PL188387B1 - Białko o aktywności hamującej proteazę serynową, kompozycja farmaceutyczna, wyodrębniona sekwencja,samopowtarzający się wektor, zastosowanie białka o aktywności proteazy serynowej, sposób hamowania aktywności proteazy serynowej ex vivo i sposób wytwarzania białka - Google Patents

Abstract

1. Bialko o aktywnosci hamujacej proteaze serynowa zawierajace jedna z nastepu- jacych sekwencji aminokwasowych, ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRW N Y N VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50 YLTKESCLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ D SEDHSSDMF 100 NYEEYCTANA VTGPCR A F P RW YFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150 A C MLRCFRQQ ENPPLPLGSK 170 [SEQ I D N r. 5 2 1 , MAQICGL RRSRAF A L A L L GS L L L S G V L A ADRERSI HDP CLVSKVVGRC RASM PWWYM VTDGSCQLFV YGGCOGNSNN 50 YLTYEECLKK CATV TENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSS O M F 100 NYEEYCTANA VTGPCHASFP RW YFDVERN S CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150 ACHLRCFRQQ ENPPLPLGSK VV LAgLFVN VLILFLGASM VYLFRVARRN 200 QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225 (SEQ ID N r 4 9 ) , AGSFLAW L GSLLLSGVLA -1 ADRERSIHDF CLVSKVVGRC RASM PRW YN VTD G SCQLFV YGGCDGNSNN 50 YLTREECLKK CATV TENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMY 100 N YEEYCTANA VTGPCRASFP R W YFDVERNS CNNFIYG GCR GNKNSYRSSE 150 ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VVVLAGAVS 179 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko o aktywności hamującej proteazę serynową, kompozycja farmaceutyczna, wyodrębniona sekwencja, samopowtarzający się wektor, zastosowanie białka o aktywności proteazy serynowej, sposób hamowania aktywności proteazy serynowej ex vivo i sposób wytwarzania białka.

Utrata krwi jest poważnym powikłaniem dużych operacji, takich jak operacja na otwartym sercu i inne skomplikowane procedury. Pacjenci kardiochirurgiczni korzystają w znacznej mierze z transfuzji krwi od dawców. Transfuzja krwi niesie ryzyko przenoszenia chorób oraz niekorzystnych reakcji. Poza tym, krew od dawcy jest droga i często wymaga nadmiernego uzupełniania. Opisano farmakologiczne metody zmniejszania utraty krwi i wynikającą z niej potrzebę transfuzji (opracowane przez Scotta i in., Ann. Thorac. Surg. 50: 843-851, 1990).

Aprotynina, bydlęcy inhibitor proteazy serynowej z rodziny Kunitza, jest substancją aktywną w leku o nazwie Trasy lo®. Aprotyninę (Trasylol®) opisywano jako skutecznie zmniejszającą okołooperacyjną utratę krwi (Royston i in., Lancet ii: 1289-1291, 1987; Dietrich i in., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 92-98, 1989; Fraedrich i in., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 89-91, 1989); W. van Oeveren i in., (1987), Ann Thorac. Surg. 44, strony 640-645; Bistrup i in., (1988) Lancet I, 366-367), lecz opisywano także niekorzystne efekty, włączając niedociśnienie i uderzenia krwi (Boehrer i in., Anesthesia 45: 853-854, 1990) oraz reakcje alergiczne (Dietrich i in., jak wyżej). Nie zaleca się stosowania aprotyniny u pacjentów, którym wcześniej był on podawany. Trasylol® stosowano także do leczenia krwotoków hiperfibrynolitycznych oraz wstrząsu pourazowego wywołanego krwotokiem.

O aprotyninie wiadomo, że hamuje kilka proteaz serynowych, łącznie z trypsyną, chymotrypsyną, plazminą i kallikreiną. Stosuje się ją leczniczo w leczeniu ostrego zapalenia trzustki, różnych stanów zespołu wstrząsowego, krwotoku hiperfibrynolitycznego oraz zawału mięśnia sercowego (Trapnell i in., (1974) Brit. J. Surg. 61: 177; J. McMichigan i in., (1982) Circulatory Shock 9: 107; Auer i in., (1979) Acta Neurochir. 49: 207; Sher (1977) Am. J. Obstet. Gynecol. 129: 164; Schneider (1976), Artzneim-Frisch. 26: 1606). Generalnie uważa się, że Trasylol® zmniejsza utratę krwi in vivo, poprzez inhibicję kallikreiny i plazminy. Odkryto, że aprotynina (3-58. Rgl5, Alal7, Ser42) wykazuje większą siłę hamowania kallikreiny w osoczu w porównaniu z samą aprotyniną natywną (WO 89/10374).

Ponieważ aprotynina jest pochodzenia bydlęcego, istnieje określone ryzyko wywołania anafilaksji u pacjentów po ponownym zażyciu leku. Tak więc, z powodu niższego ryzyka anafilaksji, najbardziej użyteczny i pożądany byłby ludzki funkcjonalny odpowiednik aprotyniny.

Aprotynina jest także nefrotoksyczna u gryzoni i psów przy podawaniu w powtarzających się wysokich dawkach (Bayer, Trasylol®, Inhibitor of proteinase; Glasser i in., w „Verhandlung der Deutchen Geselschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress”, Bergmann, Monachium, 1972 strony 1612-1614). Jedna z hipotez przypisuje ten wpływ gromadzeniu się aprotyniny w ujemnie naładowanych proksymalnych kanalikach nerkowych, z powodu dużego dodatniego ładunku sieciowego (WO 93/14120).

W związku z tym, celem niniejszego wynalazku było zidentyfikowanie ludzkich białek o aktywności funckjonalnej podobnej do aprotyniny oraz zidentyfikowanie ludzkich białek, które byłyby mniej naładowane i wykazywały przy tym taką samą, bardzo podobną lub polepszoną specyficzność proteazową, zwłaszcza pod względem siły hamowania plazminy i kallikreiny.

188 387

Takie inhibitory można by więc stosować w sposób powtarzający się, jako leki u pacjentów ludzi, ze zmniejszonym ryzykiem niekorzystnej odpowiedzi immunologicznej i zmniejszoną neurotoksycznością. ... .

Przedmiotem wynalazku jest białko o aktywności hamującej proteazę serynową zawierające jedną z następujących sekwencji aminokwasowych,

ADRERSIHDF	CLVSfKW/GRC	RASMPRWWYN	VTDGSCQLIL/	YYGGCGGSNN	50
YLTKEECLKK	CATVTENATG	DLATSRNAAD	SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDMF	110
NYEEYCTANA	VTGPCRASFP	RWYFDVERNS	CNNFIYGGCR	CGN^YESSE	110
ACMLRCFRQQ	ENPPLPLGSK				117
(SEQ ID Nr:	: 02),
MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA			-1
ADRERSIHDF	CLVSKWGRC	RASMPRWWYN	VTDGSCQLFV	YGGCDGNSNN	50
YLTYEECLKK	CATVTENATG	DLATSRNAAD	SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDMF	110
NYEEYCTANA	VTGPCRASFP	RWYFDVERNS	CNNFIYGGCR	GNNK SYRSEE	110
ACMLRCFRQQ	ENPPLPLGSK	WW]AkgLFVM	VLILFLGASM	WLIRVARRN	220
QERALRTVWS	SGDDKEQLVK	NTTYVl			222

(SEQ ID Nr: 49),

AGSFLAWL GSLLLSGVLA -1

ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 110

NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 110

ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK WWLAGAVS 117

188 387

Ί (SEQ ID Nr: 2),

MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA -1

ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGScQLFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100

NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK WVLAGLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200

QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225 (SEQ ID Nr: 45),

MAQLCĆL RRSRAFLA1L GS LLLSGVLA -1 ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100

NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VWLAGLFVM vLILFLGASM VYLIRVARRN 200

QERALRTVWS FGD 213 (SEQ ID Nr: 47)

IHDF CLCSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK CATV 64 (SEQ ID Nr : 4),

CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK C 61 (SEQ ID Nr: 5),

YEEYCTANA VTGPCPASFP RWYFDVERNS CNNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

ACMLRCFRQ 159 (SEQ ID Nr: 6),

CTANAVTGPC RASFPRWYFD VERNSCNNFI YGGCRGNKNS YRSEE

150

188 387

ACMLRC 156 (SEQ ID Nr: 7) ,

IHDF CLVSiKW/GRC RASMPRtWłGYJ VTDGSCQLEFV YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKK CATVTENATG DIDLTSRNRNAD

NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS

ACMLRC FRQ (SEQ ID Nr: 3),

CLVSIKW7GRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV

YLTKEECLKK CATVTENATG DIDLTSRNJNAD

NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS

ACMLRC (SEQ ID Nr: 50),

ADRERSIHDF CLVSIKW/GRC RASMPRWWYN

YLTKEECLKK CATATTENATG DDATSRRAAD

NYEEYCTANA VTGPCFC\SFP RWYFDVERNS

ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VWVLAGAVS (SEQ ID Nr: 1), i

ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRłGiGY

YLTKEECLKK CATVTENATG DLATTRNAAD (SEQ ID Nr: 8) .

SSVPSAPPRQ	DSEDHSSDMF	75
CNNFIYGGCR	GNKNSYRSEE	125
		159

YGGCDGNSNN		50
SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDMF	110
CNNFIYGGCR	GNIOJSYRSEE	150
		1^6

VTDGSCQLFV	YGGCDGNSNN	25
SSVPSTPWWQ	DSEDHSSDMF	75
CNNFIYGGCR	GNKNSYRSEE	125
		179

VSDGSCQLFV	YGGCDGNSNN	50
SSVPSAPRRQ	DS	92

Korzystnie białko według wynalazku jest glikozylowane lub zawiera co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, albo jest zarówno glikozylowane jak i zawiera co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna do hamowania aktywności proteazy serynowej obejmująca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną, zawiera białko określone powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kompozycja według wynalazku korzystnie zawiera białko glikozylowane lub co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, albo białko, które jest zarówno glikozylowane jak i obejmujące co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wyodrębniona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje białko zdefiniowane w sekwencji o numerze SEQ ID nr 52,49, 2,45,47, 3, 50 lub 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest samopowtarzający się wektor ekspresji białka, zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, który koduje i jest zdolny do ekspresji białka określonego powyżej.

188 387

Przedmiotem wynalazku jest także sposób hamowania aktywności proteazy serynowej ex vivo, polegający na tym, że obejmuje etap zetknięcia proteazy serynowej ze skuteczną ilością co najmniej jednego białka określonego powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także powyżej określone białko do zastosowania jako lek.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyżej określonego białka do wytwarzania leku do leczenia stanu obrzęku mózgu, obrzęku rdzenia kręgowego, stwardnienia rozsianego, niedokrwienia, okołooperacyjnej utraty krwi, sepsy, wstrząsu septycznego, zwłóknienia, choroby związanej z patologiczną koagulacją lub krzepnięciem krwi, wielu urazów, udaru, krwotoku mózgowego lub podpajęczynówkowego, zapalenia mózgu, zapalenia rdzenia kręgowego, infekcji mózgowych, ziarnicy mózgu, infekcji rdzenia kręgowego, ziarnicy rdzenia, operacji na otwartym sercu, raka żołądka, raka szyjki lub zapobiegania przerzutom.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania powyżej określonego białka, polegający na tym, że białko to otrzymuje się przy użyciu technologii rekombinacji DNA.

Niniejszy wynalazek zapewnia białko, które ma właściwości ludzkiego inhibitora proteazy serynowej. Białko to może specyficznie hamować kallikreinę. Białko to wyizolowano z tkanki ludzkiego łożyska, poprzez chromatografię powinowactwa.

Nowo zidentyfikowane ludzkie białko według wynalazku, zwane tu ludzką bikuniną łożyskową, zawiera dwie domeny inhibitora proteazy serynowej klasy Kunitza. W jednej szczególnej postaci realizacji, jak już wspomniano białko to posiada sekwencję aminokwasową:

TVWRWRIHVD CLVSIK,W),GRC WTRMRWWWFS ESVGRCQLFE EGGCVGSRSS 50
EASKRRCLKK	CTSETRSTSG	VLTSRWSTTV	RRERRTRWWQ	VRRVHRRVMD	100
SFRRFCSTST	ESGRCRTRDR	RWYDWERNS	CSSFIEGGCW	GSKSRFWRRR	150
TCMAWCDWQQ	RSRRARAGRK	EWVLAGAER			179
(SEQ ID NO:	1)

W zalecanej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia natywne białko ludzkiej bikuniny łożyskowej, posiadające sekwencję aminokwasową:

ADRERSIEDD CLVSKWGRC WTRMRRWWFS ESVGRCQADE FGGCVGSRSS 50
FASKRRCAKK	CTSESESTSG	VATTRWSTTV	RRERRTRWWQ	VRRVHRRVMD	100
SFRRFCSTST	ESGRCWTRDR	RWYDWERNS	CSSFIFGGCR	GSKSRFWRRR	150
TCMAWCDWQQ	RSRRLRAGRK				170
(SEQ ID NO:	: 52)

W jednym aspekcie, biologiczna aktywność białka według niniejszego wynalazku umożliwia wiązanie i hamowanie aktywności biologicznej trypsyny, kallikreiny ludzkiego osocza i tkanki oraz Czynnika XIIa. W zalecanej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia natywne białko ludzkiej bikuniny łożyskowej w postaci glikozylowanej. W dalszej postaci realizacji, niniejszy wynalazek obejmuje natywne białko ludzkiej bikuniny, które zostało wytworzone tak, że zawiera co najmniej jedno wiązanie disiarczkowe cysteina-cysteina. W zalecanej postaci realizacji, białko zawiera co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe cysteina-cysteina, utworzone między parami cystein wybranych z grupy składającej się z CYS11-CYS61, CYS20-CYS44, CYS36-CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139 oraz CYS131-CYS152, w których cysteiny numeruje się zgodnie z sekwencją aminokwasową natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Przeciętny fachowiec rozpozna, że białko według niniejszego wynalazku może się fałdować do odpowiedniej konformacji trójwymiarowej, tak że zachowuje aktywność biologiczną natywnej ludzkiej bikuniny, gdzie brak żadnego lub obecne są jedno lub więcej, albo wszystkie natywne wewnątrzłańcuchowe wiązania disiarczkowe cysteina-cysteina. W najbardziej zalecanej postaci realizacji, białko według niniejszego wynalazku składa się prawidłowo i tworzy ze wszystkimi prawidłowymi natywnymi wiązaniami di siarczkowymi cysteina-cysteina.

188 387

Aktywne białko według niniejszego wynalazku można otrzymać przez oczyszczenie z tkanki ludzkiej, takiej jak łożysko, albo poprzez techniki chemicznej syntezy białek, jak zilustrowano w poniższych przykładach. Zrozumiałe jest także, że białko według niniejszego wynalazku można otrzymać przy użyciu technik biologii molekularnej, gdzie samopowtarzające się wektory są zdolne do ekspresji białka według niniejszego wynalazku z transformowanych komórek. Takie białka można wytworzyć jako postacie nie wydzielane lub wydzielane z transformowanych komórek. W celu ułatwienia wydzielania z transformowanych komórek, wzmocnienia stabilności funkcjonalnej odczytanego białka, albo aby ułatwić składanie białka bikuniny, do części NH2-terminalnej natywnego białka ludzkiej bikuniny, można dodać pewne sekwencje peptydu sygnałowego.

W jednej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia więc natywne białko ludzkiej bikuniny z nienaruszoną co najmniej częścią natywnej sekwencji peptydu sygnałowego. Tak więc, jedna postać realizacji wynalazku zapewnia natywną ludzką bikuninę z co najmniej częścią peptydu sygnałowego, posiadającego sekwencję aminokwasową:

AGSFLAWLGSLLLSGVLA -1

ADRERSIHDFCLVSKVVGRCiA\SMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 50 YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF 100 NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150

ACMLRCFRQQENPPLPLGStVVV/IAGAVS 17 9 (SEQ ID NO: 2)

W zalecanej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia natywne białko ludzkiej bikuniny łożyskowej z nienaruszoną częścią sekwencji liderowej, posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 52 z nienaruszonym segmentem liderowym, posiadającym sekwencję aminokwasową:

MAQLCGL RRSRAFLL GSLLLSGVLA -1 (SEQ ID nr 53)

W innej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia białko bikuniny z nienaruszoną częścią sekwencji liderowej, posiadającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 52 z nienaruszonym segmentem liderowym, posiadającym sekwencję aminokwasową:

MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA -1 (SEQ ID nr 54)

W zalecanym systemie numerowania stosowanym tutaj, aminokwas numerowany +1 przypisuje się do końca NH2 sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Można łatwo zauważyć, że funkcjonalne fragmenty białka mogą pochodzić z natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej, która zachowa co najmniej część aktywności biologicznej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej i działa jako inhibitor proteazy serynowej.

W jednej postaci realizacji, białko według niniejszego wynalazku obejmuje fragment natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej, która zawiera co najmniej jedną funkcjonalną domenę taką jak Kunitza, posiadającą sekwencję aminokwasową natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 7-159, zwanej tu potem „bikuniną (7-159)”. Tak więc, niniejszy wynalazek realizuje białko, posiadające sekwencję aminokwasową:

IHDFCLVSKWGRCIASSMPRWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 55

YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF 100

NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150 159

ACMLRCFRQ (SEQ ID NO: 3)

188 387 gdzie numerowanie aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Inną funkcjonalną odmianą tej postaci realizacji może być fragment natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej, która zawiera co najmniej jedną funkcjonalną domenę taką jak Kunitza, posiadającą sekwencję aminokwasową natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 11-56, bikuniny(11-156)

CLVSKKWGRClAASMPR(WYYNVTDGSCQLiV/YGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMF 100 NYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150

ACMLRC 156 (SEQ ID NO: 50).

Można zauważyć, że poszczególne domeny podobne do Kunitza są także fragmentami natywnej bikuniny łożyskowej. W szczególności, niniejszy wynalazek zapewnia białko, posiadające sekwencję aminokwasową pierwszej domeny podobnej do Kunitza, składającej się z sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 7-64, zwanej tu potem, ,,bikuniną(7-64)”. Tak więc, jedna postać realizacji niniejszego wynalazku obejmuje białko, które zawiera co najmniej jedną domenę podobną do Kunitza, posiadającą sekwencję aminokwasową:

IHDFCLVSiKW/GRCRASMPRVWiYNVTIG3SCQLIVYfGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKKCATV 64 (SEQ ID nr 4) gdzie numerowanie aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Inną postacią białka według niniejszego wynalazku może być pierwsza domena podobna do Kunitza, składająca się z sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 11-61, „bikuniny (11-61)”, posiadającej sekwencję aminokwasową:

CLVSKVVGRCFA\SMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKKC 61 (SEQ ID nr 5)

Niniejszy wynalazek zapewnia także białko o sekwencji aminokwasowej domeny podobnej do Kunitza, składającej się z sekwencji aminokwasów natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 102-159 zwanej „bikuniną (102-159)”. Tak więc jedna postać realizacji niniejszego wynalazku obejmuje białko, które zawiera co najmniej jedną domenę podobną do Kunitza, posiadające sekwencję aminokwasową;

YEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 150

ACMLRCFRQ (SEQ ID nr 1)

159

188 387 gdzie numerowanie aminokwasów odpowiada sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Inną postacią tej domeny może być domena podobna do Kunitza, składająca się z sekwencji aminokwasowej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej aminokwasów 106-156, „bikuniny (106-156)”, posiadającej sekwencję aminokwasową:

CTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEE 110

ACMLRC 116 (SEQ ID nr 7)

Tak więc przeciętny fachowiec zauważy, że fragmenty natywnego białka ludzkiej bikuniny łożyskowej, które można wytworzyć, utrzymają co najmniej część aktywności biologicznej białka natywnego. Takie fragmenty można także łączyć w różnych kierunkach lub wielorakich kombinacjach, aby zapewnić białka alternatywne, które utrzymują część albo tyle samo, albo więcej aktywności biologicznej natywnego białka ludzkiej bikuniny.

Można łatwo zauważyć, że biologicznie aktywne białko według niniejszego wynalazku może zawierać jedną lub więcej niniejszych domen podobnych do Kunitza, w połączeniu z dodatkowymi domenami podobnymi do Kunitza, z innych źródeł. Biologicznie aktywne białko według niniejszego wynalazku może obejmować jedną lub więcej niniejszych domen podobnych do Kunitza w połączeniu z dodatkowymi domenami białkowymi z innych źródeł, o różnej aktywności biologicznej. Aktywność biologiczną białka według niniejszego wynalazku można połączyć z aktywnością innego znanego białka lub białek, aby zapewnić wieloczynnościowe białka połączone, posiadające możliwą do przewidzenia aktywność biologiczną. Tak więc, w jednej postaci realizacji, niniejszy wynalazek obejmuje białko, które zawiera co najmniej jeden segment sekwencji aminokwasowej taki sam lub funkcjonalnie równoważny sekwencji aminokwasowej albo SEQ ID nr 5, albo SEQ ID nr 7.

Otwarta ramka odczytu, która kończy się przy wczesnym kodonie przestankowym, może jeszcze kodować funkcjonalne białko. Niniejszy wynalazek obejmuje taką alternatywną terminację i w jednej postaci realizacji zapewnia białko o sekwencji aminokwasowej:

ADRERSIHnFCLWSKVVGRCRA3MRRWWYNVTCGSCQLFVYGGCDGNSNN 50

YLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSVAVPRRQDS 92 (SEQ ID nr:8)

W jednej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia zasadniczo oczyszczone lub wytworzone rekombinacyjnie natywne białko ludzkiej bikuniny z nienaruszonym segmentem sekwencji liderowej, oraz co najmniej częścią nienaruszonego natywnego regionu transbłonowego. Tak wiec, jedna postać realizacji wynalazku zapewnia natywną ludzką bikuninę z nienaruszoną sekwencją liderową i z co najmniej częścią domeny transbłonowej (podkreślona), posiadającej sekwencję aminokwasową wybraną z:

1) EST MLR GSLLLSGWL -1

2) PCR IMYQLCGL RRSERAFLALL GSLLLSGVLA -1

3)XcDNA tMAQLCGL RRSIRAFILALL GSLLLSGWA -1

1)	ADRERSIHDF	CLyswyGRC	ΡΛδΗΡΚί^ίΥΝ	VTDGSCQLFV	YYRRDDRSEN	50
2)	ADRERSIHDF	CLVSKWGRC	FRAHPRłWi^YiJ	VTDGSCQLFV	YYGCDGGSNN	50
3)	ADRERSIHDF	CLVSKWGRC	iRASHPRWYN	SWOCSCOLFy	YGGRDGRSEN	500
1)	YLTKEECLKK	CATVTENATG	DLATSSRNAAD	SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDMF	100
2)	YLTKEECLKK	CATVTENATG		SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDHF	100
3)	YLTKEECLKK	CATVTENATG	DLATSRNNAAD	SSVPSAPRRQ	DSEDHSSDHF	100

188 387

1)	EYDDYNTPFP	VTGPCRASFP		NFFFYYGGNR	GNKNSYRSEE	150
2)	EYDDYNTPNP	VTGPCERASFP	RWYFDVEFEAS	NFEFYYGGNR	GNKNSYRSEE	150
3)	EYDDYNTAEP	VTGPCRASFP	RWYFDVERNS	CFEFYYGGCR	GNINSSYRSEE	150
1)	PNMLRNIRQQ	ENPPLPLGSK	WLAGLEPM	VLYLFLGPSM		200
2)	PNMLRNIRQQ	ENPPLPLGSK	WLAGLL^Ml	PLILFLGASH	VYLIRVARRN	200
3)	PNMLRNIRQQ	ENPRLRLGSK	WLPALIVM1	VLILFLGASH	VYLIRVARRN	200
1)	OERALRTPWS	SGDDKEQLVK	NTYVL			225
2)	PERAI^^S	FGD				213
3)	QDRPLRTPWS	SGSSSEQLVK	NTYVL			225

gdzie sekwencja 1) oznacza konsensusową SEQ ID nr 45 pochodząca od EST, 2) oznacza klon PCR SEQ ID nr 47, oraz 3) oznacza klon cDNA lambda SEQ iD nr 49. W zalecanej postaci realizacji białko według niniejszego wynalazku zawiera jedną z sekwencji aminokwasowych SEQ ID nr 45, 47 lub 49, w której białko odszczepiono w regionie między końcem ostatniej domeny Kunitza i regionem transbłonowym.

Niniejszy wynalazek realizuje także białko, w którym usuwa się peptyd sygnałowy. Tak więc, niniejszy wynalazek zapewnia białko, posiadające sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 52, będące w ciągłości z transbłonową sekwencją aminokwasową:

EST tPWLAGLFPM PLIL^GASM VYLIRVARRN 200

EST SGSSSDQLPS NTYVL· 225 (SEQ ID nr 55) transbłonową sekwencją aminokwasową:

RCR .WARUTyM VLILFLGASM VYLIRVi\RFN1 200

RCR OEFALORTWiS FGD 213 (SEQ ID nr 58) lub transbłonową sekwencją aminokwasową:

ZcDNA VVVLAGLFVM PLILFLGASM VY LI RVARRN 200

ZcDNA QEFALRTVWS SGSSSDQLPS NTYVL 225 (SEQ ID nr 57)

Sekwencje aminokwasowe białka według niniejszego wynalazku jasno wskazują osobie obeznanej odpowiednie sekwencje kwasu nukleinowego, które można stosować w technikach biologii molekularnej do wytwarzania białek według niniejszego wynalazku. Tak więc, jedna postać realizacji niniejszego wynalazku zapewnia sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje ludzką bikuninę, posiadającą konsensusową sekwencję DNA według fig. 3 (SEQ ID nr 9), która podlega translacji na sekwencję aminokwasową natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej według fig. 3 SEQ ID nr 10). W innej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia konsensusową sekwencję kwasu nukleinowego według fig. 4C (SEq ID nr 51), która koduje sekwencję aminokwasową według fig. 4D (SEQ ID nr 45).

W zalecanej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje natywną ludzką bikuninę łożyskową, posiadającą sekwencję DNA według fig. 4F (SEQ ID nr 48), która koduje sekwencję białkową SEQ ID nr 49). W innej postaci realizacji, niniejszy wynalazek zapewnia sekwencję kwasu nukleinowego według fig. 4E (SEQ ID nr 46), która koduje sekwencję białkową SEQ ID nr 47.

Łatwo zauważyć, że można wytworzyć pewne mutacje alleliczne oraz substytucje konserwatywne przeprowadzone w sekwencji kwasu nukleinowego, z których wciąż wynika sekwencja

188 387 aminokwasowa, której dotyczy wynalazek. Fachowiec może zauważyć, że pewne naturalne mutacje alleliczne białka według mniejszego wynalazku oraz konserwatywne substytucje aminokwasów w białku według niniejszego wynalazku, nie zmienią znacząco aktywności biologicznej białka, i wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

Niniejszy wynalazek zapewnia także kompozycje farmaceutyczne, zawierające ludzką bikuninę łożyskową i jej fragmenty użyteczne w zmniejszaniu okołooperacyjnej utraty krwi u pacjentów przechodzących operację.

Białko według wynalazku w kompozycji z biologicznie zgodnym nośnikiem zapewnia także możliwość zmniejszania okołooperacyjnej utraty krwi u pacjenta, przechodzącego operację, w których pacjentowi podaje się skuteczną ilość ujawnionych ludzkich inhibitorów proteazy serynowej.

Możliwe jest także skonstruowanie odmiany bikuniny łożyskowej oraz specyficznych domen Kunitza opisanych powyżej, które zawierają substytucje aminokwasowe, zmieniające specyficzność proteazową. Zalecane miejsca substytucji wskazano poniżej jako pozycje Xaa' do Xaa³² w sekwencji aminokwasowej natywnej bikuniny łożyskowej. Substytucje przy Xaa’ do Xaa¹⁶ zaleca się także dla odmian bikuniny (7-64), podczas gdy substytucje przy Xaa¹⁷ do Xaa32 zaleca się dla odmian bikuniny (102-159).

W przypadku realizacji takiej odmiany wytwarzane białko posiada następującą sekwencję aminokwasową:

Ala	Asp	Arg	Glu	Arg	Ser	Ile	Xaa1	Asp	Phe	10
Cys	Leu	Val	Ser	Lys	Val	Xaa2	Gly	Xaa3	Cys	20
Xaa4	Xaa0	Xaa6	Xaa7	Xaa	8 Xaa'	9 Trp	Trp	Tyr	Asn	30
Val	Thr	Asp	Gly	Ser	Cys	Gln	Leu	Phe	Xaa10	44
Tyr	Xaan	Gly	Cys	Xaan Xaa13 Xaau Ser	Asn	Asn	50
Tyr	Xaa!0	Thr	Lys	Glu	Glu	Cys	Leu	Lys	Lys	60
Cys	Ala	Thr	Xaa16	Thr	Glu	Asn	Ala	hOn	Gly	77
Asp	Leu	Ser	Thr	Ser	Arg	Asn	Ala	Ala	Asp	80
Ser	Ser	Val	Pro	Ser	Ala	Pro	Arg	Arg	Gln	90
Asp	Ser	Glu	His	Asp	Ser	Ser	Asp	Met	Phe	100
Asn	Tyr	Xaa17	Glu	Tyr	Cys	Tho	Ala	Asn	Ala	110
Val	Xaa18	Gly Xaa19	Cys Xaa20	Xaa21	Xaa22	Xaa23	Xaa24	120
Xaa25 Trp	Tyr Phe	Asp	Val	Glu	Arg	Asn	Ser	130
Cys	Asn	Asn	Phe	Xaa2«	’ Tyr	Xaa27	Gly	Cys	Xaa28	140
Xaa29 Xaa	50 Lys	Asn	Ser	Tyo	Xaa31	Ser	Glu	Glu	150
Ala	Cys	Met	Leu	Arg	Cys	Phe	Arg	Xaa32	Gln	1^0
Glu	Asn	Pro	Ppo	Leu	Ppo	Leu	Gly	Ser	Ls n	117
Val	Val	Val	Leu	Ala	Gly	Ala	Val	Ser		179

(SEQ ID NO: 11) gdzie Xaa'-Xaa32 przedstawiają każda niezależnie naturalnie występującą resztę aminokwasową z wyjątkiem Cys, pod warunkiem, że co najmniej jedna z reszt aminokwasowych Xaa1-Xaa32 jest różna od odpowiadającej reszty aminokwasowej sekwencji natywnej.

188 387

W tym kontekście, określenie „naturalnie występująca reszta aminokwasowa” w zamierzeniu wskazuje każdą z 20 powszechnie występujących aminokwasów, to jest Ala, Arg, Asn, Ap, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.

Przez podstawienie jednego lub więcej aminokwasów w pozycjach wskazanych powyżej, możliwa jest zmiana profilu specyficzności inhibitorowej natywnej bikuniny łożyskowej albo bikuniny z poszczególnymi domenami podobnymi do Kunitza, bikuniny (7-64) lub bikuniny (102-159) tak, że w pierwszym rzędzie hamuje ona inne proteazy serynowe takie jak, nie ograniczając, enzymy pełnej kaskady, TF/FVIIa, FXa, trombinę, elastazę neutrofilową, katepsynę G lub proteinazę-3.

