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KR20240135629A - 폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입 - Google Patents

폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입 Download PDF

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KR20240135629A
KR20240135629A KR1020247026318A KR20247026318A KR20240135629A KR 20240135629 A KR20240135629 A KR 20240135629A KR 1020247026318 A KR1020247026318 A KR 1020247026318A KR 20247026318 A KR20247026318 A KR 20247026318A KR 20240135629 A KR20240135629 A KR 20240135629A
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KR
South Korea
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seq
set forth
sequence set
nucleic acid
variant
Prior art date
Application number
KR1020247026318A
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English (en)
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앤드류 백
마리아 프라가스티스
캐서린 시그나
레아 사빈
폴라미 사마이
에반젤로스 페파니스
필립 칼라파티
니콜 키팅
파스칼린 에임-윌슨
존 듀간
민 가오
로버트 밥
앤서니 포겟
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로 삽입되고/되거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 발현되도록 하는, 핵산 작제물 및 조성물이 또한 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은, 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 핵산의 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 방법, 세포에서 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)의 발현 방법, 글리코겐 축적 감소 방법, 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍의 치료 방법, 및 신생아 세포 및 대상체를 포함하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용될 수 있다.

Description

폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2022년 2월 2일자로 출원된 미국 출원 63/306,040호 및 2022년 7월 29일자로 출원된 미국 출원 63/369,902호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
EFS 웹을 통해 XML 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 590204SEQLIST.xml로 작성된 서열 목록은 1.16 메가바이트 크기이고, 2023년 1월 26일에 생성되었고, 본원에 인용되어 포함된다.
유전자 요법은 오랫동안 인간 질환에 접근하고 치료하는 방식에 대한 이의 잠재력이 큰 것으로 인식되어 왔다. 약물 또는 수술에 의존하는 대신, 기저의 유전적 인자를 갖는 환자는 기저 원인을 직접 표적화하여 치료될 수 있다. 또한, 기저의 유전적 원인을 표적화함으로써, 유전자 요법은 환자를 효과적으로 치유하는 잠재력을 제공할 수 있다. 그러나, 유전자 요법 접근의 임상적 적용은 여전히 몇몇 측면에서 개선이 필요하다. 또한, 생애 초기 치료는 신생아 환자의 고유한 환경으로 인해 추가적인 장애물을 제시할 수 있다.
폼페병(PD) 또는 II형 글리코겐 저장 질환은 효소 리소솜 산 알파-글루코시다제(GAA)의 활성 결핍으로 인해 유발되는 단일 유전자성 리소솜 질환이다. GAA 결핍은 골격근 및 심장근을 포함하는 조직 내 세포의 리소솜에 이의 기질, 글리코겐을 축적시킨다. 근섬유 내 글리코겐의 이러한 비정상적인 축적은 심장 비대, 경미하거나 심각한 근력 저하, 및 결국 심장 또는 호흡 부전으로 인한 사망을 포함할 수 있는 증상이 있는, 근육 조직의 진행성 손상을 초래한다. 유아 발병 PD(IOPD)는 정상의 1% 미만의 GAA 활성과 관련된다. 이는 중증이고, 내장 기관, 근육, 및 중추신경계(CNS)에 영향을 미친다. 후기 발생 PD(LOPD)는 2 내지 40%의 GAA 활성과 관련된다. 이는 덜 중증이고, 주로 호흡 기관 및 골격근이 관여된다.
PD에 대해 승인된 유일한 요법은 효소 대체 요법(ERT)이다. 재조합 인간(rh) GAA는 격주로 정맥내 주입에 의해 환자에 전달된다. ERT가 PD의 심장 징후를 치료하는 데 매우 성공적이었지만, 골격근 및 CNS는 여전히 ERT에 의해 최소한으로 치료된다. rhGAA가 리소솜에 도달하는 주요 메커니즘은 rhGAA 상의 M6P에 결합하는 양이온-독립적 만노스 6-포스페이트(M6P) 수용체(CIMPR)에 의한 흡수를 통해 이루어진다. 그러나, 골격근 내의 CI-MPR 발현은 매우 낮고, rhGAA는 만노스 6-포스포릴화가 불충분하다. 또한, CI-MPR은 리소솜보다 영향을 받은 세포의 자가소화포로 잘못 전달될 수 있는 동시에, 많은 양의 약물이 또한 PD의 주요 병리학을 갖지 않는 기관인 간에 의해 흡수될 수 있다. ERT는 혈액-뇌-장벽을 횡단하지 않는다. 또한, PD는 생애 초기 치료가 필요하며, 이는 신생아 및 청소년 환자의 고유한 환경으로 인해 추가적인 장애물을 제시한다.
다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로 삽입되고/되거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 발현되도록 하는 핵산 작제물 및 조성물이 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 핵산을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체의 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 또는 삽입하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 발현시키는 방법, 글리코겐 축적을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 감소시키는 방법, 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍의 치료 방법, 및 신생아 대상체를 포함하는 감소된 GAA 활성 또는 발현을 갖는 대상체 및 폼페병으로 진단된 대상체와 같은 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단, 또는 대상체는 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체이다.
일 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 일 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 간 세포(liver cell)이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 헤파토사이트(hepatocyte)이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 신생아 대상체의 생체내에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 신생아 대상체의 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제의 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 일부 이러한 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 및 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 헤파토사이트이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 또 다른 양태에서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킴 -. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킴 -. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료함 -. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료함 -. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근 및/또는 심장 조직 내 글리코겐 수준을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다.
또 다른 양태에서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킴 -. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킴 -. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다.
일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성하거나; 일부 이러한 방법에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 리소솜 알파-글루코시다제 활성에 대해 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%만큼 리소솜 알파-글루코시다제 활성을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간 대상체이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 핵산 작제물을 대상체에 투여하기 전에 신생아 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력이다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여된다.
일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다(CpG-depleted). 일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, CD63-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 이러한 방법에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하며, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 아암(homology arm)을 포함하지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 비-상동성 단부 접합을 통해 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 인도 복구(homology-directed repair)를 통해 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)에 의해 플랭킹되고(flank), 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 CpG-고갈된다.
일부 이러한 방법에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN); (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는 (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 서열 번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 이러한 방법에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) Cas9 단백질로부터 유래한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형된다. 일부 이러한 방법에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 방법에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘이다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질(helper lipid), 및 스텔스 지질(stealth lipid)을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 일부 이러한 방법에서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 이러한 방법에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 이러한 방법에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 방법에서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 방법에서, 지질 나노입자는 다음 몰비로 4개의 지질을 포함한다: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG.
일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 제작된 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 제공된다. 또 다른 양태에서, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 제작된 세포 또는 세포 집단이 제공된다. 또 다른 양태에서, 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 제공되며, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 또 다른 양태에서, 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 제공되며, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 헤파토사이트이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 생체내에 존재한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질이 발현된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, CD63-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 다중 도메인 치료 단백질에 대한 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈되고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, CD63-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 이러한 조성물에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 CpG-고갈된다.
일부 이러한 조성물에서, 조성물은 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN); (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는 (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열 번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음의 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형된다. 일부 이러한 조성물에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA 및 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 일부 이러한 조성물에서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 이러한 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 이러한 조성물에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 다음 몰비로 4개의 지질을 포함한다: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG.
일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 세포는 신생아 세포이고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 조성물에서, 세포는 신생아 세포가 아니고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
또 다른 양태에서, 상기 조성물 중 임의의 것을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 간 세포는 헤파토사이트이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포가 아니다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공되며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 및 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체에서 발현된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 양태에서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장 조직, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근 및/또는 심장 조직 내 글리코겐 수준을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다.
또 다른 양태에서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 리소솜 알파-글루코시다제 활성에 대해 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%만큼 리소솜 알파-글루코시다제 활성을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 핵산 작제물을 대상체에 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력이다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여된다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로 삽입되고/되거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 발현되도록 하는 핵산 작제물 및 조성물이 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 핵산을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체의 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 또는 삽입하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 발현시키는 방법, 글리코겐 축적을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 감소시키는 방법, 및 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍의 치료 방법, 및 신생아 세포 및 대상체를 포함하는 감소된 GAA 활성 또는 발현을 갖는 대상체 및 폼페병으로 진단된 대상체와 같은 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단, 또는 대상체는 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체이다.
일 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 헤파토사이트이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 신생아 대상체의 생체내에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 신생아 대상체의 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제의 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입됨 -. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌의 표적 유전자의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 일부 이러한 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 헤파토사이트이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 인간 세포 집단이다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현됨 -. 또 다른 양태에서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킴 -. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료함 -. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근, 심장, 및/또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다.
또 다른 양태에서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 하기를 투여하는 단계를 포함한다: (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하고, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전좌로부터 발현되며,이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킴 -. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 리소솜 알파-글루코시다제 활성에 대해 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%만큼 리소솜 알파-글루코시다제 활성을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 핵산 작제물을 대상체에 투여하기 전에 신생아 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력이다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여된다.
일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및/또는 (ii) 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (2) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (3) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (4) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (5) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (6) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (7) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (8) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (9) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (10) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (11) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (12) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (13) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (14) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (15) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (16) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (17) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (18) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (19) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (20) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (21) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (22) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (23) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (24) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (25) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (26) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (27) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (28) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (29) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (30) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (31) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (32) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (2) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 218(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 219(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 220(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 223(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 224(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 225(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (b) 서열번호 228(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 229(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 230(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 233(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 234(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 235(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (c) 서열번호 238(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 239(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 240(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 243(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 244(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 245(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (d) 서열번호 248(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 249(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 250(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 253(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 254(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 255(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (e) 서열번호 258(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 259(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 260(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 263(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 264(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 265(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (f) 서열번호 268(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 269(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 270(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 273(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 274(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 275(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (g) 서열번호 278(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 279(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 280(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 283(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 284(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 285(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (h) 서열번호 288(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 289(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 290(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 293(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 294(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 295(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (i) 서열번호 298(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 299(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 300(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 303(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 304(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 305(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (j) 서열번호 308(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 309(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 310(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 313(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 314(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 315(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (k) 서열번호 318(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 319(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 320(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 323(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 324(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 325(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (l) 서열번호 328(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 329(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 330(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 333(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 334(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 335(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (m) 서열번호 338(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 339(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 340(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 343(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 344(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 345(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (n) 서열번호 348(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 349(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 350(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 353(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 354(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 355(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (o) 서열번호 358(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 359(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 360(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 363(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 364(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 365(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (p) 서열번호 368(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 369(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 370(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 373(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 374(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 375(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (q) 서열번호 378(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 379(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 380(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 383(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 384(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 385(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (r) 서열번호 388(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 389(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 390(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 393(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 394(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 395(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (s) 서열번호 398(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 399(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 400(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 403(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 404(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 405(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (t) 서열번호 408(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 409(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 410(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 413(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 414(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 415(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (u) 서열번호 418(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 419(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 420(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 423(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 424(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 425(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 428(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 429(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 430(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 433(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 434(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 435(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (w) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 448(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 449(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 450(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 453(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 454(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 455(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (y) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (z) 서열번호 468(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 469(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 470(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 473(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 474(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 475(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (aa) 서열번호 478(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 479(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 480(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 483(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 484(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 485(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ab) 서열번호 488(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 489(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 490(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 493(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 494(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 495(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ac) 서열번호 498(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 499(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 500(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 503(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 504(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 505(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ad) 서열번호 508(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 509(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 510(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 513(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 514(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 515(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ae) 서열번호 518(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 519(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 520(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 523(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 524(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 525(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및/또는 (af) 서열번호 528(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 529(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 530(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 533(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 534(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 535(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (b) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ii) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iii) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iv) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vi) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vii) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (viii) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ix) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xi) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xii) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiii) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiv) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xv) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvi) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvii) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xviii) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xix) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xx) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxi) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxii) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiii) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiv) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxv) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvi) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvii) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxviii) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxix) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxx) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxxi) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 및/또는 (xxxii) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 또는 (ii) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, TfR-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 다음 배향으로 배열된 도메인을 포함하고: N'-중쇄 가변 영역-경쇄 가변 영역-리소솜 알파 글루코시다제-C' 또는 N'-경쇄 가변 영역-중쇄 가변 영역-리소솜 알파-글리코시다제-C', 선택적으로, scFv 및 리소솜 알파-글루코시다제는 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, 선택적으로, scFv 가변 영역은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 리소솜 알파-글루코시다제를 포함하며, VH, VL, 및 리소솜 알파-글루코시다제는 다음과 같이 배열된다: (i) VL-VH-리소솜 알파-글루코시다제; (ii) VH-VL-리소솜 알파-글루코시다제; (iii) VL-[(GGGGS)3]-VH-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제; 또는 (iv) VH-[(GGGGS)3]-VL-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제. 일부 이러한 방법에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열 번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 비-상동성 단부 접합을 통해 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 상동성 인도 복구를 통해 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 CpG-고갈된다.
일부 이러한 방법에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN); (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는 (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 방법에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 서열 번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 이러한 방법에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형된다. 일부 이러한 방법에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 방법에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘이다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 일부 이러한 방법에서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 이러한 방법에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 이러한 방법에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 방법에서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 방법에서, 지질 나노입자는 다음 몰비로 4개의 지질을 포함한다: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG.
일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, 방법은 RNA 형태의 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 방법은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
다른 양태에서, 상기 방법 중 임의의 것에 의해 제작된 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 제공된다. 또 다른 양태에서, 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 제공되며, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 간 세포이거나, 신생아 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 헤파토사이트이거나, 신생아 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 신생아 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 신생아 세포 집단은 생체내에 존재한다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질이 발현된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및/또는 (ii) 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (2) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (3) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (4) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (5) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (6) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (7) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (8) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (9) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (10) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (11) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (12) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (13) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (14) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (15) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (16) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (17) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (18) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (19) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (20) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (21) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (22) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (23) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (24) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (25) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (26) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (27) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (28) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (29) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (30) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (31) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (32) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (2) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 218(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 219(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 220(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 223(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 224(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 225(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (b) 서열번호 228(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 229(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 230(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 233(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 234(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 235(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (c) 서열번호 238(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 239(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 240(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 243(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 244(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 245(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (d) 서열번호 248(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 249(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 250(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 253(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 254(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 255(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (e) 서열번호 258(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 259(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 260(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 263(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 264(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 265(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (f) 서열번호 268(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 269(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 270(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 273(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 274(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 275(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (g) 서열번호 278(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 279(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 280(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 283(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 284(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 285(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (h) 서열번호 288(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 289(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 290(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 293(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 294(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 295(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (i) 서열번호 298(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 299(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 300(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 303(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 304(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 305(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (j) 서열번호 308(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 309(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 310(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 313(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 314(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 315(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (k) 서열번호 318(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 319(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 320(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 323(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 324(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 325(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (l) 서열번호 328(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 329(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 330(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 333(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 334(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 335(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (m) 서열번호 338(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 339(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 340(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 343(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 344(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 345(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (n) 서열번호 348(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 349(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 350(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 353(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 354(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 355(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (o) 서열번호 358(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 359(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 360(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 363(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 364(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 365(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (p) 서열번호 368(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 369(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 370(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 373(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 374(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 375(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (q) 서열번호 378(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 379(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 380(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 383(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 384(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 385(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (r) 서열번호 388(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 389(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 390(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 393(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 394(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 395(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (s) 서열번호 398(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 399(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 400(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 403(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 404(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 405(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (t) 서열번호 408(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 409(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 410(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 413(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 414(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 415(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (u) 서열번호 418(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 419(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 420(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 423(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 424(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 425(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 428(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 429(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 430(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 433(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 434(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 435(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (w) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 448(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 449(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 450(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 453(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 454(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 455(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (y) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (z) 서열번호 468(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 469(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 470(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 473(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 474(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 475(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (aa) 서열번호 478(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 479(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 480(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 483(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 484(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 485(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ab) 서열번호 488(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 489(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 490(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 493(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 494(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 495(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ac) 서열번호 498(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 499(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 500(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 503(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 504(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 505(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ad) 서열번호 508(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 509(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 510(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 513(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 514(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 515(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ae) 서열번호 518(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 519(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 520(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 523(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 524(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 525(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및/또는 (af) 서열번호 528(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 529(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 530(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 533(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 534(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 535(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (b) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ii) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iii) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iv) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vi) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vii) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (viii) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ix) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xi) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xii) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiii) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiv) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xv) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvi) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvii) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xviii) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xix) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xx) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxi) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxii) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiii) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiv) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxv) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvi) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvii) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxviii) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxix) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxx) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxxi) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 및/또는 (xxxii) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 항-TfR 항원-결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 또는 (ii) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, TfR-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 다음 배향으로 배열된 도메인을 포함하고: N'-중쇄 가변 영역-경쇄 가변 영역-리소솜 알파 글루코시다제-C' 또는 N'-경쇄 가변 영역-중쇄 가변 영역-리소솜 알파-글리코시다제-C', 선택적으로, scFv 및 리소솜 알파-글루코시다제는 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, 선택적으로, scFv 가변 영역은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m- (서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 리소솜 알파-글루코시다제를 포함하며, VH, VL, 및 리소솜 알파-글루코시다제는 다음과 같이 배열된다: (i) VL-VH-리소솜 알파-글루코시다제; (ii) VH-VL-리소솜 알파-글루코시다제; (iii) VL-[(GGGGS)3]-VH-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제; 또는 (iv) VH-[(GGGGS)3]-VL-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 다중 도메인 치료 단백질에 대한 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩서열은 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩서열은 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항원-결합 단백질을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및/또는 (ii) 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (2) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (3) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (4) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (5) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (6) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (7) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (8) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (9) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (10) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (11) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (12) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (13) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (14) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (15) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (16) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (17) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (18) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (19) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (20) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (21) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (22) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (23) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (24) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (25) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (26) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (27) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (28) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (29) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (30) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (31) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (32) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (1) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (2) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 218(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 219(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 220(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 223(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 224(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 225(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (b) 서열번호 228(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 229(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 230(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 233(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 234(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 235(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (c) 서열번호 238(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 239(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 240(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 243(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 244(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 245(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (d) 서열번호 248(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 249(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 250(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 253(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 254(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 255(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (e) 서열번호 258(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 259(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 260(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 263(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 264(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 265(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (f) 서열번호 268(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 269(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 270(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 273(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 274(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 275(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (g) 서열번호 278(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 279(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 280(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 283(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 284(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 285(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (h) 서열번호 288(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 289(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 290(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 293(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 294(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 295(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (i) 서열번호 298(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 299(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 300(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 303(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 304(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 305(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (j) 서열번호 308(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 309(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 310(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 313(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 314(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 315(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (k) 서열번호 318(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 319(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 320(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 323(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 324(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 325(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (l) 서열번호 328(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 329(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 330(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 333(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 334(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 335(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (m) 서열번호 338(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 339(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 340(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 343(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 344(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 345(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (n) 서열번호 348(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 349(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 350(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 353(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 354(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 355(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (o) 서열번호 358(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 359(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 360(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 363(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 364(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 365(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (p) 서열번호 368(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 369(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 370(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 373(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 374(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 375(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (q) 서열번호 378(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 379(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 380(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 383(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 384(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 385(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (r) 서열번호 388(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 389(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 390(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 393(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 394(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 395(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (s) 서열번호 398(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 399(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 400(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 403(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 404(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 405(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (t) 서열번호 408(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 409(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 410(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 413(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 414(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 415(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (u) 서열번호 418(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 419(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 420(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 423(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 424(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 425(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 428(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 429(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 430(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 433(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 434(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 435(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (w) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 448(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 449(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 450(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 453(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 454(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 455(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (y) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (z) 서열번호 468(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 469(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 470(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 473(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 474(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 475(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (aa) 서열번호 478(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 479(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 480(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 483(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 484(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 485(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ab) 서열번호 488(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 489(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 490(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 493(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 494(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 495(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ac) 서열번호 498(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 499(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 500(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 503(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 504(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 505(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ad) 서열번호 508(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 509(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 510(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 513(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 514(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 515(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ae) 서열번호 518(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 519(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 520(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 523(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 524(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 525(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및/또는 (af) 서열번호 528(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 529(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 530(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 533(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 534(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 535(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (a) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (b) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ii) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iii) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iv) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vi) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vii) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (viii) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ix) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xi) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xii) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiii) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiv) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xv) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvi) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvii) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xviii) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xix) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xx) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxi) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxii) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiii) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiv) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxv) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvi) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvii) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxviii) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxix) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxx) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxxi) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 및/또는 (xxxii) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: (i) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 또는 (ii) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, TfR-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 다음 배향으로 배열된 도메인을 포함하고: N'-중쇄 가변 영역-경쇄 가변 영역-리소솜 알파 글루코시다제-C' 또는 N'-경쇄 가변 영역-중쇄 가변 영역-리소솜 알파-글리코시다제-C', 선택적으로, scFv 및 리소솜 알파-글루코시다제는 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고, 선택적으로, scFv 가변 영역은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 리소솜 알파-글루코시다제를 포함하며, VH, VL, 및 리소솜 알파-글루코시다제는 다음과 같이 배열된다: (i) VL-VH-리소솜 알파-글루코시다제; (ii) VH-VL-리소솜 알파-글루코시다제; (iii) VL-[(GGGGS)3]-VH-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제; 또는 (iv) VH-[(GGGGS)3]-VL-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제. 일부 이러한 조성물에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, scFv 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 551을 포함하는 scFv를 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화고CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 CpG-고갈된다.
일부 이러한 조성물에서, 조성물은 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN); (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는 (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열 번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음의 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형된다. 일부 이러한 조성물에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA 및 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 일부 이러한 조성물에서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 이러한 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 이러한 조성물에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 다음 몰비로 4개의 지질을 포함한다: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG.
일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하거나, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 세포는 신생아 세포이고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, 세포는 신생아 세포가 아니고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체이다. 일부 이러한 조성물에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
또 다른 양태에서, 상기 조성물 중 임의의 것을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 간 세포는 헤파토사이트이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포가 아니다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 양태에서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다.
일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근, 심장, 및/또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다.
또 다른 양태에서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법은 신생아 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 리소솜 알파-글루코시다제 활성에 대해 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%만큼 리소솜 알파-글루코시다제 활성을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차 또는 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 핵산 작제물을 대상체에 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력이다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제에 대한 코딩 서열을 포함하는 작제물을 포함하는 조성물이 제공되며, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈된다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 조성물에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA이다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터이다. 일부 이러한 조성물에서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터이다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 CpG-고갈된다.
일부 이러한 조성물은 표적 게놈 유전자좌 내 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이며, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN); (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는 (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 작용제는 (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하며, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재한다. 일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이다. 일부 이러한 조성물에서, (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나; (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열 번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나; (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성된다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음의 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형된다. 일부 이러한 조성물에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA 및 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함한다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 일부 이러한 조성물에서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. 일부 이러한 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 이러한 조성물에서, 스텔스 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG)이다. 일부 이러한 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 이러한 조성물에서, 지질 나노입자는 다음 몰비로 4개의 지질을 포함한다: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG.
일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물에서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합된다. 일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고, 핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 이러한 조성물은 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 상기 조성물 중 임의의 것을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 리소솜 알파-글루코시다제는 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 리소솜 알파-글루코시다제는 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 간 세포는 헤파토사이트이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포이다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 신생아 세포가 아니다. 일부 이러한 세포에서, 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 세포 또는 세포 집단에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아니다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포에서 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간 세포이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 간세포이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 신생아 세포가 아니다.
또 다른 양태에서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 양태에서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 폼페병을 갖는다. 또 다른 양태에서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료한다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장 조직, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 수준을 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다.
또 다른 양태에서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법은 대상체에 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하며, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 유아 발병 폼페병이다. 일부 이러한 방법에서, 폼페병은 후기 발병 폼페병이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 리소솜 알파-글루코시다제를 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다.
일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 리소솜 알파-글루코시다제를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 발현을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 리소솜 알파-글루코시다제를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 증가시킨다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득한다. 일부 이러한 방법에서, 방법은 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, (I) 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하거나; (II) 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성한다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 이러한 방법에서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
일부 이러한 방법에서, 방법은 핵산 작제물을 대상체에 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력이다. 일부 이러한 방법에서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여된다.
도 1은 성체 및 신생아 마우스에서 시험된 상이한 인간 인자 IX(hFIX) 삽입 템플릿을 설명하는 개략도를 나타낸다.
도 2a는 에피솜 hFIX(에피솜), LNP-g666 + hFIX-HDR-500 템플릿(HDR500), LNP-g666 + hFIX-HDR-800 템플릿(HDR800), 및 LNP-g666 + hFIX-NHEJ 템플릿(NHEJ)의 투여 후 상이한 시점에서의 신생아 마우스(그룹당 n = 4-10; 수컷 및 암컷) 및 성체 마우스(그룹당 n = 5; 암컷)의 hFIX 혈장 수준을 나타낸다. 신생아 마우스에서의 투여는 P0 또는 P1에서 발생하였다. 식염수가 주사된 마우스가 음성 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 로그 스케일로 나타나 있다. 도 2b는 에피솜 hFIX(에피솜), LNP-g666 + hFIX-HDR-500 템플릿(HDR500), LNP-g666 + hFIX-HDR-800 템플릿(HDR800), 및 LNP-g666 + hFIX-NHEJ 템플릿(NHEJ)의 투여 후 상이한 시점에서의 신생아 마우스(그룹당 n = 4-10; 수컷 및 암컷)의 hFIX 혈장 수준을 나타낸다. 신생아 마우스에서의 투여는 P0 또는 P1에서 발생하였다. 식염수가 주사된 마우스가 음성 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 선형 스케일로 나타나 있다.
도 3은 인간 알부민(ALB) 인트론 1을 표적화하는 sgRNA 9860 및 Cas9 mRNA를 함유하는 지질 나노입자인 LNP-g9860 및 항-CD63:GAA 삽입 템플릿으로 패키징된 재조합 AAV8(rAAV8) 캡시드의 개략도를 나타낸다.
도 4는 항-CD63 scFv에 대한 융합을 통한 리소솜에 GAA를 표적화하는 개략도를 나타낸다.
도 5는 ALB 유전자좌에서의 항-CD63:GAA 삽입 템플릿의 CRISPR/Cas9-매개 삽입에 대한 개략도를 나타낸다. 인간 ALB 유전자좌가 도시되며, Cas9 절단 부위는 가위로 표시된다. 삽입 템플릿에서 항-CD63:GAA 전이유전자를 플랭킹하는 스플라이스 수용체 부위가 도시된다. 내인성 ALB 프로모터에 의해 유도된 삽입 및 전사 후, 파선으로 도해된 ALB 엑손 1과 삽입된 항-CD63:GAA DNA 템플릿 사이에 스플라이싱이 발생하여 하이브리드 ALB-항-CD63:GAA mRNA를 생성한다. ALB 신호 펩타이드는 항-CD63:GAA 분비를 촉진하고, 단백질 성숙 동안 제거되어 혈장 내 항-CD63:GAA를 수득한다.
도 6은 성체 폼페병 모델의 수컷 및 암컷 마우스(n = 12; GAA -/-; CD63 hu/hu)에 LNP-g666(1 mg/kg)과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(1.2e13 vg/kg)("삽입)"의 투여 후 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV(4e12 vg/kg)("에피솜")의 투여 후 10개월의 시간 경과에 걸쳐 혈청 내 항-CD63:GAA의 수준을 나타낸다.
도 7은 성체 폼페병 모델의 수컷 및 암컷 마우스(n = 12; GAA -/-; CD63 hu/hu)에 LNP-g666과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿의 투여 후 10개월차 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV의 투여 후 10개월차에 폼페병 모델 마우스(GAA -/-; CD63 hu/hu)의 심장, 사두근, 횡격막, 및 척수 내 글리코겐 수준을 나타낸다. 야생형 GAA 마우스(GAA +/+; CD63 hu/hu; n = 4) 및 치료되지 않은 폼페병 모델 마우스(n = 4)가 대조군으로 사용되었다. 수평 점선은 검정의 검출 하한이다.
도 8a 및 도 8b는 신생아(P1) 폼페병 모델 마우스(GAA -/-; CD63 hu/hu)에 LNP-g666과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(n = 10; 수컷 및 암컷: "삽입")의 투여 후 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV(n = 6; 수컷 및 암컷; "에피솜")의 투여 후 15개월의 시간 경과에 걸쳐 혈청 내 항-CD63:GAA의 수준을 나타낸다. 수평 점선은 검정의 검출 하한이다. 도 8a의 오류 막대는 ± SD이고, 도 8b의 오류 막대는 ± SEM이다.
도 9a는 신생아(P1) 마우스에 LNP-g666과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(n = 5; 수컷 및 암컷: "I")의 투여 후 3개월차 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV(n = 3; 수컷 및 암컷; "E")의 투여 후 3개월차에 폼페병 모델 마우스(GAA -/-; CD63 hu/hu)의 심장, 사두근, 비복근, 및 횡격막 내 글리코겐 수준을 나타낸다. 치료되지 않은 폼페병 모델 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 9b는 신생아(P1) 마우스에 LNP-g666과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(n = 10; 수컷 및 암컷: "I")의 투여 후 15개월차 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV(n = 6; 수컷 및 암컷; "E")의 투여 후 15개월차에 폼페병 모델 마우스(GAA -/-; CD63 hu/hu)의 심장, 사두근, 비복근, 횡격막, 대뇌, 및 척수 내 글리코겐 수준을 나타낸다. 치료되지 않은 폼페병 모델 마우스("U") 및 야생형 마우스("W")가 대조군으로 사용되었다.
도 10은 신생아(P1) 마우스에 LNP-g666과 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(n = 10; 수컷 및 암컷: "P1 삽입 AAV + LNP")의 투여 후 15개월차 또는 항-CD63:GAA를 인코딩하는 에피솜 AAV(n = 6; 수컷 및 암컷; "P1 에피솜 AAV")의 투여 후 15개월차에 폼페병 모델 마우스(GAA -/-; CD63 hu/hu)의 악력을 나타낸다. 야생형 GAA 마우스(GAA +/+; CD63 hu/hu; "야생형") 및 치료되지 않은 폼페병 모델 마우스("치료되지 않은 KO")가 대조군으로 사용되었다.
도 11은 1차 인간 플라스마시토이드(plasmacytoid) DC 기반 검정에서 IFNα ELISA에 의해 측정된 IFNα 반응을 나타낸다. 다양한 rAAV6 CpG-고갈된 항-CD63:GAA 템플릿이 제1 세대(비-CpG-고갈됨) 항-CD63:GAA 템플릿과 비교하여 시험되었다. rAAV6-GFP가 양성 대조군으로 사용되고, CpG-고갈된(0 CpG) F9 템플릿이 음성 대조군으로 사용되었다.
도 12는 rAAV2에 의한 전달 후 1차 인간 헤파토사이트의 알부민 유전자좌 내로 다양한 항-CD63:GAA 및 항-TfR:GAA 삽입 템플릿의 삽입 후 배지 내 GAA 효소적 활성을 나타낸다.
도 13은 rAAV6에 의한 전달 후 1차 인간 헤파토사이트의 알부민 유전자좌 내로 다양한 항-CD63:GAA 삽입 템플릿의 삽입 후 배지 내 GAA 효소적 활성을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 LNP-g666 및 다양한 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿의 투여 후 GAA -/- 마우스에서의 GAA 혈청 발현을 나타낸다. 치료되지 않은 KO 및 치료되지 않은 WT 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 15는 인간 알부민(ALB) 인트론 1을 표적화하는 sgRNA 9860 및 Cas9 mRNA를 함유하는 지질 나노입자인 LNP-g9860 및 항-TfR:GAA 삽입 템플릿으로 패키징된 재조합 AAV8(rAAV8) 캡시드의 개략도를 나타낸다.
도 16은 항-TfR scFv에 대한 융합을 통한 다수의 경로를 통해 GAA를 표적화하는 개략도를 나타낸다.
도 17은 ALB 유전자좌에서의 항-TfR:GAA 삽입 템플릿의 CRISPR/Cas9-매개 삽입에 대한 개략도를 나타낸다. 인간 ALB 유전자좌가 도시되며, Cas9 절단 부위는 가위로 표시된다. 삽입 템플릿에서 항-TfR;GAA 전이유전자를 플랭킹하는 스플라이스 수용체 부위가 도시된다. 내인성 ALB 프로모터에 의해 유도된 삽입 및 전사 후, 파선으로 도해된 ALB 엑손 1과 삽입된 항-TfR:GAA DNA 템플릿 사이에 스플라이싱이 발생하여 하이브리드 ALB-항-TfR:GAA mRNA를 생성한다. ALB 신호 펩타이드는 항-TfR:GAA 분비를 촉진하고, 단백질 성숙 동안 제거되어 혈장 내 항-TfR:GAA를 수득한다.
도 18a 내지 도 18c는 항-인간 TfR 항체 클론이 GAA를 Tfrc hum 마우스의 대뇌로 전달하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 각각의 레인 = 한 마리의 마우스. Wt 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 양성 대조군으로 사용되었다. Tfrc hum 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 19는 항-hTfR 항체 클론의 하위 세트가 성숙 GAA를 scfv:GAA 형식(HDD에 의해 전달됨)으로 뇌 실질로 전달하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다. Wt 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 양성 대조군으로 사용되었다. Tfrc hum 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 20은 4개의 선택된 항-hTfR 항체 클론이 성숙 GAA를 scfv:GAA 형식(AAV8 에피솜 간 데포 유전자 요법)으로 뇌 실질로 전달하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다. Wt 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 양성 대조군으로 사용되었다. Tfrc hum 마우스의 항-마우스 mTfR:GAA가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 21은 3개의 선택된 에피솜 AAV8 간 데포 항-hTfR 항체 클론이 성숙 GAA를 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 CNS, 심장, 및 근육으로 전달하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 4개의 선택된 에피솜 AAV8 간 데포 항-hTfR 항체 클론이 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 CNS, 심장, 및 근육 내 글리코겐 저장을 구제(rescue)하는 것을 나타낸다. Wt 치료되지 않은 마우스가 양성 대조군이고, Gaa -/- 치료되지 않은 마우스가 음성 대조군이었다.
도 22c는 선택된 에피솜 AAV8 간 데포 항-hTfR 항체 클론이 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 배근 신경절(DRG) 내 글리코겐 저장을 구제하는 것을 나타낸다. Wt 치료되지 않은 마우스가 양성 대조군이고, Gaa -/- 치료되지 않은 마우스가 음성 대조군이었다.
도 23a 내지 도 23d는 3개의 선택된 에피솜 AAV8 간 데포 항-hTfR 항체 클론이 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 뇌 시상(도 23a), 뇌의 대뇌 피질(도 23b), 및 뇌 해마 CA1(도 23c), 및 사두근(도 23d) 내 글리코겐 저장을 구제하는 것을 나타낸다. Wt 치료되지 않은 마우스가 양성 대조군이고, Gaa -/- 치료되지 않은 마우스가 음성 대조군이었다.
도 24a는 항-hTfR 12847scfv:GAA의 삽입이 성숙 GAA 단백질을 폼페 모델 마우스의 CNS 및 근육에 전달하는 것을 나타낸다. 도 24b는 항-hTfR 12847scfv:GAA의 삽입이 폼페 모델 마우스의 CNS 및 근육 내 글리코겐 저장을 구제하는 것을 나타낸다. 일원 ANOVA *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. 치료되지 않은 폼페병 모델 마우스 및 야생형 마우스가 대조군으로 사용되었다. 재조합 AAV8 항-TfR:GAA 에피솜 템플릿이 주사된 마우스가 양성 대조군으로 사용되었다. LNP-g666 없이 재조합 AAV8 항-TfR:GAA 삽입 템플릿이 주사된 마우스가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 25a 및 도 25b는 rAAV6에 의한 전달 후 1차 인간 헤파토사이트의 알부민 유전자좌 내로 다양한 항-TfR:GAA 삽입 템플릿(CpG 고갈된 및 자연)의 삽입 후 배지 내의 GAA 효소적 활성을 나타낸다.
도 26a는 항-인간 TfR 항체 클론(0 CpG 및 자연)이 LNP-g666(3 mg/kg) 및 다양한 재조합 AAV8 항-TfR:GAA 또는 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿으로 정맥내 투여된 3개월령의 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 뇌에 GAA를 전달하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 각각의 레인 = 한 마리의 마우스.
도 26b는 항-hTfR:GAA의 알부민 삽입이 LNP-g666(3 mg/kg) 및 다양한 재조합 AAV8 항-TfR:GAA 또는 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿으로 정맥내 투여된 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 대뇌, 사두근, 횡격막, 및 심장 내의글리코겐 저장을 구제하는 것을 나타낸다. 글리코겐 수준은 투여 후 3주차에 측정되었다. Wt 치료되지 않은 마우스가 양성 대조군이고, Gaa -/- 치료되지 않은 마우스가 음성 대조군이었다.
도 27a는 CpG 고갈된 항-CD63:GAA 템플릿 및 LNP-g9860을 함유하는 재조합 AAV8이 투여된 시노몰구스 원숭이(cynomolgus macaque)의 형광측정 기질 검정을 사용하여 측정된 혈청 내 GAA 활성을 나타낸다. 3 mg/kg LNP 용량과 함께 3개의 상이한 AAV8 용량(0.3e13vg/kg, 1.5e13vg/kg, 및 5.6e13vg/kg)이 사용되었다. 비히클 대조군 그룹 N=1, 투여된 그룹 N=3.
도 27b는 CpG 고갈된 항-CD63:GAA 템플릿 및 LNP-g9860을 함유하는 재조합 AAV8이 투여되었던 시노몰구스 원숭이로부터의 조직 용해물 내 성숙 GAA의 발현을 나타낸다. 3 mg/kg LNP 용량과 함께 3개의 상이한 AAV8 용량(0.3e13vg/kg, 1.5e13vg/kg, 및 5.6e13vg/kg)이 사용되었다. 비히클 대조군 그룹 N=1, 투여된 그룹 N=3. 조직을 희생 시 수집하고(89일차), GAA의 76 kDa 리소솜 형태의 존재에 대해 웨스턴 블롯에 의해 규명하였다.
정의
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 코딩된 및 비-코딩된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체성 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드와 같은 변형되었던 중합체를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 지칭한다.
단백질은 "N-말단"과 "C-말단"을 갖는 것으로 언급된다. 용어 "N-말단"은 유리 아민기(-NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결된 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작을 지칭한다. 용어 "C-말단"은 유리 카르복실기(-COOH)에 의해 종결된 아미노산 사슬(단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부를 지칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 포함한다. 이들은 단일 가닥, 이중 가닥, 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 기타 자연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-자연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
핵산은 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 갖는 것으로 언급되는데, 이는 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 결합을 통해 일 방향으로 이의 이웃 3' 산소에 부착되도록 하는 방식으로 모노뉴클레오타이드가 반응되어 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 때문이다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않은 경우 "5' 단부"로 지칭된다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 이의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않은 경우 "3' 단부"로 지칭된다. 핵산 서열은 더 큰 올리고뉴클레오타이드에 내재하더라도 또한 5' 및 3' 단부를 갖는 것으로 언급될 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 불연속 요소는 "상류" 또는 "하류"의 5' 또는 3' 요소로 지칭된다.
용어 "게놈적으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되도록 세포 내로 도입되었던 핵산을 지칭한다. 임의의 프로토콜이 핵산을 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입하는 데 사용될 수 있다.
용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로의 패키징에 충분하거나 이를 허용하는 요소를 포함하는 재조합 핵산을 지칭한다. 벡터 및/또는 입자는 DNA, RNA, 또는 다른 핵산을 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 세포 내로 전이시키는 목적에 활용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 알려져 있다.
세포, 조직(예를 들어, 간 샘플), 단백질, 및 핵산에 대한 용어 "단리된"은 세포, 조직(예를 들어, 간 샘플), 단백질, 및 핵산의 실질적으로 순수한 조제물을 포함하여 이에 이르기까지 인시츄로 보통 존재할 수 있는 다른 박테리아, 바이러스, 세포, 또는 다른 성분에 대해 상대적으로 정제된 세포, 조직(예를 들어, 간 샘플), 단백질, 및 핵산을 포함한다. 용어 "단리된"은 또한 자연 발생 대응물을 갖지 않고, 화학적으로 합성되었으며, 따라서 다른 세포, 조직(예를 들어, 간 샘플), 단백질, 및 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않거나, 이들이 자연적으로 수반하는 대부분의 다른 성분(예를 들어, 세포성 성분)(예를 들어, 다른 세포성 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 또는 세포성 성분)으로부터 분리 또는 정제되었던 세포, 조직(예를 들어, 간 샘플), 단백질, 또는 핵산을 포함한다.
용어 "야생형"은 정상(돌연변이나 질환에 걸리거나 변경된 것 등과 대조적임) 상태 또는 맥락에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 갖는 독립체를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 대개 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다.
용어 "내인성 서열"은 세포 또는 동물 내에서 자연적으로 발생하는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 인간의 내인성 ALB 서열은 인간 내의 ALB 유전자좌에서 자연적으로 발생하는 자연 ALB 서열을 지칭한다.
"외인성" 분자 또는 서열은 보통 해당 형태로는 세포에 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상 존재는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련된 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은 예를 들어 세포 내의 상응하는 내인성 서열의 돌연변이 버전, 예컨대 내인성 서열의 인간화 버전을 포함할 수 있거나, 세포 내의 내인성 서열에 상응하지만 상이한 형태(즉, 염색체 내에 존재하지 않음)의 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에 특정 발단 단계의 특정 세포에서 해당 형태로 보통 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 동일한 분자에서 함께 자연적으로 발생하지 않는 적어도 2개의 세그먼트를 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 용어 "이종성"은 핵산의 세그먼트 또는 단백질의 세그먼트와 관련하여 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계(예를 들어, 함께 접합된)로 발견되지 않는 둘 이상의 하위-서열을 포함함을 나타낸다. 일례로, 핵산 벡터의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 회합되어 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 세그먼트이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종성 영역은, 자연에서 코딩 서열과 회합되어 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹되는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 단백질의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 펩타이드 분자와 회합되어 발견되지 않는 또 다른 펩타이드 분자 내에 있거나 이에 부착된 아미노산의 세그먼트이다(예를 들어, 융합 단백질 또는 태그가 있는 단백질). 유사하게, 핵산 또는 단백질은 이종성 표지 또는 이종성 분비 또는 위치 결정 서열을 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"(즉, "코돈 최적화된" 서열)는 아미노산을 특정하는 3개의 염기쌍 코돈 조합의 다양성으로 나타나는 코돈의 축퇴를 이용하고, 일반적으로 자연 아미노산 서열을 유지하면서 자연 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특정 숙주 세포에서의 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 자연 발생 핵산 서열과 비교하여 세균 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는 소정의 원핵 또는 진핵 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈으로 치환하도록 변형될 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어 "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 입수 가능하다. 이들 표는 다수의 방식으로 조정될 수 있다. 문헌[Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화에 대한 컴퓨터 알고리즘이 또한 입수 가능하다(예를 들어, Gene Forge 참조).
용어 "유전자좌"는 유기체의 게놈 염색체 상의 유전자(또는 유의한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-인코딩 서열, 또는 자리의 특정 위치를 지칭한다. 예를 들어, "ALB 유전자좌"는 이러한 서열이 잔류하는 곳으로서 식별되었던 유기체의 게놈 염색체 상의 ALB 유전자, ALB DNA 서열, 알부민-인코딩 서열, 또는 ALB 자리의 특정 위치를 지칭할 수 있다. "ALB 유전자좌"는 예를 들어 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR), 또는 이들의 조합을 포함하는 ALB 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 자연적으로 존재하는 경우, 적어도 하나의 코딩 및 적어도 하나의 비-코딩 영역을 함유할 수 있는 염색체 내의 DNA 서열을 지칭한다. 생성물(예를 들어, 비제한적으로 RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 코딩하는 염색체 내의 DNA 서열은 유전자가 전장 mRNA(5' 및 3' 비번역 서열 포함)에 상응하도록 5' 단부와 3' 단부 둘 모두 상의 코딩 영역에 인접하게 위치한 비-코딩 인트론 및 서열이 개재된 코딩 영역을 포함할 수 있다. 추가적으로, 조절 서열(예를 들어, 비제한적으로 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위, 사일런서(silencer), 인슐레이션 서열(insulating sequence), 및 기질 부착 영역을 포함하는 기타 비-코딩 서열이 유전자에 존재할 수 있다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 근접하거나(예를 들어, 비제한적으로 10 kb 이내) 원거리 부위에 있을 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이체 형태를 지칭한다. 일부 유전자는 다양한 상이한 형태를 갖고, 이는 염색체 상의 동일한 위치 또는 유전적 유전자좌에 위치한다. 이배체 유기체는 각각의 유전적 유전자좌에 2개의 대립유전자를 갖는다. 각각의 쌍의 대립유전자는 특정 유전적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 존재하는 경우, 동형접합성으로서 기재되고, 2개의 대립유전자가 상이한 경우, 이형접합성으로서 기재된다.
"프로모터"는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 폴리머라제 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 일반적으로 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조정한다. 프로모터는 본원에 개시된 하나 이상의 세포 유형(예를 들어, 마우스 세포, 랫트 세포, 만능 세포, 단세포 단계(one-cell stage) 배아, 분화된 세포, 또는 이들의 조합)에서 활성일 수 있다. 프로모터는 예를 들어 구성적 활성 프로모터, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 시간적 제약 프로모터(예를 들어, 발달적 조절 프로모터), 또는 공간적 제약 프로모터(예를 들어, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는 예를 들어 국제공개 WO 2013/176772호에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
"작동 가능한 결합" 또는 "작동 가능하게 결합된"은 둘 모두의 성분이 정상적으로 작용하고 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 하는 가능성을 허용하는 둘 이상의 성분(예를 들어, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어하는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 인접하거나 트랜스로 작용하는 이러한 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 거리를 두고 작용할 수 있음).
본원에 제공된 방법 및 조성물은 다양한 상이한 성분을 이용한다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 일부 성분은 활성 변이체 및 단편을 가질 수 있다. 용어 "기능적"은 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 단백질 또는 핵산(또는 이의 단편 또는 변이체)의 선천성 능력을 지칭한다. 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 기능은 원래의 분자와 비교하여 동일할 수 있거나 실제로 변경될 수 있으나(예를 들어, 이들의 특이성 또는 선택성 또는 효능에 관하여). 분자의 기본적인 생물학적 기능은 보유한다.
용어 "변이체"는 집단에 가장 우세한 서열과 상이한(예를 들어, 1개 뉴클레오타이드만큼) 뉴클레오타이드 서열 또는 집단에 가장 우세한 서열과 상이한(예를 들어, 1개 아미노산만큼) 단백질 서열을 지칭한다.
용어 "단편"은 단백질을 지칭할 때, 전장 단백질보다 더 짧거나 더 적은 수의 아미노산을 갖는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 지칭할 때, 전장 핵산보다 더 짧거나 더 적은 수의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산을 의미한다. 단편은 예를 들어 단백질 단편을 지칭할 때, N-말단 단편(즉, 단백질의 C-말단 단부 중 일부의 제거), C-말단 단편(즉, 단백질의 N-말단 단부 중 일부의 제거), 또는 내부 단편(즉, 단백질의 각각의 N-말단 및 C-말단 단부 중 일부의 제거)일 수 있다. 단편은 예를 들어 핵산 단편을 지칭할 때, 5' 단편(즉, 핵산의 3' 단부 중 일부의 제거), 3' 단편(즉, 핵산의 5' 단부 중 일부의 제거), 또는 내부 단편(즉, 핵산의 각각의 5' 및 3' 단부 중 일부의 제거)일 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 범위에 걸쳐 최대 상응도에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 대개 보존적 아미노산 치환에 의해 달라지며, 이때, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되므로 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 인해 달라질 때, 서열 동일성 퍼센트는 치환의 보존적 성질에 대해 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 달라지는 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이러한 조절을 수행하기 위한 수단은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이것은 완전한 불일치보다는 부분적인 것으로 보존적 치환의 점수를 매기는 것을 포함하며, 이로 인해 서열 동일성 백분율을 증가시킨다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고, 비-보존적 치환에 0의 점수가 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 점수는 예를 들어 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 구현된 바와 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열(완벽하게 일치하는 잔기의 최대 수)을 비교함으로써 결정된 값을 포함하며, 비교 범위에서의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 일부는 2개의 서열의 최적의 정렬에 대한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 모두의 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 범위 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 더 짧은 서열은 연결된 이종성 서열을 포함함), 비교 범위는 비교되는 2개의 서열 중 더 짧은 것의 전체 길이이다.
달리 명시되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 포함한다: 50의 GAP 가중치와 3의 길이 가중치를 사용한 뉴클레오타이드 서열에 대한 %동일성과 %유사성 및 nwsgapdna.cmp 스코어링 매트릭스; 8의 GAP 가중치와 2의 길이 가중치를 사용한 아미노산 서열에 대한 %동일성과 %유사성 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스; 또는 이들의 임의의 동등한 프로그램. "동등한 프로그램"은 당해 임의의 2개의 서열에 대하여, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 일치 및 동일한 서열 동일성 퍼센트를 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 비극성(소수성) 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 또는 류신을 또 다른 비-극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 아르기닌과 라이신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이와 같이 하나의 극성(친수성) 잔기를 또 다른 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 추가적으로, 염기성 잔기, 예컨대 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘을 또 다른 염기성 잔기로 치환하는 것, 또는 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산을 또 다른 산성 잔기로 치환하는 것은 보존적 치환의 추가적인 예이다. 비-보존적 치환의 예는 극성(친수성) 잔기, 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 또는 라이신을 비극성(소수성) 아미노산 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌으로 치환하는 것 및/또는 비극성 잔기를 극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 전형적인 아미노산 범주화는 하기 요약되어 있다.
[표 1]
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"상동성" 서열(예를 들어, 핵산 서열)은 알려진 기준 서열과 동일하거나 실질적으로 유사하여 알려진 기준 서열과 예를 들어 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하도록 하는 서열을 포함한다. 상동성 서열은 예를 들어 이종상동성(orthologous) 서열 및 동종상동성(paralogous) 서열을 포함할 수 있다. 상동성 유전자는 예를 들어 전형적으로 종분화 사건(이종상동성 유전자) 또는 유전적 복제 사건(동종상동성 유전자)을 통해 공통의 조상 DNA 서열로부터 계통이 이어진다. "이종상동성" 유전자는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 포함한다. 이종상동체는 전형적으로 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. "동종상동성" 유전자는 게놈 내에서의 복제와 관련된 유전자를 포함한다. 동종상동체는 진화의 과정에서 새로운 기능을 진화시킬 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공 환경 및 인공 환경(예를 들어, 시험 튜브 또는 단리된 세포나 세포주) 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체내"는 자연 환경(예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체) 및 자연 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체외"는 개체의 신체로부터 제거되었던 세포 및 이러한 세포 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)가 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인을 포함한다: CH1, CH2, 및 CH3. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 본원에 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역이 개재된 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 초가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 축약될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 축약될 수 있음). 용어 "고친화력" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™ 또는 용액 친화력 ELISA에 의해 측정된 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M; 적어도 10-11 M; 또는 적어도 10-12 M의 이들의 표적에 대한 결합 친화력을 갖는 이들 항체를 지칭한다. 용어 "항체"는 예를 들어 단클론 또는 다클론과 같은 임의의 유형의 항체를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 예를 들어 포유류 또는 비-포유류과 같은 임의의 기원일 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 포유류 또는 조류일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 항체는 인간 기원일 수 있고, 추가로 인간 단클론 항체일 수 있다.
문구 "이중 특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중 특이적 항체는 일반적으로 2개의 상이한 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원) 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중 특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화력은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화력보다 적어도 1배 내지 2배 또는 3배 또는 4배 크기만큼 더 낮을 것이고, 그 반대도 그러할 것이다. 이중 특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상)에 존재할 수 있다. 이중 특이적 항체는 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 제작될 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있으며, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포 내에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중 특이적 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR에 이어서(N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 2개의 중쇄 및 항원 결합 특이성을 부여하지 않으나 각각의 중쇄와 회합될 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 항원 결합 영역에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합될 수 있고 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 면역글로불린 경쇄를 갖는다.
문구 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한, 중쇄 가변 영역을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄 단편은 CDR, CDR과 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 이후 (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프 인식) 세포로부터 발현 및 분비될 수 있고 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
문구 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한, 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 경쇄 가변(VL) 도메인은 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는 예를 들어 항원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합되는 제1 또는 제2 항원에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 적합한 경쇄는 기존 항체 라이브러리(웨트 라이브러리(wet library) 또는 인실리코)에서 가장 일반적으로 이용되는 경쇄에 대한 스크리닝에 의해 식별될 수 있는 것들을 포함하며, 경쇄는 항원 결합 단백질의 항원 결합 도메인의 친화력 및/또는 선택성을 실질적으로 간섭하지 않는다. 적합한 경쇄는 항원 결합 단백질의 항원 결합 영역에 의해 결합되는 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 포함한다.
문구 "가변 도메인"은 (달리 명시되지 않는 한) N-말단에서 C-말단으로의 서열에서 다음 아미노산 영역: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄(원하는 대로 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조를 갖는 표준 도메인(VH 또는 VL)으로 접힐 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 베타 시트는 제1 베타 시트와 제2 베타 시트 잔기 사이에 이황화 결합에 의해 연결된다.
문구 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 내 2개의 프레임워크 영역들 사이에서 일반적으로(즉, 야생형 동물에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어 생식계열 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열 및 예를 들어 자연 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 상황(예를 들어, CDR3의 경우)에서, CDR은 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 인접하지 않지만 예를 들어 서열을 스플라이싱하거나 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)한 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 인접한 둘 이상의 서열(예를 들어, 생식계열 서열)에 의해 인코딩될 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편, 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편, 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌[Ward et al. (1989) Nature 241:544-546]), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 접합되어 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하는 Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH로 구성된 scFv를 포함한다. 단쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 디아바디(diabody)가 또한 용어 "항체"에 포함된다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
문구 "Fc-함유 단백질"은 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능적 부분을 포함하는 항체, 이중 특이적 항체, 면역접합제(immunoadhesin), 및 기타 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부분"은 Fc 수용체(예를 들어, FcyR; 또는 FcRn, 즉, 신생 Fc 수용체)에 결합할 수 있고/있거나 보체 활성에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 지칭한다. CH2 및 CH3 영역이 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없고 보체를 활성화할 수 없도록 만드는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 기타 변형을 함유하는 경우, CH2 및 CH3 영역은 기능적이지 않다.
Fc-함유 단백질은 변형이 결합 단백질의 하나 이상의 이펙터 기능에 영향을 미치는 경우(예를 들어, FcyR 결합, FcRn 결합에 영향을 미치며, 따라서 반감기 및/또는 CDC 활성을 영향을 미치는 변형)를 포함하여 면역글로불린 도메인의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 면역글로불린 불변 영역의 EU 넘버링에 대한 다음 변형 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.
제한으로서가 아닌 예로서, 결합 단백질은 Fc-함유 단백질이고, (열거된 변형(들)을 갖지 않는 동일한 Fc-함유 단백질과 비교하여) 향상된 혈청 반감기를 나타내고, 위치 250(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T), 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433(예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 갖는다. 또 다른 예에서, 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591(예를 들어, V259I), 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단백질"은 본 발명의 세포 특이적 항원 및/또는 표적 항원과 같은 항원 상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드 또는 단백질(기능성 단위로 복합체화된 하나 이상의 폴리펩타이드)을 지칭한다. 항원 결합 단백질은 다중 특이적일 수 있다. 항원 결합 단백질과 대한 용어 "다중 특이적"은 단백질이 동일한 항원 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식함을 의미한다. 본 발명의 다중 특이적 항원 결합 단백질은 단일 다중 기능적 폴리펩타이드일 수 있거나, 이는 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 회합된 둘 이상의 폴리펩타이드의 다량체성 복합체일 수 있다. 용어 "항원 결합 단백질"은 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 이와 공동 발현될 수 있는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의해) 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대 단백질 또는 이의 단편에 기능적으로 연결되어 제2 결합 특이성을 갖는 이중 특이적 또는 다중 특이적 항원 결합 분자를 생성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 다중 특이적 항원 결합 폴리펩타이드에 의해 인식되는 항원 부분을 지칭한다. 단일 항원(예컨대, 항원성 폴리펩타이드)은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위 세트이고, 항원 결합 폴리펩타이드와 항원 사이의 상호작용의 친화력에 직접적으로 기여하는 이들 잔기로 정의된다. 에피토프는 입체배위적, 즉, 비-선형 아미노산으로 구성될 수도 있다. 특정한 실시형태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적으로 활성 표면의 그룹화인 결정기를 포함할 수 있고, 특정한 실시형태에서, 특이적 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출 시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리 시 소실된다.
