PT1156813E - Reovírus para o tratamento de distúrbios proliferativos das células - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

REOVÍRUS PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS PROLIFERATIVOS

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto a utilização de reovírus recombinantes, tal como reivindicado na reivindicação 1, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de distúrbios proliferativos em mamíferos, mediados por ras.

Referências

As publicações, pedidos de patentes e patentes que se seguem são citados neste pedido de patente de invenção:

Patente norte-americana U.S. No. 5.023.252

Armstrong, G.D. et al. (1984), Virology 138: 37;

Aronheim, A., et al., (1994) Cell, 78:949-961

Barbacid, M., Annu. Rev. Brochem., 56: 779-827 (1987);

Berrozpe, G-, et al. (1994), Int. J. Câncer, 58: 185-191

Bischoff, J.R. ed Samuel, C.E., (1989} Virology, 172: 106-115 1

Cahill, Μ.A., et al. , Curr. Biol., 6: 16-19 (1996); Chandron e Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein mui and mulC is blocked by alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology 72 (1): 467-75 (1998)

Chaubert, P. et al. (1994), Am. J. Path. 144: 767; Bos, J. (1989) Câncer Res. 49: 4682

Cuff et al., "Enteric reovírus infection as a probe to study immunotoxicity of the gastrointestinal tract" Toxicological Sciences 42 (2): 99-108 (1998)

Der, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 94: 3279-3283 (1997) Dudley, R.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92: 7686-7689 (1995)

Duncan et al., "Conformational and functional analysis of the C-terminal globular head of the reovirus cell attachment protein" Virology 182 (2): 810-9 (1991)

Fields, B.N. et al. (1996), Fundamental Virology, 3a Edição, Lippincott-Raven;

Gentsch, J.R.K. e Pacitti, A.F. (1985), J. Virol. 56: 356; E. Harlow e D. Lane, "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988)

Helbing, C.C. et al., Câncer Res. 57: 1255-1258 (1997)

Hu, Y.. e.Conway, T.W. (1993), J. Interferon Res., 13: 323-328 2

Laemmli, U.K., (1970) Nature, 227: 680-685

Lee. J.M. et al. (1993) PNAS 90: 5742-5746;

Lee, P.W.K. et al. (1981) Virology, 108: 134-146

Levitzki, A. (1994) Eur. J. Biochem. 226: 1;

James, P.W., et al. (1994) Oncogene 9: 3601;

Bos. J. (1989) Câncer Res. 49: 4682

Lowe. S.W. et al. (1994) Science. 266: 807-810;

Lyon, H., Cell Biology, A Xaboratory Handbook, J.E. Cells, ed., Academic Press, 1994, p. 232

Mah et al., "The N-terminal quarter of reovírus cell attachment protein. sigma 1 possesses intrinsic virion-anchoring function" Virology 179 (1): 95-103 (1990)

McRae, M.A. e Joklik, W.K., (1978) Virology, 89: 578- 593

Millis, NE et al. (1995) Câncer Res. 55: 1444;

Mundschau, L.J.. e Faller, D.V., (1992) J. Biol. Chem., 267:23092-23098

Nagata, L., et al. ,(1984) Nucleic Acids Res., 12: 8699-8710

Paul R.W. et al. (1989) Virology 172: 382-385 3

Raybaud-Diogene. H. et al. (1997) J. Clin. Oncology, 15 (3): 1030-1038;

Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia PA 17a ed. (1985)

Robinson, M.J. e Cobb, M.H., Curr. Opin. Cell. Biol. 9: 180-186 (1997);

Rosen, L. (1960) Am. J. Hyg. 71: 242;

Sabin, A.B. (1959), Science 130: 966

Samuel, C.E. e Brody, M., (1990) Virology, 176: 106- 113;

Smith, R.E. et al-, (1969) Virology, 39: 791-800

Stanley, N.F. (1967) Br. Med. Buli. 23: 150

Strong, J.E. et al., (1993) Virology, 197: 405-411;

Strong, J.E. e Lee, P.W.K., (1996) J. Virol., 70: 612- 616

Trimble, W.S. et al. (1986) Nature, 321: 782-784

Turner e Duncan, "Site directed mutagenesis of the C-terminal portion of reovirus protein sigmal: evidence for a conformation-dependent receptor binding domain" Virology 186 (1): 219-27 (1992);

Waters, S.D. et al., J. Biol. Chem. 270: 20883-20886 (1995) 4

Wiessmuller, L. e Wittinghofer, F. (1994), Cellular Signaling 6(3): 247-267;

Wong, H., et al., (1994) Anal. Biochem., 223: 251-258

Yang, Y.L. et al. EMBO J. 14: .6095-6106 (1995)

Yu, D. et al. (1996) Oncogene 13: 1359 Estado da técnica A proliferação normal das células é regulada por um equilíbrio entre os proto-oncogénios que promovem o crescimento e os genes supressores dos tumores que restringem o crescimento. A génese de tumores pode ser causada por alterações genéticas ao genoma, que resulta na mutação desses elementos celulares que governam a interpretação de sinais celulares, tal como a potenciação da actividade proto-oncogénica ou Pa inactivação da supressão do tumor. Crê-se que a interpretação destes sinais influencia, em última análise, o crescimento e a diferenciação de uma célula e que a má interpretação destes sinais pode resultar num crescimento neoplásico (neoplasia).

Crê-se que a alteração genética do proto-oncogene Ras contribua para aproximadamente 30 % de todos os tumores humanos (Wiessmuller, L. e Wittinghofer, F. (1994), Cellular Signaling 6 (3) : 247-267; Barbacid, M. (1987) A

Rev. Biochem. 56, 779-827). O papel que Ras desempenha na patogénese dos tumores humanos é especifico do tipo de tumor. Verificam-se mutações de activação no próprio Ras na maior parte dos tumores malignos humanos e estão altamente representadas no cancro pancreático (80 %), carcinomas co-lorectais esporádicos (40-50 %), adenocarcinomas do pulmão 5 humano (15-24 %) , tumores da tiróide (50 %} e leucemia mielóide (30 %) (Millís. NE et al. (1995) Câncer Res. 55: 1444; Chaubert, P. et al. (1994). Am. J. Path. 144 : 767; Bos, J. (1989) Câncer Res. 49: 4682). A activação de Ras é também demonstrada por elementos de sinalização mitogénica a montante, nomeadamente pelas cinases do receptor de tirosina (CRTs, RTKs na terminologia inglesa). Estes elementos a montante, se amplificados ou sobre-expressos, resultam, por fim, numa actividade elevada de Ras por meio da actividade de transduçâo do sinal de Ras. Exemplos disto incluem a sobre-expressão de RFCDP (receptores de factores de crescimento derivados de plaquetas, PDGFR na terminologia inglesa) em certas formas de glioblastomas, assim como em c-erbB-2/neu no cancro da mama (Levitzki, A. (1994) Eur. J. Biochem. 226: 1; James, P.W., et al. (1994) Oncogene 9: 3601; Bos, J. (1989) Câncer Res. 49: 4682).

Os processos correntes de tratamento da neoplasia incluem cirurgia, quimioterapia e. radiação. A cirurgia utiliza-se normalmente como o principal tratamento para os estados precoces de cancro; contudo, muitos tumores não podem ser completamente removidos por meios cirúrgicos. Além disso, o crescimento metastásico dos neoplasmas pode impedir a cura completa do cancro por meio de cirurgia. A quimioterapia envolve a administração de compostos com actividade anti-tumor, tal como agentes de alquilação, antimetabólitos, e antibióticos anti-tumor. A eficácia da quimioterapia é muitas vezes limitada por severos efeitos colaterais, incluindo náusea e vómito, depressão da medula óssea, problemas renais e depressão do sistema nervoso central. A terapia por radiação baseia-se na maior capacidade das células normais para se refazerem a elas próprias, após o tratamento com radiação, em contraste com as células neoplásicas. Contudo, a radioterapia não pode 6 ser utilizada para tratar muitos neoplasmas, por causa da sensibilidade do tecido que rodeia o tumor. Além disso, certos tumores têm mostrado resistência à radioterapia e isso depende do estado oncogénico ou anti-oncogénico da célula (Lee. J.M. et al. (1993) PNAS 90: 5742-5746; Lowe. S.W. et al. (1994) Science, 266: 807-810; Raybaud-Diogene. H. et al. (1997) J. Clin. Oncology, 15 (3): 1030-1038). Na Science vol. 282, 1998, 1332-4 descreve-se a utilização do reovírus no tratamento de tumores activos em ratos. Tendo em vista as desvantagens associadas com os meios correntes para o tratamento do crescimento neoplásico, há uma necessidade de processos melhores para o tratamento da maior parte dos tipos de cancros.

SUMÁRIO,DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto a utilização de um reovírus, tal como definido na reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferativo mediado por ras num mamífero seleccionado entre cães, gatos, ovelhas, cabras, vacas, cavalos, porcos, primatas humanos e não humanos, em que se administra o vírus às células em proliferação, numa quantidade efectiva, em condições que resultam numa lise substancial das células em proliferação. O reovírus pode ser um reovírus de mamífero ou um reovírus de aves. O reovírus pode ser modificado de tal modo que a cápside externa é removida, o virião é acondicionado num liposoma ou as micélas ou as proteínas da cápside externa foram mutadas. O reovírus pode ser administrado numa dose única ou em doses múltiplas. O distúrbio proliferativo pode ser um neoplasma. Pode-se atingir tanto os neoplasmas sólidos como os hematopoié-ticos. 7

Também tem por objecto a utilização de um reovirus, tal como definido na reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um neoplasma mediado por ras num ser humano, em que se administra o reovirus ao neoplasma numa quantidade suficiente para que resulte uma oncólise substancial das células neoplásicas. 0 reovirus pode ser administrado por injecção no neoplasma sólido ou próximo dele.

Também tem por objecto a utilização de um reovirus, tal como definido na reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para a inibição de metástases de um neoplasma num mamífero, em que se administra o reovirus a um mamífero numa quantidade suficiente para que resulte uma lise substancial das células neoplásicas.

Também tem por objecto a utilização de um reovirus, tal como definido na reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma suspeita de neoplasma num mamífero, em que praticamente todo o neoplasma é eliminado cirurgicamente e o virus é administrado numa quantidade efectiva no sítio da cirurgia ou próximo dele o que resulta numa oncólise de quaisquer células neoplásicas remanescentes.

Outros enquadramentos da presente invenção . vêm referidos nas reivindicações.

As composições farmacêuticas da presente invenção dão meios eficazes para tratar a neoplasia, sem os efeitos colaterais associados com outras formas da terapia do cancro. Além disso, dado que o reovirus não é conhecida por estar associado com a doença, qualquer preocupação de 8 segurança associada com a administração deliberada de um virus fica minimizada.

Os objectos anteriores e outros, as características e as vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição mais detalhada dos enquadramentos preferidos da presente invenção que se seguem, tal como ilustrado nos desenhos que acompanham a descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é uma descrição da base molecular da oncó-lise do reovirus, em que o repvírus usurpa a via de sinalização de Ras da célula hospedeira. A figura 2 é uma representação gráfica dos efeitos, ao longo do tempo, do serotipo 3 do reovirus (estirpe Dearing) activo {círculos abertos) ou inactivos (círculos fechados) na dimensão dos tumores THC-11 que crescem em condições de imuno-deficiência combinada severa (IDCS, SCID na terminologia inglesa) em ratos. Os valores do gráfico representam a média das medições em que se vê também o desvio padrão da média. A figura 3 é uma representação gráfica dos efeitos, ao longo do tempo, do serotipo 3 do reovirus (estirpe Dearing) activo (círculos abertos) ou inactivos (círculos fechados) na dimensão dos xenotransplantes do glioblastoma humano U-87 em ratos com IDCS. Os valores do gráfico representam a média das medições em que se vê também o desvio padrão da média. A figura 4 é uma representação gráfica dos efeitos, ao longo do tempo, do serotipo 3 do reovirus (estirpe 9

Dearing) activo (círculos abertos, quadrados abertos) ou inactivos (círculos fechados, quadrados fechados) na dimensão dos xenotransplantes do glíoblastoma humano U-87 bilateral injectado/tratado (círculos abertos e fechados) ou não fechados (quadrados abertos e fechados) em ratos com I-DCS. Os valores do gráfico representam a média das medições em que se vê também o desvio padrão da média. A figura 5 é uma representação gráfica dos efeitos, ao longo do tempo, do serotipo 3 do reovírus (estirpe Dearing) activo (círculos abertos) ou inactivos (círculos fechados) na dimensão de tumores de células transformadas de ratos C3H imuno-competentes. A figura 6 é uma representação gráfica dos efeitos, ao longo do tempo, do serotipo 3 do reovírus (estirpe Dearing) activo (círculos abertos, quadrados abertos) ou inactivos (círculos fechados) na dimensão dos tumores de ratos C3H de células transformadas que cresceram em ratos C3H imuno-competentes previamente expostos (quadrados abertos) ou não expostos (círculos abertos) a reovírus.

