PT1539966E - Método de produção de proteínas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS"

AREA TÉCNICA A presente invenção é em geral relativa a métodos e a materiais a serem empregues na expressão genética, e em particular na produção de proteína não-vegetal extracelular a partir de protoplastos de musgo.

ESTADO DA TÉCNICA

Os sistemas de produção de proteínas recombinantes actualmente empregues vão desde sistemas procarióticos, como Escherichia coli e Bacillus, até sistema eucarióticos como levedura, células de mamíferos, culturas de células de insectos, animais transgénicos e plantas. As proteínas que têm modificações pós-tradução, por exemplo, glicosilação e processamento de pontes dissulfureto, são tipicamente produzidas em sistemas eucarióticos. No caso da produção à grande escala de proteínas recombinantes, empregou-se tipicamente linhas celulares ou organismos transformados de forma estável (ou seja, sistemas em que o ácido nucleico em questão foi integrado no genoma nuclear), assim como sistemas celulares de insectos/baculovírus. Por exemplo, Schaefer et al. (1991) revelam um método para a transformação estável do Physcomitrella patens, que engloba fazer a cultura dos protoplastos transformados em meio de cultura 3M durante 4 a 7 dias antes de regenerar a planta. 0 estabelecimento destas linhas celulares ou destes organismos transformados de forma estável constitui um processo dispendioso em termos de tempo e de trabalho. 2 A transfecção de células de mamíferos ou de células de insecto requer muitas horas de trabalho e a utilização de equipamento técnico especializado, por exemplo, câmara de incubação de C02. Ambos estes factores tornam muito grande o custo de produção.

Os sistemas de transformação transitória de base vegetal, utilizados na expressão transitória e na produção de proteínas recombinantes, baseiam-se na inoculação de tecidos vegetais ou de plantas inteiras com agrobactérias ou partículas virais (Vaquero et al. 1999; Fischer et al. 1999; Fischer and Emans 2000; Dirnberger et al. 2001). Também se utilizou a transferência directa de ADN para o tecido vegetal pelo bombardeamento de partículas, como um método de testar a expressão genética antes da transformação estável (Fischer et al. 1999).

Os sistemas de transformação transitória alternativos, ou seja, sistemas em que o ácido nucleico em questão não esteja integrado no genoma nuclear, constituem um passo em frente no sentido da expressão eficiente de proteínas heterólogas em quantidades comerciais.

Até à data, a expressão proteica transitória nos protoplastos apenas foi utilizada com sistemas repórter, por exemplo, análise de promotores (Zeidler et al. 1999); "analysis of signal transduction; protein targeting and trafficking; and protein-protein interaction" (Sheen 2001) . Utilizou-se ensaios repórter em experiências de transformação transitória com protoplastos, com vista à análise de péptidos de sinal para a secreção de proteínas, (por exemplo, De Loose et al. 1991, Denecke et al. 1990). 3 A secreção de proteínas recombinantes no espaço extracelular (apoplasto) com a utilização de plantas transformadas de forma estável (esporófito) encontra-se bem caracterizada (Magnuson et al. 1996, De Wilde et al. 1998) e pareceu à primeira vista constituir uma ferramenta útil na produção proteica nas plantas. Também se fez a descrição da secreção de proteínas recombinantes, expressa em estirpes de musgo transgénicas transformadas de forma estável (gametófito), directamente no meio (WO 01/25456 A2) .

Houba-Herin et al. (1999) descrevem a introdução de uma citoquinina oxidase (CKO) de planta (milho) em protoplastos de musgo num sistema de ensaio transitório, e a análise do papel da CKO no desenvolvimento da planta. O teor do documento descreve a expressão de uma citoquinina oxidase de planta (milho) correctamente dobrada e glicosilada e não sugere o protoplasto de musgo como um possível sistema de produção de proteínas.

No entanto, a expressão transitória e a secreção de proteínas não-vegetais recombinantes para a produção de proteínas (suficiente para análises de proteínas, por exemplo, modificações pós-tradução, análise MALDI-TOF), com a utilização de protoplastos de musgo transformados de forma transitória via transferência de ADN directa mediada por PEG, não parece ter sido descrita no estado da técnica.

De forma surpreendente, os presentes inventores descobriram que os protoplastos de musgo transformados de forma transitória (gametófitos) são capazes de expressar grandes niveis de proteínas não-vegetais recombinantes, que são secretadas no meio. É possível fazer a cultura dos 4 protoplastos de musgo transformados de forma transitória em meios simples, que poderão conter ou não componentes adequados à estabilização das proteínas. Além disso, os protoplastos de musgo podem ser concentrados até a uma grande densidade celular, que lhes permite ser transformados de forma transitória com relativa facilidade em grandes números, tendo em vista a utilização em sistemas em que se possa empregar baixos volumes de meio de cultura, permitindo a produção de soluções concentradas de proteínas, facilitando ainda as análises que requeiram baixos volumes mas grandes concentrações proteicas (por exemplo, modificações pós-tradução).

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, fornece-se um método para a produção transitória de uma ou mais proteínas não-vegetais extracelulares num protoplasto de musgo, indo esse método englobar as etapas de transformar de forma transitória o protoplasto com um constructo de ácidos nucleicos contendo (a) sequência(s) nucleotídica(s) heteróloga(s) que codificam a(s) referida(s) proteína(s) não vegetal(ais) ligada(s) de forma operante a um promotor, e a cultura do protoplasto transformado, de modo a produzir a(s) referida(s) proteína(s) não-vegetal(ais) , sendo que a referida cultura decorre durante pelo menos 48 horas num meio de cultura seleccionado do grupo composto por W5, 3M e MMS.

Seguidamente, debater-se-á aspectos particulares da invenção em maior detalhe.

Definições 5

Emprega-se dum modo geral o termo "heterólogo" em baixo para indicar que o gene/a sequência nucleotídica em questão foi introduzido/a de forma transitória em protoplastos de musgo recorrendo a engenharia genética, ou seja, com a intervenção humana. Uma sequência heteróloga de nucleótidos poderá conter a sequência de codificação de uma proteína de fusão composta por um parceiro de fusão, que poderá ser constituído, por exemplo, em parte por uma proteína vegetal que poderá estar fundida numa proteína não-vegetal, que poderá receber a denominação de planta híbrida: proteína de fusão não-vegetal para os fins da presente invenção. Esta proteína de fusão híbrida também poderá se considerada uma proteína não-vegetal para os fins da presente invenção. Em alternativa, uma proteína de fusão poderá ser uma constituída por parceiros de fusão de origem não-vegetal. Um gene heterólogo poderá aumentar a expressão de uma proteína de interesse de um gene endógeno equivalente, ou seja, uma que desempenhe normalmente a mesma função ou uma função semelhante, ou a sequência inserida poderá ser adicional ao gene endógeno ou a outra sequência. 0 ácido nucleico heterólogo em relação a uma célula poderá não ocorrer naturalmente em protoplastos de musgo desse tipo, dessa variedade ou espécie. Por conseguinte, o ácido nucleico heterólogo poderá conter uma sequência de codificação de um tipo particular de organismo, ou derivada dele, como é o caso de uma espécie mamífera, por exemplo, espécie humana, ovina, bovina, equina ou suína, no âmbito do contexto de um protoplasto de musgo, como é o caso dum protoplasto derivado do Physcomitrella patens. Outra possibilidade é a de colocar uma sequência de ácido nucleico num protoplasto de musgo, no qual ela ou uma homóloga se encontre naturalmente, mas em que a sequência de ácido nucleico esteja ligada e/ou adjacente ao ácido 6 nucleico que não ocorre naturalmente na célula, ou nas células desse tipo ou espécie ou variedade de planta, como ligada de forma operante a uma ou mais sequências reguladoras, como uma sequência de promotor, com vista ao controlo da expressão. "Gene", se nada for expresso em contrário, refere-se a um ácido nucleico não vegetal que codifica a informação genética para a tradução num péptido, polipéptido ou numa proteina. "Vector" é definido para incluir, entre outros, qualquer plasmideo, cosmideo, fago ou vector virai na forma linear ou circular, de cadeia dupla ou simples, que poderá ou não ser autotransmissivel ou mobilizável, e que pode transformar um hospedeiro procariótico ou eucariótico e existe extracromossomicamente (por exemplo, plasmideo de replicação autónomo com uma origem de replicação). Especificamente incluídos estão os vectores transportadores, significando um veículo de ADN capaz, de forma natural ou concebida, de replicação em dois organismos hospedeiros diferentes, que podem ser seleccionados de actinomicetes e espécies relacionadas, bactérias e células eucarióticas (por exemplo, de plantas superiores, musgos, mamíferos, leveduras ou fungos). "Vector de expressão" refere-se a um vector no qual um ácido nucleico está sob o controlo e ligado de forma operante a um promotor apropriado ou a outros elementos reguladores de transcrição numa célula hospedeira, como uma célula microbiana ou um protoplasto de musgo. 0 vector poderá ser um vector de expressão bifuncional, que funcione em múltiplos hospedeiros. No caso do ADN genómico ou 7 subgenómico, este poderá conter o seu próprio promotor ou outros elementos reguladores e, no caso do ADNc, este poderá estar sob o controlo de um promotor apropriado ou de outros elementos reguladores para expressão na célula hospedeira.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos, para a qual poderá ter início a transcrição do ADN ligado de forma operante a jusante (ou seja, na direcção 3' na cadeia sense de ADN de cadeia dupla). "Ligado de forma operante" significa ligado como parte da mesma molécula de ácido nucleico, posicionado ou orientado de forma apropriada para que se inicie a transcrição a partir do promotor. 0 termo "indutível", quando aplicado a um promotor, é bem compreendido pelos especialistas da técnica. Essencialmente, a expressão sob o controlo de um promotor indutível é "activada" ou aumentada em resposta a um estímulo aplicado. A natureza do estimulo varia entre os promotores. Alguns promotores indutiveis provocam níveis baixos ou indetectáveis de expressão (ou nenhuma expressão) na ausência do estímulo apropriado. Outros promotores indutiveis provocam uma expressão constitutiva detectável na ausência do estímulo. Seja qual for o nível de expressão na ausência de estímulo, verifica-se um aumento da expressão a partir de qualquer promotor indutível na presença do estímulo correcto. A invenção também contempla a utilização de uma variante de qualquer uma destas sequências. Uma proteína variante partilha homologia ou é idêntica à totalidade ou a parte 8 das sequências acima debatidas. Dum modo geral, seja onde for que se empregue o termo no presente documento, as variantes poderão ser: (i) variantes homólogas de ocorrência natural da proteína não-vegetal relevante, (ii) variantes homólogas geradas de forma artificial (derivados) que podem ser preparadas pelo especialista à luz da presente divulgação, por exemplo, mutagénese dirigida ou mutagénese aleatória, ou por síntese directa. De preferência, gera-se o ácido nucleico variante, que codifica o polipéptido variante, directa ou indirectamente (por exemplo, através de uma ou mais etapas de amplificação ou replicação) a partir dum ácido nucleico original. As alterações à sequência de ácido nucleico poderá produzir um derivado por meio de uma (ou mais) adição, inserção, delecção ou alterações poderão substituição de um ou mais nucleótidos no ácido nucleico, levando à adição, inserção, delecção ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipéptido codificado. A mutação pretendida poderá ser mutagénese aleatória ou dirigida, de modo a alterar a actividade (por exemplo, especificidade) ou a estabilidade do polipéptido codificado. As alterações podem ser por variação conservadora, ou seja, substituição de um resíduo hidrófobo, como a isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, como a arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, ou glutamina por asparagina. Também incluídas estão as variantes que têm substituições não conservadoras. Em regiões críticas para determinar a conformação ou a actividade dos péptidos, essas alterações poderão conferir 9 propriedades vantajosas no polipéptido, por exemplo, estabilidade ou especificidade alterada.

