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KR960016208B1 - 인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 백신 및 진단방법. - Google Patents

인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 백신 및 진단방법. Download PDF

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KR960016208B1
KR960016208B1 KR1019880701053A KR880701053A KR960016208B1 KR 960016208 B1 KR960016208 B1 KR 960016208B1 KR 1019880701053 A KR1019880701053 A KR 1019880701053A KR 880701053 A KR880701053 A KR 880701053A KR 960016208 B1 KR960016208 B1 KR 960016208B1
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프락시스 바이오로직스, 인코포레이티드
데이비드 에이치. 스미스
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Abstract

내용없음

Description

인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 백신 및 진단방법
제1도는 PBOMP-1의 소디움 도데실술페이트 폴리아크릴 아미드겔 전기이동(SDS-PAGE)분석을 나타낸 그림인데 시료와 겔을 실시예 1-1의 방법에 따라 제조했다. A레인(lane)에는 PBOMP-1이 약 5ug 함유되어 있고, B레인에는 미리 염색한 저분량의 기준물, 즉 난단백(ovalbumin), 알파-키아모트립시노겐, 베타-락토글루블린, 리소자인, 소의 트립신 억제제 및 인슐린(A사슬과 B사슬)을 함유한다. 상대분자량(킬로달톤(kd)단위로)은 양쪽에 나와 있다.
제2도는 (A와 B)는 폴리그로날 앤티-PBOMP-1 항체와 모노클로날 앤타-PBOMP-항체(G1-1)가 있는 대장균과 인플루엔자균의 전체 세포용해산물(lysate)의 반응성을 나타낸 그림이다.
제2A도에서 세포용해산물을 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항체와 반응시켰다. 각 레인은 다음과 같다:(1) 대장균 HB101; (2) 대장균 JM83; (3) 분자량 기준률; (4) 배양된 H인플루엔과 세포에서 얻은 정제된 PBOMP-1.
제2B도에서는 세포용해산물을 모노클로날 앤티-PMOMP-1항체와 반응시켰다. 각 레인은 제2A도에 나와 있다.
제3도는 pLG339 유도체인 pGD103의 리스트릭션 맵(restriction map)(Stoker 등, 1982, Gene 18:335-41 참조).
제4도는 pGD103속으로 클로닝된 H인플루엔자 DNA의 4.2kb 단편으로된 pAA152의 맵, PBOMP-1을 인코우드하는 유전자는 737bp의 BalⅢ-BamHⅠ단편에 편재되어 있다. 제2A도는 pAA152의 원형의 리스트릭션 맵이다. 제2B도는 pAA152의삽입된 단편의 결실분석(deletion analysis)이다. 결식유도체중에서 잔존하는 H인플루엔자 DNA를 흑색선으로 나타내었고 PBOMP 표현형(phenotype)은 오른쪽에 나타나 있다.
제5도는 PBOMP-1의 상이한 에피토우프(epitope)와 더불어 pAA152를 함유한 대장균 JM83의 저체세포용해산물의 반응성을 나타낸 것인데 각 레인은 다음과 같다:(A) 모노클로날항체 G1-1; (b) 모노클로날항체 G94-3; (C) 모노클로날항체 G18-3; (D) 모노클로날항체 25-2; (E) 모노클로날항체 G2-3.
제6도는 재조합 플라스미드 pAA1320과 pAA152를 함유하는 DS410 미닐셀(minicell)의 방사선 사진분석법이다. 그림의 왼쪽에 분자량 기준물이 보인다. 각 레인은 다음과 같다:(A) DS410(pAA130); (B) DS410(pGD103); (C) DS410(pAA152). 카나마이신 아미노글리코시다아제의 위치가 그림의 오른쪽에 나타나 있다.
제7도는 (A와 B)는 pGD103속으로 클로닝된 H인플루엔자 DNA의 5.7kb 단편으로된 pAA130의 맵이다.
제7A도는 pAA130의 원형의 리스틱릭션맵이고,
제7B도는 pAA130의 인플루엔자균 삽입단편의 결실분석이다. 검은 색선은 결실유도체중에서 잔존하는 인플루엔자균 DNA이다. PBOMP-2를 인코우드하는 유전자는 781bp BstEⅡ-Xmn Ⅰ에 위치한다.
제8도는 폴리크로날 앤티-PBOMP-1항 혈청과 더불어 pAA130을 함유하는 대장균 JM83가 대장균 JM83의 전체 세포용해산물의 반응성이다. 각 레인은 다음과 같다:(A) pAA130을 함유하는 JM83; (B) pAA130을 함유하는 JM83; (C) JM83; (D) JM83; (E) 그림의 오른쪽에 킬로달톤으로 나타낸 분자량 기준물; (F) Hi S-2.
제9도는 여러가지 클론으로부터 결정된 결합서열의 정도, 방향 및 시초등을 나타내는 pAA152의 737bp 삽입단편의 DNA 결합서열 결정방법이다. 바닥에 있는 화살표는 주요한 오픈리딩프레임(ORF:open rdading frame)의 위치를 나타낸다.
제10도는 PBOMP-1 유전자를 가지는 737bp 단편의 뉴클레오티드 결합서열이다. 예측된 오프리딩프레임(ORF)은 화살표로 나타낸 전사방향과 밑줄친 결합서열로 나타나 있다.
제11도는 PBOMP-1의 추측된 아미노산 결합서열인데 뉴클레오티드 결합서열은 위쪽선에 있고 상응한 아미노산 결합서열은 아래쪽에 있다. 상자안의 아미노산은 천연 단백질의 예측된 N-말단 아미노산을 나타낸다.
제12도는 PBOMP-1 유전의 유도된 아미노산의 일부(위쪽)과 PBOMP-1에서 유도된 펩티드의 부분 아미노산 결합서열(아래쪽)이 조정되어 있음을 나타낸다. 상자속에 있는 자니근 부정합(不整合)을 나타낸다.
제13도는 각각의 클론으로부터 결정된 결합서열의 원점, 방향 및 정도를 나타내는 pAA130의 789bp BstEⅡ-XmnⅠ의 결합서열이다. 바닥의 화살표는 주요한 오픈리딩프레임(ORF)의 위치를 나타낸다.
제14도는 PBOMP-2 유전자를 가지는 pAA130의 789bp BstEⅡ-XnmⅠ 단편의 뉴클레오티드 결합서열이다. 예측된 ORF는 밑줄친 결합서열로 나타나 있다. 전사방향은 화살표로 나타나 있고 "N"로 나타내어진 두개의 염기는 미지의 뉴클레오티드이다.
제15도는 PBOMP-2 추측된 아미노산 결합서열이다. 뉴클레오티드 결합서열은 위쪽에 그리고 상응한 아미노산 결합서열은 아래쪽에 나와 있다. 상자속의 잔기는 천연 단백질의 예측된 N-말단아미노산이다.
제16도는 기체 액체 크로마토그래피를 사용해서 얻은 PBOMP-1의 지방산 크로마토그램이다. 노나데칸산(C19)산은 내부표준으로 포함되었다.
제17도는 pGD103을 함유하는 대조 대장균 JM83 세포는 물론이고 재조합 플라스미드 pAA130과 pAA152를 함유하는 대장균 JM83 세포의 방사선 사진에 의한 SDS-PAGE 분석법이다. 각 레인은 다음과 같다:(1) pAA130; (2) pAA152; (3) pGD103. 약 15,000 달톤분자량이나 되는 밴드(band)의 위치는 그림의 왼쪽에 나타나 있다.
제18도는 (A와 B)는 글로보마이신이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 pAA130 또는 pAA152를 함유하는 대장균 JM83의 전체 세포용해산물에 대한 웨스턴 블랏 겔 분석법(Western blot gel analysis)이다. 분자량 표준은 제18도(A와 B)의 왼편에 나타나 있다.
제18A도는 PBOMP-1 유전자를 함유하는 pAA152를 가진 세포의 세포용해산물이다. 각 레인은 다음과 같다:(1) 글리보마이신 없음; (2) 글로보마이신 조재함.
제18B도는 PBOMP-2 유전자를 함유하는 pA130을 가진 세포의 용해분산물이다. 각 레인은 다음과 같다:(1) 글로보마이신 없음; (2) 글로보마이신 존재함.
제19도는 PBOMP-1(5.2ug)을 함유하는 백신 조제물을 성인에게 투여했을 때 얻은 항체응답 그래프이다.
제20도는 모노클로날 항체 G-204와 대장균 JM101 또는 JM103의 전체 세표용해산물과의 반응성을 나타낸 것이다. 각 레인은 다음과 같다:(A) pPX166을 함유한 JM103; (B) pPX160을 함유한 JM103; (C) pUC19을 함유한 JM101; (D) 그림의 왼편에 킬로달톤을 나타낸 분자량 표준; (E) 인플루엔자균에서 얻은 천연 PBOMP-1.
제21도는 PBOMP-1 신호 결합서열이 결핍된 코우딩 결합서열을 가진 플라스미드 구성예이다. 플라스미드 pPX167에 있어서 신호 결합서열이 결핍된 PBOMP-1 유전자를 lac 촉진유전자의 아래쪽에 삽입한다. 폴리링커(polylinker)의 BamHⅠ 위치에 있는 pPX167의 PBOMP-1의 코우딩 결합서열을 분열시키고 여기서 생긴 단편을 플라스미드 pINⅢ-ompA3의 BamHⅠ 위치속으로 클로닝하므로서 원형질 pPX168을 구성하였다. 플라스미드 pPX168에는 아미노 말단에서 대장균 ompA 단백질의 신호 결합서열쪽에서 연결된 PBOMP-1에 대해 코우딩하는 키메라 결합서열이 있다.
제22도는 역상 C-4 고속 액체 크로마토그래피를 사용해서 얻는 플라스미드 pPX167을 가진 대장균주 PR13의 세포질 추출물의 상청액부분의 크로마토그램이다.
제23A도는 쿠우마시스테인(Coomassie stain)으로 염색한 플라스미드 pPX107을 함유하는 대장균 PR113에서 얻은 신호가 없는 PBOMP-1의 SDS-PAGE 분석이다. 각 레인은 다음과 같다:(1) 세포질분획; (2) DEAE 용출물; (3) 역상(逆相)용출물; 분자량 표준을 레인에 있어서 레인 1의 왼편으로 향해 조작하였고 상대분자량(킬로달톤)은 그림의 왼편에 나와 있다.
제23B도는 각 분획과 앤티-PBOMP-1 모노클로날 항체와의 반응성을 나타낸 것이다. 각 레인은 제23A도와 같다.
제24도는 lac 촉진유전자 아래쪽에서 삽입된 PBOMP-2 단백질의 전체 코우딩 결합서열을 가지는 폴라스미드 pPX163의 구성예이다.
제25도는 IPTG가 존재하던 많던간에 성장한 pPX163을 함유한 대장균 JM103의 전체 세포용해산물의 SDS-PAGE 분석이다. 각 레인은 다음과 같다:(1) 분자량 표준:킬로달톤; (2) IPTG가 없이 성장한 pPX163을 가진 JM103의 세포용해산물; (3) 레인 2에서와 같이 IPTG(5mM) 존재하에 4시간 성장한 것, 화살표는 IPTG에 의해 유발된 세가지 PBOMP-2 반응성 밴드의 위치이다.
본 발명은 인플루엔자균 외막(out membrane)과 관련된 단백질 및 펩티드 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 PBOMP-1 및 PBOMP-2를 비롯한 B형 인플루엔자 및 형상이 정해지지 않는 인플루엔자균에 속하는 돌턴(Dalton)분자량이 약 16,000 정도되는 외막 단백질과 관련된 단백질 및 펩티드 제조방법과 조성물에 관한 것이다. 단백질과 펩티드는 수동면역에 사용되는 항체 생성과 능동면역용 백신(vaccine) 조제의 면역원으로 사용하고 또한 전단분석시약으로 사용된다. 단백질과 펩티드를 인플루엔자균으로부터 신규의 개량된 정제법으로 얻든지 재조합 DNA나 화학적인 합성법으로 제조할 수 있다. 더우기 본 발명은 PBOMP-1과 PBOMP-2의 발현에 유용한 신규의 DNA 결합서열과 벡터(vector)에 관한 것이다. 뉴클레오티드 결합서열을 핵산잡종형성분석에 시약으로 사용한다.
(1) 재조합 DNA 기술과 유전자 발현
재조합 DNA 기술에는 DNA 매개체(벡터:vector)속으로 특수한 DNA 결합서열을 삽입해서 숙주세포중에서 복제가 가능한 재조합 DNA 분자를 생성시키는 것이다. 일반적으로 삽입된 DNA 결합서열은 수용성(受溶性) DNA 매개체에 대해서는 성질을 달리하는 것인데 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 삽입된 DNA 결합서열을 형성할 수 있다. 재조합 DNA 분자들을 구성할 수 있는 몇가지 일반적인 방법들이 개발되었는데 그 예를들자면 미국특허 제4,237,224호에서는 제한효소로 분열시킨 뒤 공지방법으로 DNA 리가아제(ligase)와 결합시키는 방법을 사용하여 이러한 재조합 플라스미드를 제조하고 있다. 이들 조직배양에서 성장한 진핵(眞核) 세포와 원핵(原核)생물을 비롯해서 단세포 배양물에서의 형질전환과 복제에 의해 이들 재조합 플라스미드가 도입된다.
여기에 나온 방법들은 일반적으로 응용되기 때문에 미국특허 제4,237,225호를 본 발명에서 인용하고 있는 것이다.
단세포생물에 재조합 DNA 분자를 도입하는 또다른 방법은 미국특허 제4,304,863호에 나와있는 이 방법에서는 박테리오파아지(bacteriphage)벡터가 있는 패키징/형질도입계(packaging/transduction system)를 사용하고 있다. 재조합 유전자를 바이러스(예:vaccina virus)속으로 도입할 수도 있다. 플라스미드를 바이러스로 감염된 세포속으로 도입하여 재조한 바이러스를 발생시킬 수 있다. 구성방법과는 관계없이 재조합 DNA 분자는 숙주세포와는 친화성이 있어야 하는데 즉 숙주세포중에서 자율적으로 복제가 되던지 숙주세포의 염색체중 한 염색체에 안정하게 결합이 되어야 한다.
재조합 DNA 분자 또는 바이러스(예:우두 바이러스 재조합물)는 소요의 재조합 DNA 분자나 바이러스를 선택하게 하는 표지기능(marker function)이 있어야 한다. 더우기 모든 적당한 복제, 전사(轉寫) 및 전이(轉移)신호들이 재조합 DNA 분자에서 정확하게 배열된다면 외부 유전자는 박테리아 발현 플라스미드의 경우처럼 형질전환된 박테리아 세포중에서 또는 전해복제원을 가진 재조합 플라스미드나 재조합 바이러스로 감염된 허용세포 계통중에서 적절하게 발현되게 된다.
상이한 유전신호와 처리경우에 따라 유전자 발형정도가 대다수 통제되는데 예컨데 DNA 전사와 메신저 RNA(mRNA)전이가 그것이다. DNA 전사는 RNA 폴리머라이제(polymerase)의 결합을 유도해서 mRNA합성을 촉진시키는 DNA 결합서열인 촉진유전자의 존재여부에 관련을 가지고 있다. 진핵 촉진유전자의 DNA 결합서열을 원핵 촉진유전자의 것과는 상이하다. 더우기 원핵 촉진유전자와 부수되는 유전신호는 원핵계에서는 인식되지 않거나 그 기능을 발휘하지 못하고 또한 원핵 촉진유전자는 인식되지도 않고 진핵세포중에서 기능을 발휘하지도 않는다.
마찬가지로 원핵중의 mRNA의 전이는 진핵의 것과는 상이한 적절한 원핵신호의 존재여부에 따라 달라진다. 원핵중에서 mRNA가 효과적으로 전이되자면 mRNA에 Shine-Dalagarno(SD) 결합서열이라고 부르는 리보솜(rivosome) 결합위치가 있어야 한다. 이 결합서열은 단백질의 아미노말단 메티오닌을 인코우드하는 시발코돈(start codon), 보통 AUG 앞쪽에 위치한 mRNA의 짧은 뉴클레오티드 결합서열이다. SD 결합서열은 165 rRNA(리보솜 RNA)의 3'-말단에 대해 보완적이고 rRNA와 중복되어 리보솜의 올바른 위치를 잡아주므로써 mRNA를 리보솜에다 결합시켜 주는 역할을 한다. 유전자 발현을 극대화하는 문헌에 대해서는 Roberts와 Lauer의 "Methods in Enzymology 68:473(1979)"를 참조하면 된다.
여러가지 기타 인자들이 적절한 신호가 삽입되고 적절히 위치를 잡고난뒤라도 원핵세포중에서 외부 유전자의 발현을 복잡하게 한다. 이러한 인자들중 하나는 대장균과 기타 박테리아에 활성원핵계가 있다는 것이다. 이러한 단백질 분해계는 외부단백질이나 "비정상적인" 단백질을선택적으로 파괴한다.
따라서 박테리아에서 발현된 원핵 단백질이 단백질 분해되지 않게 하는 수단을 개발하면 큰 유용성이 있게될 것이다. 그 한가지 방법은 외부 결합서열을 원핵 유전자와 상(phase)중에서(예:정확한 리딩프레임(reading frame)중에서)결찰(ligate)하는 잡종 유전자를 구성하는 것이다. 이러한 잡종 유전자가 발현되면 융합 단백질 생성물(원핵 및 외부 아미노산 결합서열의 혼성인 단백질)이 생기게 된다.
클로닝된 유전자가 성공적으로 발현되자면 효과적인 DNA 전사, mRNA 전이 및 어떤 경우에 있어서는 단백질의 전이후의 개질이 있어야 한다. 발현벡터를 사용해서 적당한 숙주중에서 유전자를 발전시켜 단백질의 생성량을 증가시키고 있다. 클로닝된 유전자를 통제가능한 강력한 촉진유전자에 인접해 있도록 하여야만 필요에 따라서는 전사를 할 수 있는 것이다. 세포를 고밀도도 성장시킨 다음 촉진유전자를 유발시켜 전사량이 많도록 한다. 이렇게 해서 효과적으로 전이가 되면 단백질을 큰 수득율로 얻게 되는 것이다. 이것은 외부 단백질이 숙주세포에 대하여 해로운 경우에 특히 중요한 게(system)인 것이다.
(1-1) 발현 숙주계로서의 대장균
대장균 보편적으로 사용된 대부부의 플라스미드 클로닝(cloning) 벡터는 ColE1형 레플리콘(replicon) 유도체이다(여기에 Mol. Gen. Genet. 172:151-159 참조). 복제수가 염색체당 약 15-20인 단량체 분자로서의 대장균 균주속에서 Cole1 플라스미드를 안정하게 유지시킨다. 이들 플라스미드속에 삽입된 외부 유전자의 인간 및 동물 단백질 생성물의 발현정도는 여러가지로 나타난다.
그러나 계가 외부 단백질 생성물을 경제적으로 융통성있게 생성하도록 하자면 발현정도를 크게해야만 한다. 다량의 주어진 유전자 생성물을 얻는 한가지 방법은 박테리아 세포내에 복사수가 극히 큰 플라스미드에 유전자를 클로닝하는 것이다. 이론에 있어서특정 유전자의 복사수를 증가시키면 mRNA 수준도 증가시켜 주어야 하고 이렇게 되므로서 재조합 단백질의 생성량을 크게 할 수 있다.
(1-2) 발현벡터로서의 우두 바이러스
우드 바이러스는 클로닝 및 발현벡터로 사용한다. 이 바이러스에는 약 187kb쌍의 선형의이중가닥 DNA게놈(genome)이 있어서 감염된 세포의 세포질내에서 복제된다. 이들 바이러스는 바이러스감염에 필요한 바이러스 코어(virus core)내에 완전히 전사 효소계(캐핑(capping), 메틸화 및 폴리아데닐화 효소 포함)를 가지고 있다. 우두 바이러스 전자 규제 결합서열(촉진유전자)는 우수 RNA 폴리머라제에 의해 전사를 시작하지만 진핵 RNA 폴리머라아제에 의해서는 전사를 시작하지 않는다. 재조합 바이러스중에서 외부 DNA가 발현하자면 우두 촉진유전자를 외부 유전자의 단백질 코우딩 결합서열에다 융합시켜야 한다. 삽입벡터라고도 불리우는 플라스미드벡터들을 구성하여 우두 바이러스에다 키메라성 유전자를 삽입시키고 있다. 한가지 삽입벡터는 (1) 전사 개시위치를 포함하는우두 바이러스 촉진유전자; (2) 외부 DNA 단편들을 삽입하기 위한 전사개시위치 아래쪽에 있는 몇가지 독특한 제한 앤도뉴클레아제(endonuclease) 클로닝 위치; (3) 바이러스 게놈의 동족영역에 키메라성 유전자를 삽입시키는 클로닝 위치와 촉진유전자를 플랭킹(flanking)하는 비필수적인 우두 바이러스 DNA(예:TK 유전자); (4) 대장균에서 복제와 선택을 하기 위한 항생작용성의 저항 표지물과 박테리아성 복제원으로 구성되어 있다. 이러한 벡터의 예에 대해서는 MacKett의 논문(1984, J, Virol. 49:857-865)을 보면 된다.
외부 유전자를 함유하는 재조합 박테리아 삽입 플라스미드를 우두 바이러스로 감염된 세포속으로 도입 감염시켜 재조합 바이러스를 만든다. 동족 재조합이 감염된 세포내에서 일어나서 바이러스성 게놈속으로 외부 유전자를 삽입하게 된다. 재조합으로 바이러스를 스크린한 다음 면역기법 DNA 플라크 교잡법(plaque hybridiazation) 또는 유전자 선택등의 방법을 사용해서 분리한다.
