PT1461428E - Método para produção de anticorpos híbridos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS HÍBRIDOS"

CAMPO TÉCNICO A presente descrição refere-se a anticorpos híbridos e fragmentos de anticorpos híbridos derivados de uma espécie que, de um modo preferido, se ligam a um objecto alvo e que têm uma reduzida imunogenicidade numa espécie diferente.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA RELACIONADA

Os anticorpos são proteínas produzidas por linfócitos, conhecidos por células B, em vertebrados, em resposta a estimulação por antigénios. A unidade estrutural básica de uma molécula de anticorpo (também conhecida por imunoglobulina (Ig)) consiste em quatro cadeias polipeptídicas reunidas na forma de uma letra maiúscula "Y". Duas das quatro cadeias são cadeias leves (L) idênticas e duas são cadeias pesadas (H) idênticas. Há cinco tipos diferentes (isótipos) de cadeias pesadas que dividem os anticorpos em cinco classes, nomeadamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Além disso, há dois isótipos diferentes de cadeias leves, designados κ e λ. Cada classe de cadeias pesadas pode combinar-se com qualquer das cadeias leves. As cadeias pesada e leve contêm, cada, uma região variável (VH e VL, respectivamente) que está envolvida na ligação de antigénio e uma região constante (C) . 0 sítio de ligação do antigénio é composto por seis regiões hipervariáveis (também conhecidas por 1 regiões determinantes de complementaridade (CDR)). Três CDR da cadeia pesada e três CDR da cadeia leve estão, respectivamente, posicionadas entre quatro folhas β antiparalelas relativamente conservadas que são denominadas regiões de estrutura (FR1, FR2, FR3 e FR4), em cada cadeia. Por convenção, foram utilizados sistemas de numeração para designar a localização das partes componentes das cadeias VH e VL. A definição de Kabat baseia-se na variabilidade de sequência e a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de gancho estruturais.

Para cada tipo de cadeia de Ig sintetizada por células B, há um agregado separado de segmentos génicos, conhecidos por genes de linha germinal, a partir do qual uma cadeia polipeptídica simples é sintetizada. Cada agregado está localizado num cromossoma diferente e, tipicamente, contém um número relativamente grande de segmentos génicos codificando a região V e um número menor de segmentos génicos codificando a região C. Cada região V de cadeia leve é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos, agrupada a partir de dois tipos de segmentos génicos de linha germinal, i. e., um segmento génico V longo, um segmento génico de união (J) curto e um segmento C. A cadeia pesada é codificada por quatro tipos de segmentos génicos de linha germinal, três para a região variável e um para a região constante. Os três segmentos génicos de linha germinal que codificam a região variável de cadeia pesada são um segmento V, um segmento J e um segmento de diversidade (D) . As sequências génicas de V, D e J de linha germinal humana foram caracterizadas. Os segmentos génicos de VH de linha germinal humana (esses "segmentos" também são aqui referidos por membros de família) são classificados em sete famílias (VH1-VH7), com base na homologia de sequência de, pelo menos, 80%. Ver, e. g-, Matsuda, et ai. J. Exp. Med. (1998) 188:2151-2162. Há, 2 aproximadamente, cinquenta segmentos de VH (membros de família). As primeiras duas CDR e três regiões de estrutura da região variável de cadeia pesada são codificadas por VH. A CDR3 é codificada por alguns nucleótidos de VH, a totalidade de DH e parte de JH, enquanto a FR4 é codificada pelo restante do segmento génico de JH. Com respeito a cadeias leves, os segmentos génicos de V Kapa (Vk) ou V lambda (VX) (membros de família), codificam as primeiras duas CDR e três regiões de estrutura da região V, juntamente com alguns resíduos de CDR3.

Os segmentos de J Kapa (Jk) e J Lambda (JX) codificam o restante da região CDR3 numa região Vk ou VX, respectivamente. 0 ADN codificando a cadeia κ inclui, aproximadamente, quarenta segmentos de Vk (membros de família) que são classificados em seis famílias (Vk I-Vk VI), com base na homologia de sequência. 0 ADN codificando a cadeia X inclui, aproximadamente, trinta e um segmentos de VX (membros de família) que são classificados em dez famílias. Ver as Fig. 1, 2, 3 e 6.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos tornaram-se agentes terapêuticos promissores com respeito a diversas doenças humanas, em quadros agudos e crónicos. Há vários métodos sendo utilizados para produzir anticorpos, incluindo a tecnologia de hibridoma, apresentação bacteriana, apresentação de ribossoma, apresentação de levedura e expressão recombinante de fragmentos de anticorpos humanos na superfície de bacteriófago replicativo. Os anticorpos monoclonais (mAb) que podem ser produzidos por hibridomas, foram, durante muitos anos, aplicados com sucesso como diagnóstico, mas a sua utilização como agentes terapêuticos está apenas a emergir. A grande maioria dos mAb é de origem não humana (maioritariamente roedora), colocando o problema de imunogenicidade em humanos. Quando os anticorpos de origem roedora são administrados a humanos, são produzidos anticorpos 3 anti-roedor que resultam em eliminação melhorada do anticorpo roedor do soro, bloqueando o seu efeito terapêutico e reacções de hipersensibilidade. Estas limitações desencadearam o desenvolvimento de tecnologias de engenharia, conhecidas por "humanização".

As primeiras estratégias de humanização eram baseadas no conhecimento de que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve eram responsáveis pela ligação ao antigénio e os domínios constantes pela função efectora. Os anticorpos quiméricos foram criados, por exemplo, através da transplantação de domínios variáveis de um mAb de roedor nos domínios constantes de anticorpos humanos (e. g· , Neuberger MS, et al. , Nature 314, 268-70, 1985 e Takeda, et al., Nature 314, 452-4, 1985). Embora estes anticorpos quiméricos induzissem melhores funções efectoras em humanos e exibissem reduzida imunogenicidade, a região variável de roedor ainda colocava o risco de indução de uma resposta imunitária. Quando se reconheceu que os domínios variáveis consistiam numa estrutura de folha beta, encimada por ganchos de ligação de antigénio (regiões determinantes de complementaridade ou CDR), os anticorpos humanizados foram concebidos para conterem as CDR de roedor enxertadas numa estrutura humana. Vários sítios de ligação de antigénio diferentes foram transferidos com sucesso para uma única estrutura humana utilizando, frequentemente, um anticorpo onde todas as regiões de estrutura humanas tinham a homologia mais próxima à sequência de roedor (e. g. , Jones PT, et al. , Nature 321, 522-5, 1986; Riechmann L. et al., Nature 332, 323-327, 1988 e Sato K. et al., Mol. Immunol. 31, 371-8, 1994).

Alternativamente, as estruturas humanas de consenso eram construídas com base em várias cadeias pesadas humanas (e. g., Cárter P. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89, 487-99, 1992). 4

Contudo, o enxerto de CDR simples resultava, frequentemente, em perda de afinidade de antigénio. Para recriar o sitio de ligação do antigénio, tinham de ser consideradas outras possíveis interacções entre a estrutura de folha β e os ganchos (Chothia C, et ai., Mol. Biol. 196, 901-917, 1987). A comparação dos resíduos de estrutura essenciais requeridos na humanização de vários anticorpos, assim como a modelação computorizada baseada nas estruturas cristalinas de anticorpo, revelou um conjunto de resíduos de estrutura, designados por "resíduos de zona Vernier" (Foote J., et al., Mol Biol 224, 487-99, 1992) que, muito provavelmente, contribuem para a integridade do sítio de ligação. Além disso, vários resíduos na zona de interface de VH-VL poderão ser importantes na manutenção de afinidade para o antigénio (Santos AD, et ai., Nucleic Acid Res Mol Biol 60, 169-94 1998). Inicialmente, os resíduos de estrutura eram mutados, por etapas, de volta até à sequência de roedor (Kettleborough CA, et ai. Protein Engin. 4, 773-783, 1991). Contudo, esta abordagem de mutação consome muito tempo e não consegue abranger todos os resíduos importantes.

Os seguintes são exemplos de documentos descrevendo a humanização de diferentes anticorpos: i) QU Z ET AL: "HUMANIZAÇÃO DE IMMU31, UM ANTICORPO ESPECÍFICO DE ALFA-FETOPROTEÍNA", CLINICAL CÂNCER RESEARCH, THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CÂNCER RESEARCH, EUA, vol. 5, n° 10, SUPL. , Outubro de 1999 (1999-10), páginas 3095S-3100S; ii) LEUNG S-0 ET AL: "Construção e caracterização de um anticorpo de leucemia/linforna humanizado, internalizante, específico de célula B (CD22), LL2", MOLECULAR IMMUNOLOGY, ELMSFORD, NI, EUA, vol. 32, n° 17/18, Dezembro de 1995 (1995-12), páginas 5 1413-1421; iii) Documentos US 6254868 e EP 0939127A (PROTEIN DESIGN LABS, INC), 1 de Setembro de 1999.

Para qualquer anticorpo particular, um pequeno conjunto de alterações pode ser suficiente para optimizar a ligação, contudo é difícil seleccionar do conjunto de resíduos de Vernier e VH/VL. As abordagens de biblioteca combinatória, combinadas com tecnologias de selecção (tal como a apresentação fágica), revolucionaram as tecnologias de humanização, através da criação de uma biblioteca de moléculas humanizadas que representam alternativas entre a sequência roedora e humana em todos os resíduos de estrutura importantes e permitem a determinação simultânea de actividade de ligação de todas as formas humanizadas (e. g. Rosok MJ, J Biol Chem, 271, 22611-8, 1996 e

Baca M, et al. J Biol Chem 272, 10678-84, 1997).

As abordagens acima utilizam regiões de estrutura integrais de uma única cadeia pesada variável ou leve variável de anticorpo para receber as CDR. É vantajoso proporcionar anticorpos manipulados altamente homólogos, baseados em anticorpos de uma espécie originadora que exibam imunogenicidade reduzida enquanto matêm um perfil de ligação óptimo, que possam ser administrados a uma espécie alvo para efeitos terapêuticos e de diagnóstico.