Przykładami zalecanych odmian bikuniny łożyskowej są takie, w których Xaa’ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z His, Glu, Pro, Ala, Val lub Lys, w szczególności w których Xaa' oznacza His lub Pro; albo w których Xaa² oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala, Lys, w szczególności w których Xaa² oznacza Val lub Thr; albo w których Xaa³ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Arg, Pro, Ile, Leu, Thr, w szczególności w których Xaa³ oznacza Arg lub Pro; albo w których Xaa⁴ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Arg, Lys i Ser, Gin, w szczególności w których Xaa⁴ oznacza Arg lub Lys; albo w których Xaa~oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Ala, Gly, Asp, Thr, w szczególności w których Xaa⁵ oznacza Ala; albo w których Xaa” oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe, w szczególności w których Xaa oznacza Ser lub Arg; albo w których Xaa⁷ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr i Val, w szczególności w których Xaa7 oznacza Met lub Ile; albo w których Xaa'⁸ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Pro, Lys, Thr, Gin, Asn, Leu, Ser lub Ile, w szczególności w których Xaći oznacza Pro lub Ile; albo w których Xaa⁹ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Arg, Lys lub Leu, w szczególności w których Xaa9 oznacza Arg; albo w których Xaa¹⁰ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gin, Leu i Thr, w szczególności w których Xaa¹⁰ oznacza Val; albo w których Xaaⁿ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Gly, Ser i Thr, w szczególności w których Xaa^H oznacza Gly; albo w których Xaa¹² oznaczą resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Asp, Arg, Glu, Leu, Gin, Gly, w szczególności w których Xaa¹² oznacza Asp lub Arg; albo w których Xaa¹³ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Gly lub Ala; albo w których Xaa^u oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Asn lub Lys; albo w których Xaa*5 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val i Lys, w szczególności w których Xaa^ oznacza Leu lub Lys; albo w których Xaa¹⁶ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Gin, Asp, Gly, Ile, Ala, Met i Val, w szczególności w których Xaa oznacza Val lub Ala; albo w których Xaa17 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z His, Glu, Pro, Ala, Lys i Val, w szczególności w których Xaa^u oznacza Glu lub Pro; albo w których Xaa'1 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Thr, Asp, Pro, Arg. Tyr, Glu, Ala lub Lys, w szczególności w których Xaa^ oznacza Thr; albo w których Xaa™ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Arg, Pro, Ile, Leu lub Thr, w szczególności w których Xaa¹⁹ oznacza Pro; albo w których Xaa^ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Arg, Lys, Gin i Ser, w szczególności w których Xaa2° oznacza Arg lub Lys; albo w których Xaa21 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Ala, Asp, Thr lub Gly, w szczególności w których Xaa® oznacza Ala, albo w których Xaa22 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg lub Phe, w szczególności w których Xaa²² oznacza Ser lub Arg; albo w których Xa^23 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr i Val, w szczególności w których Xaa2 oznacza Phe lub Ile; albo w których Xaa24 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Pro, Lys, Thr, Asn, Leu, Gin, Ser lub Ile, w szczególności w których Xaa24 oznacza Pro lub Ile; albo w których Xaa25 oznacza resztę aminokwasową wybraną. z grupy, składającej się z Arg, Lys lub Leu, w szczególności w których Xaa25 oznacza Arg; albo w których Xaa26 oznacza

188 387 resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Ile, Lys, Leu, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp i Thr, w szczególności w których Xati oznacza Val lub Ile; albo w których Xaa²⁷ oznacza resztę aminokwasową wybraną' z grupy, składającej się z Gly, 3er i Thr, w szczególności w których Xaa²⁷ oznacza Gly; albo w których Xatt oznacza resztę aminokwasową wybrany z grupy, składającej się z Asp, Ar& Glu, Leu, Gly lub Gin, w szczególności w których Xaa2⁸ oznacza Arg; albo w których Xaa2⁹ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Gly i Ala; albo w których Xaa³⁰ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Asn lub Lys; albo w których Xaaⁿ oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val i Lys, w szczególności w których Xaaⁿ oznacza Arg lub Lys; albo w których Xaa³² oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy, składającej się z Val, Gin, Asp, Gly, Ile, Ala, Met i Thr, w szczególności w których Xaa³2 oznacza Gin lub Ala.

Wynalazek został zilustrowany na rycinach, na których:

Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową E3T R35464 (3EO ID nr 12) i translację tej sekwencji DNA (3EQ ID nr 13), w wyniku której uzyskuje się otwartą ramkę odczytu o pewnym podobieństwie sekwencji do aprotyniny. Produkt translacji zawiera 5 z 6 cystein w prawidłowych odstępach, co jest charakterystyczne dla domen inhibitorowych podobnych do Kunitza (zaznaczone pogrubionym drukiem). Pozycja normalnie zajmowana przez pozostającą cysteinę (przy kodonie 38) zamiast tego zawiera fenyloalaninę (zaznaczoną gwiazdką).

Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową E3T R74593 (3EQ ID nr 14) i translację tej sekwencji DNA (3EQ ID nr 15), w wyniku której uzyskuje się otwartą ramkę odczytu o homologii z klasą Kunitza domen inhibitorów proteazy serynowej. Produkt translacji zawiera 5 z 6 cystein w prawidłowych odstępach, co jest charakterystyczne dla domen inhibitorowych podobnych do Kunitza (zaznaczone pogrubionym drukiem). Jednak ta sekwencja ramki odczytu zawiera kodony przestankowe przy kodonie 3 i 23.

Figura 3 przedstawia wnioskowaną sekwencję kwasu nukleinowego ludzkiej bikuniny łożyskowej (3E.Q ID nr 9) oznaczonej „konsensusowa” i dopasowanej do przepisanej sekwencji aminokwasowej białka oznaczonej „po translacji” (3EQ ID nr 10). Dla porównania, ukazuje się także sekwencję kwasu nukleinowego dla E3T H94519 (3EQ ID nr 16), N39798 (3EQ ID nr 17), R74593 (3EQ ID nr 14) i R35464 (3EQ ID nr 12). Podkreślone nukleotydy w sekwencji konsensusowej odpowiadają miejscu primerów PCR opisanych w przykładach. Podkreślone aminokwasy w sekwencji konsensusowej po translacji są resztami, których identyczność potwierdzono przez sekwencjonowanie aminokwasów oczyszczonej natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej. Kod nukleotydowy i aminokwasowy jest standardowym kodem pojedynczych liter, „N” w kodzie kwasu nukleinowego oznacza nieoznaczony kwas nukleinowy, a oznacza kodon przestankowy w sekwencji aminokwasowej.

Figura 4A przedstawia oryginalne nakładanie się szeregów E3T o pewnej homologii sekwencji kwasu nukleinowego do E3T, kodującej ludzką bikuninę łożyskową, albo jej część. Dla odniesienia pokazano relatywne pozycje bikuniny (7-64) i bikuniny (102-159), zaznaczone odpowiednio KID1 i KID2.

Figura 4B przedstawia kolejne rozleglejsze nakładanie E3T wprowadzające dodatkowe E3T. Liczby na górnej osi X odnoszą się do długości w parach zasad, zaczynając od pierwszej zasady od sekwencji najbardziej 5' E3T. Długość każdego słupka jest proporcjonalna do długości w parach zasad poszczególnych E3T, łącznie z odstępami. Numery dostępu ENE zaznaczono na prawo od odpowiadających im słupków.

Figura 4C przedstawia odpowiadające uszeregowanie sekwencji oligonukleotydowych każdej nakładającej się E3T ukazanej schematycznie w fig. 4B. Górna sekwencja bikuniny oznaczona (3EQ ID nr 51) przedstawia konsensusową sekwencję oligonukleotydową pochodzącą od nakładających się nukleotydów z każdej pozycji. Liczby odnoszą się do pozycji par zasad w mapie E3T. Oligonukleotydy w E3T R74593, które pogrubiono i podkreślono (w pozycjach na mapie 994 i 1005) są insertami zasad obserwowanymi w R74593, które były konsekwentnie nieobecne w każdej z innych nakładających się E3T.

Figura 4D przedstawia translację aminokwasów konsensusowej sekwencji oligonukleotydowej dla bikuniny opisanej w fig. 4C (3EQ ID nr 45).

188 387

Figura 4E przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID nr 46) i odpowiadającą translację aminokwasów (SEQ ID nr 47), pochodzącą z ludzkiej łożyskowej biblioteki cDNA przez powielenie oparte o PCR.

Figura 4F przedstawia sekwencję nukleotydową (SEQ ID nr 48) i odpowiadającą translację (SEQ ID nr 49), kodującą natywną ludzką bikuninę, pochodzącą z klonu, który wyizolowano z ludzkiej łożyskowej biblioteki cDNA lambda przez hybrydyzację kolonii.

Figura 4G przedstawia uszeregowanie aminokwasów po translacji z sekwencji oligonukleotydowych dla bikuniny łożyskowej otrzymanej przez nałożenie EST (SEQ ID nr 45), kloning w oparciu o PCR (SEQ ID nr 47) oraz konwencjonalną hybrydyzację kolonii lambda (SEQ ID nr 49).

Figura 5 ukazuje wykres oczyszczania ludzkiej bikuniny łożyskowej z tkanki łożyska po filtracji żelowej Superdex 75. Wykres jest naniesieniem profilu elucji białka zmierzonym przez OD 280 nm (linia ciągła), aktywności wymywanego białka w oznaczeniu inhibicji trypsyny (% inhibicji ukazano kółkami) oraz aktywności wymywanego białka w oznaczeniu inhibicji kallikreiny (% inhibicji ukazano kwadratami).

Figura 6 ukazuje wykres oczyszczania ludzkiej bikuniny łożyskowej z tkanki łożyska przy użyciu chromatografii z odwrotną fazą na kolumnie C18. Wykres jest naniesieniem profilu wymywania białka zmierzonym przez OD 215 (linia ciągła), aktywności wymywanego białka w oznaczeniu inhibicji trypsyny (% inhibicji ukazano kółkami) oraz aktywności wymywanego białka w oznaczeniu inhibicji kallikreiny (% inhibicji ukazano kwadratami).

Figura 7 opisuje żel SDS-PAGE z barwieniem srebrem wysoko oczyszczonej bikuniny łożyskowej (tor 2) oraz szeregi białek markerowych wielkości cząsteczkowych (tor 1) o wielkościach zaznaczonych w kilodaltonach. Migracja zachodziła od góry w dół.

Figura 8 ukazuje ilość aktywności hamującej trypsyny obecnej w bulionie fermentacyjnym pozbawionym komórek z hodowli szczepów drożdży SC 101 (tabela 8A) lub WHL341 (tabela 8B), stabilnie transformowanych plazmidem (pS604), który kieruje ekspresją bikuniny łożyskowej.

Figura 9 ukazuje SDS-PAGE z barwieniem srebrem (pole lewe) oraz Western blot z pAB anty-bikuninie łożyskowej (102-159) (pole prawe) bulionu fermentacyjnego pozbawionego komórek z hodowli szczepu drożdży SC 101 (rekombinanty 2,4 i 2,5) stabilnie transformowanego plazmidem, kierującym ekspresją albo aprotyniny bydlęcej, albo bikuniny łożyskowej (102-159). Migracja zachodziła z góry na dół.

Figura 10 jest fotografią, ukazującą SDS-PAGE z barwieniem srebrem wysoko oczyszczonej bikuniny łożyskowej (102-159) i szeregi białek markerowych wielkości cząsteczkowych (tor 1) o wielkościach wskazanych w kilodaltonach. Migracja zachodziła z góry na dół.

Figura 11 jest fotografią, ukazującą wyniki Nothern blot mRNA z różnych tkanek człowieka, które hybrydyzowano z sondą cDNA znakowaną ³²P, kodującą albo bikuninę łożyskową (102-159) (tabela 11A), albo bikuninę łożysko wą(1-123) (tabela 11B). Migracja zachodziła z góry na dół. Liczby na prawo od każdego odcisku odnoszą się do wielkości w kilozasadach sąsiadujących markerów RNA. Narządy, z których pochodzi mRNA opisano pod każdym torem odcisku.

Figura 12 opisuje odcisk immunologiczny bikuniny łożyskowej pochodzącej z łożyska za pomocą króliczego antyserum wywołanego albo przeciw syntetycznej zredukowanej bikuninie łożyskowej (7-64) (tabela A), albo 102-159 (tabela B). Każda tabela zawiera: markery wielkości cząsteczkowej (tory 1); natywną bikuninę łożyskową wyodrębnioną z łożyska człowieka (tory 2); syntetyczną bikuninę łożyskową (7-64) (tory 3) i syntetyczną bikuninę łożyskową (102-159) (tory 4). Wykonano odciski na żelach SDS-PAGE z 10-20% tricynąi wywołano z białkiem A - pierwotnym przeciwciałem poliklonalnym (8 pg IgG w 20 ml 0,1% BSA/solanka buforowana Tris (pH' 7,5)), po czym wtórnym przeciwciałem kozim antykróliczym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Migracja zachodziła z góry na dół.

Figura 13 opisuje SDS-PAGE z 10-20% tricyny i z barwieniem błękitem Coomassie 3 mikrogramów wysoko oczyszczonej bikuniny łożyskowej (1-70), pochodzącej z układu ekspresji bakulowirus/Sf9 (tor 2). Tor 1 zawiera markery wielkości cząsteczkowej. Migracja zachodziła z góry na dół.

188 387

Figura 14 opisuje porównanie wpływu zwiększania stężeń albo ludzkiej bikuniny łożyskowej pochodzącej od Sf9 (1-70) (kółka wypełnione), syntetycznej bikuniny łożyskowej (102-159) (puste kółka), albo aprotyniny (puste kwadraty) na czas częściowo aktywowanej tromboplastyny ludzkiego osocza. Krzepnięcie inicjowano CaCl₂. Nanosi się stężenie białek kontra krotność wydłużenia czasu krzepnięcia. Niehamowany czas krzepnięcia wynosił 30,8 sekundy.

Niniejszy wynalazek obejmuje nowo zidentyfikowane białko ludzkie zwane tutaj ludzką bikuniną łożyskową klasy Kunitza. Niniejszy wynalazek obejmuje także kompozycje farmaceutyczne, zawierające bikuninę łożyskową i jej fragmenty, użyteczne w zmniejszaniu okołooperacyjnej utraty krwi u pacjenta, przechodzącego operację, albo z dużym urazem.

Ludzkie inhibitory proteazy serynowej według niniejszego wynalazku zawarte w biologicznie zgodnym nośniku umożliwiają także zmniejszanie okołooperacyjnej utraty krwi u pacjenta, przechodzącego operację lub spowodowanej dużym urazem.

Zalecanym stosowaniem bikuniny łożyskowej, wyodrębnionych domen i innych odmian, jest zmniejszanie utraty krwi, wynikającej z urazu lub operacji, w której istnieje możliwość utraty dużych objętości krwi. Sposoby te i kompozycje zmniejszają lub eliminują potrzebę dawcy krwi w całości lub produktów krwiopochodnych, zmniejszając przez to ryzyko infekcji i innych niekorzystnych skutków ubocznych, jak również kosztów operacji. Metody są więc użyteczne w zmniejszaniu utraty krwi u normalnych pacjentów, to jest tych, którzy nie cierpią z powodu wrodzonych czy innych przedoperacyjnych niedoborów czynników koagulacji. Jako zmniejszenie utraty krwi uważa się zmniejszenie utraty krwi podczas operacji, zmniejszenie drenażu pooperacyjnego, albo jednego i drugiego. Zalecane zastosowania chirurgiczne obejmują, nie ograniczając, stosowanie w chirurgii klatki piersiowej i jamy brzusznej, operacje całkowitej lub częściowej wymiany stawu biodrowego oraz operacje leczące pacjentów, mających uszkodzenie nabłonka oka. Zalecane procedury operacyjne klatki piersiowej obejmują nie ograniczając, obejście aortalno-wieńcowe, wycięcie tętniaka serca i aorty oraz operacje żylaków przełyku i operacje obejść naczyń wieńcowych. Zalecanymi operacjami jamy brzusznej są, nie ograniczając przeszczepy wątroby, radykalne usunięcie prostaty, operacja zapalenia uchyłka okrężnicy, zmniejszanie wielkości guza, operacja na aorcie brzusznej oraz operacja wrzodów dwunastnicy, i naprawa uszkodzeń wątroby i śledziony. Zalecanymi zastosowaniami w leczeniu urazu są, nie ograniczając, zastosowania w stabilizacji pacjentów poważnie rannych w wypadku, cierpiących z powodu np. utraty nogi albo dużych zranień klatki piersiowej/jamy brzusznej. W przypadku stosowania przy zmniejszaniu utraty krwi wynikającej z operacji, zaleca się podanie bikuniny łożyskowej, wyodrębnionych domen lub innej odmiany przed albo podczas operacji, podczas gdy w przypadku stosowania w leczeniu urazów zaleca się podanie bikuniny łożyskowej, wyodrębnionych domen lub innej odmiany możliwie jak najszybciej po zranieniu i powinny one być na stanie w pojazdach pogotowia zmierzających na miejsce wypadku.

Czynnik XII (znany także jako czynnik Hagemana) jest proteazą serynową, którą odkryto w układzie krążenia w postaci zymogenu (80 kD) w ilości około 29-40 pg/ml (patrz Pixley i in., (1993) Meth. in Enz. 22, 51-64) i aktywuje go kallikreina tkankowa lub osocza. Raz aktywowany, uczestniczy w wewnętrznym szlaku krzepnięcia, który jest aktywowany po zetknięciu krwi lub osocza z „obcą” lub anionową powierzchnią. Raz aktywowany, czynnik XIIa może więc rozszczepić i aktywować liczne proteazy osocza, łącznie z czynnikiem XI, prekallikreiną i Cl układu dopełniacza. Tak więc czynnik XII może być związany z powodowaniem reakcji podciśnieniowych, ponieważ aktywowana kallikreina może rozszczepić bradykininę uwalniającąkininogen (patrz Colman, (1994) J. Clin. Invest., 73, 1249).

Sepsa jest chorobą, która wynika z infekcji bakteryjnej z powodu endotoksyny bakteryjnej lub lipopolisacharydu (LPS). Wystawienie czynnika XII na LPS powoduje aktywację czynnika XII. Pacjenci z sepsą mają często objawy koagulacji wewnątrznaczyniowej, którą także może powodować aktywacja czynnika XII przez LPS. Wstrząs septyczny może wynikać z infekcji bakteryjnej i jest związany z gorączką, niską odpornością układu naczyniowego oraz niskim ciśnieniem tętniczym. Powszechne są przypadki śmierci w jednostkach intensywnej opieki w Stanach Zjednoczonych, gdzie siedemdziesiąt pięć procent pacjentów, którzy umierają z powodu wstrząsu septycznego ma stałe niskie ciśnienie (patrz Parillo i in., (1989) Ann Rev Med., 40, 469-485).

188 387

Zespól wyczerpania oddechowego dorosłych charakteryzuje się obrzękiem płuc, niedotlenieniem krwi i zmniejszoną podatnością płuc. Patogeneza tej choroby nie jest aktualnie znana chociaż uważa się, że rolę w niej odgrywają szlaki proteolityczne krzepliwości i fibrynolizy (patrz Carvalho i in., (1989) J. Lab. Clin. Med., 112: 270-277).

Białka według niniejszego wynalazku są także nowymi ludzkimi inhibitorami kallikreiny, typu Kunitza, która aktywuje czynnik XII. Tak więc, innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest przedstawienie sposobu profilaktycznego lub leczniczego traktowania układowych reakcji zapalnych, takich jak wstrząs septyczny, zespół wyczerpania oddechowego dorosłych (ARDS), niewydolność wielonarządowa i rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe (DIC). Terapeutyczne lub profilaktyczne podawanie peptydów według niniejszego wynalazku da w wyniku modulację tych stanów zapalnych i będzie korzystne dla pacjenta.

Plazmina odgrywa istotną rolę w rozkładzie matriks zewątrzkomórkowej i aktywacji kaskad matriks-metaloproteaza (MMP). W sumie proteazy te pośredniczą w migracji i inwazji tkanki zarówno przez komórki nabłonka podczas rozwoju naczyń/tworzenia nowych naczyń, jak i komórek raka podczas przerzutów. Tworzenie się nowych naczyń jest zasadnicze dla utrzymania wzrostu guza i przerzut jest procesem, który pośredniczy w rozprzestrzenianiu się guzów oraz który wiąże się z bardzo złym prognozowaniem dla pacjenta.

Kilka badań przeklinicznych sugeruje, że inhibitory proteaz serynowych podobne do Kunitza, o specyficzności proteazowej podobnej do aprotyniny, są użytecznymi lekami na raka. Przykładowo, aprotynina zmniejsza wzrost i naciekanie guza, wraz ze zwiększeniem nekrozy guza, po podaniu chomikom, noszącym bardzo inwazyjnego włókniakomięsaka albo myszom, noszącym podobnie złośliwego raka sutka (Latner i in., (1974), Br. J. Cancer 30: 60-67; Latner i Turner (1976) Br. J. Cancer 33: 535-538). Ponadto, podanie 200 000 KIU aprotyniny dootrzewnowo samcom myszy C57B1/6 Cr w dniach 1 do 14 po zaszczepieniu komórkami raka płuca Lewisa, zmniejszyło przerzuty płucne o 50% chociaż nie miało wpływu na masę guza pierwotnego (Giraldi i in., (1977) Eur. J. Cancer, 13: 1321-1323). Podobnie, podanie 10 000 KIU dootrzewnowo każdego dnia 13-16 po zaszczepieniu myszy C57BL/5J komórkami guza Lewisa, zahamowało przerzuty płucne o 90% bez wpływu na wzrost guza pierwotnego (Uetsuji i in., (1992) Jpn. J. Surg. 22: 429-442). W tym samym badaniu, podanie plazminy lub kallikreiny z tym samym trybem dawkowania dowiodło zmniejszenie liczby przerzutów płucnych. Wyniki te nakłaniają autorów do przypuszczenia, że okołooperacyjne podanie aprotyniny pacjentom z rakiem może zmniejszyć prawdopodobieństwo przerzutu. Black i Steger (1976, Eur. J. Pharmacol., 38: 313-319) odkryli, że aprotynina hamuje wzrost wszczepionego mięsaka limfatycznego gryzoni Murphy-Strum u szczurów i sugerowali, że wiąże się z hamowaniem układu enzymów, tworzących kininę. Wstrzykiwanie dwa razy dziennie dootrzewnowo 10 000 KIU aprotyniny przez 7 tygodni samicom myszy ddY, z których każda niosła pojedynczego autochtonicznego raka komórek łuskowatych, powstałego w wyniku traktowania 3-metylocholantrenem, zmniejszyło tempo wzrostu guzów pierwotnych o 90%. U niektórych zwierząt obserwowano regresję guza. Mimo, że wszystkie zwierzęta traktowane samym nośnikiem padły w ciągu siedmiu tygodni, wszystkie z grupy traktowanej aprotyniną przeżyły. Zmniejszenie wzrostu guza związane było z nadmiernym rogowaceniem (Ohkoshi, Gann (1980), 71: 246-250).

Klinicznie, operacyjnie leczona grupa 26 pacjentów, którzy otrzymywali aprotyninę dożylnie, wykazała 70%> przeżycie dwóch lat po operacji bez nawrotów guza, podczas gdy grupa 26 pacjentów, otrzymujących placebo w tym samym czasie wykazała tylko 38% przeżycia z istotnym współczynnikiem nawrotów guza (Freeman i in., Br. Soc. Gastroenterol. (1980) suplement A: 902). W badaniu przypadku (Guthrie i in., Br. J. Clin. Pract. (1981) 35: 330-332), podawanie bromokryptyny z aprotyniną pacjentkom z zaawansowanym rakiem szyjki, powodowało remisję. Aprotyninę podawano zarówno jako 500 000 KIU dootrzewnowo w bolusie co osiem godzin, równocześnie z ciągłym wlewem dożylnym aprotyniny w tempie 200 000 KIU na 6 godzin, przez siedem dni raz w miesiącu. Leczenie zakończono po czterech miesiącach z powodu rozwoju reakcji alergicznej na aprotyninę. Późniejsze dowody podkreślają rolę plazminy jako celu dla tego wpływu aprotyniny na przerzuty.

Mechanizm tych zdarzeń można odnieść do faktu, że aprotynina blokuje inwazyjną siłę linii komórkowych raka (G. Liu i in., Int. J. Cancer (1995), 60: 501-506). Ponadto ponieważ białka według niniejszego wynalazku są także silnymi inhibitorami plazminy i kallikreiny,

188 387 rozważa się ich stosowanie jako środków antyrakowych. Przykładowo, rozważa się je pod kątem stosowania w blokowaniu wzrostu guza pierwotnego przez restrykcję tworzenia się nowych naczyń, inwazji guza pierwotnego i w blokowaniu przerzutu przez inhibicję naciekania tkanki. Związki można podawać miejscowo do guza lub układowo. W zalecanym sposobie leczenia, białko będzie podawane okołooperacyjnie podczas zmniejszania objętości guza, aby zminimalizować ryzyko przerzutu. Przy takim reżimie, właściwości związku oszczędzania krwi będą dodatkowo korzystne zapewniając czystszy wygląd pola operacyjnego. Innym zalecanym sposobem podawania będzie terapia połączona albo z inhibitorami MMP, albo z chemoterapią. Dodatkowym zalecanym sposobem podawania będzie miejscowo podawana terapia genowa przeznaczona do uzyskania selektywnej ekspresji bikuniny łożyskowej wewnątrz komórek guza, albo towarzyszącemu im zrębowi i łożyskom naczyniowym.

Zalecanymi typami raków, będących celem terapii, będą guzy stałe, zależne od naczyń, takie jak raki piersi, okrężnicy, płuca, prostaty i jajnika, które wykazują dużą siłę przerzutową i te, dla których miejscowe dostarczenie białka o wysokim stężeniu jest ułatwione, tak jak raki płuc przez dostarczenie drogami oddechowymi, raki okrężnicy przez dostarczenie wątrobowe do przerzutu wątrobowego, albo raki skóry, takie jak raki głowy i szyi lub czerniaki, przez dostarczenie podskórne. Ponieważ białka według niniejszego wynalazku są pochodzenia ludzkiego, mniejsze byłoby prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji alergicznych czy anafilaktycznych rodzaju obserwowanego przez Guthrie i in., jak wyżej, po ponownym użyciu.

Dodatkowo, białka według niniejszego wynalazku rozważa się pod względem zastosowania w zmniejszaniu komplikacji zakrzepowo-zatorowych związanych z aktywacją wewnętrznego szlaku krzepnięcia. Obejmowałoby to zapobieganie zatorom płucnym u pacjentów z późnymi stanami rakowymi, częstym przyczynom śmierci (MB. Donati (1994) Haemostasis 24: 128-131).

Obrzęk mózgu i rdzenia kręgowego jest powikłaniem, wynikającym z urazu mózgu lub uszkodzenia rdzenia kręgowego, udaru, niedokrwienia mózgu, krwotoku mózgowego i podpajęczynówkowego, operacji (łącznie z operacją na otwartym sercu), chorobom infekcyjnym, takim jak zapalenie mózgu, zapalenie opon mózgowych, chorób zaminiakowych, takich Sarkoid i raki skupione lub rozproszone, i jest on przyczyną wysokiego poziomu zachorowań i śmierci w następstwie tych zdarzeń. Bradykinina znana jest z tego, że przerywa doświadczalnie barierę krew-mózg (J. Greenwood (1991), Nueroradiology, 33: 95-100; Whittle i in., (1992), Acta Neurochir., 115: 53-59), a infuzja bradykininy do wewnętrznej tętnicy szyjnej indukowała obrzęk mózgu u szczurów z samorzutnym nadciśnieniem (SHR) poddanych zwykłemu zamknięciu tętnicy szyjnej (Kamiya, (1990), Nippon łka Daigaku Zasshi. 57: 180-191). Podwyższony poziom bradykininy odkryto w płynach zewnątrzkomórkowych w następstwie urazu w modelu, obejmującym uraz rdzenia kręgowego szczura (Xu i in., (1991), J. Neurochem, 57: 975-980) oraz w osoczu i tkance od szczurów z obrzękiem mózgu, wynikającym z niedokrwienia mózgu (Kamiya i in,, (1993), Stroke, 24: 571-575). Bradykinina uwalniana jest z kininogenu o wysokiej masie cząsteczkowej, przez proteazy serynowe, łącznie z kallikreiną (Coleman (1984) J. Clin. Invest. 73: 1249), a inhibitor proteazy serynowej aprotynina, jak odkryto, blokuje wielkość obrzęku mózgu, wynikającego z niedokrwienia mózgu u szczurów z SHR (Kamiya (1990), Nippon łka Daigaku Zasshi. 57: 180-191; Kamiya i in., (1993), Stroke, 24: 571-575) oraz królików poddanych zimnemu uszkodzeniu mózgu (Unterberg i in., (1986), J. Neurosurgery, 64: 249-276).

Obserwacje te wskazują, że obrzęk mózgu wynika z miejscowego proteolitycznego uwalniania kinin, takich jak bradykinina, z kininogenu o wysokiej masie cząsteczkowej, poprzedzonego zwiększeniem przenikalności bariery krew-mózg indukowanym przez bradykininę. W związku z tym, rozważa się bikuninę łożyskową i jej fragmenty jako leki zapobiegające obrzękowi u pacjentów z ryzykiem tego stanu, zwłaszcza tych z wysokim ryzykiem śmiertelności lub uszkodzeniem mózgu. Obejmuje to pacjentów z urazem głowy i rdzenia, pacjentów z wieloma urazami, pacjentów, przechodzących operację mózgu lub rdzenia kręgowego i związanych z nimi naczyń, albo inne operacje ogólne, łącznie z operacjami na otwartym sercu, pacjentów, którzy cierpią z powodu udaru, krwotoku mózgowego lub podpajęczynówkowego, infekcyjnych chorób mózgu, chorób ziaminiakowych mózgu albo rozsianych lub skupionych raków i guzów mózgu, albo wszystkich stanów, takich jak stwardnienie

188 387 rozsiane, łącznie z przerwaniem bariery krew-mózg, lub pacjentów, cierpiących z powodu każdego innego procesu zapalnego mózgu czy rdzenia kręgowego. Pacjenci otrzymywaliby bikuninę łożyskową albo w postaci infuzji, albo iniekcji w bolusie, dożylnie lub doczaszkowo. Dodatkowe dawki bikuniny łożyskowej powinno się podawać z przerwami przez następne jeden do trzech tygodni. Poziom dawki wyznaczony byłby taki, aby utrzymać krążące stężenie, przekraczające stężenie wymagane do zobojętnienia w osoczu zwiększonego poziomu bradykininy i innych peptydów naczynioaktywnych utworzonych przez działanie proteaz serynowych, oraz zmniejszyć obrzęk. Ponieważ białko jest pochodzenia ludzkiego, powtarzające się podawanie w tym kursie terapii, nie powodowałoby wywołania reakcji immunologicznej wobec białka. Bikunina łożyskowa i jej fragmenty rozważałoby się pod kątem terapii pojedynczej lub profilaktyki, jak również pod kątem stosowania w połączeniu z innymi lekami, takimi jak neuroterapeutyki i neuroprotektanty.

Ostatnie doniesienie (R.A. Dela Cadena i in., (1995) FA3EB J. 9: 446-452) wskazuje, że kontaktowy szlak aktywacyjny może się przyczyniać do patogenezy zapalenia stawów i anemii, oraz że inhibitory kallikreiny mogą być korzystne terapeutycznie. W związku z tym, inhibitory według niniejszego wynalazku rozważa się zgodnie z ich zdolnością do hamowania ludzkiej kallikreiny, jako leki do leczenia zapalenia stawów i anemii u ludzi.

Leczenie pacjentów mężczyzn z cukrzycą nie insulinową (NIDDM) aprotyniną istotnie poprawiło wychwyt glukozy całkowitej i zmniej szyło tempo klirensu metabolicznego insuliny (Laurenti i in., (1996), Diabetic Medicine 13: 642-645). W związku z tym, ludzkie białka według niniejszego wynalazku rozważa się do długotrwałego stosowania jako leku do leczenia NIDDM.

Codzienne leczenie pacjentek z ryzykiem przedwczesnego porodu inhibitorem trypsyny do dróg moczowych, przez dwa tygodnie, istotnie zmniejszyło nawracające skurcze macicy (Kanayama i in., (1996), Eur. J. Obstet. Gynecol. &Reprod. Biol 67: 133-138). W związku z tym, białka ludzkie według niniejszego wynalazku rozważa się pod kątem stosowania w zapobieganiu przedwczesnym porodom.

Aprotyniną, jak się okazało, stymuluje różnicowanie mioblastów myszy w hodowli (Wells i 3trickland, Development, (1994), 120: 3639-3647), proces, hamowany przez TGFb. TGFb istnieje w postaci nieaktywnego propolipeptydu aktywowanego przez ograniczoną proteolizę. Zaproponowano mechanizm działania aprotyniny, aby hamować proteazy, które przekształcają pro-TGFb w dojrzałe formy aktywne. TGFb, jak się okazało, występuje w nadmiarze przy rozmaitych uszkodzeniach włóknienia i długo uważany był za potencjalny cel terapii zapobiegającej włóknieniu. Przykładowo w szczurzym modelu zwłóknienia płuc, stężenia TGF-b były równoległe do zwiększania się zapalenia indukowanego przez bleomycynę. Ponadto, poziom plazminy w makrofagach pęcherzyków współistniał z poziomem dojrzałego TGF-b, a dodanie inhibitora plazminy a-2-antyplazminy znosiło posttranslacyjną aktywację pro-TGFb przez makrofagi (Khal i in., (1996), Am. J. Respir. Celi Mol. Biol. 15: 252-259). Dane sugerują że plazmina przyczynia się do tworzenia aktywnego TGFb dzięki makrofagom pęcherzykowym i że ten proces odgrywa patologiczną rolę w zapaleniu płuc indukowanym przez bleomycynę.

W świetle tych obserwacji, bikuninę łożyskową i jej fragmenty rozważa się pod kątem wykorzystania jako środków terapeutycznych do różnych schorzeń włóknienia, łącznie z włóknieniem płuc, wątroby, nerek i skóry (twardzina skóry).

Aprotyniną w postaci aerozolu, jak się okazało, zabezpiecza >50% myszy zakażonych letalną dawką albo wirusa grypy, albo paramyksowirusa (Ovcharenko i Zhirnov, Antiviral Research, (1994), 23: 107-118). Zanotowano także hamowanie rozwoju śmiertelnego krwotocznego zapalenia oskrzeli i płuc oraz normalizację przyrostu ciężaru ciała, dzięki leczeniu aerozolem aprotyniny. W świetle tych obserwacji, bikuninę łożyskową i jej fragmenty rozważa się pod kątem stosowania jako środka terapeutycznego do różnych grypopodobnych chorób oddechowych.