용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 도메인은 세포 특이적 또는 표적 항원에 결합한다. 본원에 사용된 세포 특이적 항원 또는 표적 항원 결합 도메인 등은 항원에 특이적으로 결합하는 자연 발생, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다.
상호교환적으로 사용되는 용어 "반-체(half-body)" 또는 "반-항체(half-antibody)"는 본질적으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하는 항체의 절반을 지칭한다. 항체의 중쇄는 이량체를 형성할 수 있으며, 따라서 하나의 반-체의 중쇄는 상이한 분자(예를 들어, 또 다른, 반-체) 또는 또 다른 Fc-함유 폴리펩타이드와 관련된 중쇄와 회합될 수 있다. 2개의 약간 상이한 Fc-도메인은 이중 특이적 항체 또는 다른 헤테로이량체, 헤테로삼량체, 헤테로사량체 등의 형성에서 "헤테로이량체화"될 수 있다. 문헌[Vincent and Murini (2012) Biotechnol. J. 7(12):1444-1450]; 및 문헌[Shimamoto et al. (2012) MAbs 4(5):586-91]을 참조한다. 일 실시형태에서, 반-체 가변 도메인은 내재화 이펙터를 특이적으로 인식하고, 반-체 Fc-도메인은 대체 효소(예를 들어, 펩티바디(peptibody))를 포함하는 Fc-융합 단백질과 이량체화한다.
용어 "단쇄 가변 단편" 또는 "svFc"는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 함유하는 단쇄 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 및 VL은 10개 내지 25개의 아미노산의 링커 서열에 의해 연결된다. ScFV 폴리펩타이드는 또한 다른 아미노산 서열, 예컨대 CL 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. ScFc는 파지 디스플레이에 의해 제작되거나, 하이브리도마 또는 C-세포로부터의 중쇄와 경쇄를 직접 서브클로닝하여 제작될 수 있다. 문헌[Ahmad et al. (2012) Clin. Dev. Immunol. 2012:980250]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 인간의 맥락에서 용어 "신생아"는 최대 1세(52주) 또는 그 이하의 연령, 바람직하게는 최대 24주 또는 그 이하의 연령, 보다 바람직하게는 최대 12주 또는 그 이하의 연령, 더욱 바람직하게는 최대 8주 또는 그 이하의 연령, 그리고 보다 더 바람직하게는 최대 4주 또는 그 이하의 연령의 인간 대상체를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 4주령이다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 8주령이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 7일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 6일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 5일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 4일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1일 이내이다. 상기 개시된 시간 범위는 인간 대상체에 대한 것이며, 또한 다른 동물에 상응하는 발달 시간 범위를 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 "신생아 세포"는 신생아 대상체의 세포이고, 신생아 세포 집단은 신생아 대상체의 세포 집단이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 대조군 샘플 또는 대조군 대상체에서의 "대조군"은 측정, 예를 들어 질환의 징후 또는 증상의 진단 측정에 대한 비교체이다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 더 이른 시점에서, 예를 들어 치료 개입 전의 동일한 대상체로부터의 대상체 샘플일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 정상 대조군, 예를 들어 대상체 샘플 내의 효소 농도 또는 활성을 제공하기 위해 정상 대상체, 즉, 치료되는 대상체의 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 측정일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 정상 대조군은 집단 대조군, 즉, 일반적인 집단에서 대상체의 평균일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 동일한 질환이 있는 치료되지 않은 대상체일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 상이한 요법, 예를 들어 표준 치료로 치료된 대상체일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 비교되는 대상체의 질환이 있는 대상체의 자연사 연구(natural history study)로부터의 대상체 또는 대상체의 집단일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 시험되는 대상체에 대한 특정 인자, 예를 들어 연령, 성별이 일치한다. 특정한 실시형태에서, 대조군은 특정 실험실, 예를 들어 임상 실험실에 대한 대조군 수준일 수 있다. 적절한 대조군의 선택은 당업자의 능력 내에 있다.
하나 이상의 열거된 요소를 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는(comprise)" 또는 "포함하는(include)" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 구성성분과 조합하여 함유할 수 있다. 전이 문구 "~로 본질적으로 구성되는"은 청구범위의 범주가 청구범위에서 열거된 특정 요소 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 용어 "~로 본질적으로 구성되는"은 본 발명의 청구범위에서 사용될 때, "포함하는(comprising)"과 동등한 것으로 해석되도록 의도되지 않는다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명되는 시건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고 설명은 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 사건 또는 상황이 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
값의 범위의 표시는 그 범위 내의 또는 그 범위를 정의하는 모든 정수 및 그 범위 내의 정수에 의해 정의되는 모든 하위범위를 포함한다. 예를 들어, 5개 내지 10개의 뉴클레오타이드는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 뉴클레오타이드로 이해되는 반면, 5% 내지 10%는 5% 및 10%까지 가능한 모든 값을 보유하는 것으로 이해된다.
20개의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 17개의 뉴클레오타이드는 제공된 서열의 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되므로 명확하게 이해될 바와 같이 구체적으로 제공되지 않더라도 상한을 제공한다. 유사하게, 최대 3개의 뉴클레오타이드는 0개, 1개, 2개, 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어, 구체적으로 제공되지 않더라도 하한을 제공한다. "적어도", "최대", 또는 다른 유사한 언어가 수를 수식할 때, 일련의 각각의 수를 수식하는 것으로 이해될 수 있다.
본원에 사용된 "이하" 또는 "미만"은 문구에 인접한 값으로 이해되고, 논리적 하위 값 또는 정수는 문맥에서 논리적으로 0으로 이해된다. 예를 들어, "2개 이하의 뉴클레오타이드 염기 쌍"의 듀플렉스 영역은 2개, 1개, 또는 0개의 뉴클레오타이드 염기쌍을 갖는다. 일련의 숫자 또는 범위 이전에 "이하" 또는 "미만"이 존재할 때, 일련의 또는 범위의 각각의 숫자가 수식되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "분석물을 검출하는 것" 등은 존재하는 경우 분석물이 검출될 수 있는 검정을 수행하는 것으로 이해되며, 분석물은 검정의 검출 수준 초과의 양으로 존재한다.
본원에 사용된 "기능 손실"은 임의의 이유로 인해 활성이 존재하지 않고, 예를 들어 효소 활성이 존재하지 않는 것으로 이해된다. 특정한 실시형태에서, 활성의 부재는 기능을 갖는 단백질의 부재로 인한 것일 수 있으며, 예를 들어 단백질은 전사 또는 번역되지 않고, 단백질은 번역되나 안정하지 않거나 세포내 또는 전신으로 적절하게 수송되지 않는다. 특정 실시형태에서, 활성의 부재는 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 절두(truncation), 비정상적 스플라이싱의 존재로 인한 것이어서 단백질이 존재하나, 기능적이지 않을 수 있다. 기능 손실은 기능의 부분적 또는 완전한 손실일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 다양한 정도의 기능 손실은 다양한 병태, 질환의 중증도, 및 발병 연령을 초래하는 것으로 알려질 수 있다. 본원에 사용된 기능 손실은 바람직하게는 예를 들어 스트레스 반응 또는 기능적 단백질의 순간적 손실을 초래하는 다른 반응으로 인한 일시적 기능 손실이 아니다. 단백질의 기능 손실을 치유하기 위한 치료적 개입은 결핍된 단백질 또는 기능 손실은 보상되나 기능이 상실된 단백질과 상이한 서열 또는 구조를 갖는 단백질의 기능 손실에 대한 보상을 포함할 수 있다. 하나의 단백질의 기능 손실은 동일한 생물학적 경로의 또 다른 단백질의 활성을 제공 또는 변경함으로써 보상될 수 있는 것으로 이해된다. 특정한 실시형태에서, 기능 손실을 보상하는 단백질은 하나 이상의 절두, 돌연변이, 또는 비-자연 서열을 포함하여 세포내 또는 전신으로 단백질을 직접적으로 트래피킹(trafficking)하여 단백질의 기능 손실을 극복한다. 치료적 개입은 모든 세포 유형 또는 조직의 단백질의 기능 손실을 치유할 수 있거나, 그러하지 않을 수 있다. 치료적 개입은 단백질 결여 기능이 전형적으로 발현되는 부위, 예를 들어 결핍이 세포 또는 기관의 기능장애를 초래하는 부위로부터 먼 부위에서 기능 손실을 보상하기 위한 단백질의 발현을 포함할 수 있다. 치료적 개입은 간에서 먼 부위에서의 기능 손실을 보상하기 위해 간에서의 단백질의 발현을 포함할 수 있다. 다수의 유전적 돌연변이는 인간 및 다른 종 모두에서 특정 기능 돌연변이 손실과 연결되었다.
본원에 사용된 "효소 결핍"은 단백질의 기능 손실로 인한 효소 활성의 불충분한 수준으로 이해된다. 효소 결핍은 부분적이거나 전체적일 수 있고, 기능 손실 수준 및 부위에 따라 효소 결핍의 징후 또는 증상의 발병 시간 또는 중증도가 상이할 수 있다. 본원에 사용된 효소 결핍은 바람직하게는 스트레스 또는 다른 인자로 인한 일시적 효소 결핍이 아니다. 다수의 유전적 돌연변이는 인간 및 다른 종 모두에서 효소 결핍과 연결되었다. 특정한 실시형태에서, 효소 결핍은 선천대사장애를 초래한다. 특정한 실시형태에서, 효소 결핍은 리소솜 저장 질환을 초래한다. 특정한 실시형태에서, 효소 결핍은 갈락토스혈증을 초래한다. 특정한 실시형태에서, 효소 결핍은 출혈 장애를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, 값의 최대량이 100%(예를 들어, 100% 억제 또는 100% 캡슐화)로 표시될 때, 값은 검출 방법에 의해 제한되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 100% 억제는 검정의 검출 수준 미만의 수준으로의 억제로서 이해되고, 100% 캡슐화는 캡슐화에 의도된 재료가 소포 외부에서 검출될 수 없는 것으로 이해된다.
맥락으로부터 달리 명백하지 않는 한, 용어 "약"은 명시된 값의 ± 5% 값을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 용어 "약"은 당업계 내의 허용 편차 또는 오차, 예를 들어 평균으로부터 2의 표준 편차, 또는 측정을 취하는 데 사용되는 방법의 민감도, 또는 예를 들어 연령에 대한 당업계에서 허용되는 값의 퍼센트를 포함하는 것으로 이해된다. 일련의 제1 값 전에 "약"이 존재할 때, 이는 일련의 각각의 값을 수식하는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 관련된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합뿐만 아니라 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 지칭하고, 또한 해당 목록의 구성원들의 임의의 조합을 포함한다.
단수형 형태의 관사는 문맥상 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수형 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 단백질" 또는 "적어도 하나의 단백질"은 복수의 단백질을 이들의 혼합물을 포함하여 포함할 수 있다.
통계학적으로 유의하다는 것은 p ≤0.05를 의미한다.
본 출원의 서열과 수탁 번호에서 표시된 수탁번호 또는 위치 사이에 충돌이 있는 경우, 본 출원의 서열이 우세하다.
I. 개요
관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하거나 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체에서 발현하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 대상체에서의 효소 결핍의 치료 방법, 리소솜 저장 질환의 치료 방법, 및 효소 결핍 또는 리소솜 저장 질환의 징후 또는 증상의 발현을 예방 또는 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 또한 제공된다.
특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 신생아 대상체에서의 GAA 결핍 치료, 조직 내 글리코겐 축적 감소, 폼페병의 치료, 또는 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단이 또한 제공된다.
본원에 기재된 신생아 유전자 삽입 플랫폼은 신생아에서의 기존 에포솜 플랫폼에 대해 발현 수준, 발현 영속성, 및 효소 결핍의 기능적 구제 수준의 측면에서 이점을 갖는다.
다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)의 발현을 위한 핵산 작제물 및 조성물(예를 들어, 에포솜 발현 벡터)이 또한 본원에 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로 삽입되고/되거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 발현되도록 하는 핵산 작제물 및 조성물이 또한 본원에 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 핵산을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체의 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 또는 삽입하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 발현시키는 방법, 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 글리코겐 축적을 감소시키는 방법, 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍의 치료 방법, 및 신생아 세포 및 대상체를 포함하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 기반으로 하고, 선택적으로 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 8(rAAV8)에 함유된 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) DNA 유전자 삽입 템플릿과 회합된 지질 나노입자(LNP) 전달 시스템이 선택적으로 함유된 치료적 생성물이 본원에 기재된다. CRISPR/Cas9 성분은 이중 가닥 DNA를 표적화하고 이를 표적 유전자 유전자좌(예를 들어, 헤파토사이트의 ALB 유전자 유전자좌와 같은 세이프 하버 유전자좌(safe harbor locus))에서 절단하도록 설계되어 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) DNA 템플릿이 표적 게놈 유전자좌의 게놈 내로 삽입되도록 하였다. 전이유전자 삽입은 폼페병 환자의 누락 또는 결함 게놈 GAA를 인코딩하는 기능적 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 유전자를 제공한다.
본원에 개시된 작제물의 일부 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열은 자연 GAA 코딩 서열과 비교하여 발현에 최적화된다. 예를 들어, 본원에 개시된 작제물의 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위(cryptic splice site)의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 작제물의 다른 다중 도메인 치료적 단백질의 코딩 서열은 자연 GAA 코딩 서열을 포함한다.
II. 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 삽입하고 세포 또는 신생아 세포에서 발현시키기 위한 조성물
관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 알부민(ALB) 유전자좌 내로 삽입하고/하거나 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 발현하도록 하는 핵산 작제물 및 조성물이 본원에 제공된다. 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 발현을 위한 핵산 작제물 및 조성물(예를 들어, 에포솜 발현 벡터)이 또한 본원에 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합하고/하거나 세포 또는 대상체에서 발현하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로의 핵산 작제물의 통합을 용이하게 하는 뉴클레아제 작용제(예를 들어, 내인성 ALB 유전자좌 표적화) 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다.
다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 알부민(ALB) 유전자좌 내로 삽입되고/되거나 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질) 코딩 서열이 발현되도록 하는 핵산 작제물 및 조성물이 또한 본원에 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질(예를 들어, GAA 융합 단백질)의 발현을 위한 핵산 작제물 및 조성물(예를 들어, 에포솜 발현 벡터)이 또한 본원에 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체 내로 도입하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 표적 게놈 유전자좌 내로 십입 또는 통합하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체에서 발현시키는 방법, 대상체의 세포 또는 세포 집단 또는 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법, 및 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍의 치료 방법에 사용될 수 있다. 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 내인성 ALB 유전자좌 내로의 핵산 작제물의 통합을 용이하게 하는 뉴클레아제 작용제(예를 들어, 내인성 ALB 유전자좌 표적화) 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다.
A. 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물
본원에 기재된 조성물 및 방법은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열(예를 들어, 외인성 폴리펩타이드 코딩 서열)을 포함하는 핵산 작제물의 사용을 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 관심 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 관심 폴리펩타이드의 역상보(reverse complement) 코딩 서열(예를 들어, 외인성 폴리펩타이드 코딩 서열 또는 외인성 폴리펩타이드 코딩 서열의 역상보)을 포함하는 핵산 작제물의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 작제물은 세포에서 관심 폴리펩타이드의 발현을 위한 것일 수 있다. 이러한 핵산 작제물은 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 뉴클레아제 작용제 또는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 생성된 절단 부위 또는 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하기 위한 것일 수 있다. 용어 절단 부위는 닉(nick) 또는 이중 가닥 파단부가 뉴클레아제 작용제(예를 들어, 가이드 RNA와 복합체화된 Cas9 단백질)에 의해 생성된 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중 가닥 파단부는 가이드 RNA와 복합체화된 Cas9 단백질, 예를 들어 스파이 Cas9 가이드 RNA와 복합체화된 스파이 Cas9 단백질에 의해 생성된다. 일부 경우, 관심 폴리펩타이드는 본원에 정의된 외인성 폴리펩타이드이다.
특정 예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열(다중 도메인 치료적 단백질 핵산)을 포함하는 핵산 작제물의 사용을 포함한다. 이러한 핵산 작제물은 세포에서 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 위한 것일 수 있다. 이러한 핵산 작제물은 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 뉴클레아제 작용제 또는 CRISPR/Cas 시스템에 의한 절단 부위에서의 절단 후 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하기 위한 것일 수 있거나, 표적 게놈 유전자좌 또는 절단 부위 내로의 삽입 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현(예를 들어, 에피솜에서)을 위한 것일 수 있다. 용어 절단 부위는 닉 또는 이중 가닥 파단부가 뉴클레아제 작용제(예를 들어, 가이드 RNA와 복합체화된 Cas9 단백질)에 의해 생성된 DNA 서열을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 절단 부위는 이중 가닥 파단부가 가이드 RNA와 복합체화된 Cas9 단백질, 예를 들어 스파이 Cas9 가이드 RNA와 복합체화된 스파이 Cas9 단백질에 의해 생성된 DNA 서열을 포함한다.
본원에 개시된 핵산 작제물의 길이는 달라질 수 있다. 작제물은 예를 들어 약 1 kb 내지 약 5 kb, 예컨대 약 1 kb 내지 약 4.5 kb 또는 약 1 kb 내지 약 4 kb일 수 있다. 예시적인 핵산 작제물은 약 1 kb 내지 약 5 kb 길이 또는 약 1 kb 내지 약 4 kb 길이이다. 대안적으로, 핵산 작제물은 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 2.5 kb, 약 2.5 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 4.5 kb, 또는 약 4.5 kb 내지 약 5 kb의 길이일 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물은 예를 들어 5 kb 이하, 4.5 kb 이하, 4 kb 이하, 3.5 kb 이하, 3 kb 이하, 또는 2.5 kb 이하의 길이일 수 있다.
작제물은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 단일 가닥 및 부분적으로 이중 가닥일 수 있고, 선형 또는 원형(예를 들어, 미니원형) 형태로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 2010/0047805호, 미국 특허 US 2011/0281361호, 및 미국 특허 US 2011/0207221호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 선형 형태로 도입되는 경우, 작제물의 단부는 알려진 방법에 의해(예를 들어, 엑소뉴클레오용해성(exonucleolytic) 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나 또는 양쪽 단부에 결찰될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963] 및 문헌[Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하는 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같이 변형된 뉴클레오타이드간 연결부의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 작제물은 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입할 수 있다. 작제물은 바이러스 요소를 생략할 수 있다. 또한, 작제물은 노출된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.
본원에 개시된 작제물은 필요에 따라 그리고 하나 이상의 기능적 이점을 부여하기 위해 하나 이상의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 하나 또는 양쪽 단부에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 작제물을 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 방법(들)(예를 들어, 바이러스 벡터 전달 또는 전달용 지질 나노입자 내로의 패키징 사용)에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 역말단 반복부(ITR), 헤어핀, 루프, 및 환상체(toroid)와 같은 기타 구조와 같은 말단 구조를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 작제물은 1개, 2개, 또는 3개의 ITR을 포함할 수 있거나, 2개 이하의 ITR을 포함할 수 있다. 구조적 변형의 다양한 방법은 알려져 있다.
일부 작제물은 삽입 부위에서 내인성 프로모터(예를 들어, 작제물이 숙주 세포의 ALB 유전자좌 내로 통합될 때의 내인성 ALB 프로모터)에 의해 이들의 발현이 유도되도록 삽입될 수 있다. 이러한 작제물은 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질)의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질)의 발현은 숙주 세포의 프로모터(예를 들어, 전이유전자가 숙주 세포의 ALB 유전자좌 내로 통합될 때의 내인성 ALB 프로모터)에 의해 유도될 수 있다. 이러한 경우, 작제물은 이의 발현을 유도하는 제어 요소(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)가 결여될 수 있다(예를 들어, 프로모터가 없는 작제물). 그렇지만, 다른 경우, 작제물은 에피솜에서 또는 통합 시 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질)의 발현을 유도하는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직-특이적(예를 들어, 간- 또는 혈소판-특이적) 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 작제물은 발현을 위한 것이나 삽입을 위한 것은 아닌 작제물(예를 들어, 에피솜 작제물)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 작제물은 삽입을 위한 것이 아니다. 비제한적인 예시적인 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(CMV: cytomegalovirus immediate early promoter), 시미안 바이러스(SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기(MLP: adenovirus major late) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV: Rous sarcoma virus) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV: mouse mammary tumor virus) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK: phosphoglycerate kinase) 프로모터, 신장 인자-알파(EF1a: elongation factor-alpha) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 기능적 단편, 또는 전술한 것들 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터 또는 절두형 CMV 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적 유도성 프로모터는 열 충격, 빛, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 유도가능한 것들을 포함한다. 유도성 프로모터는 Tet-On® 프로모터(Clontech)와 같은 낮은 기저(비-유도) 발현 수준을 갖는 것일 수 있다. 발현에 필요하지는 않지만, 작제물은 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 펩타이드를 인코딩하는 추가적인 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호와 같은 전사 또는 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 작제물은 신호 펩타이드를 인코딩하는 신호 서열에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류의 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질)를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질)를 인코딩하는 핵산의 상동성-독립적 삽입에서 작동한다. 이러한 핵산 작제물은 예를 들어 비-분열 세포(예를 들어, 상동성 재조합(HR)이 아닌 비-상동성 단부 접합(NHEJ)이 이중 가닥 DNA 파단이 복구되는 주요 메커니즘인 세포) 또는 분열 세포(예를 들어, 활발하게 분열하는 세포)에서 작동할 수 있다. 이러한 작제물은 예를 들어 상동성-독립적 공여체 작제물일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터 및 다른 조절 서열은 인간에서 사용하기에 적절하고, 예를 들어 인간 세포, 예를 들어 인간 간 세포의 조절 인자에 의해 인식되고, 인간에서의 사용을 위해서 규제 기관에 의해 용인된다. 간 특이적 프로모터의 예는 TTR 프로모터, 예컨대 인간 또는 마우스 TTR 프로모터를 포함한다. 일례에서, 작제물은 TTR 프로모터, 예컨대 마우스 TTR 프로모터 또는 인간 TTR 프로모터를 포함할 수 있다(예를 들어, 관심 폴리펩타이드 또는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 TTR 프로모터에 작동 가능하게 연결됨). 일례에서, 작제물은 SERPINA1 인핸서, 예컨대 마우스 SERPINA1 인핸서 또는 인간 SERPINA1 인핸서를 포함할 수 있다(예를 들어, 관심 폴리펩타이드 또는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 SERPINA1 인핸서에 작동 가능하게 연결됨). 일례에서, 작제물은 TTR 프로모터 및 SERPINA1 인핸서, 예컨대 인간 SERPINA1 인핸서 및 마우스 TTR 프로모터를 포함할 수 있다(예를 들어, 관심 폴리펩타이드 또는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 SERPINA1 인핸서 및 TTR 프로모터에 작동 가능하게 연결됨).
본원에 개시된 작제물은 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 소기의 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특성을 포함하거나 제외하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 일부 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 본원에 개시된 일부 작제물은 비-상동성 단부 접합에 의해 뉴클레아제 작용제에 대한 표적 DNA 서열의 절단 부위 또는 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다(예를 들어, 세이프 하버 유전자, 예컨대 ALB 유전자좌 내로 삽입될 수 있음). 예를 들어, 이러한 작제물은 본원에 개시된 바와 같이 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어 SpyCas9 CRISPR/Cas 시스템)에 의한 절단 후 평활 단부 이중 가닥 파단부 내로 삽입될 수 있다. 특정 예에서, 작제물은 AAV를 통해 전달될 수 있고, 비-상동성 단부 접합(예를 들어, 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않음)에 의해 삽입을 할 수 있다.
특정한 예에서, 작제물은 상동성-독립적 표적화 통합을 통해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 작제물의 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)은 뉴클레아제 작용제에 대한 표적 부위(예를 들어, 표적화된 삽입을 위해 표적 DNA 서열에서와 동일한 표적 부위(예를 들어, 세이프 하버 유전자) 및 동일한 뉴클레아제 작용제가 표적화된 삽입을 위해 표적 DNA 서열을 절단하는 데 사용됨)에 의해 각각의 측면 상에 플랭킹될 수 있다. 이어서, 뉴클레아제 작용제는 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)에 의해 플랭킹된 표적 부위를 절단할 수 있다. 특정 예에서, 작제물은 AAV-매개 전달에 의해 전달되고, 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)에 의해 플랭킹된 표적 부위의 절단은 AAV의 역말단 반복부(ITR)를 제거할 수 있다. 일부 경우, 표적화된 삽입을 위한 표적 DNA 서열(예를 들어, 세이프 하버 유전자좌의 표적 DNA 서열, 예컨대 플랭킹하는 포토스페이서 인접 모티프를 포함하는 gRNA 표적 서열)은 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)이 절단 부위 또는 표적 DNA 서열 내로 올바른 배향으로 삽입되는 경우 더 이상 존재하지 않지만, 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)이 절단 부위 또는 표적 DNA 서열 내로 반대 배향으로 삽입되는 경우 재형성된다. 이는 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)이 발현을 위한 올바른 배향으로 삽입되도록 도울 수 있다.
본원에 개시된 작제물은 폴리아데닐화 서열 또는 폴리아데닐화 테일 서열(예를 들어, 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열의 하류 또는 3')을 포함할 수 있다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열을 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. 폴리아데닐화 테일 서열은 예를 들어 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열의 하류에서 "폴리-A" 신전부로서 인코딩될 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 아데닌 및 선택적으로 최대 300개의 아데닌을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리-A 테일은 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만, UAUAAA 또는 AU/GUAAA와 같은 변이체가 식별되었다. 예를 들어, 문헌[Proudfoot (2011) Genes & Dev. 25(17):1770-82]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 용어 폴리아데닐화 신호 서열은 전사의 종료 및 mRNA 전사물에 대한 폴리-A 테일의 첨가를 지시하는 임의의 서열을 지칭한다. 진핵생물에서, 전사 종결자는 단백질 인자에 의해 인식되고, 종결에 뒤이어, 폴리(a) 폴리머라제의 존재 하에 폴리(a) 테일을 mRNA 전사물에 첨가하는 과정인 폴리아데닐화가 이어진다. 포유류 폴리(a) 신호는 전형적으로 약 45개 뉴클레오타이드 길이인 코어 서열로 구성되며, 이는 절단 및 폴리아데닐화 효율을 향상시키는 역할을 하는 다양한 보조 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 코어 서열은 절단 및 폴리아데닐화-특이성 인자(CPSF)에 의해 인식되는 폴리 A 인식 모티프 또는 폴리 A 인식 서열로 지칭되는 mRNA의 고도로 보존된 상류 요소(AATAAA 또는 AAUAAA) 및 절단 자극 인자(CstF)에 의해 결합되는 정의가 불충분한 하류 영역(U 또는 G 및 U가 풍부함)으로 구성된다. 사용될 수 있는 전사 종결자의 예는 예를 들어 인간 성장 호르몬(HGH) 폴리아데닐화 신호, 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 폴리아데닐화 신호, AOX1 전사 종결 서열, CYC1 전사 종결 서열, 또는 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절하기에 적합한 것으로 알려진 임의의 전사 종결 서열을 포함한다. 일례에서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호이다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 712, 169, 또는 161을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 169 또는 161을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 169를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 712를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 또는 CpG 고갈된 BGH 폴리아데닐화 신호이다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 162를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
본원에 개시된 작제물은 또한 스플라이스 수용체 부위(관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)에 작동 가능하게 연결됨), 예컨대 관심 폴리펩타이드의 코딩 서열(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 융합 단백질 코딩 서열)의 상류 또는 5'를 포함할 수 있다. 스플라이스 수용체 부위는 예를 들어 NAG를 포함하거나 NAG로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 ALB 스플라이스 수용체(예를 들어, ALB의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, ALB 엑손 2 스플라이스 수용체))이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 ALB 유전자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 유전자(예를 들어, 마우스 ALB의 엑손 1 및 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 Alb 스플라이스 수용체(즉, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체))로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자로부터의 스플라이스 수용체(예를 들어, GAA 스플라이스 수용체)이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 GAA 유전자로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이러한 스플라이스 수용체는 마우스 GAA 유전자로부터 유래될 수 있다. 인공 스플라이스 수용체를 포함하는 진핵생물에 유용한 추가적인 적합한 스플라이스 수용체 부위는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Shapiro et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:7155-7174] 및 문헌[Burset et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:255-259]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체이다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 서열번호 163을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물은 양방향 작제물일 수 있으며, 이는 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물은 일방향 작제물일 수 있으며, 이는 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. 마찬가지로, 일부 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물은 본원 다른 곳에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 또는 rAAV8) 및/또는 지질 나노입자 내에 존재할 수 있다.
(1) 관심 폴리펩타이드 및 다중 도메인 치료적 단백질
임의의 관심 폴리펩타이드는 본원에 기재된 핵산 작제물에 의해 인코딩될 수 있다. 일례에서, 관심 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드(예를 들어, 신생아 대상체에서 결여되거나 결핍된 폴리펩타이드)이다. 일례에서, 관심 폴리펩타이드는 효소이다.
관심 폴리펩타이드는 분비된 폴리펩타이드(예를 들어, 세포에 의해 분비되고/되거나 가용성 세포외 단백질로 기능적으로 활성인 단백질)일 수 있다. 대안적으로, 관심 폴리펩타이드는 세포내 폴리펩타이드(예를 들어, 세포에 의해 분비되지 않고/되거나 가용성 세포기질 폴리펩타이드를 포함하는 세포 내에서 기능적으로 활성인 단백질)일 수 있다.
관심 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드일 수 있다. 대안적으로, 관심 폴리펩타이드는 변이 또는 돌연변이 폴리펩타이드일 수 있다.
일례에서, 관심 폴리펩타이드는 간 단백질(예를 들어, 간에서 내인성으로 생성되고/되거나 간에서 기능적으로 활성인 단백질)이다. 또 다른 예에서, 관심 폴리펩타이드는 간에 의해 생성된 순환 단백질일 수 있다. 또 다른 예에서, 관심 폴리펩타이드는 비-간 단백질일 수 있다.
관심 폴리펩타이드는 외인성 폴리펩타이드일 수 있다. "외인성" 폴리펩타이드 코딩 서열은 외인성 공급원에서 숙주 세포 게놈 내의 부위(예를 들어, ALB 인트론 1을 포함하는 세이프 하버 유전자좌와 같은 게놈 유전자좌에서)로 도입되었던 코딩 서열을 지칭할 수 있다. 즉, 외인성 폴리펩타이드 코딩 서열은 이의 삽입 부위에 대해 외인성이고, 이러한 외인성 코딩 서열로부터 발현된 관심 폴리펩타이드는 외인성 폴리펩타이드로 지칭된다. 외인성 코딩 서열은 자연 발생되거나 조작될 수 있고, 야생형 또는 변이체일 수 있다. 외인성 코딩 서열은 외인성 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열 이외에 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위). 외인성 코딩 서열은 야생형 또는 변이체(예를 들어, 돌연변이)로서 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하는 코딩 서열일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 관심 코딩 서열(야생형 또는 변이체로서)을 함유하더라도, 동일한 코딩 서열 또는 이의 변이체가 외인성 공급원으로서(예를 들어, 고도로 발현되는 유전자좌에서의 발현을 위해) 도입될 수 있다. 외인성 코딩 서열은 또한 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 게놈에서 자연적으로 발생하지 않는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 코딩 서열일 수 있다. 외인성 코딩 서열은 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있거나(예를 들어, 핵산 서열은 수용체 세포에 내인성이 아님), 이의 삽입 부위 및/또는 이의 수용체 세포에 대해 외인성일 수 있다.
일례에서, 관심 폴리펩타이드는 유전적 효소 결핍과 관련된 폴리펩타이드이다. 특정한 실시형태에서, 유전적 효소 결핍은 질환의 유아 발병을 초래한다. 특정한 실시형태에서, 유전적 효소 결핍은 신생아 스크리닝으로 진단될 수 있거나 일반적으로 진단된다. 특정한 실시형태에서, 효소 결핍은 발병 연령이 질환의 유아 발병 형태 및 질환의 후기 발병 형태(예를 들어, 아동, 청소년, 또는 성인 발병 형태)를 포함하도록 다양한 중증도의 질환으로 나타낼 수 있다.
일례에서, 관심 폴리펩타이드는 리소솜 알파-글루코시다제(GAA) 폴리펩타이드이다.
또 다른 예에서, 관심 폴리펩타이드는 다중 도메인 치료적 단백질이다. 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질은 내재화 이펙터(세포 내로 내재화될 수 있거나 막 트래피킹을 역행하는 데 달리 참여하거나 기여하는 단백질)에 대한 결합을 제공하는 전달 도메인에 연결되거나 융합된 리소솜 알파-글루코시다제(GAA; 예를 들어 GAA 효소 대체 활성 제공)를 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질의 예는 국제공개 WO 2013/138400호, 국제공개 WO 2017/007796호, 국제공개 WO 2017/190079호, 국제공개 WO 2017/100467호, 국제공개 WO 2018/226861호, 국제공개 WO 2019/157224호, 및 국제공개 WO 2019/222663호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예를 들어, 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질은 리소솜 알파-글루코시다제(GAA)에 연결되거나 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함할 수 있다. CD63-결합 도메인 및 GAA는 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. CD63-결합 도메인은 내재화 인자 CD63에 대한 결합을 제공한다. 다중 도메인 치료적 단백질은 근육에서 고도로 발현된 신속한 내재화 단백질인 CD63을 표적화함으로써 근육에 표적화된다. 일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, CD63-결합 전달 도메인은 GAA에 공유 연결된다. 공유 연결은 임의의 형태의 공유 결합(예를 들어, 전자의 공유를 수반하는 임의의 결합)일 수 있다. 일부 경우, 공유 결합은 GAA 및 CD63-결합 전달 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 융합 단백질로서의 연속적 폴리펩타이드 사슬을 형성하도록 하는 2개의 아미노산들 사이의 펩타이드 결합이다. 일부 경우, GAA 부분 및 CD63-결합 전달 도메인 부분은 직접 연결된다. 다른 경우, 링커, 예컨대 펩타이드 링커가 2개의 부분을 구속(tether)하는 데 사용된다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 문헌[Chen et al., "Fusion protein linkers: property, design and functionality," 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013)]을 참조한다. 일부 경우, 절단 가능한 링커가 사용된다. 예를 들어, 카텝신 절단 가능한 링커가 CD63-결합 전달 도메인과 GAA 사이에 삽입되어 리소솜에서 CD63-결합 전달 도메인의 제거를 용이하게 할 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 아미노산 서열, 예를 들어 약 10개의 아미노산 길이, 예를 들어 Gly4Ser(서열번호 600)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 또는 10 반복부를 포함할 수 있다. 일례에서, 링커는 3개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 713). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 715-719 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 2개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 714). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 720-726 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 1개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 600). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 727을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, GAA는 항-CD63 항체의 중쇄의 C-말단 또는 경쇄의 C-말단에 공유 연결된다. 또 다른 특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, GAA는 항-CD63 항체의 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 공유 연결된다. 또 다른 특정한 실시형태에서, GAA는 항-CD63 scFv 도메인의 C-말단에 연결된다.
또 다른 예로서, 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질은 리소솜 알파-글루코시다제(GAA)에 연결되거나 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함할 수 있다. TfR-결합 도메인 및 GAA는 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. TfR-결합 도메인은 내재화 인자 TfR에 대한 결합을 제공한다. 간에 의해 생성된 다중 도메인 치료적 단백질은 근육 및 뇌 내피세포에서 발현되는 TfR을 표적화함으로써 근육 및 CNS에 표적화된다. 이들 세포에서 TfR의 통과세포외배출은 혈액-뇌-장벽 횡단을 가능하게 한다. 일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, TfR-결합 전달 도메인은 GAA에 공유 연결된다. 공유 연결은 임의의 형태의 공유 결합(예를 들어, 전자의 공유를 수반하는 임의의 결합)일 수 있다. 일부 경우, 공유 결합은 GAA 및 TfR-결합 전달 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 융합 단백질로서의 연속 폴리펩타이드 사슬을 형성하도록 하는 2개의 아미노산들 사이의 펩타이드 결합이다. 일부 경우, GAA 부분 및 TfR-결합 전달 도메인 부분은 직접 연결된다. 다른 경우, 링커, 예컨대 펩타이드 링커가 2개의 부분을 구속하는 데 사용된다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 문헌[Chen et al., "Fusion protein linkers: property, design and functionality," 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013)]을 참조한다. 일부 경우, 절단 가능한 링커가 사용된다. 예를 들어, 카텝신 절단 가능한 링커가 TfR-결합 전달 도메인과 GAA 사이에 삽입되어 리소솜에서 TfR-결합 전달 도메인의 제거를 용이하게 할 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 아미노산 서열, 예를 들어 약 10개의 아미노산 길이, 예를 들어 Gly4Ser(서열번호 600)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 또는 10 반복부를 포함할 수 있다. 일례에서, 링커는 3개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 713). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 715-719 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 2개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 714). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 720-726 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, 링커는 1개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 600). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 727을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, GAA는 항-TfR 항체의 중쇄의 C-말단 또는 경쇄의 C-말단에 공유 연결된다. 또 다른 특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, GAA는 항-TfR 항체의 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 공유 연결된다. 또 다른 특정한 실시형태에서, GAA는 항-TfR scFv 도메인의 C-말단에 연결된다.
(a) 리소솜 알파-글루코시다제(GAA)
리소솜 알파-글루코시다제(GAA; 산 알파-글루코시다제, 산 알파-글루코시다제 프리프로단백질, 산 말타즈, 아글루시아다제 알파, 알파-1,4-글루코시다제, 아밀로글루코시다제, 글루코아밀라제, LYAG)는 GAA에 의해 인코딩된다. 이 효소는 리소솜에서 활성이며, 이는 글리코겐을 글루코스로 분해한다.
인간 GAA 유전자(NCBI 유전자ID 2548)는 952개의 아미노산 단백질을 인코딩한다. 리소솜에서, 인간 GAA는 프로테아제에 의해 회합된 상태로 유지되는 76-, 19.4-, 및 3.9-kDa의 폴리펩타이드로 순차적으로 처리된다. R(200)과 A(204) 사이의 추가 절단은 비효율적으로 76-kDa의 폴리펩타이드를 추가적인 10.4-kDa의 폴리펩타이드가 있는 성숙한 70-kDa 형태로 전환한다. GAA 성숙은 7배 내지 10배만큼 글리코겐에 대한 이의 친화력을 증가시킨다. 신호 펩타이드는 아미노산 1-27에 의해 인코딩되고, 프로펩타이드는 아미노산 28-69에 의해 인코딩되고, 신호 펩타이드와 프로펩타이드의 제거 후 리소솜 알파-글루코시다제는 아미노산 70-952에 의해 인코딩되고, 76 kDa의 리소솜 알파-글루코시다제는 아미노산 123-952에 의해 인코딩되고, 70 kDa의 리소솜 알파-글루코시다제는 아미노산 204-952에 의해 인코딩된다.
본원에 개시된 조성물 및 방법으로부터 발현되는 GAA는 임의의 야생형 또는 변이체 GAA일 수 있다. 일례에서, GAA는 인간 GAA 단백질이다. 인간 GAA는 UniProt 참조 번호 P10253로 지정된다. 인간 GAA에 대한 일 예시적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_000143.2로 지정되고, 서열번호 170에 제시된다. 일 예시적인 인간 GAA mRNA(cDNA)서열은 NCBI 수탁번호 NM_000152.5로 지정되고, 서열번호 171에 제 제시된다. 일 예시적인 인간 GAA 코딩 서열은 CCDS ID CCDS32760.1로 지정되고, 서열번호 172에 제시된다. 아미노산 70에서 시작하는(즉, GAA 70-952) 일 예시적인 성숙 인간 GAA 아미노산 서열(즉, 신호 펩타이드와 프로펩타이드의 제거 후 인간 GAA 서열)은 서열번호 173에 제시된다. GAA 70-952에 대한 일 예시적인 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된다.
일부 예에서, GAA(예를 들어, 인간 GAA)는 야생형 GAA(예를 들어, 야생형 인간 GAA) 서열 또는 이의 단편이다. 예를 들어, GAA는 성숙 GAA 아미노산 서열(즉, 신호 펩타이드와 프로펩타이드의 제거 후 GAA 서열)을 포함하는 단편, GAA의 77 kDa 형태를 포함하는 단편, 또는 GAA의 70 kDa 형태를 포함하는 단편일 수 있다. 특정 예에서, GAA는 서열번호 173을 포함할 수 있거나, 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, GAA는 서열번호 173으로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, GAA는 서열번호 173으로 구성될 수 있다.
본원에 개시된 작제물에서 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위의 돌연변이, 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 CpG 디뉴클레오타이드는 작제물의 치료적 유용성을 제한할 수 있다. 먼저, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드는 숙주의 톨(toll)-유사 수용체-9(TLR-9)와 상호작용하여 선천성, 전염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 두번째로, 일단 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되면, 이들은 메틸-CpG 결합 단백질에 의해 배위된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다. 잠적 스플라이스 부위는 보통 스플라이스 부위로서 사용되지 않지만 예를 들어 표준 스플라이스 부위를 비활성화하거나 전에 존재하지 않았던 스플라이스 부위를 생성하는 돌연변이에 의해 활성화될 수 있는 프리-메신저 RNA에서의 서열이다. 정확한 스플라이스 부위 선택은 성공적인 유전자 발현에 중요하고, 잠적 스플라이스 부위의 제거는 정상 또는 의도된 스플라이스 부위의 사용에 유리할 수 있다.
일례에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는다(즉, CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거된다(즉, 완전히 CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고, 하나 이상 또는 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨). 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고(즉, 완전히 CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨).
다양한 GAA 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 다양한 GAA 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 GAA 코딩 서열이 제공된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 175-182 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 181에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 180에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 178에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
다양한 다른 GAA 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
다양한 다른 코돈 최적화된 GAA 코딩 서열이 제공된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 174에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 205에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 206에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 207에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 208에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 209에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 210에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 211에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
일례에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, GAA 코딩 서열은 서열번호 212에 제시된 서열로 구성된다. GAA 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, GAA 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) GAA 단백질(또는 서열을 포함하는 GAA 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 173에 제시된 서열로 구성된 GAA 단백질을 인코딩한다.
특정 GAA 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 GAA 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 작제물 요소가 특정 5'에서 3'으로의 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, GAA 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터 중 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
(b) CD63-결합 전달 도메인
본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질은 GAA에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함할 수 있다. CD63-결합 도메인은 내재화 인자 CD63(UniProt Ref. P08962-1)에 대한 결합을 제공한다. CD63(CD63 항원, 그래눌로피신(granulophysin), 리소솜 관련 막 단백질 3, LAMP-3, 리소솜 통합 막 단백질 1, Limp1, 흑색종 관련 항원 ME491, OMA81H, 안구 흑색종 관련 항원, 테트라스파닌(tetraspanin)-30 또는 Tspan-30으로도 알려짐)은 세포막을 4회 가로지르는 세포 표면 단백질의 테트라스파닌 수퍼패밀리의 구성원이다. 이는 CD63 유전자(MLA1 또는 TSPAN30로도 알려짐)에 의해 인코딩된다. CD63은 사실상 모든 조직에서 발현되고 신호전달 복합체의 형성 및 안정화에 관여하는 것으로 여겨진다. CD63은 세포막, 리소솜 막, 및 후기 엔도솜 막에 편재된다. CD63은 인테그린과 회합되는 것으로 알려지며, 상피-간엽 전이화에 관여될 수 있다.
일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, CD63-결합 전달 도메인은 항체, 항체 단편, 또는 기타 항원-결합 단백질이다. 일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, CD63-결합 전달 도메인은 항원-결합 단백질이다. 항원-결합 단백질의 예는 예를 들어 수용체-융합 분자, 트랩 분자(trap molecule), 수용체-Fc 융합 분자, 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv(scFv) 분자, dAb 단편, 단리된 상보 결정 영역(CDR), CDR3 펩타이드, 속박 FR3-CDR3-FR4 펩타이드(constrained FR3-CDR3-FR4 peptide), 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅 항체, 디아바디, 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디, 나노바디, 1가 나노바디, 2가 나노바디, 소형 모듈 면역약제(SMIP: small modular immunopharmaceutical), 낙타과 항체(VHH 중쇄 동종이량체성 항체), 및 상어 가변 IgNAR 도메인을 포함한다. CD63-결합 전달 도메인의 예는 국제공개 WO 2013/138400호, 국제공개 WO 2017/007796호, 국제공개 WO 2017/190079호, 국제공개 WO 2017/100467호, 국제공개 WO 2018/226861호, 국제공개 WO 2019/157224호, 및 국제공개 WO 2019/222663호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 scFv이다. 특정 예에서, 항-CD63 scFv는 서열번호 183을 포함할 수 있거나, 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 항-CD63 scFv는 서열번호 183으로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 항-CD63 scFv는 서열번호 183으로 구성될 수 있다.
본원에 개시된 작제물에서 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위의 돌연변이, 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 CpG 디뉴클레오타이드는 작제물의 치료적 유용성을 제한할 수 있다. 먼저, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드는 숙주의 톨-유사 수용체-9(TLR-9)와 상호작용하여 선천성, 전염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 두번째로, 일단 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되면, 이들은 메틸-CpG 결합 단백질에 의해 배위된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다. 잠적 스플라이스 부위는 보통 스플라이스 부위로서 사용되지 않지만 예를 들어 표준 스플라이스 부위를 비활성화하거나 전에 존재하지 않았던 스플라이스 부위를 생성하는 돌연변이에 의해 활성화될 수 있는 프리-메신저 RNA에서의 서열이다. 정확한 스플라이스 부위 선택은 성공적인 유전자 발현에 중요하고, 잠적 스플라이스 부위의 제거는 정상 또는 의도된 스플라이스 부위의 사용에 유리할 수 있다.
일례에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는다(즉, CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거된다(즉, 완전히 CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고, 하나 이상 또는 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨). 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고(즉, 완전히 CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨).
다양한 항-CD63 scFv 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 항-CD63 scFv 코딩 서열이 제공된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 185-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 184에 제시된 서열로 구성된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 191에 제시된 서열로 구성된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 190에 제시된 서열로 구성된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 188에 제시된 서열로 구성된다. 항-CD63 scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 CD63-결합 활성을 유지하는) 항-CD63 scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-CD63 scFv 코딩 서열은 서열번호 183에 제시된 서열로 구성된 항-CD63 scFv 단백질을 인코딩한다.
특정 항-CD63 scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 항-CD63 scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 작제물 요소가 특정 5'에서 3'으로의 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 항-CD63 scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터 중 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
(c) TfR-결합 전달 도메인
본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질은 GAA에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함할 수 있다. TfR-결합 도메인은 내재화 인자 트린스페린 수용체 단백질 1(TfR; UniProt Ref. P02786)에 대한 결합을 제공한다. TfR(TR, TfR1, 및 Trfr로도 알려짐)은 TFRC 유전자에 의해 인코딩된다. TfR은 근육 및 뇌 내피세포 상에 발현된다. 이들 세포에서 TfR의 통과세포외배출은 혈액-뇌-장벽 횡단을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, GAA에 융합된 TfR-결합 전달 도메인(예를 들어, scFv)을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 트랜스퍼린 흡수를 변경하지 않는다. 일부 실시형태에서, GAA에 융합된 TfR-결합 전달 도메인(예를 들어, scFv)을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 철 항상성을 변경하지 않는다. 일부 실시형태에서, GAA에 융합된 TfR-결합 전달 도메인(예를 들어, scFv)을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 트랜스퍼린 흡수 또는 철 항상성을 변경하지 않는다.
트랜스퍼린 수용체 1(TfR)은 트랜스퍼린, 주요 철-캐리어 단백질의 결합을 통해 세포에 대한 철 공급을 제어하는 데 관여하는 막 수용체이다. 트랜스퍼린 수용체 1은 TFRC 유전자로부터 발현된다. 트랜스퍼린 수용체 1은 본원에서 TFRC로 지칭될 수 있다. 이 수용체는 세포 증식 제어에 중요한 역할을 하는데, 그 이유는 철이 리보뉴클레오타이드 환원효소 활성을 유지하는 데 필수적이고, 리보뉴클레오타이드의 데옥시리보뉴클레오타이드로의 전환을 촉매작용하는 유일한 효소이기 때문이다. 바람직하게는, TfR은 인간 TfR(hTfR)이다. 예를 들어, 수탁 번호 NP_001121620.1; BAD92491.1; 및 NP_001300894.1.; 및 e!Ensembl entry: ENSG00000072274를 참조한다. 인간 트랜스퍼린 수용체 1은 비제한적으로 하기를 포함하는 몇몇의 조직에서 발현된다: 대뇌 피질; 소뇌; 해마; 미상; 부갑상샘; 부신; 기관지; 폐; 구강 점막; 식도; 위; 십이지장; 소장; 결장; 직장; 간; 쓸개; 췌장; 신장; 방광; 정소; 부고환; 전립선; 질; 난소; 나팔관; 자궁내막; 자궁경부; 태반; 유방; 심근; 평활근; 연조직; 피부; 충수; 림프절; 편도; 및 골수. 관련 트랜스퍼린 수용체는 트랜스퍼린 수용체 2(TfR2)이다. 인간 트랜스퍼린 수용체 2는 인간 트랜스퍼린 수용체 1과 약 45% 서열 동일성을 보유한다. 문헌[Trinder & Baker, Transferrin receptor 2: a new molecule in iron metabolism. Int J Biochem Cell Biol. 2003 Mar;35(3):292-6]. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 트랜스퍼린 수용체는 일반적으로 트랜스퍼린 수용체 1(예를 들어, 인간 트랜스퍼린 수용체 1)을 지칭한다.
인간 트랜스퍼린(Tf)은 단백질의 음이온 결합 수퍼패밀리의 단쇄, 80 kDa 구성원이다. 트래스퍼린은 698개의 아미노산 전구체이며, 이는 19개의 aa 신호 서열과 전형적으로 19개의 사슬간 이황화 결합을 함유하는 679개의 aa 성숙 세그먼트로 나뉜다. N- 및 C-말단 플랭킹 영역(또는 도메인)은 불가피한 음이온(obligate anion)(예를 들어, 중탄산염)과 4개의 아미노산(His, Asp, 및 2개의 Tyr)의 상호작용을 통해 제2 철에 결합한다. 아포트랜스퍼린(또는 무-철)은 초기에 C-말단에서 하나의 철 원자와 결합할 것이며, N-말단에 의한 후속 철 결합이 이어져서 홀로트랜스퍼린(디페릭(diferric) Tf, 홀로-Tf)을 형성한다. 이의 C-말단 철 결합 도메인을 통해, 홀로트랜스퍼린은 세포의 표면 상의 TfR과 상호작용할 것이며, 이때, 이는 산성화 엔도솜 내로 내재화된다. 철은 이들 엔도솜 내에서 Tf 분자로부터 해리되고, 제2철로서 세포기질 내로 수송된다. TfR 이외에, 트랜스퍼린은 쿠불린(cubulin), IGFBP3, 미생물 철-결합 단백질, 및 간 특이적 TfR2에 결합하는 것으로 보고된다.
혈액-뇌 장벽(BBB)은 뇌의 미세혈관계 내에 위치하고, 이는 혈액에서 뇌로의 분자의 통과를 조절한다. 문헌[Burkhart et al., Accessing targeted nanoparticles to the brain: the vascular route. Curr Med Chem. 2014;21(36):4092-9]. 뇌 모세혈관 내피세포를 통한 세포횡단 통과는 1) 백혈구에 의한 세포 진입; 2) 예를 들어 글루코스 수송체 1(GLUT-1)에 의한 글루코스, 예를 들어 L형 아미노산 수송체 1(LAT-1)에 의한 아미노산, 및 예를 들어 유기 음이온-수송 펩타이드 B(OATP-B)에 의한 소형 펩타이드의 캐리어-매개 유입; 3) 소형 소수성 분자의 측세포 통과; 4) 예를 들어 알부민 및 양이온화 분자의 흡착 매개 통과세포외배출; 5) CO2 및 O2를 포함하는 지질 가용성, 비극성 용질의 수동 확산; 및 5) 예를 들어 인슐린 수용체에 의한 인슐린 및 TfR에 의한 Tf의 수용체 매개 통과세포외배출을 통해 일어날 수 있다. 문헌[Johnsen et al., Targeting the transferrin receptor for brain drug delivery, Prog Neurobiol. 2019 Oct;181:101665].
예를 들어, 트랜스퍼린 수용체에 대한 고친화력 및 우수한 혈액-뇌 장벽 횡단을 나타내는 항-TfR:GAA 융합 단백질이 제공된다. 놀랍게도, TfR에 대한 높은 결합 친화력을 나타내는 융합물은 낮은 친화력의 결합제의 것보다 더 효율적으로 혈액-뇌 장벽을 횡단하였다. 본 발명의 융합물은 GAA를 뇌에 효율적으로 전달하는 능력을 가지며, 따라서 폼페병과 같은 글리코겐 저장 질환의 효과적인 치료이다.
트랜스퍼린 수용체, 바람직하게는 인간 트랜스퍼린 수용체 1(항-hTfR)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체, 이의 항원-결합 단편, 예컨대 Fabs 및 scFvs가 본원에 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 항-hTfR은 융합 단백질의 형태이다. 융합 단백질은 GAA에 융합된 항-hTfR 항원-결합 단백질을 포함한다. 항-hTfR은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 효율적으로 횡단하며, 이로 인해 융합된 GAA를 뇌에 전달할 수 있다.
트랜스퍼린 수용체 및 이의 융합물, 예를 들어 태그, 예컨대 His6 및/또는 myc(예를 들어, 인간 트랜스퍼린 수용체(예를 들어, REGN2431) 또는 원숭이 트랜스퍼린 수용체(예를 들어, REGN2054))에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질은 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 검정에서 약 20 nM의 KD 또는 더 높은 친화력으로 약 25℃에서 결합한다. 이러한 항원-결합 단백질은 "항-TfR"로 지칭될 수 있다.
일 실시형태에서, 항-hTfR scFv:GAA 융합 단백질은 LCVR-HCVR 또는 HCVR-LCVR과 같은 가변 영역의 배열을 포함하는 scFv를 포함하며, HCVR 및 LCVR은 선택적으로 링커에 의해 연결되고, scFv는 선택적으로 링커에 의해 GAA에 연결된다(예를 들어, LCVR-(Gly4Ser)3-HCVR-(Gly4Ser)2)-GAA; 또는 LCVR-(Gly4Ser)3-HCVR-(Gly4Ser)2)-GAA)(Gly4Ser = 서열번호 600)). 일례에서, HCVR과 LCVR 사이의 링커는 3개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 713). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 715-719 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, HCVR과 LCVR 사이의 링커는 2개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 714). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 720-726 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, HCVR과 LCVR 사이의 링커는 1개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 600). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 727을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 일례에서, scFv와 GAA 사이의 링커는 3개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 713). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 715-719 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, scFv와 GAA 사이의 링커는 2개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 714). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 720-726 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, scFv와 GAA 사이의 링커는 1개의 이러한 반복부를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다(서열번호 600). 예를 들어, 링커에 대한 코딩 서열은 서열번호 727을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
항-hTfR:GAA는 선택적으로 GAA에 (선택적으로 링커에 의해) 융합된, 트랜스퍼린 수용체(TfR), 바람직하게는 인간 트랜스퍼린 수용체(hTfR)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질에 연결된 신호 펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드는 mROR 신호 서열이다(예를 들어, mROR 신호 서열-LCVR-(Gly4Ser)3-HCVR-(Gly4Ser)2)-GAA; 또는 LCVR-(Gly4Ser)3-HCVR-(Gly4Ser)2)-GAA)(Gly4Ser = 서열번호 600)). 융합된 폴리펩타이드에 대한 용어 "융합된" 또는 "구속된"은 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 폴리펩타이드(예를 들어, 링커 또는 다른 폴리펩타이드를 통해)를 지칭한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 면역글로불린의 각각의 프레임워크 또는 CDR 도메인에 대한 아미노산 배치는 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat et al]; 문헌[National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; 문헌[Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75]; 문헌[Kabat et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]; 문헌[Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917], 또는 문헌[Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878-883]의 정의에 따른다. 따라서, VH의 CDR 및 VL의 CDR을 포함하는 항체 및 항원-결합 단편이 포함되며, VH 및 VL은 본원에 제시된 아미노산 서열을 포함하고(예를 들어, 표 29의 서열 또는 이의 변이체 참조), CDR은 카바트(Kabat) 및/또는 초티아(Chothia)에 따라 정의된 바와 같다.
