PT1601768E - Peptídeo antimicrobiano conhecido como halocintina, gene codificador do referido peptídeo, vector, organismo, transformado e composição contendo o mesmo - Google Patents

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ΡΕ1601768 1 DESCRIÇÃO "PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO CONHECIDO COMO HALOCINTINA, GENE CODIFICADOR DO REFERIDO PEPTÍDEO, VECTOR, ORGANISMO TRANSFORMADO E COMPOSIÇÃO CONTENDO O MESMO" O presente invento diz respeito a um novo peptideo antimicrobiano, aqui designado halocintina, identificado e purificado a partir de um extracto de um invertebrado marinho.

Numerosas doenças (tuberculose, pneumonias, patologias urinárias, ...), bem controladas após a descoberta dos antibióticos, constituem actualmente patologias re-emergentes, de prognóstico muitas vezes fatal, devido à impotência dos antibióticos clássicos.

Com efeito, antigamente flagelo implacável, a tuberculose (causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis) regrediu nos últimos quarenta anos nos países industrializados, graças à melhoria das condições sociais e à aplicação de um tratamento antibiótico eficaz. Reapareceu sob uma forma mais virulenta, em meados dos anos 80, em numerosos países incluindo a França e os Estados Unidos. As "novas" formas do bacilo são resistentes aos antibióticos classicamente usados contra a tuberculose (estreptomicina, isoniazida, rifampicina) assim como a outros antibióticos 2 ΡΕ1601768 até recentemente eficazes.

Igualmente, as infecções designadas nosocomiais, frequentemente contraídas em meio hospitalar, são frequentemente muito difíceis de dominar devido às resistências aos antibióticos disponíveis. 20 a 25% dos pneumococos isolados em meio hospitalar, em França, revelaram-se muito resistentes aos antibióticos da família dos macrolidos e 20 a 40% dos Staphylococcus aureus isolados nos hospitais nos EUA são resistentes à meticilina. A existência e aparecimento constante de bactérias cada vez mais resistentes aos antibióticos induz uma pesquisa importante por parte da indústria farmacêutica e torna absolutamente necessária a descoberta de novas famílias de antibióticos. O biótopo marinho é considerado como o mais rico dos diferentes habitats do globo, mas igualmente como o menos conhecido dos cientistas. É igualmente o berço pré-biótico do nosso planeta (3 mil milhões de anos de evolução). Consequentemente, este biótopo tem uma diversidade de espécies, sistemas de organização, formas e soluções adaptativas. Esta biodiversidade é a fonte de uma formidável quimiodiversidade, uma fonte potencial de novos compostos naturais. As pesquisas já conduziram à descoberta de substâncias importantes, tanto pelas suas estruturas como pelas suas actividades biológicas. Muitos milhares de 3 ΡΕ1601768 substâncias foram até agora reportadas; mais de 150 publicações, descrevendo os novos metabolitos secundários, têm surgido anualmente nos últimos dez anos. Alguns destes metabolitos foram objecto de ensaios clínicos ou foram já comercializados. Outros compostos, como as toxinas de microrganismos marinhos (ciguatoxina, brevetoxina, saxitoxina ou tetrodotoxina) são ferramentas de eleição em neurofisiologia e, em particular, em estudos de canais iónicos.

Actualmente, mais de metade das moléculas de origem marinha susceptiveis de serem utilizadas no domínio da saúde destina-se ao tratamento de cancro. Em vinte cinco anos, de 1970 a 1995, mais de 130 substâncias marinhas foram patenteadas pelas proprietárias farmacêuticas a nível mundial.

Curiosamente, o domínio dos antibióticos foi um pouco esquecido. A pesquisa de novos peptídeos antibióticos em invertebrados marinhos só recentemente foi abordada. Os peptídeos antimicrobianos são moléculas cujo alvo é a membrana bacteriana. Consequentemente, para adquirir uma resistência a este tipo de moléculas, os microrganismos deverão mudar a composição dos seus lípidos membranares. Esta solução, dispendiosa do ponto de vista evolutivo, explica porque é que a resistência aos microrganismos face a este tipo de antibióticos só raramente é referenciado.

