PL197057B1 - Peptyd, przeciwciało i test diagnostyczny - Google Patents
Peptyd, przeciwciało i test diagnostycznyInfo
- Publication number
- PL197057B1 PL197057B1 PL336714A PL33671498A PL197057B1 PL 197057 B1 PL197057 B1 PL 197057B1 PL 336714 A PL336714 A PL 336714A PL 33671498 A PL33671498 A PL 33671498A PL 197057 B1 PL197057 B1 PL 197057B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- prrsv
- amino acid
- gkgp
- protein
- pnn
- Prior art date
Links
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims abstract 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- -1 GP4 amino acid Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 60
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 39
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 32
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 29
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 22
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 241000710789 Lactate dehydrogenase-elevating virus Species 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000011999 immunoperoxidase monolayer assay Methods 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 101000836906 Homo sapiens Signal-induced proliferation-associated protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 101150012812 SPA2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100027163 Signal-induced proliferation-associated protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 244000144980 herd Species 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150082475 ORF7 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100028161 Porcine circovirus 2 ORF4 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 101000714195 Varicella-zoster virus (strain Dumas) Tegument protein UL51 homolog Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 1
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000977065 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 11.6 kDa protein in mobS 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000787133 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 12.3 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000010773 Antigen Neutralization Effects 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827603 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 10.2 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 101000861180 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) Uncharacterized protein H16_B0147 Proteins 0.000 description 1
- 101710098807 DNA helicase/primase Proteins 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710173308 Gene 4 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 description 1
- 101710127403 Glycoprotein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000602237 Homo sapiens Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001113490 Homo sapiens Poly(A)-specific ribonuclease PARN Proteins 0.000 description 1
- 101001130286 Homo sapiens Rab GTPase-binding effector protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000802734 Homo sapiens eIF5-mimic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 101000977786 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 9.7 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100038551 Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase Human genes 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101001113905 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P4 Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001516645 Simian hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 102100035859 eIF5-mimic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108040002068 peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
1. Peptyd, o 10-15 resztach aminokwasowych wzbudzaj acy przeciwcia la, które reaguj a z co najmniej dwoma ró znymi izolatami PRRSV, który to peptyd obejmuje sekwencj e aminokwasow a od- powiadaj ac a miejscu konserwowanemu PRRSV bia lka N, przy czym to miejsce konserwowane jest wybrane z VNQLCQLLGA lub VNQLCQMLGK lub sekwencji aminokwasowej przy czym reszty tej se- kwencji aminokwasowej zosta ly zast apione konwencjonalnie lub zgodnie z wskazówkami mapowania zast apie n. PL PL PL PL
Description
| RZECZPOSPOLITA POLSKA | (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 336714 | (11) 197057 (13) B1 |
| (22) Data zgłoszenia: 05.05.1998 | (51) Int.Cl. C07K 14/08 (2006.01) | |
| (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: | C07K 16/10 (2006.01) | |
| 05.05.1998, PCT/NL98/00251 | A61K 39/12 (2006.01) | |
| Urząd Patentowy | (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: | G01N 33/68 (2006.01) |
| Rzeczypospolitej Polskiej | 12.11.1998, WO98/50426 |
PCT Gazette nr 45/98 (54)
Peptyd, przeciwciało i test diagnostyczny
| (73) Uprawniony z patentu: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA | |
| (30) Pierwszeństwo: | GmbH,Ingelheim nad Renem,DE |
| 06.05.1997,EP,97201343.7 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | Antonie Paul Van Nieuwstadt,Lelystad,NL |
| 03.07.2000 BUP 14/00 | Jan Langeveld,Harderwijk,NL Janneke Meulenberg,Amsterdam,NL |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | |
| 29.02.2008 WUP 02/08 | (74) Pełnomocnik: |
| Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. |
(57) 1. Peptyd, o 10-15 resztach aminokwasowych wzbudzający przeciwciała, które reagują z co najmniej dwoma różnymi izolatami PRRSV, który to peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą miejscu konserwowanemu PRRSV białka N, przy czym to miejsce konserwowane jest wybrane z VNQLCQLLGA lub VNQLCQMLGK lub sekwencji aminokwasowej przy czym reszty tej sekwencji aminokwasowej zostały zastąpione konwencjonalnie lub zgodnie z wskazówkami mapowania zastąpień.
PL 197 057 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy peptydu, przeciwciała i testu diagnostycznego.
Wirus PRRS (PRRSV) jest czynnikiem sprawczym choroby świń, aktualnie zwanej zespołem reprodukcyjnym i oddechowym trzody chlewnej (PRRS). Wirus jest czynnikiem sprawczym choroby świń, obserwowanej od około 1987 w US i od 1990 w Europie, znanej początkowo pod różnymi nazwami, tak jak tajemnicza choroba świń, niepłodność świń i zespół oddechowy i wiele innych. Samemu wirusowi nadawano wiele nazw, wśród nich wirus Lelystad (LV), wirus SIRS i wiele innych, lecz obecnie w większości oznacza się go jako wirus zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV). Powoduje on poronienia i niewydolność oddechową u świń i wyizolowano go po raz pierwszy w Europie w 1991 (opis patentowy EP 587780, opis patentowy U.S. nr 5,620,691) i nastę pnie w US i wielu innych krajach na świecie. PRRSV jest małym wirusem otoczkowym, zawierającym genom dodatniej nici RNA. PRRSV rośnie przede wszystkim w makrofagach. Oprócz makrofagów, PRRSV może rosnąć w linii komórkowej CL2621 i innych liniach komórkowych klonowanych z linii komórkowej nerki małpiej MA-104 (Benfield i in., J. Vet. Diagn. Invest. 4: 127-133, 1992). Genom PRRSV, poliadenylowany RNA o około 15 kb, sekwencjonowano w 1993 (Meulenberg i in., Virology, 192; 62-74, 1993). Sekwencja nukleotydowa, organizacja genomu i strategia replikacji wskazywały, że PRRSV jest spokrewniony z grupą małych otoczkowych wirusów o dodatniej nici RNA, oznaczonych jako Arteriwirusy. Grupa ta obejmuje wirusa, podnoszącego dehydrogenazę mleczanową (LDV), wirusa zapalenia tętnicy koni (EAV) oraz wirusa gorączki krwotocznej małp (SHFV). Wirusy te mają podobną organizację genomu, strategię replikacji, morfologię oraz sekwencję aminokwasową białek wirusowych. Arteriwirusy zawierają genom o 12,5 do 15 kb i w trakcie replikacji syntetyzują skrócony (nested) zbiór 3' sześciu subgenomowych RNA. Te subgenomowe RNA zawierają sekwencję liderową, która pochodzi z koń ca 5' genomu wirusa. ORF 1a i 1b obejmują około dwie trzecie genomu wirusa i kodują polimerazę RNA zależną od RNA. Sześć mniejszych ORF, ORF 2 do 7 umiejscowione są na końcu 3' genomu wirusa. ORF 2 do 6 prawdopodobnie kodują białka otoczki, podczas gdy ORF7 koduje białko nukleokapsydu (Meulenberg i in., Virology 206: 155-163, 1995).
PRRSV jest pierwszym Arteriwirusem, dla którego pokazano, że wszystkie sześć białek kodowanych przez ORF 2 do 7 jest związanych z wirionem. Białko N o 15 kDa (kodowane przez ORF7) oraz integralne białko błonowe M o 18 kDa (ORF6) nie są N-glikozylowane, podczas gdy białka GP2 o 29- do 30 kDa (ORF2), biał ko GP3 o 45- do 50 kDa (ORF3), biał ko GP4 o 31- do 35 kDa (ORF4) oraz białko GP5 o 25 kDa (ORF5), są N-glikozylowane. Białka te wykrywano także w wirusie zewnątrzkomórkowym i lizatach komórek zakażonych izolatem ORRSV z Północnej Ameryki, ATCCVR2332 i innymi izolatami PRRSV (inne izolaty PRRSV to np. CNCM I-1140, ECACC V9307108, CNCM I-1387, CNCM I-1388, ATCC-VR2402, ATCC-VR2429, ATCC-VR2430, ATCC-VR2431, ATCCVR2475, ATCC-VR2385, lecz wiele innych jest znanych).
Opisaliśmy wcześniej izolację i charakterystykę panelu Mab specyficznych wobec PRRSV, które były specyficzne wobec GP3, GP4, M i N (van Nieuwstadt i in., J. Virol. 70, 4767-4772, 1996). Jest interesujące, że Mab skierowane przeciw GP4 były neutralizowane, sugerując, że co najmniej część białka ulega ekspozycji na powierzchni wirusa. Ponadto, większość Mab skierowanych przeciw N reagowało ze wszystkimi testowanymi izolatami PRRSV.
PRRS stanowi problem głównie dotyczący przemysłu trzody chlewnej w większości części świata. Wprowadzenie PRRSV do trzody chlewnej spowoduje poważne straty ekonomiczne. Testowanie diagnostyczne przeciw PRRS praktykuje się szeroko w wielu lecznicach weterynaryjnych i laboratoriach. Większość testów diagnostycznych, takich jak IPMA, IFT, IFA, ELISA, każdy obejmujący odpowiednie środki detekcji, takie jak sprzężone enzymy lub fluorochromy i inne substraty, wykorzystują interakcje między antygenem pochodzącym od PRRSV i przeciwciałami skierowanymi przeciw PRRSV, w celu pomiaru obecności albo antygenu PRRSV, albo przeciwciał skierowanych przeciw PRRSV w próbce biologicznej, takiej jak krew, surowica, tkanka, płyny tkankowe, płyny z płukania, mocz, kał, pobranych od zwierzęcia (takiego jak świnia) do przetestowania. Antygen i/lub przeciwciała użyte w tych testach diagnostycznych, albo zestawach diagnostycznych lub oznaczeniach do diagnozowania pod względem PRRS, określone są jedynie przez ich pochodzenie lub przez ich reaktywność z PRRSV. W zasadzie to wystarcza do testów skriningowych, gdzie wysoka specyficzność lub czułość nie jest kategorycznie wymagana. Jednakże, ciągle rozprzestrzeniający się PRRS spowodował wielkie zaniepokojenie w przemyśle trzody chlewnej, do takiego stopnia, że uważa się jako konieczne usunięcia PRRS z całych stad albo nawet z całych obszarów, regionów lub krajów, w których hoduje
PL 197 057 B1 się trzodę chlewną. Przykładem tej potrzeby jest proponowany program zwalczania w odniesieniu do PRRS, w Danii. Jeśli ktoś decyduje się na całkowite usunięcie PRRS, wtedy potrzeba testów diagnostycznych, wykazujących wyższą specyficzność lub czułość niż testy stosowane obecnie.