A semelhança ou a homologia no caso das variantes é de preferência estabelecida por meio de comparações de sequências, realizadas recorrendo a FASTA e FASTP (consultar Pearson & Lipman, 1988. "Methods in Enzymology" 183: 63-98). Define-se de preferência os parâmetros utilizando a matriz default, da seguinte forma:

Gapopen (penalização para o primeiro resíduo num

espaçamento): -12 para proteínas/-l6 para ADN

Gapext (penalização para resíduos adicionais num

espaçamento): -2 para proteínas/-4 para ADN comprimento de palavra KTUP: 2 para proteínas/6 para ADN. A homologia pode estar ao nível da sequência nucleotídica e/ou da sequência de aminoácidos codificada. De preferência, a sequência de ácido nucleico e/ou de aminoácidos partilha pelo menos cerca de 75%, ou 80%, de identidade, com maior preferência pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.

Também é possível analisar a homologia pela utilização de uma metodologia de sonda (Sambrook et al., 1989). Uma fórmula comum de calcular as condições rígidas necessárias para se conseguir a hibridização entre as moléculas de ácidos nucleicos de uma homologia de sequência especificada é: Tm = 81,5 °C + 16, 6Log [Na+]+0,41 (% G+C) - 0,63 (% formamida) - 600/#bp em duplex. Como uma ilustração da fórmula anterior, utilizando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com teor GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm é 57°C. A Tm de um duplex de ADN diminui 10 em 1 - 1,5°C com cada diminuição de 1% de homologia. Assim, observar-se-á os alvos com uma identidade de sequência superior a cerca de 75%, recorrendo a uma temperatura de hibridização de 42°C.

Utilização em musgos

Como abaixo descrito, nos seus diversos aspectos, empregar-se-á dum modo geral a invenção em protoplastos de musgo, utilizando os ácidos nucleicos que codificam as proteínas não-vegetais em questão.

Os promotores apropriados que operam em protoplastos de musgo incluem o Cauliflower Mosaic Vírus 35S (CaMV 35S) . Outros exemplos são revelados na pág. 120 de Lindsey & Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture"® Pub. OU Press, Milton Keynes, RU. É possível seleccionar o promotor para incluir um ou mais elementos ou motivos de sequência, conferindo um controlo regulador específico de tecido e/ou de desenvolvimento da expressão. Os promotores indutíveis de plantas incluem o promotor induzido por etanol de Caddick et al (1998) "Nature Biotechnology" 16: 177-180.

Caso se pretenda, é possível incluir marcadores genéticos seleccionáveis no constructo, como aqueles que conferem fenótipos seleccionáveis, como a resistência a antibióticos ou a herbicidas (por exemplo, canamicina, higromicina, fosfinotricina, clorossulfurona, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas e glifosato). A presente invenção também fornece métodos englobando a introdução transitória destes constructos que contêm sequências heterólogas apropriadas, numa célula duma planta de musgo e/ou a indução da expressão de um constructo numa 11 célula de planta de musgo, através da aplicação dum estímulo adequado, por exemplo, um indutor exógeno eficaz. As células de planta de musgo apropriadas incluem protoplasto de musgo, como os que derivam do Physcomitrella patens. É possível introduzir ácido nucleico em protoplastos de musgo recorrendo a qualquer tecnologia apropriada, como a introdução de ADN mediada por PEG, como descrito no presente documento, bombardeamento de partículas ou de microprojectéis (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616),

microinjecção (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) "Plant Tissue and Cell

Culture", Academic Press), electroporação (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser), outras formas de introdução directa de ADN (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), introdução de ADN mediada por lipossomas (por exemplo, Freeman et al. "Plant Cell Physiol". 29: 1353 (1984)), ou o método de vortex (por exemplo, Kindle, PNAS U. S. A. 87: 1228 (1990d) "Physical methods for the transformation of plant cells are reviewed in Oard", 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11. É dada preferência à electroporação, à introdução de ADN mediada por PEG e à introdução directa de ADN. Particular preferência vai para o procedimento de introdução de ADN mediada por PEG modificada, como revelado nos exemplos do presente documento. A escolha particular de uma tecnologia de transformação será determinada pela respectiva eficiência na transformação de determinadas espécies de musgo, assim como pela experiência e pela preferência daqueles que põem a 12 invenção em prática com uma metodologia opcional particular. Será aparente ao especialista que a escolha particular de um sistema de transformação transitória, para introduzir ácido nucleico em protoplastos de musgo, não é essencial à invenção. No entanto, é dada preferência à utilização do sistema de transformação de ADN mediado por PEG, como descrito no presente documento.

Assim, diversos aspectos da presente invenção proporcionam um método para transformar de forma transitória um protoplasto de musgo, envolvendo a introdução de um constructo com base em ácido nucleico heterólogo como abaixo descrito, num protoplasto de musgo, e levando ou permitindo a expressão transitória do vector, o que resulta por sua vez na secreção de proteína extracelular para o meio. A cultura de protoplastos em grande concentração tem por resultado concentrações de proteínas de eficiência melhorada.

Numa forma preferida, fornece-se um método para transformar de forma transitória um protoplasto de musgo por introdução de ADN mediada por PEG e a respectiva cultura, que se caracteriza por se fazer a cultura com um volume de cultura de até 1 OOOpL. Em termos preferenciais, faz-se a cultura num volume de cultura de 50 - 1 OOOpL, com maior preferência de 100 - 600pL, ainda com maior preferência de 100 - 300pL e, com total preferência, de cerca de 200pL +/-50pL.

Selecção dos genes a ampliar

Os genes em questão incluem os que codificam proteínas não-vegetais que são elas próprias medicamentos naturais, tais como fármacos ou produtos veterinários. 13

Os ácidos nucleicos heterólogos poderão codificar, entre outros, genes de origem bacteriana, fúngica ou não-vegetal, como as proteínas de fusão, como se fez alusão anteriormente, ou de origem animal. É possível utilizar os polipéptidos produzidos na produção de polipéptidos que possam ser daí purificados, com vista a uma utilização noutro local. As proteínas que podem ser produzidas num processo da invenção incluem heterodímeros, como FSH, imunoglobulinas, anticorpos de fusão e anticorpos de cadeia simples.

Estas proteínas incluem, sem ficarem a elas limitadas, proteína retinoblastoma, p53, angiostatina e leptina. Do mesmo modo, é possível recorrer aos métodos da invenção para produzir proteínas reguladoras de mamífero. Outras sequências com interesse incluem proteínas, hormonas, como a hormona foliculoestimulante, factores de crescimento, citoquinas, albumina sérica, hemoglobina, colagéneo, taumatina, proteínas do tipo taumatina, factores de crescimento epidérmico como o VEGF, etc.