Assim, os trabalhos do Requerente permitiram pôr 4 PE1601768 em evidência e purificar um novo peptideo antibiótico, designado halocintina, tendo em conta o facto de não apresentar qualquer homologia de estrutura primária relativamente a outras moléculas descritas na literatura e que foi purificado a partir de uma espécie de tunicado, a ascidea solitária Halocynthia papillosa, na qual este tipo de molécula nunca foi pesquisado. A actividade anti-bacteriana da halocintina foi avaliada no laboratório: trata-se de uma molécula bacteriolitica essencialmente activa contra as bactérias Gram positivas. Esta molécula é particularmente interessante pelo seu modo de actuação especifico. Com efeito, ela não permite a indução resistência nos alvos bacterianos.

Nas sequências peptidicas atrás descrita, os aminoácidos são representados pelo código de uma letra, mas podem ser também representados pelo código de três letras se acordo com a nomenclatura abaixo. A Ala alanina C Cis cisteina D Asp ácido aspártico E Glu ácido glutâmico F Fen fenilalanina G Gli glicina H His histidina I ile isoleucina K Lis lisina L Leu leucina 5 ΡΕ1601768 M Met metionina N Asn asparagina P Pro prolina Q Gin glutamina R Arg arginina S Ser serina T Tre treonina V Vai valina W Trp triptofano Y Tir tirosina 0 presente invento diz respeito a um peptídeo isolado de 26 aminoácidos cuja sequência de aminoácidos é F WG ΗIWNAVKRVGANAL HGAVT GAL S (SEQ ID N0:1 na lista de sequências em anexo), seus derivados e seus fragmentos. A titulo de "derivados" do peptídeo do invento, pode-se citar os peptídeos que apresentam uma modificação pós-tradução e/ou uma modificação química, em particular uma glicosilação, uma amidação, uma acilação, uma acetilação, uma metilação, assim como peptídeos possuidores de um grupo protector. Entende-se por "grupo protector" de acordo com o presente invento, qualquer grupo que permite evitar a degradação do peptídeo do invento.

Os derivados do peptídeo do invento podem igualmente ser aqueles em que um ou mais aminoácidos são enantiómeros, diastereoisómeros, aminoácidos naturais de conformação D, aminoácidos raros, principalmente hidroxi- 6 PE1601768 prolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 6-N metilisina, N-etilglicina, N-metilglicina, N-etilasparagina, alo-isoleucina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, piro-glutamina, ácido aminobutírico e aminoácidos sintéticos principalmente ornitina, norleucina, norvalina, ciclo-hexil-alanina e aminoácidos ómega. O invento abrange igualmente retropeptideos e retroinversopeptideos, assim como peptideos cuja cadeia lateral de um ou vários aminoácidos foi substituída por grupos que não modificam a actividade antimicrobiana do peptídeo do invento.

Como "derivados" do peptídeo do invento, entende-se igualmente peptideos que apresentem 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e/ou 95% de identidade com o peptídeo da sequência SEQ ID NO:l na lista de sequências em anexo.