Ludzka bikunina łożyskowa, wyodrębnione domeny i inne odmiany wynalazku rozważa się pod kątem stosowania medycznego/terapeutycznego sugerowanego wobec natywnej aprotyniny lub analogów aprotyniny o innym profilu inhibicji, w szczególności tych, które wymagają wielkich dawek. Będą to choroby, wobec których wskazane będzie stosowanie ludzkiego białka, z powodu jego zdolności hamowania ludzkich proteaz serynowych, takich jak trypsyna,

188 387 plazmina, kallikreina, elastaza, katepsyna G i proteinaza-3, które obejmują i nie ograniczają się do ostrego zapalenia trzustki (elastaza trzustkowa i trypsyna), zapalenia, małopłytkowości, zabezpieczenia działania płytek krwi, zabezpieczenia narządów, leczenia zranień, różnych postaci wstrząsu, łącznie z wstrząsem płucnym, wstrząsem endotoksynowym i komplikacjami pooperacyjnymi; zaburzeń krzepliwości krwi, takich jak krwotok hiperfibrynolityczny; ostrych i przewlekłych reakcji zapalnych, w szczególności leczenia i profilaktyce uszkodzeń narządów, takich jak np. zapalenie trzustki i zapalenie jelita wywołane promieniowaniem, reakcji zapalnych, w których pośredniczy kompleks, takich jak odpornościowe zapalenie naczyń, zapalenie kłębuszków nerkowych i różne rodzaje zapalenia stawów; kolagenoz, w szczególności reumatoidalnego zapalenia stawów; rodzajów zapalenia stawów powodowanych przez odkłady związane z metabolizmem (np. skaza moczanowa); degeneracji elastycznych składników części tkanki łącznej narządów, takich jak miażdżycy tętnic (elastaza surowicy) lub rozedmy płuc (elastaza neutrofilowa); zespołu wyczerpania oddechowego dorosłych, chorób zapalnych jelit oraz łuszczycy.

Głównym nieoczekiwanym odkryciem było to, że syntetyczne peptydy, kodujące bikuninę (7-64) i bikuninę (102-159), mogły się prawidłowo fałdować do prawidłowej konformacji trójwymiarowej, posiadającej bioaktywność aktywnego inhibitora proteazy (przykłady odpowiednio 2 i 1). Podczas fałdowania, każdy z tych fragmentów przechodził zmniejszenie masy o 6 jednostek masy, zgodnie z tworzeniem, w każdym wypadku, trzech wewnątrzłańcuchowych wiązań disiarczkowych między sześcioma resztami cysternowymi każdego fragmentu. Innym zaskakującym odkryciem jest to, że syntetyczne peptydy, kodujące bikuninę (7-64), bikuninę (102-159) i bikuninę (1-170) wysoce hamują plazminę oraz kallikreinę zarówno tkankową. jak i osocza (przykład odpowiednio 4, 3 i 10). Hamowanie plazminy i kallikreiny przez Trasylol® uważane jest za związane z mechanizmem, przez który Trasylol® zmniejsza utratę krwi podczas operacji na otwartym sercu. Nieoczekiwane odkrycia Zgłaszającego specyficzności domen Kunitza według niniejszego wynalazku czyni je odpowiednimi środkami terapeutycznymi do tamowania krwi podczas operacji lub urazu, gdzie ma miejsce znaczna utrata krwi, albo do innych stanów, gdzie korzystna byłaby inhibicja plazminy i/lub kallikreiny.

Ponadto Zgłaszający wykazał w tym opisie (przykład 10), że bikunina łożyskowa (1-170) jest silnym inhibitorem czynnika XIa i średnim inhibitorem czynnika Xa. Czynnik XIa odgrywa zasadniczą rolę w wewnątrznym szlaku krzepnięcia, służąc do przekształcania nieczynnego czynnika IX w aktywny czynnik IXa. Tak więc, bikunina łożyskowa hamuje dwa kluczowe enzymy wewnątrznego szlaku kallikreiny i czynnika XIa. Zgodnie z tymi obserwacjami, Zgłaszający wykazał także, że bikunina łożyskowa (1-170) jest silnym inhibitorem czasu aktywowanej częściowo tromboplastyny, który jest pomiarem prędkości krzepnięcia kierowanego przez szlak wewnętrzny. Z drugiej strony, Zgłaszający wykazał, że bikunina łożyskowa (1-170) jest bardzo słabym inhibitorem kompleksu tkankowego czynnika Vna, sugerując, że nie jest on istotny w regulacji wewnętrznej kaskady krzepnięcia. W oparciu o te nieoczekiwane odkrycia, bikuninę łożyskową rozważa się pod kątem stosowania wobec chorób, w których aktywacja wewnętrznego szlaku krzepnięcia przyczynia się zasadniczo do mechanizmu chorobowego. Przykładami takich chorób są wstrząs pourazowy i rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe.

Istotną korzyścią domen Kunitza jest to, że są one białkami ludzkimi, a także mniejszy ładunek dodatni niż Trasylol® (przykład 1), co zmniejsza ryzyko uszkodzenia nerek przy podawaniu wielkich dawek białek. Będąc pochodzenia ludzkiego, białko według niniejszego wynalazku można więc podawać pacjentom - ludziom z istotnie zmniejszonym ryzykiem niepożądanych reakcji immunologicznych w porównaniu z podawaniem podobnych dawek Trasylolu®. Ponadto odkryto, że bikunina (102-159), bikunina (7-64) i bikunina (1-170) są znacznie silniejszymi inhibitorami kallikreiny osocza in vitro niż Trasylol® (przykłady 3, 4 i 10). Tak więc bikunina i jej fragmenty jak się oczekuje, skuteczniej obniżają utratę krwi u pacjentów in vivo.

Ilość podawanego inhibitora proteazy serynowej powinna wystarczać do zapewnienia powyższego normalnego poziomu w osoczu. W celu profilaktycznego zmniejszenia krwawienia podczas i po operacji obejścia aortalno-wieńcowego (CABG), białka według niniejszego wynalazku można stosować w miejsce Trasylolu®, biorąc pod uwagę różnice w sile. Stosowanie Trasylolu® naszkicowano w Physicians Desk Reference, (1995), wymieniając Trasylol®

188 387 w suplemencie A. Krótko, pacjentowi, leżącemu na plecach, podaje się powoli dawkę uderzeniową bikuniny łożyskowej, wyodrębnionej domeny lub innej odmiany, przez około 20-30 minut po wywołaniu uśpienia lecz przed nacięciem mostka. Ogólnie, zastosuje się całkowitą dawkę^ wynoszącą między wartością około 2x10⁶ KIU (jednostek hamowania kallikreiny) i 8x10⁶ KIU, w zależności od takich czynników jak ciężar pacjenta i długość operacji. Zalecane dawki uderzeniowe zawierają całkowitą ilość 1 do 2 milionów jednostek hamowania kallikreiny (KIU). Po podaniu całej dawki uderzeniowej, następuje stała dawka infuzyjna, którą kontynuuje się do zakończenia operacji i opuszczenia przez pacjenta sali operacyjnej. Zalecane dawki infuzyjne wynoszą około 250 000 do 500 000 KIU na godzinę. Do płynu sprawdzającego urządzenie do krążenia pozaustrojowego dodaje się dawkę sprawdzającą pompę, przez wymianę równej ilości płynu sprawdzającego do urządzenia krążenia pozaustrojowego. Zalecane dawki sprawdzające pompę zawierają całkowitą ilość jednego do dwóch milionów KIU.

Białka według niniejszego wynalazku wykorzystuje się w kompozycjach farmaceutycznych tworzonych w sposób znany w tej dziedzinie. Takie kompozycje zawierają składnik(i) aktywny razem z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, rozcieńczalników, wypełniaczy, środków wiążących i innych zarobek, w zależności od sposobu podawania i rozważanej postaci dawkowania. Przykładami terapeutycznie obojętnych nieorganicznych lub organicznych nośników znanych fachowcom są, nie ograniczając laktoza, skrobia kukurydziana lub jej pochodne, talk, oleje roślinne, woski, tłuszcze, poliole, takie jak glikol polietylenowy, woda, sacharoza, alkohole, gliceryna i inne. Można także dodawać różne konserwanty, środki emulgujące, rozpraszające, zapachowe, środki zwilżające, przeciwutleniacze, środki słodzące, barwiące, stabilizujące, sole, bufory i temu podobne, według potrzeby, aby pomóc stabilizować preparat albo pomóc zwiększyć biodostępność składnika(ów) aktywnego lub uzyskać preparat o dopuszczalnym smaku czy zapachu w przypadku dawkowania doustnego. Inhibitor wykorzystany w takich kompozycjach może występować w postaci samego związku początkowego albo ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Białka według niniejszego wynalazku można podawać same lub w rozmaitych połączeniach z innymi kompozycjami terapeutycznymi, kompozycje tak ułożone wybiera się według potrzeby do podawania inhibitora każdym odpowiednim sposobem znanym osobie fachowej.

Podawanie pozajelitowe obejmuje drogi dożylne (i.v.), podskórne (s.c.), dootrzewnowe (i.p) oraz domięśniowe (i.m.). Podawanie dożylne można stosować do uzyskania czułej regulacji piku stężeń leku w osoczu, jaka może być potrzebna. Alternatywnie, lek można podawać w żądanym tempie w sposób ciągły, przez cewnik i.v. Odpowiednimi podłożami są jałowe, niepirogenne rozcieńczalniki wodne, takie jak jałowa woda do wstrzyknięć, jałowe roztwory buforowane lub jałowe roztwory soli. Otrzymaną kompozycję podaje się pacjentowi przed i/lub w czasie operacji przez injekcję lub infuzję dożylną.

Poprawę okresu półtrwania i nacelowanie leku na fagosomy, takie jak neutrofile i makrofagi związane z zapaleniem można uzyskać przez zamknięcie leku w liposomach. Powinno być możliwe poprawienie selektywności celów liposomowych przez wprowadzenie do otoczenia liposomów ligandów, wiążących się z makrocząsteczkami specyficznymi wobec docelowych narządów/tkanek, takich jak przewód pokarmowy i płuca. Alternatywnie można stosować iniekcje osadu i.m. lub s.c. z, lub bez otoczkowania leku rozkładalnymi mikrokuleczkami (np. zawierającymi poli-DL-laktydokoglikolid) lub preparatami zabezpieczającymi, zawierającymi kolagen, aby uzyskać przedłużone, podtrzymywane uwalnianie leku. W celu polepszenia wygody postaci dawkowania możliwe jest stosowanie wszczepionego i.p. zbiorniczka i przegrody, takiej jak układ dawkowania przezskórnego. Poprawę wygody i dogodności dla pacjenta można także uzyskać przez użycie albo urządzeń wstrzykujących typu pen (np. Novo Pin lub Q-pen) albo urządzeń do wtrzykiwania bezigłowego typu jet (np. od Bioject, Mediject lub Becton Dickinson). Dokładnie kontrolowane uwalnianie można także uzyskać przy użyciu wszczepianych pompek z doprowadzeniem do żądanego miejsca przez kaniulę. Przykładami są wszczepiane podskórnie pompki osmotyczne dostępne od ALZA, takie jak pompka osmotyczna ALZET.

Doprowadzenie donosowe można osiągnąć przez wprowadzenie leku do rozdrobnionych nośników bioadhezyjnych (<200 mm), takich jak zawierające celulozę, poliakrylan lub polikarbofil (polycarbophyl), w połączeniu z odpowiednimi wzmacniaczami absorpcji, takimi

188 387 jak fosfolipidy lub acylokamityny. Układy dostępne na rynku obejmują te, które są ulepszane przez Dan Biosys i Scios Nova.

Doprowadzanie do płuc jest niepozajelitowym sposobem podawania leku do krążenia. Nabłonek dolnych dróg oddechowych jest bardzo przepuszczalny dla wielu białek o wielkości cząsteczkowej do około 20 kDa. Suche proszki o rozmiarach mikronów, zawierające lek w odpowiednim nośniku, takim jak mannitol, sacharoza lub laktoza można dostarczać do dystalnej powierzchni pęcherzyków przy użyciu inhalatorów do suchych proszków, takich jak inhalatory dawkujące oparte o gaz nośny Inhale™, Dura™, Fisons (Spinhaler™) oraz Glaxo (Rotahaler™) lub Astra (Turbohaler™). Preparaty w roztworach z, lub bez liposomów można dostarczać przy użyciu nebulizatorów ultrasonowych.

Doprowadzenie doustne można uzyskać przez wprowadzenie leku do tabletek, tabletek powlekanych, drażetek, twardych i miękkich kapsułek żelatynowych, roztworów, emulsji, zawiesin lub jelitowych kapsułek powlekanych przeznaczonych do uwalniania leku w jelicie, jeśli aktywność proteaz trawiennych jest mała. Przykładami tych ostatnich są układ OROS-CT/Osmet™ z ALZA oraz układ PULSlNCAP™ z Scherer Drug Delivery Systems. Inne układy stosują polimery Azo-sieciowane, ulegające rozkładowi przez azoreduktazy bakteryjne specyficzne dla jelita, albo wrażliwe na pH polimery poliakrylanowe, aktywowane przez wzrost pH w jelicie. Powyższe układy można stosować w połączeniu z wieloma dostępnymi wzmacniaczami absorpcji. Doprowadzenie doodbytnicze można uzyskać przez wprowadzenie leku do czopków.

W zalecanym zastosowaniem medycznym, do zmniejszania okołooperacyjnej utraty krwi, zalecanym sposobem podawania odmian bikuniny łożyskowej według niniejszego wynalazku jest droga pozajelitowa, korzystnie droga i.v. przez linię centralną.

Ilość użytej kompozycji farmaceutycznej będzie zależeć od leczonego biorcy i jego stanu. Wymaganą ilość można określić bez niepotrzebnego eksperymentowania dzięki protokołom znanym fachowcom. Alternatywnie, wymaganą ilość można obliczyć, opierając się o ilość docelowej proteazy, takiej jak plazmina lub kallikreina, którą trzeba zahamować w celu wyleczenia stanu. Jako, że aktywne materiały rozważane w tym wynalazku, uważa się za nietoksyczne, leczenie korzystnie obejmuje podawanie nadmiaru optymalnie wymaganej ilości czynnika aktywnego.

Dodatkowo, bikuninę łożyskową, wyodrębnione domeny lub inne odmiany można stosować do izolowania naturalnych substancji, takich jak ich pokrewnych proteaz z materiału ludzkiego, przy użyciu metod oddzielania w oparciu o powinowactwo, jak również do wywoływania przeciwciał wobec proteazy, stosowanych później do badania rozmieszczenia w tkance i użytecznych funkcji bikuniny łożyskowej.

Wyszukiwanie danych o ludzkiej sekwencji

O istnieniu oddzielnego ludzkiego biaHa i^ok^olc^omznc^gio wdziałaniu do aprotyniny wywnioskowano postępując zgodnie z unikalną analizą sekwencji przez wejścia do bazy danych oznaczeń sekwencji, wykazujących ekspresję (określonych tu potem dbEST) w NCBI (National Center for Biological Information, Maryland). Przy użyciu algorytmu TBlasN (BLAST, lub Basic Local, Alignment Search Tool stosuje metodę Altschula i in., (1990) J. Biol 215: 403-410, do wyszukiwania podobieństw między sekwencją pytającą i wszystkimi sekwencjami w bazie danych, białka lub kwasu nukleinowego we wszystkich kombinacjach), bazę danych zbadano pod względem sekwencji nukleotydowyoh, posiadających homologię z sekwencją preproaprotyniny bydlęcej, Trasylolu®. To przeszukiwanie licznych klonów selektywnie zawężono do dwóch poszczególnych klonów, które prawdopodobnie mogłyby kodować przypuszczalną sekwencję aminokwasową, odpowiadającą białku homologicznemu w działaniu z aprotyniną. Wybranymi sekwencjami kwasu nukleinkwegk były R35464 (SEQ ID nr 12) i R74593 (SEQ ID nr 14), które wytworzono z biblioteki kwasu nukleinowego ludzkiego łożyska. Przepisana sekwencja białkowa w najdłuższej otwartej ramce odczytu dla R35464 (SEQ ID nr 13) utraciła jedną z 6 cystein, które są krytyczne dla tworzenia struktury kowalentnej z domeną Kunitza, oznaczając, że sekwencja kwasu nukleinowego R35464 nie mogłaby dać działającego inhibitora. Podobnie najdłuższa przepisana ramka odczytu z klonu R74593 (SEQ iD nr 15) zawierała kodon przestankowy 5' w stosunku do regionu, kodującego sekwencję podobną do Kunitza, oznaczając, że sekwencja ta nie może po translacji wydzielać

188 387 funkcjonalnej domeny Kunitza. Znaczenie tych sekwencji pojedynczych było niejasne. Możliwe, że reprezentują one a) produkty pseudogenów, b) regiony mRNA nie podlegające translacji lub c) produkty żywego mRNA, które sekwencjonowano nieprawidłowo.

Odkrycie ludzkiej bikuniny

Aby konkretnie wyodrębnić i określić aktualną sekwencję lud:zl^^ wyznaczono primery cDNA zdolne do hybrydyzowania z sekwencjami umiejscowionymi na 5' i 3' segmentu cDNA, kodującego proponowane przez Zgłaszającego sekwencje podobne do Kunitza odkryte w R35464 i R74593. Primerami użytymi do powielenia fragmentu kodującego sekwencję podobną do Kunitza R74593 były:

CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG (primer 3' z miejscem

HindIII; SEQ ID nr 33) oraz

AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA (primer 5' z miejscem

XbaI; SEQ ID nr 34).

Primerów tych użyto do powielenia przez PCR (30 cykli) produktu o 500 parach zasad z biblioteki cDNa ludzkiego łożyska od Clontech (MATCHMAKER, Cat #HL4003AB, Clontech Laboroatories, Palo Alto, CA), które poddano subkloningowi do Bluescript-SK+ i sekwencjonowano primerem T3 za pomocą zestawu Sequenase™ wersja 2,0. Niespodziewanie, sekwencja fragmentu otrzymanego przy użyciu tych primerów była inna niż sekwencja wymieniona w bazie danych dbEST dla klonu R74593. W szczególności, ta nowa sekwencja zawierała dodatkową zasadę guanozynę wtrąconą w 3' w stosunku do przypuszczalnego kodonu przestankowego, lecz 5' w stosunku do segmentu, kodującego sekwencję podobną do Kunitza (fig. 3). Insercja dodatkowego G przesuwała kodon przestankowy poza ramkę odczytu dla domeny podobnej do Kunitza (G przy parze zasad 114 prawidłowej sekwencji dla R74593; fig. 3).

Kolejne przeszukiwanie dbEST pod względem sekwencji homologicznych do sekwencji peptydowej podobnej do Kunitza R74593 dało H94519 pochodzącą z biblioteki ludzkiej siatkówki oraz N39798. Sekwencje te zawierały sekwencję podobną do Kunitza, która była prawie identyczna z domeną podobną do Kunitza kodowaną w R35464 z wyjątkiem tego, że zawierała ona wszystkie sześć z charakterystycznych cystein. Nałożenia każdej z sekwencji nukleotydowych z R74593 (poprawionej przez wtrącenie G przy bp 114) i R35464 użyto do otrzymania konsensusowej sekwencji nukleotydowej dla częściowej ludzkiej bikuniny łożyskowej (SEQ ID nr 9; fig. 3). Sekwencja konsensusowa po translacji dała otwartą ramkę odczytu, rozciągającą się od reszty -18 do +179 (Fig. 3; pełna translacja SEQ ID nr 10), która zawierała dwie pełne sekwencje domeny podobnej do Kunitza, w regionie reszt aminokwasowych odpowiednio 17-64 i 102-159.

Podjęto dalsze działania w celu otrzymania dodatkowej sekwencji 5' przez przeszukanie dbEST sekwencją R35646. Możliwe dopasowania z tych poszukiwań, które posiadały dodatkową sekwencję 5' stosowano potem odwrotnie do odwrotnego przeszukiwania dbEST. W taki powtarzalny sposób zidentyfikowano szereg nakładających się sekwencji 5', które obejmowały klony H16866, T66058, R34808, R87894. N40851 i N39876 (fig. 4). Uszeregowanie niektórych z tych sekwencji sugeruje obecność ATG 5', który może służyć jako miejsce początkowe syntezy konsensusowej przepisanej sekwencji białkowej. Dzięki tym wybranym informacjom można było teraz przesiać selektywnie i określić sekwencje kwasu nukleinowego i polipeptydowe ludzkiego białka o działaniu homologicznym do aprotyniny.

Powtórne przeszukiwanie dbEST ujawniło liczne nowe wejścia EST pokazane schematycznie na fig. 4B. Nałożenie się z tymi dodatkowymi EST pozwoliło na zmontowanie znacznie dłuższej konsensusowej sekwencji oligonukleotydowej (fig. 4C). która rozciągała się zarówno 5' jak i 3' poza oryginalną sekwencję oligonukleotydową opisaną w fig. 3. W rzeczywistości nowa sekwencja o długości całkowitej, wynoszącej 1,6 kilozasad przebiegała przez całą odległość do ogonka poli-A 3'. Zwiększona ilość nakładających się EST w każdej pozycji par zasad wzdłuż sekwencji polepszyła poziom ufności w pewnych regionach, takich jak sekwencja

188 087 nakładająca się z końcem 3' EST R74593 (fig. 3). Kilka nakładających się EST w tym regionie potwierdziło dwie krytyczne delecje zasad względem R74593 (umiejscowione jako pogrubione i podkreślone w Fig. 4C, pozycje w mapie 994 i 1005). Translacja nowej sekwencji konsensusowej (fig. 4D) w ramce kodującej bikuninę, dała postać bikuniny łożyskowej większej (248 aminokwasów) niż dojrzała sekwencja (179 aminokwasów) kodowana z konsensusowej oryginalnej (SEQ ID nr 1) i była zakończona przez kodon przestankowy w ramce wewnątrz oligonukleotydu konsensusowego. Zwiększenie rozmiaru spowodowało przesunięcie ramki w regionie kodującym 3', wynikającym z usunięcia dwóch insercji zasad unikalnych w stosunku do EST R74593. Przesunięcie ramki przeniosło kodon przestankowy konsensusu oryginalnego (fig. 3) poza ramkę, umożliwiając odczyt przez nową ramkę, kodującą dodatkową sekwencję aminokwasową. Nowy produkt translacji (Fig. 4D) był identyczny z oryginalną sekwencją konsensusową białka (SEQ ID nr 1) między resztami +1 do +175 (kodującymi domeny Kunitza), lecz zawierał nowe przedłużenie C-terminalne, wykazujące domniemaną domenę transbłonową o 24 resztach (podkreślone w fig. 4D), a po niej krótką domenę cytoplazmatyczną o 31 resztach. Dokładna sekwencja wokół metioniny inicjatorowej i peptydu sygnałowego była jakby na próbę z powodu poważnej heterogeniczności wśród zachodzących EST w tym regionie.

Analiza sekwencji białkowej przez Geneworks™, ujawniła reszty asparaginowe w pozycjach 30 i 67 jako miejsca konsensusowe dla przypuszczalnej glikozylacji związanej z N. Asparaginy 30 nie obserwowano podczas sekwencjonowania N-terminalnego białka pełnej długości wyodrębnionego z ludzkiego łożyska, zgodnie z tym, że jest ona glikozylowana.

Kloning bikuniny ludzkiej

Istnienie ludzkiego mRNA, odpowiadającego przypuszczalnej sekwencji nukleotydowej ludzkiej bikuniny wnioskowanej w fig. 3, potwierdzono jak następuje. Primera kwasu nukleinowego, hybrydyzującego z 5' w stosunku do sekwencji cDNA, kodującej Kunitza R35646 (bp 3-27 konsensusowej sekwencji nukleotydowej w fig. 3):

GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA (primer 5' pochodzący z sekwencji R35464 z miejscem XbaI; SEQ ID 35), oraz primera kwasu nukleinowego, hybrydyzującego z 3' w stosunku do sekwencji cDNA, kodującej Kunitza R74593 (bp 680-700 konsensusowej sekwencji nukleotydowej w fig. 3), użyto do powielenia PCR z biblioteki ludzkiego łożyska Clontech, fragmentu o wielkości (około 670 bp) oczekiwanej z cDNA konsensusowej sekwencji nukleotydowej, kodującej sekwencję bikuniny łożyskowej z fig. 3 (ukazanej schematycznie w fig. 4A).

Przy użyciu primera 5', hybrydyzującego z sekwencją w R87894, który jest 126 bp 5' w stosunku do przypuszczalnego miejsca startu ATG omawianego powyżej (ukazanego schematycznie w Fig. 4A przy bp 110), plus tego samego primera 3' do R74593 jak użyto powyżej, było możliwe powielenie fragmentu z biblioteki ludzkiego łożyska Clontech o oczekiwanej wielkości (około 872 bp) przewidzianej przez nałożenie EST (ukazane schematycznie w fig. 4).

Sekwencjonowanie fragmentu o 872 bp pokazało, że zawiera on segment nukleotydowy, odpowiadający bp 110 do 218 EST R87894 na jego końcu 5' i bp 310 do 542 sekwencji konsensusowej dla bikuniny łożyskowej wnioskowanej z analizy nakładania EST (fig. 3) na końcu 3'. Ta sekwencja nukleotydowa 3' zawierała wszystkie z domen podobnych do Kunitza kodowanych przez bikuninę łożyskową (102-159).

Aby otrzymać cDNA, kodujący całość regionu zewnątrzkomórkowego białka, użyto następującego primera 5; PCR:

CACCTGATCGCGAGACCCC (SEQ ID nr 36) przeznaczonego do hybrydyzacji z sekwencją wewnątrz EST R34808 z tym samym primerem 3' do EST 74593, aby powielić (30 cykli) produkt cDNA o około 780 par zasad z biblioteki cDNA ludzkiego łożyska. Produkt ten oczyszczono na żelu i klonowano do wektora TA (Invitrogen) w celu sekwencj onowania DNA metodą dideoksy (F. Sanger i in., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 74 5463-5467) za pomocą następujących primerów:

Specyficzny wobec wektora:

GATTTAGGTGACACTATAG (SP6)(SEQ ID nr 07)

TAATACGACTCACTATAGGG (T7) (SEQ ID no 08)

188 387

Specyficzny wobec genu:

SSACCSGACCAAGGAGGAGSGC (SEQ ID nr 39) TTSCCGCTGCTS^,SCCSGCSGGTG (SEQ ID nr 40) CTGSCTCSGGGCCTTGCCGS (SEQ ID nr 41)

Otrzymaną sekwencję cDNA opisuje fig. 4E razem z produktem translacji. Na poziomie nukleotydów sekwencja wykazywała tylko pomniejsze różnice w stosunku do konsensusowej sekwencji EST (fig. 4D). Translacja sekwencji dała sekwencję kodującą, zawierającą miejsce inicjatorowe ATG wewnątrz ramki, peptyd sygnałowy i sekwencję dojrzałej bikuniny łożyskowej oraz domenę transbłonową. Sekwencja po translacji produktu PCR utraciła ostatnie 12 reszt aminokwasowych z domeny cytoplazmatycznej jako konsekwencję wybrania primera 3' do powielenia PCR. Ten wybór primera 3' PCR (wyznaczonego w oparciu o sekwencję R74593) odpowiadał także za wprowadzenie sztucznej mutacji S na F w pozycji aminokwasu 211 poddanej translacji sekwencji otrzymanej w wyniku PCR. Peptyd sygnałowy wnioskowany z translacji fragmentu PCR był nieco inny niż z konsensusu EST.

Aby otrzymać cDNA bikuniny łożyskowej o pełnej długości, produkt pochodzący z PCR (fig. 4E) oczyszczono na żelu i użyto do wyodrębnienia klonu pełnej długości nie pochodzącego z PCR, reprezentującego sekwencję bikuniny. Sekwencję cDNA pochodzącą z PCR znakowano ³²P-CTP przez High Prime (Boehringer Monachium) i użyto do sondy biblioteki cDNA łożyska (biblioteka X Stratagene, Unizap™) przy użyciu technik hybrydyzacji kolonii. Przeprowadzono 3 okrążenia skriningu i oczyszczania płytek z użyciem około 2x10⁶ płytek faga. Dwa klony uznano za pełnej długości (-1,5 kilozasady) co określono przez analizę restrykcyjną enzymu i w oparciu o porównanie z wielkością sekwencji konsensusowej EST (patrz powyżej). Przez sekwencjonowanie jednego z tych klonów metodą dideoksy uzyskano sekwencję oligonukleotydową opisaną w fig. 4F. Produkt translacji z tej sekwencji dał białko z metioniną inicjatorową w ramce, peptyd sygnałowy i sekwencję dojrzałej bikuniny łożyskowej. Sekwencja dojrzałej bikuniny łożyskowej była identyczna z sekwencją dojrzałego białka otrzymanego przez translację konsensusu EsT mimo, że długość sekwencji peptydu sygnałowego i sekwencji była inna. W przeciwieństwie do produktu pochodzącego z PCR, cDNA otrzymane przez hybrydyzację kolonii zawierał całą ektodomenę, domenę transbłonową, domenę cytoplazmatyczną i kodon przestankowy w ramce. W rzeczywistości klon rozciągał się aż do ogonka poli-A. Po metioninie inicjatorowej następował hydrofobowy peptyd sygnałowy, który był identyczny z peptydem sygnałowym kodowanym w klonie pochodzącym z PCR. Następnie Zgłaszający poddał ekspresji i oczyścił rozpuszczalny fragment bikuniny łożyskowej, bikuniny (1-170) z komórek Sf9 (przykład 9) i odkrył, że jest on funkcjonalnym inhibitorem proteazy (przykład 10). Ponadto, wyodrębnił z ludzkiego łożyska rozpuszczalny fragment bikuniny łożyskowej, która także była aktywnym inhibitorem proteazy (przykład 7). Zarówno białko naturalne jak i postać białka po ekspresji w komórkach Sf9 są prawdopodobnie glikozylowane przy reszcie asparaginowej, w pozycji 30 w oparciu o odkrycia aminokwasów PTH w czasie sekwencjonowania N-terminalnego (przykłady 7 i 9).

W oparciu o powyższe obserwacje, wydaje się, że bikunina łożyskowa o pełnej długości może istnieć jako białko transbłonowe na powierzchni komórek jak również jako białko rozpuszczalne. Wiadomo, że inne białka transbłonowe, które zawierają domeny Kunitza prze-. chodzą przekształcanie proteolityczne, dając mieszaniny towarzyszących postaci rozpuszczalnych i błonowych. Obejmują one dwie postacie amyloidowego białka prekursorowego określanego APP751 (F. Esch i in., (1990) Science, 248: 1122-1124) oraz APP 770 (R. Wang i in., (1991), J. Biol. Chem. 266: 16960-16964).

Aktywacja kontaktowa jest procesem aktywowanym przez wystawienie zniszczonych powierzchni naczyń na składniki kaskady krzepnięcia. Rozwój naczyń jest procesem, który obejmuje miejscową aktywację plazminy na powierzchni nabłonka. Specyficzność bikuniny łożyskowej i jej przypuszczalna zdolność do łączenia się z powierzchnią komórkową sugeruje, że fizjologicznymi funkcjami bikuniny łożyskowej może być regulacja aktywacji kontaktowej i rozwoju naczyń.

188 387

Sekwencje aminokwasowe dla bikuniny łożyskowej (7-64), bikuniny (102-159) i bikuniny łożyskowej o pełnej długości (fig. 4F) przeszukiwano przeciw białkowym bazom danych PIR (wersja 46,0) i PatchX (wersja 46,0), jak również białkową bazę danych GeneSeq sekwencji patentowych, przy użyciu programu FastA Genetics Computer Group. Stosując program TFastA Genetics Computer Group (Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448) przeszukano te same sekwencje białkowe kontra sześcioramkowym translacjom nukleotydowych baz danych GenBank (wersja 92,0 z modernizacją 1/26/96) oraz EMBL (modyfikowana wersja 45,0), jak również nukleotydowych baz danych GeneSeq (wersja 20,0) sekwencji patentowych. Podzbiory EST i STS GenBank i EMBL nie wchodziły w zakres tego zbioru poszukiwań. Sekwencje najlepiej pasujące, otrzymane w wyniku tych poszukiwań zawierały sekwencje, będące tylko w 50% identyczne w ich pełnej długości z 58-aminokwasową sekwencją białową pochodzącą z analizy klonów R74593 i R35464.

W'yodrębnienie bikuniny łożyskowej

Jak wspomniano powyżej, syntetyczne peptydy, odpowiadające bikuninie (7-64) i bikuninie (102-159) jak określono z konsensusowej sekwencji po translacji dla bikuniny (fig. 3), można ponownie fałdować (przykłady odpowiednio 2 i 1), aby uzyskać aktywne białko inhibitora kallikreiny (przykłady odpowiednio 4 i 3). Zgłaszający wykorzystał tę nieoczekiwaną, właściwość do obmyślenia schematu oczyszczania, aby wyodrębnić natywną bikuninę łożyskową z ludzkiej tkanki.

