PL229487B1

PL229487B1 - Kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, kompozycja zawierająca przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna, sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu, sposób identyfikacji obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/ lub poli-N-acetyloglukozaminy (PNAG), wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania do wytwarzania przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego

Info

Publication number: PL229487B1
Application number: PL377145A
Authority: PL
Inventors: Gerald B. Pier; Tomas Maira-Litran
Original assignee: Brigham & Womens Hospital Inc
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2018-07-31
Also published as: BR0316018A; EP1565478B1; ZA200502607B; BRPI0316018B1; CN1708506A; BRPI0316018B8; AU2003295520B8; WO2004043405A2; NO341730B1; JP6335102B2; NO20052828L; US10919956B2; EP1565478A2; JP2006513166A; CA2501077A1; MXPA05005045A; PT1565478T; AU2003295520A1; JP2013010789A; KR20050074582A

Abstract

Wynalazek dotyczy kompozycji deacylowanej poli N-acetylowanej glukozoaminy (dPNAG) ze Staphylococci. dPNAG może zostać wyizolowany ze źródeł naturalnych lub zsyntetyzowany de novo. Wynalazek dotyczy również zastosowania dPNAG jako szczepionki do indukcji czynnej odporności na zakażenia wywołane przez Staphylococcus aureus, S. epidermis, inne pokrewne Staphylococci koagulazo-ujemne lub koagulazo-dodatnie oraz inne organizmy niosące lokus ica (adhezja wewnątrzkomórkowa). Wynalazek dostarcza ponadto sposoby zastosowania przeciwciał skierowanych przeciwko dPNAG, w szczególności do indukcji odporności biernej na tę samą klasę zakażeń.

Description

Opis wynalazku

Kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, kompozycja zawierająca przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna, sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu, sposób identyfikacji obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/lub poli-N-acetyloglukozaminy-(PNAG), wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania do wytwarzania przeciwciał, w tym przeciwciałmonoklonalnych, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, kompozycja zawierająca przeciwciało lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyodrębniony polisacharyd w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu, sposób identyfikacji w próbce obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/lub poli-N-acetyloglukozaminy (PNAG), wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia bakteriami wytwarzającymi poli-N-acetyloglukozaminę (PNAG), wyodrębniony polisacharyd do zastosowania do wytwarzania przeciwciał, wyodrębniony polisacharyd i adiuwant do zastosowania do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego swoistego względem polisacharydu.

Zakres wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji polisacharydowych użytecznych do indukcji odporności do profilaktyki i leczenia zakażeń gronkowcami. Wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania i zastosowania antygenów opartych na polisacharydach, pokrewnych przeciwciał. Opisano tu także zestawy diagnostycznych oraz do indukcji odporności biernej i czynnej przy użyciu materiału polisacharydowego i przeciwciał.

Tło wynalazku

Gronkowce stanowią gram-dodatnie bakterie normalnie zasiedlające i kolonizujące skórę i błony śluzowe człowieka. Jeśli dojdzie do uszkodzenia skóry lub błon śluzowych podczas zabiegu chirurgicznego lub innego rodzaju urazu, gronkowce mogą uzyskać dostęp do tkanek wewnętrznych powodując rozwój zakażenia. Jeśli gronkowce namnażają się lokalnie lub wnikają do układu limfatycznego lub krwionośnego, może dojść do poważnych powikłań, takich jak te związane z bakteriemią gronkowcową. Powikłania te obejmują szok septyczny, zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie stawów, zapalenie szpiku, zapalenie płuc i ropnie różnych organów.

Gronkowce obejmują zarówno organizmy koagulazo-dodatnie, które produkują koagulazę wolną oraz organizmy koagulazo-ujemne, które nie produkują takiej wolnej koagulazy. Staphylococcus aureus jest najczęstszą formą koagulazo-dodatnią spośród gronkowców. S. aureus ogólnie powoduje zakażenie lokalne, pozanaczyniowe, jak i wewnątrznaczyniowe, które ostatecznie prowadzą do bakteriemii. S. aureus jest również głównym czynnikiem ostrego zapalenia szpiku i powoduje gronkowcowe zapalenia płuc. Dodatkowo, S. aureus jest odpowiedzialny za około 1-9% przypadków bakteryjnego zapalenia opon mózgowych oraz 10-15% ropni mózgu.

Istnieje co najmniej dwadzieścia jeden znanych gatunków koagulazo-ujemnych gronkowców, w tym S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophiticus, S. cohnii, S. xylosus, S. simulans oraz S. capitis. S. epidermidis jest najczęstszym czynnikiem etiologicznym związanym z zakażeniami sprzętu dostępu dożylnego oraz najczęstszym izolatem w pierwszorzędowych bakteriemiach szpitalnych. S. epidermidis jest również związany z zapaleniem mięśnia sercowego związanym z protezami zastawek.

Gronkowiec jest również najczęstszym źródłem zakażeń bakteryjnych u zwierząt. Przykładowo, zapalenie gruczołu mlekowego wywołane gronkowcami jest częstym problemem u przeżuwaczy takich jak bydło, owce i kozy. Choroba jest ogólnie leczona za pomocą antybiotyków celem redukcji zakażenia, jednak leczenie jest kosztowną procedurą i mimo wszystko prowadzi do utraty produkcji mleka. Najbardziej efektywnymi szczepionkami zidentyfikowanymi do chwili obecnej są szczepionki z żywych, całych S. aureus podawane podskórnie. Podawanie żywych szczepionek jest jednak związane z ryzykiem zakażenia. Z tego powodu, przeprowadzono wiele badań w celu otrzymania szczepionek z zabitych S. aureus i/lub izolacji polisacharydów otoczkowych lub składników ściany komórkowej, które będą indukować odporność przeciwko S. aureus. Jednak żadna z tych prób nie okazała się sukcesem.

Polimer poli-N-acetyloglukozaminy jest znany w stanie techniki. Na przykład w publikacji autorstwa Maira-Litran i wsp. (Infect. Immun., 2002, 70 (8): 4433-4440) ujawniono pochodzący z gronkowca

PL 229 487 Β1 polisacharyd powierzchniowy zawierający polimer poli-N-acetyloglukozaminy. W odróżnieniu do polisacharydu według niniejszego wynalazku jest on wysoce acetylowany, tj. 95% reszt jest podstawionych octanem (zob. str. 4436, lewa kolumna, pierwszy akapit). Ponadto w publikacji autorstwa Mack i wsp. (J. Bacteriol., 1996, 178 (1):17 5-183) ujawniono polisacharyd wewnątrzkomórkowej adhezyny (ang. polysaccharide intercellular adhesion, PIA), który jest w wysokim stopniu acetylowany, tj. co najmniej 74% reszt jest acetylowanych. Publikacja autorstwa McKenney i wsp. (Infect. Immun., 1998, 66 (10) 4711-4720) ujawnia natomiast polisacharyd glukozaminy, który, w odróżnieniu do polisacharydu według przedmiotowego wynalazku, zawiera 65-100% N-podstawień bursztynianem i 0-33% N-podstawień octanem. Natomiast publikacja autorstwa Baldassarri i wsp. (Infec. Immun., 1996, 64 (8): 3410-3416) ujawnia antygen SAA (ang. slime-associated antygen) ze Staphylococcus epidermidis, którego głównym składnikiem jest N-acetylo-glukozamina (zob. str. 3414, lewa kolumna, drugi paragraf), aczkolwiek ani struktura antygenu SAA, ani odsetek acetylacji w preparacie SAA nie zostały ujawnione.

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów i produktów użytecznych do immunizacji ludzi i zwierząt przeciwko zakażeniu gronkowcami koagulazo-ujemnymi i koagulazo-dodatnimi. Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że polisacharyd powierzchniowy, poli-N-acetyloglukozamina, (PNAG) gronkowców, takich jak S. aureus i S. epidermis, w niewielkim stopniu podstawiony resztami acetylowymi jest wysoce immunogenny in vivo i preferencyjnie indukuje produkcję przeciwciał sprzyjających zabijaniu przez opsonizację oraz ochronę przed zakażeniem. Polisacharyd ten jest zatem użyteczny, między innymi, do wytwarzania odpowiedzi immunologicznych przeciwko gronkowcom, w tym odpowiedzi immunologicznych zależnych od przeciwciał.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, charakteryzująca się tym, że zawiera wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy o długości co najmniej czterech jednostek monomerycznych, mający masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 2500 Daltonów o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą wynoszącą co najmniej cztery, przy czym R jest wybrany z grupy składającej się z NH-CO-CHs oraz -NH2, pod warunkiem, że mniej niż 40% grup R stanowi NH-CO-CH3, i kompozycja jest sterylna.

Korzystnie taka kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy według wynalazku zawiera wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym.

Korzystnie w takich kompozycjach według wynalazku mniej niż 35%, mniej niż 30%, mniej niż 25%, mniej niż 20%, mniej niż 15%, mniej niż 10%, lub mniej niż 5% grup R stanowi -NH-CO-CHs lub żadna z grup R nie stanowi -NH-CO-CHs.

Korzystnie w takich kompozycjach według wynalazku n oznacza liczbę całkowitą wybraną z grupy składającej się z co najmniej 6, co najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 50, co najmniej 100, co najmniej 200, co najmniej 300, co najmniej 400 oraz co najmniej 500.

Korzystnie w takich kompozycjach według wynalazku wyodrębniony polisacharyd stanowi heteropodstawiony polimer.

Korzystnie w takich kompozycjach według wynalazku wyodrębniony polisacharyd ma masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z co najmniej 5000 Daltonów, co najmniej 7500 Daltonów,

PL 229 487 Β1 co najmniej 10000 Daltonów, co najmniej 25000 Daltonów, co najmniej 50000 Daltonów, co najmniej 75000 Daltonów, co najmniej 100000 Daltonów, co najmniej 125000 Daltonów, co najmniej 150000 Daltonów, co najmniej 200000 Daltonów, co najmniej 250000 Dal tonów, co najmniej 300000 Daltonów, co najmniej 350000 Daltonów, co najmniej 400000 Daltonów, co najmniej 450000 Daltonów i co najmniej 500000 Daltonów.

Korzystnie kompozycja według wynalazku ma czystość wybraną z grupy składającej się z co najmniej 90% czystości, co najmniej 95% czystości, co najmniej 97% czystości, i co najmniej 99% czystości.

Korzystniej kompozycja według wynalazku zawierająca wyodrębniony polisacharyd sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym zawiera polimer β-1,6-glukozaminy sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym poprzez łącznik.

Korzystniej w kompozycji według wynalazku zawierającej wyodrębniony polisacharyd sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym związek nośnikowy stanowi nośnik peptydowy.

Korzystnie kompozycje według wynalazku zawierają ponadto farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie wyodrębniony polisacharyd w kompozycjach według wynalazku jest wytwarzany w postaci szczepionki.

Korzystniej w kompozycji według wynalazku zawierającej wyodrębniony polisacharyd sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym wyodrębniony polisacharyd składa się z następującego wzoru:

w którym każdy z X1, X2, X3, X4, X5 i X6 stanowi H, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym, a każdy z Υ1, Y2 i Y3 stanowi OH, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym, przy czym tylko jeden związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym jest sprzęgnięty z wyodrębnionym polisacharydem.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment, które wiąże się z wyodrębnionym polisacharydem jak określono powyżej.

Korzystnie w takiej kompozycji według wynalazku jak określono powyżej wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment stanowi:

a) przeciwciało poliklonalne,

b) przeciwciało humanizowane lub przeciwciało chimerowe, lub

c) przeciwciało ludzkie.

Korzystnie w takiej kompozycji według wynalazku wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment sprzęgnięte jest z:

a) wykrywalnym znacznikiem,

b) czynnikiem bakteriobójczym,

c) wykrywalnym znacznikiem, który jest wybrany z grupy składającej się ze znacznika radioaktywnego, enzymu, cząsteczki biotyny, cząsteczki awidyny i fluororochromu, lub

d) czynnikiem bakteriobójczym stanowiącym antybiotyk.

PL 229 487 Β1

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera wyodrębniony polisacharyd jak określono powyżej w ilości skutecznej do stymulacji odpowiedzi immunologicznej, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera ponadto adiuwant.

Korzystnie odpowiedź immunologiczną stanowi odpowiedź immunologiczna antygenowo-specyficzna.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu jak określono powyżej, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których:

a) precypituje się etanolem nieoczyszczony preparat polisacharydu z zatężonego preparatu komórek bakteryjnych, jednocześnie trawi się nieoczyszczony polisacharyd za pomocą lizozymu oraz lizostafiny, a następnie trawi się sekwencyjnie nukleazą i proteinazą K z wytworzeniem preparatu strawionego polisacharydu, frakcjonuje się według wielkości preparat strawionego polisacharydu, wyodrębnia się frakcję acetylowanego polisacharydu oraz deacetyluje się frakcję acetylowanego polisacharydu z otrzymaniem polisacharydu mającego mniej niż 40% podstawień octanem; albo

b) wytwarza się zanieczyszczony polisacharyd z hodowli bakteryjnej, inkubuje się zanieczyszczony polisacharyd z kwasem lub zasadą z otrzymaniem częściowo oczyszczonego preparatu polisacharydu, neutralizuje się preparat przez inkubację zneutralizowanego preparatu w kwasie fluorowodorowym, i wyodrębnia się z preparatu acetylowany polisacharyd, i deacetyluje się acetylowany polisacharyd z otrzymaniem polisacharydu mającego mniej niż 40% podstawień octanem, w przypadku którego opcjonalnie wyodrębnia się z preparatu polisacharyd mający mniej niż 40% podstawień octanem.

Korzystnie w sposobie wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu według wynalazku jako hodowlę bakteryjną stosuje się:

a) hodowlę koagulazo-ujemnego gronkowca,

b) hodowlę Staphylococcus aureus, lub

c) hodowlę Staphylococcus epidermidis.

Korzystnie w sposobie wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu według wynalazku acetylowany polisacharyd:

a) deacetyluje się chemicznie,

b) deacetyluje się chemicznie poprzez inkubację w roztworze zasadowym, lub

c) deacetyluje się enzymatycznie.

Korzystnie w sposobie wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu według wynalazku, w którym frakcjonuje się według wielkości preparat strawionego polisacharydu wykorzystuje się kolumnę.

Korzystnie w sposobie wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu według wynalazku wyodrębniony polisacharyd wytwarza się ponadto w postaci szczepionki.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji w próbce obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/lub poli-N-acetyloglukozaminy (PNAG), polegający na tym, że obejmuje etapy, w których:

kontaktuje się próbkę z wyodrębnionym przeciwciałem lub jego fragmentem jak określono powyżej oraz wykrywa się wiązanie wyodrębnionego przeciwciała lub jego fragmentu z próbką, przy czym wiązanie wyodrębnionego przeciwciała lub jego fragmentu wskazuje, że w próbce występuje deacetylowana poli-N-acetyloglukozamina (dPNAG) i/lub poli-N-acetyloglukozamina (PNAG).

Korzystnie w sposobie identyfikacji według wynalazku próbkę stanowi:

a) próbka biologiczna pochodząca od osobnika, lub

b) próbka biologiczna jest wybrana z grupy składającej się z moczu, krwi, ropy, skóry, plwociny, płynu stawowego, limfy i mleka.

Korzystnie w sposobie identyfikacji według wynalazku wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment sprzęga się z wykrywalnym znacznikiem.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyodrębniony polisacharyd jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia bakteriami wytwarzającymi poli-N-acetyloglukozaminę

PL 229 487 Β1 (PNAG), u osobnika niebędącego gryzoniem, obejmującym indukowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom wytwarzającym PNAG.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku bakterie wytwarzające PNAG to:

a) gronkowiec,

b) Staphyloccocus aureus, lub

c) Staphyloccocus epidermidis.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku osobnikiem niebędącym gryzoniem jest:

a) osobnik ludzki,

b) osobnik wybrany z grupy składającej się z naczelnych, koni, krów, świń, kóz, owiec, psów i kotów,

c) osobnik zagrożony ryzykiem ekspozycji na gronkowca,

d) osobnik, który podlegał ekspozycji na gronkowca, lub

e) osobnik zagrożony ryzykiem ekspozycji na gronkowca i osobnikowi nie został wszczepiony implant medyczny.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku wyodrębniony polisacharyd:

a) stosowany jest w połączeniu z adiuwantem,

b) wytwarzany jest w postaci szczepionki,

c) wytwarzany jest do podawania układowego,

d) sprzęgnięty jest ze związkiem nośnikowym, lub

e) sprzęgnięty jest z peptydowym związkiem nośnikowym.

Przedmiotem wynalazku jest także wyodrębniony polisacharyd jak określono powyżej w połączeniu z adiuwantem do zastosowania do wytwarzania przeciwciał u osobnika.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku przeciwciałami są przeciwciała poliklonalne.

Przedmiotem wynalazku jest również wyodrębniony polisacharyd jak określono powyżej i adiuwant do zastosowania do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych obejmującego etapy: podawania osobnikowi niebędącemu człowiekiem ilości skutecznej do wytwarzania przeciwciał swoistych względem gronkowca, zbierania komórek śledziony od osobnika, poddawania fuzji komórek śledziony od osobnika z komórkami szpiczaka, i zbierania przeciwciała wytworzonego z fuzyjnego subklonu.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku osobnikiem jest królik.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyodrębniony polisacharyd jak określono powyżej do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego swoistego względem polisacharydu u osobnika niebędącego człowiekiem obejmującej etapy: indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec polisacharydu, wyodrębniania komórek wytwarzających przeciwciało od osobnika, wytwarzania unieśmiertelnionych komórek z komórek wytwarzających przeciwciało, i testowania zdolności unieśmiertelnionych komórek do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego.

Korzystnie w takim zastosowaniu według wynalazku ponadto wyodrębniane jest przeciwciało monoklonalne z supernatantu unieśmiertelnionych komórek.

Przedmiotem wynalazku jest również wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu osobnika zagrożonego ryzykiem rozwoju zakażenia bakteriami wytwarzającymi poli-N-acetyloglukozaminę (PNAG).

Korzystnie zakażenie jest:

a) zakażeniem gronkowcem, lub

b) wybrane z grupy składającej się z zakażenia Staphyloccus epidermidis i zakażenia Staphyloccus aureus.

Korzystnie do takiego zastosowania według wynalazku wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment jest sprzęgnięte z:

a) czynnikiem bakteriobójczym, lub

b) czynnikiem bakteriobójczym stanowiącym antybiotyk.

W jednym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy o długości co najmniej czterech jednostek monomerycznych, gdzie mniej niż 40% grup aminowych glukozaminy jest podstawionych octanem. W jednym aspekcie, kompozycja jest sterylna (tj. odpowiednia do wstrzykiwań in vivo). W kolejnym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycję zawierającą wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy, o długości co najmniej czterech jednostek monomerycznych, gdzie mniej niż 40% grup aminowych glukozaminy jest podstawionych octanem oraz gdzie polisacharyd jest sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym.

PL 229 487 Β1

W stosowanym tu znaczeniu, „polisacharyd według wynalazku odnosi się do polisacharydu powierzchniowego gronkowców, poli-N-acetyloglukozaminy (PNAG) posiadającej mniej niż 40% podstawień octanem. Tego rodzaju polisacharyd jest niniejszym określany jako deacetylowana PNAG (dPNAG). Należy rozumieć, że dPNAG może być w całości lub częściowo deacetylowana, pod warunkiem, że zakres deacetylacji wynosi od 0 do mniej niż 40%. W stosowanym tu znaczeniu, natywna PNAG stanowi mieszaninę form PNAG o różnych stopniach acetylacji. Natywna PNAG może obejmować dPNAG, jednak zazwyczaj zawarta jest w mieszaninie wysoce acetylowanych form PNAG. W stosowanym tu znaczeniu, „wysoce acetylowana” forma PNAG stanowi formę PNAG posiadającą więcej niż 50% podstawień octanem.

Szereg wykonań odpowiada jednakowo różnym aspektom wynalazku. Wykonania te zamieszczono poniżej. W jednym wykonaniu, wyodrębniony polisacharyd jest zdefiniowany za pomocą następującego wzoru:

w którym n oznacza liczbę całkowitą większą lub równą 4, R jest wybrany z grupy składającej się z NH-CO-CHs oraz -NH2, oraz mniej niż 40% grup R stanowi NH-CO-CHs. Według niektórych aspektów wynalazku, w których polisacharyd jest sprzęgany ze związkiem nośnikowym lub łącznikiem połączonym ze związkiem nośnikowym, n może stanowić 4 lub więcej.