SUMÁRIO

Num aspecto, é proporcionado um método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido que inclui proporcionar um anticorpo inicial tendo especificidade para um alvo; determinar a sequência de, pelo menos, uma porção de uma 6 região variável do anticorpo inicial; e (i) seleccionar um primeiro componente da região variável seleccionada do grupo consistindo de FR1, FR2, FR3 e FR4; comparar a seguência do primeiro componente seleccionado a seguências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos de uma espécie alvo; e seleccionar uma sequência de um anticorpo na base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o primeiro componente; (i i) seleccionar um segundo componente da região variável que é diferente do primeiro componente, o segundo componente seleccionado do grupo consistindo de FR1, FR2, FR3 e FR4; comparar a sequência do segundo componente a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos da espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o segundo componente e que é de um anticorpo diferente do anticorpo seleccionado na etapa (i); e (iii) ligar operativamente as sequências de estrutura seleccionadas a uma ou mais CDR do anticorpo inicial para produzir um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido. 0 método descrito acima pode ser continuado, com respeito aos restantes componentes da região variável, até ser sintetizada uma região variável integral. Os componentes restantes podem ser dos mesmos anticorpos ou anticorpos diferentes dos seleccionados da base de dados nas etapas (i) e (ii) acima. 0 primeiro, segundo e/ou restantes componentes acima podem incluir uma ou mais CDR. Deve ser compreendido que, para comparação nas etapas apresentadas acima, podem ser utilizadas combinações das regiões de estrutura no primeiro, segundo e/ou restantes componentes. A região variável do anticorpo inicial pode ser uma cadeia leve variável ou uma cadeia pesada variável. As sequências referidas acima podem ser sequências de aminoácidos ou sequências de 7 ácidos nucleicos. 0 anticorpo pode ser qualquer forma conhecida de anticorpo, conhecida dos especialistas na técnica, e. g. , anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos bivalentes e semelhantes. 0 fragmento de anticorpo referido acima pode ser seleccionado do grupo consistindo de scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, cadeias leves de anticorpos e cadeias pesadas de anticorpos. A espécie alvo pode ser humana.

Numa forma de realização, a sequência da região FR1 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia. Noutra forma de realização, a sequência da região FR2 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia. Noutra forma de realização, a sequência da região FR3 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia. Noutra forma de realização, a sequência da região FR4 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia. A base de dados de referência pode conter sequências de anticorpos de linha germinal ou rearranjadas da espécie alvo.

Noutro aspecto, é proporcionado um método para a produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido que inclui proporcionar um anticorpo inicial tendo especificidade para um alvo; determinar a sequência de, pelo menos, uma porção de uma região de estrutura variável do anticorpo inicial; e (i) seleccionar um primeiro componente da região variável seleccionada do grupo consistindo de FR1, FR2 e FR3; comparar a sequência do primeiro componente da região variável a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos de uma espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o primeiro componente; e determinar a família génica de linha germinal a partir da qual a sequência foi derivada; (ii) seleccionar um segundo componente da região variável que é diferente do primeiro componente, o segundo componente seleccionado do grupo consistindo de FR1, FR2 e FR3; comparar a sequência do segundo componente a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos da espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o segundo componente e que corresponde à mesma família génica de linha germinal que a primeira sequência seleccionada da base de dados na etapa (i) deste parágrafo; e (iii) ligar operativamente as sequências de estrutura seleccionadas a uma ou mais CDR do anticorpo inicial para produzir um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido. 0 método descrito neste aspecto pode ser continuado com respeito ao terceiro componente da região de estrutura. Numa forma de realização, a FR4 é adicionada e ligada operativamente ao produto da etapa (iii) deste parágrafo e uma região variável integral é sintetizada. 0 método pode ser prolongado até que um anticorpo híbrido integral seja produzido. A região de estrutura variável do anticorpo inicial pode ser uma cadeia leve ou uma cadeia pesada. 0 primeiro, segundo e/ou terceiro componentes neste parágrafo podem incluir uma ou mais CDR. Deve ser compreendido que, para comparação nas etapas apresentadas neste parágrafo, podem ser utilizadas combinações das regiões de estrutura no primeiro, segundo e/ou terceiro componentes. 9

Numa forma de realização, duas ou mais das sequências seleccionadas da base de dados de referência são de anticorpos diferentes. As sequências referidas acima podem ser sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos. 0 anticorpo pode ser qualquer forma conhecida de anticorpo, conhecida dos especialistas na técnica, e. g., anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos bivalentes e semelhantes. 0 fragmento de anticorpo referido acima pode ser seleccionado do grupo consistindo de scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, cadeias leves de anticorpos e cadeias pesadas de anticorpos. A espécie alvo pode ser humana.

Numa forma de realização, a sequência da região FR1 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que corresponde a outra sequência seleccionada. Noutra forma de realização, a sequência da região FR2 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que corresponde a outra sequência seleccionada. Noutra forma de realização, a sequência da região FR3 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que corresponde a outra sequência seleccionada. Noutra forma de realização, a sequência da região FR4 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia. A base de dados de referência pode conter 10 sequências de linha germinal ou rearranjadas da espécie alvo. Numa forma de realização, pelo menos, duas das sequências seleccionadas correspondem ao mesmo membro de família na família génica de linha germinal.

Noutro aspecto, um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido inclui uma primeira região de estrutura de cadeia pesada de um primeiro anticorpo e uma segunda região de estrutura de cadeia pesada de um segundo anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido inclui uma terceira região de estrutura de cadeia pesada originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo e um terceiro anticorpo que não é nem o primeiro nem o segundo anticorpo. Noutra forma de realização, o anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido inclui uma quarta região de estrutura de cadeia pesada de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo, no terceiro anticorpo e um quarto anticorpo que não é nem o primeiro, nem o segundo nem o terceiro anticorpo. Numa forma de realização, as regiões de estrutura são de origem humana e as CDR são de origem não humana.

Noutro aspecto, um anticorpo híbrido inclui uma primeira região de estrutura de cadeia leve de um primeiro anticorpo e uma segunda região de estrutura de cadeia leve de um segundo anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma terceira região de estrutura de cadeia leve originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo e um terceiro anticorpo que não é nem o primeiro nem o segundo anticorpo. Noutra forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma quarta região de 11 estrutura de cadeia leve, originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo, no terceiro anticorpo e um quarto anticorpo que não é nem o primeiro, segundo, nem terceiro anticorpo. Numa forma de realização, as regiões de estrutura são de origem humana e as CDR são de origem não humana.

Noutro aspecto, um anticorpo híbrido inclui uma primeira região de estrutura de cadeia pesada de um primeiro anticorpo, a primeira região de estrutura de cadeia pesada correspondendo a uma família particular de VH e uma segunda região de estrutura de cadeia pesada de um segundo anticorpo, a segunda região de estrutura de cadeia pesada correspondendo à mesma família de VH que a primeira região de estrutura de cadeia pesada. Numa forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma terceira região de estrutura de cadeia pesada originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo e um terceiro anticorpo que não é nem o primeiro nem o segundo anticorpo. A terceira região de estrutura corresponde à mesma família de VH que a primeira região de estrutura de cadeia pesada. Noutra forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma quarta região de estrutura de cadeia pesada de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo, no terceiro anticorpo e um quarto anticorpo que não é nem o primeiro, segundo nem terceiro anticorpo. Ainda noutra forma de realização, uma ou ambas da segunda região de estrutura de cadeia pesada e da terceira região de estrutura de cadeia pesada corresponde ao mesmo membro da família de VH que a primeira região de estrutura de cadeia pesada. Numa forma de realização, as regiões de estrutura são de origem humana e as CDR são de origem não humana. 12

Noutro aspecto, um anticorpo híbrido inclui uma primeira região de estrutura de cadeia leve de um primeiro anticorpo, a primeira região de estrutura de cadeia leve correspondendo a uma família particular de Vk e uma segunda região de estrutura de cadeia leve de um segundo anticorpo, a segunda região de estrutura de cadeia leve correspondendo à mesma família de Vk que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Numa forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma terceira região de estrutura de cadeia leve originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo e um terceiro anticorpo que não é nem o primeiro nem o segundo anticorpo. A terceira região de estrutura corresponde à mesma família de Vk que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Noutra forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma quarta região de estrutura de cadeia leve, originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo, no terceiro anticorpo e um quarto anticorpo que não é nem o primeiro, segundo nem terceiro anticorpo. Ainda noutra forma de realização, uma ou ambas da segunda região de estrutura de cadeia leve e da terceira região de estrutura de cadeia leve corresponde ao mesmo membro da família de Vk que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Numa forma de realização, as regiões de estrutura são de origem humana e as CDR são de origem não humana.

Noutro aspecto, um anticorpo híbrido inclui uma primeira região de estrutura de cadeia leve de um primeiro anticorpo, a primeira região de estrutura de cadeia leve correspondendo a uma família particular de VX e uma segunda região de estrutura de cadeia leve de um segundo anticorpo, a segunda região de estrutura de cadeia leve correspondendo à mesma família de VX que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Numa forma de 13 realização, o anticorpo híbrido inclui uma terceira região de estrutura de cadeia leve originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo e um terceiro anticorpo que não é nem o primeiro nem o segundo anticorpo. A terceira região de estrutura corresponde à mesma família de VX que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Noutra forma de realização, o anticorpo híbrido inclui uma quarta região de estrutura de cadeia leve, originária de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo no primeiro anticorpo, no segundo anticorpo, no terceiro anticorpo e um quarto anticorpo que não é nem o primeiro, segundo nem terceiro anticorpo. Ainda noutra forma de realização, uma ou ambas da segunda região de estrutura de cadeia leve e da terceira região de estrutura de cadeia leve corresponde ao mesmo membro da família de VX que a primeira região de estrutura de cadeia leve. Numa forma de realização, as regiões de estrutura são de origem humana e as CDR são de origem não humana.