Stosując schemat oczyszczania, wykorzystujący chromatografię powinowactwa kallikreina-sefaroza jako etap pierwszy, wyodrębniono wysoko oczyszczony natywny silny inhibitor kallikreiny. Wyodrębniona natywna bikunina ludzka miała identyczny koniec N (sekwencjonowany dla 50 reszt aminokwasowych) jak sekwencja przewidziana przez translację konsensusowej sekwencji kwasu nukleinowego (fig. 3) reszt aminokwasowych +1 do +50 (przykład 7). Potwierdziło to po raz pierwszy istnienie nowego natywnego inhibitora kallikreiny wyodrębnionego z ludzkiego łożyska.

Znane domeny podobne do Kunitza wymienia się poniżej. Reszty uważane za powodujące kontakt z docelowymi proteazami zaznaczono jako specjalnie interesujące (pogrubione/podkreślone). Te poszczególne reszty nazwano pozycjami Xaa^l_I6 dla specyficznego odniesienia jak ukazano przez oznaczenie Xaa poniżej:

Xaa			1 1 111	1	1
	1 2 3	456789		0 1 234	5	6
1)	IHDFCLVSKVV	grcrasmprw	WY)NTTX3SCQ	LEVYGGCDGN	SNNYLTKEEC	LKKCATV
2)	YEEYCTANWT	GPCRASFERW	YFDVERNSCN	NFIYGGCRGN	KNSYRSEEAC	MLRCFRQ
3)	-BSFCAFKADD	GPCKAIMKRF	FFNIFTRQCE	EFIYGGCEGN	QN)FESLEEC	KKMCTRD
4)	-PDFCFLEEDP	GICRGYITRY	FYNQTKQCE	RFKYGGCLGN	MNiFETLEEC	KNICEDG
5)	-PSWCLTPADR	GLCRANItNF	YTOSVIGKCR	PFKYSGCGGN	ENNFTSKQEC	LRACKKG
6)	-AEICLLPLDY	GPCRALLLRY	YYRYdCSCR	QFLYGGCEGN	ANNFYTWEAC	DDACtWI
7)	-PSFCYSPKDE	GLCSANTRY	YFNPRYRTCD	AFTYTGCOCN	DNNFVSREDC	KRACAKA
8)	-KAVCSQEAMT	GPCRAVMMRT	TFDLSKGKCV	RFITGGCGGN	RNNFESEDYC	MAVCKAM
9)	RPDFCLEPPYT	GPCWARIRY	FYNAKAGLCQ	TFVYGGCRAK	RNNFKSAEDC	M^TCGGA
10)	----CQLGYSA	GPCMOMSRLY	FYNGTSMACE	TFQYGGCMGN	GNNVTEKEC	LQTC
11)	vaaccnlivr	GPCRAFIQLW	AFDAVKGKCV	LFPYGGCQGN	GNKFYSEKEC	REYCGVP
12)	-EVCCSEQAET	GPCRAMSRW	YFDVTEGKCA	PFFYGGCGGN	RNNFDTEEYC	MWCGSA
13)	----CKLPKDE	GTCRDFIUW	YYDPNTKSCA	RFWYGGCGGN	ENKFGSQKEC	EKVC
14)	-PNVCAFPMEK	GPCQTYMTRW	FFNFETGECE	LFAYGGCGGN	SNNFLRKEKC	EKFCKFT

188 387

Gdzie numer sekwencji 1) oznacza bikuninę (7-64) (3EQ ID nr 4); sekwencji 2) oznacza bikuninę (102-159) (3EQ ID nr 6); sekwencji 3) oznaczał prekursor 1 inhibitora szkiku czynnika tkankowego (3EQ ED nr 18); sekwencja 4) oznacza prekursor 1 inhibitora szkiku czynnika tkankowego (3EQ ID nr 19); sekwencja 5) oznacza prekursor inhibitora szlaku czynnika tkankowego (3EQ ED nr 2(0); sekwencja 6) oznacza 2 ίηΝΕΕοΓη ss^z^l^u czynnika tkankowego (3EQ II) nr 21)) sekwencją 7) prekursor 2 inhibitora szlaku czynnika tkankowego (3EQ ID nr 22); sekwencja 8) oznacza homolog prekurosora białkowego amyloidu (3EQ ID nr 23); sekwencja 9) oznacza aprotyninę (3EQ ID nr 24); sekwencja 10) oznacza prekursor inhibitora inter-a-trypsyny (3EQ ED nr 25); sekwencja 11) oznacza prekursor inhibitora mter-a-trypsyny (3EO ID nr 26); sekwencja 12) oznacza białko prekursora amyloidu (3EO ID nr 27); sekwencja 13) oznacza prekursor kolagenu a-3(VI) (3eQ ID nr 28) i sekwencja 14) oznacza HKI-B9 (3EO ID nr 29).

Można zauważyć, że bikunina łożyskowa (7-64) i (102-159) każda, posiada taką samą liczbę (sześć) i oddalenie reszt cysternowych jak odkryto u członków klasy Kunitza inhibitorów proteaz serynowych. Znane jest precyzyjne wiązanie reszt cysternowych, tworzące trzy wewnątrzłańcuchowe wiązania disiarczkowe i niezmienne dla wszystkich wcześniej znanych członków rodziny Kunitza (M. Laskowski i in., 1980, Ann. Rev. Biochem. 49: 593-626). Na podstawie tego znanego wzoru wiązania i faktu, że fałdowanie bikuniny łożyskowej (7-64) i (102-159) do aktywnych inhibitorów proteazy towarzyszy zmniejszaniu masy, z powodu tworzenia się trzech wewnątrzłańcuchowych wiązań disiarczkowych (przykłady 2 i 1), jest wysoce prawdopodobne, że wiązanie disiarczkowe wewnątrz domeny Kunitza bikuniny łożyskowej zachodzi między resztami cysternowymi Cli i C61; C20 i C44; C36 i C57; C106 i 056; Cl 15 i C139; C131 i C152. Ponadto, ten wzór wiązania disiarczkowego jest wysoce prawdopodobny u większych postaci bikuniny łożyskowej, zawierających obie domeny Kunitza, ponieważ takie postacie białka są także aktywnymi inhibitorami proteazy serynowej i dlatego, że sekwencjonowanie N-terminalne (przykład 7) natywnej bikuniny łożyskowej przez 50 cykli dało sekwencję cichą w pozycjach, gdzie oczekiwano reszt cysternowych.

Bikuninę łożyskową, wyodrębnione domeny i inne odmiany według niniejszego wynalazku można wytworzyć przez standardową syntezę peptydową w fazie stałej, przy użyciu albo chemii t-Boc jak opisano u R.B. Merrifielda i G. Barany w: The peptides, Analysis, Synthrsis, Biology, 2, E. Gross i in., wyd. Academic Press (1980) rozdział 1; albo przy użyciu chemii F-moc jak opisano u L.A. Carpino i G.Y. Hana (1970) J. Amer. Chem. 3oc., 92: 5748-5749, i zilustrowano w przykładzie 2. Alternatywnie, można wykorzystać ekspresję DNA, kodującego odmianę bikuniny łożyskowej do wytworzenia rekombinowanych odmian bikuniny łożyskowej.

Wynalazek odnosi się także do konstrukcji DNA, które kodują odmiany białka bikuniny łożyskowej według niniejszego wynalazku. Konstrukcje te można wytworzyć metodami syntetycznymi, takimi jak opisane u 3.L. Beaucage i M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Lett, 22 strony 1859-1862; M.D. Matteucci i M.H. Caruthers (1981), J. Am. Chem. 3oc. 103, strona 3185; albo z genomowego lub cDNA otrzymanego przez skrining bibliotek genomowego lub cDNA za pomocą sond cDNA przeznaczonych do hybrydyzacji z sekwencją DNA, kodującą bikuninę łożyskową. Sekwencję genomowego albo cDNA można modyfikować w jednym lub więcej miejsc, aby otrzymać cDNA, kodujący każdą z substytucji lub delecji aminokwasowych opisanych w tym opisie.

Niniejszy wynalazek odnosi się także do wektorów ekspresji, zawierających konstrukcje DNA, kodującego bikuninę łożyskową, wyodrębnione domeny lub inne odmiany według niniejszego wynalazku, których można użyć do wytworzenia rekombinowanych odmian bikuniny łożyskowej. cDNA powinno być połączone z odpowiednią sekwencją promotora, która wykazuje aktywność transkrypcyjną w wybranej komórce gospodarza, posiada odpowiedni terminator i sygnał poliadenylacji. cDNA, kodujący odmianę bikuniny łożyskowej można połączyć z peptydem sygnałowym 5' co da w wyniku białko kodowane przez cDNA, poddające się sekrecji. Peptyd sygnałowy może być taki, którego rozpoznaje organizm gospodarza. W przypadku ssaczych komórek gospodarza peptyd sygnałowy może być także naturalnym peptydem sygnałowym obecnym w pełnej długości bikumnie łożyskowej. Procedury stosowane do wytwarzania takich wektorów ekspresji odmian bikuniny łożyskowej są dobrze znane

188 387 w tej dziedzinie i np. opisano je u Sambrooka i in., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, (1989).

Niniejszy wynalazek odnosi się także do transformowanych komórek, zawierających konstrukcje DNA, kodujące bikuninę łożyskową, wyodrębnione domeny lub inne odmiany według niniejszego wynalazku, które można stosować do wytwarzania rekombinowanych odmian bikuniny łożyskowej. Do wytwarzania odmian bikuniny łożyskowej można użyć wielu istniejących połączeń wektora ekspresji i organizmu gospodarza. Odpowiednimi komórkami gospodarza są komórki owadzie zakażone bakulowirusem Sf9, komórki ssaka, takie jak BHK, CHO, Hela i C-127, bakterie, takie jak E. coli oraz drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae. Metody do stosowania układów ekspresji ssaków, owadów i drobnoustrojów są dobrze znane w tej dziedzinie i opisuje się je np. u F.M. Ausubel i in., Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons (1995), rozdział 16. Dla fragmentów bikuniny łożyskowej, zawierającej pojedynczą domenę inhibitora Kunitza, tak jak bikunina (7-64) i (102-159), korzystne są układy ekspresji drożdży i E. coli, przy czym najkorzystniejsze są układy drożdżowe. Typowo ekspresję w drożdżach przeprowadzałoby się jak opisano w zgłoszeniu patentowym US nr 5 164 482 dla odmian aprotyniny i przystosowano w przykładzie 5 według niniejszego opisu dla bikuniny łożyskowej (102-159). Ekspresję w E. coli można by przeprowadzić przy użyciu metod opisanych w zgłoszeniu patentowym US nr 5 032 573. Użycie układów ssaczych i drożdżowych zaleca się najbardziej do ekspresji większych odmian bikuniny łożyskowej, zawierających obie domeny inhibitorowe, tak jak odmiana bikuniny (7-159).

DNA, kodujący odmiany bikuniny łożyskowej, które posiadają substytucje aminokwasowe naturalnej sekwencji aminokwasowej można wytworzyć w celu ekspresji rekombinowanego białka, stosując metody T.A. Kunkela (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492. Krótko, DNA poddawany mutagenezie klonuje się do wektora bakteriofaga o pojedynczej nici, takiego jak M13. Oligonukleotyd, obejmujący zmieniany region i kodujący substytucję, hybrydyzuje się z DNA o pojedynczej nici i podwaja nić standardowymi technikami biologii molekularnej. Ten DNA transformuje się następnie do odpowiedniego gospodarza bakteryjnego i weryfikuje przez sekwencjonowanie dideoksynukleotydowe. Prawidłowy DNA klonuje się potem do plazmidu ekspresji. Alternatywnie, docelowy DNA można poddać mutagenezie standardowymi technikami PCR, sekwencjonować i wprowadzić do odpowiedniego plazmidu ekspresji.

Przedstawia się następujące poszczególne przykłady w celu zilustrowania, a nie ograniczania, pewnych aspektów i zalecanych postaci realizacji mniejszego wynalazku.

Przykład 1

Wytwarzanie syntetycznej bikuniny łożyskowej (102-159)

Stosowane materiały i metody/odczynniki. Fluorogeniczny substrat Tos-Gly-Pro-Lys-AMC nabyto od Bachem BioScience Inc. (King of Prussia, PA). PNGB, Pro-Phe-Arg-AMC. Ala-Ala-Pro-Met-AMC, trypsynę bydlęcą (typ III), ludzką kallikreinę z osocza i ludzką plazminę nabyto od Sigma (St. Louis, MO).

Rekombinowana aprotynina (Trasylol™) pochodziła od Bayer AG (Wuppertal, Niemcy). Wstępnie załadowaną Gln żywicę Wang nabyto od Novabiochem (La Jolla, CA). Tioanizol, etanoditiol i eter metylowo-tert-butylowy pochodził od Aldrich (Milwaukee, WI).

Ocena ilościowa funkcjonalnej bikuniny łożyskowej (7-64) i (102-159)

Zmierzono ilość aktywności hamującej trypsyny obecnej w powtórnie fałdowanej próbce w różnych stadiach oczyszczania, przy użyciu GPK-AMC jako substratu. Trypsynę bydlęcą (200 moli) inkubowano przez 5 minut w temperaturze 37°C z bikuniną (7-64) i (102-159) z różnych stadiów oczyszczania, w buforze A (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl₂ i 0,01% Triton X-100). Dodano GRP-AMC (20 pM ostatecznie) i określono ilość wytworzonej kumaryny przez pomiar fluoroscencji (wzbudzenie = 370 nm, emisja 432 nm) na fluorymetrze Perkin-Elmer LS-50B przez okres 2 minut. Dla testowanych próbek obliczono % inhibicji dla każdej zgodnie z rówaniem 1; gdzie R0 oznacza współczynnik wzrostu fluorescencji w obecności inhbitora i R1 oznacza współczynnik określony przy nieobecności dodanej próbki. Jedną jednostkę aktywności inhibitora określa się jako ilość potrzebną dla uzyskania 50% inhibicji w oznaczeniu z użyciem opisanych warunków.

188 387 % inhibicji = 100 x [1 - R0Ri] (1)

Synteza. Zsyntetyzowano bikuninę łożyskową (102-159) na syntetyzerze peptydów Applied Biosystems model 420A przy użyciu chemii Fmoc NMP-HBTU. Peptyd syntetyzowano na żywicy wstępnie załadowanej Gln z 8-krotnym nadmiarem aminokwasów do każdego sprzęgania. Rozszczepienie i odbezpieczenie przeprowadzono w 84,6% kwasie trifluorooctowym (TFA), 4,4% tioanizolu, 2,2% etanoditiolu, 4,4% ciekłym fenolu i 4,4% H2 O przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Surowy peptyd wytrącono, odwirowano i przemyto dwukrotnie w eterze metylowo-tert-butylowym. Peptyd oczyszczono na kolumnie HPLC z odwrotną fazą Dynamax 60A C18, przy użyciu gradientu TFA/acetonitryl. Końcowe wytwarzanie (61,0 mg) dało prawidłowy skład aminokwasowy i masę cząsteczkową według spektroskopii masowej w nośniku jonowym (MH+ = 6836,1; obliczona - 6835,5) dla sekwencji przewidywanej:

YEEYCTANAV TGPCRASFPR WYFDVERNSC NNFIYGGCRG NKNSYRSEEA CMLRCFRQ (SEQ ID nr 6)

Oczyszczanie. Powtórne fałdowanie bikuniny łożyskowej (102-159) przeprowadzono zgodnie z metodą Tama i in., (J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 6657-62). Część oczyszczonego peptydu (15,2 mg) rozpuszczono w 4,0 ml 0,1 Tris, pH 6,0 i 8 M moczniku. Utlenianie disiarczków osiągnięto przez wkroplenie roztworu, zawierającego 23% DMSO i 0,1 Tris, pH 6,0, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mg/ml peptydu w 20% DMSO, 0,1 M Tris pH 6,0 i 1 M moczniku. Roztwór pozostawiono do mieszania przez 24 godziny w temperaturze 25°C, po których rozcieńczono go 1:10 w buforze, zawierającym 50 mM Tris, pH 8,0 i 0,1 M NaCl. Materiał oczyszczono przy użyciu kolumny powinowactwa kallikreiny wykonanej przez kowalentne przyłączenie 30 mg bydlęcej kallikreiny trzustkowej (Bayer AG) do 3,5 ml Sepharose (Pharmacia) aktywowanej CNBr zgodnie z instrukcjami producentów. Pofałdowany materiał załadowano na kolumnę powinowactwa przy prędkości przepływu 1 ml/minutę i przemyto 50 mM Tris, pH 8,0 i 0,1 M NaCl do uzyskania absorbancji przemywanego materiału, której przy 280 nm nie można było wykryć. Kolumnę przemyto 3 objętościami każda 0,2 M kwasu octowego, pH 4,0 i 1,7. Frakcje aktywne zlano (patrz poniżej) i wyregulowano pH roztworu do 2,5. Materiał załadowano bezpośrednio na kolumnę z odwrotną fazą Vydac Cl 8 (5 mikronów, 0,46 x 25 cm), którą zrównoważono w 22,5% acetonitrylu w 0,1% TFA. Rozdzielanie uzyskano przy użyciu liniowego gradientu, wynoszącego 22,5 do 40% acetonitrylu w 0,1% TFA przy 1,0 ml/minutę przez 40 minut. Frakcje aktywne zlano, liofilizowano, rozpuszczono ponownie w 0,1% TFA i przechowywano w temperaturze -20°C do ponownego użycia.

Wyniki. Syntetyczną bikuninę łożyskową (102-159) fałdowano ponownie przy użyciu 20% DMSO jako czynnika utleniającego jak opisano powyżej i oczyszczono przez 2-etapowy protokół oczyszczania jak ukazano poniżej, uzyskując aktywny inhibitor trypsynowy (tabela 1 poniżej).

Tabela 1

Tabela oczyszczania w celu wyodrębnienia syntetycznej bikuniny łożyskowej (102-159)

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	mg/ml	mg	Jednostki0 (U)	SpA (U/mg)	Wydajność
8,0 M mocznik	4,0	3,750a	15,00	0	0	-
20% DMSO	32,0	0,470a	15,00	16,162	1,078	100
Powinowactwo kallikreiny	9,8	0,009b	0,09	15,700	170,000	97
C18	3,0	0,013ab	0,04	11,964	300,000	74

“Białko określone przez AAA ^bBiałko określone przez OD 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji określonego dla oczyszczonego białka (1,7 x W^moŁcm'¹) ^cJedna jednostka określona jako ilość materiału wymaganego do hamowania 50% aktywności trypsyny w oznaczeniu standardowym.

188 387

Chromatografia surowego ponownie pofałdowanego materiału przez kolumnę z unieruchomioną bydlęcą kallikreiną trzustkową, selektywnie wyodrębniła 6,0% białka i 97% obecnej aktywności hamującej trypsynę. Kolejna chromatografia przy użyciu C18 z odwrotną fazą dała dalsze 2-krotne oczyszczanie z całkowitym odzyskiem, wynoszącym 74%. Przy RPHPLC zredukowana i powtórnie pofałdowana bikunina łożyskowa (102-159) wykazała czas elucji, wynoszący odpowiednio 26,3 i 20,1 minut. Analiza spektroskopii masowej oczyszczonego materiału ujawniła masę cząsteczkową, wynoszącą 6829,8; utratę 6 jednostek masy z materiału wyjściowego. Pokazuje to całkowite utworzenie 3 disiarczków wywnioskowanych z sekwencji peptydowej.

Określono punkt izoelektryczny oczyszczonej, ponownie pofałdowanej, syntetycznej bikuniny łożyskowej (102-159) przy użyciu przebiegu Multiphor II Electrophoresis System (Pharmacia) zgodnie z propozycjami producentów, razem ze standardami pl, stosując wstępny odlew (precast) Ampholine® PAGplate (pH 3,5 do 9,5) i ogniskowano przez 1,5 godziny. Po barwieniu zmierzono odległość migracji od krawędzi katody żelu do innych wstęg białkowych. Określono każde nieznane pi przez użycie standardowej krzywej utworzonej przez naniesienie odległości migracji standardów przeciw odpowiadającym pi. Dzięki tej technice określono, że pi bikuniny łożyskowej (102-159) wynosiło 8,3, zgodnie z wartością przewidzianą z sekwencji aminokwasowej. Jest ona niższa niż wartość 10,5 ustalona dla pi aprotyniny. (Tenstad i in., 1994, Acta Physiol. Scand. 152: 33-50).

Przykład 2

Wytwarzanie syntetycznej bikuniny łożyskowej (7-64)

Bikuninę łożyskową (7-64) syntetyzowano, fałdowano i oczyszczono zasadniczo jak opisano dla bikuniny łożyskowej (102-159) lecz z następującymi modyfikacjami: podczas ponownego fałdowania, syntetyczny peptyd mieszano przez 30 godzin w postaci roztworu w 20% DMSO w temperaturze 25°C; oczyszczanie przez C18 RP-HPLC uzyskano za pomocą gradientu liniowego, wynoszącego 25 do 45% acetonitrylu w 0,1% TFA przez 40 minut (1 ml/minutę). Frakcje aktywne z pierwszego przebiegu C18 ponownie załadowano na kolumnę i frakcjonowano gradientem liniowym (60 minut, 1 ml/minutę), wynoszącym 20 do 40% acetonitrylu w 0,1% TFA.

Wyniki. Ostatecznie oczyszczony zredukowany peptyd wykazywał MH+ = 6563, zgodnie z sekwencją:

IHDFCLVSKV VGRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID nr 4).

Przez ponowne fałdowanie i oczyszczanie uzyskano funkcjonalną domenę Kunitza, aktywną jako inhibitor trypsynowy (tabela 2A poniżej).

Tabela 2A

Tabela oczyszczania w celu wyodrębnienia syntetycznej bikuniny łożyskowej (7-64)

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	mg/ml	mg	Jednostki (U)	SpA (U/mg)	Wydajność
8,0 M mocznik	8,0	2,50	20,00	0	0	-
20% DMSO	64,0	0,31	20,00	68,699	3,435	100,0
Powinowactwo kall pH 4,0	11,7	0,10	1,16	43,333	36,110	62,0
Powinowactwo kall pH 1,7	9,0	0,64	5,80	4972,000	857,000	7,2
C18-1	4,6	0,14	0,06	21,905	350,143	31,9
Cl 8-2	1,0	0,08	0,02	7,937	466,882	11,5

188 087

Oczyszczone sfałdowane białko wykazywało MH+6558, to jest 5±1 jednostek masy mniej niż dla peptydu zredukowanego. Demonstruje to, że ponowne fałdowanie powoduje tworzenie się co najmniej jednego odpowiedniego wiązania disiarczkowego.

Określono pi bikuniny łożyskowej (7-64) przy użyciu metod wykorzystywanych do określania pi bikuniny łożyskowej (102-159). Bikunina łożyskowa (7-64) wykazała pH znacznie wyższą niż wartość przewidywana (pl=7,9). Ponownie fałdowana bikunina łożyskowa (7-64) migrowała do brzegu katody na żelu (pH 9,5) i w tych warunkach nie można było dokładnie określić pi.

Ciągłe wytwarzanie syntetycznej bikuniny (7-64)

Ponieważ syntetyczna bikunina łożyskowa (7-64) może nie podlegać pełnemu odbezpieczeniu przed oczyszczaniem i ponownym fałdowaniem, powtórzono fałdowanie przy użyciu białka, które na pewno było całkowicie odbezpieczone. Bikuninę łożyskową (7-64) syntetyzowano, fałdowano i oczyszczono zasadniczo jak opisano dla bikuniny łożyskowej (102-159) lecz z następującymi modyfikacjami: podczas fałdowania syntetyczny peptyd (0,27 mg/ml) mieszano przez 30 godzin jako roztwór w 20% DMSO w temperaturze 25°C; oczyszczanie przez C18 RP-HPLC uzyskano za pomocą liniowego gradientu, wynoszącego 22,5 do 50% acetonitrylu w 0,1% TFA przez 40 minut (1 ml/minutę).

Wyniki. Ostatecznie oczyszczony zredukowany peptyd wykazywał MH+ = 6567,5, zgodnie z sekwencją:

IHDFCLVSKV VGRCRASMPRW WYNVTDGSC QLFCYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID nr 4).

Przez ponowne fałdowanie i oczyszczanie uzyskano funkcjonalną domenę Kunitza, aktywną jako inhibitor trypsynowy (tabela 2B poniżej).

Tabela 2B

Tabela oczyszczania w celu wyodrębnienia syntetycznej bikuniny łożyskowej (7-64)

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	mg/ml	mg	Jednostki (U)	SpA (U/mg)	Wydajność
8,0 M mocznik	4,9	2,10	10,50	0	0	-
20% DMSO	39,0	0,27	10,50	236,000	22,500	100,0
Powinowactwo kall pH 2	14,5	0,30	0,43	120,000	279,070	52,9
C18 z odwrotną fazą	0,2	1,20	0,24	70,676	294,483	30,0

Oczyszczone sfałdowane białko wykazywało MH+ = 6561,2 to jest 6,3 jednostek masy mniej niż peptyd zredukowany. Pokazuje to, że fałdowanie spowodowało tworzenie się oczekiwanych wiązań disiarczkowych.

Określono pi bikuniny łożyskowej (7-64) przy użyciu metod stosowanych do określenia pi bikuniny łożyskowej (102-159). S fałdowana bikunina łożyskowa (7-64) wykazywała pi, wynoszące 8,85, trochę więcej niż wartość przewidywana (pi = 7,9).

Przykład 3

Specyficzność in vitro fragmentu funkcjonalnej bikuniny łożyskowej (102-159)

Proteazy. Przeprowadzono ocenę ilościową trypsyny bydlęcej, ludzkiej plazminy i bydlęcej kallikreiny trzustkowej przez mianowanie miejsca aktywnego przy użyciu pnltrótenyló-p'-guanidynobenz(óesanu HC1 jak opisano wcześniej (T. Chase i E. Shaw (1970) Methods Enzmol., 19: 20-27). Oceniono ilościowo ludzką kallikreinę przez mianowanie aktywnego miejsca przy użyciu aprotyniny bydlęcej jako standardu i PFR-AMC jako substratu, przypuszczając utworzenie się kompleksu 1:1. K_m dla GPL-AMC z trypsyną i plazminą w warunkach stosowanych dla każdego enzymu wynosiła odpowiednio 29 pM i 726 jtM; Km dla PFR-AMC z ludzką kallikreiną osocza i bydlęcą kallikreiną trzustkową wynosiła odpowiednio 457 jiM i 81,5 pM; Km dla AAPR-AMC z elastazą wynosiła 1600 pM. Przeprowadzono

188 387 ocenę ilościową ludzkiej kallikreiny tkankowej (Bayer, Niemcy), przez mianowanie miejsca aktywnego przy użyciu p-nitrofenylo-p'-guanidynobenzoesanu HCl jak opisano wcześniej (T. Chase i E. Shaw (1970) Methods Enzmol., 19: 20-27).

Kinetyka inhibicji: Zmierzono inhibicję trypsyny przez bikuninę łożyskową (102-159) lub aprotyninę przez inkubację 50 mM trypsyny z bikuniną łożyskową (102-159) (0-2 nM) lub aprotyniną (0-3 nM) w buforze A w całkowitej objętości 1,0 ml. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 15 pl 2 mM GPK-AMC i monitorowano zmianę fluorescencji (jak wyżej). Określono inhibicję ludzkiej plazminy przez bikuninę łożyskową (102-159) oraz aprotyninę, za pomocą plazminy (50 pM) i bikuniny łożyskowej (102-159) (0-10 nM) albo aprotyniny (0-4 nM) w buforze, zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl oraz 0,02% Triton Χ-100. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze 37°C dodano 25 pl 20 mM GPK-AMC i monitorowano zmianę fluorescencji. Określono inhibicję ludzkiej kallikreiny osocza przez bikuninę łożyskową (102-159) albo aprotyninę przy użyciu kallikreiny (2,5 nM) i bikuniny łożyskowej (102-159) (0-3 nM) lub aprotyniny (0-45 nM) w 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl i 0,02% Triton Χ-100. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 15 pl 20 mM PFR-AMC i monitorowano zmianę fluorescencji. Określono inhibicję bydlęcej kallikreiny trzustkowej przez bikuninę łożyskową (102-159) i aprotyninę w podobny sposób za pomocą kallikreiny (92 pM), bikuniny łożyskowej (102-159) (0-1,6 nM) oraz aprotyniny (0-14 pM) i końcowego stężenia substratu, wynoszącego 200 pM. Określono stałą widocznej inhibicji Ki* przy użyciu programu analizy nieliniowej regresji danych oprogramowania Enzfitter (Biosoft, Cambridge, UK). Dane kinetyczne z każdego doświadczenia analizowano w kategoriach równania dla mocnego inhibitora wiązania:

Vi/V0= 1-(E0+I0+Ki*-[(E0+I0+Ki*)²-4E0I0]^b'²)/2E0 (2) gdzie Vi/V0 oznacza częściową aktywność enzymu (współczynnik hamowanego kontra niehamowanego), oraz E0 i I0 oznaczają całkowite stężenia odpowiednio enzymu i inhibitora. Wartości K,* otrzymano przez poprawę pod względem wpływu substratu zgodnie z równaniem:

K, = Ki*/(1+[S0]/K_m) (3) (C. Boudier i J.G. Bieth, (1989) Biochim Biophys Acta., 995: 36-41).

W celu inhibicji ludzkiej elastazy neutrofilowej przez bikuninę łożyskową (102-159) i aprotyninę, elastazę (19 nM) inkubowano z bikuniną łożyskową (102-159) (150 nM) lub aprotyniną (0-7,5 pM) w buforze, zawierającym 0,1 Tris-HCl (pH 8,0) i 0,05% x-100. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano AAPM-AMC (500 pM lub 1000 pM) i mierzono fluorescencję przez okres dwóch minut. Określono wartości Ki z naniesień Dixon postaci 1/V kontra [I] przeprowadzonych dla dwóch różnych stężeń substratu (Dixon i in., 1979).

Mierzono inhibicję ludzkiej kallikreiny tkankowej przez aprotyninę, fragment bikuniny łożyskowej (7-64) lub fragment bikuniny łożyskowej (102-159) przez inkubację 0,35 nM ludzkiej kallikreiny tkankowej z bikuniną łożyskową (7-64) (0-40 nM) lub bikuniną łożyskową (102-159) (0-2,5 nM) albo aprotyniną (0-0,5 nM) w 1 ml objętości reakcyjnej, zawierającej 50 mM buforu Tris-HCl pH 9,0, 50 mM NaCl oraz 0,1% x-100. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 5 pl 2 mM PFR-AMC, uzyskując ostatecznie 10 pM i monitorowano zmianę fluorescencji. K dla PFR-AMC z ludzką kallikreiną tkankową w stosowanych warunkach wynosiła 5,7 pM. Mierzono inhibicję ludzkiego czynnika Xa (American Diagnostica, Inc, Greenwich, CT) przez syntetyczną bikuninę łożyskową (102-159), rekombinowaną bikuninę łożyskową i aprotyninę, przez inkubację w buforze, zawierającym 20 mM Tris (pH 7,5), 0,1 M NaCl i 0,1% BSA. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 30 pl 20 mM LGR-AMC (Sigma) i monitorowano zmianę fluorescencji. Inhibicję ludzkiej urokinazy (Sigma) przez inhibitory Kunitza mierzono przez inkubację urokinazy (2,7 ng) z inhibitorem w całkowitej objętości 1 ml buforu, zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl i 0,1% x-100. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 35 pl 20 mM GGR-AMC (Sigma) i monitorowano zmianę fluorescencji. Inhibicję czynnika Xia (od Enzyme Research Labs, Southbend, IN) mierzono przez inkubację FXCIa (0,1 nM) albo z 0-800 nM bikuniny łożyskowej (7-64), 0-140 nM bikuniny łożyskowej (102-159) albo 0-800 nM aprotyniny w buforze, zawierającym 50 mM Hepes pH 1,5, 100 mM NaCl, 2 mM CaCf, 0,01% x-100 i 1% BSA w całkowitej objętości 1 ml.

188 387

Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 10 pl 40 mM Boc-Glu(OBzl)-Ala-AMC (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) i monitorowano zmianę fluorescencji.

Wyniki: Przeprowadzono bezpośrednie porównanie profili inhibicji bikuniny łożyskowej (102-159) i aprotyniny przez pomiar ich stałej inhibicji z różnymi proteazami w identycznych warunkach. Wartości Ki wymieniono w tabeli 3 poniżej.