W jednym wykonaniu, polisacharyd ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 2500 Daltonów, co najmniej 5000 Daltonów, co najmniej 7500 Daltonów, co najmniej 100000 Daltonów, co najmniej 25000 Daltonów, co najmniej 50000 Daltonów, co najmniej 75000 Daltonów, oraz co najmniej 100000 Daltonów. W jeszcze innych wykonaniach masa cząsteczkowa jest wybrana z grupy składającej się z co najmniej 125000 Daltonów, co najmniej 150000 Daltonów, co najmniej 200000 Daltonów, co najmniej 250000 Daltonów, co najmniej 300000 Daltonów, co najmniej 350000 Daltonów, co najmniej 400000 Daltonów, co najmniej 450000 Daltonów i co najmniej 500000 Daltonów. Opisano tu także polisacharydy mające masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 800, 1000, 1200 i 2000 Daltonów.

Wyodrębniony polisacharyd może mieć długość co najmniej czterech, co najmniej pięciu, co najmniej sześciu jednostek monomerycznych. W kolejnych wykonaniach, długość polisacharydu jest wybrana z grupy składającej się z co najmniej 6, co najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 50, co najmniej 100, co najmniej 200, co najmniej 300, co najmniej 400 oraz co najmniej 500 jednostek monomerycznych.

W innych wykonaniach mniej niż 40%, równo lub mniej niż 35%, równo lub mniej niż 30%, równo lub mniej niż 25%, równo lub mniej niż 20%, równo lub mniej niż 15%, równo lub mniej niż 10%, równo lub mniej niż 5%, równo lub mniej niż 1% grup aminowych glukozoaminy (lub grup R) zostało podstawionych octanem. dPNAG może się odnosić do każdej z nich.

Odpowiednio, polisacharyd może stanowić polimer z heteropodstawnikami, przy czym grupy R stanowią mieszaninę podstawień octanem (tj. -NH-CO-CHs) oraz niepodstawionych grup aminowych (tj. -NH2) pod warunkiem, że mniej niż 40% tych grup jest podstawionych octanem. Polisacharyd może mieć również homopodstawniki, jeśli wszystkie grupy R są aminami (tj. żadna z nich nie jest podstawiona octanem).

PL 229 487 Β1

W niektórych wykonaniach wynalazku wyodrębniony polisacharyd może być sprzęgany ze związkiem nośnikowym. Związek nośnikowy może być sprzęgany z polisacharydem za pomocą łącznika.

Związkiem nośnikowym może być nośnik peptydowy, ale bez ograniczeń.

W tych i innych wykonaniach kompozycja zawierająca wyodrębniony polisacharyd może ponadto zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

W niektórych wykonaniach kompozycja jest w co najmniej 90% czysta, w co najmniej 95% czysta, w co najmniej 97% czysta lub w co najmniej 99% czysta (to znaczy co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 97%, lub co najmniej 99% polisacharydu obecnego w kompozycji stanowi dPNAG). W jeszcze innych wykonaniach kompozycja jest zasadniczo pozbawiona fosforanów lub kwasu tejchojowego. Dogodnie kompozycja jest zasadniczo pozbawiona polisacharydów mających więcej niż 50%, więcej niż 75% lub więcej niż 90% podstawień octanem w grupie aminowej glukozaminy.

W niektórych wykonaniach polisacharyd składa się z następującego wzoru :

w którym każdy z X1, X2, X3, X4, X5 i X6 stanowi H, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym. Każdy z Υ1, Y2 i Y3 stanowi OH, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym. W niektórych wykonaniach tylko jeden związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym jest sprzęgnięty z wyodrębnionym polisacharydem o podanym tu wzorze. W innych wykonaniach tylko jeden z Χ1, X2, X3, X4, X5 lub X6 jest sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym lub łącznikiem połączonym ze związkiem nośnikowym. W kolejnych wykonaniach tylko jeden spośród Υ1, Y2 lub Y3 jest sprzęgany ze związkiem nośnikowym lub łącznikiem połączonym ze związkiem nośnikowym. W jeszcze innych wykonaniach, związek nośnikowy lub łącznik sprzęgany jest tylko w jednej z pozycji Χ1, X2, X3, X4, X5, X6, Υ1, Y2 lub Y3. Związkiem nośnikowym może być polisacharyd. W jeszcze innych wykonaniach, cząsteczka nośnikowa stanowi polisacharyd opcjonalnie podstawiony bezpośrednio, lub za pomocą łącznika, jednym lub więcej związków nośnikowych takich jak inne polisacharydy, peptydy i inne. W niektórych wykonaniach polisacharyd nośnikowy nie stanowi N-acetylo-beta-(3)-1 -6 glukozaminy. Według niektórych aspektów wynalazku, w których X stanowi związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym, n może stanowić 4 lub więcej.

Wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznych zawierających dowolny z polisacharydów według wynalazku, które mogą być zastosowane jako szczepionki. Kompozycje te zawierają polisacharyd w ilości skutecznej do stymulacji odpowiedzi immunologicznej, takiej jak antygenowo-specyficzna odpowiedź immunologiczna. Kompozycja szczepionki może w dalszej kolejności zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać polisacharyd sprzęgany ze związkiem nośnikowym, bezpośrednio lub za pomocą łącznika. Inne aspekty wynalazku dostarczają sposobów otrzymywania polisacharydów według wynalazku. Sposoby te opisano poniżej.

W jednym aspekcie wynalazek dostarcza wyodrębnionego polisacharydu wytwarzanego według następującego sposobu: precypitacji etanolem nieoczyszczonego preparatu polisacharydów z zatężonego preparatu komórek bakteryjnych, jednoczesnego trawienia nieoczyszczonego polisacharydu za pomocą lizozymu oraz lizostafiny, trawienia sekwencji za pomocą nukleazą i proteinazą K z wytworzeniem preparatu strawionych polisacharydów, frakcjonowania według wielkości preparatu strawionych

PL 229 487 Β1 polisacharydów, wyodrębniania frakcji acetylowanych polisacharydów oraz deacetylacji acetylowanych polisacharydów z otrzymaniem deacetylowanego polisacharydu (tj. polisacharydu mającego mniej niż 40% podstawień octanem.

W kolejnym aspekcie, wynalazek dostarcza również polisacharydu wytwarzanego według następującego sposobu: wytwarzania zanieczyszczonego polisacharydu z hodowli bakteryjnej, inkubacji zanieczyszczonego polisacharydu z kwasem lub zasadą z otrzymaniem częściowo oczyszczonego preparatu, neutralizacji preparatu oraz inkubacji zneutralizowanego preparatu w kwasie fluorowodorowym. W jednym wykonaniu sposób w dalszej kolejności obejmuje wyodrębnienie acetylowanego polisacharydu z preparatu i deacetylowanie acetylowanego polisacharydu z otrzymaniem deacetylowanego polisacharydu. W jednym wykonaniu acetylowany polisacharyd jest chemicznie deacetylowany, a pożądany poziom wynosi mniej niż 40%. W kolejnym wykonaniu acetylowany polisacharyd jest deacetylowany poprzez inkubację z roztworem zasadowym do pożądanego poziomu mniejszego niż 40%. W kolejnym wykonaniu acetylowany polisacharyd jest deacetylowany enzymatycznie.

Szereg wykonań odnosi się do następujących sposobów. Niektóre z dodatkowych wykonań podano poniżej. Hodowla bakteryjna może stanowić koagulazo-ujemną lub koagulazo-dodatnią hodowlę Staphylococcus. Hodowla bakteryjna może stanowić hodowlę Staphylococcus aureus lub hodowlę Staphylococcus epidermidis. W kolejnym wykonaniu preparat polisacharydu frakcjonuje się pod względem wielkości wykorzystując kolumnę.

Przykład wytwarzania polisacharydu według wynalazku jest następujący: hodowlę bakteryjną inkubuje się z silną zasadą lub silnym kwasem w celu otrzymania roztworu zasadowego lub kwasowego. Roztwór zasady lub kwasu następnie neutralizuje się do pH 2 w celu otrzymania nieoczyszczonej zawiesiny antygenu. Nieoczyszczoną zawiesinę antygenu dializuje się wobec roztworu takiego jak dejonizowana woda, zaś nierozpuszczalny, nieoczyszczony antygen zbiera się.

Nierozpuszczalny nieoczyszczony antygen może być liofilizowany, a następnie zawieszany ponownie w buforze. Bufor może zostać wybrany z grupy składającej się z 50 mM PBS i 100 mM Tris z 150 mM NaCI. Silna zasada lub kwas może stanowić więcej niż 1 N NaOH lub 1 M HCI. W niektórych wykonaniach, silną zasadą lub kwasem jest 5 N NaOH lub 5 M HCI. W kolejnym wykonaniu, ekstrakt hodowli bakteryjnej jest mieszany w silnej zasadzie lub kwasie przez 18-24 godzin. Ekstrakcja silnym kwasem lub zasadą może zostać powtórzona. Sposób w dalszej kolejności obejmuje poddawanie preparatu antygenu usuwaniu grup acetylowych związanych z grupami aminowymi aż do osiągnięcia pożądanego poziomu podstawień octanem, co prowadzi do otrzymania deacetylowanej PNAG. Deacetylacja może zostać wykonana chemicznie lub enzymatycznie. Przykładowo, preparat antygenu może być inkubowany w 37°C przez 2-20 godzin w 1,0 N NaOH. Inkubacja może być również wykonana w słabszej zasadzie przez dłuższe okresy czasu lub w wyższych temperaturach lub w silniejszych zasadach przez krótsze okresy czasu lub w niższych temperaturach.

Powyższe sposoby mogą opcjonalnie obejmować wyodrębnianie frakcji z preparatu mającego mniej niż 40% podstawień octanem, bez konieczności dodatkowej deacetylacji.

Opisano tu sposoby wytwarzania kompozycji farmaceutycznych. W jednym wykonaniu polisacharyd jest łączony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub adiuwantem. W kolejnym wykonaniu polisacharyd jest sprzęgany ze związkiem nośnikowym, bezpośrednio lub za pomocą łącznika, a następnie opcjonalnie łączony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub adiuwantem. Każdy z deacetylowanych, niniejszym opisanych polisacharydów (tj. dPNAG) może zostać użyty w terapeutycznych lub profilaktycznych sposobach tu opisanych.

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza wyodrębnionego polisacharydu do zastosowanie do profilaktyki zakażenia gronkowcami u osobnika niebędącego gryzoniem. Wynalazek obejmuje podawanie potrzebującemu tego osobnikowi dowolnego z polisacharydów według wynalazku w ilości skutecznej do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko gronkowcom. W niektórych wykonaniach, gronkowca stanowi Staphylococcus aureus, zaś w innych Staphylococcus epidermidis.

Osobnikiem jest dowolny osobnik zakażony gronkowcem, w szczególności niebędący gryzoniem. W niektórych wykonaniach osobnikiem jest osobnik-człowiek, zaś w innych wykonaniach osobnikiem jest zwierzę należące do naczelnych, koń, krowa, Świnia, koza, owca, pies lub kot.

W niektórych wykonaniach osobnik jest zagrożony ryzykiem ekspozycji na gronkowca, a w innych wykonaniach osobnik już podlegał ekspozycji na gronkowca. W niektórych wykonaniach osobnik jest człowiekiem w wieku powyżej 60 lat. Osobnik może być zdrowy. W niektórych wykonaniach, osobnikowi nie został wszczepiony implant medyczny.

PL 229 487 Β1

Polisacharyd jest korzystnie wytwarzany w postaci szczepionki, jak tu opisano, lub w sposób znany w tej dziedzinie. W pokrewnym wykonaniu, polisacharyd jest podawany z adiuwantem. W innych wykonaniach polisacharyd jest podawany osobnikowi układowo. Antygen może być sprzęgany ze związkiem nośnikowym. W niektórych wykonaniach związek nośnikowy stanowi nośnik peptydowy, choć bez ograniczeń.

Ponadto, opisano tu sposób indukcji aktywnej odporności na zakażenie gronkowcami u osobnika. Sposób obejmuje etap podawania osobnikowi ilości skutecznej do indukcji aktywnej odporności na zakażenie gronkowcami dla każdej z powyższych kompozycji zawierających polisacharyd. W jednym wykonaniu sposób stanowi sposób indukcji odporności na zakażenie Staphylococcus aureus. W kolejnym wykonaniu sposób stanowi sposób indukcji odporności na zakażenie Staphylococcus epidermidis.

Opisano tu także sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych oraz monoklonalnych. Sposób obejmuje etap podawania osobnikowi adiuwantu i dowolnego z polisacharydów według wynalazku w ilości skutecznej do wytwarzania przeciwciał swoistych względem gronkowca oraz wyodrębnianie przeciwciał z osobnika. W tych, jak również w pozostałych aspektach wynalazku, polisacharyd jest wykorzystywany jako antygen. W jednym wykonaniu osobnik jest człowiekiem, podczas gdy w innych wykonaniach osobnik nie jest człowiekiem, ale królikiem, myszą lub szczurem. Sposób obejmuje ponadto oczyszczanie przeciwciała.

Opisano tu również sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych obejmujący podawanie osobnikowi ilości skutecznej do indukcji wytwarzania przeciwciał specyficznych dla gronkowców wyodrębnionego polisacharydu według wynalazku oraz adiuwantu, zbieranie komórek śledziony osobnika, poddanie fuzji komórek śledziony osobnika z komórkami szpiczaka oraz zbieranie wytworzonych przeciwciał z subklonu fuzyjnego.

Według kolejnego aspektu wynalazku, dostarcza się wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego swoistego względem polisacharydu według wynalazku. Obejmuje to indukcję odpowiedzi immunologicznej wobec polisacharydu w osobniku niebędącym człowiekiem, wyodrębnianie komórek wytwarzających przeciwciała, wytwarzanie unieśmiertelnionych komórek z komórek wytwarzających przeciwciała oraz testowanie zdolności unieśmiertelnionych komórek do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego przy użyciu polisacharydu według wynalazku. W jednym wykonaniu wynalazek korzystnie obejmuje również etap wyodrębniania przeciwciała monoklonalnego z supernatantu komórek unieśmiertelnionych.

W dalszej kolejności wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej wyodrębniony czynnik wiążący się z wyodrębnionym polisacharydem według wynalazku, który wiąże się selektywnie. W jednym wykonaniu wyodrębniony czynnik wiążący stanowi peptyd. Peptyd może stanowić przeciwciało lub jego fragment. Przeciwciało może stanowić przeciwciało poliklonalne. Przeciwciało może być przeciwciałem humanizowanym lub chimerowym. W niektórych ważnych wykonaniach przeciwciało jest przeciwciałem ludzkim. W niektórych wykonaniach wyodrębniony czynnik wiążący wiąże się specyficznie (swoiście) z dPNAG. W kolejnych wykonaniach wyodrębniony czynnik wiążący wiąże się zarówno z dPNAG, jak i z wysoce acetylowanymi formami PNAG.

W niektórych wykonaniach wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment jest sprzęgnięte z wykrywalnym znacznikiem. Wykrywalny znacznik może zostać wybrany z grupy składającej się ze znacznika radioaktywnego, enzymu, cząsteczki biotyny, cząsteczki awidyny lub fluorochromu. Wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment może być sprzęgnięte z czynnikiem bakteriobójczym, takim jak antybiotyk.

Opisano tu również sposób indukcji biernej odporności na zakażenie gronkowcami u osobnika. Zakażenie może być zakażeniem Staphylococcus aureus lub zakażeniem Staphylococcus epidermis, bez ograniczeń. Sposób obejmuje etap podawania osobnikowi ilości skutecznej do indukcji opsonizacji gronkowca za pomocą jednego z powyższych przeciwciał wiążących się z dPNAG.

Powyższe sposoby przeznaczone do profilaktyki zakażenia gronkowcami mogą być przeprowadzane na osobnikach zagrożonych ryzykiem rozwoju tego rodzaju zakażenia. Sposoby te mogą zostać analogicznie zastosowane do leczenia osobników z zakażeniem gronkowcem. Profilaktyczne i terapeutyczne sposoby tu opisane mogą być stosowane u osobników z zakażeniem lub zagrożonych ryzykiem zakażenia gatunkiem bakteryjnym eksprymującym natywną PNAG.

Opisano tu również sposób leczenia osobnika z zakażeniem gronkowcem, obejmujący podawanie osobnikowi wyodrębnionego czynnika wiążącego, który wiąże się z wyodrębnionym polisacharydem według wynalazku, w ilości skutecznej do zahamowania zakażenia gronkowcem. W ważnych wykonaniach czynnik wiążący wiąże się do wysoce acetylowanych form PNAG jak również dPNAG.

PL 229 487 Β1

W jednym wykonaniu zakażenie gronkowcem jest wybrane z grupy składającej się z zakażenia Staphylococcus epidermidis i z zakażenia Staphylococcus aureus. W kolejnym wykonaniu wyodrębniony czynnik wiążący może być sprzęgnięte z czynnikiem bakteriobójczym, takim jak antybiotyk.

Opisano tu ponadto sposób oceny zdolności polisacharydu do ochrony przeciwko zakażeniu osobnika gronkowcami. Sposób obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej ilości polisacharydu, który to polisacharyd indukuje aktywną odporność, ekspozycji osobnika na gronkowca oraz badania obecności gronkowca w osobniku.

W jeszcze kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu identyfikacji obecności dPNAG w próbce, obejmującego kontaktowanie próbki z wyodrębnionym czynnikiem wiążącym z dPNAG oraz wykrywanie wiązania wyodrębnionego czynnika wiążącego do próbki. Wiązanie wyodrębnionego czynnika wiążącego z próbką wskazuje na obecność dPNAG w próbce. Jeśli czynnik wiążący, wiąże również PNAG, wówczas sposób może zostać wykorzystany do wykrywania obecności PNAG w próbce. W jednym wykonaniu próbka jest próbką biologiczną otrzymaną od osobnika. Próbka biologiczna może zostać wybrana z grupy składającej się z moczu, krwi, ropy, skóry, plwociny, płynu stawowego, limfy i mleka. W jednym wykonaniu wyodrębniony czynnik wiążący jest sprzęgany z wykrywalnym znacznikiem w sposób niniejszym opisany. Próbka może zostać również otrzymana z wymazu z wszczepionego lub przeznaczonego do wszczepienia urządzenia medycznego.

Każde z ograniczeń wynalazku może obejmować różne wykonania wynalazku. Przewiduje się zatem, że każde z ograniczeń wynalazku dotyczące pojedynczego elementu lub kombinacji elementów może zostać włączone do każdego aspektu wynalazku.

Krótki opis wykazu sekwencji

SEQ ID nr 1 stanowi sekwencję nukleotydową locus ica S. aureus, zdeponowaną w GenBank pod numerem dostępu AF086783.

Krótki opis figur

Fig. 1 pokazuje wiązanie przeciwciała z natywną PNAG. Przeciwciało otrzymano dla natywnej PNAG sprzęgniętego z toksoidem błonicy.

Fig. 2 pokazuje wiązanie przeciwciała z deacetylowaną PNAG. Przeciwciało otrzymano dla dPNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy.

Fig. 3 pokazuje miana przeciwciał otrzymane u myszy (10 na grupę) immunizowanych 3 razy podskórnie, w 1 tygodniowych odstępach, za pomocą natywnej PNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (DTm). Zwierzęta immunizowano dawką wskazaną w legendzie. Próbki krwi otrzymywano co tydzień, 1-4 tygodnie po końcowej immunizacji.

Fig. 4 pokazuje miana przeciwciał otrzymane u myszy (10 na grupę) immunizowanych 3 razy podskórnie, w 1 tygodniowych odstępach, za pomocą dPNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (DTm). Zwierzęta immunizowano dawką wskazaną w legendzie. Próbki krwi otrzymywano co tydzień, 1 -4 tygodnie po końcowej immunizacji.

Fig. 5 pokazuje zabijanie przez opsonizację szczepów gronkowca, wskazanych w legendzie, za pomocą przeciwciał z surowic królików immunizowanych za pomocą dPNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (królik 1). Każdy punkt pokazuje średni procent zabitych dla podanego rozcieńczenia.

Fig. 6 pokazuje zabijanie przez opsonizację szczepów gronkowca, wskazanych w legendzie, za pomocą przeciwciał z surowic królików immunizowanych za pomocą dPNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (królik 2). Każdy punkt pokazuje średni procent zabitych dla podanego rozcieńczenia.

Fig. 7 pokazuje zabijanie przez opsonizację szczepów gronkowca, wskazanych w legendzie, za pomocą przeciwciał z surowic królików immunizowanych za pomocą natywnego PNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (królik 3). Każdy punkt pokazuje średni procent zabitych dla podanego rozcieńczenia.

Fig. 8 pokazuje zabijanie przez opsonizację szczepów gronkowca, wskazanych w legendzie, za pomocą przeciwciał z surowic królików immunizowanych za pomocą natywnej PNAG sprzęgniętej z toksoidem błonicy (królik 4). Każdy punkt pokazuje średni procent zabitych dla podanego rozcieńczenia.

