser liofilizada ou, de outra forma, seca em gelo e depois reconstituída ou rehidratada assepticamente usando um diluente adequado pouco antes do uso. Diluentes adequados incluem, mas não estão limitados a, solução salina, meio mínimo essencial Eagle e afins. 15

Aditivos ou co-formulantes típicos são, por exemplo, corantes certificados, aromatizantes, adoçantes e um ou mais conservantes antimicrobianos tais como timerosal (etilmercuritiosalicilato sódio), neomicina, polimixina B, anfotericina B e afins. Tais soluções podem ser estabilizadas, por exemplo, por adição de gelatina parcialmente hidrolizada, sorbitol ou meio de cultura celular, e podem ser tamponadas por métodos convencionais usado reagentes conhecidos na arte, tais como fosfato de hidrogénio de sódio, fosfato dihidrogénio de sódio, fosfato de hidrogénio de potássio, fosfato dihidrogénio de potássio, uma mistura dos mesmos, e afins.

As formulações líquidas também podem incluir suspensões e emulsões que contêm agentes suspensores ou emulsionantes em combinação com outros co-formulantes padrão. Estes tipos de formulações líquidas podem ser preparados por métodos convencionais. As suspensões, por exemplo, podem ser preparadas usando um moinho coloidal. As emulsões, por exemplo, podem ser preparadas usando um homogeneizador.

As formulações parentéricas, desenhadas para injeção nos sistemas de fluídos corporais, requerem uma isotonicidade e tamponamento de pH próprios para os níveis correspondentes dos fluídos corporais do felino. A isotonicidade pode ser ajustada adequadamente com cloreto de sódio e outros sais como necessário. No momento da vacinação, o vírus é derretido (se congelado) ou reconstituído (se liofilizado) com um veículo fisiologicamente aceitável tal como água desionizada, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, ou afins. Solventes adequados, tais como propileno glicol, podem ser usados para aumentar a solubilidade dos ingredientes na formulação e a estabilidade das preparações líquidas.

Aditivos adicionais que podem ser empregues na 16 presente vacina incluem, mas não se limitam a, dextrose, anti-oxidantes convencionais e agentes quelantes convencionais, tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA). Outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis que podem opcionalmente suplementar a formulação da vacina incluem, mas não se limitam a, tensoativos, polianiões, policatiões, péptidos, emulsão de óleo mineral, imunomoduladores, uma variedade de combinações e afins. Exemplos adicionais não limitantes de adjuvantes adequados incluem esqualano e esqualeno (ou outros óleos de origem animal); copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno tais como Pluronic ® (L121, por exemplo, comercialmente disponíveis a partir de BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen, Alemanha); saponina; detergentes tais como Tween ® 80 (polissorbato 80, comercialmente disponíveis a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Quil A (nome commercial de uma forma purificada de Quillaja saponaria, disponível a partir de Iscotec AB, Suécia e Superfos Biosector a/s, Vedbaek, Diamarca); óleos minerais tais como Marcol ® (uma mistura purificada de hidrocarbonetos líquidos saturados, disponível comercialmente a partir de ExxonMobil, Fairfax, VA); óleos vegetais tais como óleo de amendoim; adjuvantes derivados de Corynebacterium tais como Corynebacterium parvum; adjuvantes derivados de Propionibacterium tais como Propionibacterium acnes; Mycobacterium bovis (Bacilo Calmette-Guérin, ou BCG); interleucinas tais como interleucina-2 e interleucina-12; interferões tais como interferão gamma; combinações tais como saponina-hidróxido de alumínio ou Quit A-hidróxido de alumínio; lipossomas; adjuvante ISCOM; extrato de parede celular de micobactéria; glicopeptídeos sintéticos tais como dipeptídeos muramilo ou outros derivados; N,N-dioctadecil-N',Ν'-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina (avridina); Lípido A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano; carboxipolimetileno, tal como Carbopol ® 17 (polímero poliacrílico disponível comercialmente a partir de B.F. Goodrich Company, Cleveland, Ohio); etileno anidrido maleico ou copolímeros etileno/anidrido maleico (EMA ®, um copolímero linear etileno/anidrido maleico que tem quantidades aproximadamente iguais de etileno e anidrido maleico, tendo um peso molecular médio estimado de cerca de 75,000 a 100,000, disponível comercialmente a partir de Monsanto Co., St. Louis, MO); emulsões de copolímero acrílico tais como um copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e ácido metacrílico como NeoCryl ® A640 (por exemplo, Patente U.S. N.° 5 047 238, um copolímero ácido acrílico aquoso não coalescente de ácido acrílico e ácido metacrílico misturados com estireno, disponível comercialmente a partir de Polyvinyl Chemicals, Inc., Wilmington, MA); proteínas de poxvírus animal; adjuvantes de partículas subvirais tais como orbivírus; toxina da cólera; brometo de dimetildioctadecilamonia (DDA, disponível comercialmente a partir de Kodak, Rochester, NY) ; ou misturas dos mesmos. Um adjuvante preferido compreende copolímero etileno/anidrido maleico, copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e ácido metacrílico, emulsão de óleo mineral ou combinações dos mesmos.