Expressão de genes-alvos

Dum modo geral, os ácidos nucleicos heterólogos podem ser expressos por qualquer processo apropriado utilizado no estado da técnica, ou podem ser transcritos ou expressos como se segue: (i) expressão transitória de ADN "nu", por exemplo, contendo um promotor ligado de forma operante à sequência heteróloga em questão, (ii) expressão a partir de um vector de expressão, como um vector de replicação. Dum modo geral, os 14 especialistas da técnica são bem capazes de construir vectores e conceber protocolos para a expressão genética recombinante transitória. É possível seleccionar ou construir os vectores adequados, contendo sequências reguladoras apropriadas, inclusive sequências de promotor, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências ampliadoras, genes marcadores e outras sequências, se tal for apropriado. Relativamente a mais detalhes, consultar, por exemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual": 2.a edição, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou "Current Protocols in Molecular Biology", segunda edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. (iii) expressão de um vector não-integrante, que esteja presente pelo menos de forma transitória no citoplasma.

Subentender-se-á que estas categorias não são mutuamente exclusivas, pois, por exemplo, um vector não-integrante também poderá ser um vector de expressão, etc.

Os métodos para alcançar esta expressão são debatidos algures no presente documento.

EXPRESSÃO TRANSITÓRIA MELHORADA A PARTIR DE VECTORES NÃO-INTEGRADOS

Como acima debatido, os presentes inventores descobriram que a expressão melhorada a partir de constructos introduzidos (de preferência com grandes níveis) nos protoplastos de um musgo, de preferência com grande 15 densidade celular, como o Physcomitrella patens, não estando esses constructos integrados no genoma (por exemplo, ectopicamente), dá origem a ARNm transcrito. É possível introduzir os constructos com um número relativamente elevado de cópias, com promotores fortes e sem o efeito moderador inerente que poderá ocorrer ao seleccionar um transformante estável no qual um constructo esteja integrado no genoma. Em resultado disso, os níveis e as concentrações de proteína produzidos poderão exceder em muito os que se podem obter com a utilização de métodos para a produção de proteínas em sistemas com base em células de plantas do estado da técnica.

Por conseguinte, num aspecto da invenção, revela-se a utilização de um protoplasto de musgo transformado de forma transitória, capaz de gerar ARNm que codifica uma proteína-alvo gerada pela transcrição de um constructo de ácido nucleico introduzido de forma transitória, incluindo a sequência nucleotídica alvo, ligada de forma operante a um promotor, sendo esse constructo introduzido na célula de um organismo. 0 "ácido nucleico introduzido" incluirá assim a sequência de ácido nucleico heteróloga como uma sequência de ADN fornecida na forma dum constructo capaz de dar origem à produção de proteína extracelular, com um nível elevado relativamente ao nível de produção proteica normalmente associada à expressão transgénica estável da referida sequência de ADN. Num aspecto da invenção, a sequência de ácido nucleico heteróloga poderá codificar uma proteína composta por um péptido de sinal e/ou de trânsito ligado à sequência da proteína ou do polipéptido em questão. 16

Por conseguinte, num aspecto preferido da invenção, revela-se um método para alcançar a expressão transitória de uma sequência nucleotidica heteróloga numa planta, indo esse método contemplar a etapa da introdução de forma transitória, num protoplasto de musgo, de pelo menos uma primeira sequência de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica não-vegetal heteróloga.

Numa execução, fornece-se um método para gerar pelo menos uma proteína não-vegetal heteróloga extracelular, indo esse método englobar as etapas: (i) introdução de forma transitória, num protoplasto de musgo, de um primeiro ácido nucleico contendo a sequência nucleotidica que codifica a proteína heteróloga, (ii) provocar ou permitir a expressão, a partir do ácido nucleico e durante um período de tempo, da proteína heteróloga, (iii) colheita da proteína heteróloga secretada do meio, (iv) isolamento opcional dos protoplastos de musgo do meio.

Em resultado, é possível utilizar os protoplastos de musgo para produzir em contínuo as proteínas pretendidas, após cada colheita da proteína secretada. 0 isolamento pode ser realizado por meios inteiramente convencionais, e pode contemplar ou não a purificação parcial ou total. 17

Os tecidos ou protoplastos de musgo conterão geralmente células do gametófito, como os gametófitos do musgo, Physcomitrella patens. 0 período de tempo da cultura de protoplastos de musgo poderá ser qualquer período até ao qual, ou mesmo além do qual, o tecido continua viável, ou até que esteja saturado com proteína; em geral, poderá preferir-se que seja de cerca de 1 a 10 dias, com maior preferência de cerca de 1 a 5 dias.

Naturalmente, o especialista da técnica reconhecerá que se poderá empregar mais do que um gene no ou em cada constructo, embora se prefira uma sequência simples em qualquer dos casos. É possível introduzir múltiplos vectores (cada um incluindo uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam a proteína heteróloga pretendida) nos protoplastos de musgo, por meio de métodos de introdução de ADN mediada por PEG, como descrito no presente documento. Isto poderá ser útil na produção, por exemplo, de múltiplas subunidades, por exemplo, de uma enzima.

Como mostrado nos Exemplos em baixo, a expressão transitória da sequência heteróloga, se introduzida desta forma, pode dar origem a níveis muito altos do polipéptido- alvo durante o período de expressão transitória, que será geralmente de vários dias, em função dos métodos e materiais precisos empregues. Recorrendo aos métodos da invenção, como descrito no presente documento, consegue- -se a secreção de polipéptidos heterólogos no meio. 18

Por conseguinte, a expressão transitória no protoplasto de musgo representa uma ferramenta útil em muitos contextos para os quais poderá ter sido considerada inadequada anteriormente, por exemplo, expressão fiável de sequências proteicas ou polipeptidicas heterólogas instáveis, ou seja, expressas de forma transitória, que são secretadas para o meio. 0 método poderá ser particularmente preferido nas aplicações em que sejam necessários níveis elevados de expressão, mas em que os constructos virais (requerendo "infecção" da planta) ou as plantas transgénicas estáveis sejam indesejáveis, por exemplo, em que seja importante um ensaio rápido, ou em que a sequência em questão transmita um fenótipo letal. 0 repórter poderá ser qualquer proteína detectável, como um gene marcador, comummente empregue no estado da técnica, tais como GUS, GFP, luciferase, etc. De preferência, o repórter é um marcador não-invasivo como a GFP ou a luciferase. A invenção será ainda descrita com referência aos seguintes Figuras e Exemplos não restritivos. Outras execuções da invenção ocorrerão aos especialistas da técnica à luz das presentes execuções.

EXEMPLOS Métodos e Materiais

Material vegetal

Utilizou-se a estirpe do tipo selvagem do Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. caracterizada previamente por Reski 19 et al. 1994. Trata-se de uma subcultura da estirpe 16/14 que foi colhida por H. L. K. Whitehouse em Gransden Wood, Huntingdonshire, RU e que foi propagada por Engel (1968).

Construção de vectores

Construção do pRTlOl To32

Detecção por PCR de sequências polinucleotídicas derivadas. Fez-se o varrimento de uma biblioteca de ADNc de Thuja occidentalis com primers (iniciadores) degenerados, em busca de clones específicos, através de PCR. Nesse intuito, concebeu-se primers 5' de acordo com a sequência de terminação N obtida por degradação Edman (Edman and Begg G, 1967) da proteína To32 endógena purificada, derivou-se os primers 3' do motivo consensual das proteínas do tipo taumatina: utilizou-se 50 ng da biblioteca de ADNc de Thuja occidentalis como modelo numa Pfu-proof-reading-PCR (Promega, Alemanha; condições de PCR: 5 min 94°C; 30 ciclos: 30 s 94°C/45 s 50°C/90 s 72°C; extensão: 10 min), utilizando o primer 5' To32N-2-S

(5'-TTYGAYATIMGIAAYCARCAYGGNTAYAC-3' ) e O primer 3' Thaum-Mot-2-AS (5'-TCYTKIGSRTAGCTRTAVGCITSDGGRCA-3'). O produto PCR amplificado foi purificado de acordo com procedimentos padrão (consultar Sambrook and Russell, 2001). Voltou-se a amplificar 1 pL do produto PCR diluído de 1/100 numa Pfu-proof-reading-PCR "nested" (Promega, Alemanha; condições de PCR: 5 min 94°C; 30 ciclos: 30 s 94°C/45 s 50°C/90 s 72°C; extensão: 10 min) com o primer 5' To32-N-3-S (5'-GCNGCIGGNYTNCCNGGIGGIGGNCA-3' ) e o primer 3' Thaum-Mot-1-AS (5'-CCRTCRAYIAIMGAIAYGTCSYAGAAATC-3'). Analisou-se os produtos PCR por electrof orese em gel de agarose a 2% (w/v) , e fez-se a excisão de uma banda de 263 bp e purificou-se do gel (Quiagen, Hilden, Alemanha). Fez-se a 20 respectiva clonagem no vector pCR4-TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; protocol book: versionH, 072701; 25-0276) para a seguenciação. Em detalhe: para 4 pL de produto de PCR purificado, adenilado (por extensão de Tag-PCR; consultar o protocolo) , adicionou-se 1 pL de solução salina e 1 pL do vector TOPO. A reacção misturada com cuidado foi incubada durante 5 min à temperatura ambiente e transformou-se em seguida nas células ToplO guimiocompetentes (relativamente ao método, consultar Sambrook and Russell, 2001). Seleccionou-se os clones positivos por colocação em placas LB, contendo 50 pg/mL de canamicina. Sequenciou-se o vector pCRTo resultante e o mesmo continha um fragmento de 263 bp (bp 121-384 em CDS) do ADNc da To32. Derivou-se desta sequência um novo primer 5' To32-300-1-S (5'-GGCAGGGACAAAGAAGGC-3') e um novo primer 3' To32-300-2-AS (5'-AGTGTGCAGCTCAGTTGGC-3').