DESCRIÇÃO DATALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto a utilização de um reovírus, tal como definido na reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferativo num mamífero mediado por ras. A designação reovírus (do inglês "respiratory and enteric orphan vírus" [vírus orfão respiratório e entérico]) é um acrónimo descritivo que sugere que estes 10 vírus, embora não estando associados a qualquer estado de doença conhecida em seres humanos, podem ser isolados de qualquer parte do tracto respiratório ou do tracto entérico (Sabin, A.B. (1959), Science 130: 966). 0 termo "reovírus" refere-se a todos os vírus classificados no género reovírus.

Os reovírus são vírus com um genoma de ARN segmentado, de estrutura helicoidal dupla. Os viriões medem 60-80 nm de diâmetro e possuem dois invólucros de cápside concêntricos, sendo cada um deles icosaédrico. 0 genoma consiste num ARN de estrutura helicoidal dupla com 10-12 segmentos discretos com uma dimensão total do genoma de 16-27 kpb. Os segmentos individuais de ARN variam na sua dimensão. Já se recuperaram, de muitas espécies, três tipos de reovírus distintos. Os três tipos partilham um antigénio de fixação do complemento. 0 reovírus humano consiste em três serotipos: tipo 1 (estirpe Lang ou TIL), tipo 2 (estirpe Jones, T2J) e tipo 3 (estirpe Dearing ou estirpe Abney, T3D). Os três serotipos são facilmente identificáveis com base nos ensaios de neutralização e de inibição da hemaglutinina (Sabin, A.B. (1959), Science 130: 966; Fields. B.N. et al. (1996), Fundamental Virology, 3a Edição, Lippincott-Raven; Rosen. L. (1960) Am. J. Byg. 71: 242; Stanley, N.F. (1967) Br. Med. Buli. 23: 150).

Embora o reovírus não seja conhecido por estar associado a nenhuma doença em particular, muitas pessoas estiveram expostas ao reovírus no momento em que atingiram a idade adulta (isto é, menos do que 25 % em crianças < 5 anos de idade, até mais do que 50% em pessoas com 20-30 anos de idade (Jackson G.G. e Muldoon R.L. (1973) J. 11

I

Infect. Die. 128: 811; Stanley N.F. (1974) em: Comparative Diagnosis of Virai Diseases, editado por E. Kurstak e K. Kurstak, 385-421, Academic Press, New York).

Para os reovirus de mamíferos, o sinal de reconhecimento da superfície das células é o ácido siãlico (Armstrong, G.D. et al. (1984), Virology 138: 37; Gentsch, J.R.K. e Pacitti, A.F. (1985), J. Virol. 56: 356; Paul R.W. et al. (1989) Virology 172: 382-385) Devido à natureza ubíqua do ácido siálico, o reovirus liga-se de forma eficiente a muitas linhas de células e como tal pode potencialmente atingir muitos tecidos diferentes; contudo, há diferenças significativas na susceptibilidade à infecção por reovirus entre as linhas de células.

Tal como se descreve aqui, os requerentes verificaram que as células que são resistentes à infecção pelo reovirus tornam-se sensíveis à infecção por reovirus quando transformadas por um gene na série de reacções de Ras. A "resistência" das células à infecção por reovirus indica que a infecção das células com o não resulta numa produção ou rendimento virais significativos. As células que são "susceptíveis" são as que demonstram indução de efeitos citopáticos, síntese de proteínas virais e/ou produção de vírus. Verificou-se que , a resistência à infecção por reovirus estava ao nível da tradução do gene, em vez da transcrição precoce: quando os transcríptos virais eram produzidos, as proteínas do vírus não eram expressas. Sem estar ligado a nenhuma teoria, pensa-se que a transcrição do gene virai em células resistentes correlacionadas com a fosforilação de uma proteína da célula com aproximadamente 65 kDa, que se determinou que era uma proteína-cinase activada por ARN (PCA, PKR na terminologia inglesa), não se observa em células transformadas. A fosforilação de PCA 12 leva à inibição da tradução. Quando se suprime a fosfo-rilação por meio de 2-aminopurina, um inibidor conhecido de PCA, ocorre um aumento drástico das sínteses das proteínas do reovírus nas células transformadas. Além disso, um modelo de rato com imunodeficiência combinada severa (IDCS) em que se criaram tumores em ambos os flancos traseiros direito e esquerdo, revelaram que o reovírus reduziu significativamente a dimensão do tumor quando injectado directamente no tumor do lado direito; além disso, também se notou uma redução significativa na dimensão do tumor do lado esquerdo que não tinha sido directamente injectado com o reovírus, indicando que a capacidade oncolítica do reovírus era sistémica assim como local.

Estes resultados indicam que o reovírus utliza o mecanismo da via de Ras das células hospedeiras para diminuir a regulação das PKR e isso reproduz. A figura 1 descreve a usurpação, pelo reovírus, da via de sinalização de Ras da célula hospedeira. Tal como se mostra na figura 1, tanto para as células não transformadas (resistentes a reovírus) como para as células EGFR-, Sos- ou transformadas de ras (sensíveis ao reovírus), a ligação do vírus, a internalização, a desprotecção e a transcrição precoce dos genes virais prosseguem normalmente. No caso de células não transformadas, as estruturas secundárias nos transcriptos virais precoces provocam inevitavelmente a fosforilação de PCR, activando-o assim, o que leva à fosforilação do factor de iniciação da tradução elF-2a ee portanto à inibição da tradução do gene virai. No caso das células de EGFR-, Sos-, ou células transformadas de ras, a etapa de fosforilação de PKR é evitada ou invertida por Ras ou por um dos seus elementos a jusante, permitindo assim que ocorra a tradução do gene virai. A acção de Ras (ou um dos seus elementos a jusante) pode ser simulada pela utilização de 2-aminopurina 13 (2-AP), que promove a tradução do gene víral (e conse-quentemente a infecção do reovírus) em células não transformadas por meio do bloqueio da fosforilação de PKR. A implantação de células humanas de tumor em ratos SCID é reconhecida como um sistema de um modelo bem conhecido para a análise da eficácia de vários agentes anti-tumor em seres humanos. Já fòi demonstrado antes que a os produtos farmacêuticos eficazes contra tumores humanos implantados em ratos SCID fazem prever a sua eficácia contra os mesmos tumores em seres humanos.

Com base nestas descobertas, os requerentes desenvolveram composições para o tratamento de distúrbios proli-ferativos mediados por ras em mamíferos. Os mamíferos representativos incluem cães, gatos, ovelhas, cabras, vacas, cavalos, porcos, primatas não humanos e seres humanos. Num enquadramento preferido,, o mamífero é um ser humano. 0 reovirus é administrado às células em proliferação mediada por ras, num indivíduo mamífero. Tipos representativos de reovirus humanos que podem ser utilizados incluem os do tipo 1 (por exemplo, estirpe Lang ou TIL); do tipo 2 (por exemplo, estirpe Jones ou T2J) ; e do tipo 3 (por exemplo, estirpe Dearing ou estirpe Abney, T3Dou T3A); também se podem utilizar outras estirpes de reovírus. Num enquadramento preferido, o reovírus é um serotipo 3 de reovírus humano, mais preferencialmente o reovírus é um serotipo 3 de reovírus humano da estirpe ' Dearing. Alternativamente, o reovírus pode ser um reovírus de mamífero não humano (por exemplo, um reovírus de primata não humano, tal como um reovírus de babuíno; equino; ou um reovírus canino}, ou um reovírus não pertencente a um mamífero (por exemplo um reovírus de aves). Pode-se 14 utilizar uma combinação de diferentes serotipos e/ou de estirpes diferentes de reovirus, tal como reovirus de espécies diferentes de animais. 0 reovirus pode ser de ocorrência natural ou modificado. 0 reovirus é de "ocorrência natural": quando pode ser isolado de uma fonte natural e não foi intencionalmente modificado por seres humanos no laboratório. Por exemplo, o reovirus pode ser de uma "fonte de campo": isto é, de um paciente humano. 0 reovirus pode estar modificado mas ainda capaz de infectar liticamente uma célula de mamífero que tenha uma via activa de ras. 0 reovirus pode ser pré-tratado quimicamente ou bioquimicamente (por exemplo, por tratamento com uma protease, tal como quimiotripsina ou tripsina) antes da administração às células em proliferação. 0 pré-tratamento com uma protease elimina a camada externa ou a cápside do vírus e pode aumentar a capacidade de infecção do vírus. 0 reovirus pode estar revestido num lipossoma ou micelas (Chandron e Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein mui and mulC is blocked by alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology 72 (1): 467-75 (1998)) para reduzir ou prevenir uma resposta imunitária de um mamífero que tenha desenvolvido imunidade ao reovirus. Por exemplo, o virião pode ser tratado com quimiotripsina ria presença de micelas que formam concentrações de detergentes de sulfato de alquilo para gerar uma nova partícula de sub-virião infeccioso.

Na presente invenção, o reovirus é um reovirus recombinante de dois ou mais tipos de reovirus com diferentes fenotipos patogénicos de tal modo que contenha 15 diferentes determinantes antigénicos reduzindo assim ou prevenindo uma resposta imunitária por um mamífero previamente exposto a um sub-tipo de reovírus. Esses viriões recombinantes podem ser gerados por co-infecção de células de mamíferos com diferentes sub-tipos de reovírus com o resultante recurso e incorporação de diferentes sub-tipos de proteínas de revestimento nas cápsides de virião resultantes. 0 reovírus pode ser modificado por incorporação de proteínas de revestimento mutadas, tal como, por exemplo σΐ, na cápside externa do virião. As proteínas podem ser mutadas por substituição, inserção ou eliminação. A substituição inclui a inserção de diferentes aminoácidos em lugar dos aminoácidos originais. As inserções incluem a inserção de resíduos adicionais de aminoácidos na proteína em uma ou mais localizações. As eliminações incluem eliminações de um ou mais resíduos de aminoácidos na proteína. Essas mutações podem ser geradas por processos conhecidos na técnica. For exemplo, a mutagénese dirigida ao sítio dos oligonucleótidos do gene que codifica para uma das proteínas de revestimento pode resultar na geração da proteína de revestimento mutante desejada. A expressão da proteína mutada nas células de mamífero infectadas in vitro com o reovírus, tal como células COST resulta na incorporação da proteína mutada na partícula do virião do reovírus (Turner e Duncan, "Site directed mutagenesis of the C-terminal portion of reovírus protein sigmal: evidence for a conformation-dependent receptor binding domain" Virology 186 (1): 219-27 (1992); Duncan et al., "Conformational and functional analysis of the C-terminal globular head of the reovírus cell attachment protein" Virology 182 (2): 810-9 (1991); Mah et al., The N-terminal quarter of reovírus cell 16 attachment protein sigma 1 possesses intrinsic virion-anchoring function" Virology 179 (1) : 95-103 (1990) ) O reovírus é preferencialmente um reovirus modificado para reduzir ou eliminar uma reacção imunitária ao reovirus. Esse reovírus modificado é designado por "reovírus imuno-protegido". Essas modificações podem incluir o englobar o reovírus num lipossoma, uma micela ou outro veículo para mascarar o reovírus do sistema imunitário dos mamíferos. Alternativamente, a cápside exterior da partícula do virião do reovírus pode ser eliminada dado que as proteínas presentes na cápside exterior são os determinantes principais das respostas humorais e celulares do hospedeiro.

Um "distúrbio proliferativo" é qualquer distúrbio celular em que as células proliferam mais rapidamente do que o crescimento normal do tecido. Assim,, uma "célula em proliferação" é uma célula que está em proliferação mais rapidamente do que as células normais. 0 distúrbio proliferativo inclui mas não se limita a neoplasmas. Um neoplasma é um crescimento anormal do tecido, geralmente formando uma massa distinta, que cresce por proliferação celular mais rapidamente do que o crescimento normal do tecido. Os neoplasmas exibem uma perda total ou parcial da organização estrutural e da coordenação funcional com o tecido normal. Podem ser classificados de uma forma ampla em três tipos principais. Os neoplasmas malignos que aparecem em estruturas epiteliais são designados por carcinomas, os neoplasms malignos que têm origem nos tecidos conjuntivos tal como músculo, cartilagem, gordura ou ossos são designados por sarcomas e os tumores malignos que afectam as estruturas hematopoiéticas (estruturas relacionadas com a formação das células do sangue) 17 incluindo componentes do sistema imunitário, são designados por leucemias e linfornas. Um tumor é o crescimento neoplá-sico do cancro. Tal como se utiliza aqui, um "neoplasma", também referido como um "tumor", engloba neoplasmas hemato-poiéticos tal como neoplasmas sólidos. Outros distúrbios proliferativos incluem, mas não se limitam a neurofi-bromatose.