일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, TfR-결합 전달 도메인은 항체, 항체 단편, 또는 기타 항원-결합 단백질이다. 일부 다중 도메인 치료적 단백질에서, TfR-결합 전달 도메인은 항원-결합 단백질이다. 항원-결합 단백질의 예는 예를 들어 수용체-융합 분자, 트랩 분자, 수용체-Fc 융합 분자, 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv(scFv) 분자, dAb 단편, 단리된 상보 결정 영역(CDR), CDR3 펩타이드, 속박 FR3-CDR3-FR4 펩타이드, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디, 1가 나노바디, 2가 나노바디, 소형 모듈 면역약제(SMIP), 낙타과 항체(VHH 중쇄 동종이량체성 항체), 및 상어 가변 IgNAR 도메인을 포함한다.
인간 트랜스퍼린 수용체 1에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 일 실시형태에서, 각각의 항체의 중쇄(HC)는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH")(예를 들어, 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 및/또는 527 또는 이들의 변이체 포함) 및 중쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 IgG, 인간 IgG1, 또는 인간 IgG4)을 포함하고; 각각의 항체의 경쇄(LC)는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는 "VL")(예를 들어, 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 및/또는 532 또는 이들의 변이체 포함) 및 경쇄 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 또는 인간 람다)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역이 개재된 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 초가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 본원에 개시된 항-TfR 항체는 또한 GAA에 융합될 수 있다.
본 발명의 항-TfR 항원-결합 단백질은 GAA에 구속될 수 있는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"이라는 용어는 항원에 결합하되 전체 항체(바람직하게는, 전체 항체는 IgG임)의 모든 서열을 포함하지는 않는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항원-결합 단편의 비제한적 예는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편;(iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; 및 (vi) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기(예를 들어, 단리된 상보 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드) 또는 속박 FR3-CDR3-FR4 펩타이드로 구성된 dAb 단편. 다른 조작 분자, 예컨대 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-고갈된 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 소형 모듈 면역약제(SMIP)가 또한 본원에 사용된 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항-TfR 항원-결합 단백질은 GAA에 구속될 수 있는 scFv일 수 있다. scFv(단쇄 단편 가변)은 바람직하게는 가요성 링커(예를 들어, 펩타이드 링커)에 의해 함께 접합되는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 도메인의 가변 영역(어느 순서로든)을 갖는다. 둘 모두의 V 영역을 연결하는 데 사용되는 가요성 링커의 길이는 폴리펩타이드 사슬의 올바른 접힘을 수득하기 위해 중요할 수 있다. 이전에, 펩타이드 링커는 접히고 온전한 항원-결합 부위를 형성하는 도메인의 능력에 영향을 미치지 않으면서 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 도메인의 아미노 말단 사이에서 3.5 nm(35 Å)에 걸쳐 이어져야 하는 것으로 추정되었다(문헌[Huston et al., Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. Methods in Enzymology. 1991;203:46-88]). 일 실시형태에서, 링커는 이러한 길이의 아미노산 서열을 포함하여 약 3.5 nm만큼 가변 도메인을 분리한다.
일 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열과 인접하거나 이와 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성이고, VH - VH, VH - VL, 또는 VL - VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
"단리된" 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 및 벡터는 이들이 생성되는 세포 또는 세포 배양으로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 다른 항체 또는 항원-결합 단편, 지질, 탄수화물, 또는 기타 물질, 예컨대 세포 잔해 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항원-결합 단백질은, 추가로, 적어도 부분적으로 발현 시스템 성분, 예컨대 숙주 세포 또는 이의 성장 배지로부터의 생물학적 분자가 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재(예를 들어, 소량 또는 유의하지 않은 양의 불순물이 잔여할 수 있음) 또는 물, 완충액, 또는 염의 부재 또는 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함하는 약학적 제형의 성분을 지칭하도록 의도되지 않는다.
본 발명의 항-TfR 항원-결합 단백질은 GAA에 구속될 수 있는 단클론 항체 또는 단클론 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명은 단클론 항-TfR 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 및 이의 항원-결합 단편뿐만 아니라 복수의 단리된 단클론 항원-결합 단백질을 포함하는 단클론 조성물을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 동종 항체 집단의 구성원을 지칭하며, 즉, 항체 분자를 포함하는 집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 아미노산 서열이 동일하다. 조성물 중의 "복수"의 이러한 단클론 항체 및 단편은 상기의 동일한(즉, 상기 논의된 바와 같이, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외한 아미노산 서열) 항체 및 단편의 농축물을 지칭하며, 이는 자연, 예를 들어 마우스 또는 인간과 같은 숙주 유기체의 혈액에서 자연적으로 발생할 것이다.
일 실시형태에서, 항-TfR 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편(페이로드에 구속될 수 있음)은 예를 들어 유형 IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), 또는 IgM의 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어 유형 카파 또는 람다의 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
GAA에 구속될 수 있는 인간 항-TfR 항원-결합 단백질이 본원에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "인간" 항원-결합 단백질, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 세포 내에 있거나 비-인간 세포, 예를 들어 마우스 세포에 그래프딩되든 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 US8502018호, 미국 특허 US6596541호, 또는 미국 특허 US5789215호를 참조한다. 본 발명의 항-TfR 인간 mAb는 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종(예를 들어, 마우스)의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 그래프팅되었던 mAb를 포함하도록 의도되지는 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유류 또는 비-인간 포유류의 세포에서 재조합으로 생산된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 직접 단리된 자연 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
항-TfR 키메라 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체 및 이의 항원-결합 단편(GAA에 구속될 수 있음) 및 이의 사용 방법이 또한 본원에 포함된다. 본원에 사용된 "키메라 항체"는 제1 항체로부터의 가변 도메인 및 제2 항체로부터의 불변 도메인을 갖는 항체이며, 제1 및 제2 항체는 상이한 종으로부터 유래된다. (예를 들어, 미국 특허 US4816567호; 및 문헌[Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855] 참조).
용어 "재조합" 항-TfR 항원-결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편(GAA에 구속될 수 있음)은 예를 들어 DNA 스플라이싱 및 형질전환 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술과 같은 기술 또는 당업계에 알려진 방법에 의해 생산, 발현, 단리, 또는 수득된 이러한 분자를 지칭한다. 상기 용어는 비-인간 포유류(형질전환 비-인간 포유류, 예를 들어 형질전환 마우스 포함) 또는 세포(예를 들어, CHO 세포), 예컨대 세포 발현 시스템에서 발현되거나 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한다.
폴리펩타이드의 "변이체"는 본원에 제시된 기준 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 217-220; 222-225; 227-230; 232-235; 237-240; 242-245; 247-250; 252-255; 257-260; 262-265; 267-270; 272-275; 277-280; 282-285; 287-290; 292-295; 297-300; 302-305; 307-310; 312-315; 317-320; 322-325; 327-330; 332-335; 337-340; 342-345; 347-350; 352-355; 357-360; 362-365; 367-370; 372-375; 377-380; 382-385; 387-390; 392-395; 397-400; 402-405; 407-410; 412-415; 417-420; 422-425; 427-430; 432-435; 437-440; 442-445; 447-450; 452-455; 457-460; 462-465; 467-470; 472-475; 477-480; 482-485; 487-490; 492-495; 497-500; 502-505; 507-510; 512-515; 517-520; 522-525; 527-530; 532-535; 703(선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 673) 미포함), 704(선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호: 673) 미포함), 705(선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호: 673) 미포함), 706(선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호: 673) 미포함); 538-573, 603-672, 또는 675-702 중 임의의 것)과 적어도 약 70-99.9%(예를 들어, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (이때, 비교는 BLAST 알고니즘에 의해 수행하고, 알고니즘의 파라미터는 각각의 기준 서열의 전체 서열에 대해 각각의 서열들 사이의 최대 일치를 제공하도록 선택됨(예를 들어, 역치:10 제외; 문자 크기: 3; 질의 범위의 최대 일치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 코스트(gap cost); 존재 11, 연장 1; 컨디셔닝된 조성 득점 매트릭스 조절)), 상기 아미노산 서열을 포함하되 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 돌연변이(예를 들어, 점 돌연변이, 삽입, 절두, 및/또는 결실)를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 바람직하게는, 기능적 GAA 액토도메인.
다음 참고문헌은 대개 서열 분석에 사용되는 BLAST 알고니즘에 관한 것이다: 문헌[BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109]; 문헌[Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272]; 문헌[Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141]; 문헌[Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 문헌[Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656]; 문헌[Wootton, J. C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163]; 문헌[Hancock, J. M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; 문헌[Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3.'' M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; 문헌[Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565]; 문헌[States, D. J., et al., (1991) Methods 3:66-70]; 문헌[Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]; 문헌[Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; 문헌[ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]; 문헌[Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]; 문헌[Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039]; 및 문헌[Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y.]
본 발명의 일 실시형태에서, 항-hTfR:페이로드 또는 항-hTfR:페이로드(예를 들어, scFv, Fab, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 형식에서)(예를 들어, 페이로드는 인간 GAA임)는 다음 특징 중 하나 이상을 나타낸다:
Figure pct00002
표면 플라즈몬 공명 형식으로 25℃에서 약 41 nM 또는 더 높은 친화력의 인간 TfR에 대한 결합 친화력(KD)(예를 들어, 약 1 또는 0.1 nM 또는 0.18 내지 약 1.2 nM 이상);
표면 플라즈몬 공명 형식으로 25℃에서 약 0 nM(측정 가능한 결합 없음) 또는 더 높은 친화력의 인간 TfR에 대한 결합 친화력(KD)(예를 들어, 약 20 nM 이상);
표면 플라즈몬 공명 형식으로 25℃에서 0 내지 278(예를 들어, 약 17 또는 18)의 원숭이 TfR/인간 TfR에 대한 결합 KD 비;
인간 홀로-Tf에 대한 약 3, 5, 10, 또는 13%의 hTfR(예를 들어, Hmm-hTFRC, 예컨대 REGN2431) 결합 차단, Fab 형식(IgG1)일 때 예를 들어 약 45% 이하의 차단;
인간 홀로-Tf에 대한 약 6, 8, 10, 또는 13%의 hTfR(예를 들어, Hmm-hTFRC, 예컨대 REGN2431) 결합 차단, scFv(VK-VH) 형식일 때 예를 들어 약 45% 이하의 차단;
인간 홀로-Tf에 대한 약 11, 17, 23, 또는 26%의 hTfR(예를 들어, Hmm-hTFRC, 예컨대 REGN2431) 결합 차단, scFv(VK-VH) 형식일 때 예를 들어 약 45% 이하의 차단;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 HDD를 통해 분자에 투여된 마우스(예를 들어, Tfrc hum/hum 유전자삽입(knock-in) 마우스)의 뇌에서 약 1 이상; 0.67 이상; 1.08 이상; 0.91 이상; 0.65 이상; 0.55 이상; 0.50 이상; 0.27 이상; 0.72 이상; 1.05 이상; 0.49 이상; 0.29 이상; 1.29 이상; 1.72 이상; 1.79 이상; 3.08 이상; 1.24이상; 0.59 이상; 또는 0.47 이상(또는 약 1-2 또는 그 초과)의 비의 성숙 hGAA 단백질(양성 대조군 8D3:GAA scFv의 것에 정규화됨)을 나타내거나; 성숙 인간 GAA 단백질을 상기 scFv:hGAA 분자가 투여된 인간의 뇌에 전달하고;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 HDD를 통해 분자에 투여된 마우스(예를 들어, Tfrchum/hum 유전자삽입 마우스)의 뇌 실질에서 약 0.44, 0.05, 1.13, 또는 0.60(약 0.1-1.2) 비의 성숙 hGAA 단백질(양성 대조군 8D3:GAA scFv의 것에 정규화됨)을 나타내거나; 성숙 인간 GAA 단백질을 상기 scFv:hGAA 분자가 투여된 인간의 뇌 실질로 전달하고;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 HDD를 통해 분자에 투여된 마우스(예를 들어, Tfrchum/hum 유전자삽입 마우스)의 사두근에서 약 0.67, 1.80, 1.78, 또는 7.74(약 1-2) 비의 성숙 hGAA 단백질(양성 대조군 8D3:GAA scFv의 것에 정규화됨)을 나타내거나; 성숙 인간 GAA 단백질을 상기 scFv:hGAA 분자가 투여된 인간의 사두근 또는 기타 근조직으로 전달하고;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 AAV8 간 데포를 통해 분자에 투여된 마우스(예를 들어, Tfrchum 유전자삽입 마우스)의 뇌 실질에서 약 0.94, 0.49, 0.61, 또는 1.90(약 0.1-1.2) 비의 성숙 hGAA 단백질(양성 대조군 8D3:GAA scFv의 것에 정규화됨)을 나타내거나; 성숙 인간 GAA 단백질을 바이러스, 예를 들어 AAV, 간 데포를 통해 상기 scFv:hGAA 분자가 투여되거나 단백질 scFv:hGAA 융합 형식으로 비경구 전달된 인간의 뇌 실질로 전달하고;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 성숙 hGAA 단백질을 AAV8 간 데포를 통해 분자가 투여된 마우스(예를 들어, Tfrc hum 유전자삽입 마우스)의 혈청, 간, 대뇌, 소뇌, 척수, 심장, 및/또는 사두근으로 전달하거나; 성숙 인간 GAA 단백질을 바이러스, 예를 들어 AAV, 간 데포를 통해 상기 scFv:hGAA 분자가 투여되거나 단백질 scFv:hGAA 융합 형식으로 비경구 전달된 인간의 혈청, 간, 대뇌, 소뇌, 척수, 심장, 및/또는 사두근으로 전달하고;
항-hTfR scFv:hGAA 형식일 때 AAV8 간 데포를 통해 분자가 투여된 마우스(예를 들어, Tfrc hum 유전자삽입 마우스)의 대뇌, 소뇌, 척수, 심장, 및/또는 사두근에 저장된 글리코겐을 예를 들어 적어도 75% 내지 95% 초과 또는 99% 초과만큼 감소시키거나; 바이러스, 예를 들어 AAV, 간 데포를 통해 상기 scFv:hGAA 분자가 투여되거나 단백질 scFv:hGAA 융합 형식으로 비경구 전달된 인간의 대뇌, 소뇌, 척수, 심장, 및/또는 사두근에 저장된 글리코겐을 감소시키고;
간 데포 AAV8 항-hTFRC scfv:hGAA(예를 들어, 4e11vg/kg AAV8)으로 치료된 Gaa -/- / Tfrc hum 마우스의 조직(예를 들어, 소뇌) 내 글리코겐 수준을 치료되지 않은 Gaa -/- / Tfrc hum 마우스에 대해 적어도 약 90%(예를 들어, 약 95% 이상)만큼 감소시키고;
간 데포 AAV8 항-hTFRC scfv:hGAA(예를 들어, 4e11vg/kg AAV8)으로 치료된 Gaa -/- / Tfrc hum 마우스 또는 예를 들어 융합 단백질의 비경구 전달에 의해 융합물로 치료된 인간의 조직(예를 들어, 사두근) 내 글리코겐 수준을 치료되지 않은 Gaa -/- / Tfrc hum 마우스에 대해 적어도 약 89%(예를 들어, 약 90% 또는 91% 이상)만큼 감소시키고;
Tfrc hum 마우스(예를 들어, 마우스는 정상적 혈청, 심장, 간, 및/또는 비장 철 수준, 정상적 총 철 결합 능력(TIBC) 및/또는 정상적 헵시딘 수준을 유지함)에 투여될 때(예를 들어, HDD 또는 AAV8 에피솜 간 데포에 의함) 또는 예를 들어 융합 단백질의 비경구 전달에 의해 인간에 투여될 때 비정상적 철 항상성을 유발하지 않고;
예를 들어, AAV8 벡터로 대상체(예를 들어, 인간 또는 Gaa -/- /Tfrc hum/hum 마우스)에 염색체 삽입되거나(예를 들어, 알부민 유전자 유전자좌 내로) 에피솜으로 전달될 때, 융합물을 인코딩하는 DNA는 성숙 인간 GAA의 발현을 혈청, 간, 소뇌, 및/또는 사두근에 유발하고; 그리고/또는
예를 들어, AAV8 벡터로 대상체(예를 들어, 인간 또는 Gaa -/- /Tfrc hum/hum 마우스)에 염색체 삽입되거나(예를 들어, 알부민 유전자 유전자좌 내로) 에피솜으로 전달될 때, 융합물을 인코딩하는 DNA는 소뇌 및/또는 사두근 내 글리코겐 수준을 감소시킨다.
* Tfrchum 또는 Tfrchum/hum 는 동형접합성 유전자삽입 마우스이다.
본원에 개시된 융합물의 항-인간 트랜스퍼린 수용체 항원-결합 단백질의 도메인의 아미노산 서열은 하기 표 29에 요약되어 있다. 예를 들어, GAA에 융합된, 표 29의 분자의 HCVR 및 LCVR을 포함하거나; 이의 CDR을 포함하는 항-인간 트랜스퍼린 수용체 1 항체 및 이의 항원-결합 단편(예를 들어, scFvs 및 Fab)이 본원에 개시된다.
논의된 바와 같이, 항-hTfR:GAA scFv 융합 단백질(예를 들어, 31874B; 31863B; 69348; 69340; 69331; 69332; 69326; 69329; 69323; 69305; 69307; 12795B; 12798B; 12799B; 12801B; 12802B; 12808B; 12812B; 12816B; 12833B; 12834B; 12835B; 12847B; 12848B; 12843B; 12844B; 12845B; 12839B; 12841B; 12850B; 69261; 또는 69263)은 GAA에 연결된 선택적 링커에 연결된 scFv(선택적으로 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 포함)에 연결된 선택적인 신호 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 선택적인 신호 펩타이드는 생쥐(Mus musculus) Ror1로부터의 신호 펩타이드일 수 있다(예를 들어, 아미노산 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 673)로 구성됨).
특정한 다중 도메인 치료적 단백질에서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR scFv이다. 예를 들어, scFv는 선택적으로 링커에 의해 연결된 VL 및 VH를 포함할 수 있다.
일례에서, 항-hTfR scFv는 하기를 포함한다: (i) 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (ii) 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 예에서, 항-TfR scFv는 하기를 포함할 수 있다: (1) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (2) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (3) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (4) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (5) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (6) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (7) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (8) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (9) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (10) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (11) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (12) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (13) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (14) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (15) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (16) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (17) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (18) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (19) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (20) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (21) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (22) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (23) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (24) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (25) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (26) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (27) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (28) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (29) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (30) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; (31) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는 (32) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR. 변이체는 본원에 제시된 기준 아미노산과 적어도 약 70 내지 99.9%(예를 들어, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
또 다른 예에서, 항-TfR scFv는 하기를 포함할 수 있다: (a) 서열번호 218(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 219(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 220(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 223(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 224(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 225(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (b) 서열번호 228(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 229(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 230(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 233(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 234(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 235(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (c) 서열번호 238(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 239(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 240(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 243(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 244(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 245(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (d) 서열번호 248(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 249(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 250(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 253(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 254(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 255(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (e) 서열번호 258(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 259(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 260(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 263(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 264(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 265(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (f) 서열번호 268(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 269(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 270(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 273(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 274(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 275(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (g) 서열번호 278(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 279(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 280(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 283(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 284(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 285(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (h) 서열번호 288(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 289(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 290(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 293(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 294(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 295(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (i) 서열번호 298(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 299(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 300(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 303(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 304(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 305(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (j) 서열번호 308(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 309(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 310(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 313(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 314(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 315(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (k) 서열번호 318(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 319(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 320(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 323(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 324(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 325(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (l) 서열번호 328(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 329(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 330(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 333(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 334(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 335(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (m) 서열번호 338(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 339(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 340(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 343(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 344(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 345(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (n) 서열번호 348(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 349(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 350(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 353(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 354(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 355(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (o) 서열번호 358(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 359(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 360(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 363(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 364(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 365(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (p) 서열번호 368(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 369(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 370(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 373(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 374(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 375(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (q) 서열번호 378(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 379(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 380(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 383(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 384(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 385(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (r) 서열번호 388(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 389(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 390(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 393(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 394(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 395(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (s) 서열번호 398(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 399(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 400(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 403(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 404(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 405(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (t) 서열번호 408(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 409(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 410(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 413(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 414(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 415(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (u) 서열번호 418(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 419(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 420(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 423(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 424(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 425(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 428(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 429(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 430(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 433(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 434(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 435(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (w) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 448(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 449(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 450(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 453(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 454(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 455(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (y) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (z) 서열번호 468(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 469(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 470(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 473(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 474(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 475(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (aa) 서열번호 478(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 479(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 480(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 483(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 484(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 485(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ab) 서열번호 488(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 489(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 490(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 493(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 494(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 495(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ac) 서열번호 498(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 499(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 500(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 503(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 504(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 505(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ad) 서열번호 508(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 509(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 510(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 513(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 514(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 515(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; (ae) 서열번호 518(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 519(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 520(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 523(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 524(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 525(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및/또는 (af) 서열번호 528(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 529(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 530(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 533(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 534(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 535(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR. 변이체는 본원에 제시된 기준 아미노산과 적어도 약 70 내지 99.9%(예를 들어, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
또 다른 예에서, 항-TfR scFv는 하기를 포함할 수 있다: (i) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ii) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iii) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (iv) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (v) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vi) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (vii) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (viii) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (ix) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (x) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xi) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xii) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiii) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xiv) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xv) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvi) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xvii) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xviii) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xix) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xx) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxi) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxii) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiii) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxiv) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxv) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvi) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxvii) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxviii) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxix) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxx) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; (xxxi) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 및/또는 (xxxii) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR, - 선택적으로, HCVR과 LCVR은 링커(예를 들어, 아미노산 서열, 예를 들어, 약 10개의 아미노산 길이, 예를 들어 Gly4Ser(서열번호 600)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 또는 10 반복부 포함)에 의해 연결됨 -. 변이체는 본원에 제시된 기준 아미노산과 적어도 약 70 내지 99.9%(예를 들어, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
항-TfR scFvs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 예는 표 29에 제공되며, 하기를 포함한다: (1) 서열 번호 216에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 221에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (2) 서열 번호 226에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 231에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (3) 서열 번호 236에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 241에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (4) 서열 번호 246에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 251에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (5) 서열 번호 256에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 261에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (6) 서열 번호 266에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 271에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (7) 서열 번호 276에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 281에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (8) 서열 번호 286에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 291에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (9) 서열 번호 296에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 301에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (10) 서열 번호 306에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 311에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (11) 서열 번호 316에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 321에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (12) 서열 번호 326에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 331에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (13) 서열 번호 336에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 341에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (14) 서열 번호 346에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 351에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (15) 서열 번호 356에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 361에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (16) 서열 번호 366에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 371에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (17) 서열 번호 376에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 381에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (18) 서열 번호 386에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 391에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (19) 서열 번호 396에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 401에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (20) 서열 번호 406에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 411에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (21) 서열 번호 416에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 421에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (22) 서열 번호 426에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 431에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (23) 서열 번호 436에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 441에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (24) 서열 번호 446에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 451에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (25) 서열 번호 456에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 461에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (26) 서열 번호 466에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 471에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (27) 서열 번호 476에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 481에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (28) 서열 번호 486에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 491에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (29) 서열 번호 496에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 501에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (30) 서열 번호 506에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 511에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (31) 서열 번호 516에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 521에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (32) 서열 번호 526에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCVR 및 서열번호 531에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 LCVR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(이때, HCVR 및 LCVR은 임의의 순서임).
일 실시형태에서, VL-(Gly4Ser)3-VH 형식(Gly4Ser = 서열번호 600)의 항-hTfR scFv는 서열번호 538-569 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 형식 VH-(Gly4Ser)3-VL 형식(Gly4Ser = 서열번호 600)인 이러한 융합물이 또한 고려된다.
또 다른 예에서, TfR-결합 전달 도메인은 Fab 단편(예를 들어, 인간 트랜스퍼린 수용체에 특이적으로 결합)일 수 있다. Fab 단편은 전형적으로 하나의 완전한 경쇄, VL 및 불변 경쇄 도메인, 예를 들어 카파(예를 들어, RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 601)) 및 VH 및 하나의 중쇄의 IgG1 CH1 부분(예를 들어, ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH(서열번호 602)) 또는 IgG4 CH1(예를 들어, ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPLLQGSG(서열번호 674))을 함유한다. Fab 단편 항체는 힌지 영역을 포함하는 전체 Fc 단편을 제거하기 위한 전체 IgG 항체의 파파인 소화에 의해 발생될 수 있다. 일례에서, Fab 단백질은 하기를 포함할 수 있다: (1) 서열번호 217에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 222에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (2) 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 232에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (3) 서열번호 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 242에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (4) 서열번호 247에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 252에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (5) 서열번호 257에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 262에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (6) 서열번호 267에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 272에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (7) 서열번호 277에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 282에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (8) 서열번호 287에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 292에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (9) 서열번호 297에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 302에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (10) 서열번호 307에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 312에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (11) 서열번호 317에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 322에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (12) 서열번호 327에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 332에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (13) 서열번호 337에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 342에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (14) 서열번호 347에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 352에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (15) 서열번호 357에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 362에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (16) 서열번호 367에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 372에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (17) 서열번호 377에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 382에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (18) 서열번호 387에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 392에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (19) 서열번호 397에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 402에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (20) 서열번호 407에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 412에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (21) 서열번호 417에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 422에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (22) 서열번호 427에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 432에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (23) 서열번호 437에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 442에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (24) 서열번호 447에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 452에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (25) 서열번호 457에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 462에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (26) 서열번호 467에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 472에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (27) 서열번호 477에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 482에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (28) 서열번호 487에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 492에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (29) 서열번호 497에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 502에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (30) 서열번호 507에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 512에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); (31) 서열번호 517에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 522에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR); 및/또는 (32) 서열번호 527에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 또는 CH1 도메인에 연결된 이러한 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 532에 제시된 아미노산 서열 또는 CL 도메인에 연결된 이러한 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR). 예를 들어, CH1은 서열번호 602 또는 서열번호 674일 수 있다.
일례에서, Fab 단백질은 하기를 포함할 수 있다: (1) 서열번호 603에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 604에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(31874B); (2) 서열번호 605에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 606에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(31863B); (3) 서열번호 607에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 608에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69348); (4) 서열번호 609에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 610에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69340); (5) 서열번호 611에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 612에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69331); (6) 서열번호 613에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 614에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69332); (7) 서열번호 615에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 616에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69326); (8) 서열번호 617에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 618에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69329); (9) 서열번호 619에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 620에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69323); (10) 서열번호 621에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 622에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69305); (11) 서열번호 623에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 624에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69307); (12) 서열번호 625에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 626에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12795B); (13) 서열번호 627에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 628 또는 서열번호 667에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12798B); (14) 서열번호 629에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 630 또는 서열번호 668에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12799B); (15) 서열번호 631에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 632에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12801B); (16) 서열번호 633에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 634에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12802B); (17) 서열번호 635에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 636에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12808B); (18) 서열번호 637에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 638에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12812B); (19) 서열번호 639에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 640에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12816B); (20) 서열번호 641에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 642에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12833B); (21) 서열번호 643에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 644에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12834B); (22) 서열번호 645에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 646에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12835B); (23) 서열번호 647에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 648 또는 서열번호 669에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12847B); (24) 서열번호 649에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 650에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12848B); (25) 서열번호 651에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 652 또는 서열번호 670에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12843B); (26) 서열번호 653에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 654에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12844B); (27) 서열번호 655에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 656 또는 서열번호 671에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12845B); (28) 서열번호 657에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 658 또는 서열번호 672에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12839B); (29) 서열번호 659에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 660에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12841B); (30) 서열번호 661에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 662에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(12850B); (31) 서열번호 663에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 664에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69261); 또는 (32) 서열번호 665에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 666에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(69263).
"31874B"; "31863B"; "69348"; "69340"; "69331"; "69332"; "69326"; "69329"; "69323"; "69305"; "69307"; "12795B"; "12798B"; "12799B"; "12801B"; "12802B"; "12808B"; "12812B"; "12816B"; "12833B"; "12834B"; "12835B"; "12847B"; "12848B"; "12843B"; "12844B"; "12845B"; "12839B"; "12841B"; "12850B"; "69261"; 및 "69263"은 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며; scFv의 경우, 각각 예를 들어 펩타이드 링커(예를 들어, (G4S)3)(G4S = 서열번호 600)에 의해 함께 융합될 수 있거나; VH의 CDR(CDR-H1(또는 이의 변이체), CDR-H2 (또는 이의 변이체),및 CDR-H3(또는 이의 변이체))을 포함하는 VH 및/또는 VL의 CDR(CDR-L1(또는 이의 변이체), CDR-L2 (또는 이의 변이체), 및 CDR-L3(또는 이의 변이체))을 포함하는 VL을 포함하며, scFv의 경우 VL에 융합된 VH 또는 VH에 융합된 VL은 예를 들어 펩타이드 링커(예를 들어, (G4S)3)(G4S = 서열번호 600)에 의해 GAA에 융합될 수 있는 항-TfR:GAA 융합 단백질, 예를 들어 항-TfR scFv:GAA 또는 항-TfR Fab:GAA를 지칭한다.
본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위의 돌연변이, 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 CpG 디뉴클레오타이드는 작제물의 치료적 유용성을 제한할 수 있다. 먼저, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드는 숙주의 톨-유사 수용체-9(TLR-9)와 상호작용하여 선천성, 전염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 두번째로, 일단 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되면, 이들은 메틸-CpG 결합 단백질에 의해 배위된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다. 잠적 스플라이스 부위는 보통 스플라이스 부위로서 사용되지 않지만 예를 들어 표준 스플라이스 부위를 비활성화하거나 전에 존재하지 않았던 스플라이스 부위를 생성하는 돌연변이에 의해 활성화될 수 있는 프리-메신저 RNA에서의 서열이다. 정확한 스플라이스 부위 선택은 성공적인 유전자 발현에 중요하고, 잠적 스플라이스 부위의 제거는 정상 또는 의도된 스플라이스 부위의 사용에 유리할 수 있다.
일례에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는다(즉, CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거된다(즉, 완전히 CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 CDTfR63-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고, 하나 이상 또는 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨). 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 작제물의 TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고(즉, 완전히 CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서 발현을 위해 코돈 최적화됨).
다양한 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 538-569에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595, 및 599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 594에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 595에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 554에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590-592 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 590에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 591에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 592에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 551에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 항-TfR scFv 코딩 서열이 제공된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587-589 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 587에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 588에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 589에 제시된 서열로 구성된다. 항-TfR scFv 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항-TfR scFv 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 TfR-결합 활성을 유지하는) 항-TfR scFv 단백질(또는 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열을 포함하는 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 항-TfR scFv 코딩 서열은 서열번호 540에 제시된 서열로 구성된 항-TfR scFv 단백질을 인코딩한다.
특정 항-TfR scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 항-TfR scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 작제물 요소가 특정 5'에서 3'으로의 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 항-TfR scFv 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터의 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
(2) 양방향 작제물
본원에 개시된 핵산 작제물은 양방향 작제물이다. 이러한 양방향 작제물은 인코딩된 관심 폴리펩타이드의 삽입 및 발현을 향상시킬 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 시스템; 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템)와 조합하여 사용될 때, 핵산 작제물의 양방향성은 작제물이 표적 게놈 유전자좌 또는 절단 부위 또는 표적 삽입 부위 내에서 어느 방향으로든 삽입(즉, 한 방향으로의 삽입으로 제한되지 않음)되게 하여, 어느 한 배향으로 삽입될 때 관심 폴리펩타이드가 발현되게 함으로써 발현 효율을 향상시킨다.
본원에 개시된 양방향 작제물은 적어도 2개의 핵산 세그먼트를 포함할 수 있으며 제1 세그먼트는 관심 폴리펩타이드에 대한 제1 코딩 서열을 포함하고, 제2 세그먼트는 관심 폴리펩타이드에 대한 제2 코딩 서열의 역상보를 포함하거나, 그 반대이다. 그러나, 본원에 개시된 다른 양방향 작제물은 적어도 2개의 핵산 세그먼트를 포함할 수 있으며, 제1 세그먼트는 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함하고, 제2 세그먼트는 또 다른 단백질에 대한 코딩 서열의 역상보를 포함하거나, 그 반대이다. 역상보는 기준 서열의 상보 서열인 서열을 지칭하며, 상보 서열은 역배향으로 작성된다. 예를 들어, 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'에 대해, 완벽한 상보 서열은 3'-GACCTGGCT-5'이고, 완벽한 역상보는 5'-TCGGTCCAG-3'으로 작성된다. 역상보 서열은 완벽할 필요가 없으며, 기준 서열과 동일한 폴리펩타이드 또는 유사한 폴리펩타이드를 여전히 인코딩할 수 있다. 코돈 사용 중복으로 인해, 역상보는 동일한 폴리펩타이드를 인코딩하는 기준 서열로부터 분기될 수 있다. 코딩 서열은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 서열, 예컨대 관심 폴리펩타이드 또는 다른 단백질에 연결된 신호 서열, 표지 서열(예를 들어, HiBit), 또는 이종성 기능적 서열(예를 들어, 핵 위치 서열(NLS) 또는 자가-절단 펩타이드)과 같은 아미노- 또는 카르복시-말단 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
특정 양방향 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 양방향 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'으로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 양방향 작제물 요소가 특정 5'에서 3' 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 5'에서 3'으로 제1 스플라이스 수용체, 제1 코딩 서열, 제1 종결자, 제2 종결자의 역상보, 제2 코딩 서열의 역상보, 및 제2 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 양방향 작제물이 본원에 개시되는 경우, 이는 또한 5'에서 3'으로 제2 스플라이스 수용체, 제2 코딩 서열, 제2 종결자, 제1 종결자의 역상보, 제1 코딩 서열의 역상보, 및 제1 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 작제물을 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 양방향 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터 중 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
적어도 2개의 세그먼트가 둘 모두 관심 폴리펩타이드를 인코딩할 때, 적어도 2개의 세그먼트는 동일한 관심 펩타이드 또는 상이한 관심 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 상이한 관심 폴리펩타이드는 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5% 동일할 수 있다. 예를 들어, 제1 세그먼트는 야생형 관심 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩할 수 있고, 제2 세그먼트는 관심 폴리펩타이드의 변이체 또는 이의 단편을 인코딩할 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 대안적으로, 제1 세그먼트는 관심 폴리펩타이드의 제1 변이체를 인코딩할 수 있고, 제2 세그먼트는 관심 폴리펩타이드의 제1 변이체와 상이한 관심 폴리펩타이드의 제2 변이체를 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 2개의 세그먼트는 동일한 관심 폴리펩타이드를 인코딩한다(즉, 100% 동일함).
2개의 세그먼트가 동일한 관심 폴리펩타이드를 인코딩할 때에도, 제1 세그먼트의 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열은 제2 세그먼트의 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열과 상이할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 코딩 서열의 코돈 사용은 제2 코딩 서열의 코돈 사용과 동일하다. 다른 양방향 작제물에서, 제2 코딩 서열은 헤어핀 형성을 줄이기 위해 제1 코딩 서열의 코돈 사용과 상이한 코돈 사용을 채택한다. 코딩 서열 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 코딩 서열 중 단지 하나만 코돈-최적화된다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 코딩 서열이 코돈-최적화된다. 일부 양방향 작제물에서, 제2 코딩 서열이 코돈-최적화된다. 일부 양방향 작제물에서, 둘 모두의 코딩 서열이 코돈-최적화된다. 예를 들어, 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있거나, 제1 세그먼트의 관심 폴리펩타이드 코딩 서열에 의해 인코딩된 동일한 관심 폴리펩타이드(즉, 동일한 아미노산 서열)의 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 대체 코돈은 소정의 아미노산에 대한 코돈 사용의 변화를 지칭하고, 소정의 발현 시스템에 대해 바람직하거나 최적화된 코돈(코돈 최적화됨)일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 소정의 발현 시스템에서 바람직한 코돈 사용 또는 널리 용인된 코돈은 알려져 있다.
일례에서, 제2 세그먼트는 헤어핀 형성을 줄이기 위해 제1 세그먼트의 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용과 상이한 코돈 사용을 채택하는 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 역상보를 포함한다. 이러한 역상보는 제1 세그먼트의 코딩 서열의 모든 뉴클레오타이드보다는 적게 염기쌍을 형성하지만, 이는 선택적으로 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일례에서, 제2 세그먼트의 역상보 서열은 제1 세그먼트의 코딩 서열에 실질적으로 상보적이지 않다(예를 들어, 70% 이하 상보적). 그러나, 다른 경우, 제2 세그먼트는 제1 세그먼트의 코딩 서열에 고도로 상보적인(예를 들어, 적어도 90% 상보적) 역상보 서열을 포함한다.
제2 세그먼트는 제1 세그먼트에 대한 임의의 백분율의 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 세그먼트 서열은 제1 세그먼트에 대해 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 99%의 상보성을 가질 수 있다. 또 다른 예로, 제2 세그먼트 서열은 제1 세그먼트에 대해 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 약 95% 미만, 약 97% 미만, 또는 약 99% 미만의 상보성을 가질 수 있다. 일부 핵산 작제물에서, 제2 코딩 서열의 역상보는 제1 코딩 서열에 대해 실질적으로 상보적이지 않거나(예를 들어, 70% 이하 상보적임), 제1 코딩 서열의 단편에 대해 실질적으로 상보적이지 않거나, 제1 코딩 서열에 대해 고도로 상보적이거나(예를 들어, 적어도 90% 상보적임), 제1 코딩 서열의 단편에 대해 고도로 상보적이거나, 제1 코딩 서열의 역상보와 약 50% 내지 약 80% 동일하거나, 제1 코딩 서열의 역상보와 약 60% 내지 약 100% 동일하다.
본원에 개시된 양방향 작제물은 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 소기의 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 양방향 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함할 필요가 없고/없거나 예를 들어 상동성-독립적 공여체 작제물일 수 있다. 부분적으로 핵산 작제물의 양방향 기능으로 인해, 양방향 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 어느 방향으로든 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 관심 폴리펩타이드가 효율적으로 삽입 및/또는 발현되도록 할 수 있다.
일부 경우, 양방향 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드의 발현은 숙주 세포의 프로모터(예를 들어, 전이유전자가 숙주 세포의 ALB 유전자좌 내로 통합될 때, 내인성 ALB 프로모터)에 의해 유도될 수 있다. 다른 경우, 양방향 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 즉, 발현에 필요하지는 않지만, 본원에 개시된 작제물은 또한 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 펩타이드를 암호화하는 추가적인 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호와 같은 전사 또는 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물은 제1 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현을 유도하는 프로모터 및/또는 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 역상보의 발현을 유도하는 프로모터의 역상보를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 양방향 작제물은 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 소기의 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특징을 포함하거나 제외하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 일부 양방향 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 부분적으로 핵산 작제물의 양방향 기능으로 인해, 양방향 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 어느 방향(배향)으로든 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 관심 폴리펩타이드가 효율적으로 삽입 및/또는 발현되도록 할 수 있다.
일부 경우, 양방향 작제물은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 폴리아데닐화 테일 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제2 세그먼트는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있고, 제2 세그먼트는 제2 폴리아데닐화 신호 서열(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열의 역상보)을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 코딩 서열의 3'에 위치한 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제2 세그먼트는 제2 코딩 서열의 역상보의 5'에 위치한 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역상보를 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 코딩 서열의 3'에 위치하는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있고, 제2 세그먼트는 제2 코딩 서열의 역상보의 5'에 위치하는 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역상보를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 폴리아데닐화 신호 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 일례에서, 제1 및 제2 폴리아데닐화 신호는 상이하다. 특정 예에서, 제1 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이거나, 그 반대이다. 예를 들어, 하나의 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호일 수 있고, 다른 폴리아데닐화 신호는 BGH 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 특정 예에서, 하나의 폴리아데닐화 신호는 서열번호 161을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나, 구성될 수 있고, 다른 폴리아데닐화 신호는 서열번호 162를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나, 구성될 수 있다.
일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트 둘 모두는 폴리아데닐화 테일 서열을 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열을 설계하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 일부 양방향 작제물에서, 제1 및 제2 세그먼트 중 하나 또는 둘 모두는 개방형 리딩 프레임의 하류에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열(즉, 코딩 서열의 3'에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열 또는 코딩 서열의 역상보의 5'에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열)을 포함한다. 폴리아데닐화 테일 서열은 예를 들어 제1 및/또는 제2 세그먼트의 관심 폴리펩타이드(또는 다른 단백질 코딩 서열)의 코딩 서열의 하류에서 "폴리-A" 신전부로서 인코딩될 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 아데닌 및 선택적으로 최대 300개의 아데닌을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리-A 테일은 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만, UAUAAA 또는 AU/GUAAA와 같은 변이체가 식별되었다. 예를 들어, 문헌[Proudfoot (2011) Genes & Dev. 25(17):1770-82]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 일부 양방향 작제물에서, 단일 양방향 종결자를 사용하여 센스 또는 안티센스 방향 중 임의의 하나에서 RNA 폴리머라제 전사를 종결시킬 수 있다(즉, 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트 둘 모두로부터 RNA 폴리머라제 전사를 종결시킴). 양방향 종결자의 예는 ARO4, TRP1, TRP4, ADH1, CYC1, GAL1, GAL7, 및 GAL10 종결자를 포함한다.
일부 경우, 양방향 작제물은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제2 세그먼트는 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있고, 제2 세그먼트는 제2 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 스플라이스 수용체 부위의 역상보)를 포함할 수 있다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 코딩 서열의 5'에 위치한 제1 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 일부 양방향 작제물에서, 제2 세그먼트는 제2 코딩 서열의 역상보의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용체 부위의 역상보를 포함한다. 일부 양방향 작제물에서, 제1 세그먼트는 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 제1 스플라이스 수용체 부위를 포함하고, 제2 세그먼트는 제2 코딩 서열의 역상보의 3'에 위치하는 제2 스플라이스 수용체 부위의 역상보를 포함한다. 제1 및 제2 스플라이스 수용체 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 예에서, 둘 모두의 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체이다. 특정 예에서, 둘 모두의 스플라이스 수용체는 서열번호 163을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
양방향 작제물은 스플라이스 수용체에 연결된 제1 코딩 서열을 인코딩하는 제1 코딩 서열 및 스플라이스 수용체의 역상보에 작동 가능하게 연결된 제2 코딩 서열의 역상보를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 양방향 작제물은 또한 작제물의 하나 또는 양쪽 단부 상에 스플라이스 수용체 부위 또는 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트 둘 모두에서 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다(예를 들어, 코딩 서열의 5'에서 스플라이스 수용체 부위 또는 코딩 서열의 역상보의 3'에서 스플라이스 수용체의 역상보). 스플라이스 수용체 부위는 예를 들어 NAG를 포함하거나 NAG로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 ALB 스플라이스 수용체(예를 들어, ALB의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, ALB 엑손 2 스플라이스 수용체))이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 ALB 유전자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 유전자(예를 들어, 마우스 Alb의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체))로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자로부터의 스플라이스 수용체이다. 인공 스플라이스 수용체를 포함하는 진핵생물에 유용한 추가적인 적합한 스플라이스 수용체 부위는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Shapiro et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:7155-7174] 및 문헌[Burset et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:255-259]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 양방향 작제물에 사용되는 스플라이스 수용체는 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 예에서, 둘 모두의 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체이다.
양방향 작제물은 원형 또는 선형일 수 있다. 예를 들어, 양방향 작제물은 선형일 수 있다. 제1 및 제2 세그먼트는 링커 서열을 통해 선형 방식으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 역상보 서열을 포함하는 제2 세그먼트의 5' 단부는 제1 세그먼트의 3' 단부에 연결될 수 있다. 대안적으로, 제1 세그먼트의 5' 단부는 역상보 서열을 포함하는 제2 세그먼트의 3' 단부에 연결될 수 있다. 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 링커는 약 5개 내지 약 2000개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 한 예로서, 링커 서열은 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 35개, 약 40개, 약 45개, 약 50개, 약 55개, 약 60개, 약 65개, 약 70개. 약 75개, 약 80개, 약 85개, 약 90개, 약 95개, 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 250개, 약 300개, 약 500개, 약 1000개, 약 1500개, 약 2000개, 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 링커 서열 이외에 또는 그 대신에 다른 구조적 요소가 또한 제1 세그먼트와 제2 세그먼트 사이에 삽입될 수 있다.
본원에 개시된 양방향 작제물은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적 단일 가닥 및 부분적 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 작제물은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오사이드 유사체 사용). 특정 예에서, 양방향 작제물은 단일 가닥(예를 들어, 단일 가닥 DNA)이다.
본원에 개시된 양방향 작제물은 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 기능적 이점을 부여하는 하나 이상의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 하나 또는 양쪽 단부에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 작제물을 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 방법(들)(예를 들어, 바이러스 벡터 전달 또는 전달용 지질 나노입자 내로의 패키징 사용)에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 역말단 반복부(ITR), 헤어핀, 루프, 및 환상체와 같은 기타 구조와 같은 말단 구조를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 작제물은 1개, 2개, 또는 3개의 ITR을 포함할 수 있거나, 2개 이하의 ITR을 포함할 수 있다. 구조적 변형의 다양한 방법은 알려져 있다.
유사하게, 작제물의 하나 또는 양쪽 단부는 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오용해성 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나 또는 양쪽 단부에 결찰될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963] 및 문헌[Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 분해로부터 작제물을 보호하는 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결부의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본원에 보다 상세하게 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 양방향 작제물은 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 작제물은 노출된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 리포솜, 중합체, 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.
일 예시적인 양방향 작제물에서, 제2 세그먼트는 제1 세그먼트의 3'에 위치하고, 제1 관심 폴리펩타이드 코딩 서열 및 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열은 둘 모두 동일한 인간 관심 폴리펩타이드를 인코딩하고, 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열은 제1 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 코돈 사용과 상이한 코돈 사용을 채택하고, 제1 세그먼트는 제1 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 3'에 위치한 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 세그먼트는 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 역상보의 5'에 위치한 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역상보를 포함하고, 제1 세그먼트는 제1 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 5'에 위치한 제1 스플라이스 수용체 부위를 포함하고, 제2 세그먼트는 제2 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 역상보의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용체 부위의 역상보를 포함하고, 핵산 작제물은 제1 관심 폴리펩타이드 단백질 및 제2 관심 폴리펩타이드 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 선택적으로, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
(3) 일방향 작제물
본원에 개시된 핵산 작제물은 일방향 작제물이다. 특정 일방향 구조체 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 일방향 구조체가 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'으로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 일방향 구조체 요소가 특정 5'에서 3' 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 일방향 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터의 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일방향 작제물에서, 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있거나, 관심 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용할 수 있다(즉, 동일한 아미노산 서열). 본원에 사용된 대체 코돈은 소정의 아미노산에 대한 코돈 사용의 변화를 지칭하고, 소정의 발현 시스템에 대해 바람직하거나 최적화된 코돈(코돈 최적화됨)일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 소정의 발현 시스템에서 바람직한 코돈 사용 또는 널리 용인된 코돈은 알려져 있다.
본원에 개시된 일방향 작제물은 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 소기의 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 일방향 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함할 필요가 없고/없거나 예를 들어 상동성-독립적 공여체 작제물일 수 있다.
일부 경우, 일방향 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드의 발현은 숙주 세포의 프로모터(예를 들어, 전이유전자가 숙주 세포의 ALB 유전자좌 내로 통합될 때, 내인성 ALB 프로모터)에 의해 유도될 수 있다. 다른 경우, 일방향 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 즉, 발현에 필요하지는 않지만, 본원에 개시된 작제물은 또한 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 펩타이드를 암호화하는 추가적인 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호와 같은 전사 또는 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 일방향 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 발현을 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 경우, 일방향 작제물은 하나 이상(예를 들어, 2개)의 폴리아데닐화 테일 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 일방향 작제물은 관심 폴리펩타이드 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 BGH 폴리아데닐화 신호이다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 BGH 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 161을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 162를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
적합한 폴리아데닐화 테일 서열을 설계하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 일부 일방향 작제물은 개방형 리딩 프레임의 하류에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열(즉, 코딩 서열의 3'에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열)를 포함한다. 폴리아데닐화 테일 서열은 예를 들어 제1 및/또는 제2 세그먼트의 관심 폴리펩타이드(또는 다른 단백질 코딩 서열)에 대한 코딩 서열의 하류에서 "폴리-A" 신전부로서 인코딩될 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 아데닌 및 선택적으로 최대 300개의 아데닌을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리-A 테일은 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만, UAUAAA 또는 AU/GUAAA와 같은 변이체가 식별되었다. 예를 들어, 문헌[Proudfoot (2011) Genes & Dev. 25(17):1770-82]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우, 일방향 작제물은 하나 이상의 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 일부 일방향 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체이다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 서열번호 163을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
스플라이스 수용체 부위는 예를 들어 NAG를 포함하거나 NAG로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 ALB 스플라이스 수용체(예를 들어, ALB의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, ALB 엑손 2 스플라이스 수용체))이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 ALB 유전자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 유전자(예를 들어, 마우스 Alb의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체))로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자로부터의 스플라이스 수용체이다. 인공 스플라이스 수용체를 포함하는 진핵생물에 유용한 추가적인 적합한 스플라이스 수용체 부위는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Shapiro et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:7155-7174] 및 문헌[Burset et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:255-259]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일방향 작제물은 원형 또는 선형일 수 있다. 예를 들어, 일방향 작제물은 선형일 수 있다.
본원에 개시된 일방향 작제물은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적 단일 가닥 및 부분적 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 작제물은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오사이드 유사체 사용). 특정 예에서, 일방향 작제물은 단일 가닥(예를 들어, 단일 가닥 DNA)이다.
본원에 개시된 일방향 작제물은 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 기능적 이점을 부여하는 하나 이상의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 하나 또는 양쪽 단부에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 작제물을 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 방법(들)(예를 들어, 바이러스 벡터 전달 또는 전달용 지질 나노입자 내로의 패키징 사용)에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 역말단 반복부(ITR), 헤어핀, 루프, 및 환상체와 같은 기타 구조와 같은 말단 구조를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 작제물은 1개, 2개, 또는 3개의 ITR을 포함할 수 있거나, 2개 이하의 ITR을 포함할 수 있다. 구조적 변형의 다양한 방법은 알려져 있다.
유사하게, 작제물의 하나 또는 양쪽 단부는 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오용해성 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나 또는 양쪽 단부에 결찰될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963] 및 문헌[Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 분해로부터 작제물을 보호하는 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결부의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본원에 보다 상세하게 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 일방향 작제물은 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 작제물은 노출된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 리포솜, 중합체, 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.
일 예시적인 일방향 작제물에서, 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 작제물은 관심 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용체 부위를 포함하고, 핵산 작제물은 관심 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 선택적으로, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
(4) 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물
본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 일방향 작제물 또는 양방향 작제물이다. 특정 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'으로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 작제물 요소가 특정 5'에서 3'으로의 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터의 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
핵산 작제물에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있거나, 단백질의 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용할 수 있다(즉, 동일한 아미노산 서열). 본원에 사용된 대체 코돈은 소정의 아미노산에 대한 코돈 사용의 변화를 지칭하고, 소정의 발현 시스템에 대해 바람직하거나 최적화된 코돈(코돈 최적화됨)일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 소정의 발현 시스템에서 바람직한 코돈 사용 또는 널리 용인된 코돈은 알려져 있다.
핵산 작제물에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화될 수 있거나, 단백질의 하나 이상의 아미노산에 대한 하나 이상의 대체 코돈을 사용할 수 있다(즉, 동일한 아미노산 서열). 본원에 사용된 대체 코돈은 소정의 아미노산에 대한 코돈 사용의 변화를 지칭하고, 소정의 발현 시스템에 대해 바람직하거나 최적화된 코돈(코돈 최적화됨)일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 소정의 발현 시스템에서 바람직한 코돈 사용 또는 널리 용인된 코돈은 알려져 있다.
본원에 개시된 핵산 작제물은 임의의 특정 용도를 위해 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 소기의 기능을 부여하는 임의의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함할 필요가 없고/없거나 예를 들어 상동성-독립적 공여체 작제물일 수 있다.
일부 경우, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현은 숙주 세포의 프로모터(예를 들어, 전이유전자가 숙주 세포의 ALB 유전자좌 내로 통합될 때, 내인성 ALB 프로모터)에 의해 유도될 수 있다. 다른 경우, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 즉, 발현에 필요하지는 않지만, 본원에 개시된 작제물은 또한 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 펩타이드를 암호화하는 추가적인 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호와 같은 전사 또는 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 간 특이적 프로모터일 수 있다. 간 특이적 프로모터의 예는 TTR 프로모터, 예컨대 인간 또는 마우스 TTR 프로모터를 포함한다. 일례에서, 작제물은 TTR 프로모터, 예컨대 마우스 TTR 프로모터 또는 인간 TTR 프로모터를 포함할 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 TTR 프로모터에 작동 가능하게 연결됨). 일례에서, 작제물은 SERPINA1 인핸서, 예컨대 마우스 SERPINA1 인핸서 또는 인간 SERPINA1 인핸서를 포함할 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 SERPINA1 인핸서에 작동 가능하게 연결됨). 일례에서, 작제물은 TTR 프로모터 및 SERPINA1 인핸서, 예컨대 인간 SERPINA1 인핸서 및 마우스 TTR 프로모터를 포함할 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 SERPINA1 인핸서 및 TTR 프로모터에 작동 가능하게 연결됨).
일부 경우, 작제물은 하나 이상의 폴리아데닐화 테일 서열 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호(또는 이의 변이체)이다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 CpG-고갈된 BGH 폴리아데닐화 신호이다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 CpG-고갈된 BGH 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 712, 169, 또는 161을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 712를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 169를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 161을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호 162를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
적합한 폴리아데닐화 테일 서열을 설계하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 일부 핵산 작제물은 개방형 리딩 프레임의 하류에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열(즉, 코딩 서열의 3'에서 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열)를 포함한다. 폴리아데닐화 테일 서열은 예를 들어 제1 및/또는 제2 세그먼트의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열(또는 다른 단백질 코딩 서열)의 하류에서 "폴리-A" 신전부로서 인코딩될 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 아데닌 및 선택적으로 최대 300개의 아데닌을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 폴리-A 테일은 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 적합한 폴리아데닐화 테일 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 서열을 설계하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열 AAUAAA는 포유류 시스템에서 일반적으로 사용되지만, UAUAAA 또는 AU/GUAAA와 같은 변이체가 식별되었다. 예를 들어, 문헌[Proudfoot (2011) Genes & Dev. 25(17):1770-82]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우, 핵산 작제물은 하나 이상의 스플라이스 수용체 부위를 포함할 수 있다. 일부 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체이다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 서열번호 163을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
스플라이스 수용체 부위는 예를 들어 NAG를 포함하거나 NAG로 구성될 수 있다. 특정 예에서, 스플라이스 수용체는 ALB 스플라이스 수용체(예를 들어, ALB의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, ALB 엑손 2 스플라이스 수용체))이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 ALB 유전자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 마우스 Alb 유전자(예를 들어, 마우스 Alb의 엑손 1과 엑손 2를 함께 스플라이싱하는 데 사용되는 ALB 스플라이스 수용체(즉, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체))로부터 유래될 수 있다. 또 다른 예에서, 스플라이스 수용체는 GAA 스플라이스 수용체이다. 예를 들어, 이러한 스플라이스 수용체는 인간 GAA 유전자로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이러한 스플라이스 수용체는 마우스 GAA 유전자로부터 유래될 수 있다. 인공 스플라이스 수용체를 포함하는 진핵생물에 유용한 추가적인 적합한 스플라이스 수용체 부위는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Shapiro et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:7155-7174] 및 문헌[Burset et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:255-259]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
핵산 작제물은 원형 또는 선형일 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 선형일 수 있다. 본원에 개시된 핵산 작제물은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적 단일 가닥 및 부분적 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 작제물은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오사이드 유사체 사용). 특정 예에서, 핵산 작제물은 단일 가닥(예를 들어, 단일 가닥 DNA)이다.
본원에 개시된 핵산 작제물은 필요에 따라 그리고/또는 하나 이상의 기능적 이점을 부여하는 하나 이상의 적합한 구조적 특성을 포함하도록 하나 또는 양쪽 단부에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 변형은 본원에 개시된 작제물을 숙주 세포에 전달하는 데 사용되는 방법(들)(예를 들어, 바이러스 벡터 전달 또는 전달용 지질 나노입자 내로의 패키징 사용)에 따라 달라질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 역말단 반복부(ITR), 헤어핀, 루프, 및 환상체와 같은 기타 구조와 같은 말단 구조를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 핵산 작제물은 1개, 2개, 또는 3개의 ITR을 포함할 수 있거나 2개 이하의 ITR을 포함할 수 있다. 구조적 변형의 다양한 방법은 알려져 있다.