Szczepienie przeciw PRRS jest także szeroko praktykowane. Znanych jest kilka przykładów stosowanych modyfikowanych żywych szczepionek, a także znane są szczepionki zabite. Jednakże, ogólnie z żywymi szczepionkami a więc tym samym i z żywymi szczepionkami PRRS istnieje problem, ponieważ szczepionki te mają tendencję do rozprzestrzeniania się na świnie nie szczepione, rozprzestrzeniając zamiast redukować, wykrywalną infekcję w stadzie trzody chlewnej, będąc w ten sposób przeciwieństwem całkowitego zwalczenia. Jeśli stosowałoby się szczepionkę markera liniowego, którą można by odróżnić serologicznie od wirusa dzikiego typu, wtedy problem ten byłby bardzo zredukowany. Inne wady są takie, że żywe szczepionki czasem powodują reakcje anafilaktyczne u szczepionych świń, ze względu na nieokreślone składniki antygenowe. Mimo, że zabite szczepionki ogólnie opisuje się jako indukujące odporność u szczepionych świń i mających dodatkową korzyść, taką, że nie przenoszą się ze świni na świnię, wadą tych zabitych szczepionek jest to, że może być trudne uzyskanie wystarczającej masy antygenowej w jednej dawce, aby wywołać odpowiedź immunologiczną możliwą do zmierzenia i zabezpieczającą. Zwłaszcza korzystne byłyby zabite szczepionki, które indukują mierzalne miana przeciwciała neutralizujących u świń, ponieważ pomiar tych neutralizujących przeciwciał w populacjach szczepionych świń pomógłby w rozumieniu problemu poziomu zabezpieczenia uzyskiwanego przez szczepienie w stadzie świń. Poza tym, jeśli osiągnie się sukces w budowaniu koniecznej masy antygenowej, oznacza to takż e, ż e w szczepionce obecnych jest wię cej innej nieokreślonej masy antygenowej, która także może wywołać reakcje anafilaktyczne, jak opisano powyżej. W tym sensie, byłoby korzystne wiedzieć, które specyficzne miejsce na PRRSV wiąże się z neutralizacją, prowadząc do zaplanowania lepiej dopasowanych szczepionek, wprowadzających istotne sekwencje peptydowe potrzebne do wywołania przeciwciał neutralizujących. Korzyścią aktualnie stosowanych szczepionek, pochodzących od izolatów PRRSV izolowanych w US jest to, że takie szczepionki chociaż w pełni zabezpieczające i immunologicznie reaktywne krzyżowo z izolatami europejskimi PRRSV, zawierają, jeszcze nieokreślone, epitopy lub miejsca antygenowe, dzięki którym można je odróżnić od izolatów europejskich PRRSV. Odwrotnie, żywe szczepionki, pochodzące od izolatów PRRSV wyizolowanych w europie, chociaż w pełni zabezpieczające i immunologicznie reagujące krzyżowo z izolatami US PRRSV, zawierają podobnie jeszcze nieokreślone epitopy lub miejsca antygenowe, dzięki którym można je odróżnić od izolatów PRRSV z US.
Jeśli byłyby dostępne testy serologiczne, które mogłyby odróżnić (na podstawie małych różnic epitopowych między izolatami PRRSV) świnie albo zaszczepione szczepionką, pochodzącą z US albo zakażone europejskim PRRSV dzikiego typu (będące zaszczepionymi lub nie), lub które mogłyby odróżnić świnie albo zaszczepione szczepionką, pochodzącą z Europy albo zakażone PRRSV dzikiego typu z US (będące zaszczepionymi lub nie), wtedy możnaby ulepszyć szczepionki markerowe i odpowiadające testy diagnostyczne (wprowadzające wymienione epitopy odróżniające lub miejsca antygenowe), które możnaby stosować z wielką pewnością w programach zwalczania dla PRRS. Przykładowo, w Danii możnaby wtedy szczepić szczepionkami pochodzącymi z USA i mierzyć zbiór przeciwciał u duńskich świń, skierowanych jedynie przeciw unikatowym epitopom na europejskich dzikich typach PRRSV i nie reagujących krzyżowo ze szczepami z USA. Umożliwiałoby to jednoznaczną detekcję i następnie usunięcie z duńskich stad świń zakażonych dzikim typem. Aktualnie, takie rozróżnienie nie jest możliwe z powodu całkowitej szerokiej reaktywności krzyżowej między izolatami PRRSV. Rozumie się samo przez się, że takie połączone programy szczepienia-testowania będą podstawą zwalczania PRRS i można ich także używać w innych krajach, jeśli potrzeba z różnymi miejscami antygenowymi PRRSV stosowanymi w szczepionce i/lub teście diagnostycznym.
Celem wynalazku było zdefiniowanie miejsc antygenowych obejmujących sekwencje peptydowe PRRSV, pozwalających na ulepszenie szczepionek, przy czym są to szczepionki zabite lub atenuowane lub szczepionki otrzymane dzięki technologii rekombinacji DNA, oraz miejsca antygenowe, pozwalające na ulepszenie metod diagnostycznych, testów i zestawów.
Przedmiotem wynalazku jest peptyd, o 10-15 resztach aminokwasowych wzbudzający przeciwciała, które reagują z co najmniej dwoma różnymi izolatami PRRSV, który to peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą miejscu konserwowanemu PRRSV białka N, przy czym to miejsce konserwowane jest wybrane z VNQLCQLLGA lub VNQLCQMLGK lub sekwencji amiokwasowej przy czym reszty tej sekwencji aminokwasowej zostały zastąpione konwencjonalnie lub zgodnie z wskazówkami mapowania zastą pień .
PL 197 057 B1
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało reaktywne z peptydem według wynalazku zdefiniowanym powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także test diagnostyczny do wykrywania lub identyfikacji przeciwciał skierowanych przeciw izolatowi PRRSV, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jeden peptyd jak zdefiniowano w powyżej wraz z odpowiednimi środkami do wykrywania.
Następnie przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny do wykrywania lub identyfikacji przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi pochodzącemu od izolatu PRRSV, charakteryzujący się tym, że zawiera przeciwciało według wynalazku zdefiniowane powyżej wraz z odpowiednimi środkami do wykrywania.
Sztuczne zmiany lub substytucje reszt aminokwasowych, które utrzymują antygeniczność (jak np. określone przez reaktywność z serami poliklonalnymi lub Mab), a więc funkcjonalność miejsca antygenowego można łatwo uzyskać z sekwencji, o których wiadomo, że stanowią miejsce antygenowe konkretnego izolatu i może to wykonać osoba przeciętnie wyspecjalizowana w technice planowania i syntezy peptydów. Przykładowo, pewne reszty aminokwasowe można konwencjonalnie zamienić na inne o porównywalnym charakterze, np. reszty zasadowe na inne reszty zasadowe, kwasowe na kwasowe, przestrzenne na przestrzenne, hydrofobowe lub hydrofilowe na inne hydrofobowe lub hydrofilowe i tak dalej. Możliwe są także inne mniej konwencjonalne lecz bardziej specyficzne zmiany, które utrzymują lub nawet polepszają antygeniczność wybranej sekwencji. Takie zmiany można np. wykonać z użyciem technik mapowania substytucji lub zamiany aminokwasów w oparciu o PEPSCAN (van Amerongen i in., Peptide Research (1992) 5, 269-274). W skrócie, reszty aminokwasowe wewnątrz miejsc antygenowych opisywanych w wynalazku można np. zamienić konwencjonalnie lub pod przewodnictwem mapowania zamiany, przez co uzyskane sekwencje peptydowe są funkcjonalnie równoważne miejscom antygenowym. Zamieniane aminokwasy mogą być albo resztami L- albo D. Poza tym, sekwencje aminokwasowe opisywane przez wynalazek czyni się nawet bardziej immunogenicznymi przez sprzężenie z adjuwantami (takimi jak KLH) znanymi w technice. Dodatkowo, peptydy czyni się nawet bardziej immunogenicznymi przez wykonanie peptydów z jedną (tak jak peptydy tandemowe) lub więcej powtórzonych sekwencji lub przez polimeryzację albo cyrkulizację.
Mimo, że ukazano wcześniej, że białko N jest immunogeniczne (Meulenberg (1995), J. Glin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, GB 2 289 279 A) oraz że istnieją zakonserwowane i niezakonserwowane regiony między białkiem N szczepów europejskich (LV) i szczepów amerykańskich (VR2332) (WO 96/04010), pokazujemy w niniejszym po raz pierwszy, które zakonserwowane i nie zakonserwowane regiony są antygeniczne i które można stosować indywidualnie lub w połączeniach jako antygeny do immunizacji lub prób diagnostycznych. Ponadto, określa się w niniejszym, że regiony antygeniczne w białku N składają się zarówno z epitopów liniowych jak i zależnych od konformacji.
Białko GP4 jest pierwszym białkiem strukturalnym o około 40 aminokwasach, które jak wykazano, wywołuje przeciwciała mogące neutralizować wirusa. Zidentyfikowano specyficzny region o około 40 aminokwasach i określono, że powinien być eksponowany na powierzchni wirionu jako cel dla przeciwciał neutralizujących, które następnie zapobiegają zakażeniu wirusem komórek. Jest to ekscytujące nowe odkrycie, ponieważ uważa się generalnie, że białko GP5, główne strukturalne PRRSV jest najważniejszym kandydatem związanym z przyłączaniem komórki gospodarza.
Wynalazek zapewnia główne miejsce antygenowe, miejsce neutralizujące na GP4 PRRSV. Wynalazek zapewnia lokalizację głównego miejsca neutralizacji ważnego dla planowania skutecznych szczepionek markerowych, które obejmują rdzeniowe sekwencje aminokwasowe raz sekwencje aminokwasowe, oskrzydlające sekwencje rdzeniowe izolatów PRRSV, które to sekwencje obejmują miejsce neutralizacji na białku ORF4 PRRSV. Przez wprowadzenie omawianych sekwencji miejsca neutralizacji do różnych typów szczepionek, możliwa jest specyficzna indukcja przeciwciał neutralizujących u szczepionych świń. Zabite szczepionki wykonuje się tak, aby indukowały możliwe do zmierzenia przeciwciała neutralizujące. Zwłaszcza sekwencje położone w pozycjach w białku kodowanym przez ORF4 PRRSV, odpowiadającym tym, które odkryto w pobliżu aminokwasu 40 do 79 jakie znaleziono w izolacie PRRSV I-1102, obejmują miejsce neutralizacji. Ponadto, wybrane sekwencje peptydowe wykonuje się tak, że są nawet bardziej immunogeniczne, przez mieszanie peptydów z adjuwantami lub innymi nośnikami znanymi w technice. Tak otrzymane kompozycje peptydowe stosuje się jako szczepionki. Jednakże, do układów wektorowych szczepionki wprowadza się także wybrane sekwencje peptydowe, obejmujące miejsce neutralizacji, przy czym są one albo różnymi rekombinowanymi wektorami, pochodzącymi od heterologicznych wirusów lub bakterii, lecz wybrane sekwencje peptydowe są także selektywnie wprowadzane do wirusów wektorowych PRRSV lub szczepionek od nich pochodzących.