Fig. 9 podsumowuje miana przeciwciał zdolnych do zabijania przez opsonizację w surowicach czterech królików immunizowanych przeciwko szczepom gronkowców wskazanych na osi X. Króliki opisano w legendzie figur powyżej. Każdy słupek pokazuje odwrotność rozcieńczenia surowicy, przy którym zabitych było > 40% bakterii. Słupki < 10 wskazują surowice niezdolne do zabijania 40% bakterii w rozcieńczeniu surowicy wynoszącym 1:10.

PL 229 487 Β1

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy antygenów polisacharydowych otrzymanych z bakterii gronkowców jak określono w zastrzeżeniach patentowych. Antygeny te są użyteczne do indukcji odporności na zakażenie bakteryjne, jak również do wytwarzania przeciwciał dla celów diagnostycznych i terapeutycznych.

Niniejszy wynalazek jest oparty w części na stwierdzeniu, że słabo acetylowana (tj. deacetylowana) poli-N-acetyloglukozamina (PNAG), określana niniejszym jako dPNAG, jest wysoce immunogenna i tym samym stanowi odpowiednią potencjalną szczepionkę do stymulacji ochronnych odpowiedzi immunologicznych in vivo. Deacetylowana PNAG posiada mniej niż 40% grup aminowych podstawionych octanem. W niektórych korzystnych wykonaniach mniej niż 35% grup acetylowych jest podstawionych octanem, podczas gdy w innych wykonaniach 15% lub mniej podstawień octanem jest podstawionych octanem. W dalszej kolejności stwierdzono, że dPNAG jest lepsza we wzbudzaniu wytwarzania ochronnych przeciwciał opsonizujących niż natywna PNAG. „Natywna PNAG odnosi się do naturalnie występującej mieszaniny PNAG o zakresie poziomów acetylacji wynoszącym od 0-100%. dPNAG może zostać otrzymana z natywnej PNAG przy użyciu niniejszym opisanych sposobów deacetylacji. Przeciwciała wytwarzane przeciwko dPNAG są tym samym bardziej skuteczne przeciwko gronkowcom takim jak S. aureus i S. epidermidis. Odpowiednio, zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że stopień acetylacji wpływa na poziom odpowiedzi immunologicznej indukowanej po podaniu antygenu in vivo.

Przeciwciała wzbudzone po podaniu dPNAG rozpoznają dPNAG, zaś w ważnych wykonaniach rozpoznają również wysoce acetylowane formy PNAG.

Wynalazek dostarcza kompozycji wyodrębnionej dPNAG, sposobów wyodrębniania i w niektórych przypadkach oczyszczania dPNAG. Opisano tu również sposoby do stosowania terapeutycznego, profilaktycznego i diagnostycznego. W stosowanym tu znaczeniu, dPNAG może się odnosić do dPNAG jako antygenu. Te ostatnie terminy są stosowane wymiennie. Wynalazek dostarcza również kompozycji farmaceutycznych dPNAG, które mogą być zastosowane jako szczepionki.

W niektórych aspektach, dPNAG może posiadać następujący wzór:

w którym n oznacza liczbę całkowitą od 4 do większej niż lub równej 300, R jest wybrany z grupy składającej się z NH-CO-CHs oraz -NH2, oraz mniej niż 50% grup R stanowi NH-CO-CH3. dPNAG ma wiązanie β 1-6 (tj. składa się z jednostek monomerycznych glukozoaminy połączonych wiązaniami beta (β 1-6).

dPNAG może być homopolimerem jeśli wszystkie grupy R są niepodstawione (tj. R=NH2). Homopolimer to taki polimer, w którym grupy R reszt glukozaminy są identyczne. dPNAG może być również heteropolimerem z mieszaniną grup -NH2 oraz -NH-CO-CHs w pozycji R pod warunkiem, że mniej niż 40% grup R jest podstawionych octanem. W zależności od wykonań, mniej niż 40%, mniej niż 35%, mniej niż 30%, mniej niż 25%, mniej niż 20%, mniej niż 15%, mniej niż 10%, mniej niż 5%, lub mniej niż 1% grup R zostało podstawionych octanem.

Wielkość dPNAG może się różnić, i zależy od tego czy dPNAG jest sprzęgnięta ze związkiem nośnikowym, jak tu opisano. W niektórych aspektach antygen dPNAG ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 100000 Daltonów. W innych aspektach antygen dPNAG ma masę cząsteczkową

PL 229 487 Β1 wynoszącą mniej niż 2000 Daltonów. Masa cząsteczkowa PNAG może wynosić co najmniej 200 Daltonów, lub co najmniej 400 Daltonów, lub co najmniej 600 Daltonów lub co najmniej 800 Daltonów. Można stosować dPNAG o niższej masie cząsteczkowej, w szczególności po sprzęganiu ze związkiem nośnikowym. Te dPNAG mogą być tak małe jak 2-3 jednostki monomerów, ale dogodnie mają długość co najmniej 4-6 jednostek monomerów. Odpowiadające masy cząsteczkowe wynoszą około 400, 600, 800, 1000 i 1200 Daltonów. Polisacharydy pomiędzy 500 a 20000000 Daltonów są typowe.

Jest oczywistym, że wartość n w powyższym wzorze ma wpływ na masę cząsteczkową antygenu. Jeśli n jest równe lub większe niż 300, wówczas masa cząsteczkowa minimalnego polisacharydu we wzorze wynosi 60,918 Daltonów (300 jednostek x 203 Daltonów/jednostkę +18 Daltonów dla podstawników reszt końcowych). Jeśli antygen ma minimalną masę cząsteczkową wynoszącą 100000 Daltonów, wówczas polisacharyd ma więcej niż 300 jednostek lub polisacharyd jest sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym, który ma znaczenie dla masy cząsteczkowej.

Opisano tu również występujące naturalnie, jak i syntetyczne formy antygenu dPNAG. W stosowanym tu znaczeniu naturalnie występującą dPNAG stanowi dPNAG wyodrębniona lub pochodząca z naturalnie występujących źródeł. Antygeny dPNAG są również dostarczane w formie wyodrębnionej. Wyodrębniony polisacharyd, taki jak wyodrębniona dPNAG, stanowi polisacharyd, który został usunięty i oddzielony od środowiska, w którym normalnie występuje. W niektórych przypadkach, wyodrębniony polisacharyd jest wydajnie oddzielany od innych związków scharakteryzowanych strukturalnie lub funkcjonalnie. Przykładowo, wyodrębniony polisacharyd może zostać „zsekwencjonowany w celu określenia jego składu chemicznego.

dPNAG może zostać przygotowana z dowolnego szczepu bakteryjnego niosącego locus ica. Szczepy te obejmują, ale nieograniczająco, S. epidermis i S. aureus oraz inne szczepy (np. S. carnosus), które transformowano genami zawierającymi locus ica. W szczególności, dPNAG może być otrzymana ze specyficznych szczepów, w tym S. epidermis RP62A (numer ATCC 35984), S. epidermis RP12 (numer ATCC 35983), S. epidermis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27), oraz S. aureus MN8 mukoidalny.

Jeden ze sposobów obejmuje inkubację zanieczyszczonej PNAG z zasadą lub kwasem w celu otrzymania częściowo oczyszczonego preparatu PNAG, neutralizacji preparatu i dalszej obróbki zneutralizowanego preparatu w celu otrzymania dPNAG.

Zanieczyszczona natywna PNAG może być wytworzona za pomocą szeregu sposobów, w tym ekstrakcji nieoczyszczonego natywnego preparatu PNAG z hodowli bakteryjnej, w tym komórek i supernatantów z hodowli pozbawionych komórek, co prowadzi do wyodrębnienia z nieoczyszczonego preparatu PNAG, materiału o wysokiej masie cząsteczkowej, wzbogaconego w natywną PNAG. Następnie, natywną PNAG można otrzymać początkowo poprzez precypitację zanieczyszczonej PNAG zawierającej materiał bogaty w PNAG o wysokiej masie cząsteczkowej za pomocą rozpuszczalnika powodującego precypitację polisacharydów z wodnych roztworów, takiego jak metanol, etanol, aceton lub innego organicznego rozpuszczalnika znanego fachowcom. Etapy ekstrakcji nieoczyszczonego, natywnego preparatu PNAG oraz wyodrębniania i precypitacji zanieczyszczonej, natywnej PNAG są wykonywane za pomocą dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak w np. patencie U.S.A nr 5055455. Ten zanieczyszczony materiał jest w dalszej kolejności oczyszczany i deacetylowany w celu otrzymania dPNAG według wynalazku.

Etapy oczyszczania są wykonywane poprzez inkubację zanieczyszczonego PNAG z enzymami bakteryjnymi, które trawią materiały biologiczne, w tym z czynnikami niszczącymi ściany komórkowe, takimi jak lizozym, lizostafina i proteinaza K oraz nukleazy, takie jak Dnaza i Rnaza, celem strawienia DNA i RNA. Następnie, dodawany jest rozpuszczalnik celem precypitacji PNAG z roztworu, precypitat jest zbierany i PNAG ponownie rozpuszczana w zasadzie, takiej jak NaOH lub w kwasie, takim jak HCI, a następnie wykonywana jest neutralizacja. Neutralizację można osiągnąć przy użyciu zasady, jeśli etap inkubacji jest wykonywany z kwasem, albo za pomocą kwasu, jeśli etap inkubacji jest wykonywany z zasadą. Frakcja nierozpuszczalna z materiału zneutralizowanego jest następnie poddawana np.: inkubacji z kwasem fluorowodorowym w celu otrzymania oczyszczonego, natywnego antygenu PNAG lub poprzez ponowne rozpuszczenie w buforach o pH < 4,0 a następnie chromatografię sączenia molekularnego i/lub chromatografię jonowymienną.

Inna metoda wyodrębniania obejmuje etapy ekstrakcji nieoczyszczonej zawiesiny PNAG z hodowli bakteryjnej poprzez inkubację bakterii z silną zasadą lub kwasem. Dogodnie, bakterie są mieszane w silnej zasadzie lub kwasie przez co najmniej 2 godżiny, a w szczególności co najmniej przez 5, 10, 15, 18 lub 24 godziny. Silną zasadę lub kwas może stanowić dowolny rodzaj silnej zasady lub kwasu,

PL 229 487 Β1 w szczególności mające siłę wynoszącą co najmniej 1 M NaOH lub HCL W niektórych wykonaniach silną zasadą lub kwasem jest 5 M NaOH lub 5 M HCL Roztwór zasady lub kwasu jest następnie poddawany wirowaniu w celu zebrania ciał komórek. W niektórych wykonaniach procedura ekstrakcji jest powtarzana kilka razy. Powstający roztwór kwasu lub zasady jest neutralizowany do pH około 7, a następnie dializowany w celu otrzymania nierozpuszczalnej zanieczyszczonej PNAG.

dPNAG może być zsyntetyzowana z naturalnie występujących polisacharydów, które mają więcej niż 50% podstawień octanem. Przykładowo, antygen dPNAG może być syntetyzowany poprzez deacetylację silnie acetylowanego polimeru glukozaminy za pomocą środków chemicznych (np. zasady) lub enzymatycznych.

Antygeny dPNAG mogą być również syntetyzowane de novo (Patrz, przykładowo, Melean i wsp. Carbohydrate Research, 337:1893-1916, 2002.) Materiały wyjściowe obejmują, ale nieograniczająco, poliglukozę (tj. dekstran), poliglukozoaminy takie jak chityna lubchitozan, oraz kwas poliglukozoaminouronowy. Kwas poligalaktozaminouronowy może być również wykorzystany do wytwarzania antygenu dPNAG według wynalazku. Poliglukozoaminy mające różne podstawniki mogą być również modyfikowane w celu otrzymania antygenu PNAG. Przykładowo, wewnątrzkomórkowa adhezyna polisacharydowa (PIA) jest silnie acetylowanym polimerem reszt β 1-6 związanej glukozoaminy. PIA posiada następujący wzór:

COOK

Dla tych polisacharydów zawierających ugrupowania iminy (C-NH) wolne grupy aminowe mogą być otrzymane za pomocą konwencjonalnych technik chemicznych znanych fachowcom. Jeden odpowiedni sposób obejmuje użycie borowodorku sodu. Grupa iminowa może zostać zredukowana za pomocą borowodorku sodu w celu utworzenia wolnej grupy aminowej. Wykonuje się to poprzez dodanie w nadmiarze 5 mg borowodorku do polisacharydu rozpuszczonego w wodzie destylowanej podczas mieszania w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszanina jest następnie dializowana wobec wody i liofilizowana (patrz, przykładowo, DiFabio, i wsp. Biochem J. , 1987 15; 244(1): 27-33).

Wynalazek dostarcza preparatów dPNAG o różnym stopniu czystości. Jak niniejszym zastosowano, „czysty preparat dPNAG stanowi preparat dPNAG wyodrębniony lub zsyntetyzowany, który jest w więcej niż 92% wolny od zanieczyszczeń. Zanieczyszczenia te obejmują silnie acetylowane formy PNAG (tj. mające więcej niż 40% podstawień octanem), galaktozę, fosforan, kwas tejchojowy i tym podobne. W niektórych wykonaniach, kompozycje dPNAG są co najmniej 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% wolne od zanieczyszczeń lub w 100% wolne od zanieczyszczeń.

Kompozycje dPNAG mogą być również określane jako „zasadniczo wolne od zanieczyszczeń. Kompozycja dPNAG jest zasadniczo wolna od, przykładowo, galaktozy, co wskazuje na obecność mniej niż 10%, dogodnie mniej niż 5%, a dogodniej mniej niż 1% galaktozy w preparacie zawierającym dPNAG.

PL 229 487 Β1

Stopień czystości kompozycji dPNAG jest osiągany za pomocą środków znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, czystość może być oceniana za pomocą testów analizy chemicznej, jak również chromatografii gazowej i magnetycznego rezonansu jądrowego weryfikującego strukturalne aspekty materiału.

Kolejne duże zanieczyszczenia niektórych preparatów dPNAG mogą stanowić kwasy tejchojowe zawierające fosforany. Zanieczyszczenie kwasem tejchojowym może interferować z charakterystyką chemiczną oraz z immunogennością antygenu dPNAG według wynalazku. Opisano tu wytwarzanie wyodrębnionego preparatu dPNAG zasadniczo pozbawionego kwasu tejchojowego. Preparat dPNAG zasadniczo wolny od kwasu tejchojowego to preparat zawierający mniej niż 1,0% fosforanu, a jeszcze dogodniej mniej niż 0,1% fosforanu. Ilość fosforanu obecnego w próbce może być oceniana za pomocą sposobów znanych w tej dziedzinie. Ilość zanieczyszczeń fosforanem może być mierzona z zastosowaniem metod opisanych w Keleti, G. i W.H. Lederer, ((1974) Handbook of Micromethods for the Biological Sciences Van Nostrand Reinhold Co., New York). Krótko, test jest wykonywany w sposób następujący: do 100 μg próbki 100 μΙ roztworu sporządzonego poprzez dodanie 43,5 ml wody, 6,5 ml 70% kwasu nadchlorowego (HCIO4) oraz 50 ml 20 N kwasu siarkowego (H2SO4). Mieszaninę podgrzewa się do 95°C przez 2 godziny w probówce z marmurem na górze. Mieszaninę następnie umieszcza się w piecu w 165°C i podgrzewa przez następne 2 godziny, a następnie schładza w temperaturze pokojowej. Następnie, do próbki dodaje się 1 ml odczynnika 5, sporządzonego w następujący sposób:

Odczynnik 1:1,36 gram octanu sodu 3H2O rozpuszczony w 10 ml wody.

Odczynnik 2: 500 mg molibdenianu amonu rozpuszczano w 20 ml wody.

Odczynnik 3: 2 ml odczynnika 1,2 ml odczynnika 2 i 16 ml wody.

Odczynnik 4: 2 mg kwasu askorbinowego rozpuszczonego w 20 ml wody, przygotowano natychmiast przed użyciem.

Odczynnik 5: Dodać w łaźni lodowej 9 ml odczynnika 3 i 1 ml odczynnika 4. Po dodaniu odczynnika 5 probówki dokładnie miesza się, i gęstość optyczną mierzy przy 820 nanometrach w spektrofotometrze. Do wyliczenia ilości fosforanu obecnego w badanych próbkach stosuje się krzywą standardową składającą się z jednozasadowego fosforanu sodu (zakres 0,1-5 μg na probówkę). (Lowry, O.H., N.R. Roberts, K.Y. Leiner, M.L. Wu i A. L. Farr., (1954), Biol.Chem. 207,1.)

Kompozycje według wynalazku są użyteczne do wielu różnych zastosowań, w tym do rozpoznawania in vitro, in situ oraz in vivo statusu patologicznego, takiego jak zakażenie. Kompozycje mogą być wykorzystywane do immunizacji osobników in vivo w celu profilaktyki lub leczenia zakażenia. Kompozycje mogą być również zastosowane do wytwarzania przeciwciał lub innych peptydów wiążących, użytecznych do tych samych celów co kompozycje dPNAG według wynalazku. Tym samym, wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające dPNAG lub odpowiadające czynniki wiążące (np. przeciwciała), które mogą być stosowane do celów szczepienia w celu indukcji odporności aktywnej lub biernej u osobnika, który tego potrzebuje. Opisano tu również sposoby wytwarzania czynników wiążących, takich jak przeciwciała, które wiążą się do dPNAG, które mogą być stosowane w rozpoznawaniu i leczeniu zakażeń gronkowcami i związanych z nimi stanów.

dPNAG może być zastosowana w formie sprzęganej i niesprzęganej. W formie sprzęganej, dPANG mogą być sprzęgane ze związkiem nośnikowym, bezpośrednio lub za pomocą łącznika. Sprzęganie może zachodzić w każdej pozycji w monomerycznej jednostce glukozaminy lub na końcach polimeru.

„Związek nośnikowy, w stosowanym tu znaczeniu, stanowi związek, który może być sprzęgany do polisacharydu, bezpośrednio lub za pomocą łącznika, który jest immunologicznie aktywny lub obojętny.

Związki nośnikowe obejmują, ale nieograniczająco, białka lub peptydy, polisacharydy, kwasy nukleinowe lub inne polimery, lipidy i małe cząsteczki. Białka obejmują, przykładowo, białka osocza takie jak albumina surowicy, immunoglobuliny, apolipoproteiny i transferyna, peptydy bakteryjne takie jak TRPLE, β-galaktozydaza, polipeptydy takie jak białko gD wirusa herpes, alergeny, toksoidy błonicy i tężca, flagelina z Salmonella, pilina z Hemophilus, białka błonowe 15 kDa z Hemophilus, 28-30 kDa oraz 40 kDa, Escherichia coli, termolabilna enterotoksyna 1 tb, toksyna cholery oraz białka wirusowe obejmujące rotawirusa VP oraz białka f i g wirusa RV. Białka użyteczne w wynalazku obejmują wszelkie białka, które można bezpiecznie podawać ssakom, i które są opcjonalnie immunologicznie skutecznym białkiem nośnikowym.

Związki nośnikowe, które są szczególnie dogodne w immunizacji obejmują białka takie jak hemocyjanina z Megathura crenulata, albumina surowicy, tyroglobulina bydlęca lub sojowy inhibitor trypsyny.

PL 229 487 Β1

Wszelkie inne związki, mające charakter immunogenny w gatunkach zwierząt, które mają zostać poddane immunizacji, mogą być podobnie użyte.

W tej dziedzinie jest znanych wiele sposobów sprzęgania polisacharydu z białkiem. Ogólnie, polisacharyd powinien być aktywowany lub inaczej pozostawiany w stanie zdolnym do sprzęgania, tj. co najmniej jedno ugrupowanie powinno mieć zdolność kowalencyjnego wiązania białka lub innej cząsteczki. W tej dziedzinie jest znanych wiele tego rodzaju metod. Przykładowo, patent U.S.A. nr 4356170 wydany dla Jennings, opisuje użycie kwasu nadjodowego do wytwarzania grup aldehydowych w polisacharydzie, a następnie użycie aminowania redukcyjnego za pomocą cyjanoborowodorku. W patencie U.S.A nr 4663160, wydanym dla Tsay i wsp., również wykorzystywano kwas nadjodowy do wytwarzania grup aldehydowych, następnie łączono polisacharyd z białkiem za pomocą ugrupowania węglowego 4-12 (przygotowane w obecności czynnika kondensującego) za pomocą zasady Schiffa w obecności czynnika redukującego, takiego jak cyjanoborowodorek. W patencie U.S.A nr 4619828, wydanym dla Gordon, wykorzystywano bromek cyjanogenu do aktywacji polisacharydu, a następnie sprzęgano go z białkiem za pomocą mostka z 4-8 atomów węgla. W patencie U.S.A nr 4808700, dla Anderson i Clements, polisacharyd był modyfikowany w celu otrzymania co najmniej jednego końca redukującego przy użyciu ograniczającej oksydatywnego cięcia z użyciem nadjodanu, hydrolizy za pomocą glikozydazy lub kwaśnej hydrolizy, a następnie sprzęgano z białkiem poprzez aminowanie redukcyjne w obecności cyjanoborowodorku. Patent U.S.A nr 4711779, wydany dla Porro i Costantino, opisuje aktywację polisacharydów poprzez wprowadzenie pierwszorzędowych grup aminowych do końcowych grup redukujących przy użyciu cyjanoborowodorku sodu, a następnie konwersję do estrów w obecności pochodnych kwasu adypinowego oraz sprzęganie do toksoidu w obecności rozpuszczalnika organicznego, takiego jak dimetylosulfotlenek. W tej dziedzinie znanych jest wiele innych sposobów sprzęgania.