유사하게, 핵산 작제물의 하나 또는 양쪽 단부는 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오용해성 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나 또는 양쪽 단부에 결찰될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963] 및 문헌[Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 분해로부터 작제물을 보호하는 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결부의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본원에 보다 상세하게 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 핵산 작제물은 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산 작제물은 노출된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 리포솜, 중합체, 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있다.
본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위의 돌연변이, 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 CpG 디뉴클레오타이드는 작제물의 치료적 유용성을 제한할 수 있다. 먼저, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드는 숙주의 톨-유사 수용체-9(TLR-9)와 상호작용하여 선천성, 전염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 두번째로, 일단 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되면, 이들은 메틸-CpG 결합 단백질에 의해 배위된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다. 잠적 스플라이스 부위는 보통 스플라이스 부위로서 사용되지 않지만 예를 들어 표준 스플라이스 부위를 비활성화하거나 전에 존재하지 않았던 스플라이스 부위를 생성하는 돌연변이에 의해 활성화될 수 있는 프리-메신저 RNA에서의 서열이다. 정확한 스플라이스 부위 선택은 성공적인 유전자 발현에 중요하고, 잠적 스플라이스 부위의 제거는 정상 또는 의도된 스플라이스 부위의 사용에 유리할 수 있다.
일례에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는다(즉, CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고, 하나 이상 또는 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, CD63-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고(즉, 완전히 CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨).
본원에 개시된 핵산 작제물에서 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화(예를 들어, 인간 코돈에 대해), CpG 디뉴클레오타이드의 고갈, 잠적 스플라이스 부위의 돌연변이, 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 CpG 디뉴클레오타이드는 작제물의 치료적 유용성을 제한할 수 있다. 먼저, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드는 숙주의 톨-유사 수용체-9(TLR-9)와 상호작용하여 선천성, 전염증성 면역 반응을 자극할 수 있다. 두번째로, 일단 CpG 디뉴클레오타이드가 메틸화되면, 이들은 메틸-CpG 결합 단백질에 의해 배위된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다. 잠적 스플라이스 부위는 보통 스플라이스 부위로서 사용되지 않지만 예를 들어 표준 스플라이스 부위를 비활성화하거나 전에 존재하지 않았던 스플라이스 부위를 생성하는 돌연변이에 의해 활성화될 수 있는 프리-메신저 RNA에서의 서열이다. 정확한 스플라이스 부위 선택은 성공적인 유전자 발현에 중요하고, 잠적 스플라이스 부위의 제거는 정상 또는 의도된 스플라이스 부위의 사용에 유리할 수 있다.
일례에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는다(즉, CpG 고갈됨). 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 돌연변이되거나 제거된 하나 이상의 잠적 스플라이스 부위를 갖는다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고, 하나 이상 또는 모든 식별된 잠적 스플라이스 부위가 돌연변이되거나 제거된다. 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 제거된 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖고(즉, CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨). 또 다른 특정 예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, TfR-결합 전달 도메인 코딩 서열, 및/또는 GAA 코딩 서열은 모든 CpG 디뉴클레오타이드가 제거되고(즉, 완전히 CpG 고갈됨), 코돈 최적화된다(예를 들어, 인간 또는 포유류에서의 발현을 위해 코돈 최적화됨).
일 예시적인 핵산 작제물에서, 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용체 부위를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고, 선택적으로, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193을 포함할 수 있거나, 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193으로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193으로 구성될 수 있다.
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 195-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 194에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 201에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 200에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 198에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일부 경우, VL-(Gly4Ser)3- VH:GAA(Gly4Ser = 서열번호 600) 형식의 항-hTfR:GAA scFv 융합 단백질. 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 및 675-702 중 임의의 하나를 포함할 수 있거나, 서열번호 570-573 및 675-702 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 및 675-702 중 임의의 하나로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 및 675-702 중 임의의 하나로 구성될 수 있다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570을 포함할 수 있거나, 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570으로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570으로 구성될 수 있다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 571을 포함할 수 있거나, 서열번호 571과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 571로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 571로 구성될 수 있다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572를 포함할 수 있거나, 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 572로 구성될 수 있다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573을 포함할 수 있거나, 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573으로 본질적으로 구성될 수 있다. 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573으로 구성될 수 있다.
일부 경우, VL-(Gly4Ser)3-VH:GAA(Gly4Ser = 서열번호 600) 형식의 항-hTfR:GAA scFv 융합 단백질. 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 특정 예에서, 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 703-706 중 임의의 하나를 포함할 수 있거나(선택적으로, N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA 서열 결여), 서열번호 703-706 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다(선택적으로, N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA 서열 결여). 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 703-706 중 임의의 하나로 본질적으로 구성될 수 있다(선택적으로, N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA 서열 결여). 또 다른 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 703-706 중 임의의 하나로 구성될 수 있다(선택적으로, N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA 서열 결여).
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 577 및 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 585에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 734에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 586에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 735에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 576 및 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581-583 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 581에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 729에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 582에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 730에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 583에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
핵산 작제물은 예를 들어 (1) 5' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것), (2) 스플라이스 수용체 부위(예를 들어, 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체, 예컨대 서열번호 163에 제시된 것), (3) 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열, (4) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, SV40 폴리아데닐화 신호, 예컨대 서열번호 712에 제시된 것), 및 (5) 3' ITR(예를 들어, 예컨대 서열번호 160에 제시된 것 또는 이의 역상보)을 포함할 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 서열번호 731에 제시된 서열을 포함한다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 핵산 작제물은 서열번호 572에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 574 및 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 코돈 최적화된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다(예를 들어, CpG-고갈되고(예를 들어, 완전히 CpG-고갈되고), 코돈 최적화됨). 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578-580 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 GAA 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 578에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 579에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고(또는 서열을 포함하고), 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 580에 제시된 서열로 구성된다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 예를 들어 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고/되거나 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 CpG-고갈(예를 들어, 완전히 CpG-고갈)되고, 코돈 최적화될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 570에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
다양한 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 제공된다. 일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575와 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하다(또는 서열을 포함한다). 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575에 제시된 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575에 제시된 서열로 본질적으로 구성된다. 또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 575에 제시된 서열로 구성된다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571과 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한(그리고 예를 들어 자연 GAA의 활성을 유지하는) 다중 도메인 치료적 단백질(또는 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질)을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571에 제시된 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571에 제시된 서열로 본질적으로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다. 선택적으로, 상기 예의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 서열번호 571에 제시된 서열로 구성된 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩한다.
특정 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 서열이 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 작제물 요소가 특정 5'에서 3'으로의 순서로 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 이에 대한 한 가지 이유는 본원에 개시된 다수의 실시형태에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 단일 가닥 재조합 AAV 벡터의 일부라는 것이다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
(5) 벡터
본원에 개시된 핵산 작제물은 발현을 위해 또는 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위해 벡터 내에 제공될 수 있다. 벡터는 예를 들어 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 뉴클레아제 작용제 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 관심 폴리펩타이드를 인코딩(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩)하는 핵산 작제물, CRISPR/Cas 시스템(Cas 단백질 및 gRNA를 인코딩하는 핵산), CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 또는 이들의 조합(예를 들어, 핵산 작제물 및 gRNA)을 포함할 수 있다. 일부 경우, 관심 폴리펩타이드를 인코딩(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩)하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터는 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제의 어떠한 성분도 포함하지 않는다(예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하지 않고, gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하지 않음). 일부 이러한 벡터는 표적 게놈 유전자좌 내 표적 부위에 상응하는 상동성 아암을 포함한다. 다른 이러한 벡터는 임의의 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 벡터는 원형일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 선형일 수 있다. 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비-지질 나노입자, 또는 바이러스 캡시드를 통해 전달되기 위해 패키징될 수 있다. 비제한적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터, 및 발현 벡터를 포함한다.
벡터는 예를 들어 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터일 수 있다. AAV는 임의의 적합한 혈청형일 수 있고, 단일 가닥 AAV(ssAAV) 또는 자기-상보적 AAV(scAAV)일 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분열 세포, 비-분열 세포, 또는 분열 세포와 비-분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있거나, 대안적으로는 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 이러한 바이러스는 또한 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-적격일 수 있거나 복제-결함(예를 들어, 추가적인 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 하나 이상의 유전자가 결함됨)일 수 있다. 바이러스는 일시적 발현 또는 더 길게 지속하는 발현을 유발할 수 있다. 바이러스 벡터는 이들의 야생형 대응물로부터 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 용이하게 하거나 벡터의 하나 이상의 특성이 변경되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성은 패키징 수용력, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사, 및 번역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 바이러스 게놈 일부가 결실될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 예에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 서열의 숙주 게놈 내로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예컨대, 인테그라제)는 바이러스가 비-통합되도록 돌연변이될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 벡터 상의 코딩 서열의 발현을 유도하기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스는 헬퍼-의존적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 바이러스 입자 내로 증폭 및 패키징하는 데 필요한 바이러스 성분(예컨대, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 바이러스 성분을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분이 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단 내로 도입될 수 있다. 다른 예에서, 바이러스는 무-헬퍼일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭 및 패키징할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 성분을 인코딩할 수 있다.
예시적인 바이러스 역가(viral titer)(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/mL를 포함한다. 다른 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/(체중 kg)을 포함한다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간 및 비-인간 영장류(NHP)를 포함하는 다수의 종에 고유하다. 현재까지 적어도 12개의 자연 혈청형 및 수백개의 자연 변이체가 단리되고 특성 규명되었다. 예를 들어, 문헌[Li et al. (2020) Nat. Rev. Genet. 21:255-272]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. AAV 입자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 게놈을 함유하는 비-외피 이십면체 단백질 캡시드로 자연적으로 구성된다. DNA 게놈에는 복제 및 패키징 신호의 바이러스 기점으로서 역할을 하는 2개의 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된다. rep 유전자는 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 4개의 단백질을 인코딩하는 한편, cap 유전자는 AAV 혈청형을 지시하는 3개의 구조적 캡시드 하위단위 및 일부 혈청형에서 비리온 조립을 촉진하는 조립 활성화 단백질(AAP)을 인코딩한다.
재조합 AAV(rAAV)는 치료적 전이유전자를 생체내 표적 세포에 전달함으로써 인간 질환을 치료하는 유전자 요법에 사용되는 현재 가장 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터 중 하나이다. 실제로, rAAV 벡터는 자연 AAV와 유사한 이십면체 캡시드로 구성되지만, rAAV 비리온은 AAV 단백질-코딩 또는 AAV 복제 서열을 캡슐화하지 않는다. 이들 바이러스 벡터는 비-복제성이다. rAAV 벡터에 필요한 유일한 바이러스 서열은 rAAV 벡터의 제작 동안 게놈 복제 및 패키징을 안내하는 데 필요한 2개의 ITR이다. rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자가 없어서, 이들을 생체내에서 비-복제성으로 만든다. rAAV 벡터는, AAV ITR에 의해 플랭킹된 의도된 전이유전자 카세트와 조합하여, 트랜스로(in trans) 추가적인 바이러스 헬퍼 단백질과 함께 rep 및 cap 유전자를 발현함으로써 생산된다.
치료적 rAAV 게놈에서, 유전자 발현 카세트는 ITR 서열들 사이에 배치된다. 전형적으로, rAAV 게놈 카세트는 치료적 전이유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 이어서 폴리아데닐화 서열로 구성된다. rAAV 발현 카세트를 플랭킹하는 ITR은 일반적으로 AAV2로부터 유래되며, 제1 혈청형은 단리되고 재조합 바이러스 벡터로 전환된다. 이후, 대부분의 rAAV 생산 방법은 AAV2 Rep-기반 패키징 시스템에 의존한다. 예를 들어, 문헌[Colella et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8:87-104]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
사용될 수 있는 ITR의 일부 비제한적 예는 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 ITR을 포함한다. ITR의 다른 예는 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 본원에 개시된 일부 rAAV 게놈에서, 핵산 작제물은 동일한 ITR이 양쪽 측면 상에 플랭킹된다(즉, 5' 단부 상의 ITR 및 3' 단부 상의 ITR의 역상보, 예컨대 5' 단부 상의 서열번호 158 및 3' 단부 상의 서열번호 168, 또는 5' 단부 상의 서열번호 159 및 3' 단부 상의 서열번호 710, 또는 5' 단부 상의 서열번호 160 및 3' 단부 상의 서열번호 711). 일례에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 158 및 3' 단부 상의 역상보). 또 다른 예에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 159 및 3' 단부 상의 역상보). 일례에서, 적어도 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 5' 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 3' 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 160 및 3' 단부 상의 역상보). 본원에 개시된 다른 rAAV 게놈에서, 핵산 작제물은, 각각의 단부 상에 상이한 ITR에 의해 플랭킹된다. 일례에서, 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 또 다른 예에서, 하나의 단부 상의 상 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
재조합 AAV 벡터의 특정 혈청형은 특정 조직에 대한 이의 생체내 향성에 영향을 미친다. AAV 캡시드 단백질은 표적 세포 내로의 부착 및 진입을 매개하고, 이어서 엔도솜 탈출 및 핵으로의 트래피킹을 담당한다. 따라서, rAAV 벡터를 개발할 때 혈청형의 선택은 벡터가 생체내 주입될 때 어떤 세포 유형 및 조직에 결합하고 형질도입될 가능성이 가장 높은지에 영향을 미칠 것이다. rAAV8을 포함하는 rAAV의 몇몇의 혈청형은 마우스, NHP, 및 인간에서 전신으로 전달될 때 간에 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Li et al. (2020) Nat. Rev. Genet. 21:255-272]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일단 핵 내에서, ssDNA 게놈은 비리온으로부터 방출되고, 상보적 DNA 가닥이 합성되어 이중 가닥 DNA(dsDNA) 분자를 생성한다. 이중 가닥 AAV 게놈은 이들의 ITR을 통해 자연적으로 원형화되고, 핵에서 염색체 외부에 지속될 에피솜이 된다. 따라서, 에피솜 유전자 요법 프로그램의 경우, rAAV-전달 rAAV 에피솜은 비-분열 세포에서 장기적 프로모터-유도 유전자 발현을 제공한다. 그러나, 이러한 rAAV-전달 에피솜 DNA는 세포가 분할함에 따라 희석된다. 대조적으로, 본원에 기재된 유전자 요법은 장기적 유전자 발현을 허용하는 유전자 삽입을 기반으로 한다.
특정 서열(예를 들어, 특정 양방향 작제물 서열 또는 특정 일방향 작제물 서열)을 포함하는 특정 rAAV가 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 양방향 또는 일방향 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'으로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 특정 5'에서 3' 순서의 양방향 또는 일방향 작제물 요소를 포함하는 rAAV가 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 5'에서 3'으로 제1 스플라이스 수용체, 제1 코딩 서열, 제1 종결자, 제2 종결자의 역상보, 제2 코딩 서열의 역상보, 및 제2 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 양방향 작제물을 포함하는 rAAV가 본원에 개시되는 경우, 이는 또한 5'에서 3'으로 제2 스플라이스 수용체, 제2 코딩 서열, 제2 종결자, 제1 종결자의 역상보, 제1 코딩 서열의 역상보, 및 제1 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 작제물을 포함하도록 의도된다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
ssDNA AAV 게놈은 상보적 DNA 가닥이 합성되도록 하는 2개의 역말단 반복부에 의해 플랭킹된 2개의 개방형 리딩 프레임, Rep 및 Cap로 구성된다. AAV 전이 플라스미드를 구축할 때, 전이유전자는 2개의 ITR들 사이에 배치되고, Rep 및 Cap는 트랜스로 공급될 수 있다. Rep 및 Cap 외에, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드가 필요할 수 있다. 이들 유전자(E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개한다. 예를 들어, 전이 플라스미드, Rep/Cap 및 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포 내로 형질주입되어 감염성 AAV 입자를 생산할 수 있다. 대안적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 내로 조합될 수 있다. 유사한 패키징 세포 및 방법이 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 사용될 수 있다.
AAV의 다수의 혈청형이 식별되었다. 이들 혈청형은 이들이 감염시키는 세포의 유형(즉, 이들의 향성)이 상이하여, 특정 세포 유형의 형질도입을 선호하게 한다. 용어 AAV는 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 자연 말단 반복부(TR), Rep 단백질, 및 캡시드 하위단위의 서열은 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 본원에 사용된 "AAV 벡터"는 전형적으로 관심 외인성 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함하는, AAV 기원이 아닌 이종성 서열(즉, AAV에 대한 이종성 핵산 서열)을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 작제물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV 캡시드 서열을 포함한다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열(전이유전자)은 적어도 하나 및 일반적으로 2개의 AAV 역말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된다. AAV 벡터는 단일 가닥(ssAAV)이거나 자기-상보적(scAAV)일 수 있다. 간 조직을 위한 혈청형의 예는 AAV3B, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.74, 및 AAVhu.37, 및 특히 AAV8을 포함한다. 특정 예에서, 핵산 작제물을 포함하는 AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8)일 수 있다. 본원에 기재된 rAAV8 벡터는 캡시드가 AAV8 유래인 것이다. 예를 들어, AAV2로부터의 ITR 및 AAV8의 캡시드를 사용하는 AAV 벡터는 본원에서 rAAV8 벡터인 것으로 간주된다.
향성은 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드와 게놈의 혼합인 위형화(pseudotyping)를 통해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 패키징된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 위형화된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 향상시킬 뿐만 아니라 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드가 또한 바이러스 향성을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고, 생체내에서 광범위한 세포 유형 범위에 걸쳐 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 나타내되 향상된 뇌 흡수를 갖는 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 또한 돌연변이를 통해 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형화된/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다.
전이유전자 발현을 가속화하기 위해, 자기-상보적 AAV(scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV는 AAV의 단일-가닥 DNA 게놈의 상보적 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 기구에 의존하기 때문에, 전이유전자 발현이 지연될 수 있다. 이러한 지연을 해결하기 위해, 감염 시 자발적으로 서냉복원할 수 있는 상보적 서열을 함유하는 scAAV가 사용되어, 숙주 세포 DNA 합성을 위한 요건을 없앨 수 있다. 그러나, 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터가 또한 사용될 수 있다.
패키징 수용력을 증가시키기 위해, 더 긴 전이유전자는 2개의 AAV 전이 플라스미드들 사이에서 분할될 수 있으며, 제1 AAV는 3' 스플라이스 공여체가 있고, 제2 AAV는 5' 스플라이스 수용체가 있다. 세포의 공동-감염 시, 이들 바이러스는 콘카타머(concatemer)를 형성하며, 함께 스플라이싱되고, 전장 전이유전자가 발현될 수 있다. 이는 더 긴 전이유전자가 발현되게 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 수용력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동 재조합을 활용한다. 예를 들어, 전이유전자는 공동-발현이 전장 전이유전자의 상동 재조합 및 발현을 유도하도록 2개의 전이 플라스미드들 사이에서 분할되나 실질적인 서열 중첩이 있을 수 있다.
B. 뉴클레아제 작용제 및 CRISPR/Cas 시스템
본원에 개시된 방법 및 조성물은 본원에 개시된 핵산 작제물의 삽입을 위해 세이프 하버 유전자(예를 들어, ALB)와 같은 표적 유전자의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키도록 뉴클레아제 작용제, 예컨대 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부(CRISPR: clustered regularly interspersed short palindromic repeat)/CRISPR-관련(Cas) 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 활용할 수 있다. 일반적으로, 뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위에서 이중 가닥 파단 또는 닉(즉, 단일 가닥 파단)을 유도하기 위해 조작된 절단 시스템의 사용을 수반한다. 절단 또는 닉킹은 뉴클레아제 표적 부위의 특정 절단 또는 닉킹을 안내하기 위한 조작된 가이드 RNA가 있는 조작된 ZFN, TALEN, 또는 CRISPR/Cas 시스템과 같은 특정 뉴클레아제의 사용을 통해 일어날 수 있다. 소기의 표적 서열에서 닉 또는 이중 가닥 파단을 유도하는 임의의 뉴클레아제 작용제가 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 숙주 게놈 내의 소기의 유전자좌(표적 유전자)에서 삽입 부위를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이 부위에 핵산 작제물이 삽입되어 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 발현한다. 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)는 세이프 하버 유전자좌와 같은 이의 삽입 부위 또는 유전자좌(표적 유전자)에 대해 외인성일 수 있으며, 이로부터 관심 폴리펩타이드는 정상적으로 발현되지 않는다. 대안적으로, 관심 폴리펩타이드는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 내인성 유전자좌 내로의 삽입과 같이 이의 삽입 부위에 대해 비-외인성이어서 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 결함 유전자를 보정할 수 있다.
일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이다. 또 다른 예에서, 뉴클레아제 작용제는 하나 이상의 ZFN을 포함한다. 또 다른 예에서, 뉴클레아제 작용제는 하나 이상의 TALEN을 포함한다. 특정 예에서, CRISPR/Cas 시스템 또는 이러한 시스템의 성분은 세포 내의 ALB 유전자 또는 유전자좌(예를 들어, ALB 게놈 유전자좌), 또는 세포 내의 ALB 유전자 또는 유전자좌의 인트론 1을 표적화한다. 보다 특정 예에서, CRISPR/Cas 시스템 또는 이러한 시스템의 성분은 세포 내의 인간 ALB 유전자 또는 유전자좌, 또는 인간 ALB 유전자 또는 유전자좌의 인트론 1을 표적화한다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 유도하는 전사물 및 기타 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 예를 들어 유형 I, 유형 II, 유형 III 시스템, 또는 유형 V 시스템(예를 들어, 하위유형 V-A 또는 하위유형 V-B)일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위-특이적 결합 또는 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체화된 가이드 RNA(gRNA) 포함)를 활용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 이용할 수 있다. ALB 유전자 또는 유전자좌를 표적화하는 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질(또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 하나 이상의 가이드 RNA(또는 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA)를 포함하며, 하나 이상의 가이드 RNA는 각각 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, ALB 유전자 또는 유전자좌)에서 상이한 가이드 RNA 표적 서열을 표적화한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 비-자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 시스템은 인위적인 관여를 나타내는 임의의 것, 예컨대 이들의 자연 발생 상태로부터 변경되거나 돌연변이화되거나, 이들이 자연상에서 자연적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없거나, 이들이 자연적으로 회합되지 않는 적어도 하나의 다른 성분과 회합되는 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 함께 발생하지 않는 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하는 비-자연 발생 CRISPR 복합체를 이용하거나, 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질을 이용하거나, 자연적으로 발생하지 않는 gRNA를 이용한다.
(1) 표적 게놈 유전자좌 및 알부민 ( ALB )
유전자를 발현할 수 있는 임의의 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 세이프 하버 유전자좌(세이프 하버 유전자, 예컨대 ALB) 또는 내인성 GAA 유전자좌가 사용될 수 있다. 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌의 임의의 부분 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌의 인트론 또는 엑손 내로 삽입될 수 있거나, 표적 게놈 유전자좌의 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손을 대체할 수 있다. 특정 예에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌의 인트론, 예컨대 표적 게놈 유전자좌의 제1 인트론(예를 들어, ALB 인트론 1) 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2020/082042호, 미국 특허 US 2020/0270617호, 국제공개 WO 2020/082041호, 미국 특허 US 2020/0268906호, 국제공개 WO 2020/082046호, 및 미국 특허 US 2020/0289628호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 표적 게놈 유전자좌 내로 통합된 작제물은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 프로모터(예를 들어, 내인성 ALB 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
통합된 외인성 DNA와 숙주 게놈 사이의 상호작용은 통합의 신뢰성 및 안전성을 제한할 수 있고, 표적화된 유전적 변형으로 인한 것은 아니지만 대신에 주변 내인성 유전자 상의 의도치 않은 통합 효과로 인한 명백한 표현형 효과를 야기할 수 있다. 예를 들어, 무작위로 삽입된 전이유전자는 위치 효과 및 사일런싱(silencing)에 적용되어, 이들의 발현을 신뢰할 수 없고 예측 불가능하게 만들 수 있다. 마찬가지로, 염색체 유전자좌 내로의 외인성 DNA의 통합은 주변 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미침으로써 세포 거동 및 표현형을 변경시킬 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 전이유전자 또는 다른 외인성 핵산 삽입물이 세포 거동 또는 표현형을 명백하게 변경시키지 않으면서(즉, 숙주 세포 상의 임의의 해로운 효과 없이) 모든 관심 조직에서 안정하게 그리고 신뢰할 수 있게 발현될 수 있는 염색체 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sadelain et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예를 들어, 세이프 하버 유전자좌는 삽입된 유전자 서열의 발현이 이웃 유전자로부터의 임의의 번역초과(read-through) 발현에 의해 동요되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 세이프 하버 유전자좌는 외인성 DNA가 내인성 유전자 구조 또는 발현에 유해한 영향을 미치지 않으면서 예측 가능한 방식으로 통합 및 작용할 수 있는 염색체 유전자좌를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 예를 들어 비본질적이거나, 비필수적이거나, 명백한 표현형을 수반하지 않으면서 파괴될 수 있는 유전자 내의 유전자좌와 같은 유전자외 영역 또는 유전자내 영역을 포함할 수 있다.
이러한 세이프 하버 유전자좌는 모든 조직에서 개방형 염색질 배치를 제공할 수 있으며, 성체에서 배아 발달 동안 도처에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3789-3794]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 또한, 세이프 하버 유전자좌는 고효율로 표적화될 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌는 명백한 표현형 없이 파괴될 수 있다. 세이프 하버 유전자좌의 예는 ALB, CCR5, HPRT, AAVS1, 및 Rosa26을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 제8,586,526호; 및 미국 특허 공개 제2003/0232410호; 제2005/0208489호; 제2005/0026157호; 제2006/0063231호; 제2008/0159996호; 제2010/00218264호; 제2012/0017290호; 제2011/0265198호; 제2013/0137104호; 제2013/0122591호; 제2013/0177983호; 제2013/0177960호; 및 제2013/0122591호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 표적 게놈 유전자좌의 다른 예는 인간 염색체 1 또는 이의 비-인간 포유류 이종 상동 유전자(orthologue)의 ALB 유전자좌, EESYR 유전자좌, SARS 유전자좌, 위치 188,083,272, 인간 염색체 10 또는 이의 비-인간 포유류 이종 상동 유전자의 위치 3,046,320, 인간 염색체 17 또는 이의 비-인간 포유류 이종 상동 유전자의 위치 67, 328,980, 염색체 상의 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 인간 염색 19 또는 이의 비-인간 포유류 이종 상동 유전자 염색체 상의 AAV 바이러스의 자연 발생 통합 부위, 케모킨 수용체 5(CCR5) 유전자, HIV-1 공동 수용체를 인코딩하는 케모킨 수용체 유전자, 또는 마우스 Rosa26 유전자좌 또는 이의 비-뮤린 포유류 이종 상동 유전자를 포함한다.
특정 예에서, 세이프 하버 유전자좌는 게놈 내의 유전자좌이며, 유전자는 헤파토사이트와 같은 숙주 세포에 대한 유의한 해로운 영향 없이(예를 들어, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않거나, 대조군 세포 집단과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% 초과의 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 유발하지 않음) 삽입될 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 헤파토사이트와 같은 숙주 세포에 유의한 해로운 영향 없이(예를 들어, 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 야기하지 않고, 또는 대조군 세포 집단과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 40% 이상 아폽토시스, 괴사, 및/또는 노화를 야기하지 않으면서) 외인성 유전자가 과발현되도록 할 수 있다. 바람직한 세이프 하버 유전자좌는 삽입된 유전자 서열의 발현이 이웃 유전자로부터의 번역초과 발현에 의해 동요되지 않는 것일 수 있다. 세이프 하버은 인간 세이프 하버(예를 들어, 간 조직 또는 헤타토사이트 숙주 세포에 대한)일 수 있다.
특정 예에서, 표적 게놈 유전자좌는 ALB 유전자좌, 예컨대 ALB 유전자좌의 인트론 1이다. 보다 특정 예에서, 표적 게놈 유전자좌는 인간 ALB 유전자좌, 예컨대 인간 ALB 유전자좌의 인트론 1(예를 들어, 서열번호 4)이다.
(2) Cas 단백질
Cas 단백질은 일반적으로 가이드 RNA와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인(예를 들어, DNase 도메인 또는 RNase 도메인), DNA-결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 및 기타 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 일부 도메인(예를 들어, DNase 도메인)은 자연 Cas 단백질로부터의 것일 수 있다. 이러한 다른 도메인이 첨가되어 변형된 Cas 단백질을 제작할 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 절단에 대해 촉매적 활성을 보유하며, 이는 핵산 분자의 공유 결합의 파단을 포함한다. 절단은 평활 단부 또는 엇갈린 단부를 생성할 수 있으며, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로 평활 절단 생성물을 생성할 것이다. 대안적으로, 야생형 Cpf1 단백질(예를 들어, FnCpf1)은 5-뉴클레오타이드 5' 오버행(overhang)이 있는 절단 생성물을 수득할 수 있으며, 절단은 비-표적화된 가닥 상의 PAM 서열로부터 18번째 염기쌍 다음 및 표적화된 가닥 상의 23번째 염기 다음에 발생한다. Cas 단백질은 표적 게놈 좌위에서 이중 가닥 파단부(예를 들어, 평활 단부가 있는 이중 가닥 파단부)를 생성하기 위한 완전 절단 활성을 가질 수 있거나, 이는 표적 게놈 좌위에서 단일 가닥 파단부를 생성하는 닉카제(nickase)일 수 있다.
Cas 단백질의 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전을 포함한다.
예시적인 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것이며, 전형적으로는 보존된 구조체를 갖는 4개의 주요 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다쏜빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티내스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실루스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스패라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 미크로사이스티스 애루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네코코커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹토르 벡스치이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라내로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 악시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 악시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니이(Nitrosococcus watsonii), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나배나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르쓰로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르쓰로스피라 종(Arthrospira sp.), 라인그바이아 종(Lyngbya sp.), 미크로콜레우스 크쏘노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오스칠라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카라이오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터의 것이다. Cas9 패밀리 구성원의 추가적인 예는 국제공개 WO 2014/131833호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 에스. 피오게네스로부터의 Cas9(SpCas9)(예를 들어, 지정된 UniProt 수탁번호 Q99ZW2)가 예시적인 Cas9 단백질이다. 예시적인 SpCas9 단백질 서열은 서열번호 8(서열번호 9로 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)에 제시된다. 예시적인 SpCas9 mRNA(cDNA) 서열은 서열번호 10에 제시된다. 더 작은 Cas9 단백질(예를 들어, 가이드 RNA 코딩 서열 및 Cas9와 가이드 RNA에 대한 조절 요소와 조합될 때 코딩 서열이 최대 AAV 패키징 수용력으로 상용성인 Cas9 단백질, 예컨대 SaCas9 및 CjCas9 및 Nme2Cas9)이 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 에스. 아우레우스로부터의 Cas9(SaCas9)(예를 들어, 지정된 UniProt 수탁번호 J7RUA5)가 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 마찬가지로, 캄필로박터 제주니로부터의 Cas9(CjCas9)(예를 들어, 지정된 UniProt 수탁번호 Q0P897)가 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Kim et al. (2017) Nat. Commun. 8:14500]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. SaCas9는 SpCas9보다 더 작고, CjCas9는 SaCas9와 SpCas9 둘 모두보다 작다. 네이쎄리아 메닌지티디스로부터의 Cas9(Nme2Cas9)가 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Edraki et al. (2019) Mol. Cell 73(4):714-726]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 단백질(예를 들어, CRISPR1 유전자좌에 의해 인코딩되는 스트렙토코커스 써모필루스 LMD-9 Cas9(St1Cas9) 또는 CRISPR3 유전자좌로부터의 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9(St3Cas9))이 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)로부터의 Cas9(FnCas9) 또는 대안적인 PAM(E1369R/E1449H/R1556A 치환)을 인식하는 RHA 프란시셀라 노비시다 Cas9 변이체가 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 이들 및 다른 예시적인 Cas9 단백질은 예를 들어 문헌[Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261]에서 검토되며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Cas9 코딩 서열, Cas9 mRNA, 및 Cas9 단백질 서열의 예는 국제공개 WO 2013/176772호, 국제공개 WO 2014/065596호, 국제공개 WO 2016/106121호, 국제공개 WO 2019/067910호, 국제공개 WO 2020/082042호, 미국 특허 US 2020/0270617호, 국제공개 WO 2020/082041호, 미국 특허 US 2020/0268906호, 국제공개 WO 2020/082046호, 및 미국 특허 US 2020/0289628호에 제공되며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. ORF 및 Cas9 아미노산 서열의 특정 예는 국제공개 WO 2019/067910호의 단락 [0449]의 표 30에 제공되고, Cas9 mRNA 및 ORF의 특정 예는 국제공개 WO 2019/067910호의 단락 [0214]-[0234]에 제공된다. 또한 국제공개 WO 2020/082046 A2호(pp. 84-85) 및 국제공개 WO 2020/069296호의 표 24를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예시적인 SpCas9 단백질 서열은 서열번호 11을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. SpCas9 단백질 서열을 인코딩하는 예시적인 SpCas9 mRNA 서열은 서열번호 12를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. SpCas9 단백질 서열을 인코딩하는 또 다른 예시적인 SpCas9 mRNA 서열은 서열번호 1을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. SpCas9 단백질 서열을 인코딩하는 또 다른 예시적인 SpCas9 mRNA 서열은 서열번호 2를 포함한다. 예시적인 SpCas9 코딩 서열은 서열번호 3을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
Cas 단백질의 또 다른 예는 Cpf1(프레보텔라 및 프란시셀라 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은 Cas9의 특유의 아르기닌-풍부 클러스터에 대한 대응물과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 단백질(약 1300개의 아미노산)이다. 그러나, Cpf1은 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여되고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9와 대조적으로 Cpf1 서열에 인접하다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예시적인 Cpf1 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 1(Francisella tularensis 1), 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다(Francisella tularensis subsp. novicida), 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 라흐노스피라세애 박테리움 MC2017 1(lachnospiraceae bacterium MC2017 1), 부타이리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA2_33_10(Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10), 파르쿠박테리아 박테리움 GW2011_GWC2_44_17(Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17), 스미쎌라 종 SCADC(Smithella sp. SCADC), 악시다미노코커스 종 BV3L6(Acidaminococcus sp. BV3L6), 라흐노스피라세애 박테리움 MA2020(lachnospiraceae bacterium MA2020), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 237(Moraxella bovoculi 237), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라흐노스피라세애 박테리움 ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006), 포르파이로모나스 크레비오리카니스 3(Porphyromonas crevioricanis 3), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 및 포르파이로모나스 마카캐(Porphyromonas macacae)로부터의 것이다. 프란시셀라 노비시다 U112로부터의 Cpf1(FnCpf1; 지정된 UniProt 수탁번호 A0Q7Q2)은 예시적인 Cpf1 단백질이다.
Cas 단백질의 다른 예는 CasX(Cas12e)이다. CasX는 DNA에서 엇갈린 이중 가닥 파단부를 생성하는 RNA-안내된 DNA 엔도뉴클레아제이다. CasX는 1000개 미만의 아미노산 크기이다. 예시적인 CasX 단백질은 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria)(DpbCasX 또는 DpbCas12e) 및 플란토미세테스(Planctomycetes)(PlmCasX 또는 PlmCas12e)로부터의 것이다. Cpf1과 마찬가지로, CasX는 DNA 절단을 위한 단일 RuvC 활성 부위를 사용한다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2019) Nature 566(7743):218-223]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
Cas 단백질의 또 다른 예는 박테리오파지에서 고유하게 발견되는 CasΦ(CasPhi 또는 Cas12j)이다. CasΦ는 1000개 미만의 아미노산 크기(예를 들어, 700개 내지 800개의 아미노산)이다. CasΦ 절단은 엇갈린 5' 오버행을 생성한다. CasΦ에서 단일 RuvC 활성 부위는 crRNA 가공 및 DNA 절단이 가능하다. 예를 들어, 문헌[Pausch et al. (2020) Science 369(6501):333-337]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 자연에서 발생하는 것들), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매적 활성에 대해 활성인 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매적 활성에 대해 활성인 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이들의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 활성 변이체는 소기에 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하며, 따라서 닉-유도 또는 이중-가닥 파단-유도 활성을 보유한다. 닉-유도 또는 이중 가닥 파단-유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고, 일반적으로 절단 부위를 함유하는 DNA 기질 상의 Cas 단백질의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
변형된 Cas 단백질의 일례는 변형된 SpCas9-HF1 단백질이며, 이는 비-특이적 DNA 접촉을 감소시키도록 설계된 변경을 보유하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 고-충실도 변이체(N497A/R661A/Q695A/Q926A)이다. 예를 들어, 문헌[Kleinstiver et al. (2016) Nature 529(7587):490-495]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 변형된 Cas 단백질의 또 다른 예는 표적외(off-target) 효과를 감소시키도록 설계된 변형된 eSpCas9 변이체(K848A/K1003A/R1060A)이다. 예를 들어, 문헌[Slaymaker et al. (2016) Science 351(6268):84-88]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 다른 SpCas9 변이체는 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 포함한다. 이들 및 다른 변형된 Cas 단백질은 예를 들어, 문헌[Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261]에서 검토되며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 변형된 Cas9 단백질의 또 다른 예는 xCas9이며, 이는 확장된 범위의 PAM 서열을 인식할 수 있는 SpCas9 변이체이다. 예를 들어, 문헌[Hu et al. (2018) Nature 556:57-63]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화도, 핵산 결합 특이성, 및 효소적 활성 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성, 예컨대 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형, 결실, 또는 비활성화될 수 있거나, Cas 단백질은 단백질의 기능에 본질적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 또는 Cas 단백질의 활성 또는 특성을 최적화하기 위해(예를 들어, 향상 또는 감소시키기 위해) 절두될 수 있다.
Cas 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로 아마도 이량체성 배치에서 표적 DNA의 양쪽 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 마찬가지로, CasX 및 CasΦ는 일반적으로 표적 DNA의 양쪽 가닥을 절단하는 단일 RuvC-유사 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 각각 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥을 절단하여 DNA에서 이중 가닥 파단부를 제작할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337(6096):816-821]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
뉴클레아제 도메인 중 하나 이상은 뉴클레아제 도메인이 더 이상 기능적이지 않거나 감소된 뉴클레아제 활성을 갖도록 결실되거나 돌연변이화될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 도메인 중 하나가 Cas9 단백질에서 결실되거나 돌연변이화되는 경우, 수득된 Cas9 단백질은 닉카제로 지칭될 수 있고, 이중 가닥 파단부가 아니라 이중 가닥 표적 DNA 내에서 단일 가닥 파단부를 발생할 수 있다(즉, 이는 상보적 가닥과 비-상보적 가닥 둘 모두가 아니라 둘 중 하나를 절단할 수 있음). 뉴클레아제 도메인 중 어느 것도 Cas9 단백질에서 결실되지 않거나 돌연변이화되지 않는 경우, Cas9 단백질은 이중 가닥 파단-유도 활성을 유지할 것이다. Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 한 예는 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 도메인에서의 D10A(Cas9의 위치 10에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의) 돌연변이이다. 마찬가지로, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 HNH 도메인에서의 H939A(아미노산 위치 839에서 히스티딘에서 알라닌으로), H840A(아미노산 위치 840에서 히스티딘에서 알라닌으로), 또는 N863A(아미노산 위치 N863에서 아스파라긴에서 알라닌으로)는 Cas9를 닉카제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 다른 예는 에스. 써모필루스로부터의 Cas9에 대한 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39(21):9275-9282] 및 국제공개 WO 2013/141680호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 이러한 돌연변이는 부위-특이적 돌연변이유발, PCR-매개 돌연변이유발, 또는 전체 유전자 합성과 같은 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 닉카제를 생성하는 다른 돌연변이의 예는 예를 들어 국제공개 WO 2013/176772호 및 국제공개 WO 2013/142578호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
xCas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예는 SpCas9에 대해 상기 기재된 것들과 동일하다. 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 효소(SaCas9)는 위치 N580에서의 치환(예를 들어, N580A 치환) 또는 위치 D10에서의 치환(예를 들어, D10A 치환)을 포함하여 Cas 닉카제를 발생할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2016/106236호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Nme2Cas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D16A 또는 H588A). St1Cas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D9A, D598A, H599A, 또는 N622A). St3Cas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D10A 또는 N870A). CjCas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D8A 또는 H559A의 조합). FnCas9 및 RHA FnCas9의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, N995A).
Cpf1 단백질의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 프란시셀라 노비시다 U112(FnCpf1), 악시다미노코커스 종 BV3L6(AsCpf1), 라흐노스피라세애 박테리움 ND2006(LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237(MbCpf1 Cpf1)로부터의 Cpf1 단백질에 관하여, 이러한 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 이종 상동 유전자 내 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 이종 상동 유전자 내 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 이종 상동 유전자 내 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A, 또는 Cpf1 이종 상동 유전자 내 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 2016/0208243호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
CasX 단백질의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 델타프로테오박테리아로부터의 CasX 단백질에 관하여, D672A, E769A, 및 D935A(개별적으로 또는 조합하여) 또는 다른 CasX 이종 상동 유전자 내 상응하는 위치가 비활성화된다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2019) Nature 566(7743):218-223]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
CasΦ 단백질의 촉매적 도메인에서의 비활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 단독으로 또는 조합하여 D371A 및 D394A가 비활성화 돌연변이이다. 예를 들어, 문헌[Pausch et al. (2020) Science 369(6501):333-337]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질로서 이종성 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인에 융합될 수 있다. 국제공개 WO 2014/089290호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Cas 단백질은 또한 이종성 폴리펩타이드에 융합되어 증가 또는 감소된 안정성을 제공할 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종성 폴리펩타이드는 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 내부에 위치할 수 있다.
일례로, Cas 단백질은 세포내 국소화를 제공하는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 이종성 폴리펩타이드는 예를 들어 핵에 대한 표적화를 위한 하나 이상의 핵 위치 신호(NLS), 예컨대 단분절(monopartite) SV40 NLS 및/또는 이분절(bipartite) 알파-임포틴 NLS, 미토콘드리아에 대한 표적화를 위한 미토콘드리아 위치 신호, ER 잔류 신호 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282(8):5101-5105]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 이러한 세포내 위치 신호는 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 어디에서나 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 신전부를 포함할 수 있고, 단분절 서열 또는 이분절 서열일 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질은 N-말단에서의 NLS(예를 들어, 알파-임포틴 NLS 또는 단분절 NLS) 및 C-말단에서의 NLS(예를 들어, SV40 NLS 또는 이분절 NLS)를 포함하는 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다. Cas 단백질은 또한 N-말단에서의 둘 이상의 NLS 및/또는 C-말단에서의 둘 이상의 NLS를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 예를 들어 1개 내지 10개의 NLS와 융합될 수 있다(예를 들어, 1개 내지 5개의 NLS와 융합되거나 하나의 NLS와 융합됨). 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 Cas 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 이는 또한 Cas 단백질 서열 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 하나 초과의 NLS와 융합될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 예에서, Cas 단백질은 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정한 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나(예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 카르복시 말단에서 연결된 2개의 SV40 NLS 서열에 융합될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 2개의 NLS와 융합될 수 있으며, 하나의 NLS는 N-말단에서 연결되고 하나의 NLS는 C-말단에서 연결된다. 다른 예에서, Cas 단백질은 3개의 NLS와 융합될 수 있거나 어떠한 NLS와도 융합되지 않을 수 있다. NLS는 예를 들어 SV40 NLS, PKKKRKV(서열번호 13) 또는 PKKKRRV(서열번호 14)와 같이 단분절 서열일 수 있다. NLS는 이분절 서열, 예컨대 핵플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 15)일 수 있다. 특정 예에서, 단일 PKKKRKV(서열번호 13) NLS는 Cas 단백질의 C-말단에서 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커가 선택적으로 융합 부위에 포함된다.
Cas 단백질은 또한 세포 침투 도메인 또는 단백질 형질도입 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포 침투 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스로부터의 TLM 세포 침투 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스로부터의 세포 침투 펩타이드, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/089290 호 및 국제공개 WO 2013/176772호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 세포 침투 도메인은 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 어디에서나 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제의 용이성을 위해 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 단량체성 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, eYFP, 시트린, 비너스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질(예를 들어, eBFP, eBFP2, 아주라이트, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어), 시안색 형광 단백질(예를 들어, eCFP, 세룰린, CyPet, AmCyanl, 미도리이시-시안색), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-탠덤, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 주황색 형광 단백질(예를 들어, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지, 단량체성 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 태그의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화력 정제(TAP: tandem affinity purification) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌(HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘(His), 비오틴 카르복실 캐리어 단백질(BCCP), 및 칼모듈린을 포함한다.
Cas 단백질은 또한 표지된 핵산에 구속될 수 있다. 이러한 구속(즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 달성될 수 있으며, 구속은 직접적일 수 있거나(예를 들어, 단백질 상의 시스테인 또는 라이신 잔기의 변형 또는 인테인 변형에 의해 달성될 수 있는 직접적 융합 또는 화학적 접합을 통해), 하나 이상의 개재 링커 또는 어댑터 분자, 예컨대 스트렙타비딘 또는 앱타머를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55]; 문헌[Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822]; 문헌[Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332]; 문헌[Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557]; 및 문헌[Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 단백질-핵산 복합체를 합성하기 위한 비공유적 전략은 비오틴-스트렙타비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 복합체는 적절하게 작용화된 핵산 및 단백질을 광범위하게 다양한 화학을 사용하여 연결함으로써 합성될 수 있다. 이들 화학 중 일부는 단백질 표면 상의 아미노산 잔기(예를 들어, 라이신 아민 또는 시스테인 티올)에 대한 올리고뉴클레오타이드의 직접적 부착을 수반하는 한편, 다른 보다 복잡한 계획은 단백질의 번역후 변형 또는 촉매적 또는 반응성 단백질 도메인의 수반이 필요하다. 핵산에 대한 단백질의 공유 부착 방법은 예를 들어 단백질 라이신 또는 시스테인 잔기에 대한 올리고뉴클레오타이드의 화학적 가교, 발현된 단백질 결찰, 화학효소적 방법, 및 포토앱타머의 사용을 포함할 수 있다. 표지된 핵산은 Cas 단백질 내의 C-말단, N-말단, 또는 내부 영역에 구속될 수 있다. 일례에서, 표지된 핵산은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 구속된다. 마찬가지로, Cas 단백질은 표지된 핵산 내의 5' 단부, 3' 단부, 또는 내부 영역에 구속될 수 있다. 즉, 표지된 핵산은 임의의 배향 및 극성으로 구속될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 표지된 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부에 구속될 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 세균 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈으로 치환하도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산이 세포 내로 도입될 때, Cas 단백질은 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합되고, 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 관심 유전자 또는 다른 핵산 서열(예를 들어, Cas 유전자)의 발현을 유도할 수 있고, 이러한 관심 핵산 서열을 표적 세포로 전이할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 내에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이는 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터와는 별개인 벡터 또는 플라스미드 내에 존재할 수 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 만능 세포, 배아 줄기(ES)세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포(developmentally restricted progenitor cell), 유도 만능 줄기(iPS)세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 하나의 방향에서 Cas 단백질의 발현과 다른 방향에서 가이드 RNA의 발현을 둘 모두 유도하는 양방향 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소를 함유하는 완전한 종래의 일방향 Pol III 프로모터: 원위부 서열 요소(DSE), 근위부 서열 요소(PSE), 및 TATA 박스; 및 (2) 역배향에서 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스 및 PSE를 포함하는 제2 기본 Pol III 프로모터로 구성될 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 U6 프로모터로부터 유래된 TATA 박스 및 PSE를 부착하여 역방향의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 2016/0074535호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Cas 단백질 및 가이드 RNA를 동시에 인코딩하는 유전자를 발현하기 위한 양방향 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하는 컴팩트한 발현 카세트가 발생하도록 한다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 인간에서의 사용을 위해서 규제 기관에 의해 용인된다. 특정한 실시형태에서, 프로모터는 간 세포에서의 발현을 유도한다.
상이한 프로모터가 Cas 발현 또는 Cas9 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 방법에서, Cas 또는 Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물에 맞을 수 있도록 작은 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas 또는 Cas9 및 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 1개의 gRNA 또는 2개의 gRNA 또는 3개의 gRNA 또는 4개의 gRNA)는 LNP-매개 전달(예를 들어, RNA 형태) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)-매개 전달(예를 들어, AAV2-매개 전달, AAV5-매개 전달, AAV8-매개 전달, 또는 AAV7m8-매개 전달)을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas9일 수 있고, 내인성 인간 ALB 유전자좌의 인트론 1을 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA는 LNP-매개 전달 또는 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. Cas 또는 Cas9 및 gRNA(들)는 단일 AAV에서 또는 2개의 별개의 AAV를 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 유사하게, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 둘 이상의 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 대안적으로, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 유사하게는, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 둘 이상의 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 상이한 프로모터가 gRNA, 예컨대 U6 프로모터 또는 작은 tRNA Gln의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 상이한 프로모터가 Cas9 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물에 맞을 수 있도록 작은 프로모터가 사용된다. 유사하게, 작은 Cas9 단백질(예를 들어, SaCas9 또는 CjCas9)이 AAV 패키징 수용력을 최대화하는 데 사용된다.
mRNA로서 제공되는 Cas 단백질은 개선된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위해 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오사이드에 이루어질 수 있다. mRNA 핵염기에 대한 화학적 변형의 예는 유사우리딘, 1-메틸-유사우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. Cas 단백질을 인코딩하는 mRN는 또한 캡핑될 수 있다. 캡은 예를 들어 +1 리보뉴클레오타이드가 리보스의 2'O 위치에서 메틸화되는 캡 1 구조일 수 있다. 캡핑은 예를 들어 우수한 생체내 활성을 제공할 수 있고(예를 들어, 자연 캡을 모방함으로써), 숙주의 선천성 면역계의 자극을 감소시키는 자연 구조체를 수득할 수 있다(예를 들어, 선천성 면역계에서 패턴 인식 수용체의 활성화를 감소시킬 수 있음). Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 (폴리(a) 테일을 포함하도록) 폴리아데닐화될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 유사우리딘을 포함하도록 변형될 수 있다(예를 들어, 유사우리딘으로 완전히 치환될 수 있음). 또 다른 예로서, N1-메틸-유사우리딘을 함유하는 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 N1-메틸-유사우리딘을 포함하도록 변형될 수 있다(예를 들어, N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환될 수 있음). 또 다른 예로, 유사우리딘으로 완전히 치환된 Cas mRNA가 사용될 수 있다(즉, 모든 표준 우라실 잔기는 우라실이 질소-탄소보다는 탄소-탄소 결합으로 부착되는 우리딘 이성질체인 유사우리딘으로 대체됨). 또 다른 예로서, N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된 Cas mRNA가 사용될 수 있다(즉, 모든 표준 우라실 잔기는 N1-메틸-유사우리딘으로 대체됨). 마찬가지로, Cas mRNA는 동의 코돈(synonymous codon)을 사용한 우리딘의 고갈에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 유사우리딘으로 완전히 치환된, 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다. 예를 들어, N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환된, 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다.
Cas mRNA는 적어도 하나, 복수, 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 변형된 우리딘은 5 위치에서(예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로) 변형된 우리딘일 수 있다. 변형된 우리딘은 1 위치에서(예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로) 변형된 유사우리딘일 수 있다. 변형된 우리딘은 예를 들어 유사우리딘, N1-메틸-유사우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-아이오도우리딘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-유사우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘과 N1-메틸-유사우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 유사우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘과 N1-메틸-유사우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 유사우리딘과 5-아이오도우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-아이오도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다.
본원에 개시된 Cas mRNA는 또한 5' 캡, 예컨대 Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함할 수 있다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트리포스페이트를 통해 mRNA의 5'에서 3'으로의 사슬의 제1 뉴클레오타이드의 5' 위치(즉, 제1 캡-근접 뉴클레오타이드)에 결합된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오타이드(이는 예를 들어 ARCA에 대해 추가로 변형될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 모두 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오타이드의 리보스는 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 각각 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 모두 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Katibah et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(33):12025-30] 및 문헌[Abbas et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114(11):E2106-E2115]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 포유류 mRNA, 예컨대 인간 mRNA를 포함하는 대부분의 내인성 고등 진핵생물 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap0, 및 Cap1과 Cap2와 상이한 다른 캡 구조체는 인간과 같은 포유류에서 선천성 면역계의 성분, 예컨대 IFIT-1 및 IFIT-5에 의해 자가가 아닌 것으로 인식되므로 면역원성일 수 있으며, 이는 유형 I 인터페론을 포함하는 사이토카인 수준을 상승시킬 수 있다. 선천성 면역계의 성분, 예컨대 IFIT-1 및 IFIT-5는 또한 Cap1 또는 Cap2 이외의 캡과 mRNA의 결합을 위해 eIF4E와 경쟁하여, mRNA의 번역을 잠재적으로 억제할 수 있다.
캡은 공동-전사적으로 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA(안티-리버스 캡 유사체(anti-reverse cap analog); Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 AM8045)는 시험관내에서 개시 시 전사물 내로 혼입될 수 있는 구아닌 리보뉴클레오타이드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트리포스페이트를 포함하는 캡 유사체이다. ARCA는 제1 캡-근접 뉴클레오타이드의 2' 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 수득한다. 예를 들어, 문헌[Stepinski et al. (2001) RNA 7:1486-1495]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
CleanCap™ AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7113) 또는 CleanCap™ GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7133)를 사용하여 Cap1 구조체를 공동-전사적으로 제공할 수 있다. CleanCap™ AG 및 CleanCap™ GG의 3'-O-메틸화된 버전은 또한 TriLink Biotechnologies로부터 각각 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로서 입수 가능하다.
대안적으로, 캡은 전사-후에 RNA에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 상업적으로 입수 가능하고(New England Biolabs 카탈로그 번호 M2080S), 이의 D1 하위단위에 의해 제공되는 RNA 트리포스파타제 및 구아닐릴트랜스퍼라제 활성 및 이의 D12 하위단위에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼라제를 갖는다. 이와 같이, 이는 S-아데노실 메티오닌 및 GTP의 존재 하에 Cap0을 제공하기 위해 7-메틸구아닌을 RNA에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Guo and Moss (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4023-4027] 및 문헌[Mao and Shuman (1994) J. Biol. Chem. 269:24472-24479]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
Cas mRNA는 폴리-아데닐화된(폴리-A 또는 폴리(a) 또는 폴리-아데닌) 테일을 추가로 포함할 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개의 아데닌 및 선택적으로 최대 300개의 아데닌을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리-A 테일은 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
(3) 가이드 RNA
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)에 결합하고 Cas 단백질을 표적 DNA 내의 특정 위치로 표적화하는 RNA 분자이다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트를 포함할 수 있다: "DNA-표적화 세그먼트"("가이드 서열"이라 불림) 및 "단백질-결합 세그먼트". "세그먼트"는 분자의 섹션 또는 영역, 예컨대 RNA 내 뉴클레오타이드의 연속 신전부를 포함한다. 일부 gRNA, 예컨대 Cas9에 대한 것들은 2개의 별개의 RNA 분자를 포함할 수 있다: "활성자-RNA"(예를 들어, tracrRNA) 및 "표적자-RNA"(예를 들어, CRISPR RNA 또는 crRNA). 다른 gRNA는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이며, 이는 또한 "단일-분자 gRNA", "단일-가이드 RNA", 또는 "sgRNA"라 불릴 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2013/176772호, 국제공개 WO 2014/065596호, 국제공개 WO 2014/089290호, 국제공개 WO 2014/093622호, 국제공개 WO 2014/099750호, 국제공개 WO 2013/142578호, 및 국제공개 WO 2014/131833호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용인 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 또는 crRNA와 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)의 조합을 지칭할 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA 또는 sgRNA)로서 또는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA 또는 dgRNA)에서 회합될 수 있다. Cas9의 경우, 예를 들어 단일-가이드 RNA는 (예를 들어, 링커를 통해) tracrRNA에 융합된 crRNA를 포함할 수 있다. Cpf1 및 CasΦ의 경우, 예를 들어 표적 서열에 대한 결합을 달성하기 위해 단지 crRNA가 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중-분자(즉, 모듈형) gRNA 및 단일-분자 gRNA 둘 모두를 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, gRNA는 에스. 피오게네스 Cas9 gRNA 또는 이의 등가물이다. 본원에 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, gRNA는 에스. 아우레우스 Cas9 gRNA 또는 이의 등가물이다.