Para se obter a sequência 5' em falta da To32, realizou-se uma Pfu-proof-reading-PCR (Promega, Alemanha; condições de PCR: 5 min 94°C; 30 ciclos: 30 s 94°C/45 s 50°C/90 s 72°C; extensão: 10 min) com 50 ng da biblioteca de ADNc de Thuja occidentalis, primer 5' T7term (5'-CTAGTTATTGCTCAGCGG-3') e primer 3' To32-300-2-AS (ver em cima). Clonou-se o produto de PCR purificado no PCR4-TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; protocol book: versionH, 072701; 25-0276), resultando no vector pCRToN, e procedeu-se a sequenciação. Este vector contém as primeiras 295 bp do To32-CDS (bpl-295). Para se obter a sequência 3' em falta da To32, realizou-se uma Pfu-proof-reading-PCR (Promega, Alemanha; condições de PCR: 5 min 94°C; 30 ciclos: 30 s 94°C/45 s 50°C/90 s 72°C; extensão: 10 min) com 50 ng da biblioteca de ADNc da Thuja occidentalis, 21 primer 5' To32-300-1-S (ver em cima) e primer 3' pYES-2-AS (5'-AACTAATTACATGATGCGGC-3'). Clonou-se o produto de PCR purificado no PCR4-T0P0 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; protocol book: versionH, 072701; 25-0276), resultando no vector pCRToC, e procedeu-se a sequenciação. Este vector contém a região 3' do To32-CDS (bp 185-693) . As sequência de ADNc da To32 sobrepunham-se nos vectores pCRTo, pCRToN e PCRToC. Assim, foi possível identificar todo o CDS para a To32, contendo 693 bp. Foi possível verificar isto pela sequenciação do pETTo32 (ver os procedimentos de clonagem para a To32 no pET24b(+) em baixo), que era 100% idêntico. Neste caso o CDS, que codifica a proteína nativa, foi de novo amplificado a partir da biblioteca de ADNc da Thuja occidentalis. NB para os primers degenerados acima descritos: R = G ou A; Y = CouT; W = AouT; M = AouC; K = GouT; 1 = inosina; S = C ou G; N = G, A, T ou C.

Procedimentos de clonagem para a To32 no pET24 b(+) (Novagen, Madison, WI, EUA) . Amplificou-se a sequência de codificação de 615 bp da To32, que não continha a sequência de codificação do péptido líder de 26 aminoácidos, a partir da biblioteca de Thuja occidentalis, através de Pfu-proof-reading PCR (Promega, Alemanha), utilizando o primer a montante To32Nterm-BamHl-S (5'-CGG GAT CCA GTG AAG TTT AAT ATA CGG AAC C-3') e o primer a jusante To32Cterm-EcoRIl-AS (5'-CGG AAT TCG GGC AGA ATA CGA TAC TGT AGT C-3'). Após restrição do produto de amplificação resultante com EcoRI e BamHl, procedeu-se a clonagem no vector de expressão procariótico pET24b(+), tendo por resultado o pETTo32. 22

Procedimentos de clonagem para a To32 no pGEX-4T-l. Amplificou-se a sequência de ADNc de 615 bp a partir do pETTo32. Clonou-se um produto de PCRA EcoRI/Xhol-restrito no pGEX-4T-l, utilizando os primers P33 (5'-ATCGAATTCGTGAAGTTTAATATACGG-3') e P34 (5'-GTCCTCGAGTTA GGGGCAGAATACGATAC-3'), tendo por resultado o pGEXTo32.

Procedimentos de clonagem para a To32 no pKSTo32. Amplificou-se uma sequência de ADNc de 150 bp que codifica a terminação N da To32 (incluindo a sequência de 78 bp que codifica o péptido de sinal da To32) a partir do pCRToN, utilizando os primers P72 (5'-GTC GAA TTC ATG GCC ACA GTT TCA GAT C -3') e P74 (5'- AAG CAG CTG GAC CAG GGT CAG AC -3'). Clonou-se o produto de PCR EcoRI/RvuII-restrito no pKs (EcoRI/Notl-digerido) , numa ligação de um tubo contendo um fragmento de 546 bp PvuII/Notl-digerido derivado do pGEXTo32, tendo por resultado o pKSTo32. O pKSTo32 continha a sequência de ADNc da proteína do tipo taumatina To32, inclusive a sequência de codificação do péptido de sinal.

Procedimentos de clonagem para a To32 no pRT101To32. Amplificou-se o ADNc da To32 a partir do plasmídeo pKsTo32, utilizando os primers MoB254 (5'- ATA CTC GAG GAA GAT GGC CAC AGT TTC -3') e P73 (5'-GTC GGA TCC TTA CTT GTC GTC GTC ATC CTT GTA GTC GGG GCA GAA TAC GAT ACT G -3') através de Pfu-proof-reading-PCR (Promega, Alemanha; condições de PCR: 2 min 94 °C; 25 ciclos: 30 s 94°C/30 s 54°C/2 min 72°C; extensão: 10 min). Após restrição do produto de amplificação resultante com Xhol e BamRI, procedeu-se a clonagem no pRTIOl (Tõpfer et al. 1987; XhoI/BamRI-digerido). O plasmídeo resultante continha o ADNc da To32 (inclusive as sequências de codificação do péptido de sinal da To32 e o epítopo FLAG de terminação C) , posicionado a 23 jusante do promotor CaMV 35 S e terminado pelo terminador CaMV. Este plasmídeo recebeu a denominação de pRT101To32.

Construção do pRTIOlVEGF C3

Fez-se a excisão do ADNc do factor de crescimento do endotélio vascular humano 121 (VEGF121) sem sequência lider, como um fragmento Ndel-Sall do PCYTEXP-VEGF121 (gentilmente fornecido pelo Dr McCarthy, GBF, Braunschweig, Alemanha). Este fragmento foi blunted pela reacção de Klenow e introduzido no pRTIOl (Tõpfer et al. 1987) no mesmo local de restrição SmaI, para formar o plasmídeo pRTIOlVEGF C3. Neste constructo, colocou-se o ADNc do VEGF121 sem sequência líder a jusante do promotor CaMV 35 S e fez-se a terminação com o terminador CaMV (Gorr, 1999).

Construção do pRTlOlTPVEGF C3 A sequência do péptido de sinal VEGF (sinal de selecção de secreção) foi clonada no pRTIOlVEGF C3. Amplificou-se o ADNc do péptido de sinal com base no plasmídeo pRTIOl P21 (Gorr, 1999), utilizando o primer 5' MoB323 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT TGG -3' contendo um local de restrição Xhol, e o primer 3' MoB349 5'-CTG CCA TGG GTG CAG CCT GGG ACC AC -3' contendo o local de restrição Ncol. Digeriu-se o ADN amplificado com Xhol e Ncol e ligou-se no pRTIOlVEGF C3 (XhoI/iVcoI-digerido) , tendo por resultado o pRTlOlTPVEGF C3. 0 plasmídeo resultante continha as sequências de codificação do péptido de sinal do VEGF e do VEGF121 in frame sob controlo do promotor CaMV 35 S.

Construção do pRTlOlTPVEGF-Ι C3

Clonou-se a sequência do péptido de sinal do VEGF (sinal de selecção da secreção) sem três nucleótidos de terminação 3' (provocando uma delecção do último aminoácido (terminação 24 C) do péptido de trânsito) no pRTIOlVEGF C3. Amplificou-se o ADNc do péptido de sinal com base no plasmídeo pRTIOl P21 (Gorr, 1999), utilizando o primer 5' MoB323 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT TGG -3', contendo um local de restrição Xhol, e o primer 3' MoB350 5'-CTG CCA TGG GTG CAG CCT GGG ACC ACT TGG -3' contendo o local de restrição iVcol e a delecção 3' . Digeriu-se o ADN amplificado com Xhol e Ncol e ligou-se no pRTIOlVEGF C3 (XhoI/NcoI-digerido), tendo por resultado o pRTl01TPVEGF-1 C3. 0 plasmídeo resultante continha as sequências de codificação do péptido de sinal do VEGF incluindo a delecção 3' e do VEGF12i in frame sob controlo do promotor CaMV 35 S.

Construção do pRTl0lTPTo32 C3

Clonou-se a sequência do péptido de sinal da proteína do tipo taumatina To32 (sinal de selecção da secreção) no pRTIOlVEGF C3. Amplificou-se o ADNc do péptido de sinal com base no plasmídeo pCRToN (pTo63), utilizando o primer 5ΉΟΒ254 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GGC CAC AGT TTC AGA TC-3' , contendo um local de restrição Xhol, e o primer 3' MoB250 5'-CTG CCA TGG GTG CTG CTC CCG CCT CT-3' contendo o local de restrição ZVcol. Digeriu-se o ADN amplificado com Xhol e Ncol e ligou-se no pRTIOlVEGF C3 (XhoI/NcoI-digerido), tendo por resultado o pRT101TPTo32 C3. 0 plasmídeo resultante continha as sequências de codificação do péptido de sinal da To32 e do VEGF121 in frame sob controlo do promotor CaMV 35 S.