Pelo menos algumas das células do distúrbio proli-ferativo tem uma mutação em que o gene de Ras (ou um elemento da via de sinalização de Ras) está activado, quer directaménte (por exemplo, por uma mutação de activação em Ras) ou indirectamente (por exemplo, por activação de um elemento a montante na via de Ras). A activação de um elemento a montante na via de Ras inclui, por exemplo, a transformação com o receptor do factor de crescimento epidérmico (RFCE) ou Sos. Um distúrbio proliferativo que resulta, pelo menos em pare, pela activação de Ras, um elemento a montante de Ras, ou um elemento na via de sinalização de Ras, é referido aqui como um "distúrbio proliferativo mediado por Ras

Um neoplasma que é particularmente sensível ao tratamento pelos processos da presente invenção é o cancro pancreático, por causa da prevalência dos neoplasmas mediados por Ras associados com o cancro pancreático. Outros neoplasmas que são particularmente sensíveis ao tratamento pelos processos da presente invenção incluem o cancro da mama, o cancro do sistema nervoso central (por exemplo, neuroblastoma e glioblastoma), cancro do sistema nervoso periférico, cancro do pulmão, cancro da próstata, cancro colorectal, cancro da tiróide, cancro renal, cancro das supra-renais, cancro do fígado, linforna e leucemia. Um distúrbio proliferativo que é particularmente sensivel ao 18 tratamento pelos processos da presente invenção inclui neurofibromatose I por causa da activação da via de ras. "Administração a uma célula em proliferação ou neo-plasma" indica que o reovírus é administrado de uma maneira tal que contacta com as células em proliferação ou as células do neoplasma (também referidas aqui como "células neoplásicas") . A via pela qual se administra o reovírus, assim como a formulação, e o veiculo dependerão da localização assim como do tipo de neoplasma. Pode-se utilizar uma ampla variedade de vias de administração..Por exemplo, para um neoplasma sólido que está acessível, o reovírus pode ser administrado por injecção directamante ao neoplasma. Para um neoplasma hematopoiético, por exemplo, o reovírus pode ser administrado intravenosamente ou intravascularmente. Para neoplasmas que não. são facilmente acessíveis dentro do corpo, tal como metástases ou tumores do cérebro, administra-se o reovírus de uma maneira tal que pode ser transportado sistemicamente através do corpo do mamífero e assim atingir o neoplasma. (por exemplo, intratecalmente, intravenousamente ou intramuscularmente}. Alternativamente, o reovírus pode ser administrado directamente a um neoplasma sólido simples, em que é transportada então sistemicamente através do corpo até às metástases. 0 reovírus pode também ser administrado sub-cutaneamente, intraperitonealmente, topicamente (por exemplo, para o melanoma), oralmente (por exemplo, para neoplasma oral ou esofágico), rectalmente (por exemplo, para neoplasma colorectal), vaginalmente (por exemplo, para neoplasma cervical ou neoplasma vaginal), nasalmente ou por aerossol de inalação (por exemplo, para neoplasma do pulmão). 0 reovírus pode ser administrado sistemicamente a mamíferos que estão comprometidos sob o ponto de vista 19 imunitário ou que não desenvolveram imunidade aos epítopos de reovirus. Nesses casos, o reovirus administrado sistemicamente, isto é, por injecção intravenosa, irá contactar as células em proliferação resultando na lise das células.

Os mamíferos imuno-competentes previamente expostos a um sub-tipo de reovirus podem ter desenvolvido uma imunidade humoral e/ou celular a esse sub-tipo de reovirus. Apesar disso, verificou-se que a injecção directa do reovirus num tumor sólido em mamíferos imuno-competentes resultará na lise das células neoplásicas.

Por outro lado, quando se administra o reovirus sistemicamente a mamiferos imuno-competentes, os mamíferos podem produzir uma resposta imunitária ao reovirus. Essa resposta imunitária pode ser evitada se o reovirus for de um sub-tipo para o qual o mamífero não tenha desenvolvido, imunidade, ou o reovirus tenha sido modificado de tal forma que está imuno-protegído, por exemplo, por digestão da protease da cápside externa ou incluída numa micela.

Alternativamente, considera-se, em principio, que a imunocompetência do mamífero contra o reovirus pode ser suprimido quer por co-administração de produtos farmacêuticos conhecidos na técnica para suprimir o sistema imunitário em geral (Cuff et al. , "Enteric reovirus infection as a probe to study immunotoxicity of the gastrointestinal tract" Toxicological Sciences 42 (2) :99-108 (1998)) ou alternativamente a administração de anticorpos anti-antireovírus.. A imunidade humoral do mamífero contra o reovirus pode tarribém ser temporariamente reduzida ou suprimida pela plasmoforese do sangue dos mamíferos para eliminar os anticorpos anti-reovírus. A imunidade humoral 20 do mamífero contra o reovírus pode adícionalmente ser temporariamente reduzida ou suprimida pela administração intravenosa ao mamífero de imunoglobulina não específica.

Considera-se que o reovírus pode ser administrado a mamíferos imunocompetentes imunizados contra o reovírus em conjunto com a administração de anticorpos anti-anti-reovírus. "Anticorpos anti-antireovírus" são anticorpos dirigidos contra anticorpos anti-reovírus. Esses anticorpos podem ser produzidos por processos conhecidos na técnica. Ver por exemplo "Antibodies: A laboratory manual" E. Harlow e D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Esses anticorpos anti-antireovírus podem ser administrados antes, ao mesmo tempo ou pouco depois da administração do reovírus. Preferencialmente administra-se uma quantidade efectiva dos anticorpos anti-antireovírus durante o tempo suficiente para reduzir ou eliminar Uma reposta imunitária por parte do mamífero ao reovírus administrado. A expressão "lise substancial" significa pelo menos 10 % das células em proliferação células são lisadas, mais preferencialmente pelo menos 50 % e ainda mais preferen-cialmente pelo menos 75 % das células sofrem lise. A percentagem de lise pode ser determinada para células de tumor por meio da medição da redução da dimensão do tumor no mamífero ou a lise das células de tumor in vitro.

Um "mamífero de que se suspeita que tenha um distúrbio proliferativo" significa que o mamífero· pode ter um distúrbio proliferativo ou um tumor ou a quem tenha sido diagnosticado um distúrbio proliferativo ou um tumor ou a quem tenha sido diagnosticado previamente um distúrbio proliferativo ou um tumor, o tumor ou praticamente todo o tumor tenha sido eliminado cirurgicamente e de que se 21 suspeita que o mamífero seja portador de algumas células residuais de tumor. A presente invenção também inclui composições farmacêuticas que contêm, como ingrediente activo, um ou mais dos reovírus associados com "veículos ou excipiente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ". Na produção das composições da presente invenção, o ingrediente acti-vo/reovirus é normalmente misturado com um excipiente, diluído por meio de um excipiente ou englobado num veículo que possa estar sob a forma de uma cápsula, saqueta, papel ou outra embalagem. Quando o excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico serve como um diluente, pode ser um material sólido, semi-sólido, ou líquido, que actua como um veículo ou um meio para o ingrediente activo. Assim, as composições podem estar sob a forma de comprimidos, pílulas, pós> pastilhas, saquetas, cachets, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (tal como um sólido num meio líquido), pomadas contendo, por exemplo, até 10 % em peso do composto activo, cápsulas de gelatina mole ou dura, supositórios, soluções injectáveis esterilizadas, e pós esterilizados embalados.

Alguns exemplos de excipientes apropriados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatia, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água esterilizada, xarope e celulose metílica. As formulações podem incluir adicionalmente: agentes de lubrificação tal como talco, estearato de magnésio, e óleo mineral; agentes de molhagem; agentes emulsionantes e de suspensão; agentes conservantes tais como benzoatos de metilo e de propil-hidroxi; agentes adoçantes; e agentes aromatizantes. As composições da pre- 22 sente invenção podem ser formuladas de modo a providenciar uma difusão rápida, sustentada ou retardada do ingrediente activo após a administração ao doente, utilizando processos conhecidos na técnica.

Para a preparação de composições sólidas tais como comprimidos, mistura-se o ingrediente activo princi-pal/reovírus com um excipiente farmacêutico para formar uma pré-formulação sólida da composição contendo uma mistura homogénea de um composto da presente invenção. Quando se referem estas pré-formulações das composições como homogéneas, significa que o ingrediente activo está disperso de uma forma homogénea pela composição de tal modo que a composição possa ser facilmente sub-dividida em formas de doses unitárias igualmente efectivas tais como comprimidos, pilulas e cápsulas.

Os comprimidos ou pilulas da presente invenção podem ser revestidos ou de outro modo compostos para providenciar uma forma de dosagem que traga a vantagem de uma acção prolongada. Por exemplo, o comprimido ou a pilula podem compreender uma dosagem mais interna e um componente de dosagem, estando esta última sob a forma de um envelope da primeira. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente mais interno passe intacto para o duodeno ou que se seja difundido de forma retardada. Pode-se utilizar uma variedade de materiais para essas camadas entéricas ou revestimentos, materiais esses que incluem um certo número de ácidos pomenteméricos e misturas de ácidos pomenteméricos com materiais tais como goma-laca, álcool de cetilo, e acetato de celulose. 23

As formas líquidas em que as novas composições da presente invenção podem ser incorporadas por administração oral ou por injecção, incluem soluções aquosas, xaropes aromatizados apropriadamente, suspensões aquosas ou oleosas e emulsões aromatizadas com óleos comestíveis tal como óleo de milho, óleo de sementes de algodão, óleo de sésamo, óleo de coco, ou óleo de amendoim, assim como elixires e veículos farmacêuticos similares.

As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em dissolventes aquosos ou orgânicos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou as suas misturas e pós. As composições líquidas e sólidas podem conter excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico tal como se descreve aqui. Preferencialmente as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para um efeito local ou sistémico. As composições preferencialmente em dissolventes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico podem ser nebulizadas por meio da utilização de gases inertes. As soluções nebulizadas podem ser inaladas directamente a partir de dispositivos de nebulização ou os dispositivos de nebulização podem estar ligados a uma máscara facial ou a uma máquina de respiração intermitente de pressão positiva. As composições em soluções, suspensões ou pós podem ser administradas preferencialmente oralmente ou nasalmente, a partir do dispositivo que difunde a formulação de uma forma apropriada.

Uma outra formulação preferida utilizada nos processos da presente invenção utiliza dispositivos de difusão transdérmica ("adesivos"). Esses adesivos transdérmicos podem ser utilizados para providenciar infusão contínua ou descontínua do reovírus da presente invenção, em quantidades controladas. 0 fabrico e a utilização de adesi- 24 vos transdérmicos para a difusão de agentes farmacêuticos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. 5.023.252, aqui incorporada como referência. Esses adesivos podem ser preparados para difusão dos agentes farmacêuticos de forma continua, por impulsos, ou à medida do necessário.

Outras formulações apropriadas para serem utilizadas na presente invenção podem encontrar-se em Remington ' s Pharmaceutical Sciences. O reovirus ou a composição farmacêutica que contém o reovirus podem ser embalados em kits apropriados que providenciam os materiais necessários embalados em embalagens apropriadas. Considera-se que os kits podem também incluir agentes quimioterapêuticos e/ou anticorpos anti-antireovirus. 0 reovirus é administrado numa quantidade que é suficiente para tratar o distúrbio proliferativo (por exemplo, uma "quantidade efectiva"). Um distúrbio proliferativo é "tratado" quando a administração do reovirus às células em proliferação efectua a lise das células em proliferação. Isto pode resultar numa redução da dimensão do neoplasma, ou numa eliminação completa do neoplasma. A redução da dimensão do neoplasma, ou a eliminação do neoplasma, é geralmente causada pela lise das células neoplásicas ("oncólise") pelo reovirus. Preferencialmente, uma quantidade efectiva é a quantidade capaz de inibir o crescimento das células do tumor. Preferencialmente, uma quantidade efectiva varia desde cerca de 1,0 ufp/kg de peso do corpo até cerca de 1013 ufp/kg de peso do corpo, mais preferencialmente desde cerca de 102 ufp/ de peso do corpo até cerca de 1013 ufp/kg de peso do 25 corpo. Por exemplo, para o tratamento de um ser humano, pode-se utilizar aproximadamente 102 a 1G17 unidades de formação de placa (UFP) de reovirus, consoante o tipo, dimensão e número de tumores presentes. A quantidade efectiva será determinada numa base individual e pode basear-se, pelo menos em parte, tendo em consideração o tipo de reovirus; a via de administração escolhida; a dimensão individual, idade e género; a severidade dos sintomas do doente; a dimensão e outras caracteristicas do neoplasma; e similares. A terapia pode durar desde vários dias até vários meses ou até se conseguir a diminuição da doença. 0 reovirus pode ser administrado numa dose única, ou doses múltiplas (isto é, mais do que uma dose) . As doses múltiplas podem ser administradas ao mesmo tempo ou em sequência (por exemplo durante um período de dias ou semanas). 0 reovirus também pode ser administrado para mais do que um neoplasma no mesmo indivíduo.