Para ilustrar exemplos de como preparar o antígeno FCV-DD1 e fabricar vacinas mortas do FCV-DD1, o vírus foi usado para infetar células CRFK confluentes a um MOI de 0,01 (tipicamente oscila entre cerca de 0,001 a cerca de 1,0) em cultura de tecido em frasco cilíndrico. Os fluídos do vírus foram colhidos quando foi observado 90-100% CPE. Os fluídos colhidos foram desativados com 0,04% formalina a 36° C durante 4 dias. A formalina residual foi neutralizada por adição de bissulfito de sódio. As vacinas mortas de FCV-DD1 contendo aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v de FCV-DD1 foram depois formuladas para conter FCV-DDl desativado com formalina apenas; FCV-DD1 em combinação 18 com FeLV morto (na quantidade de aproximadamente 5,0% p/v a aproximadamente 50% p/v), FPV (na quantidade de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v), FCV-255 (na quantidade de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v), FVR (na quantidade de aproximadamente 1,0% p/v a aproximadamente 20% p/v) e C. felis (na quantidade de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v); e FCV-DD1 em combinação com FPV (na quantidade de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v), FCV-255 (na quantidade de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v) e FVR (na quantidade de aproximadamente 1,0% p/v a aproximadamente 20% p/v) . As vacinas foram adjuvantadas adequadamente; e o meio minimo essencial Eagle foi adicionado como o diluente misturador. A quantidade de cada antigeno nas vacinas foi determinada usando um teste de potência ELISA especifico do antigeno. Verificou-se que as vacinas induziam imunidade protetora contra o FCV hemorrágico em testes de desafio de vacinação padrão. A falta de interferência de outras frações da vacina da FCV-DD1 foi confirmada tanto por testes de desafio como serológicos. Foi também preparada outra formulação da vacina contendo FCV-DD1, FPV, FCV-255, FVR e C. felis.

Também é revelado aqui um novo método de proteger um felino contra a infeção ou prevenir a doença causada pelo calicivirus felino que compreende administrar ao felino uma quantidade imunologicamente eficaz das vacinas descritas aqui que contêm o calicivirus felino FCV-DDl hemorrágico isolado e purificado. Métodos adicionais protegem o felino contra a infeção ou previnem a doença causada por outros agentes patogénicos usando um ou mais antigenos em conjunto com FCV-DDl tais como, por exemplo, vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina, vírus da rinotraqueíte felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da raiva, vírus da peritonite infeciosa felina, 19

Bartonella, etc. e, mais preferencialmente, uma combinação dos antigenos abrangendo um ou mais calicivirus felinos não hemorrágicos tais como FCV-255, virus da rinotraqueite felina e virus da panleucopenia felina, com a adição opcional do virus da leucemia felina e/ou C. felis, ou outras estirpes do FCV hemorrágicas, compreendendo a administração ao felino de uma quantidade imunologicamente eficaz das vacinas multivalentes descritas aqui. São, ainda, revelados os anticorpos que são criados ou produzidos contra o antigeno FCV-DDI. Os anticorpos podem ser criados ou produzidos tanto por métodos in vitro ou in vivo que são bem conhecidos àqueles com habilitação comum na arte. Por exemplo, um método in vivo tipico para estimular a formação de anticorpos contra o FCV-DDI compreende administrar diretamente ao felino uma quantidade imunologicamente eficaz de FCV-DDI ou uma subunidade antigénica do mesmo que será suficiente para induzir títulos detetáveis de anticorpo neutralizadores do vírus. Ambos os anticorpos monoclonais específicos para o antigeno do FCV-DDI e os anticorpos policlonais úteis para reconhecer epítopos diferentes das estirpes do calicivirus hemorrágico relacionadas estreitamente com o antigeno do FCV-DDI podem ser usados. Métodos adicionais são baseados na interação antígeno-anticorpo e a capacidade do antigeno do FCV-DDI e dos anticorpos anti-FCV-DDl para formar um complexo immune detetável; tais métodos incluem um método de detetar ou diagnosticar uma infeção por calicivirus felino hemorrágico num hospedeiro suscetível que compreende analisar um espécime biológico do hospedeiro e detetar a presença de FCV-DDI ou um anticorpo criado ou produzido contra o FCV-DDI no espécime biológico e um método de detetar o anticorpo anti-FCV-DDl numa amostra biológica que compreende contatar a amostra biológica com um antigeno compreendendo FCV-DDI e detetar ou observar a formação de um complexo imune antígeno-anticorpo. 0 antigeno usado 20 nestes métodos é, por exemplo, o vírus FCV-DD1 completo, uma subunidade antigénica de FCV-DD1 tal como a proteína da cápside imunogénica e afins.