Construção of pRT 10lTPTo32-l C3

Clonou-se a sequência do péptido de sinal da proteína do tipo taumatina To32 (sinal de selecção da secreção) sem três nucleótidos de terminação 3' (provocando a delecção do último aminoácido (terminação C) do péptido de trânsito) no 25 pRTIOlVEGF C3. Amplificou-se o ADNc do péptido de sinal com base no plasmídeo pCRToN (pTo63) , utilizando o primer 5' MOB254 5' -ATA CTC GAG GAA GAT GGC CAC AGT TTC AGA TC-3', contendo um local de restrição Xhol, e o primer 3' MoB324 5' -CTG CCA TGG GTG CTC CCG CCT CTT GG-3' contendo o local de restrição NcoI. Digeriu-se o ADN amplificado com Xhol e Ncol e ligou-se no pRTIOlVEGF C3 (Xhol/Ncol-diqerido) , tendo por resultado o pRTl01TPTo32-1 C3. 0 plasmídeo resultante continha as sequências de codificação do péptido de sinal da To32 incluindo a delecção 3' e do VEGF12i in frame sob o controlo do promotor CaMV 35 S.

Construção do pRT99TPftszGFP

Fez-se a excisão da cassete de expressão da GFP, contendo o fragmento de ADNc ftsZ1 de 297 bp que codifica o péptido de trânsito do cloroplasto FtsZl e o ADNc do gfp sob controlo do promotor CaMV 35 S e o terminador nos, como um fragmento HindiII/FcoRI do pFtsZ1(1-93)-GFP (Kiessling et al. 2000). Ligou-se o fragmento no pRT99 (HindIII/EcoRI-digerido) , tendo por resultado o pRT99TPftszGFP.

Condições de cultura padrão

Cultivou-se as plantas axenicamente sob condições estéreis em meio Knop modificado, líquido inorgânico simples (1 000 mg/L de CaNC>3)2 x 4H20 250 mg/L de KC1, 250 mg/L de KH2PO4, 250 mg/L de MgS04 x 7 H20 e 12,5 mg/L de FeS04 X 7 H20; pH de 5,8 (Reski and Abel 1985)). Fez-se crescer as plantas em balões Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio de cultura, e agitou-se os balões num agitador Certomat R (B. Braun Biotech International, Alemanha) definido para as 120 rpm. As condições da estufa eram de 25 +/- 3°C e um regime de luz-escuridão de 16:8 h. Os balões eram iluminados de cima por duas lâmpadas fluorescentes (Osram L 58 W/25) 26 fornecendo 35 pmols-1m-2. Fez-se a subcultura das culturas uma vez por semana por meio de desintegração, utilizando um equipamento de homogeneização Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Alemanha) , e por meio de inoculação de dois novos balões Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de meio Knop fresco.

Isolamento de protoplastos

Pré-cultura de tecido de musgo para isolamento óptimo dos protoplastos. É possível fazer a pré-cultura de musgos (em especial do Physcomitrella patens) sob diferentes condições, para obter rendimentos óptimos de protoplastos: I. Rother et al. 1994 fizeram a cultura de tecido de musgo durante 7 dias em meio Knop com teor reduzido (10%) de Ca(N03)2. Filtrou-se as culturas 3 ou 4 dias depois da desintegração e fez-se a sua transferência para meio Knop fresco com teor reduzido (10%) de Ca (N03) 2 · II. Em vez de redução do Ca(N03)2f é possível suplementar o meio de pré-cultura com tartrato de amónio 5 mM ou é possível mudar o pH para 4,5 (em culturas líquidas com valores de pH não controlados, atinge-se um pH médio de 5,8 no caso de meio Knop modificado). Filtrou-se as culturas 3 ou 4 dias depois da desagregação do tecido e transferiu-se as mesmas para meio Knop modificado fresco (suplementado com tartrato de amónio 5 mM o mudou-se para um pH de 4,5). III. Hohe and Reski (2002) optimizaram as condições de cultura num biorreactor semicontínuo, de modo a obter grandes rendimentos de protoplastos. Obteve-se protoplastos isolados com grandes rendimentos por 27 suplementação de meio Knop modificado (Reski and Abel 1985) com 460 mg/L de tartrato de amónio ou sob valores de pH controlados com um ponto definido de 4,5 (em culturas de biorreactor com valores de pH não controlados, atinge-se um pH médio de 5, 8 no caso de meio Knop modificado).

Foram descritos diferentes protocolos para o isolamento de protoplastos (Grimsley et al. 1977; Schaefer et ai. 1991; Rother et al. 1994; Zeidler et al. 1999; Hohe and Reski 2002, Protocol Schaefer 2001) e para a transformação (Schaefer et al. 1991; Reutter and Reski 1996, Protocol Schaefer 2001) no caso do Physcomitrella patens.

No caso do trabalho apresentado no presente documento, recorreu-se a uma modificação/combinação dos métodos anteriormente descritos:

Após filtração, os protonemata de musgo foram pré-incubados em manitol 0,5 M. Passados 30 min, adicionou-se Driselase a 4% (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) à suspensão. Dissolveu-se a driselase em manitol 0,5 M (pH de 5,6-5,8), centrifugou-se nas 3 600 rpm durante 10 min e esterilizou-se por meio de passagem através de um filtro de 0,22 pm (Millex GP, Millipore Corporation, EUA). Incubou-se a suspensão, contendo Driselase a 1% (concentração final), no escuro à TA e agitou-se com suavidade (alcançou-se os melhores rendimentos de protoplastos passadas 2 horas de incubação) (Protocol Schaefer 2001). Passou-se a suspensão através de filtros (Wilson, CLF, Alemanha) com poros com tamanhos de 100 pm e 50 pm. Centrifugou-se a suspensão em tubos de centrifugação estéreis e ocorreu a sedimentação de protoplastos à TA durante 10 min com 55 g (aceleração de 3; 28 abrandamento em 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Alemanha) (Protocol Schaefer 2001). Ressuspendeu-se os protoplastos com cuidado em meio W5 (CaCl2 125 mM x 2H20; NaCl 137 mM; glucose 5,5 mM; KC1 10 mM; pH de 5,6; 660-680 mOsm; filtrou-se de forma estéril). Centrifugou-se a suspensão de novo à TA durante 10 min com 55 g (aceleração de 3; abrandamento em 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Alemanha) (modificação, nota: Schaefer et al. 1991 mencionaram que o meio W5 teve por resultado uma menor viabilidade). Ressuspendeu-se os protoplastos com cuidado em meio W5 (Rother et al. 1994) . Com vista à contagem dos protoplastos, transferiu-se um pequeno volume da suspensão para uma câmara de Fuchs-Rosenthal.

Protocolo de transformação

Com vista à transformação, incubou-se os protoplastos em gelo no escuro durante 30 minutos. Subsequentemente, sedimentou-se os protoplastos por centrifugação à temperatura ambiente, durante 10 min com 55 g (aceleração de 3; abrandamento em 3; Multifuge 3 S-R, Kendro) . Ressuspendeu-se os protoplastos em meio 3M (CaCl2 15 mM x 2H20; MES a 0,1 %; manitol 0,4 8 M; pH de 5,6; 54 0 mOsm; filtrou-se de forma estéril, Schaefer et al. 1991) com uma concentração de 1,2 x 106 protoplastos/mL (Reutter and

Reski 1996). Deitou-se 250 pL desta suspensão de protoplastos num novo tubo de centrifugação estéril, adicionou-se 50 pL de solução de ADN (ADN purificado por coluna em H20 (Qiagen, Hilden, Alemanha); 10-100 pL; adicionou-se a quantidade de ADN óptima de 60 pg) e, por fim, 250 pL de solução PEG (40% de PEG 4000; manitol 0,4 M; Ca(N03) 2 0, 1 M; pH de 6 após autoclivagem) . Misturou-se de imediato a suspensão mas com cuidado, e incubou-se em seguida durante 6 min à TA com mistura suave ocasional. 29

Diluiu-se progressivamente a suspensão pela adição de 1, 2, 3 e 4 mL de meio 3M. Centrifugou-se a suspensão nos 20°C durante 10 minutos com 55 g (aceleração de 3; abrandamento em 3; Multifuge 3 S-R, Kendro). Ressuspendeu-se o pelete em 300 pL ou 400 pL de meio (por exemplo: meio 3M ou meio W5 ou meio MMS (contendo 610 mg de MgCl2 x 6H2O; 0,2 g de MES; 18,21 g de D sorbitol (Roth, Alemanha), pH de 5,6-5,8; 591 mOsm) . Fez-se a cultura de protoplastos transformados em placas de 96 poços (300 pL, Nunclon, Nunc GmbH, Wiesbaden, Alemanha) ou placas de 48 poços (400 pL, Cellstar, greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha).

Incubou-se amostras de transformação transitória sob luz atenuada (4,6 pmols^m”2) nos 25°C.