일 예시적인 2-분자 gRNA는 crRNA-유사("CRISPR RNA" 또는 "표적자-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사("트랜스-활성화 CRISPR RNA" 또는 "활성자-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트(단일 가닥) 및 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스 중 하나의 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 신전부 둘 모두를 포함한다. DNA-표적화 세그먼트의 하류(3')에 위치한 crRNA 테일(예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9와 사용하기 위한)의 한 예는 GUUUUAGAGCUAUGCU(서열번호 16) 또는 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(서열번호 17)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 16 또는 서열번호 17의 5' 단부에 접합되어 crRNA를 형성할 수 있다.
상응하는 tracrRNA(활성자-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 세그먼트의 dsRNA 듀플렉스 중 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 신전부를 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드의 신전부는 tracrRNA의 뉴클레오타이드의 신전부에 상보적이고 이와 혼성화하여 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성한다. 이와 같이, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖는 것으로 언급될 수 있다. tracrRNA 서열(예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9과 사용하기 위한)의 예는 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(서열번호 18), AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(서열번호 19), 또는 GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 20) 중 임의의 하나를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
crRNA와 tracrRNA 둘 모두가 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 혼성화하여 gRNA를 형성한다. 오직 crRNA가 필요한 시스템에서는, crRNA가 gRNA일 수 있다. crRNA는 표적 DNA의 상보적 가닥에 혼성화하는 단일 가닥 DNA-표적화 세그먼트를 추가적으로 제공한다. 세포 내에서의 변형에 사용되는 경우, 소정의 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은 RNA 분자가 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mali et al. (2013) Science 339(6121):823-826]; 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337(6096):816-821]; 문헌[Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):227-229]; 문헌[Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):233-239]; 및 문헌[Cong et al. (2013) Science 339(6121):819-823]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
소정의 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트(crRNA)는 하기 보다 상세하기 기재되는 바와 같이 표적 DNA의 상보적 가닥 상의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 세그먼트는 혼성화(즉, 염기쌍 형성(base pairing))를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 이와 같이, DNA-표적화 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열은 달라질 수 있고, gRNA 및 표적 DNA가 상호작용할 표적 DNA 내에서의 위치를 결정한다. 대상체 gRNA의 DNA-표적화 세그먼트는 표적 DNA 내의 임의의 소기의 서열에 혼성화하도록 변형될 수 있다. 자연 발생 crRNA는 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만, 보통 21개 내지 46개의 뉴클레오타이드 길이의 2개의 직접 반복부(DR: direct repeat)에 의해 플랭킹되는 21개 내지 72개 뉴클레오타이드 길이의 표적화 세그먼트를 함유한다(예를 들어, 국제공개 WO 2014/131833호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함됨). 에스. 피오게네스의 경우, DR은 36개의 뉴클레오타이드 길이이고, 표적화 세그먼트는 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 3'에 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보적이고 이와 혼성화하며, 이는 결국 Cas 단백질에 결합한다.
DNA-표적화 세그먼트는 예를 들어 적어도 약 12개, 적어도 약 15개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 또는 적어도 약 40개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이러한 DNA-표적화 세그먼트는 예를 들어 약 12개 내지 약 100개, 약 12개 내지 약 80개, 약 12개 내지 약 50개, 약 12개 내지 약 40개, 약 12개 내지 약 30개, 약 12개 내지 약 25개, 약 12개 내지 약 20개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 세그먼트는 약 15개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 17개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 뉴클레오타이드)일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 2016/0024523호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 세그먼트는 16개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이 또는 17개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 세그먼트는 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. Cpf1의 경우, 전형적인 DNA-표적화 세그먼트는 적어도 16개의 뉴클레오타이드 길이 또는 적어도 18개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일례에서, DNA-표적화 세그먼트는 약 20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 그러나, 더 짧은 서열 및 더 긴 서열이 또한 표적화 세그먼트(예를 들어, 15개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이)에 사용될 수 있다. DNA-표적화 세그먼트와 상응하는 가이드 RNA 표적 서열 사이의 동일성 정도(또는 DNA-표적화 세그먼트과 가이드 RNA 표적 서열의 다른 가닥 사이의 상보성 정도)는 예를 들어 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다. DNA-표적화 세그먼트 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 미스매치를 함유할 수 있다(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열의 총 길이가 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개 이상의 뉴클레오타이드인 경우). 예를 들어, 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 미스매치를 함유할 수 있으며, 이때, 가이드 RNA 표적 서열의 총 길이는 20개의 뉴클레오타이드이다.
일례로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 36에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 30에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 33에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트(즉, 가이드 서열)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 41에 제시된 서열(DNA-표적화 세그먼트)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드와 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다.
[표 2]
Figure pct00019
[표 3]
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Figure pct00021
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Figure pct00023
[표 4]
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[표 5]
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TracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이일 수 있다. 이들은 1차 전사물 또는 가공된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA(단일-가이드 RNA의 일부로서 또는 2-분자 gRNA 중 일부와 별개의 분자로서)는 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracrRNA 서열의 약 20개, 26개, 32개, 45개, 48개, 54개, 63개, 67개, 85개 이상 또는 이를 초과하는 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 에스. 피오게네스로부터의 야생형 tracrRNA 서열은 171-뉴클레오타이드, 89-뉴클레오타이드, 75-뉴클레오타이드, 및 65-뉴클레오타이드 버전을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Deltcheva et al. (2011) Nature 471(7340):602-607]; 국제공개 WO 2014/093661호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 포함된다. 단일-가이드 RNA(sgRNA) 내의 tracrRNA의 예는 sgRNA의 +48, +54, +67, 및 +85 버전에서 발견되는 tracrRNA 세그먼트를 포함하며, 이때, "+n"은 야생형 tracrRNA의 최대 +n개의 뉴클레오타이드가 sgRNA에 포함됨을 나타낸다. 미국 특허 US 8,697,359호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 퍼센트는 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)일 수 있다. DNA-표적화 세그먼트와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 퍼센트는 약 20개의 연속하는 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 한 예로서, DNA-표적화 세그먼트와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 퍼센트는 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서의 약 14개의 연속하는 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우, DNA-표적화 세그먼트는 14개의 뉴클레오타이드 길이인 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 예로, DNA-표적화 세그먼트와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 퍼센트는 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서의 7개의 연속하는 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우, DNA-표적화 세그먼트는 7개의 뉴클레오타이드 길이인 것으로 간주될 수 있다. 일부 가이드 RNA에서, DNA-표적화 세그먼트 내의 적어도 17개 뉴클레오타이드는 표적 DNA의 상보적 가닥에 상보적이다. 예를 들어, DNA-표적화 세그먼트는 20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 표적 DNA의 상보적 가닥과 1개, 2개, 또는 3개의 미스매치를 포함할 수 있다. 일례에서, 미스매치는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 상응하는 상보적 가닥의 영역(즉, PAM 서열의 역상보)에 인접하지 않다(예를 들어, 미스매치는 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트의 5' 단부에 존재하거나, 미스매치는 PAM 서열에 상응하는 상보적 가닥의 영역으로부터 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 또는 19개의 염기쌍만큼 떨어져 있음).
gRNA의 단백질-결합 세그먼트는 서로 상보적인 뉴클레오타이드의 2개의 신전부를 포함할 수 있다. 단백질-결합 세그먼트의 상보적 뉴클레오타이드는 혼성화하여 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA)를 형성한다. 대상체 gRNA의 단백질-결합 세그먼트는 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을 DNA-표적화 세그먼트를 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 안내한다.
단일-가이드 RNA는 DNA-표적화 세그먼트 및 스캐폴드 서열(즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가이드 RNA는 3' 스캐폴드 서열에 접합된 5' DNA-표적화 세그먼트를 가질 수 있다. 예시적인 스캐폴드 서열(예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9와 사용하기 위한)은 하기를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (버전 1; 서열번호 21); GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 2; 서열번호 22); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 3; 서열번호 23); 및 GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 4; 서열번호 24); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (버전 5; 서열번호 25); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (버전 6; 서열번호 26); GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (버전 7; 서열번호 27); 또는 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 8; 서열번호 28). 일부 가이드 sgRNA에서, 버전 6의 4개의 말단 U 잔기는 존재하지 않는다. 일부 sgRNA에서, 버전 6의 4개의 말단 U 잔기 중 오직 1개, 2개, 또는 3개가 존재한다. 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA는 예를 들어 가이드 RNA의 3' 단부 상의 임의의 예시적인 가이드 RNA 스캐폴드 서열에 융합된 가이드 RNA의 5' 단부 상의 DNA-표적화 세그먼트를 포함할 수 있다. 즉, 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 세그먼트는 임의의 하나의 상기 스캐폴드 서열의 5' 단부에 접합되어 단일 가이드 RNA(키메라 가이드 RNA)를 형성할 수 있다.
가이드 RNA는 추가적인 바람직한 특성(예를 들어, 변형된 또는 조절된 안정성; 세포내 표적화; 형광 표지로 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 즉, 가이드 RNA는 표준 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 이외에 사용되는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 또는 하나 이상의 비-자연 및/또는 자연 발생 성분 또는 배치를 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 예를 들어 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화 테일(즉, 3' 폴리(a) 테일); 리보스위치 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위해); 안정성 제어 서열; dsRNA 듀플렉스(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열; RNA를 세포내 위치(예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)에 표적화하는 변형 또는 서열; 추적을 제공하는 변형 또는 서열(예를 들어, 형광 분자에 대한 직접 접합, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 대한 접합, 형광 검출을 가능하게 하는 서열 등); 단백질(예를 들어, 전사 활성화제, 전사 저해제, DNA 메틸트랜스퍼라제, DNA 데메틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제 등을 포함하는 DNA에 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열; 및 이들의 조합을 포함한다. 변형의 다른 예는 조작된 스템 루프 듀플렉스 구조, 조작된 벌지(bulge) 영역, 스템 루프 듀플렉스 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 US 2015/0376586호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 벌지는 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 구성된 듀플렉스 내의 뉴클레오타이드의 쌍을 이루지 않은 영역일 수 있다. 벌지는 듀플렉스의 한 측면 상에 쌍을 이루지 않은 5'-XXXY-3'(이때, X는 임의의 퓨린이고 Y는 반대 가닥 상의 뉴클레오타이드와 워블 쌍(wobble pair)을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드일 수 있음) 및 듀플렉스의 다른 측면 상에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함하는 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: (1) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두의 변경 또는 대체 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경 또는 대체(예시적인 골격 변형); (2) 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경 또는 대체와 같은 리보스 당의 구성성분의 변경 또는 대체(예시적인 당 변형); (3) 포스페이트 모이어티의 데포스포 링커로의 대체(예를 들어, 전면적 대체)(예시적인 골격 변형); (4) 자연 발생 핵염기의 비표준 핵염기를 포함하는 것으로의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (5) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형(예시적인 골격 변형); (6) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형(예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형, 또는 대체 또는 모이어티, 캡, 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음)); 및 (7) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형). 다른 가능한 가이드 RNA 변형은 우라실 또는 폴리-우라실 트랙트(tract)의 변형 또는 대체를 포함한다. 예를 들어, 국제공개 WO 2015/048577 호 및 미국 특허 US 2016/0237455호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 유사한 변형이 Cas-인코딩 핵산, 예컨대 Cas mRNA에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Cas mRNA는 동의 코돈을 사용한 우리딘의 고갈에 의해 변형될 수 있다.
상기 나열된 이러한 호스(hose)에서의 화학적 변형은 조합되어 2개, 3개, 4개 이상의 변형을 가질 수 있는 잔기(뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드)를 포함하는 변형된 gRNA 및/또는 mRNA를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일례에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다(예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트기, 예컨대 포스포로티오에이트기를 가짐). 예를 들어, gRNA의 모든 또는 실질적으로 모든 포스페이트기는 포스포로티오에이트기로 대체될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 gRNA는 5' 단부 또는 그 부근에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 변형된 gRNA는 3' 단부 또는 그 부근에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함할 수 있다.
일부 gRNA는 1개, 2개, 3개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변형된 gRNA 내 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 위치는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드일 수 있다.
비변형된 핵산은 분해에 취약할 수 있다. 외인성 핵산은 또한 선천성 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입하고 면역원성을 감소시키도록 도울 수 있다. 본원에 기재된 일부 gRNA는 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 일부 변형된 gRNA는 세포 집단 내로 도입될 때 감소된 선청성 면역 반응을 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 gRNA는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형된 잔기의 포스페이트기가 변형될 수 있는 골격 변형을 포함할 수 있다. 변형은 비변형된 포스페이트 모이어티를 본원에 기재된 변형된 포스페이트기로 전반적으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 포스페이트 골격의 골격 변형은 또한 비하전된 링커 또는 비대칭성 전하 분포가 있는 하전된 링커를 수득하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형된 포스페이트기 내의 인 원자는 비카이랄이다. 그러나, 비-가교 산소 중 하나를 상기 원자 또는 원자군 중 하나로 대체하는 것은 인 원자가 카이랄이 되게 할 수 있다. 입체발생 인 원자는 "R" 배치(Rp) 또는 "S" 배치(Sp)를 보유할 수 있다. 골격은 또한 가교 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트), 및 탄소(가교된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 어느 하나의 연결 산소 또는 둘 모두의 연결 산소에서 발생할 수 있다.
포스페이트기는 특정 골격 변형에서 비-인 함유 연결기에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 포스페이트기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 제한 없이 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조, 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한 구축될 수 있으며, 이때, 포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대리물에 의해 대체된다. 이러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 대리물 골격에 의해 구속될 수 있다. 예는 제한 없이 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘, 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대리물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당 기에 대한 하나 이상의 변형(당 변형)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)가 변형될 수 있다(예를 들어, 다수의 상이한 옥시 또는 데옥시 치환기로 대체됨). 2' 하이드록실기에 대한 변형은 하이드록실이 더 이상 탈양성자화되어 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 이때, "R"은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR을 포함할 수 있으며, 이때, R은 예를 들어 H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있다. 2' 하이드록실기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 마찬가지로, 2' 하이드록실기 변형은 2' 하이드록실기를 플루오라이드로 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 2' 하이드록실기 변형은 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있으며, 이때, 2' 하이드록실은 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있고, 예시적인 가교는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 가교; O-아미노(이때, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(이때, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 2' 하이드록실기 변형은 비잠금 핵산(UNA)을 포함할 수 있으며, 이때, 리보스 고리는 C2'-C3' 결합이 결여된다. 2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE)(OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
데옥시 2' 변형은 수소(즉, 예를 들어 부분적 dsRNA의 오버행 부분에서의 데옥시리보스 당); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 아이오도); 아미노(이때, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(이때, 아미노는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(이때, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들어 본원에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐, 및 알키닐을 포함할 수 있다.
당 변형은 리보스에서 상응하는 탄소의 입체화학적 배치와 반대되는 입체화학적 배치를 보유하는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당 기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 예를 들어 아라비노스를 당으로서 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기성(abasic) 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기성 당은 또한 하나 이상의 구성성분 당 원자에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태로 존재하는 하나 이상의 당을 포함할 수 있다(예를 들어, L-뉴클레오사이드).
변형된 핵산 내로 혼입될 수 있는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기로 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 및 우라실(U)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산 내로 혼입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 전반적으로 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 독립적으로 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 예를 들어 염기의 자연 발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA에서, 각각의 crRNA 및 tracrRNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracrRNA의 하나 또는 양쪽 단부에 존재할 수 있다. sgRNA에서, sgRNA의 하나 또는 양쪽 단부에서의 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있고/있거나 내부 뉴클레오사이드가 변형될 수 있고/있거나 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 gRNA는 5' 단부 변형을 포함한다. 일부 gRNA는 3' 단부 변형을 포함한다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 국제공개 WO 2018/107028 A1호에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 미국 특허 US 2017/0114334호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 국제공개 WO 2017/136794호, 국제공개 WO 2017/004279호, 미국 특허 US 2018/0187186호, 또는 미국 특허 US 2019/0048338호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일례로, 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다(예를 들어, 염기는 포스포로티오에이트기인 변형된 포스페이트기를 가질 수 있음). 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부의 2개, 3개, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드들 사이에서 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부(예를 들어, 5' 단부)의 2개, 3개, 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2017/173054 A1호 및 문헌[Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 다른 가능한 변형은 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 특정 예에서, 가이드 RNA는 처음 3개의 5' 및 3' 말단 RNA 잔기에서 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함한다. 이러한 화학적 변형은 예를 들어 더 큰 안정성 및 엑소뉴클레아제로부터의 보호를 가이드 RNA에 제공하여, 이들이 비변형된 가이드 RNA보다 더 오랫동안 세포 내에서 지속되게 할 수 있다. 이러한 화학적 변형은 또한 예를 들어 RNA를 적극적으로 분해하거나 세포 사멸에 이르는 면역 캐스케이드를 촉발할 수 있는 선천성 세포내 면역 반응에 대해 보호할 수 있다.
일례로, 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 일례에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트(PS) 결합, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일례에서, 본원에 기재된 가이드 RNA는 하나 이상의 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드들 사이에서의 하나 이상의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
변형은 가이드 RNA의 어디에서나 발생할 수 있다. 일례로, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하거나, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하거나, 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합, 가이드 RNA의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일례에서, 변형된 gRNA는 다음 서열: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(서열번호 29)을 포함할 수 있으며, 이때, "N"은 임의의 자연 또는 비-자연 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, N 잔기의 전체는 본원에 기재된 인간 ALB 인트론 1 DNA-표적화 세그먼트를 포함한다(예를 들어, 서열번호 29에 제시된 서열, 이때, N 잔기는 서열번호 30-61 중 임의의 하나의 DNA-표적화 세그먼트, 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나의 DNA-표적화 세그먼트, 또는 서열번호 36의 DNA-표적화 세그먼트로 대체됨). 예를 들어, 변형된 gRNA는 표 3의 서열번호 94-125 중 임의의 하나에 제시된 서열, 서열번호 100, 94, 97, 및 105 중 임의의 하나에 제시된 서열, 또는 서열번호 100에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 용어 "mA," "mC," "mU," 및 "mG"는 2'-O-Me로 변형되었던 뉴클레오타이드(각각 A, C, U, 및 G)를 나타낸다. 부호 "*"는 포스포로티오에이트 변형을 도시한다. 특정한 실시형태에서, A, C, G, U, 및 N은 독립적으로 리보스 당, 즉, 2'-OH를 나타낸다. 특정한 실시형태에서, 변형된 서열의 맥락에서, A, C, G, U, 및 N은 독립적으로 리보스 당, 즉, 2'-OH를 나타낸다. 포스포로티오에이트 연결부 또는 결합은 황이 포스포디에스테르 연결부, 예를 들어 뉴클레오타이드 염기들 사이의 결합에서 하나의 비-가교 포스페이트 산소에 대해 치환되는 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오타이드를 생산하는 데 사용될 때, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 S-올리고로 지칭될 수 있다. 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 포스포로티오에이트 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 용어 "mA*", "mC*", "mU*", 및 "mG*"는 2'-O-Me로 치환되었고 포스포로티오에이트 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드(각각 A, C, U, 및 G)를 나타낸다.
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리 상의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화력 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다. 무염기성 뉴클레오타이드는 질소형성 염기가 결여된 것들을 지칭한다. 역전된 염기는 정상적인 5'에서 3'으로의 연결부로부터 역전된 연결부(즉, 5'에서 5'로 또는 3'에서 3'으로)가 있는 것들을 지칭한다.
무염기성 뉴클레오타이드는 역전된 연결부와 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기성 뉴클레오타이드는 5'에서 5'로의 연결부를 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 무염기성 뉴클레오타이드는 3'에서 3'으로의 연결부를 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드에서의 역전된 무염기성 뉴클레오타이드는 또한 역전된 무염기성 단부 캡이라 불릴 수 있다.
일례에서, 5' 말단의 처음 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상, 및 3' 말단의 마지막 3개, 4개, 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된다. 변형은 예를 들어 2'-O-Me, 2'-F, 역전된 무염기성 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키는 것으로 잘 알려진 다른 뉴클레오타이드 변형일 수 있다.
또 다른 예에서, 5' 말단의 처음 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결될 수 있다.
또 다른 예에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 예에서, 5' 말단의 처음 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(별개의 crRNA 및 tracrRNA) 또는 1개의 분자(sgRNA)로서의 RNA의 형태 및 선택적으로 Cas 단백질과의 복합체의 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한 gRNA를 인코딩하는 DNA 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 인코딩하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 별개의 RNA 분자(예를 들어, 별개의 crRNA 및 tracrRNA)를 인코딩할 수 있다. 후자의 경우, gRNA를 인코딩하는 DNA는 1개의 DNA 분자로서 또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 인코딩하는 별개의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA가 DNA 형태로 제공될 때, gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNA를 인코딩하는 DNA는 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 인코딩하는 DNA는 발현 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 인코딩하는 DNA는 이종성 핵산, 예컨대 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 내에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로부터 별개인 벡터 또는 플라스미드 내에 존재할 수 있다. 이러한 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 만능성 세포, 배아 줄기(ES)세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포, 유도 만능성 줄기(iPS)세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 또한 예를 들어 양방향 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 특정 예는 RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 랫트 U6 폴리머라제 III 프로모터, 또는 마우스 U6 폴리머라제 III 프로모터를 포함한다.
대안적으로, gRNA는 다양한 다른 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 예를 들어 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 제작될 수 있다(예를 들어, 국제특허 WO 2014/089290호 및 국제특허 WO 2014/065596호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함됨). 가이드 RNA는 또한 화학적 합성에 의해 제작된 합성적으로 생산된 분자일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 처음 3개의 5' 및 3' 말단 RNA 잔기에서 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다.
가이드 RNA(또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산)는 하나 이상의 가이드 RNA(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 가이드 RNA) 및 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는(예를 들어, 소정의 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃ 또는 주위 온도) 하에서 분해 생성물이 역치 미만, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만으로 유지되는 기간을 연장시키거나; 생체내 안정성을 증가시키는) 캐리어를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 캐리어의 비제한적인 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락틱-코글리콜릭-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 마이셀, 역마이셀, 지질 코킬레에이트, 및 지질 미세소관을 포함한다. 이러한 조성물은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
일례로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100 에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62 또는 서열번호 94에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62 또는 서열번호 94에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62 또는 서열번호 94에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 62 또는 서열번호 94에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 65 또는 서열번호 97에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 65 또는 서열번호 97에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 65 또는 서열번호 97에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 65 또는 서열번호 97에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 73 또는 서열번호 105에 제시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 73 또는 서열번호 105에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 73 또는 서열번호 105에 제시된 DNA-표적화 세그먼트와 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 73 또는 서열번호 105에 제시된 서열과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다.
(4) 가이드 RNA 표적 서열
가이드 RNA에 대한 표적 DNA는 결합에 대한 충분한 조건이 존재하는 한, gRNA의 DNA-표적화 세그먼트가 결합할 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 세포에 정상적으로 존재하는 생리학적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건(예를 들어, 무-세포 시스템에서의 조건)은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함됨). gRNA에 상보적이고 이와 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보적 가닥"이라 불릴 수 있고, "상보적 가닥"에 상보적인(그리고 따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보적이지 않은) 표적 DNA의 가닥은 "비상보적 가닥" 또는 "템플릿 가닥"이라 불릴 수 있다.
표적 DNA는 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 서열과 비-상보적 가닥 상의 상응하는 서열(예를 들어, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접함) 둘 모두를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "가이드 RNA 표적 서열"은 구체적으로 가이드 RNA가 상보적 가닥 상에서 혼성화하는 서열에 상응하는 비-상보적 가닥 상의 서열(즉, 이의 역상보)을 지칭한다. 즉, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 인접한 비-상보적 가닥 상의 서열을 지칭한다(예를 들어, Cas9의 경우 PAM의 상류 또는 5'). 가이드 RNA 표적 서열은 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트과 동등하지만, 우라실 대신에 티민이 있다. 일례로, SpCas9 효소에 대한 가이드 RNA 표적 서열은 비-상보적 가닥 상의 5'-NGG-3' PAM의 상류 서열을 지칭할 수 있다. 가이드 RNA는 표적 DNA의 상보적 가닥에 대해 상보성을 갖도록 설계되며, 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재하는 한, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 가이드 RNA가 본원에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 것으로 지칭되는 경우, 이는 가이드 RNA가 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 역상보인 표적 DNA의 상보적 가닥 서열에 혼성화함을 의미한다.
표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 예를 들어 세포의 핵 또는 세포질 또는 세포의 세포소기관, 예컨대 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 위치할 수 있다. 표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성의 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 서열)일 수 있거나, 둘 모두를 포함할 수 있다.
Cas 단백질에 의한 표적 DNA의 부위-특이적 결합 및 절단은 (i) 가이드 RNA와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 염기쌍-형성 상보성 및 (ii) 표적 DNA의 비-상보적 가닥에서 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로 불리는 짧은 모티프 둘 모두에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA 표적 서열을 플랭킹할 수 있다. 선택적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 3' 단부 상에 PAM에 의해 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cas9의 경우). 대안적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 5' 단부 상에 PAM에 의해 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cpf1의 경우). 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 내)의 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개 염기쌍(예를 들어, 3개 염기쌍) 상류 또는 하류일 수 있다. SpCas9의 경우, PAM 서열(즉, 비-상보적 가닥 상)은 5'-N1GG-3'일 수 있으며, 이때, N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고, PAM은 표적 DNA의 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 3'에 인접하다. 이와 같이, 상보적 가닥 상의 PAM 서열(즉, 역상보)은 5'-CCN2-3'일 것이며, 이때, N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고, 가이드 RNA의 DNA-표적화 세그먼트가 표적 DNA의 상보적 가닥 상에 혼성화하는 서열의 5'에 인접하다. 일부 이러한 경우, N1 및 N2는 상보적일 수 있고, N1 내지 N2 염기쌍은 임의의 염기쌍(예를 들어, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A)일 수 있다. 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있으며, 이때, N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 씨. 제주니로부터의 Cas9의 경우, PAM은 예를 들어 NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있으며, 이때, N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우(예를 들어, FnCpf1의 경우), PAM 서열은 5' 단부의 상류일 수 있고, 서열 5'-TTN-3'을 갖는다. DpbCasX의 경우, PAM은 서열 5'-TTCN-3'을 가질 수 있다. CasΦ의 경우, PAM은 서열 5'-TBN-3'을 가질 수 있으며, 이때, B는 G, T, 또는 C이다.
가이드 RNA 표적 서열의 한 예는 SpCas9 단백질에 의해 인식되는 NGG 모티프 바로 앞의 20개의 뉴클레오타이드의 DNA 서열이다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 2개 예는 GN19NGG(서열번호 5) 또는 N20NGG(서열번호 6)이다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/165825호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 5' 단부의 구아닌은 세포에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 다른 예는 시험관내에서 T7 폴리머라제에 의한 효율적인 전사를 용이하게 하기 위해 5' 단부에 2개의 구아닌 뉴클레오타이드(예를 들어, GGN20NGG; 서열번호 7)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/065596호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG를 포함하여 서열번호 5-7의 4개 내지 22개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 또 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은 서열번호 5-7의 14개 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
표적 DNA에 혼성화된 CRISPR 복합체의 형성은 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 영역(즉, 표적 DNA의 비-상보적 가닥 및 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 역상보 상의 가이드 RNA 표적 서열) 내에서 또는 그 부근에서 표적 DNA의 하나 또는 양쪽 가닥을 절단할 수 있다. 예를 들어, 절단 부위는 가이드 RNA 표적 서열 내에 있을 수 있다(예를 들어, PAM 서열에 대해 정의된 위치에서). "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일 가닥 파단부 또는 이중 가닥 파단부를 생성하는 표적 DNA의 위치를 포함한다. 절단 부위는 이중 가닥 DNA 중 단지 하나의 가닥(예를 들어, 닉카제가 사용될 때) 또는 양쪽 가닥 상에 존재할 수 있다. 절단 부위는 양쪽 가닥 상의 동일한 위치에 존재하거나(평활 단부 생성; 예를 들어 Cas9)), 각각의 가닥 상의 상이한 부위에 존재할 수 있다(엇갈린 단부(즉, 오버행) 생성; 예를 들어 Cpf1). 엇갈린 단부는 예를 들어 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생성될 수 있으며, 각각의 Cas 단백질은 상이한 가닥 상의 상이한 절단 부위에서 단일 가닥 파단부를 생성하여 이중 가닥 파단부를 생성한다. 예를 들어, 제1 닉카제는 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 제1 가닥 상에 단일 가닥 파단부를 생성할 수 있고, 제2 닉카제는 오버행 서열이 생성되도록 dsDNA의 제2 가닥 상에 단일 가닥 파단부를 생성할 수 있다. 일부 경우, 제1 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카제의 절단 부위는 제2 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카제의 절단 부위로부터 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 250개, 500개, 또는 1,000개 염기쌍만큼 분리된다.
가이드 RNA 표적 서열은 또한 표적-외 변형을 최소화하거나 표적-외 효과를 피하기 위해 선택될 수 있다(예를 들어, 표적-외 게놈 서열에 대해 2개 이하의 미스매치를 피함으로써).
일례로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 126-157 중 임의의 하나에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 126-157 중 임의의 하나에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 132, 126, 129, 및 137 중 임의의 하나에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 132, 126, 129, 및 137 중 임의의 하나에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 132에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 132에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 126에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 126에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 129에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 129에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 137에 제시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 ALB 유전자의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA는 서열번호 137에 제시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
[표 6]
Figure pct00026
[표 7]
Figure pct00027
(5) 뉴클레아제 작용제를 포함하는 지질 나노입자
뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)를 포함하는 지질 나노입자가 또한 제공된다. 지질 나노입자는 대안적으로 또는 추가적으로 본원에 개시된 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)를 포함할 수 있거나, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있거나, 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템) 및 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 둘 모두 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템에 관하여, 지질 나노입자는 임의의 형태(예를 들어, 단백질, DNA, 또는 mRNA)의 Cas 단백질을 포함할 수 있고/있거나 임의의 형태(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 가이드 RNA(들)를 포함할 수 있다. 일례에서, 지질 나노입자는 mRNA(예를 들어, 본원에 기재된 변형된 RNA) 형태의 Cas 단백질 및 RNA(예를 들어, 본원에 개시된 변형된 가이드 RNA) 형태의 가이드 RNA(들)를 포함한다. 또 다른 예로, 지질 나노입자는 단백질 형태의 Cas 단백질 및 RNA 형태의 가이드 RNA(들)를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질은 각각 동일한 LNP의 LNP-매개 전달을 통해 RNA 형태로 도입된다. 본원 다른 곳에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 RNA는 변형될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 하나 이상의 안정화 단부 변형을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 5' 단부 및/또는 3' 단부에서의 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결부 또는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서의 하나 이상의 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, Cas mRNA 변형은 유사우리딘으로의 치환(예를 들어, 유사우리딘으로 완전히 치환됨), 5' 캡, 및 폴리아데닐화를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, Cas mRNA 변형은 N1-메틸-유사우리딘으로의 치환(예를 들어, N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환됨), 5' 캡, 및 폴리아데닐화를 포함할 수 있다. 다른 변형이 또한 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 고려된다. 이러한 방법을 통한 전달은 일시적으로 Cas를 발현하고/하거나 가이드 RNA가 일시적으로 존재하도록 할 수 있으며, 생분해성 지질은 청소율을 향상시키고, 내약성을 향상시키고, 면역원성을 감소시킨다. 지질 제형은 이들의 세포 흡수를 개선하면서 생물학적 분자를 분해로부터 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 미소구체(단층 및 다층 소포, 예를 들어 리포솜 포함), 에멀젼 중 분산상, 마이셀, 또는 현탁액 중 내부상을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전달을 위해 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제형은 다가음이온, 예컨대 핵산을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질(즉, 비하전된 또는 양쪽성 지질), 음이온성 지질, 형질감염을 향상시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스 지질이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는 예를 들어 국제공개 WO 2016/010840 A1호 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예시적인 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일례에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대, 콜레스테롤 및 중성 지질, 예컨대 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤, 선택적인 중성 지질, 예컨대 DSPC, 및 스텔스 지질, 예컨대 S010, S024, S027, S031, 또는 S033을 포함할 수 있다.
LNP는 다음 중 하나 이상 또는 전부를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 헬퍼 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예를 들어, 문헌[Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 특정한 LNP에서, 카고는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 본원의 다른 곳에서 기재된 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 및 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 일부 LNP에서, 지질 성분은 아민 지질, 예컨대 생분해성 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 경우, 지질 성분은 생분해성 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG를 포함한다. 예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA는 이온화 가능한 지질 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)로도 불리는 ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데칸-9,12-디에노에이트, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 제형을 활용하여 세포 및 동물에 전달될 수 있다.
일부 예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 예에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트 또는 또 다른 이온화 가능한 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2019/067992호, 국제공개 WO 2017/173054호, 국제공개 WO 2015/095340호, 및 국제공개 WO 2014/136086호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 일부 예에서, LNP는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5의 RNA 포스페이트에 대한 양이온성 지질 아민(N:P)의 몰비를 포함한다. 일부 예에서, LNP 지질의 맥락에서 용어 양이온성 및 이온화 가능한은 상호교환적이다(예를 들어, 이온화 가능한 지질은 pH에 따라 양이온성임).
캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질은 양이온성 지질일 수 있다. 지질은 또한 생분해성 지질, 예컨대 생분해성 이온화 가능한 지질일 수 있다. 적합한 지질의 일례는 지질 A 또는 LP01이며, 이는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트이다. 예를 들어, 문헌[Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 B이며, 이는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)로도 불리는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 C이며, 이는 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 D이며, 이는 3-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트리데실 3-옥틸운데카노에이트이다. 다른 적합한 지질은 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트([(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일] 4-(디메틸아미노)부타노에이트 또는 Dlin-MC3-DMA(MC3))로도 알려져 있음)를 포함한다.
본원에 기재된 LNP에 사용하기에 적합한 일부 이러한 지질은 생체내에서 생분해성이다.
이러한 지질은 그들이 있는 배지의 pH에 따라 이온화 가능할 수 있다. 예를 들어, 약간 산성 배지에서, 지질은 양성자화될 수 있으므로 양전하를 가질 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약간의 염기성 배지에서, 지질은 양성화되지 않으므로 전하를 보유하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질은 적어도 약 9, 9.5, 또는 10의 pH에서 양성자화될 수 있다. 전하를 보유하는 이러한 지질의 능력은 이의 고유 pKa와 관련이 있다. 예를 들어, 지질은 독립적으로 약 5.8 내지 약 6.2 범위 내의 pKa를 가질 수 있다.
중성 지질은 LNP의 가공을 안정화시키고 개선하는 작용을 한다. 적합한 중성 지질의 예는 다양한 중성, 비하전된, 또는 양쪽성 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 5-헵타데실벤젠-1,3-디올(레조르시놀), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
헬퍼 지질은 형질감염을 향상시키는 지질을 포함한다. 헬퍼 지질이 형질감염을 향상시키는 메커니즘은 입자 안정성을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 특정한 경우, 헬퍼 지질은 막 융합성(fusogenicity)을 향상시킬 수 있다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 적합한 헬퍼 지질의 예는 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트를 포함한다. 일례에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트일 수 있다.
스텔스 지질은 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경시키는 지질을 포함한다. 스텔스 지질은 예를 들어 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제형화 과정을 도울 수 있다. 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조정할 수 있다. 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기를 갖는 지질을 포함한다.
스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 예를 들어 PEG(때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로 지칭됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N- 비닐피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드를 기반으로 하는 중합체로부터 선택되는 중합체 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 PEG는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 중합체를 의미한다. 특정한 LNP 제형에서, PEG는 PEG 2000으로도 칭하는 PEG-2K이며, 이는 약 2,000달톤의 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
스텔스 지질의 지질 모이어티는 예를 들어 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카마이드기를 포함하는 것들을 포함하는 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래될 수 있으며, 사슬은 예를 들어 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카마이드기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다.
일례로, 스텔스 지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디라우일글리카마이드, PEG-디미리스틸글리카마이드, PEG-디팔미토일글리카마이드, 및 PEG-디스테아로일글리카마이드, PEG-콜레스테롤 (l-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사마이도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k- DMPE), 또는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리옥시에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리 에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)으로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정한 예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다.
일부 실시형태에서, PEG 지질은 글리세롤기를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 디미리스토일글리세롤(DMG) 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-DMG이다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다. 일부 실시형태에서, PEG2k-DMG는 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다.
LNP는 상이한 각각의 몰비의 성분 지질을 제형에 포함할 수 있다. CCD 지질의 mol%는 예를 들어 약 30 mol% 내지 약 60 mol%일 수 있다. 헬퍼 지질의 mol%는 예를 들어 약 30 mol% 내지 약 60 mol%일 수 있다. 중성 지질의 mol%는 예를 들어 약 1 mol% 내지 약 20 mol%일 수 있다. 스텔스 지질의 mol%는 예를 들어 약 1 mol% 내지 약 10 mol%일 수 있다.
LNP는 생분해성 지질의 양으로 하전된 아민기(N)와 캡슐화되는 핵산의 음으로 하전된 포스페이트기(P) 사이의 상이한 비를 가질 수 있다. 이것은 식 N/P로 수학적으로 표시될 수 있다. 예를 들어, N/P 비는 약 0.5 내지 약 100일 수 있다. N/P 비는 또한 약 4 내지 약 6일 수 있다.
일부 LNP에서, 카고는 Cas mRNA(예를 들어, Cas9 mRNA) 및 gRNA를 포함할 수 있다. Cas mRNA 및 gRNA는 상이한 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, LNP 제형은 약 25:1 내지 약 1:25 범위의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 2:1 내지 약 1:2의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 특정 예에서, Cas mRNA 대 gRNA의 비는 약 2:1일 수 있다.
특정한 LNP에서, 카고는 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물 및 gRNA를 포함할 수 있다. 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물 및 gRNA은 상이한 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, LNP 제형은 약 25:1 내지 약 1:25 범위의 핵산 작제물 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다.
적합한 LNP의 특정 예는 약 4.5의 포스페이트에 대한 질소(N/P) 비를 갖고, 생분해성 양이온성 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 약 45:44:9:2 몰비(약 45:약 44:약 9:약 2)로 함유한다. 생분해성 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:1(약 1:약 1)의 중량비로 존재할 수 있다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA(MC3), 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG를 약 50:38.5:10:1.5 몰비(약 50:약 38.5:약 10:약 1.5)로 함유한다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:2(약 1:약 2) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:1(약 1:약 1) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 2:1(약 2:약 1) 중량비로 존재할 수 있다.
적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 약 6의 포스페이트에 대한 질소(N/P) 비를 갖고, 생분해성 양이온성 지질, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 약 50:38:9:3 몰비(약 50:약 38:약 9:약 3)로 함유한다. 생분해성 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)로도 불리는, 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트일 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:2(약 1:약 2) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:1(약 1:약 1) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 2:1(약 2:약 1)의 중량비로 존재할 수 있다.
적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 약 3의 포스페이트에 대한 질소(N/P) 비를 갖고, 양이온성 지질, 구조적 지질, 콜레스테롤(예를 들어, 콜레스테롤(양)(Avanti 700000)), 및 PEG2k-DMG(예를 들어, PEG-DMG 2000(NOF America-SUNBRIGHT® GM-020(DMG-PEG))를 약 50:10:38.5:1.5의 비(약 50:약 10:약 38.5:약 1.5) 또는 약 47:10:42:1의 비(약 47:약 10:약 42:약 1)로 함유한다. 구조적 지질은 예를 들어 DSPC(예를 들어, DSPC(Avanti 850365)), SOPC, DOPC, 또는 DOPE일 수 있다. 양이온성/이온화 가능한 지질은 예를 들어 Dlin-MC3-DMA(예를 들어, Dlin-MC3-DMA(Biofine International))일 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:2(약 1:약 2) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:1(약 1:약 1) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 2:1(약 2:약 1) 중량비로 존재할 수 있다.
적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 약 45:9:44:2의 비(약 45:약 9:약 44:약 2)로 함유한다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA, DOPE, 콜레스테롤, 및 PEG 지질 또는 PEG DMG를 약 50:10:39:1의 비(약 50:약 10:약 39:약 1)로 함유한다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 약 55:10:32.5:2.5의 비(약 55:약 10:약 32.5:약 2.5)로 갖는다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG-DMG를 약 50:10:38.5:1.5의 비(약 50:약 10:약 38.5:약 1.5)로 갖는다. 적합한 LNP의 또 다른 특정 예는 Dlin-MC3-DMA, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG-DMG를 약 50:10:38.5:1.5의 비(약 50:약 10:약 38.5:약 1.5)로 갖는다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:2(약 1:약 2) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 1:1(약 1:약 1) 중량비로 존재할 수 있다. Cas9 mRNA는 가이드 RNA에 대해 약 2:1(약 2:약 1) 중량비로 존재할 수 있다.
적합한 LNP의 다른 예는 예를 들어 국제공개 WO 2019/067992호, 국제공개 WO 2020/082042호, 미국 특허 US 2020/0270617호, 국제공개 WO 2020/082041호, 미국 특허 US 2020/0268906호, 국제공개 WO 2020/082046호(예를 들어, pp. 85-86 참조), 및 미국 특허 US 2020/0289628호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
(6) 뉴클레아제 작용제를 포함하는 벡터
본원에 개시된 뉴클레아제 작용제(예를 들어, ZFN, TALEN, 또는 CRISPR/Cas)는 발현을 위한 벡터에 제공될 수 있다. 벡터는 예를 들어 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 포함할 수 있다.
일부 벡터는 원형일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 선형일 수 있다. 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비-지질 나노입자, 또는 바이러스 캡시드를 통해 전달되기 위해 패키징될 수 있다. 비제한적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터, 및 발현 벡터를 포함한다.
핵산의 도입은 또한 바이러스-매개 전달, 예컨대 AAV-매개 전달 또는 렌티바이러스-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 벡터는 예를 들어 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터일 수 있다. AAV는 임의의 적합한 혈청형일 수 있고, 단일 가닥 AAV(ssAAV) 또는 자기-상보적 AAV(scAAV)일 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분열 세포, 비-분열 세포, 또는 분열 세포와 비-분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있거나, 대안적으로는 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 이러한 바이러스는 또한 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-적격일 수 있거나 복제-결함(예를 들어, 추가적인 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 하나 이상의 유전자가 결함됨)일 수 있다. 바이러스 벡터는 이들의 야생형 대응물로부터 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 용이하게 하거나 벡터의 하나 이상의 특성이 변경되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성은 패키징 수용력, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사, 및 번역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 바이러스 게놈 일부가 결실될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 예에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 서열의 숙주 게놈 내로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예컨대, 인테그라제)는 바이러스가 비-통합되도록 돌연변이될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 벡터 상의 코딩 서열의 발현을 유도하기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스는 헬퍼-의존적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 바이러스 입자 내로 증폭 및 패키징하는 데 필요한 바이러스 성분(예컨대, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 바이러스 성분을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분이 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단 내로 도입될 수 있다. 다른 예에서, 바이러스는 무-헬퍼일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭 및 패키징할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 성분을 인코딩할 수 있다.
예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/mL를 포함한다. 다른 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/(체중 kg)을 포함한다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 인간 및 비-인간 영장류(NHP)를 포함하는 다수의 종에 고유하다. 현재까지 적어도 12개의 자연 혈청형 및 수백개의 자연 변이체가 단리되고 특성 규명되었다. 예를 들어, 문헌[Li et al. (2020) Nat. Rev. Genet. 21:255-272]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. AAV 입자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 게놈을 함유하는 비-외피 이십면체 단백질 캡시드로 자연적으로 구성된다. DNA 게놈에는 복제 및 패키징 신호의 바이러스 기점으로서 역할을 하는 2개의 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된다. rep 유전자는 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 4개의 단백질을 인코딩하는 한편, cap 유전자는 AAV 혈청형을 지시하는 3개의 구조적 캡시드 하위단위 및 일부 혈청형에서 비리온 조립을 촉진하는 조립 활성화 단백질(AAP)을 인코딩한다.
재조합 AAV(rAAV)는 치료적 전이유전자를 생체내 표적 세포에 전달함으로써 인간 질환을 치료하는 유전자 요법에 사용되는 현재 가장 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터 중 하나이다. 실제로, rAAV 벡터는 자연 AAV와 유사한 이십면체 캡시드로 구성되지만, rAAV 비리온은 AAV 단백질-코딩 또는 AAV 복제 서열을 캡슐화하지 않는다. 이들 바이러스 벡터는 비-복제성이다. rAAV 벡터에 필요한 유일한 바이러스 서열은 rAAV 벡터의 제작 동안 게놈 복제 및 패키징을 안내하는 데 필요한 2개의 ITR이다. rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자가 없어서, 이들을 생체내에서 비-복제성으로 만든다. rAAV 벡터는, AAV ITR에 의해 플랭킹된 의도된 전이유전자 카세트와 조합하여, 트랜스로 추가적인 바이러스 헬퍼 단백질과 함께 rep 및 cap 유전자를 발현함으로써 생산된다.
치료적 rAAV 게놈에서, 유전자 발현 카세트는 ITR 서열들 사이에 배치된다. 전형적으로, rAAV 게놈 카세트는 치료적 전이유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 이어서 폴리아데닐화 서열로 구성된다. rAAV 발현 카세트를 플랭킹하는 ITR은 일반적으로 AAV2로부터 유래되며, 제1 혈청형은 단리되고 재조합 바이러스 벡터로 전환된다. 이후, 대부분의 rAAV 생산 방법은 AAV2 Rep-기반 패키징 시스템에 의존한다. 예를 들어, 문헌[Colella et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8:87-104]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
사용될 수 있는 ITR의 일부 비제한적 예는 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 ITR을 포함한다. ITR의 다른 예는 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 서열번호 158, 서열번호 159, 또는 서열번호 160과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 본원에 개시된 일부 rAAV 게놈에서, 뉴클레아제 작용제(또는 이의 성분)를 인코딩하는 핵산 작제물은 동일한 ITR이 양쪽 측면 상에 플랭킹된다(즉, 5' 단부 상의 ITR 및 3' 단부 상의 ITR의 역상보, 예컨대 5' 단부 상의 서열번호 158 및 3' 단부 상의 서열번호 168, 또는 5' 단부 상의 서열번호 159 및 3' 단부 상의 서열번호 710, 또는 5' 단부 상의 서열번호 160 및 3' 단부 상의 서열번호 711). 일례에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 158 및 3' 단부 상의 역상보). 또 다른 예에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 159 및 3' 단부 상의 역상보). 일례에서, 적어도 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 5' 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 3' 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다(즉, 5' 단부 상의 서열번호 160 및 3' 단부 상의 역상보). 일례에서, 각각의 단부 상 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 본원에 개시된 다른 rAAV 게놈에서, 뉴클레아제 작용제(또는 이의 성분)를 인코딩하는 핵산은 각각의 단부 상에 상이한 ITR에 의해 플랭킹된다. 일례에서, 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 또 다른 예에서, 하나의 단부 상의 상 ITR은 서열번호 158을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일례에서, 하나의 단부 상의 ITR은 서열번호 159를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 다른 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
재조합 AAV 벡터의 특정 혈청형은 특정 조직에 대한 이의 생체내 향성에 영향을 미친다. AAV 캡시드 단백질은 표적 세포 내로의 부착 및 진입을 매개하고, 이어서 엔도솜 탈출 및 핵으로의 트래피킹을 담당한다. 따라서, rAAV 벡터를 개발할 때 혈청형의 선택은 벡터가 생체내 주입될 때 어떤 세포 유형 및 조직에 결합하고 형질도입될 가능성이 가장 높은지에 영향을 미칠 것이다. rAAV8을 포함하는 rAAV의 몇몇의 혈청형은 마우스, NHP, 및 인간에서 전신으로 전달될 때 간에 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Li et al. (2020) Nat. Rev. Genet. 21:255-272]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
일단 핵 내에서, ssDNA 게놈은 비리온으로부터 방출되고, 상보적 DNA 가닥이 합성되어 이중 가닥 DNA(dsDNA) 분자를 생성한다. 이중 가닥 AAV 게놈은 이들의 ITR을 통해 자연적으로 원형화되고, 핵에서 염색체 외부에 지속될 에피솜이 된다. 따라서, 에피솜 유전자 요법 프로그램의 경우, rAAV-전달 rAAV 에피솜은 비-분열 세포에서 장기적 프로모터-유도 유전자 발현을 제공한다. 그러나, 이러한 rAAV-전달 에피솜 DNA는 세포가 분할함에 따라 희석된다. 대조적으로, 본원에 기재된 유전자 요법은 장기적 유전자 발현을 허용하는 유전자 삽입을 기반으로 한다.
특정 서열(예를 들어, 특정 양방향 작제물 서열 또는 특정 일방향 작제물 서열)을 포함하는 특정 rAAV가 본원에 개시될 때, 이들은 개시된 서열 또는 서열의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 본원에 개시된 양방향 또는 일방향 작제물이 가상 서열 5'-CTGGACCGA-3'으로 구성되는 경우, 이는 또한 해당 서열의 역상보(5'-TCGGTCCAG-3')를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 특정 5'에서 3' 순서의 양방향 또는 일방향 작제물 요소를 포함하는 rAAV가 본원에 개시될 때, 이들은 또한 이들 요소의 순서의 역상보를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 5'에서 3'으로 제1 스플라이스 수용체, 제1 코딩 서열, 제1 종결자, 제2 종결자의 역상보, 제2 코딩 서열의 역상보, 및 제2 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 양방향 작제물을 포함하는 rAAV가 본원에 개시되는 경우, 이는 또한 5'에서 3'으로 제2 스플라이스 수용체, 제2 코딩 서열, 제2 종결자, 제1 종결자의 역상보, 제1 코딩 서열의 역상보, 및 제1 스플라이스 수용체의 역상보를 포함하는 작제물을 포함하도록 의도된다. 단일 가닥 AAV 게놈은 센스(플러스-가닥) 또는 안티-센스(마이너스-가닥 게놈)로 패키징되고, + 및 - 극성의 단일 가닥 AAV 게놈은 동일한 빈도로 성숙 rAAV 비리온으로 패키징된다. 예를 들어, 문헌[LING et al. (2015) J. Mol. Genet. Med. 9(3):175], 문헌[Zhou et al. (2008) Mol. Ther. 16(3):494-499], 및 문헌[Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
ssDNA AAV 게놈은 상보적 DNA 가닥이 합성되도록 하는 2개의 역말단 반복부에 의해 플랭킹된 2개의 개방형 리딩 프레임, Rep 및 Cap로 구성된다. AAV 전이 플라스미드를 구축할 때, 전이유전자는 2개의 ITR들 사이에 배치되고, Rep 및 Cap는 트랜스로 공급될 수 있다. Rep 및 Cap 외에, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드가 필요할 수 있다. 이들 유전자(E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개한다. 예를 들어, 전이 플라스미드, Rep/Cap 및 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포 내로 형질주입되어 감염성 AAV 입자를 생산할 수 있다. 대안적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 내로 조합될 수 있다. 유사한 패키징 세포 및 방법이 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 사용될 수 있다.
AAV의 다수의 혈청형이 식별되었다. 이들 혈청형은 이들이 감염시키는 세포의 유형(즉, 이들의 향성)이 상이하여, 특정 세포 유형의 형질도입을 선호하게 한다. 용어 AAV는 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 자연 말단 반복부(TR), Rep 단백질, 및 캡시드 하위단위의 서열은 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 본원에 사용된 "AAV 벡터"는 전형적으로 관심 외인성 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함하는, AAV 기원이 아닌 이종성 서열(즉, AAV에 대한 이종성 핵산 서열)을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 작제물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAV-DJ, AAV2/8, AAVrh10, AAVLK03, AV10, AAV11, AAV12, rh10, 및 이들의 하이브리드, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV 캡시드 서열을 포함한다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열(전이유전자)은 적어도 하나 및 일반적으로 2개의 AAV 역말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된다. AAV 벡터는 단일 가닥(ssAAV)이거나 자기-상보적(scAAV)일 수 있다. 간 조직을 위한 혈청형의 예는 AAV3B, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.74, 및 AAVhu.37, 및 특히 AAV8을 포함한다. 특정 예에서, 핵산 작제물을 포함하는 AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8)일 수 있다. 본원에 기재된 rAAV8 벡터는 캡시드가 AAV8 유래인 것이다. 예를 들어, AAV2로부터의 ITR 및 AAV8의 캡시드를 사용하는 AAV 벡터는 본원에서 rAAV8 벡터인 것으로 간주된다.
향성은 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드와 게놈의 혼합인 위형화를 통해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 패키징된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 위형화된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 향상시킬 뿐만 아니라 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드가 또한 바이러스 향성을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고, 생체내에서 광범위한 세포 유형 범위에 걸쳐 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 나타내되 향상된 뇌 흡수를 갖는 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 또한 돌연변이를 통해 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형화된/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다.
전이유전자 발현을 가속화하기 위해, 자기-상보적 AAV(scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV는 AAV의 단일-가닥 DNA 게놈의 상보적 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 기구에 의존하기 때문에, 전이유전자 발현이 지연될 수 있다. 이러한 지연을 해결하기 위해, 감염 시 자발적으로 서냉복원할 수 있는 상보적 서열을 함유하는 scAAV가 사용되어, 숙주 세포 DNA 합성을 위한 요건을 없앨 수 있다. 그러나, 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터가 또한 사용될 수 있다.
패키징 수용력을 증가시키기 위해, 더 긴 전이유전자는 2개의 AAV 전이 플라스미드들 사이에서 분할될 수 있으며, 제1 AAV는 3' 스플라이스 공여체가 있고, 제2 AAV는 5' 스플라이스 수용체가 있다. 세포의 공동-감염 시, 이들 바이러스는 콘카타머를 형성하며, 함께 스플라이싱되고, 전장 전이유전자가 발현될 수 있다. 이는 더 긴 전이유전자가 발현되게 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 수용력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동 재조합을 활용한다. 예를 들어, 전이유전자는 공동-발현이 전장 전이유전자의 상동 재조합 및 발현을 유도하도록 2개의 전이 플라스미드들 사이에서 분할되나 실질적인 서열 중첩이 있을 수 있다.
특정한 AAV에서, 카고는 1개 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA, 또는 2개 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA)을 포함할 수 있다. 특정한 AAV에서, 카고는 Cas9과 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, DNA), 또는 1개 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA(예를 들어, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 또는 2개 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA)를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정한 AAV에서, 카고는 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 특정한 AAV에서, 카고는 Cas9과 같은 Cas 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, DNA), 가이드 RNA(또는 다수의 가이드 RNA)를 인코딩하는 DNA, 및 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다.
예를 들어, Cas 또는 Cas9 및 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 1개의 gRNA 또는 2개의 gRNA 또는 3개의 gRNA 또는 4개의 gRNA)는 LNP-매개 전달(예를 들어, RNA 형태) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)-매개 전달(예를 들어, rAAV8-매개 전달)을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA는 LNP-매개 전달을 통해 전달될 수 있거나, Cas9을 인코딩하는 DNA 및 gRNA를 인코딩하는 DNA는 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. Cas 또는 Cas9 및 gRNA(들)는 단일 AAV에서 또는 2개의 별개의 AAV를 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 유사하게, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 둘 이상의 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 대안적으로, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 유사하게는, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 둘 이상의 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 상이한 프로모터가 gRNA, 예컨대 U6 프로모터 또는 작은 tRNA Gln의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 상이한 프로모터가 Cas9 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물에 맞을 수 있도록 작은 프로모터가 사용된다. 유사하게, 작은 Cas9 단백질(예를 들어, SaCas9 또는 CjCas9)이 AAV 패키징 수용력을 최대화하는 데 사용된다.
C. 세포 또는 동물 또는 게놈
상기 조성물 중 임의의 것(예를 들어, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물, 뉴클레아제 작용제, 벡터, 지질 나노입자, 또는 이들의 임의의 조합)을 포함하는 세포 또는 동물(즉, 대상체)이 또한 본원에 제공된다. 이러한 세포 또는 동물(또는 게놈)은 본원에 개시된 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 동물은 본원에 기재된 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 도메인)를 인코딩하는 임의의 핵산 작제물, 본원에 개시된 임의의 뉴클레아제 작용제, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 이러한 세포 또는 동물(또는 게놈)은 신생아 세포 또는 동물(또는 게놈)일 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포 또는 동물(또는 게놈)은 비-신생아 세포 또는 동물(또는 게놈)일 수 있다.
