PL177344B1 - [D-arginylo1]-pochodne proktoliny - Google Patents

Abstract

[D-arginylo^-pochodne proktoliny o ogólnym wzorze D-arg(^R1}-R2-R3-R4-R5) gdzie D-arg oznacza D-argininę, R1 wodór albo grupę nitrową, R2 - D-tyrozynę albo L-tyrozynę, R3 - L-leucynę albo D-leucynę, r4 - D-prolinę albo L-prolinę, R5 - D-treoninę albo L-treoninę.

Description

Przedmiotem wynalazku są [D-arginylo^-pochodne proktoliny, będące nowymi agonistami owadziego neuropeptydu proktoliny, mające zastosowanie jako czynniki miotropowe u owadów, służące dla celów naukowo-badawczych, a zwłaszcza jako środki stymulujące akcję serca owadów oraz jako środki farmakologiczne działające na kręgowce i jako środki diagnostyczne do badań farmakologicznych i endokrynologicznych owadów.

Znane są pochodne proktoliny, L-arginylo-L-fenyloalanylo (3'-R)-L,-leucylo-L-prolylo-L-treoniny, gdzie R oznacza NH 2 albo OCH3 albo NO2 albo N(CH3)2 albo OC2H5, które wykazują aktywność biologiczną w zakresie stymulowania akcji serca owadów Periplaneta americana i Tenebrio molitor dla stężeń fizjologicznych od l0‘⁹ mola do 10- mola oraz wywierają silne działanie przeciwbólowe u szczurów in vivo, w sposób porównywalny ze znanymi peptydami analgetycznymi z grupy enkefaliny.

Wynalazek dotyczy [D-arginyloi]-pochodnych proktoliny, o ogólnym wzorze D-arg(Ri)-R2-R3-R4-R5_j gdzie D-arg oznacza D-argininę, R1 - wodór albo grupę nitrową, R2 - D-tyrozynę albo L-tyrozynę, R3 - L-leucynę albo D-leucynę, R4 - D-prolinę albo L-prolinę, a R5 - D-treoninę albo L-treoninę. Nowe [D-arginyloj-pochodne proktoliny są znacznie silniejszymi agonistami niż natywny peptyd. Działają one kardiostymulująco w bioteście in vitro na serce owada Tenebrio molitor w znacznie niższych stężeniach niż proktolina, mają silniejszy wpływ na pracę serca owadów i odznaczają się chronotropowododatnim i intropowo ujemnym działaniem na serce wymienionego owada. Ze względu na swą wysoką aktywność biologiczną [D-arginylo^-pochodne proktoliny według wynalazku mogą być wykorzystane do charakterystyki farmakologicznej receptorów proktoliny oraz w badaniach fizjologicznych i neuroendokrynologicznych u owadów i kręgowców.

Sposób wytwarzania nowych [D-arginylo^-pochodnych proktoliny jest przedstawiony w przykładach wykonania, które ilustrują sposób wytwarzania D-arginylo-D-tyrozylo-D-leucylo-D-prolylo-D-treoniny, D-arginylo-L-tyrozylo-L-leucylo-D-prolylo-L-treoniny, D-arginylo(NG-nitro)-L-tyrozylo-D-leucylo-L-prolylo-L-treoniny i D-arginylo-L-tyrozylo-D-leucylo-D-prolylo-L-treoniny.

Przykład 1.5 g (16 mmoli) N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-D-treoniny umieszcza się w kolbie o pojemności 50 ml i rozpuszcza w 15 ml metanolu, a następnie dodaje 2,63 g (8 mmoli) węglanu cezu rozpuszczonego w 5 ml wody destylowanej. Całość miesza się przez 3θ minut mieszadłem magnetycznym. Następnie odparowuje się do sucha rozpuszczalniki, w próżni na wyparce rotacyjnej. Pozostałość zadaje się 10 ml benzenu i ponownie odparowuje w próżni do sucha, powtarzając tę czynność trzykrotnie, po czym dodaje się 10 ml bezwodnego etanolu, odparowuje w próżni, dodaje 15 ml eteru dietylowego i znów odparowuje w próżni. Pozostały osad suszy się przez 24 godziny nad pięciotlenkiem fosforu i otrzymuje 5,1 g soli cezowej N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-D-treoniny. 5 g (14,7 mmola) uzyskanej soli cezowej umieszcza się w kolbie okrągłodennej o pojemności ΐ0θ ml i dodaje 8,65 g żywicy Merrifielda o obsadzeniu 1,7 mmola chloru na 1 g żywicy, 54 ml dimetyloformamidu i miesza przez 24 godziny, utrzymując temperaturę 313 K. Całość odsącza się

177 344 na szklanym sączku i przemywa na nim dimetyloformamidem, mieszaniną dimetyloformamidu z wodą, w stosunku 1:1, ponownie dimetyloformamidem, a następnie metanolem i dichlorometanem, po czym suszy nad pięciotlenkiem fosforu w próżni, przez 24 godziny, w temperaturze pokojowej.