PL 197 057 B1
Sekwencje aminokwasowe położone w pozycjach odpowiadających od około 52 do 75 stanowią szczególnie reaktywne miejsce neutralizacji. Inne miejsca neutralizacji zapewnione przez wynalazek można znaleźć wśród różnych izolatów PRRSV znanych lub odkrywanych (patrz np. pod względem części doświadczalnej tego opisu). Osoba pracująca w dziedzinie biologii molekularnej łatwo porówna sekwencje, zawierające miejsce neutralizacji zapewnione przez wynalazek z sekwencjami aminokwasowymi z białka kodowanego przez ORF4 jeszcze innego izolatu PRRSV.
Wynalazek zapewnia także sekwencje peptydowe PRRSV, które ulepszają testy diagnostyczne, przy czym są to testy wykrywające antygen lub przeciwciało. Wynalazek zapewnia różne grupy miejsc antygenowych, które stosuje się pojedynczo lub w połączeniu z testami diagnostycznymi. W ten sposób wynalazek zapewnia testy diagnostyczne, które służą różnym potrzebom, istniejącym w tej dziedzinie pod względem diagnozy i diagnozy różnicującej. Interakcje antygen-przeciwciało zawsze powoduje interakcje reaktywne krzyżowo epitop-paratop sekwencji aminokwasowych o długości od 5 do 15 aminokwasów. Tak więc wynalazek zapewnia sekwencje aminokwasowe do długości 5 do 15 aminokwasów i częściowo lub całkowicie zachodzące na sekwencje rdzeniowe miejsc antygenowych według wynalazku, do wprowadzania do testów diagnostycznych. Te sekwencje peptydowe stosuje się do selekcji lub planowania antygenu lub substancji antygenowej, zawierającej sekwencje w stosowanym teście. Alternatywnie, wynalazek zapewnia też syntetyczne przeciwciała reagujące z miejscami antygenowymi zapewnionymi przez wynalazek. Miejsca te lub sekwencje pokrewne reagują z syntetycznym przeciwciałem otrzymanym z układów, takich jak biblioteki obrazujące faga lub selekcja klonalna przeciwciał (łańcucha ciężkiego), które stanowią cząsteczki podobne do przeciwciał, mogące łatwo ulegać ekspresji w heterologicznych układach ekspresji.
Jedna grupa opisywana przez wynalazek obejmuje sekwencję peptydową, odpowiadającą wymienionemu miejscu neutralizacji, jakie już objaśniono powyżej. Testy diagnostyczne, zawierające to miejsce i/lub przeciwciała specyficznie skierowane przeciw temu miejscu, wykrywają przeciwciała u świni.
Inną grupą opisaną przez wynalazek jest zakonserwowane miejsce antygenowe na białku N. Wewnątrz zakonserwowanego miejsca antygenowego, wynalazek zapewnia sekwencję rdzeniową VNQLCQLLGA lub VNQLCMLGK. Testy diagnostyczne, zawierające to miejsce i/lub przeciwciała specyficznie skierowane przeciw temu miejscu, wykrywają te przeciwciała u świń, które specyficznie reagują z większością izolatów PRRSV. Zapewnia się także testy diagnostyczne, które stosują przeciwciała skierowane przeciw zakonserwowanemu miejscu, w celu wykrycia antygenu PRRSV, pozwalając przez to na detekcję przez test izolatów PRRSV, bez względu na ich pochodzenie.
Inną grupą zapewnioną przez wynalazek jest nie zakonserwowane różnicujące miejsca antygenowe na białku N. Testy diagnostyczne, obejmujące to miejsce i/lub przeciwciała specyficznie skierowane przeciw temu miejscu, wykrywają te przeciwciała u świń, które specyficznie reagują z różnymi izolatami PRRSV, przez co np. szczepione świnie można odróżnić od świń zakażonych PRRSV dzikiego typu. Zapewnia się także testy diagnostyczne, które stosują przeciwciała skierowane przeciw nie zakonserwowanemu miejscu, w celu detekcji antygenu PRRSV, pozwalając przez to na odróżnienie przez test różnych izolatów PRRSV. Wewnątrz jednego takiego nie zakonserwowanego miejsca, wynalazek zapewnia sekwencje rdzeniową PRGGQAKKKK lub PRGQAKRKK lub PRGGQAKKRK lub GPGKKNNKKKN lub GPGKKNKKT lub GPGKKNRKKN lub GPGKKFKKKN lub GPGKKIKKKN lub GPQINKKIN. Wewnątrz innego nie zakonserwowanego miejsca, wynalazek zapewnia sekwencję rdzeniową MAGKNQSQKK lub MPNNNGKQTE lub MPNNNGKQPK lub MPNNNGKQQK lub MPNNNGKQQN lub MPNNNGKQQK lub MPNNNGRQQK. Także, sztuczne zmiany, utrzymujące antygeniczność, a więc funkcjonalność powyższych sekwencji rdzeniowych w białku GP4 lub N, może łatwo wprowadzić osoba wyspecjalizowana w technice planowania i syntezy peptydów, jak opisano powyżej.
Wynalazek opisuje także grupę, obejmującą epitopy konformacyjne (mogące różnić się bardzo wśród różnych izolatów), które można znaleźć w pozycjach, odpowiadających pozycjom odkrytym w izolacie I-1102 od pozycji aminokwasowej 51 do około 68 (w sekwencji rdzeniowej PKHFPLAAEDDIRHHL izolatu I-1102) lub od 79 do około 90 (w sekwencji rdzeniowej SIQTAFNQGAGT izolatu I-1102) lub od 11 do 124 (w sekwencji rdzeniowej HTVTLIRVTSTSAS izolatu I-1102) na białku N. Zakonserwowane i nie zakonserwowane oraz różnicujące i konformacyjne miejsca w białku N, które to miejsca opisuje wynalazek, zapewniają testy diagnostyczne, które niedwuznacznie diagnozują zakażenia PRRSV. Testy wykonuje się tak, aby unikały stosowania miejsc nie zakonserwowanych, unikając przez to wyników fałszywie ujemnych. Oprócz tego, stosuje się różne miejsca nie zakonserwowane w ulepszaniu testów różnicujących, które mogą, np. odróżniać świnie szczepione od świń zakażonych izolatami dzikiego typu PRRSV. Ponownie, jak mówiono, każda osoba pracująca w dziedzinie
PL 197 057 B1 biologii molekularnej łatwo uszereguje sekwencje, zawierające zakonserwowane lub nie zakonserwowane albo konformacyjne miejsca epitopowe z sekwencjami aminokwasowymi białka kodowanego przez ORF 7 jeszcze innego izolatu PRRSV. Miejsca zapewnione przez wynalazek stosuje się w nowych parach testów diagnostycznych, odróżniających szczepionki, do użytku w programach zwalczania PRRSV.
Część doświadczalna
Komórki i wirusy
Szczep Ter Huurne (CNCM I-1102) PRRSV wyizolowano w 1991 (Wensvoort i in., 1991). Szczep amerykański ATCC-VR2332 wyizolowano przez Benfield i in. (1992). Szczep NL1 (Holandia, 1991) wyizolowano w naszym laboratorium, szczep NY2 (Anglia, 1991) dostarczono dzięki uprzejmości T.Drew, szczep DEN (Dania, 1992) dostarczono dzięki uprzejmości A.Botner, szczep LUX (Luksemburg, 1992) dostarczono dzięki uprzejmości Losch SPA1 i SPA2 (Hiszpania, 1992) dostarczono dzięki uprzejmości odpowiednio Shokouhi i Espuna, oraz szczep FRA (Francja, 1992) dostarczono dzięki uprzejmości Y. Leforban.
PRRSV i VR2332 hodowano na komórkach CL2621 jak opisano wcześniej (van Nieuwstadt i in., 1996). Siedem róż nych izolatów europejskich hodowano w ś wiń skich makrofagach pę cherzykowych. Makrofagi utrzymuje się jak opisano wcześniej (Wensvoort i in., 1991). Komórki BHK-21 utrzymuje się w Dulbecco's Minimal Essential Medium uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. Do doświadczeń transfekcji, komórki BHK-21 hoduje się w Glasgow Minimal Essential Medium (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd).
Antysurowice
Świńską surowicę 21 anty-PRRSV i królicze surowice antypeptydowe 698 i 700 stosowano w poprzedzają cych doś wiadczeniach. Surowica 700 jest skierowana przeciw aminokwasom 106 do 122 (CLFYASEMSEKGFKVIF) kodowanych przez ORF4 PRRSV i uzyskano je od królika. Wytwarzanie i charakteryzację Mab opisano (van Nieuwstadt i in., 1996). Hybrydomy uzyskano od pięciu następujących po sobie doświadczeń fuzyjnych i skierowano przeciw białku ORF4 (Mab 121,4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28) lub białku ORF 7 (Mab 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138.22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17). Mab WBE otrzymano dzięki uprzejmości Dr. Benfield, South Dakota, US.