Amostragem:

Substituiu-se o meio com cuidado (para evitar a dispersão de protoplastos) por meio fresco cada 24 h. O meio não foi substituído totalmente, uma vez que os protoplastos têm de ser mantidos em líquido. Armazenou-se o meio removido (inclusive proteína recombinante) nos -20°C. Realizaram-se experiências no decorrer do tempo, ao substituir metade do meio (removeu-se 200 pL, adicionou-se 200 pL de meio fresco). Em algumas experiências, isolou-se os protoplastos e também o meio após as segundas 24 h. Armazenou-se as amostras nos -20°C.

Ensaios:

Quantificação do VEGF121 recombinante

Quantificou-se o VEGF121 recombinante, expresso por protoplastos de musgo transformados transitórios, através de ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha). Realizou-se o 30 ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Diluiu-se as amostras para fins de quantificação.

Realizou-se a determinação da actividade biológica do VEGF121 recombinante, expressa por protoplastos de musgo transformados de forma transitória, através de RELIDA especifico do VEGF (RELIATech, Braunschweig, Alemanha). Realizou-se o RELIDA de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio reconhece apenas formas biologicamente activas não complexas e livres do VEGF-A, que não sejam sequestradas por receptores solúveis. Não se detectará moléculas de VEGF-A monoméricas, degradadas e sequestradas (instruções do fabricante).

Análise por Western blot

Analisou-se a expressão proteica por análise Western blot. Misturou-se as amostras com tampão de amostra redutor ou não redutor e voltou-se a diluir num gel de SDS-poliacrilamida a 12% ou a 15% de acordo com Laemmli (1970). No caso do Western Blotting, fez-se a electrotransferência de proteínas de SDS-PAGE por transferência semi-seca para Optitran BA-S83 Reinforced NC Membrane (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) de acordo com Towbin (1979), utilizando um equipamento Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Alemanha). Realizou-se a análise utilizando um sistema de detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.

Realizou-se a detecção do VEGF121 sob condições não redutoras. Aqueceu-se as amostras durante 10 min nos 60 °C antes do carregamento. Detectou-se o VEGF recombinante pela utilização de anticorpo anti-rhVEGF (AF-293-NA, R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha) diluído de 1/500 em soro 31 fisiológico tamponado com Tris, pH de 8/Tween 20 a 0,05% e uma IgG anti-cabra, titulada com peroxidase (A5420, Sigma, Taufkirchen, Alemanha), diluída de 1/8 000 em soro fisiológico tamponado com Tris, pH de 8/Tween 20 a 0,05%.

Realizou-se a detecção da proteína do tipo taumatina To32 sob condições redutoras. Aqueceu-se as amostras durante 10 min nos 95°C antes do carregamento. Detectou-se a To32 recombinante pela utilização de conjugado de peroxidase-anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 (A-8592, Sigma, Deisenhofen, Alemanha), diluído de 1/1 000 em soro fisiológico tamponado com Tris, pH de 8/Tween 20 a 0,05%.

Microscopia

Analisou-se tecidos vegetais recorrendo a um Axiovert 200 (Zeiss, Alemanha). Visualizou-se a fluorescência da GFP usando um conjunto de filtros 10 (excitação: 450-490 nm; emissão: 515-565 nm, Zeiss, Alemanha). Corou-se substâncias das paredes celulares com 5 pg/mL de Fluorescent Brightener 28 (específico de celulose, Sigma, Deisenhofen, Alemanha) ou 0,01% de Aniline Blue (específico de calose, Merck, Darmstadt, Alemanha), e analisou-se a regeneração das paredes celulares recorrendo ao conjunto de filtros 2 (excitação: G 365 nm; emissão: LP 420 nm, Zeiss, Alemanha).

Resultados

Viabilidade A viabilidade dos protoplastos de musgo, isolados 48 horas após a transformação, era de aproximadamente 50%. Calculou-se a viabilidade pela contagem dos protoplastos sobreviventes ao microscópio numa câmara de Fuchs- 32

Rosenthal. Schaefer (Protocol 2001) mencionou uma taxa de regeneração de 50%.

Taxa de transformação

Estimada por protoplastos transformados de forma transitória que expressam a GFP, tendo ocorrido a transformação de 5 a 10% de protoplastos viáveis. Realizou-se a transformação com 60 pg de ADN. Calculou-se a relação de protoplastos transformados para protoplastos sobreviventes pela contagem dos protoplastos sobreviventes e que expressam a GFP ao microscópio numa câmara de Fuchs-Rosenthal. Schaefer (Protocol 2001) mencionou uma taxa de transformação de protoplastos sobreviventes de 5 a 25%.

Regeneração de protoplastos

Foi possível a cultura de protoplastos em meio 3M ou em meio W5 durante 2 a 3 meses. Com cultura em meio 3M ou W5, os protoplastos não foram capazes de regenerar as paredes celulares ou de se dividirem. No entanto, a transferência de protoplastos com 3 meses para meio de regeneração teve por resultado uma regeneração mais lenta mas aparentemente normal. Verificou-se a regeneração das paredes celulares pela utilização de corantes específicos contra calose (Aniline Blue) e celulose (Fluorescent Brightener 28) e fez-se a respectiva visualização por microscopia.

Secreção

Realizou-se experiências de delecção, de modo a analisar a clivagem apropriada de péptidos de sinal e a secreção-alvo. Delectou-se os aminoácidos terminais dos péptidos de sinal representando os locais de clivagem. 33

Exemplo 1: Péptido de sinal do VEGF humano

Amplificou-se a sequência codificadora do péptido de sinal do VEGF humano através de PCR, recorrendo a primers específicos (MoB323/MoB349; modelo: pRTIOl P21 (Gorr 1999)) e introduziu-se in frame em relação ao vegf121 no pRTIOl C3 (Gorr 1999). Utilizou-se o plasmídeo pRTIOlTPVEGF C3 resultante em experiências de transformação transitória.

Amplificou-se a sequência de codificação do péptido de sinal do VEGF humano não tendo os três nucleótidos (5'-CAG-3' ) que codificam o aminoácido (Gin) de terminação C, através de PCR, recorrendo a primers específicos (MoB323/MoB350) , e introduziu-se in frame em relação ao vegfl21 no pRTIOl C3. Também se utilizou o plasmídeo resultante pRTl01TPVEGF-1 C3 em experiências de transformação transitória.

Utilizou-se 60 pg de ADN (purificado por colunas, Qiagen, Alemanha) de cada constructo com vista à transformação. Realizou-se três experiências de transformação em paralelo para cada constructo. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 48 h em placas de 48 poços sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuridão). 24 h após a transformação, substituiu-se metade do meio por meio fresco. Realizou-se a amostragem 48 h após a transformação pela remoção de 200 pL. O VEGF121 definido como alvo no meio pelo péptido de sinal nativo teve por resultado 8,47 ng/mL +/- 1,95 e foi definido para 100%. A delecção do último aminoácido do péptido de sinal teve por resultado uma menor secreção de 0,21 ng/mL +/-0,06, 2,48% respectivamente (Tab. 1). 34

Exemplo 2: Péptido de sinal da proteína do tipo taumatina vegetal To32

Amplificou-se a sequência codificadora do péptido de sinal da proteína do tipo taumatina vegetal To32 por PCR, recorrendo a primers específicos (MoB254/MoB250; modelo: pCRToN) e introduziu-se in frame em relação ao vegf121 no pRTIOl C3 (Gorr 1999). Utilizou-se o plasmídeo resultante pRT101TPTo32 C3 em experiências de transformação transitória.

Amplificou-se a sequência de codificação do péptido de sinal da proteína do tipo taumatina vegetal To32, não incluindo os três nucleótidos (CTG) que codificam o aminoácido (Leu) de terminação C, por PCR, utilizando primers específicos (MoB254/MoB324) e introduziu-se in frame em relação ao vegf121 no pRTIOl C3. Utilizou-se o plasmídeo resultante pRTl0lTPTo32-l C3 em experiências de transformação transitória.

Utilizou-se 60 pg de ADN (purificado por colunas, Qiagen, Alemanha) de cada constructo com vista à transformação. Realizou-se três experiências de transformação em paralelo para cada constructo. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 48 h em placas de 48 poços sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuridão). 24 h após a transformação, substituiu-se metade do meio por meio fresco. Realizou-se a amostragem 48 h após a transformação por remoção de 200 pL. 0 VEGF121 definido como alvo no meio pelo péptido de sinal nativo produziu 26, 83 ng/mL +/- 6,25 e foi definido como 100%. A delecção do último aminoácido do péptido de sinal teve por resultado uma diminuição da secreção de 2,18 ng/mL +/- 0,67, 8,13% respectivamente. (Tab. 1). 35

Comparação entre diferentes péptidos de sinal em ensaios de expressão transitória

Investigou-se se a utilização de péptidos de sinal diferentes do péptido de sinal nativo resulta ou não numa melhor secreção de proteínas recombinantes. 0 péptido de sinal nativo do VEGF foi comparado com o péptido de sinal da proteína do tipo taumatina To32.

Amplificou-se a sequência de codificação do péptido de sinal do VEGF humano por PCR, utilizando primers específicos (MoB/MoB; modelo: pRTIOl P21 (Gorr 1999)) e introduziu-se in frame em relação ao vegfl21 no pRTIOl C3 (Gorr 1999) . Utilizou-se o plasmídeo resultante pRTIOlTPVEGF C3 em experiências de transformação transitória. Amplificou-se a sequência codificadora do péptido de sinal da proteína do tipo taumatina vegetal To32 por PCR, utilizando primers específicos (MoB/MoB; modelo: pCRToN) e introduziu-se in frame em relação ao vegf121 no pRTIOl C3 (Gorr 1999). Utilizou-se o plasmídeo resultante pRT101TPTo32 C3 em experiências de transformação transitória.