W wyniku powyższego otrzymuje się 10,93 g N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-D-treonylo-żywicy, zawierającej na 1 g 0,208 g N-karbn-t-butoksy-O-benzylo-D-treoniny. 1 g (0,7 mmola) tej żywicy umieszcza się w naczyniu Merrifielda o pojemności 50 ml i zadaje 20 ml trzydziestoprocentowego roztworu kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie, po czym miesza przez przepuszczanie azotu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odsącza się rozpuszczalniki i przemywa kolejno: trzykrotnie dichlorometanem, dwukrotnie etanolem i dwukrotnie dichlorometanem, używając każdorazowo 10 ml rozpuszczalnika, przy czym po przemyciu każdą kolejną porcją rozpuszczalnika zawartość naczynia przedmuchuje się azotem przez dwie porcje i odfiltrowuje rozpuszczalnik. Po zakończeniu przemywania, całość zobojętnia się dziesięcioprocentowym roztworem trietyloaminy w dichlorometanie, mieszając azotem przez 10 minut, po czym ponownie przemywa kolejno: trzykrotnie dichlorometanem, etanolem i trzykrotnie dichlorometanem, w sposób opisany powyżej. Następnie żywicę zawiesza się w 15 ml dichlorometanu i dodaje 0,45 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-D-proliny w 5 ml dichlorometanu oraz 0,43 g (2,1 mmola) dicykloheksylokarbodiimidu. Całość miesza się przedmuchując azotem przez godzinę, i po odsączeniu rozpuszczalnika przemywa kolejno: trzykrotnie trzydzięstotrzyprocentowym roztworem metanolu w chloroformie, dwukrotnie etanolem i dichlorometanem, prowadząc proces przemywania w sposób opisany powyżej.

Osad zawierający N-karbo-t-butoksy-D-prolylo-O-henzyło-D-treonylo-źywicę zadaje się trzydzżestoprocentowym roztworem kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie, miesza azotem przez 30 minut, odsącza i przemywa kolejno: trzykrotnie dichlorometanem i trzykrotnie etanolem, po czym zobojętnia dziesięcioprocentowym roztworem trietyloaminy w dichlorometanie i przemywa kolejno: trzykrotnie dichlorometanem, etanolem i trzykrotnie dichlorometanem, prowadząc procesy przemywania i zobojętniania w sposób opisany powyżej. Otrzymany suchy osad zawiesza się ponownie w 15 ml dichlorometanu miesza z 5 ml roztworu 0,48 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-D-leucyny w 0,43 g (2,1 mmola) dicykloheksyiokarbodiimidu, po czym postępuje się w sposób identyczny jak przy otrzymywaniu opisanej pcwy/żej N-karbo-t-butoksy-D-prolylo-O-benzylo-D-treonylożywicy. W wyniku tego otrzymuje . się N-karbo-t-butoksy-D-leucylc-D-prolylc-O-benzylc-D-treonylo-żywicę, którą poddaje się działaniu trzydziestoprocentowego kwasu trifluorooctcwego, przemywa i zobojętnia w sposób opisany powyżej, po czym zawiesza w 15 ml dichlorometanu i dodaje 0,78 g (2,1 mmola) N-karbn-t-butoksy-O-benzylo-D-tyrozyny w 5 ml dichlorometanu i 0,43 g (21,1 mmola) dicyklchekiylckarbodiimidu. Następnie postępuje się identycznie jak podczas wytwarzania N-karbo-t-butoksy-D-prolylo-O-benzylo-D-treonylo-żywicy. W wyniku tego otrzymuje się N-karbc-t-butcksy-O-benzylo-D-1yτozylo-D-leucylo-D-prolylo-O-benzylo-D-treonylo-żywicę.