Um método adicional é descrito para detetar um veículo do calicivírus felino hemorrágico é justificado porque o vírus é altamente contagioso e virulento. O FCV infecioso pode ser transportado ou transmitido por um gato assintomático a outros gatos, ou cuidadores num cenário hospitalar podem facilmente disseminar a infeção de gatos doentes que espalham o vírus a gatos saudáveis. Assim, um método para detetar o portador do calicivírus felino hemorrágico é apresentado que envolve as etapas de (a) obter uma amostra teste de gatos assintomáticos (urina, soro, saliva, fezes, etc.), cuidadores ou donos (pelos de gato das roupas, mãos, mobília, etc.), jaulas de gatos e afins; (b) incubar a amostra teste com um anticorpo específico do FCV-DD1; (c) permitir a formação de um complexo anticorpo-antígeno; e (d) detetar a presença do complexo anticorpo-antígeno. 0 complexo imune antígeno-anticorpo pode ser detetado por qualquer imuno-ensaio padrão que inclui, mas não se limita a, um ensaio imunosorvente ligado às enzimas (ELISA), técnica Western Blot, imuno-histoquímica, citometria de fluxo e afins. Técnicas bem conhecidas de citometria de fluxo, por exemplo, podem usar um dispositivo tal como um citómetro de fluxo Becton-Dickinson FACScan que deteta e mede a quantidade de corante fluorescente nas partículas. Uma amostra de espécime ou célula é marcada com anticorpo marcado com fluorocroma, o excesso de anticorpo não ligado é lavado, e depois a amostra é analisada pelo citómetro de fluxo. O grau de fluorescência e índices de dispersão do laser são observados e registados para as células da amostra que passam através do citómetro. Desta forma, os dados exibidos sob a forma de histogramas de cor mostrando a relação entre o fluorocromo e a característica 21 da dispersão da luz confirma a presença de antigeno FCV-DD1 ligado na amostra.

Outros ensaios imunológicos in vitro padrão para a deteção de anticorpos virais no soro específicos ou outras amostras teste podem ser usados através de métodos imunofluorescentes diretos ou indiretos de deteção de anticorpo e determinação do título. Ensaios imunofluorescentes indiretos podem ser usados para classificar e identificar FCV numa amostra de espécime. Por exemplo, uma amostra teste é incubada com antigeno FCV-DD1, um fragmento da principal proteína da cápside única do FCV-DD1 na qual o fragmento pode ser um péptido sintético ou uma cadeia petídica curta expressa usando técnicas de ADN recombinante, isolados relacionados com calicivírus hemorrágico e afins, depois revestidos e estabilizados numa lâmina de vidro. Se os anticorpos anti-FCV-DDl estão presentes na amostra, forma-se um complexo imune antígeno-anticorpo estável. 0 anticorpo ligado reage depois com um reagente conjugado com fluoresceína e o complexo é observado com um microscópio de fluorescência. Uma fluorescência claramente colorida no local do antigeno confirma a reação positiva do anticorpo. Outros ELISA ou técnicas imunocromatográficas padrão podem ser empregues para fins diagnósticos na deteção de anticorpos ou antígenos unidos a uma enzima facilmente testada tal como, por exemplo, deteção da presença de antígenos FCV-DD1 que são reconhecidos por um anticorpo monoclonal ou teste para anticorpos que reconhecem o antigeno FCV-DD1. Os ELISA's, em particular, podem fornecer uma medida útil tanto das concentrações do antigeno como do anticorpo. Em alternativa, o antigeno FCV-DD1 pode ser anexado a um suporte sólido tal como uma superfície de poliestireno de uma tira teste de micropoços. A amostra teste tal como soro de gato é lavada para remover soro residual e depois é adicionada a enzima conjugada com peroxidase. Um substrato 22 detetável tal como o tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogénio incolor é também adicionado e hidrolizado pela enzima. 0 cromógeno muda para uma cor azul. Depois da reação ser parada com a adição de ácido, o tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogénio incolor muda para amarelo. Na análise final, a intensidade da cor deteta a presença do complexo anticorpo-antigeno na amostra. A nova estirpe do FCV foi depositada sob as condições exigidas por 37 C.F.R. § 1.808 e mantidas de acordo com o Tratado de Budapeste na Coleção de Cultura de Tipos Americana (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, E.U.A.. Especificamente, a amostra do FCV-DD1 foi depositada na ATCC a 9 de Setembro de 2 004 e foi-lhe atribuída a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6204.