Empregou-se 60 pg de ADN (purificado por colunas, Qiagen, Alemanha) de cada constructo com vista à transformação. Realizou-se três experiências de transformação em paralelo para cada constructo. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 48 h em placas de 48 poços sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuro). 24 h após a transformação, substituiu-se metade do meio por meio fresco. Realizou-se a amostragem 48 h após a transformação pela remoção de 200 pL. O VEGF 12i definido como alvo pelo péptido de sinal da proteína do tipo taumatina vegetal To32 no meio teve por resultado 36 rendimentos três vezes maiores (123,3 ng/mL + /- 11,1) em comparação com o targeting pelo péptido de sinal do VEGF (41,7 ng/mL +/- 6,9).

Melhorou-se a secreção de proteína recombinante pela utilização do péptido de sinal não-nativo (Tab. 2).

Experiências no decorrer do tempo com a utilização de diferentes meios

Amplificou-se a sequência codificadora do péptido de sinal do VEGF humano por PCR, utilizando primers específicos (MoB/MoB; modelo: pRTIOl P21 (Gorr 1999)) e introduziu-se in frame em relação ao vegfl21 no pRTIOl C3 (Gorr 1999). Utilizou-se o plasmídeo pRTIOlTPVEGF C3 resultante em experiências de transformação transitória.

Utilizou-se 60 pg de ADN (purificado por Qiagen Midiprep) do pRTIOlTPVEGF C3 com vista à transformação. Realizou-se três experiências de transformação em paralelo para cada condição de cultura. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M ou meio W5 ou meio MMS, durante 96 h em placas de 48 poços sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuro) . Realizou-se a amostragem através de substituição de metade do meio (200 pL) por meio fresco cada 24 h. Calculou-se as taxas de secreção como se segue: rendimento proteico passadas 24 h = taxa de secreção 0-24 h (24 h); rendimento proteico passadas 48 h - (rendimento proteico passadas 24 h/2) = taxa de secreção 24-48 h (48 h); rendimento proteico passadas 72 h - (rendimento proteico passadas 48 h/2) = taxa de secreção 48-72 h (72 h); rendimento proteico passadas 96 h - (rendimento proteico passadas 72 h/2) = taxa de secreção 72-96 h (96 h); 37 taxas de secreção 0-24 h + 24-48 h + 48-72 h + 72-96 h = taxa de secreção 0-96 h (0-96 h).

Os períodos de tempo da secreção foram ligeiramente diferentes nos meios testados. A expressão transitória realizada em meio W5 (24 h = 6,25 ng/mL) e em meio MMS (24 h =5,12 ng/mL) começou mais cedo em comparação com a taxa de secreção 0-24 h em meio 3M (24 h = 1,72 ng/mL) . No entanto, era possível observar mais ou menos as mesmas taxas de secreção em meio 3M entre as 24 e as 96 h (48 h = 5,85 ng/mL; 72 h = 4,48 ng/mL; 96 h = 4,3 ng/mL). Em contraste, mediu-se menores taxas de secreção entre as 72 e as 96 h em amostras de transformação transitória realizadas em meio W5 (48 h = 7,05 ng/mL; 72 h = 5,05 ng/mL; 96 h = 2,43 ng/mL) e meio MMS (48 h = 4,54 ng/mL; 72 h = 4,68 ng/mL; 96 h = 0,86 ng/mL) (Tab. 3). O cálculo das taxas de secreção durante a totalidade das 96 h (0-96 h) teve por resultado os rendimentos mais elevados no caso do meio W5 (20,77 ng/mL), a que se seguiu o meio 3M (16,35 ng/mL) e o meio MMS (15,2 ng/mL) (Tab. 3). A utilização de diferentes meios na transformação transitória de protoplastos teve por resultado diferentes periodos de tempo de secreção durante 96 h. Em contrapartida, os rendimentos totais de proteína recombinante excretada passadas 96 h eram apenas ligeiramente diferentes.

Rendimentos proteicos muito concentrados

Empregou-se 60 pg de ADN do constructo (pRT101TPTo32 C3 purificado por Qiagen Midiprep) em cada transformação. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 72 h em placas de 96 poços, sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuro) . Substituiu-se o 38 meio por meio fresco 24 h depois da transformação. Colheu-se os sobrenadantes (150 pL/amostra de transformação) 48 h após a transformação, adicionou-se novo meio 3M e voltou-se a colher os sobrenadantes 72 h após a transformação. A incubação dos protoplastos num tal baixo volume teve por resultado 130 ng/mL, (média: 2 pg/poço) do VEGF121 recombinante excretado durante 24 h.

Dimerização do VEGF121 em protoplastos de musgo

Nas células dos mamíferos, o VEGF12i é sintetizado como uma proteína precursora e, após a remoção do péptido de sinal, é processado num homodímero de ligação dissulfureto com 34-36 kDa. Neste caso, utilizou-se a o péptido líder do VEGF e o péptido líder da proteína do tipo taumatina To32 para avaliar correctamente a dimerização de ligação dissulfureto e a secreção do VEGF12i, expressa em protoplastos de musgo transformados de forma transitória. Analisou-se a proteína excretada em ensaios de Western blot sob condições não redutoras. Empregou-se 60 pg do ADN dos constructos (pRTl01TPVEGF C3 e pRT101TPTo32 C3) em cada transformação.

Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 72 h, em placas de 96 poços sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuro) . Passadas 24 h da transformação, substituiu-se o meio por meio fresco. Colheu-se os sobrenadantes 48 h após a transformação, adicionou-se novo meio 3M e, 72 h após a transformação, voltou-se a colher os sobrenadantes.

Sob condições não redutoras, o anticorpo detectou uma banda de 35 kDa. Isto sugere que os monómeros foram dimerizados de forma apropriada e secretados com eficiência. Utilizou- 39 se o VEGF121 recombinante derivado de E. coli (redobrado na estrutura nativa, R&D Systems, Alemanha) como controlo.

Determinação quantitativa do VEGF121 recombinante biologicamente activo expresso por musgo

Determinou-se a actividade biológica por tecnologia RELIDA (RELIATech, Braunschweig, Alemanha). 0 kit RELIDA tem por base receptores VEGF-A solúveis como moléculas de captura de ligandos activos. 0 receptor apenas reconhece formas biologicamente activas, não complexas e livres do VEGF-A (inclusive o VEGF12i) . Em comparação com os resultados de ELISA, mediu-se as mesmas quantidades de VEGF12i com o RELIDA. Com base neste resultado, o VEGF121 recombinante excretado parece ser totalmente activo a nível biológico.

Proteína do tipo taumatina To32 A proteína do tipo taumatina To32 mostrou capacidade de ligação a CD4. Para fins de análise, foram necessárias quantidades em micrograma. A transformação transitória acima descrita de protoplastos de musgo foi empregue na produção da To32 recombinante excretada.

Realizou-se a expressão transitória da proteína do tipo taumatina To32 em meio 3M. Isolou-se os protoplastos de culturas de biorreactor (pH de 4,5). Empregou-se 60 pg de ADN (pRT101To32) em cada transformação. Fez-se a cultura das amostras de transformação em meio 3M durante 96 h, em placas de 96 poços, sob condições de luz atenuada (16 h de luz : 8 h de escuro) . Fez-se a colheita dos sobrenadantes (150 pL) 24 h, 48 h, 72 h e 96 h após a transformação. Os sobrenadantes colhidos foram sempre substituídos por volumes idênticos de meio fresco. Durante as primeiras 24 h, não ocorreu excreção da To32 recombinante para o meio. 40

Após as primeiras 24 h, ocorreu a excreção de grandes rendimentos da To32 recombinante em continuo para o meio (24-48 h = 2,5 pg (média: 37,5 pg/poço) ; 48-72 h = 5 pg (média: 75 pg/célula); 72-96 h = 3,75 pg (média: 56,2 pg/célula; média). A To32 derivada de E. coli foi utilizada na quantificação em análises de Western blot.

Com a transformação transitória em protoplastos de musgo, a proteína recombinante excretada atingiu rendimentos de até 5 pg/mL cada 24 h, no caso de uma proteína do tipo taumatina (To32) tendo capacidade de ligação a CD4.

Comparação com outros sistemas

Fiebich et al. (1993) descreveram a expressão recombinante e a secreção do VEGF em células de insecto infectadas com baculovírus. Atingiram níveis de 3 - 5 pg de VEGF/mL por 2 - 4 x 106 células (média por célula = 1,33 pg). No caso de protoplastos de musgo transformados de forma transitória, atingiu-se níveis de secreção de 130 ng de VEGF/mL por 6,6 x 104 células (média por célula = 1,95 pg). A transformação transitória de protoplastos de musgo com a sequência de codificação da proteína do tipo taumatina To32 teve por resultado 5 pg/mL por 6,6 x 104 células (média por célula = 75 pg) durante 24 h.