Noutro aspecto, é proporcionada uma biblioteca de anticorpos ou fragmentos de anticorpos que inclui anticorpos híbridos e/ou fragmentos de anticorpos híbridos de acordo com a presente divulgação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um quadro representando genes de linha germinal do lócus do gene de Vk. É mostrado o alinhamento da sequência de aminoácidos do exão de Vk. Os alinhamentos, numeração e regiões de gancho estão de acordo com os critérios estruturais definidos por Chothia. As CDR estão de acordo com Kabat, et al. 14 A FIG. 2 é um quadro representando genes de linha germinal do lócus do gene de VH. É mostrado o alinhamento da sequência de aminoácidos do exão de VH. Os alinhamentos, numeração e regiões de gancho estão de acordo com os critérios estruturais definidos por Chothia. As CDR estão de acordo com Kabat, et al. A FIG. 3 é um quadro representando genes de linha germinal do lócus do gene de VX. É mostrado o alinhamento da sequência de aminoácidos do exão de VX. Os alinhamentos, numeração e regiões de gancho estão de acordo com os critérios estruturais definidos por Chothia. As CDR estão de acordo com Kabat, et al. de aminoácidos anticorpo murino (i. e., a cadeia sequência nos A FIG. 4A representa a sequência (SEQ ID N° 123) de uma cadeia leve variável de dirigida à lectina de ligação de manose humana leve do anticorpo inicial), separando a componentes de estrutura e CDR. A FIG. 4B representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 124) do número 3747016 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 4C representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 125) do número 5833827 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 4D representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 126) do número 722614 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. 15 A FIG. 4E representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 127) do número 1785870 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 4F representa a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo humanizado híbrido (SEQ ID N° 128), separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. É proporcionada a percentagem de homologia de cada região de estrutura com a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial da FIG. 4A. A FIG. 4G é um quadro mostrando o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo monoclonal murino (ver a FIG. 4F) e a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial (ver a FIG. 4A) , em termos apenas das regiões de estrutura, apenas CDR e cadeia de Vk intacta. Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo monoclonal murino e a sequência de linha germinal humana mais semelhante VkVI (A10/A26). Também é mostrado o grau de homologia entre a cadeia leve variável enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante, obtida por métodos da técnica anterior e a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial. Também é mostra a VL enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante versus a sequência de linha germinal humana mais semelhante VkVI (A14). A FIG. 4H representa uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 129), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando a cadeia leve variável integral do anticorpo monoclonal murino inicial representado na FIG. 4a. 16 A FIG. 41 representa uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 130), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando apenas as regiões de estrutura combinadas da cadeia leve variável do anticorpo monoclonal murino inicial representado na FIG. 4a. A FIG. 5A representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 131) de uma cadeia pesada variável de anticorpo murino dirigida à lectina de ligação de manose humana (i. e., a cadeia pesada do anticorpo inicial), separando a sequência nos componentes de estrutura e CDR. A FIG. 5B representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 132) do número 563649 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 5C representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 133) do número 951263 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 5D representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 134) do número 484852 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 5E representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 135) do número 2367531 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. 17 A FIG. 5F representa a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo humanizado híbrido (SEQ ID N° 136), separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. É proporcionada a percentagem de homologia de cada região de estrutura com a cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino inicial da FIG. 5a. A FIG. 5G é um quadro mostrando o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino (ver a FIG. 5F) e a cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino inicial (ver a FIG. 5A) , em termos apenas das regiões de estrutura, apenas CDR e cadeia de VH intacta. Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino e a sequência de linha germinal humana mais semelhante VH4-31. Também é mostrado o grau de homologia entre a cadeia pesada variável enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante, obtida por métodos da técnica anterior e a cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino inicial. Também é mostrado o grau de homologia entre a VH enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante versus a sequência de linha germinal mais semelhante VH4-31. A FIG. 5H representa uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 137), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando a cadeia pesada variável integral do anticorpo murino representado na FIG. 5A. A FIG. 51 representa uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 138), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando apenas as regiões de estrutura combinadas da cadeia pesada variável do anticorpo monoclonal murino representado na FIG. 5A. 18 A FIG. 6 é um quadro representando os genes de linha germinal traduzidos dos loci dos genes de JH, JK e JL, em termos de alinhamento de sequência de aminoácidos. A FIG. 7 representa as sequências de ácidos nucleicos (SEQ ID N° 154) e aminoácidos (SEQ ID N° 155) da cadeia leve variável humanizada híbrida e da sequência de ácidos nucleicos (SEQ ID N° 156) e sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 157) da cadeia pesada variável humanizada híbrida e indica as posições de particulares nucleótidos e aminoácidos que foram alterados, em comparação com as sequências de anticorpos murinos iniciais. As regiões de estrutura estão sublinhadas e os nucleótidos e aminoácidos alterados estão a negrito. A FIG. 8 representa as sequências nucleotídicas de cadeias oligonucleotídicas que foram utilizadas para mutagénese dirigida pontual das cadeias leve variável e pesada variável de anticorpos murinos iniciais. , As cadeias são designadas como se segue para VL: Oligo 1 (SEQ ID N 0 158) , Oligo 2 (SEQ ID N° 159) f Oligo 3 (SEQ ID N° 160) , Oligo 4 (SEQ ID N° 161) r Oligo 5 (SEQ ID N° 162) , Oligo 6 (SEQ ID N° 163) r Oligo 7 (SEQ ID N° 164); para VH: Oligo 8 (SEQ ID N° 165) r Oligo 9 (SEQ ID N° 16 6), Oligo 10 (SEQ ID N° 167) r Oligo 11 (SEQ ID N° 168) , Oligo 12 (SEQ ID N° 169) t Oligo 13 (SEQ ID N° 170) , Oligo 14 (SEQ ID N° 171) A FIG. 9A representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 172) de uma cadeia leve variável de anticorpo murino dirigida a h-DC-SIGN-Fc (i. e., a cadeia leve do anticorpo inicial), separando a sequência nos componentes de estrutura e CDR. 19 A FIG. 9B representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 172 e 174) dos números 441333 e 5578780 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 9C representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 175 e 176) dos números 4324018 e 18041766 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 9D representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 177) dos números 553476 e 33251 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 9E representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 178) do número 446245 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia leve variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 9F representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve de anticorpo humanizado hibrido (SEQ ID N° 179, 180 e 181), separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. É proporcionada a percentagem de homologia de cada região de estrutura com a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial da FIG. 9A. A FIG. 9G é um quadro mostrando o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo monoclonal 20 murino (ver a FIG. 9F) e a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial (ver a FIG. 9A) , em termos apenas das regiões de estrutura, apenas CDR e cadeia de Vk intacta. Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo monoclonal murino e a sequência de linha germinal humana mais semelhante. Também é mostrado o grau de homologia entre a cadeia leve variável enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante, obtida por métodos da técnica anterior e a cadeia leve de anticorpo monoclonal murino inicial. Também é mostra a VL enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante versus a sequência de linha germinal humana mais semelhante. A FIG. 9H representa uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 182), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando a cadeia leve variável integral do anticorpo monoclonal murino inicial (excluindo as CDR) representado na FIG. 9A. A FIG. 10A representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 183) de uma cadeia pesada variável de anticorpo murino dirigida a h-DC-SIGN-Fc (i. e., a cadeia pesada do anticorpo inicial), separando a sequência nos componentes de estrutura e CDR. A FIG. 10B representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 184 e 185) dos números 8698373 e 392677 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. 21 A FIG. 10C representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 186 e 187) dos números 886288 e 999106 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 10D representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 188) do número 5542538 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 10E representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 189, 190 e 191) dos números 4530559, 5834122 e 106709 de identificação do gene (GI) da sequência de cadeia pesada variável de anticorpo humano, separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. A FIG. 10F representa as sequências de aminoácidos de uma cadeia pesada de anticorpo humanizado híbrido (SEQ ID N° 192 e 193), separando a sequência nas partes componentes de estrutura e CDR. É proporcionada a percentagem de homologia de cada região de estrutura com a cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino inicial da FIG. 10A. A FIG. 10G representa sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 194 e 195), resultando de uma pesquisa BLAST no Genbank, utilizando a cadeia pesada variável integral do anticorpo murino representado na FIG. 10A. A FIG. 10H é um quadro mostrando o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino (ver a FIG. 10F) e a cadeia pesada de 22 anticorpo monoclonal murino inicial (ver a FIG. 10A), em termos apenas das regiões de estrutura, apenas CDR e cadeia de VH intacta. Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada hibrida da cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino e a sequência de linha germinal humana mais semelhante. Também é mostrado o grau de homologia entre a cadeia pesada variável enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante, obtida por métodos da técnica anterior e a cadeia pesada de anticorpo monoclonal murino inicial. Também é mostrado o grau de homologia entre a VH enxertada de CDR rearranjada humana mais semelhante versus a sequência de linha germinal mais semelhante. A FIG. 11 mostra os resultados de experiências de ELISA de competição, envolvendo um anticorpo de acordo com a presente divulgação e anticorpos comparativos. A FIG. 12 mostra os resultados do teste de afinidade de ligação no anticorpo inicial e um anticorpo híbrido dirigido para a lectina de ligação de manana (MBL). A FIG. 13 mostra os resultados do testa de afinidade de ligação no anticorpo inicial e anticorpos híbridos dirigidos para h-DC-SIGN-Fc.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

As técnicas aqui descritas proporcionam anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos (colectivamente aqui referidos como "híbridos") que são activos contra um objecto alvo e que, quando administrados a uma espécie alvo, reduzem o risco de imunogenicidade. A presente divulgação proporciona 23 técnicas que maximizam a homologia entre regiões de estrutura de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, obtidos de uma espécie originadora e os de uma espécie alvo. Os híbridos que foram construídos por incorporação de regiões de estrutura altamente homólogas a partir de dois ou mais anticorpos de uma espécie alvo e que foram manipulados de acordo com a presente divulgação mantêm um elevado grau de afinidade para o objecto alvo reduzindo, simultaneamente, o risco de uma resposta imunitária adversa quando administrados à espécie alvo. Além disso, os híbridos que foram construídos por incorporação de regiões de estrutura altamente homólogas a partir de um ou mais anticorpos de uma espécie alvo que correspondem à mesma família de sequências génicas de linha germinal e que foram manipulados de acordo com a presente divulgação também mantêm um elevado grau de afinidade para o objecto alvo reduzindo, simultaneamente, o risco de uma resposta imunitária adversa quando administrados à espécie alvo. Numa forma de realização, a espécie alvo é humana e o anticorpo manipulado é humanizado.

Salvo aqui definido em contrário, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os significados geralmente compreendidos por alguém com conhecimentos gerais na técnica, a que pertencem os presentes ensinamentos. É aqui feita referência a diversas metodologias conhecidas dos especialistas na técnica. As publicações e outros materiais que apresentam essas metodologias conhecidas a que é feita referência, são aqui incorporados por referência na sua totalidade como, todavia, apresentados no seu todo. A prática dos métodos aqui descritos empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante e imunologia, as quais estão dentro da especialidade na técnica. Essas técnicas convencionais são explicadas totalmente na literatura. Ver, e. g., Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning; Laboratory Manual 2 a ed. (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridlzatlon (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); a série, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.) , particularmente o Vol. 154 e Vol. 155 (Wu e Grossman, eds.); PCR-A Practical Approach (McPherson, Quirke e Taylor, eds., 1991); Immunology, 2a Edição, 1989, Roitt et al. , C.V. Mosby Company e Nova Iorque; Advanced Immunology, 2a Edição, 1991, Male et al., Grower Medicai Publishing, Nova Iorque; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed); Transcription and Translation, 1984 (Hames e Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R.I. Freshney ed.);

Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning e Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., Cold

Spring Harbor Laboratory); documento W097/08320; Patente US. N° 5427908; 5885793; 5969108; 5565332; 5837500; 5223409; 5403484; 5643756; 5723287; 5952474; Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86; Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 88:7978-7982; Schaffitzel et al. 1999, J. Immunol.

Meth. 10:119-135; Kitamura, 1998, Int. J. Hematol., 67:351-359;

Georgiou et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15:29-34; Little, et al., 1995, J. Biotech. 41:187-195; Chauthaiwale et al., 1992, Microbiol. Rev., 56:577-591; Aruffo, 1991, Curr. Opin.

Biotechnol. 2:735-741; McCafferty (Editor) et al., 1996, Antibody Engineering: A Practical Approach, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

Quaisquer materiais e/ou métodos adequados conhecidos dos especialistas podem ser utilizados na realização dos métodos 25 aqui descritos; contudo, descrevem-se os materiais e/ou métodos preferidos. Os materiais, reagentes e semelhantes a que é feita referência na seguinte descrição e exemplos, salvo indicação em contrário, são obteníveis de fontes comerciais.