신생아 대상체(예를 들어, 동물)는 최대 1세(52주) 또는 그 이하의 연령, 바람직하게는 최대 24주 또는 그 이하의 연령, 보다 바람직하게는 최대 12주 또는 그 이하의 연령, 더욱 바람직하게는 최대 8주 또는 그 이하의 연령, 보다 더 바람직하게는 최대 4주 또는 그 이하의 연령의 인간 대상체일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 4주령이다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 8주령이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 7일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 6일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 5일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 4일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1일 이내이다. 상기 개시된 시간 범위는 인간 대상체에 대한 것이며, 또한 다른 동물에 상응하는 발달 시간 범위를 포함하도록 의도된다.
신생아 세포는 임의의 신생아 대상체의 세포일 수 있다. 예를 들어, 이들은 최대 1세(52주) 또는 그 이하의 연령, 바람직하게는 최대 24주 또는 그 이하의 연령, 보다 바람직하게는 최대 12주 또는 그 이하의 연령, 더욱 바람직하게는 최대 8주 또는 그 이하의 연령, 보다 더 바람직하게는 최대 4주 또는 그 이하의 연령의 인간 대상체의 것일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 4주령이다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 8주령이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 7일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 6일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 5일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 4일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1일 이내이다. 상기 개시된 시간 범위는 인간 대상체에 대한 것이며, 또한 다른 동물에 상응하는 발달 시간 범위를 포함하도록 의도된다.
일부 이러한 세포 또는 동물 또는 게놈에서, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물은 세이프 하버 유전자좌(예를 들어, ALB 유전자좌 또는 인간 ALB 유전자좌, 예컨대, ALB 유전자좌 또는 인간 ALB 유전자좌의 인트론 1)와 같은 표적 게놈 유전자좌에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 일부 이러한 세포, 동물, 또는 게놈에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩된 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)는 세포, 동물, 또는 게놈에서 발현된다. 예를 들어, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물이 ALB 유전자좌(예를 들어, 인간 ALB 유전자좌의 인트론 1) 내로 통합되는 경우, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)는 ALB 유전자좌로부터 발현될 수 있다. 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)에 대한 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산 작제물이 본원에 개시된 양방향 핵산 작제물인 경우, 신생아 게놈, 신생아 세포, 또는 신생아 동물은 제1 관심 폴리펩타이드를 발현할 수 있거나 제2 관심 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 일부 신생아 게놈, 신생아 세포, 또는 신생아 동물에서, 표적 게놈 유전자좌는 ALB 유전자좌이다. 예를 들어, 핵산 작제물은 내인성 ALB 유전자좌의 인트론 1에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 이어서, 내인성 ALB 엑손 1은 핵산 작제물의 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스될 수 있다.
핵산 작제물이 안정하게 통합되는 표적 게놈 유전자좌는 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물에 대해 이형접합성일 수 있거나, 관심 폴리펩타이드(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질)를 인코딩하는 핵산 작제물에 대해 동형접합성일 수 있다. 이배체 유기체는 각각의 유전적 유전자좌에 2개의 대립유전자를 갖는다. 각각의 쌍의 대립유전자는 특정 유전적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정 유전자좌에 2개의 동일한 대립유전자가 존재하는 경우, 동형접합성으로서 기재되고, 2개의 대립유전자가 상이한 경우, 이형접합성으로서 기재된다.
세포, 동물, 또는 게놈은 진핵 세포 또는 진핵생물, 또는 포유류 세포 또는 포유류(예를 들어, 비-인간 포유류 세포 또는 비-인간 포유류, 또는 인간 세포 또는 인간)와 같은 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 포유류는 예를 들어 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 랫트, 마우스, 또는 햄스터일 수 있다. 다른 비-인간 포유류는 예를 들어 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이 및 잔나비를 포함한다. 용어 "비-인간"은 인간을 제외한다. 예는 인간 세포/인간, 설치류 세포/설치류, 마우스 세포/마우스, 랫트 세포/랫트, 및 비-인간 영장류 세포/비-인간 영장류를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 특정 예에서, 세포는 인간 세포이거나 동물은 인간이다. 마찬가지로, 세포는 임의의 적합한 유형의 세포일 수 있다. 특정 예에서, 세포는 헤파토사이트와 같은 간 세포(예를 들어, 인간 간 세포 또는 인간 헤파토사이트)이다.
세포는 단리된 세포(예를 들어, 시험관내), 생체외 세포일 수 있거나, 동물 내에(즉, 대상체 내에) 생체내에서 존재할 수 있다. 세포는 유사분열적으로(mitotically) 적격인 세포 또는 유사분열적으로 비활성 세포, 감수분열적으로(meiotically) 적격인 세포 또는 감수분열적으로 비활성 세포일 수 있다. 유사하게는, 세포는 또한 1차 체세포, 또는 1차 체세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식모세포(gametocyte), 또는 미분화된 줄기세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 헤파토사이트(예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 또는 인간 헤파토사이트)와 같은 간 세포일 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적인 건강한 세포일 수 있거나, 유병 또는 돌연변이-보유 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 관심 폴리펩타이드의 결핍을 가질 수 있거나 관심 폴리펩타이드의 결핍이 있는 대상체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포는 GAA 결핍을 가질 수 있거나, GAA 결핍을 초래하는 돌연변이를 보유할 수 있거나, GAA 결핍 또는 폼페병을 초래하는 돌연변이를 보유하는 GAA 결핍이 있는 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 신생아 대상체의 것이다.
본원에 제공된 세포는 분열 세포일 수 있다(예를 들어, 활발하게 분열하는 세포). 대안적으로, 본원에 제공된 세포는 비-분열 세포일 수 있다.
III. 치료적 방법 및 세포 또는 대상체에서 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입, 통합, 또는 발현하기 위한 방법
본원에 개시된 핵산 작제물 및 조성물은 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입 또는 통합하는 방법 또는 관심 폴리펩타이드를 세포, 세포 집단, 또는 대상체(예를 들어, 신생아 세포, 신생아 세포 집단, 또는 신생아 대상체)에서 발현시키는 방법에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 및 조성물은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단) 내로 도입하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입 또는 통합하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)에서 발현시키는 방법, 글리코겐 축적을 대상체의 세포 또는 세포 집단 또는 조직(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)에서 감소시키는 방법, 대상체 폼페병 또는 GAA 결핍을 치료하는 방법, 및 대상체의 폼페병 또는 GAA 결핍 징후 또는 증상의 발병을 예방 또는 감소시키는 방법에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질 조성물(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 조합된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물)은 GAA 결핍 또는 폼페병을 치료하고/하거나 (예를 들어, 대조군, 치료되지 않은 대상체와 비교하여) GAA 결핍 또는 폼페병과 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는 데 유용하다. 본원에 개시된 다중 도메인 치료적 단백질 조성물(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 조합된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물)은 또한 (예를 들어, 대조군, 치료되지 않은 대상체와 비교하여) GAA 결핍 또는 폼페병의 징후 또는 증상의 발병을 예방 또는 감소시키는 데 유용하다. 마찬가지로, 본원에 개시된 조성물은 GAA 결핍 또는 폼페병을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
GAA 결핍 또는 폼페병과 관련하여, 용어 "치료하다", "치료된", "치료하는", 및 "치료"는 본원에 개시된 다중 도메인 치료적 도메인 핵산 작제물(예를 들어, 본원에 개시된 뉴클레아제 작용제와 함께)을 대상체에 투여하여 GAA 결핍 또는 폼페병의 증상, 합병증, 또는 생화학적 표시의 발병을 예방 또는 지연시켜 GAA 결핍 또는 폼페병의 증상을 완화시키거나 추가 발생을 저지 또는 억제하는 것을 포함한다. 치료는 예방적(GAA 결핍 또는 폼페병의 발병을 예방 또는 지연 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위함)이거나 GAA 결핍 또는 폼페병의 징후 후에 증상의 치료적 저해 또는 완화일 수 있다.
GAA 결핍은 GAA의 발현 및/또는 활성 수준이 정상 GAA 발현 및/또는 활성 수준보다 대상체(예를 들어, 신생아 대상체)에서 더 낮아서 GAA의 정상적 기능이 대상체에서 충분히 수행되지 않도록 하는 것을 지칭한다(예를 들어, 폼페병 초래). 폼페병은 산 말타제 결핍, 산 말타제 결핍 질환, 알파-1,4-글루코시다제 결핍, AMD, 알파-글루코시다제 결핍, GAA 결핍, II형 글리코겐 저장 질환, II형 글리코겐증, GSD II, GSD2, 및 폼페병으로도 알려진다.
폼페병은 신체 세포에서의 글리코겐의 축적에 의해 유발되는 유전성 장애이다. 특정한 기관 및 조직, 특히 근육 내 글리코겐의 축적은 이들의 정상적으로 작용하는 능력을 손상시킨다. 상이한 유형의 폼페병은 중증도 및 이들이 나타나는 연령이 상이하다. 이들 유형은 유아 발병 폼페병(전통적 유아 발병 및 비-전통적 유아 발병) 및 후기 발병 폼페병으로 알려진다. 후기 발병 폼페병이 있는 대상체는 질환의 유아 발병 형태에서 발견되는 것보다는 더 높은 GAA 효소 수준을 갖되, 일반적으로 정상적 효소 활성의 40% 미만의 GAA 효소를 갖는다. 전통적 유아 발병 폼페병 환자는 전형적으로 1% 미만의 GAA 효소 활성을 갖는 한편, 비-전통적 형태를 갖는 이들은 일반적으로 10% 미만을 갖는다.
유아 발병 폼페병의 전통적 형태는 출생 후 수개월 내에 시작한다. 일부 표현형, 예컨대 심근병증은 출생 시 존재할 수 있다. 이러한 장애가 있는 유아는 전형적으로 근력 저하(근질환), 근 긴장 저하(근긴장저하(hypotonia)), 비대해진 간(간비대), 및 심장 결함을 경험한다. 영향을 받은 영아는 체중 증가에 실패하고 예상 속도로 성장하지 못하며(성장 실패) 호흡 문제를 겪을 수도 있다. 치료되지 않는 경우, 이러한 형태의 폼페병은 생후 첫 해에 심부전으로 인해 사망에 이른다.
비-전통적 형태의 유아 발생 폼페병은 일반적으로 1세에 나타난다. 이는 지연된 운동 기능(예컨대, 구르거나 앉는 것) 및 진행성 근력 저하를 특징으로 한다. 심장이 비정상적으로 클 수 있지만(심장 비대), 영향을 받은 개체는 일반적으로 심부전을 경험하지는 않는다. 이 장애의 근력 저하는 심각한 호흡 문제에 이르고, 비-전통적 유아 발병 폼페병이 있는 대부분의 어린이는 오직 유아기까지만 산다.
후기 발병 유형의 폼페병은 아동기, 청소년기, 또는 성인기 후반까지 명백하게 나타나지 않을 수 있다. 후기 발병 폼페병은 일반적으로 이 장애의 유아 발병 형태보다 더 경미하고 심장을 침범할 가능성이 적다. 후기 발병 폼페병이 있는 대부분의 개체는 호흡을 제어하는 근육을 포함하여 특히 다리 및 몸통에서 진행성 근력 저하를 경험한다. 장애가 진행함에 따라, 호흡 문제는 호흡 부전에 이를 수 있다.
GAA 유전자의 돌연변이는 폼페병을 유발할 수 있다. GAA 유전자는 알팔-글루코시다제로 불리는 효소를 인코딩한다. 이 효소는 리소솜에서 활성이다. 효소는 정상적으로 글리코겐을 글루코스로 분해한다. GAA 유전자의 돌연변이는 알파-글루코시다제가 글리코겐을 효과적으로 분해하는 것을 방해하여 이러한 당이 리소솜에서 독성 수준으로 축적되도록 한다. 이러한 축적은 신체 전반에 걸친 기관 및 조직, 특히 근육에 손상을 입혀서 폼페병의 진행성 징후 및 증상에 이른다.
이는 유전적 병태이기 때문에, 이 질병을 얻은 사람은 부모로부터 이를 물려받는다. 그러나, 부모 중 누구도 어떠한 증상을 나타내지 않는 것이 일반적이다. 이 질환은 희귀하다. 미국에서, 40,000명 중 한 명만이 폼페병에 걸린다. 이는 모든 인종 그룹의 남성 및 여성에 영향을 미칠 수 있다.
폼페병의 증상은 질환이 발생한 시기에 따라 상이할 수 있다. 전통적 유형의 경우, 유아 증상은 다음을 포함할 수 있다: 약한 근육, 근 긴장 저하, 비대해진 간, 체중 증가 및 예상된 속도로 성장하는 데 실패(성장 실패), 호흡 곤란, 식이 문제, 호흡계 감염, 및 청력 문제. 비-전통적 유형의 경우, 유아 증상은 다음을 포함할 수 있다: 지연된 운동 능력(예컨대, 구르거나 앉는 것), 근육이 점차 약해지는 것, 비정상적으로 큰 심장, 및 호흡 문제. 후기 발병 유형의 경우, 증상은 다음을 포함할 수 있다: 다리 및 몸통이 점차 약해지는 것, 호흡 문제, 비대해진 심장, 걷는 것의 어려움 증가, 큰 면적에 걸친 근육 통증, 운동 능력의 손실, 자주 넘어지는 것, 빈번한 폐 감염, 무리할 때 숨가쁨, 아침 두통, 낮 동안 피곤해짐, 체중 감소, 이전처럼 쉽게 삼킬 수 없음, 불규칙한 심장 박동, 청력 장애 증가, 및 더 높은 수준의 크레아틴 키나제.
폼페병의 병리는 대상체가 증상이 나타나기 전부터 오래 전에 시작할 수 있다. 폼페병은 혈액 샘플을 취하여 진단될 수 있고, 혈액 내 효소는 연구되고 계수된다. 확인은 DNA 시험을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, GAA 효소 활성은 흐름-주입 탄뎀 질량분석기(flow-injection tandem mass spectrometry)에 의해 측정될 수 있고, GAA 유전자의 전체 시퀀싱이 낮은 GAA 효소 활성이 있는 신생아에서 수행된다. 예를 들어, 문헌[Ficicioglu et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen. 6(4):89], 문헌[Tang et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen. 6(1):9], 및 문헌[Klug et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen 6(1):11]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. GAA 활성은 임의의 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, GAA 활성(또는 활성 결핍)을 평가하기 위해, 혈액 기반 검정이 건조된 혈액 스팟 또는 신선한 혈액에서 GAA 활성을 측정할 수 있다. GAA 활성은 또한 피부 생검 또는 근육 생검으로부터의 섬유아세포에서 측정될 수 있다. 다른 2차 척도는 질량분석기에 의해 소변의 글루코스 사당류를 측정하는 것일 수 있다. 이들은 유전적 분석과 조합하여 유아 및 후기 발병 폼페병을 진단할 수 있다. 무증상 대상체는 유전적 스크리닝에 의해 진단되는 경우 폼페병을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 대상체는 무증상이더라도 감소된 GAA 활성 및 병원성 GAA 변이체 또는 돌연변이를 갖는 경우 폼페병을 갖는 것으로 간주된다. 폼페병과 관련된 병원성 GAA 돌연변이 및 변이체는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Ficicioglu et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen. 6(4):89], 문헌[Tang et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen. 6(1):9], 및 문헌[Klug et al. (2020) Int. J. Neonatal Screen 6(1):11]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
몇몇의 다른 리소솜 질환의 경우와 같이, 폼페병인 현재 효소 대체 요법(ERT)에 의해 치료된다. 재조합 인간 GAA는 격주로 정맥내 주입에 의해 환자에 전달된다. ERT가 폼페병의 심장 징후를 치료하는 데 매우 성공적이었지만, 골격근 및 중추신경계(CNS)는 여전히 ERT에 의해 최소한으로 치료된다.
세포 또는 세포 집단은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단일 수 있고, 대상체는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단) 내로 도입하는 일부 방법, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입 또는 통합하는 방법, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)에서 발현시키는 방법, 글리코겐 축적을 대상체의 세포 또는 세포 집단 또는 조직(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)에서 감소시키는 방법, 및 대상체에서의 폼페병 또는 GAA 결핍을 치료하는 방법에서의 신생아 대상체일 수 있다. 신생아 대상체는 최대 1세(52주) 또는 그 이하의 연령, 바람직하게는 최대 24주 또는 그 이하의 연령, 보다 바람직하게는 최대 12주 또는 그 이하의 연령, 더욱 바람직하게는 최대 8주 또는 그 이하의 연령, 보다 더 바람직하게는 최대 4주 또는 그 이하의 연령의 인간 대상체일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 4주령이다. 특정한 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 최대 8주령이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1주 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 7일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 6일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 5일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 4일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 3일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 2일 이내이다. 또 다른 실시형태에서, 신생아 인간 대상체는 출생 후 1일 이내이다. 상기 개시된 시간 범위는 인간 대상체에 대한 것이며, 또한 다른 동물에 상응하는 발달 시간 범위를 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 "신생아 세포"는 신생아 대상체의 세포이고, 신생아 세포 집단은 신생아 대상체의 세포 집단이다. 다른 방법에서, 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포가 아니고, 신생아 세포 집단이 아니고, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
일례에서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 이를 필요로 하는 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단) 내로 도입하는 방법이 본원에 제공된다. 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단일 수 있고, 대상체는 일부 방법에서 신생아 대상체일 수 있다. 다른 방법에서, 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포가 아니고, 신생아 세포 집단이 아니고, 대상체는 신생아 대상체가 아니다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 세포에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께 투여될 수 있거나, 단독으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되지 않고 다중 도메인 치료적 단백질을 발현시키는 것일 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열이 프로모터에 작동 가능하게 연결된 에피솜 벡터 또는 발현 벡터). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다.
또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질을 이를 필요로 하는 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)에서 발현시키는 방법이 본원에 제공된다. 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단일 수 있고, 대상체는 일부 방법에서 신생아 대상체일 수 있다. 다른 방법에서, 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포가 아니고, 신생아 세포 집단이 아니고, 대상체는 신생아 대상체가 아니다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 세포에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 뉴클레아제 작용제 없이 투여될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 경우). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다.
또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 이를 필요로 하는 세포 또는 세포 집단 또는 대상체(예를 들어, 대상체의 세포 또는 세포 집단)의 표적 세포 유전자좌 내로 삽입 또는 통합하는 방법이 본원에 제공된다. 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단일 수 있고, 대상체는 일부 방법에서 신생아 대상체일 수 있다. 다른 방법에서, 세포 또는 세포 집단은 신생아 세포가 아니고, 신생아 세포 집단이 아니고, 대상체는 신생아 대상체가 아니다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 세포에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1에서 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다.
상기 방법 중 임의의 것에서, 세포는 진핵 세포 또는 포유류 세포(예를 들어, 비-인간 포유류 세포 또는 인간 세포)와 같은 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 포유류는 예를 들어 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 랫트, 마우스, 또는 햄스터일 수 있다. 다른 비-인간 포유류는 예를 들어 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이 및 잔나비를 포함한다. 용어 "비-인간"은 인간을 제외한다. 특정 예는 인간 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 및 비-인간 영장류 세포를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 특정 예에서, 세포는 인간 세포이다. 마찬가지로, 세포는 임의의 적합한 유형의 세포일 수 있다. 특정 예에서, 세포는 헤파토사이트와 같은 간 세포(예를 들어, 인간 간 세포 또는 인간 헤파토사이트)이다. 세포는 신생아 세포일 수 있거나, 이들은 비-신생아 세포일 수 있다.
세포는 단리된 세포(예를 들어, 시험관내), 생체외 세포일 수 있거나, 동물 내에(즉, 대상체 내에) 생체내에서 존재할 수 있다. 특정 예에서, 세포는 생체내(예를 들어, GAA 결핍 또는 폼페병을 갖는 대상체)에 존재한다. 세포는 유사분열적으로 적격인 세포 또는 유사분열적으로 비활성 세포, 감수분열적으로 적격인 세포 또는 감수분열적으로 비활성 세포일 수 있다. 유사하게는, 세포는 또한 1차 체세포, 또는 1차 체세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포는 배우자, 생식 세포, 생식모세포, 또는 미분화된 줄기세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 헤파토사이트와 같은 간 세포(예를 들어, 마우스, 비인간 영장류, 또는 인간 헤파토사이트)일 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적인 건강한 세포일 수 있거나, 유병 또는 돌연변이-보유 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 GAA 결핍을 가질 수 있거나, GAA 결핍 또는 폼페병이 있는 대상체로부터 유래될 수 있다.
리소솜 알파-글루코시다제(GAA) 결핍의 치료가 필요한 대상체(예를 들어, 폼페병이 있는 대상체)에서의 리소솜 알파-글루코시다제(GAA) 결핍의 치료 방법이 또한 제공된다. 폼페병은 임의의 유형의 폼페병(예를 들어, 유아 발병 폼페병(전통적 유아 발병 또는 비-전통적 유아 발병) 또는 후기 발병 폼페병)일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 가질 수 있다. 폼페병은 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 간, 또는 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 또는 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 간 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 간, 및 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 및 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 간, 심장, 또는 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 간 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 간, 심장, 및 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화된다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 일부 경우, 글리코겐 수준은 야생형 수준으로 감소된다. 일부 경우, 골격근, 심장, 및/또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적한 수준으로 감소된다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 근력을 개선한다(예를 들어, 근력을 야생형 수준으로 복원함). 일부 방법에서, 방법은 대조군과 비교하여 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 대상체에 투여하여 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 뉴클레아제 작용제 없이 투여될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 경우). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함). 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함).
글리코겐 축적 감소가 필요한 대상체(예를 들어, 폼페병이 있는 대상체)에서의 세포 또는 세포 집단 또는 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 또 다른 양태에서, 세포 또는 세포 집단 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법이 제공된다. 폼페병은 임의의 유형의 폼페병(예를 들어, 유아 발병 폼페병(전통적 유아 발병 또는 비-전통적 유아 발병) 또는 후기 발병 폼페병)일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 가질 수 있다. 폼페병은 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 일부 경우, 글리코겐 수준은 야생형 수준으로 감소된다. 일부 경우, 골격근, 심장, 및/또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적한 수준으로 감소된다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 근력을 개선한다(예를 들어, 근력을 야생형 수준으로 복원함). 일부 방법에서, 방법은 대조군과 비교하여 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 대상체에 투여하여 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 뉴클레아제 작용제 없이 투여될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 경우). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함). 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함).
대상체에서의 폼페병의 치료 방법이 또한 제공된다. 폼페병은 임의의 유형의 폼페병(예를 들어, 유아 발병 폼페병(전통적 유아 발병 또는 비-전통적 유아 발병) 또는 후기 발병 폼페병)일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 가질 수 있다. 폼페병은 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근 및 심장 조직에서 감소될 수 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에서 감소될 수 있다. 일부 경우, 글리코겐 수준은 야생형 수준으로 감소된다. 일부 경우, 골격근, 심장, 및/또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준은 동일한 연령의 야생형 수준과 필적한 수준으로 감소된다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 근력을 개선한다(예를 들어, 근력을 야생형 수준으로 복원함). 일부 방법에서, 방법은 대조군과 비교하여 대상체의 근력 손실을 방지한다. 일부 방법에서, 방법은 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 한다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 대상체에 투여하여 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 뉴클레아제 작용제 없이 투여될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 경우). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함). 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함).
치료는 대상체에서 질환 또는 장애를 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하며, 질환을 억제하거나, 이의 발생을 억제하거나, 질환의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 질환을 치유하거나 질환의 하나 이상의 증상의 재발을 예방하는 것을 포함한다. 예를 들어, 폼페병의 치료는 폼페병의 증상을 완화시키는 것을 포함할 수 있다. 폼페병은 상기 상세하게 기재되며, 누락 또는 결함 GAA 유전자 또는 GAA 폴리펩타이드에 의해 유발되는 장애를 지칭한다. 결함 GAA 유전자 또는 GAA 폴리펩타이드는 GAA 발현 및/또는 GAA 활성을 감소시킬 수 있다.
대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법이 또한 제공된다(예를 들어, 치료되지 않은 대조군 대상체와 비교하여). 예방한다는 것은 폼페병의 징후 또는 증상이 전혀 존재하지 않음을 의미한다. 이러한 징후 또는 증상은 잘 알려져 있고, 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 폼페병은 임의의 유형의 폼페병(예를 들어, 유아 발병 폼페병(전통적 유아 발병 또는 비-전통적 유아 발병) 또는 후기 발병 폼페병)일 수 있다. 예를 들어, 폼페병은 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)일 수 있다. 폼페병은 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 또는 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 및 심장 조직에서 예방 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근 및 심장 조직에서 예방 또는 감소될 수 있다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 간, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 골격근 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 간 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시킨다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 간, 심장, 및 중추신경계 조직에서 예방 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 글리코겐 축적은 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직에서 예방 또는 감소될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(또는 예를 들어 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하여 본원에 기재된 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 임의의 조성물)을 대상체에 투여하여 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 뉴클레아제 작용제 없이 투여될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 표적 게놈 유전자좌 내로의 통합 없이 다중 도메인 치료적 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 경우). 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원에 기재된 뉴클레아제 작용제와 함께(예를 들어, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 표적 유전자) 내의 뉴클레아제 표적 서열을 절단할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함). 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합 시 표적 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 이는 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 뉴클레아제 작용제는 CRISPR/Cas 시스템이고, 표적 유전자는 ALB(예를 들어, ALB의 인트론 1)이다. 이러한 방법에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합할 수 있고, Cas 단백질을 ALB 유전자의 인트론 1의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화할 수 있고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적을 절단할 수 있고, 핵산 작제물은 ALB 유전자 내로 삽입되어 변형된 ALB 유전자를 생성할 수 있고, 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 ALB 유전자로부터 발현될 수 있다(예를 들어, 치료적으로 유효한 수준의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA가 대상체에서 달성되도록 함).
일부 방법에서, 치료적 유효량의 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함하는 조성물 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물과 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)의 조합이 대상체에 투여된다. 치료적 유효량은 투여될 때 소기의 효과를 생성하는 양이다. 정확한 양은 치료의 목적에 따라 좌우될 것이며, 알려진 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다. 예를 들어, 문헌[Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding]을 참조한다. 특정 예에서, 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준이 치료적으로 유효한 것으로 간주되고 근육 내 글리코겐 저장의 완전한 보정에 해당한다.
본원에 개시된 조성물을 포함하는 치료적 또는 약학적 조성물은 제형에 혼입되는 적합한 캐리어, 부형제, 및 기타 작용제와 함께 투여되어 개선된 전이, 전달, 내성 등을 제공할 수 있다. 다수의 적절한 제형은 모든 약학적 화학자에 알려진 처방집에서 확인될 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]. 또한 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311]을 참조한다. 특정한 실시형태에서, 약학적 조성물은 비-발열성이다.
본원에 개시된 조성물은 GAA 결핍 또는 폼페병의 하나 이상의 증상의 중증도를 완화시키거나 예방하거나 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 이러한 증상은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재되어 있다.
상기 방법 중 임의의 것에서 대상체는 GAA 결핍 또는 폼페병의 개선 또는 치료를 필요로 하는 대상체일 수 있다. 상기 방법 중 임의의 것에서 대상체는 진핵생물 또는 포유류와 같은 임의의 적합한 종으로부터 것일 수 있다. 포유류는 예를 들어 비-인간 포유류, 인간, 설치류, 랫트, 마우스, 또는 햄스터일 수 있다. 다른 비-인간 포유류는 예를 들어 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이 및 잔나비를 포함한다. 용어 "비-인간"은 인간을 제외한다. 적합한 종의 특정 예는 인간, 설치류, 마우스, 랫트, 및 비-인간 영장류를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 특정 예에서, 대상체는 인간이다. 일부 방법에서, 대상체는 신생아 대상체일 수 있다. 다른 방법에서, 대상체는 신생아 대상체가 아니다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 유전적으로 통합되는 방법에서, 유전자를 발현할 수 있는 임의의 표적 게놈 유전자좌, 예컨대 세이프 하버 유전자좌(세이프 하버 유전자) 또는 내인성 GAA 유전자좌가 사용될 수 있다. 이러한 유전자좌는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재되어 있다. 특정 예에서, 표적 게놈 유전자좌는 내인성 ALB 유전자좌, 예컨대 내인성 인간 ALB 유전자좌일 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 내인성 ALB 유전자좌의 인트론 1에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 이어서, 내인성 ALB 엑손 1은 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스될 수 있다.
표적 게놈 유전자좌 및 특히 내인성 ALB 유전자좌 내로의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 표적화된 삽입은 다수의 이점을 부여한다. 이러한 방법은 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 안정한 장기적 발현을 가능하게 하는 안정한 변형을 수득한다. ALB 유전자좌와 관련하여, 이러한 방법은 치료적으로 유효한 수준의 발현을 달성하기 위해 내인성 ALB 프로모터 및 조절 영역을 활용할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 프로모터가 없는 유전자를 포함할 수 있고, 삽입된 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, ALB 유전자좌)의 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 내인성 프로모터의 사용은 이것이 핵산 작제물에서 프로모터를 포함할 필요성을 배제하여, 보통 (예를 들어, AAV에서) 효율적으로 패키징할 수 없는 더 큰 전이유전자의 패키징을 가능하게 하기 때문에 이롭다. 대안적으로, 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은 핵산 작제물의 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 유형의 예는 본원의 다른 곳에 개시된다.
선택적으로, 표적 게놈 유전자좌의 내인성 유전자(예를 들어, 내인성 ALB 유전자) 중 일부 또는 전부는 핵산 작제물로부터 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열의 삽입 시 발현될 수 있다. 대안적으로, 일부 방법에서, 표적 게놈 유전자좌의 내인성 유전자 중 어느 것도 발현되지 않는다. 일례로, 핵산 작제물의 통합 후 변형된 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 변형된 ALB 유전자좌)는 내인성 분비 신호(예를 들어, 알부민 분비 신호) 및 핵산 작제물에 의해 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩할 수 있다. 또 다른 예에서, ALB 유전자좌의 제1 인트론이 표적화될 수 있다. ALB의 분비 신호 펩타이드는 ALB 유전자의 엑손 1에 의해 인코딩된다. 이러한 시나리오에서, 스플라이스 수용체 및 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 보유하는 프로모터가 없는 카세트는 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 및 분비를 지원할 것이다. 내인성 ALB 엑손 1과 통합된 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열 사이의 스플라이싱은 통합된 핵산 작제물에 의해 인코딩된 다중 도메인 치료적 단백질 서열에 작동 가능하게 연결된 엑손 1에 의해 인코딩된 내인성 ALB 서열을 포함하는 키메라 mRNA 및 단백질을 생성한다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 상동성 재조합(HR) 및 비-상동성 말단 접합(NHEJ)을 포함하는 임의의 수단에 의해 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 NHEJ에 의해 삽입된다(예를 들어, 상동성 아암을 포함하지 않고, NHEJ에 의해 삽입됨).
또 다른 특정 예에서, 핵산 작제물은 상동성-독립적 표적화된 통합(예를 들어, 방향성 상동성-독립적 표적화된 통합)을 통해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물의 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열은, 각각의 측면 상에 뉴클레아제 작용제에 대한 표적 부위(예를 들어, 표적 게놈 유전자좌에서와 동일한 표적 부위 및 동일한 뉴클레아제 작용제가 표적 게놈 유전자좌의 표적 부위를 절단하는 데 사용됨)에 의해 플랭킹될 수 있다. 이어서, 뉴클레아제 작용제는, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위를 절단할 수 있다. 특정 예에서, 핵산 작제물은 AAV-매개 전달에 의해 전달되고, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위의 절단은 AAV의 역말단 반복부(ITR)를 제거할 수 있다. IRT의 제거는 성공적인 표적화를 평가하는 것을 더 쉽게 만들 수 있는데, 이는 ITR의 존재가 반복된 서열로 인해 시퀀싱 노력을 방해할 수 있기 때문이다. 일부 방법에서, 표적 게놈 유전자좌의 표적 부위(예를 들어, 플랭킹하는 프로토스페이서 인접 모티프를 포함하는 gRNA 표적 서열)는 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌 내로 올바른 배향으로 삽입되는 경우, 더 이상 존재하지 않지만, 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 표적 게놈 유전자좌 내로 반대 배향으로 삽입되는 경우, 재형성된다. 이는 다중 도메인 치료적 단백질 코딩 서열이 발현을 위해 올바른 배향으로 삽입되도록 도울 수 있다.
상기 방법 중 임의의 것에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 동시에 투여되거나, 동시에 투여되지 않을 수 있다(예를 들어, 임의의 조합으로 순차적으로). 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 및 뉴클레아제 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에서, 이들은 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 전에, 뉴클레아제 작용제 후에, 또는 뉴클레아제 작용제와 동시에 투여될 수 있다. 핵산 작제물 및 뉴클레아제 작용제를 세포에 투여하는 임의의 적합한 방법, 특히 간에 투여하는 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법의 예는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재되어 있다. 치료 방법 또는 대상체의 생체내 세포를 표적화하는 방법에서, 핵산 작제물은 대상체의 특정 유형의 세포에 삽입될 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 및/또는 뉴클레아제 작용제를 대상체 내로 도입하기 위한 방법 및 비히클은 표적화되는 대상체의 세포 유형에 영향을 미칠 수 있다. 일부 방법에서, 예를 들어, 핵산 작제물은 간 세포, 예컨대 헤파토사이트의 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 내인성 ALB 유전자좌) 내로 삽입된다. 이러한 작제물 및 뉴클레아제 작용제를 대상체에 도입하기 위한 방법 및 비히클(지질 나노입자-매개 전달 및 AAV-매개 전달(예를 들어, rAAV8-매개 전달) 및 정맥내 주사와 같은 간 또는 헤파토사이트를 표적화하는 방법 및 비히클 포함)은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 개시된다.
핵산 작제물(또는 벡터 또는 LNP) 및 뉴클레아제 작용제를 포함하는 조성물이 투여되는 방법(즉, 핵산 작제물(또는 벡터 또는 LNP) 및 뉴클레아제 작용제가 둘 모두 투여되는 방법)에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 작용제는 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 작용제는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 후에 투여될 수 있거나, 뉴클레아제 작용제는 핵산 작제물 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 작용제는 핵산 작제물의 투여 전 또는 후 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 48시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 2시간 내지 약 6시간, 약 3시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간 내지 약 48시간에 투여될 수 있다.
일례에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제를 투여하기 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 1주 전에 투여된다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제를 투여하기 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 1일, 적어도 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 또는 적어도 약 1주 전에 투여된다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물을 뉴클레아제 작용제를 투여하기 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 7일, 약 6일 내지 약 7일, 또는 약 1일 내지 약 3일 전에 투여된다.
일례에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제를 투여한지 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 1주 후에 투여된다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제를 투여한지 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 1일, 적어도 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 또는 적어도 약 1주 후에 투여된다. 또 다른 예에서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제를 투여한지 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 7일, 약 6일 내지 약 7일, 또는 약 1일 내지 약 3일 후에 투여된다.
상기 방법 중 임의의 것에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 및 뉴클레아제 작용제(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)는 임의의 적합한 전달 시스템 및 알려진 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 뉴클레아제 작용제 성분 및 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물(예를 들어, 가이드 RNA, Cas 단백질, 및 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물)은 적절한 동일하거나 상이한 전달 방법을 사용하여 개별적으로 또는 임의의 조합으로 함께 전달될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템이 사용되는 방법에서, 가이드 RNA는 예를 들어 RNA 형태(예를 들어, 시험관내 전사된 RNA, 예컨대 본원에 개시된 변형된 가이드 RNA) 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 형태로 대상체 또는 세포에 도입 또는 투여될 수 있다. DNA 형태로 도입될 때, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 세포 또는 대상체의 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 AAV를 통해 전달되고 U6 프로모터 하에 생체내에서 발현될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 작제물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 작제물은 단일 핵산 분자의 성분일 수 있다. 대안적으로, 이들은 둘 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다(즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 인코딩하는 DNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 핵산 분자의 성분일 수 있음).
마찬가지로, Cas 단백질은 임의의 형태로 대상체 또는 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대, RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)), 예컨대 본원에 개시된 변형된 mRNA, 또는 DNA 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈으로 치환하도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산이 세포 또는 대상체 내로 도입될 때, Cas 단백질은 세포 또는 대상체의 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
일례에서, Cas 단백질은 mRNA(예를 들어, 본원에 개시된 변형된 mRNA) 형태로 도입되고, 가이드 RNA는 본원에 개시된 변형된 gRNA와 같은 RNA 형태로 도입된다(예를 들어, 동일한 지질 나노입자 내에 함께). 가이드 RNA는 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 변형될 수 있다. 마찬가지로, Cas mRNA는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 변형될 수 있다.
다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물이 유전자 편집 시스템(예를 들어, Cas 단백질)에 의한 절단 후에 삽입되는 방법에서, 유전자 편집 시스템(예를 들어, Cas 단백질)은 표적 게놈 유전자좌를 절단하여 단일 가닥 파단부(닉) 또는 이중 가닥 파단부를 생성할 수 있고, 절단된 또는 닉킹된 유전자좌는 비-상동성 단부 접합(NHEJ)-매개 삽입 또는 상동성-인도 복구를 통한 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물의 삽입에 의해 복구될 수 있다. 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물에 의한 복구는 가이드 RNA 표적 서열(들)을 제거하거나 방해하여, 표적화되었던 대립유전자가 CRISPR/Cas 시약에 의해 재-표적화될 수 없도록 할 수 있다.
본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있고, 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 이들은 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 노출된 핵산일 수 있거나 바이러스, 예컨대 AAV에 의해 전달될 수 있다. 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 AAV를 통해 전달될 수 있고, 표적 게놈 유전자좌(예를 들어, 세이프 하버 유전자, ALB 유전자, 또는 ALB 유전자의 인트론 1) 내로 비-상동성 단부 접합에 의해 삽입될 수 있다(예를 들어,다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는 것일 수 있음).
일부 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 비-상동성 단부 접합에 의해 삽입될 수 있다. 일부 경우, 이러한 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 예를 들어, 이러한 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 Cas 단백질에 의한 절단 후 평활 단부 이중 가닥 파단부 내로 삽입될 수 있다. 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 AAV를 통해 전달될 수 있고, 비-상동성 단부 접합에 의해 삽입될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는 것일 수 있음).
또 다른 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 상동성-독립적 표적화된 통합을 통해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은, 각각의 측면 상에 가이드 RNA 표적 서열(예를 들어, 표적 게놈 유전자좌에서와 동일한 표적 부위 및 CRISPR/Cas 시약(Cas 단백질 및 가이드 RNA)이 표적 게놈 유전자좌의 표적 부위를 절단하는 데 사용됨)에 의해 플랭킹될 수 있다. 이어서, Cas 단백질은, 핵산 삽입물을 플랭킹하는 표적 부위를 절단할 수 있다. 특정 예에서, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 AAV-매개 전달에 의해 전달되고, 핵산 삽입물을 플랭킹하는 표적 부위의 절단은 AAV의 역말단 반복부(ITR)를 제거할 수 있다. 일부 방법에서, 표적 게놈 유전자좌의 표적 부위(예를 들어, 플랭킹하는 프로토스페이서 인접 모티프를 포함하는 가이드 RNA 표적 서열)는 핵산 삽입물이 표적 게놈 유전자좌 내로 올바른 배향으로 삽입되는 경우, 더 이상 존재하지 않지만, 핵산 삽입물이 표적 게놈 유전자좌 내로 반대 배향으로 삽입되는 경우, 재형성된다.
본원에 개시된 방법은 대상체(예를 들어, 동물 또는 포유류, 예컨대 인간) 또는 세포에 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물 및 선택적으로 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA), 단백질, 또는 핵산-단백질 복합체의 형태를 포함하는 CRISPR/Cas 시약과 같은 뉴클레아제 작용제를 도입 또는 투여하는 단계를 포함할 수 있다. "도입" 또는 "투여"는 세포 내부 또는 대상체 내 세포의 내부로의 접근을 획득하는 방식으로 세포 또는 대상체에 분자(들)(예를 들어, 핵산(들) 또는 단백질(들))를 제시하는 것을 포함한다. 도입은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 둘 이상의 성분(예를 들어, 성분 중 2개 또는 모든 성분)은 동시에 또는 임의의 조합으로 순차적으로 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 가이드 RNA의 도입 전에 세포 또는 대상체 내로 도입될 수 있거나, Cas 단백질은 가이드 RNA의 도입 후에 도입될 수 있다. 또 다른 예로, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 전에 도입될 수 있거나, 이는 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 후에 도입될 수 있다(예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물은 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 전 또는 도입 후 약 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 또는 72시간에 투여될 수 있음). 예를 들어, 미국 특허 US 2015/0240263호 및 미국 특허 US 2015/0110762호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 또한, 둘 이상의 성분은 동일한 전달 방법 또는 상이한 전달 방법에 의해 세포 또는 대상체 내로 도입될 수 있다. 유사하게는, 둘 이상의 성분은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 대상체 내로 도입될 수 있다.
가이드 RNA는 예를 들어 RNA(예를 들어, 시험관내 전사된 RNA) 형태 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 형태로 대상체 또는 세포 내로 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 변형될 수 있다. DNA 형태로 도입될 때, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 세포 또는 대상체의 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 AAV를 통해 전달되고 U6 프로모터 하에 생체내에서 발현될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 작제물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 작제물은 단일 핵산 분자의 성분일 수 있다. 대안적으로, 이들은 둘 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다(즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 인코딩하는 DNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 핵산 분자의 성분일 수 있음).
마찬가지로, Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA 형태로 제공될 수 있다. Cas RNA는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 변형될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈으로 치환하도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산이 세포 또는 대상체 내로 도입될 때, Cas 단백질은 세포 또는 대상체의 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
Cas 단백질 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산은 발현 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 관심 유전자 또는 다른 핵산 서열(예를 들어, Cas 유전자)의 발현을 유도할 수 있고, 이러한 관심 핵산 서열을 표적 세포로 전이할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 내에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이는 하나 이상의 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터와 별개인 벡터 또는 플라스미드 내에 존재할 수 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 예를 들어 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 만능 세포, 배아 줄기(ES)세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포, 유도 만능 줄기(iPS)세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 헤파토사이트와 같은 간 세포에서 활성일 수 있다. 이러한 프로모터는 예를 들어 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 하나의 방향에서 Cas 단백질의 발현과 다른 방향에서 가이드 RNA의 발현을 둘 모두 유도하는 양방향 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소를 함유하는 완전한 종래의 일방향 Pol III 프로모터: 원위부 서열 요소(DSE), 근위부 서열 요소(PSE), 및 TATA 박스; 및 (2) 역배향에서 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스 및 PSE를 포함하는 제2 기본 Pol III 프로모터로 구성될 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 U6 프로모터로부터 유래된 TATA 박스 및 PSE를 부착하여 역방향의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성이 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 2016/0074535호를 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. Cas 단백질 및 가이드 RNA를 동시에 인코딩하는 유전자를 발현하기 위한 양방향 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하는 컴팩트한 발현 카세트가 발생하도록 한다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 인간에서의 사용을 위해서 규제 기관에 의해 용인된다. 특정한 실시형태에서, 프로모터는 간 세포에서의 발현을 유도한다.
대상체 또는 세포 내로 도입되는 분자(예를 들어, Cas 단백질 또는 가이드 RNA 또는 인코딩 핵산)는 도입되는 분자의 안정성을 증가시키는(예를 들어, 소정의 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃, 또는 주위 온도) 하에서 분해 생성물이 역치 미만, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만으로 유지되는 기간을 연장시키거나; 생체내 안정성을 증가시키는) 캐리어를 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 캐리어의 비제한적인 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락틱-코글리콜릭-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 마이셀, 역마이셀, 지질 코킬레에이트, 및 지질 미세소관을 포함한다.
다양한 방법 및 조성물이 세포 또는 대상체 내로의 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 도입을 가능하게 하기 위해 본원에 제공된다. 분자를 다양한 세포 유형 내로 도입하는 방법은 알려져 있고, 예를 들어 안정한 형질감염 방법, 일시적인 형질감염 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함한다.
형질감염 프로토콜뿐만 아니라 분자를 세포 내로 도입하는 프로토콜은 달라질 수 있다. 비제한적 형질감염 방법은 리포솜; 나노입자; 인산칼슘(문헌[Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (4):1590-4], 및 문헌[Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97]); 덴드리머; 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체를 사용하는 화학 기반 형질감염 방법을 포함한다. 비-화학적 방법은 전기천공, 초음파-천공(sonoporation), 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자-기반 형질감염은 유전자 총 또는 자기-보조 형질감염의 사용을 포함한다(문헌[Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277--28]). 바이러스 방법이 또한 형질감염에 사용될 수 있다.
세포 내로의 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 전기천공에 의해, 세포질내 주사에 의해, 바이러스 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 아데노 관련 바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 형질감염에 의해, 지질-매개 형질감염에 의해, 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질이 세포질뿐만 아니라 핵막을 통해 핵 내로도 전달되게 할 수 있는 개선된 전기천공 기술이다. 또한, 본원에 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 일반적인 전기천공보다 훨씬 더 적은 세포가 필요하다(예를 들어, 일반적인 전기천공에 의한 7백만개와 비교하여 단지 약 2백만개). 일례에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.
세포(예를 들어, 접합체) 내로의 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)의 도입은 또한 미량주사법에 의해 달성될 수 있다. 접합체(즉, 단세포 단계 배아)에서, 미량주사법은 모체 및/또는 부체 전핵 내로 또는 세포질 내로 수행될 수 있다. 미량주사법이 단지 하나의 전핵 내로 수행되는 경우, 부체 전핵이 이의 더 큰 크기로 인해 바람직하다. mRNA의 미량주사법은 바람직하게는 세포질 내로 수행되는 한편,(예를 들어, mRNA를 번역 기구에 직접 전달하기 위해), Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하거나 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 미량주사법은 바람직하게는 핵/전핵 내로 수행된다. 대안적으로, 미량주사법은 핵/전핵과 세포질 둘 모두 내로 주사하여 수행될 수 있으며: 우선 바늘이 핵/전핵 내로 도입되고 제1 양이 주사될 수 있고, 바늘을 단세포 단계 배아로부터 제거하면서 제2 양이 세포질 내로 주사될 수 있다. Cas 단백질이 세포질 내로 주사되는 경우, Cas 단백질은 바람직하게는 핵/전핵으로 전달되도록 핵 위치 신호를 포함한다. 미량주사법을 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)]을 참조하고; 또한 문헌[Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:15022-15026] 및 문헌[Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:9354-9359]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질)를 세포 또는 대상체 내로 도입하기 위한 다른 방법은 예를 들어 벡터 전달, 입자-매개 전달, 엑소좀-매개 전달, 지질 나노입자-매개 전달, 세포 침투 펩타이드-매개 전달, 또는 이식 가능 장치-매개 전달을 포함할 수 있다. 특정 예로, 핵산 또는 단백질은 캐리어, 예컨대 폴리(락트산)(PLA), 미소구체, 폴리(D,L-락틱-코글리콜릭-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 마이셀, 역마이셀, 지질 코킬레이트(cochelate), 또는 지질 미세소관에서 세포 또는 대상체 내로 도입될 수 있다. 대상체로의 전달의 일부 특정 예는 유체역학적 전달, 바이러스-매개 전달(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV)-매개 전달), 및 지질 나노입자-매개 전달을 포함한다.
세포 또는 대상체 내로의 핵산 및 단백질의 도입은 유체역학적 전달(HDD)에 의해 달성될 수 있다. 실질 세포로의 유전자 전달을 위해, 필수적인 DNA 서열만 선택된 혈관을 통해 주사될 필요가 있으며, 현재의 바이러스 및 합성 벡터와 관련된 안전성 우려를 해소할 수 있다. 혈류 내로 주사될 때, DNA는 혈액에 접근 가능한 여러가지 조직 내의 세포에 도달할 수 있다. 유체역학적 전달은 큰 부피의 용액을 순환하는 비압축성 혈액 내로 신속하게 주사함으로써 발생되는 힘을 이용하여, 크고 막-불투과성인 화합물이 실질 세포에 진입하는 것을 방지하는 내피 및 세포막의 물리적 장벽을 극복한다. DNA 전달 외에도, 이 방법은 생체내에서 RNA, 단백질, 및 다른 작은 화합물의 효율적인 세포내 전달에 유용하다. 예를 들어, 문헌[Bonamassa et al. (2011) Pharm. Res. 28(4):694-701]을 참조하며, 이는 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
핵산의 도입은 또한 바이러스-매개 전달, 예컨대 AAV-매개 전달 또는 렌티바이러스-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분열 세포, 비-분열 세포, 또는 분열 세포와 비-분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있거나, 대안적으로는 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 이러한 바이러스는 또한 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-적격일 수 있거나 복제-결함(예를 들어, 추가적인 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 하나 이상의 유전자가 결함됨)일 수 있다. 바이러스는 일시적 발현 또는 더 길게 지속하는 발현을 유발할 수 있다. 바이러스 벡터는 이들의 야생형 대응물로부터 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 용이하게 하거나 벡터의 하나 이상의 특성이 변경되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성은 패키징 수용력, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사, 및 번역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 바이러스 게놈 일부가 결실될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 예에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응이 감소될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 서열의 숙주 게놈 내로의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예컨대, 인테그라제)는 바이러스가 비-통합되도록 돌연변이될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 벡터는 벡터 상의 코딩 서열의 발현을 유도하기 위해 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이러스는 헬퍼-의존적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 벡터를 바이러스 입자 내로 증폭 및 패키징하는 데 필요한 바이러스 성분(예컨대, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 바이러스 성분을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분이 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단 내로 도입될 수 있다. 다른 예에서, 바이러스는 무-헬퍼일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭 및 패키징할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 성분을 인코딩할 수 있다.
예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/mL를 포함한다. 다른 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012 내지 약 1016 vg/(체중 kg)을 포함한다.
핵산 및 단백질의 도입은 또한 지질 나노입자(LNP)-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, LNP-매개 전달은 Cas mRNA와 가이드 RNA의 조합 또는 Cas 단백질과 가이드 RNA의 조합을 전달하는 데 사용될 수 있다. LNP-매개 전달은 RNA 형태의 가이드 RNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질은 각각 동일한 LNP의 LNP-매개 전달을 통해 RNA 형태로 도입된다. 본원 다른 곳에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 RNA는 변형될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 하나 이상의 안정화 단부 변형을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결부 또는 5' 단부 및/또는 3' 단부에서 하나 이상의 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, Cas mRNA 변형은 유사우리딘으로의 치환(예를 들어, 유사우리딘으로 완전히 치환됨), 5' 캡, 및 폴리아데닐화를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, Cas mRNA 변형은 N1-메틸-유사우리딘으로의 치환(예를 들어, N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환됨), 5' 캡, 및 폴리아데닐화를 포함할 수 있다. 다른 변형이 또한 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 고려된다. 이러한 방법을 통한 전달은 일시적으로 Cas를 발현하고/하거나 가이드 RNA가 일시적으로 존재하도록 할 수 있으며, 생분해성 지질은 청소율을 향상시키고, 내약성을 향상시키고, 면역원성을 감소시킨다. 지질 제형은 이들의 세포 흡수를 개선하면서 생물학적 분자를 분해로부터 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 미소구체(단층 및 다층 소포, 예를 들어 리포솜 포함), 에멀젼 중 분산상, 마이셀, 또는 현탁액 중 내부상을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전달을 위해 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제형은 다가음이온, 예컨대 핵산을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질(즉, 비하전된 또는 양쪽성 지질), 음이온성 지질, 형질감염을 향상시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스 지질이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는 예를 들어 국제공개 WO 2016/010840 A1호 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호에서 확인할 수 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 예시적인 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일례에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤 및 중성 지질, 예컨대, DSPC를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤, 선택적인 중성 지질, 예컨대 DSPC, 및 스텔스 지질, 예컨대 S010, S024, S027, S031, 또는 S033을 포함할 수 있다.
LNP는 다음 중 하나 이상 또는 전부를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 헬퍼 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예를 들어, 문헌[Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 특정한 LNP에서, 카고는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 특정한 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 방법에 사용하기 위한 LNP는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재되어 있다.
전달 모드는 면역원성을 감소시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질 및 gRNA는 상이한 모드에 의해 전달될 수 있다(예를 들어, 바이모달 전달). 이들 상이한 모드는 대상체에게 전달되는 분자(예를 들어, Cas 또는 인코딩 핵산, gRNA 또는 인코딩 핵산, 또는 다중 도메인 치료적 단백질 핵산 작제물)에 대해 상이한 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 상이한 모드는 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 상이한 시간적 분포를 수득할 수 있다. 일부 전달 모드(예를 들어, 세포에서 자율 복제 또는 게놈 통합에 의해 지속되는 핵산 벡터의 전달)는 분자의 보다 지속적인 발현 및 존재를 수득하는 반면, 다른 모드의 전달은 일시적이고 덜 지속적이다(예를 들어, RNA 또는 단백질의 전달). 예를 들어, Cas 단백질의 보다 일시적인 방식, 예를 들어 mRNA 또는 단백질로서의 전달은 Cas/gRNA 복합체가 단지 단기간 동안 존재하고 활성이도록 하고, MHC 분자에 의해 세포의 표면 상에 제시되는 세균-유래 Cas 효소로부터의 펩타이드에 의해 유발되는 면역원성을 감소시킬 수 있다. 이러한 일시적인 전달은 또한 표적-외 변형의 가능성을 감소시킬 수 있다.
생체내 투여는 예를 들어 전신 투여 경로, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 피하, 동맥내, 또는 근육내를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 특정 예에서, 생체내 투여는 정맥내 투여이다.
가이드 RNA 및/또는 Cas 단백질을 포함하는 조성물(또는 가이드 RNA 및/또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산)은 하나 이상의 생리학적으로 그리고 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 희석제, 부형제, 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 좌우될 수 있다. 약학적으로 허용 가능하다는 것은 캐리어, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제형의 다른 구성성분과 상용성이고 이의 수용자에게 실질적으로 유해하지 않음을 의미한다. 특정 예에서, 투여 경로 및/또는 제형의 경로 또는 간(예를 들어, 헤파토사이트)으로의 전달을 위해 선택된다.
본원에 개시된 방법은 세포 또는 대상체(예를 들어, 대상체에서 순환 혈청 또는 혈장 수준)에서 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 단백질 수준 및/또는 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 활성 수준을 증가시킬 수 있고, 세포 또는 대상체(예를 들어, 대상체에서 순환 혈청 또는 혈장 수준)에서 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 단백질 수준 및/또는 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 활성 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일례에서, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 방법은 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. 방법은 또한 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질 활성 또는 GAA 활성을 증가시킬 수 있다. 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 활성 수준은 잘 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 방법에서, 대상체에서의 GAA 활성 및/또는 발현 수준은 정상 수준의 약 또는 적어도 약 2%, 약 또는 적어도 약 10%, 약 또는 적어도 약 25%, 약 또는 적어도 약 40%, 약 또는 적어도 약 50%, 약 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 100% 이상으로 증가된다. 일부 방법에서, 대상체에서의 GAA 활성 및/또는 발현 수준은 정상 수준의 약 또는 적어도 약 40%, 약 또는 적어도 약 50%, 약 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 100% 이상으로 증가된다. 특정한 실시형태에서, 발현 또는 활성 수준은 GAA 기능 손실의 징후 또는 증상이 존재하는 세포 또는 조직에서 측정된다. 예를 들어, 기능 손실이 근육 기능장애를 초래할 때, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 수준 또는 활성은 근육 세포에서 측정된다. 외인성 단백질에 따라, 다중 도메인 치료적 단백질의 활성 수준은 중량을 기준으로 자연 GAA 단백질과 1:1에 필적하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 실시형태에서, 다중 도메인 치료적 단백질 및 자연 GAA의 상대적 활성은 비교될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 기능 손실이 거의 완전하여 상대적 활성이 결정될 수 없도록 한다. 특정한 실시형태에서, 비교는 적절한 대조군 대상체에 대해 이루어진다. 적절한 대조군 대상체의 선택은 당업자의 능력 내에 있다. 특정한 실시형태에서, 발현 수준은 GAA 기능 손실로부터 비롯된 적어도 하나의 징후 또는 증상을 치료하기에 충분하다. GAA 활성은 임의의 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, GAA 활성(또는 활성 결핍)을 평가하기 위해, 혈액 기반 검정이 건조된 혈액 스팟 또는 신선한 혈액에서 GAA 활성을 측정할 수 있다. GAA 활성은 또한 피부 생검 또는 근육 생검으로부터의 섬유아세포에서 측정될 수 있다. 다른 2차 척도는 질량분석기에 의해 소변의 글루코스 사당류를 측정하는 것일 수 있다.