Konstrukcje plazmidowe
Dwa oligonukleotydy położone w górę (PRRSV13) i w dół (PRRSV14) ORF4 użyto wcześniej do powielenia i klonowania ORF4 izolatu I-1102 w pGEM-4Z przy użyciu Miejsc BamHI i Hindlll wprowadzonych w primerach (Meulenberg i in., 1995). Otrzymany plazmid nazwano pABV209. Dwa oligonukleotydy położone w podobnej pozycji pod względem kodonu inicjacji (PRRSV4) i kodonu terminacji (PRRSV5) ORF4 VR2332, użyto do powielenia ORF4 VR2332 za pomocą RT-PCR, zgodnie z opisem we wcześniejszych badaniach. Fragment PCR trawiono BamHI i częściowo Hindlll ponieważ ORF4 VR2332 zawiera wewnętrzne miejsce Hindlll, oraz klonowano w pGEM-4Z, uzyskując plazmid pABV270. Rekombinowane techniki DNA przeprowadzono zasadniczo według opisu w Sambrook i in., (Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, NY, 1989). Sekwencja nukleotydowa VR2332 ORF4 w pABV270 określona na automatycznym sekwenatorze DNA (Applied Biosystems), była identyczna z sekwencją publikowaną (Mutaugh i in., Aren. Virol. 140: 1451-1460, 1995). Następnie, ORF4 z I-1102 i VR2332 przeniesiono do wirusowego wektora ekspresji Semliki Forest pCFV1. pABV209 i pABV270 trawiono BamHI i Hindlll (częściowo dla pABV270), fragmenty ORF4 traktowano polimerazą Klenowa (Pharmacia) aby stworzyć lepkie końce, i poddano je ligacji w miejscu Smal pSFV1, defosforylowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną (Pharmacia). Plazmidy, zawierające ORF4 z I-1102 (pABV265) i VR2332 (pABV271) w prawidłowej orientacji testowano dodatkowo pod względem ekspresji białka GP4. Poza tym wykonano cztery różne chimeryczne geny ORF4 I-1102 i VR2332. Sekwencję nukleotydową ORF4, kodującą aminokwasy 1 do 39 białka GP4 VR2332 powielono z plazmidu pABV270 z użyciem oligonukleotydów PRRSV4 i PRRSV6. Uzyskany fragment trawiono BamHI i SacII. Fragment ten poddano ligacji w pABV209 trawiono BamHI i SacII, aby utworzyć fuzję w ramce mię dzy aminokwasami 1 do 39 białka GP4 VR2332 i 40 do 183 białka GP4 I-1102 w pABV306. Sekwencję nukleotydową ORF4, kodującą aminokwasy 1 do 75 GP4 YR2332 powielono z użyciem oligonukleotydów PRRSV4 i PRRSV9 (patrz tabela 2). Fragment ten trawiono KpnI i BamHI. Sekwencję nukleotydową ORF4, kodującą aminokwasy 80 do 183 I-1102 białka GP4 powielono z PRRSV46 i PRRSV14 i powielony fragment trawiono KpnI i BamHI. Oba fragmenty poddano ligacji razem w pGEM-4Z trawionym BamHI i Hindlll, uzyskując plazmid pABV308. W ten sam sposób utworzono konstrukcję komplementarną w pABV314, składającą się z sekwencji nuklePL 197 057 B1 otydowej, kodującej aminokwasy 1 do 79 I-1102 białka GP4 powielonej z PRRSV13 i PRRSV57 poddanej ligacji z fragmentem, kodującym aminokwasy 76 do 178 YR2332, który powielono z PRRSV10 i PRRSV5, w pGEM-4Z. Czwarta konstrukcja chimeryczna składała się z fragmentu, kodującego aminokwasy 40 do 79 PRRSV białka GP4 połączonego z fragmentami, kodującymi aminokwasy 1 do 39 i aminokwasy 76 do 178 białka VR2332 GP4. Osiągnięto to przez ligację fragmentu BamHI/SacII ORF4 z pABV270 i fragmentu SacII/Hindlll ORF4 z pABV314 w pGEM-4Z trawionego BamHI i Hindlll. Plazmid oznaczono pABV325. Plazmidy pABV306, pABV308, pABV314 i pABV325 sprawdzono pod względem prawidłowej sekwencji, przez sekwencjonowanie oligonukleotydowe. Chimeryczne geny przeniesiono z pABV306, pABV308, pABV314 i pABV325 do PSFVI, identycznego jak opisano powyżej dla genów ORF4 z VR2332 i PRRSV, uzyskując pABV296, pABV305, pABV321 i pABV326, odpowiednio (fig. 3).
Dwa oligonukleotydy położone w górę (LV108: 5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') oraz w dół (LV112: 5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3') ORF7, użyto do powielenia i klonowania genu ORF7 w pGEM-T, otrzymując pABV431. Sekwencje i pozycję tych i innych oligonukleotydów użytych do powielenia fragmentów ORF7, wymieniono w tabeli 1. Poza tym, wykonano cztery różne chimeryczne konstrukcje, przez mutagenezę kierowaną PCR. Sekwencje, kodujące dla aminokwasów 25-26, 28-30 (miejsce B; fig. 3) podstawiono odpowiadającymi sekwencjami białka N EAV. Osiągnięto to przez powielenie PCR ORF7 z LV108 i LV134 (5' TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAAGTCC 3'). Zmutowany fragment DNA wprowadzono do pABV431 przy użyciu miejsca MscI i PacI, w wyniku czego uzyskano pABV455. Region ORF7, kodujący aminokwasy 51 do 67 podstawiono odpowiadającym regionem LDV ORF7. pABV431 trawiono EcoNI i ClaI i poddano ligacji z fragmentem PCR wytworzonym za pomocą primerów LV98 (5'CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTCCCATGGCTGGTCCATCTGAC 3') oraz LB99 (5'CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC 3'), trawiono tymi samymi enzymami. Plazmid ten oznaczono pABV643. Region ORF7, kodujący aminokwasy 80 do 90 podstawiono odpowiadającym regionem genu LDV ORF7. Gen ORF7 LV zmutowano w PCR za pomocą primerów LV101 (5' GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTCATCCA 3') oraz LV112. Otrzymany fragment trawiono NarI i PacI i poddano ligacji z pABV431 trawionym ClaI i PacI. W wyniku tego otrzymano pABV453. Ostatecznie, region, kodujący C-terminalną część białka N (aminokwasy 111-128) zamieniono na sekwencje, kodującą odpowiadające aminokwasy białka N LDV. Gen ORF7 powielono za pomocą primerów LV108 i LV102 (5' ATGTCCCGGGCTAAG-CGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG 3') i klonowano w wektorze pGEM-T, który dał pABV456. Geny ORF7 dzikiego typu i zmutowane wycięto z pABV431, pABV453, pABV455 i pABV463 przez trawienie PacI (lepkie końce) oraz Hpal i z pABV456 przez trawienie Hpal i Swal. Geny te wprowadzono następnie do defosforylowanego miejsca Smal wirusowego wektora ekspresji Semliki forest pSFV1. Plazmidy pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 i pABV471, zawierające odpowiadające geny ORF7 w prawidłowej orientacji, testowano dodatkowo pod względem ekspresji białka N. Transkrypcja i transfekcja in vitro RNA ORF7 wirusa Semliki forest była taka jak opisano powyżej dla konstrukcji SFV-ORF4.
Aby sklonować geny ORF4 siedmiu różnych europejskich izolatów, makrofagi zakażono NL1,
NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2 i LUX, a RNA wyizolowano jak opisano u Meulenberg i in., (1993). Geny ORF4 powielono za pomocą RT-PCR z użyciem oligonukleotydów PRRSV13 i PRRSV14, i klonowano z BamHI i Hindlll w pGEM-4Z. Dla każdego szczepu, określono sekwencję nukleotydową ORF4 dwóch klonów pochodzących z dwóch niezależnych PCR. Sekwencje białka pochodzące od sekwencji nukleotydowej uszeregowano przy użyciu programu do wielokrotnego uszeregowania sekwencji CLUSTAL PCGene (Intelligenetics Tm).
Transkrypcja i transfekcja in vitro RNA SFV-ORF4.
Plazmidy pSFV1, zawierające różne konstrukcje ORF4 linearyzowano przez trawienie Spel i poddano transkrypcji in vitro. Syntetyzowany RNA transfekowano do komórek BHK-21 w 15 mm studzienkach dwudziestocztero-studzienkowych płytek, przy użyciu lipofektyny. Komórki utrwalono lodowatym 50% (objętościowo) metanolem/acetonem i białko GP4, którego ekspresja zachodziła w róż nych konstrukcjach ORF4 barwiono Mab w próbie jednowarstwowej z immunoperoksydazą (IPMA). Aby zanalizować produkty ekspresji ORF4 przez immunoprecypitację, 107 komórek BHK-21 transfekowano 10 μg RNA SFV-ORF4 poddanym transkrypcji in vitro, przez elektroporację. Komórki poddane elektroporacji powleczono w trzech 35 mm studzienkach sześcio-studzienkowych płytek i 18 godzin po transfekcji komórki oznakowano.
PL 197 057 B1
Metoda pepscan
Pełny zbiór nakładających się nonapeptydów lub dodekapeptydów syntetyzowano z aminokwasów pochodzących od sekwencji ORF4 lub ORF7 PRRSV, jak określono poprzednio (Meulenberg i in., 1993). Syntezę peptydów w fazie stałej na prętach polietylenowych i immunoskrining z użyciem rodzaju analizy testu immunoabsorpcyjnego sprzężonego z enzymem (ELISA), przeprowadzono zgodnie z ustalonymi procedurami PEPSCAN (Geysen i in., PNAS, 81, 3998-4002, 1984).
Wyniki
Opisaliśmy wcześniej panel neutralizujących Mab, które reagowały z białkiem PRRSV o 31 do 35 kDa, oznaczonym GP4, oraz panel Mab reaktywnych z białkiem N, przez analizę Western immunoblot. Okazało się, że GP4 jest strukturalną glikoproteiną kodowaną przez ORF4, N okazał się być białkiem nukleokapsydowym kodowanym przez ORF7. W doświadczeniach immunoprepicytacji z użyciem Mab specyficznych wobec GP4, białko GP4 pochodzące z lizatów komórek zakażonych PRRSV, migrowało w postaci oddzielnej wstęgi o 28 kDa razem z jasną plamą o nieco większym widocznym ciężarze cząsteczkowym. Mab spowodowały immunoprecypitację rozległego (glikozylowanego) białka GP4 o około 31 kDa ze środowiska zewnątrzkomórkowego zakażonego PRRSV lecz nie ze środowiska zewnątrzkomórkowego komórek zakażonych pozornie.
Identyfikacja neutralizujących domen w GP4.