Tabela 3

Wartości K, dla inhibicji różnych proteaz przez bikuninę (102-159)

Proteza (stężenie)	Bikunina (102-159) K (nM)	Aprotynina K (nM)	Substrat (stężenie)	Kra (mM)
Trypsyna (48,5 pM)	0,40	0,800	GPK-AMC (0,03 mM)	0,0220
Chymotrypsyna (5 nM)	0,24	0,860	AAPF-AMC (0,08 mM)	0,0270
Bydlęca kallikreina trzustkowa (92,0 pM)	0,40	0,020	PFR-AMC (0,1 mM)	0,0800
Ludzka kallikreina osocza (2,5 nM)	0,30	19,000	PFR-AMC (0,3 mM)	0,4600
Ludzka plazmina (50 pM)	1,80	1,300	GPK-AMC (0,05mM)	0,7300
Ludzka elastaza neutrofilowa (19 nM)	323,00	8500,000	AAPM-AMC (1,0 pM)	1,6000
Czynnik XIla	>300,00	12000,000	PFR-AMC (0,2 pM)	0,3500
Ludzka kallikreina tkankowa (0,35 nM)	0,13	0,004	PFR-AMC (10 mM)	0,0057
Czynnik Xa	274,00	N.I.	LGR-AMC	N.D.
(0,87 nM)	przy 3pM	(0,6 mM)
Urokinaza	11000,00	4500,000	GGR-AMC (0,7mM)	N.D.
Czynnik XIa (0,1 nM)	15,00	288,000	E(OBz)AR-AMC (0,4 mM)	0,4600

Bikunina łożyskowa (102-159) i aprotynina hamuje trypsynę bydlęcą i ludzką plazminę w porównywalnym zakresie w stosowanych warunkach. Aprotynina hamowała elastazę z K, 8,5 pM. Bikunina łożyskowa (102-159) hamowała elastazę z K, 323 nM. Wartość Kj dla inhibicji bydlęcej kallikreiny trzustkowej przez bikuninę łożyskową (102-159) była 20-krotnie wyższa niż inhibicja aprotyniny. Przeciwnie, bikunina łożyskowa (102-159) jest silniejszym inhibitorem ludzkiej kallikreiny osocza niż aprotynina i wiąże z 56-krotnie wyższym powinowactwem.

Ponieważ bikunina łożyskowa (102-159) jest więcej niż 50 razy silniejsza niż Trasylol® jako inhibitor kallikreiny, potrzebne są mniejsze ilości ludzkiej bikuniny łożyskowej lub jej fragmentów (to jest bikuniny łożyskowej (102-159)) niż Trasylolu® w celu utrzymania skutecznej dla pacjenta dawki inhibitora, w KIU. Zmniejsza to koszt leku na dawkę i zmniejsza prawdopodobieństwo niekorzystnych skutków nefrotoksycznych po ponownym podaniu leku pacjentowi. Ponadto białko jest pochodzenia ludzkiego, a więc znacznie mniej immunogenne

188 387 dla człowieka niż aprotynina, która pochodzi od krów. W wyniku tego znacznie zmniejsza się ryzyko występowania niekorzystnych zdarzeń immunologicznych po ponownym podaniu leku pacjentowi.

Przykład 4

Sprcyflczność in vitro funkcjonalnego fragmentu bikuniny łożyskowej (7-64)

Określono specyficzność in vitro funkcjonalnej bikuniny łożyskowej (7-64) przy użyciu materiałów i metod jakie opisano w przykładach powyżej.

Wyniki: Poniższa tabela ukazuje skuteczność bikuniny łożyskowej (7-64) jako inhibitora różnych proteaz serynowych in vitro. Ukazuje się dane porównane z danymi otrzymanymi dla inhibicji skriningowej przy użyciu albo bikuniny łożyskowej (102-159), albo aprotyniny (Trasylol®).

Tabela 4A

Wartości Kj dla inhibicji różnych proteaz przez bikuninę (7-64)

Proteza (stężenie)	Bikunina (7-64) K, (nM)	Aprotynina K (nM)	Bikunina (102-159) K (nM)
Trypsyna (48,5 pM)	0,17	0,80	0,4
Bydlęca kallikreina trzustkowa (92,0 pM)	0,40	0,02	0,4
Ludzka kallikreina osocza (2,5 nM)	2,40	19,00	0,3
Ludzka plazmina (50 pM)	3,10	1,30	1,8
Chymotrypsyna bydlęca (5 nM)	0,60	0,90	0,2
Czynnik XIIa	>300,00	12000,00	>300,0
Elastaza	>100,00	8500,00	323,0

Wyniki ukazują, że sekwencję aminokwasową, kodującą bikuninę łożyskową (7-64) można ponownie fałdować, aby otrzymać aktywny inhibitor proteazy serynowej, skuteczny przeciw co najmniej czterem proteazom serynowym takim jak trypsyna.

Poniższa tabela 4B ukazuje skuteczność ponownie fałdowanej bikuniny łożyskowej (7-64) jako inhibitora różnych proteaz serynowych in vitro. 3fałdowaną bikuninę łożyskową wytworzono z białka, które z pewnością było całkowicie odbezpieczone przed oczyszczaniem i fałdowaniem. Ukazuje się dane, które porównuje się z danymi otrzymanymi dla inhibicji skaningowej przy użyciu albo bikuniny łożyskowej (102-159), albo aprotyniny (Trasylolu®).

Tabela 4B

Wartości K, dla inhibicji różnych proteaz przez ponownie fałdowaną bikuninę (7-64)

Proteza (stężenie)	Bikunina (7-64) K (nM)	Aprotynina K (nM)	Bikunina (102-159) K (nM)
1	2	3	4
Trypsyna (50,0 pM)	0,8	0,800	0,30
Ludzka kallikreina osocza (0,2 nM)	0,7	19,000	0,70

188 387 ciąg dalszy tabeli 4B

1	2	3	4
Ludzka plazmina (50 pM)	3,7	1,300	1,80
Czynnik XIIa	nie wykonano	12000,000	4500,00
Czynnik Xia (0,1 nM)	200,0	288,000	15,00
Ludzka kallikreina tkankowa	2,3	0,004	0,13

Nieoczekiwanie, bikunina łożyskowa (7-64) okazała się silniejsza niż aprotynina w hamowaniu ludzkiej kallikreiny osocza i co najmniej podobnie skuteczna jako inhibitor plazminy. Dane te wskazują, że bikunina łożyskowa (7-64) jest co najmniej tak skuteczna jak aprotynina, przy użyciu oznaczeń in vitro i że można oczekiwać większej lub takiej samej siły in vivo.

Przykład 5

Ekspresja odmiany bikuniny łożyskowej (102-159) w drożdżach

Wytworzono sekwencje DNa, kodującą bikuninę łożyskową (102-159) (SEQ ID nr 6) stosując syntetyczne oligonukleotydy. Ostateczny produkt DNA składał się (5' do 3') z 15 nukleotydów z sekwencji propeptydowej czynnika łączącego a drożdży połączonej z sekwencją cDNA w ramce, kodującą bikuninę łożyskową (102-159), po czym kodon przestankowy w ramce. Po kloningu do wektora ekspresji drożdży pS604 cDNa kierowałby ekspresją białka połączonego, zawierającego N-terminalny propeptyd czynnika łączącego a drożdży połączony z sekwencją aminokwasową o 50 aminokwasach bikuniny łożyskowej (102-159). Obróbkę tego białka połączonego w miejscu rozszczepienia KEX-2 przy łączeniu między czynnikiem łączącym a i domeną Kunitza, wyznaczono do uwolnienia domeny Kunitza przy jej natywnym końcu N.

Zsyntetyzowano sensowny oligonukleotyd 5' o następującej sekwencji i zawierający miejsce Hindlll do kloningu:

GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA TAT GSA (GAA TAC TGC ACC

GCC AAC GCA (GT ACT GGG CCC TTG CCT GGC. GC^C TTC CCA CGG

TGG TAC GGT GAC GTG GAG AGG (SEQ ID nr 42) .

Zsyntetyzowano sensowny oligonukleotyd 3' o następującej sekwencji i zawierający miejsce BamHI do kloningu:

CGC

GGA

TCC

CTA

CCT

GCG

GAA

GCA

(GCG

(GAA

CAT

GCA

GGC

CTT

CTC

AGA

GCG

GTA

GGC

GTT

CTT

ATT

GCC

CCC

GCA

GCC

TCC

AAT

GAT

GAA

GTT

ATT

GCA

GGA

GTT

CCT

CTC

CCC

GTC

GGG

GTC

CCC.

GCG

(SEQ

ID

nr 43)

Oligonukleotydy rozpuszczono w buforze 10 mM Tris pH 8,0, zawierającym 1 mM EDTA, dodano 12 fig każdego połączonego oligonukleotydu i przeniesiono do 0,25 m NaCl. W celu hybrydyzacji oligonukleotydy denaturowano przez gotowanie przez 5 minut i pozostawiono do ochłodzenia z temperatury 65°C do temperatury pokojowej przez 2 godziny.

188 387

Przedłużono nałożenia przy użyciu fragmentu Klenowa i trawiono Hindlll i BamHI. Otrzymany strawiony fragment o dwóch niciach klonowano do pUC19 i potwierdzono sekwencję. Klon, zawierający fragment o prawidłowej sekwencji trawiono BamHI/Hindlll aby uwolnić fragment, zawierający bikuninę z następującą sekwencją nici+:

GAA

GGG

aga:

“TTC

CPT

PAP

AGA

ΤΑΤ

CPA

GPA

TAC

TGN

ACC

CNN

AAR

GNA

GTC

ACT

GCC

CCT

TCC

CGT

GRP

TRR

TTC

NCP

CGC

TCC

TAR

TTT

GAC

GTC

CAG

AC

AAR

TCR

TCC

PPT

PPC

TTN

ATN

TAT

GGA

CGN

TGC

CCCG

CCC

PPT

PAC

AAR

AGC

TPC

cnc

TNT

GAG

GAC

GRN TGN ATG NTR CGN TCR TTN NGN RAC TAG GGA TRR (SEQ ID nr 44) którą następnie oczyszczono na żelu i poddano ligacji do pS604 ciętego BamHI/Hindlll. Mieszaninę ligacyjną ekstrahowano do fenolu/chloroformu i oczyszczono na kolumnie S-200 z minispinem. Produkt ligacji transformowano bezpośrednio do szczepów drożdży SC 101 i WHL341 i umieszczono na płytkach wybiórczych z mocznikiem (ura). Dwanaście kolonii z każdego szczepu ponownie powleczono prążkami na płytkach nakroplonych mocznikiem (ura). Pojedyncze kolonie zaszczepiono do 2 ml pożywki mocznikowej (ura) DO i hodowano przez noc w temperaturze 30°C. Komórki wirowano przez 2 minuty przy 14000 x g i supematanty oceniono pod względem zawartości w nich bikuniny łożyskowej (102-159).

Detekcja ekspresji bikuniny łożyskowej (102-159) w transformowanych drożdżach

Najpierw oceniono supematanty (50 |xl na oznaczenie) pod względem ich zdolności do hamowania in vitro aktywności trypsyny, przy użyciu metod oznaczania jakie opisano w przykładzie 1 (objętość do oznaczenia 1 ml). Jedna próbka niezużytej pożywki jak również klon drożdży wykazujący ekspresję niektywnej odmiany aprotyniny służyły jako kontrole ujemne. Klon drożdży, wykazujący ekspresję naturalnej aprotyniny służył jako kontrola dodatnia i ukazuje się ją dla porównania.

Druga metoda oceny ilościowej ekspresji bikuniny łożyskowej (102-159) wykorzystywała przeciwciała poliklonalne (pAb) przeciw syntetycznemu peptydowi, w celu monitorowania nagromadzenia rekombinkwanegk peptydu przy użyciu Western biot. Badania te przeprowadzono tylko z rekombinantami pochodzącymi ze szczepu SC 101, ponieważ wytwarzał on większą aktywność hamującą niż rekombinanty pochodzące ze szczepu WHL341.

Aby wytworzyć pAb, immunizowano samice królików New Zeland White (Hazelton Research Labs, Denver, Pa) w wieku 6-8 tygodni, w dniu zero, za pomocą 250 jg oczyszczonej zredukowanej syntetycznej bikuniny łożyskowej (102-159) w kompletnym adjuwancie Freunda, po czym dawkami przypominającymi w dniu 14, 35, 56 i 77, każdą wynoszącą 125 |ig tego samego antygenu w niekompletnym adjuwancie Freunda. Antyserum użyte w niniejszych badaniach zebrano po trzeciej dawce przypominającej dzięki stałym procedurom. Przeciwciała poliklonalne oczyszczono z antyserum poprzez białko A.

Kolonie 2,4 i 2,5 z transformacji drożdży SC101 (Fig. 8) jak również kontrolę aprotyninową hodowano przez noc w 50 ml pożywki mocznikowej DO w temperaturze 30°C. Komórki zagęszczono i supematant zatężono 100-krotnie przy użyciu urządzenia do zatężania Centriprep 3 (Amicon, Beverly, MA). Każdą próbkę (30 |xl) poddano SDS-PAGE na żelach buforowanych 10-20% tricyny (Novex, San Diego, CA) stosując procedury producenta. Podwójne żele albo wywoływano za pomocą zestawu do barwienia srebrem (Integrated Separation Systems, Nantick, MA) albo przenoszono na nitrocelulozę i wywoływano z oczyszczonym przeciwciałem poliklonalnym wywołanym przeciw syntetycznej bikuninie (102-159). Jako przeciwciała wtórnego użyto przeciwciała koziego antykrólicz.egk sprzężonego z fosfatazą alkaliczną, zgodnie z zaleceniami producentów (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD).

Oczyszczanie bikuniny łożyskowej (102-159) z transformowanego szczepu SC101

Bulion fermentacyjny z 1 litra hodowli SC 101 szczepu 2,4 zebrano przez wirowanie (4000 g x 30 minut), potem załadowano na 1,0 ml kolumnę bezwodna chymotrypsyna-sefaroza (Takara Biochemical Inc., CA), którą wcześniej zrównoważono buforem Hepes 50 mM

188 087 pH 1,5, zawierającym 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl₂ i 0,01% (objętościowych) x-100. Kolumnę przemywano tym samym buforem lecz zawierającym 1,0 M NaCl do momentu, gdy A280 nm spadła do zera i wtedy kolumnę przemyto 0,1 M kwasem mrówkowym pH 2,5. Wymyte frakcje zlano i załadowano na kolumnę C18 (Vydac, 5 pm, 4,6 x 250 mm) wcześniej zrównoważonej 0,1% TFA i wymyto liniowym gradientem, wynoszącym 20-80% acetonitrylu w 0,1% TFA przez 50 minut. Frakcje, zawierające bikuninę łożyskową (102-159) zlano i ponownie chromatografowano na C18, stosując gradient liniowy 22,5-50% acetonitrylu w 0,1% TFA.

Wyniki. Fig. 8 ukazuje procent aktywności hamowanej przez dwadzieścia kolonii pochodzących z trasformacji każdego ze szczepów SC101 i WHL341. Wyniki pokazują, że wszystkie dwadzieścia kolonii szczepu drożdży SC 101 transformowanych inhibitorem trypsyny bikuniną łożyskową (102-159) posiadało zdolność wytwarzania znacznych ilości aktywności hamującej trypsynę w porównaniu z kontrolami ujemnymi, z których obie nie wykazywały zdolności hamowania trypsyny. Aktywność jest zatem związana z ekspresją specyficznego inhibitora w komórkach transformowanych odmianą bikuniny łożyskowej (102-159). Próbki drożdży WHL341 zawierały minimalną aktywność hamującą trypsynę. Może się to wiązać z powolnym wzrostem obserwowanym dla tego szczepu w stosowanych warunkach.

Figura 9 ukazuje SDS-PAGE oraz analizę western supematantów drożdży SC101. Barwiona srebrem SDS-PAGE superantantów pochodzących od rekombinowanych drożdży 2,4 i 2,5, wykazujących ekspresję bikuniny łożyskowej (102-159) jak również z drożdży, wykazujących ekspresję aprotyniny, dała wstęgę białka, przebiegającą przy około 6 kDa, odpowiadającą wielkości oczekiwanej dla każdej rekombinowanej domeny inhbitorowej Kunitza. Analiza western wykazała, że wstęgi o 6 kDa wywołane przez barwienie 2,4 i 2,5 reagowały z pAb wywołanym przeciw bikuninie łożyskowej (102-159). Ta sama wstęga o 6 kDa w kontroli aprotyninowej nie reagowała z tym samym przeciwciałem, demostrując specyficzność przeciwciała wobec odmiany bikuniny łożyskowej (102-159).

Końcowy preparat domeny C-terminalnej odmiany bikuniny był wysoko oczyszczony przez SDS-PAGE z barwieniem srebrem (fig. 10). Całkowity odzysk aktywności hamującej trypsynę, pochodzącej z bulionu w preparacie końcowym, wynosił 31%. Sekwencjonowanie N-terminalne oczyszczonego inhibitora wskazywał, że 40% białka przetworzono prawidłowo, uzyskując prawidłowy koniec N dla bikuniny łożyskowej (102-159), podczas gdy około 60% materiału zawierało część drożdżowego czynnika łączącego a. Oczyszczony materiał obejmował aktywny inhibitor proteazy serynowej, wykazujący widoczną K,, wynoszącą 0,35 nM dla inhibicji in vitro kallikreiny osocza.

Podsumowując, akumulacja w bulionie aktywności inhibitorowej proteazy i białka immunochemicznie pokrewnego syntetycznej bikuninie (102-159) w bulionie fermentacyjnym, jak również wyodrębnienie bikuniny łożyskowej (102-159) z jednej z transformowanych linii, dostarczyło dowodu ekspresji bikuniny łożyskowej w rekombinowanych szczepach drożdży tu opisanych, pokazując po raz pierwszy przydatność drożdży do wytwarzania fragmentów bikuniny łożyskowej.

Wytworzono dodatkowe konstrukcje, próbując zwiększyć poziom ekspresji domeny Kunitza zawartej w bikuninie łożyskowej 102-159, jak również zwiększyć wydajność białka z prawidłowym końcem N. Zgłaszający zakładał, że N-terminalne reszty bikuniny łożyskowej

102- 159 (YEEY--) mogą prezentować miejsce rozszczepienia, słabo rozpoznawane przez proteazę KEX-2 drożdży, która enzymatycznie usuwa proregion czynnika a drożdży. Zatem, Zgłaszający wytworzył drożdżowe konstrukcje ekspresji do wytwarzania bikuniny łożyskowej

103- 159 (koniec N EEY...), 101-159 (koniec N NYEEY...) i 98-159 (DMFNYEEY...) w celu modyfikacji podrzędnych miejsc P', otaczających miejsce rozszczepienia KEX-2. Próbując zwiększyć poziom ekspresji rekombinowanego białka, Zgłaszający użył także raczej zalecanych kodonów drożdżowych niż zalecanych kodonów ssaczych, przy wytwarzaniu niektórych konstrukcji opisanych poniżej. Konstrukcje wytworzono zasadniczo jak opisano powyżej dla bikuniny łożyskowej 102-159 (określona jako konstrukcja #1) lecz z następującymi modyfikacjami:

188 387

Konstrukcja #2 bikunina łożyskowa 103-159, użycie kodonu drożdżowego, sensowny oligonukleotyd 5'

GTTΑΑΑΑSAT ΑCTSGGTSAT ^GAGAM^ STCSGTACSG CSTTSGCSGS

STCSGGSCCT TGSTGTGCSS CSSSSCCTTG TTGGSTCSSS GTSGSSGATT GA (SEQ ID nr 55) i antysensowny oligonukleotyd 3'

ACTGGATCCT CTSTGGCGTT TACATCTCTT CTTTCTGGCS TCTSCTGTSC

SGS.TTGTASS SSTASSACCT CSACTACCTC CGTTTTTTTT ASTATTACTT

GTTTSSCSTT CAACATCAAA GTCCATCT (SEQ ID nr 56) którymi Zgłaszający manipulował jak opisano dla wytwarzania konstrukcji ekspresji (konstrukcja #1 powyżej) w celu ekspresji bikuniny łożyskowej 102-159.

Konstrukcja #3 bikunina łożyskowa 101-159, użycie kodonu drożdżowego, sensowny oligonukleotyd 5'

GATGGGGTTA GCSTGGTSAT TT.ΑTTAJTTC GΑTTGSTCTACT GTACTGCTAA

SGCSGTSACS GGSCCATGTT GAGCTTCTTT C^C^(GA^(^J^TGG TACTTTGATG

TTGTTAGT (SEQ ID nr 57) oraz ten sam antysensowny oligonukleotyd 3'jaki użyto dla konstrukcji #2, którymi manipulowano jak opisano dla wytwarzania konstrukcji ekspresji (konstrukcja #1 powyżej) w celu ekspresji bikuniny łożyskowej 102-159.

Konstrukcja #4 bikunina łożyskowa 98-159, użycie kodonu drożdżowego, sensowny oligonukleotyd 5'

GTAGGGGTAT GCTSGGTTAA TAGAGTSATG STTTATCAVG Α^ΑΜΆεΤΟ

SACSGCSTTT ΑCTΑTSTCTΑ GSCCTSΑSAΑ ASΑTTTTTVT TTΑTSΑGΑGT

TCSSSΑTTGT SΑTTTΑT (SEQ ID nr 58) oraz ten sam antysensowny oligonukleotyd 3'jaki użyto dla konstrukcji #2, którymi manipulowano jak opisano dla wytwarzania konstrukcji ekspresji (konstrukcja #1 powyżej).

Transformowano szczep drożdżowy SC 101 (MATa, ura 3-52, suc 2) za pomocą plazmidów, zawierających każdy z powyższych cDNA i spowodowano ekspresję białek przy użyciu metod opisanych powyżej dla wytwarzania bikuniny łożyskowej 102-159 z użyciem kodonu ludzkiego. Zebrano około 250 ml każdej hodowli drożdżowej i supernatant z wirowania (15 minut x 3000 obrotów/minutę) oddzielnie poddano oczyszczaniu przez 1 ml kolumny z kallikreiną-sefarozą jak opisano powyżej. Określono relatywną ilość aktywności hamującej trypsyny w stosowanym materiale, ilość odzyskanego oczyszczonego białka i sekwencję N-terminalną oczyszczonego białka i wymieniono je poniżej w tabeli 7.

Tabela 7

Relatywny poziom wytwarzania różnych białek, zawierających C-terminalną domenę Kunitza bikuniny łożyskowej

Konstrukcja	Relatywne stęż. inhibitora w materiale	Sekwencj onowan ie ilość (pmol)	N-terminalne sekwencja	Komentarz
1	2	3	4	5
#2 103-159	nie wykryto	brak	brak	brak ekspresji
#3 101-159	25% inhibicji	brak	brak	niska ekspresja

188 387 ciąg dalszy tabeli 7

1	2	3	4	5
#4 98-159 prawidłowy produkt ekspresji	93% inhibicji	910	DMFNYE-	Dobra
#1 102-159	82% inhibicji	480	AKEEGV-	ekspresja aktywnego nieprawidłowo obrobionego białka

Wyniki pokazują, że fragmenty bikuniny od różnej długości, które zawierają C-terminalną. domenę Kunitza, wykazują szeroką zmienność zdolności ekspresji funkcjonalnego wydzielanego białka. Konstrukcje, wykazujące ekspresję fragmentów 101-159 i 103-159 dawały małą lub niską aktywność enzymu w supernatantach przed oczyszczeniem, a sekwencjonowanie N-terminalne równych ilości o 0,05 ml z każdej oczyszczonej frakcji dało niewykrywalne ilości inhibitora. Z drugiej strony ekspresja bikuniny łożyskowej albo 102-159, albo 98-159 dała istotne ilości aktywności proteazy przed oczyszczeniem. Jednak sekwencjonowanie N-terminalne pokazało, że oczyszczone białko odzyskane z ekspresji 102-159 było jeszcz raz nieprawidłowo obrobione, wykazując zgodność końca N z obróbką większości prebiałek w miejscu, w pro-sekwencji czynnika łączącego a drożdży. Oczyszczone białko odzyskane z ekspresji bikuniny łożyskowej 98-159 obrobiono jednak w całości w prawidłowym miejscu, aby uzyskać prawidłowy koniec N. Ponadto, odzyskano blisko dwukrotnie więcej białka w porównaniu z odzyskiem bikuniny łożyskowej 102-159. Bikunina łożyskowa 98-159 reprezentuje więc zalecaną długość fragmentu do wytwarzania C-terminalnej domeny Kunitza bikuniny łożyskowej przez preprosekwencję czynnika łączącego a/układ przetwarzający KEX-2 S.cerevisiae.

Przykład 6

Alternatywna procedura ekspresji w drożdżach

Peptyd o 58 aminokwasach pochodzący od produktu translacji R74593 można także powielić przez PCR albo z produktu PCR R87894-R74593 klonowanego do wektora TA™ (Invitrogen, San Diego, CA) po sekwencjonowaniu DNA albo z cDNA ludzkiego łożyska. Powielony produkt DNA będzie się składał z 19 nukleotydów z sekwencji liderowej czynnika łączącego a drożdży połączonego z sekwencją R74593, która koduje YEEY--CFRQ (58 reszt) tak, aby wprowadzić produkt translacji w ramkę, montując białko połączone czynnik łączący α/domena Kunitza. Sekwencja białka także zawiera rozszczepienie kex 2, które będzie uwalniać domenę Kunitza przy swym natywnym końcu N.

Sensowny oligonukleotyd 5', który zawiera kloningowe miejsce HindIII, będzie zawierać następującą sekwencję:

GCCAARCTTR GATAAAAGAT ATGAAGAAT ACTRCACCGC CAACGCA (SEQ ID nr 30)

Antysensowny oligonukleotyd 3' zawiera kloningowe miejsce BamHI jak również kodon przestankowy i posiada następującą sekwencję:

RRRRAVCCVC ACVRCVRRCR RAARCARCGR AGCAT (SEQ ID nr 31)

188 387

Pełna klonowana do wektora ekspresji drożdży sekwencja nukleotydową cDNA posiada następującą sekwencję:

CCAAGCTTGG ATAAA^GAT.A TGGGGGG.TGC TGOGCCGCCA

TGGGCCTTGC CGGTGAGCCT TCCCACGCTG GTJACTTTGAC GTCGAGAWKG

GCTCCTGCGG TAGGTTCAGC TCTGGAGGCT GCCGGGGCCGG ΤΤΓ(ΑΤνΑ«^

TACCGCTCTG AGCCTCCCTG CATGCTCCGC TGCTTCCGCC jCCTCTr<GGC3

GTCCCC {SEQ ID nr 32)

Po powieleniu PCR, ten DNA będzie trawiony Hindlll, BamHI i klonowany do drożdżowego wektora ekspresji pMT15 (patrz zgłoszenie patentowe U3 nr 5 164 482, załączone w całości jako odnośnik) także trawiony Hindlll i BamHI. Otrzymany wektor plazmidowy stosuje się do transformowania szczepu drożdży 3C 106 przy użyciu metod opisanych w zgłoszeniu patentowym U3 nr 5 164 482. Transformanty drożdżowe URA 3+ wyodrębnia się i hoduje w warunkach indukujących. Wydajność rekombinowanych odmian bikuniny łożyskowej określa się według ilości aktywności hamującej trypsynę, zgromadzoną w supematantach hodowlanych w czasie, stosując metodę oznaczania in vitro opisaną powyżej. Buliony fermentacyjne wiruje się przy 9000 obrotów na minutę przez 30 minut. 3upematanty filtruje się następnie przez filtr o 0,4 i potem 0,2 pm, rozcieńcza do przewodności 7,5 ms i reguluje pH do 3 za pomocą kwasu cytrynowego. Potem próbkę absorbuje się w całości na 200 ml S-sepharosr z szybkim przepływem (Pharmacia) w 50 mM cytrynianu sodu pH 3,0 i miesza przez 60 minut. Żel przemywa się następnie kolejno za każdym razem 2 litrami: 50 mM cytrynianu sodu pH 3,0, 50 mM Tris-HCl pH 9,0; 20 mM HEPE3 pH 6,0. Przemyty żel przenosi się do odpowiedniej kolumny i wymywa gradientem liniowym, wynoszącym 0-1 M chlorku sodu w 20 mM Ι1ΕΙ'Έ3 pH 6,0. Wymyte frakcje, zawierające aktywność hamującą trysynę in vitro zlewa się potem i dodatkowo oczyszcza albo przez a) chromatografię na kolumnie z unieruchomioną bezwodną trypsyną (zasadniczo jak opisano w przykładzie 2); b) chromatografię na kolumnie z unieruchomioną kallikreiną bydlęcą; lub c) połączenie konwencjonalnych etapów chromatograficznych, łącznie z filtracją żelową i/lub chromatografię aniono-wymienną.

Przykład 7

Wyodrębnianie i charakteryzacja natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej z łożyska

Białko bikuniny oczyszczono do widocznej homogeniczności z całego zamrożonego łożyska. (Analitycal Biological Services, Inc, Wilmington, DE). Łożysko (740 gm) rozmrożono do temperatury pokojowej i pocięto na kawałko o 0,5 do 1,0 cm, umieszczono w lodzie i przemyto 600 ml buforu PB3. Zdekantowano płyn i 240 ml kawałków łożyska umieszczono w blenderze Waring. Po dodaniu 300 ml buforu, składającego się z 0,1 M Tris (pH 8,0) i 0,1 M NaCl, mieszaninę rozdrabniano przy wysokiej prędkości przez 2 minuty, zdekantowano do 750,0 ml rurek wirówki i umieszczono w lodzie. Procedurę tę powtarzano aż do obrobienia całego materiału. Połączoną zawiesinę wirowano przy 4500 x g przez 60 minut w temperaturze 4°C. 3uperantant przesączono przez chustę serowarską i oczyszczono bikuninę łożyskową z użyciem kolumny powinowactwa wykonanej przez kowalentne przyłączenie 70 mg bydlęcej kallikremy trzustkowej (Bayer AG) do 5,0 ml 3epharose aktywowanej CNBr (Pharmacia) zgodnie z instrukcjami producenta. Materiał załadowano na kolumnę powinowactwa przy prędkości przepływu 2,0 ml/minutę i przemywano 0,1 Tris (pH 8,0), 0,1 M NaCl aż absorbancja przy 280 nm nie była możliwa do wykrycia. Kolumnę dodatkowo przemyto 0,1 M Tris (pH 8,0), 0,5 M NaCl i potem wymywano 3 objętościami 0,2 M kwasu octowego, pH 4,0. Frakcje, zawierające aktywność inhibicji kallikreiny i trypsyny (patrz poniżej) zlano, zamrożono i liofilizowano. Bikuninę łożyskową oczyszczono dodatkowo przez chromatografię żelowo-filtracyjną przy użyciu kolumny 3uperdex 75 10/30 (Pharmacia) połączonej z układem Beckman 3ystem Gold HPLC. Krótko, kolumnę zrównoważono w 0,1 M Tris, 0,15 M NaCl i 0,1% Triton X-100 przy prędkości przepływu 0,5 ml/minutę. Liofilizowaną próbkę odtworzono w 1,0 ml 0,1 M Tris, pH 8,0 i wstrzykiwano na kolumnę żelofiltracyjną w równych ilościach 200 |il. Frakcje zebrano (0,5 ml) i oznaczono pod względem aktywności hamującej trypsynę i kallikreinę.

188 387

Aktywne frakcje zlano i wyregulowano pH roztworu do 2,5 przez dodanie TFA. Materiał załadowano bezpośrednio na kolumnę Vydac C18 z odwrotną fazą (5 mikronów, 0,46 c 25 cm), którą zrównoważono w 20% acetonitrylu w 0,1% TFA. Uzyskano rodzielenie, stosując gradient liniowy, wynoszący 20-80% acetonitrylu w 0,1% TFA przy 1,0 ml/minutę przez 50 minut, po początkowym 20 minutowym przemywaniu w 0,1% TFA. Frackje (1 ml) zebrano i oznaczono pod względem aktywności hamującej trypsyny i kallikreiny. Frakcje, zawierające aktywność hamującą zatężono przy użyciu urządzenia do zatężania speed-vac (Savant) i poddano analizie sekwencji N-terminalnej.

Oznaczenia funkcjonalne dla bikuniny łożyskowej

Identyfikację funkcjonalnej bikuniny łożyskowej uzyskano przez pomiar jej zdolności do hamowania bydlęcej trypsyny i ludzkiej kallikreiny osocza. Pomiar aktywności hamowania trypsyny przeprowadzono w buforze do oznaczania (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2,0 mM CaCl₂, 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej w 96-studzienkowej płytce do mikromianowania (Perkin Elmer) przy użyciu Gly-Pro-Lys-aminometylokumaryny jako substratu. Określono ilość kumaryny wytworzonej przez trypsynę, przez pomiar fluorescencji (wzbudzenie = 370 nm, emisja 432 nm) na fluorymetrze Perkin-Elmer LS-50B zaopatrzonym w czytnik płytek. Trypsynę (23 pg w 100 pl buforu) wymieszano z 20 pl próbki testowanej i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C. Reakcję zapoczątkowano przez dodanie 50 pl substratu GPK-AMC (końcowe 33 pM) w buforze do oznaczania. Mierzono intensywność fluorescencji i określono % inhibicji dla każdej frakcji przez:

% inhibicji = 100 x [1 - F0/F1] gdzie F0 oznacza fluorescencję nieznaną i F1 oznacza fluorescencję trypsyny jako kontroli. Podobnie mierzono aktywność hamującą kallikreinę frakcji, przy użyciu 7,0 nM kallikreiny w buforze do oznaczania (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) oraz 66,0 pM Pro-Phe-Arg-AMC jako substratu.