Os seguintes exemplos demonstram certos aspetos da presente invenção. Contudo, deve ser entendido que estes exemplos são para ilustração apenas e não pretendem ser totalmente definitivos como condições e âmbito desta invenção. Deverá ser apreciado que todos os termos científicos e tecnológicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendidos por aqueles com habilitação comum nas artes veterinária e farmacêutica. Para os fins desta invenção, qualquer referência na especificação ou reivindicações à estirpe FCV-DD1 inclui os clones virais derivados do isolado do FCV-DDl. Estes clones virais podem ser prontamente substituídos por FCV-DDl em todos os aspetos das vacinas, métodos, etc. descritos aqui. Deverá ser, ainda, apreciado que quando forem proporcionadas as condições típicas de reação (por exemplo, temperatura, tempos de reação, etc.), as condições tanto acima como abaixo dos intervalos especificados também podem ser usadas, apesar de geralmente de forma menos conveniente. Os exemplos são conduzidos à temperatura ambiente (cerca de 23°C a cerca de 28°C) e à pressão 23 atmosférica. Todas as partes e percentagens referidas aqui são-no numa base de peso e todas as temperaturas estão expressas em graus centígrados a menos que especificado em contrário.

Um entendimento adicional da invenção pode ser obtido a partir dos exemplos não limitantes que se seguem. EXEMPLO 1

TENTATIVA FALHADA DE ISOLAR 0 CALICIVÍRUS FELINO HEMORRÁGICO

Foram obtidos dois frascos de cultura de tecido com 25 cm2 de FCV-Ari (rotulado 1:100 e 1 : 1000) a partir do Dr. Neils Pedersen, Escola de Medicina Veterinária, UC Davis (N. C. Pedersen et al., "An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent estirpe of feline calicivirus," Veterinary Microbiol. 73:281-300 (May 2000)). O frasco com FCV-Ari rotulado 1:1000 foi congelado e derretido. Depois foi usado 1 mL do fluído da cultura para infetar uma cultura de tecido com 850 cm2 em frasco cilíndrico com células Crandell de rim felino confluentes (CRFK) (R. A. Crandell et al., "Development, characterization, and virai susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK)," In Vitro 9:176-185 (1973)). Dezasseis horas depois, o frasco cilíndrico foi congelado, derretido e dividido em aliquotas como cultura de trabalho. A "cultura de trabalho" inicial do FCV-Ari foi usada para inocular gatos de maneira a confirmar que o material continha calicivirus hemorrágico. Os gatos inoculados com a "cultura de trabalho" do FCV-Ari despoletaram sinais clínicos extremos tais como elevada pirexia, edema, desidratação, e morte. Assim, confirmou-se que a "cultura de trabalho" do FCV-Ari continha o calicivirus hemorrágico. A "cultura de trabalho" do FCV-Ari foi diluída para um título de aproximadamente 105 TCID50 por mL e filtrada em filtro de 0,2 pm. O FCV-Ari filtrado foi usado para 24 purificação/isolamento da estirpe mais virulenta de calicivirus. 0 FCV-Ari filtrado foi diluído em série e usado para infetar placas de cultura de tecido de 24 poços confluentes com células CRFK. 0 poço da diluição mais elevada que exibia um efeito citopático (CPE) nas células CRFK foi colhido, congelado, derretido rapidamente, diluído em série, e usado para infetar outra placa de cultura de tecido de 24 poços confluente com células CRFK. Este procedimento foi repetido duas vezes durante um total de três ciclos de purificação e isolamento. 0 FCV-Ari purificado foi desativado com formalina e usado para misturar uma vacina morta, monovalente. Esta vacina do FCV-Ari (morta) foi posta em gatos para medir a resposta serológica à vacinação. A vacina não induziu títulos de anticorpo neutralizadores do vírus apesar de ter induzido anticorpos contra o vírus tal como confirmado por ELISA.