Pokazaliśmy wcześniej, że Mab specyficzne dla białka GP4 rozpoznawały I-1102 lecz nie izolat amerykański VR2332 (van Nieuwstadt i in., 1996). W celu identyfikacji domeny wiązania neutralizujących Mab w białku GP4, wykonaliśmy białka fuzyjne białka GP4 I-1102 i VR2332. Białka te podlegały ekspresji w wirusowym wektorze ekspresji Semliki Forest, wykorzystanym przez Liljestrom i in., (Biotechnol., 9, 1356-1362, 1991). Najpierw klonowano ORF4 I-1102 w pSFV1, otrzymując plazmid pABV265 (fig. 1). RNA transkrybowane z pABV265 transfekowano do komórek BHK-21 i 24 godziny po transfekcji, komórki barwiono dodatnio panelem piętnastu neutralizujących Mab. Mab nie reagują z komórkami BHK-21 transfekowanymi RNA pSFV1. Rekombinowane białko GP4 poddano immunoprecypitacji za pomocą Mab 126.1 z komórek BHK-21 znakowanych L- [35S]-metioniną, transfekowanych RNA pABV265. Miało ono podobną wielkość jak autentyczne GP, białko syntetyzowane w komórkach CL2621 zakażonych I-1102, a także zawierało N-glikany wrażliwe wobec PNGazy i EndoH. Białko GP4 z VR2332 klonowano także w pSFV1, lecz białko to nie zostało rozpoznane przez Mab podczas ekspresji w komórkach BHK-21 (fig. 1). Aby dodatkowo zlokalizować region w GP4 rozpoznawany przez Mab, skonstruowano cztery geny chimeryczne ORF4 I-1102 i VR2332 w pSFV1 (fig. 1). RNA transkrybowany z plazmidów pABV296, pABV305, pABV321 i pABV326 transfekowano do komórek BHK-21 i testowano przez IPMA reaktywność białek ulegających ekspresji, z Mab specyficznymi wobec GP4. Wzór reakcyjny tych piętnastu Mab był identyczny i wskazywał, że te Mab były skierowane do regionu o 40 aminokwasach w białku GP4. Produkt ekspresji pABV326, składający się z aminokwasów 40 do 79, pochodzący od białka GP4 izolatu CNCM I-1102 i otoczonych przez sekwencje pochodzące od białka GP4 VR2332, był wciąż rozpoznawany przez panel Mab. Aby upewnić się, że różne białka GP4, zwłaszcza te, które nie zostały rozpoznane przez Mab, ulegały prawidłowej ekspresji w komórkach BHK-21, poddano je immunoprecypitacji z lizatów komórek BHK-21, które transfekowano RNA transkrybowanym in vitro z plazmidów pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 i pABV326. Immunoprecypitację przeprowadzono ze świńską surowicą 21 anty-PRRSV, Mab 126.1 oraz surowicami antypeptydowymi 698 i 700. Surowica 700 jest skierowana przeciw aminokwasom 106-122 białka GP4 PRRSV izolatu CNCN I-1102, którego sekwencja jest identyczna w białku GP4 izolatu ATCC-VR2332, oprócz aminokwasu 121. Zatem wszystkie białka GP4 poddano immunoprecypitacji z surowicą 700. Były one niemożliwe do odróżnienia pod względem wielkości podczas analizy przez SDS-PAGE, z wyjątkiem białek GP4, których ekspresję wykazywały pABV305 i pABV271, które migrowały nieco szybciej. Jest to prawdopodobnie spowodowane delecją 4 aminokwasów w sekwencji VR2332 w stosunku do sekwencji I-1102, między aminokwasami 62-64 (fig. 3). Pełny zbiór Mab specyficznych wobec GP4 rozpoznawał białka GP4, których ekspresję wykazywały pABV265, pABV296, pABV321, pABV326, lecz nie te o ekspresji z pABV305 i pABV321, które potwierdziły wyniki uzyskane przez IPMA (fig. 3). Surowica 698 ma taki sam profil reakcji jak Mab. Surowica 698 jest skierowana przeciw aminokwasom 62 do 77 GP4 PRRSV, które są położone wewnątrz obecnie zidentyfikowanej domeny neutralizacji białka GP4. Region ten jest wysoce heterogeniczny w ORF4 VR2332, a zatem produkty ekspresji, zawierające sekwencje VR2332 w tym regionie nie były rozpoznawane przez te surowicę. Jednakże, neutralizujące poliklonalne surowice świńskie rozpoznają białko GP4 I-1102 i chimeryczne białka GP4 oraz białko GP4 VR2332, wskazując, że w świńskich suPL 197 057 B1 rowicach anty-PRRSV obecne są różne neutralizujące przeciwciała skierowane przeciw miejscu neutralizacji utworzonym przez aminokwasy 40 do 79 białka GP4.
Pepscan białka ORF4 i ORF7.
Ponieważ wszystkie piętnaście Mab reaktywnych z białkiem ORF4 reagowało z białkiem Gp4 w analizie western blot, oczekiwano, że rozpoznają liniowy epitop w regionie, obejmującym aminokwasy 40 do 79 GP4 izolatu I-1102. W celu dodatkowego zmapowania regionu wiążącego Mab, przeprowadzono analizę PEPSCAN, przy użyciu nakładających się nonapeptydów lub dodekapeptydów w tym regionie. Peptydy uznano za reprezentują ce miejsca antygenowe jeś li piki w takim zbiorze w sposób powtarzalny osiągały wię cej niż dwa razy tło. Mab 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7, 138-28 reagowały dodatnio z jednym specyficznym miejscem antygenowym, składającym się z aminokwasów 59 do 67 (SAAQEKISF) (fig. 2). Mab 122-12 reagowało jedynie słabo z tym miejscem antygenowym, podczas gdy pozostałe 7 Mab było ujemnych w analizie PEPSCAN. Poliklonalne surowice świńskie także zidentyfikowały to miejsce w PEPSCAN. Neutralizująca surowica 21, pobrana 6 tygodni po zakażeniu świni 21 PRRSV, reagowała silnie i szeroko z miejscem oraz jego regionami oskrzydlającymi. Oprócz tego, świńskie surowice poliklonalne (va12 i va14) pobrane 54 dni po szczepieniu wirusem wektorowym PRV-ORF4 i przy uboju 30 dni po prowokacji PRRSV w dniu 54, reagowały silnie i szerzej z miejscem neutralizują cym identyfikowanym w PEPSCAN.
W izolacie I-1102, sekwencja rdzeniowa miejsca neutralizują cego obejmuje sekwencje aminokwasową SAAQEKISF położoną od pozycji aminokwasu 59-67. W innych izolatach sekwencję rdzeniową można znaleźć przy, lub wokół odpowiadającej pozycji aminokwasowej, będącą sekwencją aminokwasową, odpowiadającą miejscu neutralizującemu białka GP4, obejmującemu np. sekwencje takie jak SAAQEEISF lub STAQENISF albo STAQENIPF lub SEESQSVT albo SASEAIR, albo SASEAFR, albo PAPEAFR albo PAPEAIR lub SAFETFR, lub STSEAFR, lecz oczekuje się, że inne izolaty PRRSV mają odpowiadające lecz nieco inne sekwencje rdzeniowe miejsca neutralizującego położonego przy, lub wokół pozycji aminokwasowej, odpowiadającej aminokwasom 59-67 sekwencji aminokwasowej ORF4 izolatu I-1102 PRRSV. Można także łatwo wprowadzić sztuczne zmiany, które utrzymają antygeniczność, a więc funkcjonalność powyższych sekwencji rdzeniowych, będąc osobą średnio wyspecjalizowaną w technice planowania i syntezy peptydów. Także, jak jest jasno pokazane przez znacznie szerszą reaktywność w PEPSCAN neutralizujących surowic poliklonalnych, sekwencje aminokwasowe, obejmujące sekwencje aminokwasowe rdzenia i sekwencje aminokwasowe, oskrzydlające sekwencje rdzeniowe różnych izolatów PRRSV dodatkowo stanowią miejsce neutralizacji na białku ORF4 PRRSV. Zwłaszcza sekwencje położone w pozycjach, odpowiadających aminokwasom w przybliż eniu 40 dp 79 stanowią miejsce neutralizacji (fig. 1). Ponownie, moż na ł atwo wprowadzić sztuczne zmiany, które utrzymają antygeniczność, a więc funkcjonalność powyższych sekwencji rdzeniowych, będąc osobą średnio wyspecjalizowaną w technice planowania i syntezy peptydów. Także, biorąc pod uwagę szeroką reaktywność poliklonalnych surowic neutralizujących va12 i va14 (fig. 2), sekwencje aminokwasowe położone w pozycjach, odpowiadających aminokwasom od około 52 do 75 konkretniej stanowią szeroko reaktywne miejsce neutralizacji.
Mab skierowane przeciw białku ORF7 reagowało w czterech różnych grupach w PEPSCAN, grupie A(4), B(2), C(3) i D(1). Grupa 1(D) (w której między innymi Mab 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17 i obejmujące zakonserwowane i nie zakonserwowane miejsca reaktywne) reagowała z epitopem konformacyjnym w sposób nie wykrywalny w PEPSCAN. Grupa 2 (B) (w której między innymi 125.1, 126.9, NS95 i NS99 oraz reaktywne ze wszystkimi testowanymi izolatami PRRSV, identyfikujące w ten sposób zakonserwowane miejsce antygeniczne) identyfikuje sekwencję rdzeniową VNQLCQLLGA (znalezioną w izolacie I-1102 od pozycji aminokwasowej 22 do około 32) lub VNQLCQMLGK. Grupa 3 (C) (w której między innymi Mab 126.15 i głównie reaktywne ze szczepami PRRSV wyizolowanymi w Europie, identyfikując w ten sposób różnicujące miejsce antygeniczne) identyfikuje sekwencją rdzeniową PRGGQAKKKK (znalezioną w izolacie I-1102 od pozycji aminokwasowej 41 do około 50) lub PRGGQAKRKK lub PRGGQAKKRK albo GPGKKNKKKN lub GPGKKNKKKT lub GPGKKNRKKN lub GPGKKFKKKN lub GPGKKIKKKN lub GPGQINKKIN. Grupa 4 (A) (w której mię dzy innymi Mab 138.22 i gł ównie reaktywny ze szczepami PRRSV wyizolowanymi w Europie, identyfikujący w ten sposób różnicują ce miejsce antygeniczne) identyfikuje sekwencje rdzeniowa MAGKNQSQKK (znaleziona w izolacie I-1102 od pozycji aminokwasowej 1 do około 10) lub MPNNNGKQTE lub MPNNNGKQPK albo MPNNNGKQQK albo MPNNNGKQQN lub MPNNNGKQQK lub MPNNNGRQQK. Także, można łatwo wprowadzić sztuczne zmiany, które utrzymają antygeniczność, a więc funkcjonalność powyższych sekwencji rdzeniowych, będąc osobą śred10
PL 197 057 B1 nio wyspecjalizowaną w technice planowania i syntezy peptydów. Mimo, że grupa 1 nie stanowi epitopów liniowych, porównanie sekwencji aminokwasowych PRRSV z sekwencjami LDV ukazuje, że epitopy konformacyjne (które różnią się bardzo wśród innych izolatów) można znaleźć w pozycjach, odpowiadających tym znalezionym w izolacie I-1102 od pozycji aminokwasowej 51 do około 68 (w sekwencji aminokwasowej izolatu I-1102 PKPHFPLAAEDDIRHHL) lub od 79 do około 90 (w sekwencji aminokwasowej izolatu I-1102 SIQTAFNQGAGT) albo od 111 do 124 (w sekwencji aminokwasowej izolatu I-1102 HTVRLIRVTSTSAS). Także, można łatwo wprowadzić sztuczne zmiany, które utrzymają antygeniczność, a więc funkcjonalność powyższych sekwencji rdzeniowych, będąc osobą średnio wyspecjalizowaną w technice planowania i syntezy peptydów, zwłaszcza z informacją zebraną przez porównanie sekwencji izolatów PRRSV, oraz przez porównanie z sekwencjami białek N innych Arteriviridae. Określono to w ekspresji chimerycznych białek LDV/PRRSV ORF7 w układzie ekspresji SFY (wykonanym jak powyżej dla ORF4) i określeniu ich reaktywności z Mab z grupy 1.