Os anticorpos híbridos e fragmentos de anticorpos híbridos incluem moléculas de anticorpos completas tendo cadeias pesadas e leves de comprimento completo, ou qualquer seu fragmento, tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, cadeias leves de anticorpos e cadeias pesadas de anticorpos. Os anticorpos quiméricos que têm regiões variáveis como aqui descritas e regiões constantes de diversas espécies também são adequados.

Inicialmente, é escolhido um objecto alvo predeterminado para o qual um anticorpo pode ser deduzido. As técnicas para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos para objectos alvo são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Os exemplos dessas técnicas incluem mas não estão limitados aos envolvendo bibliotecas de apresentação, murganhos xeno ou humab, hibridomas, etc. Os objectos alvo incluem qualquer substância que seja capaz de exibir antigenicidade e, habitualmente, são proteínas ou polissacáridos proteicos. Os exemplos incluem receptores, enzimas, hormonas, factores de crescimento, péptidos e semelhantes. Deve ser compreendido que, para utilização de acordo com a presente divulgação, são adequados não apenas os anticorpos de ocorrência natural, mas também são adequados os anticorpos e fragmentos de anticorpos manipulados que são dirigidos para um objecto alvo predeterminado.

Os anticorpos (Ab) que podem ser submetidos às técnicas aqui apresentadas incluem Ab monoclonais e policlonais e fragmentos de anticorpos, tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, 26 diacorpos, cadeias leves de anticorpos, cadeias pesadas de anticorpos e/ou fragmentos de anticorpos derivados de fago ou tecnologias de apresentação fagemídica. Para começar, um anticorpo inicial é obtido de uma espécie originadora. De um modo mais particular, é necessária a sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos da porção variável da cadeia leve, cadeia pesada ou ambas, de um anticorpo de espécie originadora, tendo especificidade para um antigénio alvo. A espécie originadora é qualquer espécie que foi utilizada para produzir os anticorpos ou bibliotecas de anticorpos, e. g., rato, murganhos, coelho, galinha, macaco, humano, etc. As técnicas para a produção e clonagem de anticorpos monoclonais são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Após a obtenção de um anticorpo desejado, as regiões variáveis (VH e VL) são separadas nas partes componentes (i. e., estruturas (FR) e CDR) utilizando qualquer definição de CDR possível (e. g., apenas Kabat, apenas Chothia, Kabat e Chothia combinadas e quaisquer outras conhecidas dos especialistas na técnica). Após a obtenção do anterior, é necessária a selecção de estruturas de espécies alvo apropriadas. Uma forma de realização envolve o alinhamento de cada região de estrutura individual a partir da sequência de anticorpo da espécie originadora, com sequências de aminoácidos ou sequências génicas variáveis da espécie alvo. Os programas para pesquisar para alinhamentos são bem conhecidos na técnica, e. g. , BLAST e semelhantes. Por exemplo, se a espécie alvo for humana, uma fonte dessas sequências de aminoácidos ou sequências génicas (sequências de anticorpos de linha germinal ou rearranjadas) pode ser consultada em qualquer base de dados de referência adequada, tal como Genbank, o banco de dados de proteínas NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), VBASE, uma base de dados de genes de anticorpos humanos (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc) e a base de dados Kabat 27 de imunoglobulinas (htstp://www.immuno.bme.nwu.edu) ou os seus produtos traduzidos. Se os alinhamentos forem feitos com base nas sequências nucleotídicas, então, devem ser analisados os genes seleccionados para determinar que genes desse subconjunto têm a homologia de aminoácidos mais próxima das espécies de anticorpos originadoras. Está contemplado que as sequências de aminoácidos ou sequências génicas que se se aproximam com um grau de homologia mais elevado, em comparação com outras sequências na base de dados, podem ser utilizadas e manipuladas de acordo com os processos aqui descritos. Além disso, as sequências de aminoácidos ou genes que têm menor homologia podem ser utilizados quando codificarem produtos que, quando manipulados e seleccionados de acordo com os processos aqui descritos, exibem especificidade para o antigénio alvo predeterminado. Em determinadas formas de realização, uma gama de homologia aceitável é superior a cerca de 50%. Deve ser compreendido que a espécie alvo pode ser outra que não a humana.

Num aspecto, após determinar o grau de homologia de uma região de estrutura individual de uma espécie originadora, i. e., FR1, FR2, FR3 ou FR4, com as correspondências mais semelhantes de dois ou mais anticorpos diferentes na base de dados de referência da espécie alvo, é seleccionado um conjunto de sequências homólogas que pode incluir, e. g., os 100 maiores acertos. Isto é feito com cada região de estrutura individual, enquanto se procuram correspondências na base de dados com a homologia mais próxima com o anticorpo da espécie originadora. Está contemplado que podem ser obtidas, pelo menos, duas das sequências seleccionadas de anticorpos diferentes na base de dados. Por exemplo, a FR1 pode provir do anticorpo um, a FR2 pode provir do anticorpo dois, a FR3 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois ou um terceiro anticorpo que não é nem o 28 anticorpo um nem o anticorpo dois e a FR4 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois, anticorpo três ou anticorpo quatro que não é nem o anticorpo um nem o anticorpo dois nem o anticorpo três, com a condição de que, pelo menos, duas FR são de anticorpos diferentes. Como outro exemplo, a FR1 pode provir do anticorpo um, a FR3 pode provir do anticorpo dois, a FR2 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois ou um terceiro anticorpo que não é nem o anticorpo um nem o anticorpo dois e a FR4 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois, anticorpo três ou anticorpo quatro que não é nem o anticorpo um nem o anticorpo dois nem o anticorpo três, com a ressalva de que, pelo menos, duas FR são de anticorpos diferentes. Como outro exemplo, a FR1 pode provir do anticorpo um, a FR4 pode provir do anticorpo dois, a FR2 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois ou um terceiro anticorpo que não é nem o anticorpo um nem o anticorpo dois e a FR3 pode provir do anticorpo um, anticorpo dois, anticorpo três ou anticorpo quatro que não é nem o anticorpo um nem o anticorpo dois nem o anticorpo três, com a ressalva de que, pelo menos, duas FR são de anticorpos diferentes. Após seleccionar os candidatos da região de estrutura adequados, são produzidas uma ou ambas das regiões variáveis das cadeias pesada e leve, como adicionalmente discutido abaixo, através do enxerto das CDR da espécie originadora nas regiões de estrutura híbridas.

Noutro aspecto, após determinar o grau de homologia de uma região de estrutura individual de uma espécie originadora, i. e., FR1, FR2, FR3 ou FR4, com as correspondências mais semelhantes das sequências de anticorpos de linha germinal ou rearranjadas, é seleccionado um conjunto de sequências homólogas que pode incluir, e. g., os 100 maiores acertos. Nesse momento, com respeito a FR1, FR2 e FR3, os membros do conjunto são 29 categorizados em famílias de linha germinal originais, i. e., VH1, VH2, VH3, etc., VkI, VkII, VkIII, etc. e VXl, VA2, VÀ3, etc. e, adicionalmente, onde possível, em membros de família. Para uma listagem mais completa de famílias e membros de família, ver as Fig. 1, 2 e 3. Embora nem sempre seja o caso, as correspondências de sequências mais semelhantes para cada região de estrutura individual provirão, tipicamente, de anticorpos ou fragmentos de anticorpos diferentes. Numa forma de realização, duas ou mais regiões de estrutura provêm de anticorpos na mesma família variável. Noutra forma de realização, duas ou mais regiões de estrutura provêm de um anticorpo diferente do mesmo membro de família. Noutra forma de realização, até três regiões de estrutura podem ser do mesmo anticorpo. Está contemplado que, embora possam existir sequências de estrutura na base de dados de uma família diferente com um grau homologia mais elevado, a sequência candidata mais preferida pode, na realidade, ter uma homologia inferior, mas ser da mesma família que as outras estruturas seleccionadas. De modo semelhante, podem existir sequências de estrutura na base de dados da mesma família com elevada homologia, mas de membros diferentes da mesma família; os candidatos mais preferidos podem ser do mesmo membro de família que as outras estruturas seleccionadas. Um critério de selecção opcional envolve verificar que sequências de estrutura se assemelham mais estreitamente às mutações somáticas contidas no anticorpo da espécie originadora. As mutações somáticas fazem com que as sequências de anticorpos sejam diferentes, mesmo se provierem do mesmo membro de família. Em determinadas formas de realização, prefere-se fazer a selecção que seja mais próxima das mutações somáticas ocorrendo na sequência da espécie originadora. 30

As regiões FR4 não são correspondentes entre famílias e membros de família de FR1, FR2 e FR3. De facto, a FR4 é codificada por segmentos J (Ver a Fig. 6) e uma escolha de sequências de FR4 adequadas pode ser determinada com base na homologia entre as sequências de FR4 de anticorpos iniciais e as sequências de FR4 mais semelhantes numa base de dados de referência. Numa forma de realização, a FR4 é escolhida com base no grau de homologia máxima entre o anticorpo inicial e os verificados em bases de dados de referência de sequências de anticorpos rearranjadas. Em determinadas formas de realização, prefere-se homologia de 100% entre a FR4 do anticorpo inicial e a FR4 seleccionada da base de dados de referência da espécie alvo. As escolhas baseadas nas bases de dados de sequências de linha germinal, embora não necessariamente completamente homólogas ao anticorpo inicial, também podem ser apropriadas. Um critério de selecção opcional envolve verificar que sequências de estrutura se assemelham mais estreitamente às mutações somáticas contidas no anticorpo da espécie originadora. As mutações somáticas fazem com que as sequências de anticorpos sejam diferentes, mesmo se provierem do mesmo membro de família. Em determinadas formas de realização, prefere-se fazer a selecção que seja mais próxima das mutações somáticas ocorrendo na sequência da espécie originadora.

Após seleccionar os candidatos da região de estrutura adequados da mesma família e/ou membro de família, são produzidas uma ou ambas das regiões variáveis das cadeias pesada e leve, através do enxerto das CDR da espécie originadora nas regiões de estrutura híbridas. O agrupamento de anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos tendo regiões de cadeia variável híbrida, com respeito a qualquer dos aspectos acima, pode ser alcançado utilizando métodos convencionais 31 conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, as sequências de ADN codificando os domínios variáveis híbridos aqui descritos (i. e., estruturas baseadas na espécie alvo e CDR da espécie oriqinadora) podem ser produzidas por síntese oligonucleotídica e/ou PCR. As regiões de CDR codificando ácidos nucleicos também podem ser isoladas dos anticorpos das espécies originadoras, utilizando enzimas de restrição adequadas e ligadas na estrutura da espécie alvo, através da ligação com enzimas de ligação adequadas. Alternativamente, as regiões de estrutura das cadeias variáveis do anticorpo da espécie originadora podem ser alteradas por mutagénese dirigida pontual.