Como "fragmentos" do peptídeo do invento, entende-se fragmentos de pelo menos 7 aminoácidos que apresentem uma actividade antibacteriana. A actividade antibacteriana dos derivados e dos fragmentos do peptídeo do invento pode ser evidenciada através de testes in vitro descritos a seguir nos exemplos. O invento diz respeito a um polipeptídeo isolado, compreendendo o peptídeo do invento. O invento tem como objectivo, mais particularmente, um polipeptídeo compreendendo o peptídeo do invento em que um ou os dois extremos do referido peptídeo consistem em um ou mais aminoácidos necessários à sua expressão e/ou seu alvo num 7 PE1601768 organismo hospedeiro. O polipeptideo do invento pode apresentar um peptideo sinal ou de trânsito de forma a dirigir a secreção do peptideo ou polipeptideo do invento num organismo hospedeiro. O peptideo, seus derivados e seus fragmentos, assim como polipeptideos do invento, podem ser sintetizados quimicamente de acordo com técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria. O invento diz igualmente respeito a um poli-nucleótido isolado caracterizado por codificar o peptideo ou um polipeptideo do invento. Entende-se por "polinucleótido" de acordo com o presente invento, uma sequência de ácido nucleico do tipo DNA ou RNA, de preferência DNA, principalmente de cadeia dupla. Os familiarizados com a matéria conhecendo o código genético e a sequência de aminoácidos do peptideo do invento conseguem isolar um polinucleótido codificador do peptideo do invento, testando bibliotecas de ácidos nucleicos, usando um ou mais oligonucleótidos deduzidos da sequência de aminoácidos do peptideo do invento. Os familiarizados com a matéria têm igualmente à sua disposição sistemas informáticos capazes, a partir de uma sequência de aminoácidos, de fornecer a sequência nucleotidica correspondente (proteína em código reverso). O invento diz respeito igualmente a polinucleótidos isolados que compreendem alterações ao PE1601768 nível de um ou mais nucleotídeos, resultante da degenerescência do código genético, e que codificam uma mesma sequência de aminoácidos do peptídeo do invento. O invento abrange igualmente polinucleótidos isolados, codificadores do peptídeo ou de um polipeptídeo do invento, e capazes de hibridar, em condições restrin-gentes, com a sequência nucleotídica do referido peptídeo ou polipeptídeo. Entende-se por "condições restringentes" de acordo com o presente invento, as condições descritas por Sambrook et al. (Molecular Cloning, 1989, Noland C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). O invento abrange igualmente as sequências nucleotídicas complementares dos polinucleótidos isolados atrás definidos, assim como os RNAs correspondentes. O presente invento diz igualmente respeito a um vector de clonagem e/ou de expressão, caracterizado por conter um polinucleótido de acordo com o invento, para transformar um organismo hospedeiro e expressar neste último o peptídeo ou polipeptídeo do invento. De forma vantajosa, o vector de clonagem e/ou de expressão pode conter, para além do polinucleótido codificador de um peptídeo ou polipeptídeo do invento, pelo menos um elemento escolhido do grupo de promotores constitutivos, promotores induzíveis e elementos terminadores.

De preferência, o referido vector compreende 9 ΡΕ1601768 ligados de forma operacional, um promotor, um poli-nucleótido codificador do peptideo ou polipeptídeo do invento e um elemento terminador. Entende-se por "ligados entre eles de forma operacional" de acordo com o invento, elementos ligados entre si de forma a que o funcionamento de um dos elementos seja afectado pelo de outro. Como exemplo, um promotor é ligado de forma operacional a uma sequência codificadora quando é capaz de afectar a expressão desta última. Estes elementos reguladores da transcrição, da tradução e da maturação dos peptideos que o vector pode compreender são conhecidos dos familiarizados com a matéria e estes sabem como os escolher em função do organismo hospedeiro no qual a expressão ou a clonagem deve ser realizada. 0 vector do invento é, vantajosamente, escolhido entre um plasmideo, cosmideo, bacteriófago e virus, em particular um baculovirus. De preferência, o peptideo do invento é um vector de replicação autónoma possuindo elementos, como seja uma origem de replicação, que permitem a sua manutenção e a sua replicação no organismo hospedeiro. 0 vector pode ainda possuir elementos que permitem a sua selecção no organismo hospedeiro como, por exemplo, um gene de resistência a um antibiótico ou um gene de selecção que assegura a complementação com o gene respectivo deletado ao nivel do genoma do organismo hospedeiro. Tais vectores de clonagem e/ou de expressão são 10 PE1601768 conhecidos dos familiarizados com a matéria e estão largamente descritos na literatura. O invento diz respeito igualmente a um organismo hospedeiro caracterizado por ser transformado com a ajuda de um vector do invento. Por "organismo hospedeiro" de acordo com o invento, entende-se qualquer organismo mono ou pluricelular, inferior ou superior, no qual um poli-nucleótido do invento é introduzido para a produção de um peptideo ou polipeptideo do invento. Os familiarizados com a matéria conhecem diferentes métodos para introduzir de forma eficaz um polinucleótido num organismo hospedeiro e para que seja produzido o peptideo ou polipeptideo codificado pelo referido polinucleótido no organismo hospedeiro. Como exemplo, e de forma não exaustiva, este método pode ser uma electroporação, uma lipofecção, uma transformação biológica de um vegetal usando Agrobacterium tumefasciens, etc...