Chimeryczne białka N
Domenę D zmapowano dodatkowo konstrukcjami chimerycznych białek N o ekspresji ORF7. Ponieważ 6 z 10 Mab skierowanych przeciw domenie D rozpoznawało zarówno europejskie jak i północnoamerykańskie izolaty PRRSV, zmutowano regiony, które były najbardziej zakonserwowane między białkami LV i północnoamerykańskim prototypem VR2332 (fig. 4). Sekwencję nukleotydową kodującą dla aminokwasów 51 do 67, 80 do 90 i 111 do 128 podstawiono sekwencją, która koduje odpowiadające aminokwasy LDV (fig. 4). W celu zakończenia zmutowano miejsce B (aminokwasy 25-30), które są także zakonserwowane w izolatach europejskim i północnoamerykańskim. Ponieważ sekwencja aminokwasowa białka N LV była bardzo podobna do sekwencji białka N LV w miejscu B, region ten białka N LV podstawiono regionem, kodującym odpowiadające aminokwasy białka N EAV (fig. 4). Po ekspresji zmutowanych i dzikiego typu białek N w komórkach BHK-21 przy użyciu wirusowego układu ekspresji Semliki forest i przetestowaniu ich z użyciem N-specyficznych Mab w IPMA, Mab specyficzne wobec D reagowały identycznie (tabela 1). Ich wiązanie było przerwane przez mutacje między aminokwasami 51-67 i 80-90, lecz nie przez mutacje między aminokwasami 111-128 lub aminokwasami 25-30 (miejsce B). Jak oczekiwano, białka N z sekwencjami LDV między aminokwasami 51-67 i 80-90 ulegały wciąż zabarwieniu przez Mab skierowane przeciw miejscom A, B i C. Jednakże, liczba zabarwionych komórek oraz jasność tego zabarwienia była mniejsza niż obserwowana dla białka N dzikiego typu i białek N zmutowanych przy aminokwasach 25-30 (miejsce B) lub aminokwasach 111-128 (tabela 1). Prawdopodobnie było to spowodowane niższą ekspresją białek N, zawierających mutacje między aminokwasami 51-67 lub 80-90, ponieważ niższa wydajność tych zmutowanych białek N w porównaniu z innymi białkami N uzyskiwaną przy translacji in vitro równych ilości transkryptów (dane nie ukazane). Jak oczekiwano, białko N, zawierające sekwencje EAV w miejscu B nie było rozpoznawane przez Mab zmapowane do miejsca B (w analizie pepscan), lecz wciąż było rozpoznawane przez Mab zmapowane do miejsc A, C lub domeny D. Dane te wskazują, że epitopy zmapowane do domeny D są zależne od konformacji i składają się (częściowo) z aminokwasów 51-67 i 80-90.
Analiza sekwencji białka GP4 różnych szczepów PRRSV.
Aby przeanalizować, czy główne miejsce neutralizacji antygenowej, rozpoznawane przez przeciwciała specyficzne wobec GP4, było zakonserwowane wśród różnych izolatów PRRSV, testowano dodatkowo reaktywność i aktywność neutralizacji Mab na siedmiu różnych szczepach europejskich. Wyniki wskazywały, że te Mab rozpoznawały inny szczep holenderski NL1 i szczep angielski NY, lecz nie duński izolat DEN, dwa szczepy hiszpańskie SPA1 i SPA2, izolat francuski FRA oraz LUX wyizolowany w Luksemburgu. Byliśmy zatem zainteresowani sekwencją aminokwasową w regionie miejsca neutralizacji białka GP4 tych izolatów. Geny ORF4 klonowano za pomocą RT-PCR przy użyciu primerów pochodzących od sekwencji PRRSV i określono sekwencje nukleotydową. Sekwencja aminokwasowa białka GP4 z różnych izolatów pochodzących od tej sekwencji nukleotydowej była w 86 do 97% identyczna z I-1102. Uszeregowanie tych sekwencji aminokwasowych pokazało, że miejsce neutralizacji (aminokwasy 40 do 79) jest znacznie bardziej rozbieżna niż pozostała część białka. W tym regionie, zwłaszcza sekwencje aminokwasowe szczepów DAN, SPA1, SPA2 i FRA, są różne. Jest to zgodne z odkryciem, że te szczepy nie są neutralizowane przez Mab specyficzne wobec I-1102 i potwierdza dalej, że to miejsce nie jest wysoko zakonserwowane wś ród izolatów europejskich. Inny region wysokiej heterogeniczności obserwowano w N-terminalnej części białka GP4. Porównanie sekwencji aminokwasowej białka GP4 PRRSV i sekwencji VR2332 i innych szczepów północnoamerykańskich, ukazuje, że te ostatnie są także heterogeniczne w miejscu neutralizacji białka. Uszeregowanie sekwencji aminokwasowych powoduje wprowadzenie przerwy w miejscu neutralizacji izolatów
PL 197 057 B1 północnoamerykańskich (fig. 3), która jest zgodna z obserwacją, że żaden z tych izolatów nie jest rozpoznawany przez Mab. Ogólnie, wyższą rozmaitość obserwowano wśród sekwencji izolatów amerykańskich niż wśród sekwencji izolatów europejskich. Jest to zgodne z cechami charakterystycznymi dla typowej otoczki wirusowej, identyfikowanej np. w sekwencji aminokwasowej GP4.
Moc miejsca neutralizującego jest bardzo ważna dla ulepszenia szczepionki ze względu na heterogeniczność miejsca neutralizacji. Porównanie sekwencji aminokwasowej białek GP4 różnych szczepów europejskich wskazywała, że miejsce neutralizacji było znacznie bardziej zmienne niż inne części białka, sugerując, że miejsce to jest wrażliwe na immunoselekcję. Porównanie sekwencji miejsca neutralizacji szczepów europejskich i północnoamerykańskich obrazowało przerwę o 4 aminokwasach w sekwencjach północnoamerykańskich w stosunku do europejskich, ilustrując dodatkowo wielką zmienność aminokwasów obecnie zidentyfikowanego miejsca neutralizacji PRRSV.
Miejsce neutralizacji w białku GP4 opisanym w niniejszym, jest pierwszym miejscem zidentyfikowanym dla wirusa Lelystada. Dla dwóch innych arteriwirusów, EAV i LDV, wszystkie neutralizujące Mab, które wyizolowano były skierowane przeciw białku G1/VP3 kodowanemu przez OFR5 (Deregt i in., 1994; Glaser i in., 1995; Balasuriya i in., 1995; Harty i Plagemann, 1998). Stosując mutanty unikające neutralizacji zmapowano miejsce neutralizacji EAV do specyficznych aminokwasów w ektodomenie G1.
Podobne porównania sekwencji wykonano dla białka ORF7 PORRSV (fig. 4), ilustrujące dodatkowo wielką zmienność aminokwasów obecnie zidentyfikowanego antygenowo zakonserwowanego miejsca oraz miejsc nie zakonserwowanych PRRSV. W tej pracy zidentyfikowaliśmy cztery różne miejsca antygenowe w białku N PRRSV. Trzy miejsca oznaczone A, B i C zawierają liniowe epitopy i zmapowano je mię dzy aminokwasami 2-12, 25-30 i 40-46, odpowiednio. Przeciwnie, cztery miejsca, oznaczone jako domena D, zawierają epitopy zależne od konformacji, które składają się (częściowo) z aminokwasów 51-67 i 80-90. Miejsca A i C zawierają epitopy zakonserwowane w europejskich lecz nie północnoamerykańskich izolatach PRRSV, podczas gdy miejsce D zawiera oba epitopy zakonserwowane i nie zakonserwowane w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV. Miejsca zakonserwowane w białku N opisanym w niniejszym, są niezwykle ważne dla ulepszania testów diagnostycznych, będących celem niedwuznacznej diagnozy infekcji PRRSV, testy te powinny unikać wykorzystywania miejsc nie zakonserwowanych unikając przez to fałszywie ujemnych wyników. Oprócz tego, wiedza na temat różnych miejsc nie zakonserwowanych jest bardzo wartościowa przy ulepszaniu testów różnicujących, które mogą np. odróżniać świnie szczepione od świń zakażonych izolatami dzikiego typu PRRSV.
Legenda
Fig. 1. Schematyczny diagram białek G o ekspresji w pSFV1 oraz ich reaktywności z Mab specyficznymi wobec GP4. Zaznaczono nazwy plazmidów, zawierających różne geny ORF4. Puste słupki przedstawiają sekwencje aminokwasowe pochodzące od białka G kodowanego przez ORF4 PRRSV, czarne słupki przedstawiają sekwencje aminokwasowe pochodzące od białka G kodowanego przez ORF4 VR2332. Liczby aminokwasów zaznaczono nad słupkami. Geny wprowadzono najpierw do PGEM-4Z, a potem przeniesiono do pSFV1, jak opisano szczegółowo w sekcji materiały i metody. Pełny zbiór 14 Mab specyficznych wobec GP4 reagował identycznie z różnymi konstrukcjami w IPMA i reaktywność jest zaznaczona jako dodatnia (+) oraz ujemna (-).
Fig. 2. Analiza pepscan Mab specyficznych wobec GP4 oraz surowic poliklonalnych z nakładającymi się 12-merowymi peptydami, pokrywającymi reszty 25 do 94 GP4. Ukazana jest analiza Mab 130.7 i Mab 138.28, które rozpoznają cztery kolejne peptydy (2A). Pięć innych Mab (122.29, 122.30, 122.66, 122.71 i 138.28) wykazywało podobną specyficzność. Ukazano analizy surowic poliklonalnych od dwóch świń przed immunizacją (v12-0 i va14-0), po immunizacji wektorem wirusa wścieklizny rzekomej, wykazującym ekspresję ORF4 (ca12-54 i va14-54) oraz po następnej prowokacji PRRSV (va12-s1 i va14-s1) (2A i 2B), oraz ukazano analizę poliwalentnej świńskiej surowicy 21 anty-LV (va21) (2D). Ukazano sekwencje aminokwasową reaktywnych peptydów z zakreślonym rdzeniem wspólnych reszt.
Fig. 3. Uszeregowanie sekwencji aminokwasowych GP4 (A) oraz białek N (B) różnych szczepów PRRSV. Ukazano tylko aminokwasy, które różnią się od I-1102. Rdzeniowe sekwencje peptydowe rozpoznawane przez Mab i/lub surowice poliklonalne w analizie pepscan, podkreślono.