Visto que os híbridos são construídos a partir de escolhas entre múltiplos candidatos correspondendo a cada região de estrutura, existem muitas combinações de sequências que são passíveis de construção de acordo com os princípios aqui descritos. Consequentemente, as bibliotecas de híbridos podem ser agrupadas tendo membros com combinações diferentes de regiões de estrutura individuais. Essas bibliotecas podem ser colecções de bases de dados electrónicas de sequências ou colecções físicas de híbridos. 0 agrupamento de uma biblioteca física de anticorpos ou fragmentos de anticorpos é, de um modo preferido, alcançado utilizando oligonucleótidos sintéticos. Num exemplo, os oligonucleótidos são concebidos para terem regiões de sobreposição, de modo que possam emparelhar-se e ser preenchidas por uma polimerase, tal como com a reacção de polimerização em cadeia (PCR). São realizadas múltiplas etapas de extensão de sobreposição, para produzir os insertos génicos de VL e VH. Os fragmentos são concebidos com regiões de sobreposição com domínios constantes humanos, para que possam ser fundidos por 32 extensão de sobreposição, para produzir cadeias leves de comprimento completo e fragmentos de cadeia pesada de Fd. As regiões de cadeia leve e pesada de Fd podem ser ligadas entre si por extensão de sobreposição, para criar um único inserto de biblioteca Fab a ser clonado num vector de apresentação. Também podem ser utilizados métodos alternativos para o agrupamento dos genes de biblioteca humanizados. Por exemplo, a biblioteca pode ser agrupada a partir de oligonucleótidos de sobreposição, utilizando uma abordagem de Reacção em Cadeia da Ligase (LCR). Ver, e. g. , Chalmers e Curnow, Biotechniques (2001) 30-2, p. 249-252.

Para criar uma biblioteca de anticorpos híbridos ou biblioteca de fragmentos de anticorpos híbridos, diversas formas de fragmentos de anticorpos podem ser produzidas e clonadas num vector apropriado. Por exemplo, os genes variáveis podem ser clonados num vector que contenha, em fase, a restante porção do domínio constante necessário. Os exemplos de fragmentos adicionais que podem ser clonados incluem cadeias leves intactas, a porção Fd de cadeias pesadas ou fragmentos que contêm a sequência codificante de cadeia leve e cadeia pesada de Fd. Alternativamente, os fragmentos de anticorpos utilizados para humanização podem ser anticorpos de cadeia simples (scFv).

Pode ser utilizado qualquer sistema de apresentação de selecção em conjunto com uma biblioteca de acordo com a presente divulgação. Os protocolos de selecção para o isolamento de membros desejados de bibliotecas de grandes dimensões são conhecidos na técnica, como tipificados por técnicas de apresentação fágica. Esses sistemas, nos quais diversas sequências peptídicas são apresentadas na superfície do bacteriófago filamentoso (Scott e Smith (1990) Science, 249: 33 386), provaram ser úteis para criar bibliotecas de fragmentos de anticorpos (e as sequências nucleotidicas que os codificam) para a selecção e amplificação in vitro de fragmentos de anticorpos específicos que se ligam a um antigénio alvo. As sequências nucleotidicas codificando as regiões VH e VL estão ligadas a fragmentos génicos que codificam sinais condutores que as dirigem para o espaço periplasmático de E. coli e, como resultado, os fragmentos de anticorpos resultantes são apresentados na superfície do bacteriófago, tipicamente como fusões para proteínas de revestimento do bacteriófago (e. g., pIII ou pVIII). Alternativamente, os fragmentos de anticorpos são apresentados externamente em cápsides do fago lambda ou T7 (corpos de fago). Uma vantagem dos sistemas de apresentação baseados no fago é que, por serem sistemas biológicos, os membros de biblioteca seleccionados podem ser amplificados simplesmente através do cultivo do fago contendo o membro de biblioteca seleccionado em células bacterianas. Além disso, visto que a sequência nucleotídica que codifica o membro de biblioteca polipeptídica está contida num fago ou vector fagemídico, a sequenciação, expressão e subsequente manipulação genética são relativamente simples. Os métodos para a construção de bibliotecas de apresentação de anticorpos de bacteriófagos e bibliotecas de expressão de fagos lambda são bem conhecidos na técnica (ver, e. g. , McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552;

Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 88: 4363).

Uma abordagem de apresentação tem sido a utilização das bibliotecas de fagos scFv (ver, e. g., Huston et al., 1988,

Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A., 87: 1066-1070. Foram descritas diversas formas de realização de bibliotecas de scFv apresentadas em proteínas de revestimento de bacteriófagos. 34

Também são conhecidos refinamentos de abordagens de apresentação fágica, por exemplo como descritos nos documentos WO96/06213 e W092/01047 (Medicai Research Council et ai.) e W097/08320 (Morphosys) , os quais são aqui incorporados por referência. A apresentação de bibliotecas de Fab também é conhecida, por exemplo como descrita nos documentos W092/01047 (CAT/MRC) e W091/17271 (Affymax).

Os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos que são clonados num vector de apresentação podem ser seleccionados contra o antigénio apropriado, de modo a identificar variantes que mantenham boa actividade de ligação, devido ao anticorpo ou fragmento de anticorpo estar presente na superfície do fago ou partícula fagemídica. Ver, por exemplo, Barbas III, et al. (2001) Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Por exemplo, no caso de fragmentos Fab, os produtos de cadeia leve e cadeia pesada de Fd estão sob o controlo de um promotor lac e cada cadeia tem um sinal condutor a ela fundido, de modo a ser dirigido para o espaço periplasmático do hospedeiro bacteriano. É neste espaço que o fragmento de anticorpo será capaz de se agrupar de modo apropriado. Os fragmentos de cadeia pesada são expressos como uma fusão com um domínio de proteína de revestimento de fago, que permite que o fragmento de anticorpo agrupado seja incorporado num vector de um fago ou partícula de fago recém-preparado. A produção de novas partículas fagemídicas requer a adição de fago auxiliar que contém todos os genes fágicos necessários. Após a apresentação de uma biblioteca de fragmentos de anticorpos na superfície do fago ou fagemídeo, segue-se um processo designado enriquecimento. Trata-se de um método pelo que os anticorpos 35 apresentados na superfície do fago ou partículas fagemídicas são ligados ao antigénio desejado, ii) os não ligantes são removidos por lavagem, iii) as partículas ligadas são eluídas do antigénio e iv) as partículas eluídas são apresentadas a novos hospedeiros bacterianos, de modo a amplificar o agregado enriquecido para uma série de selecção adicional. Tipicamente, antes do rastreio de clones de anticorpos para ligação especifica são realizadas três ou quatro séries de enriquecimento. Deste modo, as partículas de fago/fagemídeo permitem a ligação do fenótipo de ligação (anticorpo) com o genótipo (ADN), tornando a utilização da tecnologia de apresentação de anticorpos muito bem-sucedida. Contudo, para este processo de humanização, poderiam ser utilizados outros formatos de vector, tal como clonagem da biblioteca de fragmento de anticorpo num vector de fago lítico (sistemas T7 ou Zap Lambda modificados) para selecção e/ou rastreio.

Após selecção de anticorpos híbridos e/ou fragmentos de anticorpos híbridos desejados, está contemplado que podem ser produzidos em grande volume por qualquer técnica conhecida dos especialistas na técnica, e. g. , expressão celular procariótica ou eucariótica e semelhantes. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos híbridos podem ser produzidos através da utilização de técnicas convencionais de construção de um vector de expressão que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, na qual as CDR e, se necessário, uma porção mínima da estrutura de região variável, que são requeridas para se reter a especificidade de ligação de anticorpo da espécie original (como manipulado de acordo com as técnicas aqui descritas), são derivadas do anticorpo da espécie originadora e o restante do anticorpo é derivado de uma imunoglobulina da espécie alvo que pode ser manipulada como aqui descrito produzindo, desse modo, 36 um vector para a expressão de uma cadeia pesada de anticorpo híbrido.

Adicionalmente, pode ser construído um vector de expressão que codifica uma cadeia leve de anticorpo, na qual uma ou mais CDR e, se necessário, uma porção mínima da estrutura de reqião variável, as quais são requeridas para se reter a especificidade de ligação de anticorpo da espécie oriqinal que pode ser manipulada como aqui proporcionado, são derivadas do anticorpo da espécie originadora e o restante do anticorpo é derivado de uma imunoglobulina da espécie alvo que pode ser manipulada como aqui proporcionado produzindo, desse modo, um vector para a expressão de uma cadeia leve de anticorpo híbrido.

Os vectores de expressão podem ser, depois, transferidos para uma célula hospedeira adequada por técnicas convencionais para produzir uma célula hospedeira transfectada para expressão de anticorpos ou fragmentos de anticorpos manipulados optimizados. A célula hospedeira transfectada ou transformada é, depois, cultivada utilizando qualquer técnica adequada conhecida destes especialistas na técnica para produzir anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos.

Em determinadas formas de realização, as células hospedeiras podem ser co-transfectadas com dois vectores de expressão, o primeiro vector codificando um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo codificando um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis diferentes mas, com a excepção das sequências codificantes de cadeia pesada e leve, são, de um modo preferido, idênticos. Este processo proporciona expressão igual de polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser 37 utilizado um único vector que codifica polipéptidos de cadeia pesada e leve. As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender ADN ou ADN genómico ou ambos.

Em determinadas formas de realização, a célula hospedeira utilizada para expressar anticorpos hibridos ou fragmentos de anticorpos hibridos pode ser uma célula bacteriana, tal como Escherichia coli ou, de um modo preferido, uma célula eucariótica. De um modo preferido, pode ser utilizada uma célula mamífera, tal como uma célula de ovário de hámster Chinês ou células NSO. A escolha do vector de expressão está dependente da escolha da célula hospedeira e pode ser seleccionada de forma a ter as características de expressão e regulatórias desejadas na célula hospedeira seleccionada.

Uma vez produzidos, os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos, podem ser purificados por processos comuns da técnica, incluindo filtração de contra-corrente, precipitação por sulfato de amónio, cromatografia de coluna de afinidade (e. g. , proteína A), electroforese em gel e semelhantes.