De acordo com uma forma preferida do invento, o organismo hospedeiro é um microrganismo como seja levedura, bactéria ou fungo. A transformação de tais microrganismos permite produzir o peptideo do invento à escala semi-industrial ou industrial. Os familiarizados com a matéria conhecem tais microrganismos e sabem como os transformar sem experimentação adicional.

De acordo com uma outra forma do invento, o organismo hospedeiro é uma célula animal, como seja uma 11 ΡΕ1601768 célula de mamífero.

De acordo com uma outra forma do invento, o organismo hospedeiro é uma célula vegetal ou uma planta. Por "célula vegetal" entende-se, de acordo com o presente invento, qualquer célula derivada de uma planta e que pode constituir tecidos indiferenciados como sejam os calos, tecidos diferenciados tais como embriões, partes de plantas, plantas ou sementes. Por "planta", entende-se de acordo com o invento, qualquer organismo multicelular diferenciado capaz de fazer fotossíntese, em particular monocotiledóneas ou dicotiledóneas, mais particularmente plantas de cultivo destinadas ou não à alimentação animal ou humana.

Consequentemente, o organismo hospedeiro de acordo com o invento é escolhido entre microrganismos, células animais, células vegetais e plantas. 0 peptideo do invento é igualmente útil para conferir às plantas um carácter de resistência às doenças microbianas. 0 invento diz igualmente respeito a uma célula vegetal resistente às doenças microbianas compreendendo um polinucleótido do invento e expressando o peptideo ou polipeptídeo do invento. 0 invento refere-se igualmente a uma planta compreendendo pelo menos uma célula vegetal resistente a doenças microbianas como atrás definido.

Finalmente, o invento utiliza as propriedades 12 ΡΕ1601768 antimicrobianas do peptídeo do invento para prevenir e/ou tratar infecções microbianas, tanto no homem e animais como nas plantas. No contexto do presente invento, entende-se por "propriedades antimicrobianas" propriedades antibacterianas e propriedades antifúngicas. 0 invento diz respeito à utilização vantajosa do peptideo do invento como medicamento na terapia humana e animal. Ele diz igualmente respeito à utilização do peptideo do invento para o tratamento de plantas contra as infecções microbianas, aplicando o referido peptideo directamente sobre as plantas. Assim, o presente invento diz respeito à utilização de um peptideo ou de um polipeptideo do invento como agente antimicrobiano e, mais particularmente, como agente antibacteriano contra bactérias Gram positivas. O presente invento diz igualmente respeito à utilização de um peptideo ou polipeptideo como atrás definido para a preparação de uma composição antimicrobiana e, mais particularmente, antibacteriana destinada a lutar contra bactérias Gram positivas. 0 invento diz assim respeito a uma composição antimicrobiana compreendendo, como agente activo, o peptideo ou polipeptideo do invento, vantajosamente associado na referida composição a um veículo aceitável. A composição actua, mais particularmente, contra bactérias Gram positivas. A composição antimicrobiana do invento pode, por outro lado, compreender ainda um outro princípio activo, como seja um outro agente antimicrobiano. 13 PE1601768

Por "veículo" entende-se, de acordo com o presente invento, qualquer substância que é adicionada ao peptídeo ou polipeptídeo do invento para favorecer o seu transporte, evitar a sua degradação substancial na referida composição e preservar as suas propriedades anti-microbianas. O veículo é escolhido em função do tipo de aplicação da composição. Essencialmente, quando a composição se destina a utilização farmacêutica na saúde humana e animal, os especialistas escolherão o veículo farmaceuticamente aceitável adaptado à via de administração da composição farmacêutica do invento.