Fig. 4. Położenie miejsc wiązania antygenu w sekwencji białka N i porównanie sekwencji białka N z sekwencjami ze szczepu północnoamerykańskiego VR2332 i LDV. Miejsca antygenowe A, B, C i domenę D ukazano jako zacienione. Miejsca A, B, i C zidentyfikowano w analizie pepscan, miejsce D zidentyfikowano przez konstrukcję chimerycznych białek N. Podkreślono sekwencje aminokwasowe LV, które podstawiono odpowiadającymi sekwencjami aminokwasowymi LDV w celu zmapowania
PL 197 057 B1 domeny D. Aminokwasy białka N EAV, które wprowadzono między aminokwasy 25-30 w celu zmutowania miejsca B, ukazano pod sekwencją LDV. Identyczne aminokwasy połączono pionowymi kreskami.
T a b e l a 1
Barwienie chimerycznych białek N, którego ekspresję wykazuje wirus Semliki forest w komórkach BHK-21, w IPMA
| Plazmid | Mutacja | Barwienie Mab w IPMA | |||
| 138,22 | 125.1/126.9/NS95/NS99 | 126.15 | 122.15/130.2/130.4/131.7/131.9/WBE1/ WBE4/WBE5/WBE6/SDOW17 | ||
| A | B | C | D | ||
| pABV470 | - | +++ | +++ | ++ | +++ |
| pABV462 | 25-30 | +++ | - | ++ | +++ |
| pABV518 | 51-67 | ++ | ++ | + | - |
| pABV460 | 80-90 | ++ | ++ | + | - |
| pABV471 | 111-124 | +++ | +++ | ++ | +++ |
T a b e l a 2
Sekwencja primerów stosowanych w PCR do klonowania genów ORF4 LV i VR2332 oraz chimerycznych genów ORF-4 w wektorach plazmidowych pGEM-4Z i pSFV1
| Nazwa | Sekwencja3 | Wprowadzone miejsce restrykcji |
| LV13 | 5'GGCAATTGGATTCCATTTGGA 3' | BamHI |
| LV14 | 5' AGAAGCAAGCTTGCGGAGTC 3' | Hindlll |
| LV46 | 5' GCCGTCGGTACCCCTCAGTACTA 3' | KpnI |
| LV57 | 5' ATGTACTGAGGGGTACCGACGGC 3' | KpnI |
| PRRSV4 | 5' GGCAATTGGATCCACCTAGAATGGC 3' | BamHI |
| PRRSV5 | 5 ' GCGAGCAAGCTTCCGCGGTCAAGCATTTCT 3' | Hindlll |
| PRRSV6 | 5' CTTGCCGCCGCGGTGGTGTTG 3' | SacI |
| PRRSV9 | 5' ACAGCTGGTACCTATCGCCGTACGGCACTGA 3' | KpnI |
| PRRSV10 | 5' GCGATAGGTACCCCTGTGTATGTTACCAT 3' | KpnI |
a Nukleotydy podkreślone w tych primerach są zmutowane ze względu na sekwencję początkową, aby utworzyć miejsca restrykcji lub sekwencje nawisowe, albo w celu uniknięcia długich obszarów jednego poszczególnego nukleotydu. Miejsca restrykcji w primerach, ukazano drukiem pochyłym.
Claims (4)
- Zastrzeżenia patentowe1. Peptyd, o 10-15 resztach aminokwasowych wzbudzający przeciwciała, które reagują z co najmniej dwoma różnymi izolatami PRRSV, który to peptyd obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą miejscu konserwowanemu PRRSV białka N, przy czym to miejsce konserwowane jest wybrane z VNQLCQLLGA lub VNQLCQMLGK lub sekwencji aminokwasowej przy czym reszty tej sekwencji aminokwasowej zostały zastąpione konwencjonalnie lub zgodnie z wskazówkami mapowania zastąpień.
- 2. Przeciwciało reaktywne z peptydem zdefiniowanym w zastrz. 1.
- 3. Test diagnostyczny do wykrywania lub identyfikacji przeciwciał skierowanych przeciw izolatowi PRRSV, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden peptyd jak zdefiniowano w zastrz. 1 wraz z odpowiednimi ś rodkami do wykrywania.
- 4. Test diagnostyczny do wykrywania lub identyfikacji przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi pochodzącemu od izolatu PRRSV, znamienny tym, że zawiera przeciwciało jak zdefiniowano w zastrz. 2 wraz z odpowiednimi ś rodkami do wykrywania.PL 197 057 B1RysunkiPL 197 057 B1PL 197 057 B1PL 197 057 B1PL 197 057 B1PL 197 057 B1Fig. 3A Uszeregowanie aminokwasów GP4 izolatów PRRSV 1-1102-4 MAAATLFFIAGAQHIMVSEAFACXPCFSTHLSDXETNTTAAAGFMVLQDI 50 NL1-4 50 NY2-4 b 50 PRRSV10-4 L 50 LUX-4 L K 50 SPA1-4 r c ; p K N 50 FRA-4 I L F K N 50 DEN-4 I L L K 50 VR2332-4 SSL LW FKCLL Q SS A K S A 50 IA1-4 SL L v FKCLL Q SS A K S A E 50 KS1-4 SL LMV FKCLL Q SS A K SSV 50 MN1-4 SL LMV FKCLL Q SS A K S A 50 IA6-4 SL L V FKCLL Q SS A X S A 50 IL1-4 SL L V FKCFV Q SS A X S A 50 ΝΞ1-4 SSL LMV FKCLL Q SS A X N A E 50 SG1-4 SL L V FKCLL Q NQ SS E X G A E 50 VR2385-4 SL L V FKCLL Q SS X G A 50 KYl-4 SL LMV FKCLL Q SS A K S A 50 MOI-4 SL LMV FERLL Q SS A K G A E 50 ** * ’ł ' » kr »♦»· ' * · · ★ 1 fc *«»«*«»* ♦♦< r _ »1-1102-4 NCFRPHGVSAAQEKISFGKSSOCREAVGTPOYITITANVTDESYLYNADLNL1-4NY2-4PRRSV10-4 LUX-4 L R E SPA1-4 L T NP P I FRA-4 L . T N P I DEN-4 T A A EESQSVT N •p L H VR2332-4 s L HRDSASE----AIR IP T I V V N HSS IA-4 s L HRNSASE----AIR VP T I V N HSS KS1-4 s L HRNSASE----AIR VP Y T I V N HSS MN1-4 s L HRNSASE-----AIR IP A I V N HSS IA5-4 s L HROSASE----AIR P T I V N HSS ILI-4 s L HROSASE----AIR IP T I V N HSS NE1-4 s I* HRNPAPE----A R IP T I V N HSS SG1-4 £ L HRNPAPE----AIR VP T I V sv N HSS VR2385-4 s L HRNSASE----AIR vp T I V V N HSS KYl-4 s L HRDSAFE----T R VP T I V V N HSS MOI-4 s L HROSTSE----AFR VP T I V V N HSS r * r _ _ . . < r ★ • 4 * * * ' t#**#** *1 tPL 197 057 B1Fig. 3A Ciąg dalszy 1-1102-4 LMLSACLFYASEMSEKGFKVIF<aiVSGWSACVNFTDYVAHVTQHTQQHH 150 NL1-4 ISO NY2-4 150 PRRSV10-4 150 LUX-4 150 ΞΡΑ1-4 150 FRA-4 150 DEN-4 150 VR2332-4 S V I AV S Q KEF -RS 145 tai-4 s Ε V I AV s n REF -RS 145 KS1-4 s ε v Ϊ AV ε 6 REF -RS 145 MN1-4 s Ε V I AV s Q REF -RS 145 IA6-4 s V IAAV s Q KES -RS 145 IL1-4 s Ε V I AV s Q REF -RS 145 NB1-4 ε V I AV s Q KEF -RS 145 SS1-4 s V I AV s Q KEF -RS 145 VR2335-4 s V . I AV s Q KEF -RS 145 KY1-4 s V AV s Q IKEF -PS 145 MOI-4 s * * * * « V ii * < ★ h W 4r AV s »#* , G IKEF * -RS * 145 1-1102-4 LVIDKIRLLHFLTPSAMRMATTIACLFAILLAI 183 NL1-4 183 NY2-4 183 PRRSV10-4 183 LUX-4 183 SPA1-4 T 183 FRA— 4 T 183 DEN-4 A 183 VR2332-4 V V M ET VL 178 IA1-4 MV V M ET VL 178 KS1-4 MV v M ET VL 178 MN1-4 MV V M ET FL G 178 IAfi-4 V V M ET VL 178 ILI-4 V V M ET VL 178 NE1-4 V V M ET VL F 178 SCI-4 V V M ET VL 178 VR2385-4 V V M ET VL T 178 KY1-4 V V F I ET VL G --- 175 MOI-4 V V I ET FL G --- 175 * * * * * + * * » *»*★★ * * »* « * ♦ * · »PL 197 057 B1Fig. 3S Uszeregowanie sekwencji aminokwasowych N izolatów PRRSV 1-1102-7 PRRSV10-7 VR2332-7 MAGKNQSQKKKKSTAPMGNGQPVNOLCOLLGAMIKSQ - - - ROOPRGROAK 47 47 46 PNN 3X T£E ~---K D H KI AQ NQS GKGP KKN ΝΞ1-7 PNN Gk TEE ----R D M KI AQ NOS GKGP KKN 46 ILI-7 PNN GK P B ----K D M KI AQ NQS GKGP KKN 46 IA1-7 PNN GK Q ----K D K KI AQ NQS GKGP KXNR •46 IA6-7 PNN GK ON -~--K D M KI aq nos GKGP KKN 46 KSl-7 PKN GK Q R ----K 0 M KI AQ NOS GKGP KKF 46 MN1-7 PNN GK 5 R ----K □ M KI AQ NOS GKGP KKN 46 SG1-7 PNN GR Q ----K DC M KI AQ NQS GKGP KKN 46 MOI-7 PNN GR Q ”--K D M KI AQ NOS GKGP KKI 46 ΚΪΊ-7 PHN GR 0 ~---K D M KI AQ NOS GKGP QIN 46 ISU3927-7 PNN GK Q —-K D M KI AQ NQS GKGP KKN 46 ISU5S-7 PNN GK 0 ----K D M KI AQ NQS GKGP KKN 46 ISU1994-7 PNN GK Q R ----κ D M KI AQ NQS GKGP KKN 46 7R2385-7 PNNTGK Q R ----K D M KI AH NQS GKGP KKN 46 IAF-7 PNN GP. Q *. * . * -«--K D > * M »***»♦» * KI AQ NQS ♦ * * i GKGP KKN ► * 46 1-1102-7 KKKPEKPI-.FPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSG 97 PRRSV10-7 P 97 VR2332-7 N T V P PS Q s CT D 96 NB1-7 T T V F PS Q s CT D 96 IL1-7 N τ V • F PS Q s CT D 96 IA1-7 N, T V F PS Q s CI D 96 ΙΑύ-7 N T V F PS 0 5 CT D 96 KSl-7 N T V F PS 0 s CT D 96 MN1-7 N τ V F PS Q s ICI D 96 SG1-7 N T V V F PS Q s CT 0 96 MOI-7 N SI FV F PS Q s CT D 96 ΚΪ1-7 IN ' V YS VT V F PS Q s CT D 96 ISU3927-7 N T V F PS Q s CI D 96 ISU5S-7 N T V F SG Q s CT D 96 ISU1894-7 N T V F PS 0 s CT D 96 VR2385-7 N T V F PS Q s CT D 96 IAF-7 N T V F PS Q s CT D 96 w . * ** r r · t «* 1 * . . * » w»t *·» #♦*·<**-·** *1 *. * * 1-1102-7 KVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS 12 B PRRSV10-7 12S VR2332-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 NE1-7 RI YT s TH ASPSA--- 123 ILI-7 RI YT s TH APSSA--- - 123 IA1-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 IA6-7 RI YT s TH APPSA--- - 123 KSl-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 MN1-7 RI YT s TH VSPSA--- • 123 SG1-7 RI YT s TH ASPSA—- - 123 MOI-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 KY1-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 ISU3927-7 RI YT s TH APPSA--- - 123 ISU55-7 RI YT s TH appsa--- - 123 ISU1394-7 RI YT s TH ASPSA--- - 123 VR2385-7 RI YT s TH ASPSA--- * 123 IAF-7 RI YA s TH ASPSA--- - 123PL 197 057 B1VR2332 G Rl SYTVEFSLPTHHTVRLIRVTASPSA - - - - i i iii ii mu III LV GKVSFQVEFMLPVAHTVRL RVTSTSASOGAS I I I Illl Illl ILDV GGI N F TVSFMLPTHATVRLI N ASANSSA - - -
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97201343 | 1997-05-06 | ||
| PCT/NL1998/000251 WO1998050426A1 (en) | 1997-05-06 | 1998-05-05 | Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL336714A1 PL336714A1 (en) | 2000-07-03 |
| PL197057B1 true PL197057B1 (pl) | 2008-02-29 |
Family
ID=8228298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL336714A PL197057B1 (pl) | 1997-05-06 | 1998-05-05 | Peptyd, przeciwciało i test diagnostyczny |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6495138B1 (pl) |
| EP (2) | EP1882696A3 (pl) |
| JP (1) | JP2000512313A (pl) |
| KR (1) | KR100388257B1 (pl) |
| CN (1) | CN1259141B (pl) |
| AT (1) | ATE365746T1 (pl) |