As composições são formuladas preferencialmente numa forma de dosagem unitária, contendo cada dose desde cerca de 102 ufps até cerca de 1013 ufps do reovirus. A expressão "formas de dosagem unitárias" refere-se a unidades discretas sob o ponto de vista físico apropriadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e outros mamíferos, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de .· reovirus calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente apropriado, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Verificou-se que o reovirus é eficaz para o tratamento de neoplasmas sólidos em mamíferos imuno-competentes. A administração de reovirus mão modificado, directamente ao 26 neoplasma resulta na oncólise of das células neoplásicas e na redução da dimensão do tumor.

Considera-se que o reovirus pode ser administrado em conjunto com cirurgia ou eliminação do neoplasma. Por isso, a presente invenção providencia processos para o tratamento de um neoplasma sólido compreendendo a remoção cirúrgica do neoplasma e administração de um reovirus no sítio ou próximo do sítio do neoplasma.

Considera-se que o reovirus pode ser administrado em conjunto ou em adição à terapia de radiação.

Considera-se ainda que o reovirus da presente invenção pode ser administrado em conjunto ou em' sobreposição a compostos anti-cancro ou agentes quimioterapêuticos conhecidos. Os agentes quimioterapêuticos são compostos que podem inibir o crescimento de tumores. Esses agentes incluem, mas não se limitam a 5-fluorouracilo, mitomicina C, metotrexato, hidroxiureia, ciclofosfamida, dacarbazina, mitoxantrona, antraciclinas (Epirubicina e Doxurubicina), anticorpos dos receptores, tal como herceptina, etopósido, pregnasoma, compostos de platina tais como carboplatina e cisplatina, taxanos tais como taxol e taxotere, terapias hormonais tais como tamoxifen e anti-estrogénios, inter-ferões, inibidores de aromatase, agentes progestacionais e análogos de LHRH.

Preferencialmente o reovirus é administrado na ausência de 1,3-bis (2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU) . Por exemplo, não se administra a 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU) ao mamífero quer antes, durante ou depois de o mamífero receber o reovirus. 27

Verificou-se que o reovirus da presente invenção reduz o crescimento de tumores com metástases. Num enquadramento da presente invenção, providenciam-se composições para a redução do crescimento de tumores com metástases mamífero.

Utilidade 0 reovirus da presente invenção pode ser utilizado para o tratamento de distúrbios proliferativos mediados por ras num mamífero, para reduzir ou eliminar neoplasmas, para o tratamento de metástases. Podem ser utilizados em conjunto com tratamentos conhecidos para o cancro incluindo cirurgia, quimioterapia e radiação. EXEMPLOS dados com fins informativos

Nos exemplos que se seguem, todas as temperaturas estão em graus Celsius (a menos . que seja indicado doutra forma) e todas as percentagens são percentagens em peso (também a menos que seja indicado doutra forma).

Nos exemplos que se seguem, as abreviaturas têm os significados dados a seguir. Se uma abreviatura não estiver definida, é porque tem um significado geralmente aceite: μΜ = ιαΜ = Μ = ml = μΐ = mg = pg = EGPA = rpm = micromolár milimolar molar mililitro microlitro miligrama micrograma electroforese em gêl de poliacrilamida revoluções por minuto 28 SBF = soro de bovino fetal DTT= ditiotrietol SDS = sulfato de dodecilo e sódio PBS = solução salina tamponada com fosfato MEMD = meio de Eagle modificado por Dulbecco α-MEM = α-meio de Eagle modificado β-ΜΕ = β-mercaptoetanol MDI = multiplicidade da infecção UFP = unidades de formação de placas MAPC = MAP-cinase MAPC-fosf = MAP-cinase fosforilada PRB - peroxidase de rábano PCR = proteina-cinase activada por ARN de hélice dupla RCP-TI = inversa reacção em cadeia de. polimerase- transcriptase GAPDH = gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase RFCE = receptores do factor de crescimento epidérmico CEM cinase = cinase regulada pelo sinal extracelular activado por mitogénio DMSO = dimetilsulfóxido IDSC = imunodeficiência severa combinada

Processos gerais Células e Vírus

As células parentais de NIH-3T3 e as células NIH-3T3 transfectadas com os oncogenes Harvey-ras (H-ras) e EJ-ras foram uma generosa oferta do Dr. Douglas Faller (Boston University School of Medicine). As células NIH-3T3 em conjunto com as suas contra-partes Sos transformadas (designadas por TNIH#5) foram uma generosa oferta do Dr. Michael Karin (University of Califórnia. San Diego). 0 Dr. H.-J. Kung (Case Western Reserve University) doou gentil- 29 mente as células parentais de NIH-3T3 em conjunto com as células NIH-3T3 células transfectadas com o oncogene v-erbB (designadas por TC-11). As células 2H1, um derivado da linha de fibroblastos de murino C3H 10T1/2, contendo o gene Harvey-ras sob o controlo transcricional do promotor de metalotioneina de rato, foram obtidas do Dr. Nobumichi Hozumi (Mount Sinai Hospital Research Institute). Estas-células 2H1 são transformantes condicionais de ras que expressam o oncogene de H-ras na presença de 50 μΜ de ZnS04. Todas as linhas de célula cresceram em meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) contendo 10 % de soro bovino fetal (SBF).

Obtiveram-se as células NIH-3T3 tet-mic do Dr. R.N. Johnston (University of Calgary) que cresceram em MEMD contendo 10 % de SBF inactivado pelo calor e antibióticos na presença ou na ausência de 2 pg/rnl tetraciclina (Helbing, C.C. et al, Cancro Res. 57: 1255-1258 (1997)). Na presença de tetraciclina, a expressão do gene humano c-mic fica reprimida. A eliminação da tetraciclina resulta, no aumento da expressão de c-mic até 100 vezes nestas células, que também exibe um fenotipo transformado.

Obtiveram-se os fibroblastos de embrião de rato (FERs) PCR +/~ e PCR. °/° do Dr. B.R.G. Williams (te Cleveland Clinic Foundation) e cresceram em α-MEM contendo soro bovino fetal e antibióticos tal como descrito previamente (Yang, Y.L. et al. EMBO J. 14: 6095-6106 (1995). Der, S.D. et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 3279-3283 (1997)). A estirpe Dearing do serotipo 3 de reovirus serotipo utilizado nestes estudos foi propagada em culturas de suspensão de células L e foi purificada de acordo com Smith (Smith. R.E. et al., (1969) Virology, 39: 791-800} com a 30 excepção de que se omitiu β-mercaptoetanol (β-ΜΕ) do tampão de extracção. 0 reovirus marcado com [35S]-metionina cresceu e foi purificado conforme descrito por McRae e Joklik (McRae, M.A. e Joklik, W.K., (1978) Virology, 89: 578-593). A taxa de partícula /UFP para o reovirus purificado foi normalmente de 100/1.

Análise por imunofluorescência da infecção pelo reovirus

Para os estudos de imunofluorescência de NIH-3T3, TNIH#5, H-ras, as células de EJ-ras, 2H1 (V ZnS04), e TC-11 cresceram em coberturas de vidro,. e foram infectadas com reovirus numa multiplicidade de infecções (MDI) de ~ 10 UFP células ou infecções simuladas por aplicação do agente veicular (solução salina às células. 48 horas após a infecção, fixaram-se as células numa mistura de eta-nol/ácido acético (20/1) durante 5 minutos, depois voltou a hidratar-se por lavagens sequenciais em 75 %, 50. % e 25 % de etanol, seguido de quatro lavagens com solução salina tamponada com fosfato (STF). As células fixadas e re-hidratadas foram então expostas ao anticorpo primário (soro de anti-reovírus do tipo 3 policlonal de coelho diluído a 1/100 em SBF) [anti-soro preparado por injecçâo a coelhos de serotipo 3 de reovirus em adjuvante completo de Freund, e subsequentes hemorragias] durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de três lavagens com SBF, as células foram expostas ao segundo anticorpo (conjugado de IgG anti-coelho de cabra / isotiocianato de fluoresceína (molécula completa) (ITCF) [Sigma ImmunoChémicals F-0382] diluído a 1/100 em SBF contendo 10 % de soro de cabra e 0,005 % de azul de Evan] durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as células fixadas e tratadas foram lavadas mais três vezes com- SBF e depois uma vez com água duplamente destilada, secou-se e montou-se em lâminas em 90 % de glicerol 31 contendo 0, 1 % de fenilenodiamina, e examinou-se com um microscópio Axiofot da Zeiss no qual se montou uma câmara Cari Zeiss (o aumento para todas as fotografias foi de 200X).

Detecção da actividade da MAP Cinase (ERC)

Utilizou-se o kit do anticorpo FosfoPlus p44/42 MAP cinase (Tr202/Tir204) (New England Biolabs) para a detecção de MAP cinase nos lisados de células de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, fez-se a lise de culturas em mono-camadas sub-confluentes com o tampão de amostra contendo SDS recomendado e submeteu-se a EGPA-SDS, seguido de electro-mancha em papel de nitrocelulose. Fez-se então uma sondagem da membrana com o anticorpo primário (MAPC anti-total ou anti-fosfo-MAPC) , seguido do antocorpo secundário conjugado com peroxidase se rábano (PRB) conforme descrito no manual de instruções do fabricante.

Radiomarcação das células infectadas por reovírus e preparação de lisados

Monocamadas confluentes de células NIH-3T3, TN1H#5, liras, EJ-ras, 2H1 (+/-ZnS04) , e TC-11 foram infectadas com reovírus (MDI-10 UFP/célula). 12 horas após a infecção, substituiu-se o meio com MEMD isento de metionina contendo 10 % de SBF díalisado e 0,1 mCi/ml de [35S] metionina.

Depois de mais uma incubação de 36 horas a 37°C, lavaram-se as célulasem solução salina tamponada com fosfato (STF) e fez-se a lise no mesmo tampão contendo 1 % de Triton X-100, 0,5% de desoxicolato de sódio e EDTA 1 mM. Retiraram-se então os núcleos por meio de uma centrifugação a baixa velocidade e armazenaram-se os sobrenadantes a -70 °C até à sua utilização.' 32

Preparação de extractos citoplásmicos para ensaios de cinase in vitro Várias linhas de células em monocaraadas confluentes cresceram em placas de cultura de 96 cavidades. No momento apropriado após a infecção, aspirou-se o meio e fez-se a lise das células com um tampão contendo HEPES 20 mM [pH 7,4], KC1 120 mM, MgCl2 5 mM, ditiotreitol 1 mM, 0,5 % de Nonidet P-40, 2 pg/ml de- leupeptina, e 50 pg/ml de aprotinina. Retiraram-se então os núcleos por meio de uma centrifugação a baixa velocidade e armazenaram-se os sobrenadantes a -70 °C até à sua utilização.

Os extractos citoplásmicos foram normalizados para as concentrações de proteína antes da sua utilização por meio de um processo de micro-ensaio da proteína da Bio-Rad. Cada reacção de cinase in vitro continha 20 μΐ de extracto de célula, 7,5 μΐ de tampão de reacção (HEPES 20 mM [pH 7,4], M KCl 120 m, MgCl2 5 mM, ditiotreitol 1 mM, e 1 % de glicerol) e incubou-se 7,0 μΐ de uma mistura de ATP (1,0 μΟϊ [γ-32Ρ] ATP em 7μ1 de tampão de reacção), e incubou-se durante 30 minutos a 37 °C (Mundschau, L.J., e Faller, D.V., J. Biol. Chem., 267: 23092-23098 (1992)). Imediata- mente após a incubação os extractos marcados ou foram fervidos em SDS de Laemmii SDS - tampão de amostra ou precipitaram com pérolas de agarose-poli(I)poli(C) ou imuno-precipitaram com anticorpo anti-PCR.