Określenie specyficzności in vitro bikuniny łożyskowej

Określono specyficzność in vitro natywnej ludzkiej bikuniny łożyskowej przy użyciu materiałów i metod opisanych w poprzednich przykładach powyżej. Bikuninę łożyskową oceniono ilościowo przez mianowanie miejsca aktywnego przeciw znanemu stężeniu trypsyny, stosując GPK-AMC jako substratu do monitorowania frakcji niezwiązanej trypsyny.

Sekwencjonowanie białka

Frakcję 1 ml (C18-29 Delaria) zredukowano do objętości 300 ml na Speed Vac, aby zmniejszyć ilość rozpuszczalnika organicznego. Próbkę załadowano potem na miniaturową bifazową kolumnę reakcyjną Hewlett-Packard i przemyto 1 ml 2% kwasu trifluorooctowego. Próbkę poddano sekwencjonowaniu w układzie sekwencjonowania białek Hewlett-Packard Model G1005A, stosując rozkład Edmana. Metody sekwencjonowania wersja 3,0 i wszystkie odczynniki otrzymano od Hewlett-Packard. Sekwencję potwierdzano przez 50 cykli.

Wyniki. Bikuninę łożyskową oczyszczono do widocznej homogeniczności przez kolejne chromatografie powinowactwa, filtracji żelowej i odwrotnej fazy (patrz tabela oczyszczania poniżej):

Tabela 5

Tabela oczyszczania natywnej bikuniny łożyskowej (1-179)

Etap	Objętość (ml)	OD 280 (/ml)	OD 280	Jednostki3 (U)	Jednostki /OD 280
1	2	3	4	5	6
Supernatant łożyska	1800,0	41,7000	75,060	3000000	40,0
Powinowactwo kallikreiny pH 4,0	20,0	0,1700	3,360	16000	4880,0

188 387 ciąg dalszy tabeli 5

1	2	3	4	5	6
Powinowactwo kallikreiny pH 1,7	10,2	0,4500	4,560	12000	2630,0
Superdex75	15,0	0,0085	0,130	3191	24546,0

Jedna jednostka określa tę ilość, która hamuje 50% aktywności trypsynowej w standardowym oznaczeniu.

Większość aktywności hamującej kallikreinę i trypsynę wymyto z kolumny powinowactwa kallikreiny w elucji o pH 4,0. Następna chromatografia żelowo-filtracyjna (fig. 5) dała pik aktywności hamującej kallikreinę i trypsynę o zakresie ciężaru cząsteczkowego 10-40 kDa, jak oceniono ze standardowej krzywej utworzonej przez przebieg standardów ciężaru cząsteczkowego w identycznych warunkach. W wyniku chromatografii z odwrotną fazą na C18 (fig. 6) uzyskano 4 piki aktywności inhibitorowej z najsilniejszym wymywaniem przy około 30% acetonitrylu. Aktywność związana z pierwszym pikiem wymywania z C18 (frakcja 29) wykazała sekwencję aminokwasową zaczynającą się aminokwasem 1 przewidywanej sekwencji aminokwasowej bikuniny łożyskowej (ADRER...; SEQ ID nr 1) i była identyczna z sekwencją przewidywaną przez 50 cykli sekwencjonowania (aminokwasy podkreślone w fig. 3). Reszty cysteinowe w tej rozciągłości sekwencji były ciche jak oczekiwano z powodu sekwencjonowania utlenowanego białka. Reszty cysteinowe w pozycjach aminokwasów 11 i 20 dojrzałej bikuniny łożyskowej identyfikowano później z sekwencjonowania S-pirydyloetylowanego białka na którym odzyskano PTH-pirydyloetylocysteinę w cyklu 11 i 20.

Co ciekawe, asparagina przy reszcie aminowasowej numer 30 sekwencji (fig. 3) była cicha, pokazując, że miejsce to jest prawdopodobnie glikozylowane. We frakcji 29 uzyskano dużą sekwencję, odpowiadającą sekwencji bikuniny łożyskowej, zaczynającej się przy reszcie #1 (27 pmoli w cyklu 1) razem z mniejszą sekwencją (2 pmole) także pochodzącą z bikuniny łożyskowej, zaczynającą się przy reszcie 6 (SIDH...). Pokazuje to, że końcowy preparat sekwencjonowany we frakcji 29 jest wysoko oczyszczony i najprawdopodobniej odpowiedzialny za aktywność inhibitorową proteazy związaną z tą frakcją (fig. 6).

W związku z tym, ostateczny preparat bikuniny łożyskowej z chromatografii C18 był wysoko oczyszczony na podstawie analizy SDS-PAGE z barwieniem srebrem (fig. 7), gdzie białko migrowało z widocznym Mr o 24 kDa na żelu akrylamidowym z 10-20% tricyny (Novex, San Diego, CA) skalibrowanym za pomocą następujących markerów ciężaru cząsteczkowego: insulina (2,9 kDa); inhibitor trypsyny bydlęcej (5,8 kDa); lizozym (14,7 kDa); β-laktoglobulina (18,4 kDa); anhydraza karboniowa (29 kDa) i owoalbumina (43 kDa). Powyższa wielkość bikuniny łożyskowej na SDS-PAGE zgadza się z przewidzianą z pełnej długości sekwencji kodującej (fig. 4F).

Jak oczekiwano na podstawie wyników sekwencjonowania N-terminalnego opisanego powyżej, oczyszczone białko reagowało z przeciwciałem wywołanym przeciw bikuninie łożyskowej (7-64), dając wstęgę o tej samej masie (fig. 12A) jak obserwowano dla oczyszczonego preparatu wykrywanego na żelach przez barwienie srebrem (fig. 7). Jednak gdy ten sam preparat poddawano reakcji z przeciwciałem wywołanym przeciw syntetycznej bikuninie łożyskowej (102-159), wstęgi, odpowiadającej białku pełnej długości nie obserwowano. Obserwowano raczej fragment migrujący razem z syntetyczną bikuniną (102-159) o około 6 kDa. Najprostszą interpretacją tych wyników jest to, że oczyszczony preparat został poddany rozkładowi w następstwie oczyszczenia, co dało fragment N-terminalny, obejmujący domenę N-terminalną i C-terminalny fragment, obejmujący domenę C-terminalną. Przypuszczając, że fragment reagujący przeciw antyserum wobec bikuniny łożyskowej (7-64) jest pozbawiony końca C-terminalnego białka o pełnej długości, wielkość (24 kDa) sugerowałaby wysoki stan glikozylacji.

Tabela 6 poniżej ukazuje siłę inhibicji in vitro różnych proteaz serynowych przez bikuninę łożyskową. Dane porównuje się z otrzymanymi dla aprotyniny (Trasylol®).

188 087

Tabela 6

Wartości K, dla inhibicji różnych proteaz przez bikuninę łożyskową

Proteza (stężenie)	Bikunina łożyskowa K, (nm)	Aprotynina K, (nM)
Trypsyna (48,5 pM)	0,13	0,8
Ludzka plazmina (50 pM)	1,90	1,3

Wyniki pokazują, że bikunina łożyskowa wyodrębniona z naturalnego źródła (ludzkie łożysko) jest silnym inhibitorem proteaz serynowych podobnych do trypsyny.

Przykład 8

Wzór ekspresji bikuniny łożyskowej wśród różnych ludzkich narządów i tkanek

Nothem wielu tkanek nabyto od Clontech, który zawierał 2 pg poliA + RNA z ludzkiego serca, mózgu, łożyska, płuca, wątroby, mięśni szkieletowych, nerek i trzustki. Użyto dwóch różnych sond cDNA: 1) oczyszczony na żelu cDNA, kodujący bikuninę łożyskową (102-159); 2) cDNA pochodzący z PCR o 780 parach zasad (fig. 4E) uwolniony z klonu TA przez trawienie EcoRI i oczyszczony na żelu. Każdą sondę oznakowano przy użyciu ³²P-dCTP i zestawu do losowego znakowania przez przepłukiwanie od Boehringer Mannheim Biochemicals (Indiana), potem użyto do hybrydyzacji z notheim wielu tkanek zgodnie z opisem producenta. Utworzono autoradiografy, stosując błonę Biomax z 18 godzinnym czasem ekspozycji i wywołano ją przy użyciu Umax Scanner i skanowano z użyciem Adobe Photoshop.

Wyniki. Wzór ekspresji tkankowej obserwowany przy użyciu sondy bikuniny łożyskowej (102-159) (fig. 11 A) lub większej sondy, zawierającej obie domeny Kunitza bikuniny łożyskowej (fig. 1 IB) był zasadniczo taki sam jak można było oczekiwać. mRNA bikuniny łożyskowej był najliczniejszy w trzustce i łożysku. Istotny poziom obserwowano także w płucach, mózgu i nerce, podcza gdy niższy poziom obserwowano w sercu i wątrobie, przy czym mRNA był nie wykrywalny w mięśniach szkieletowych. Wielkość transkryptu wynosiła 1,95 kilozasad we wszystkich przypadkach, w ścisłej zgodzie z przewidywaną wielkością bikuniny łożyskowej wnioskowanej zarówno z nałożeń EST jak i kloningu cDNA pełnej długości opisanym w poprzednich sekcjach.

Obszerne rozmieszczenie w tkankach mRNA pokazuje, że bikunina łożyskowa podlega szerokiej ekspresji. Ponieważ białko zawiera także sekwencję liderową będzie także szeroko wystawione na ludzki układ odpornościowy, wymagając, że będzie rozpoznawane jako białko własne. Dodatkowym dowodem na obszerne rozmieszczenie w tkankach ekspresji mRNA bikuniny łożyskowej pochodzi z faktu, że niektóre z wejść EST z homologią do bikuniny łożyskowej (fig. 4B) pochodziły z ludzkiego dorosłego i dziecięcego mózgu oraz ludzkiej siatkówki, piersi, jajnika, nabłonka węchowego i łożyska. Wnioskuje się zatem, że podawanie natywnego ludzkiego białka pacjentom ludziom prawdopodobnie nie wywoła odpowiedzi immunologicznej.

Co ciekawe, wzór ekspresji bikuniny łożyskowej nieco przypomina wzór dla aprotyniny bydlęcej, którą znajduje się w dużych ilościach w płucach bydlęcych ! trzustce. Aby dodatkowo wyjaśnić wzór ekspresji bikuniny łożyskowej określono RT-PCR całkowitego RNA z następujących ludzkich komórek: nie stymulowanych ludzkich komórek nabłonka żyły pępkowej (HUVEC), HK-2 (linia pochodząca z kanalika proksymalnego nerki), TF-1 (linia erytroleukemii) oraz forbolesterowych (phorbolester) stymulowanych (PMA) ludzkich leukocytów z krwi obwodowej. Użyte sondy:

CACCTGATCGCGAGACCCC (sensowny; (SEQ ID so δ9);

CTGGCGGAAGCAGCGGAGCATGC (a1StLAenAownL; (SEQ ID no 00), wyznaczono do powielenia fragmentu cDNA bikuniny łożyskowej o 600 bp. Porównania znormalizowano przez włączenie primerów aktyny aby powielić fragment aktyny o 800 bp.

188 387

Podczas gdy fragment o 800 bp zidentyfikowany na żelach agarozowych za pomocą bromku etidium był równie intensywny we wszystkich przebiegach, fragment bikuniny łożyskowej 0 600 bp HUVEC był nieobecny, ale obecny z istotnych ilościach w każdej z innych linii komórkowych. Zgłaszający wnioskuje, że ekspresja bikuniny łożyskowej nie zachodzi w co najmniej niektórych komórkach nabłonka lecz zachodzi w niektórych populacjach leukocytów.

Przykład 9

Oczyszczanie i właściwości bikuniny łożyskowej (1-170) wysoko oczyszczonej z układu ekspresji bakulowirus/Sf9

Wielki fragment bikuniny łożyskowej, zawierający obie domeny Kunitza (bikunina łożyskowa 1-170) poddano ekspresji w komórkach Sf9 jak następuje. cDNA bikuniny łożyskowej otrzymanej przez PCR (fig. 4E) i zawartej w wektorze TA (patrz poprzednie przykłady) uwolniono przez trawienie Hindlll i XbaI, uzyskując fragment oskrzydlony przez miejsce XbaI 5' i miejsce Hindlll 3'. Fragment ten oczyszczono na żelu i potem klonowano do wektora M13mpl9 (New England Biolabs, Beverly, Ma). Do wytworzenia miejsca Pstl 3' do miejsca XbaI na końcu 5' użyto mutagenezy in vitro (T.A. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492), lecz 5' w stosunku do sekwencji kodującej miejsce startu ATG, peptydu sygnałowego naturalnej bikuniny łożyskowej i sekwencji kodującej dojrzałą bikuninę łożyskową. Oligonukleotyd użyty do mutagenezy miał sekwencję:

5' CGC GTC TCG GCT GAC CTG GCC CTG CAG ATC GCG CAC GTG TGC

GGG 3 (SEQ ID nr 61)

Kodon przestankowy (TAG) i miejsce BglII/XmaI zmontowano podobnie na końcu 3' cDNA przy użyciu oligonukleotydu:

5' CTG CCC CTT GGC TGA AAG TAG GAA GAT CTT CCC CCC GGG GGG

GTG GTT CTG GCG GGG CTG 3' (SEQ ID nr 62) .

Kodon przestankowy znajdował się w ramce z sekwencją kodującą bikuninę łożyskową i powodował terminację bezpośrednio za lizyną przy reszcie aminokwasowej 170, kodując w ten sposób skrócony fragment bikuniny łożyskowej pozbawionej przypuszczalnej domeny transbłonowej. Wyodrębniono produkt trawienia PstI i BglII i klonowano do wektora BacPac8 w celu ekspresji fragmentu bikuniny łożyskowej (1-170), który zawiera obie domeny Kunitza, lecz który jest ucięty bezpośrednio na końcu N w stosunku do przypuszczalnego segmentu transbłonowego.

Ekspresja bikuniny przez owadzie komórki Sf9 była optymalna przy wielokrotności zakażenia, wynoszącej 1 do 1, gdy pożywkę zebrano 72 godziny po zakażeniu. Po zebraniu, supernatant z hodowlą komórek bakulowirusa wyregulowano do pH 8,0 przez dodanie Tris-HCl. Bikuninę oczyszczono przez chromatografię, przy użyciu 5 ml kolumny powinowactwa bydlęcej kallikreiny trzustkowej jak opisano wcześniej w przykładzie 7 dla oczyszczania natywnej bikuniny łożyskowej z łożyska. pH wymytego materiału wyregulowano do pH 2,5 za pomocą TFA i poddano chromatografii na kolumnie C18 z odwrotną fazą (1,0 x 25 cm) zrównoważoną w 10%o acetonitrylu w 0,1% TFA przy tempie przepływu 1 ml/minutę. Bikuninę wymyto liniowym gradientem 10-80%o acetonitrylu w 0,1% TFA przez 40 minut. Aktywne frakcje zlano, liofilizowano, ponownie rozpuszczono w 50 mM Hepes (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl₂ i 0,1% x-100 i przechowywano w temperaturze -20°C aż będą potrzebne. Stężenie rekombinowanej bikuniny określono przez analizę aminokwasów.

Wyniki. Rekombinowaną bikuninę oczyszczono z supematantu hodowli komórkowej bakulowirusa, stosując 2-etapowy protokół oczyszczania jak ukazano poniżej, uzyskując aktywny inhibitor trypsyny (tabela 8 poniżej).

188 387

Tabela 8

Oczyszczanie rekombinowanej bikuniny z supernatantu transformowanej hodowli

Etap oczyszczania	Objętość (ml)	OD 280/ml	OD 280 całkowite	Jednostki (U)	Aktywność specyficzna (U/OD)
Supernatant	2300,0	9,00	20700,00	6150000	297
Powinowactwo kallikreiny	23,0	0,12	2,76	40700	14746
C18 z odwrotną fazą	0,4	3,84	1,54	11111	72150

Chromatografia surowego materiału przez kolumnę powinowactwa unieruchomionej bydlęcej kallikreiny trzustkowej selektywnie wyodrębniła 0,013% białka i 0,67% obecnej aktywności inhibitorowej trypsyny. Większość obecnej aktywności inhibitorowej trypsyny w wyjściowym supernatancie nie wiązała się z unieruchomioną. kallikreiną i nie jest związana z bikuniną (wyniki nie pokazane). Kolejna chromatografia z użyciem C18 z odwrotną fazą dała dalsze 5-krotne oczyszczenie, z odzyskiem, wynoszącym 0,2%. Ostateczny preparat był wysoko oczyszczony przez SDS-PAGE (fig. 13), wykazując Mr o 21,3 kDa i reagował na odciskach immunologicznych z króliczymi przeciw bikuninie łożyskowej 1102-159 (nie pokazano). Po sekwencjonowaniu N-terminalnym (26 cykli) uzyskano oczekiwaną sekwencję dla dojrzałej bikuniny łożyskowej (fig. 4F) zaczynając przy reszcie +1 (ADRER....), wykazując, że peptyd sygnałowy przekształcono prawidłowo w komórkach Sf9.

Oczyszczoną bikuninę łożyskową z komórek Sf9 (100 pmoli) poddano pirydyloetyloalkilacji, trawiono CNBr i potem sekwencjonowano bez rozdzielania otrzymanych fragmentów. Po sekwencjonowaniu przez 20 cykli uzyskano następujące końce N:

Sekwencja Ilość

LRCFrQQENPP-PLG-— 21 pmoii

ADRERSIHDFCLVSKVVGRC 20pmoli

FNYeE YCTANAVTGPCRASF 16 pmoi i

Pr--Y-V-dGS-Q-F-Y-G 6 pmoii

Reszta bikuniny łożyskowej # 154 - 168 SSEQU)nr63)

- 20 SSEQ ID nr 64)

100- 119(SEQDnr65)

- 43 (SEQ ID nr 66)

Tak więc odzyskano końce N, odpowiadające każdemu z oczekiwanych czterech fragmentów. Potwierdza to, że ekspresja białka w Sf9 zawierała całość sekwencji ektodomeny bikuniny łożyskowej (1-170). W wyniku sekwencjonowania N-terminalnego (50 cykli) dodatkowej próbki nietrawionej bikuniny łożyskowej (1-170) uzyskano sekwencję aminokwasową, którą w cyklu 30 pozbawiono jakiegokolwiek PTH-aminokwasu (oczekiwano PTAasparaginy). Podobny wynik otrzymano przy sekwencjonowaniu naturalnego białka z ludzkiego łożyska (przykład 7) i jest on zgodny z tą resztą glikozylowaną jak przewidziano od sekwencji aminokwasowej, otaczającej tę resztę asparaginową. Ponadto, reszty cysteinowe w tym regionie były także ciche zgodnie z ich udziałem w wiązaniu disiarczkowym.

Przykład 10

Specyficzność inhibicji oczyszczonej bikuniny łożyskowej pochodzącej z komórek Sf9.

Określono specyficzność in vitro rekombinowanej bikuniny przy użyciu materiałów i metod jakie opisano w przykładach 3, 4 i 7. Dodatkowo, zmierzono inhibicję ludzkiej kallikreiny tkankowej przez rekombinowaną bikuninę w buforze, zawierającym 50 mM Tris (pH 9,0), 50 mM NaCl i 0,01% Triton X-100. Po 5 minutach w temperaturze 37°C dodano 5 pl 2 mM pFR-AMC i monitorowano zmianę fluorescencji.

Określono inhibicję aktywatora plazminogenu tkankowego (tPA) jak następuje: tPA (pojedynczy łańcuch utworzony z hodowli ludzkich komórek czerniaka od Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) wstępnie inkubowano z inhibitorem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 20 mM buforze Tris pH 7,2, zawierającym 150 mM NaCl i 0,02% azydku sodu. Reakcje zapoczątkowano potem przez przeniesienie do układu reakcyjnego, zawierającego

188 387 następujące stężenia początkowe składników: tPA (7,5 nM), inhibitor 0-6,6 pM, DIle-LPro-Larg-p-nitroanilina (1 mM) w 28 mM buforze Tris pH 8,5, zawierającym 0,004% (objętościowo) Triton X-100 i 0,005% (objętościowo) azydku sodu. Określono tworzenie się p-nitroaniliny z A405 nm mierzonego po inkubacji w temperaturze 37°C przez 2 godziny.

Tabela poniżej ukazuje skuteczność rekombinowanej bikuniny jako inhibitora różnych proteaz serynowych in vitro. Ukazuje się dane porównujące dane otrzymane dla inhibicji skaningowej przy użyciu albo rekombinowanej bikuniny, albo aprotyniny.

Tabela 9

Porównanie wartości Ki w celu inhibicji różnych proteaz przez rekombinowaną bikuninę łożyskową (1-170) albo aprotyninę

Proteza (stężenie)	Rekombinowana bikuina Ki (nM)	Aprotynina Ki (nM)
Trypsyna (48,5 pM)	0,064	0,800
Ludzka kallikreina osocza (2,5 nM)	0,180	19,000
Ludzka kallikreina tkankowa (0,35 nM)	0,040	0,004
Bydlęca kallikreina trzustkowa (100 pM)	0,120	0,020
Ludzka plazmina (50 pM)	0,230	1,300
Czynnik Xa (0,1 nM)	180,000	5% inhibicji przy 31 pM
Czynnik XIa (0,1 nM)	3,000	288,000
Aktywator plazminogenu tkankowego	<60,000	brak inhibicji przy 6,6 μΜ
Tkankowy czynnik VIIa	800,000	brak inhibicji przy 1 pM

Wyniki ukazują, że można uzyskać ekspresję rekombinowanej bikuniny w komórkach owadzich, otrzymując aktywny inhibitor proteazy skuteczny przeciw co najmniej pięciu różnym inhibitorom proteaz serynowych. Rekombinowaną bikunina była silniejsza niż aprotynina przeciw ludzkiej kallikreinie osocza, trypsynie i plazminie. Nieoczekiwanie, rekombinowaną bikunina była silniejsza niż fragmenty bikuniny pochodzenia syntetycznego (7-64) i (102-159) przeciw wszystkim testowanym enzymom. Dane te ukazują, że rekombinowana bikunina jest skuteczniejsza niż aprotynina, przy użyciu oznaczeń in vitro, oraz że można oczekiwać większej siły in vivo.

Poza pomiarem siły przeciw specyficznym proteazom, oceniono zdolność bikuniny łożyskowej (1-170) do przedłużania czasu aktywowanej częściowo tromboplastyny (APTT) i porównano z aktywnością związaną z aprotyniną. Inhibitor rozcieńczono w 20 mM buforze Tris pH 7,2, zawierającym 150 mM NaCl i 0,02% azydku sodu, i dodano (0,1 ml) do kuwety, zawartej w mierniku krzepliwości MLA Electra^R 800 Automatic Coagulation Timer (Medical Laboratory Automation, Inc., Pleasantville, N.Y). Instrument ustawiono na APTT z 300 sekundowym czasem aktywacji i na podwojenie. Po dodaniu 0,1 ml osocza (Specialty Assayed Reference Plasma partia 1-6-5185, Helena Laboratories, Beaumont, TX), odczynnika APTT (Automated APTT-partia 102345 od Organon Teknika Corp., Durhan, Nc) i 25 mM CaCh automatycznie rozpoczęło się tworzenie skrzepu i czas krzepnięcia był mierzony automatycznie. Wyniki (fig. 14) pokazały, że podwojenie czasu krzepnięcia wymagał około 2 pM końcowej

188 387 aprotyniny, lecz tylko 0,3 pM bikuniny łożyskowej pochodzącej od Sf9. Dane te wskazują, że bikunina łożyskowa jest skutecznym środkiem przeciwkrzepliwym i pożytecznym lekiem przeciw chorobom związanym z patologiczną aktywacją wewnętrznego szlaku krzepnięcia.

Mimo, że pewne postacie realizacji wynalazku opisano szczegółowo w celu zilustrowania, osoba fachowa łatwo zauważy, że metody i preparaty tu opisane można modyfikować bez odbiegania od ducha i kształtu wynalazku. W związku z tym wynalazek nie jest ograniczony z wyjątkiem załączonych zastrzeżeń.

Fig. 2

R74593	GCAATAATTA	CCTGACCAAG	GAGGAGTGCC	TCAAGAAATG	TGCCACTGTC	50
ORF	Q * Ł	P D Q G	G V P	Q Ε M	C H C H	17
R74593	ACAGAGAATG	CCACGGGTGA	CCTGGCCACC	AGCAGGAATG	CAGCGGATTC	100
ORF	R E C	H G ·	P G H Q	Q £ C	S G F	33
R74593	CTCTGTCCCA	AGTCTCCCAG	AAGGCAGGAT	TCTGAAGACC	ACTCCAGCGA	150
ORF	L C Ρ K	S P R	R Q D	S E 0 H	S S 0	50
R74S93	TATGTTCAAC	TATGAAGAAT	ACTGCACCGC	CAACGCAGTC	ACTGGGCCTT	200
ORF	M F N	Y Ε Ε Y	C T A	N A V	T G P C	67
R74593	GCCGTGCATC	CTTCCCACGC	TGGTACTTTG	ACGTGGAGAG	GAACTCCTGC	250
ORF	RAS	F P R	W Y F D	V E R	NSC	83
R74593	AATAACTTCA	TCTATGGAGG	CTGCCGGGGC	AATAAGAACA	GCTACCGCTC	300
ORF	N N F I	Y G G	C R G	N K M S	Y R S	100
R74593	TGAGGAGGCC	TGCATGCTCC	GCTGCTTCCG	CCAGCAGGAG	AATCCTCCCC	350
ORF	Ε E A	C M L R	C F R	Q Q E	N Ρ P L	117
R74593	TGCCCCTTGG	CTCAAAGGTG	GTGGTTCTGG	CCGGGGCTGT	TTCGTGATGG	400
ORF	P Ł G	S K V	V V L A	G A V	s · w	133
R74593	TGTTGATCCT	TTTCCTGGGG	AGCNTCCATG	GTCTTACTGA	TTCCGGGTGG	450
ORF	C · S F	S W G	ASM	V L L I	P G G	150
R74593	CAAGGAGGAA	CCAGGAGCGT	GCCCTGCGGA	NCGTCTGGAG	CTTCGGAGAT	500
ORF	K Ε E	P G A C	Ρ A X	RLE	L R R *	167
R74S93	GACAAGGGMT					510
ORF	Q G					169

Klucz

R74593 - Sekwencja kwasu nukleinowego EST R74593 (SEQ ID nr 14) ORT » EST R74593 Translacja otwartej ramki odczytu (SEQ ID nr 15)

188 387

Fig. 3

R33464

N3979I

H94319

1174593 pópr.

Konsensus

Translacja

R33464

H3979*

H34519

R74591 popr.

Konsensus

Translacja

AIS464

K39796

H94S19

R74593 popr.

Konsensus

Translacja

R33464 «9799

H94S19

R74393 popr.

Konsensus

Translacja «5464 «9791

H94519

R74593 popr.

Konsensus

Translacja

GCCCOGGTCGT TTCTCGCCTG GCTGGGA-TC GCTGCTCCTC TCTGGGGTCC TGGGAMTC GCTGCTCCTC TCTGGGGTCC

GCWJCO-CGT TMMTCGCKT- GCTGGGA-TC GCTGCACCTC TCTOOOOTCO

Gnrmamfrrrr Trcrcnrcm QCTgaaa-TC GCTGCTCCTC TCTGGGGTCC A G 3 Γ LAM L G S L L L S O V

TGGCCGGCCG ACCGAGAACG CAGCATCCAC GACTTCTGCC TGGTGTCGAA 100 TGG-CGGCCG ACCGAGAACG CAGCATCCAC GACTTCTGCC TGGTGTCGAA 77 NGG-CGGCCG ACCGAGAACG CAGCATCCAC GACTTCTGCC TGGTGTCGAA 96

TGG-CGGCCG ACCGAGAACG CAGCATCCAC GACTTCTGCC TGGTGTCGAA 99 l a a a a ε a a i a a ε c a χ a a is

GGTGGTGGGC AGATTCCGGG CCTCCATGCC TAGGTGGTGG TACAATGTCA ISO GGTGGTGGGC AGATGCCOGG CCTCCATGCC ΤΑβΟΓΟβΤββ TACAATGTCA 127 GGTGGTGGGC AGATGCCGGG CCTCCATGCC TAGGTGGTGG TACAATGTCA 146

GGTGGTGGGC AGATfiCCGGG CCTCCATOCC TAGGTGGTGG TACAATGTCA 149 x x i* a c a a a a s a κ χ χνχζιζ

CTGACGGATC CTGCCAGCTG TTTGTGTATG GGGGCTGTOA CGOAAACAGC 200 CTGACGGATC CTGCCAGCTG TTTGTGTATG GOGGCTOTOA CGOAAACAGC 177 CTGACGGATC CTGCCAGCTG TTTGTGTATG GGGGCTGTOA OGGAAACAGC 196

CTGACGGATC CTGCCAGCTG TTTGTGTATG GGGGCTGTGA CGGAAACAGC 199 a a s c a l ε χ x g sca a u a

AATAATTACC TGACCAAGGA GGAGTGCCTC AAGAAATGTG CCACTGTCAC 250 AATAATTACC TGACCAAGGA GGAGTGCCTC AAGAAATGTG CCACTGTCAC 227 AATAATTACC TGACCAAGGA GGAGTGCCTC AAGAAATGTG CCACTGTCAC 246 AATAATTACC TGACCAAGGA GGAGTGCCTC AAGAAATGTG CCACTGTCAC 52 AATAATTACC TGACCAAGGA GGAGTGCCTC AAGAAATGTG CCACTGTCAC 249 Β M 7 l ΤΧΒ KCL RKCA Τ V T 65

ACGGGTGACC TGGCCACCAG ACGGGTGACC TGGCCACCAG ACGGGTGACC TGGCCACCAG ACGGGTGACC TGGCCACCAG ACGGGTGACC TGGCCACCAG T G O L ATS

TGCTCCCAGA AGGCAGGATT TGCTCCCAGA AGGCAGGATT TGCTCCCAGA AGGCAGGATT TGCTCCCAGA AGGCAGGATT TGCTCCCAGA AGGCAGGATT A P R R 0 O S

MTATTGKAAC AATAATTGCA CTA-TG-AAG AATACT-GCA CTA-TG-AAG AATACTGGCA CTA-TG-AAG AATACT-GCA ĆTA-TG-AAG AATACT-GCA

Υ Ε Ε X C T

CAGGAATGCA GCGGATTCCT 300 CAGGAATGCA GCGGATTCCT 277 CAGGAATGCA GCGGATTCCT 296 CAGGAATGCA GCGGATTCCT 102 CAGGAATGCA GCGGATTCCT 299 RNA AOSS92

CTSBAAGACC ACTTCAGCGA 350 CT-GAAGACC ACTCCAGCGA 326 CT-GAAGACC ACTCCAGCGA 345 CT-GAAGACC ACTCCAGCGA 151 CT-GAAGACC ACTCCAGCGA 349

X D H 5 S D 99

CCGMCAACGN ATT-------393

CCGCCAACOC AGTCACTGGG 372 CCGCCAACGC ATTCACTGGG 392 CCGCCAACOC AGTCACTGGG 197 CCGCCAACGC AGTCACTGGG 394

A N A V T G H3

188 387

Fig. 3 (ciąg dalszy)

R35464

N39798

H94319

R74593 popr

Konsensus

Translacja

CCTTGC-GTG GAATCCTTTC CCACGCTGGN AATTTNGACG TTGAGKAGGA 421

CCT-GC-GTG -CATCCTT-C CCACGCTGGT ACTTT-GNCG ---------- 427

CCTTGCCGTG -CATCCTT-C CCACGCTGGT ACTTT-GACG TGGAGA-GGA 243 CCTTGCCGTG -CATCCTT-C CCACGCTGGT ACTTT-GACG TGGAGA-GGA 440 PCRA SF PRWY F D V ER N 129

R35464

N39798

H94519

R74393 popr

Konsensus

Translacja

AC

ACTCCTGCAA TAACTTCATC TATGGAGGCT GCCGGGGCAA TAAGAACAGC ACTCCTGCAA TAACTTCATC TATGGAGGCT GCCGGGGCAA TAAGAACAGC S C N N F I Y G G ,C RGN K N S

423

293

490

143

R35464

N39798

H94519

R74593 popr

Konsensus

Translacja

TACCGCTCTG AGGAGGCCTG CATGCTCCGC TGCTTCCGCC AGCAGGAGAA TACCGCTCTG AGGAGGCCTG CATGCTCCGC TGCTTCCGCC AGCAGGAGAA YRSE EAC MLR CFRQ Q Ε N

343

540

162

R35464 -------------------------------------------------N39798 ---------------------------------------- ---------H94519 -------------------------------------------------R74593 popr. TCCTCCCCTG CCCCTTGGCT CAAAGGTGGT GGTTCTGGCC GGGGCTGTTT Konsensus TCCTCCCCTG CCCCTTGGCT CAAAGGTGGT GGTTCTGGCC GGGGCTGTTT

Translacja PPL PLGS KVV V L A GAVS

393

590

179

R35464

N3979B

H94519

R74393 popr

Konsensus

Translacja

CGTGATGGTG TTGATCCTTT TCCTGGGGAG CNTCCATGGT CTTACTGATT CGTGATGGTG TTGATCCTTT TCCTGGGGAG CNTCCATGGT CTTACTGATT * * C *SF S W G A SMV L Ł I

443

640

195

R33464

N39798

H94519

R74593 Popr

Konsensus

Translacja

CCGGGTGGCA AGGAGGAACC AGGAGCGTGC CCTGCGGANC GTCTGGAGCT CCGGGTGGCA AGGAGGAACC AGGAGCGTGC ΓΓΤπΓΠΠΑΜΓ GTCTGGAGCT PGGK EEP GAC P A * R LEL

493

690

212

R35464

N39798

H94519

R74593 Popr

Konsensus

Translacja

TCGGAGATGA CAAGGGNT ICGGiftGAIGA CAAGGGNT

R R « Q G

511

708

217

Klucz

R35464 - Sekwencja kwasu nukleinowego EST R35464 (SEQ ID nr: 12)

Ν3979Θ «= Sekwencja kwasu nukleinowego EST N39798 (SEQ ID nr: 17)

H94519 = Sekwencja kwasu nukleinowego EST H94519 (SEQ ID nr: 16)

R74593 popr. = Wersja poprawiona (SEQ ID nr: 14) przy bp 114

Konsensus = Sekwencja kwasu nukleinowego dla ludzkiej bikuniny (SEQ Translacja = Translacja aminokwasowa konsensusu (SEQ ID nr: 10)

ID nr:9)

188 387

Fig. 4A

Schemat, opisujący nakładanie się EST, niosących homologię do sekwencji cDNA, kodującej bikuninę łożyskową

H87300

T47439

H94519

R32678

N39798

H02982

R34808

H049Ż3

R73968

H18888

T66058

R34701

R53778

R87894

ATO

2C.