이들 우두 재조합물은 이들은 필수적인 기능을 가지고 있어서 이들을 효과적으로 구성하여 약 35kb의 외부 DNA를 수용하게 할 수 있다.
효소 또는 면역학적 검정법[예:면역침전법, 효소결합면역흡수를 검정법(ELISA), 방사면역분석시험 또는 면역불롯팅법(immunoblotting)]으로 외부 유전자의 발현을 탐지한다. 또한 재조합 우두감염세포에서 생긴 천연산막 글리코 단백질(membrane glycoprotein)을 글리코실화하여 세포표면으로 이전시킨다. 적정한 벡터와 적당한 숙주중에서 단일유전자와 복수개의 복사를 클로닝하던지 강력한 촉진유전자를 사용해서 큰 정도로 발현시킬 수 있다.
(1-3) 발현벡터로서의 바쿨로바이러스(baculovirus)
오토그래피카 칼리포르니카(Autographica californica)핵다한증 바이러스(AcNPV)같은 바쿨로바이러스도 클로닝 또는 발현벡터로 사용된다. 감염형의 AcNPV는 보통 바이러스 내장물에서 발견된다. 이 구조는 대개가 바이러스 입자가 매몰되어 있는 다면체 펩티드로 구성되어 있다. 다면체 유전자 발현은 성숙 바이러스 입자가 생긴 후 감염 사이클에서 극히 늦게 일어난다. 따라서 다면체 유전자 발현은 없어도 상관없는 기능인데 즉 다면체 유전자 발현이 없이 생긴 비내장 바이러스 입자는 완전히 활성이어서 배양중 세포를 감염시킨다. 구주특허출원 제84105841.5호에 의하면 바쿨로바이러스 DNA를 분열시켜 다면체 유전자 또는 이들의 일부로 구성된 단편을 생성시켜 이것을 클로닝 매개체속에 삽입한 다음 발현될 유전자를 삽입해서 다면체 유전자 촉진제의 통제하에 있게 하므로서 재조합 바쿨로바이러스 발현벡터를 제조하고 있다. 이러한 방법으로 생성된 재조합 전달벡터를 바쿨로바이러스 보조 DNA(helper DNA)와 혼합해서 곤충세포를 배양물중 감염시켜 바쿨로바이러스 게놈의 다면체 유전자 부위에 있는 선택된 유전자를 재조합하고 결합하게 한다. 여기서 생긴 재조합 바쿨로바이러스를 사용해서 감염되기 쉬운 곤충이나 배양된 곤충세포를 감염시킨다.
2) 인플루엔자균과 질병
인플루엔자균을 두가지로 나눈다. 공지의 캡슐을 가지고 있는 균주들을 기준 항혈청과 캡슐간의 혈청반응에 의한 형(型)으로 하고 기준 항혈청중 어떤 것도 반응을 하지 않는 균주들을 형이 없는 무형(無型)의 것이라 한다.
인플루엔자균(Hib)은 미국에 있어서는 신생아 뇌막염과 기타 침임성 감염증의 주원인이 되고 있다(Fraser et al., 1974, Am. J. Epidemiol. 100:29-34). 어린이 뇌막염의 주요빈도는 1살-5살 B형 인플루엔자로 인하여 2살미만의 어린이들에게서 일어난다. 잘 알려진 사실로서는 무형의 인플루엔자균(Hi) 역시 성인들에 있어서 폐염, 균혈증, 뇌막염, 산후패혈증 및 급성 유혈성 기관지염을 비롯한 질병의 원인이 되고 있다(Murphy et al., 1985, J. Infect, Diseases 152:1300-1307). 무형의 인플루엔자균은 어린이와 젊은 성인들에 있어서 중이염의 원인이 되고 있는데 모든 중이염의 약 20~40%가 여기에 그 원인을 두고 있다. 어린이들은 감염에 의해 지속적인 면역성이 없기 때문에 동일한 생물로 인한 여러가지로 감염이 될 수가 있다. 만성 또는 반복된 중이염 발생에 대한 현재의 치료방법중에는 항생제 투여와 속귀에다 관을 삽입하여 약을 주입하는 것이 포함된다. 인플루엔자균주를 동염(sinusitis)의 일차 원인으로 보고 있기도 하다(Cherry J.D. and J.P. Dudley, 1981, in Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Feigin and Cherry eds., pp 103-105). 또한 무형의 인플루엔자균은 산후 패혈증의 원인이 되고 있다.
폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)로 되어 있는 b형 인플루엔자균(Hib)의 캡슐형 다당류에 대해 생겨난 항혈청은 박테리아성임이 밝혀졌고 b형 인플루엔자균(Hib)에 대해 보호성이 있음이 밝혀졌다(Smith et al., 1973, Pediatrics 52:637-644; Anderson, et al., 1972, J. Clin, Inv. 51:31-38). 앤티-PRP 항체는 무형의 인플루엔자균 감염에 대해 효과가 없다.
(3) 인플루엔자균에 대한 백신
혈액기호성 세균백신(Haemophilus vaccine)의 이상적인 후보는 다음과 같은 세가지 성질을 가져야 한다:(a) 2-6개월된 유아에 있어서 면역성이 있어야 한다. (b) 유형(有型) 및 무형(無型)의 인플루엔자균에 의해 감염이 되지 않게 하는 항체를 끌어낼 수 있는 것이라야 한다. (c) 인플루엔자균의 모든 균주의 표면에서 발견되는 유전기질(determinant)에 대해 항체를 끌어낼 수 있는 것이라야 한다.
B형 인플루엔자 감염이 되지 않게 하는 현재 사용되는 백신은 필수적으로 b형 캡슐형 다당류인 PRP로 되어 있다. 정제된 PRP 다당류는 18개월 이상된 어린이들에 있어서는 면역성이 있으나 18개월 이하된 어린이들에 있어서는 보호성의 항체응답을 유발하지 못한다.
일반적으로 다당류는 약 18개월 이하의 어린이들에 있어서 면역원이 불량함이 밝혀졌다. 이 문제를 해결코자 PRP를 화학적으로 단백질 운반분자에 결합시킨다던지(Anderson et al., 1985, Ped. Res. 18:252A)단백질 분자와 혼합해서(Monji et al., 1986, Infect. Immun. 51:865-871) 동물이나 인간에게 투여하는 등의 여러가지 연구가 시작되었다. PRP를 단백질에 접합(conjugation)시키는 방법에 의해 6월 되는 유아에 있어서 엔티-PRP 항체를 유발시킴이 확인된 반면 PRP와 몇가지 단백질과의 혼합물에서는 유치기의 동물에 있어서 앤티-PRP 항체를 생성하고 있음이 밝혀졌다(Monji et al., 위의 문헌에서).
접합체와 혼합물 백신 조제물에 의해 PRP 백신의 한가지 난점이 있기는 해도 즉 18개월 이하의 유아들이 감염되지 않도록 하지는 못하지만 PRP 백신의 또 다른 주요한 문제점을 제시하지는 않고 있다. 앤티-PRP 항체는 정의상 PRP 캡슐이 없는 무형의 인플루엔자균에 대해서는 효과가 없다. 따라서 오래동안 필요로 하여온 것은 18개월 이하 정도되는 아이들에 있어서 B형 및 무형의 인플루엔자균에 대한 보호성 면역응답을 나타내는 백신을 개발하는 것이었다.
본 발명의 한가지 목적은 6개월 이하의 어린이들과 그 이상의 어린들 및 성인들에 있어서 b형 및 무형의 인플루엔자균에 대한 보호성 면역응답을 가지는 백신 조제물을 제공함에 있다. 본 발명의 접근 방법은 혈액 기호성 세균 표면에 노출되어 있는 단백질 또는 그 단편과 접종시키는 것이다. 가장 양호한 부호는 인플루엔자균의 외막 단백질(OMP:outer membrane protein)인데 이들은 보통 유아들에 있어서 면역성인 단백질로 되어 있어서 기타 박테리아계에 있어서도 보호성의 항체를 나타낼 수 있음이 확인되었다(Sugasawara et al., 1983, Infect. immun. 42:980-985).
더우기 b형 및 무정형의 인플루엔자균주는 OMP와 유사한 특성을 가지다(Loeb and Smith, 1980, Infect. Immun. 30:709-717). 혈액 기호성 세균의 OMP에 대한 항체는 앤티-PRP가 b형 인플루엔자에 대하여 박테리아성이고 옵소닝성(opsonic)인 정도만큼 박테리아성이고 옵소닝성이다(Anderson et al., 1972, J. Clin, Invest. 51:31-38; Cates et al., 1985, Infect. Immun. 48:183-139). 외막 단백질의 추가적인 장점은 b형 및 무형 인플루엔자에 보편적으로 나타나며 이들 두가지 형의 박테리아에 대해 보호성이있다.
본 발명은 본 출원인에 의하여 확인된 약 1600 돌턴분자량의 인플루엔자균의 외막 단백질과 관련되고 PBOMP-1(Praxis Biologics Outer Membrane Protein-1)로 명명되어진 단백질과 펩티드 및 본 출원인에 의해 역시 확인된 약 16000 돌턴 분자량의 인플루엔자균의 PBOMP-2(Praxis Biologics Outer Membrabe Protein-2)로 명명되어진 항원성으로 관련된 외막 단백질과 이들 펩티드나 단백질을 인코우드(encode)하는 분자적으로 클로닝된 유전자 또는 유전자 단편에 관한 것이다.
본 발명은 신규의 개선된 방법을 사용해서 인플루엔자균으로부터 수득한 거의 순수한 PBOMP-1에 관한 것이기도 한다. 본 발명의 펩티드와 단백질을 인플루엔자균의 백신 제조용 면역원으로서 사용하던지 인플루엔자균의 진단에 의한 면역학적 검정시약으로 사용하다. 본 발명은 PBOMP-1 및 PBOMP-2 관련 펩티드인 인코우드하는 유전자 또는 유전자 단편을 분자클로닝하는 방법에 관한 것이기도 하다. 이들 분자적으로 크로닝된 결합서열을 인코우드된 펩티드의 발현벡터를 포함해서 재조합 DNA법으로 다시 더 기타 여러가지 벡터를 구성하는데 사용하거나 헥산 교잡에 근거한 인프루엔자균의 진단분석용 PBOMP-1 및 PBOMP-2 유전자를 얻는데 이용된다.
본 발명의 펩티드 또는 단백질을 인플루엔자균으로부터 정제하던지 벡터-숙주계중에서 재조한 DNA 기법을 사용해서 제조하던지 화학적인 방법으로 합성한다. 따라서 본 발명은 펩티드와 단백질이 정제되는 적당한 숙주세포중에서 PBOMP-1 및 PBOMP-2 관련 펩티드나 단백질 발현을 하도록 하는데 사용되는 박테리오파아지, 곤충 바이러스, 동물 바이러스 또는 인간 바이러스 같은 바이러스성 DNA, 플라스미드 DNA를 포함하는 벡터와 신규의 DNA 결합서열을 구성하는 것과 관련이 있다. PBOMP-1 및 PBOMP-2 관련 펩티드와 단백질 합성의 화학적인 방법에 관하여 기술한다.
PBOMP-1 및 PBOMP-2 관련펩티드와 단백질을 b형 및 무형의 인플루엔자균을 포함하는 모든 병원성 인플루엔자균에 대해 사용되는 소단위 백신 조제물의 면역원으로 사용된다. 소단위 백신 조제물에 사용되는 PBOMP-1 및 PBOMP-2 관련 단백질 또는 펩티드는 인플루엔자균으로부터의 정제, 화학적인 합성 또는 재조합 발현벡터계로부터의 정제등에 의해 얻게된다. 또한 PBOMP-1 또는 PBOMP-2 관련 펩티드 또는 단백질 자체를 생산하는 재조합 바이러스 또는 이런 재조합 바이러스로 감염된 세포의 추출물을 바이러스 백신 조합물에 있어서 면역원으로 사용한다. PBOMP-1 또는 PBOMP-2 단백질은 숙주동물에 있어서는 "외부 물질"로 인식되기 때문에 세포매개면역응답이 PBOMP-1 또는 PBOMP-2에 대해 일어난다. 적절히 제조된 백신 조제물에 있어서 이것은 인플루엔자균 감염에 대해 숙주를 보호해야만 하고 더우기 소단위 백신 조제물은 현재 사용되고 있는 PRP 백신과 혼화성이 있어야 한다.
본 발명의 PBOMP-1 관련 및/또는 PBOMP-2관련 결합서열을 인간의 의학적 검정에 사용할 수 있다. 이들 중에는 본 발명의 펩티드와 단백질을 혈액시료, 체액, 조직등에 있어서, 인플루엔자균 감염을 알아내는 진단도구로 유용한 방사면역분석시험과 ELISA 시험 같은 면역학적 검정시의 시약으로 사용되는 것도 포함된다. PBOMP-1 인코우딩 및/또는 PBOMP-2 인코우딩 유전자 결합서열을 마찬가지의 인플루엔자균 진단검출시의 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 교잡형성 검정에 사용한다. 더우기 이들 시약은 인플루엔자균의 발병과정 메카니즘을 구명하는데 귀중한 도구가 되고 있다.
본 발명은 수동 면역화 및 진단성의 면역학적 검정시의 용도를 가지는 엔티 PBOMP-1 및/또는 앤티-PBOMP-2 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명은 인플루엔자균의 약 16000 달톤 분자량인 외막 단백질, 즉 PBOMP-1과 인플루엔자균의 약 16000 달톤 분자량이 외막 단백질 즉 PBOMP-2의 에피토우프와 관련된 단백질과 펩티드에 관한 것이다. SDS-PAGE를 사용해서 측정한 겉보기 분자량은 성숙(즉, 단백질 분해식으로 처리된)한 형태와 전이후의 개질(예:지방아실화, 아세틸화등)을 포함해서 전체 분자량을 반영한다. 재조합 DNA법을 사용하거나 화학적인 합성법으로 본 발명의 단백질과 펩티드를 제조한다. 더우기 본 발명의 단백질과 펩티드는 신규하고도 개선된 분리 및 정제방법을 사용해서 인플루엔자균의 배양물로부터 거의 순수한 형태로 얻게 된다. 인플루엔자균의 에피토우프를 분명히 하는 PBOMP-1 및 PBOMP-2 단백질과 펩티드는 인플루엔자균의 감염을 방지하는 여러가지 백신 조제물의 면역원으로서 세균성 뇌막염, 중이염, 폐염등의 병원학적인 치료제로 사용된다. 백신 조제물은 a형, b형, c형, d형, e형 및 f형과 무형의 인플루엔자균을 비롯해서 여러가지 인플루엔자균에 대해 효과가 있다. 본 발명은 PBOMP-1과 PBOMP-2 단백질을 인코우드하는 유전자의 뉴크레오티드 결합서열과 PBOMP-1 및 PBOMP- 2 단백질과 이들의 폴리펩티드 단편의 아미노산 결합서열에 관한 것이다. 본 발명의 한가지 실시태양에 의하면 재조합 DNA 기법을 사용하여 적당한 숙주세포중에서 결합서열을 나타내게 하는 발현벡터속으로 PBOMP-1과 PBOMP-2 에피토우프를 인코우드하는 뉴클레오티드 결합서열을 삽입한다. 이들 발현 숙주세포계를 사용해서 PBOMP-1과 PBOMP-2 및 관련 단백질과 펩티드를 생성시킨다. 유전자 생성물을 배양중의 세포로부터 정제해서 소단위 백신 조제물의 면역원으로 사용한다. 또한 PBOMP-1과 PBOMP-2 단백질과 펩티드의 아미노산 결합서열은 (1) 인플루엔자균으로부터 분리한 거의 순수한 PBOMP-1 단백질로부터, 또는 (2) 면역성의 PBOMP-1 또는 PBOMP-2 관련 단백질과 페티드를 발현하는 재조합물중에 함유된 인플루엔자균의 뉴클레오티드 결합서열로부터 추측할 수 있다. 이들 단백질과 펩티드를 화학적으로 합성되어 소단위 백신제조에 사용된다. PBOMP-1 및/또는 합성 PBOMP-2 결합서열을 발현하는 발현벡터가 재조합 바이러스인 경우에는 바이러스 자체를 백신으로 사용해도 된다. PBOMP-1 및/또는 PBOMP-2 단백질과 펩티드를 발현하고 숙주중에서 질병을 유발하지 않는 감염성 재조합 바이러스를 생존하고 있는 바이러스 백신 조제물에 사용해서 면역성을 부여한다. 또한 PBOMP-1 및/또는 PBOMP-2 단백질과 펩티드를 발현하는 "죽은" 재조합 바이러스를 사용하여 비활성의 바이러스 백신을 제조한다.
본 발명은 PBOMP-1 및/또는 PBOMP-2에 대한 모노클로날 항체와 다가 항혈청 및 인플루엔자균의 진단분석과 수동 면역화의 면역글로블린의 사용방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 목적상 다음의 여러단계로 구분한다. 즉 (1) PBOMP-1 단백지의 분리 정제; (2) PBOMP-1의 부분 아미노산 결합서열 확인; (3) 유전자 또는 유전자 단편을 발현벡터속으로 삽입하고 재조합 유전자 생성물을 확인하고 정제하는과정을 포함해서 PBOMP-1과 PBOMP-2을 인코우드하는 유전자 또는 유전자 단편의 분자클로닝, (4) PBOMP-1과 PBOMP-2를 인코우드하는 유전자의 뉴클레오티드 결합서열 확인; (5) 정제된 재조합 단백질과 펩티드 생성물에 대한 항체 생산을 통해 PBOMP-1과 PBOMP-2 단백질과 관련 생성물의 면역성 측정; (6) 백신 제조 및; (7) 체액 시료중의 PBOMP-과 PBOMP- 유전자 또는 유전자 생성물 탐지용 진단분석방법.
(가) PBOMP-1의 분리 및 정제
b형 인플루엔자균 및 기타 균주에 있어서 외막 단백질 PBOMP-1의 정제시의 필요한 단계는 외막 단백질을 외막 및 세포벽과 빈틈없는 관계로 유지하는 결합을 파괴하는 것이다. 이것은 다음과 같은 2단계로 된 본 발명의 신규하고도 개선된 방법에 의해 가능해진다. 즉 (1) 인플루엔자균의 물리적으로 파괴된 세포로부터 PBOMP-1의 풍부한 불용성 세포벽 분획물을 분리한 다음, (2) 인간에게 투여하기 적당한 세척제 존재하던지 세척제 존재 또는 부존재하에 리소자임으로 세포벽 분획물을 소화시키므로써 세포벽 분획물로부터 PBOMP-1을 용해시킨다. 본 발명의 신규하고도 개선된 방법에서는 중요한 에피토우프를 파괴하고 인간에게 투여하기 위한 백신제조물의 적당한 성분이 아닌것들인 2-메르캅토에탄올과 소비움 도데실술페이트(Munson et al., 1984, Infect, Immun. 49:544-49 참조)같은 환원제와 변질제를 사용하지 않는다.
(가-1) 인플루엔자균으로부터 PBOMP-1이 풍부한 세포벽의 부리
음파처리, 분쇄등을 포함하는 방법으로 인플루엔자균을 파괴한후 차동 침강법으로 전체 세포막 분획물을 얻는다. 전체막 분획물을 다시 밀도 구배침강법이나 Triton X-100 또는 N-라우로일 사르코신, 소디움염(사르코실)등과 같은 세척제로 내부막을 차동가용화하는 방법을 써서 내막과 외막으로 분리한다. 외막은 10mM HEPES-NaOH(pH 7.4)중의 1%(W/V) 사르코실에서 내막의 차동가용화법으로 얻는 편이 좋다. 기타 외막-세포벽 성분의 차동 세척제 추출법으로 PBOMP-1가 풍부한 소분획물을 제조한다. 예를 들어 이 방법은 1% 옥틸글루코시드, 노닐글루코시드, 양성제제 3-14 또는 양성제제 3-6으로 외막-세포벽 착물을 순차 추출한 다음 1% 사르코실로 불용물질을 추출하고 나서 원심분리하여 PBOMP-1이 풍부한 불용물질을 분리하므로써 그 실시가능하다.
(가-2) PBOMP-1이 풍부한 불용성 세포벽 물지로부터 PBOMP-1의 가용화
다음의 한가지 방법 또는 조합으로 외막-세포벽 착물로부터 PBOMP-1을 가용화한다. 즉(1) PBOMP-1이 풍부한 분획물을 데옥시콜레이트, Triton X-100, Tween 80, CHAPS, CHAPSO, 도데실말토시드, 양성세척제 3-14, 양성세척제 3-16을 포함해서 몇가지 세척제중 한가지 또는 여러가지 조합해서 55℃-60℃에서 1시간 추출하므로써 PBOMP-을 가용화한다; (2) PBOMP-1의 풍부한 분획물중의 세포벽을 세척제 존재하에 또는 부존재하에 리소자임으로 파괴해서 PBOMP-1을 가용화한다. 바람직한 실시태양에 의하면 세척제는 데옥시콜레이트와 폴리에톡실레이트 소르비탄 모노올레에이트(Tween-80)중에서 또한 Triton X-100, 사르코실, 옥틸글루코시드, 노닐글루코시드, 양성세척제 3-14 또는 양성세척제 3-16을 비롯해서 한가지 또는 몇가지 세척제를 조합하여 인플루엔자균 세포, 외막 또는 이들의 소분획물을 추출하므로써 PBMP-1을 분리한다. 이 추출과정을 55-60℃ 또는 적당한 완충계중에서 실온하에서 실시한다. 가용화한 다음 이온교환, 분자체, 소수성 또는 역상 크로마토그래피, 친화크로마토그래피, 크로마토포커싱, 등전점포커싱, 예비전기이동등을 비롯한 공지의 표준방법으로 PBOMP-1을 더한층 정제한다.