Precipitação em agarose poli (L)poli (C)

Adicionou-se a cada mistura reaccional de cinase in vitro, 30 μΐ de uma pasta a 50 % de Ag poli (I) poli (C) do tipo 6 (Pharmacia LKB Biotechnology), e incubou-se a mistura a 4 °C durante 1 h. Lavaram-se então quatro vezes 33 as pérolas de Ag poli(I)poli(C) com as proteínas marcadas absorvidas, com tampão (HEPES 20 m M [7,5 pH], KC1 90 mM, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 2 mM, 10 % de glicerol) à temperatura ambiente e misturou-se 2X com tampão de amostra de SDS Laemmli. Ferveram-se então as pérolas durante 5 min, e as proteínas libertadas foram analisadas por EGPA-SDS.

Reacção em cadeia de polimerase

Em vários momentos após a infecção, colheram-se as células e voltou a fazer-se uma suspensão em TNE arrefecido com gelo (Tris 10 mM [pH 7,8], NaCl 150 mM, EDTA 1 mM) e depois adícionou-se-lhe NP-40 até a uma concentração final de 1 %. Passados 5 minutos, fez-se uma peletização dos núcleos e extraiu-se o ARN do sobrenadante utilizando um processo com fenol:clorofórmio. Submeteram-se quantidades iguais de ARN celular total de cada amostra e submeteram-se depois a RCP-TI (Wong, H., et al., (1994) Anal. Biochem., 223: 251-258) utilizando aleatoriamente iniciadores de hexanucleótidos (Pharmacia) e RTase (GIBCO-BRL) de acordo com o protocolo do fabricante. Os ADNcs da etapa de RCP-TI foram então submetidos a uma ampliação selectiva do ADNc sl do reovírus utilizando os iniciadores 5'-AAT T C GAT T TAGGT GACACTATAGCTAT T GGT CGGAT G-3' (SEQ ID N0:1) e 5 T-CCCTTTTGACAGTGATGCTCCGTTATCACTCG-3’ (SEQ ID N0:2) que ampliaram um fragmento previsto de 116 pb. Estas sequências de iniciadores derivaram das sequências Sl sequências determinadas previamente (Nagata, L, et. al., (1984) Nucleic Acids Res., 12: 8699-8710). Os iniciadores de GAPDH (Wong, H., et al., (1994) Anal. Biochem., 223:251-258), 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-31 (SEQ ID N0:3) e 5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-31 (SEQ ID NO:4) foram utilizados para ampliar um fragmento previsto de GAPDH de 30 6 bp que serviu como um controlo da RCP e carga do gel. A ampliação 34 selectiva dos ADNcs de sl e de GAPDH foi realizada utilizando Taq ADN polimerase. (GIBCO-BRL) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando um sistema 9600 de Gene Amp PCR da Perkin Elmer. Realizou-se a RCP em 28 ciclos cada um deles consistindo numa etapa de desnaturação durante 30 segundos a 97°C, uma etapa de enrolamento durante 45 segundos a 55 °C, e uma etapa· de polimerização durante 60 segundos a 72 °C. Analisaram-se os produtos da RCP por electroforese por meio de um gel de agarose com 2 % de TAE impregnado com brometo de etídio e fotografou-se com iluminação ultra-violeta com um filme Polaroid 57.

Imuno-precipitação e análise por EGPA-SDS

Realizou-se a imuno-precipitação dos lisados de células infectadas com reovirus marcado com 35S com soro do

serotipo 3 anti-reovirus tal como descrito previamente (Lee, P.W.K. et al. (1981) Virology, 108: 134-146). A imuno-precipitação dos lisados de células marcadas com 32P com um anticorpo anti-RCP (do Dr. Michael Matews, Cold Spring Harbor) foi realizada de forma semelhante. Analisaram-se os imuno-precipitados por meio de EGPA-SDS descontinua de acordo com o protocolo de Laemmli (Laemmli, U.K., (1970) Nature, 227: 680-685). EXEMPLO 1. Produtos intermédios activados na via de sinalização de aumente a eficiência da infecção com o Reovirus Já se demonstrou antes que as células 3T3 e os seus derivados a que faltam receptores do factor de crescimento epidérmico (RFCE) dificilmente se podem infectar com o reovirus, enquanto as mesmas células transformadas quer com RFCE ou com v-erb B são altamente sensíveis tal como se pode determinar pelos efeitos citopáticos, síntese virai 35 das proteínas e saída do vírus (Strong, J.E. et al.,{1993) Virology, 197: 405-411; Strong, J.E. e Lee, P.W.K., (1996) J. Virol., 70: 612-616).

Para determinar se os mediadores a jusante da via de transdução de sinal de RFCE podem estar envolvidos, fez-se a análise de um certo número de derivados diferentes de NIH 3T3, transformadas com oncogenes activados constitutivamente, a jusante de RFCE quanto à sensibilidade relativa à infecção pelo reovírus infecção. De particular interesse foram os produtos intermédios na via de sinalização de ras (revisto por Barbacid, M., Annu. Rev, Biochem., 56: 779-827 (1987); Cahill, M.A., et al. , Curr. Biol., 6: 16-19 (1996) . Para investigar a via de sinalização de Ras, transfectaram-se as linhas de células parentais de NIH 3T3 e NIH 3T3 com aversões activadas de Sos (Aronheim, A., et al.,(1994) Célula, 78: 949-961) ou ras (Mundschau. L.J. e Faller, D.V., (1992) J. Biol.Chem., 267: 23092-23098) e expuseram-se os oncogenes ao reovírus, e comparou-se a sua capacidade para promover a síntese da proteína virai.

Realizou-se inicialmente a detecção das proteínas virais utilizando a microscopia de imunofluorescência indirecta, tal como se descreveu antes. Os resultados indicaram que enquanto as células NIH 3T3 adoptaram uma morfologia tipicamente plana, uma morfologia estendida com uma marcada inibição de contacto, as células transformadas cresceram todas como células em forma de bilro com muito menos inibição de contacto. Ao comparar as linhas de células parentais não infectadas com as várias linhas de células transformadas, será evidente que a morfologia das células era bastante distinta após a transformação. Após um reforço com reovírus, tornou-se claro que a linha parental de NIH 3T3 dificilmente era infectável (< 5%), independen- 36 temente da fonte da linha parental de NIH 3T3. Ao contrário, cada uma das linhas de células transfectadas demonstrou uma imuno-fluorescência relativamente pronunciada, 48 horas após a infecção (dados não mostrados).

Para demonstrar que a sintese das proteínas virais era mais eficiente nas linhas de células transformadas de Sos ou de Ras, as células foram continuamente marcadas com [35S]-metionina 12 a 48 h após a infecção e analisaram-se as proteínas por meio de electroforese em gel de poliacrilamida - sulfato de dodecilo e sódio (EGPA-SDS), conforme se descreveu antes. .Os resultados mostraram claramente que os- níveis de síntese de proteína virai foram significativamente mais elevados nas células transformadas de Sos ou de Ras do que nas células parentais de NIH 3T3. As identidades das bandas virais foram conformadas por imuno-precipitação das proteínas marcadas com anticorpos anti-reovírus policlonais. Dado que as células NIH 3T3 não infectadas e as suas contra-partes transformadas exibiam níveis comparáveis de síntese de proteínas celulares e tempos duplos (dados não mostrados), a diferença observada no nível de síntese de proteína virai não pode ser devida a diferenças intrínsecas nas taxas de crescimento ou nas eficiências de tradução para estas linhas de células. A destruição a longo prazo das células NIH-3T3 infectadas foi seguida da passagem destas células durante pelo menos 4 semanas. Cresceram normalmente e pareceram saudáveis, sem sinais de infecção lítica ou persistente; não se detectou nenhum vírus no meio depois deste tempo (dados não mostrados). 37 EXEMPLO 2. A infectibilidade aumentada, conferida por oncoqenes activados não se deve à transformação a longo prazo nem a um estado de transformação generalizada da célula

Para determinar se as diferenças de susceptibilidade podem ser o resultado de -efeitos a longo prazo da transformação ou o resultado do próprio oncogene activado, fez-se um ensaio da uma linha de células que expressam um gene celular de Harvey-ras (c-H-ras) indutivel por zinco para avaliar a susceptibilidade à infecção pelo reovirus, tal como descrito antes. Estas células, designadas por 2HI, derivaram da linha de células C3H 10T1/2 que é pouco infectável pelo reovirus (dados não mostrados), e que comporta o gene c-H-ras sob o controlo do promotor de metalotionina-I de rato (Trimble, W.S. et al. (1986) Nature, .321: 782-784) .

As células ou foram tratadas de forma simulada com ed ou pré-tratadas com ZnS04 50 μΜ 18 horas antes da infecção ou da pseudo-infecção (administração do agente veicular) , seguida da análise indirecta por imuno-fluorescência destas células 48 horas após a infecção ou a pseudo-infecção.

Os resultados (não mostrados) demonstraram que as células não induzidas foram muito pouco infectadas {< 5 %) enquanto as induzidas apenas durante 18 horas eram muito mais susceptiveis (> 40 %) . O aumento da síntese da proteína virai induzida por Zn, nas células 2H1, foi ainda confirmado pela marcação metabólica das células com [35S]metionina seguida de uma análise por EGPA-SDS das proteínas específicas do vírus (não mostrados). 38

Com base nestas observações, o aumento da eficiência da infecção pelo reovirus nas células transformadas é um resultado directo dos produtos activados do oncogene e não é devido a outros factores tais como aneuplòidia muitas vezes associadas a uma transformação a longo prazo ou outras mutações acumuladas que podem ser adquiridas num estado transformado cronicamente (por exemplo, activação de p53 ou de mic).

Para demonstrar melhor que a susceptibilidade para a infecção pelo reovirus não é um resultado da transformação per se (isto é, um resultado do estado transformado da célula hospedeira), examinaram-se células NIH-3T3 contendo um gene c-mic humano controlado por tetraciclina (células tet-raic) (Helbing, C.C. et al., Cancro Res. 57: 1255-1258 (1997)) . Estas células normalmente mantêm-se em tetraciclina (2 pg/ml) que reprime a expressão de c-mic. A eliminação da tetraciclina em condições normais de crescimento (soro bovino fetal a 10 %) leva à acumulação da proteína de c-Mic e as células, exibem um fenotipo transformado. Os requerentes verificaram que estas células não eram capazes de suportar o crescimento do vírus quer na presença ou na ausência de tetraciclina (dados não mostrados), sugerindo que a susceptibilidade para a infecção pelo reovirus não é devida, em geral ao estado geral de transformação da célula hospedeira, mas em vez disso requer uma transformação específica por meio de elementos da via de sinalização de Ras.

Um bom indicador da activação da via de sinalização de Ras é a sinalização da activação das cinases de MAP, ERC1 e ERC2 (para uma revisão, ver Robinson, M.J. e Cobb, M.H., Curr. Opin. Cell. Biol. 9: 180-186 (1997)). Sob este ponto de vista, verificou-se que, comparadas com as células não 39 transformadas, as células transformadas por Ras têm uma actividade de ERC1/2 significativamente mais elevada (dados não mostrados) . Além disso, um exame a um certo número de linhas de células de cancro humano revelou uma excelente correlação entre o nível de. actividade de ERC1/2 e a susceptibilidade para a infecção por reovírus (dados não mostrados), embora a própria ERC1/2 não pareça representar qualquer papel nela. As células L de rato e as células HeLa humanas, nas quais o reovírus cresce muito bem, não manifestaram uma actividade elevada de ERC1/2 (dados não mostrados). EXEMPLO 3 Os transcritos virais são gerados mas não tra-duzidos em células NIH 3T3 resistentes ao reovirus A etapa na qual a infecção pelo reovírus é bloqueada era células NIH 3T3 não sensíveis, foi também identificada. Dado que a ligação do vírus e a internalização do vírus para células não sensíveis foram comparáveis às observadas para células, sensíveis (Strong, J.E. et al., (1993) Virology, 197: 405-411), investigou-se a transcrição de genes virais.

As quantidades relativas dos transcritos SI do reovírus geradas nas células NIH . 3T3 e as células transformadas de Ras durante as primeiras 12 horas de infecção, foram comparadas, depois da ampliação destes transcritos, por meio de uma reacção em cadeia de polimerase (RCP) , tal como se descreveu antes. Os resultados demonstraram que as taxas de acumulação dos transcritos Sinas duas linhas de células foram similares, pelo menos até 12 horas após a infecção. Obtiveram-se dados semelhantes quando as taxas de acumulação de outros transcritos de reovírus foram comparadas (dados não 40 mostrados). Estes resultados demonstram que o bloqueio da infecção em células não sensíveis não está ao nível da transcrição de genes virais, mas em vez disso ao nível da tradução dos transcriptos.