Especificamente, o estudo com a vacina do FCV-Ari morta, purificada, usada em 20 gatos, cinco gatos por grupo em doses de 0,5 % v/v, 2% v/v e 8% v/v com cinco controlos (sem injeções). Cada um dos quinze gatos recebeu 2 doses de 1 mL por via subcutânea na nuca do pescoço com três semanas de intervalo. À primeira e segunda semanas após a vacinação final, não havia títulos de neutralização de soro (SN) mensuráveis ao FCV num momento em que os títulos SN do FCV estão tipicamente no seu auge.

Para re-testar e confirmar as descobertas iniciais, quatro gatos adicionais receberam 2 doses de 1 mL com um intervalo de três semanas da vacina do FCV-Ari morta, purificada. Uma semana após a vacinação final, não havia títulos de anticorpo de neutralização de soro mensuráveis (todos < 2) no momento em que os títulos de neutralização do soro paa o FCV são tipicamente os mais altos. O FCV-Ari purificado (vivo) também foi usado para inocular dois grupos de gatos. Os dois grupos de gatos não 25 exibiram sinais clínicos característicos de uma infeção por calicivírus hemorrágico tais como temperaturas elevadas, edema, pioderma, alopecia, etc. Por esse motivo, foi confirmado que a estirpe purificada a partir da "cultura de trabalho" não era a estirpe do calicivírus hemorrágico. Porque a vacina também não induziu anticorpos neutralizadores, o trabalho adicional e desenvolvimento desta estirpe cessou. EXEMPLO 2

ISOLAMENTO DO FCV-DD1 POR CLONAGEM POR DILUIÇÃO LIMITE 0 FCV-Ari original recebido do Dr. Pedersen, rotulado 1:100, foi usado durante três ciclos de clonagem por diluição limite para purificar e isolar o FCV-DD1. A amostra de FCV-Ari 1:100 foi incubada com os anti-soros gerados a partir da vacinação original do FCV-Ari (morta) para neutralizar a estirpe do FCV isolada a partir da primeira purificação/isolamento do FCV-Ari. O vírus foi diluído em série e usado para infetar pratos de cultura de tecido de 24 poços confluentes com células CRFK e o poço da diluição mais alta que mostrou um efeito citopático (CPE) nas células CRFK foi colhido, congelado, e derretido rapidamente. Os clones colhidos foram avaliados por ensaios de neutralização do soro. (Para uma descrição geral do método de clonagem por diluição limite e ensaios de neutralização do soro usados para distinguir e isolar estirpes do FCV, ver H. Poulet et al., "Comparison between acute oral/respiratory and chronic stomatitis/gingivitis isolates of feline calicivírus: pathogenicity, antigenic profile and cross-neutralisation studies," Arch. Virol. 145:43-261 (2000).) Cada clone virai do FCV-Ari foi incubado com os anti-soros gerados a partir da primeira vacina morta de purificação, ou com os anti-soros gerados a partir da inoculação com a "cultura de trabalho" viva. Os resultados deste ensaio de neutralização de soro mostraram que havia mais do que uma estirpe de calicivírus na amostra 26 original. Os clones virais que não foram selecionados e descartados foram aqueles que foram neutralizados pelos anti-soros específicos ao produto indesejado da primeira purificação. Os clones do vírus selecionados para as rondas subsequentes de purificação foram aqueles que foram neutralizados pelos anti-soros à amostra de vírus original do Dr. Pedersen mas não foram neutralizados pelos anti-soros específicos ao produto indesejado da primeira purificação. Este padrão de seleção de clone do vírus, colhendo a diluição mais alta contendo CPE, foi repetida duante um total de três rondas. 0 clone resultante, designado FCV-DD1, foi escolhido para estudos biológicos.