Assim, as composições farmacêuticas de acordo com o invento são constituídas por pelo menos o peptídeo ou polipeptídeo do invento, sob a forma livre ou sob a forma de um sal de adição de ácido com um ácido farmaceuticamente aceitável, no estado puro ou sob a forma de uma composição na qual está associado a qualquer outro produto farmaceuticamente compatível. As composições farmacêuticas de acordo com o invento podem ser empregues por via oral, parenteral, rectal ou tópica.

Como composições sólidas para administração oral, pode-se utilizar comprimidos, pílulas, pós, etc... onde o peptídeo ou polipeptídeo do invento é misturado com um ou mais diluentes inertes classicamente utilizados, e eventualmente com outras substâncias, tais como por exemplo um lubrificante, um corante, um revestimento, etc.... 14 PE1601768

Como composições líquidas para administração oral ou ocular, pode-se utilizar suspensões, soluções, emulsões, xaropes farmaceuticamente aceitáveis contendo diluentes inertes classicamente utilizados e, eventualmente, outras substâncias como produtos molhantes, edulcorantes, espessantes, etc....

As composições estéreis para administração parentérica podem ser soluções aquosas ou não, suspensões ou emulsões. Como solvente ou veículo, pode-se empregar água, propilenoglicol, óleos vegetais ou outros solventes orgânicos adequados. Estas composições podem conter igualmente adjuvantes, como agentes molhantes, tamponantes, emulsionantes, etc.

As composições para administração tópica podem ser, por exemplo cremes, loções, colutórios, gotas nasais ou oculares ou aerossóis.

Quando a composição antimicrobiana do invento se destina a utilização agroquímica, o veículo é um veículo aceitável em agroquímica adaptado a uma administração nas plantas ou na proximidade das plantas sem as degradar.

Nas composições antimicrobianas alvo do presente invento, a quantidade de peptídeo ou de polipeptídeo do invento vantajosamente utilizada situa-se entre 0,1 e 50 μΜ. No entanto, é evidente que os familiarizados com a matéria saberão adaptar esta quantidade em função do tipo 15 ΡΕ1601768 de composições antimicrobianas, í.e. composições farmacêuticas ou composições agroquimicas, e em função do modo de administração das referidas composições. 0 presente invento diz igualmente respeito a um método para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção microbiana. 0 presente método caracteriza-se pela administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptideo, polipeptídeo, polinucleótido ou composição de acordo com o presente invento. Por "indivíduo" entende-se, no presente invento, qualquer animal ou ser humano para o qual foi diagnosticada uma infecção microbiana e, mais particularmente, uma infecção bacteriana causada por bactérias Gram positivas e igualmente qualquer animal ou ser humano susceptível de sofrer daquela infecção.

Os exemplos que se seguem permitem ilustrar o presente invento e não deverão ser interpretados como limitantes do mesmo. Estes exemplos fazem particularmente referência à descoberta da halocintina, sua purificação e sua actividade antibacteriana. Os exemplos que se seguem fazem referência à figura 1 em anexo, a qual representa a actividade hemolítica, testada com eritrócitos de carneiro, para diferentes concentrações de halocintina. I. Isolamento de halocintina A caracterização bioquímica desta molécula está completa. A halocintina foi isolada a partir de células 16 ΡΕ1601768 circulantes (hemócitos) de ascídea. Foi purificada por cromatografia liquida de alta resolução (HPLC), seguindo a sua actividade por testes realizados in vitro ao longo de todo o protocolo de purificação. 1.1 Isolamento a partir de hemócitos de ascídeas A colheita de hemolinfa foi efectuada, após lavagem em etanol das ascídeas (eliminação das mucilagens), através de corte ao nível do pé. A separação dos dois compartimentos sanguíneos (o plasma e os hemócitos) faz-se por centrifugação da hemolinfa (1000 xg durante 10 min). Obtêm-se assim os hemócitos no sedimento. O sedimento celular foi homogeneizado em 10 volumes de ácido acético 2M usando um homogeneizador, depois o homogenato foi deixado durante 12 horas, com agitação, a 4°C. Em seguida, este homogenato foi centrifugado a 10000 xg, durante 20 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi então submetido a um primeiro fraccionamento em cassete Sep-Pak C18 de fase inversa (Sep-Pak Vac 12cc, Waters Corporation, USA, ref: WAT036915). O sobrenadante foi depositado na cassete e três fracções de polaridade decrescente foram eluídas graças a 3 soluções preparadas a partir de água ultrapura (EUP) e acetonitrilo (ACN, HPLC Gradient Grade, ACROS Organics, ref: 32573-0025), a que se adicionou 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA, Fluka Chemika, ref: 91707): 17 PE1601768