Em momentos posteriores, o nível de transcriptos virais presentes nas células NIH-3T3 não transformadas decresceu significativamente enquanto os transcriptos nas células transformadas continuou a acumular-se (dados não mostrados). A incapacidade destes transcriptos para serem traduzidos em células NIH-3T3 contribuiu provavelmente para a sua degradação. Tal como se esperava, o nível de transcriptos virais em células L infectadas foi pelo menos comparável ao das células.transformadas de Ras (dados não mostrados). EXEMPLO 4. Uma proteína de 65 kDa é fosforilada em células NIH 3T3 tratadas com reovírus mas não em células transformadas infectadas com reovírus

Dado que os transcriptos virais foram gerados mas não traduzidos em células NIH 3T3, investigou-se se a proteína-cinase activada por ARN de hélice dupla (ARNhd), PCR, está activada (fosforilada) nestas células (por exemplo, por meio dos transcriptos SI de ARNm que tinham mostrado ser activadores potentes de PCR (Bischoff, J.R. e Samuel, C.E., (1989) Virology, 172: 106-115), que por sua vez leva à inibição da tradução de genes virais. 0 corolário deste cenário seria que no caso das célula transformadas, evita-se esta activação, permitindo que a síntese da proteína virai prossiga.

Trataram-se as células NIH 3T3 e v-erbB ou as células transformadas de Ras (designadas por TC-11 e H-ras, 41 respectivemente) com reovirus (i.e.. infectaram-se) ou pseudo-infectadas (como antes), e 48 horas após tratamento, submeteram-se a reacções in vitro de cinase, seguido de uma análise autoradiográfica tal como descrito antes.

Os resultados claramente demonstraram que houve uma migração distinta de fosfoproteína a aproximadamente 65 kDa, a dimensão esperada da PCR, apenas nas células NIH 3T3 e apenas após exposição ao reovirus. Esta proteína não estava marcada nos lisados quer das linhas de células transformadas não infectadas, quer das linhas de células transformadas infectadas. Em vez disso, verificou-se uma migração de aproximadamente 100 kDa estava marcada nas linhas de células transformadas após a infecção virai. Esta proteína estava ausente quer nos lisados pré-infecção quer nos da post-infecçâo das linhas de células NIH 3T3, e não numa proteína de reovirus porque não reagiu com um soro anti-reovírus soro que precipitou todas as proteínas de proteínas (dados não mostrados) . Encontrou-se uma proteína similar de 100 kDa marcada com 32P em reacções in vitro de lisados post-infecção das linhas de células transformadas de Sos (dados não mostrados).

Esses produtos intermédios na via de sinalização de Ras foram responsáveis pela falta de fosforilação da proteína de 65 kDa po que foi confirmado mais tarde pela utilização das células 2H1 que contêm um oncogene de Ras indutível por Zn. As células 2H1 não induzidas (relativamente resistentes à infecção pelo reovirus, tal como se mostrou antes) foram capazes de produzir a fosfoproteína de 65 kDa apenas depois da exposição ao vírus. Contudo, as células 2H1 submetidas oncogene de Ras indutível por Zn mostraram uma diminuição significativa da produção desta fosfoproteína. Este diminuição coincidiu com 42 o aumento da síntese virai. Estes resultados eliminam assim a possibilidade de que a indução da fosfoproteina de 65 kDa fosse um evento específico de NIH 3T3 e estabelecem claramente o papel de Ras na prevenção (ou reversão) da indução da produção desta fosfoproteina. As células 2H1 induzidas por Zn não produziram a fosfoproteina de 100 kDa vista nas células H-Ras cronicamente transformadas e infectadas'. EXEMPLO 5. A indução da fosforilação da Proteína de 65 kDa Requer uma transcrição virai activa

Dado que a produção da fosfoproteina de 65 kDa ocorreu apenas nas células que eram resistentes à infecção pelo reovírus, e apenas após as células terem sido expostas ao reovírus, investigou-se se a trnascrição virai activa era necessária para a produção da fosfoproteín de 68 kDa. O reovírus foi tratado com UV para inactivar o seu genoma antes da administração do reovírus às células NIH 3T3. Para o tratamento com UV, fez-se uma suspensão do reovírus em MEMD até a uma concentração de aproximadamente 4 x 108 UFP/mL e expus eram-se a uma luz UV de onda curta (254 nm) durante 20 minutos. O vírus inactivado por UV não eram infecciosos como se determinou pela inexistência de efeitos citopáticos em fibroblastos L-929 de rato e à falta de síntese da proteína virai por processos de marcação com [35S]-metionina como se descreveu previamente. Esse tratamento com UV aboliu a transcrição do gene virai, tal como foi analisado por RCP, e daí a infectividade virai (dados não mostrados). Incubaram-se então as células durante 48 horas, e prepararam-se os lisados e submeteram-se a uma marcação in vitro com 32P tal como antes. Os resultados mostraram que as células NIH 3T3 infectadas com reovírus não tratado produziram uma banda proeminente marcada com 43 32P de 65 kDa, que não se encontrou nas células não infectadas. As células expostas ao reovirus tratado com UV comportando-se de um modo semelhante às células de controlo não infectadas manifestando pouca fosforilação da proteína de 65 kDa. Assim, a indução da fosforilação da fosfopro-teína de 65 kDa não se deve ao ARNhd presente no reovirus que entrou; em vez disso, requer uma transcrição de novo dos genes virais, consistente com a identificação da fosfoproteína de 65 kDa como PCR.

EXEMPLO 6. Identificação da Fosfoproteína de 65 kDa como PCR

Para determinar se a fosfoproteína de 65 kDa era PCR, realizou-se uma experiência de ligação de ARNhd a dsRNA na qual se adicionaram pérolas dê poli (t)-poli(c) agarose a lisados marcados com 32P, tal como se descreveu, antes. Depoiis da incubação durante 30 minutos a 4°C, lavaram-se as pérolas e as proteínas ligadas libertaram-se e foram analisadas por EGPA-SDS. Os resultados mostraram que a fosfoproteína de 65 kDa produzida na post-infecção dos lisados de células NIH 3T3 eram capazes de se ligar a ARNhd; essa ligação é uma característica bem reconhecida da PCR. Pelo contrário, a fosfoproteína de 100 kD detectada na linha de células transformadas de H-ras infectadas não se ligou à Poli (I)-poli(c)-agarose. A fosfoproteína de 65 kDa tão era imunoprecipitável com um anticorpo específico de PCR (cedido pelo Dr. Mike Mathews, Cold Spring Harbor Laboratory), confirmando que era na verdade PCR. EXEMPLO 7. Resultados da inactivação ou eliminação de PCR eno aumento ~ da capacidade de infecção de células não transformadas 44 A fosforilação de PCR é responsável pelo paragem da tradução de genes virais nas células NIH-3T3 e uma das funções dos produtos activados do oncogene nas células transformadas é a prevenção deste evento de fosforilação, inibindo assim a fosforilação de PCR nas células NIH-3T3 por outros meios (por exemplo, fármacos) deve resultar no aumento da síntese das proteínas virais e- portanto da infecção/ nestas células. Para testar esta ideia, utilizou-se 2-aminopurina. Este fármaco demonstrou possuir uma actividade inibidora relativamente específica em relação à auto-fosforilação de RCP (Samuel, C.E. e, Brody, M., (1990) Virology, 176: 106-113; Hu, Y. ed Conway. T.W. (1993), J. Interferon Res., 13: 323-328). De acordo com isto, expuseram-se células NIH 3T3 a 2-aminopurina 5 mM simultaneamente com exposição ao reovírus. Marcaram-se as células com [35S]-metionina entre 12 e 48 h post-infecção, e colheram-se os lisados e analisaram-se por EGPA-SDS.

Os resultados demonstraram que a exposição a 2-aminopurina resultou num nivel significativamente mais elevado de síntese virai de proteína nas células NIH 3T3 (não mostrado). O aumento foi particularmente pronounciado após a imuno-precipitação dos lisados com soro anti-reovírus. Estes resultados demonstraram que a fosforilação de PCR leva à inibição da tradução virai dos genes e que a inibição deste evento de fosforilação liberta o bloqueio da tradução. Por isso, os produtos intermédios na via de sinalização de Ras regulam negativamente PCR, levando a um aumento da capacidade de infecção das células transformadas de Ras.

Verificou-se que o interferão β, conhecido por induzir a expressão de PCR, reduz significativamente a replicação 45 do reovlrus em células transformadas de Ras (dados nao mostrados).

Uma abordagem mais directa para definir o papel de PCR na infecção por reovlrus é através da utilização de células que isentas PCR. De acordo com isto, compararam-se, em termos de susceptibilidade em relação à infecção por reovlrus, fibroblastos de embriões primários de PCR +/+ e PCR °/° de ratos selvagens (Yang, Y.L. et al.EMBO J. 14: 6095-6106 (1995)). Os resultados mostraram claramente que as proteínas do reovlrus foram sintetizadas a um nível significativamente mais elevado nas . células de PCR °/° do que nas células de PCR +/+. Estas experiências demonstraram que a inactivação ou a eliminação de PCR aumentou a susceptibilidade da célula hospedeira à infecção pelo reovlrus da mesma maneira que acontece com a transformação por Ras ou elementos da via de sinalização de Ras, dando assim um forte suporte do papel dos elementos da via de sinalização de Ras na PCR de regulação negativa.

EXEMPLO 8 A inactivação de PCR em Células transformadas não envolve CEM

Os receptores de tirosina cinases tais como RFCEs são conhecidos por estimularem as cinases activadas pelo mitogénio ou as cinases reguladas pelo sinal extracelular (ERK1/2) por via de Ras (ver Robinson, M.J. e Cobb, M.H., Curr. Opin. . Cell. Biol. 9: 180-186 (1997)). Esta estimulação requer a fosforilação de ERK1/2 por meio da cinase regulada pelo sinal extracelular activada pelo mitogénio, a cinase CEM, que é ela própria activada (fosforilada) por Raf, uma cinase de serina-treonina a jusante de Ras. Para determinar se a actividade de CEM era necessária para a inactivação de PCR em células 46 transformadas, estudou-se o efeito do inibidor de CEM recentemente identificado PD98059 (Dudley, D.T. et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 92: 7686-7689 (1995); Waters, S.D. et al., J Biol. Chem. 270: 20883-20886 (1995)) em células transformadas de Ras infectadas.

As células H-Ras transformadas cresceram até a uma confluência de 80 % e foram infectadas com reovirus a uma MDI de aproximadamente 10 u.f.p./célula. Aplicou-se PD98059 (Calblochem), dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), a células ao mesmo tempo que o vírus (a concentração final de PD98059 foi de 50 μΜ). As células de controlo receberam um volume equivalente de DMSO. Marcaram-se as células com 35S-metionine de 12 a 48 horas post-infecção. Prepararam-se então lisados, imuno-precipitados com o soro do serotipo 3 anti-reovírus policlonal e analisou-se por EGPA-SDS.

Os resultados {dados não mostrados) mostraram que PD98059, a uma concentração que inibe efectivamente a fosforilação de ERKl/2, não inibiu a síntese da proteína de reovirus nas células transformadas. Pelo contrário, o tratamento de PD98059 causou consistentemente um ligeiro aumento da síntese da proteína virai nestas células; a razão para isto está sob investigação. Consistente com a falta de inibição da síntese da proteína virai na presença de PD98059, a PCR nestas células permaneceu sem ser fosforilada (dados não mostrados). Tal como se esperava, PD98059 não teve efeito na fosforilação de PCR induzida por reovirus nas células NIH-3T3 não transformadas (dados não mostrados). Estes resultados indicaram que CEM e ERKl/2 não estão envolvidas na activação de PCR. 47 EXEMPLO 9. Capacidade oncolítica in Vivo de Reovlrus

Utilizou-se um modelo de tumor de hospedeiro com imunodeficiência severa combinada (IDSC) para avaliar a eficácia de utilização de reovirus para a redução do tumor. Injectaram^se ratos machos e fêmeas (Charles River, Canada) com IDSC, com fibroblastos de ratos de NIH 3T3 transformadas com v-erbB (designadas por células THC-11) em dois sítios subcutâneos sobrepostos aos flancos traseiros. Num primeiro ensaio, utilizou-se uma injecção em bolus de 2,3 X 1Q5 células em 100 μΐ de SBF esterilizado. Num segundo ensaio, utilizou-se uma injecção em bolus de 4,8 X 1Q6 células em 100 μΐ de SBF. Tumores palpáveis eram evidentes aproximadamente duas a três semanas após a injecção.