Związek nośnikowy może być sprzęgany do dPNAG za pomocą łącznika lub wstawki. Polisacharyd może być sprzęgany z łącznikiem lub wstawką za pomocą dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, przykładowo przy użyciu wolnego końca redukującego polisacharydu w celu otrzymania wiązania kowalencyjnego z łącznikiem lub wstawką. Wiązanie kowalencyjne można otrzymać konwertując wolny koniec redukujący dPNAG do wolnego 1-aminoglikozydu, który może zostać następnie kowalencyjnie połączony do wstawki poprzez acylację. (Lundąuist i wsp., Carbohydrate Chem., 10:377(1991)). Opcjonalnie, dPNAG może być kowalencyjnie połączony ze wstawką przy użyciu aktywnego estru N-hydroksybursztynowego na aktywowanej grupie na wstawce. (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146:C1 (1986)). Wolny redukujący koniec dPNAG może być również przekształcany do laktonu przy użyciu jodu i wodorotlenku potasu. (Isebell i wsp., Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, New York (1962)). Lakton może być kowalencyjnie połączony ze wstawką za pomocą pierwszorzędowej grupy aminowej na wstawce lub łączniku. Wolny redukujący koniec dPNAG może być również kowalencyjnie połączony z łącznikiem lub wstawką przy użyciu aminowania redukcyjnego.

Wynalazek obejmuje przeciwciała wiążące dPNAG. Przeciwciała mogą być zarówno przeciwciałami monoklonalnymi, jak i poliklonalnymi. Przeciwciała dPNAG wiążą się z dPNAG i mogą również wiązać się z formami PNAG, które są acetylowane bardziej niż w 50%. Przeciwciała poliklonalne są ogólnie wytwarzane w zwierzętach poprzez wielokrotne wstrzyknięcia podskórne lub dootrzewnowe za pomocą antygenu i adiuwantu. Przeciwciała poliklonalne dla dPNAG mogą być wytwarzane poprzez wstrzyknięcie dPNAG w formie sprzęgniętej lub niesprzęgniętej same lub w połączeniu z adiuwantem.

Przykład preparatu przeciwciała poliklonalnego jest następujący. Koniugat dPNAG lub sama dPNAG jest połączony z adiuwantem, takim jak kompletny adiuwant Freunda (np. 100 gg koniugatu dla królików lub myszy w 1-3 objętościach Freunda) i wstrzykiwany śródskórnie w wielu miejscach. Około miesiąc później, zwierzętom podaje się dawkę przypominającą antygenu w objętości 1/5-1/10 oryginalnej ilości antygenu, lub koniugatu antygenu za pomocą wstrzyknięcia podskórnego w wielu miejscach. Tydzień do dwóch tygodni później zwierzęta są skrwawiane, zaś surowicę bada pod kątem obecności przeciwciał. Zwierzętom podawane są powtarzalnie przypominające dawki aż do osiągnięcia stabilnego miana przeciwciał. Zwierzętom podaje się przypominającą dawkę samego dPNAG, koniugatu dPNAG lub dPNAG sprzęgniętego z innym związkiem nośnikowym, z dodatkiem lub bez, adiuwantu. W niektórych wykonaniach, kolejne przypominające dawki mogą zawierać PNAG, zamiast dPNAG, lub mogą zawierać mieszaninę dPNAG i PNAG.

Oprócz stanowienia źródła przeciwciał polikonalnych, immunizowane zwierzęta mogą być wykorzystywane do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych anty-dPNAG. W stosowanym tu znaczeniu, termin „przeciwciało monoklonalne odnosi się do homogennej populacji immunoglobulin wiążących się

PL 229 487 Β1 z tym samym epitopem (tj. determinantą antygenową) dPNAG. Epitop ten może być również obecny w formach PNAG, które są acetylowane w bardziej niż 50%. Przeciwciała monoklonalne mają tę samą rearanżację genów dla Ig, a tym samym wykazują jednakową swoistość wiązania. Przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowane za pomocą dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak unieśmiertelnienie komórek śledziony wyodrębnionych z immunizowanych zwierząt poprzez np. fuzję z komórkami szpiczaka lub transformację wirusem Epstein-Barr'a oraz przeszukiwanie klonów pod kątem klonów eksprymujących pożądane przeciwciało. Inne metody obejmują izolację rearanżowanych sekwencji genu dla Ig oraz ich sklonowanie do unieśmiertelnionych linii komórkowych. Sposoby wytwarzania i wykorzystywania przeciwciał monoklonalnych są znane w tej dziedzinie.

Przeciwciała monoklonalne anty-d-PNAG myszowatych mogą być wytwarzane za pomocą dowolnej z tych metod wykorzystujących dPNAG jako immunogen. Kolejny opis sposobu otrzymywania przeciwciała monoklonalnego anty dPNAG ma charakter przykładowy i ilustracyjny. Myszy Balb/c immunizowane są dootrzewnowo za pomocą około 75-100 qg oczyszczonej dPNAG w kompletnym adiuwancie Freunda. Wstrzyknięcia dawek przypominających około 25-50 qg dPNAG w niekompletnym adiuwancie Freunda podawane są około 15-35 dni po początkowym wstrzyknięciu. W dniu 60-65 myszom podawane są wstrzyknięcia dawek przypominających dPNAG bez obecności adiuwantu. Wstrzyknięcie przypominające może opcjonalnie zawierać natywny preparat PNAG lub mieszaninę dPNAG lub PNAG. Trzy dni później, myszy są uśmiercane, a wyodrębnione komórki śledziony poddawane fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 myszowatych przy użyciu glikolu polietylenowego za pomocą procedury opisanej przez Oi (Oi VT: Immunoglobulin-producing hybrid celi lines in Herzenberg LA (red.): Selected Methods in Cellular Biology, San Francisco, CA, Freeman, (1980)). Komórki hybrydomy selekcjonuje się wykorzystując hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (HAT) i hoduje w hodowli. Czternaście do piętnastu dni po fuzji, komórki hybrydomy produkujące przeciwciała monoklonalne anty-dPNAG są identyfikowane przy użyciu testu radioimmunoenzymatycznego fazy stałej poprzez wychwytywanie przeciwciał anty-dPNAG z kondycjonowanej pożywki za pomocą immobilizowanych kozich przeciwciał antymysie IgG oraz pomiaru specyficznie związanych wyznakowanych ¹²⁵l dPNAG lub PNAG. Hybrydomy pozytywne w teście swoistości przeciwciał wobec dPNAG są subklonowane metodą ograniczających rozcieńczeń i ponownie testowane. Następnie w myszach Balb/c przygotowuje się puchliny z hybrydom, którym wcześniej stymulowano pristanem, poprzez wstrzykiwanie około 1 χ 10⁶ komórek/mysz. Koncentraty wzbogacone w wybrane przeciwciała monoklonalne są otrzymywane z płynu wysiękowego poprzez filtrację w żelu na S-200 i zatężanie za pomocą NH4SO4. Osady są rozpuszczane w odpowiednim roztworze do przechowywania, np. 50% glicerol/H2O i przechowywane w 4°C.

„Przeciwciało anty-dPNAG, w stosowanym tu znaczeniu, dotyczy humanizowanych przeciwciał oraz fragmentów przeciwciał, jak również nienaruszonych przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych, które wiążą dPNAG i w niektórych przypadkach również formy PNAG acetylowane bardziej niż w 50%. „Humanizowane przeciwciało monoklonalne, w stosowanym tu znaczeniu, stanowi ludzkie przeciwciało monoklonalne lub jego funkcjonalnie aktywny fragment posiadający co najmniej ludzkie stałe regiony oraz miejsce wiązania dPNAG (np. ODR) z gatunku ssaka innego niż człowiek. Nienaruszone humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-dPNAG w formie wyodrębnionej lub w postaci preparatu farmaceutycznego w szczególności odpowiada niektórym aspektom wynalazku. Humanizowane przeciwciała mają szczególną użyteczność kliniczną, ponieważ swoiście rozpoznają dPNAG, i dogodnie również natywne formy PNAG, jednak nie wywołują odpowiedzi immunologicznej u ludzi przeciwko samemu przeciwciału. W jednym zalecanym wykonaniu ODR myszowatych jest wszczepiany do regionu zrębowego ludzkiego przeciwciała w celu otrzymania „humanizowanego przeciwciała. Patrz, L. Riechmann i wsp., Naturę 332,323 (1988); M. S. Neuberger i wsp., Naturę 314,268 (1985) oraz EPA 0 239 400 (publikacja 30.09.1987).

Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą zostać wyprodukowane za pomocą dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak ta ujawniona w patencie U.S.A. nr 5 567 610, wydanym dla Borrebaeck i wsp., patencie U.S.A. nr 565,354, wydanym dla Ostberg, patencie U.S.A. nr 5 571 893, wydanym dla Baker i wsp, Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984), Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, Nowy Jork, 1987), oraz Boerner i wsp., J. Immunol., 147: 8695 (1991). Oprócz konwencjonalnych metod wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych, tego rodzaju przeciwciała mogą być wytwarzane poprzez immunizację zwierząt transgenicznych zdolnych do wytwarzania ludzkich przeciwciał (np. Jakobovits i wsp., PNAS USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits i wsp., Naturę, 362: 255-258 (1993), Bruggermann i wsp., Year in Immunol., 7:33 (1993) oraz patencie U.S.A. nr 5 569 825 wydanym dla Lonberg).

PL 229 487 Β1

Kolejne przykłady sposobów wytwarzania humanizowanych przeciwciał monoklonalnych, które oddziałują z dPNAG oraz dogodnie z innymi natywnymi formami PNAG mają charakter przykładowy i ilustracyjny. Humanizowane przeciwciała monoklonalne, przykładowo, mogą zostać skonstruowane poprzez zastąpienie regionów nie-CDR nie-ludzkiego ssaczego przeciwciała za pomocą podobnych regionów przeciwciał ludzkich przy zachowaniu swoistości epitopowej oryginalnego przeciwciała. Przykładowo, nie-ludzki CDR oraz opcjonalnie jeden z regionów zrębowych może być kowalencyjnie połączony do ludzkich regionów FR i/lub Fc/pFc' celem otrzymania funkcjonalnego przeciwciała. W Stanach Zjednoczonych istnieją instytucje komercyjnie syntetyzujące humanizowane przeciwciała ze specyficznych regionów przeciwciał myszowatych, takich jak Protein Design Labs (Mountain View California), Abgenix i Medarex.

Europejskie Zgłoszenie Patentowe 0239400 dostarcza przykładu wytwarzania i zastosowania humanizowanych przeciwciał monoklonalnych, w których co najmniej jedna część CDR przeciwciała myszowatych (lub innego ssaka nieczłowieka) jest włączona do przeciwciała humanizowanego. Krótko, następujące metody są użyteczne do konstrukcji humanizowanego przeciwciała monoklonalnego CDR zawierającego co najmniej część mysiego CDR. Przygotowuje się pierwszy replikacyjny wektor ekspresyjny zawierający odpowiedni promotor operacyjnie połączony z sekwencją DNA kodującą co najmniej domenę zmienną lekkiego lub ciężkiego łańcucha Ig oraz domenę zmienną zawierającą regiony zrębowe z ludzkiego przeciwciała oraz region CDR z przeciwciała myszowatych. Opcjonalnie, przygotowuje się drugi replikacyjny wektor ekspresyjny zawierający odpowiedni promotor operacyjnie połączony z sekwencją kodującą DNA co najmniej domeny zmiennej komplementarnego ludzkiego łańcucha lekkiego lub ciężkiego Ig. Następnie, linię komórkową transformuje się wektorami. Dogodnie, linię komórkową stanowi unieśmiertelniona ssacza linia komórkowa pochodzenia limfoidalnego, np. linia komórkowa szpiczaka, hybrydomy, triomy, kwadromy lub normalne komórki limfoidalne unieśmiertelnione poprzez transformację wirusem. Stransformowaną linię komórkową następnie hoduje się w warunkach znanych w tej dziedzinie w celu otrzymania humanizowanego przeciwciała.

Jak podano w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 0239400, znanych jest w tej dziedzinie szereg technik pozwalających na stworzenie poszczególnych domen przeciwciał, które mają być wstawiane do wektora replikacyjnego. (Zalecane wektory i techniki rekombinacyjne są opisane szczegółowo poniżej). Przykładowo, sekwencja DNA kodująca domenę może być wytwarzana na drodze syntezy oligonukleotydów. Opcjonalnie można wykorzystać syntetyczny gen pozbawiony regionów CDR, w którym cztery regiony zrębowe są poddawane fuzji razem z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi w połączeniach, w taki sposób, że dwuniciowe syntetyczne lub restrykcyjne subklonowane kasety CDR z lepkimi końcami mogą być ligowane w połączeniach regionów zrębowych. Kolejna metoda obejmuje przygotowanie sekwencji DNA kodującej domenę zmienną zawierającą CDR za pomocą ukierunkowanej mutagenezy. Każdy z tych sposobów jest dobrze znany w tej dziedzinie. Fachowcy mogą skonstruować humanizowane przeciwciała zawierające region CDR myszowatych bez niszczenia swoistości przeciwciała w stosunku do epitopu.

Ludzkie przeciwciała mogą być również otrzymane poprzez odzyskiwanie limfocytów wytwarzających przeciwciała z krwi, bądź z innych tkanek ludzkich produkujących przeciwciało dla dPNAG. Limfocyty te mogą być poddawane manipulacjom komórek, które same rosną w laboratorium w odpowiednich warunkach hodowli. Hodowle komórek mogą być badane w kierunku produkcji przeciwciał przeciwko dPNAG, a następnie klonowane. Hodowle klonów mogą być wykorzystywane do produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko dPNAG bądź też elementy genetyczne kodujące zmienne części łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała mogą zostać sklonowane i wstawione do wektorów kwasu nukleinowego służących do produkcji przeciwciał różnych typów.

Wynalazek obejmuje również fragmenty przeciwciał wiążących dPNAG. Jak wiadomo w tej dziedzinie, tylko niewielka część cząsteczki przeciwciała, zwana paratopem, bierze udział w wiązaniu przeciwciała z epitopem (patrz, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Nowy Jork; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7 wyd, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Regiony pFc' i Fc, przykładowo, są efektorami kaskady dopełniacza ale nie biorą udziału w wiązaniu antygenu. Przeciwciało, z którego region pFc' został enzymatycznie wycięty, lub które zostało otrzymane bez regionu pFc', oznaczone jako fragment F(ab')2, zachowuje miejsca wiązania antygenu nienaruszonego przeciwciała. Wyodrębniony fragment F(ab')2jest określany jako biwalentny fragment monoklonalny z powodu dwóch miejsc wiążących antygen. Podobnie przeciwciało, z którego wycięto enzymatycznie region Fc, oznaczone jako fragment Fab, zachowuje jedno z miejsc wiązania antygenu z nienaruszonej cząsteczki przeciwciała. Poddawanie dalszej obróbce fragmentów Fab składa

PL 229 487 Β1 się z kowalencyjnie związanego lekkiego łańcucha przeciwciała oraz części łańcucha ciężkiego przeciwciała, oznaczonego jako Fd (region zmienny łańcucha ciężkiego). Fragmenty Fd są głównymi determinantami swoistości przeciwciała (pojedynczy fragment Fd może być związany do 10 różnych łańcuchów lekkich, bez zmiany swoistości przeciwciała) i fragmenty Fd zachowują zdolność do wiązania epitopu w izolacji.

Terminy Fab, Fc, pFc', F(ab')₂ i Fv zostały użyte w ich standardowym znaczeniu immunologicznym [Klein, Immunology (John Wiley, Nowy Jork, NY, 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork); Roitt, I, (1991) Essential Immunology, 7 wyd., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)j. Znane, funkcjonalnie aktywne fragmenty przeciwciał obejmują, ale nieogranczająco, fragmenty F(ab')₂, Fab, Fv i Fd przeciwciał. Fragmenty te, pozbawione fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, są szybciej usuwane z krążenia i mają mniejsze nieswoiste wiązanie do tkanek niż nienaruszone przeciwciało (Wahl i wsp., Nuci. Med. 24:316-325 (1983)). Przykładowo, jednołańcuchowe przeciwciała mogą być skonstruowane zgodnie ze sposobami opisanymi w patencie U.S. nr 4946 778 dla Ladner i wsp. Tego rodzaju jednołańcuchowe przeciwciała obejmują regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich połączone elastycznym ugrupowaniem łącznika. Opisano również sposoby otrzymywania przeciwciała o jednej domenie (Fd”), które zawiera jedną domenę zmienną wyodrębnionego łańcucha ciężkiego (patrz, Ward i wsp., Naturę 341:644-646 (1989), ujawniono również sposób przeszukiwania służący identyfikacji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała (jedno-domenowe przeciwciało Vh) o wystarczającym powinowactwie do wiązania wyodrębnionej formy epitopu docelowego). Sposoby otrzymywania rekombinowanych fragmentów Fc opartych na znanych sekwencjach regionów zmiennych łańcuchów ciężkich oraz lekkich przeciwciał są znane w tej dziedzinie i zostały opisane, np. Moore i wsp., patent U.S.A. nr 4462334. Inne odniesienia opisujące wykorzystanie i wytwarzanie fragmentów przeciwciał obejmują, np. fragmenty Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), fragmenty Fv (Hochman i wsp., Biochemistry 12: 1130 (1973), Sharon i wsp., Biochemistry 15: 1591 (1976), Ehrilch i wsp., patent U.S.A. nr 4 355023) oraz części cząsteczek przeciwciał (Audilore-Hargreaves, patent U.S.A. nr 4 470 925). Fachowcy mogą skonstruować fragmenty przeciwciał z różnych części nienaruszonych przeciwciał bez niszczenia swoistości przeciwciał dla epitopów dPNAG. Jest zrozumiałym, że epitop rozpoznawany przez przeciwciała anty-dPNAG może być również obecny na innych natywnych formach PNAG.

Fragmenty przeciwciał obejmują również „humanizowane fragmenty przeciwciał. Tego rodzaju fragmenty mogą być przygotowane za pomocą konwencjonalnego enzymatycznego cięcia nienaruszonych humanizowanych przeciwciał. Jeśli jednak nienaruszone przeciwciała nie są podatne na tego rodzaju cięcie z powodu natury konstruktu, dane konstrukty mogą zostać przygotowane z fragmentów immunoglobulin użytych jako materiały wyjściowe. Jeśli natomiast stosuje się techniki rekombinacyjne, wówczas sekwencje DNA mogą zostać tak zmodyfikowane, aby kodowały pożądany „fragment, który po ekspresji może być połączony in vitro lub in vivo, za pomocą środków chemicznych lub biologicznych, celem otrzymania końcowego pożądanego fragmentu nienaruszonej immunoglobuliny.

W sposobach diagnostycznych tu opisanych można zastosować inne czynniki wiążące dPNAG, wykazujące swoistość wiązania dla dPNAG. Można zastosować kilka rutynowych testów w celu łatwej identyfikacji peptydów wiążących dPNAG. Testy przesiewowe identyfikacji peptydów tu opisanych są wykonywane, przykładowo, wykorzystując procedury prezentacji na fagach, takie jak te opisane w Hart, i wsp., J.Biol.Chem. 269:12468 (1994). Hart i wsp. opisują wykorzystanie biblioteki prezentacji faga filamentowego do identyfikacji nowych ligandów peptydowych dla receptorów na ssaczych komórkach. Ogólnie biblioteki prezentacji faga filamentowego, np. faga M13 lub fd, są przygotowywane przy użyciu procedur konwencjonalnych, takich jak te opisane w powyższych odniesieniach. Biblioteki zawierają wstawki zawierające od 4 do 80 reszt aminokwasowych. Wstawki opcjonalnie stanowią w pełni zdegenerowany lub ukierunkowany zestaw peptydów. Ligandy selektywnie wiążące się do dPNAG są otrzymywane poprzez selekcję faga z ekspresją na powierzchni liganda wiążącego się z dPNAG. Fagi te są następnie poddawane kilku cyklom reselekcji wcelu identyfikacji faga z ekspresją liganda peptydowego o najdogodniejszej charakterystyce wiązania. Zazwyczaj fag wykazujący najlepszą charakterystykę wiązania (np. największe powinowactwo) jest w dalszej kolejności charakteryzowany przy pomocy analizy kwasów nukleinowych celem identyfikacji poszczególnych sekwencji aminokwasowych peptydów ulegających ekspresji na powierzchni faga oraz posiadających optymalną długość zapewniającą optymalne wiązanie do dPNAG.