10% de ACN + 90% de EUP + 0,05% TFA 60% de ACN + 40% de EUP + 0,05% TFA 80% de ACN + 20% de EUP + 0,05% TFA

Os extractos hemocitários foram portanto separados em três fracções. Estas diferentes fracções foram em seguida congeladas a -80°C, liofilizadas e ressuspensas em 1 ml de EUP a que se adicionou 0,05% de TFA. Uma centrifugação foi em seguida realizada (lOOOg, 20 minutos a 4°C) . O sobrenadante constitui o material que será utilizado para HPLC.

1.2 Purificação por HPLC

Todos os passos de purificação foram efectuados numa coluna de HPLC do tipo Waters (modelo 1525 HPLC Binary Pump) equipada com um detector espectrofotométrico (modelo 2487 Dual λ absorvance detector, Waters), uma câmara termostatizada de efeito Peltier (modelo 560-CIL, Cluzeau info labo) e ligada a um sistema de aquisição de dados (computador Breeze) . As moléculas eluidas da coluna foram analisadas ao nivel do detector de UV em dois comprimentos de onda (224 e 280 nm).

No primeiro passo de HPLC usou-se a fracção Sep-Pak 60% que contem a halocintina. A eluição foi efectuada em fase inversa numa coluna de Sephasil C18 (250*4, 6 mm, Waters, ref: WAT054275) seguindo um gradiente binário linear: ACN e EUP a que se adicionou 0,05% TFA. Este 18 ΡΕ1601768 gradiente varia entre 2% e 72% de ACN ao longo de 90 minutos, o débito aplicado sendo de 1 ml/minuto.

As fracções eluidas foram detectadas pela visualização dos picos de absorvância no monitor e foram colhidas em tubos de polietileno (tubos de baixa ligação Minisorp, Meck eurolab, ref: 13183.01). Estas fracções serão em seguida congeladas, liofilizadas e suspensas em EUP TFA 0,05%.

Foram em seguida testadas quanto às actividades antibacterianas. A fracção contendo a halocintina foi submetida a um último passo de purificação, efectuado em fase inversa numa coluna de Sephasil C8 (150*2.1 mm, Waters, ref: WAT056955). O gradiente de eluição utilizado inclui a percentagem de eluição da fracção com interesse quando do passo de separação anterior (31% ACN): a janela de eluição está apresentada em termos de percentagem de acetonitrilo -5% até +5% relativamente à percentagem de eluição anteriormente obtida.

Ainda, um gradiente alargado no tempo (10% em 40 minutos) foi efectuada com o fim de obter uma separação mais fina. Este segundo passo de HPLC permite obter o produto puro. A eluição foi efectuada em 40 minutos, a um débito de 0,3 ml/minutos, com um gradiente binário linear: ACN/TFA e EUP/TFA. 19 PE1601768 II. Caracterização da halocintina II. 1 Testes de actividade antibacteriana durante os passos de purificação.

Os testes de actividade antibacteriana, que permitem seguir a actividade biológica no decurso dos passos de purificação, foram realizados em microplaca (96 alvéolos, Becton Dickinson, USA, ref:18572). AS diferentes fracções colhidas após a separação (Sep-Pak ou HPLC) foram congeladas, liofilizadas depois suspensas em eup/tfa.