Exemplo 3: Produção transitória de anticorpos em protoplastos do Physcomitrella patens

Vectores de expressão

Os vectores de expressão são gerados por produtos de Pfu-proof-reading-PCR de clonagem blunt de cadeia pesada (CP; 1 410 bp) ou leve (CL; 711 bp) , respectivamente, no local 41 de restrição Smal do pRTIOl (Tõpfer et al. (1987), NAR, 15, pág. 5 8 90) . Como modelo recorre-se ao homólogo de CL kapa humano (n.° de registo do GENBANK BC005332, contido no clone IMAGE 3934658; ver a sequência em baixo) e, no caso da CP, um constructo de ADN sintético (ver a sequência em baixo) , que é uma fusão do precursor de CP da IgG humana (n.° de registo do GENBANK AF135164) e da região constante de CP da IgG4 humana (n.° de registo do GENBANK K01316) . Condições de PCR: 2 min 94°C; 30 ciclos: 20 s 94°C/10 s 50°C/1 min/kb 72°C; extensão: 10 min, utilizando primers com 22 nucleótidos de comprimento, começando com o códão de iniciação ou de terminação correspondente, respectivamente. Nestes constructos de expressão, encontram-se o promotor CaMV 35S, as sequências de CP ou de CL de codificação, inclusive os respectivos péptidos de sinal endógenos correspondentes (sinais de selecção da secreção) e, como terminador de transcrição, utiliza-se o sinal de terminação CaMV 35S. N.2 de registo do GENBANK BC005332 (bp 21 - 731): 5'-

ATGGACATGAGAGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGAC

ATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTCGGAGACACAGTCACCATCACTTGTCGG

GCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTCCCTG

ATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCAATCAAAGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAT

TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAAAAGT

TATCCTGTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC

ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC

TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT

GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC

TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCAACAGGGGAGAGTGTTAG -3' 42

Constructo sintético de CP: bp 1-437: n.° de registo do GENBANK AF135164 bp 438-1 410: n.° de registo do GENBANK K01316 (intrões removidos) 5'- ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG GTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACTT ATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGACTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACACTGTATCTGGAAATGAACAGCCTGAGAACCGAGGACACGGCCACATATTACTGT GCGAAAGATCTCATGGCTCGGGGAGTCACCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAAAGGTC ACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCC GAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCA CCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGG TACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAG AAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA -3'

Transformação transitória O protocolo é o mesmo acima descrito. Em cada transformação, os vectores de expressão para as duas cadeias, CP e CL, são co-transformados utilizando 20 micrograma de ADN plasmídico super-enrolado não cortado por constructo. Tira-se amostras passadas 48 horas. 43

Verificação do produto

Detecção de montagens de cadeia leve e pesada

Revestimento: CL Kapa anti-humana (Sigma, cat# K4377; 1/300 em tampão de revestimento (ver em baixo).

Conjugado: conjugado de peroxidade IgG4 anti-humana (Sigma, cat# A2290; 1 : 1 000 em PBS (ver em baixo)+BSA a 0,1%).

Padrão: Kapa de IgG4 humana (40 ng/mL de TBS 2 0 mM (pH de 8,0) Sigma, cat# 14639), com diluição em série por 8 vezes (em PBS + BSA a 0,1%) de 1:2 para o ensaio (diluição até 256 vezes).

Protocolo: revestimento de placa ELISA de 96 poços com 50 pL/poço de solução de revestimento. Pernoita nos 4°C. A solução é removida com um movimento de agitação rápido e lava-se três vezes com 100 pL/poço com PBS-T (ver em baixo). Depois a placa é bloqueada com 200 pL/poço de PBS + BSA a 1%. Permanência durante 90 minutos nos 37°C. A solução de bloqueio é removida com um movimento de agitação rápido, lava-se três vezes com 100 pL/poço com PBS-T e aplica-se 50 pL/poço de padrões/amostras. Permanência durante 90 minutos nos 37°C. Lavou-se a placa três vezes com 100 pL/poço com PBS-T. Aplicou-se o conjugado com 100 pL/poço. Permanência durante 40 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se a placa três vezes com 100 pL/poço com PBS-T. Ad 100 pL/poço de TMB (trimet ilbenzidina; Dunn Labortechnik; cat# TMBE-500), interrupção da reacção passados 10 minutos, através da adição de 50 pL/poço de H2S04 2 M. Medição da absorção nos 450 nm (comprimento de onda de referência: 610 nm; leitor ELISA: Labsystems Multiskan RC). 44

Tampão de revestimento: titulação de 70 mL de Na2C03 0,1 M (10,6 g/L, anidro) com 175 mL de NaHCC>3 0,2 M (16,8 g/L, anidro). 10 x PBS: 20 mL de KH2P04 1 M/80 mL de K2HP04 1 M/87, 66 g de NaCl ad 1 000 mL de PBS-T: PBS/0,05% (v/v) de Tween 20

Resultados

Detecção de montagens de cadeia leve e pesada

Detecta-se as montagens de cadeia leve e pesada em diversas experiências independentes.

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Tabela 1: Expressão transitória e secreção do VEGF121 em protoplastos de musgo, recorrendo a diferentes sequências peptidicas líderes e a delecções das mesmas.

Constructo Média rh VEGF Percentagem pRTIOlTPVEGF C3 8,47 ng/mL +/- 1,95 100 pRTIOlTPVEGF-l C3 0,21 ng/mL +/- 0,06 2,48 Constructo Média rh VEGF Percentagem pRTl01TPTo32 C3 26,83 ng/mL +/- 6,25 100 pRTl01TPTo32-1 C3 2,18 ng/mL +/- 0,67 8,13 A construção de vectores encontra-se descrita em Métodos e Materiais. Mediu-se as quantidades de VEGF121 secretado 48 através de ELISA. Calculou-se as médias e o desvio padrão a partir de três experiências de transformação realizadas em paralelo.

Tabela 2: Expressão transitória e secreção do VEGF121 em protoplastos de musgo, recorrendo a diferentes sequências peptidicas lideres.

Constructo Média rh VEGF Percentagem PRTIOlTPVEGF C3 41,7 ng/mL +/- 6,9 100 PRT101TPTo32 C3 123,3 ng/mL +/- 11,1 295 A construção de vectores encontra-se descrita em Métodos e Materiais. Mediu-se as quantidades de VEGFm secretado através de ELISA. Calculou-se as médias e o desvio padrão a partir de três experiências de transformação realizadas em paralelo.

Tabela 3: Taxas de secreção (por 24 h) do VEGF121 em protoplastos de musgo transformados de forma transitória com cultura em diferentes meios.

Meio 24 h 48 h 72 h 96 h Rendimento total 3M 1,72 ng/mL 5,85 ng/mL 4,48 ng/mL 4,3 ng/mL 16,35 ng/mL W5 6,25 ng/mL 7,05 ng/mL 5,05 ng/mL 2,43 ng/mL 20,77 ng/mL MMS 5,12 ng/mL 5,54 ng/mL 4,68 ng/mL 0,86 ng/mL 15,20 ng/mL

As taxas de secreção são calculadas como descrito em Métodos e Materiais. Calculou-se as médias com base em três experiências de transformação realizadas em paralelo. Empregou-se o constructo pRTIOlTPVEGF na transformação.

Lisboa, 7 de Setembro de 2010

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção transitória de uma ou mais proteínas extracelulares não-vegetais num protoplasto de musgo, indo esse método contemplar as etapas de transformar de forma transitória o protoplasto com um constructo de ácido nucleico, que inclui (a) sequência(s) nucleotídica(s) heteróloga(s) que codifica(m) a(s) referida(s) proteína (s) não-vegetal(ais), ligada(s) de forma operante a um promotor, e a cultura do protoplasto transformado, de modo a produzir a(s) referida (s) proteína(s) não-vegetal (ais), sendo que essa cultura ocorre pelo menos durante 48 horas num meio de cultura seleccionado do grupo composto por W5, 3M e MMS.

2. Um método de acordo com a reivindicação 1, englobando ainda a etapa de obter a(s) referida(s) proteína(s) não-vegetal (ais) do meio de cultura.

3. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o protoplasto é do Physcomitrella patens.

4. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que o volume do meio de cultura vai de 50 pL a 1 000 pL.

5. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que o volume do meio de cultura vai de 100 pL a 600 pL.

6. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o volume do meio de cultura vai de 100 pL a 300 pL.

7. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que o volume do meio de cultura é de 200 pL +/- 50 pL. 2

8. Um método de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o ácido nucleico heterólogo contém duas ou mais sequências nucleotidicas heterólogas.

9. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que os ácidos nucleicos se encontram presentes num único constructo de vector.

10. Um método de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o promotor é um promotor indutivel.

11. Um método de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que a sequência nucleotídica heteróloga codifica uma proteína ou um polipéptido que é uma proteína animal.

12. Um método de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que a sequência nucleotídica heteróloga codifica uma proteína ou um polipéptido que é uma proteína de mamífero.

13. Um método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a sequência nucleotídica heteróloga codifica uma proteína seleccionada do grupo composto por um heterodímero, um anticorpo de fusão, uma imunoglobulina e um anticorpo de cadeia simples.

14. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, em que a sequência nucleotídica heteróloga codifica uma proteína ou um polipéptido que é uma proteína fúngica.

15. Um método de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, 3 3 uma em que a sequência nucleotídica heteróloga codifica proteína ou um polipéptido que é uma proteína bacteriana Lisboa, 7 de Setembro de 2010