PL 229 487 Β1

Opcjonalnie, tego rodzaju ligandy peptydowe mogą zostać wybrane z bibliotek kombinatoryjnych dla peptydów zawierających jeden lub więcej aminokwasów. Tego rodzaju biblioteki mogą być w dalszej kolejności syntetyzowane tak, aby zawierały nie-peptydowe reszty syntetyczne, które są mniej wrażliwe na enzymatyczną degradację w porównaniu do ich naturalnie występujących odpowiedników.

W celu określenia, czy peptyd wiąże dPNAG, zastosowany może zostać dowolny znany test wiązania. Przykładowo, peptyd może być immobilizowany na powierzchni, a następnie kontaktowany z wyznakowaną dPNAG. Ilość dPNAG oddziałującej z peptydem lub ilość nie wiążąca peptydu może wówczas zostać oznaczona celem określenia, czy peptyd wiąże się z dPNAG. Powierzchnia posiadająca immobilizowane przeciwciało anty-dPNAG może służyć jako kontrola pozytywna. Testy wiązania mogą również określić stopień, w którym domniemane dPNAG-swoiste przeciwciało wiąże się w innymi natywnymi formami dPNAG. Kompozycje według wynalazku są użyteczne w wielu zastosowaniach in vivo i in vitro. Przykładowo, kompozycje według wynalazku są użyteczne w wytwarzaniu odpowiedzi przeciwciałowej, np., jako szczepionka do aktywnej immunizacji ludzi i zwierząt w celu profilaktyki zakażenia gronkowcami oraz zakażeń innymi bakteriami, które produkują PNAG; jako szczepionka do immunizacji ludzi lub zwierząt w celu produkcji przeciwciał anty-dPNAG, które mogą być podawane innym ludziom lub zwierzętom w celu profilaktyki lub leczenia zakażeń gronkowcami; jako antygen do badania czynników biologicznych, takich jak przeciwciała monoklonalne zdolne do profilaktyki zakażeń gronkowcami; jako biblioteki genowe biorące udział w produkcji przeciwciał lub mimetyków peptydów; jako czynnik diagnostyczny w zakażeniach gronkowcami oraz zakażeniach wywołanych innymi gatunkami bakterii produkującymi PNAG, jako czynnik diagnostyczny do określania statusu immunologicznego ludzi lub zwierząt w odniesieniu do ich wrażliwości na zakażenia gronkowcami oraz zakażenia innymi gatunkami bakterii produkującymi PNAG.

dPNAG może zostać użyta do ochrony osobnika przeciwko zakażeniu bakteriami produkującymi PNAG poprzez indukcję aktywnej odporności na zakażenie gronkowcem u osobnika. Sposób jest realizowany poprzez podawanie osobnikowi ilości skutecznej do indukcji odpowiedzi immunologicznej, takiej jak odpowiedź humoralna przeciwko dPNAG dowolnego gronkowca według wynalazku. „Aktywna odporność w stosowanym tu znaczeniu, oznacza wprowadzenie antygenu do osobnika, w taki sposób, że antygen powoduje różnicowanie niektórych komórek limfoidalnych do komórek produkujących przeciwciała, a w pewnych warunkach różnicowanie innych komórek limfoidalnych w komórki pamięci. Komórki pamięci nie wydzielają przeciwciał, ale włączają przeciwciała do swoich błon celem identyfikacji antygenu, jeśli ponownie poda się go do ciała.

Sposób jest użyteczny do indukcji odporności przeciwko zakażeniu gronkowcami. „Gronkowce, jak niniejszym użyto, oznaczają wszystkie gatunki gronkowców eksprymujące PNAG. Chociaż nie jest to ograniczone żadnym szczególnym mechanizmem, wysoce acetylowane formy PNAG (tj. >50% acetylowanych) nie są w stanie wzbudzać produkcji opsonizujących przeciwciał ochronnych w takim samym stopniu co dPNAG. Bakterie klasyfikowane jako gronkowce są dobrze znane fachowcom i dobrze opisane w literaturze mikrobiologicznej. Gronkowce eksprymujące PNAG obejmują, ale nieograniczająco, Staphylococcus epidermidis (w tym RP62A (numer ATCC 35984), RP12 (numer ATCC 35983), oraz M187), Staphylococcus aureus (w tym RN4220 (pCN27) i MN8 mukoidalny), oraz szczepy takie jak Staphylococcus carnosus transformowany genami locus ica (w tym TM300 (pCN27)). Inne szczepy bakteryjne z ekspresją PNAG mogą z łatwością zostać zidentyfikowane przez fachowców.

Przykładowo, gronkowiec z ekspresją locus ica będzie eksprymował PNAG. Fachowiec może z łatwością poszukać ekspresji mRNA lub białka związanego z locus ica ponieważ znane są sekwencje kwasu nukleinowego locus ica (SEQ ID nr 1 oraz po raz pierwszy opisane w Heihnann, C., 0. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack i F. Gotz (1996) Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Molec. Microbiol. 20:1083.) Szczepy bakteryjne eksprymujące PNAG mogą z łatwością zostać zidentyfikowane przy użyciu mikroskopii immunoelektronowej (lub innego rodzaju immunotestu) przy użyciu przeciwciał anty-PNAG lub przeciwciał anty-dPNAG celem detekcji obecności PNAG na powierzchni bakterii. Dodatkowo, ze szczepów bakteryjnych można wyodrębniać otoczki i analizować je wykorzystując chromatografię cieczową i spektroskopię masową.

„Osobnik, w stosowanym tu znaczeniu oznacza stałocieplnego ssaka i obejmuje, przykładowo, ludzi, naczelnych, konie, krowy, świnie, kozy, owce, psy i koty. W niektórych wykonaniach osobnikiem nie jest gryzoń. Osobnika niebędącego gryzoniem stanowi dowolny osobnik, jak zdefiniowano powyżej, ale nie wykluczając konkretnie gryzoni takich jak myszy, szczury i króliki. W niektórych wykonaniach, korzystnym osobnikiem jest człowiek.

PL 229 487 Β1 dPNAG może być podawana dowolnemu osobnikowi zdolnemu do indukcji odpowiedzi immunologicznej, takiej jak odpowiedź humoralna na antygen. Antygen jest specyficznie dostosowany do indukcji aktywnej immunizacji przeciwko układowemu zakażeniu gronkowcami u osobnika zdolnego do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej oraz zagrożonego ryzykiem rozwoju zakażenia gronkowcami. Osobnik zdolny do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej oraz zagrożony ryzykiem rozwoju zakażenia gronkowcami stanowi ssaka posiadającego układ immunologiczny i zagrożonego ryzykiem ekspozycji na gronkowce w środowisku. Przykładowo, hospitalizowani pacjenci są zagrożeni ryzykiem rozwoju zakażenia gronkowcami w wyniku ekspozycji na bakterie w środowisku szpitalnym. Populacje zagrożone wysokim ryzykiem rozwoju zakażenia S. auerus obejmują, przykładowo, osobników z chorobami nerek na dializie oraz pacjentów poddawanych operacjom o wysokim ryzyku. Populacje zagrożone wysokim ryzykiem rozwoju zakażenia S. epidermidis obejmują, przykładowo, pacjentów z zainstalowanymi urządzeniami medycznymi, takimi jak wejścia dożylne (np. dojścia centralne) lub z protezami (np. protezy biodrowe lub kolana), ponieważ kliniczne izolaty gronkowców wykazują wysoką adherencję do powierzchni plastikowych dzięki zdolności do tworzenia materiału pozakomórkowego (określanego jako biofilm). W niektórych wykonaniach osobnikiem jest osobnik, któremu został wszczepiony implant medyczny, zaś w innych wykonaniach osobnikiem jest osobnik, któremu nie został wszczepiony implant medyczny, ale może go wkrótce otrzymać. Osobnicy o wysokim ryzyku rozwoju zakażenia S. epidermidis przykładowo wcześniaki i pacjenci poddawani chemioterapii.

dPNAG może być podawana osobnikowi w ilości skutecznej do indukcji odpowiedzi humoralnej. „Ilość skuteczna do indukcji odpowiedzi immunologicznej (np. odpowiedzi humoralnej), w stosowanym tu znaczeniu, jest to ilość dPNAG wystarczająca do (i) umożliwienia osobnikowi produkcji własnej ochrony immunologicznej, np. poprzez indukcję produkcji przeciwciał anty-dPNAG (które mogą rozpoznawać zarówno dPNAG, jak i wysoce acetylowane formy PNAG), indukcję produkcji komórek pamięci oraz reakcji limfocytów cytotoksycznych i/lub (ii) profilaktyki zakażenia gronkowcami pojawiającego się u osobnika poddanego ekspozycji na gronkowce.

W niektórych zalecanych wykonaniach skuteczna ilość szczepionki dPNAG stymulująca odpowiedź immunologiczną stanowi ilość szczepionki dPNAG, która wystarcza do wzbudzenia produkcji przeciwciał krzyżowo reagujących z co najmniej dwoma gatunkami gronkowców, np. S. aureus i S. epidermidis.

Fachowcy mogą określić, czy ilość dPNAG wystarcza do indukcji aktywnej odporności przy użyciu rutynowych metod znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, zdolność specyficznego antygenu do indukcji produkcji przeciwciał u ssaka może być oceniana poprzez poszukiwanie przeciwciał u myszy lub innego osobnika wykorzystując dPNAG jako antygen.

Przeciwciała anty-dPNAG według wynalazku są użyteczne do indukcji immunizacji biernej osobnika, zapobiegając rozwojowi zakażenia układowego u osobników zagrożonych ekspozycją na czynniki zakaźne. Sposób indukcji odporności biernej na zakażenie gronkowcem takim jak S. aureus jest osiągany poprzez podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciał anty-dPNAG celem indukcji odpowiedzi immunologicznej na gronkowce tj. powoduje opsonizację gronkowców takich jak S. aureus. „Odporność bierna, w stosowanym tu znaczeniu, oznacza podawanie przeciwciał osobnikowi, przeciwciał wyprodukowanych w innym osobniku (w tym w osobnikach tego samego i innego gatunku), tak, że przeciwciała, które wiążą się z powierzchnią bakterii i powodują fagocytozę bakterii.

Przeciwciało anty-dPNAG może być podawane dowolnemu osobnikowi zagrożonemu ryzykiem rozwoju zakażenia gronkowcami celem indukcji odporności biernej, a w niektórych wykonaniach przeciwciało może być konkretnie dostosowane do osobników niezdolnych do indukcji aktywnej odporności na dPNAG. Ponieważ szczepienie za pomocą dPNAG może nie być skuteczne u osobników z niedoborem immunologicznym, tego rodzaju osobnicy skorzystają z leczenia preparatami przeciwciała przeciwko gronkowcom takim jak Staphylococcus aureus. Osobnik niezdolny do indukcji odpowiedzi immunologicznej stanowi osobnika z niedoborem immunologicznym (np. pacjenta poddawanego chemioterapii, pacjenta z AIDS, itp.) lub osobnika z nierozwiniętym układem immunologicznym (np. wcześniaki).

Przeciwciało anty-dPNAG może być podawane osobnikowi zagrożonemu ryzykiem rozwoju gronkowcami w celu profilaktyki namnażania czynnika zakaźnego w ciele lub w celu zabicia czynnika zakaźnego. Przeciwciało anty-dPNAG może być również podawane osobnikowi, który ma już zakażenie spowodowane gronkowcem w celu profilaktyki namnażania czynnika zakaźnego w ciele lub w celu zabicia czynnika zakaźnego.

PL 229 487 Β1

Przeciwciało anty-dPNAG według wynalazku jest podawane osobnikowi w ilości skutecznej do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko gronkowcom takim jak Staphylococcus aureus. „Ilość skuteczna do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko gronkowcom, w stosowanym tu znaczeniu, jest to ilość przeciwciała anty-dPNAG wystarczająca do (i) profilaktyki zakażenia gronkowcami u osobnika poddanego ekspozycji na gronkowca (ii) zahamowania rozwoju zakażenia, tj. zatrzymania lub zwolnienia rozwoju zakażenia oraz/i (iii) ustąpienia zakażenia, tj. zwalczenia bakterii u zakażonych osobników.

Fachowcy mogą określić, przy użyciu rutynowych procedur, czy ilość przeciwciała anty-dPNAG jest ilością skuteczną do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko gronkowcom w teście opsonizacji in vitro, który określa stopień opsonizacji przeciwciała. Przeciwciało, które opsonizuje bakterię gronkowca, to takie, które po dodaniu do probówki gronkowca powoduje fagocytozę bakterii. Test opsonizacji może przyjmować postać testu kolorymetrycznego, testu chemiluminescencji, testu pobierania fluorescencyjnego lub radioaktywnego, testu bakteriobójczości przy użyciu komórek lub testu mierzącego opsonizujący potencjał danego materiału. Następujący test opsonizacji może zostać użyty do określenia skutecznej ilości przeciwciała anty-dPNAG. Przeciwciało anty-dPNAG inkubuje się z gronkowcem i eukariotyczną komórką fagocytarną i opcjonalnie z białkiem dopełniacza. Zdolność do opsonizacji przez przeciwciało anty-dPNAG określana jest w oparciu o ilość pozostającego gronkowca po inkubacji. Można to osiągnąć poprzez porównanie ilości przeżywających gronkowców pomiędzy dwoma podobnymi testami, w których tylko w jednym występują opsonizujące immunoglobuliny. Redukcja ilości gronkowców w porównaniu do inkubacji z kontrolną, niespecyficzną immunoglobuliną, wskazuje na opsonizację.

Sposoby tu opisane są użyteczne w indukcji immunizacji biernej na gronkowce u osobnika poprzez podawanie osobnikowi ilości skutecznej do indukcji opsonizacji gronkowców za pomocą przeciwciała anty-dPNAGczysty. Przeciwciało anty-dPNAGczysty jest tu stosowane jako przeciwciało swoiście oddziałujące z czystym antygenem dPNAG według wynalazku i indukujące opsonizację koagulazo-ujemnych lub koagulazo-dodatnich gronkowców, jednak nie oddziałujące z zanieczyszczonym preparatem dPNAG. Jak powyżej opisano, zanieczyszczone preparaty dPNAG mogą być zanieczyszczone kwasem tejchojowym lub innymi zanieczyszczeniami, które mogą wpływać na immunogenność antygenu. Fachowiec może z łatwością zidentyfikować czy przeciwciało anty-dPNAG jest przeciwciałem antydPNAGczysty stosując rutynowe testy wiązania. Przykładowo, przeciwciało anty-dPNAG może być immobilizowane na powierzchni, a następnie doprowadzone do kontaktu z wyznakowanym zanieczyszczonym preparatem dPANG lub wyznakowanym oczyszczonym preparatem dPNAG. Ilość preparatu dPNAG (preparatu czystego w stosunku do zanieczyszczonego), która oddziałuje z przeciwciałem lub ilość, która nie wiąże się z przeciwciałem może zostać następnie zmierzona w celu określenia czy przeciwciało wiąże się do zanieczyszczonego preparatu dPNAG. W ważnych wykonaniach przeciwciało anty-dPNAGczysty jest skuteczne w stosunku do koagulazo-ujemnego lub koagulazo-dodatniego gronkowca lub wobec dowolnego odpowiedniego organizmu bakteryjnego z ekspresją dPNAG lub wysoce acetylowanej PNAG na jego powierzchni.

Antygen dPNAG może zostać wytworzony w postaci szczepionki. Odpowiednie podłoże nośnika do wytworzenia szczepionki obejmuje sól fizjologiczną buforowaną fosforanem sodu (pH 7,4) lub 0,125 M fosforan glinu zawieszony w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu w pH 6 oraz inne zwyczajowe podłoża. Ogólnie, szczepionki zawierają od około 5 do około 100 pg, a w szczególności około 10-50 pg antygenu celem wzbudzenia skutecznych poziomów przeciwciał u ssaków stałocieplnych. W przypadku podawania jako szczepionka, dPNAG może opcjonalnie zawierać adiuwant.

Termin „adiuwant ma obejmować każdą substancję, która jest włączona lub jednocześnie podawana z dPNAG, która to substancja wzmacnia odpowiedź immunologiczną osobnika. Adiuwanty obejmują, ale nieograniczająco, związki glinu, np. żele, wodorotlenku glinu i fosforan glinu oraz kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda (np. w którym antygen dPNAG jest włączony w fazie wodnej stabilizowanej wody w emulsji oleju parafinowego). Olej parafinowy może zostać zastąpiony różnymi typami olejów, np. olejem skwalenowym lub olejem z orzeszków ziemnych. Inne materiały o właściwościach adiuwantów obejmują BCG (atenuowany Mycobacterium tuberculosis), fosforan wapnia, lewamizol, izoprinozin, polianiony (np. poli A:LJ), lentinan, toksynę ksztuśca, lipid A, saponiny, OS-21 i peptydy, np. dipeptyd muramylowy. Jako adiuwanty mogą być również stosowane sole ziem rzadkich, np. lantanu i ceru. Ilość adiuwantów zależy od osobnika i konkretnego użytego antygenu dPNAG (np. poziomu podstawień octanem) i może być łatwo określona przez fachowca bez niepotrzebnych doświadczeń.

PL 229 487 Β1

Ogólnie, przy podawaniu w celach terapeutycznych, kompozycje według wynalazku są podawane w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów. Tego rodzaju kompozycje mogą rutynowo zawierać farmaceutycznie dopuszczalne stężenia soli, czynników buforujących, konserwantów, kompatybilnych nośników, adiuwantów oraz opcjonalnie innych składników terapeutycznych.

Kompozycje według wynalazku mogą być podawane jako takie lub w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. W przypadku stosowania w medycynie, sole powinny być farmaceutycznie dopuszczalne, jednak sole niedopuszczalne farmaceutycznie mogą zostać odpowiednio przygotowane do farmaceutycznie dopuszczalnej soli i nie są wyłączone z zakresu tego wynalazku. Tego rodzaju farmakologicznie i farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują, ale nie są ograniczone do soli następujących kwasów: solnego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, p-tolueno-sulfonowego, winowego, cytrynowego, metanosulfonowego, mrówkowego, malonowego, bursztynowego, naftaleno-2-sulfonowego oraz benzenosultonowego. Ponadto, farmaceutycznie dopuszczalne sole mogą być przygotowane jako sole metali alkalicznych lub sole ziem alkalicznych takich jak sole sodu, potasu lub wapnia dla grup kwasu karboksylowego.

Odpowiednie czynniki buforujące obejmują: kwas octowy i sól (1-2% wagowo/objętościowo), kwas cytrynowy i sól (1-3% wagowo/objętościowo), kwas borowy i sól (0,5-2,5% wagowo/objętościowo) oraz kwas fosforowy i sól (0,8-2% wagowo/objętościowo). Odpowiednie konserwanty obejmują chlorek benzalkoniowy (0,003-0,03% wagowo/objętościowo), chlorobutanol (0,3-0,9% wagowo/objętościowo); parabeny (0,01-0,25% wagowo/objętościowo) oraz trimerosal (0,004-0,02% wagowo/objętościowo).

Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznych do użytku medycznego zawierających dPNAG wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników oraz z opcjonalnie innymi składnikami terapeutycznymi. Termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, w tu stosowanym i poniżej opisanym znaczeniu, oznacza jeden lub więcej wypełniaczy stałych lub ciekłych, rozcieńczalników lub substancji zamykających, które są odpowiednie do podawania człowiekowi lub innemu zwierzęciu. W niniejszym wynalazku, termin „nośnik oznacza składnik organiczny i nieorganiczny, naturalny lub syntetyczny, który jest połączony wraz ze składnikiem czynnym w celu ułatwienia podawania. Składniki kompozycji farmaceutycznych mogą być łączone z dPNAG lub z innymi składnikami, w taki sposób, że nie dochodzi do interakcji, która mogłaby w zasadniczy sposób wpływać na pożądaną wydajność farmaceutyczną.

Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego obejmują dogodnie sterylny wodny preparat polisacharydu, który może być izotoniczny z krwią biorcy. Spośród dopuszczalnych nośników i rozpuszczalników należy wymienić wodę, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo, sterylne, zestalone oleje są zwyczajowo stosowane jako rozpuszczalnik lub podłoże do zawieszania. W tym celu, zastosowany może zostać dowolny łagodny olej zestalony w tym syntetyczne monoi di-glicerydy. Ponadto w przygotowaniu preparatów do wstrzykiwać znajdują zastosowanie kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy. Preparaty nośników odpowiednie do podawania podskórnego, domięśniowego, dootrzewnowego, dożylnego, itp. można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Kompozycje według wynalazku są podawane w ilościach skutecznych. Jak omówiono powyżej, ilość skuteczna stanowi ilość dPNAG lub przeciwciała anty-dPNAG, która pojedynczo lub razem z innymi dawkami indukuje odpowiednio odporność aktywną lub opsonizację zakażonych bakterii. Uważa się, że skuteczne będą dawki w zakresie od 1 nanograma/kilogram do 100 miligram/kilogram, w zależności od sposobu podania. Uważa się, że dogodny zakres znajduje się pomiędzy 500 nanogramami a 500 mikrogramami/kilogram, a najdogodniej pomiędzy 1 mikrogramem a 100 mg/ml. Bezwzględna ilość będzie zależeć od szeregu czynników w tym od tego czy podawana jest osobnikowi z wysokim ryzykiem, ale jeszcze niezakażonemu czy też osobnikowi już zakażonemu, jednoczesnego leczenia, liczby dawek oraz parametrów indywidualnych pacjenta, takich jak wiek, stan fizyczny, wzrost i masa. Są to czynniki dobrze znane fachowcom i poddawane rutynowym doświadczeniom. Ogólnie zalecane jest stosowanie dawki maksymalnej, to jest najwyższej bezpiecznej dawki, zgodnie z oceną medyczną.

Rozważane są również wielokrotne dawki kompozycji farmaceutycznych według wynalazku. Ogólnie schematy immunizacyjne obejmują podawanie wysokiej dawki antygenu, a następnie niskich dawek antygenu po odczekaniu kilku tygodni. Dalsze dawki mogą być również podawane. Schemat dawkowania przy immunizacji biernej jest inny i wymaga częstszego podawania. Zastosowany może zostać każdy schemat prowadzący do zwiększonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenia bakte

PL 229 487 Β1 ryjne i/lub do uzyskania ochrony przed zakażeniem. Wymagane odstępy czasu przy dostarczaniu dawek wielokrotnych dla danej dPNAG mogą być określane przez fachowca wykorzystującego wyłącznie rutynowe doświadczenia.

Dostępnych jest szereg dróg podawania. Konkretnie wybrana droga będzie zależała, oczywiście, od wybranej dPNAG, konkretnego leczonego stanu, oraz wymaganej dawki dla skuteczności terapeutycznej. Sposoby tu opisane, ogólnie rzecz biorąc, mogą być realizowane przy użyciu dowolnej medycznie dopuszczalnej drogi podawania, to znaczy dowolnego sposobu, który daje skuteczne poziomy odpowiedzi immunologicznej bez wywoływania klinicznie niedopuszczalnych skutków ubocznych. Zalecane drogi podawania stanowią drogi pozajelitowe. Termin „pozajelitowy obejmuje wstrzyknięcie podskórne, dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe i domostkowe lub techniki wlewu. Inne drogi obejmują, ale nie są ograniczone do podawania doustnego, donosowego, doskórnego, podjęzykowego lub lokalnego.

Kompozycje mogą być zwyczajowo podawane w postaci dawkowania jednostkowego i mogą być przygotowane dowolnym ze sposobów z dziedziny farmacji. Wszystkie sposoby obejmują etap połączenia dPNAG lub czynnika wiążącego dPNAG z nośnikiem, stanowiącym jeden lub więcej składników pomocniczych. Ogólnie, kompozycje są przygotowywane poprzez połączenie polimeru z ciekłym nośnikiem, dokładnie rozdrobnionym stałym nośnikiem lub obydwoma, a w dalszej kolejności formowane do postaci produktu. Polimer może być przechowywany w postaci liofilizowanej.

Inne systemy dostarczania obejmują czasowe, opóźnione lub stałe systemy dostarczania. Tego rodzaju systemy mogą pozwalać na uniknięcie powtarzanego podawania polisacharydów według wynalazku, zwiększając wygodę osobnika i lekarza. Dostępnych jest wiele systemów dostarczania znanych fachowcom. Obejmują one systemy oparte na polimerach takie jak kwas polimlekowy i poliglikolowy, polibezwodniki i polikaprolaktony; systemy niepolimerowe, takie jak lipidy, w tym sterole takie jak cholesterol, estry cholesterolu i kwasy tłuszczowe lub tłuszcze obojętne takie jak mono-, dii triglicerydy; hydrożelowe systemy uwalniania, systemy silikonowe, systemy oparte na peptydach, pokrycia woskowe, twarde tabletki wykorzystujące konwencjonalne wypełniacze i zarobki oraz częściowo podlegające fuzji implanty i tym podobne. Specyficzne przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do: (a) systemów erozyjnych, w których polisacharyd jest zawarty w postaci macierzy, jak w patentach LJ.S.A. nr 4452775 (Kent); 4667014 (Nestor i wsp.); oraz 4748034 i 5239660 (Leonard) i (b) systemów dyfuzyjnych, w których składnik czynny przenika w sposób kontrolowany przez polimer jak w patentach LJ.S.A. nr 3 832 253 (Higuchi i wsp.) i 3854480 (Zaffaroni). Dodatkowo, zastosowany może zostać system dostarczania oparty na pompie, niektóre z systemów są zaadaptowane do implantacji.

Fachowcy zauważą, że antygeny PNAG według niniejszego wynalazku mogą same w sobie posiadać właściwości adiuwantów. W stopniu, w jakim niniejszym opisane polisacharydy wzmacniają odpowiedzi immunologiczne u ludzi, mogą one być stosowane jako adiuwanty w połączeniu z innymi materiałami.

Zgodnie z wynalazkiem antygeny dPNAG oraz przeciwciała anty-dPNAG mogą być dostarczane w połączeniu z innym lekiem przeciwbakteryjnym (tj. bakteriobójczym) lub w postaci koktajli przeciwbakteryjnych lub wraz z innymi antygenami bakteryjnymi lub przeciwciałami przeciwbakteryjnymi.

Przeciwbakteryjny koktajl antybiotyków stanowi mieszaninę dowolnych kompozycji według wynalazku z lekiem przeciwbakteryjnym. Zastosowanie antybiotyków w leczeniu zakażenia bakteryjnego jest rutynowe. Zastosowanie antygenów do indukcji immunizacji aktywnej oraz użycie przeciwciał do indukcji immunizacji biernej jest również rutynowe. W tym wykonaniu, zazwyczaj nośnik do podawania (np. tabletka, implant, roztwór do wstrzykiwać, itp.) mogą jednocześnie zawierać dogodną kompozycję według niniejszego wynalazku oraz antybiotyk przeciwbakteryjny i/lub antygen lub przeciwciało. Opcjonalnie, przeciwbakteryjny lek i/lub antygen lub przeciwciało mogą być podawane oddzielnie. Czynnik przeciwbakteryjny (np. antybiotyk) może być również sprzęgany z dPNAG lub z przeciwciałem anty-dPNAG.

Przeciwbakteryjne leki antybiotykowe są dobrze znane i obejmują: penicylinę G, penicylinę G, ampicylinę, amoksycyklinę, bakampicylinę, cyklacyklinę, dikloksacylinę, epicylinę, hetacylinę, piwampicylinę, metycylinę, nafcylinę, oksacylinę, kloksacylinę, dikloksacylinę, flukloksacylinę, karbenicylinę, tikarcylinę, awlocylinę, mezlocyklinę, piperacylinę, amdinocylinę, cefaleksynę, cefradynę, cefadoksyl, cefaklor, cefazolinę, aksetyl cefuroksymu, cefamandol, cefonycyd, cefoksytynę, cefotaksym, ceftyzoksym, cefmenoksym, ceftriakson, moksalaktam, cefotetan, cefoperazon, ceftazydym, imipenem, kwas klawulanowy, timentynę, sulbaktam, neomycynę, erytromycynę, metronidazol, chloramfenikol, klinda

PL 229 487 Β1 mycynę, linkomycynę, wankomycynę, trimetoprim-sulfametoksazol, aminoglikozydy, chinolony, tetracykliny i rifampicynę (patrz Goodman i Gilman’s, Pharmacological Basics of Therapeutics, wyd. 8, 1993, McGraw Hill Inc.)

Inne polisacharydowe antygeny i przeciwciała są dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowo, następujące polisacharydowe antygeny i/lub przeciwciała mogą być podawane w połączeniu z antygenem dPNAG i/lub przeciwciałem: antygen Vi otoczki Salmonella typhi(Szu, S.C.. X. Li, A.L. Stone i J.B. Robbins, Relation between structure and immunologie properties of the Vi capsular polysaccharide. Infection and Immunity. 59:4555-4561 (1991)), K5 otoczki E. coli (Vann, W. , M.A. Schmidt, B. Jann and K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin, European Journal of Biochemistry. 116: 359-364, (1981)), typ 5 otoczki Staphylococcus aureus (Fournier, J.-M., K. Hannon, M. Moreau, W .W. Karakawa i W.F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (Paris). 138:561-567, (1987)), egzopolisacharyd II Rhizobium melilori (Glazebrook, J. i G.C. Walker, a novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. Celi. 65:661-672(1989)), typ III Streptococcus typ B (Wessels, M.R., V. Pozsgay, D.L. Kasper i H. J. Jennings, Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry, 262:8262-8267 (1987)), Pseudomonas aeruginosa O-specyficzny łańcuch boczny Fisher 7 (Knirel, Y.A., N.A. Paramonov, E.V. Vinogradov, A.S. Shashkow, B.A. N.K. Kochetkov, E.S. Stanislavsky i E.V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharides of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 and 7, European Journal of Biochemistry. 167:549, (1987)), O-specyficzny łańcuch boczny Shigella sonnei (Kenne, L., B. Lindberg i K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research. 78:119-126, (1980)), otoczki typu I S. pneumoniae (Lindberg, B., Lindqvist, B., Lonngren,J., Powell, D.A., Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 1, Carbohydrate Research. 78:111-117 (1980)) oraz antygen grupowy Streptococcus pneumoniae (Jennings, HJ., C. Ługowski i N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from Streptococcus pneumoniae type I, Biochemistry. 19:4712-4719(1980)).

Inne nie-polipeptydowe antygeny i przeciwciała są dobrze znane fachowcom i mogą być wykorzystywane w połączeniu z kompozycjami dPNAG według wynalazku.

Antygeny dPNAG oraz przeciwciała są również użyteczne do określania statusu immunologicznego osobnika lub próbki, bądź mogą być wykorzystywane jako odczynniki w testach immunologicznych. Przykładowo, przeciwciała mogą być wykorzystywane do wykrywania w próbce obecności bakterii mających PNAG na powierzchni. Jeśli bakteria jest obecna w próbce, wówczas można zastosować przeciwciała do leczenia zakażonego osobnika. Przeciwciała mogą być również wykorzystywane do badania bakterii pod kątem obecności antygenu PNAG oraz do wyodrębniania dPNAG lub antygenu PNAG oraz bakterii zawierających dPNAG lub antygen PNAG ze złożonych mieszanin.

Powyżej opisane testy i inne znane w tej dziedzinie testy mogą zostać przeprowadzone poprzez wyznakowanie dPNAG lub przeciwciał i/lub immobilizację dPNAG lub przeciwciał na nierozpuszczalnej macierzy. Metody analityczne lub diagnostyczne wykorzystujące dPNAG i/lub ich przeciwciała wykorzystują co najmniej jeden z następujących odczynników: wyznakowany analog analizowanej substancji, immobilizowany analog analizowanej substancji, wyznakowany czynnik wiążący, immobilizowany czynnik wiążący oraz koniugaty sferyczne. Zastosowany znacznik może posiadać dowolną wykrywalną grupę funkcyjną, która nie wpływa na wiązanie substancji analizowanej oraz jego czynnika wiążącego. Znanych jest szereg znaczników stosowanych w testach immunologicznych. Przykładowo, związki mogą być wykrywane bezpośrednio, tak jak fluorochromy, znaczniki chemiluminescencyjne lub radioaktywne, jak i pośrednio, poprzez reakcję lub powstanie pochodnej, takiej jak reakcja enzymatyczna. Przykłady znaczników obejmują radioizotopy ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ³H oraz ¹³¹1, fluorochromy takie jak chelaty ziem rzadkich lubfluoresceina i ich pochodne, rodamina i jej pochodne, dansyl, umbelliferon, lucyferaza taka jak lucyferaza robaczka świętojańskiego i lucyferaza bakteryjna (patent LJ.S.A nr 4737456), lucyferyna, 2,3-dihydroftalawinediony, peroksydaza chrzanowa (HRP), fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza, glukoamylaza, lizozym, oksydazy sacharydów takie jak oksydaza glukozy, oksydaza galaktozy oraz dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu. Oksydazy heterocykliczne takie jak urykaza i oksydaza ksantyny sprzężone z enzymem wykorzystują nadtlenek wodoru do utleniania prekursorów barwników, tak

PL 229 487 Β1 jak HRP, laktoperoksydaza lub mikroperoksydaza, biotynoawidyna, znaczniki spinowe, znaczniki bakteriofagowe i stabilne wolne rodniki.

Znaczniki mogą być sprzęgane z dPNAG lub przeciwciałem anty-dPANG za pomocą sposobów znanych fachowcom. Przykładowo, patenty U.S.A. nr 3940475 oraz 3645090 pokazują sprzęganie fluoroforumów i enzymów z przeciwciałami. Inne testy, które według doniesień powszechnie wykorzystują przeciwciało i antygen oraz które mogą być stosowane według wynalazku, obejmują testy kompetycyjne i kanapkowe.

Opisano tu również sposób wytwarzania antygenu dPNAG poprzez wytwarzanie komórki gospodarza z ekspresją PNAG, wprowadzając locus ica do komórki, wyodrębniając antygen PNAG z tego rodzaju komórki oraz deacetylując antygen w celu otrzymania dPNAG. Komórka gospodarza PNAG może zostać wytworzona poprzez transfekcję, transdukcję lub transformację komórki kwasem nukleinowym kodującym gen ica (SEQ ID nr 1). Komórkę może stanowić komórka eukariotyczna lub prokariotyczna, ale dogodnie stanowi ją komórka bakteryjna. Komórką może być gronkowiec, który naturalnie nie eksprymuje PNAG.

Kwas nukleinowy ica w jednym wykonaniu, jest operacyjnie połączony z sekwencją ekspresji genu, która kieruje ekspresją kwasu nukleinowego ica w komórce eukariotycznej lub prokariotycznej. „Sekwencja ekspresji genu stanowi dowolną regulatorową sekwencję nukleotydową, taką jak sekwencja promotora lub połączenie promotor-wzmacniacz, która ułatwia wydajną transkrypcję i translację kwasu nukleinowego ica, z którym jest operacyjnie połączona. Sekwencja ekspresji genu może, przykładowo, stanowić promotor ssaczy lub wirusowy, taki jak konstytutywny lub indukowalny promotor. Konstytutywne promotory ssacze obejmują, ale nie są ograniczone do promotorów następujących genów: transferazy fosforybozylohipoksantyny (HPRT), deaminazy adenozyny, kinazy pirogronianowej oraz β-aktyny. Przykłady promotorów wirusowych konstytutywnie działających w komórkach obejmują, przykładowo, promotory wirusów szympansich, wirusa brodawczaka, adenowirusa, ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) lub wirusów mięsaka Rousa, wirusa białaczki Moloneya, cytomegalowirusa, długie powtórzenia końcowe (LTR)oraz innych retrowirusóworaz promotor kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki pospolitej. Fachowcom znane są inne promotory konstytutywne. Promotory zalecane tu jako sekwencje ekspresji genów obejmują również promotory indukowalne. Indukowalne promotory są eksprymowane w postaci czynnika indukcyjnego. Przykładowo, promotor metalotioneiny jest indukowany do kierowania transkrypcją i translacją w obecności niektórych jonów metali. Fachowcom znane są inne indukowalne promotory.

Ogólnie, sekwencja ekspresji genów będzie obejmować sekwencje 5' nieulegające transkrypcji i 5' nieulegające translacji biorące udział w inicjacji, odpowiednio, transkrypcji i translacji. Tego rodzaju sekwencje 5' nieulegające transkrypcji obejmują region promotora z sekwencją promotora służącą do kontroli transkrypcyjnej operacyjnie połączonego kwasu nukleinowego ica. Sekwencje ekspresji genów opcjonalnie obejmują sekwencje wzmacniacza lub sekwencje aktywatora „w górę, w razie potrzeby.

Uważa się, że sekwencja kwasu nukleinowego ica oraz sekwencja ekspresji genów są „operacyjnie połączone, jeśli są połączone kowalencyjnie w taki sposób, że transkrypcja i/lub translacja sekwencji kodującej ica znajduje się pod wpływem lub kontrolą sekwencji ekspresji genów. Jeżeli sekwencja ica ma ulegać translacji do białka funkcjonalnego, dwie sekwencje DNA uważa się, że są operacyjne połączone jeśli indukcja promotora na 5' końcu sekwencji ekspresji genu prowadzi do transkrypcji sekwencji ica, oraz jeśli charakter połączenia pomiędzy dwiema sekwencjami DNA (1) nie prowadzi do wprowadzenia mutacji w zmianie ramki odczytu, (2) nie interferuje ze zdolnością regionu promotora do kierowania transkrypcją sekwencji ica oraz (3) nie interferuje ze zdolnością odpowiadającego transkryptu RNA, który ma ulec translacji na białko. Tym samym, sekwencja ekspresji genów będzie operacyjnie połączona z sekwencją kwasu nukleinowego ica, jeśli sekwencja ekspresji genów może wpływać na transkrypcję sekwencji kwasu nukleinowego ica w taki sposób, że powstający transkrypt może ulegać translacji do pożądanego białka lub polipeptydu.

Kwas nukleinowy ica może być dostarczany do komórki gospodarza sam lub w połączeniu z wektorem. W najszerszym sensie „wektor jest dowolnym nośnikiem zdolnym do ułatwiania: (1) dostarczania cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej geny w locus ica, kodujące białka biorące udział w syntezie PNAG lub (2) pobierania cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej geny lokus ica kodujące białka biorące udział w syntezie PNAG przez komórkę docelową. Korzystnie, wektory transportują cząsteczkę ica do komórki docelowej ze zredukowaną degradacją w odniesieniu do stopnia degradacji wynikającej z braku wektora. Ogólnie, wektory użyteczne w wynalazku są podzielone na dwie klasy: wektory biologiczne oraz wektory chemiczne/fizyczne. Wektory biologiczne są użyteczne do

PL 229 487 Β1 dostarczania/pobierania kwasów nukleinowych ica do/przez komórkę docelową. Wektory chemiczne/fizyczne są użyteczne do dostarczania/pobierania kwasów nukleinowych ica lub polipeptydów ica do komórek docelowych.

Wektory biologiczne, obejmują, ale nieograniczająco, plazmidy, fagmidy, wirusy, inne nośniki otrzymane ze źródeł wirusowych lub bakteryjnych, które zmieniono w taki sposób, aby wstawić lub włączyć sekwencje kwasu nukleinowego tu opisane oraz fragmenty wolnych kwasów nukleinowych, które można przyczepić do sekwencji kwasu nukleinowego tu opisanych. Wektory wirusowe są zalecanym typem wektora biologicznego i obejmują, ale nieograniczająco, sekwencje kwasów nukleinowych z następujących wirusów: retrowirusów, takich jak wirus białaczki Moloneya myszowatych, wirus mięsaka Harveya myszowatych, wirus nowotworu gruczołu mlekowego myszowatych, wirus mięsaka Rousa, adenowirus, wirus związany z adenowirusami, wirusy typu SV40, wirusy polioma, wirusy Epstein-Barr'a, wirusy brodawczaka, wirusy opryszczki, wirusy krowianki, poliowirusy oraz wirusy RNA, takie jak retrowirusy. Można z łatwością użyć innych wektorów, niewymienionych, ale znanych w tej dziedzinie.

Zalecane są wektory wirusowe oparte na niecytopatycznych wirusach eukariotycznych, w których niezasadnicze geny zostały zastąpione pożądanym genem. Wirusy niecytopatyczne obejmują retrowirusy, których cykl życiowy wymaga odwrotnej transkrypcji genomu wirusowego RNA na DNA z integracją prowirusa do DNA komórki gospodarza. Ogólnie, retrowirusy są niezdolne do replikacji (tj. zdolne do kierowania syntezą pożądanych białek, ale niezdolne do wytwarzania cząstek zakaźnych). Standardowe protokoły do produkcji retrowirusów niezdolnych do replikacji (w tym etapy włączania egzogennego materiału genetycznego do plazmidu, transfekcji pakującej linii komórkowej za pomocą plazmidu, wytwarzania rekombinacyjnych retrowirusów przez pakującą linię komórkową, zbierania cząstek wirusa z pożywki hodowlanej oraz zakażanie komórek docelowych za pomocą cząstek wirusa) są opisane w Kriegler, M. , Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manuał, W.H. Freeman Co., Nowy Jork (1990) oraz Murry, E.J. Ed. Methods in Molecular Biology, tom 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991).