Especificamente, a amostra de FCV-Ari foi neutralizada e re-purifiçada através de clonagem por diluição limite. Para neutralizar o vírus do FCV-Ari, a cultura de tecido original da amostra de FCV-Ari foi diluída para 1:200 em lx MEM (meio Eagle modificado). Os anti-soros gerados a partir da vacinação original do FCV-Ari (morta) (Vacina soro a-Ari) foram diluídos 1:50 em Ix MEM. Para 2 mL de soro anti-Ari diluído foram adicionados 2 mL do vírus diluído. A mistura vírus/anti-soros foi incubada durante cerca de 1 hora a 37°C. A partir de uma purificação piloto do FCV-Ari usando vírus neutralizado, verificou-se que o CPE em pratos de 24 poços foi positivo até uma diluição de 10 2 (poços 10 2 foram 50% CPE e 1CT3 foram 0% CPE) . Com base nesta informação, o vírus foi diluído para atingir o CPE em cerca de 50% ds poços das células CRFK. Foram feitas três diluições, quatro vezes acima do objetivo, no objetivo e quatro vezes abaixo do objetivo.

Um prato de 24 poços foi usado para cada diluição. Todos os 24 poços foram usados como réplicas da mesma diluição. Estes pratos foram incubados a 37°C com 5% C02 durante 4 dias. Foram colhidos os poços que eram positivos ao CPE na diluição que proporcionou menos do que ou 27 aproximadamente igual a 50% CPE nas 24 réplicas (isto é, < 12 poços positivos).

Para a Ronda #1 do procedimento de clonagem por diluição limite, foi realizada uma análise de neutralização cruzada nos clones colhidos. Cada colheita foi diluída 1:200 e 1:1000 em lx MEM e misturada com diluições tanto de Desafio cx-Ari (anti-soros gerados a partir da inoculação com a "cultura de trabalho" viva) ou Vacina α-Ari (anti-soro da primeira vacina morta de purificação), em réplicas de dois. A mistura vírus-soro foi incubada a 37°C durante 1 hora e depois folhada em células CRFK em pratos de 96 poços. Os pratos foram incubados durante 3 dias e lidos para CPE. Os resultados da primeira ronda de clonagem por diluição limite e classificação por neutralização cruzada são apresentados no Quadro 1 em baixo.

Cinco clones colhidos (AB2, BC1, BC4, CB4 e DDl) foram neutralizados por anti-soros à amostra de vírus original do Dr. Pedersen mas não foram neutralizados por anti-soros específicos ao produto indesejado da primeira purificação. Estes foram selecionados para a Ronda #2 de purificação.

Para a Ronda #2 do procedimento de clonagem por diluição limite, verificou-se que o CPE nos pratos de 24 poços era positivo até 1CT5 a IO-6. Foram feitas três diluições, quatro vezes acima do objetivo, no objetivo e quatro vezes abaixo do objetivo. Um prato de 24 poços foi usado para cada diluição. Todos os 24 poços foram usados como réplicas da mesma diluição. Estes pratos foram incubados a 37°C com 5% C02 durante 4 dias. Os poços que eram positivos ao CPE na diluição que proporcionou ^ 50% CPE nas 24 réplicas foram colhidos.

As etapas anteriores foram repetidas para a terceira ronda de clonagem por diluição limite. 28

Quadro 1. Classificação da neutralização cruzada por diluição limite de FCV-Ari ID da colheita Diluição do virus Desafio a-Ari Vacina a-Ari AB2 1:200 >256 <2 AB2 1:1000 >256 <2 BC1 1:200 >256 <2 BC1 1:1000 >256 <2 BC4 1:200 >256 <2 BC4 1:1000 >256 <2 CA4 1:200 >256 <2 CA4 1:1000 >256 <2 CB2 1:200 >256 <2 CB2 1:1000 >256 <2 CB3 1:200 >256 <2 CB3 1:1000 >256 <2 CB4 1:200 >256 <2 CB4 1:1000 >256 <2 CC5 1:200 >256 <2 CC5 1:1000 >256 <2 CD1 1:200 >256 37 CD1 1:1000 >256 <2 DA5 1:200 >256 <2 DA5 1:1000 >256 <2 DB1 1:200 >256 <2 DB1 1:1000 >256 <2 DB5 1:200 >256 <2 DB5 1:1000 >256 <2 DC2 1:200 >256 <2 DC2 1:1000 >256 <2 DD1 1:200 >256 <2 DD1 1:1000 >256 <2 DD2 1:200 >256 <2 DD2 1:1000 >256 <2 DD4 1:200 >256 <2 DD4 1:1000 >256 <2 29 EXEMPLO 3 ISOLAMENTO DA ESTIRPE FCV-DD1 O clone colhido, DD1, foi selecionado a partir da ronda #3 e usado para infetar 850 cm2 de cultura de tecido em frasco cilíndrico de células CRFK confluentes a MOI (Multiplicidade de Infeção) de aproximadamente 0,003. O fluído do vírus foi colhido do frasco cilíndrico quando se observou 100% CPE, congelado a -50°C durante 4 horas e depois derretido rapidamente em banho de água a 37°C. O fluído do vírus foi centrifugado numa Centrígufa Beckman GS-6R (disponível comercialmente a partir de Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) a 3000 rpm durante 20 minutos, e o sobrenadante livre de células foi dividido em aliquotas por 81 frascos de amostra de 1 mL e armazenados a -80 °C. EXEMPLO 4