Żywicę tę poddaje się obróbce z trzydziestoprocentowym roztworem kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie, przemywa i zobojętnia, prowadząc te procesy w sposób opisany powyżej, po czym otrzymaną żywicę zawiesza się w dichlorometanie i dodaje 1,2 g (2,1 mmola) Na ,Nó, Nw-trikarbobenzoksy-D-argininy w 5 ml dichlorometanu oraz 0,43 g (2,1 mmola) dicykloheksyiokarbcdiimidu. Następnie postępuje się w sposób identyczny jak przy otrzymywaniu opisanej powyżej N-karbo-t-butoksy-D-prolylo-O-benzylo-D-treonylo-żywicy. W wyniku tego otrzymuje się 2,3 g Na ,Nó, Nw-trikarbobenzoksy-D-arginylo-O-benzylo-D-tyrczylo-D-leucylo-D-prolylc-O-benzylo-D-treonylo-żywicy. Z tak otrzymanej żywicy uwalnia się żądany związek chemiczny i usuwa grupy blokujące. W tym celu żywicę umieszcza się w kolbie okrągłodennej o pojemności 20 ml i zadaje mieszaniną 0,8 ml kwasu triiluorom^tanosulfonowego, 0,6 ml anizolu i 0,3 ml etanoditiolu. Całość miesza się przez godziny w temperaturze 313 K, po czym żywicę odsącza się na sączku szklanym i przemywa 4 ml anizolu, który łączy się z pierwszym przesączem. Do połączonych frakcji anizolowych dodaje się nadmiar, około 50 ml, eteru dietylowego, a wypadający osad odsącza się na sączku szklanym i przemywa pięciokrotnie 10 ml porcją eteru dietylowego.

Po wysuszeniu w próżni nad stałym wodorotlenkiem potasu otrzymuje się 0,41 g suchego proszku, który rozpuszcza się w dziesięcioprocentowym roztworze wodnym kwasu octowego i doprowadza pH do wartości 4,0, za pomocą jednoprocentowego roztworu amoniaku, a następnie dodaje 2,5 g wymieniacza jonowego w formie octanowej i miesza przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po odsączeniu wymieniacza jonowego i zliofilizowaniu przesączu, otrzymaną substancję rozpuszcza się w 1 ml pięcioprocentowego roztworu wodnego kwasu octowego i filtruje przez kolumnę wypełnioną żelem polisacharydowym, używając jako eluentu pięcioprocentowego wodnego roztworu kwasu octowego, otrzymując 0,3 g D-arginylo-D-tyrozylo-D-leucylo-D-prolylo-D-treoniny. Wydajność procesu wynosi 54,9%. Czystość produktu sprawdzono przy użyciu szybkosprawnej chromatografii kolumnowej, mierząc czas retencji Rt z kolumny, przy rozpuszczalniku 80% acetonitrylu i 0,1% kwasu trifluorooctowego, w ciągu 60 minut. Rt(HPLC)=18,81 min, kąt skręcalności właściwej [α]^2θυ = -43,9° (c-0,22, w metanolu). Czystość produktu sprawdzono również przy zastosowaniu chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemiankowym, określając współczynnik wędrowania związku Rf w następujących eluentach: X=n-butanol:kwas octowy:woda (4:1:5); Y = n-butanol:pirydyna:kwas octowy:woda (30:20:6:24), W = n-butanol:kwas octowy:octan etylu:woda (v/v). Rf(X.)=0,16; Rf(Y)=0,5; Rf(W)=0,47. Analiza aminokwasowa wykazuje następujący skład aminokwasowy w proporcjach molowych: arginina 1,02; tyrozyna 0,97; leucyna 1,0; prolina 0,96; treonina 0,95. Otrzymana pochodna proktoliny stymuluje akcję serca owada Tenebrio molitor w teście in vitro (metoda Rosiński i Gade) w zakresie stężeń od 5 · 10'¹¹ mola do 10'⁹ mola, maksymalnie przy 10⁴⁰ mola, podczas gdy proktolina działa w zakresie stężeń od 10'9 mola do 10’⁷ mola. Przy stężeniu 10’9 mola aktywność biologiczna otrzymanej pochodnej proktoliny jest 13 razy większa niż aktywność biologiczna proktoliny przy takim samym stężeniu.

Przykład II.WytwarzanieD-arginylo-L-tyrozylo-L-leucylo-D-prolylo-L-treoniny prowadzi się w sposób analogiczny jak opisano w przykładzie pierwszym, używając żywicy Merrifielda w ilości 1 g, obsadzonej przez 0,7 mmola N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-L-treoniny i stosując kolejno następujące komponenty: 0,43 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-Dproliny, 0,48 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-L-leucyny, 0,78 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-L-tyrozyny i 1,2 g (2,1 mmola) Na ,Νό,Νω-trikarbobenzoksyD-argininy. W każdym etapie stosuje się jako czynnik kondensujący 0,43 g (2,1 mmola) dicykloheksylokarbodiimidu. Produkt końcowy uwalnia się z żywicy w identyczny sposób jak opisano w przykładzie pierwszym. Otrzymuje się 0,26 g D-arginylo-L-tyrozylo-L-leucylo-D-prolylo-L-treoniny. Wydajność procesu wynosi 50%. Rt(HPLC) = 22,02 min; Rf(X)=0,12; Rf(Y)=0,64; Rf(W)=0,50. [a]²⁰D = -16,17° (c-0,12, metanol), gdzie Rt, Rf, X, Y, W, [ajD mają powyżej podane znaczenie. Analiza aminokwasowa wykazuje następujący skład aminokwasowy w proporcjach molowych: arginina 1,03; tyrozyna 0,9; leucyna 1,0; prolina 0,97; treonina 1,0. Otrzymana pochodna stymuluje akcję serca owada Tenebrio molitor w teście in vitro (metoda Rosiński i Gade) w zakresie stężeń od 0,5 · 10'^u mola do 10'9 mola, maksymalnie przy 10’^w mola. Efekt biologiczny przy stężeniu 10'9 mola jest 9,6 razy silniejszy niż proktoliny.