Kolejnym wirusem zalecanym do niektórych zastosowań jest wirus związany z adenowirusem, wirus z dwuniciowym DNA. Wirus związany z adenowirusem może zostać wytworzony tak, aby był niezdolny do replikacji, natomiast był zdolny do zakażania szeregu rodzaju komórek i gatunków. Ma on inne zalety, takie jak stabilność cieplna i stabilność w rozpuszczalniku lipidowym, wysoka częstotliwość transdukcji w komórkach różnych linii, brak zahamowania superinfekcji pozwalający na wielokrotne serie transdukcji. Odpowiednio, wirus związany z adenowirusem może integrować do ludzkiego komórkowego DNA w sposób specyficzny, minimalizując tym samym możliwość mutagenezy insercyjnej oraz zmienności ekspresji wstawionego genu. Dodatkowo, zakażenia wirusem związanym z adenowirusem typu dzikiego były śledzone w hodowli tkankowej przez co najmniej 100 pasaży w nieobecności presji selekcyjnej, co wskazuje na relatywnie stabilną integrację do genomu wirusa związanego z adenowirusem. Wirus związany z adenowirusem może również funkcjonować w postaci pozachromosomowej.

W celu dostarczania cząsteczki ica do komórki docelowej, zastosowane mogą zostać, oprócz wektorów biologicznych, wektory fizyczne/chemiczne. W stosowanym tu znaczeniu, „wektor chemiczny/fizyczny odnosi się do naturalnej lub syntetycznej cząsteczki, innej niż ta otrzymana ze źródeł bakteryjnych lub wirusowych, zdolnej do dostarczania cząsteczki ica do komórki. Zalecanym wektorem fizycznym/chemicznym tu opisanym jest system koloidalnej dyspersji. Systemy koloidalnej dyspersji obejmują systemy oparte na lipidach, w tym emulsji olej w wodzie, micelach, mieszanych micelach oraz liposomach. Zalecany system koloidalny tu opisany stanowi liposom. Liposomy są sztucznymi pęcherzykami błonowymi zalecanymi jako wektory do dostarczania in vitro lub in vivo. Wykazano, że duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV), których wielkość mieści się od 0,2 do 4,0 μm mogą zawierać duże makrocząsteczki. RNA, DNA oraz nienaruszone wiriony mogą zawierać się w wodnym wnętrzu i dostarczane do komórek w formie biologicznie aktywnej (Fraley, i wsp. Trends Biochem. Sci., (1981) 6:77). Aby liposom był efektywnym wektorem do transferu genów, musi posiadać jedną lub więcej z następujących cech: (1) musi zawierać pożądany gen z wysoką wydajnością utrzymywania aktywności biologicznej, (2) musi dostarczać wodne zawartości pęcherzyka do cytoplazmy komórek docelowych z wysoką wydajnością oraz (3) musi zapewniać dokładną i efektywną ekspresję informacji genetycznej. Liposomy są dostępne komercyjnie w Gibco BRL, przykładowo LIPOFECTIN™ i LIPOFECTACE™, które są wytwarzane z lipidów kationowych, takich jak chlorek N-[1-(2,3-dioleiloksy)-propylo]-N,N,N-trimety

PL 229 487 Β1 loamonu (DOTMA) oraz bromek dioktadecyloamonu dimetylu (DDAB). Sposoby wytwarzania liposomów są znane w tej dziedzinie i zostały opisane wielu publikacjach. Liposomy przeglądowo opisano w Gregoriadis, G. w Trends in Biotechnology, (1985) 3:235241.

Czynnik pakujący może być stosowany pojedynczo lub w połączeniu z wektorem biologicznym lub chemicznym/fizycznym. „Czynnik pakujący, w stosowanym tu znaczeniu, odnosi się do czynnika, takiego jak histon, który neutralizuje negatywne ładunki kwasu nukleinowego, tym samym pozwalając na upakowanie kwasu nukleinowego do niewielkiej przestrzeni. Upakowanie kwasu nukleinowego ułatwia pobranie kwasu nukleinowego przez komórkę docelową. Czynniki pakujące mogą być wykorzystywane same, tj. do dostarczania cząsteczki ica w postaci wydajnie pobieranej przez komórkę, lub dogodniej w połączeniu z jednym lub więcej z powyżej opisanych wektorów.

Inne przykładowe kompozycje, które mogą być stosowane do ułatwienia pobierania przez komórkę docelową kwasów nukleinowych ica obejmują fosforan wapnia i inne chemiczne mediatory transportu wewnątrzkomórkowego, kompozycje do mikroiniekcji, elektroporację i rekombinację homologiczną (np. integracja kwasu nukleinowego ica do wcześniej wybranego miejsca w obrębie chromosomu docelowej komórki).

Następujące przykłady stanowią ilustrację wynalazku.

Przykłady

Przykład 1: Oczyszczanie dPNAG

Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że dPNAG może być wytwarzana z dowolnego szczepu bakteryjnego z ekspresją locus ica. Specyficznie, obejmują one Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, oraz inne szczepy gronkowców takie jak Staphylococcus camosus transformowane genami w locus ica. Zgodnie z wynalazkiem można wykorzystać następujące konkretne szczepy do oczyszczania PNAG: S. epidermidis RP62A (numer ATCC 35984), S. epidermidis RP12 (numer ATCC 35983), Staphylococcus epidermidis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27) oraz S. aureus MN8 mukoidalny.

Podany tu następnie sposób może być stosowany do produkcji dPNAG z gronkowca zawierającego locus ica.

Materiał wyjściowy przygotowuje się z hodowli gronkowców z ekspresją genów ica poprzez hodowlę bakterii w następujący sposób: polisacharyd przygotowuje się z 16 litrów hodowli bakteryjnej pożywki wzrostowej. Dogodną pożywką jest chemicznie zdefiniowana pożywka (CDM) oparta na RPMI1640 AUTO-MOD, zmodyfikowana tak, aby możliwa była sterylizacja przez autoklawowanie (Sigma Chemical Co., St, Mo.). CDM jest uzupełniona dodatkowymi aminokwasami, witaminami oraz nukleotydami w celu dopasowania ich stężenia do tych w innych CDM (Hussain, M., J.G.M. Hastings, i P.J. White, 1991). Chemicznie zdefiniowana pożywka do produkcji otoczki przez koagulazo-ujemne gronkowce. J. Med. Microbiol. 34:143-147. Pożywka jest również uzupełniana sacharozą i glukozą do końcowego stężenia wynoszącego 1%.

Hodowle ciekłe inokuluje się pojedynczą kolonią szczepu bakterii produkujących polisacharyd. Wykorzystywać można zalecany szczep oznaczony Staphyloccocus aureus MN8m z konstytutywną nadprodukcją polisacharydu. Pojedynczą kolonię pobiera się z płytki z agarem tryptofanowo-sojowym lub z płytki z podobną bakteryjną pożywką wzrostową i hoduje w 37°C. Dopuszczalne są również temperatury 10-42°C. Hodowle ciekłe inkubuje się w 37°C przez 1-96 godzin podczas ciągłego mieszania i napowietrzania tlenem przy szybkości 2 litry/min. pH utrzymuje się przy 7,0 przez cały okres hodowli przez dodawanie 10 N NaOH i miareczkowanie pH. Pod koniec okresu hodowli, komórki bakteryjne osadza się przy 9000 g przez 30 minut, zaś supernatant zatęża do 500 ml za pomocą filtracji z przepływem stycznym (punkt odcięcia błony 10000-500000 masy cząsteczkowej). W celu precypitacji nieoczyszczonego preparatu polisacharydu dodaje się dwie objętości etanolu. Precypitat odzyskuje się poprzez wirowanie, ponowne zawieszanie w wodzie i całonocną dializę wobec wody destylowanej. Antygen jest nierozpuszczalny. Nieropuszczalny, nieoczyszczony antygen zawiesza się w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 0,1 M fosforan, 0,15 M chlorek sodu) w celu strawienia lizozymem (0,5 mg) oraz lizostafiną (0,5 mg) przez 0,5 do 16 godz. w 37°C. Zawiesiny antygenu w dalszej kolejności poddaje się działaniu nukleaz (0,5 mg) w 37°C przez 0,5 do 16 godz., a następnie inkubacji przez 0,5 do 16 godz. za pomocą proteinazy K (5 mg) w 37-56°C. Po dializie i liofilizacji, wysuszone ekstrakty rozpuszcza się w 5 M HCI a pH doprowadza do 2 za pomocą 4 N NaOH. 20 ml porcje tego roztworu nakłada się na kolumnę 5 x 88 cm, upakowaną Sephacryl S-300 (Pharmacia, Piscataway, NJ) przy użyciu buforu 0,1 N HCI/0,15 M NaCI z wyeluowanym polisacharydem zidentyfikowanym za pomocą absorpcji optycznej przy 206 nm. Frakcje odpowiadające polisacharydowi stanowiącemu ciągły

PL 229 487 Β1 zakres wielkości % cząsteczkowych zbiera się oddzielnie, dializuje wobec wody i liofilizuje. Opcjonalnie, frakcjonowanie na podstawie wielkości można wykonywać przy użyciu wielu alternatywnych procedur znanych w tej dziedzinie, na przykład przy użyciu błon do diafiltracji.

Poziom acetylacji można dostosować poprzez chemiczne traktowanie natywnego polisacharydu. Polisacharyd zawierający >50% octanu wyodrębnia się i deacetyluje w celu osiągnięcia pożądanego poziomu acetylacji. Reakcję wykonuje się w roztworze zasadowym usuwającym grupy acetylowe związane z grupą aminową z glukozaminy. Dogodnym środkiem jest inkubacja w 37°C przez 2-20 godzin w 1,0 M NaOH. Równie efektywne są słabsze roztwory lub dłuższe czasy inkubacji lub wyższe temperatury, bądź silniejsze roztwory z krótszymi czasami inkubacji i niższymi temperaturami. Ogólnie, każde działanie zwiększające pH powyżej 10 może być skuteczne w odpowiedniej temperaturze. Istnieją również enzymatyczne środki deacetylacji antygenu. Obejmują one enzymy deacetylujące takie jak te związane z deacetylazą chloramfenikolu oraz produktem genu icaB.

Przykład 2. Wytwarzanie szczepionki koniugatu dPNAG-toksoid błonicy (DTm)

DTm był kowalencyjnie sprzężony z oczyszczonym dPANG w aminowaniu redukcyjnym. W pierwszej kolejności na powierzchnię toksoidu błonicy wprowadzano grupy aldehydowe działając na białko glutaraldehydem, jak opisano etapie 1, poniżej. Aktywowany DTm następnie reagował z dPNAG poprzez wolne grupy aminowe w obecności czynnika redukującego, cyjanoborowodorku sodu, jak opisano w etapie 2 poniżej.

Etap 1. Aktywacja DTm za pomocą glutaraldehydu mg DTm (4,86 mg/ml roztwór w 20 mM buforze HEPES, 50 mM NaCI, pH 8) dializowano wobec buforu węglanowego 0,1 M (pH 10) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej stosując kasetę dializacyjną 10 kDa MWCO. Po całkowitej wymianie roztworu białka za pomocą buforu węglanowego, glutaraldehyd dodawano do końcowego stężenia wynoszącego 1,25%, zaś mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Doprowadziło to do otrzymania aktywowanego DTm, który wymieniano za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) i zatężano do około 10 mg/ml poprzez utrafiltrację z użyciem błony filtracyjnej 10 kDa MWCO.

Etap 2. Sprzęganie aktywowanego DTm z PNAG.

PNAG oczyszczano jak opisano w publikacji autorstwa Maira i wsp. (Maira-Litran T, Kropec A, Abeygunawardana C, Joyce J, Mark. III G, Goldmann DA, and Pier GB. Immunochemical properties of the staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70:4433-4440). Jedną z frakcji tego materiału, oznaczoną jako PNAG-II w publikacji autorstwa Maira i wsp., użyto do przygotowania deacetylowanej PNAG (dPNAG). Natywną PNAG rozpuszczano do stężenia wynoszącego 2 mg/ml w 5 M NaOH i inkubowano w 37°C, mieszając. Po 18 godz., próbkę umieszczano w lodzie i pozwalano na schłodzenie do < 10°C. 5 N HCI również schładzano na lodzie i dodawano do 0,5 ml porcji aż do osiągnięcia przez roztwór obojętnego pH. Roztwór dPNAG następnie dializowano przez noc wobec wody w kasetce dializacyjnej 10 KiloDalton Molecular Weight Cutoff (10 K, MWCO) i liofilizowano. Procedura ta doprowadziła do dPNAG z 15-20% podstawień octanem.

Oczyszczoną dPNAG (10 mg) rozpuszczano w 0,25 ml 5 M HCI, neutralizowano jednakową objętością wynoszącą 5 M NaOH, zaś końcową objętość doprowadzano do 2 ml za pomocą PBS. Roztwory dPNAG są nierozpuszczalne w pH neutralnym, ale pozostają całkowicie rozpuszczalne w lekko zasadowym lub kwaśnym pH. Aby zapewnić rozpuszczalność, pH roztworów dPNAG doprowadzano do 9,0. dPNAG (10 mg), mieszano z 1 ml 10 mg/ml roztworu aktywowanego DTm w PBS, zaś pH reakcji doprowadzano do 7,5. Dwieście mg oczyszczonego cyjanoborowodorku sodu dodawano do mieszaniny, a reakcję pozostawiano w ciemności przez 14 godz. w 37°C z mieszaniem. Po tym czasie, mieszaninę reakcyjną wymieniano poprzez dializę za pomocą buforu węglanowego 0,1 M, 0,15 M NaCI, pH 10 (kasetka dializacyjna 10 kDa MWCO), zaś koniugat o wysokiej masie cząsteczkowej oczyszczano z niesprzęgniętych składników za pomocą sączenia molekularnego na kolumnie preparatywnej Superose 6. Koniugat dPNAG-DTm dializowano wobec 20 mM buforu HEPES, 50 mM NaCI, pH 8 i przechowywano zamrożony w -2°C.

Przykład 3. Wytwarzanie szczepionki koniugatu natywnej PNAG-DTm

Natywną PNAG (w tym przypadku mającą 95-100% podstawień octanem) kowalencyjnie sprzęgano z oczyszczonym DTm przy użyciu organicznego czynnika cyjanującego, tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), celem aktywacji grup hydroksylowych polisacharydu jak opisano w etapie 1, poniżej. Aktywowana przez CDAP PNAG była następnie sprzęgana do DTm, jak opisano w etapie 2 poniżej, bez dodatkowego dodawania cząsteczek wstawki.

PL 229 487 Β1

Etap 1. Aktywacja PNAG za pomocą CDAP mg oczyszczonej PNAG rozpuszczano w 150 mikrolitrach 5 M HCI, neutralizowano za pomocą jednakowej objętości 5 M NaOH i rozcieńczano do 1 ml za pomocą buforu boranowego o pH 9,2. CDAP przygotowywano do stężenia 100 mg/ml w acetonitrylu i przechowywano w -20°C do 1 miesiąca. 200 mikrolitrów CDAP (zawierającego 20 mg) powoli odpipetowywano do uprzednio zmieszanego roztworu PNAG-II (Maira, i wsp. Infect. Immun. 2002, 70:4433-4440) w buforze boranowym (szybkie dodawanie rozpuszczalników organicznych precypituje polisacharyd), zaś reakcję pozostawia się na 2 minuty.

Etap 2. Sprzęganie PNAG aktywowanej przy użyciu CDAP z DTm mg DT (roztwór wyjściowy w 20 mM buforze HEPES, 50 mM NaCI, pH 8) dializowano wobec buforu boranowego, pH 9,2, przez 3 godziny w kasetce dializacyjnej 10 kDa MWCO. Po aktywacji PNAG za pomocą CDAP, 5 mg DTm szybko dodawano, zaś mieszaninę pozostawiano w temperaturze pokojowej na 3 godziny z mieszaniem. Po tym czasie, koniugat o wysokiej masie cząsteczkowej oczyszczano z niesprzęgniętych składników za pomocą sączenia molekularnego na kolumnie preparatywnej Superose 6. Frakcje zawierające koniugat PNAG-DTm pulowano, zatężano i przechowywano zamrożone w -20°C.

Przykład 4: Wytwarzanie surowicy odpornościowej w królikach

Przeciwciała dla oczyszczonej PNAG-DTm lub dPNAG-DTm otrzymywano w białych królikach rasy New Zealand poprzez podskórną immunizację za pomocą dwóch 10 gg dawek sprzęganego polisacharydu zemulgowanych dla pierwszej dawki w kompletnym adiuwancie Freunda oraz dla drugiej dawki w niekompletnym adiuwancie Freunda. Tydzień później podawano trzy dożylne wstrzyknięcia antygenu w soli fizjologicznej, każdy w odstępie trzech dni. Króliki skrwawiano co dwa tygodnie, zaś surowice testowano za pomocą ELISA. Krzywe wiązania otrzymane z ELISA dla dwóch reprezentatywnych królików immunizowanych za pomocą PNAG lub koniugatów dPNAG- DTm pokazano na fig. 1 i 2, odpowiednio. Miana określono jak opisano w publikacji autorstwa Maira i wsp. (MairaLitran T, Kropec A, Abeygunawardana C, Joyce J, Mark III G, Goldmann DA, and Pier GB. Immunochemical properties of the staphyhcoccal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70:4433-4440).

Przykład 5: Immunogenność PNAG-DTm i dPNAG-DTm u myszy

Grupy 10 myszy (Swiss Webster; samice, 5-7 tygodni) immunizowano podskórnie, w odstępie tygodnia, za pomocą 1,5, 0,7 5 lub 0,15 gg sprzęganego polisacharydu PNAG-DTm i dPNAG-DTm w 0,1 ml PBS i skrwawiano co tydzień przez okres czterech tygodni po trzeciej immunizacji. Grupy kontrolne immunizowano mieszaniną niesprzęganego polisacharydu i białka w tym samym stosunku. Miana dla myszy immunizowanych koniugatami natywnymi i deacetylowanymi pokazano na fig. 3 i 4, odpowiednio. Grupy kontrolne nie wytwarzały żadnych mian dla każdej użytej dawki.

Przykład 6. Aktywność zabijania przez opsonizację króliczych surowic odpornościowych przeciwko PNAG i dPNAG sprzęgniętej z toksoidem tężca.

Dwa króliki immunizowano za pomocą PNAG sprzęgniętego z toksoidem błonicy, zaś dwa króliki immunizowano za pomocą dPNAG sprzęgniętego z toksoidem błonicy, jak opisano powyżej. Aktywność zabijania przez opsonizację określano używając sposobu opisanego przez Maira i wsp. (Maira-Litran T, Kropec A, Abeygunawardana C, Joyce J, Mark III G, Goldmann DA, and Pier GB. Immunochemical properties of the Staphylococcal poly-N-acetyl glucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 2002; 70:4433-4440). Określano miano i definiowano jako rozcieńczenie surowicy, przy którym >40% bakterii było zabijanych. Krzywe wiązania dla surowic odpornościowych 4 królików skierowanych przeciwko różnym szczepom gronkowca pokazano na fig. 5-8. Szczep M187 stanowi szczep S. epidermidis, pozostałe stanowią szczepy S. aureus. Porównania mian pokazano na fig. 9.

Odpowiedniki

Powyższy opis powinien wystarczyć fachowcowi do praktycznego wykonania wynalazku. Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony zakresem przedstawionych przykładów, ponieważ przykłady mają jedynie charakter ilustracyjny dla jednego z aspektów wynalazku, zaś pozostałe funkcjonalne wykonania znajdują się w zakresie wynalazku.