ESTUDOS DE DESAFIO FISIOLÓGICO A estirpe FCV-DD1 isolada e purificada preparada no Exemplo 3 foi inoculada em gatos. Foi usado um grupo desafio de três gatos em que cada gato recebeu 6,3 logs do FCV-DD1 virulento por administração de 0,25 mL por cada narina e 0,5 mL oralmente num total de 1 mL. Os gatos exibiram sinais clínicos típicos do calicivírus hemorrágico. Apareceram temperaturas extremamente elevadas nos três gatos após o Io dia. O edema (inchaço) começou ao quinto dia de observação. Apareceram ulcerações, tanto externas como orais, no sexto dia de observação. Dois terços dos gatos foram eutanasiados (exsanguinados) no sexto dia de observação uma vez que tinham ficado moribundos. O terceiro gato estava moribundo com temperaturas descendentes no séptimo dia de observação e o estudo foi terminado. Os resultados deste estudo de desafio provaram que a estirpe do calicivírus purificada e isolada da amostra original do FCV-Ari, designada FCV-DD1, era uma verdadeira estirpe de calicivírus felino hemorrágico. 30

Nas linhas antecedentes, foi providenciada uma descrição detalhada das modalidades particulares da presente invenção com o fim de ilustração e não limitação. 31

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 60948004 P [0001] • US 3944469 A, J. L. Bittle [0006] • US 5972350 A [0006] • US 5242686 A, H.-J. Chu [0006] • US 4264587 A, N. C. Pedersen [0006] • US 4522810 A [0006] • US 6231863 D, D. Colau [0006] • US 5106619 G, G. P. Wiesehahn [0006] • US 6051239 L, L. Simpson [0006] US 20040180064 AI [0007] US 20040259225 AI [0007] US 6004563 H, H.-J. Chu [0008] • US 5374424 W, W. H. Kelsey [0008] US 5047238 A [0031]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • J. N. BURROUGHS et al. Physio-chemical evidence for the re-classification of the caliciviruses. Journal Gen. Virol., 1974, vol. 22, 281-286 [0004] • N. C. PEDERSEN et al. Mechanisms for persistence of acute and chronic feline calicivirus infections in the face of vaccination. Veterinary Microbiol., November 1995, vol. 47 (1-2), 141-156 [0004] • A. LAURITZEN et al. Serological analysis of feline calicivirus isolates from the United States and United 32

Kingdom. Veterinary Microbiol., May 1997, vol. 56 (1- 2), 55-63 [0004] T. HOHDATSU et al. neutralizing feature of commercially available feline calicivirus (FCV) vaccine immune sera against FCV field isolates. Journal of Veterinary Medicine Sei., March 1999, vol. 61 (3), 299-301 [0004] A. D. RADFORD et al. Comparison of serological and sequence-based methods for typing feline calcivirus isolates from vaccine failures. Vet. Rec., 29 January 2000, vol. 146 (5), 117-123 [0004] N. C. PEDERSEN et al. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent estirpe of feline calicivirus. Veterinary Microbiol., May 2000, vol. 73, 281-300 [0005] [0041] E. M. SCHORR-EVANS et al. An epizootic of highly virulent feline calicivirus disease in a hospital setting in New England. Journal of Felino Medicine and Surgery, 2003, vol. 5, 217-226 [0005] E. V. DAVIS et al. Studies on the safety and efficacy of an intranasal feline rhinotracheitis-calicivirus vaccine. VM-SAC, 1976, vol. 71, 1405-1410 [0006] D. E. KAHN et al. Induction of immunity to feline caliciviral disease. Infect. Iramun., 1975, vol. 11, 1003-1009 [0006] D. E. KAHN. Feline viruses: pathogenesis of picornavirus nfection in the cat. Am. J. Vet. Research, 1971, vol. 32, 521-531 [0006] K. F. HURLEY et al. An Outbreak of virulent systemic feline calicivirus disease. J. Am. Vet. Med. Assoe., 15 January 2004, vol. 224 (2), 241-249 [0007] N. C. PEDERSEN et al. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and 33 highly virulent strain of feline calicivirus. Veterinary Microbiol., May 2004, vol. 73, 281-300 [0014] R. A. CRANDELL et al. Development, characterization, and virai susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK. In Vitro, 1973, vol. 9, 176-185 [0014] [0041] MANIATIS et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0023] H. POULET et al. Comparison between acute oral/respiratory and chronic stomatitis/gingivitis isolates of feline calicivirus: pathogenicity, antigenic profile and cross-neutralisation studies. Arch. Virol., 2000, vol. 145, 43-261 [0048]