일부 방법에서, 순환 다중 도메인 치료적 단백질 수준(즉, 혈청 수준)은 약 또는 적어도 약 0.5, 약 또는 적어도 약 1, 약 또는 적어도 약 2, 약 또는 적어도 약 3, 약 또는 적어도 약 4, 약 또는 적어도 약 5, 약 또는 적어도 약 6, 약 또는 적어도 약 7, 약 또는 적어도 약 8, 약 또는 적어도 약 9, 또는 약 또는 적어도 약 10 ㎍/mL이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 수준은 적어도 약 1 ㎍/mL 또는 약 1 ㎍/mL이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 수준은 적어도 약 2 ㎍/mL 또는 약 2 ㎍/mL이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 수준은 적어도 약 5 ㎍/mL 또는 약 5 ㎍/mL이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 수준은 약 1 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 3 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL이다. 예를 들어, 방법은 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL 또는 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 다중 도메인 치료적 단백질 수준을 수득할 수 있다. 예를 들어, 방법은 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 다중 도메인 치료적 단백질 수준을 수득할 수 있다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 1개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 2개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 3개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 4개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 5개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 6개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 9개월차이다. 일부 실시형태에서, 열거된 발현 수준은 투여 후 적어도 12개월차이다.
일부 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 발현 및/또는 활성(즉, 투여 전 발현 및/또는 활성)에 비해 GAA 또는 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 일부 방법에서, 방법은 대상체의 기준선 발현 및/또는 활성(즉, 투여 전 발현 및/또는 활성)에 비해 GAA의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 일부 방법에서, 대상체에서의 GAA 활성 및/또는 GAA 발현 또는 혈청 수준은 투여 전 대상체의 GAA 발현 또는 혈청 수준 및/또는 활성(예를 들어, GAA 활성)(즉, 대상체의 기준선 수준)과 비교하여 약 또는 적어도 약 10%, 약 또는 적어도 약 25%, 약 또는 적어도 약 50%, 약 또는 적어도 약 75%, 약 또는 적어도 약 100%만큼 증가된다. 다중 도메인 치료적 단백질에 따라, 다중 도메인 치료적 단백질의 활성 수준은 중량을 기준으로 자연 단백질과 1:1에 필적하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 실시형태에서, 다중 도메인 치료적 단백질 및 자연 GAA의 상대적 활성은 비교될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 기능 손실이 거의 완전하여 상대적 활성이 결정될 수 없도록 한다. 특정한 실시형태에서, 발현 수준은 GAA 기능 손실로부터 비롯된 적어도 하나의 징후 또는 증상을 치료하기에 충분하다.
일부 방법에서, 방법은 세포의 기준선 발현 및/또는 활성(즉, 투여 전 발현 및/또는 활성)에 대해 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 일부 방법에서, 방법은 세포의 기준선 발현 및/또는 활성(즉, 투여 전 발현 및/또는 활성)에 대해 GAA의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 일부 방법에서, 세포 또는 세포 집단(예를 들어, 간 세포 또는 헤파토사이트)에서의 GAA 활성 및/또는 발현 수준은 투여 전 대상체의 GAA 활성 및/또는 발현 수준(즉, 대상체의 기준선 수준)과 비교하여 약 또는 적어도 약 10%, 약 또는 적어도 약 25%, 약 또는 적어도 약 50%, 약 또는 적어도 약 75%, 약 또는 적어도 약 100%만큼 증가된다. 다중 도메인 치료적 단백질에 따라, 다중 도메인 치료적 단백질의 활성 수준은 중량을 기준으로 자연 GAA 단백질과 1:1에 필적하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 실시형태에서, 다중 도메인 치료적 단백질 및 자연 GAA 단백질의 상대적 활성은 비교될 수 있다. 특정한 실시형태에서, GAA 기능 손실이 거의 완전하여 상대적 활성이 결정될 수 없도록 한다. 특정한 실시형태에서, 발현 수준은 GAA 기능 손실로부터 비롯된 적어도 하나의 징후 또는 증상을 치료하기에 충분하다.
특정 예에서, 대상체에서 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 300% 이하, 약 250% 이하, 약 200% 이하, 또는 약 150% 이하로 증가된다.
특정 예에서, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%로 증가된다. 특정 예에서, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%로 증가된다. 특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 또는 비-전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 2% 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%(예를 들어, 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%)로 증가된다. 특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 또는 비-전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 2% 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%(예를 들어, 정상 GAA 활성 수준의 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%)로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 1% 초과, 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과로 증가된다. 특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 또는 비-전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 2% 초과, 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과(예를 들어, 정상 GAA 활성 수준의 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과)로 증가된다. 특정 예에서, 대상체는 유아 발병 폼페병(예를 들어, 전통적 또는 비-전통적 유아 발병 폼페병)을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과로 증가된다.
특정 예에서, 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 대상체에서의 GAA 활성 수준은 정상 GAA 활성 수준의 약 2% 초과, 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과(예를 들어, 정상 GAA 활성 수준의 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 100% 초과)로 증가된다.
일부 방법에서, 방법은 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체(예를 들어, 신생아 대상체)에서의 다중 도메인 치료적 단백질 발현을 증가시킨다. 일부 방법에서, 방법은 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체(예를 들어, 신생아 대상체)에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 증가시킨다.
일부 방법에서, 방법은 대상체(예를 들어, 신생아 대상체)의 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 기준선 발현 또는 활성에 대해 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 활성을 증가시킨다(즉, 전형적 오차 바보다 큰 임의의 발현 변화 퍼센트). 일부 방법에서, 방법은 0 초과의 검출 가능한 수준, 예를 들어 통계적으로 유의한 수준, 임상적으로 적절한 수준으로 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA를 발현시킨다.
일부 방법은 적어도 8주, 적어도 24주, 예를 들어 적어도 1년 또는 선택적으로 적어도 2년 효과 및 일부 실시형태에서 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 효과와 같이 인간에서 영속적 또는 지속적인 효과를 달성하는 것을 포함한다. 일부 방법은 적어도 8주, 적어도 24주, 예를 들어 적어도 1년 또는 선택적으로 적어도 2년 효과 및 일부 실시형태에서, 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 효과와 같이 영속적 그리고 지속적인 방식으로 인간에서 치료 효과를 달성하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 인간에서 증가된 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 활성 및/또는 발현 수준은 적어도 8주, 적어도 24주, 예를 들어 적어도 1년, 선택적으로 적어도 2년 및 일부 실시형태에서, 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 안정하다. 일부 방법에서, 인간에서 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 정상 상태 활성 및/또는 수준은 적어도 7일, 적어도 14일, 또는 적어도 28일, 선택적으로 적어도 56일, 적어도 80일, 또는 적어도 96일만큼 달성된다. 추가적인 방법에서, 방법은 인간에서 단일 용량 후에 적어도 8주, 적어도 16주, 또는 적어도 24주 또는 일부 실시형태에서, 적어도 1년, 또는 적어도 2년, 선택적으로 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA 활성 및/또는 수준을 유지하는 것을 포함한다. 예를 들어, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현은 치료 후 적어도 약 8주, 적어도 약 12주, 적어도 약 24주, 특정 실시형태에서, 적어도 약 1년, 또는 적어도 약 2년 및 일부 실시형태에서, 치료 후 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 인간 대상체에서 지속될 수 있다. 마찬가지로, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 활성은 치료 후 적어도 약 8주, 적어도 약 12주, 적어도 약 24주, 특정 실시형태에서, 적어도 약 1년, 또는 적어도 약 2년 및 일부 실시형태에서, 치료 후 적어도 3년, 적어도 4년, 또는 적어도 5년 동안 인간 대상체에서 지속될 수 있다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 활성은 치료 전 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 활성(즉, 대상체의 기준선)보다 더 높은 수준으로 유지된다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 활성은 치료적으로 유효한 수준의 발현 또는 활성으로 유지되는 경우 지속된 것으로 간주된다. 다른 유기체에서, 상대적인 기간은 예를 들어 수명 및 발달 단계를 기반으로 이해되고, 상기 개시내용 내에 포함된다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현 또는 활성은 투여 후 6개월차, 투여 후 1년차, 또는 투여 후 2년차에 인간에서 발현 또는 활성이 해당 대상체에 대해 측정된 발현 또는 활성의 피크 발현 또는 활성 수준의 적어도 50%인 경우, "지속된" 것으로 간주된다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 6개월차, 예를 들어 24주차 내지 28주차에, 발현 또는 활성이 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%이다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 1년차, 즉, 약 12개월차, 예를 들어 11개월차 내지 13개월차에 발현 또는 활성은 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%이다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 2년차, 즉, 약 24개월차, 예를 들어 23개월차 내지 25개월차에 발현 또는 활성은 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%이다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 6개월차에 발현 또는 활성은 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%이다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 1년차에 발현 또는 활성은 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%이다. 특정한 실시형태에서, 투여 후 2년차에 발현 또는 활성은 해당 대상체에 대해 측정된 피크 발현 또는 활성 수준의 발현 또는 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%이다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 예를 들어 매주, 매달, 특히 투여 후 초기, 예를 들어 처음 6개월 이내에 폴리펩타이드의 발현 또는 활성 수준의 일상적인 모니터링을 받는다. 주기적 측정은 발현 또는 활성에 대한 효과가 예를 들어 투여 후 6개월차, 투여 후 1년차, 또는 투여 후 2년차에 지속됨을 확립할 수 있다. 일부 방법에서, 신생아 대상체에서, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현은 신생아 대상체가 성인이 될 때 지속된다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질 또는 GAA의 발현은 대상체 또는 신생아 대상체의 일생 동안 지속된다.
일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다. 일부 방법에서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%이다.
ALB 유전자좌 내로의 삽입을 수반하는 일부 방법에서, 대상체의 순환 알부민 수준 또는 세포의 알부민 수준은 정상이다. 이러한 방법은 대상체의 순환 알부민 수준 또는 세포의 알부민 수준을 정상 순환 알부민 수준 또는 정상 알부민 수준의 ±5%, ±10%, ±15%, ±20% 또는 ±50% 이내로 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 대상체 또는 세포의 알부민 수준은 적어도 4주, 적어도 8주, 적어도 12주, 또는 적어도 20주까지 치료되지 않은 개체의 알부민 수준과 비교하여 변하지 않는다. 일부 방법에서, 대상체의 또는 세포의 알부민 수준은 일시적으로 떨어지고, 이어서 정상 수준으로 복귀한다. 특히, 방법은 혈장 알부민의 수준에서 유의한 변화를 검출하지 않는 것을 포함할 수 있다.
일부 방법에서, 방법은 본원에 기재된 임의의 핵산 작제물을 투여하기 전에 대상체에서의 기존의 항-GAA 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법은 총 항체(TAb) 면역 검정 또는 중화 항체(NAb) 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 대상체는 이전에 재조합 GAA 단백질을 투여받지 않았다.
일부 방법에서, 방법은 본원에 기재된 임의의 핵산 작제물을 투여하기 전에 대상체에서의 기존의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV8) 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법은 총 항체(TAb) 면역 검정 또는 중화 항체(NAb) 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Manno et al. (2006) Nat. Med. 12(3):342-347], 문헌[Kruzik et al. (2019) Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 14:126-133], 및 문헌[Weber (2021) Front. Immunol. 12:658399]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 일부 실시형태에서, TAb 검정은 AAV 벡터에 결합하는 항체를 찾는 반면, Nab 검정은 존재하는 항체가 표적 세포에 형질도입되어 AAV 벡터를 정지시키는지 여부를 평가한다. TAb 검정에 의해, 약물 생성물 또는 빈 캡시드를 사용하여 항체를 포획할 수 있고; NAb 검정은 리포터 벡터(예를 들어, 루시퍼라제를 인코딩하는 AAV 벡터의 버전)가 필요할 수 있다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁번호 등은 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 인용되어 포함된 것으로 명시된 것과 동일한 정도로 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다. 상이한 버전의 서열이 다양한 시점에서 특정 수탁 번호와 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 적용 가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일 중 더 빠른 날짜를 의미한다. 마찬가지로, 상이한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특성, 단계, 요소, 실시형태, 또는 양태는 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명이 명확성과 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변경 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있음이 명백할 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부된 서열 목록에서 나열된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대해서는 표준 글자 약어 및 아미노산에 대해서는 3-글자 코드를 사용하여 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부로 순방향으로(즉, 각각의 선에서 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관행을 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 오직 1개 가닥만 나타내지만, 상보적 가닥이 표시된 가닥이 임의의 참조로 포함됨이 이해된다. 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 이의 코돈 축퇴 변이체가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단으로 순방향으로(즉, 각각의 선에서 좌측에서 우측으로) 진행되는 표준 관행을 따른다.
[표 9]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예
실시예 1. 간의 알부민 유전자좌 내로의 신생아 삽입을 위한 시스템의 개발
특정 유전자좌(예를 들어, 알부민 인트론 1) 내로의 전이유전자의 뉴클레아제-매개 삽입을 위한 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 신생아에게 투여할 때를 포함하여 전이유전자의 영속적 발현을 생성하도록 개발하였다. 이후 실시예에서 사용되는 것들을 포함하여 시스템의 예시적인 성분이 하기 보다 상세하게 기재되어 있다.
단일 가이드 RNA 설계 및 선택
ALB 유전자좌를 DNA 템플릿을 위한 삽입 부위로 선택하였다. 인간 ALB 인트론 1을 표적화하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 목록을 생성하였다. 표 10을 참조한다. 후보 sgRNA를 합성하고 시험관내 및 생체내 평가를 위해 Cas9 mRNA와 함께 지질 나노입자(LNP)로 제형화하였다.
[표 10]
Figure pct00031
먼저 양방향 nanoluc-인코딩 AAV 삽입 템플릿을 리포터로 사용하여 LNP를 1차 인간 헤파토사이트(PHH)에서 스크리닝하였다. nanoluc의 표적화 삽입을 지원하는 LNP는 PHH 배양의 상청액으로 분비되는 nanoluc 단백질을 측정하여 식별하였다. 이어서, 초기 PHH 스크리닝을 통과한 후보를 생체내 유전자 삽입을 지원하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 생체내 연구의 상위 후보를 표적-외 절단에 대해 기능적으로 평가하였다.
하기에 보다 상세하게 기재되는 ALB-표적 sgRNA 9860으로 제형화된 LNP-g9860은 다수의 플랫폼(1차 인간 및 비-인간 영장류 헤파토사이트, ALB 인간화 마우스, 비-인간 영장류)에 걸친 강력한 전이유전자 발현 수준에 대한 지원, 확인된 표적-외 부위 결여, 종 간 번역, 표적 부위의 공통적인 인간 SNP 결여, 그룹 내 전이유전자 발현의 낮은 변동성, 및 용량 범위에 걸친 성능을 바탕으로 선택하였다. sgRNA 9860의 표적 부위는 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 보존된다. LNP-g9860은 인간 게놈에서 검출 가능한 표적-외 부위를 갖지 않고(포화 수준의 편집에서의 두 개의 로트의 1차 인간 헤파토사이트에서 수행된 표적화된 앰플리콘 시퀀싱에서는 ALB에서의 표적-내 이외의 임의의 유전자좌를 검증하지 않았음), 1차 인간 및 비-인간 영장류 헤파토사이트, ALB 인간화 마우스, 및 비-인간 영장류에서 삽입을 통한 전이유전자 발현을 지원하였다.
LNP-g9860
LNP-g9860은 인간 ALB 인트론 1을 표적화하는 데 사용하기 위해 개발하였다. LNP-g9860은 약 100개의 뉴클레오타이드 길이의 sgRNA(g9860) 및 4개의 상이한 지질로 구성된 LNP에 캡슐화된 Cas9-인코딩 mRNA를 포함하는 지질 나노입자이며, 이들 각각은 하기 추가로 기재된다. Cas9 mRNA로부터 발현된 Cas9 단백질은 sgRNA 9860이 PAM과 회합된 표적화된 상보적 DNA 서열에 결합할 때 DNA를 절단하도록 지시된다. LNP의 조성은 표 11에 요약되어 있다. LNP-g9860은 다음 몰비: 50 mol%의 지질 A, 9 mol%의 DSPC, 38 mol%의 콜레스테롤, 및 3 mol%의 PEG2k-DMG로 4개의 지질을 포함하고, pH 7.4에서 50 mM의 Tris-HCl, 45 mM의 NaCl, 5%(w/v)의 수크로스로 구성된 수성 완충액에서 제형화된다. N:P 비는 약 6이고, gRNA:Cas9 mRNA 비는 약 1:2 중량비이다.
[표 11]
Figure pct00032
단일 가이드 RN A. LNP-g9860에 사용된 단일 가이드 RNA(sgRNA 9860)는 인간 ALB 유전자의 인트론 1의 표적 영역에 상보적인 20개의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 100량체 올리고뉴클레오타이드이다. g9860에 의해 인식되는 표적 서열은 시노몰구스 원숭이 mfAlb 유전자 인트론 1에서 보존된다. g9860에 대한 서열은 서열번호 68 및 서열번호 100에 제시된다. 화학적 변형은 합성 동안 100량체에 혼입되며, sgRNA의 5'- 및 3'-단부에서의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 RNA의 일부 당에 대한 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
Cas9 mRNA. LNP-g9860에 사용된 Cas9 메신저 RNA(mRNA)는 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 단백질 서열을 기반으로 한다. Cas9-인코딩 mRNA(서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 코딩 서열(CDS)이 있음)는 대략 4400개의 뉴클레오타이드 길이이다. 서열은 5' 캡, 5' 비번역 영역(UTR), Cas9 단백질을 인코딩하는 개방형 리딩 프레임(ORF), 3' UTR, 및 폴리A 테일을 함유한다. 5' 캡은 안티-리버스 캡 유사체(ARCA)로 알려진 합성 캡 유사체 구조체를 사용하여 동시-전사적으로 생성된다. mRNA 서열의 우라실은 시험관내 전사 동안 변형된 N1 메틸 유사우리딘으로 완전히 대체되었다. mRNA의 5' 단부는 합성 캡 유사체 구조체를 갖는다. 폴리-A 테일은 대략 100개의 뉴클레오타이드이다.
LNP-g666
LNP-g666은 마우스 Alb 인트론 1을 표적화하는 데 사용하기 위해 개발하였다. LNP-g666은 인간 알부민 표적화 g9860이 g666, 마우스 알부민 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA로 대체된 것을 제외하고 LNP-g9860과 동일하다. g666에 대한 서열은 서열번호 166 및 서열번호 167에 제시된다.
rAAV8 벡터
재조합 AAV8(rAAV8) 벡터를 DNA 삽입 템플릿을 운반하기 위해 개발하였다. DNA 삽입 템플릿을 운반하는 rAAV8은 AAV 혈청형 8로부터 유래된 AAV 기반 벡터인 비-복제 벡터이다. 게놈은 각각의 단부에서 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(DNA)이다. ITR은, 프로모터가 없는 삽입 템플릿을 플랭킹한다. 카세트를 플랭킹하는 AAV ITR은 AAV2로부터 유래되었다. rAAV8 벡터에 의해 전달되는 DNA 삽입 템플릿은 프로모터가 없는 템플릿으로 설계될 수 있으므로 발현을 위해 표적화 ALB 유전자좌 프로모터에 의존한다.
실시예 2. 신생아 마우스에 삽입 후 영속적 인간 FIX 단백질 발현
성체 및 신생아 마우스에서 에피솜-매개 발현 대 삽입-매개 발현을 비교하고 성체 및 신생아 마우스에서 다양한 DNA 복구 경로를 비교하기 위해, 본 발명자들은 hFIX 에피솜(hAAT 프로모터에 의해 유도되는 발현), 양방향 hFIX NHEJ 삽입 템플릿, 500bp의 상동성 아암이 있는 hFIX HDR 삽입 템플릿, 및 800bp의 상동성 아암이 있는 hFIX HDR 삽입 템플릿의 투여 후 hFIX 혈청 수준을 비교하였다. 도 1을 참조한다. 신생아 C57BL/6 마우스에 다음을 P0 또는 P1에서 투여하였다: (1) 4 mg/kg의 LNP-g666 및 3e9 vg/마우스의 hFIX-HDR-500 템플릿이 있는 rAAV8; (2) 4 mg/kg의 LNP-g666 및 3e9 vg/마우스의 hFIX-HDR-800 템플릿이 있는 rAAV8; (3) 4 mg/kg의 LNP-g666 및 3e9 vg/마우스의 hFIX-NHEJ 템플릿이 있는 rAAV8; 또는 (4) 3e9 vg/마우스의 rAAV8 에피솜 템플릿. 식염수가 주사된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 에피솜 AAV의 hFIX 코딩 서열은 야생형 인간 F9를 인코딩하는 코돈-최적화된 서열이었다. 2개의 HDR 작제물에서 hFIX 코딩 서열은 파두아 돌연변이(R338L)가 있는 자연 인간 F9 코딩 서열이었다. 혈액을 수집하고, 투여 후 1주차, 2주차, 및 5주차에 혈장을 준비하였다. hFIX 수준을 인간 FIX ELISA에 의해 측정하였다. 이어서, 실험은 성체 C57BL/6 마우스에 반복적으로 수행하고, 성체 마우스에는 다음이 투여되었다: (1) 0.8 mg/kg의 LNP-g666 및 2e10 vg/마우스의 hFIX-HDR-500 템플릿이 있는 rAAV8; (2) 0.8 mg/kg의 LNP-g666 및 2e10 vg/마우스의 hFIX-HDR-800 템플릿이 있는 rAAV8; (3) 0.8 mg/kg의 LNP-g666 및 2e10 vg/마우스의 hFIX-NHEJ 템플릿이 있는 rAAV8; 또는 (4) 2e10 vg/마우스의 rAAV8 에피솜 템플릿. 식염수가 주사된 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. 혈액을 수집하고, 투여 후 1주차, 2주차, 및 4주차에 혈장을 준비하였다. 결과는 도 2a와 도 2b 및 표 12 내지 표 14에 나타난다. 에피솜-매개 발현은 신생아에서의 삽입-매개 발현과 비교하여 제1 시점에서도 낮았고, 신생아에서 시간이 지남에 따라 손실되었다. 성체 마우스에서 반대가 관찰되었다: 에피솜-매개 발현은 성체 마우스에서의 삽입-매개 발현과 비교하여 제1 시점 및 후속 시점에서 더 높았다. 이들 결과는 이전의 유사한 실험에서 관찰된 것을 확인시켜 주었다(데이터 미도시). 신생 마우스에서의 결과와 대조적으로, hFIX 수준은 에피솜 및 삽입 작제물 둘 모두가 있는 성체 마우스에서 안정적으로 유지되었으며, 에피솜 작제물은 최대 발현을 제공하였다. 도 2a와 도 2b 및 표 12 내지 표 14를 참조한다.
[표 12]
Figure pct00033
[표 13]
Figure pct00034
[표 14]
Figure pct00035
이들 실험은 삽입된 F9의 발현이 신생아 간에서 영속적임을 보여주었으며, 이는 알부민 유전자좌 내로의 F9 템플릿의 삽입으로 인해 신생아 대상체에서 발현이 영속적임을 나타낸다. 이들 게놈 통합은 신생아 마우스에서 실험 전체에 걸쳐 유지된 영속적 발현을 제공하였다.
실시예 3. 폼페병의 치료를 위한 신생아 삽입 시스템 및 시약의 개발
특정 유전자좌(예를 들어, 알부민 인트론 1) 내로의 항-CD63:GAA 전이유전자 또는 항-TfR:GAA 전이 유전자의 뉴클레아제-매개 삽입을 위한 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)을 신생아에게 투여할 때를 포함하여 항-CD63:GAA 또는 항-TfR:GAA의 영속적 발현을 생성하도록 개발하였다.
이후 실시예에서 사용되는 것들을 포함하여 항-CD63:GAA의 삽입을 위한 시스템의 예시적인 성분은 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. 도 3 내지 도 5를 참조한다. 하기 기재되는 작동예의 항-CD63:GAA DNA 템플릿을 재조합 AAV8 벡터에 의해 간으로 가져오고, CRISPR/Cas9 RNA 성분(Cas9 mRNA 및 sgRNA)을 LNP-매개 전달에 의해 간에 전달한다(도 3 및 도 5) 간에 의해 생성된 항-CD63:GAA 단백질은 근육에서 고도로 발현된 신속한 내재화 단백질인 CD63을 표적화함으로써 근육 내 리소솜을 표적화한다. 도 4를 참조한다. 단일 가이드 RNA, LNP-g9860, Cas9 mRNA, 및 LNP-g666 설계 및 선택은 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
이후 실시예에서 사용되는 것들을 포함하여 항-TfR:GAA의 삽입을 위한 시스템의 예시적인 성분은 하기 보다 상세하게 기재되어 있다. 도 15 내지 도 17을 참조한다. 하기 기재되는 작동예의 항-TfR:GAA DNA 템플릿을 재조합 AAV8 벡터에 의해 간으로 가져오고, CRISPR/Cas9 RNA 성분(Cas9 mRNA 및 sgRNA)을 LNP-매개 전달에 의해 간에 전달한다(도 15 및 도 17) 간에 의해 생성된 항-TfR:GAA 단백질은 근육 및 뇌 내피세포에서 발현되는 TfR을 표적화함으로써 근육 및 CNS을 표적화한다. 이들 세포에서 TfR의 통과세포외배출은 혈액-뇌-장벽 횡단을 가능하게 한다. 도 16을 참조한다. 단일 가이드 RNA, LNP-g9860, Cas9 mRNA, 및 LNP-g666 설계 및 선택은 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
DNA 템플릿 설계 및 선택
본 발명자들은 항-CD63:GAA 융합물을 인코딩하는 핵산의 삽입을 위한 DNA 템플릿을 조작하였으며, 이때, 단쇄 단편 가변(scFv)의 C-말단은 글리신-세린 링커에 의해 GAA의 아미노산 70-952의 N-말단에 융합된다. GAA(70-952) 서열은 서열번호 173에 제시되고, 서열번호 174에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. DNA 템플릿은 서열번호 194에 제시되고, 서열번호 193에 제시된 융합 단백질을 인코딩한다. 스플라이스 수용체는 항-CD63:GAA 전이유전자의 상류에서 인코딩되고, 폴리아데닐화 사열은 항-CD63:GAA 전이유전자의 하류에서 인코딩된다. 전이유전자의 5' 단부에서의 스플라이스 수용체 서열은 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체로부터 유래되었다. 전이유전자의 3' 단부에서의 폴리아데닐화 서열은 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래되었다.
본 발명자들은 항-TfR:GAA 융합물을 인코딩하는 핵산의 삽입을 위한 DNA 템플릿을 조작하였으며, 이때, 단쇄 단편 가변(scFv)의 C-말단은 글리신-세린 링커에 의해 GAA의 아미노산 70-952의 N-말단에 융합된다. GAA(70-952) 서열은 서열번호 173에 제시되고, 서열번호 174에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. 스플라이스 수용체는 항-TfR:GAA 전이유전자의 상류에서 인코딩되고, 폴리아데닐화 사열은 항-TfR:GAA 전이유전자의 하류에서 인코딩된다. 전이유전자의 5' 단부에서의 스플라이스 수용체 서열은 마우스 Alb 엑손 2 스플라이스 수용체로부터 유래되었다. 전이유전자의 3' 단부에서의 폴리아데닐화 서열은 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래되었다.
rAAV8 벡터
재조합 AAV8(rAAV8) 벡터를 DNA 삽입 템플릿을 운반하기 위해 개발하였다. 항-CD63:GAA DNA 템플릿(REGV044)을 운반하는 rAAV8은 AAV 혈청형 8로부터 유래된 AAV 기반 벡터인 비-복제 벡터이다. 게놈은 각각의 단부에서 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(DNA)이다. ITR은, 항-CD63:GAA의 프로모터가 없는 삽입 템플릿을 플랭킹한다. 카세트를 플랭킹하는 AAV ITR은 AAV2로부터 유래되었다. rAAV8 벡터에 의해 전달되는 항-CD63:GAA DNA 삽입 템플릿은 프로모터가 없는 템플릿으로 설계될 수 있으므로 발현을 위해 표적화된 ALB 유전자좌 프로모터에 의존한다.
항-TfR:GAA DNA 템플릿을 운반하는 rAAV8은 AAV 혈청형 8로부터 유래된 AAV 기반 벡터인 비-복제 벡터이다. 게놈은 각각의 단부에서 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(DNA)이다. ITR은, 항-TfR:GAA의 프로모터가 없는 삽입 템플릿을 플랭킹한다. 카세트를 플랭킹하는 AAV ITR은 AAV2로부터 유래되었다. rAAV8 벡터에 의해 전달되는 항-TfR:GAA DNA 삽입 템플릿은 프로모터가 없는 템플릿으로 설계될 수 있으므로 발현을 위해 표적화된 ALB 유전자좌 프로모터에 의존한다.
실시예 4. 신생아 마우스에서 항-CD63:GAA DNA 템플릿의 삽입 후 영속적 알파-글루코시다제(GAA) 발현
본 발명자들은 다음으로 항-CD63:GAA 융합물을 인코딩하는 핵산의 삽입을 위한 DNA 템플릿을 조작하였으며, 이때, 항-CD63 단쇄 단편 가변(scFv)의 C-말단은 글리신-세린 링커에 의해 GAA의 N-말단에 융합된다(상기 기재됨). 본 발명자들은 폼페병(PD) 마우스 모델, Gaa-/-;Cd63hu/hu에서 항-CD63:GAA 삽입 템플릿을 시험하였으며, 이때, Gaa는 LacZ로 대체되고, Cd63 유전자좌의 단백질 코딩 영역은 이의 인간 대응물로 대체되었다. 성체(2개월령) 수컷 및 암컷 Gaa-/-;Cd63hu/hu 마우스(62.5% C57BL/6, 37.5% 129Sv)에 다음을 정맥내 투여하였다: (1) 항-CD63:GAA(REGV042)를 인코딩하는 4e12 vg/kg의 재조합 AAV8; 또는 (2) 1 mg/kg의 LNP-g666 및 1.2e13 vg/kg의 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(REGV044). REGV042는 hSerpina1 인핸서 및 mTTR 프로모터를 사용하여 항-CD63:GAA의 헤파토사이트 특이적 발현을 제공하는 에피솜 AAV이며, 이는 추가로 인간 알부민 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 항-CD63:GAA 코딩 서열은 REGV042 및 REGV044에서 식별되었으며, 서열번호 194에 제시된다. 치료되지 않은 Gaa-/-;Cd63hu/hu 마우스 및 야생형 마우스를 대조군으로 사용하였다. 혈액을 수집하고, 투여 후 7일차, 30일차, 2개월차, 3개월차, 6개월차, 및 10개월차에 혈청을 준비하고, 조직을 투여 후 10개월차에 수집하였다. 항-CD63:GAA 혈청 수준을 분자의 scFv 부분을 검출하는 플레이트 기반 샌드위치 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 항-CD63:GAA 정제된 단백질을 정량화를 위한 단백질 표준으로 사용하였다. 데이터는 도 6 및 표 15와 표 16에 나타난다. 투여 후 10개월차에, 동물을 희생시키고, 글리코겐 수준을 희생된 동물의 근육 조직 용해물에서 정량화하였다. CO2 질식에 의한 희생 직후 마우스로부터 조직을 적출하고, 액체 질소에서 스냅 동결(snap frozen)하고, -80℃에서 저장하였다. 글리코겐 측정을 위한 증류수 또는 단백질 분석을 위한 RIPA 완충액 중에 스테인리스 강재 비드가 있는 벤치탑 균질기 상에서 조직을 용해시켰다. 글리코겐 분석 용해물을 비등하고, 조직 파편을 제거하기 위해 원심분리하였다. 글리코겐 측정을 제조업체(K646, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)의 지시에 따라 상업적인 키트로 형광측정을 수행하였다. 도 7 및 표 17 내지 표 19에 나타낸 바와 같이, 글리코겐은 에피솜 그룹 및 삽입 그룹 둘 모두의 성체 마우스의 심장, 사두근, 및 횡격막에서 거의 야생형 수준으로 유의하게 감소하였다.
[표 15]
Figure pct00036
[표 16]
Figure pct00037
[표 17]
Figure pct00038
[표 18]
Figure pct00039
[표 19]
Figure pct00040
이어서, 신생아 Gaa-/-;Cd63hu/hu 마우스(62.5% C57BL/6, 37.5% 129Sv)에 다음이 P1에서 정맥내 투여되는 유사한 실험을 수행하였다: (1) 항-CD63:GAA를 인코딩하는 8.2e12 vg/kg의 재조합 AAV8(REGV042); 또는 (2) 4 mg/kg의 LNP-g666 및 8.2e12 vg/kg의 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(REGV044). 치료되지 않은 Gaa-/-;Cd63hu/hu 마우스 및 야생형 마우스를 대조군으로 사용하였다. 혈액을 수집하고, 투여 후 7일차, 30일차, 2개월차, 3개월차, 4개월차, 5개월차, 6개월차, 7개월차, 8개월차, 9개월차, 12개월차, 13개월차, 및 15개월차에 혈청을 준비하고, 조직을 투여 후 3개월차 및 15개월차에 수집하였다. 도 8a와 도 8b 및 표 20과 표 21에 나타낸 바와 같이, 성체 마우스가 투여될 때 관찰되었던 것과 대조적으로, 혈청 항-CD63:GAA 수준은 삽입 그룹에서 15개월차의 시간 경과에 걸쳐 안정하지만, 에피솜 그룹은 낮아지기 시작하고, 신생아 마우스가 투여될 때 1개월 내에 혈청 ELISA 검정을 사용한 정량화의 하한 미만으로 떨어졌다. 유사하게, 도 9a 및 표 22에 나타낸 바와 같이, 3개월차의 글리코겐 저장은 삽입 그룹의 심장, 사두근, 비복근, 및 횡격막에서 야생형 수준으로 정상화되었지만, 에피솜 그룹에 대해서는 그렇지 않았다. 마찬가지로, 도 9b 및 표 23에 나타낸 바와 같이, 15개월차의 글리코겐 저장은 삽입 그룹의 심장, 사두근, 비복근, 및 횡격막에서 야생형 수준으로 정상화되고, 글리코겐 저장은 삽입 그룹의 CNS 조직에서 부분적으로 보정되었지만, 에피솜 그룹에 대해서는 그렇지 않았다.
[표 20]
Figure pct00041
[표 21]
Figure pct00042
[표 22]
Figure pct00043
[표 23]
Figure pct00044
신생아 마우스의 삽입 템플릿으로 관찰된 개선된 글리코겐 감소가 개선된 근육 기능으로 번역되었는지 여부를 평가하기 위해, 마우스를 투여 후 15개월차에 악력 장치 상에서 시험하였다. 팔의 악력을 힘 미터(force meter)(Columbus Instruments, 미국 오하이오주 콜럼버스 소재)로 측정하였다. 모든 시험을 3회 반복 수행하였다. 삽입 템플릿으로 치료된 마우스는 악력 시험에 대해 에피솜 작제물로 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 개선된 성능을 나타냈다. 사실상, 삽입 그룹의 악력은 치료 후 15개월차의 야생형 마우스의 것에 가깝게 추적했던 반면, 치료되지 않은 그룹과 비교하여 추적된 에피솜 그룹의 악력에는 차이가 없었다. 도 10 및 표 24를 참조한다. 이들 결과는, 신생아 마우스에서 삽입 접근법이 에피솜 접근법과 비교하여 발현 영속성이 대단히 개선되고, 기질 감소가 보다 양호한 것을 보이며, 이는 삽입이 소아과 적응증에 우수한 접근법임을 나타낸다.
[표 24]
Figure pct00045
항-CD63:GAA가 인간 알부민 gRNA를 사용하여 알부민에 대해 인간화된 마우스 내로 삽입될 수 있는지를 입증하기 위해, 4개월령 Gaa-/-;Albhu/hu 마우스(n=3)에 7.5e10 vg/마우스의 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(REGV044)과 1 mg/kg LNP-g9860을 정맥내 투여하여 실험을 수행하였다. 혈액을 수집하고, 투여 후 7일차, 14일차, 35일차, 및 60일차에 혈청을 준비하였다. 최대 약 3 μg/mL의 GAA 혈청 수준이 관찰되고, 시간 경과에 걸쳐 유지되었으며(데이터 미도시), 이는 항-CD63:GAA가 인간 알부민 gRNA를 사용하여 알부민에 대해 인간화된 마우스 내로 삽입될 수 있음을 확인시켜 주었다.
요약하면, LNP에 의해 전달되는 고도로 정확하고 표적화된 CRISPR/Cas9 기술과 선택된 rAAV8 벡터에 의해 전달되는 항-CD63:GAA DNA 템플릿의 조합이 헤파토사이트로부터 항-CD63:GAA 단백질이 장기적으로 발현되게 하고 PD에 영향을 받은 근육 세포로 전달되도록 하며, 잠재적으로 신생아 환자를 포함하는 PD 환자의 평생 동안의 효과적인 치료를 제공한다.
이들 결과는 신생아 마우스에서 삽입 접근법이 에피솜 접근법과 비교하여 대단히 개선된 발현 영속성을 보임을 나타내며, 이는 삽입이 신생아 대상체에 우수한 접근법임을 나타낸다.
실시예 5. 최적화된 항-CD63:GAA DNA 템플릿
최적화된 항-CD63:GAA 템플릿을 비-인간 영장류(NHP) 연구에 대한 리드(lead)를 개발하기 위해 제작하였다. 개발 후보를 선택하기 위해, 항-CD63:GAA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 변형(예를 들어, CpG 고갈에 의함)된 몇몇의 삽입 카세트 버전을 제작하였다. 표 25는 설계된 여러가지 버전의 항-CD63:GAA 삽입물을 나열하고 있다. 또한, GS 50 작제물을 6개의 활성화 CpG 모티프를 제거하되 44개의 비-활성 CpG 모티프를 남기도록 추가로 최적화하였다(GS 44; 서열번호 200). GS 0 작제물을 AATAA 폴리A를 제거하고 잠적 스플라이스 수용체를 제거하고 GGGGGGGGGGG(서열번호 203)를 인코딩하는 글리신을 GGAGGAGGTGG(서열번호 204)로 대체하여 추가로 최적화하였다(GS 0v2; 서열번호 198).
[표 25]
Figure pct00046
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 단리하였다. 플라스마시토이드 수지상 세포(pDC)를 농축하고 pBMC(웰당 1e4 pDC + 1e5 PBMC)와 조합하였다. 세포를 AAV6 또는 대조군 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 함께 16시간 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수확하고, IFNα ELISA를 수행하였다. 이 검정은 CpG-고갈된 항-CD63:GAA 서열이 비-CpG-고갈된 서열과 비교하여 1차 인간 플라스마시토이드 DC 기반 검정에서 감소된 IFN-I 반응을 나타내는지 여부를 평가하였다. 양성 대조군 AAV6-GFP 및 CpG-고갈된 음성 대조군(0 CpG F9 전이유전자) 템플릿을 포함하는 시험된 샘플은 표 26에 나타난다. 결과는 도 11에 나타난다.
[표 26]
Figure pct00047
최적화된 템플릿의 활성을 1차 인간 헤파토사이트 검정에서 시험하였다. AAV 템플릿을 AAV2 바이러스 내로 패키징하였다. 1차 인간 헤파토사이트를 96-웰 플레이트 내에 성장시키고, LNP 용량 적정으로 고정된 MOI 또는 AAV 용량 적정으로 고정된 LNP 농도로 템플릿 DNA 및 LNP-g9860을 함유하는 AAV (AAV2, AAV6, 또는 AAV8)를 투여하였다. 상청액을 투여 후 7일차에 수집하고, 섭씨 -80도에서 저장하였다. 상청액을 융해하고, 상청액의 GAA 활성을 세포로부터 생성 및 분비된 효소 활성 GAA 생성물의 양의 측정으로서 4-메틸움벨리페론 기반 형광측정 검정(K690, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)을 사용하여 측정하였다. 최적화된 항-CD63:GAA 및 항-TfR:GAA 템플릿의 제1 배치(batch)를 표 27 및 도 12에 나타낸 바와 같이 AAV2를 사용하여 시험하였다. 50 CpG 항-CD63:GAA 템플릿은 자연 템플릿과 유사하게 발현하였지만, 더 적은 CpG이 있는 초기 템플릿은 잘 발현되지 않았다. 추가적인 최적화된 항-CD63:GAA을 표 28 및 도 13에 나타낸 바와 같이 AAV6을 사용하여 시험하였다. GA 0 CpG 항-CD63:GAA 템플릿은 시험관내 1차 인간 헤파토사이트 삽입 검정에서 높은 CpG의 자연 템플릿과 비교하여 발현을 유지하였다. 유사한 결과가 AAV6 대신에 AAV8을 사용하여 관찰되었다(데이터 미도시). GA 0 CpG 항-CD63:GAA 템플릿은 1차 인간 헤파토사이트 검정에서 자연과 유사한 수준의 기능적 GAA를 생성하는 동시에, pDC/AAV 검정에서 감소된 IFNα 반응을 생성하였다.
[표 27]
Figure pct00048
[표 28]
Figure pct00049
최적화된 템플릿의 발현을 실시예 4에 기재된 바와 같이 Gaa-/- 마우스에 삽입 후 입증하였다. 성체 마우스에 1.97e12 vg/kg의 재조합 AAV8 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(REGV044) 및 1 mg/kg LNP-g666을 정맥내 투여하였다. 시험된 재조합 AAV8 템플릿은 자연 181 CpG 항-CD63:GAA 삽입 템플릿(REGV044), GA 0 CpG 템플릿, GSa50 CpG 템플릿, 및 GS 44 CpG 템플릿을 포함하였다. 치료되지 않은 Gaa-/- 마우스 및 야생형 마우스를 대조군으로 사용하였다. 혈액을 수집하고, 투여 후 13일차, 34일차, 및 92일차에 혈청을 준비하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, GA 0 CpG 템플릿은 높은 CpG의 자연 템플릿과 비교하여 성체 Gaa-/- 마우스의 생체내에서 유사한 혈청 발현을 나타냈다. 도 14b에 나타낸 바와 같이, 혈청 발현 수준은 3개의 시점에 걸쳐 일정하였다.
GA 0 CpG 항-CD63:GAA 템플릿(서열번호 196 및 서열번호 736)의 발현을 비-인간 영장류에서 삽입 후 평가하였다. 2세령의 시토몰구스 원숭이에 CpG 고갈된 항-CD63:GAA 템플릿 및 시노몰구스 알부민 인트론 1을 표적화하는 LNP-g9860을 함유하는 재조합 AAV8을 투여하였다. 3 mg/kg LNP 용량의 3개의 상이한 AAV8 용량(0.3e13vg/kg, 1.5e13vg/kg, 및 5.6e13vg/kg)을 사용하였다. 비히클 대조군 그룹 N=1, 투여된 그룹 N=3. 혈청 GAA 활성을 연구의 과정 전반에 걸쳐 원숭이의 형광측정 기질 검정을 사용하여 측정하였다. 혈청 GAA 활성 수준에서 AAV-용량 의존적 증가가 그룹에서 경시적으로 관찰되었다(도 27a). 이는 알부민 유전자좌 내로의 항-CD63:GAA 전이유전자의 성공적인 삽입 및 동물에서 전이유전자의 결과적인 발현 및 분비를 나타냈다. 조직을 희생 시 수집하고(89일차), GAA의 76 kDa 리소솜 형태의 존재에 대해 웨스턴 블롯에 의해 규명하였다. 조직에서 리소솜 GAA의 용량 의존적 증가가 심장 및 횡경막에서 관찰되었으며(도 27b), 이는 원위 조직으로의 간 유래 항-CD63:GAA 단백질의 전달을 나타냈다.
최적화된 템플릿의 활성을 실시예 4에 기재된 바와 같이 PD 마우스 모델, Gaa-/-;Cd63hu/hu에서 입증한다.
최적화된 템플릿의 발현을 비-인간 영장류에서 평가한다. 2개의 LNP 용량 및 2개의 gRNA를 시험한다. 구체적으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이 1 또는 3 mg/kg의 LNP-g9860 및 각각 최적화된 템플릿을 포함하는 1.5e13 vg/kg의 rAAV8을 투여하여 발현을 평가한다. gRNA9844가 있는 LNP를 또한 사용한다. 발현을 12주 연구에 걸쳐 분석한다. 조직을 또한 GAA의 생체분포 분석을 위해 수집하고, GAA 활성을 수집된 조직에서 평가한다.
실시예 6. 신생아 마우스에서 항-TfR:GAA DNA 템플릿의 삽입 후 영속적 알파-글루코시다제(GAA) 발현
항-인간 트랜스퍼린 수용체(hTfR) 항체를 생산하고, hTfR에 결합하는 능력 및 인간 트랜스퍼린-hTfR 결합의 강한 차단의 결여에 대해 스크리닝하였다. 이러한 초기 분석을 기반으로, 32개의 가변 서열을 선택하였다. 표 29를 참조한다.
[표 29]
Figure pct00050
31874B
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCCTTTAGCAGCTATGCCATGACCTGGGTCCGACAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATCAGTGGTACTGGTGGTAGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGGGAGCAGCTCGTAGAATGGAATACTTCCAGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 216)
HCVR(VH) 아미노산 서열
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGAARRMEYFQYWGQGTLVTVSS (서열번호 217)
HCDR1: GFAFSSYA (서열번호 218)
HCDR2: ISGTGGST (서열번호 219)
HCDR3: AKGGAARRMEYFQY (서열번호 220)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAACCTCCTTATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 221)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPLTFGGGTKVEIK (서열번호 222)
LCDR1: QGISNY (서열번호 223)
LCDR2: AAS (서열번호 224)
LCDR3: QKYNSAPLT (서열번호 225)
31863B
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAACAGCTATGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTTATTGGTGGTAGTACTGGTAACACATACTACGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGCGACAATTCCAAGAAGACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGGGGAGCAGCTCGTAGAATGGAATACTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 226)
HCVR(VH) 아미노산 서열
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMTWVRQAPGKGLEWVSFIGGSTGNTYYAGSVKGRFTISSDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGAARRMEYFQHWGQGTLVTVSS (서열번호 227)
HCDR1: GFTFNSYA (서열번호 228)
HCDR2: IGGSTGNT (서열번호 229)
HCDR3: AKGGAARRMEYFQH (서열번호 230)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACCATAACAGTGTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 231)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNHNSVPLTFGGGTKVEIK (서열번호 232)
LCDR1: QGISNY (서열번호 233)
LCDR2: AAS (서열번호 234)
LCDR3: QNHNSVPLT (서열번호 235)
69348
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCACTACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCTGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATATTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGACGACACGGCTGTTTATTACTGTACGAGAACCCATGGCTATACCAGGTCGTCGGACGGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 236)
HCVR (VH) 아미노산 서열
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVDDTAVYYCTRTHGYTRSSDGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 237)
HCDR1: GFTFTTYG (서열번호 238)
HCDR2: IWYDGSNK (서열번호 239)
HCDR3: TRTHGYTRSSDGFDY (서열번호 240)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGAAATGTTTTAGGCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTCAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATTTTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 241)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWFQQKPGKAPQRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNFYPLTFGGGTKVEIK (서열번호 242)
LCDR1: QSIRNV (서열번호 243)
LCDR2: AAS (서열번호 244)
LCDR3: LQHNFYPLT (서열번호 245)
69340
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR (VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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69331
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR (VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR (VL) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR (VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
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LCVR(VL) 아미노산 서열
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HCVR(VH) 아미노산 서열
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12841B(REGN16823 항-hTfR scFv:hGAA)
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCAATATAAAAGAAGATGGAGGTAAGAAATTGTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGAAGATACAACTTTGGTTGTGGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 496)
HCVR(VH) 아미노산 서열
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGGKKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREDTTLVVDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 497)
HCDR1: GFTFSNYW (서열번호 498)
HCDR2: IKEDGGKK (서열번호 499)
HCDR3: AREDTTLVVDYYYYGMDV (서열번호 500)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (서열번호 501)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (서열번호 502)
LCDR1: QSISSY (서열번호 503)
LCDR2: AAS (서열번호 504)
LCDR3: QQSYSTPPIT (서열번호 505)
12850B(REGN16828 항-hTfR scFv:hGAA)
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAACACCTATGCTATCACCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGGGGAATCATCCCTATCTCTGGCATAGCAGAGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATCACCACGGATGACTCCTCGACCACAGCCTACATGGAACTGAACAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCTGGAACTACGCACTCTACTACTTCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCGAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 506)
HCVR(VH) 아미노산 서열
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNTYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPISGIAEYAQKFQGRVTITTDDSSTTAYMELNSLRSEDTAVYYCASWNYALYYFYGMDVWGRGTTVTVSS (서열번호 507)
HCDR1: GGTFNTYA (서열번호 508)
HCDR2: IIPISGIA (서열번호 509)
HCDR3: ASWNYALYYFYGMDV (서열번호 510)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (서열번호 511)
LCVR(VL) 아미노산 서열
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (서열번호 512)
LCDR1: QSVSSSY (서열번호 513)
LCDR2: GAS (서열번호 514)
LCDR3: QQYGSSPWT (서열번호 515)
69261
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTATTACATGAACTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTCCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGGGAGAGAAGGGTATAGTGGGACTTATTCTTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 516)
HCVR(VH) 아미노산 서열
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGREGYSGTYSYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 517)
HCDR1: GFTFSVYY (서열번호 518)
HCDR2: ISSSGSTI (서열번호 519)
HCDR3: GREGYSGTYSYYGMDV (서열번호 520)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGTTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 521)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK (서열번호 522)
LCDR1: QSLLHSNGYNY (서열번호 523)
LCDR2: LGS (서열번호 524)
LCDR3: MQALQTPYT (서열번호 525)
69263
HCVR(VH) 뉴클레오타이드 서열
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGGTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTACCAGAGGATATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGGTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGTAAAAGATATTACGATATCCCCCAACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 526)
HCVR(VH) 아미노산 서열
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAVSGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGTRGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRGEDTALYYCVKDITISPNYYGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 527)
HCDR1: GFTFDDYA (서열번호 528)
HCDR2: ISWNSGTR (서열번호 529)
HCDR3: VKDITISPNYYGMDV (서열번호 530)
LCVR(VL) 뉴클레오타이드 서열
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGACATTAGCCATTATTCAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACTTCCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCTCTCTCACCACCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (서열번호 531)
LCVR(VL) 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISHYSAWYQQKPGKLPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFSLTTSSLQPEDVATYYCQKYNSVPLTFGGGTKVEIK (서열번호 532)
LCDR1: QDISHY (서열번호 533)
LCDR2: AAS (서열번호 534)
LCDR3: QKYNSVPLT (서열번호 535)
[표 30]
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
항-hTfR:GAA 융합 단백질에서 항-hTfR Fab의 중쇄 및 경쇄:
(1) 31874B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 603)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGAARRMEYFQYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 604)
(2) 31863B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNHNSVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 605)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMTWVRQAPGKGLEWVSFIGGSTGNTYYAGSVKGRFTISSDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGAARRMEYFQHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 606)
(3) 69348
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWFQQKPGKAPQRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNFYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 607)
Fab 중쇄
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVDDTAVYYCTRTHGYTRSSDGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 608)
(4) 69340
Fab 경쇄
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHDVSNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFVVYYCQQRSDWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 609)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDKAMHWVRQVPGKGLEWISGISWNSGTIGYADSVKGRFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDGDTSGWYWYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 610)
(5) 69331
Fab 경쇄
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 611)
Fab 중쇄
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCIASGFTFSVYGIHWVRQAPGKGLEWMAVISHDGNIKHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRTEDTAVYYCAKDTWNSLDTFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 612)
(6) 69332
Fab 경쇄
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYNYPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 613)
Fab 중쇄
QVTLRESGPALVKPSQTLTLTCTFSGFSLNTYGMFVSWIRQPPGKALEWLAHIHWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGHNNLNYIIHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 614)
(7) 69326
Fab 경쇄
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNFAWYQQKPGQAPRLLIYSASSRATGIPVRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNIWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 615)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFIFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGVVLFDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 616)
(8) 69329
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQKANSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 617)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKDYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDGEQLVDYYYYYVMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 618)
(9) 69323
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKVLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 619)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGYIGYADSVKGRFTISRDNAENSLHLQMNSLRAEDTALYYCARGGSTLVRGVKGGYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 620)
(10) 69305
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDRYLNWYRQKPGKAPKLLIYTTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTLSSLQPEDFATYYCQQSYSPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 621)
Fab 중쇄
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGQLDLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 622)
(11) 69307
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQKADSLPYAFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 623)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSNYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKEYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDGEQLVDYYYYYVMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 624)
(12) 12795B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRDHFGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDTYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 625)
Fab 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTSYDMKWVRQAPGLGLEWVSAISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHDFGAFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 626)
(13) 12798B (REGN17078)
Fab 경쇄
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQTVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGSSSRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 627)
Fab 중쇄
EVQLVESGGDLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSATRVYADSVKGRFTISRDNAKNFLYLQMNSLRSEDTALYHCAKDMDISLGYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 628); 또는
EVQLVESGGDLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSATRVYADSVKGRFTISRDNAKNFLYLQMNSLRSEDTALYHCAKDMDISLGYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPLLQGSG (서열번호 667)
(14) 12799B (REGN17079)
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIASWLAWYQQKPGKAPELLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQANYFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 629)
Fab 중쇄
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVVWIRQPPGKALEWLALIYWNDHKRYSPSLGSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHYSGSYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 630); 또는
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVVWIRQPPGKALEWLALIYWNDHKRYSPSLGSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHYSGSYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPLLQGSG
(서열번호 668)
(15) 12801B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRTDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLRPEDFATFYCLQYNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 631)
Fab 중쇄
EVQLLESGGALVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYAMHWVRQAPGKGLEWVSSIRGSGGGTYSADSVKGRFTISRDNSRDTLYLQMNSVRAEDTAVYYCARSHDYGAFDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 632)
(16) 12802B
Fab 경쇄
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSINLAWYQQKPGQAPRLLIFVASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFATYYCQQYDIWPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 633)
Fab 중쇄
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWIRQAPGKGLEWVSYISSTGSTINYADSVKGRFTISRDNVKNSLYLQMTSLRVEDTAVYYCTRDNWNYEYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 634)
(17) 12808B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPLRFSGSGSGTEFTLTINNLQPEDFATYYCLSHNSYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 635)
Fab 중쇄
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGESISSNTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIDYSGTTNYNPSLKSRVTISVDTSRNHFSLRLRSVTAADTAVYYCAREWGNYGYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 636)
(18) 12812B
Fab 경쇄
DIQMTQSPPSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 637)
Fab 중쇄
QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASRGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFLARVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKGWNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 638)
(19) 12816B
Fab 경쇄
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHGNGYNYLTWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 639)
Fab 중쇄
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMNWIRQAPGKGLEWVSYISSSGTTIYYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLEMNSLRAEDTAVYYCAREGYGNDYYYYGIDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH (서열번호 640)
(20) 12833B
Fab 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 641)
Fab 중쇄
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(21) 12834B
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(22) 12835B
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(23) 12847B (REGN17083)
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(서열번호 669)
(24) 12848B
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(25) 12843B (REGN17081)
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(서열번호 670)
(26) 12844B
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(27) 12845B (REGN17082)
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(서열번호 671)
(28) 12839B (REGN17080)
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(서열번호 672)
(29) H1H12841B
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(30) 12850B
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(31) 69261
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(32) 69263
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항-TfR scFV:GAA 서열:
(1) 12795B
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(서열번호 675)
(2) 12798B (REGN16818)
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(서열번호 676)
(3) 12799B (REGN16819)
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(4) 12801B
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(6) 12808B
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(서열번호 702);
(1)
MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADADIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIASWLAWYQQKPGKAPELLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQANYFPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVVWIRQPPGKALEWLALIYWNDHKRYSPSLGSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHYSGSYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
(서열번호 703; 선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 709) 서열 결여);
(2)
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(서열번호 704; 선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 709) 서열 결여);
(3)
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(서열번호 705; 선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 709) 서열 결여);
(4)
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(서열번호 706; 선택적으로 N-말단 MHRPRRRGTRPPPLALLAALLLAARGADA(서열번호 709) 서열 결여);
시험관내 결합에 대해 스크리닝된 항-인간 TfR 항체를 입증하기 위해, 본 발명자들은 혈액-뇌-장벽(BBB) 횡단을 평가하기 위한 Tfrc hum/hum 유전자삽입 마우스에서 생체내 마우스 연구를 수행하였다. 웨스턴 블롯에 의해 검출된 뇌 호모게네이트(brain homogenate)에서 성숙 hGAA 단백질을 갖는 7개의 클론을 31개의 항체의 이러한 제1 스크린으로부터 선택하였다.