R74593

R35464

PCR

FCR * ΤΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖλ 670 bp * W77777777777777777777777777777\ βτζ bp | K3D 1 | ( KI02 1

I_I_1_I_1_I_I_L

200 400 600 800 1000 1 200 1400

PARY ZASAD

188 387

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000.

2250 n40851 .gbewwy >

~l n39876.gbxhowy ► r87894.gb«mi2 >

J hl S866.gbxełtl ► [r34808.gbxest2 >

l6605Łgbx«st2 t 1 n57450.gtntnowy ► | n57374.ghxno«y» | r35464.gbxest2 >

Ί h94519.gbxnowy>

] n39798.gbxnowy ► h87300.pbxestl ►

I f74S93.flbxext2 ► |r31730.gbxen2 ► | f34701 .gbxest2 4 [h02982.gbxest1 >

|r32676.gbxe«2 >

| t47439.gbxett2 ► | r73968.gbxełt2 > ]_h39840.gbxest1 ►

I h95233.gb»™«y 4 [h39841.gbx«tl 4 1 n30199.gb»owy4 j t5296B.gbxest2 ► ) n29508.gba*owy4 [n269l9.gbxnowy4 1 nzeSlO.glupw^l [ hl 6757.gbx»st1 4 | n27732.gbxnowy4

Fig. 4C

50

Bikunina ......CCCA CCTCCCCCCC TTGCCACCTC TACCCCCCCT CTCAACCCCT

840131 CCCA CCTCCCCCCC TTCGGACCTG TACCOCCCCT CTCAACCCCT

839474 CCCA CCTCCCCCCC TTCCCAOCTC TACCCCCCCT CTCAACCCCT

RI7494 ..................................................

H1S444 .....CCC CA CCTCCCCCCC TTGCCACCTC TACCGCC.CT CTCAACCCC8

834408 ..................................................

T4C058 ..................................................

857450 .............................I TACCCCCCCT CTCAACCCBA

857374 ..................................................

835484 ..................................................

89451» ..................................................

839798 ..................................................

887300 ..................................................

874593 ..................................................

831730 ..................................................

R347O1 ..................................................

802982 ..................................................

83247« ..................................................

Τ4743» ..................................................

873968 ..................................................

H39840 ..................................................

H95233 ..................................................

839841 ..................................................

83019« ..................................................

TS2944 ..................................................

829508 ..................................................

824919 ..................................................

824910 ..................................................

814757 ..................................................

N27732 ..................................................

188 387

Fig, 4C (c.d.)

100

Bikunina _CMA GCGCCC TTGACTCTCC CACCCCCCCA CCGCGCCAGT CACCAGCACA M4O851 MCACMCCCCC TTGACTCTCC CACCCCCCCA CCOCCCCACT CACCAGCACA

CCA.GCGCCC TTGACTCTCC CACCCCCCCA CCCCCCGACT CACCAGCACA «87844 ..........TTCACTGTMC MACCCCOCCA CCCCCCGACT CACCAGCACA

HUIM . .AHCCCCCG TTGACTCTCC CACCCCCC.A GGCCM.GAGT CACCAGCACA

R34808 .......................................G CACCAGCACA

758058 ..................................................

«57450 CAACNCCCCC TTGACTCTCC CAGCCSCCCA CCGCGCCAGT CACCAGCACA

H37374 ...............................................ACA

R354C4 ..................................................

«»451» ..................................................

«39798 ..................................................

«87300 ..................................................

R74593 ..................................................

R31730 ..................................................

R34701 ..................................................

H029B2 ..................................................

A32575 ..................................................

747439 ..................................................

R7396B ..................................................

K39B4O ..................................................

R95233 ..................................................

B39841 ..................................................

«30199 ..................................................

7529« ..................................................

«29508 ..................................................

«28919 ........................................ ..........

«25910 ..................................................

«15757 ..................................................

»27732 ..................................................

Fig. 4C (c.d.)

101 150

Bikunina CCCACCCATC CCCCCCCCAC AAC8C CCGC CTCCCCACAC TCAACCTCCC «40851 CCCACCCATC CCGCCCCGAC AAOfC.CCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC «39875 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACMC.GCCC HTCCCCACAC TCAACCTCCC RI1894 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACCCCCCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC «15856 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACMC.GCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC R34808 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACMC.GCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC

T55058 ..................................................

«57430 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACMC.GCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC «37374 CCCACCCATC CCCCCCCCAC AACMC.GCCC CTCCCCACAC TCAACCTCCC

M35454 .................... ..............................

H94519 ..................................................

«39798 ..................................................

«87300 ..................................................

R74513 ..................................................

R31730 ..................................................

R34701 ..................................................

«02982 ..................................................

R32576 ..................................................

T47439 ...........................·.......................

R73968 ..................................................

«39840 ..........·........................................

H95233 ..................................................

«39841 ..................................................

«30199 ..................................................

TS2955 ..................................................

«29508 ..................................................

«25919 ..................................................

«25910 ..................................................

«15757 ..................................................

«27732 ..................................................

188 387

Fig. 4C (c.d.)

131 20C

Bikunina CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT GGCGGACCCT CCCCCACCCT N40851 CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT 8398¼ CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT RH894 GAAAGGCGAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT KI<866 CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACC.T CCCCGACCN. R34808 GAAAGGCGAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT

TM0S8 .................................GCACCCT CCCCCACCCT

857450 CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT N57374 CAAACCCCAC TTCCCCCCCC TTTCCCACCT CCCCCACCCT CCCCCACCCT

R33484 ........................................ ..........

894519 ..................................................

N39798 ....................................„.............

H873OO ..................................................

R74593 ..................................................

R31730 ..................................................

R347O1 ..................................................

H02982 ..................................................

R33C76 ................................'..................

TO439 ..................................................

R?3968 ..................................................

B39I4O ..................................................

895233 ..................................................

839841 ..................................................

N30199 ..................................................

TS2966 .......... ........................................

H2950I ..................................................

826919 ..................................................

N26910 ..................................................

816757 ..................................................

827732 ..................................................

Fig. 4C (c.d.)

201 230

Bikunina CCGCACCTCA ACCCCACCCG CTCCATTGCG CCTCCCTTTC .ACCCGCTTC N40851 CCGCACCTCA ACGCCACGCC CTCCATTGCG CCTCCCT8TC .AGGGGCTTC N39876 CCGCACCTCA ACCCCACCCG CTCCATTGCG CCTCCCTTTC .AGGGGCTTC R87894 CCGCACCTCA ACCCCACCCG CTCCATTCCC CCTCCCTTTC .ACCCGCTTC H16866 .GCCACCTCA ACCCCACCCG CTCCATTCCC CCTCCCTTTC .ACCCGCTTC R34B08 CCGCACCTCA ACCCGAGCCG CTCCATTCCC CCTCCGTKTC GACCGCCTTC T66058 CGGCACCTGA ACCCCAGCC. CTCCATTCCC .CTCCCTCTC HACGCCCTTC N57450 CCGCACCTCA ACGCCACGCC CTCCATTCCC CCTCCCTTTC .ACCCGCTTC N57J74 CCGCACCTCA ACCCCAGCC. CTCCATTCC. CCTGCCTTBG .ACCCGCTTC

R35464 ..................................................

H94S19 ..................................................

N39798 ..................................................

H87300 ..................................................

R74593 ..................................................

R31730 ..................................................

R34701 ..................................................

H029B2 ..................................................

R32S74 ..................................................

T47439 ..................................................

R73968 ..................................................

839840 ..................................................

895233 ..................................................

839841 ..................................................

830199 ..................................................

T52966 ..................................................

829308 ..................................................

828919 ..................................................

826910 ..................................................

816757 ..................................................

827732 ..................................................

188 387

Fig. 4C (c.d.) aikunlna »«0151 »39176 R87894 81886* mioa ?Mosa »57430 »5737« »33464 H94519 »39796 »87300 »74593 R31730 »34701 »02982 R32676 W439 »73988 K39840 H95233 »39841 »30199 TS2966 »29508 »28919 »26910 K18757 »27732

251

CCGCACCT G CCGCACCT.C CCGCACCT.C CCGCACCT.G CCGCACCT.C CCGCACCT.C CCGCACCT.C CCGCACCT.C CC CG AA CT TG

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

ATCGCGAGAC

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

ATCCCCACAC

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACCCCT

CCCAACGCCT

CCCAACCCCT

CCTCC CCTC CCTCC.CCTC CCTCC.CCTC CCTHC.CCTC CCTHC.CCTC CCTGCCCCTC CCTCC.CCTC CCTCC.CCTC CCTCC.CCTC

300

CC TC cccc CCCTC.CCCC CCCTC.CCCC CC.TN.CCCC CC.TCGCCCC CC.TG.CCCC CC.TC.CGCC CCCTC.CCCC CC.TC.CGCC

Fig. 4C (c.d.)

Bikuniaa »40851

N39I78 »0789«

818888 »34808

T66038 »57450 »57374 »3346« »94319

N39798

H87300

R74593 »31730 »34701 »02912 »3267$

T«7«39

R73988

301

TC TCCCCTC TC.TCCCCTC TC.TCCGCTC TC.TCCCCTC TTCTCCCCTC TCTTCCCCTC TC.TCCCCTC TC.TCCCCTC TCCTCCCCTC

ACCT CCCCA ACCT.CCHCA ACCT,CCCCA AGCTTCCCCA ACCT.CCCCA ACCTCCCCCA ACCT. CCCCA ACCT. CCCCA ACCT. CCCC A

TCCCCCAWT

TCTCG

TCCCCCACT.

TCCCCCART.

TCCCCCART.

TGGCGCAMTT

TCCCCCART.

tcccccawt.

TCCCCCAMT.

CTTCC cccc

C.TCCCCMCC GTTRC.CGGC CTTCC.GNCC CTTCC. cccc CTTCC. c» cc CCTCC.cccc CCTGCCCHCC

350

T CAGCC CC

T.CACCC.G T.8ACCC.CC T.CAGCC.CC T.CAGCC.GG T.CAGCC.CC TTCACCC.CC T.CAGCCCCC ....cccccc

839840 ..................................................

895233 ..................................................

839841 ..................................................

»30199 ..................................................

T52986 ..................................................

»29308 ..................................................

»28919 ..................................................

»28910 ..................................................

H18757 ..................................................

»27732 ..................................................

188 087 δ7

Fig. 4C (c.d.)

351	400
Bikunina	AC CG CC	TTTCTCG	CC TGCTCGG	A TCCCT cc	T CCTCTCT
Rt7g94	ACC,
HI 8188	AC..CCNC3T	TTTTCTTCC.	CCTTGCTCGC	ATTCCCTTCC	7TCCTNTCTC
RJ4808	ACCCCCMCC.	.TTTTTTCCM	CCTTCCTCCC	ATTCC.TTG.	TTNCTCTCTN
TCCOSfi	...cccscc.	• TTTTCTCC.	CC.TGCTCCC	A.TCCCT.cc	T.CCTCTCT.
4437450	ANN.NGCCC.	..TTTCTCG.	CC.TCCTCCC	A.TCCCT.CC	T.CCTCTCT.
»57374	AC..GCCCCC	.. TTTCTCG.	CCTTCCTCCC	A.TCCCT.CC	T.CCTCTCTC
R3S4«4	.....CTCC.	..TTTCTCG.	CCTCCCTCCC	A.TCCCT.CC	T. CCTCTCT.
H94519	.CCNCCCCC.	. .TTOMTCC.	CN.TGCTCGG	A.TCCCT.CC	A. CCTCTCT.
NJ9798			.....CTCCC	AXTCCCT.CC	T.CCTCTCT.

H873OO ..................................................

RH 593 ..................................................

R31730 ..................................................

R347O1 ..................................................

ΗΟ29Θ2 ..................................................

R32878 ..................................................

T47439 ..................................................

R73988 ..................................................

H3984O ..................................................

K95233 ..................................................

839841 ..................................................

»30199 ..................................................

TS2988 ..................................................

»29508 ..................................................

»26919 ..................................................

»26910 ..................................................

H157S7 ..................................................

N27732 ..................................................

Fig. 4C (c.d.)

401 450

Bikunina CCCC TCCTC C CGCCCGA CCCA CAACS CA CCA TCC ACCACTT CT Rieass CCCCTTCCTC CG.CCCCCCA CCCA.CAACC CA. CC A. TCC AACAATTTTT

R34808 CCCGTTC.TC CCCłłCCCCCA NCCA.CAACC CAACCA?TTC ACCA.TTT T66058 CCCC.TCCTS C..CCCCCCA CCCA.CAACC CA.CCA.TCC ACCAKTT.CT »57450 GCGC.TCCTS C. .CCCCCCA CCCA.CAACC CA.CCA.TCC ACCACTT.CT N57374 CCCC.TCCTC C..CCCCCCA MCCAACAAHG CA.CCAATCC AHGAATTHCT R33464 CCCC.TCCTC C.CCCCCCCA CCCA.CAACC CA.CCA.TCC ACCACTT.CT 894519 CCCC.TCGHG C..CCCCCCA CCCA.CAACC CA.CCA.TCC ACCACTT.CT N397M CCCC.TCCTC C. .CCCCCCA CCCA.CAACC CA.CCA.TCC ACCACTT.CT

H873OO ..................................................

R74S93 ..................................................

A317J0 ..................................................

A347O1 ..................................................

H02982 ...................................................

R32676 ..................................................

T47439 ..................................................

R73988 ..................................................

»39840 ..................................................

H9S233 ..................................................

839841 ..................................................

»30199 ..................................................

TS2986 ..................................................

»29508 ..................................................

»28918 ..................................................

H26910 ..................................................

816757 ..................................................

»27732 ..................................................

188 387

Fic.. 4C (c.d.)

451

BlkunifOi GCCTCGTGT CGAAGCT CC H15866 768058 N57450 Nsnu R35464 H94519 N39796 H87300 R74593 R31730 R34701 H02982 R32676 747439 R73968 H3964O H9S233 K39841 N30199 752966 N29SO8 K26919 826910 R16757 827732

GCC

TCCTCGTCTT CGAAGG GCCTCGTGT. CGAAGCT.GG GCCTGGTCTT CGAAAGTTCC GCCTGGTGT. CGAAGCT. GG GCCTGGTGT. CGAAGCT.CG GCCTGGTGT. CGAAGCT.GG

SOC

TGGGCAGATG CCGGG CCTC CATCCCTA C

TGGGCAG

TGGGCANATT CCGGCGCCTT CATGNCTAAG TGGGCAGATT CCGGG.CCTC CATGCCTA.G TGGGCAGATG CCGGG.CCTC CATGCCTA.G TGGGCAGATG CCGGG.CCTC CATGCCTA.G

188 387

Fig. 4C (c.d.)

501 SIO

Bikunina C TCGT GGT ACAATCTCAC TGACGGATCC TCCCAGCTCT TTCTGT ATC »57374 CTTGGTTGGT ANAATGTHAA TTAANCATTC TTGCAACTGT TTCTCTMATT «35464 C.TCGT.CGT ACAATCTCAC TGACCCATCC TCCCAGCTCT TTCTGT.ATC »44319 C.TCGT.GCT ACAATCTCAC TGACGGATCC TCCCAGCTCT TTCTGT.ATC »34794 C.TGCT.CGT ACAATCTCAC TGACGGATCC TCCCAGCTCT TTCTGT.ATC

Η·1300 ..................................................

«74593 ..................................................

R317J0 ..................................................

«34 701 ..................................................

H02982 ..................................................

«3267« ..................................................

T47439 ..................................................

«73*68 ..................................................

»39840 ..................................................

H9S233 ..................................................

»39841 ..................................................

»30199 ..................................................

T52966 ..................................................

N29508 ..................................................

»26919 ..................................................

»26910 ..................................................

»16757 ..................................................

»27732 ..................................................

551 600

Bikunina CCCCCTCTCA CCCAAACA CCAATAATTA CCTGACCAAG CA CCACTCC »37374 GGGGCTSTTA AACCCAAANA .CAATAATKA CCTOACCAAA CAAGHAAT.. «33464 CCCCCTCTCA ..CCCAAACA CCAATAATTA CCTGACCAAG CA.CGACTCC »94319 CCCCCTCTCA ..CCCAAACA CCAATAATTA CCTCACCAAC CA.CCACTCC »39748 CCCCCTCTCA . .CCCAAACA CCAATAATTA CCTCACCAAC GA.CCACTCC »87300 CATTCCCCAC ACCCCAAACA CCAATAATTA CCTCACCAAC CA.CCACTtlC «74593 .................... CCAATAATTA CCTCACCAAC CA.CCACTCC «31730 ..................................................

R34701 ..................................................

»02482 .................... ..............................

«32676 ..................................................

T47439 ..................................................

R73968 ..................................................

»39840 ..................................................

H9S233 ..................................................

»39841 ..................................................

»30199 ..................................................

TS2966 ..................................................

»29308 ..................................................

»26919 ..................................................

»26910 ..................................................

»16737 ..................................................

»27732 ...................................................

188 387

Fig. 4R (c.d.)

601 6SC

Bikunina CTCAAGAAAT CTCCCACTCT CACAGACAAT GCCACGCGTG ACCTGGCCAC R35464 CTCAAGAAAT GTGCCACTGT CACAGACAAT GCCACGGGTC ACCTGGCCAC H94S19 CTCAAGAAAT GTGCCACTGT CACAGACAAT GCCACGGGTC ACCTGGCCAC NT9798 CTCAAGAAAT GTGCCACTGT CACAGACAAT GCCACGGGTC ACCTGGCCAC H87300 CTCAAGAAAT CTMCCACTGT CACAGACAAT GCCACGGGTC ACCTGGCCAC R74593 CTCAAGAAAT CTCCCACTCT CACAGACAAT CCCACCCCTC ACCTGGCCAC

R31730 ..................................................

R347O1 ..................................................

H02982 ..................................................

R32676 ..................................................

T47439 ..................................................

R73968 ..................................................

H39840 ..................................................

H95233 ..................................................

H39841 ..................................................

»30199 ..................................................

TS2966 ..................................................

»29508 ..................................................

»26919 ..................................................

»26910 ..................................................

H16757 ..................................................

N27732 ..................................................

651 700

Bikunina CAGCAGGAAT GCAGCGGATT CCTCTGTCCC AAGTGCTCCC AGAAGGCAGG R35464 CAGCAGGAAT GCAGCGGATT CCTCTGTCCC AAGTGCTCCC AGAAGGCAGG H94519 CAGCAGGAAT GCAGCCCATT CCTCTGTCCC AAGTGCTCCC AGAAGCCACC »39798 CAGCAGGAAT GCAGCGGATT CCTCTGTCCC AACTCCTCCC AGAAGGCAGG H87300 CAGCAGGAAT CCAGCCCATT CCTCTGTCCC AACTCCTCCC AGAAGCCACC R74593 CAGCAGGAAT GCAGCGGATT CCTCTGTCCC AACT.CTCCC ACAACGCACG

831730 ..................................................

R347O1 ..................................................

H02982 ..................................................

R32S76 ..................................................

T47439 ..................................................

R73968 ..................................................

H39840 ..................................................

H9S233 ..................................................

H39841 ..................................................

»30199 ..................................................

752966 ..................................................

N29508 ..................................................

»26919 ..................................................

»26910 ...................................................

H16757 ..................................................

»27732 ..................................................

188 387

Fig. 4C (c.d.)

701 ⁷50

Bikunina ATTCT CAAG ACCACTCCAG CGATATGTT CAACTAT G AAGAATACTC RJ5464 ATTCTTCAAG ACCACTTCAG CGATATGTTT CAAKTATTCM AAG AAT AA TT H94519 ATTCT.GAAG ACCACTCCAG CGATATGTT. CAACTAT..G AAGAATACTC H3J79B ATTCT.CAAC ACCACTCCAG CGATATGTT. CAACTAT..G AAGAATACTC H87300 ATTCT.CAAG ACCACTCCAG CGATATGTT. CAACTAT..G AAGAATACTC R74593 ATTCT.GAAG ACCACTCCAG CGATATGTT, CAACTAT..C AAGAATACTC

R31730 ..................................................

R34701 ..................................................

H029B2 ..................................................

«3367« ..................................................

T47439 ..................................................

R7396B ..................................................

K39B40 ..................................................

H93333 ..................................................

H39841 ..................................................

N30199 ..................................................

T52966 ..................................................

H29S0B ..................................................

H26919 ..................................................

K26910 ..................................................

H16757 ..................................................

N27732 ..................................................

Bikunina R35464 H94S19 K3979S H873C0 RHS93 R31730 R34701 H02 983 R32676 147*39 R73968 H39B40 H95233 Η39Θ41 N30199 T52966 N29508 N2691J N26910 K16757 «7732

751

CACCCCCAA CCCACT CAC GCACCGNCAA CGNATT GCACCCCCAA CGCATT.CAC .CACCCCCAA CCCACT.CAC .CACCCCCAA CGCAGTNCAC .CACCCCCAA CCCACT.CAC

TCGGCC TTG CCGTG CAT

TCGGCC..IG C.CTG.CAT. TGGGCCCTTG C.GTGGAAT. TCCCCC.TTC C.CTCCCATN TGGCCC.TTG CCGTG.CAT.

B00

CCTT CCCAC

CCTT.CCCAC

CCTTTCCCAC

CCTT.CCCAC

CCTT.CCCAC

188 387

Fig. 4C (c.d.)

801 850

Bikunina CCTGGTACTT T GACCTGGA CA CGAACTC CTC CAATAA CTTCATCTAT

H94519 CCTGGTACTT T.GMCGT

S39798 GCTGCNAATT TNCACSTTGA CAACCAAC

H87300 CCTNCTACTT T.GACCTGGA GA.CGAACTC CTCCCAATAA CTTCATCTAT R74S93 CCTGGTACTT T.GACCTGGA CA.GGAACTC CTG.CAATAA CTTCATCTAT

R31730 ..................................................

R34701 ..................................................

H02982 ..................CA CA.GGAACTC CTG.CAATAA CTTCATCTAT

R32676 .......................................CATTC..GGAA

T47439 ..................................................

R73968 ..................................................

K3984O ..................................................

K9S233 ..................................................

R39841 ..................................................

N30199 ..................................................

75296« ..................................................

«29508 ..................................................

«26919 ..................................................

N26910 ..................................................

R18757 ..................................................

H27732 ..................................................

851 900

Bikunina CGAGCCT CC CCGGCCAAT AAGAACAC C TACCGCTC T GAGGAGCCCT 887300 CCAGCCTTGC CCCGGCAATN AACAACACMT TACCCCTCTT TACCAGCCCT R74593 CCACCCT.CC CCCCCCAAT. AAGAACAC.C TACCCCTC.T CAGCAGCCCT

R31730 ...........................G.C TACCGCTC.T CAGCAGCCCT

R34701 ..................................................

H02992 CCNCCCT.CC CCGGC.AA7. AAGAACA.MC TACCCCTC.T GAGGAGCCCT R3 2 6 7 « CCACCA..CC CCGGCCAAT. AAGAACAC.C TACCGCTC. T GACGAGGCCT

T47439 ............................................NGGCCT

R73969 ..................................................

H39840 ..................................................

H95233 ..................................................

H39641 ..................................................

K30199 ..................................................

T52966 ..................................................

«29508 ..................................................

«28919 ..................................................

«28910 ...........j......................................

H1S757 ..................................................

«27732 ..................................................

188 387

Fig. 4C (c.d.)

901 950

Bikunina GCA TCCTC CGCTGCTTCC CC CA CCACCA

H87300 .GCA.T.....

RH593 .GCA.TGCTC CGCTGCTTCC GC...................CA.GCAGGA

R31730 .GCA.TGCTC CGCTGCTTCC GC...................CA.GCACGA

R34701 ................TTCC GC...................CAACCACCA

H02982 .CCC.TCCTC CGCTGCTTCC GCTGTGTGTT CTCTTCCAGG CCA.GCAGGA

R32676 .GCA.TGCTC CGCTCCTTCC CC...................CA.CCACCA

T 4 7 4 3 9 TGCACTCCTC CGCTGCTTCC CC.......: ...........CA. GCAGGA

R73968 ..................................................

H39840 ..................................................

K95233 ..................................................

H39841 ..................................................

830199 ..................................................

752966 ..................................................

829508 ..................................................

826919 ..................................................

826910 ..................................................

H16757 ..................................................

827732 ..................................................

951 1000

Bikunina GAA TCCTCC CCTGCCCCTT GCCTCAAAGC TCGTGCTTC TCG CGGCCC R74593 GAA.TCCTCC CCTCCCCCTT GGCTCAAACG TGGTGGTTC. TGGfiCGGGGC R31730 GAA.TCCTCC CCTGCCCCTT GCCTCAAAGC TGGTGGTTC. TGG.CGGGGC R34701 AAAMTCCTCC CCTCCCCCTT GCCTCAAAGC TGGTGGTTCC TGG.CGGGGC H02 982 CAA.TCCTCC CCTCCCCCTT GCCTCAAAGC TCGTGCTTC. TGG.CGGGGC R32676 GAA.TCCTCC CCTGCCCCTT GCCTCAAAGC TGGTGGTTC. TGG.CGCGGC T47439 CAA.TCCTCC CCTCCCCCTT CCCTCAAAGG TCGTGCTTC. TCG.CGGCCC

R73968 ............................................CGGCCC

H39B40 ..................................................

H9S233 ..................................................

839841 ..................................................

830199 ..................................................

T52966 ..................................................

829508 ..................................................

826919 ..................................................

826910 ..................................................

H167S7 ..................................................

N27732 ..................................................

188 387

Fig. 4N (c.d.) ιοο; 1050

Bikunina TCTT CCTCA TGGTGTTGAT CC T CTTCC TCCG ACCCT CC ATCCTC

R14S93 TGTTSCCTGA TGGTCTTCAT CCTT..TTCC TGGGGAGCNT CC.ATGGTCT R31730 TGTT.CGTGA TCGTGTTGAT CC.T.CTTCC TGGGGAGCCT CC.ATGGTC. RH701 TGTT.CGTGA TCGTGTTGAT CCCTCCTTCC CCCG.ACCCT CCCATGCTCC H029B2 TGTT.CGTGA TGGTGTTGAT CC.T.CTTCC TGGC.AGCCT CC.ATGCTK. R32676 TGTT.CGTGA TCGTGTTGAT CC.T.CTTCC TCCG.ACCCT CC.ATCCTC. T47439 TGTT.CGTGA TGGTGTTGAT CC.T.CTTCC TGGC.AGCCT CC.ATGGTC. R73968 TGTT.CGTGA TGGTGTTGAT CC.T.CTTCC TGGC.AGCCT CC.ATGGTC.

H39840 ..................................................

H95233 ..................................................

H39941 ..................................................

830199 ..................................................

T32966 ..................................................

Ν295ΟΘ ..................................................

826919 ..................................................

826910 ..................................................

H16737 ..................................................

827732 ..................................................

1051 1100

Bikunina TACC TCAT CCGGGTGCCA CGGAGG AAC C AGC ACCG TCCCCTCCCC R74393 TAC..TGATT CCGGGTGCCA AGGACG.AAC C.AGC.ACCG TCCCCTCCCC R31730 TACC.TCAT. CCGGGTGCCA CCCAGGCAAC C.AGGGAGCG TCCCCTCCCC R34701 TACCCTGAT. CCGGGTGGCA CGCAGG.AAC CCAGG.ANCC TCCCCTCCCC H02982 TACC.TGAT. CCGGGTNGCA CGCAGG.AAC C.AGGGAGCG TGCCCTGCGN R32676 TACC.TCAT. CCGGGTGCCA CGCAGG.AAC C.AGGGAGCG TCCCCTCCCC T47439 TACC.TCAT. CCCCCTNGCA CGCAGG.AAC C.ACC.AGCG TGCCCTGCCC R73969 TACC.TGAT. CCGGGTGGCA CGGACG.AAC C.ACC.AGCG TCCCCTCCCC

H39940 .......................GCC.AAC C.AGG.AGCG TGCCCTGCCC

H95233 ..................................................

839841 ..................................................

N30199 ......................GAGGAACC C.AKG.AGCT TCCCCTGCGC

T52966 ..................................................

829509 ..................................................

N26919 ..................................................

826910 ..................................................

H16757 ..................................................

827732 ..................................................

188 387

Fig. 4C (c.d.)

	1101					11 SC
Bikunina	ACCG	TCT G	CACCTCCCCA	CATCACAACC	ACCACCTCG	TCAACAAC
R14593	ANCC	.TCT.C	CACCTTCCCA	CATCACAACC	CNT
R31730	ACCC	.TCTGG	CACCTCCCGA	CATCACAACC	CACCACCTCC	CTCAACAAC.
R34701	ACCG	.TCT.C	CACCTCCCGA	CATCACAACC	.ACCACCTGC	.TCAACAAC.
802982	ACCC	.TCTNG	CACCTCCCCA	CATCACAAGG	.ACCACCTGC	.TCAACAAC.
R32676	ACCC	.TCTGG	CACCTCCCGA	GATCACAACC	CACCACCTCC	.TCAACAAC.
T«7<39	ACCC	.TCT.C	CACCTCCCCA	CATCACAACC	.ACCACCTCG	.TCAACAAC.
R73968	ACCC	.TCT.C	CACCTCCCCA	CATCACAAGG	.ACCAGCTCG	.TCAACAAC.
H39840	ACCGGTCT.C	CACCTCCCGA	CATCACAACC	.ACCACCTCG	.TCAACAAC.
895233
H39841
830199	ACCC	.TCT.C	CACCTCCCCA	SAT8ACAAHC	.ACCACCTCN	.TCAACAACC

T52966

N29508

826919

826910

816757

N27732

	1151								1200
Bikunina	acatatct c	CTGT CACCC	CCCTGT	CGC	c	AACAGC	A	CT	GGCCAA
R3173O	ACATATCTTC	CTCTTCACCC	NCCTCTTCCC	c	AACAGG	A	TTCCCCCAA.
R347O1	ACATATCT.C	CTCT.CACCC	CCCTCT	.CCC	c	AACAGC	λ	CT	.GGCCAA.
HO2982	ACATATGT.C	ctct.caccc	8CCTCTTCCN	c	AACACC	A	CTKGGGGAAA
R32676	ACATATCTTC	CTCTTCACCC	CCCTCTTCCC	c	AACACCCA	NTCCCCCAA.
T47439	ACATATCT.C	CTCT.GACCC	CCCTCT	CCC	c	AACACC	A	CT	CCGCAA.
R73968	ACATATCT.C	CTCT.CACCC	CCCTCT	CGC	c	AACAGC	A	CT	GGCCAA.
839840	ACATATCT.C	CTCT.CACCC	c<*c*^** wwU a «	CCC	c	AACACC	A	CT	NGCCAA.
895233
839841		........c,	CCCTCT	CCC		A	CT
N30199	ACATATGT.C	CTCT.GACCC	CCCT8T	CGC	c	AACACC	A	CT	CCC8AAA
?32966
829508		.......CC.	CCCT8T	CCC	c	AACACC	A	CT	CCC.AA.
826919
826910
H1675T
N27732

188 387

Fig. 4C (c.d.)