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um calicivírus felino hemorrágico FCV-DDl isolado e purificado que tem a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6204 ou um clone virai derivado dele.

2. Uma vacina compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz do calicivírus felino de acordo com a reivindicação 1, e um veículo ou diluente fisiologicamente aceitável e não tóxico, e opcionalmente compreendendo ainda um ou mais calicivírus felinos adicionais.

3. A vacina de acordo com a reivindicação 2, em que o calicivírus felino adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em FCV-255, FCV-2280, FCV-Diva, FCV-Kaos, FCV-Bellingham, FCV-F9, FCV-F4, FCV-M8 e uma combinação dos mesmos.

4. A vacina de acordo com a reivindicação 3, em que o calicivírus felino adicional compreende FCV-255, FCV-2280 ou a combinação de FCV-255 e FCV-2280.

5. A vacina de acordo com a reivindicação 4, em que o calicivírus felino adicional compreende FCV-255.

6. A vacina de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ainda um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em Chlamydophila felis, vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina, vírus da rinotraqueíte felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da raiva, vírus da peritonite infeciosa felina, Bartonella e uma combinação dos mesmos.

7. A vacina de acordo com a reivindicação 6, em que o antígeno compreende a combinação de Chlamydophila felis, 2 vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina.

8. A vacina de acordo com a reivindicação 6, em que o antígeno compreende a combinação de Chlamydophila felis, vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina.

9. A vacina de acordo com a reivindicação 6, em que o antígeno compreende a combinação de vírus da panleucopenia felina e vírus da rinotraqueíte felina.

10. A vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-9, compreendendo ainda um adjuvante selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, um tensoativo, um polianião, um policatião, um detergente, um péptido, um óleo animal ou vegetal metabolizável, um óleo mineral, uma emulsão de óleo mineral, um imunomodulador, um copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno, um copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e ácido metacrílico, um adjuvante derivado de Corynebacterium, um adjuvante derivado de Propionibacterium, Mycobacterium bovis (Bacilo Calmette-Guérin), uma interleucina, um interferão, um lipossoma, um adjuvante ISCOM, um extrato de parede celular micobacteriana, um glicopeptídeo sintético, avridina, Lípido A, sulfato de dextrano, DEAE-Dextrano, carboxipolimetileno, copolímero de etileno/anidrido maleico, uma emulsão de copolímero acrílico, uma proteína de poxvírus animal, um adjuvante de partícula subviral, toxina da cólera, brometo de dimetildioctadecilamonio e uma combinação dos mesmos.

11. A vacina de acordo com a reivindicação 10, em que o adjuvante é um copolímero de etileno/anidrido maleico, um copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e 3 ácido metacrílico, uma emulsão de óleo mineral ou a combinação dos mesmos.

12. A vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-11, em que o veiculo ou diluente fisiologicamente aceitável e não tóxico compreende solução salina ou meio mínimo essencial de Eagle.

13. A vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-12, compreendendo ainda um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em timerosal, neomicina, polimixina B, anfotericina B e uma combinação dos mesmos.

14. 0 uso de uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-13 no fabrico de um medicamento para proteger um felino contra a infeção ou prevenir a doença causada pelo calicivírus felino, Chlamydophila felis, vírus da leucemia felina, vírus da panleucopenia felina, vírus da rinotraqueíte felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da raiva, vírus da peritonite infeciosa felina, Bartonella ou uma combinação dos mesmos.

15. 0 uso de acordo com a reivindicação 14, no qual a vacina é administrada ao felino por via parentérica, oral, intranasal, oronasal ou transdérmica.