Injectou-se reovirus do serotipo três (estirpe Dearing) no lado direito da massa tumoral (a "massa de tumor tratada") num volume de 20 μΐ a uma concentração de 1,0 X 107 unidades de formação de placas (UFP)/ml. A massa tumoral do lado esquerdo (a " massa de tumor não tratado") foi deixada por tratar. Observaram-se os ratos durante um pe'riodo de sete dias no seguimento da injecção com reovirus, fizeram-se medições da dimensão do tumor de dois em dois dias utilizando calibradores, e mediu-se o peso dos tumores depois do sacrifício dos animais. Todos os ratos foram sacrificados no sétimo dia. Os resultados estão indicados no quadro 1. 48

Quadro 1 Massa do tumor após tratamento com Reovirus

Ensaio 1 (n=8) média massa de tumor não tratado 602 mg média massa de tumor tratado 284 mg Ensaio 2 (n =12) média massa de controlo do tumor 1523,5 iftg média massa de tumor nSo tratado 720, 9 mg média massa de tumor tratado 228,0 mg A massa de tumor tratado era 47 % da massa de tumor não tratado no ensaio 1 e 31,6 % da massa de tumor não tratado no ensaio 2. Estes resultados indicaram que os tumores tratados com o vírus eram substancialmente mais pequenos do que a dos tumores não tratados, e que pode haver um efeito sistemático adicional do vírus na massa de tumor não tratado.

Realizaram-se também experiências similares utilizando a introdução unilateral de células de tumor. Injectaram-se ratos com IDSC, subcutaneamente e unilateralmente no flanco transeiro com fibroblastos de ratos de NIH 3T3 transformadas com v-erbB (células THC-11.) . Apareceram tumores palpáveis (área média de 0,31 cm2) passadas duas semanas. Deu-se então a oito animais uma única injecção intra-tumo-ral de 1,0 x 107 UFPs de reovirus do serotipo 3 (estirpe Dearing) em solução salina tamponada com fosfato (STF). Injectaram-se os tumores de controlo (n=10) com quantidades equivalentes de vírus inactivados com UV. Seguiu-s-e o crescimento do tumor durante .12 dias, durante os quais não se administrou mais nenhum tratamento com reovirus.

Os resultados, mostrados na Figura 2, demonstraram que o tratamento destes tumores com uma dose única de reovirus activo (círculos abertos) resultaram numa repressão dramática do crescimento do tumor por volta do décimo 49 terceiro dia (ponto final), guando os tumores nos animais de controlo injectados com uma única dose de reovirus inactivado (ciculos fechados) . excederam as fronteiras aceitáveis do tumor. Esta experiência foi repetida várias vezes e verificou-se que era altamente reprodutível, demonstrando ainda mais a eficácia do reovirus na repressão do crescimento do tumor. EXEMPLO 10: Capacidade oncolítica in Vivo do Reovirus contra linhas de células derivadas de cancro da mama humano

Os estudos in vivo foram realizados utilizando células de carcinoma da mama humano em modelos de ratos com uma IDSC. Inj ectaram-se ratos fêmeas com IDSC com 1 x 106 células MDA-MB468 de carcinoma da mama humano em dois sítios sub-cutâneos, na parte superior dos dois flancos traseiros. Os tumores palpáveis eram evidentes aproxima-damente duas a quatro semanas após a injecção, Injectou-se o reovirus do serotipo três (estirpe Dearing) não diluído na massa do lado direito do tumor num volume de 20 μΐ a uma concentração de 1,0 x 107 UFP/ml. Obtiveram-se os seguintes resultados:

Quadro 2 Massa de tumor após o Tratamento com Reovirus TRATAMENTO Média da massa de tumor nâo tratado (lado esouerdo) Média da massa de tumor tratado (lado direito) Reovirus (N=8) 29,02 g 38,33 g Controlo (¢1=8) 171,8 g 128,54 g *Nota: Um dos ratos de controlo morreu precocemente durante a fase de tratamento. Nenhum dos ratos que recebeu reovirus morreu

Embora estes estudos sejam preliminares, foi claro que a dimensão dos tumores nos animais tratados com reovirus foi substancialmente inferior à dos animais não tratados. Contudo, a dimensão dos tumores do lado direito (tratado) 50 dos animais tratados com reovírus foi ligeiramente superior à média do lado esquerdo (não tratado). Isto foi inesperado mas pode ser explicado pela composição da massa absorvida pelas células inflamatórias com subsequente fibrose, assim como pelo facto destes tumores serem originalmente maiores do lado direito do que a média do lado esquerdo. A composição histológica das massas de tumor está a ser investigada. Estes resultados também suportam o efeito sistemático que o reovírus tem na dimensão do tumor não tratado na lâmina contra-lateral da injecção de reovírus. EXEMPLO 11. Susceptibilidade de tumores humanos adicionais à oncólise do reovírus

Tendo em vista os resultados in vivo apresentados antes, investigou-se a capacidade oncolítica observada em células de murinos, nas linhas de células de outros tumores humanos. Células e Vírus

Todas as linhas de células cresceram em meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) contendo 10 % de soro de bovino fetal (SBF). A estirpe Dearing do serotipo 3 do reovírus utilizado nestes estudos propagou-se em culturas em suspensão de células L e purificou-se de acordo com Smit (Smit, R.E. et al., (1969) Virology, 39: 791-800} com a excepção de se ter omitido B-mercaptoetanol (β-ΜΕ) do tampão de extracção. 0 reovírus marcado com [35S]metionina cresceu e foi purificado conforme descrito por McRae e Joklik (McRae. M.A. e Joklik, W.K., (1978) Virology, 89: 578-593). A relação entre partículas/UFP para o reovírus purificado foi normalmente de 100/1. 51

Efeitos citopáticos do reovírus nas células

Infectaram-se as mono-camadas confluentes das células com serotipo 3 do reovírus (estirpe Dearing) numa multiplicidade de infecções (MDI) de aproximadamente 40 unidades de formação de placas (UFP) por célula* As fotografias foram tiradas 36 horas post-infecção tanto para as células infectadas por reovírus como as células falsamente infectadas.

Análise por imunofluorescência da infecção pelo reovírus

Para os estudos de imuno-fluorescência as células cresceram em coberturas de vidro, e infectaram- -se com reovírus numa multiplicidade de infecções (MDI) de -10 UFP/célula ou de falsas infecções tal como se descreveu antes. Em vários momentos após a infecção, fixaram-se as células numa mistura de etanol/ácido acético (20/1) durante 5 minutos, depois foram novamente re-hidratadas por meio de lavagens sequenciais em etanol a 75 %, 50 % e 25 %, seguidas de 4 lavagens com solução salina tamponada com fosfato (STF). As células fixadas e re-hidratadas foram então expostas ao anticorpo primário (soro policlonal anti-reovírus do tipo 3 diluído a 1/100 em STF) durante 2 hr à temperatura ambiente. Depois de 3 lavagens com . STF, expuseram-se as células a um anticorpo secundário [IgG anti-coelho de cabra (molécula completa) conjugada com isotiocianato de fluoresceína (CITF) diluído a 1/100 em STF contendo 10 % de soro de cabra e 0,005 % do contra-corante Azul de Evan] durante 1 hora à temperatura ambiente.

Finalmente, as células fixadas e tratadas foram lavadas mais 3 vezes com STF, seguida de 1 lavagem com água duplamente destilada, secou-se e montou-se em lâminas em glicerol a 90 % contendo 0,1 % de fenilenodiamina, e 52 visualizou-se com um microscópio Zeiss Axiofot montado com uma câmara Cari Zeiss (a ampliação para todas as fotografias foi de 200 x).

Infecção das células e quantificação do vírus

Infectaram-se mono-camadas confluentes de células que cresceram em placas de 24 orifícios com reovírus a uma multiplicidade estimada em 10 UFP/célula. Passada 1 hora de incubação a 37 °C, lavaram-se as mono-camadas com MEMS aquecido - SBF a 10 %, e depois incubaram-se no mesmo meio. Em vários momentos após a infecção, adicionou-se directamente uma mistura de NP-40 e desoxicolato de sódio ao meio nas mono-camadas infectadas até a concentrações finais de 1 % e 0,5 %, respectivamente. Depois colheram-se os lisados e determinaram-se os rendimentos de vírus por meio da titulação das placas em células L-929.

Radio-marcação de células infectadas com reovírus e preparação de lisados

Infectaram-se as mono-camadas confluentes das células com reovírus {MDI-10 UFP/célula). Em vários momentos após a infecção, substituiu-se o meio com MEMD isento de metionina contendo STF dialisada a 10 % e 0,1 mCi/ml de [35S]meti-onina. Depois de outra incubação durante mais 1 hora a 37 °C, lavaram-se as células em solução salina tamponada com fosfato (STF) e fez-se a lise no mesmo tampão contendo Triton X-100 a 1 %, desoxicolato de sódio a 0,5 % e EDTA 1 mM. Retiraram-se então os núcleos por meio de centrifugação a baixa velocidade e armazenaram-se os sobrenadantes a 70 °C até a sua utilização. 53

Análise por imuno-precipitação e EGPA-SDS

Realizou-se a imuno-precipitação dos lisados de células infectadas com reovírus marcadas com [35S] por meio do soro de anti-reovírus do serotipo 3 como se descreveu previamente (Lee, P.W.K. et al. (1981) Virology, 108: 134-146) . Os imuno-precipitados foram então analisados por EGPA-SDS de acordo com o protocolo de Laemmli (Laemmli, U.K., (1970) Nature, 227: 680-685).

Cancro da mama O gene c-erbB-2/neu codifica uma proteína da transmembrana com uma enorme homologia com RFCE que está sobre-expressa em 20-30 % dos doentes com cancro da mama (Yu, D. et al. (1996) Oncogene 13: 1359). Dado que se estabeleceu aqui que a activação de Ras activação, quer através de mutações pontuais ou através de elementos em cascata de sinalização aumentada a montante de Ras (incluindoo homólogo de EGFR tec-erbB-2/neu) cria, em última análise uma replicação do reovírus em ambiente hospitalar, ensaiou-se uma matriz de linhas de células derivada de cancros da mama humanos para avaliar a susceptibilidade ao reovírus. As · linhas de células inçluiram MDA-MD-435SD (ATCC depósito HTB-129), MCF-7 (ATCC depósito HTB-22), T-27-D (ATCC depósito HTB-133), BT-20 (ATCC depósito HTB-19), HBL-100 (ATCC depósito HTB-124), MDA-MB-468 (ATCC depósito HTB-132), e SKBR-3 (ATCC depósito HTB-30) .

Com base na indução dos efeitos citopáticos e a síntese de proteínas virais, conforme medido por marcação metabólica radioactiva e imuno-fluorescência, tal como se descreveu antes, verificou-se que cinco em cada sete dos 54 cancros da mama analisados eram sensíveis à infecção pelo reovírus: MDA-MB-435S, MCF-7, T-27-D, MDA MB-468, e SKBR-3 eram altamente sensíveis à infecção, enquanto BT-20 e' HBL-100 não demonstraram capacidade para serem infectados.

Glioblastoma do cérebro A seguir investigou-se uma variedade de linhas de células derivadas de glioblastomas de cérebro humano. As linhas de células incluíram A-172, U-118, U-178, U-563, U-251, U-87 e U-373 (as células foram uma generosa oferta do Dr. Wee Yong, University of Calgary).

Seis de cada sete das linhas de células de glio-blastoma demonstraram susceptibilidade à infecção pelo reovírus, incluindo U-118, U-178, U-563, U-251, U-87 e U-373, enquanto A-172 não demonstrou qualquer infectibi-lidade, conforme medido pelos efeitos citopáticos, imuno-fluorescência e marcação com [35S]-metionina das proteínas do reovírus. A linha de células U-87 de glioblastoma foi mais investigada. Para avaliar a sensibilidade das células U-87 em relação ao reovírus, as células U-87 células (obtidas do Dr. Wee Yong, University of Calgary) cresceram até 80% de confluência e foram depois reforçadas com reovírus numa multiplicidade de infecções (MDI) de 10. No prazo de 48 horas verificou-se um efeito citopático surpreendente e alargado (dados não mostrados). Para demonstrar ainda que a lise destas células foi devida à replicação do reovírus, as células foram então marcadas com impulsos com [35S]metionina durante períodos de três horas em vários momentos após a infecção e as proteínas foram analisadas por meio de electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato 55 de dodecilo e sódio (EGPA-SDS) tal como se descreveu antes. Os resultados (não mostrados) demonstram claramente a replicação efectiva do reovirus replicação dentro destas células com a interrupção resultante da síntese das proteínas do hospedeiro 24 horas após a infecção.