PL 229 487 Β1

Wykaz sekwencji < 110> THE BRIGKAM AND WQMEN^łS SOSPITAL, INC, < 120* , . ,

Szczepionka polisacharydową na zakażenia gronkowcows < 130> BO801.702 92WO00 < 140> Jeszcze nie przypisany <141> 2003-11-12 < 150> VS £0/425,425 <153> 2002-11-12 <160> 1 <170> Patentln wersja 3.2 <210> 1 <211> €520 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <4G0> 1 .

ggtaccgagc	tcgctaatag	gtgactttgg	ttgttcatgg	aęaattaaac	ttgatgćact	60
tcttcgtgta	ttcgtcatgg	taattcctcg	taaattaaaa	tttttgtatt	gaacotaaaa	120
taggtaatcc	tagttgcgac	tcąacatett	ćttctgtctt	aatacgctra	tctaataatt	180
cttttaagaa	aataatcaat	attgetaaaa	caataccaac	aataatgctg	ataactaagt	240
tgacagatac	tattggagat	acttttacgg	cattatcatg	tgctgaggaa	agtatcgtaa	300
cattatcąac	actcataatt	ttaggoatigt	cątgagcaaa	aactttsgat	attttattaa	360
caattttgtc	agattcagat	ttattcccag	tggtaactga	tacagtaata	atttgagagt	420
ttgtttgatt	ggttactttt	aaaaatgaat	tcaactcagc	tgttgaatac	tgaccatcaa	4B0
attctctaga	tactttatct	agaattctag	gaottttgat	aatttcegta	tatgtattaa	540
cagactgcaa	actactttga	acatztttgga	aagctaaatc	acttgaggac	tttttcatgt	600
tcaetaatat	ttgagtagaa	gcagtatatt	tgtcaggcat	aacaaaaaag	gttaatgccg	660
cacttactac	aagacatatt	gccggtaaaa	taagcaataa	tttaatet-tc	ttctttagaa	720
tatttaatag	ttetachaaa	tcaaactttt	ctttcatggt	ttcctccaca	taatcaatca	760
ttgtattcat	tatgtahgte	ttataaaćcg	gacaattata	totagtttaa	cgaccacaaa	840
acatacacaa	ctacattttc	tctaattatfc	tatataaata	tttcatcgtt	taaaattata	900
tcatgatstct	ctaccattat	gtataactta	tttatatttt	tgcauaagat	ataatattgt	960
ccaacfcttaa	atatccaaac	ctattaataa	taaaactaga	taccaccgta	etctgtcatg	1020
gctttcrtat	aatcgagtag	aagcatcatc	attacttgat	tatttgctct	ttacaacacc	1080
gagcgtgccc	gtactcggta	attcaatacc	ttgcgtaacc	cgtcactgtg	«gttgggtta	1X40

PL 229 487 Β1

atgataataa	agcecacaec	ttttaaaaag	atgtgggtaa	tttatataat	ttttatttac	1200
attttbaact	tataaaaaaa	agcgcctatg	tcatgattta	ccatcacata	ggegettate	1260
aataaattat	tacttatrac	tttccatttc	atctaattta	tgcggattcc	ctgtaattag	132 0
atgacaactt	attcttttca	ggggaacatt	acacttttat	aatatgttca	aagacaaact	1380
taaccattca	caaatataaa	gaataatatt	atcaaatcat	tgaacaaatc	gtattttgca	1440
acaattgata	tttatattaa	tgtattgcat	ttaatttata	aaattcatat	acatcttaat	1500
attctcaata	tcgatttgta	ttgtcaactt	tatatagatt	taaaaaaata	atctcatgtc	1560
tttttttaca	aaagtaagtt	aattattaca	aactagtaac	aaaaattatt	tcttcaaaaa	1620
tatatttagt	agcgaataca	cttcahcttt	gaattgactt	rtactttctt	ceactgctcc	1680
aaatttttge	gaaaaggatg	utttcaaata	ccaactttca	agaaacagca	atattaaatt	1740
ctgaaagtct	tcttttgtca	tctttatctt	tgattcatca	tagaattttg	etatetettt:	1800
acttaatgat	tgatttaaat	cttgtatttg	tccgtaaata	tttccagaaa	attcctcagg	1860
cgtattagat	aattgaacgt	acattctaat	atacctttct	tegatgtega	aaataaactc	1920
aaataagaat	tgatataaag	catcaattga	atagttcgat	ttattttgat	tcatcataat	1980
aatattatta	aggtaatcaa	aacaacattt	aacactttgt	tcgtaaataa	tttttttcga	2 04 0
gtcaaaatgg	taatataaac	tcgctttctt	tatatttaca	cttttagcta	tatcatcaag	2100
tgttgtaccg	tcatacccet	tctctgaaaa	taaggttatt	gcgttatcaa	taatettate	2160
attcaatttt	tataaccccc	tactgaaaat	taatcacact	atgttacagg	aaaattaagt	2220
tgcaattaca	aatatttęcg	tttaattata acctaactaa	ącaacaatet	attgcaaatt	aaaatactat	2280
caattaecat	at.ggctt.aca	cgaaaggtag	gta^agaaat	tgcaattttt	2340
taactttttg	cttttttata	ctgtatttat	gtetatttac	tggattgtcg	gtteaattta	2400
tttctatttc	accagagaaa	ttagatattc	attgaacaag	aagcctgaca	taaatgtgga	2460
tgaattacaa	ggcattacat	ttttacttgc	ctgttataac	gaaagtgaaa	cgattgaaga	2520
tacgttgtct	aatgttcttg	cactcaaata	cgagaagaaa	gaaattatta	tcattaatga	2580
tggaagttca	gataatacag	cagaactcat	ctataaaatc	aaagaaaata	atgactttat	2640
tttcgtcgat	ttacaagaaa	acagaggtaa	agccaacgca	cteaatcaag	gcattaaaca	2700
ggcttcątat	gattatgtaa	tgtgcttgga	tgcagatact	ategttgate	aagatgcacc	2760
atattatatg	attgagaatt	tcaaacatga	tccaaaactt	ggtgcggtta	caggtaatcc	2820
tagaattcga	aataagagtt	ctattttagg	taaaattcaa	acgatagaat	atgcaagttt	2830
aattggctgt	attaagcgaa	gtcagacact	tgctggcgca	gteaatacta	tctcgggtgt	2 940
cttaactota	tttaaaaaaa	gtgcagttgt	cgacgttggc	taetgggata	ctgatatgat	2000

PL 229 487 Β1

fcaccgaagat	attgcagttt	cttggaaatt	gcatttacgt	ggatatcgta	ttaagtatga	306Q
accgcttgcc	atgtgttgga	tgttggttcc	agaaacattg	ggaggtcttt	gcaagcaacg	3120
cgtgagatgg	gctcaagggg	gaeacgaagt	attactacga	gactttttta	gcacaatgaa	3190
aacgaaaagg	tttcctttat	atattttgat	gtrtgagcaa	ateatetega	ttttaŁcggt	3240
atatatagtg	cttctatatt	taggctattt	gttcataaca	gcaaacttct	tagactatac	3300
atttatgaca	tatagttttt	caatatttct	actatcatca	tttactatga	cttttataaa	3360
cgttatheaa	fcttacagtcg	cactctttat	tgat<tgtcgc	tacgagaaaa	agaatatggc	3420
tggaętcatą	tttgtaagtt	ggtatccgac	agtatactgg	attattaacg	cagcagtagt	3480
tcttgtcgca	bttccaaaag	cattaaaacg	taagagaggt	ggttacgcaa	catggtcaag	3540
cccagacaga	gggaatacce	aacgctaaaa	teategetaa	atattgtaag	agaaacagca	3600
cttategcta	tatcttgtgt	cttttggata	tatstgtttag	ttgttctąęt	cgtttatatt	3660
ggtactatat	ttgaaattca	tgaegaaagt	atcaatacaa	tacgtgttgc	Cttaaacatt	3720
gaaaataćtg	aaattttaga	tatatttgaa	actatgggca	ttttcgcgat	tatcantttt	3780
gtatttttca	caattagcat	attgatteaa	aaatggcaga	gagggagaga	atcgtgaagt	3840
atagaaastt	tataatttta	gtgttgagta	tettgateat	attgcctgta	agcacactgg	3900
atggtcatca	tattgcaaat	gcagatgacg	attcacctaa	aaaactgaaa	tataaagaaa	3960
atagtgctct	ggcatcaaat	tatcaccgtg	ta ag aa a ag c	gaattttctg	aataatttta	4020
tttacttctt	ttctagtagt	aaagaaatta	aaaattatag	tgtbagteaa	tcacaatttg	4080
aatctcaaat	aaaatggcta	aaatcacatg	atgctaaatt	tttaacctr.g	aaag&ątttt	4140
tatattacaa	gaaaaaaggt	aagtttccaa	aacgaagtga	gtgggttaac	tttgatgata	4200
tggatgaaac	tatttatgaa	aatgettate	caatcttaaa	aaaatataaa	ataccggcga	4260
ctgggtttat	tatcacaggt	catgttgggg	gggaaaactt	tcacaaccte	gatatgatta	4320
gtaaaaaaga	actaaaagaa	atgtataaaa	ętgggttatg	ggaafcttgaa	acacataccc	4380
acgattt-gca	taacttatct	aaaaataata	agtcaaaatt	aat.gaaagct	tctgaagcta	4440
caatcataaa	/ agatttaaac	aaaagtgaaa	aatatctaac	taaaaacttt	aaaaagtćgć	4503
agaaaactat	agcctatcct	tatggcttga	tgaatgacga	taaattaccg	gtaatcaaaa	4560
aagctgggtt	aaaatacggt	ttttcattag	aggaaaaagc	agtcactccg	aactcca&tg	462Q
attattacat	ccctagaata	ttaattagtg	atgatgctrt	tgagcattta	attaagagat	4680
gggacggatt	ccatgaaaaa	gattagaett	gaactcgtat	atttacgtgc	Eattatatgt	4740
gcaattatta	ttatcacaca	tttacttaca	caaattactt	taaaacatga	aaat&tggag	4800

ggtgggtcct tagtgttaca attttacatt cgc&atattg tgatttttgg tacaccttgc 4860

PL 229 487 Β1

tttattatct	tgtcacagtt	actgacaacc ttgaattaąc aaaaagtęaę	ctatagatac	4^20
ttaactacac	gcgtaaaata	tatacttatt ccttacatat taatgggatt	gttttacagt	4980
tatagtgaat	cattattaac	agattcaagt ttcaataaac aattcattga	aaatgtccta	S040
ttaggtcaat	ggtatggcta	ttttatcgtt gttatcatgc aattctttafc	tttgagttat	5100
atcattttta	aaattaacta	taacctattc aacagtaaaa tattattatt	gttatctttt	51SO
attttacagc	aatcattttt	atattaęttt acgaacaaca cagcgtttca	cgataccgtg	522Q
ctacactatt	atcccttaag	tgaaaatact ataatattcg gatggatttt	ttatttcttc	5280
ttaggtgcat	afcatgggttą	taaotacgaa cgtgtattaa atttcttaga	acgttattta	5340
gttattatga	ttgtattagc	tgfcagctact tattttgtgt tfcattgcgtt	agcaaatgga	5400
gactattgga	acgttacaag	cttttcatat tcattaacac catataatag	tattatgttt	5460
attgttatct	tgggtatttg	cacgcatttt aaaacaatgt tatttaatas	gattcaaatg	5520
attagtgctt	tcfccattctt	tatttattta ttacatccaa teattctaga	ctcattgttt	5580
gcatatacaa	atatatttga	ggataataca atggtctttc tagcgatatc	actactattc	5640
attttaggat	tatgtatagg	tgtcggcatg atafctgcgtg aattctatat	etttaggttt	5700
attattgg&a	aacaaccata	taaattgaac attaatgctt attaattatt	aagctatgtt	5760
aaaaacacgę	ggtgggcgaa	afcęagttęga attgactgac ttcgttttac	ęgcgtgttta	5820
atattgttat	acatatattc	taattgcaca tttaaacttc gtaaatgcca	atgggagtgg	5880
gacagaaatg	atattttcgc	aaaatttatt tcgtcgtccc accccaactt	gcacattatt	5940
gtaacctgac	tttccgccag	cttatatgtt ggggcceegc caacttgeae	ąttattgtaa	6000
gctgacttta	cgecagcttc	tttgttgggg ccccgccaac ttgcattgtt	tgtagaattt	6060
cttttcgaaa	ttctttatgt	tggggactęg cccaatgttt tacttgaata	attcttttag	6120
aąttctaaat	aatgatccga	ttaattgaaa gaagtctgca gtcattatta	attcctccct	6180
ttactttata	aattatgctt	gcttagtatc agteagcttt tcagttttca	ctaaatcgtc	6240
tgctaaatga	tgccaaaaat	cttgtaattc ttctcttgtg egcactgtat	cagaactgta	6300
ttgtcctaca	aagtcaacat	gatcecaatc atgttttgta ggogtcactt	gccaaatgcc	6360
tttttgaatt	ttatctgtcg	cttttgtata agcttgatta' aatggatgtt	gagaagaaat	6420
aacggatact	aaaccatcgt	tttctcgcca ttctttttca gtagctttac	cgattaagtt	6480
accagtaatc	acaaatggga	aaaacatatt taagtctgct		6520

PL 229 487 Β1

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, znamienna tym, że zawiera wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy, o długości co najmniej czterech jednostek monomerycznych, mający masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 2500 Daltonów, o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą wynoszącą co najmniej cztery, przy czym R jest wybrany z grupy składającej się z NH-CO-CHs oraz -NH2, pod warunkiem, że mniej niż 40% grup R stanowi -NH-CO-CH3, i kompozycja jest sterylna.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera wyodrębniony polisacharyd zawierający polimer β-1,6-glukozaminy sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że mniej niż 35%, mniej niż 30%, mniej niż 25%, mniej niż 20%, mniej niż 15%, mniej niż 10%, lub mniej niż 5% grup R stanowi -NH-CO-CH3 lub żadna z grup R nie stanowi -NH-CO-CH3.

4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że n oznacza liczbę całkowitą wybraną z grupy składającej się z co najmniej 6, co najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 50, co najmniej 100, co najmniej 200, co najmniej 300, co najmniej 400 oraz co najmniej 500.

5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wyodrębniony polisacharyd stanowi heteropodstawiony polimer.

6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wyodrębniony polisacharyd ma masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z co najmniej 5000 Daltonów, co najmniej 7500 Daltonów, co najmniej 10000 Daltonów, co najmniej 25000 Daltonów, co najmniej 50000 Daltonów, co najmniej 75000 Daltonów, co najmniej 100000 Daltonów, co najmniej

125000 Daltonów, co najmniej 150000 Daltonów, co najmniej 200000 Daltonów, co najmniej

250000 Daltonów, co najmniej 300000 Daltonów, co najmniej 350000 Daltonów, co najmniej

400000 Daltonów, co najmniej 450000 Daltonów i co najmniej 500000 Daltonów.

7. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że kompozycja ma czystość wybraną z grupy składającej się z co najmniej 90% czystości, co najmniej 95% czystości, co najmniej 97% czystości, i co najmniej 99% czystości.

8. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że wyodrębniony polisacharyd jest sprzęgnięty ze związkiem nośnikowym poprzez łącznik.

9. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że związek nośnikowy stanowi nośnik peptydowy.

10. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że ponadto zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

11. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wyodrębniony polisacharyd jest wytwarzany w postaci szczepionki.

12. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że wyodrębniony polisacharyd składa się z następującego wzoru:

PL 229 487 Β1

η

....... ... _w w którym każdy z Χ1, X2, X3, X4, X5 i X6 stanowi H, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym, a każdy z Υ1, Y2 i Y3 stanowi OH, związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym, przy czym tylko jeden związek nośnikowy lub łącznik połączony ze związkiem nośnikowym jest sprzęgnięty z wyodrębnionym polisacharydem.

13. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment, które wiąże się z wyodrębnionym polisacharydem według zastrz. 1 albo 2.

14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment stanowi:

a) przeciwciało poliklonalne,

b) przeciwciało humanizowane lub przeciwciało chimerowe, lub

c) przeciwciało ludzkie.

15. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment sprzęgnięte jest z:

a) wykrywalnym znacznikiem,

b) czynnikiem bakteriobójczym,

d) czynnikiem bakteriobójczym stanowiącym antybiotyk.

16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wyodrębniony polisacharyd według dowolnego z zastrz. 1 do 12 w ilości skutecznej do stymulacji odpowiedzi immunologicznej, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że ponadto zawiera adiuwant.

18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że odpowiedź immunologiczną stanowi odpowiedź immunologiczna antygenowo-specyficzna.

19. Sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu według dowolnego z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

b) wytwarza się zanieczyszczony polisacharyd z hodowli bakteryjnej, inbkubuje się zanieczyszczony polisacharyd z kwasem lub zasadą z otrzymaniem częściowo oczyszczonego preparatu polisacharydu,

PL 229 487 Β1 neutralizuje się preparat przez inkubację zneutralizowanego preparatu w kwasie fluorowodorowym, i wyodrębnia się z preparatu acetylowany polisacharyd, i deacetyluje się acetylowany polisacharyd z otrzymaniem polisacharydu mającego mniej niż 40% podstawień octanem, w przypadku którego opcjonalnie wyodrębnia się z preparatu polisacharyd mający mniej niż 40% podstawień octanem.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako hodowlę bakteryjną stosuje się:

a) hodowlę koagulazo-ujemnego gronkowca,

b) hodowlę Staphylococcus aureus, lub

c) hodowlę Staphylococcus epidermidis.

21. Sposób według zastrz. 19 a) albo 19 b), znamienny tym, że acetylowany polisacharyd:

a) deacetyluje się chemicznie,

b) deacetyluje się chemicznie poprzez inkubację w roztworze zasadowym, lub

c) deacetyluje się enzymatycznie.

22. Sposób według zastrz. 19 a), znamienny tym, że preparat polisacharydu frakcjonuje się pod względem wielkości wykorzystując kolumnę.

23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że ponadto wyodrębniony polisacharyd wytwarza się w postaci szczepionki.

24. Sposób identyfikacji w próbce obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/lub poli- N-acetyloglukozaminy (PNAG), znamienny tym, że obejmuje etapy, w których: kontaktuje się próbkę z wyodrębnionym przeciwciałem lub jego fragmentem według zastrz. 13 oraz wykrywa się wiązanie wyodrębnionego przeciwciała lub jego fragmentu z próbką, przy czym wiązanie wyodrębnionego przeciwciała lub jego fragmentu wskazuje, że w próbce występuje deacetylowana poli-N-acetyloglukozamina (dPNAG) i/lub poli-N-acetyloglukozamina (PNAG).

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że próbkę stanowi:

a) próbka biologiczna pochodząca od osobnika, lub

26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment sprzęga się z wykrywalnym znacznikiem.

27. Wyodrębniony polisacharyd według dowolnego z zastrz. 1 do 12 do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia bakteriami wytwarzającymi poli-N-acetyloglukozaminę (PNAG), u osobnika niebędącego gryzoniem, znamienny tym, że obejmuje indukowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom wytwarzającym PNAG.

28. Wyodrębniony polisacharyd do zastosowania według zastrz. 27, znamienny tym, że bakterie wytwarzające PNAG to: a) gronkowiec,

b) Staphyloccocus aureus, lub

c) Staphyloccocus epidermidis.

29. Wyodrębniony polisacharyd do zastosowania według zastrz. 27, znamienny tym, że osobnikiem niebędącym gryzoniem jest: a) osobnik ludzki, b) osobnik wybrany z grupy składającej się z naczelnych, koni, krów, świń, kóz, owiec, psów i kotów,

c) osobnik zagrożony ryzykiem ekspozycji na gronkowca,

d) osobnik, który podlegał ekspozycji na gronkowca, lub

30. Wyodrębniony polisacharyd według zastrz. 27, znamienny tym, że wyodrębniony polisacharyd:

a) stosowany jest w połączeniu z adiuwantem,

b) wytwarzany jest w postaci szczepionki,

c) wytwarzany jest do podawania układowego,

d) sprzęgnięty jest ze związkiem nośnikowym, lub

e) sprzęgnięty jest z peptydowym związkiem nośnikowym.

PL 229 487 Β1

31. Wyodrębniony polisacharyd według dowolnego z zastrz. 1 do 12 w połączeniu z adiuwantem do zastosowania do wytwarzania przeciwciał u osobnika.

32. Wyodrębniony polisacharyd do zastosowania według zastrz. 31, znamienny tym, że przeciwciałami są przeciwciała poliklonalne.

33. Wyodrębniony polisacharyd według zastrz. 1 do 2 i adiuwant do zastosowania do wytwarzania przeciwciał monokłonalnych obejmującego etapy: podawania osobnikowi niebędącemu człowiekiem ilości skutecznej do wytwarzania przeciwciał swoistych względem gronkowca, zbierania komórek śledziony od osobnika, poddawania fuzji komórek śledziony od osobnika z komórkami szpiczaka, i zbierania przeciwciała wytworzonego z fuzyjnego subklonu.

34. Wyodrębniony polisacharyd do zastosowania według zastrz. 33, znamienny tym, że osobnikiem jest królik.

35. Wyodrębniony polisacharyd według zastrz. 1 do 2 do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego swoistego względem polisacharydu u osobnika niebędącego człowiekiem obejmującej etapy: indukowania odpowiedzi immunologicznej wobec polisacharydu, wyodrębniania komórek wytwarzających przeciwciało od osobnika, wytwarzania unieśmiertelnionych komórek z komórek wytwarzających przeciwciało, i testowania zdolności unieśmiertelnionych komórek do wytwarzania przeciwciała monoklonalnego.

36. Wyodrębniony polisacharyd do zastosowania według zastrz. 35, znamienny tym, że ponadto obejmuje wyodrębnianie przeciwciała monoklonalnego z supernatantu unieśmiertelnionych komórek.

37. Wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 24 do zastosowania w leczeniu osobnika zagrożonego ryzykiem rozwoju zakażenia bakteriami wytwarzającymi poli-N-acetyloglukozaminę (PNAG).

38. Wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 37, przy czym zakażenie jest:

a) zakażeniem gronkowcem, lub

39. Wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 37, znamienne tym, że wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment jest sprzęgnięte z: a) czynnikiem bakteriobójczym, lub b) czynnikiem bakteriobójczym stanowiącym antybiotyk.