Foram em seguida colocadas em quantidades de 10 μΐ nos alvéolos da microplaca e adicionados 100 μΐ de cultura bacteriana (E. coli) em meio Poor Broth (1%

Bactotriptona, 0,5% NaCl, pH 7,5) cuja densidade óptica (DO) foi ajustada a 0,001. Colocou-se sob agitação (250 rpm) a 37°C durante 12 horas. II.2 Caracterização bioquímica da halocintina

Após purificação, uma combinação de técnicas de espectrometria de massa e de degradação de Edman permitiu ao requerente obter a caracterização bioquímica completa deste peptídeo. Trata-se de um peptídeo de 26 aminoácidos cuja sequência é como se segue: FWGHIWNAVKRVGANALHGAVTGALS (SEQ id NO:1 na lista de sequências em anexo). Este peptideo é uma molécula catiónica (ponto isoeléctrico estimado: 11) que se estrutura em hélice α anfipática como 20 ΡΕ1601768 sugerem as previsões da estrutura secundária. II.3 Actividade biológica da halocintina

Para determinar o espectro de actividade da halocianina foram realizados testes complementares. I. Actividade antibacteriana da halocintina A concentração minima bactericida (MBC) para cada estirpe bacteriana testada foi determinada da seguinte maneira: o peptideo foi suspenso numa solução contendo 0,01% de ácido acético e 0,2% de albumina sérica bovina (BSA); em seguida realizaram-se diluições seriadas de 2 em 2 na mesma solução de 0,01% de ácido acético e 0,2% de BSA. 10 μΐ de cada diluição foram incubados em placas de 96 alvéolos estéreis (Becton Dickinson, USA, ref: 18572) na presença de 100 μΐ de uma suspensão de bactérias ajustadas a uma densidade óptica de 0,001 a 600 nm em meio de Muller Hinton (MHB, SIGMA, ref:M-9677). O crescimento bacteriano foi controlado após 18 horas de incubação com agitação. A MBC foi determinada semeando o conteúdo dos três primeiros alvéolos onde nenhum crescimento bacteriano foi observado; a sementeira fez-se em caixas de Petri com agar preparado a partir de meio de Mueller Hinton. Estas caixas foram em seguida incubadas 18 horas. A MBC corresponde à concentração mais baixa de peptideo para a qual não se observa qualquer colónia 21 PE1601768 bacteriana nas caixas incubadas. A Tabela 1 apresenta o espectro de actividade da molécula. Resumindo, a halocintina tem uma actividade bacteriolitica com uma acção particularmente forte nas bactérias Gram positivas.

Tabela 1

Espectro de actividade da halocintina (Valores de MBC expressos em μΜ) Bactéria MBC Bactérias Gram positivas M luteus 1,56-3,13 S. aureus 6,25-12,5 B. megaterium 0,75-1,56 A. viridinas 3,13-6,25 E. faecalis 6,25-12,5 Bactérias Gram negativas E.coli. DH5a 6,25-12,5 S. typhimurium 50-100 F. aeruginosa >100 E. aerogenes 25-50 K. pneumoniae 12,5-25 N. gonorrhoaea 25-50 i. Actvidade hemolitica da halocintina

Uma quantidade conhecida de peptideo foi suspensa 22 ΡΕ1601768 numa solução contendo 0,01% de ácido acético e 0,2% de albumina sérica bovina (BSA) de maneira a obter uma solução stock com uma concentração de 500 μΜ; em seguida, diluições seriadas desta solução foram realizadas na mesma solução a 0,01% de ácido acético e 0,2% de bSA (AA-BSA) . 20 μΐ de cada uma destas soluções ou 20 μΐ de uma solução a 10% de Triton X-100 em PBS (controlo de 100% de hemólise) ou 20 μΐ da solução AA-BSA (controlo peptideo -) foram em seguida adicionadas a 180 μΐ de uma solução contendo 2,5% (volume/volume) de uma suspensão de eritrócitos de carneiro em PBS. A mistura foi em seguida incubada 30 minutos a 37°C, depois submetida a uma centrifugação a 10000 g durante 3 minutos. Finalmente, o sobrenadante foi recuperado e a sua absorvância foi medida a 600 nm. A percentagem de hemólise foi em seguida calculada com a seguinte equação: % hemólise = (A60o da amostra - A60o de peptideo controlo)/( A60o do controlo de 100% de hemólise -A6oo de peptideo controlo) x 100.