As células U-87 foram também introduzidas como xeno-enxertos de tumor humano no flanco traseiro de 10 ratos SCID. As células U-87 cresceram em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro bovino . fetal, tal como descrito antes. Colheram-se as células, lavaram-se, e voltou a fazer-se uma suspensão em STF esterilizada; injectou-se subcutaneamente 2,0 x 106 células em 100 μΐ no sítio subjacente ao flanco traseiro, em ratos machos SCID (Charles River, Canada) com cinco a oito semanas de idade. Mediu-se o crescimento do tumor semanalmente por duas vezes durante um período de quatro semanas. Os resultados, mostrados na Figure 3, demonstraram que o tratamento de U-87 de tumores com uma única injecção intratumoral de 1,0 x 10 UFPs de reovirus vivo (círculos abertos, n—5) resultou numa repressão drástica do crescimento do tumor, incluindo a regressão do tumor na quarta semana após o tratamento (P=0,008), em comparação com o tratamento de tumores com da mesma quantidade de reovirus inactivado por UV (círculos fechados, n=5) . A coloração com hematoxilina/eosina (HE) dos micro-focos remanescentes de tumores tratadoa com vírus activo, realizada como descrito (H. Menteon, Cell Biology, A Laboratory Handbook, J.E. Celis, ed., Academic Press, 1994, p. 232) revelou que a massa remanescente do tumor consistia, em grande parte, em estroma normal sem um número apreciável de células viáveis de tumor, e não havia qualquer evidência de infiltração de células de tumor no 56 músculo do esqueleto subjacente (dados não mostrados). A necrose das células do tumor foi devida à lise directa feita pelo virus, o mesmo mecanismo da morte das células como o do reovírus in vitro.

Para determinar se há uma difusão virai para além da massa do tumor, realizou-se microscopia por imunofluores-cência utilizando anticorpos dirigido contra as proteínas total do reovirus, tal como descrito antes, nas secções de parafina do tumor e tecido adjacente. Verificou-se que as proteínas especificas do reovírus estavam confinadas à massa do tumor; não se detectou nenhuma coloração virai no músculo do esqueleto subjacente (dados não mostrados). Tal como se esperava, as proteínas virais não estavam presentes nos tumores injectados com vírus inactivados por UV (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que a replicação do reovírus nestes animais era altamente específica, com a amplificação virai apenas nas células alvo u-87.

Dado que a maior parte dos tumores são altamente vascularizados, é provável que alguns vírus possam entrar na corrente sanguínea no seguimento da lise das células infectadas do tumor. Para determinar se há uma dispersão sistemática do vírus, colheu-se sangue dos animais tratados e dos animais de controlo e diluíram-se em série para uma subsequente titulação em placa. Verificou-se que o vírus infeccioso estava presente no sangue numa concentração de 1 x 105 UFPs/ml (dados não mostrados). O elevado grau de especificidade do vírus para o tumor, combinado com a difusão sistemática, sugeriram que o reovírus podia ser capaz de se replicar remotamente em tumores de glioblastoma a partir do tumor inicialmente 57 infectado, tal como se demonstrou antes no que respeita às células de cancro da mama. Para verificar esta hipótese, implantou-se bilateralmente, em ratos SCID, xeno-enxertos de tumor humano U-87 em sítios subjacentes a cada flanco traseiro dos animais. Deixou-se que estes tumores crescessem até medirem 0,5 x 0,5 cm. Injectaram-se então os tumores do lado esquerdo com uma dose única (1 x 107 UFP) de reovírus em animais tratados (n=5); os animais de controlo (n=7) foram tratados de modo simulado com virus inactivados com UV. Os tumores foram novamente medidos duas vezes por semana durante um período de quatro semanas.

Os resultados, mostrados na Figura 4, demonstraram que a inibição e eventual regressão tanto das massas de tumores tratados/injectados (círculos) como não tratados (quadrados) ocorreram apenas nos animais tratados com reovírus vivo (círculos e quadrados abertos), em contraste com os animais tratados com reovírus inactivados (círculos e quadrados fechados). A subsequente análise por imunofluorescência revelou que as proteínas do reovírus estavam presentes tanto no tumor ipsilateal (tratado) assim como no tumor contralateral (não tratado), indicando que a regressão no lado não tratado era o resultado da oncólise do reovírus (dados não mostrados).

Carcinoma pancreático

As linhas de células derivadas do cancro pancreático foram investigadas quanto à sua susceptibilidade para a infecção pelo reovírus. As linhas de células incluíram Capan-1 (ATCC depósito HTB-79), BxPC3 (ATCC depósito CAL-1687), MIAPACA-2 (ATCC depósito CRL-1420), PANG-1 (ATCC depósito CRL-1469), AsPC-1 (ATCC depósito CRL-1682) e Hs766T (ATCC depósito HTB-134) . 58

Cinco destas seis linhas de células demonstraram sus-ceptibilidade para a infecção pelos reovírus incluindo Capan-1, MIAPACA-2, PANC-1, AsPC-1 e Hs7 66T, em que BxPC3 demonstrou pouca capacidade de ser infectada conforme o ensaio por meio dos efeitos citopatológicos induzidos pelo vírus, imuno-fluorescência e marcação com [35S]. É interessante notar que quatro das cinco linhas de células que demonstraram susceptibilidade para a oncólise do reovírus demonstraram possuir mutações de transformação no codão 12 do gene K-ras (Capan-1, MIAPACA-2, PANG-1 e AsPC-1) em que a única que tinha falta dessa susceptibilidade (BxPC3) tinha falta dessa mutação (Berrozpe, G. , et al. (1994), Int. J. Cancro, 58: 185-191). 0 estado dos outros codões de K-ras é actualmente desconhecido para as linhas de células Hs766T. EXEMPLO 12. Utilização do Reovírus como um agente onco-lítico em animais imuno-competentes

Desenvolveu-se um modelo de rato singeneico para investigar a utilização do reovírus em animais, imuno-competentes em vez dos ratos SCID como descrito antes. Implantou-se subcutaneamente, em ratos C3H (Charles River) 1,0 x 106 UFPs de células C3H transformadas com Ras (uma oferta do D. Edwards, University of Calgary). Depois do tumor se ter desenvolvido, trataram-se os ratos com uma série de injecções intra-tumorais quer de .reovírus vivo (1,0 x 106 UFPs) ou reovírus inactivado com UV. No seguimento de uma série inicial (seis injecções durante um período de nove dias), os animais do ensaio receberam um tratamento com reovírus diluído (1,0 x 107 UFPs) de dois em dois dias. Os animais com um tratamento simulado receberam uma quantidade equivalente de vírus inactivado por UV. 59 A Figura 5 demonstra que o reovírus é um agente onco-lítico eficaz nestes animais imuno-competentes. Todos os animais do ensaio mostraram regressão dos tumores; 5 dos 9 animais do ensaio mostraram uma regressão completa dos tumores, passados 22 dias, momento em que os animais de controlo excederam as fronteiras aceitáveis do tumor. Além disso, não houve efeitos colaterais identificáveis nos animais tratados com o reovírus.

Para fazer a avaliação dos efeitos da exposição prévia ao reovírus na repressão e na regressão do tumor, metade do grupo de ensaio recebeu um reforço de reovírus (injecção intramuscular de 1,0 x 106 UFPs, do tipo 3 Dearing) antes da formação do tumor. Duas semanas depois do reforço, podia detectar-se a neutralização dos anticorpos em todos os animais expostos. No seguimento do desenvolvimento do tumor, trataram-se os animais com uma série de injecções intra-tumorais quer de reovírus. vivo quer inactivado com UV, tal como se descreveu antes. A Figura 6 demonstra que os animais com anticorpos de neutralização em relação ao reovírus em circulação (isto é, os que receberam o reforço com reovírus antes do desenvolvimento do tumor) exibiram uma repressão e uma regressão do tumor semelhante à dos animais que não foram antes expostos ao reovírus. Assim, o reovírus pode servir como um agente oncolítico efectivo mesmo em animais imuno-competentes com prévia exposição ao reovírus.

Lisboa, 22 de Agosto de 2008 60

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade efectiva de um reovirus recombinante obtido a partir de dois ou mais tipos de reo-vírus com diferentes fenotipos patogénicos caracterizada pelo facto de o reovirus recombinante conter diferentes determinantes antigénicos obtidos de cada um dos dois ou mais virus de diferentes fenotipos patogénicos para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proli-ferativo mediado por ras num mamífero em condições que resultam numa lise substancial das células em proliferação.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o distúrbio proliferativo mediado por ras ser um neoplasma.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o distúrbio proliferativo mediado por ras ser uma neurofibromatose.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o neoplasma ser um neoplasma sólido.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o neoplasma ser seleccionado no grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro da próstata, cancro colorectal, cancro da tiróide, cancro renal, cancro das supra-renais, cancro do fígado, cancro pancreático, cancro da mama e cancro do sistema nervoso central e periférico.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o neoplasma ser um cancro do sistema nervoso central. 1
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, caracte-rizada pelo facto de o neoplasma ser um cancro da mama.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizada pelo facto de o neoplasma ser um neoplasma hemato-poiético.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizada pelo facto de o medicamento ser para administração por injecção no neoplasma sólido ou próximo dele.
10. 10. Utilização de acordo com. uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de o medicamento ser para administração intravenosa num mamífero.
11. 11. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de o medicamento ser para administração intraperitoneal num mamífero.
12. 12. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo facto de o mamífero ser imuno-competente.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o reovírus estar imuno-protegido.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o reovírus estar encapsulado numa micela..
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o reovírus ser administrado em conjunto com uma quantidade efectiva de anticorpo anti-anti-reovírus. 2
16. 16. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo facto de o mamífero ser um ser humano.
17. 17. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo facto de se administrar aproximadamente 1 a 1015 unidades de formação de placas de reovírus/kg de peso do corpo.
18. 18. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo facto de o reovírus ser administrado numa dose única.
19. 19. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo facto de o reovírus ser administrado em mais do que uma dose.
20. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de o neoplasma ser metastásico.
21. 21. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo facto de o medicamento compreender um agente quimioterapêutico.
22. 22. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo facto de o reovírus recombínante ser modificado para reduzir ou eliminar uma reacção imunitária ao reovírus, modificação que consiste em envolver o reovírus num lipossoma, numa micela ou noutro veículo para mascarar o reovírus perante o sistema imunitário dos mamíferos ou por eliminação da cápside externa. 3
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizada pelo facto de o reovírus ser tratado com uma protease antes da administração.
24. 24. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo facto de o mamífero ser um ser humano.
25. 25. Utilização de um reovirus recombinante obtido a partir de dois ou mais tipos de reovirus com diferentes fenotipos patogénicos caracterizada pelo facto de o reovírus recombinante conter diferentes determinantes antigénicos obtidos de cada um dos dois ou mais vírus de diferentes fenotipos patogénicos, para o fabrico de um medicamento para a inibição de metástases de um neoplasma num mamífero, em que o reovírus é para ser administrado numa quantidade suficiente para resultar numa lise substancial das células neoplásicas.
26. 26. Utilização de acordo . com uma qualquer das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo facto de o medicamento ser administrado num sítio cirúrgico numa quantidade suficiente para que resulta numa oncólise substancial de quaisquer células neoplásicas remanescentes no seguimento da remoção cirúrgica de praticamente todo o neoplasma.
27. 27. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo facto de o reovírus recombinante ser gerado por co-infecção de células de mamíferos com diferentes sub-tipos de reovírus. 4
28. 28. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo facto de o reovirus recombínante ser de ocorrência natural.
29. 29. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo facto de o reovirus recombínante não ter ocorrência natural.
30. 30. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo facto de o reovirus recombínante compreender sequências de codificação das proteínas de revestimento da variante de ocorrência natu ral.
31. 31. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo facto de o reovirus recombínante compreender sequências de codificação das proteínas de revestimento mutadas.
32. 32. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo facto de o reovirus recombínante resultar do reagrupamento de reovirus se- leccionados no grupo que consiste em reovirus. humano de serotipo 1, reovirus humano de serotipo 2 e reovirus humano de serotipo 3.
33. 33. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindi cações 27 a 32, caracterizada pelo facto de se administrar mais do que uma estirpe de reovirus recombínante. Lisboa, 22 de Agosto de 2008 5