Os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos podem ser utilizados em conjunto ou conjugados a outras proteínas (ou as suas partes), tais como anticorpos monoclonais humanos ou humanizados. Estas outras proteínas podem ser reactivas com outros marcadores (epitopos) característicos de uma doença contra a qual os anticorpos são dirigidos ou podem ter especificidades diferentes escolhidas, por exemplo, para recrutar moléculas ou células da espécie alvo, e. g., receptores, proteínas alvo, células doentes, etc. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos híbridos podem ser administrados com essas proteínas (ou as suas partes) como composições 38 separadamente administradas, ou como composição simples, com os dois agentes ligados por métodos químicos ou de biologia molecular convencionais. Adicionalmente, o valor de diagnóstico e terapêutico dos anticorpos pode ser aumentado através da marcação dos anticorpos com marcadores que produzem um sinal detectável (in vitro ou in vivo) ou com um marcador tendo uma propriedade terapêutica. Alguns marcadores, e. g., radionucleótidos, podem produzir um sinal detectável e ter uma propriedade terapêutica. Os exemplos de marcadores de radionuclídeos incluem 12I, 131I, 14C. Os exemplos de outros marcadores detectáveis incluem uma cromosfera fluorescente, tais como proteína verde fluorescente, fluoresceína, ficobiliproteína ou tetraetilo de rodamina para microscopia de fluorescência, uma enzima que produz um produto fluorescente ou colorido para detecção por fluorescência, absorvência, cor visível ou aglutinação que produz um produto electronicamente denso para demonstração por microscopia electrónica; ou uma molécula electronicamente densa, tais como ferritina, peroxidase ou esférulas de ouro, para visualização por microscopia electrónica directa ou indirecta.

Aqui os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos podem ser, tipicamente, administrados a um doente numa composição compreendendo um veículo farmacêutico. Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância compatível, não tóxica, adequada para distribuição dos anticorpos monoclonais ao doente, Água estéril, álcool, gorduras, ceras e sólidos inertes podem ser incluídos no veículo. Os adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (agentes de tamponização, agente dispersante) também podem estar incorporados dentro da composição farmacêutica. 39

As composições de anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido podem ser administradas a um doente numa variedade de modos. De um modo preferido, as composições farmacêuticas podem ser administradas parentericamente, e. g., subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. Deste modo, as composições para administração parentérica podem incluir uma solução do anticorpo, fragmento de anticorpo ou uma sua mistura dissolvida num veículo aceitável, de um modo preferido um veículo aquoso. Pode ser utilizada uma variedade de veículos aquosos, e. g., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como requerido para condições fisiológicas aproximadas, tais como agentes de regulação de pH e tamponização, agentes de regulação de toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração de anticorpo ou fragmento de anticorpo nestas formulações pode variar largamente, e. g., de menos desde cerca de 0,5%, habitualmente a ou, pelo menos, cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20% em peso, e será seleccionada, principalmente, com base em volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo como o modo particular de administração seleccionado.

Os métodos reais para preparação de composições parentericamente administráveis e ajustamentos necessários para administração a indivíduos serão conhecidos ou evidentes aos especialistas na técnica e são descritos em maior detalhe, por exemplo, no Remington's Pharmaceutical Science, 17a Ed., 40

Publishing Company, Easton, Pa (1985), o qual é aqui incorporado por referência.

Os seguintes exemplos são proporcionados a titulo de ilustração e não devem ser considerados ou interpretados como limitando nada da matéria aqui descrita. EXEMPLO 1

Um anticorpo monoclonal murino, dirigido para a lectina de ligação a manose humana (o "anticorpo inicial"), foi utilizado em relação às técnicas aqui descritas. As regiões VH e VL foram clonadas e sequenciadas e as regiões de estrutura individuais, designadas FR1, FR2, FR3 e FR4, foram distinguidas das CDR utilizando um sistema de numeração combinado de Kabat/Chothia. Ver a Fig. 4A para a sequência de cadeia leve variável do anticorpo monoclonal. Foi conduzida uma pesquisa BLAST do banco de dados de proteínas NCBI, utilizando cada região de estrutura de cadeia leve variável individual como uma pesquisa, começando com FR1. 0 número 3747016 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR1 com boa homologia com FR1 da cadeia leve de anticorpo inicial. Ver a Fig. 4B. O 3747016 pertence à família Vk III de linha germinal humana (ver a Fig. 1), membro L2 ou L16, e a sua FR1 tem 78% de homologia com FR1 do anticorpo inicial. O número 5833827 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR2 com boa homologia (73%) com FR2 do anticorpo inicial. Ver a Fig. 4C. O 5833827 pertence à família Vk III, membros L2 ou L16. O número 722614 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR3 com boa homologia (81%) com FR3 do anticorpo inicial. Ver a Fig. 4D. 41 Ο 722614 pertence à família Vk III, membro L6. O número 1785870 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR4 com boa homologia (100%) com FR4 do anticorpo inicial. A cadeia leve variável humanizada híbrida foi construída por mutagénese dirigida pontual das regiões de estrutura de cadeia leve variável de anticorpo inicial, utilizando o Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, comercialmente disponível a partir da Promega Corp (Madison, Wisconsin). A Fig. 7 representa as respectivas sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da cadeia leve variável humanizada híbrida e mostra as posições de nucleótidos e aminoácidos particulares que foram alterados, em comparação com as sequências de anticorpos iniciais. As regiões de estrutura estão sublinhadas e os nucleótidos e aminoácidos alterados estão a negrito. Em resumo, de acordo com o sistema Altered Sites II, a clonagem e transformação foram alcançadas através da ligação do anticorpo VL inicial com o plasmídeo pALTER-EX2 (que contém os genes para resistência ao cloranfenicol e tetraciclina, o gene de cloranfenicol contendo uma mutação de deslocação de fase que pode ser restaurada utilizando o oligonucleótido de reparação de cloranfenicol para proporcionar selecção de cadeias mutantes). Após ligação, as células de E. coli JM109 foram transformadas com o plasmídeo, cultivadas e os plasmídeos resultantes foram isolados. Os plasmídeos pALTER-EX2-VL isolados foram desnaturados utilizando NaOH (solução alcalina). As reacções de emparelhamento e mutagénicas envolveram a mistura de pALTER-EX2-VL, desnaturado com solução alcalina, com reparação fosforilada, oligonucleótidos nocaute e mutagénicos (ver a Fig. 8), mais tampão de emparelhamento 10X (comercialmente disponível a partir da Promega Corp.). A mistura foi aquecida 42 até 75 °C, durante 5 minutos, e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. T4 polimerase, T4 ligase e tampão de síntese 10X foram adicionados à mistura de emparelhamento que foi incubada, durante 90 minutos, a 37 °C, para sintetizar a cadeia mutante. O produto mutado foi analisado através da transformação de células competentes ES1301 mutS (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.) com os produtos da mistura de reacção mutagénica. As células suprimem a reparação de erro de emparelhamento in vivo. Os plasmídeos da minipreparação resultantes foram transformados em células competentes JM109 (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.). Os plasmídeos purificados das células JM109 resultantes foram rastreados por análise de sequenciação. A cadeia leve variável resultante continha as estruturas seleccionadas operativamente ligadas às CDR, como mostrado na Fig. 4F. A Fig. 4G é um quadro que mostra o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo inicial (ver a Fig. 4F) e a cadeia leve do anticorpo inicial, em termos apenas das regiões de estrutura (81%), apenas CDR (100%) e da cadeia VL intacta (86%). Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo inicial e os membros VkVI (A10/A26) da família da linha germinal humana mais próxima, em termos apenas das regiões de estrutura (70%), apenas CDR (78%) e do gene da cadeia Vk (72%). Também é mostrado o grau de homologia entre uma cadeia leve humanizada, construída através da identificação da cadeia leve de anticorpo rearranjado humano mais semelhante às regiões de estrutura do anticorpo inicial e o enxerto das CDR de anticorpo inicial dentro desta cadeia leve, i. e., VL enxertada com CDR rearranjada humana e a cadeia leve de anticorpo inicial, é 43 mostrado em termos apenas de regiões de estrutura (77%), apenas CDR (100%) e da cadeia VL intacta (83%) . Finalmente, o grau de homologia entre esta Vk enxertada com CDR rearranjada humana e o membro (A14) da familia de linha germinal mais próximo em termos apenas de regiões de estrutura (70%), apenas CDR (60%) e do gene de cadeia Vk (67%). Como pode ser verificado a partir do quadro, a cadeia leve de anticorpo híbrido exemplificada acima, que foi preparada de acordo com a presente divulgação, demonstra maior homologia nas regiões de estrutura e na cadeia pesada variável global, em comparação com as sequências comparativas.

As Fig. 4H e 41 mostram as homologias de estrutura entre os anticorpos mais semelhantes no GenBank, enquanto se utilizam a cadeia leve de anticorpo inicial integral, como uma pesquisa, ou as regiões de estrutura combinadas, sem as CDR. A Fig. 5A mostra a sequência de cadeia pesada variável do anticorpo inicial. Como acima, foi conduzida uma pesquisa BLAST do banco de dados de proteínas NCBI, utilizando cada região de estrutura de cadeia pesada variável individual como uma pesquisa, começando com FR1. O número 563649 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR1 com boa homologia (91%) com FR1 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 5B. O 563649 pertence à família VH4 de linha germinal humana, membro 31 (ver a Fig. 2). O número 951263 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR2 com boa homologia (78,5%) com FR2 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 5C. O 951263 pertence à família VH4 de linha germinal humana, membro 31. O número 484852 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR3 com boa homologia (81%) com FR3 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a 44

Fig. 5D. Ο 484852 pertence à família VH4 de linha germinal humana, membros 4 ou 31. O número 2367531 de identificação do gene da seguência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR4 com boa homologia (100%) com FR4 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 5E. O 2367531 pertence a VH3, membro 23. A cadeia pesada variável humanizada híbrida foi construída por mutagénese dirigida pontual das regiões de estrutura de cadeia pesada variável de anticorpo inicial, utilizando o Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, comercialmente disponível a partir da Promega Corp (Madison, Wisconsin). A Fig. 7 representa as respectivas seguências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da cadeia pesada variável humanizada híbrida e mostra as posições de particulares nucleótidos e aminoácidos que foram alterados, em comparação com as sequências de anticorpos iniciais. As regiões de estrutura estão sublinhadas e os nucleótidos e aminoácidos alterados estão a negrito. Em resumo, de acordo com o sistema Altered Sites II, a clonagem e transformação foram alcançadas através da ligação do anticorpo VH inicial com o plasmídeo pALTER-EX2 (que contém os genes para resistência ao cloranfenicol e tetraciclina, o gene de cloranfenicol contendo uma mutação de deslocação de fase que pode ser restaurada utilizando o oligonucleótido de reparação de cloranfenicol para proporcionar selecção de cadeias mutantes). Após ligação, as células de E. coli JM109 foram transformadas com o plasmídeo, cultivadas e os plasmídeos resultantes foram isolados. Os plasmídeos pALTER-EX2-VH isolados foram desnaturados utilizando NaOH (solução alcalina) . As reacções de emparelhamento e mutagénicas envolveram a mistura de pALTER-EX2-VH, desnaturado com solução alcalina, com reparação fosforilada, oligonucleótidos nocaute e mutagénicos (ver a 45