1201 1253

Bikunina	GCCACCCC	AG ACT AT C	TCT CA CCT	TTTTTT AA	A TACA	CG
R31730	.CCCACCCGC	A
R34701	.GGGAGGGC.	AGACTAT.C.	TCT.CA.CCT	TTTTTT..AA	A.TA
«02982	CCCGAGCCC.	ACATTAT.G.	TCTTCA.CTT	TTTTTT..AA	AKT AC
R32676	GGCCAGCCCC	ACAKTATTCT	TCTTCA.CNT	TTTTTTTAAA	ATTACCACCC
T47439	.CCGAGCCG.	AGACTAT.C.	TCT.CA.CCT	TTTTTT..AA	A.TACA	• CC
R73968	•CCGAGCCG.	AGACTAT.C.	TCT.CA.CCT	TTTTTT..AA	A.TACA	.cc
H39840 H95233 «39841	.CCGAGCCG.	AGACTAT.C.	TCT.CA.CCT	TTTTTT..AA	A.TACA	.cc
CCGAGCCGA	AAACHAT.C.	TCT.GAACCT	TTTTTT.AAA	A.TACA	.cc
«30199 TS2966 «39308	.CCGAGCNC.	AGACTAT.C.	TCT.AA.CCT	TTTTTT..AA	A.TACA	.cc
.CCC AC CCC.	AGACTA..c.	TCT.CA.CCT	TTTTTT..AA	A.TACA	• CC
«2(919 «2(910 «16757
«27732
1251					3C0
91kunina	GATTCACTC	CCATTTC A	CT CATC A	TTACCC CT	CACCTCTCTT
R32676	GKTTGANTTC	CCGNTTTTKA	CTTCATCCAT	TTACGCCCNT	GAC
T47439	GATTCACTC.	.CCATTTC.A	CT.CATC.A.	TTACCC..CT	GACCTCTNTT
873968	CATTCACTC.	•CCATTTC.A	CT.CATC.A.	TTACCC. .CT	CACCTCTCTT
H39840	CATTCACTC.	.CCATTTC.A	CT.CATC.A.	TTACCC..CT	CACCTCTCTT
H95233 H39841			...... . .A,	TTACCC..CT	CACCTCTCTT
GATTCACTC.	.CCATTTC.A	CT.CATC.A.
I vl	GAGCTUlwll
«30199	GATTCACTC.	.GCATTTCGA	CT.CATC.A.	TTACCC..CT	CACCTCTCTT
T52968
«29308	CATTCACTC.	.CCATTTC.A	GT.CATCHA.	TTACCC..CT	CACCTCTCTT
«26919
«26910
«1(757
N27732
1301					.353
Bikunina	TCTCTCCCAC	CTACCACCCC	TCCTTCC TC	C TC TCCCA	CCCATCCC
T47939	TCTCTKGGAG	CTAGCACGA
R73968	TCTCTCCCAC	CTACCACCCC	kC* . TC	CCTCTTSCCA	•CCGAT3CCC
«398(0 «95233	TCTCTCCCAC HCTCTGCCAC	CTACCACCCC HTAGCACCCC	TCCTTCC. TC	C.TC.TCCCA	.CCCATCCC.
Iwww Ikk	C.TC.TCCCA	a COCATCGua.
«39841	TCHCTCCCAC	CTACCACCCC	TCCTCCCCTC	3·TC >7GCCA	.CCCATCCC.

«30199 TCTCTCCCAC CTACCACCCC TCCTTCC.TC C.TC.TCCCA .CGGATGGG.

75296« ................................TC.TCCCA .CCCATCCC.

«29508 TCTCTCCCAC CTACCACCCC TCCTTCA.TG O.TC.TCCCA .CCCATCCC.

N26919 ..................................................

«2(910 ..................................................

ΗΚ757 ..............................C C.TC.TCCCA .CCCATCCC.

N27732 .........................CCCTC CCTCCTCNCA ACCKATCCCC

188 387

Fig. 4C (c.d.)

Bikunina	1351 TTTG CTTTG	G AAATCCTC	T AGGAGGCT	CCTCCT ccc	1400 ATGG CC TC
R73988	TTTC.CTTTG	GCAAATCCTC	TTNGCACCCT	CCTCCTTccc	atcggccttg
H39840	TTTC.CTTTG	GAG AA TCCTC	T.AKGACGCT	CCTCCT.CGC	atgg.cc.tg
895233 '	TTTC.CTTTG	G.AAATCCTC.	T. AGGAGGCT	CCTCCT.CCC	ATGG.CC.TG
839841	TTTG.CTTTG	G.AAANCCNC	T.AGGAGGCT	CCTCCT.CGC	ATGG.CC.TG
830199	TTTC.CTTTG	G.AAATCCTC	T.AGGAGGCT	CCTCCTTCGC	ATGG.CC.TG
732966	TTTC.CTTTG	G. AAATCCTC	T.AGGAGGCT	CCTCCT.CGC	ATGG.CC.TG
N295O8	TTTC.CTTTG	G.AAATCCTC	T.ACĆAGGCT	CCTCCT.CGC	ATCC.CC.TG
N26919			....CACGCT	CCTCCT.ccc	ATGG.CC.TG
826910	.....CTTTT	GN AAATCCTC	T.AGGAGGCT	CCTCCT.CGC	ATGG.CC.TG
816757	TTTGCCTTTG	G.AAANCCTC	T.AGGAGGCT	CCTCCT.CGC	ATGG.CC.TG
N27732	TTTC.CTTTG	G.AAAICCTC	TTAGGAGGCT	CCTCCT.CGC	ATGG.CC.TG
Bikunina	1401 CAGT CT GG	CAGCAG CCC	CGAGTTGTTT	CC TCGCTG	1450 ATC CATTTC
R73968	CAGT.CTMGG	CAGCAHCCCC	CGAGTTTTTT	TCCTTCGCTG	ATCCGATTTC
839840	CAGT.CT.GG	CAGCAC.CCC	CGAGTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATC.CATTTC
895233	CAGTTCT. .C	CAGCAC.CCC	CGAGTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATC.CATTTC
839841	CAGT.CT.GG	CAGCAG.CCC	CCACTTGTT8	.CC.TCGCTG	ATC.GATHTC
830199	CAGT.CT.GG	CAGCAC.CCC	CGACTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATC.CATTTC
T52966	CAGT.CT.CC	CAGCAG..CC	CGAGTTGTTT	•CC.TCGCTG	ATC.CATTTC
829508	CACT.CT. .C	CAGCAC.CCC	CGACTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATC.GATTTC
826919	CAGT.CTTCG	CAGCAG.CCC	CGAGTTGTTT	•CC.TCGCTG	ANC.CATTTC
N26910	CAGT.CT..G	CACCAG.CCC	CGACTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATCCGATTTC
816757	CAGTMCT.CG	CACCAGACCC	CGACTTGTTT	.CC.TCGCTG	ATC.GATTTC
827732	CAGT.CT.GG	CAGCAC.CCC	CGACTTCTTT	.CC.TCGCTG	AHC.GATTTC
Bikunina	1451 TTT CCTCCA	CCTAG ACT	TTTC TTTG	CTTATGTTCA	1500 ATTCCATTCC
R73968 H39840	TTTTCCTCCA TTT.CCTCCA	GGTAACAATT GGTAG..AGT	TTTCTTTT TTTC.TTTG.	CTTATCTTGA	ATTCCATTCC
895233	TTT.CCTCCA	CGTAG..AGT	TTTC.TTTG.	CTTATGTTGA	ATTCCATTCC
H39841	TTT.CCCCCA	CGTAG..AGT	TTTC.TTTC.	CTTATGTTCA	ANTCCATTCC
830199	TTT.CCTCCA	CCTAC..ACT	TTTC.TTTC.	CTTATCTTGA	ATTCCATTCC
TS2966	TTT.CCTCCA	GGTAC..AGT	TTTC.TTTG.	CTTATGTTGA	ATTCCATTCC
829508	TTT.CCTCCA	GGTAC..AGT	TTTC.TTTG.	CTTATGTTGA	ATTCCATTCC
826919	TTT.CC8CCA	GGTAC..AGT	TTTC.TTTG.	CTTATCTTGA	ATTCCATTCC
826910	TTT.CCTCCA	CGTAG..ACT	TTTC.TTTG.	CTTATGTTCA	ATTCCATTCC
816757	TTTACCCCCA	CCTAG..AGT	TTTCCTTTCN	CTTATCTTGA	ATTCCATTCC
827732	TTT.CCTCCA	GGTAG..AGT		CTTATGTTCA	ATTCCATTCC

188 387

Fig. 4C (c.d.)

1301 '.552

Bikunina CTCTTTT Cł CATCACAGAA CTCATCTTCC AATCGTTTCT TTTCTTT CT 839840 CTCTTTT.CT CATCACAGAA CTCATCTTCC AATCGTTTCT TTTCTTTTGT H93233 CTCTTTT.CT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCGTTTCT TTTCTTT.GT 839841 CTCTTTT.CT CATCACAGAA CTCATCTTCC AATCGTTTCT TTTCTTT .CT 830199 CTCTTTT.CT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCGTTTCT TTTGTTT.GT T32966 CTCTTTT.CT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCCTTTCT TTTGTTT.GT 82930# CTCTTTT.CT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCGTTTCT TTTGTTT.GT 826919 CTCTTTT.C8 CATCACAGAA CTCATCTTCC AATCCTTTCT TTTGTTT.GT 826910 CTCTTTT.CT CATCACAGAA CTCATCTTCC AATCGTTTCT TTTGTTT.GT H16737 CTCTTTTACT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCGTTTCT TTTGTTT.GT 827732 CTCTTTT.CT CATCACAGAA GTGATCTTGG AATCGTTTCT TTTCTTT.CT

1531 1600

Bikunina CTGATTTATC C ΤΤΓΤΤΤΤ AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT

H39940 CTGATTTATG GCTTTTTTTT AAGTAT

H93233 CTGATTTATG C..TTTTTTT AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT H39841 CTGATTTATG G.. ΤΤΓΤΤΤΤ AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTAGCATT 830199 CTGATTTATC C..ΤΤΓΤΤΤΤ AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT TS2966 CTGATTTATG G..TTTTTTT AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT 829308 CTGATTTATC C..TTTTTTT AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT 828919 CTGATTTATC G..TTTTTTT AAGT8TAAAC AAAAGTTTTT TATTACCATT 826910 CTGATTTATG C..ΤΤΓΤΤΤΤ AACTATAAAC AAAAGTTTTT TATTAGCATT H16757 CTGATTTATG G..TTTTTTT AAGTATAAAC AAAACTTTTT TATTAGCATT 827732 CTGATTTATG G.. ΤΤΓΤΤΤΤ AAGTATAAAC AAAACTTTTT TATTAGCATT

1601 1650

Bikunina CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG GCGCCTTCCC

H95233 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAA H39B41 CTGAAAGAAG CAAACTAAAN TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC 830199 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC T32966 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC 829508 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC 826919 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC 826910 CTCAAACAAC CAAACTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG CGCCCTTCCC 816757 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG GCCCCTTCCC 827732 CTGAAAGAAG GAAAGTAAAA TGTACAAGTT TAATAAAAAG GCCCCTTCCC

1651 1689

Bikunina CTTTAG AAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA

H3S941 CTTT AA.

830199 CTTTAG.AAT AAA

T32966 CTTTACCAAT- 8ΑΑΑΑΗΑΑΑΛ AACCCTC

829308 CTTTAG.AAT AAATTTCACC ATCTCCTTTC AA

826919 CTTTAC.AAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A

826910 CTTTAC.AAT AAATTTCACC ATCTCCTTTC AAAAAA

H16757 CTTTAC.AAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA

827732 CTTTAC.AAT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA

188 387

Fig. 4D

EST	k onaana	MLRAEADGVS	rllgslllsg	VLAADR£RSI	HDFCLVSKW	GRCRASMPRW	50
EST	konssns	WYNVTDOSCQ	LFVYGGCDGN	SNNYLTKEEC	LKKCATVTEN	ATGDLATSRM	100
EST	kansana	AADSSVPSAP	RRQDSEDHSS	DMFNYEEYCT	ANAVTGPCRA	SFPRWYFDVE	150
EST	konaena	RNsawriYG	GCRGNKNSYR	SEEACMLRCF	ROGEKPPLPL	GSKVWIAGL	200
EST	konaana	EYMYŁIŁTŁG	A3MyXŁIRVA	RRKQERALRT	VWSSGOOKEQ	LVKNTYVL	248

Fig. 4E

cDNA					ACC	3
translacja					f	-47
cDNA	TGATCGCGAG	ACCCCAACGG	CTGGTGGCGT	CGCCTGCGCG	TCTCGGCTGA	53
translacja	S R D	PNG	W W R	R L R V	s λ ε	-30
cDNA	GCTGGCCATG	GCGCAGCTGT	GCGOOCTGAG	GCGGAGCCGG	GCGTTTCTCG	i 103
translacja	ŁAM	A Q L (	: G Ł R	R S R	A F L A-13
CDNA	CCCTGCTGGG	ATCGCTGCTC	CTCTCTGGGG	TCCTGGCGGC	CGACCGAGAA	153
	L Ł G	S L L	L S G V	L A A	0 R E	4
CDNA	CGCAGCATCC	ACGACTTCTG	CCTGGTGTCG	AAGGTGGTGG	GCAGATGCCG	203
translacja	R S X H	D r C	L V S	X V V G	R C R	21
CDNA	GGCCTCCATG	CCTAGGTGGT	GGTACAATGT	CACTGACGGA	TCCTGCCAGC	253
translacja	ASM	P R W W	Υ Ν V	T D G	s c a l	38
CDNA	TGTTTGTGTA	TGCGGGCTGT	GACGGAAACA	GCAATAATTA	CCTGACCAAG	303
translacja	r ν γ	GGC	D G N S	Ν Ν Y	L Τ X	54
CDNA	GAGGAGTGCC	TCAAGAAATG	TGCCACTGTC	ACAGAGAATG	CCACGGGTGA	353
translacja	ε ε C Ł	K K C	A Τ V	T S N A	T G D	71
cDNA	CCTGGCCACC	AGCAGGAATG	CAGCGGATTC	CTCTGTCCCA	agtgctccca	403
translacja	LAT	S R N A	A D S	S V P	s A P R	88
cDNA	GAAGGCAGGA	TTCTGAAGAC	CACTCCAGCO	ATATGTTCAA	CTATGAAGAA	4S3
translacja	R Q D	S E D	H S S 0	M F N	Y E E	104
CDNA	TACTGCACCG	CCAACGCAGT	CACTGGGCCT	TGCCGTGCAT	CCTTCCCACG	503
translacja	Y C T A	N A V	T G t	C R A S	F P R	121
cDNA	CTGGTACTTT	GACGTGGAGA	GGAACTCCTG	CAATAACTTC	ATCTATGGAG	553
translacja	w γ r	D V E R	N S C	Ν N F	I Y G G	138
cDNA	GCTGCCGGGG	CAATAAGAAC	AGCTACCGCT	CTGAGGAGGC	CTGCATGCTC	603
translacja	CAG	Ν X N	S Y R S	ε ε a	CML	154
cDNA	CGCTGCTTCC	GCCAGCAGGA	GAATCCTCCC	CTGCCCCTTG	GCTCAAAGGT	653
translacja	R C F R	Q 0 E	Ν P P	Ł P Ł G	s κ χ	171
CDNA	GGTGGTTCTG	GCGGGGCTGT	TCGTGATGGT	GTTGATCCTC	TTCCTGGGAG	703
translacja	V V L	A G L F	V Μ V	L I L	r I, G A	188
CDNA	CCTCCATGGT	CTACCTGATC	CGGGTGGCAC	GGAGGAACCA	GGAGCGTGCC	753
translacja	S Μ V	Y L I	R V A R	R N Q	ε r a	204
CDNA	CTGCGCACCG	TCTGGAGCTT	CGGAGATGA			782
translacja	L R Τ V	W S F	G 0			213

188 087

Fig. 4F

CDNA CDNA CDNA CDNA CDNA CDNA cDNA translacja	GCACGAGTTG GGAGGTGTAG CGCGGCTCTG AACGCGCTGA	GGGCCGTTGA GGCATCGCGC GGCGACTTCC ACCTGAACGC ACCTGATCGC TGAGCTGGCC TCGCCCTGCT ALL	SO 100 150 200 230 300 3S0 -11
GTGTCGCAGG CGGCGAGGGC GCCGAGAAGG CCGGGCGTCC	GCGAGTGAGG AGCAGACCCA CCACACTGAA GGTCCGGAAA
GGGGGCTTTG GAGGCGCTCC GAGACCCCAA ATSGCGCAGC M A Q L	GCACCTGGCG ATTGCGCGTG CGGCTGGTGG TGTGCGGGCT C G L	GACCCTCCCG CGCGTTGAGG CGTCGCCTGC GAGGCGGAGC R R S	GAGCGTCGGC GGCTTCCCGC GCGTCTCGGC CGGGCGTTTC R A F L
cDNA	GGGATCGCTG	CTCCTCTCTG	GGGTCCTGGC	GGCCGACCGA	GAACGCAGCA	400
translacja	G S L	L L S G	V L A	ADR	ε r s i	7
CDNA	TCCACGACTT	CTGCCTGGTG	TCGAAGGTGG	TGGGCAGATG	CCGGGCCTCC	450
translacja	H D F	C L V	S X V V	G R C	RAS	23
cDNA	ATGCCTAGGT	GGTGGTACAA	TGTCACTGAC	GGATCCTGCC	AGCTGTTTGT	SOO
translacja	Μ P R W	ΝΥΝ	V T D	G S C 0	L F V	40
CDNA	GTATGGGGGC	TGTGACGGAA	ACAGCAATAA	TTACCTGACC	AAGGAGGAGT
translacja	Y G G	C D G N	S N N	Y L T	χ ε ε c	57
CDNA	GCCTCAAGAA	ATGTGCCACT	GTCACAGAGA	ATGCCACGGG	TGACCTGGCC	SOO
translacja	L X X	CAT	V T E N	ATG	DLA	73
cDNA	ACCAGCAGGA	ATGCAGCGGA	TTCCTCTGTC	CCAAGTGCTC	CCAGAAGGCA	630
translacja	T S R N	A A D	S S V	P S A P	R R Q	90
CDNA	GGATTCTGAA	GACCACTCCA	GCGATATGTT	CAACTATGAA	GAATACTGCA	700
translacja	DSC	D H S S	DMF	n γ ε	Ε Y C T	107
cDNA	CCGCCAACGC	AGTCACTGGG	CCTTGCCGTG	CATCCTTCCC	ACGCTGGTAC	750
translacja	λ N A	V T G	PCRA	S F P	RWY	123
cDNA	TTTGACGTGG	AGAGGAACTC	CTGCAATAAC	TTCATCTATG	GAGGCTGCCG	800
translacja	F D V ε	R N S	CNN	F I Y G	G C R	140
CDNA	GGGCAATAAG	AACAGCTACC	GCTCTGAGGA	GGCCTGCATG	CTCCGCTGCT	850
translacja	G N X	N S Y R	SEC	ACM	L R C F	157
CDNA	TCCGCCAGCA	GGAGAATCCT	CCCCTGCCCC	TTGCCTCAAA	GGTGGTGGTT	900
translacja	R Q Q	ε n p	P L P L	G S X	Υ. V Y	173
CDNA	CTGGCGGGGC	TGTTCGTGAT	GGTGTTGATC	CTCTTCCTGG	GAGCCTCCAT	950
translacja	L A Q L	F V M	V L I	L F L G	A- S M	190
CDNA	GGTCTACCTG	ATCCGGGTGG	CACGGAGGAA	CCAGGAGCGT	GCCCTGCGCA	1000
translacja	V Y L	J. R V A	R R N	Q E R	A L R Γ	207
cDNA	CCGTCTGGAG	CTCCGGAGAT	GACAAGGAGC	AGCTGGTGAA	GAACACATAT	1050
translacja	V W s	S G D	D X E Q	L V X	N T Y	223
CDNA	GTCCTGTGAC	CGCCCTGTCG	CCAAGAGGAC	TGGGGAAGGG	AGGGGAGACT	1100
translacja	V L *					225

188 387

Fig. 4F (c.d.) cDNA ATGTGTGAGC TTTTTTTAAA TAGAGGGATT GACTCGGATT TGAGTGATCA 1150 CDNA TTAGGGCTGA GGTCTGTTTC TCTGGGAGGT AGGACGGCTG CTTCCTGGTC 1200 cDNA TGGCAGGGAT GGGTTTGCTT TGGAAATCCT CTAGGAGGCT CCTCCTCGCA 1250 CDNA TGGCCTGCAG TCTGGCAGCA GCCCCGAGTT GTTTCCTCGC TGATCGATTT 1300 CDNA CTTTCCTCCA GGTAGAGTTT TCTTTGCTTA TGTTGAATTC CATTGCCTCC 1350 cDNA TTTTCTCNAT CACAGAAGTG ATGTTGGAAT CGTTTCTTTT GTTTGTCTGA 1400 cDNA TTTATGGTTT TTTTAAGTAT AAACAAAAGT TTTTTATTAG CATTCTGAAA 1450 cDNA GAAGGAAAGT AAAATGTACA AGTTTAATAA AAAGGGGCCT TCCCCTTTAG 1500 cDNA AATAAATTTC CAGCATGTTG CTTTCAAAAA AAAAAAAAAA AAAA

1550

Fig. 4G

EST konaena

PCR klon

IcDNA klon

EST konaena ADRERSIHDF CLVSKWGRC PCR klon ADRERSIHDF CLVSKWGRC IcDNA klon ADRERSIHDF CLVSKWGRC

EST konaena YLTKEECLKK CATVTENATG PCR klon YLTKEECLKK CAT7TENATG LcDNA klon YLTKEECLKX CATVTENATG

EST konaena NYEEYCTANA VTGPCRASFP PCR klon NYEEYCTANA VTGPCRASFP IcDNA klon NYEEYCTANA VTGPCRASFP

EST konaena ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK PCR klon ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK KcDNA klon ACHLRCFROC ENPPLPLGSK

EST konaena QERALRTVWS SOTDKEQLVK PCR klon QERALRTWS FOT icDNA klon QERALRTVWS SOTDKEQLVK

MLR A£ADGV5RLL G5LIL5GVLA -1 MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1 MAOLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1

RASMPRWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50 RASMPRWYN VTOGSCQLFV YGGCDGNSNN 50 RASMPRWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100 DLATSRNAAD SSYPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100 DLATSRNAAD SSVPSAPRRO DSEDHSSDMF 100

RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150 RWYFDYERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150 RMYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE ISO

WYLAGŁFYM VŁ2ŁFŁfiA5M yXŁIRVARRN 200 VWLAGLFVM VLTŁrLGASM VYŁ1RVARRN 200 WVŁAGLFVM VŁYLFŁGASM VYLIRVARRN 200

NTYVL 225 213

NTYVL 225

188 387

Fig. 5

Oczyszczanie bikuniny łożyskowej przy użyciu filtracji żelowej Superdeac 75 ojrcao

Fig. 6

Oczyszczanie bikuniny łożyskowej przy użyciu chromatografii z odwrotną fazą C18

Czas retencji

188 387

Fig. 7

188 387

Fig. 8A

Fig. 8B

	50
>	40
c > (A α	30
i :E7	20
S Ξ c	10

Próbka

188 387

Fig. 9A

Fig. 9B

SDS-PAGE

Western

Aprotynina ta c

c f

a.

<

μ· tn ni ej *t tn ni ni

45 kDa	X·	r».s< CA B<* * * -
29	•i.-Λ? Wz’^Si	β έ ’	45 kDa
18			29
♦
14		·.·;.	18
6			14

V

188 387

Fig. 10

..-.νΧ-ϋ* kDa —>· <βΒ

188 387

Fig. 11A

Fig. 11B

9.5

7.5

9.5

7.5

4.4

4.4

2.4

1.35

2 3 4 5 6 7 8

2 3 4 5 6 7 co Trzustka

Fig. 12A

Fig. 12B

3 4

3 4 kDa 29 18 14 6 3

188 387

Fig. 13

188 387

Krotność wydłużenia

Fig. 14

Inhibitor (uM)

188 387

Fig. 1

R33464	ooccoeerce	TTTCTCGCCT	GGCTGGGATC	GCTGCTCCTC	TCTGGGOTCC	50
ORT	POR	F S P	G W 0 R	c s s	Ł G S	1$
R35464	TGGCCGGCCO	ACCGAGAACG	CAGCATCCAC	GACTTCTGCC	TGGTGTCGAA	Χ00
ORF	UPAD	RER	S Z H	D F C L	V S R	33
R3S464	GGTG3T0GGC	AOArrCCGGG	CCTCCATGCC	TAGOTGGTGG	TACAATGTCA	ISO
ORF	V V β	R £ R A	S Μ P	R W W	Y Ν V T	so
R33464	CTGACGGATC	CTGCCAGCTG	TTTGTGTATG	GGGGCTGT3A	CGGAAACAGC	200
ORF	D G S	C Q L	T V Y 0	G C 0	G N S	66
R33464	AATAATTACC	TGACCAAOGA	GGAOTGCCTC	AAOAAATGTG	CCACTGTCAC	250
ORF	Ν Η Y L	τ r ε	set	K K C A	T V T	63
R3S464	AOftfikkTdCC	ACOSOTGACC	TGGCCACC&G	CAGMAATGCA	OCGGATTCCT	300
ORF	Β M A	T G D L	ATS	RNA	A £> S S	100
R3S464	CTGTCCCAAfl	TOCTCCCAGA	AGGCAGGATT	CTTGAAflACC	ACTTCAOCGA	330
ORF	V p s	A P R	R Q 0 S	• R P	Ł 0 R	116
R3S464	TATOTTTCAA	HTATTGHAAG	AATAATTGCA	CCGRCAACGM	ATT—----	393
ORF	Y V s ·	I · R	ZZA	P Τ β		130

Klucz

R35464 - Sekwencja kwasu nukleinowego S8T R35464 (S8Q ID nr 12)

OM· · SST R35464 Translacja otwartej raaki odczytu (8EQ ID nr 13)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Białko o aktywności hamującej proteazę serynową zawierające jedną z następujących sekwencji aminokwasowych,

   ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

   YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100

   NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

   ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK 170 (SEQ ID Nr: 52),

   MAQLCGL RRSRAFLALL GSLLLSGVLA -1

   ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

   YLTYEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100

   NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

   ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK VWLAgLFVM VLILFLGASM VYLIRVARRN 200

   QERALRTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225 (SEQ ID Nr: 49),

   AGSFLAWL GSLLLSGVLA -1

   ADRERSIHDF CLVSKWGRC RASMPRWWYN VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

   YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSVPSAPRRQ DSEDHSSDMF 100

   NYEEYCTANA VTGPCRASFP RWYFDVERNS CNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

   ACMLRCFRQQ ENPPLPLGSK WVLAGAVS 179

   188 387 (SEQ ID Nr: 2) ,

   MLR AEADGVSRLL GSLLLSGVLA -1

   ADRERSIHDF CLVSfKW/GRC RASMMRWWYN VTDGGcQLEV YGGCDGNSNN 50

   YLTKEECLKK CATVTENATG DDATSRRNAD VSVPRAPRRQ DSEDHSSDMF 100

   NYEEYCTANA VTGRCRASFR RWWFDWEWN VNNFIYGGCR GNKNSYWSEE 150

   ACMLACFAQQ ENRRLRLGSK WWLAGL1D/M VLILFLGASM VYLIWVAWRN 200

   QERAARTVWS SGDDKEQLVK NTYVL 225 (SEQ ID Nr: 45),

   MTQACGA RWSATFAAAA GS AAARGVAT -1 ADRERS^DD CLVSIKWGRC RATRPRWWWY YGGCDGNSNN 50

   YLTKEECLKK CATVTENATG DDATSRRNAT VSVPRAPRRQ DSEDHSSDMF 100

   NYEEYCTANA VTGRCRARFR RWWYDVERRS VNNFIYGGCR GNKNSYRSEE 150

   ACMLWCDRQQ RSRRARAGRK WVEATLLFE VLILFLGASM VFAIWVAWWN 200

   QRRTARTVWS FGD 213 (SEQ ID Nr: 47)

   IHDD CLCSIKA/GRC RARMRWWWFN VSVGRCQADV YGGCDGNSNN 50

   YLSKRECAKK CATV 64 (SEQ ID Nr : 4),

   CLVSK\WGRC WTRMRWWWFS VSDGSCQLDE YGGCDGNSNN 50

   YLSKRECAKK C 64 (SEQ ID Nr: 5),

   FEEFCSTNA VTGRCRARDR RWYDWERNS CSSSDIYGGCR GNKNSYWREE 150

   ACMLRCDRQ 159 (SEQ ID Nr: 6),

   CTTSTETGRC RTRDRWWFDV EERSRCSSDI FGGCWGSKSR FWRRE 150

   188 387

   ACMLRC 156 (SEQ ID Nr: 7),

   IHDF CLVSiKWGGRC RASMPRWtY VTDGSCQLFV YGGCDGNSNN 50

   YLTKEECLKK CATVTENATG DIDLTSRNRNAD S SVPSAPPRR DSEDHDSDDH 75 125 159 NYEEYCTANA VTGRCRAAFR RWYFDVERNS ACMLRCFRQ CNNFIYYGGR GNKNSGRSES (SEQ ID Nr: 3) , CLVSJKWZGRC RASMRRWWYN VTDGSCQLFV YGGCSGFSNN 50 YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSSPRAPRRQ DSEDHSSEMH 700 NYEEYCTANA VTGRCRASFR RWYFDVERNS CCNFIYGGCR GNKNSGNSFA 150 ACMLRC 556 (SEQ ID Nr: : 50), ADRERSIHDF CLVSiKW/GRC RASMPRWYN VPTDSARQLV GCGCDYGECD 25 YLTKEECLKK CATVTENATG DLATSRNAAD SSSPRSPRRO GSEDHDSDMH 75 NYEEYCTANA VTGRCRASFR RWYFDVERNS CNNFIYYGGN GNKNSGFSFS 125 ACMLRCFRQQ ENRRLRLGSK WVLAGAVS 175 (SEQ ID Nr : 1), i ADRERSIHDF CL7SKWGRC RASMPRWWWJ VPTSSSRQFI GGGCDGGSNS 50 YLTKEECLKK CATVTENATG SSAPSAPRRQ GS 95 (SEQ ID Nr : 8) .
2. 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że białko to jest glikozylowane lub zawiera co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, albo jest zarówno glikozylowane jak i zawiera co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe.
3. 3. Kompozycja farmaceutyczna do hamowania aktywności proteazy serynowej obejmująca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera białko określone w zastrzeżeniu 1.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera białko glikozylowane lub co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe, albo białko, które jest zarówno glikozylowane jak i obejmujące co najmniej jedno wewnątrzłańcuchowe wiązanie disiarczkowe.
5. 5. Wyodrębniona sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje białko zdefiniowane w sekwencji o numerze SEQ ID nr 52, 49, 2, 45, 47, 3, 50 lub 1.
6. 6. Samopowtarzający się wektor ekspresji białka, zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, który koduje i jest zdolny do ekspresji białka określonego w zastrzeżeniu 1.
7. 7. Sposób hamowania aktywności proteazy serynowej ex vivo, znamienny tym, że obejmuje etap zetknięcia proteazy serynowej ze skuteczną ilością co najmniej jednego białka określonego w zastrzeżeniu 1.
8. 8. Białko określone w zastrz. 1 do zastosowania jako lek.

   188 387
9. 9. Zastosowanie białka określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania leku do leczenia stanu obrzęku mózgu, obrzęku rdzenia kręgowego, stwardnienia rozsianego, niedokrwienia, okołooperacyjnej utraty krwi, sepsy, wstrząsu septycznego, zwłóknienia, choroby związanej z patologiczną koagulacją lub krzepnięciem krwi, wielu urazów, udaru, krwotoku mózgowego lub podpajęczynówkowego, zapalenia mózgu, zapalenia rdzenia kręgowego, infekcji mózgowych, ziarnicy mózgu, infekcji rdzenia kręgowego, ziarnicy rdzenia, operacji na otwartym sercu, raka żołądka, raka szyjki lub zapobiegania przerzutom.
10. 10. Sposób wytwarzania białka, znamienny tym, że białko określone w zastrzeżeniu 1 otrzymuje się przy użyciu technologii rekombinacji DNA.