Przykład iii. Sposób wytwarzania D-argmylo(NG-nitro)-L-tyrozylo-D-leucylo-Lprolylo-L-treoniny jest analogiczny jak opisano w przykładzie pierwszym, przy czym stosuje się 1 g żywicy Merrifielda obsadzonej przez 0,7 mmola N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-Ltreoniny 0,78 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-O-benzylo-L-tyrozyny, 0,48 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-D-leucyny, 0,43 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-D-proliny i 0,7 g (2,1 mmola) N-karbo-t-butoksy-N-nitro-D-argininy. Produkt końcowy uwalnia się z żywicy w identyczny sposób jak opisano w przykładzie pierwszym. Otrzymuje się 0,45 g D-arginylo(NG-nitro)-L-tyrozylo-D-leucylo-L^-prolylo-L-treoniny. Wydajność procesu wynosi 86,0%. Rt(HPLC)=24,73 min; Rf(X)=0,17;Rf(Y)=0,60; Rf(W)=0,15, [a]2°_D = -18,7° (c-0.99, metanol), gdzie Rt, Rf, X, Y, W, [a] d mają powyżej podane znaczenie. Analiza amino177 344 kwasowa wykazuje następujący skład aminokwasowy w proporcjach molowych: arginina 1,1; tyrozyna 1,1; leucyna 1,1; prolina 1,07; treonina 1,0. Otrzymana pochodna proktoliny stymuluje akcję serca owada Tenebrio molitor w teście in vitro (metoda Rosiński i Gade) w zakresie stężeń od 2 · 10’¹¹ mola do 10'⁹ mola, maksymalnie przy 10⁴⁰ mola. Efekt biologiczny przy stężeniu 10'9 mola jest 15 razy silniejszy niż proktoliny.

Przykład IV. Sposób wytwarzania D-arginylo-L-tyrozylo-D-leucylo-L-prolylo-L-treoniny polega na tym, że 0,1 g (0,13 mmola) N-arginylo(NG-nitro)-L-tyrozylo-D-leucylo-L-prolylo-L-treoniny, wytworzonej identycznie jak opisano w przykładzie trzecim, rozpuszcza się w 30 ml dziesięcioprocentowego roztworu kwasu octowego w metanolu i dodaje 0,1 g katalizatora w postaci palladu osadzonego na węglu aktywnym. Przez mieszaninę przepuszcza się gazowy wodór, przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Po odsączeniu katalizatora, rozpuszczalniki odparowuje się w próżni na wyparce rotacyjnej, a do pozostałości dodaje eter dietylowy. Osad odsącza się, rozpuszcza w 5 ml metanolu i zadaje pięciokrotnym nadmiarem eteru dietylowego. Po odsączeniu i wysuszeniu w próżni nad pięciotlenkiem fosforu, otrzymuje się 0,28 g D-arginylo-L-tyrozylo-D-leucylo-L-prolylo-L-treoniny. Wydajność procesu wynosi 66%. Rt(HPLC)=28,11 min; Rf(X)=0,13, Rf(Y)=0,62, Rf(W)=0,12, [α]²⁰!^ = -50,54° (c-0,1, metanol), gdzie Rt, Rf, X, Y, W, [α]²θο mają powyżej podane znaczenie. Analiza aminokwasowa wykazuje następujący skład aminokwasowy w proporcjach molowych: arginina 1,0; tyrozyna 0,96; leucyna 1,02; prolina 1,04; treonina 0,96. Otrzymana pochodna proktoliny stymuluje akcję serca owada Tenebrio molitor w teście in vitro (metoda Rosiński i Gade) w zakresie stężeń

1Ω O ' 10 ^{z x} od 10' mola do 10' mola, maksymalnie przy 10' mola. Efekt biologiczny przy stężeniu 10'9 mola jest 5 razy silniejszy niż proktoliny.

177 344

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe [D-arginyloi]-pochodne proktoliny o ogólnym wzorze D-arg(R¹)-R²-R³-R⁴-R⁵, gdzie D-arg oznacza D-argininę, R1 wodór albo grupę nitrową, R* - D-tyrozynę albo L-tyrozynę, R³ - L-leucynę albo D-leucynę, R4 - D-prolinę albo L-prolinę, R⁵ - D-treoninę albo L-treoninę.

   * * *