Fig. 8), mais tampão de emparelhamento 10X (comercialmente disponível a partir da Promega Corp.)· A mistura foi aquecida até 75 °C, durante 5 minutos, e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. T4 polimerase, T4 ligase e tampão de síntese 10X foram adicionados à mistura de emparelhamento que foi incubada, durante 90 minutos, a 37 °C, para sintetizar a cadeia mutante. O produto mutado foi analisado através da transformação de células competentes ES1301 mutS (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.) com os produtos da mistura de reacção mutagénica. As células suprimem a reparação de erro de emparelhamento in vivo. Os plasmídeos da minipreparação resultantes foram transformados em células competentes JM109 (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.). Os plasmídeos purificados das células JM109 resultantes foram rastreados por análise de sequenciação. A cadeia pesada variável resultante continha as estruturas seleccionadas operativamente ligadas às CDR, como mostrado na Fig. 5F. A Fig. 5G é um quadro que mostra o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia pesada de anticorpo inicial (ver a Fig. 5F) e a cadeia pesada do anticorpo inicial, em termos apenas das regiões de estrutura (86,4%), apenas CDR (100%) e da cadeia VH intacta (90%) . Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida do anticorpo inicial e o membro VH4-31 da família da linha germinal humana mais próxima, em termos apenas das regiões de estrutura (92,8%), apenas CDR (70%) e da cadeia VH (86,6%). Também é mostrado o grau de homologia entre o anticorpo inicial e uma cadeia humanizada, construída através da identificação da cadeia pesada de anticorpo rearranjado humano mais semelhante às regiões de estrutura do anticorpo inicial e o enxerto das CDR de anticorpo 46 inicial nesta cadeia pesada, i. e., VH enxertada com CDR rearranjada humana, é mostrado em termos apenas de regiões de estrutura (80%), apenas CDR (100%) e da cadeia VH intacta (86%). Finalmente, o grau de homologia entre esta VH enxertada com CDR rearranjada humana e o membro (VH4-31) da família de linha germinal mais próximo em termos apenas de regiões de estrutura (97%), apenas CDR (70%) e do gene de cadeia VH intacto (89,6%). Como pode ser verificado a partir do quadro, o anticorpo híbrido exemplificado acima, o qual foi preparado de acordo com a presente divulgação, demonstra maior homologia nas regiões de estrutura e na cadeia pesada variável global, em comparação com as sequências comparativas.

As Fig. 5H e 51 mostram as homologias de estrutura entre os anticorpos mais semelhantes no GenBank, enquanto se utilizam, como uma pesquisa, a cadeia leve de anticorpo inicial integral ou as regiões de estrutura combinadas sem as CDR. A afinidade de ligação, constante de velocidade de associação e constante de velocidade de dissociação são determinadas para o anticorpo inicial e o anticorpo híbrido, (h3F8) preparado de acordo com esta divulgação, utilizando um sistema BIAcore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, N.J.), utilizando a lectina de ligação de manana (MBL) como antigénio e seguindo as instruções do fabricante. Os resultados são mostrados na Figura 12. São mostrados dois testes, utilizando o mesmo anticorpo híbrido e a sua média. EXEMPLO 2

Um anticorpo monoclonal murino dirigido para h-DC-SIGN-Fc (o "anticorpo inicial") foi utilizado em relação às técnicas aqui descritas. As regiões VH e VL foram clonadas e sequenciadas e as regiões de estrutura individuais, designadas FR1, FR2, FR3 e FR4, foram distinguidas das CDR utilizando um sistema de numeração combinado de Kabat/Chothia. Ver a Fig. 9A para a sequência de cadeia leve variável do anticorpo monoclonal. Foi conduzida uma pesquisa BLAST do banco de dados de proteínas NCBI, utilizando cada região de estrutura de cadeia leve variável individual como uma pesquisa, começando com FR1. FR1 0 número 441333 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR1 com boa homologia com FR1 da cadeia leve de anticorpo inicial. Ver a FIG. 9B. 0 441333 pertence à família Vk II de linha germinal humana (ver a Fig. 1), membro A17, e a sua FR1 tem 82% de homologia com FR1 do anticorpo inicial. 0 número 5578780 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como um segundo anticorpo tendo uma FR1 com boa homologia com FR1 da cadeia leve de anticorpo inicial. Ver a FIG. 9B. O 5578780 pertence à família Vk II de linha germinal humana (ver a Fig. 1), membro A3 ou A9, e a sua FR1 tem 78% de homologia com FR1 do anticorpo inicial. 48 FR2 0 número 4324018 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR2 com boa homologia (86%) com FR2 do anticorpo inicial. Ver a FIG. 9C. O 4324018 pertence à família Vk II, membro A3. O número 18041766 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como um segundo anticorpo tendo uma FR2 com boa homologia com FR2 da cadeia leve de anticorpo inicial. Ver a FIG. 9B. O 18041766 pertence à família Vk II de linha germinal humana (ver a Fig. 1), membro A3, e a sua FR1 tem 86% de homologia com FR1 do anticorpo inicial. FR3

Os números 553476 e 33251 de identificação do gene da sequência de anticorpo foram seleccionados como tendo uma FR3 com boa homologia (93%) com FR3 do anticorpo inicial. Ver a FIG. 9D. O 722614 pertence à família Vk II, membro A3. FR4 O número 446245 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR4 com boa homologia (100%) com FR4 do anticorpo inicial. Ver a Figura 9E. A cadeia leve variável humanizada híbrida foi construída por mutagénese dirigida pontual das regiões de estrutura de cadeia leve variável de anticorpo inicial, utilizando o Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, comercialmente disponível 49 a partir da Promega Corp (Madison, Wisconsin). A Fig. 9F representa as seguências de aminoácidos das cadeias leves variáveis humanizadas híbridas e mostra as posições de aminoácidos particulares que foram alterados, em comparação com as sequências de anticorpos iniciais. As regiões de estrutura estão a negrito e os aminoácidos alterados estão sublinhados. Em resumo, de acordo com o sistema Altered Sites II, a clonagem e transformação foram alcançadas através da ligação do anticorpo VL inicial com o plasmídeo pALTER-EX2 (que contém os genes para resistência ao cloranfenicol e tetraciclina, o gene de cloranfenicol contendo uma mutação de deslocação de fase que pode ser restaurada utilizando o oligonucleótido de reparação de cloranfenicol para proporcionar selecção de cadeias mutantes). Após ligação, as células de E. coli JM109 foram transformadas com o plasmídeo, cultivadas e os plasmídeos resultantes foram isolados. Os plasmídeos pALTER-EX2-VL isolados foram desnaturados utilizando NaOH (solução alcalina). As reacções de emparelhamento e mutagénicas envolveram a mistura de pALTER-EX2-VL, desnaturado com solução alcalina, com reparação fosforilada, oligonucleótidos nocaute e mutagénicos (ver a Fig. 8), mais tampão de emparelhamento 10X (comercialmente disponível a partir da Promega Corp.). A mistura foi aquecida até 75 °C, durante 5 minutos, e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. T4 polimerase, T4 ligase e tampão de síntese 10X foram adicionados à mistura de emparelhamento que foi incubada, durante 90 minutos, a 37 °C, para sintetizar a cadeia mutante. O produto mutado foi analisado através da transformação de células competentes ES1301 mutS (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.) com os produtos da mistura de reacção mutagénica. As células suprimem a reparação de erro de emparelhamento in vivo. Os plasmídeos da minipreparação resultantes foram transformados em células 50 competentes JM109 (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.). Os plasmídeos purificados das células JM109 resultantes foram rastreados por análise de sequenciação. A cadeia leve variável resultante continha as estruturas seleccionadas operativamente ligadas às CDR, como mostrado na Fig. 9F. A Fig. 9G é um quadro que mostra o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo inicial (ver a Fig. 9F) e a cadeia leve do anticorpo inicial, em termos apenas das regiões de estrutura (90%), apenas CDR (100%) e da cadeia VL intacta (93%) . Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia leve de anticorpo inicial e os membros VkII (A17) da família da linha germinal humana mais próxima, em termos apenas das regiões de estrutura (93%), apenas CDR (70%) e do gene da cadeia Vk (87%). Também é mostrado o grau de homologia entre uma cadeia leve humanizada, construída através da identificação da cadeia leve de anticorpo rearranjado humano mais semelhante às regiões de estrutura do anticorpo inicial e o enxerto das CDR de anticorpo inicial dentro desta cadeia leve, i. e., VL enxertada com CDR rearranjada humana e a cadeia leve de anticorpo inicial, é mostrado em termos apenas de regiões de estrutura (85%), apenas CDR (100%) e da cadeia VL intacta (89%). Finalmente, o grau de homologia entre esta Vk enxertada com CDR rearranjada humana e o membro VkII (A17) da família de linha germinal mais próximo em termos apenas de regiões de estrutura (88%), apenas CDR (70%) e do gene de cadeia Vk (84%). Como pode ser verificado a partir do quadro, a cadeia leve de anticorpo híbrido exemplificada acima, que foi preparada de acordo com a presente divulgação, demonstra maior homologia nas regiões de estrutura e na cadeia pesada variável global, em comparação com as sequências comparativas. 51 A Fig. 9H mostra as homologias de estrutura entre os anticorpos mais semelhantes no GenBank, ao se utilizarem, como uma pesquisa, as regiões de estrutura combinadas sem as CDR. A Fig. 10A mostra a sequência de cadeia pesada variável do anticorpo inicial. Como acima, foi conduzida uma pesquisa BLAST do banco de dados de proteínas NCBI, utilizando cada região de estrutura de cadeia pesada variável individual como uma pesquisa, começando com FR1. FR1 0 número 18698373 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como tendo uma FR1 com boa homologia (80%) com FR1 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 10B. O 18698373 pertence à família VH7 de linha germinal humana, membro 81 (ver a Fig. 2) . O número 392677 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como um segundo anticorpo tendo uma FR1 com boa homologia com FR1 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a FIG. 9B. O 392677 pertence à família VH1 de linha germinal humana, membro 2 (ver a Fig. 1), e a sua FR1 tem 76% de homologia com FR1 do anticorpo inicial. FR2 O número 886288 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como uma FR2 com boa homologia (100%) com FR2 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 10C. O 886288 pertence à família VHl de linha germinal humana, membro 52 2. 0 número 999106 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como um segundo anticorpo tendo uma FR2 com boa homologia com FR2 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 10B. O 999106 pertence à família VH1 de linha germinal humana, membro 46 (ver a Fig. 2), e a sua FR2 tem 100% de homologia com FR2 do anticorpo inicial. FR3 O número 5542538 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como uma FR3 com boa homologia (81%) com FR3 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 10D. O 5542538 pertence à família VH1 de linha germinal humana, membro 2. FR4 O número 4530559 de identificação do gene da sequência de anticorpo foi seleccionado como uma FR4 com boa homologia (100%) com FR4 da cadeia pesada de anticorpo inicial. Ver a Fig. 10E. O 4530559 pertence a VH1, membro 2. A cadeia pesada variável humanizada híbrida foi construída por mutagénese dirigida pontual das regiões de estrutura de cadeia pesada variável de anticorpo inicial, utilizando o Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, comercialmente disponível a partir da Promega Corp (Madison, Wisconsin). A Fig. 10F representa as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas variáveis humanizadas híbridas e mostra as posições de nucleótidos e aminoácidos particulares que foram alterados, em 53 comparação com as sequências de anticorpos iniciais. As regiões de estrutura estão a negrito e os aminoácidos alterados estão sublinhados. Em resumo, de acordo com o sistema Altered Sites II, a clonagem e transformação foram alcançadas através da ligação do anticorpo VH inicial com o plasmídeo pALTER-EX2 (que contém os genes para resistência ao cloranfenicol e tetraciclina, o gene de cloranfenicol contendo uma mutação de deslocação de fase que pode ser restaurada utilizando o oligonucleótido de reparação de cloranfenicol para proporcionar selecção de cadeias mutantes). Após ligação, as células de E. coli JM109 foram transformadas com o plasmídeo, cultivadas e os plasmídeos resultantes foram isolados. Os plasmídeos pALTER-EX2-VH isolados foram desnaturados utilizando NaOH (solução alcalina). As reacções de emparelhamento e mutagénicas envolveram a mistura de pALTER-EX2-VH, desnaturado com solução alcalina, com reparação fosforilada, oligonucleótidos nocaute e mutagénicos (ver a Fig. 8), mais tampão de emparelhamento 10X (comercialmente disponível a partir da Promega Corp.). A mistura foi aquecida até 75 °C, durante 5 minutos, e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. T4 polimerase, T4 ligase e tampão de síntese 10X foram adicionados à mistura de emparelhamento que foi incubada, durante 90 minutos, a 37 °C, para sintetizar a cadeia mutante. O produto mutado foi analisado através da transformação de células competentes ES1301 mutS (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.) com os produtos da mistura de reacção mutagénica. As células suprimem a reparação de erro de emparelhamento in vivo. Os plasmídeos da minipreparação resultantes foram transformados em células competentes JM109 (comercialmente disponíveis a partir da Promega Corp.). Os plasmídeos purificados das células JM109 resultantes foram rastreados por análise de sequenciação. A cadeia pesada variável resultante continha as estruturas 54 seleccionadas operativamente ligadas às CDR, como mostrado na