Conforme apresentado na figura 1, a halocintina não apresenta actividade hemolítica até concentrações de 12,5 μΜ. Para lá desta concentração, foi detectada uma actividade hemolítica muito fraca. Com efeito, o peptideo apresenta uma actividade hemolítica de 5,8% com eritrócitos de carneiro numa concentração de 50 μΜ. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Centre National de la Recherche Scientifique 23 ΡΕ1601768 < 12Ο> Peptídeo antimicrobiano designado halocintina, gene codificador do referido peptideo, vector, organismo transformado e composição contendo o mesmo

<130> 30847/PCT <140> PCT/FR04/XXXXX <141> 2004-03-05 <150> FR03/02715 <151> 2003-03-05 <16 0> 1 <170> Patentin versão 3.1

<210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Halocynthia papillosa <220> <221> PEPTÍDEO <222> (1)..(26) <223> Sequência de aminoácidos da halocintina. 24 ΡΕ1601768 < 4 Ο Ο > 1

Fen Trp Gli His Ile Trp Asn Ala Vai Lis Arg Vai Gli Ala Asn 15 10 15

Ala Leu His Gli Ala Vai Tre Gli Ala Leu Ser 20 25

Lisboa, 3 de Agosto de 2007

Claims (13)

1. ΡΕ1601768 1 REIVINDICAÇÕES 1. Peptídeo isolado cuja sequência de aminoácidos é FWGHIWNAVKRVGANALHGAVTGALS (SEQ ID NO. 1 na lista de sequências em anexo), seus derivados que apresentem pelo menos 70% de identidade com a sequência acima, seus derivados que apresentem uma glicosilação, uma amidação, uma acilação, uma acetilação, uma metilação ou que sejam portadores de um grupo protector e seus fragmentos de pelo menos 7 aminoácidos, os referidos derivados e fragmentos apresentando actividade microbiana.
2. 2. Polipeptideo isolado compreendendo um peptideo de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Polinucleótido isolado caracterizado por codificar um peptideo de acordo com a reivindicação 1 ou um polipeptideo de acordo coma reivindicação 2.
4. 4. Vector de clonagem e/ou de expressão caracterizado por conter um polinucleótido de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Vector de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por conter ainda pelo menos um elemento escolhido do grupo de promotores constitutivos, promotores induziveis e elementos terminadores. 2 PE1601768
6. 6. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado por possuir elementos que permitem a sua manutenção e a sua replicação num organismo hospedeiro.
7. 7. Organismo hospedeiro, exceptuando o ser humano, transformado com a ajuda de um vector de acordo com uma das reivindicações 4 a 6.
8. 8. Organismo hospedeiro, com excepção do ser humano, no qual um polinucleótido de acordo com a reivindicação 3 é introduzido para a produção de um peptideo de acordo com a reivindicação 1 ou de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 2.
9. 9. Organismo hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por ser escolhido entre microrganismos, células animais, células vegetais e plantas.
10. 10. Célula vegetal resistente a doenças microbianas compreendendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 3 e expressando um peptideo de acordo com a reivindicação 1 ou um polipeptideo de acordo com a reivindicação 2.
11. 11. Planta caracterizada por compreender pelo menos uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 10. 3 ΡΕ1601768
12. 12. Utilização de um peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou um peptideo de acordo com a reivindicação 2 para a preparação de uma composição antimicrobiana e, mais particularmente, antibacteriana destinada a combater bactérias Gram positivas.
13. 13. Composição antimicrobiana compreendendo, como agente activo, um peptideo de acordo com a reivindicação 1 ou um polipeptideo de acordo com a reivindicação 2, vantajosamente associado na referida composição a um veiculo aceitável. Lisboa, 3 de Agosto de 2007