(나) PBOMP 펩티드의 결합서열확인과 아미노산 분석에 따른 PBOMP-1의 특성화
인플루엔자균에서 얻은 PBOMP-1 펩티드 단편의 부분적인 아미노산 결합서열 확인과 더불어 아미노산 분석에 의하여 특징 지워진다. 정제된 단백질에 있는 아미노산의 파괴 및/또는 개질을 극소화 하자면 트립타민을 함유한 메탄술폰산 중에서 PBOMP-1을 가수분해하는 것이 좋다(Simpson et al., 1970, J. Biol. Chem. 251:1936-40). 본 발명의 한가지 실험예에 있어서 이러한 아미노산 분석을 PBOMP-1의 트립신분해 펩티드 단편의 아미노산 결합서열 확인과 결합하므로서 분리된 신규의 펩티드를 특정화하였다(실시예 1 참조).
Edman 화학에 따라 PBOMP-1의 결합서열을 파악코자 처음으로 시도해 보던중 겪었던 어려움이 뜻하는 바로서는 혈액기호성 세균의 외막 단백질의 N-말단이 차단되어 있다는 것이다. Braun의 연구결과(1970, Eur. J. Biochem 14:387-391)를 보면 지방산은 대장균의 Braun의 지방 단백질중의 N-발단 시스테이닐 잔기에 결합되어 있다는 점이다. 팔미틸 성분은 N-말단 시스테이나에 아미드결합을 하고 있고 두가지 추가적인 장산도 대장균의 Braun 지방 단백질중에서 티오에테르 결합을 형성하는 글리세릴 그룹을 통해 동일한 시스테이닐 잔기에 결합되어 있다. 따라서 인플루엔자균에서 얻은 PBOMP-1의 또다른 특징은 지방산 분석에서 나타난다. 이러한 연구결과로부터 알 수 있는 것은 본 발명의 외막 단백질과 펩티드의 N-말단 잔기에는 공유결합된 지방산 잔기가 있다는 점이다. 본 발명의 한가지 실험예에 있어서 이러한 지방산 분석에 의해 세가지 주요한 지방산, 즉 라우르산, 팔미트산 및 팔미트산 유도체가 존재함이 밝혀진 것이다. 본 발명의 공유결합식을 결합된 지방산 성분을 가진 아세틸화된 단백질과 펩티드는 인플루엔자균에 대한 백신을 만들 때 특히 유용성이 있는 것이다.
(다) PBOMP-1과 PBOMP-2를 인코우드하는 유전자 또는 유전자 단편의 분자 클로닝
(다-1) PBOMP-1 및 관련된 PBOMP들을 인코우드하는 유전자 분리
시험대상이된 인플루엔자균주(현재 수백가지)에 있어서 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔 전기이동분석(SDS-PAGE)과 웨스턴 블롯 분석(Western Blot analysis)에 의해 16000 달톤 분자량의 OMP를 분석하였다. 모노클로날 항체 데이터를 보면 이 단백질은 고도로 보존되어 있다는 것을 알 수 있다(Murphy et al., 1986, Infect, Immun. 54:774-49). 이와 같이 어떠한 인플루엔자균주라도 PBOMP 유전자의 공급원 역할을 한다. 대다수 인플루엔자균주에는 검출 가능한 정도의 플라스미드나 프로파아지가 없기 때문에 PBOMP 유전자는 염색체이다. 따라서 PBOMP를 인코우드하는 DNA 결합서열의 분자 클로닝에 있어서의 첫번째 단계는 인플루엔자 염색체 DNA로부터 그 결합서열을 분리하는 것이다. 이후부터는 인플루엔자 유전자를 인코우드하는 DNA를 "Hi DNA"로 부르기도 하고 PBOMP 결합서열을 인코우드하는 DNA를 "PBOMP DNA"라 부르기도 한다.
Hi DNA 단편을 생성시키자면 각종 제한효소를 사용하여 특정된 위치에서 Hi DNA를 분열시킨다. 또다른 방법으로서는 저농도의 DNA아제(DNAase)를 사용하여 DNA를 단편으로 만들거나 초음파처리같은 방법으로 DNA를 물리적으로 파괴할 수 있다. 선형의 DNA단편을 아가로우즈와 폴리아크릴아미드겔 전기이동, 칼럼 크로마토그래피(예:분자체 또는 이온교환 크로마토그래피) 또는 슈크로오즈 구배에 있어서 속도 침강법등을 포함하는 표준 방법에 따라 크기별로 분리한다.
어떠한 제한효소나 제한효소의 조합을 사용해서 PBOMP 결합서열을 가진 Hi DNA 단편들을 만들수 있는데 단지 효소만으로는 PBOMP 유전자 생물의 면역성을 파괴할 수는 없다. 예컨데 단백질의 항원성 위치는 약 7-약 14개의 아미노산으로 되어 있다. 따라서 PBOMP 펩티드 크기의 단백질은 불연속적인 항원성 위치를 가지고 있으므로 많은 부분적인 PBOMP 펩티드 유전자 결합서열에 의해 항원성 위치를 코우드할 수 있다. 따라서 많은 제한 효소를 조합해서 DNA 단편을 만들어 적절한 벡터속에 삽입할 경우 상이한 항원성 결정인자 유전소로 구성된 특정된 아미노산 결합서열에 PBOMP를 생성시킬 수 있다. 일단 DNA단편이 생성되면 PBOMP 유전자를 함유하는 특수한 DNA 단편을 여러가지 방법으로 확인할 수 있다.
PBOMP 유전자를 가진 DNA 결합서열을 합성 올리고뉴클레오티드 탐침으로 Hi DNA 단편의 교잡 육성에 의해 확인할 수 있다. 반복성 합성 올리고뉴클레오티드 탐침을 PBOMP 단백질의 펩티드 단편의 아미노산 결합서열에 입각하여 구성한다.
예컨데 앞서 나온 (가)에 있는 인플루엔자에서 분리된 것의 순수한 PBOMP-1 단백질의 결합서열에 입각해서 합성 올리고머뉴클레오티드 탐침을 만들 수 있다. 이들합성 탐침을 P-아데노신 트리포스페이트로 방사선 표지를 해서 PBOMP-특정 유전자 결합서열을 가진 클로운(clone)의 Hi DNA 라이브러리를 스크리닝한다(Anderson et al., 1983, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:6838-42).
또다른 방법은 "쇼트건(shotgun)" 접근방식으로 클로닝 벡터속에 삽입한 후 PBOMP 유전자 DNA를 확인하고 분리하는 것이다. 이미 알려져 있는 다수의 벡터-숙주계를 이용한다. 벡터계는 플라스미드이던지 개질된 바이러스일 수도 있다. 적당한 클로닝 벡터에 속하는 것으로는 람다 벡터계 gt11, gt WES. tB, Charon 4 및 플라스미드 벡터(예:pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pRC37, pKC101)등과 같은 바이러스성 벡터가 있다. 벡터계는 사용된 숙주세포와 혼화성이 있어야 한다. 재조합 분자를 형질전환, 감염등을 통해 세포속에 도입한다.
PBOMP 유전자 또는 유전자 단편을 가지는 Hi DNA를 클로닝 벡터속에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질전환시켜 PBOMP 유전자 또는 유전자 단편의 수많은 복사를 한다. 이것은 Hi DNA 단편을 상호보완적인 응집성 말단이 있는 클로닝 벡터속에 결찰시켜주면 되는 것이다. 그러나 만일 보충제한 위치가 없으면 DNA 분자 말단을 개질시킨다. 이러한 개질방법으로는 단일 가닥 DNA 말단을 소화시키던지 단일가닥 말단을 채워주어 말단이 뭉퉁한 말단으로 결찰되게 하는 식으로 무딘 말단을 만들어 주는 것이다. 또다른 방법으로는 DNA 말단에다 뉴클레오티드 결합서열(링커)을 결찰시켜 필요로 하는 자리를 만들어 주는 것이다. 이렇게 결찰된 링커들은 제한위치 인식 결합서열을 인코우드하는 특수하게 화학적으로 합성된 올리고머 뉴클레오티드로 되어 있다. 예컨데 Maniatis의 DNA 변경방법에 따라(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory, pp. 107-114) 전단력을 받은 DNA를 제한 메틸라아제(예:M. EcoRI)로 처리해서 합성 DNA 링커에다 결찰하여 이 효소에 대응하는 제한위치를 인코우드한다. 이어서 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 처리해서 말단 링커(변형된 내부 제한위치)를 분열시킨 다음 적당한 벡터아암에다 결찰시킨다. 또다른 방법에 있어서 단독중합 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 분열된 벡터와 PBOMP DNA 단편을 변경시킨다. 클로닝된 PBOMP의 확인은 벡터계에 Hi의 염색체 유전자 뱅크(bank)를 설정하고 각 클로운을 스크리닝해서 PBOMP에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와의 특수반응을 비롯한 여러 방법을 통해 PBOMP-1 또는 PBOMP-2 관련 단백질 제조를 하므로서 가능하다.
(다-2) 발현 벡터에의 PBOMP 유전자 삽입
PBOMP 또는 이것의 일부를 코우딩하는 뉴클레오티드 결합서열을 삽입된 단백질을 코우딩하는 결합서열의 전사와 전이를 위한 필요한 요소를 가지는 벡터같은 적당한 발현벡터속에 삽입한다. 여러가지 숙주-벡터계를 사용하여 단백질을 인코우드하는 결합서열을 발현시킨다. 주로 벡터계는 사용된 숙주세포와 적합성이 있어야 한다. 숙주-벡터계로는 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아, 효모벡터를 가진 효모같은 미생물, 바이러스로 감염된 포유동물 세포계(예:유두 바이러스, 아데노바이러스등), 바이러스로 감염된 곤충세포계등이 있다. 이들 벡터의 발현요소들은 그 강도와 특징이 여러가지이다. 사용된 숙주-벡터계에 따라 적당한 전사 및 전이요소중 한가지를 사용한다. 효과적인 유전자(또는 유전자의 일부)를 발현시키자면 발현 벡터중에 촉진유전자가 있어야 한다. RNA 폴리머라아제는 대체로 촉진유전자에 결합해서 유전자 또는 결합된 유전자와 조절요소(operon이라함)의 한무리를 전사시킨다. 촉진유전자의 강도는 여러가지인데, 즉 전사를 촉진하는 능력이 여러가지이다. 클로닝된 유전자를 발현시킬 목적으로 필요로 하는 것은 강력한 촉진유전자를 사용해서 고수준의 전사와 유전자의 발현을 얻는 것이다. 사용된 숙주세포계에 따라 적당한 한가지 촉진유전자를 사용해도 된다. 예컨데 대장균에서 클로닝할 경우 이것의 박테리오파아지 또는 플라스미드, 촉진유전자(예:lac 촉진유전자, trp 촉진유전자, recA 촉진유전자, 염색체 RNA 촉진유전자, 콜리파아지 람다의 PR및 PL촉진유전자 기타로는 lacUV5, ompF, bla, lpp등)을 사용해서 인접한 DNA 단편의 전사를 크게한다. 재조합 DNA 또는 기타 합성 DNA 기법에 의해 생성된 대장균 촉진유전자 또는 잡종 trp-lacUV5(tac) 촉진유전자를 사용해서 삽입된 유전자를 전사한다.
박테리아 숙주 세포균주와 발현벡터를 선택해서 특별히 유발되지 아니하는 한도에서 촉진유전자의 작용을 억제한다. 어떤 오페론에 있어서는 특수한 유발자(inducer)를 첨가하여 삽입된 DNA를 효과적으로 전사할 필요가 있는데, 예컨데 락토오스나 IPTG(이소프로필티오-베타-D-갈락토시드)를 첨가하여 lac 오페론을 유발시키는 것이다. trp, pro 등과 같은 여러가지 기타 오페론이 상이한 통제하에 놓여져 있다. trp 오페론은 성장 매체주아에 트립토판이 없을 때 유발되고 람다 PR촉진유전자는 온도에 민감한 람다 억제인자(예:c1857)를 함유하는 숙주세포중에서 온도상승에 의해 유발된다. 이런 방법으로 촉진유전자에 의한 전자량의 95% 이상은 유발되지 않는 세포에서 억제된다. 따라서 유전적으로 조작된 PBOMP 단백질이나 이들의 펩티드의 발현을 제어할 수 있다. 클로닝된 유전자의 단백질 생성물이 숙주세포에게 있어서 치명적인 경우에는 이것이 중요성을 가진다. 이경우에 있어서 촉진유전자가 유발되지 않는 조건하에서 형질전환체를 배양하고 세포가 성장개체중에서 적당한 밀도에 도달하면 촉진유전자가 유발되어 단백질을 생성한다. 이러한 촉진유전자/작동유전자(operator)계를 소위 "tac" 또는 trp-lac 촉진유전자/작동유전자계라 한다(Russell and Bennett, 1982, Gene 20:231-243; DeBoer, Eupopean Patent Application, 67, 540(1982. 5. 18 출원) 이러한 잡종 촉진유전자는 trp 촉진유전자의 -35b.p.(-35영역)와 lac 촉진유전자(RNA 폴라머라아제 결합위치인 DNA의 결합서열)의 -10b.p.(-10영역 또는 Pribnow box)을 조합하므로써 구성시킬 수 있다. 트림토팝 촉진유전자의 강력한 촉진유전자 특가성을 유지하는 외에도 tac를 lac 억제인자에 의해 조절하기도 한다.
진핵숙주 세포중에서 클로닝할 경우 인핸서(enhancer) 결합서열[예:SV40 DNA의 72bp 탠덤리피트(tandem-repeat) 또는 레트로바이럴(retroviral)의 긴 말단 리피트(LTR)]을 삽입해서 전사효율을 높여준다. 인핸서 결합서열은 인접한 유전자에 대해 그들의 위치와 방향에는 상대적으로 관계없는 방식으로 전사효율을 증가시켜주는 한조의 진핵 DNA 요소이다. 유전자에 대해 바로 5'에 위치해야만 하는 종래의 촉진유전자 요소(예:폴리머라아제 결합위치와 Goldberg-Hogness의 "TATA" box)와는 달리 진핵유전자로부터 아래쪽 또는 그 내부 또는 그 위쪽에서 인핸서 결합서열이 현저한 기능을 발휘하기 때문에 삽입된 유전자에 대한 인핸서 결합서열의 위치는 그 중요성이 없다. 원핵세포에서 효율적인 유전자 전사와 전이를 하기 위해서는 특수한 개시신호가 필요하다. 이들 전사 및 전이개시신호는 유전자 특정메신저 RNA와 합성된 단백질의 량으로 측정된 강도에 있어서 여러가지이다. 촉진유전자를 가지는 DNA 발현 벡터에는 여러가지 강력한 전사 및/또는 전이개시 신호가 조합되어 존재한다. 예컨데 대장균에서 효율적인 전이를 하자면 리보솜 결합위치를 부여하는 개시코돈(ATG)에 대해 5'에 약 7-9개의 염기가 있는 Shine-Dalgarno(SD) 결합서열이 필요하다. 따라서 숙주세포 리보솜이 사용하는 SD-ATG 조합을 이용할 수 있다. 이러한 조합에 속하는 것으로는 콜리파아지 람다의 N 유전자 또는 cro 유전자로된 SD-ATG 조합 또는 대장균 트립토판 E, D, C, B 또는 A 유전자로된 SD-ATG 조합등이 있다.
더우기 재조합 DNA 또는 합성 뉴클레오티드 결합을 포함하는 기타 기법에 의해 생성된 SD-ATG 조합도 사용가능하다. 벡터속으로 DNA 단편을 삽입하는 방법중 어떤 방법을 사용해서 벡터내의 특수한 위치속으로 촉진유전자와 기타 제어요소를 결찰시킬 수 있다.
따라서 PBOMP 단백질 또는 펩티드를 코우딩하는 이들 영역을 포함하는인플루엔자균 유전 결합서열을 벡터 촉진유전자와 제어 요소에 대해 특정위치의 발현 벡터속으로 결찰시켜 숙주세포속에 재조합 DNA 분자가 도입될 때 숙주세포에 의하여 외부 유전결합서열을 발현(예:전사와 전이)시킬 수 있다. (벡터/숙주세포계에 따라서는)형질전환, 형질도입 또는 트랜스팩션에 의해 적당한 숙주세포(박테리아, 바이러스, 효모, 포유동물의 세포등을 포함)속으로 재조합 DNA 분자를 도입한다. 형질전환체는 벡터속에 정상적으로 존재하는 한가지 이상의 적절한 유전자 표지물의 발현 예컨데 pBR322에 있어서의 암피실린 내성 또는 테트라사이클린 내성이나 진핵 숙주계에 있어서의 티미딘 카나아제 활성등에 따라 선택된다. 이러한 표지물 유전자의 발현에서 재조합 DNA 분자가 그대로 잔존하여 복제되고 있음을 알 수 있다. 발현 벡터를 보통 포지물 기능을 가지는 클로닝 벡터로부터 유도한다. 이러한 클로닝 벡터에 속하는 것으로는 SV40 및 아데노바이러스, 우두바이러스 벡터, 카쿨로바이러스와 같은 곤충바이러스, 효모벡터, 람다 gt-WES-람다 B, 샤론 28, 샤론 4A, 람다 gt-1-람다 BC, 람다 gt-1-람다 B, M13mp7, M13mp8, M13mp9 등과 같은 박테리오파아지 벡터 또는 pBR322, pAC105, pVA51, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, pBR325, ColE1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBR328 등과 같은 플라스미드 DNA 벡터등이 있다.
인플루엔자균과 대장균 사이의 접합을 통한 약물 내성인자의 전달(Stuy, 1979, J, Bact. 139:520-529) 및 대장균에서의 혈액기호성 세균의 염색체 유전자의 형질전환(Mann, 1979, Plasmid 2:503-505)과 클로닝(mann et al., 1980, Gene 3:97-112)으로부터 알 수 있는 것은 최소한 몇가지 유전자를 두가지 생체내에서 효과적으로 발현시킬 수 있고 전사 및 전이 제어의 기본 메카니즘이 유사하다는 점이다.
본 발명의 실시예에서 특수한 실시태양에 있어서 대장균 플라스미드계를 발현 벡터로 선택하였다. 그러나 본 발명은 이러한 대장균 발현 벡터의 사용에 한정된 것은 아니다.
유전공학기법을 사용해서 클로닝된 유전자를 특성화하고/하거나 저가응시킬 수 있다. 예컨데 PBOMP 단백질을 인코우드하는 유전자의 위치지향 진정세대교번을 이용해서 보호성 항체응답을 발생하는 단백질 영역을 확인할 수 있고 또한 보호성 영역 바깥에 있는 영역의 단백질을 개질하여 정제가 훨씬 용이하도록 단백질의 용해도를 증가시킬 수도 있다.
(다-3) 발현된 유전자 생성물의 확인 및 정제
외부유전자 삽입물을 가진 발현 벡터를 다음의 세가지 일반적인 접근방법으로 확인한다. 즉:(1) 외부 삽입유전자와 동족인 결합서열로 된 탐침을 사용한 DNA-DNA 잡종형성; (2) "표지물" 유전자 기능의 존재여부(예:항생제에 대한 내성, 형질전환표현형, 티미딘키나아제 활성등); (3) 유전자 생성물의 물리적 면역학적 또는 기능적인 특성에 입각한 삽입된 결합서열의 발현 PBOMP 유전자를 발현하는 재조합물이 일단 확인되면 유전자 생성물을 분석해야 한다. 면역학적 분석은 특히 중요한데 그 이유는 궁극적인 목표는 백신 조제물중에서 이러한 생성물을 발현하고/또는 진단학적 면역검정의 항원으로 발현하는 재조합 바이러스나 유전자 생성물을 사용하는 것이기 때문이다. 여러가지 항혈청을 사용해서 다가 항혈청과 모노클로날항체를 비롯한 생성물의 면역학적 활성을 분석한다.
본 발명의 단백질과 펩티드를 확인하자면 PBOMP 관련 단백질 또는 펩티드가 PBOMP 또는 그 유사체와 유도체에 대하여 나타나는 여러가지 항체에 면역학적인 활성이 있어야 한다.
단백질 또는 펩티드는 전체 PBOMP 유전자 결합서열, 유전자 결합서열의 일부 발현시에 또는 융합 단백질 제조시에 결찰되는 두가지 이상의 유전자 결합서열의 발현 여부에 따라 면역학적으로 활성이어야 한다. 이러한 반응은 방사면역침전법, 방사면역경합법, ELISA 등과 같은 표준 면역학적 기법에 의해 입증할 수 있다.
인플루엔자균의 PBOMP 관련 단백질이 일단 확인되면 크로마토그래피(예:이온교환, 친화력 및 사이징칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 자동용해도 기타 단백질 정제용의 표준기법을 포함하는 표준방법으로 분리정제한다.
또다른 방법으로서는 재조합물에 의해 생성된 면역활성의 인플루엔자균의 PBOMP 관련 단백질이 일단 확인되면 재조합물에 함유된 키메라성 유전자의 뉴클레오티드 결합서열로부터 면역활성인 단백질의 아미노산 결합서열을 추측할 수 있다.
결과적으로 공지의 표준화학적인 방법으로 단백질을 합성할 수 있다(Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111 참조).
본 발명의 특수한 실시태양에 있어서 재조합 DNA 기법에 의하던 화학적인 합성법에 의해 제조된 펩티드 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 무반응 변화에 생기는 결합서열내의 잔기와 치환되는 변경된 결합서열을 포함하는 제11도 및/또는 제15도에 예시된 바와 같은 아미노산 결합서열 전부 또는 일부를 포함한다. 예컨데 결합서열내의 한가지 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성을 가진 다른 아미노산으로 치환되어 결과적으로 고요한 변화가 일어나게 되는 것이다.
결합서열내의 아미노산의 치환기는 아미노산이 속하는 부류의 기타 요소중에서 선택된다.
예컨데 무극성(소수성) 아미노산은 글리신, 알라닌, 류우신, 이소류우신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 극성의 중성 아미노산으로는 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민이 있다. 양하전을 띤(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 라이신 및 히드티딘이 있다. 음하전을 띤(산성) 아미노산으로는 아스파르트산과 글루탐산이 있다.
(라) PBOMP 유전자의 뉴클레오티드 결합서열
PBOMP 유전자를 함유하는 DNA 단편들이 일단 확인되면 DNA 결합서열 분석에 의해 이들 유전자의 실질적인 뉴클레오티드 결합서열을 확인한다. 염기쌍의 서열은 Maxam과 Gilbert의 방법(Maxam and Gilbert, 1980, kMethods in Enzymology, 65:49)에 의하던지 디데옥시법(dideoxy method)(Sanger et al., 1977, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 74:5463)에 의하여 결정한다.
PBOMP 유전자의 실질적인 개시 및 종료신호는 오프리딩 프레임에 대한 뉴클레오티드 결합서열 분석방법(Rosenberg et al., 1979, Ann. Rev. Genet. 13:319)에 따라 확인한다. 만일 특수한 DNA 단편에 있어서 한가지 이상의 오픈리딩 프레임에 발견되면 유전자 생성물의 예측된 아미노산 결합서열과 PBOMP의 아미노산 결합서열을비교해서 실질적인 유전자의 확인을 할 수 있다. 유전자 융향을 이용하여 적당한 리딩프레임의 위치로 결정할 수 있다.
(마) PBOMP의 면역효능 측정
b형 인플루엔자균의 캡슐형 다당류, 즉 PRP에 대한 항체에서 겪은 경험에서보면 생체의 시험에서 항체가 박테리아를 죽일 수 있는 능력과 동물의 모형계에서 b형 인플루엔자균에 대한 보호능력은 유아들에 있어서 보호적인 면역응답 능력과 밀접한 관계가 있다. 본 발명의 PBOMP 단백질과 펩티드에 응답해서 나타나는 앤티-PBOMP 항체를 생체의 시험계와 동물 모델계를 사용해서 시험해보므로써 Hi와 Hib 세포를 줄일 수 있는 능력과 동물 모델계가 Hib에 감염되지 않게 할 수 있는 능력을 증명할 수 있다. 이들 계에서 얻은 결과를보면 PBOMP 각각이 보호성의 면역응답을 나타내고 유아, 어린이 및 성인용 백신에서 기능을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
인플루엔자균에 대해 PRP와 지방다당류(LPS)의 박테리아 활성을 측정하는데 이전부터 사용되어온 생체의 보조매개체에 의한 박테리아 검정계(Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297-304:Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38)를 사용하여 특수한 PBOMP 펩티드 또는 이것의 단편에 대한 항체가 b형 인플루엔자와 무형의 인플루엔자에 대해 박테리아 활성이 있는지의 여부를 결정할 수 있었다. 이들 검정방법을 두가지종류의 박테리아에서 나온 상대적으로 다수의 임상 분리물에 대해 실시하여 광범위한 범위의 균주를 줄일 수 있음을 확인할 수 있다. PBOMP가 보호성 항체 응답을 할 수 있는 능력에 관한 데이터는 간난쥐의 뇌막염 모델계를 사용하여(Smith et al., 1973, Infect. Immun. 8:278-290) 얻을 수 있다. 태어난지 6일째 되기전의 어린쥐에 b형 인플루엔자를 적당량 투여한 결과 인간의 유아들에게서 볼 수 있는 것과 유사한 균혈증과 치명적인 뇌막염이 나타났다. 공격균주에 대해 박테리아성인 항체를 사용해서 간난쥐를 수동면역시킨다음 균주를 사용하면 뇌막염과 사망을 하지 않는다. 혈액 기호성 b형 세균인 PRP용 백신에 대한 항체는 간난쥐 모델계에 있어서는 보호성이 있다. 혈액기호성 b형 세균에 의한 뇌막염에 대해 수동적으로 감염되지 않게 하자면 쥐의 폴리클로날 앤티-PBOMP 항체로 간난쥐를 면역화한 다음 b형 인플루엔자균을 치사량 투여하여 증명할 수 있다.
Hi에 대해 특수한 PBOMP의 항체가 감염되지 않도록 하는데 대한 데이터는 친칠라의 중이염 모델계를 사용해서 얻을 수 있다(Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52:572-78). 이러한 동물계에 있어서 친칠라의 속귀구멍을 Hi로 접종시킨다. 사람에서 볼 수 있는 것과 같은 중이염이 발생한다. Hi OMP에 대한 항체로 수동 또는 능동 면역된 친칠라는 Hi 감염이 되지 않는다. 이러한 동물 모델계를 사용하여 PBOMP에 대한 항체가 Hi 감염이 되지 않는 능력을 입증할 수 있다. 간난쥐 모델을 이용하여 앤티-PBOMP 항체가 앤티-PRP 항체와 더불어 추가적으로 감염이 되지 않음을 증명할 수 있다. 간난쥐를 그 이상 더 Hib 감염으로부터 보호할 수 없게되는 점까지 희석하고 앤티-PRP 항체 희석물과 혼합된 앤티-PBOMP 항체로부터의 추가로 감염방지 현상이 나타나기 때문에 간난쥐가 사망하지 않는다. 이러한 추가적인 감염방지현상은 PRP로된 효능된 백신조합물, 이들의 단편 또는 접합물 및 PBOMP나 이들의 단편에 대해서 유용한 것이다.
(바) 백신 조제
여러가지 방법을 사용하여 인간이나 동물에게 아래에 나온 백신 조제물을 도입한다. 이들 백신은 피내(皮內), 근육내, 복강내, 정맥내, 코속 및 피하경로를 통해 투여한다.
(바-1) 소단위 백신 조제물
본 발명의 한가지 목적은 PBOMP-1, PBOMP-2 및 관련된 단백질과 펩티드를 포함해서 인플루엔자균의 외막단백질 PBOMP와 관련되고 인플루엔자균 감염에 의한 뇌막염과 기타 질환을 예방하는 소단위 백신중의 면역원으로 사용되는 단백질과 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 소단위 백신은 주로 숙주를 면역화하는 면역성 물질로 되어 있다. 유전공학적으로 생산된 면역원, 화학적으로 합성된 면역원 및/또는 분리된 순수한 인플루엔자균의 PBOMP로 된 면역원으로된 백신은 보호성 면역응답을 하는 것으로서 수용체가 감염될 위험이 전혀 없기 때문에 특히 유용하다. 따라서 이들의 PBOMP 관련 단백질이나 단편들을 PBOMP 에피토우프를 발현하는 조환형으로부터 정제한다. 이러한 조환형에 속하는 것으로는 이제까지 나온 박테리아 형질전환체, 효모 형질전환체 또는 PBOMP 에피토우프를 발현하는 조환형 바이러스로 감염된 배양세포등이 있다. 또다른 방법으로는 PBOMP 관련 단백질 또는 펩티드를 화학적으로 합성하는 것이다. 이러한 목적으로 발현을 하게하는 유전자의 뉴클레오티드 결합서열로부터 이러한 단백질 또는 펩티드의 아미노산 결합서열을 추측할 수 있다.
또다른 방법으로서는 인플루엔자균 배양물로부터 PBOMP 관련 단백질 또는 펩티드를 거의 순수한 형태로 분리한다. 면역원을 조환형으로부터 정제하거나 화학적으로 합성하던간에 최종 생성물을 적당한 농도까지 조절하고 적당한 백신 보조제를 가해 조제한다. 적당한 보조제로는 계면활성물질[예:헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N-비스(2-히드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올], 폴리아민류[예:피란, 덱스트란술페이트, 폴리IC, 폴리아크릴산, 카르보폴], 펩티드류[예:무라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 투프트신], 기름에멀젼 및 무기겔류[예:수산화알루미늄, 인산알루미늄]이 있다.
면역원을 리포솜에 결합시키던지 다당류 및/또는 기타 중합체에 접합시켜 백신조제용으로 사용한다.
본 발명의 또다른 실시태양에 있어서 PBOMP 관련 단백질 또는 펩티드 불완전항원(hapten) 즉 동원(童原)항체와는 특징적으로 또는 선택적으로 반응하나 면역응답을 하지 않는다는점에서 면역학적이 아니라는 면에서는 항원성이 분자이다. 이 경우에 있어서 불완전 항원을 공유결합식으로 운반체나 면역원 분자에 결합한다. 예로서 단백질 혈청 알부민같은 거대한 단백질은 이것에 결합된 불완전 항체에 면역성을 부여한다. 불완전 항원 운반체를 만들어 소단위 백신으로 사용한다.
(바-2) 바이러스성 백신 조제물
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자균에 의한 뇌막염과 기타 질병의 감염 예방에 사용되는 살아있는 조환형 바이러스성 백신 또는 비활성의 조환형 바이러스성 백신을 제공함에 있다.
이러한 목적으로 PBOMP 관련 에피토우프를 발현하는 조환형 바이러스를 제조한다. 조환형 바이러스가 면역될 숙주에게는 전염성이지만 질병을 일으키지 않는때는 활성백신이 바람직한데 그 이유는 숙주에 있어서 번식이 일어나면 장기간 자극을 주게되고 따라서 거의 지속적인 면역을 부여하게 된다. 감염성 조환형 바이러스가 숙주에게 도입되면 키메라성 유전자로부터 PBOMP 관련 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 발현하게 되고 따라서 인플루엔자 항원에 대해 면역응답을 유발하게 된다. 이러한 면역응답이 인플루엔자균 감염이 되지 않도록 하는 경우에 있어서 활성 조환형 바이러스 자체를 인프룰엔자균 감염이 되지 않게 하는 예방 백신중에 넣어 사용한다. 이러한 조환형 바이러스 제조에 있어서는 생체외(예:조직배양세포)와 생체내(예:자연 숙주동물)등의 계를 포함한다. 예를 들자면 종래의 천연두 백신제조 방법을 PBOMP 관련 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 활성 조환형 바이러스백신 제조시에 적용한다. 인플루엔자균 PBOMP 에피토우프 이외에 질병을 유발하는 생체의 에피토우프를 발현하는 단일 또는 수가지의 전염성 조환형 바이러스로부터 다가의 활성 바이러스 백신을 제조한다. 예를 들자면 우두 바이러스를 사용하여 인플루엔자균 PBOMP의 것들 이외에 기타-에피토우프에 대한 코우딩 결합서열을 함유하게 한다.
이러한 조환형 바이러스자체를 다가 백신의 면역원으로 사용할 수 있다. 또다른 방법으로서는 각각이 상이한 PBOMP의 에피토우프 및/또는 기타 질병을 일으키는 에피토우프에 대한 인코우드하는 상이한 유전자를 각각 발현하는 우두 또는 기타 바이러스 혼합물을 다가백신에 사용한다. 조환형 바이러스가 면역이될 숙주에 대해 감염성이던 아니던간에 비활성 바이러스 백신을 만든다. 비활성 백신이란 보통 화학적 처리(예:포름알데히드에 의해 감염성이 파괴되어버린다는 의미에서 "죽었다"는 뜻이다. 이상적으로는 바이러스의 감염성은 바이러스의 면역성을 전달하는 단백질에 영향을 줌이 없이 파괴되는 것이다. 이상적으로는 바이러스의 감염성은 바이러스의 면역성을 전달하는 단백질에 영향을 줌이 없이 파괴되는 것이다. 비활성 배신을 제조하자면 PBOMP 관련 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 다량의 조환형 바이러스를 배양시켜 필요한 량의 항원을 만든다. 상이한 에피토우프를 발현하는 비활성 바이러스의 혼합물을 사용하여 "다가"백신을 만든다.
어떤 경우에 있어서 이들 "다가" 비활성 백신은 함께 투여된 활성 바이러스의 상흔 간섭으로 인해 제기되는 어려움 때문에 활성 백신 보다 바람직한 것이다. 어느 경우에 있어서도 비활성의 조환형 바이러스 또는 바이러스 혼합물을 적당한 보조제중에서 만들어 항원에 대한 면역학적 응답을 크게한다. 적당한 보조제로는 계면활성물질[예:헥사데실아민,옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N-비스(2-히드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올], 폴리아민류(예:피란, 덱스트란 술페이트, 폴리IC, 폴리아크릴산, 카르보폴), 펩티드류(예:무라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 투프트신), 기름에멀젼 및 무기겔(예:수산화알루미늄, 인산알루미늄등)이 있다.
(바-3) 수동면역 및 항유전형 항체
바이러스 백신이나 소단위백신으로 능동 면역화하는 대신 인플루엔자균의 에피토우프에 대해 미리 생성시킨 항체를 숙주에게 투여하므로써 단기간의 감염 예방이 되게할 수 있다. 따라서 백신 조제물을 사용해서 수동면역치료용의 항체를 생산할 수 있다. 이종성 면역글로블린은 외부면역원 성분에 대해 면역응답을 유발하기 때문에 인간의 면역글로블린이 인간의 의약에 있어서 바람직하다. 이러한 수동 면역화를 비상수단으로 사용해서 박테리아성 뇌막염 환자에게 노출되는 어린이들을 즉시 감염되지 않게 보호할 수 있다. 또다른 방법으로는 이들 항체를 항유전형 항체 제조에 사용하고 다시 인플루엔자 PBOMP 에피토우프에 대한 면역응답을 촉진시키는 항원으로 사용할 수 있다.
(사) 진단검정
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자균으로 감염된 것으로 추측되는 개체의 각종 체액중에 있는 PBOMP 항원(및 인플루엔자균)을 탐지하는데 있어 진단검정용 시약을 제공함에 있다.
(사-1) 면역학적 검정
한가지 실시태양에 있어서 본 발명의 PBOMP 관련 단백질과 펩티드를 혈액, 척수액, 타액을 비롯한 여러 환자의 조직과 체액중에서 인플루엔자균을 검출하기 위한 면역학적 검정에 있어 항원으로 사용한다. 본 발명의 항원을 방사면역학적검정, ELISA 검정, "샌드위치" 검정, 침전반응, 겔확산 침전반응, 면역확산검정, 응집반응검정, 형광면역학적 검정, 단백질 A 면역학적 검정 및 면역학적 전기이동검정등을 비롯하여 공지의 면역학적 검정 시스템에 사용한다.
(사-2) 핵신 잡종형성 검정
또다른 실시태양에 있어서 본 발명의 PBOMP 관련 단백질과 펩티드를 인코우드하는 유전자의 새로운 뉴클레오티드 결합서열을 혈액, 척수액, 타액등을 비롯한 환자의 여러가지 체액중에 있는 인플루엔자균의 검출을 위한 핵산 잡종형성 검정법의 탐침으로 이용한다. 본 발명의 뉴클레오티드 결합서열을 서어던 블랏(Southern blots:Southern, et al., 1975, J. Mol. Biol. 98:508), 노오던 블랏(Northern blots:Thomas et al., 1980, Proc, Nat'l Acad. Sci. USA 77:5201-05), 콜로니 블랏(colony blots:Grunstein et al., 1975, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72:3961-65)등의 방법을 비롯해서 공지의 헥산 잡종형성 검정계통에 사용한다. 본 발명을 실시예에 따라 설명한다.
1-1. PBOMP의 분리, 정제 및 분석
일련의 실험에서 기타세포벽 성분이 없는 PBOMP-1을 다음과 같이 인플루엔자균으로부터 얻었다. 헤민 10μg/ml과 NAD(BHI-XV) 1μg/ml을 함유하는 뇌심장 침출매체 또는 mMIC(Herriott et al의 변경, 1970, J. Bacteriol. 101:513-16) 매체중에서 하루밤동안 인플루엔자균 Edgan을 성장시키고 4℃에서 15분간 10,000×g에서 원심분리한 후 상청액을 살균체(Rocal Ⅱ)속으로 부어 넣었다. 세포 펠릿의 중량을 달고 세포의 습유냥의약 5배 정도되는 량과 동일한 체적의 완충액이 있는 10mM HEPES-NaOH(pH 7.4), 1mM EDTA중에 현탁시켰다. 세포현탁액을 아이스 바드중에서 100ml 분취액주아에서 음파처리장치[Branson Model 350 sonifier cell disruptor(Branson Sonic Power, Danbury, CT)]주아에서 펄스세팅 60% 출력에서 5분간 음파파쇄한 다음 파괴된 세포현탁액을 4℃에서 5분간 10,000×g에서 원심분리하여 파괴되지 않은 세포를 제거했다. 파괴되지 않은 침강된 세포의 중량을 달고 파괴되지 않은 세포의 습윤중량의 약 5배 정도되는 량과 동일한 체적인 10mM HEFED-NaOH pH7.4 1mM EDTA 중에서 앞서와 마찬가지로 다시 음파파쇄시켰다. 충분한 량의 NaCl을 첨가하여 최종농도가 0.5M NaCl되게하고 파괴된 세포물질을 100,000×g에서 약 1시간 초원심분리한 다음 전체막 분획물을 펠렛 상태로 얻었다.
10mM HEPES-NaOH, pH 7.4주아에서 1% 사르코실로 전체 막분획물을 반복해서 추출하여 전체막 분획물로부터 내부막 성분을 제거함으로써 외막 세포벽 착물을 얻었다. 외막 세포벽 분획을 함유한 불용성 잔류물을 350,000×g에서 30분간 원심분리한 후 50mM Tris pH 8.0, 5mM EDTA 중에 현탁시켜 4℃에서 하루밤 두었다. 옥틸글루코시드로 외막세포벽 분획물을 2회순차로 추출하고 다시 사르코실로 2회 추출하므로서 외막 분획물중에 있는 기타 단백질의 잔여부분으로부터 PBOMP-1 세포벽 착물을 분리했다.
50mM Tris, 5mM EDTA, pH 8.0중에서 1%(W/V)의 농도의 두가지 세척제를 사용했다. 실온(20℃)에서 각각 30분간 추출을 실시한 후 혼합물을 100,000×g에서 1시간 원심분리했다. 옥틸글루코시드와 사르코실로 추출하고 난뒤 잔류하는 불용성의 침강된 물질은 PBOMP-1 세포벽 착물이다. 두가지 방법으로 PBOMP-1을 용해시켰다. 즉 (1) 몇가지 세척주 한갖 세척제 존재하에 60℃에서 1시간 가열하던지, (2) 세척제 존재 또는 부존재하에 37℃에서 1시간 리소자임 소화처리에 의해 세포벽을 파괴했다. (1)의 방법이나 (2)의 방법을 실시한 후 15℃에서 100,000×g에서 1시간 원심분리해서 가용성의 PBOMP-1을 불용성 물질로부터 분리했다. 실제로 시험에 사용된 세척제(데옥시콜레이트, Triton X-100, Tween-80, CHAPS, CHAPSO, 도데실말토시드, 양성세척제 3-14 및 양성세척제 3-16을 포함)는 모두가 리소자임에 의한 용해처리는 물론이고 가열에 의한 용해처리에 효과가 있다. 더우기 옥틸글루코시드는 리소자임에 의해 가용화에 극히 효과적이고 최종농도 1%(W/V)선에서 정규적으로 사용했다. 습윤 세포증량이 40G인 것으로부터 기타 세포벽 성분이 거의 없는 PBOMP-1 약 8mg을 분리할 수 있었다. 이 순수한 PBOMP-1 조제물을 SDS-PAGE 시스템중에서 분석하여 이 단백질의 변질된 형태의 상대적인 분자량을 구하여 그 순도를 평가했다(제1도).
이들을 0.1M Tris-HCl, pH7.0, 25mM 디티오트레이톨로 처리하고 5배량의 진한 시료완충액이 있는 2% SDS로 처리한 다음 100℃에서 5분간 가열했다. 전기이동 처리하기전에 모든 시료를 6%(W/V) 슈크로오즈와 0.001% 브로모페놀 블루로 조절했다. 바이오-라드미드 프론테안 겔 시스템(Bio-Rad Mini Protoan Gel System)을 사용해서 대부분의 정규적인 분석을 하였다. 겔의 두께는 1.5mm였고 분리용 겔은 아크릴아미드와 비스의 비율이 30:0.8이고 0.375M Tris-HCl(pH 8.8)과 SDS 0.1%가 있는 아크릴아미드를 15% 함유하고 있었다. 적재용 겔중에는 아크릴아미드와 비스의 비율이 동일하고 125mM Tris-HCl(pH7.0) 및 겔당 SDS가 0.1%인 아크릴아미드 4.8%을 함유하고 있었다.
전기 이동후에 겔을 에탄올:아세트산:물(5:1:5)중에서 쿠우마시블루 0.125%(W/V)로 적어도 1시간 염색하고나서 동일한 용매중에서 블루염료없이 탈색하였다. 미리 염색된 저분자량의 표준물에는 다음의 것들을 함유하고 있었다:난 단백 43,000; 알파키모트립시노겐 25,700; 베타락토글로블린 18,400; 리소자임 14,300; 소의 트립신 억제제 6,200; 인슐린(A사슬과 B사슬) 2,300 및 3,400(BRL, Bethesda, MD)이 표준물을 사용해서 PBOMP-1의 상대적인 분자량을 측정했다. 이온 교환 크로마토그래피, 분자체, 소수성 또는 역상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 겔 전기이동 등과 같은 표준방법을 써서 PBOMP-1를 더 한층 정제한다.
(1-1-1) 아미노산 조성과 결합서열에 의한 PBOMP-1의 특성화
심프손등의 방법에 따라 아미노산 분석을 했다(Simpson et al., 1976, J. Biol. Chem. 251:1936-1940). 두꺼운 벽으로 밀봉된 유리관 중에서 감압하에 4N 술폰산 0.1ml중에서 100℃에서 22시간 단백질 0.5-1mg을 가열하여 가수분해시켰다. 지지량의 표준 아미노산을 사용하여 얻은 면적과 여러가지 피이크의 면적을 비교해서 각 아미노산의 량을 얻었다. 얻은 결과는 표 1에 나와 있다.
[표 1]
PBOMP-1의 아미노산 조성a
Figure kpo00001
Figure kpo00002
*PBOMP-1의 겉보기 분자량을 15,057의 돌턴이다. 아미노산 잔기의 총수는 140이다.
Deman 화학을 이용해서 PBOMP-1의 결합서열을 확인하고자 한 초기의 시도는 차단된 N-말단 잔기로 인해 만족스런 결과를 얻는데 실패했다. 부분적인 아미노산 결합서열 정보를 얻고자 단백질 분해효소를 사용해서 16,000돌턴 분자량의 PBOMP를 효소에 의해 소화시켜 결합서열 분석에 따르는 펩티드 단편을 얻을 필요가 있었다. 트립신을 사용해서 얻은 16,000돌턴 PBOMP-1을 27℃에서 1시간 단백질분해에 의한 소화물을 C18 칼럼을 이용한 역상 고압 액체 가스크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분리하였다. 커다란 소수성 펩티드 피이크(T9)를 분리하여 폴리브렌이 코우팅된 유리섬유 위에서 부동화시킨 다음 아미노산 결합서열 분석을 했다. Edman 분해법(Edman et al., 1967, Eur. J. Rinchan, 1:80-91)을 사용해서 T9 펩티드의 결합서열을 분석했다.
분석장치에서 나온 각 사이클에 의해 아닐리노티아졸리논 페닐티오히단토인(PTH)-아미노산을 발생시켰다. 액체 크로마토그라피계통으로 역상 C18 HPLC 카트리지 칼럼에서 분석을 하였다. 소디움 아세테이트-아세토니트릴 구배를 이용해서 실온에서 PTH를 용해해서 가변 UV 파장 검출기로 270나노메터에서 검출했다. T9 펩티드의 결합서열 분석결과는 다음과 같다:
Tyr-Asn-Thr-Val-Tyr-Phe-Gly-Phe-Asp-Lys-Tyr-Asp-Ile-
Thr-Gly-Phe-Tyr-Val-Thr-Ile -Asp-Ala-Asp-Ala-Tyr-Leu-
Asn-Ala-Thr-Pro-Ala-Ala.
T9 펩티드는 8개의 방향족 아미노산(5개의 Tyr과 3개의 Phe)과 5개의 지방족 측쇄 아미노산(1개의 Leu, Val, 2개의 Ile)을 가진 극히 소수성인 것이다. 이 펩티드의 티로신 함량은 크지만 PBOMP-1의 전체 아미노산 조성과 일치하고 있다(표 1). 더우기 PBOMP-1은 13개의 티로신을 함유하지만 메티오닌이나 트립토판은 없다는 점에서 특히이다.
(1-1-2) 지방산 분석에 의한 PBOMP-1의 특성화
(1-1-1)에서 나온 바와 같이 Edman 분해법에 의한 PBOMP-1의 결합서열을 확인코자 하는 초기의 시도에서는 차단된 N-말단 잔기로 인해 만족스런 결과를 얻지 못했다. 정제된 인플루엔자 PBOMP-1에 대한 지방산 분석을 실시하여 PBOMP-1 펩티드에 대해서 공유결합식으로 결합된 지방 아실그룹을 확인할 수 있는지를 조사하였다. 지방산 분석을 하기전에 (1-1)에서 분리된 PBOMP-1 단백질을 유기용매 혼합물, 즉 클로로포름:메탄올(2:1)로 그리고 데옥시콜레이트 세척제로 계속해서 추출하여 내인성(內因性)지질, 인지질등 미량의 오염성분을 제거하였다. 아세톤 침전법 또는 완전투석법으로 삭박된 단백질을 얻어 동결건조시켰다. 지지량의 노나데카노산을 내부표준으로 하여 건조되고 정제된 PBOMP-1(1-3mg)에 첨가해서 혼합물을 4N-HCl 200μl로 110℃에서 4시간 질소분위기에서 가수분해하였다. 이러한 산가수분해에 의하여 아미드-또는 에스테르-결합 지방산이 방출되었다. 가수분해물을 물을 가해 2ml되게 묽게하고 동일체적의 핵산으로 3회 추출했다. 핵산상(相)을 한데 모아서 동일체적의 염수로 2회 세척한 후 황산나트륨위에서 건조시켰다. 디아조메탄을 사용해서 지방산을 상응한 메틸에스테르로 전환시킨 다음(Schlenk, 1960, Anal. Chem 32:142-1414) Perkin Elmer Model 8500 가스 액체 크로마토그래피속으로 주입하였다. SPB-1 용융실리카 모세관 칼럼(Supelco, Inc., Belefonte, PA)에서 지방산 메틸 에스테르를 분리했다. 제16도에 있는 바와 같이 세가지 주요 지방산 즉 라우르산(C16), 팔미트산(C16) 및 팔미트산유도체(C16')가 PBOMP-1과 관련을 가지고 있다. C16'은 탄소원자수가 16개인 측쇄달린 지방산이다.
(1-2) 앤티-PBOMP-1 항체 제조
(1-2-1) 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈철 제조
순수한 PBOMP-1을 항원으로 사용하여 앤티-PBOMP-1 항체를 제조하였다. 부분 정제된 PBOMP-1이 풍부한 분획물(1-1에서 제조된 것)을 10℃에서 35mA의 일정전류에서 15% SDS-PAGE겔에 대해 전기이동 처리했다. 단백질 밴드를 고정시키고 (1-1-1)에 나온 바에 따라 염색했다. PBOMP-1 밴드를 겔에서 분리하여 인산염 완충염수(PBS)(인산나트륨 20mM, NaCl 150mM, pH7.4)에 대해서 평형이 될때까지 투석처리했다. PBOMP-1을 함유한 아크릴아미드겔 단편을 PSB중의 25게이지 침속을 통과시켰다. 단편들을 뉴질랜드산 백색토끼에 여러개소에서 근육내로 주사하였다. 각 토끼는 전부 약 20μg의 PBOMP-1을 수용하였다. 초기면역화후 1주일되는 때에 이 동물들의 피를 뽑아 혈청을 수집했다. 아크릴아미드중에서 PBOMP-1 20μg을 가한 것으로 동물들은 격월마다 접종하여 앤티-PBOMP-1 항체의 역가를 크게 유지시켰다.
또 다른방법으로서는 (가)에서 분리한 PBOMP-1을 불완전한 보조제(Freund's adjuvant)와 혼합하여 에멀젼화하였다. 보조제중에 PBOMP-1 약 2μg을 가한 것으로 토끼에다 근육내 주사를 했다. 초기면역후 2주 및 3주되는 때에 동물을 다시 면역시키고 최종 면역후 1주일 되는 때에 피를 뽑았다.
(1-2-2) 앤티-PBOMP-1 모노클로날 항체 제조
쥐(mouse)의 골수종 세포계통 X63.Ag8.6543을 다음과 같이 인플렌자균에 대해 면역화된 C57/B1 쥐에서 얻은 비장세포와 융합시켜 PBOMP-1에 대해 항체를 배출하는 하이브리도마 세포계통을 얻었다. 암컷쥐 C57/B1에 2개월에 걸쳐 인플루엔자균주 S2 세포 1×106을 4회 복강내 주사하고 3개월 경과후 (1-2-1)에서처럼 SDS-PAGE 밴드에서 분리된 거의 순수한 PBOMP-1로 쥐를 면역화했다. 다시 1개월후 S2에서 얻은 전체 외막을 정맥주사했다. 관행적인 기본 방법에 따라 정맥주사한지 4일째 되는날 세포융합을 실시했다(예:Gefter et al., 1977, Somat. Cell. Genet 3:231-36).
항원으로서 인플루엔자 외막 단백질을 사용하여 표준 ELISA에 따라 하이브리도마 세포배양 상청액을 스크리닝했다. 4℃에서 OMP로 하루밤 코우팅한 96개의 폴리스티렌 플레이트에서 검정을 실시했다. 각 플레이트를 40mM Tris(pH 8.0), 150mM Nacl, 5% 비지방 분유(BLOTTO)(1-4-4 참조)로 블록킹하고 PBS/0.1%/Tween-20중에서 1:10으로 희석된 배양물의 상청액을 첨가하고 25℃에서 60분간 배양한 후 앞서처럼 세척했다. 알칼리성 포스파타아제-코우트(phosphatase-Goat) F(ab) 앤티-마우스(IgG,IgM)과 알칼리성 포스파타아제 기질을 사용하여 결합된 항체를 검출했다. 정제된 PBOMP-1, 대장균 OMP, S2 지방다당류(LPS)를 써서 도트블랏분석법(dot blot analysis)으로 양성의 상청액을 스크리닝했다. 희석도를 제한하여 필요로하는 하이브리도마를 다시 클로닝하고(McKearn, 1980, in Monoclonal Antibodies, Kennett, McKearn and Bechtol, eds., Plenum Press, P. 374) Hib OMP를 써서 웨스턴 블랏법으로 스크리닝했다. 선택된 하이브리도마를 Balb/c 마우스에 주사하여 표준방법으로 복수(復水)증가량을 점검했다(Brodeur et al., 1984, J. Immunol. Meth. 71:265-72).
(1-3) 앤티-PBOMP-1 항체와 대장균과의 반응성
앤티-PBOMP-1 항혈청의 반응성에 대한 웨스턴 블랏분석법을 (1-4-4)의 방법으로 실시했다. 2-메르캅토에탄올을 함유한 시료조제물 완충액중에 하룻밤 용해시킨 박테리아 배양물 10μl을 15% SDS-PAGE겔의 각 레인에다 가했다.전기이동 처리하고 니트로셀룰로오스로 전달한 다음 토끼의 폴리클로날 앤티-PBOMP-1의 1:250의 희석액으로 블랏들을 탐침조사했다. 고추냉이 퍼옥시다아제 접합 염소 앤티-토끼 IgG로 배양한 결과 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 혈액기호성세균중의 PBOMP-1이 확인되었고 대장균중에서는 18000돌턴의 단백질이 확인되었다(제2A도). PBOMP-1의 에피토우프가 대장균의 18000돌턴의 단백질과 서로 반응한다는 것을 확인코자 PBOMP-1에 대하여 생성된 모노클로날 항체를 스크리닝하여 대장균 단백질에 대한 반응성을 조사하였다. 스크린된 대부분의 모노클로날은 대장균과 반응하지 않았으나 모노클로날 G1-1에 속하는 혈액기호성 세균의 PBOMP-1 및 대장균에 있는 18000돌턴의 단백질과는 강력히 반응하였다(제2B도). 이 사실은 PBOMP-1에존재하는 최소한 한가지의 에피토우프는 대장균 단백질의 에피토우프와 반응함을 입증하는 것이다. 또한 이것으로부터 인플루엔자균 PBOMP-1에 대한 항혈청도 대장균 감염에 대한 예방효과가 있음을 알 수 있다.
(1-4) 조환형 플라스미드 제조의 일반적인 방법
(1-4-1) 제한 효소 소화조건
제한핵산 중간분해효소(restriction endonucleases)를 BRL(Bethesda, MD.), IBI(New Haven, Ct), New England Biolabs(Beverly, MA) 또는 US Biochemical Corporation(Cleveland, OH) 등으로부터 구입하였다.
DNA를 적당한 제한 완충액중에 현탁시키고 제한 핵산 중간분해효소를 첨가한 다음 적당한 시간동안 배양시켜 완전히 소화시키므로써 제한효소 소화처리를 했다. 1단위의 효소는 20μl의 총반응 혼합물중에서 1시간내에 파아지 람다 DNA 1.0μg을 완전히 소화시키는데 필요로 하는 량으로 정의된다. 각종 효소와 더불어 사용된 완충액은 다음과 같다:
Cla Ⅰ, Hpa Ⅰ, HpaⅡ 및 KpnⅠ소화에 사용된 저염(low salt)농도 완충액:10mM Tris(pH 8.0), 10mM MgCl2및 10mM 디티오트레이톨(DTT).
AluI, AvaI, EcoRⅡ, EcoRⅤ, HaeⅡ, HaeⅢ, HincⅢ, HindⅢ, PstⅠ, Sau3aⅠ, SphⅠ, SstⅠ, SstⅡ, TagⅠ 및 XhoⅠ 소화에 사용된 중간염(medium saalt) 농도 완충액:50mM Tris(pH 8.0), 10mM MgCl2, 50mM NaCl 및 10mM DTT.
BamHⅠ, EcoRⅠ, PvuⅠ, SalⅠ 및 XbaⅠ 소화에 사용된 고염(high salt) 농도 완충액:50mM Tris(pH 8.0), 10mM MgCl2, 150mM NaCl 및 10mM DTT.
SmaⅠ 소화에 사용된 완충액:10mM Tris(pH 8.0), 20mM KCl, 10mM MgCl2및 10mM DTT.
모든 제한 소화를 37℃에서 실시했으나 단 TagⅠ만은 60℃에서 실시했다.
(1-4-2) DNA 단편의 겔정제
제한효소 소화후에 크기가 여러가지인 DNA 단편을 50mM Tris-아세테이트 1mM EDTA 완충액 pH 7.8을 사용하는 저융점 아가로우즈(FMC LGT agarose)중에서 10볼트/cm의 겔전기 이동법으로 분리 정제했다. 회수되는 단편의 크기에 따라 아가로우즈의 농도는 0.8%-1.5%에서 변하였다. 에티듐 브로마이드 형광으로 DNA를 잘 보이게 하고 겔에서 절단하였다. 65℃에서 아가로우즈를 용융시키고, 0.65M NaCl, 10M Tris(pH 8.0), 1mM EDTA 4체적을 가해 혼합의 최종 농도가 0.5M NaCl되게 하고, 0.5mM NaCl, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA(충전완충액)로 평형화된 NACS 칼럼(BRL, Bethesda, MD)위에다 DNA를 채운 후 칼럼을 3-5체적의 완충액을 세척하고 2-3체적의 2M NaCl, 10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA를 사용하여 용이하므로서 DNA를 회수하였다. DNA 용리물을 증류수로 1:1로 묽게하고 3체적의 에탄올로 침전시켰다. 팰릿을 70% 에탄올로 세척하고 진공건조시킨 다음 EDTA 1mM을 함유한 10mM Tris-HCl 완충액(TE 완충액)중에서 다시 현탁시켰다.
(1-4-3) DNA 결찰
T4 DNA 리가아제를 사용하여 모두 결찰시켰다. T4 DNA를 BRL(Bethesda, MD), US Biochemicals(Cleveland, OH) 또는 Boehringer(Indianapolis, IN) 등으로부터 구입하였다. T4 DNA 리가아제 1단위(U)는 5'-DNA 말단 농도 0.12μM(300μg/ml)에서 20μl 체적의 리가아제 완충액중에서 16℃에서 30분이내에 박테리오파아지 람다 DNA의 HindⅢ 단편을 50% 결찰시키는데 필요로 하는 량으로 정의된다. DNA 결찰은 50mM Tris(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM 아데노신 트리포스페이트로된 리가아제 완충액중에서 실시했다. 정상적으로 DNA 농도범위가 20-30μg/ml이고 벡터대 인서어트(insert)의 몰비가 1:1인 것을 사용했다. 반응 체적 20μl당 1U의 비율로 T4 DNA 리가아제를 첨가했다. 배양시간은 18-24시간이었고 응집성 말단 결찰의 경우 온도는 15℃였고 뭉뚱한 말단 결찰의 경우 온도는 22℃였다. 물질이 충분하다면 아가로우즈겔 전기이동법으로 반응혼합물의 일부를 분석해서 결찰정도를 확인한다.
(1-4-4) 단백질 면역학적 블랏분석법(웨스턴 블랏법)
특정용도에 따라 여러가지 방법으로 니트로셀룰로오스 판에다 단백질을 고정시키고 면역학적 블랏분석(immuno blot analysis)를 실시했다. 멸균된 직경 8.1cm의 니트로셀룰로오스 디스크를 직경 10cm의 파아지 역가 플레이트 위에다 살짝 두어 한천판으로부터 파아지 플라크(Plaque)를 옮겼다. 판을 완전히 축축하게 하고 멸균된 바늘로 필터속으로 펀칭해서 위치를 표시해 놓고 2분후에 필터를 들어 내었다. 니트로셀룰로오스판으로 세균 콜로니를 옮기고 영양한천위에 판(콜로니쪽은 위로 보게함)을 4-6시간 두어 콜로니를 생장시킨 다음 판을 클로로포름 증기에 30분간 노출시켜 콜로니를 용해시키므로서 콜로니 블랏(Colony blot)을 실시했다. 분석될 단백질 혼합물을 함유하는 SDS-PAGE겔을 니트로셀룰로오스판위에 두고 수평전기이동 장치(Hoeffer Transphor apparatus)에서 25mM Tris 0.38M 글리신 pH 8.8 완충액에서 0.5A에서 14시간 처리하여 단백질 겔 이동을 실시하였다. 단백질 이동이 끝나면 50mM Tris(pH 8.0), 15mM NaCl, 5% 비지방분유(BLOTTO)중에 37℃에서 1시간 필터를 침지하였다. 단 콜로니 블랏의 경우는 제외한다. 콜로니 블랏을 하고나면 1mg/ml 리소자임을 함유하는 BLOTTO중에서 4℃에서 하루밤 필터를 침지하여 세포단편을 소화시킨 다음 37℃에서 BLOTTO중에서 3시간 적당한 희석도(시행착오법으로 결정)에서 1차 항체 탐침으로 필터를 흡수시키고 BLOTTO로 15분간 세척하고나서 37℃에서 고추냉이 퍼옥시다아제 접합 2차 항체(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)로 흡수시켰다가 BLOTTO로 15분간 3회 세척했다. 필터를 50mM Tris(pH 7.0), 150mM NaCl, 0.01% 과산화수소 4-클로로-1-나프톤(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 가해서된 0.06% 용액을 첨가한다. 20분 이내에 청색이 나타나지 않으면 반응은 잘안된 것으로 본다. 필터를 증류수로 옮겨 반응을 정지시키고 건조시킨다.
(1-4-5) 유전자 융합
Manoli와 Beckwith의 방법(1985, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:8129-8133)에 따라 PBOMP 단백질 또는 이것의 펩티드를 인코우드하는 유전자 또는 유전자 단편을 알칼리성 포스파타아제(PhoA)를 인코우드하는 유전자 같은 또다른 유전자에 융합시켰다. 촉진유전자와 막전달 신호 결합서열이 결핍되고 알칼리성 포스파나아제 유전자를 함유하는 트랜스포존(transposon)Tn5 (TnPhoA)의 유도체를 가지며 천연 PhoA의 결실(deletion)을 함유하는 대장균 균주속으로 조환형 플라스미드를 도입하였다. 따라서 활성의 알칼리성 포스파티아제 효소를 제조하자면 막전달 신호 펩티드를 가지는 활성적으로 전사된 유전자속으로 PhoA 유전자가 프레임에서 융합되어 들어갈 수 있게 TnPhoA의 위치를 바꾸어 주어야 한다. 이러한 위치변화는 40μg/kml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(XP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)중에 세포를 두면 검지된다. 이러한 염료존재하에서 활성의 알칼리성 포스파타아제 효소를 생성하는 콜로니는 진한청색을 나타내지만 활성의 알칼리성 포스파타아제가 결핍된 콜로니는 백색을 띄게된다.
(1-4-6) DNA 필터잡종형성분석(서어던블랏)
서어던의 방법에 따라(Southern, 1975, J. Mol Biol. 98:508) DNA 필터 잡종형성 분석을 하였다. 필터 잡종형성에 의해 분석되는 DNA를 적당한 제한 핵산중간분해효소로 소화한 후 90mM Tris-붕산염, 8mM EDTA 완충액을 사용하는 0.8% 아가로우즈(Seakem Portland, ME)중에서 10볼트/cm의 조건에서 아가로우즈겔 전기이동법으로 분리했다. 겔을 1.5M NaCl/0.5M NaOH중에 1시간 침지하여 겔속의 DNA를 변성시켜 1.5M NaCl/1.0M Tris HCl중에 1시간 침지하여 중화하였다. 변성된 DNA를 블랏팅(blotting)하여 니트로셀룰로오스 필터페이퍼로 옮겼다. DNA를 옮긴후 필터를 6×SSC(NaCl 175.5g과 Na 시트레이트 88.2g을 함유하는 20×SSC 스톡크에서 희석시켜 제조)로 세척하고 공기중에서 건조시켰다. 80℃에서 2시간 감압하에 열처리하여 DNA 단편들을 필터에 고정시켰다. Rigby 등의 방법(1977, J. Mol. Biol., 113:237-244)에 따라 상성(相性)전이에 의해 DNA 잡종형성 탐침을 제조했다. 탐침용 DNA(1-2μg)를 상성전이 완충액(50mM Tris HCL, pH 7.4, 10mM MgSo4, 10mM DTT, 5μg/ml 소혈청 알부민, dGTP, dCTP 및 dTTP 각 20μm) 100μ중에 용해하였다. 이 반응 혼합물에다 알파 p-dATP(Amersham, 2-3000Ci/mmole), 100μCi, 데옥시리보뉴클레아제 Ⅰ(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1.0ng 및 대장균 DNA 폴리머라아제 Ⅰ(Boehringer) 10U를 첨가하고 15℃에서 45분간 배양했다. EDTA 50mM을 첨가하고 65℃에서 10분 가열하여 효소를 비활성화하므로서 반응을 정지시켰다. 3체적의 에탄올을 첨가하여 표지된 DNA를 침전시키고나서 0.3M 암모늄 아세테이트(NH OAc) 50μl에 다시 현탁시켰다. 시료를 0.3M NH4OAc로 평형화된 1ml 바이올겔 p-50 스핀칼럼에 넣고 500×g에서 5분간 원심분리하였다. 칼럼을 0.3M NH4OAc 100로 세척하고 용리물을 모아서 3체적의 에탄올로 침지시켰다. 표지된 DNA 펠릿을 진공건조시키고 TE 완충액중에서 재현탁시켰다가 세렌코프 스케터링(Cherenkov Scattering)에 의해 Beckman(LS9000) 섬광계수기로 방사능 결합을 측정했다. 잡종형성의 경우 DNA가 있는 필터를 6×SSC로 습윤시키고 6×SSC/0.5% SDS/5×Denhardt's 용액/100μg/ml tRNA로 68℃에서 2시간 예비 잡종형성시켜 필터의 과잉결합능력을 폐쇄시켰다(1×Denhardt's 용액은 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소혈청 알부민을 물에 가해서된 용액이다). 0.01M EDTA과 5-10,000,000CPM(Cherenkov) 표지된 탐침을 가해서된 동일한 완충용액중에서 잡종형성반응을 실시했다. 탐침용액을 90℃에서 10분간 가열한 후 DNA 가닥을 변성시키고 68℃로 냉각해서 68℃에서 18-24시간 필터를 배양했다. 잡종형성 후 필터를 68℃에서 0.1×SSC/0.5% SDS로 세척하여 특징이 없는 탐침을 제거했다. 사용된 조건하에서 DNA 상동물(相同物) 90% 이상은 DNA 탐침에 양성결합을 나타내었다. 필터를 공기건조하고 Dupont CRONEX "Lightning Plus" 증감 스크린을 사용하여 -70℃에서 Kodak XAR 필름에 노출시켰다.
(1-5) 인플루엔자균의 PBOMP 유전자 클로닝
PBOMP 유전자 클로닝용의 인플루엔자균의 염색체 DNA 공급원은 b-Eagan 균주로부터 얻은 DNA에 의해 b+형으로 형질전환된 Hi의 캡슐화되지 않은 Rd 균주의 유도체인 인플루엔자균 KW20b(HiKW20b)이거나(Moxon et al, 1984, Clin. Invest. 73:298-306) Hib Eagan의 자발적 캡슐 돌연변이체인 인플루엔자균 S2(HiS2)이었다.
파아지람다 라이브러리를 생성하기 위해 Hi로부터 얻은 염색체 DNA를 전단변형시켜 약 15000염기쌍(bp)의 평균길이로 되게 하고 T4 DNA 폴리머라아제로 처리하여 말단이 무디게 하며 EcoRⅠ DNA 메틸라아제로 변경시킨 다음 합성 EcoR Ⅰ링커에다 결찰시키고 조환형 람다 파아지 벡터 샤론 4(Charon 4)가 되게 클로닝한다. 플라스미드 라이브러리를 생성코자 Sau3A로 HIS2의 염색체 DNA를 부분적으로 분열시키고 여기서 얻은 3-8킬로베이스(kb)의 길이의 제한단편들을 분리해서 BamHⅠ 제한 위치에서 플라스미드벡터 pGD103에다 결찰한다. 이 플라스미드는 pLG339의 유도체(제3도 참조/Stoker et al., 1982, Gene 18:335-41) 세포당 6-8복사가 된다. 여기에는 또한 플라스미드 pUC8에서 얻는 폴리링커 영역과 lac Z-알파 펩티드가 있기 때문에 적당한 대장균 균주(예:JM83)로 형질전환될 경우 lac 표현형의 손실에 대해 스크리닝하므로써 조환형 플라스미드를 선택할 수 있다. 적당한 배양에서 클로닝되면 대장균이 불량하게 발현된 클로닝된 유전자는 강력하게 조절된 lac 촉진유전자의 통제하에 있게 된다. 조환형 플라스미드를 함유한 대장균을 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청의 혼합물을 사용해서 스크리닝하여 PBOMP를 제조했다.
(1-5-1) Hi 플라스미드 라이브러리 구성
PBOMP-1 단백질이 발현되지 않거나 람다 파아지와 화합성이 없을 가능성이 있다. 이것을 시험해 보기 위해 HiS2의 플라스미드 염색체 라이브러리를 구성했다. 복사량이 큰 플라스미드에 대장균 OMP 유전자를 클로닝한 결과독성이 있음이 밝혀졌다(예:Beck et al., 1980, Nucleic Acid Res. 8:3011-3024). 이러한 문제를 피하기 위해 복사수가 작은 플라스미드 pGD103을 사용했다(제3도). HiS2에서 얻은 염색체 DNA를 제한 핵산중간 분해효소 Sau3A(BRL, Bethesda, MD)로 부분적으로 소화처리했다. 5ml의 제한 완충액중에서 50단위의 Sau3A를 써서 37℃에서 1시간 500μg의 DNA를 소화처리했다.
Ceckman SW28 로우터에서 10mM Tris(pH 8.0), 1mM EDTA, 1M NaCl을 함유하는 10-40% 슈크로오스 구배에서 140,000×g로 24시간 속도침강법으로 단편들을 분리했다. 20ml을 수거하여 분취물을 아가로우즈 겔 전기이동법을 분석했다. 길이가 3-8kb인 제한 단편들을 함유하는 분획물을 모아서 TE 완충액에서 농축했다.
플라스미드 pGD103 DNA를 BamHⅠ 핵산 중간 분해효소로 소화시키고 알칼리성 포스파타아제(Boehringer, Indianapolis, IN)(1단위/μg DNA, 37℃×30분, 제한완충액중에서)로 처리했다. 페놀추출 및 에탄올 침전에 의해 반응혼합물로부터 DNA를 정제하고 TE 완충제속에 다시 현탁시켰다. BamHⅠ과 Sau3A 제한효소는 응집성의 말단을 형성하기 때문에 결찰하기전에는 DNA를 더 처리할 필요는 없었다. 각 약 25μg씩의 HiS2-Sau3A 소화된 DNA와 pGD103/BamHⅠ/CAP 소화된 DNA를 25U의 T4-리가아제(Boehringer, Indianapolis, IN)를 함유하는 500ml의 결찰용 완충액중에서 혼합하고 15℃에서 18시간 배양했다. 반응혼합물 20μl를 분취해서 아가로우즈겔 전기이동법으로 분석하여 결찰반응이 일어났음을 증명했다(출발물질을 인접레인에서 시동시켰다). 결찰 혼합물을 대장균 JM83으로 형질전환시키고(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.250) LB-육즙중에서 37℃에서 1시간 배양하고 50μg/ml의 카나마이신 술페이트(Sigma Chemical Co., St. Louis,MO)와 40μg/ml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토피라노시드(X-gal, BRL Bethesda, MD)를 함유하는 LB-한천판 위에서 도말처리한 후 37℃에서 24시간 배양했다. 발현된 카나마이신 내성(KamR)콜로니의 약 50%는 백갯(lac-)이었는데, 이것은 pGD103의 lac 영역에 있는BamHⅠ속으로 S2 DNA가 삽입되었음을 나타내는 것이다(lac+비조환형은 청색임). 10가지의 백색 콜로니를 무작위로 선택하여 증폭시켜 본 결과 벡터 BamHⅠ위치에 삽입이 되어 있고 pGD103보다 큰 4-8kb의 플라스미드가 함유되어 있음이 나타났다.
1525개의 백색 콜로니를 선택하여 각기 증폭시켜 18% 멸균 글리세롤을 함유하는 LB 육즙중에서 -70℃에서 접지중에 동결시켜 저장했다.
(1-5-2) HIB 람다 유전자 뱅크 구성
Hi KW20b에서 얻는 고분자량의 염색체 DNA를 농도가 200μg/ml인 TE 완충액중에 현탁시키고 25게이지 바늘속을 통과시켜 전단변형시키므로서 평균길이가 1500bp되게 하였다. 50mM Tris(pH 8.8), 10mM MgCl2, 20mM(NH)2SO4, 10mM DTT, 50μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP중에서 37℃에서 20분간 T4 DNA 폴리머라아제로 처리하여 돌출하는 말단을 제거한 다음 10mM Tris(pH 8.0), 10mM EDTA, 0.1mM S-아데노실-메틸오닌중에서 37℃에서 3시간 EcoRⅠ DNA 메틸라아제(1U/μg DNA)(BRL Bethesda, MD)를 써서 DNA를 변경시켰다. 반응혼합물로부터 DNA 1μg을 뽑아내서 변경되지 않는 람다 DNA 1μg과 혼합하고 염농도가 큰제한완충액 20μl중에서 EcoRⅠ 5단위를 써서 37℃에서 1시간 소화시키므로서 DNA의 메틸화를 확인하였다. 이들 조건하에서 변경(modified)된 Hi DNA는 소화되지 않은 반면 첨가된 람다 DNA는 완전히 소화되었다. 20μg의 변형된 Hi DNA를 T4 DNA 리가아제(5U)를 사용하는 반응혼합물 100μl중에서 화학적으로 합성된 EcoRⅠ 링커(BRL Bethesda, MD) 1μg에다 결찰시켰다. 18시간 후 60℃에서 20분 가열하여 반응을 정지시키고 NaCl을 첨가해서 최종농도가 150mM 되게 한 다음 혼합물을 EcoRⅠ 10U를 써서 6시간 소화시켰다. 변형된 Hi DNA와 링커를 분열된 링커로부터 아가로우즈겔 전기이동법으로 분리시켰다.
제조된 Hi DNA를 람다 Charon 4 DNA의 좌·우 EcoRⅠ 단편들과 1:1:1의 몰비에서 혼합하고 T4 DNA폴리머라아제와 18시간 동안 결찰시켰다. 생체의 포장반응을 이용하여 결찰된 DNA 혼합물을 포장하여 람다 파아지 입자로 만들었다. H2O 4μl에 결찰된 DNA 5μg을 가해서 된 용액을 7μl의 20mM Tris(pH 8), 10mM 2-메르캅토에탄올(2-ME), 3mM MgCl2, 1μl의 10mM Tris, pH 7.5, 1mM 스페르미딘(spermidine), 2mM 푸트레신(putrescine), 10mM MgCl2, 1.5mM ATP, 5mM 2ME 및 5μl의 대장균 BHB2690(-1 imm 434, CIt3, b2.red3, Eam 15, Sam7) 세포용해산물의 음파추출물(Hohn et al., 1977, Proc, Nat'l Acad. Sci. 74:3259)에다 첨가했다. 반응혼합물을 22℃에서 1시간 배양하고 3M-5M CsCl[10mM Tris(pH 7.5), 10mM Mgcl2, 0.02% 젤라틴(TMG 완충액)] 단계구배에서 Beckman SW50.1 로우터중에서 250,000×g에서 4시간 원심분리하여 포장된 파아지를 분리했다. 파아지를 계면으로부터 제거하여 TMG에 대해 투석하였다. 이렇게 해서 제조한 파아지의 역가측정을 한 결과 Hi 게놈의 25-30,000개의 독립클로운(independent clone)의 라이브러리가 생성되었음을 알 수 있었다. 이 파아지 라이브러리를 파아지숙주로서 대장균 KH802를 사용해서 평판증폭을 시켜 10-9플라크형성단위(PFU)/ml를 가진 5ml을 얻었다.
(1-6) PBOMP 유전자분리
(1-6-1) PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체와 반응하는 단백질을 인코우드하는 PBOMP 유전자 분리 LB-카나마이신(50μg/ml) 한천위에 있는 니트로셀룰로오스판에다 Hi 플라스미드 라이브러리를 옮기고 37℃에서 24시간 성장시킨다음 PBOMP-1에 대한 다섯가지 비경합성 모노클로날항체 혼합물을 탐침으로 사용하여 콜로니 블랏법에 의해 분석했다. 혼합된 모노클로날 탐침에 대해 반응을 한 클로운을 분리해서 플라스미드 pAA152로 지정했다. 제4도를 보면 벡터 pGD103속에 4.2kb Hi DNA 인서어트(insert)를 가진 pAA152의 리스티릭션 맵이 나와 있다. 웨스턴 블랏분석법에 의할 것 같으면 폴리클로날 앤티-PBOMP-1로 확인되며 또한 합쳐진 모노클로날 항체 탐침들에 의해서도 확인된 16000돌턴의 단백질을 클로운 pAA152가 발현하고 있음이 입증되었다. 이어서 콜로운 pAA152는 초기 푸울(pool)에 사용된 각각의 모노클로날항체에 의해 확인된 단백질을 생성하였음이 확인되고 있다(제5도).
pAA152의 Sau3A 인서어트는 인서어트의 한쪽 말단에 폴리링커영역의 BamHⅠ 위치를 재생하고 있음이 확인되었다. 이러한 BamHⅠ으로부터 Hi DNA의 독특한 BalⅡ 위치쪽이나 독특한 XbaⅠ위치쪽으로의 결실로 인해 웨스턴 블랏에서 검출된 PBOMP 발현을 유지하였다(제4도). 이들 결과로부터 결론을 지울 수 있는 것은 이러한 PBOMP를 인코우드하는 유전자는 pAA152의 Hi DNA 인서어트내의 BalⅡ-BamHⅠ737 염기쌍 단편내에 존재한다는 점이다. pAA152를 함유하는 소세포(minicell)를 분석해 본 결과(CHTMAN ET AL., 1979, Proc Nat'l Acad. Sci. USA 76:4837-41) 클로닝된 Hi DNA는 두가지의 단백질, 즉 16000돌턴 분자량과 40,000돌턴 분자량의 단백질을 인코우드한다는 점이다(제6도). JM83(pAA152)의 웨스턴 블랏의 결과를 보면 PBOMP-1에 대해 발생된 모든 모노클로날 항체는 16000돌턴 단백질과 반응한다는 것이다. 40,000돌턴 분자량 영역내에서는 교차반응이 나타나지 않는다.
(1-6-2) 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청과 반응하는 단백질을 인코우드하는 PBOMP 유전자 분리
(1-5-1)에서 제조한 증폭된 파아지 라이브러리를 TMG 1ml중에 가해 1-2000PFU가 되게 희석한 후 대장균 KH802(2×109cell/ml) 50μl을 첨가하고 혼합물을 37℃에서 20분 배양한 다음 NZYCM 배지[10g NZ 아민 A, 50g NaCL, 2.0g, MgSO4·7H2O, 5g 효소추출물, 1g 카사미노산(casamino acid(per liter)]를 함유하는 한천판위의 연질한천 3ml로 평판배양했다. 판을 하루밤 배양하고 4℃에서 30-60분 유지한 뒤 플라크를 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 필터를 (1-4-4)에 나온 방법대로 폴리클로날 앤티-PBOMP-1로 탐침조사했다. 이런 방법으로 몇가지 양성 플라크를 검출하였다. 그러나 PBOMP-1 모노클로날 항체를 탐침으로 사용했을때 양성 플라크는 전혀 검출되지 않았다. 판으로부터 양성 플라크를 떼어내서 대장균 KH802에서 성장시켜 증폭하였다. 파아지 세포용해산물에 대한 SDS-PAGE/웨스턴 블랏분석법으로 클로운을 검정하였다. 모든 양성 클로운은 PBOMP-1에 대한 폴리클로날 항체와 반응을 하는 겉보기 분자량이 16000돌턴인 단백질을 발현하였다. 이 단백질은 Charon 4파아지의 대조(control) 세포용해산물중에는 존재하지 않았다. 마찬가지 실험에서 양성 클로운에서 얻는 세포용해산물은 PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체와는 반응하지 않았다.
한가지 양성 파아지인 람다 16-3을 선택하여 다시 더 분석을 하였다. 이 파아지 분리물을 NZYCM 배양육즙내의 대장균 KH802중에서 생장시켜 증폭하고 20% 폴리에틸렌 글리콜 6000을 써서 침전시켜 회수한 다음 세슘클로라이드 평형기울기(TMG중 4M CsCl, Bekman SW50.1로우터, 300,000×g에서 24시간)로 밴딩(banding)하였다. 0.1% SDS와 20μg/ml 단백질분해효소 K(proteinase K)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 55℃에서 1시간 처리한 다음 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시키므로써 파아지 DNA를 분리했다.
람다 16-3 DNA를 EoRⅠ로 소화시켜 Hi 염색체 인서어트의 부분적인 물리도(physical mpa)을 얻었다. 인서어트의 EcoRⅠ단편을 분리하여 플라스미드 벡터 pGD103에다 서브클로닝(subcloning)했다. PBOMP-1 교차반응성 16000돌턴 단백질을 발현하는 단편을 가진 클로운을 세포용해산물에 대한 웨스턴블랏 전달분석법으로 확인하였다. 이들중 한가지를 pAA130이라 하였다. 제7도는 pGD103 플라스미드에다 클로닝된 Hi DNA로부터얻은 5.7kb 단편을 가지는 이 플라스미드의 리스트릭션 맵이다.
PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체는 pAA130으로부터 발현된 16000돌턴 단백질과는 반응하지 않았다. 이러한 조환형 플라스미드에 의해 발현된 단백질을 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 확인했다(예로서 제8도 참조).
PBOMP-1을 가진 소세포의 분석결과를 보면 클로닝된 Hib DNA는 겉보기 분자량이 16000돌턴 및 17000돌턴이나 되는 단백질을 코우딩한다는 것을 알 수 있다. 표지된 16000돌턴 단백질을 폴리클로날 앤티-PBOMP-1에 의해 특징적으로 면역학적 침전을 시켰다. 이와 같이하여 플라스미드 pAA130은 16000돌턴 분자량의 PBOMP를 발현하는 것이다.
폴리링커에서 인서어트의 독특한 PStⅠ 위치와 단일 PStⅠ 사이에 삽입된 DNA를 절개하여 생성시킨 내부결실(internal deletion)에 의해서도 교차반응성 단백질의 발현에 영향을 미치지 않았다. 이 플라스미드의 XbaⅠ 단편을 마찬가지 방법으로 삭제하여 PBOMP-교차반응성 단백질의 발현을 유지시켰다(제7도). 두가지 내부 BglⅡ 위치의 재결찰에 의해 이 플라스미드의 추가적인 결실유도체를 발생시켰고 이 유도체도 마찬가지로 PBOMP-교차반응성 단백질을 발현하였다.
저융점의 아가로우즈 겔로부터 단편을 분리해서 BstEⅡ-말단을 DNA 폴리머라아제 Ⅰ의 Klenow 단편으로 채워준 다음 단편을 pGD103의 HincⅡ 위치에다 클로닝하므로써 781염기쌍 BstEⅡ-XmnⅡ 단편을 로닝처리했다. 폴리클로날 앤티-PBOMP-1을 사용한 웨스턴 블랏분석결과를 보면 이 플라스미드는 16000돌턴 PBOMP의 발현을 유지하였다. pAA130의 경우처럼 이 플라스미드로부터 제조된 PBOMP는 PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체와는 반응하지 않았다.
이 PBOMP 유전자의 위치를 확인하는 한가지 독자적인 방법으로서 pAA130의 거대한 EcoRⅠ-PuvⅡ 단편을 pLG339의 EcoRⅠ-PuvⅡ 단편과 결찰시켜 신규의 테트라사이클린 내성의 플라스미드 pAA136을 생성시켰다. 이 플라스미드는 웨스턴 블랏법으로 확인해 본 결과 PBOMP를 발현시켰다. 이 플라스미드를 형질전환시켜 염색체 알칼리서 포스파타아제 유전자(phoA)가 결실되고 전위성 요소 ThPhoA의 세가지 독자적인 전위물을 분리하였다. pAA136의 HindⅢ, BstEⅡ, XmnⅠ 및 PstⅠ 위치와 TnphoA의 왼쪽 말단영역에 인접한 독특한 DraⅠ 제한위치를 이용하여 TnPhoA의 pAA136로의 삽입위치를 결정하였다. 세가지 모두가 pAA136의 BstEⅡ-XmnⅠ단편속에 삽입되었다. 세가지의 쐐 삽입은 모두가 같은 방향에 있었는데, 이것은 PBOMP 유전자의 전사방향은 pAA136에 있어서 BstEⅡ 위치로부터 SmnⅠ 위치쪽을 향한다는 것을 뜻하는 것이다. 모두 세가지의 TnPhoA 전위에 의해 웨스턴 블랏법으로 측정한 결과 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 검출된 16000돌턴 단백질이 상실되었다. 한편의 융합에서 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 검출되는 6000돌턴에서 웨스턴 블랏의 새로운 밴드(band)가 생겨났다. 이정도는 알칼리성 포스파타아제(45000돌턴 분자량)가 융합해서 16000돌턴 분자량 단백질이 될때 나타날 수 있는 융합단백질의 예측된 범위내에 속한다. 이들 전위물에 있어서의 PhoA 활성이 회복된다는 것은 PBOMP 단백질에는 막운반의 펩티드신호가 있다는 증거인데 그것은 바로 막 단백질이라는 증거이다.
TnPhoA와 Hi가 클로닝된 DNA 결합서열 사이의 접합점을 M13에다 서브클로닝하므로써 TnPho 융합의 서열을 확인하였다. 모든 경우에 있어서 PhoA 코우딩 결합서열이 pAA130의 PBOMP-2 유전자에 대한 예측된 오픈 리딩 프레임이 있는 구성을 하고 있음이 확인되었다(1-7-2참조).
1-7 PBOMP 유전자의 뉴클레오티드 결합서열측정
1-7-1 pAA152가 발현된 PBOMP 유전자의 결합서열 측정방법
pAA152가 발현된 PBOMP 유전자의 뉴클레오티드 결합서열은 M13게종, 즉 M13 mp18과 mp19의 단일가닥 파아지에다 서브콜로닝(subcloning)한 후 pAA152의 737bp BglⅡ-BamHi 단편의 디데옥시 뉴클레오티드의 결합서열을 측정하므로써(Sanger et al., 1978, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 74:5463-5467) 얻었다.
이들 서브콜로운(subclone)으로부터 측정된 결합서열의 위치와 방향은 제9도에 나와 있다. BalⅡ-BamHⅠ 단편의 완전한 뉴클레오티드 결합서열은 제10도에 나와있다.
pAA152의 737 BalⅡ-BamHⅠ 단편에는 153의 아미노산의 폴리펩티드를 코우딩하는 단일의 오픈 리딩프레임(ORF)가 있다(제11도). DNA 결합서열로부터 측정된 PBOMP 유전자의 아미노산 조성은 PBOMP-1 정제된 단백질의 아미노산 조성과 근접한 것이다(표 1과 2 참조).
[표 2]
성숙한 PBOMP-1과 PBOMP-2의 아미노산 조정
Figure kpo00003
*성숙한 PBOMP-1의 겉보기 분자량은 14,238 돌턴이고 아미노산 잔기의 수는 134이다.
**성숙한 PBOMP-2의 겉보기 분자량은 13,461이고 아미노산 잔기의 수는 136이다.
더욱이 PBOMP-1 유전자는 내부 펩티드 결합서열(AA 48-81)을 가지는데, 이 결합서열에 있어서 T9 펩티드 결합서열이 존재하지 않는 Leu-68 잔기에 대해 고려를 한다면 아미노산은 PBOMP-1의 T9 내부펩티드의 아미노산 결합서열과 정렬이 되어 있다. PBOMP-1의 아미노산 말단영역에는 기타 막운반 펩티드 결합서열과 유사성을 나타내는 아미노산 결합서열이 있다(Watson, 1984, Nucleic Acids Res. 12:5145-5164). 이들 데이터와 모노클로날 항체 결합 데이터로부터 결론지울 수 있는 것은 이 유전자가 PBOMP-1 단백질을 인코우드한다는 것이다.
(1-7-2) pAA130의 PBOMP 유전자 결합서열 측정방법
M13 mp18 및 mp19 파아지에다 서브클로닝한 후 pAA130의 789 염기쌍 BstEⅡ-XmnⅠ단편의 디데옥시 뉴클레오티드 결합서열을 측정하므로서(Sanger, et al., 앞서나온 자료) pAA130의 PBOMP 유전자의 뉴클레오티드 결합서열을 측정했다. 이들 조환형 파아지들을 각각 M18001 및 M19001로 하였다. 보편적인 17 염기 올리고뉴클레오티드 결합서열을 가진 프라이머(New England Biolabs)를 사용하여 BstEⅡ-XmnⅠ 단편의 양말단으로부터 결합서열을 측정했다(제13). 두가지의 올리고뉴클레오티드를 추가로 합성해서 디데옥시뉴클레오티드 결합서열 측정용 프라이머(M18PR1, M19PR2)로 사용했다. 기타 모든 결합서열 측정용 프라이머는 합성장치에서 제조했다(Praxis Biologics, Rochester, N.Y.사의 Applied Biosystems 380B. DNA synthesizer). 베타-시아노에틸 포스페이트 보호그룹화학에 기초를 두고 1μmole의 조절된 기공을 가진 유리칼럼에서 프라이머를 만들었다. 올리고뉴클레오티드의 수득율이 충분히 순수하였기 때문에 더 정제하지 않고 칼럼으로부터 나온 프라이머를 직접 사용하였다. 두가지 합성 올리고뉴클레오티드 플라이머는 제13도에 있는 단편의 양말단으로부터 약 200개의 뉴클레오티드를 가진 결합서열에 결합한다. pAA130의 BSTEⅡ-XmnⅠ 단편의전체 789bp DNA 결합서열은 제14에있다. ORF에는 제15도에서처럼 밑줄이 그어져 있다. 이와 같이 ORF는 154개의 아미노산으로 된 폴리펩티드를 인코우드한다. 아미노 말단 18 잔기 펩티드는 기타 단백질에 대해 측정된 막운반 신호 결합서열과 흡사하다. 더우기 pAA130에서 TnPhoA 융합물로부터 얻는 결합서열 데이터로부터 세가지 전위물 모두가 154개 아미노산으로 된 폴리펩티드의 리딩프레임속에 속해 있었다는 것이 입증되고 있다.
pAA130의 ORF의 DNA 결합서열로부터 추론한 바에 따라 제안된 성숙한 유전자 생성물의 아미노산 조성은 정제된 PBOMP-1의 아미노산 분석결과에서 측정된 것과는 상당한 차이가 있다(표 1과 2). pAA130의 PBOMP 유전자의 아미노산 결합서열을 정제된 PBOMP-1 단백질로부터 얻는 트립신 펩티드 T9의 것과 비교해 볼 때 아무런 큰 일치성을 발견할 수 없었다. 더우기 이 유전자에 의해 인코우드된 생성물이 폴리클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 확인된다 하더라도 PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체에 의해서는 확인되지 않는다. 이러한 관찰결과로부터 명백해 지는 것은 pAA130에 의하여 발현된 Hi유전자는 PBOMP-1에 대한 유전자가 아니라는 점이다. 따라서 pAA130에 의해 인코우드된 PBOMP-유전자를 PBOMP-2라 하였던 것이다.
1-8 조환형 대장균에 의해 발현된 PBOMP의 지방단백질로서의 특성화
(1-1-2)에서 나온 바와 같이, 인플루엔자균에서 분리된 PBOMP-1은 라우르산, 팔미트산 및 팔미트산의 유도체를 비롯해서 공유결합식으로 결합된 지방산을 가지고 있어서 세균성 지방단백질로 구분할 수 있다. 다음과 같은 실험을 하여 조환형 대장균에 의해 발형된 PBOMP가 지방단백질로 존재하고 있는지를 조사하였다. 두가지 상이한 생체내 방법을 사용하여 발현된 PBOMP의 지방단백질 특성을 알아보았다.
첫번째 실험에서 PBOMP를 발현하는 조환형 플라스미드를 함유하는 세포를 방사능으로 표지된 지방산중에서 배양했다. 이 조건하에서 공유결합식으로 결합된 지방산을 함유한 생성된 지방단백질은 어느 것이나 특징적으로 방사성표지가 된다.
PBOMP-1을 발현하는 플라스미드 pAA152 또는 PBOMP-2를 발현하는 플라스미드 pAA130을 함유한 대장균 JM83을 대장균 JM83을 50μCi/ml의 팔미트산을 함유한 M9-최소배지중에서 2시간 생장시켰다. 15% SDS-PAGE겔위에서 35mA 일정전류에서 세포용해산물(10,000 트리클로로아세트산 침전성 cpm/lane) 전부를 전기이동처리했다. 겔을 살리실산나트륨으로 함침시키고(5×겔체적×1M 용액, 20분간) 건조한 다음 -70℃에서 SAR-5필름(Eastman Kodak사 제품)에 노출시켰다.
마찬가지 방법으로 배양시킨 정상적인 대장균 JM83 세포의 세포용해산물 전부를 대조군으로 했다. 나타난 결과는 제17도에 있다. 제17도에 있다 싶이 약 15,000 돌턴정도되는 방사능 표지된 단백질을 pAA152와 pAA130을 각각 함유한 대장균의 세포용해산물중에서 관찰했는데, pAA130은 대조용 대장균세포의 용해산물에서의 관찰되지 않았다. 따라서조환형 대장균에 의해 발현된 PBOMP-1과 PBOMP-2는 특징적으로 방사능으로 표지된 것이다.
또다른 실험에서 PBOMP를 발현하는 조환형 플라스미드를 가진 세포를 글로보마이신 존재하에 배양시켰는데 이 글로보마이시는 지방 단백질 신호 펩티드의 억제에 의해 모든 공지의 세균성 지방단백질의 차단작용을 하는 항생제이다(Inukai et al., 1978, J. Antibiotics(Tokyo) 31:1203-1205).
pAA152나 pAA130을 함유하는 대장균 JM83을 25μg/ml의 글로보마이신 존재하에 1시간 배양했다. 글로보마이신으로 처리되지 않는 배양물을 대조군으로 사용했다. 세포용해산물 전부를 15% SDS-PAGE겔에서 전기이동 처리하고나서 니트로셀룰로오스로 옮겨 폴리크로날 앤티-PBOMP-1 항혈청을 사용하여 탐침조사했는데 그 결과는 제18도에 나와 있다.
제18도에서 입증된 것처럼 PBOMP-1 또는 PBOMP-2를 발현하는 글로보마이신 처리된 세포의 용해산물에 있어서 약 16,500 돌턴되는 밴드가 관찰되었는데 이것은 처리되지 않는 세포, 즉 대조군의 세포용해산물에서는 관찰되지 않았다.
이들 생체대 실험에서 얻는 결과로부터 알 수 있는 것은 PBOMP 유전자를 가진 조환형 대장균에 의해 발현된 PBOMP-1과 PBOMP-2는 지방단백질이라는 점이다.
[실시예 2]
PBOMP-1 소단위 백신의 효능
(2-1) PBOMP-1에 의해 유발된 항혈청의 항균력
(1-2)에서 제조한 앤티-PBOMP-1 폴리클로날 토끼의 생체외 보체 매개 살균성 검정시스템에 있어서의 Hib와 Hi살균력에 대해 관찰했다(Musher et al., 1983, Infet. Immun. 39:297-304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38). 검정시스템에 사용된 보체(補體)의 공급원은 첫젖이전의 갖난 소아지 혈청(PCCS) 또는 정상적인 토끼 혈청(NRS)인데, 이것들에 무형의 Hi 균주(S2)를 미리 흡수시켜 미리 존재하는 혈액기호성 세균항체를 제거하였다. PCCS는 희석하지 아니한 것을 사용하였고 NRS는 Hib의 경우에는 1:4의 희석도, 무형의 경우에는 1:8의 희석도에서 사용했다. 인산염 완충염수[20mM 인산염 완충액(pH 7.4), MgCl20.5mM을 함유하는 0.15M NaCl(PCM)]를 사용하여 희석물을 모두 만들었다. 세균균주를 BHI-XV에서 생장시켜 광학밀도 490mm에서 측정한 농도가 1×109cells/ml되게 하였다. 박테리아를 희석시켜 PCM 중에서 최종 농도가 1250cells/20μl되게 하였다. PCM중의 20μl의 적당한 항체희석물을 보체공급원 20μl와 24웰(well)의 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰중에 있는 얼음에서 혼합하였다. 마이크로타이터 플레이트를 얼음에서 제거하고 각 웰에다 희석된 시험세균 20μl을 첨가했다. 항체가 없는 웰을 음성대조군을 사용했다. 37℃에서 30분 배양한 후 56℃의 한천 0.75%를 함유한 BHI-XV 800μl을 각 웰에다 참가하고 실온에서 고화시켰다. 각 플레이트를 37℃에서 하루밤 배양한 다음날 조사하였다.
항혈청의 BC 역가를 무항체 대조용 웰에 비해 시험 셀균의 50%를 살균할 수 있는 최고희석도의 역수로 나타내었다.
앤티-PBOMP-2을 몇가지 Hib 임상용 및 실험실용 분리물에 대한 살균력을 시험하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
인플루엔자균의 실험용 및 임상용 균주에 대한 앤티-PBOMP-1 항혈청의 살균력
Figure kpo00004
a+=시험균주 50% 살균
b+/-=생존한 시험균주 약 50%
표 3에서 알수 있다 싶이 앤티-PBOMP-1 항체는 유형(有型)(예:a형, b형, c형) 및 무형(無型)의 인플루엔자균주의 임사용분리물 여러가지에 대해 살균력을 나타내고 있다. 112가지 Hib 임상용 분리물중 112가지가 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 살균되었다. 이들 균주를 미국 서남부 및 동북부와 카나다 서부에서 분리했다.
살균력이 앤티-LPS 항체의 결과였다는 가능성을 배제하기 위해 각 웰에서 면역원 제조시 사용된 Hib 균주로부터 얻은 LPS 200ng를 사용하여 살균력 검정을 실시했다. 그 결과는 표 4에 나와 있다.
[표 4]
LPS로 흡수시킨 항혈청의 살균력
Figure kpo00005
a 웰(Well)당 Hib Eagan LPS 200ng 사용하거나 0
b 50% 세균생존율을 나타내는 항혈청의 최고 희석도의 역수로 나타낸 것임.
LPS는 앤티-PRP의 역가를 두배, 그리고 Hi에 대한 앤티-PBOMP-1의 역가를 4배나 저하시켰고 그리고 Hib에 대한 앤티-PBOMP-1의 역가를 저하시키지 않았다. LPS는 앤티-PBOMP-1의 살균력을 감소시키기는 했으나 배제하지는 않았다. 관찰된 결과를 보면 이것은 앤티-PRP 살균력 역가감소에 나타난 바와 같이 LPS의 반대 보충활성의 결과인 것은 물론이다.
(2-2) 갖난쥐의 인플루엔자균의 감염예방
갖난쥐의 예방연구를 Smith 등의 방법(1973, Pediatrics 52:637-644)에 따라 실시했다. 갖난쥐(sprague-Dawley)를 PCM중에서 토끼 항혈청의 농도를 여러가지로 달리한 것 0.1ml을 생후 4일 되는 날 복강내 접종을 하므로써 수동면역시켰다. 면역한지 18시간 후 PCM 0.1ml중에 Hib 세포 104-106기를 가해서 만든 것을 쥐의 복강내에 투여했다. 세균접종된 쥐의 접종후 72시간 되는 때의 생존수로 감염예방결과를 나타내었는데 이들 실험 결과는 표 5에 있다.
[표 5]
갖난쥐의 앤티-PBOMP-1에 의한 예방
Figure kpo00006
표 5에 나온 결과로부터 갖난쥐들은 Hib를 치사량 투여해도 주동면역된 앤티-PBOMP-1 항체에 의하여 감염이 방지된다는 것을 알 수 있다. 추가로 임사용 Hib 균주를 갖난쥐의 뇌막염 감염균주로 사용한데 대해 앤티-PBOMP-1은 이종성(heterologcus) Hib 임상용 분리물에 대해 감염방지효과를나타내고 있다.
앤티-PBOMP-1이 앤티-PRP의 보호예방효과가 있는지 얻는 추가적인 효과가 있는지의 여부를 결정하기 위해서 갖난쥐를 보호예방효과 한계점을 초과하는 정도에는 앤티-PRP와 앤티-PBOMP-1로 수동면역시켰다. Hib를 투여하고 나서 항혈청은 소수의 경우를 제외하고는 큰 결과를 나타내고 있다(표 6). 표 6에 나온 결과로부터 앤티-PBOMP-1 항체와 앤티-PRP 항체는 상호간에 방해를 하지 않으며 갖난쥐의 뇌막염에 추가적인 보호예방효과를 줄 수 있다는 것을 알 수 있다.
[표 6]
앤티-PBOMP-1+앤티-PRP의 갖난쥐에 대한 연구
Figure kpo00007
Figure kpo00008
a PCM 중에서 희석시킨 폴리클로날 토끼 앤티-PBOMP-1
b 폴리클로날 토끼 앤티-PRP:CRM197접합체
c 세균접종후 72시간되는 때에 생존한 갖난쥐(Sprague-Dawley)의 수
(2-3) 성인에 있어서의 PBOMP-1의 면역유전성
성인남자 6명이 자원해서 (1-1)에서 나온 인플루엔자균에서 분리한 PBOMP-1(백반업이 PBOMP-1 5.2μg)으로된 백신 조제물을 1개월 간격을 두고 2회 예방접종했는데, 단 1면은 1회 예방접종했다. 최초의 예방접종하기 전과 접종 1개월 후가 되는 날 혈액시료를 채취했다. 인플루엔자균 PBOMP(ELISA), 디프테리아 변성독성(ELISA)에 대한 항체 역가를 측정해서 예방접종된 성인들의 특수한 항체응답을 평가했다(Engvall et al., 1972, J. Immunol. 109:129-135에 ELISA 검정방법에 관해 일반적인 것이 있으니 참조). 그리고 Hib PRP 다당류(Farr형 RIA)에 대해서도 마찬가지로 평가했다(Farr, 1958, J. Infect. Dis. 1033:239-262)에 Farr형 RIA이 있으니 참조). PBOMP-1 ELISA 검정법에서 얻은 결과는 제19도에 나와 있다.
제19도에 있다 싶이 6명중 3명은 PBOMP-1에 대한 항체 역가가 상당히 크게 상승했다. 디프테리아 변성독성 또는 Hib PRP에 특징적인 항체의 역가에서 심각한 변화는 관찰되지 않았기 때문에 이러한 항체역가상승은 면역원으로 사용된 PBOMP-1에 극히 특징적인 것이었다.
(2-4) 신호가 없는 PBOMP-1에 의해 유발된 항혈청의 살균력
(3-1)에서 나오는 pPX167를 함유하는 대장균 PR13에서 얻은 조환형의 신호없는 PBOMP-1(이후부터는 rPBOMP-1이라 한다)을 면역원으로 사용하여 백색 토끼(New Zealand산)을 면역시켰다. rPBOMP-1을 불완전 Freund 보조제(IFA:incomplete Fruend's adjuvant)중에서 에멀젼화하거나 수산화 알루미늄에 결합시켰다. 0.85% 염수중의 농도가 50μg/ml인 rPBOMP-1을 농도가 500μg/ml인 백반과 1:1 비율로 혼합하므로써 rPBOMP-1을 백반에다 결합시켰다. 이 혼합물을 37℃에서 3시간 진탕한 뒤 원심 분리하므로써 백반을 펠릿(pellet)화 하였다. 결합하지 않은 단백질에 대해서는 BCA 단백질 검정법(Pierce Chem. Co., Chicago, IL)에 의하여 상청액을 검정하였으나 아무것도 검출되지 않았다. 백반을 500μg/ml의 생리식염수중에 다시 현탁시켰다. IFA(Difco)중에서 rPBOMP-1을 1:1 비율로 에멀젼화했다. 4주 가격으로 동물을 두가지중 한가지 조제물 50μg으로 근육내에 투여하여 면역시켰다. 각각 면역처리하기 전과 0주 및 6주되는때 동물의 피를 채취했다.
여기서 얻은 앤티-rPBOMP 폴리클로날 토끼 항혈청을 (2-1)에 나온 생체의 보체 매개 살균력 검정계중에서 Hi 살균력에 대해 관찰했다. 1차 면역전, 0주 되는 때 및 2차 면역후 2주 되는 때, 6주 되는 때 항혈청을 시험하였다. 항혈청의 살균력을 인플루엔자균('자연 PBOMP-1")에서 분리한 PBOMP-1에 대해서 한 항혈청의 살균력과 비교하였다. 시험에 사용된 세균은 형(型)이 지정되지 않는 인플루엔자균주 S-2였고 시험결과는 표 7에 나와 있다.
[표 7]
rPBOMP-1에 대한 항혈청의 살균력a항혈청의 대상물
Figure kpo00009
a 시험용 생물:형이지정되지 않은 인플루엔자균 S-2
b 항혈청 제조에 애용된 면역화법에 대한 구체적인 것은 text에 나와 있음.
c 자연 PBOMP-1의 주사액에 대해 과도면역 항혈청제조
항혈청의 살균력 역가를 무항체 대조 웰(well)에 비해 시험세균의 50%를 살균할 수 있는 최고 희석도의 역수를 나타내었다.
두마리 토끼와 면역전에는 살균력이 낮았지만(1:5 및 1:10) 6주째 되는 때 채취한 혈청의 살균력은 상당히 증가하였다. IFA중에 가한 PBOMP-1로 면역시킨 토끼의 역가는 1:160였고 백반에 결합시킨 rPBOMP-1로 면역시킨 토끼의 역가는 1:80이었다.
자연 PBOMP-1의 주사액을 맞은 토끼의 과도면역항혈청(앤티-PBOMP-1 혈청)의 역가는 1:160이었다. 이들 결과로부터 명백히 알 수 있는 것은 rPBOMP-1은 혈액기호성 세균에 있는 자연 PBOMP-1를 인식하는 항체를 유발할 수 있는 살균력 검정력에 있어서 생물학적 활성이 있다는 점이다.
[실시예 3]
대장균에 있어서 PBOMP의 발현을 크게하는 신규의 플라스미드
(3-1) 대장균에 있어서 PBOMP-1의 향상된 발현
PBOMP-1 단백질은 자연촉진 유전자의 통제하에서 pAA152의 737bp BamHⅠ-Bg1Ⅱ 단편으로부터 발현된다. 결합서열 중에는 PBOMP-1 유전자의 개시 코돈(initiation codon)과 양호한 동감 리보솜 결합위치가 있다. 이 단편을 가진 플라스미드로서 대장균내에서 발현된 PBOMP-1은 웨스턴 블랏 분석법에 의하여 쉽사리 검출되었지만 생성된 단백질의 양은 세포단백질의 1% 이하, 즉 자연유전자를 가진 인플루엔자균 세포에서 만들어진 PBOMP-1의 양보다 작았다.
대장균에서 다량의 PBOMP-1을 생성시키기 위한 첫번째 시도로서 단백질의 생성량이 많다고 알려진 촉진유전자 lac가 람다의 통제하에 클로닝된 유전자를 두었다. 촉진유전자는 PBOMP-1 개시코돈의 윗쪽에 있는 BstNI 위치에 결합하였다(제4A도). 이 위치에서 분열이 일어나면 자연 PBOMP-1 촉진유전자를 제거하게 되나 리보솜 결합위치는 그대로 있게 된다. 이러한 구성을 다음과 같이 실시하였다.
우선, PBOMP-1 유전자를 가진 AA152의 739bp BamHⅠ-BglⅡ 단편을 플라스미드 pUC19의 lac 촉진유전자의 BamHⅠ위치에다 클로닝시켰다. 동일한 위치에서 lac 촉진유전자로서 PBOMP-1 유전자를 가진 하나의 클로운을 pPX160으로부터 PBOMP-1의 발현은 lac 조정하에서가 아닌 자연 촉진유전자의 조절하에 있었다. 분명히 이것은 PBOMP-1의 전이 개시코돈과 BalⅡ 위치사이에 있는 240bp의 전사 종료신호에 기인한 것이었다. 플라스미드 pPX160을 BstNI로 분할시켰는데, 이것은 유전자의 공간 전이 개시위치와 PBOMP-1 개시코돈 사이에서 분할하지만 코우팅 영역에 결합된 리보솜 결합위치는 그대로 둔다. 말단을 대장균 DNA 폴리머라아제 Ⅰ(Klenow 단편)로 채워지고 선형화된 플라스미드를 BamHⅠ로 분할했다. 촉진유전자가 없는 PBOMP-1 유전자를 가진 577bp BatNⅠ-Bg1Ⅱ을 HineⅡ와 BamHⅠ로 분할된 pUC19에다 결찰시켰다. 여기서 얻은 플라스미드 pPX166는 웨스턴 블랏법으로 확인해 본 결과 대장균 JM103에서 lac 촉진유전자의 조절하에서 PBOMP-1를 발현하였다.
대장균 JM103 또는 HB101 균주에 있는 lac나 PL촉진유전자로부터 PBOMP-1을 발현시켰을때 PBOMP-1의 발현정도가 낮았다. 성숙 PBOMP-1의 아미노말단의 20개의 아미노산에 결합하는 모노클로날 항체 G-204으로 이들 세포로부터 얻은 세포용해물을 웨스턴 블랏 분석해 본 결과 이 모노클로날 항체가 인식한 4000-5000 돌턴 단백질이 존재하고 있었다(제20도). 유발된 PL촉진유전자의 조절하에서 PBOMP-1을 발현하는 세포에 있어서 G-204 결합력의 90% 이상이 이 분해 생성물중에 있었는데, 이것은 대장균에서 정도가 크게 발현된 PBOMP-1이 불안정함을 뜻하는 것이다.
플라스미드 pPX160과 pPX166을 형질전환시켜 외부 단백질을 안정시킨다고 알려진 돌연변이체를 함유하는 몇가지 대장균을 얻었다. 이들에 속하는 것으로는 APT의 존성 단백분해효소(lon-) 돌연변이체, 열충격 감응성(htp) 돌연변이체 및 mRNA 안정성 돌연변이체(pnp)가 있다. 더우기 PBOMP-1을 지방단백질로 가지고 있으며 안정성을 크게 하기 때문에 주요한 천연 대장균 지방단백질이 무레인 지방단백질(lpp-)가 결핍된 대장균 균주속에다 플라스미드를 두었다. 시험에 사용된 모든 균주에 있어서 모노클로날 항체 G-204에 의해 인식된 PBOMP-1 파괴생성물은 거의 동일한 수준으로 존재하고 있었다. 따라서 대장균내에서 204에 의해 인식된 PBOMP-1 파괴생성물은 거의 동일한 수준으로 존재하고 있었다. 따라서 대장균내에서의 PBOMP-1의 파괴는 확인되지 않는 몇가지 다른 힘에 의한 것이라 생각할 수 있다.
두번째 접근방법으로는 유전자의 자연적인 신호 결합서열을 제거하여 변형된 PBOMP-1 유전자를 창출했다. 이러한 구성방법에서는 자연적인 PBOMP-1 단백질에 비하여 두가지 장점을 가지고 있다. 첫번째 장점은 신호가 없는 PBOMP-1이 막에 전달되지 못하기 때문에 PBOMP-1의 과다 발현으로 인한 독성효과는 훨씬 감소된다는것이다.
두번째 장점은 극히 소수성(hydrophobic)인 지질그룹으로는 변형이 되지 않기 때문에 신호가 없는 PBOMP-1는 용액중의 저장이나 분리를 위해 세척제를 사용할 필요가 없는 것이라는 점이다. 신호가 없는 형의 PBOMP-1의 구성에 대해서는 제거도에 나와 있다.
제거도에 있다 싶이 플라스미드 pPX160으로부터 얻는 PBOMP-1 유전자를 AluⅠ 제한 핵산중간 분해효소(restriction endnuclease)를 사용해서 코돈 19에서 분할했다. 여기서 생긴 단편을 pUC19 폴리링커 영역내의 SmaⅠ 제한위치에다 결찰하였다. 생성된 유전자는 아미노 말단에 있는 pUC19 폴리링커에서 나오는 추가의 18개 아미노산과 자연 PBOMP-1의 아미노산 결합서열 전부를 가지는 혼성 단백질을 발현하였다. 이 플라스미드 pPX167이라 하였다.
제21도에 있는 바와 같이 PBOMP-1을 발현하는 제2의 조환형 플라스미드는 폴리링커의 BamHⅠ 위치에서 분할하고 플라스미드 pINⅢ-ompA3의 BamHⅠ 위치에다 단편을 클로닝하므로서 플라스미드 pPX167로부터 유도하였다. 생성된 플라스미드 pPX168에는 아미노 말단에서 결합된 성숙된 PBOMP-1를 대장균 OMPA 단백질의 신호결합 서열에다 인코우드하는 잡종유전자를 가지고 있다. 이 잡종 생성물을 OMPA 신호 결합서열을 경유하여 약속을 통과시키면 지방단백질 변형이 결핍되고 아미노말단에 추가로 8개의 아미노산을 가진 성숙한 PBOMP-1 발생한다.
플라스미드 pPX167과 pPX168을 형질전환시켜 대장균 JM103을 얻고 조환형 PBOMP-1 합성시험에 사용했다. SDS-PAGE 웨스턴 블랏 분석법에 의하면 두가지 플라스미드는 폴리클로날 및 모노클로날 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 확인되는 단백질을 인코우드 하였음이 밝혀졌다. pPX167로부터 합성된 변형된 PBOMP-1은 이소프로필티오-베타-d-갈락토피라시드(IPTG)에 의해 유발되어 세포질속에 위치하여 세척제 없이도 용해하였다. 변형된 PBOMP-1은 IPTG 유발된 세포로부터 얻는 전세 세포용해물을 쿠우마씨 블로(Coomassie blue) 염색한 것에 의해서도 검출되지 않았으며 전체 세포단백질의 1% 이하였다. pPX168로부터 합성한 변형된 PBOMP-1는(잡종 lilac 촉진유전자 통제하에서) IPTG에 의해 유발되어 매체속으로 분리되어 들어가서 세척제 없이도 용해하였다. 완전히 유발되면 세포약 1-2mg의 수준으로 변형된 PBOMP-1을 생성하였다.
여러가지 대장균 균주에서 플라스미드 pPX167과 pPX168을 시험하여 여러가지 수준의 발현을 시켰다. 시험한 것중 가장 성공적인 조합은 mRNA 안정성 변이제 pnp을 함유하는 균주인 대장균 PR13으로 형질전환된 pPX167 키메라성 플라스미드이었다. 이 균주에 있어서 lac 유도후 전체 세포 단백질중 약 2-3% 정도수준에서 lac 촉진유전자의 통제하에 조환형 PBOMP-1 유전자의 아미노 말단에 융합된 다중 클로닝 결합서열과 lac 알파-펩티드로부터 오는 약 17개 정도의 아미노산을 가지는 세포질 융합단백질 형태로 발현한다.
(3-1-1) 신호없는 PBOMP-1의 정제 및 특성화
다음의 시험들을 실시하여 신호없는 PBOMP-1(이하 rPBOMP-1이라 함)을 정제하고 특성화했다.
세포질 추출물 분리
37℃에서 Luria 배양육즙 중에서 생장시킨 pPX167을 함유하는 대장균 PR13을 하루밤 배양시켜 얻는 배양물에서 얻은 세포를 8000rpm의 GSA 로우터 중에서 4℃에서 10분간 펠릿화했다. 펠릿은 1/10 체적의 10mM Tris-HCl(pH 7.5)중에서 세척하고 10μg/ml DNase와 10μg/ml RNase를 함유하는 1/100 체적의 10mM Tris(pH 7.5)중에 다시 현탁시켰다. 얼음위에서 40W에서 10분간 음파파쇄하던지 20,000psi에서 French 압력용기속을 3회 통과시키던지 하여 세포를 파괴했다. 파괴되지 않은 세포를 SS-34 로우터에서 4℃에서 10분간 10,000rpm으로 원심분리하여 제거했다. 60Ti 로우터에서 4℃에서 30분간 55,000rpm으로 원심분리하여 전체 세포막을 제거했다. 막을 버리고 상청액을 거두었다.
세포질 추출물의 DEAE 분별(Fractionation)
10mM Tris NaCl을 함유한 10mM Tris(pH 7.5)을 써서 결합된 rPBOMP-1과 기타 단백질을 단계적으로 용리했다. 이 완충액에 의해 용리된 모든 단백질을 한데 모아 60% 포화 황산암모늄으로 4℃에서 침전시키므로써 농축하였다. 원심분리하여 펠릿을 수거하고 10mM Tris(pH 7.5)중에 용해한 뒤 동일한 완충액에 대해 투석하여 잔존하는 황산암모늄을 제거했다.
RPBOMP-1의 역상 크로마토그래피
상청액을 함유하는 rPBOMP-1을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유한 dH2O의 완충액에서 희석한 다음 4.6×15mm C-4 역상 HPLC 칼럼속을 통과시켰다. 동일한 완충액을 사용하여 2ml/min의 유속으로 칼럼을 통과시켰다. 이런 조건하에서 대부분의 단백질이 칼럼에 결합했다. 0.1% TFA중의 0-95% 아세토니트릴 기울기고 20분간 단일 피이크로 결합된 rPBOMP-1을 용리했다. rPBOMP-1을 함유한 커다란 피이크(제22도의 피이크 1) 물질을 한데 모아 용매를증발시켜 농축하였다. 건조된 rPBOMP-1을 dH2O에 다시 용해했다.
플라스미드 pPX167을 함유하는 대장균 세포 PR13 세포로부터 얻은 역상용출액, DEAE 용출액 및 세포질 추출물에 대해 앞서와 마찬가지로 SDS-PAGE 처리를 했다. 전기이동 처리한 후 쿠우마씨 브릴리안트 블루염색으로 2시간 정도 겔을 염색처리했다. 모노클로날 항체 GD204를 이용하는 웨스턴 블랏분석을 하였다. 수득된 결과는 제23도 A와 B에 나와 있다.
제23A도에 있는 것처럼 쿠우마씨 염색으로 염색했을 경우 rPBOMP-1이 세포질 추출물속에 있었다. 세포질 추출물 제조시 세척제를 전혀 사용하지 않았기 때문에 결과를 보면 이들 세포로부터 얻은 rPBOMP-1은 세척제 없이도 10mM Tris-HCl(pH 7.5)에 가용성이라는 것을 알수 있다. 이것은 Hib 세포에서 지방단백질로서 얻은 PBOMP-1과는 상이함을 나타내는 것이다.
세포질 추출물을 이용한 예비실험에서 나타난 결과로부터 pPX167을 함유하는 대장균 PR13 세포에서 얻은 rPBOMP-1은 수용액중에서 그 자체와 또는 다른 세포질 단백질과의 착물로서 존재하고 있음을 알수 있다. 아크릴아미드-아가로우즈 중합체 또는 Sephadex 비이드를 사용한 겔여과 크로마토그래피를 이 rPBOMP-1에 대해 실시했을 때 겉보기 분자량이 100,000 돌턴이상인 rPBOMP-1이 용리되었다. DEAE-biogel A(Biorad Laboratories, Richmond, CA)를 사용하는 이온교환 크로마토그래피에서는 rPBOMP-1는 특정 염농도에서 단일 피이크로 용출하지 않았다. 10mM Tris(pH 7.5)중에서 약 20mM에서부터 75mM까지에 이르는 NaCl 농도범위에 걸쳐 rPBOMP-1이 용출되었다. 용출된 rPBOMP-1은 80mM NaCl 세척물중에 있는 여러가지 용출된 단백질중의 하나인 반면 상당수의 세포질 단백질은 80mM 이상의 염농도에서 칼럼에 결합된채로 있었다. 따라서 위에 나온 DEAE 크로마토그래피에 의하여 세포질 물질에서 발견되는 단백질의 수가 크게 줄어 들었으나(제23A도, 레인 2) 모노클로날 항체와 rPBOMP-1과의 반응성을 변화시키지는 않았다(제23B도, 레인2).
rPBOMP-1의 아미노산 결합서열로부터 비교적 소수성 단백질이어야 함을 알 수 있다. 세척제 없이도 세포질 추출물중에 용해하는 반면 rPBOMP-1은 대부분의 세포질 단백질보다 훨씬 소수성임을 기대할 수 있다. 따라서 rPBOMP-1을 함유하는 DEAE 용출액을 앞서 나온 바와 같이 C-4 소수성 상호작용 칼럼에서 크로마토그래피 처리하고 아세토니트릴의 증가 기울기를 써서 용출하였다. 이 계에 있어서 소수성이 큰 단백질이 보다 견고하게 칼럼에 결합해야 고농도의 아세토니트릴에서 용출한다. rPBOMP-1은 대부분의 오염성 단백질보다 훨씬 견고하게 결합해서 용출해야 함을 알 수 있다. rPBOMP-1을 C-4 칼럼에서 크로마토그래피 처리할 경우 PBOMP-1은 칼럼에서 용출된 주 피이크임이 확인되었고(제21도), 놀랍게도 아세토니트릴의 최저 농도에서 먼저 용출됨이 밝혀졌다.
제23A도의 레인 3에 있다 싶이 rPBOMP-1의 피이크는 SDS-PAGE 처리후에 단백질 10μg을 쿠우마씨 브릴리안트 블루 R-250으로 염색해서 측정되는 것만 순수하였다. 이 피이크는 쿠우마씨 염색시에 주밴브와 부밴드의 두개의 밴드를 보이고 있는 이들 밴드는 모두 PBOMP-1의 아미노 말단의 20개의 아미노산을 인식하는 PBOMP-1에 대한 모노클로날 항체와 반응하였다(제23B도, 레인 3). 부밴드는 완전한 크기의 rPBOMP-1보다 약 2000킬로돌턴 작은 것으로서 PR13(pPX167)의 전세포추출물 중에도 존재한 것으로 작은 단백질은 정제과정에서 나온 부생물이 아님을 가리키는 것이다. 용매를 증발시켜 농축하고 나서 정제한 rPBOMP-1는 세척제없이도 수성용매에 용해하였다.
토끼의 면역화
불완전 Freund 보조제중에 에멀젼화 했거나 수산화 알루미늄에 결합시킨 pPX167을 함유하는 대장균 PR13 세포에서 얻은 rPBOMP-1을 써서 뉴질랜드산 흰토끼를 면역시켰다. 0.85% 염수중의 농도가 500μg/ml인 백반을 1:1 비율로 혼합하므로서 rPBOMP-1을 맥반에다 결합시켰다. 혼합물을 37℃에서 3시간 진탕시키고 나서 원심분리하여 백반을 펠릿화했다. 상청액을 BCA 단백질 검정물(Pierce Chem, Co. Chicago, IL)로 검정하여 미결합 단백질을 확인해 봤는데 아무것도 검출되지 않았다. 500μg/ml의 생리식염수중에 백반을 다시 현탁시켰다. 불완전 Freund 보조제(Difco)중에서 1:1의 비율로 rPBOMP-1을 에멀젼화했다. 두 가지 조제물을 50μg 사용하여 4주 간격으로 동물의 근육내에 투여하여 면역시켰다. 0주째 되는날, 6주째 되는날 그리고 각각 면역처리하기 전에 동물의 피를 채취하고 ELISA 및 웨스턴 블랏분석법을 사용하여 앤티-PBOMP-1과 앤티-rPBOMP-1 항체에 대해 혈청을 검정했다.
조환형 PBOMP-1로 면역시켰을 때 ELISA 검정법으로 측정한 경우 인플루엔자균(자연 PBOMP-1)에서 얻는 PBOMP-1과 조환형 PBOMP-1에 대해 항체 역가를 나타내었다.
[표 8]
rPBOMP-1에 대한 항혈청의 ELISA 역가
Figure kpo00010
a ELISA 역가란 기본수준의 2배를 나타내는 항혈청의 최고 희석도의 역수이다.
제8도에 있는 바와 같이 백반 또는 IFA 중에 가한 rPBOMP-1로 동물을 면역시켰을 때 면역후 6주째 되는때에 rPBOMP-1와 자연 PBOMP-1와 반응성인 항체의 역가는 상당히 큼을 알 수 있다.
(3-2) 대장균에서 PBOMP-2의 향상된 발현
PBOMP-2는 플라스미드 pAA130으로부터 낮은 수준(세포 단백질의 1% 이하)으로 발현한다. 자연 촉진유전자 통제하에 PBOMP-2가 발현함이 명백하다.
PBOMP-2의 수득율을 향상시키기 위해 PBOMP-2 개시코돈에 대해 5'의 5개 염기에 있는 독특한 SspⅠ 제한위치에서 pAA130에 있는 PBOMP-2를 분할하고 pUC19의 SmaⅠ 위치에다 결찰했다(제24도). 이 결찰에 의해 전체 PBOMP-2 ORF(신호결합서열 포함)과 pUC19에서 나온 18개의 코돈 및 유전자 융합위치에서 나온 2개의 코돈을 함유하는 잡종 오픈 리딩 프레임(ORF)을 얻는다. 이러한 융합 유전자의 단백질 생성물의 예측된 분자량은 17,999 돌턴이고 lac 촉진유전자의 조절하에 발현된다. 이 플라스미드를 pPX163이라 한다.
플라스미드 pPX163을 형질전환시켜 대장균 JM103을 얻어 IPTG로 유발시켰을 때 겉보기 분자량이 17,500 돌턴인 단백질이 발현했다. 더욱이 분자량이 15,000 돌턴되는 점에서 단백질 중복이 나타났다. 웨스턴 블랏법으로 앤티-PBOMP-1 항혈청에 의해 세가지 단백질 모두를 확인했다(제25도). SDS-PAGE를 쿠우마씨 블루 염색하므로써 lac 유발후에 3가지 형태의 조환형 PBOMP-2는 전체 세포단백질의 약 15%를 차지했다(제25도, 레인 3). pPX163으로부터 발현된 세가지 형태의 조환형 PBOMP-2를분리하여 N-말단펩티드 분석을 한 결과는 다음과 같다.
1. 겉보기 분자량이 17,500 돌턴인 밴드는 예측된 pUC19/PBOMP-2 혼성 단백질이다.
2. 커다란 15,000 돌턴 분자량의 밴드는 PBOMP-2 신호결합서열의 첫번째 메티오닌 잔기(즉, PBOMP-2 ORF의 개시코돈)에서 시작하는데, 이 지점에서의 전이의 재개시에 기인한다.
3. 15,000 돌턴 분자량의 밴드는 N-말단에 대해 차단되며-팔미테이트로 표시될 수 있다. 따라서 이밴드는 PBOMP-2를 가진 지방 단백질로 되어 있다.
[실시예 4]
아래표에 나온 플라스미드를 함유하는 다음의 대장균 균주는 NRRL의 ARCC[Agricultural Research Culture Collection Peoria, IL]에 기탁하고 다음의 가입번호를 부여받았다.
Figure kpo00011
Figure kpo00012

Claims (4)

  1. 인플루엔자균(haemophilus influenzae)의 에피토프와 관련된 순수한 항원성 펩티드에 있어서, 에피토우프는 제11도에 예시된 바와 같이 아미노산 잔기 20-153의 아미노산 서열 또는 이의 항원성 부분을 가지는 아미노산 서열로 구성되고 분자량이 약 16000 달톤인 외막 단백질 PBOMP-1인 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  2. 인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 에피토프와 관련된 순수한 항원성 펩티드에 있어서, 에피토우프는 제15도에 예시된 바와 같이 아미노산 잔기 19-154의 아미노산 서열 또는 이의 항원성 부분을 가지는 아미노산 서열로 구성되고 분자량이 약 16000달톤인 외막 단백질 PBOMP-2인 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드나 단백질을 화학적으로 합성해서된 펩티드 또는 단백질.
  4. 제1항에 있어서; (가) 인플루엔자균의 물리적으로 파쇄된 세포로부터 불용성의 세포벽 분절(fraction)이 많은 외막 단백질을 분리하고, (나) (1) 인간에 투여하기 적당한 세척제 존재하에 분절을 가열하던지, (2) 세척제 존재 또는 부존재하에 리소자임으로분절을 소화시켜 불용성 세포벽 분절로부터 가용성 형태의 펩티드나 단백질을 얻는 단계로 된 공정에 의해 인플루엔자균의 세포배양물로부터 얻은 펩티드 또는 단백질.
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