Fig. 10F. A Fig. 10H é um quadro que mostra o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida da cadeia pesada de anticorpo inicial (ver a Fig. 10F) e a cadeia pesada do anticorpo inicial, em termos apenas das regiões de estrutura (87%), apenas CDR (100%) e da cadeia VH intacta (91%). Também é mostrado o grau de homologia entre a versão humanizada híbrida do anticorpo inicial e o membro VH4-31 da família da linha germinal humana mais próxima, em termos apenas das regiões de estrutura (72%), apenas CDR (44%) e da cadeia VH (64%) . Também é mostrado o grau de homologia entre o anticorpo inicial e uma cadeia humanizada, construída através da identificação da cadeia pesada de anticorpo rearranjado humano mais semelhante às regiões de

estrutura do anticorpo inicial e o enxerto das CDR de anticorpo inicial nesta cadeia pesada, i. e., VH enxertada com CDR rearranjada humana, é mostrado em termos apenas de regiões de estrutura (80%), apenas CDR (100%) e da cadeia VH intacta (87%). Finalmente, o grau de homologia entre esta VH enxertada com CDR rearranjada humana e o membro (VH1-46) da família de linha germinal mais próximo em termos apenas de regiões de estrutura (69%), apenas CDR (44%) e do gene de cadeia VH intacto (62%) . Como pode ser verificado a partir do quadro, o anticorpo híbrido exemplificado acima, o qual foi preparado de acordo com a presente divulgação, demonstra maior homologia nas regiões de estrutura e na cadeia pesada variável global, em comparação com as sequências comparativas. A Fig. 10G mostra as homologias de estrutura entre os anticorpos mais semelhantes no GenBank, ao se utilizarem, como uma pesquisa, as regiões de estrutura combinadas sem as CDR. 55 ELISA de Competição

As placas de ELISA foram revestidas com 2 pg/mL de IgG anti-humano de cabra, em tampão de revestimento de Carbonato, lavadas duas vezes com tampao de lavagem. Após bloqueio com tampão de bloqueio, a 37 °C, os poços lavados duas vezes com tampão de lavagem e, depois , incubados com hDC-SIGN-Fc a 0,25 pg/mL (em tampao de bloqueio), durante 1 h, a 37 °C, lavados 4 vezes com tampão de lavagem.

Para o ensaio de competição, 4 pg/mL ou 1 pg/ml de AZN-D1 conjugado a biotina foram misturados com diferentes

concentrações de AZN-D1 ou um anticorpo híbrido de acordo com a presente divulgação (hDIVl) ou anticorpo 5G1.1 (um anticorpo descrito na Patente U.S. N° 6355245, cuja divulgação é aqui incorporada por referência), em tampão de bloqueio e incubados, durante 2 h, à t.a. (temperatura ambiente), os poços foram, depois, lavados 6 vezes com tampão de lavagem, incubados com SA-HRP a 1:1000 (Estreptavidina-Peroxidase de Rábano) em tampão de bloqueio, durante 45 min, à t.a. Após 8 lavagens com tampão de lavagem, os poços foram desenvolvidos por OPD (o-Fenilenodiamina), em tampão de citrato-fosfato a 0,1 M, pH 5,0, contendo peróxido de hidrogénio a 0,03% e lidos a 492 nm. 56

REAGENTES DE ELISA Anti-hDC-SIGN

Tampao de revestimento de Carbonato, pH 9,6 1,6 g de Na2C03 + 2,9 g de NaHC03

Adicionar 800 mL de H20, pH para 9,6, depois, completar para 1 L com H20

Tampão de bloqueio 1 g de BSA + 100 mL de PBS

Adicionar BSA a PBS e deixar dissolver totalmente antes da utilização. Armazenar a 4 °C.

Tampão de lavagem (0,05% de Tween/PBS):0,5 g de Tween 20 + 1 L de PBS Adicionar Tween a PBS e misturar exaustivamente antes da utilização

Tampão de citrato

Ácido Cítrico. 2,1 g em 50 mL 1,47 g de Citrato de Sódio (Di-hidratado) em 50 mL Adicionar as soluções em conjunto e ajustar o pH para 4,0-4,2

Todas as incubações podem ser efectuadas a 4o C, de um dia para o outro, ou à temperatura ambiente, durante 2 h, OU a 37 °C, durante 1 h. 57

Os resultados das experiências de ELISA de competição sao mostrados na Figura 11. A afinidade de ligação, constante de velocidade de associação e constante de velocidade de dissociação são determinadas para o anticorpo inicial e dois anticorpos híbridos (Dl VI e Dl V2), preparados de acordo com a sua divulgação, utilizando h-Dc-SIGN-Fc como antigénio e seguindo as instruções do fabricante. Os resultados são mostrados na Figura 13.

Será compreendido que podem ser feitas diversas modificações às formas de realização aqui divulgadas. Por conseguinte, a descrição acima não deve ser considerada como limitativa mas, meramente, como exemplos de formas de realização preferidas.

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Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido compreendendo: proporcionar um anticorpo inicial tendo especificidade para um alvo; determinar a sequência de uma região variável do anticorpo inicial e (i) seleccionar um primeiro componente da região variável, o referido primeiro componente compreendendo uma região de estrutura seleccionada do grupo consistindo de FR1, FR2 e FR3; comparar a sequência do primeiro componente da região variável a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos de uma espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o primeiro componente; determinar de que família génica de linha germinal a sequência foi derivada; (ii) seleccionar um segundo componente da região variável que é diferente do primeiro componente, o segundo componente compreendendo uma região de estrutura seleccionada do grupo consistindo de FR1, FR2 e FR3; comparar a sequência do segundo componente a sequências contidas numa base de dados de referência 1 de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos da espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o segundo componente e que corresponde à mesma família génica de linha germinal que a primeira sequência seleccionada da base de dados na etapa (i); (iii) seleccionar um terceiro componente da região variável que é diferente do primeiro e segundo componentes, o terceiro componente compreendendo uma região de estrutura seleccionada do grupo consistindo de FR1, FR2 e FR3; comparar a sequência do terceiro componente a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos da espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o terceiro componente e que corresponde à mesma família génica de linha germinal que a primeira sequência seleccionada da base de dados na etapa (i) ; e (iv) ligar operativamente as sequências de estrutura seleccionadas a uma ou mais CDR do anticorpo inicial para produzir um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido.
2. 2. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1 compreendendo, adicionalmente, seleccionar um quarto componente da região variável, o referido quarto componente compreendendo uma região de estrutura que é FR4; 2 comparar a sequência do quarto componente a sequências contidas numa base de dados de referência de sequências de anticorpos ou sequências de fragmentos de anticorpos da espécie alvo; seleccionar uma sequência da base de dados que demonstra um elevado grau de homologia com o quarto componente e ligar operativamente as sequências de estrutura seleccionadas a uma ou mais CDR do anticorpo inicial para produzir um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido.
3. 3. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro componente compreende, adicionalmente, uma CDR.
4. 4. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que o segundo componente compreende, adicionalmente, uma CDR.
5. 5. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a região variável do anticorpo inicial é seleccionada do grupo consistindo de cadeia pesada variável e cadeia leve variável.
6. 6. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 2, em que é produzido um fragmento de anticorpo seleccionado do grupo consistindo de cadeia pesada variável e cadeia leve variável. 3
7. 7. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências seleccionadas da base de dados de referência são de anticorpos diferentes.
8. 8. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que duas ou mais das sequências seleccionadas da base de dados de referência são de anticorpos diferentes.
9. 9. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 2, em que duas ou mais das sequências seleccionadas da base de dados de referência são de anticorpos diferentes.
10. 10. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências são sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos. Método para produção de anticorpo híbrido que o fragmento de consistindo de scFv, cadeias leves de anticorpos.
11. 11. de um anticorpo híbrido ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, em anticorpo é seleccionado do grupo Fab, Fab', F(ab')2, Fd, diacorpos, anticorpos e cadeias pesadas de
12. 12. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a espécie alvo é humana. 4
13. 13. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência da região FR1 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que correspondem as outras sequências seleccionadas.
14. 14. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência da região FR2 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que correspondem as outras sequências seleccionadas.
15. 15. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência da região FR3 do anticorpo inicial é utilizada individualmente para pesquisar a base de dados de referência para sequências tendo um elevado grau de homologia e a família génica de linha germinal a que pertence é utilizada como a família a que correspondem as outras sequências seleccionadas.
16. 16. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que a base de dados de referência contém sequências de linha germinal ou rearranjadas da espécie alvo. 5
17. 17. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências seleccionadas correspondem ao mesmo membro de família na família génica de linha germinal.
18. 18. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 1, em que duas ou mais das sequências seleccionadas correspondem ao mesmo membro de família na família génica de linha germinal.
19. 19. Método para produção de um anticorpo híbrido ou fragmento de anticorpo híbrido de acordo com a reivindicação 2, em que duas ou mais das sequências seleccionadas correspondem ao mesmo membro de família na família génica de linha germinal. Lisboa, 21 de Maio de 2012 6