| AU (1) | AU754938B2 (pl) |
| BR (1) | BR9809221A (pl) |
| CA (2) | CA2703181C (pl) |
| CZ (1) | CZ297371B6 (pl) |
| DE (1) | DE69837992T2 (pl) |
| DK (1) | DK0980387T3 (pl) |
| ES (1) | ES2289781T3 (pl) |
| HU (1) | HU228704B1 (pl) |
| ID (1) | ID23399A (pl) |
| PL (1) | PL197057B1 (pl) |
| PT (1) | PT980387E (pl) |
| RU (1) | RU2220978C2 (pl) |
| SK (1) | SK286063B6 (pl) |
| UA (1) | UA73915C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998050426A1 (pl) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| DE19850718C1 (de) * | 1998-11-03 | 2000-05-18 | Hildt Eberhardt | Zellpermeabilität-vermittelndes Polypeptid |
| CA2366072C (en) * | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
| DK1183332T3 (da) | 1999-04-22 | 2010-09-06 | Us Agriculture | Porcint Reproduktions- og Respirations Syndrom-vaccine baseret på isolere JA-142 |
| CA2439254A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Life attenuated strains of prrs virus |
| US7335361B2 (en) * | 2003-06-09 | 2008-02-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine |
| KR20070028547A (ko) | 2004-06-18 | 2007-03-12 | 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 | 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정 |
| US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| KR20130105750A (ko) * | 2005-02-25 | 2013-09-25 | 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 |
| HUE031018T2 (hu) | 2005-06-24 | 2017-06-28 | Univ Minnesota | PRRS vírusok, fertõzõ klónok, ezek mutánsai és alkalmazási eljárások |
| CA2630648C (en) | 2005-11-29 | 2016-01-19 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof |
| WO2007065151A2 (en) | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Differential immunoassay for prrs vaccine antibody |
| CN102316895A (zh) * | 2008-08-25 | 2012-01-11 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(hp prrs)的疫苗 |
| KR101101386B1 (ko) * | 2008-12-04 | 2012-01-02 | 주식회사 바이오리쏘스 | 북미형 ｐｒｒｓｖ에 특이적인 면역원성 펩티드 및 그의 용도 |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| CA2800824A1 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Novel modified live-attenuated vaccines (mlv) and subunit vaccines created by dna shuffling against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) |
| CN101885759B (zh) * | 2010-06-25 | 2013-01-09 | 国家兽用生物制品工程技术研究中心 | 一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及其筛选方法和应用 |
| JP2014506795A (ja) | 2011-02-17 | 2014-03-20 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｐｒｒｓｖの工業規模の製造方法 |
| BR112013021076B1 (pt) | 2011-02-17 | 2022-11-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv) de um tipo europeu, seu uso, vacina, método para a preparação destes |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| EP2737059A1 (en) | 2011-07-29 | 2014-06-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells |
| US10300123B2 (en) | 2011-12-30 | 2019-05-28 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) |
| KR101430223B1 (ko) * | 2012-10-09 | 2014-09-25 | 전북대학교산학협력단 | 면역유도능이 증가된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 |
| CN103421817B (zh) * | 2012-10-15 | 2016-01-13 | 华中农业大学 | 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用 |
| US9149518B2 (en) | 2012-12-07 | 2015-10-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus compositions and uses thereof |
| CN103059142B (zh) * | 2012-12-17 | 2015-02-25 | 重庆市畜牧科学院 | 猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用 |
| CN105073130A (zh) | 2013-03-15 | 2015-11-18 | 勃林格殷格翰动物保健公司 | 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法 |
| EP2804000A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | Prionics AG | Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods |
| EP3591042B1 (en) | 2013-12-20 | 2023-01-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Prrs virus variant, european prrs virus cdna clone, and uses thereof |
| JP6538071B2 (ja) | 2014-03-21 | 2019-07-03 | ニューテック・ベンチャーズ | 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）及び使用する方法 |
| ES2902491T3 (es) | 2015-06-23 | 2022-03-28 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vectores virales recombinantes que contienen una proteína menor de PRRSV y procedimientos de fabricación y uso de los mismos |
| CN106442968B (zh) * | 2016-09-21 | 2018-03-06 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒 |
| CN109022613A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-12-18 | 上海申亚动物保健品阜阳有限公司 | 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及检测方法 |
| KR102138287B1 (ko) * | 2018-08-07 | 2020-07-29 | 대한민국 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 유전형별 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| KR102091279B1 (ko) * | 2018-08-07 | 2020-03-20 | 대한민국 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 재조합 항원 단백질 및 이의 용도 |
| CN110894243B (zh) * | 2019-12-16 | 2021-07-13 | 中国农业大学 | 一种猪蓝耳病毒嵌合抗原以及检测猪蓝耳病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条 |
| CN112458115B (zh) * | 2020-10-21 | 2022-06-07 | 天津农学院 | 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2069435T4 (es) | 1991-06-06 | 1997-06-16 | Stichting Centr Diergeneeskund | Composicion de vacuna para vacunar animales, en concreto mamiferos y mas concretamente cerdos o cochinos. |
| US5846805A (en) | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
| DE601062T1 (de) | 1991-08-26 | 1995-05-18 | David Allen Benfield | Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas). |
| CA2076744C (en) | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Danny W. Chladek | Viral agent associated with mystery swine disease |
| DE69206631T2 (de) | 1991-10-14 | 1996-05-15 | Akzo Nobel Nv | Impfstoff gegen das Fortpflanzungs- und Atmungssyndrom bei Schweinen (PRRS) und Diagnose. |
| US6251397B1 (en) * | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
| US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| HU218430B (hu) | 1993-02-08 | 2000-08-28 | Bayer Corp. | Eljárás sertés reproduktív és légzési szindróma vírus (PRRSV) tenyésztésére és annak alkalmazása vakcinában |
| ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
| DK53595A (da) * | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
| DK0783321T3 (da) * | 1994-08-05 | 2006-10-02 | Univ Minnesota | VR-2332 viral nucleotidsekvens og fremgangsmåder til anvendelse |
| US5690940A (en) | 1995-06-21 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof |
| ES2122921B1 (es) * | 1996-12-30 | 1999-09-16 | Inmunologia & Genetica Aplic | Proteinas recombinantes de fusion del virus reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico. |
-
1998
- 1998-05-05 PL PL336714A patent/PL197057B1/pl unknown
- 1998-05-05 CA CA2703181A patent/CA2703181C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 PT PT98921916T patent/PT980387E/pt unknown
- 1998-05-05 SK SK1526-99A patent/SK286063B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-05 CZ CZ0393299A patent/CZ297371B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-05 BR BR9809221-9A patent/BR9809221A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-05 AU AU74571/98A patent/AU754938B2/en not_active Expired
- 1998-05-05 WO PCT/NL1998/000251 patent/WO1998050426A1/en active IP Right Grant
- 1998-05-05 JP JP10547938A patent/JP2000512313A/ja active Pending
- 1998-05-05 CA CA2289980A patent/CA2289980C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 UA UA99126600A patent/UA73915C2/uk unknown
- 1998-05-05 DK DK98921916T patent/DK0980387T3/da active
- 1998-05-05 CN CN988058219A patent/CN1259141B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-05 RU RU99125615/13A patent/RU2220978C2/ru active
- 1998-05-05 EP EP07107362A patent/EP1882696A3/en not_active Ceased
- 1998-05-05 KR KR10-1999-7010289A patent/KR100388257B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-05-05 AT AT98921916T patent/ATE365746T1/de active
- 1998-05-05 HU HU0002176A patent/HU228704B1/hu unknown
- 1998-05-05 EP EP98921916A patent/EP0980387B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 DE DE69837992T patent/DE69837992T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-05 ID IDW991527A patent/ID23399A/id unknown
- 1998-05-05 ES ES98921916T patent/ES2289781T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-05 US US09/434,476 patent/US6495138B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2703181C (en) | Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays | |
| US7264802B2 (en) | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) | |
| Urniza et al. | Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91. Involvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection | |
| CA2366072C (en) | Prrsv vaccines | |
| US6977078B2 (en) | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) | |
| MXPA99010185A (en) | Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays |