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KR840000892B1 - 마이코페놀산 글루코사이드의 제조방법 - Google Patents

마이코페놀산 글루코사이드의 제조방법 Download PDF

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KR840000892B1
KR840000892B1 KR1019800004703A KR800004703A KR840000892B1 KR 840000892 B1 KR840000892 B1 KR 840000892B1 KR 1019800004703 A KR1019800004703 A KR 1019800004703A KR 800004703 A KR800004703 A KR 800004703A KR 840000892 B1 KR840000892 B1 KR 840000892B1
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일라이릴리 앤드 캄파니
아더 알. 웨일
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Abstract

내용 없음.

Description

마이코페놀산 글루코사이드의 제조방법
본 발명은 마른버짐 및 통풍치료에 유효한 마이코 페놀산 글루코사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명 화합물은 또한 새앙쥐 및 쥐에 있어서 이식된 종양세포의 성장을 억제한다. 마이코페놀산 및 마이코 페놀산 글루코사이드는 각기 다음 구조식 1 및 2를 갖는다.
Figure kpo00001
1 R=H(마이코 페놀산),
2 R=β-D-글루코피라노실(마이코페놀산 글루코사이드).
마이코페놀산 글루코사이드의 화학명은 6-〔4-(β-D-글루코피라노실)-6-메톡시-7-메틸-3-옥소-5-프탈라닐〕-4-메틸-4-헥세논 산이다.
미국특허 제3,903,071호에 기술된, 마이코 페놀산 글루코사이드를 제조하는 방법은 여러단계의 복잡한 공정이 요구되므로 제조면에서 볼 때 실제상의 가치가 있다.
본 발명에 따라, 마이코페놀산을 글루코스와 수용성매집중에서 글루코실화 효소존재하에 마이코페놀산 글루코사이드의 상당량이 얻어질때까지 반응시킴을 특징으로 하여 마이코페놀산 글루코사이드를 제조한다.
본 발명의 방법에서 유효한, 적합한 글루코실화 효소의 예를들면 스트렙토마이세스 칸디다스(Streptomyces Candidus) NRRL 5449 및 스트렙토마이세스 아우레오파시엔스(Streptomyces aureofaciens) NRRL 2209에 의해 생성되는 효소가 있다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어서 출발물질로서 정제된 마이코페놀산 또는 일부 정제된 마이코페놀산을 사용할 수있다. 상술한 바와같이, 마이코페놀산을 글루코실화는 바람직한 효소는 S. 아우레오파시엔스 NRRL 2209 또는 S. 칸디다스 NRRL 5449의 군주에 의해 생성된다.
NRRL군주가 함유된 배양물은 영구보관하고 있는 다음 기관에서 공인된 NRRL 군주를 입수할 수 있다.
〔The Northern Regional Recearch Center, U.S. Department of Agrie, 1815 North University street,Peoria, Illinois 61604〕.
S. 아우레오파시엔스 NRRL 2209 또는 S. 칸디다스 NRRL 5449에 사용되는 배지는 어느 배지나 사용할 수 있다. 그러나 최대효과를 얻기 위해서는 특정한 배지가 바람직하다. 이들 배지에는 동화성이 있는 탄소, 질소원 및 무기염을 함유시켜야 한다. 바람직한 탄소원은 환원당이고, 바람직한 질소원은 대두밀이다.
S. 우레오파시엔스 NRRL 2209 또는 S. 칸디다스 NRRL 5449가 생장시 발효중에 전환이 일어나는 경우 배지에 글루코스원을 함유시킴으로써 효과적인 전환을 얻을 수있다. 미생물이 발육되어 마이코페놀산 마이코페놀산 글루코사이드로 전환하는 후사용 효소를 생성할때는 발효중의 글루코스의 존재는 임의적이다.
미생물의 생장과 발달에 필요한 미량원소는 미생물의 성장 및 생체내 합성에서 요구되는 충분한 량으로 배지의 다른성분내에 불순물로서 함유시킬 수 있다. 그러나 철, 나트륨, 컬륨, 마그네슘, 암모늄, 컬슘, 인산엽, 엽화물, 탄산엽, 황산엽, 절산염 등의 이온을 생성할 수 있는 가용성 영양 무기염을 배지에 혼합하는 것이 유익하다.
배지의 초기 pH는 변화시킬 수 있다. 그러나 미생물을 접종하기전에 사용된 각 배지에 따라 pH5.7내지 7.5의 범위로 배지를 조정하는 것이 바람직하다. 다른 악티노마이세테스(Actinomycetes)의 경우 배지는 발효가 진행됨에 따라 서서히 강한 알카리성으로 변하며, 미생물의 발육 기간동안 초기 pH5.9에서 6.9또는 이이상으로 높아진다. 최종 pH는 배지의 기초 pH배지 내에 함유된 기질 및 완충액에 따라 영향을 받는다. 이 기간동안 미생물이 발육된다. 산 또는 염기를 가하여 pH를 조정할 수 있으나 우수한 결과는 pH를 조정하지 않은 경우에 얻게된다.
다른 스트렙토마이세스(Streptomyces)종의 경우, 미생물은 호기성 생장조건을 필요로 한다. 소량증식에는 진랑 플라스크 또는 병에 아가의 사면 또는 편평배양으로 수행하는 것이 편리하고 대량생산에는 대형 탱크내의 심부 호기성 배양이 바람직하다.
멸균된 탱크내의 발효용 배지에 포자가 형성된 현탁액으로 접종하여 발효가 시작되도록 할 수 있다. 포자 형성 현탁액으로 접종하면 발육이 지연되기 때문에 영양접종이 바람직하다. 소량의 배지에 미생물의 포자형태 또는 균사체를 접종하는 영양접종으로 미생물의 활발한 생장배양을 얻을 수 있다. 영양배양물을 대형 탱크내로 옮긴다음 영양접종의 생장에 사용되는 배지는 대규모 생산에서 사용된 것과 같은 배지를 사용할 수 있으니 다른 배지도 사용이 가능하다.
S. 아우레오파시엔스 NRRL 2209군주는 20 내지 37℃온도에서 생장할 수 있다. 그러나 최대생장 및 포자형성은 28 내지 32℃에서 일어난다.
S. 칸디다스 NRRL 5449 군주는 26°내지 40℃에서 생장하나 최적생장 및 포자형성온도는 32내지 37℃이다.
통상적인 호기성 심부배양에서와 같이 발효중 배지를 통하여 멸균된 공기를 유입한다. 미생물의 충분한 생장 및 마이코페놀산 글루코사이드 제조의 원활을 기하기 위해서는 탱크배양내의 공기의 유입량(용적으로)을 1분간 배지(용적)당 공기 0.1(용적)이상이어야 한다. (V/VM) 최적수욜은 사용된 공기의 용적이 배지용적에 대해 적어도 1/3내지 1/2 용적의 공기를 1분간에 유입하는 경우에 수득된다.
전환을 일으키는데 요하는 발효시간은 변화시킬 수있다. 또한 적합한 글루코즈 공급원을 함유시켜야 하는데, 일반적으로 적합한 량의 글루코스와 배지 l당 0.1 내지 1.0g의 마이코페놀산이 함유되는 경우 마이코 페놀산이 마이코페놀산글루코사이드로 전환하는 데는 72 내지 120시간이 소요된다. 초적전환은 마이코페놀산이 배지 ℓ당 0.2 내지 0.75g이 함유되는 경우에 일어난다. 글루코츠의 적합한 량은 중량으로 배지의 1%이상이다. 글루코즈의 바람직한 량은 중량으로 배지의 2 내지 5%이다.
글루코즈 검지용 시험 페이퍼를 농도 축정에 사용할 수 있다. 글루코즈 함량이 2%이하이면 최적농도가 유지되도록 글루코스를 가해야 한다. 전환시키는 또 다른 방법은 선기술의 방법에 의한 효소를 비유동화시키는 것이다. 〔참조Biomedical Applicatins of Immobilized Enzymes and Porteins″, Thomas Mingsivi Chang, Ed., plenum Press, New York, 1977,vol 1)비유동화 효소는 컬럼(또는 다른 적합하나 형태의 반응용기)을 사용하여 글루코실화 반응을 효과적으로 수행할 수 있다.
이외의 미생물 자체를 비유동화하여 글루코실화 반응을 촉매작용화하는데 사용할 수 있다. 전환의 진행을 검출에 사용되는 UV광을 사용하여 박충 크로마토 그래피함으로써 측정할 수 있다. 아세토니트릴 물(9:1)을 사용한 실리카겔상에서 마이코페놀산에 대한 Rf치는 약 0.62이나 마이코페놀산 글루코사이드에 대한 Rf치는 0.45이다. 마이코페놀산 글루코사이드는 배양액 및 균사체내에 존재한다. 따라서 마이코페놀산 글루코사이드의 분리에서 사용되는 기술로서 상기 공급원하나 또는 둘 모두에서 생성물이 최대로 회수될 수 있는 방법을 택해야 한다. 예를들면 발효 배지를 여과하고 여액의 pH를 산성으로 낮춘 다음 산성화된 여액을 클로로포름과 같은 적합한 용매로 추출하여 미반응된 마이코페놀산을 모두 제거시킨다. 또한 균사체 케이크는 메탄올과 같은 적합한 용매로 추출하고 유기용매를 제거한다음 잔류한 수용성용액을 분리공정단계의 여과액에 가한다. 생성물을 공지방법에 따라 용액으로부터 회수한다. 바람직한 회수방법은 중합성 수지에 흡착시키고 메탄올-물과 같은 적합한 용매로 용출시키는 것이다.
[실시예 1]
S. 아우레오파시엔스 효소를 사용하는 마이코페놀산 글루코사이드의 제조
A.S. 아우레오파시엔스의 발효
스트렙토 마이세스 아우레오파시엔스 NRRL 2209의 동결건조한 펠렛을 물에 현탁시키고 다음 조성분을 갖는 아가 사면배양기에 접종한다.
Figure kpo00002
황산철 7 H20 2g을 농염산 2㎖가 함유된 탈이온 화수 100㎖에 용해한다. 이용액을 상기 염화컬륨/황산 마그네슘 7·H2O 용액에 가하여 챠펙의 저장용 무기시약을 만든다. 접종한 사면배양기를 30℃에서 10일간 배양시키고 4℃에서 30일간 저장한다.
사면배양기에서 채취한 한백금이를 250㎖ 용삼각플라스크 내의 영양배지 50㎖에 이식한다.
영양배지의 조성분은 다음과 같다.
Figure kpo00003
＊ Stacdex R.At.Staley Co., Decatur, III. 접종한 플라스크를 250rpm으로 회전하는 진랑기매에서 30℃로 배양시킨다. 48시간 배양후 5㎖를 500㎖용 삼각플라스크내에 함유된 제2의 영양배지(상기 영양배지의 조성분과 동일) 100㎖에 이식한 다음 250rpm으로 회전하는 진탕기내에서 30℃로 48시간 배양한다.
B. 마이코페놀산 글루코사이드의 제조
마이코페놀산 50㎎을 물 8㎖에 용해한다음 pH를 7.0으로 맞추고 물을 가하여 10㎖로 한다. 이용액을 ㎖당 글루코즈는 250㎎이 함유된 4㎖의 수용액과 함께 s. 아우레오파시엔스 효소가 함유되어 있는 상기 A부에서 수득된 플라스크에 가한다. 플라스크를 다시 72시간동안 배약한다.
전환의 진행을 첵크하기 위해 발효액 일부를 주기적으로 에틸아세테이트를 가해 추출한다. 이들 추출물을 아세토니트릴 : 물(9:1)의 용매 및 검출에 사용되는 UV광을 사용하여 실리카겔 TLC로써 시험한다. TLC 에서 마이코페놀산이 모두 글루코사이드로 전환된 것으로 나타나면 발효는 완결된 것이다. 잇다른 시험에서 마이코페놀산 및 글루코사이드를 다시 가하고 24 내지 48시간동안 배양을 계속하여 다량의 생성물이 수득됨이 나타났다.
C. 생성물의 분리 및 정제
상기 B부에서 기술된 바와 같이 수득된 마이코페놀산 글루코사이드가 함유된 59개의 플라스크 내용물을 한데 모을다. 액의 pH를 염산을 가해 7.6에서 4.0으로 낮춘다. 여과보조제(Hyflo Super-cel, a diatomaceouseatth, Johns-Manville Products Corp.)를 상기 혼합액에 가하고 생성된 혼합물을 여과하여 분리한다. 균사체 덩어리(여과 보조제가 함유됨)를 메탄올로 추출한다. 여과하여 회수한 메탄올 추출물을 진공하에 농축시켜 메탄올을 제거한다. 얻어진 수용액을 여액에 가한다. 이용액의 pH를 염산으로 4.0으로 조정한다음 잔류한 마이코 페놀산을 모두 제거하기 위해 동량의 클로로포름을 가하여 추출한다.
잔류한 수용액을 진공하에 1ℓ㎖ 농축한 다음 중합성 흡착수지(XAD-2, Rohm and Haas Co., Philcedelphia, Pa.), 700㎖로 충진한 2.5-피트 ×40mm 0D(외경) 컬럼상에서 크로마토 그래피한다. 컬럼의 진행은 B부에 기술된 바와같이 TLC로써 확인한다. 용매로서 메탄올 : 물(1:7) 4ℓ, 메탄올:물(1:3)8ℓ 및 메탄올 : 물(1:1)8ℓ의 순서로 연속적으로 사용한다. 글루코사이드는 메탄올: 물(1:1)로 용출시킨다. 마이코페놀산 글루코사이드가 함유된 획분을 합하고 진공하에 농축시켜 부분적인 정제 생성물 2.0g을 수득한다. 마이코페놀산 글루코사이드의 최종정제는 가역-상 실리카-겔(하기 실시예 5에서 기술된 바와같이 제조)-사용하는 고성능 액체 크로마토그라피로서 달성할 수 있다.
XAD-2 컬럼(200㎎)에서 수득된 생성물 일부를 하기 실시예 6에 기술한 바와같이 충진한 11-인치×200mm0D C1y실리카겔 컬럼상에서 크로마토그래피한다. 컬럼은 100psi 압력 및 7㎖/분의 유속으로 작동한다. 컬럼의 용출물 물 : 메탄올(65:35)로 하여 컬럼 용출물은 250nm에서 UV흡수에 의해 확인한다. 20㎖씩 취한 획분에서 마이코페놀산 글루코사이드는 22내지 23획분내에 존재해있다. 글루코사이드가 함유된 획분을 합하고 진공하에 농축시켜 111㎎의 정제된 마이코페놀산 글루코사이드를 수득한다. 이 생성물의 물리적/화학적 분석에서 미국특허 제3,903,071호에 기술되어 있는, 화학적인 방법에 의해 제조된 6-〔4-(β-D-클루코피라노실)-6-메톡시-7-메틸-3-옥소-5-프탈라시〕-4-닐메-4-틸헥사논산과 동일함이 나타났다.
[실시예 2]
실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 마이코페놀산 글루코사이드를 제조하는데, 단, S. 아우레오파시엔스는 다음과 같은 A단계의 발효 배지에서 생장시킨다.
A.S. 아우레오파시엔스의 발효
S.아우레오파시엔스NRRL 2209는 베넷트배지로 제조된 아가 사면배지에서 생장시킨다. 생장물을 떼어내어 멸균한 탈이온화수 10㎖를 가하여 슬러리를 만든다. 이 슬러리를 500㎖용 진탕 플라스크 4개에 나누어 넣는데 각 플라스크에는 다음의 조성분을 가진 영양배지 100㎖가 함유되어 있다.
Figure kpo00004
접종한 4개의 플라스크를 250rpm의 회전 진탕기내에서 48시간 동안 30℃로 배양한다. 이 영양배지(5㎖씩)를 사용하여 상기에 기술한 영양배지와 동일한 조성분을 가진 발효배지 100㎖를 함유시킨 진탕플라스크(500㎖)에 접종한다. 접종된 배지는 48시간동안 배양시킨다.
[실시예 3]
마이코페놀산 글루코사이드를 실시예 1의 방법으로 제조하는데, 여기서 효소는 다음과 같은 A단계과정을 사용하는 스트렙토마이세스 칸디다스 NRRL 5449에 의해 생성된다.
A.S. 칸디다스의 발효
코로니를 잘 형성시키기 위하여 베넷트 배지로 제조한 아가 사면배양기내에서 S. 칸디다스 NRRL 5449를 생장시킨다. 코로니를 떼어내어 멸균한 탈이온화수 10㎖로 슬러리화한다. 이 슬러리를 다음 조성분을 갖는 영양배지 100㎖씩 들어있는 500㎖용 진탕 플라스크 4개에 나누어 넣는다.
Figure kpo00005
접종된 4개의 플라스크를 250rpm의 회전식 진량기내에서 30℃로 48시간동안 배양된다. 이 영양배지(10㎖씩)를 사용하여 다음 조성분을 갖는, 멸균한 발효배지 100㎖씩이 들어있는 진탕 플라스크(500㎖)에 접종한다.
Figure kpo00006
접종된 배지는 상술한 바와같이 72시간 동안 배양시킨다.
[실시예 4]
S. 칸디다스 효소 입상물에 의한 마이코페놀산 글루코사이드의 제조
S. 칸디다스 NRRL 5449는 실시예 3에서와 같이 발육시킨다. 발효배지로부터 진공여과에 의해 세포를 분리한다음 200g씩 나누어 넣고 냉동하에 저장한다. 이들중 2개를 실온에서 녹이고 0.05M인산 완충액을 현탁시킨후(pH5.8) 최종부피를 600㎖로 한다. 이 세포 현탁액을 30분간 초음파 처리를 한후 초음파 처리물을 10,000rpm으로 30분간 원심분리시킨다.
생성된 세포덩어리를 인산염 완충액 100㎖에 키탁시현고 이 현탁액을 냉각한 인산염 완충액 5ℓ에 18시간동안 투석시킨다. 입상화 투석효소 50㎖에 에탄올에 용해된 D-글루코즈 및 마이코페놀산을 가한다. 반응혼합물을 30℃에서 72시간동안 교반해준후 여과한다. 여액을 클로로포름으로 추출한다. 이 클로로포름추출물은 진공하에 농축시키고 크로마토그래피로 정제하여 마이코페놀산 글루코사이드를 수득한다.
[실시예 5]
실리카겔/C18역상 수지의 제조
1단계 : 가수분해
LP-1실리카겔(1,000g, Quantum Corp, 현재 whatman)을 진한 황산 1650㎖ 및 진한 질산 1650㎖가 들어 있는 5ℓ용 환저 폴라스에 가하고 적합하게 현탁되도록 진탕시킨다. 혼합물을 플라스크에 냉각기를 부착시키고 하루밤동안(16시간) 스팀베스상에서 가열한다. 혼합물을 얼음베스내에서 냉각하고 소성 유리판넨을 사용하여 주의해서 여과한다. 실리카겔은 pH가 중성이 될때까지 탈이온화수로 세척한다음 아세톤 4ℓ로 세척하고 진공하에 100℃로 2일간 건조한다.
2단계 : 1차 실릴화
1단계에서 수득한 건조 실리카겔을 환저플라스크에 넣고 3.5ℓ의 톨루엔에 현탁시킨다. 플라스크를 스팀베스상에서 2시간동안 가열하여 약간의 잔류수를 공바제거 한다. 옥타데실트리클로로실란, 32㎖(Aldrich Chemical Company)를 가하고 반응혼합물을 60℃로 기계적 교반을 서서히 하면서 하루밤(16시간) 환류시킨다. 플라스크 하부근처에 교반기가 닿지 않도록 주의한다. 이것은 실리카겔입자가 마쇄되는 것을 방지하기 위함이다. 혼합물을 방치하여 냉각한다. 실란화된 실리카겔을 모으고 톨루엔 3ℓ 및 아세톤 3ℓ로 세척한 다음 하루밤(16 내지 20시간)대기건조한다. 건조된 실리카겔을 5ℓ용 플라스크의 아세토니트릴 : 물(1:1)3.5ℓ에 현탁시키고 실온내서 2시간동안 주의하고, 교반하고 여과한 후 아세톤 3ℓ로 세척하여 대기건조시킨다.
3단계 : 제2차 실릴화
옥타데실트리클로로실란 200㎖를 사용하여 제1차 실릴화 조작을 반복한다. 현탁액을 주의하여 교반하면서 2시간동안 60℃로 환류시킨다. 최종생성물은 여과하여 회수하고 3ℓ의 톨루엔 및 6ℓ의 메탄올로 세척하고 진공하에 50℃에서 하루밤(16내지 20시간)건조한다.
[실시예 6]
미셀-밀러(Mical-Miller)컬럼용슬러리 팩킹방법
통칙
A. 분석용 또는 제제용 컬럼은 이 방법으로 팩킹할 수 있다.
B. 실리카겔 및 실리카겔 역상팩킹
(예 : Quantum LP-1, 입자크기 10 내지 20마이크론, Lichroprcp RP-8 and RP-18, 입자크기 25내지 40마이크론)을 사용한다. 그러나 다른 실리카겔(예 : Shandons DDS Hyper Sil, 입자크기 5마이크론) 및 다른 형태의 수지를 이 방법에 의해 성공적으로 팩킹할 수 있다.
C. 일반적으로, 이 슬러리 팩킹방법에서는 200psi이하의 압력 및 5내지 40㎖/분의 유속이 필요하다. 이것은 컬럼용적과 크기에 따라 결정된다. 주의 : 팩킹화 압력은 실제로 30 내지 50psi에서 분리되는 동안 사용된 압력을 초과해야 한다. 이로써 분리가 진행되는 동안 흡착제의 압축이 더 이상 일어나지 않는다. 본 발법에 의해 역상 실리카겔로 팩킹된 컬럼은 수년간 효율손실이 없이 사용할 수 있다.
D. 압력이 급격히 강하되면 팩킹물질내에 균열 또는 홈을 형성하는 원인이 될 수있다. 라서 펌프를 중지할때는 언제나 압력을 서서히 제로까지 떨어뜨리는 것이 중요하다.
E. 컬럼의 적합한 용적(ACE Gass Cot. No., 팩킹안함) : 5795-04,12㎖, 5795-10, 110㎖, 5795-16, 300㎖,5795-24,635㎖ 및 5796-34,34㎖.〕
F. 유리컬럼에 팩킹하는데 요하는 시간은 컬럼크기 및 취급자의 경험에 따라 수분에서 수시간까지로 변화시킬 수 있다.
조작순서
1. 유리컬럼을 저장용 컬럼에 커플링을 통해 연결한다.( 저장용 컬럼의 용적은 컬럼의 용적보다 2배이어야한다.) 상기 두 개의 컬럼을 수직으로 세워놓는다.
2. 팩킹물질을 평량한다. (200㎖용 컬럼에 약 100g 사용).
3. 70 내지 80% 메탄올 및 20 내지 30%물의 혼합물의 용매 약 5배의 량(용적으로) 팩킹물질에 가한다.
4. 입자가 모두 습윤화 될때까지 잘 진탕하고 하루밤 또는 그 이상 방지하여 입자가 용매에 완전히 적시게 한다. 상등액을 경사하여 버린다.
5 : 수지를 용매를 충분히 가하고 슬러리화하여 저장용 컬럼을 채운다. 저장컬럼에 가만히 붓는다.
주의 : 컬럼은 동일용매로 미리 채워야 하며 저장용 컬럼은 슬러리물을 붓기전에 용매로 일부를 채워야 한다. 다양의 슬러리를 사용함으로써 무수한 결과를 얻을 수 있다. 그러나 팩킹 과정중에 대형 저장용기, 또는 배수의 저장용기를 채울필요가 있다.
6. 컬럼하측에 레플론 플러그로 저장용기를 닫은 다음〔미국특허 제4,131,547호 참조. 펌프에 연결하고 즉시 용매를 펌프하기 시작하는데 Ace Cot. No. 1326-25 펌프 또는 유사한 용매배출 시스템을 사용하는 경우 최대유속을 약 20㎖/분으로 한다.
7. 컬럼이 흡착제로 완전히 채워질때까지 계속한다. 압력은 이 조작중에 컬럼의 최대허용치(대형 컬럼은 약 200psi, 분석용 컬럼은 300psi)를 초과해서는 안된다. 대부분의 경우 200psi 이하의 압력으로도 충분하다.
8. 압력이 최대치를 초과하면 유속을 감소시켜서 압력을 떨어트린다.
9. 컬럼을 흡착제로 채운다음 펌프를 중지하고 압력을 제로까지 떨어트린다음 저장용기를 떼고 저장용기를 예비컬럼에 다시 놓는다. 용매 및 소량의 흡착제롤 예비컬럼을 채우고 컬럼이 완전히 펙킹될때까지 최대 압력으로 펌프한다. 〔참조: 일반조작법〕
주의 : 팩킹물질내의 균열 또는 홈형성을 방지하기 위해 압력은 항상 펌프조중지후에는 서서히 감소시켜야 한다.
10. 압력을 다시 가하고 예비컬럼을 주의하여 떼어낸다. 소형 주걱으로 컬럼 상부에서 약 2내지 4mm정도의 팩킹물질을 제거해내고 컬럼 상부에 하나 또는 두 가지 충진제를 놓고 팩킹물질 상부를 온화하게 누른다음 밀봉이 확인될때까지 컬럼상부에 레플론플러그를 끼운다. 컬럼을 펌프에 연결하고 압력(통상적으로 200psi 이하)을 가하고 수지가 더 이상 팩킹되지 않는지를 컬럼상부의 유리벽을 통하여 관찰한다. 팩킹물질이 계속하여 정착되는 경우(대형 컬럼인 경우에 해당) 약간의 무익한 공간 또는 홈이 나타나는데 이때는 상기 단계 9의 조작을 반복한다.

Claims (1)

  1. 마이코페놀산을 글루코즈와 수용성 매질중에서 스트렙토마이세스 아우레오파시엔스(Streptomyces aureofaciens) NRRL 2209 및 스트렙토마이세스 칸디다스(Streptomyces Candidus) NRRL 5449에 의해 생성되는 글루코실화 효소 존재하에. 마이코페놀산 글루코사이드의 상당량이 제조될때까지 반응시킴을 특징으로 하는 마이코페놀산 글루코사이드를 제조하는 방법.
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