유체역학적 전달(HDD)에 의한 GAA 융합물. 3개월령의 인간 TFRC 유전자삽입 마우스에 간 특이적 마우스 TTR 프로모터 하에 항-hTfRscfv:2xG4S:hGAA 형식으로 다양한 항-hTfR 항체를 발현하는 DNA 플라스미드를 주사하였다. 마우스는 마우스의 체중의 10%(0.1 mL/g 체중)로 희석된 0.9% 멸균 식염수 중의 50 μg의 DNA를 받았다. 주사 후 48시간에, CO2 질식에 의한 희생 직후 마우스로부터 조직을 적출하고, 액체 질소에서 스냅 동결하고, -80℃에서 저장하였다.
조직 용해물을 프로테아제 억제제(1861282, Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)가 있는 RIPA 완충액 중의 용해에 의해 제조하였다. 조직 용해물을 비드 균질화기 (FastPrep5, MP Biomedicals, 미국 캘리포니아주 산타아나 소재)로 균질화하였다. 세포 또는 조직 용해물을 Novex 시스템(LifeTech Thermo, XPO4200BOX, LC2675, LC3675, LC2676)을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 실행시켰다. 겔을 저형광 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(IPFL07810, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 옮기고, Revert 700 총 단백질 염색(TPS; 926-11010 LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 염색한 다음, 0.1% Tween 20이 있는 트리스 완충액 식염수에서 Odyssey 차단 완충액(927-500000, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 차단하고, GAA에 대한 항체(ab137068, Abcam, 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재) 또는 항-GAPDH (ab9484, Abcam, 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재) 및 적절한 2차(926-32213 또는 925-68070, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)로 염색하였다. 블롯을 LI-COR Odyssey CLx으로 이미지화하였다.
단백질 밴드 강도를 LI-COR Image Studio 소프트웨어에서 정량화하였다. 각각의 샘플에 대한 성숙 77 kDa GAA의 정량화를 레인의 TPS 신호에 대한 제1 정규화에 이어서 혈청 내 GAA 수준에 대한 정규화에 의해 결정하였다(각각 로딩 대조군 및 간 발현 대조군). 이어서, 값을 Wt 마우스의 양성 대조군 그룹 항-마우스 TfRscfv:hGAA 및 Tfrc hum/hum 마우스의 음성 대조군 항-mTfRscfv:hGAA와 비교하였다(도 18a 내지 도 18c, 표 31). 8D3 scFv(항-마우스 TfR scFv)는 중쇄 아미노산 서열: EVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYVVDVWGQGVSVTVSS(서열번호 536) 및 중쇄 아미노산 서열: DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKLELK(서열번호 537)을 갖는다.
[표 31]
Figure pct00054
데이터는 웨스턴 블롯으로부터 임의 단위로 정량화하였다(도 18a 내지 도 18c). 모든 값은 평균 ± SD, 그룹당 n=3-6이다. 일원 ANOVA 대 Tfrc hum/hum 마우스의 음성 대조군 항-mTfRscfv:hGAA; *p<0.05; **p<0.005; ***p<0.0001.
항-hTfRscfv:hGAA 플라스미드의 HDD 후 뇌 샘플의 모세혈관 고갈. 표 31에서 선택된 항-hTfRscfv:hGAA를 Tfrc hum 마우스의 2차 스크린에서 시험하여 hGAA가 뇌 실질에서 존재하고 BBB 내피세포에 포획되지 않는지 여부를 결정하였다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯 상에서 실질 분획 내 성숙 hGAA뿐만 아니라 시노몰구스 TfR에 대한 높은 친화력을 기준으로 이 스크린으로부터 4개의 scFv(12799, 12839, 12843, 및 12847)를 선택하였다.
3개월령의 동물을 상기 상세하게 기재된 바와 같이 HDD로 치료하였다. 주사 후 48시간에, 마우스를 CO2 질식에 의한 희생 직후 30 mL의 0.9% 식염수로 관류시켰다. 대뇌의 2 mm 관상면 슬라이스를 브레그마와 -2 mm 브레그마 사이에서 취하고, 얼음 상의 700 μL의 생리학적 완충액(0.9% 식염수 pH 7.4 중 10 mM HEPES, 4 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1 mM NaH2PO4, 10 mM D-글루코스)에 두었다. 뇌 슬라이스를 유리 다운스 균질화기(dounce homogenizer)로 얼음 상에서 부드럽게 균질화하였다. 생리학적 완충액 중의 26% 덱스트린(MW 70,000 Da)의 동일한 부피를 첨가하고(최종 13% 덱스트린), 10 초과의 스트로크로 균질화하였다. 실질(상청액) 및 내피(펠릿) 분획을 4℃에서 15분 동안 5,400g로 원심분리하여 분리하였다. 항-hGAA 웨스턴 블롯을 상기와 같이 분획에 대해 수행하였다(도 19, 표 32). 블롯을 또한 항-CD31 내피 마커(Abcam ab182982)로 규명하였다.
[표 32]
Figure pct00055
hGAA 단백질을 웨스턴 블롯으로부터 임의 단위로 정량화하였다(도 19). 그룹당 n=1. hTfR에 대한 결합 퍼센트로 계산된 시노몰구스 원숭이 TfR에 대한 친화력의 Luminex 데이터: (mfTfR 결합 ÷ hTfR 결합) ×100.
[표 33]
Figure pct00056
데이터는 웨스턴 블롯으로부터 임의 단위로 정량화하였다(도 19). 모든 값은 평균 ± SD, 그룹당 n=2-4이다.
간 데포 AAV8 항-hTfRscfv:hGAA 치료 후 마우스의 뇌 샘플의 모세혈관 고갈. 보다 장기적 치료 모델에서의 본 발명자들의 HDD 스크린 발견을 확인하기 위해, 본 발명자들은 Tfrc hum 마우스를 TTR 프로모터 하에 에피솜 간 데포 AAV8 항-hTfRscfv:GAA로 전달되는 선택된 항-hTfRscfv:GAA로 치료하였다. 본 발명자들은 모든 4개의 항-hTfRscfv:GAA이 AAV8로 전달될 때 성숙 hGAA를 뇌 실질에 전달하였음을 발견하였다.
AAV 생산 및 생체내 형질도입. 재조합 AAV8(AAV2/8)을 HEK293 세포에서 생산하였다. 세포에 아데노바이러스 헬퍼 유전자, AAV8 rep, 및 캡 유전자를 인코딩하는 3개의 플라스미드 및 AAV2 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된 전이유전자를 함유하는 재조합 AAV 게놈을 형질주입하였다. 5일차에, 세포 및 배지를 수집하고, 원심분리하고, AAV 정제를 위해 처리하였다. 세포 펠릿을 동결 융해에 의해 용해시키고 원심분리에 의해 제거하였다. 처리된 세포 용해물 및 배치를 이오딕사놀 구배 컬럼 상에 놓고, 초원심분리기 내에서 원심분리하였다. 바이러스 분획을 40% 내지 60%의 이오딕사놀 용액 사이의 계면으로부터 제거하고, 탈염 컬럼이 있는 1xPBS로 교환하였다. AAV vg를 ddPCR에 의해 정량화하였다. AAV를 주사 직전 PBS + 0.001% F-68 플루로닉 중에 용해시켰다. 3개월령의 Tfrc hum 마우스에 약 100 μL 부피의 3e12 vg/(체중 kg)를 투여하였다. 마우스를 주사 후 4주차에 희생시키고, 모세혈관 고갈 및 웨스턴 블롯팅을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다(도 20, 표 34).
[표 34]
Figure pct00057
데이터는 웨스턴 블롯으로부터 임의 단위로 정량화하였다(도 20). 그룹당 n=1.
AAV8 에피솜 간 데포 항-hTfRscfv:GAA가 있는 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 글리코겐 저장 표현형의 구제. 본 발명자들은 hTfRscfv:GAA가 글리코겐 저장 표현형을 구제하는지 여부를 결정하기 위해 폼페병 모델 마우스에서 상기 실험의 4개의 항-hTfRscfv:GAA을 시험하였다. 본 발명자들은 4개(12839, 12843, 12847, 12799) 전부가 글리코겐을 Wt 수준으로 정상화되었음을 발견하였다.
AAV 생산 및 생체내 형질도입을 상기와 같이 수행하였다. 3개월령의 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스에 2e12 vg/kg의 AAV8을 투여하였다. 조직을 주사 후 4주차에 수확하고, 상기와 같이 플래시 동결하였다. hGAA 웨스턴 블롯을 상기와 같이 수행하였다(도 21, 표 35).
글리코겐 정량화(표 36, 도 22a 내지 도 22c). CO2 질식에 의한 희생 직후 마우스로부터 조직을 적출하고, 액체 질소에서 스냅 동결하고, -80℃에서 저장하였다. 글리코겐 측정을 위한 증류수 또는 단백질 분석을 위한 RIPA 완충액 중에 스테인리스 강재 비드가 있는 벤치탑 균질기 상에서 조직을 용해시켰다. 글리코겐 분석 용해물을 비등하고, 조직 파편을 제거하기 위해 원심분리하였다. 글리코겐 측정을 제조업체(K646, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)의 지시에 따라 상업적인 키트로 형광측정을 수행하였다. 모든 그룹은 주사 후 4주차에 정상적인 철 항상성을 가졌다(혈청 철, TIBC, 헵시딘, 조직 철, 조직 트랜스퍼린).
[표 35]
Figure pct00058
데이터는 웨스턴 블롯으로부터 임의 단위로 정량화하였다(도 21). 모든 값은 평균 ± SD, 그룹당 n=1-3이다. *총 hGAA 단백질; **성숙 hGAA 단백질;
[표 36]
Figure pct00059
모든 값은 (글리코겐 μg)/(조직 mg), 평균 ± SD, 그룹당 n=3-4이다. 일원 ANOVA *p<0.0001 대 Gaa -/- 치료되지 않은 그룹. DRG의 경우, 단일 값을 그룹당 다섯 마리의 마우스로부터의 풀링 요추 DRG로부터 생성하였다.
AAV8 에피솜 간 데포 항-hTfRscfv:GAA가 있는 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스의 뇌 및 근육 내 글리코겐 저장 표현형의 구제. 본 발명자들은 hTfRscfv:GAA가 글리코겐 저장 표현형을 구제하는지 여부를 결정하기 위해 폼페병 모델 마우스의 3개의 선택된 항-hTfRscfv:GAA(12799, 12843, 및 12847)를 시험하였다. 이 실험에서, 본 발명자들은 뇌 및 근육 섹션에서 조직학을 수행하여 조직 내 글리코겐을 시각화하였다. 본 발명자들은 3개의 선택된 모든 항-hTfRscfv:GAA가 뇌 및 근육 내 글리코겐 염색을 감소시켰음을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 데이터를 기반으로 추가 분석을 위해 12847scfv:GAA를 선택하였다.
AAV 생산 및 생체내 형질도입을 상기와 같이 수행하였다. 3개월령의 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스에 4e11 vg/kg의 AAV8을 투여하였다. 주사 후 4주차에, 조직을 상기와 같이 글리코겐 분석을 위해 동결하였다(표 37). 조직학을 위해, 동물을 식염수(0.9% NaCl)로 관류시키고, 조직을 10% 정상 완충 포르말린에서 밤새 적하 고정(drop-fix)하였다. 조직을 PBS로 3회 세정하고, 포매할 때까지 PBS/0.01% 나트륨 중에 저장하였다. 조직을 파라핀에 포매하고, 5 um 섹션을 뇌(관상면, -2 mm 브레그마) 및 사두근(섬유 단면적)으로부터 절단하였다. 섹션을 표준 프로토콜을 사용하여 과요오드산-쉬프 및 헤마톡실린으로 염색하였다(도 23a 내지 도 23d).
[표 37]
Figure pct00060
모든 값은 (글리코겐 μg)/(조직 mg), 평균 ± SD, 그룹당 n=5-8이다. 일원 ANOVA *p<0.0001 대 Gaa -/- 치료되지 않은 그룹.
Gaa -/- /Tfrc hum 마우스에서의 항-hTfR 12847scfv:GAA의 삽입. 본 발명자들은 에피솜 AAV8 간 데포 발현으로 관찰된 결과를 재현할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 알부민 삽입에 의해 폼페병의 모델 마우스에서 선택된 항-hTfR 12847scfv:GAA를 시험하였다. 12847scfv:GAA의 알부민 삽입은 성숙 hGAA 단백질을 뇌 및 근육에 전달하고, Gaa -/- /Tfrc hum 마우스에서 글리코겐 저장 표현형을 구제하였다. 이들 데이터는 최적화되지 않은 자연 12847scfv:GAA 서열로 생성되었다.
본 발명자들은 12847scfv:GAA를 Gaa -/- /Cd63 hum 마우스의 근육 표적화된 항-hCD63scfv:GAA와 비교하였다. 이 특정 실험에서, 항-hCD63scfv:GAA의 발현은 보통보다 더 낮았으며, 일반적인 것보다 더 많은 GAA 단백질을 근육에 전달하지도 않고 글리코겐을 정상화하지도 않는다. 이는 항-hCD63scfv:GAA가 근육에서 12847scfv:GAA보다 덜 효과적인 것으로 보이도록 하지만, 대부분의 실험에서, 본 발명자들은 이들이 근육에서 필적할 만함을 발견하였다.
AAV 생산. 프로모터가 없는 AAV 게놈 플라스미드를 12847scfv:GAA 서열 및 3' 단부에서 마우스 알부민 엑손 1 스플라이스 수용체 부위로 생산하였다. 재조합 AAV8(AAV2/8)을 HEK293 세포에서 생산하였다. 세포에 아데노바이러스 헬퍼 유전자, AAV8 rep, 및 캡 유전자를 인코딩하는 3개의 플라스미드 및 AAV2 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된 전이유전자를 함유하는 재조합 AAV 게놈을 형질주입하였다. 5일차에, 세포 및 배지를 수집하고, 원심분리하고, AAV 정제를 위해 처리하였다. 세포 펠릿을 동결 융해에 의해 용해시키고 원심분리에 의해 제거하였다. 처리된 세포 용해물 및 배치를 이오딕사놀 구배 컬럼 상에 놓고, 초원심분리기 내에서 원심분리하였다. 바이러스 분획을 40% 내지 60%의 이오딕사놀 용액 사이의 계면으로부터 제거하고, 탈염 컬럼이 있는 1xPBS로 교환하였다. AAV vg를 ddPCR에 의해 정량화하였다.
알부민 유전자좌 내로의 생체내 CRISPR/Cas9 삽입. 3개월령의 Gaa -/- /Tfrc hum 마우스에 PBS + 0.001% F-68 플루로닉으로 희석된 3e12 vg/kg AAV8 12847scfv:GAA 및 3 mg/kg LNP G666/Cas9 mRNA를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 마우스를 주사 후 3주차에 희생시켰다. 음성 대조군 마우스는 LNP가 없는 AAV8을 삽입하였다. 양성 대조군 마우스는 TTR 프로모터 하에 4e11 vg/kg의 에피솜 간 데포 AAV8 12847scfv:GAA를 투여하였다(이전에 나타낸 표현형 구제 데이터). CO2 질식에 의한 희생 직후 마우스로부터 조직을 적출하고, 액체 질소에서 스냅 동결하고, -80℃에서 저장하였다. 혈액을 CO2 질식 직후 심장 천자에 의해 마우스로부터 수집하고, 혈청을 혈청 분리기 튜브(BD Biosciences, 365967)를 사용하여 분리하였다.
[표 38]
Figure pct00061
웨스턴 블롯( 표 39, 도 24a ). 조직 용해물을 프로테아제 억제제(1861282, Thermo Fisher, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)가 있는 RIPA 완충액 중의 용해에 의해 제조하였다. 조직 용해물을 비드 균질화기 (FastPrep5, MP Biomedicals, 미국 캘리포니아주 산타아나 소재)로 균질화하였다. 세포 또는 조직 용해물을 Novex 시스템(LifeTech Thermo, XPO4200BOX, LC2675, LC3675, LC2676)을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 실행시켰다. 겔을 저형광 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(IPFL07810, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 옮기고, Revert 700 총 단백질 염색(TPS; 926-11010 LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 염색한 다음, 0.1% Tween 20이 있는 트리스 완충액 식염수에서 Odyssey 차단 완충액(927-500000, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)으로 차단하고, GAA에 대한 항체(ab137068, Abcam, 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재) 또는 항-GAPDH (ab9484, Abcam, 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재) 및 적절한 2차(926-32213 또는 925-68070, LI-COR, 미국 네브레스카주 링컨 소재)로 염색하였다. 블롯을 LI-COR Odyssey CLx으로 이미지화하였다.
단백질 밴드 강도를 LI-COR Image Studio 소프트웨어에서 정량화하였다. 레인의 TPS 신호(로딩 대조군)를 정규화하여 각각의 샘플에 대한 성숙 77 kDa GAA 밴드의 정량화를 결정하였다.
글리코겐 정량화( 표 40, 도 24b ). CO2 질식에 의한 희생 직후 마우스로부터 조직을 적출하고, 액체 질소에서 스냅 동결하고, -80℃에서 저장하였다. 글리코겐 측정을 위한 증류수 또는 단백질 분석을 위한 RIPA 완충액 중에 스테인리스 강재 비드가 있는 벤치탑 균질기 상에서 조직을 용해시켰다. 글리코겐 분석 용해물을 비등하고, 조직 파편을 제거하기 위해 원심분리하였다. 글리코겐 측정을 제조업체(K646, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)의 지시에 따라 상업적인 키트로 형광측정을 수행하였다.
[표 39]
Figure pct00062
모든 값은 임의 단위, 평균 ± SD, 그룹당 n=3-8이다. 일원 ANOVA *p<0.05 대 Gaa -/- 에피솜 AAV8 TTR 12847scfv:GAA 그룹; §§ p<0.001 대 오직 AAV의 음성 대조군 그룹.
[표 40]
Figure pct00063
모든 값은 (글리코겐 μg)/(조직 mg), 평균 ± SD, 그룹당 n=3-8이다. 일원 ANOVA *p<0.01 대 Gaa -/- /Cd63 hum 치료되지 않은 그룹; **p<0.001 대 Gaa -/- /Cd63 hum 치료되지 않은 그룹; ***p<0.0001 대 Gaa -/- /Tfrc hum 치료되지 않은 그룹; §비-유의 대 Wt 치료되지 않은 그룹.
이어서, 신생아 Gaa-/-;Tfrchu/hu 마우스에 다음을 P1에서 정맥내 투여하는 유사한 실험을 수행한다: (1) 항-TfR:GAA를 인코딩하는 재조합 AAV8; 또는 (2) LNP-g666 및 재조합 AAV8 항-TfR:GAA 삽입 템플릿. 치료되지 않은 Gaa-/-;Tfrchu/hu 마우스 및 야생형 마우스를 대조군으로 사용한다. 혈액을 수집하고, 주사 후 다양한 시점에서 혈청을 준비하고, 조직을 투여 후 다양한 시점에서 수집한다. 다양한 근육 및 CNS 조직 내 혈청 항-TfR:GAA 수준 및 글리코겐 수준을 시간 경과에 걸쳐 측정한다.
글리코겐 감소가 개선된 근육 기능으로 번역되는지 여부를 평가하기 위해, 마우스를 투여 후 시점에서 악력 장치 상에 시험한다. 팔의 악력을 힘 미터(Columbus Instruments, 미국 오하이오주 콜럼버스 소재)로 측정한다. 모든 시험을 3회 반복 수행한다.
요약하면, LNP에 의해 전달되는 고도로 정확하고 표적화된 CRISPR/Cas9 기술과 선택된 rAAV8 벡터에 의해 전달되는 항-TfR:GAA DNA 템플릿의 조합이 헤파토사이트로부터 항-TfR:GAA 단백질이 장기적으로 발현되게 하고 PD에 영향을 받은 근육 세포 및 CNS 세포로 전달되도록 하며, 잠재적으로 신생아 환자를 포함하는 PD 환자의 평생 동안의 효과적인 치료를 제공한다.
실시예 7. 최적화된 항-TfR:GAA DNA 템플릿
최적화된 항-TfR:GAA 템플릿을 비-인간 영장류(NHP) 연구에 대한 리드를 개발하기 위해 설계 및 제작하였다. 개발 후보를 선택하기 위해, 항-TfR:GAA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 변형(예를 들어, CpG 고갈에 의함)된 4개의 후보 항-TfR:GAA 삽입 템플릿의 몇몇의 버전을 제작하였다. 표 41 및 표 42는 설계된 여러가지 버전의 항-TfR:GAA 삽입물을 나열하고 있다. 표 42의 각각의 항-TfR:GAA 삽입물은 서열번호 176에 제시된 최적화된 GAA 서열을 사용한다.
[표 41]
Figure pct00064
[표 42]
Figure pct00065
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 단리한다. 플라스마시토이드 수지상 세포(pDC)를 농축하고 pBMC(웰당 1e4 pDC + 1e5 PBMC)와 조합한다. 세포를 AAV 또는 대조군 CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 함께 16시간 내지 18시간 동안 인큐베이션한다. 상청액을 수확하고, IFNα ELISA를 수행한다. 이 검정은 CpG-고갈된 항-TfR:GAA 서열이 비-CpG-고갈된 서열과 비교하여 1차 인간 플라스마시토이드 DC 기반 검정에서 감소된 IFN-I 반응을 나타내는지 여부를 평가한다.
다양한 12847 최적화된 항-TfR:GAA 템플릿(서열번호 732-735 또는 584-586(코딩 서열)) 및 12843 최적화된 항-TfR:GAA 템플릿(서열번호 729-731 또는 581-583(코딩 서열))의 활성을 1차 인간 헤파토사이트 검정에서 시험하였다. AAV 템플릿을 AAV2 바이러스 내로 패키징하였다. 1차 인간 헤파토사이트를 96-웰 플레이트 내에 성장시키고, LNP 용량 적정으로 고정된 MOI(6e4)의 LNP-g9860 및 템플릿 DNA를 함유하는 AAV를 투여하였다. 상청액을 투여 후 7일차에 수집하고, 섭씨 -80도에서 저장하였다. 상청액을 융해하고, 상청액의 GAA 활성을 세포로부터 생성 및 분비된 효소 활성 GAA 생성물의 양의 측정으로서 4-메틸움벨리페론 기반 형광측정 검정(K690, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)을 사용하여 측정하였다. 도 25a 및 도 25b에 나타낸 바와 같이, 모든 CpG-고갈된 항-TfR:GAA 템플릿은 자연 항-TfR:GAA 템플릿과 비교하여 1차 인간 헤파토사이트 상청액에서 증가된 GAA 활성을 나타냈다.
최적화된 템플릿의 활성을 1차 인간 헤파토사이트 검정에서 시험한다. AAV 템플릿을 AAV2 바이러스 내로 패키징한다. 1차 인간 헤파토사이트를 96-웰 플레이트 내에 성장시키고, AAV 용량 적정으로 고정된 LNP 농도의 LNP-g9860 및 템플릿 DNA를 함유하는 AAV를 투여한다. 상청액을 투여 후 7일차에 수집하고, 섭씨 -80도에서 저장한다. 상청액을 융해하고, 상청액의 GAA 활성을 세포로부터 생성 및 분비된 효소 활성 GAA 생성물의 양의 측정으로서 4-메틸움벨리페론 기반 형광측정 검정(K690, BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)을 사용하여 측정한다.
이어서, 12847 scFv:GAA 0 CpG v0 최적화된 템플릿(서열번호 733 또는 서열번호 584(코딩 서열))의 활성을 실시예 6에 기재된 바와 같이 PD 마우스 모델, Gaa-/-;Tfrchu/hu에서 입증하였다. 3개월령의 마우스(Gaa-/-;Tfrchu/hu 마우스 및 Gaa-/-;CD63hu/hu 마우스)에 각각 3 mg/kg LNP-g9860 및 3ev12 vg/kg AAV8 항-TfR:GAA 템플릿(자연 또는 12847 0 CpG v0) 및 최적화된 항-CD63:GAA 템플릿(GA 0 CpG 항-CD63:GAA 템플릿; 서열번호: 736 또는 서열번호 196(코딩 서열))을 정맥내 투여하였다. GAA(scFv:GAA 및 성숙 GAA)에 대한 웨스턴 블롯을 실시예 6에서와 같이 수행하였고, 자연 항-TfR:GAA 템플릿 또는 0 CpG 항-TfR:GAA 템플릿의 알부민 삽입 후 뇌(대뇌)로의 GAA의 전달을 확인시켜 주었다(도 26a). 대뇌, 사두근, 횡격막, 및 심장 내 글리코겐 정량화를 또한 실시예 6에서와 같이 수행하였고, 0 CpG 항-TfR:GAA 템플릿의 알부민 삽입이 생체내에서 TfR 결합 및 GAA 활성을 유지하고 CpG 고갈된 서열이 Gaa-/-;Tfrchu/hu 마우스에서 글리코겐 저장 표현형을 구제하는 데 자연 서열만큼 효과적이었음을 확인시켜 주었다(도 26b 및 표 43).
[표 43]
최적화된 템플릿 12847 scFv:GAA 0 CpG v0(서열번호 733 또는 서열번호 584(코딩 서열)) 및 12843 scFv:GAA 0 CpG v0(서열번호 729 또는 581(코딩 서열))의 발현을 비-인간 영장류에서 평가한다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 LNP-g9860 및 각각 최적화된 템플릿을 포함하는 rAAV8을 투여하여 발현을 평가한다. 발현을 수주 연구에 걸쳐 분석한다. 조직을 또한 GAA의 생체분포 분석을 위해 수집하고, GAA 활성을 수집된 조직에서 평가한다.
[표 44]
Figure pct00067
[표 45]
Figure pct00068
서열목록 전자파일 첨부

Claims (647)

  1. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈되고(CpG-depleted), 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 조성물.
  2. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합되는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈되는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항원 결합 단백질을 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인은 항-CD63 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, CD63-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, scFv는 서열번호 183에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 183을 포함하는 scFv를 인코딩하는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 184-192 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 186에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈되는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 193에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암(homology arm)을 포함하지 않는, 조성물.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하는, 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는, 조성물.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터인, 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA인, 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재하는, 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재하는, 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 조성물.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)에 의해 플랭킹되고(flank), 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터인, 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래되는, 조성물.
  49. 제48항에 있어서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터인, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터인, 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 CpG-고갈되는, 조성물.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함하는, 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이고, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN);
    (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는
    (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고, Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  57. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성되는, 조성물.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함하는, 조성물.
  66. 제57항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성되는, 조성물.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하는, 조성물.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 조성물.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  78. 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  79. 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)인, 조성물.
  80. 제69항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  81. 제57항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 조성물.
  82. 제81항에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) Cas9 단백질로부터 유래하는, 조성물.
  83. 제81항에 있어서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래되는, 조성물.
  84. 제57항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  85. 제57항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 조성물.
  86. 제57항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 조성물.
  87. 제86항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형되는, 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘인, 조성물.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되는, 조성물.
  91. 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  93. 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  94. 제57항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  95. 제57항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  97. 제57항 내지 제94 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  99. 제57항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질(helper lipid), 및 스텔스 지질(stealth lipid)을 포함하는, 조성물.
  101. 제100항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)인, 조성물.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 조성물.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG)인, 조성물.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 조성물.
  106. 제99항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 4개의 지질을 포함하는, 조성물.
  107. 제99항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  109. 제57항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 194-202 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 196에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 736에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  112. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  113. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  114. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  115. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  116. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  117. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  118. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  119. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  120. 제119항에 있어서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현되는, 세포.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 간 세포(liver cell)인 세포.
  122. 제121항에 있어서, 간 세포는 헤파토사이트(hepatocyte)인, 세포.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  124. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포인 세포.
  125. 제124항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  126. 제124항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  127. 제124항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  128. 제124항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  129. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포가 아닌 세포.
  130. 제119항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에 존재하는 세포.
  131. 제119항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 또는 생체외에 존재하는 세포.
  132. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  133. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  134. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법.
  135. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  136. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법.
  137. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단인, 방법.
  139. 제132항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단인, 방법.
  140. 제132항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단인, 방법.
  141. 제132항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단인, 방법.
  142. 제141항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되고, 선택적으로, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  143. 제141항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되고, 선택적으로, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  144. 제132항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이 아니고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아닌, 방법.
  145. 제132항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재하는, 방법.
  146. 제132항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재하는, 방법.
  147. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  148. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  149. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법.
  150. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인이고,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  151. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법.
  152. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  153. 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근 및 심장 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화되는, 방법.
  154. 제147항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포인, 방법.
  155. 제147항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 헤파토사이트인, 방법.
  156. 제147항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
  157. 제147항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포인, 방법.
  158. 제157항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  159. 제157항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  160. 제147항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포가 아닌, 방법.
  161. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  162. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  163. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  164. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  165. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  166. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  167. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  168. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  169. 제146항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 폼페병을 갖는, 방법.
  170. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 폼페병의 치료 방법.
  171. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 폼페병의 치료 방법.
  172. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  173. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  174. 제169항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 방법.
  175. 제169항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 방법.
  176. 제146항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 방법.
  177. 제146항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체이고, 선택적으로, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내, 출생 후 12주 이내, 출생 후 8주 이내, 또는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  178. 제146항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 방법.
  179. 제146항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는 방법.
  180. 제146항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장 조직, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키고, 선택적으로, 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 수준을 감소시키는 방법.
  181. 제146항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지하는, 방법.
  182. 제181항에 있어서, 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 하는, 방법.
  183. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  184. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  185. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  186. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제53항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  187. 제183항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  188. 제183항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  189. 제183항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  190. 제183항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  191. 제183항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  192. 제183항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  193. 제183항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  194. 제193항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  195. 제193항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  196. 제183항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  197. 제146항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현이 증가되는, 방법.
  198. 제146항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준이 증가되는 방법.
  199. 제146항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  200. 제146항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  201. 제146항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  202. 제146항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  203. 제146항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성하는 방법.
  204. 제146항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하거나;
    (II) 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하는, 방법.
  205. 제146항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  206. 제146항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  207. 제146항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  208. 제146항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  209. 제146항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  210. 제146항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  211. 제146항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 핵산 작제물을 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  212. 제211항에 있어서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력인, 방법.
  213. 제211항 또는 제212항에 있어서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  214. 제132항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되는, 방법.
  215. 제132항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는, 방법.
  216. 제215항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여되는, 방법.
  217. 제215항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여되는, 방법.
  218. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈되는, 조성물.
  219. 제218항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인은 펩타이드 링커를 통해 리소솜 알파-글리코시다제 단백질에 융합되는, 조성물.
  220. 제218항 또는 제219항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된, 조성물.
  221. 제218항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  222. 제218항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  223. 제218항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  224. 제218항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  225. 제218항 내지 224중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  226. 제218항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  227. 제218항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  228. 제218항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  229. 제218항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈되는, 조성물.
  230. 제218항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  231. 제218항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항원 결합 단백질을 포함하는, 조성물.
  232. 제231항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은
    (i) 서열번호 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 또는 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및/또는
    (ii) 서열번호 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 522, 또는 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, 조성물.
  233. 제231항 또는 제232항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함하는, 조성물:
    (1) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (2) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (3) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (4) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (5) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (6) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (7) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (8) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (9) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (10) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (11) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (12) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (13) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (14) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (15) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (16) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (17) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (18) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (19) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (20) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (21) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (22) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (23) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (24) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (25) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (26) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (27) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (28) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (29) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (30) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (31) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는
    (32) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR.
  234. 제231항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은
    (1) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는
    (2) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, 조성물.
  235. 제231항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 서열번호 218(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 219(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 220(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 223(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 224(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 225(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (b) 서열번호 228(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 229(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 230(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 233(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 234(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 235(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (c) 서열번호 238(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 239(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 240(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 243(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 244(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 245(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (d) 서열번호 248(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 249(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 250(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 253(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 254(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 255(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (e) 서열번호 258(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 259(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 260(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 263(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 264(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 265(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (f) 서열번호 268(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 269(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 270(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 273(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 274(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 275(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (g) 서열번호 278(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 279(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 280(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 283(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 284(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 285(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (h) 서열번호 288(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 289(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 290(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 293(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 294(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 295(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (i) 서열번호 298(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 299(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 300(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 303(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 304(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 305(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (j) 서열번호 308(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 309(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 310(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 313(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 314(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 315(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (k) 서열번호 318(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 319(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 320(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 323(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 324(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 325(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (l) 서열번호 328(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 329(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 330(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 333(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 334(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 335(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (m) 서열번호 338(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 339(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 340(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 343(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 344(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 345(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (n) 서열번호 348(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 349(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 350(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 353(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 354(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 355(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (o) 서열번호 358(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 359(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 360(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 363(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 364(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 365(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (p) 서열번호 368(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 369(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 370(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 373(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 374(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 375(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (q) 서열번호 378(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 379(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 380(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 383(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 384(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 385(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (r) 서열번호 388(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 389(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 390(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 393(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 394(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 395(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (s) 서열번호 398(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 399(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 400(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 403(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 404(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 405(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (t) 서열번호 408(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 409(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 410(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 413(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 414(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 415(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (u) 서열번호 418(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 419(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 420(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 423(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 424(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 425(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (v) 서열번호 428(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 429(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 430(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 433(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 434(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 435(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (w) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (x) 서열번호 448(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 449(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 450(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 453(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 454(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 455(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (y) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (z) 서열번호 468(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 469(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 470(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 473(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 474(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 475(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (aa) 서열번호 478(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 479(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 480(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 483(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 484(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 485(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (ab) 서열번호 488(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 489(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 490(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 493(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 494(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 495(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (ac) 서열번호 498(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 499(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 500(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 503(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 504(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 505(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (ad) 서열번호 508(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 509(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 510(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 513(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 514(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 515(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR;
    (ae) 서열번호 518(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 519(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 520(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 523(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 524(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 525(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및/또는
    (af) 서열번호 528(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 529(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 530(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 533(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 534(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 535(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR.
  236. 제231항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은
    (a) 서열번호 438(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 439(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 440(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 443(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 444(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 445(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 또는
    (b) 서열번호 458(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 459(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 460(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 463(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 464(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 465(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는, 조성물.
  237. 제231항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은 하기를 포함하는, 조성물:
    (i) 서열번호 217(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 222(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (ii) 서열번호 227(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 232(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (iii) 서열번호 237(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 242(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (iv) 서열번호 247(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 252(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (v) 서열번호 257(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 262(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (vi) 서열번호 267(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 272(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (vii) 서열번호 277(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 282(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (viii) 서열번호 287(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 292(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (ix) 서열번호 297(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 302(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (x) 서열번호 307(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 312(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xi) 서열번호 317(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 322(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xii) 서열번호 327(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 332(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xiii) 서열번호 337(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 342(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xiv) 서열번호 347(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 352(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xv) 서열번호 357(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 362(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xvi) 서열번호 367(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 372(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xvii) 서열번호 377(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 382(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xviii) 서열번호 387(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 392(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xix) 서열번호 397(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 402(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xx) 서열번호 407(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 412(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxi) 서열번호 417(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 422(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxii) 서열번호 427(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 432(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxiii) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxiv) 서열번호 447(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 452(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxv) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxvi) 서열번호 467(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 472(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxvii) 서열번호 477(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 482(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxviii) 서열번호 487(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 492(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxix) 서열번호 497(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 502(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxx) 서열번호 507(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 512(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR;
    (xxxi) 서열번호 517(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 522(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 및/또는
    (xxxii) 서열번호 527(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 532(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR.
  238. 제231항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TfR 항원 결합 단백질은
    (i) 서열번호 437(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 442(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR; 또는
    (ii) 서열번호 457(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR; 및 서열번호 462(또는 이의 변이체)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, 조성물.
  239. 제218항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인은 항-TfR 항체, 항체 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, 조성물.
  240. 제239항에 있어서, TfR-결합 전달 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)이고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 다음 배향으로 배열된 도메인을 포함하고: N'-중쇄 가변 영역-경쇄 가변 영역-리소솜 알파 글루코시다제-C' 또는 N'-경쇄 가변 영역-중쇄 가변 영역-리소솜 알파-글리코시다제-C',
    선택적으로, scFv 및 리소솜 알파-글루코시다제는 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고,
    선택적으로, scFv 가변 영역은 펩타이드 링커에 의해 연결되고, 선택적으로, 펩타이드 링커는 -(GGGGS)m-(서열번호 600)이고; 이때, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인, 조성물.
  241. 제240항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 및 리소솜 알파-글루코시다제를 포함하고, VH, VL, 및 리소솜 알파-글루코시다제는 다음과 같이 배열되는, 조성물:
    (i) VL-VH-리소솜 알파-글루코시다제;
    (ii) VH-VL-리소솜 알파-글루코시다제;
    (iii) VL-[(GGGGS)3]-VH-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제; 또는
    (iv) VH-[(GGGGS)3]-VL-[(GGGGS)2]-리소솜 알파-글루코시다제.
  242. 제240항 또는 제241항에 있어서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  243. 제240항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, scFv는 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, scFv는 서열번호 554에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  244. 제218항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  245. 제218항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하는, 조성물.
  246. 제218항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 540, 549, 551, 및 554 중 임의의 하나를 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 554를 포함하는 scFv를 인코딩하는, 조성물.
  247. 제218항 내지 제246중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  248. 제218항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 코딩 서열은 서열번호 587-599 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593-595 중 임의의 하나에 제시된 서열을 구성되고,
    선택적으로, scFv 코딩 서열은 서열번호 593에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  249. 제218항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되거나 CpG-고갈되는, 조성물.
  250. 제218항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  251. 제218항 내지 제250중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  252. 제218항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  253. 제218항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 조성물.
  254. 제218항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  255. 제218항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 570-573 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 584와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 서열번호 573에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  256. 제218항 내지 제255중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  257. 제218항 내지 제256중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  258. 제218항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하는, 조성물.
  259. 제218항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  260. 제218항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  261. 제218항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 조성물.
  262. 제218항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하는, 조성물.
  263. 제218항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는, 조성물.
  264. 제218항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터인, 조성물.
  265. 제218항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA인, 조성물.
  266. 제218항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 조성물.
  267. 제218항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재하는, 조성물.
  268. 제267항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재하는, 조성물.
  269. 제268항에 있어서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 조성물.
  270. 제267항 또는 제268항에 있어서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  271. 제270항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터인, 조성물.
  272. 제270항 또는 제271항에 있어서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래되는, 조성물.
  273. 제272항에 있어서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터인, 조성물.
  274. 제273항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터인, 조성물.
  275. 제218항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  276. 제218항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 CpG-고갈되는, 조성물.
  277. 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함하는, 조성물.
  278. 제277항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이고, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  279. 제278항에 있어서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  280. 제277항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN);
    (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는
    (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  281. 제277항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  282. 제281항에 있어서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  283. 제282항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  284. 제281항 내지 제283항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  285. 제281항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  286. 제281항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성되는, 조성물.
  287. 제281항 내지 제286항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  288. 제281항 내지 제287항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  289. 제281항 내지 제288항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함하는, 조성물.
  290. 제281항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성되는, 조성물.
  291. 제281항 내지 제290항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하는, 조성물.
  292. 제281항 내지 제291항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 조성물.
  293. 제281항 내지 제292항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  294. 제293항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  295. 제293항 또는 제294항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  296. 제293항 내지 제295항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  297. 제293항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  298. 제293항 내지 제297항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  299. 제293항 내지 제298항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  300. 제293항 내지 제299항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  301. 제293항 내지 제300항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  302. 제293항 내지 제301중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  303. 제281항 내지 제302항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)인, 조성물.
  304. 제281항 내지 제303항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  305. 제281항 내지 제304항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 조성물.
  306. 제305항에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래하는, 조성물.
  307. 제305항에 있어서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래되는, 조성물.
  308. 제281항 내지 제307항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  309. 제281항 내지 제308항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 조성물.
  310. 제281항 내지 제309항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 조성물.
  311. 제310항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  312. 제310항 또는 제311항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형되는, 조성물.
  313. 제312항에 있어서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘인, 조성물.
  314. 제312항 또는 제313항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되는, 조성물.
  315. 제310항 내지 제314항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
  316. 제310항 내지 제315항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  317. 제310항 내지 제316항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  318. 제281항 내지 제317항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  319. 제281항 내지 제318항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  320. 제319항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  321. 제281항 내지 제318항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  322. 제321항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  323. 제281항 내지 제322항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  324. 제323항에 있어서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함하는, 조성물.
  325. 제324항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)인, 조성물.
  326. 제324항 또는 제325항에 있어서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 조성물.
  327. 제324항 내지 제326항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
  328. 제324항 내지 제327항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG)인, 조성물.
  329. 제324항 내지 제328항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 조성물.
  330. 제323항 내지 제329항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 4개의 지질을 포함하는, 조성물.
  331. 제281항 내지 제330항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  332. 제331항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  333. 제281항 내지 제330항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  334. 제333항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열 번호 176에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 574-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584-586 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 584에 제시된 서열을 포함하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 서열번호 733에 제시된 서열을 포함하고,
    핵산 작제물은 다중 도메인 치료적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  335. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  336. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  337. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  338. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  339. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  340. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  341. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  342. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  343. 제218항 내지 제334항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  344. 제343항에 있어서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 다중 도메인 치료적 단백질은 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현되는, 세포.
  345. 제343항 또는 제344항에 있어서, 간 세포인 세포.
  346. 제343항 내지 제345항 중 어느 한 항에 있어서, 간 세포는 헤파토사이트인, 세포.
  347. 제343항 내지 제346항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  348. 제343항 내지 제347항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포인 세포.
  349. 제348항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  350. 제348항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  351. 제348항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  352. 제348항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  353. 제343항 내지 제347항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포가 아닌 세포.
  354. 제343항 내지 제353항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에 존재하는, 세포.
  355. 제343항 내지 제353항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 또는 생체외에 존재하는, 세포.
  356. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  357. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법.
  358. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  359. 제356항 내지 제358항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이고, 선택적으로, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단인, 방법.
  360. 제356항 내지 제359항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단인, 방법.
  361. 제356항 내지 제360항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단인, 방법.
  362. 제361항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  363. 제361항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  364. 제361항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  365. 제361항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  366. 제356항 내지 제360항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이 아니고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아닌, 방법.
  367. 제356항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재하는, 방법.
  368. 제356항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재하는, 방법.
  369. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  370. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법.
  371. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  372. 제370항에 있어서, 발현된 다중 도메인 치료적 단백질은 대상체의 골격근, 심장. 및 중추신경계 조직에 전달되고, 이에 의해 내재화되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 대상체의 세포에서 발현시키는 방법.
  373. 제369항 내지 제372항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포이고, 선택적으로 세포는 헤파토사이트인, 방법.
  374. 제369항 내지 제373항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
  375. 제369항 내지 제374항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포인, 방법.
  376. 제375항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  377. 제375항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  378. 제375항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  379. 제375항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  380. 제369항 내지 제374항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포가 아닌, 방법.
  381. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  382. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  383. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  384. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  385. 제368항 내지 제384항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 폼페병을 갖는, 방법.
  386. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  387. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  388. 제385항 내지 제387항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 방법.
  389. 제385항 내지 제387항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 방법.
  390. 제368항 내지 제389항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 방법.
  391. 제368항 내지 제390항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체인, 방법.
  392. 제391항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내, 출생 후 8주 이내, 또는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  393. 제368항 내지 제390항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 방법.
  394. 제368항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는 방법.
  395. 제368항 내지 제394항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법.
  396. 제395항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법.
  397. 제396항에 있어서, 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 수준을 감소시키는, 방법.
  398. 제368항 내지 제397항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지하는, 방법.
  399. 제398항에 있어서, 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 하는, 방법.
  400. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 신생아 대상체에 제218항 내지 제276항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  401. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 신생아 대상체에 제277항 내지 제334항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  402. 제400항 또는 제401항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  403. 제400항 또는 제401항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  404. 제400항 내지 제403항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 다중 도메인 치료적 단백질 또는 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  405. 제400항 내지 제404항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  406. 제400항 내지 제405항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 및 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  407. 제400항 내지 제406항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  408. 제400항 내지 제407항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  409. 제408항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  410. 제408항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  411. 제408항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  412. 제368항 내지 제407항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 방법.
  413. 제368항 내지 제412항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현이 증가되는, 방법.
  414. 제368항 내지 제413항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준이 증가되는 방법.
  415. 제368항 내지 제414항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  416. 제368항 내지 제415항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  417. 제368항 내지 제416항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  418. 제368항 내지 제417항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 혈청 수준을 수득하는, 방법.
  419. 제368항 내지 제418항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성하는 방법.
  420. 제368항 내지 제419항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하거나;
    (II) 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하는, 방법.
  421. 제368항 내지 제420항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  422. 제368항 내지 제421항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  423. 제368항 내지 제422항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  424. 제368항 내지 제423항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  425. 제368항 내지 제424항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  426. 제368항 내지 제425항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  427. 제368항 내지 제426항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 핵산 작제물을 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  428. 제427항에 있어서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력인, 방법.
  429. 제427항 또는 제428항에 있어서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  430. 제356항 내지 제429항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되는, 방법.
  431. 제356항 내지 제429항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는, 방법.
  432. 제431항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여되는, 방법.
  433. 제431항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여되는, 방법.
  434. 리소솜 알파-글루코시다제에 대한 코딩 서열을 포함하는 작제물을 포함하는 조성물로서, 당해 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 야생형 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열에 비해 CpG-고갈되는, 조성물.
  435. 제434항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 리소솜 알파-글루코시다제 신호 펩타이드 및 프로펩타이드가 결여된, 조성물.
  436. 제434항 또는 제435항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  437. 제434항 내지 제436항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제는 서열번호 173에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  438. 제434항 내지 제437항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 코돈 최적화되고 CpG-고갈되는, 조성물.
  439. 제434항 내지 제438항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  440. 제434항 내지 제439항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  441. 제434항 내지 제440항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고, 코돈 최적화되고 CpG-고갈되고, 서열번호 173을 포함하는 리소솜 알파-글루코시다제 단백질을 인코딩하는, 조성물.
  442. 제434항 내지 제441항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열을 포함하고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  443. 제434항 내지 제442항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나에 제시된 서열로 구성되고,
    선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176에 제시된 서열로 구성되는, 조성물.
  444. 제434항 내지 제443항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하는, 조성물.
  445. 제434항 내지 제444항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  446. 제434항 내지 제445항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 상류에서 스플라이스 수용체를 포함하고, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열의 하류에서 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하는, 조성물.
  447. 제434항 내지 제446항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 조성물.
  448. 제434항 내지 제446항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하는, 조성물.
  449. 제434항 내지 제448항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않는, 조성물.
  450. 제434항 내지 제448항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로, 프로모터는 간 특이적 프로모터인, 조성물.
  451. 제434항 내지 제450항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA이고, 선택적으로, 핵산 작제물은 단일 가닥 DNA인, 조성물.
  452. 제434항 내지 제451항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 조성물.
  453. 제434항 내지 제452항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 또는 지질 나노입자 내에 존재하는, 조성물.
  454. 제453항에 있어서, 핵산 작제물은 핵산 벡터 내에 존재하는, 조성물.
  455. 제454항에 있어서, 핵산 벡터는 바이러스 벡터인, 조성물.
  456. 제453항 또는 제454항에 있어서, 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이고,
    선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  457. 제456항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터인, 조성물.
  458. 제456항 또는 제457항에 있어서, AAV 벡터는 AAV8 벡터, AAV3B 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV9 벡터, AAVrh.74 벡터, 또는 AAVhu.37 벡터로부터 유래되는, 조성물.
  459. 제458항에 있어서, AAV 벡터는 재조합 AAV8(rAAV8) 벡터인, 조성물.
  460. 제459항에 있어서, AAV 벡터는 단일 가닥 rAAV8 벡터인, 조성물.
  461. 제434항 내지 제460항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  462. 제434항 내지 제461항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 CpG-고갈되는, 조성물.
  463. 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화하는 뉴클레아제 작용제를 추가로 포함하는, 조성물.
  464. 제463항에 있어서, 표적 게놈 유전자좌는 알부민 유전자이고, 선택적으로, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  465. 제464항에 있어서, 뉴클레아제 표적 부위는 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  466. 제463항 내지 제465항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) 아연 집게 뉴클레아제(ZFN);
    (b) 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 또는
    (c) (i) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (ii) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  467. 제463항 내지 제465항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 작용제는
    (a) Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    (b) 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 가이드 RNA는 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 세그먼트를 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 Cas 단백질을 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  468. 제467항에 있어서, 가이드 RNA 표적 서열은 알부민 유전자의 인트론 1에 존재하는, 조성물.
  469. 제468항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자인, 조성물.
  470. 제467항 내지 제469항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나에 제시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  471. 제467항 내지 제470항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  472. 제467항 내지 제471항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 30-61 중 임의의 하나로 구성되고, 선택적으로, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36, 30, 33, 및 41 중 임의의 하나로 구성되는, 조성물.
  473. 제467항 내지 제472항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 62-125 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 가이드 RNA는 서열번호 68, 100, 62, 94, 65, 97, 73, 및 105 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물.
  474. 제467항 내지 제473항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나;
    (II) DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 조성물.
  475. 제467항 내지 제474항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36을 포함하는, 조성물.
  476. 제467항 내지 제475항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-표적화 세그먼트는 서열번호 36으로 구성되는, 조성물.
  477. 제467항 내지 제476항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하는, 조성물.
  478. 제467항 내지 제477항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 조성물.
  479. 제467항 내지 제478항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  480. 제479항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  481. 제479항 또는 제480항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  482. 제479항 내지 제481항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  483. 제479항 내지 제482항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는, 조성물.
  484. 제479항 내지 제483항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  485. 제479항 내지 제484항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  486. 제479항 내지 제485항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  487. 제479항 내지 제486항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  488. 제479항 내지 제487중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  489. 제467항 내지 제488항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)인, 조성물.
  490. 제467항 내지 제489항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  491. 제467항 내지 제490항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 조성물.
  492. 제491항에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 단백질, 또는 네이쎄리아 메닌지티디스 Cas9 단백질로부터 유래하는, 조성물.
  493. 제491항에 있어서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질로부터 유래되는, 조성물.
  494. 제467항 내지 제493항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질은 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  495. 제467항 내지 제494항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 조성물.
  496. 제467항 내지 제495항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 조성물.
  497. 제496항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  498. 제496항 또는 제497항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 하나 이상 또는 모든 우리딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함하도록 변형되는, 조성물.
  499. 제498항에 있어서, 변형된 우리딘은 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘인, 조성물.
  500. 제498항 또는 제499항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되는, 조성물.
  501. 제496항 내지 제500항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
  502. 제496항 내지 제501항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  503. 제496항 내지 제502항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  504. 제467항 내지 제503항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  505. 제467항 내지 제504항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하는, 조성물.
  506. 제505항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  507. 제467항 내지 제504항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 조성물.
  508. 제507항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  509. 제467항 내지 제508항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  510. 제509항에 있어서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함하는, 조성물.
  511. 제510항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트)인, 조성물.
  512. 제510항 또는 제511항에 있어서, 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 조성물.
  513. 제510항 내지 제512항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
  514. 제510항 내지 제513항 중 어느 한 항에 있어서, 스텔스 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG)인, 조성물.
  515. 제510항 내지 제514항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 지질 A이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 조성물.
  516. 제509항 내지 제515항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 4개의 지질을 포함하는, 조성물.
  517. 제467항 내지 제516항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 그리고 가이드 RNA는 서열번호 68 또는 서열번호 100을 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  518. 제517항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  519. 제467항 내지 제516항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 유전자는 인간 알부민 유전자이고,
    RNA 형태의 가이드 RNA, 가이드 RNA는 서열번호 100을 포함하고, 가이드 RNA는 (i) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 4개의 뉴클레오타이드들 사이에서의 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하고,
    조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 서열번호 226, 225, 또는 12에 제시된 서열을 포함하고, Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 유사우리딘 또는 N1-메틸-유사우리딘, 선택적으로 N1-메틸-유사우리딘으로 완전히 치환되고, 5' 캡을 포함하고, 폴리아데닐화 서열을 포함하고,
    가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 선택적으로 다음 몰비: 약 50 mol%의 지질 A, 약 9 mol%의 DSPC, 약 38 mol%의 콜레스테롤, 및 약 3 mol%의 PEG2k-DMG로 지질 A, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG2k-DMG를 포함하는 지질 나노입자와 회합되는, 조성물.
  520. 제519항에 있어서, 핵산 작제물은 5'에서 3'으로 스플라이스 수용체, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 신호 또는 서열을 포함하고,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 174-182 및 205-212 중 임의의 하나를 포함하고, 선택적으로, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 서열번호 176을 포함하고,
    핵산 작제물은 리소솜 알파-글루코시다제의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 단일 가닥 rAAV8 벡터 내에 존재하고, 선택적으로, 핵산 작제물은 각각의 단부 상에 역말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹되고, 선택적으로, 적어도 일 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 선택적으로, 각각의 단부 상의 ITR은 서열번호 160을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  521. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  522. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  523. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  524. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법에 사용하거나, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  525. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  526. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  527. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  528. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법에 사용하기 위한, 조성물.
  529. 제434항 내지 제520항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  530. 제529항에 있어서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 통합되고, 리소솜 알파-글루코시다제는 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되거나, 핵산 작제물은 내인성 알부민 유전자좌의 인트론 1 내로 통합되고, 리소솜 알파-글루코시다제는 내인성 알부민 유전자좌로부터 발현되는, 세포.
  531. 제529항 또는 제530항에 있어서, 간 세포인 세포.
  532. 제531항에 있어서, 간 세포는 헤파토사이트인, 세포.
  533. 제529항 내지 제532항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  534. 제529항 내지 제533항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포인 세포.
  535. 제534항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  536. 제534항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  537. 제534항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  538. 제534항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 세포.
  539. 제529항 내지 제533항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아 세포가 아닌 세포.
  540. 제529항 내지 제539항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에 존재하는 세포.
  541. 제529항 내지 제539항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 또는 생체외에 존재하는, 세포.
  542. 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  543. 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포 또는 세포 집단에서 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단에서 발현시키는 방법.
  544. 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제를 세포 또는 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  545. 제542항 내지 제544항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포이거나, 세포 집단은 간 세포 집단이고, 선택적으로, 세포는 헤파토사이트이거나, 세포 집단은 헤파토사이트 집단인, 방법.
  546. 제542항 내지 제545항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포이거나, 세포 집단은 인간 세포 집단인, 방법.
  547. 제542항 내지 제546항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이거나, 세포 집단은 신생아 세포 집단인, 방법.
  548. 제547항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 24주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  549. 제547항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 12주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  550. 제547항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 8주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  551. 제547항에 있어서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단은 출생 후 4주 이내의 인간 신생아 대상체로부터 유래되는, 방법.
  552. 제542항 내지 제546항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포이 아니고, 세포 집단은 신생아 세포 집단이 아닌, 방법.
  553. 제542항 내지 제552항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 시험관내 또는 생체외에 존재하거나, 세포 집단은 시험관내 또는 생체외에 존재하는, 방법.
  554. 제542항 내지 제552항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 대상체의 생체내에 존재하거나, 세포 집단은 대상체의 생체내에 존재하는, 방법.
  555. 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열을 대상체 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  556. 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포에서 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포에서 발현시키는 방법.
  557. 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제를 대상체의 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  558. 제555항 내지 제557항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 간 세포이고, 선택적으로, 세포는 헤파토사이트인, 방법.
  559. 제555항 내지 제558항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
  560. 제555항 내지 제559항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 대상체의 신생아 세포인, 방법.
  561. 제560항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  562. 제560항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  563. 제560항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  564. 제560항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  565. 제555항 내지 제559항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 신생아 세포가 아닌, 방법.
  566. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 세포에서 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  567. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  568. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  569. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  570. 제554항 내지 제569항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 폼페병을 갖는, 방법.
  571. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  572. 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  573. 제570항 내지 제572항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 방법.
  574. 제570항 내지 제572항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 방법.
  575. 제554항 내지 제574항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 방법.
  576. 제554항 내지 제575항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체인, 방법.
  577. 제576항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내, 출생 후 8주 이내, 또는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 방법.
  578. 제554항 내지 제575항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 방법.
  579. 제554항 내지 제578항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는 방법.
  580. 제554항 내지 제579항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법.
  581. 제580항에 있어서, 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는 방법.
  582. 제581항에 있어서, 동일한 연령의 야생형 수준과 필적하게 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 수준을 감소시키는, 방법.
  583. 제554항 내지 제582항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 대상체와 비교하여 대상체의 근력을 개선하거나 대상체의 근력 손실을 방지하는, 방법.
  584. 제583항에 있어서, 대상체가 동일한 연령의 야생형 수준과 필적할 만한 근력을 갖도록 하는, 방법.
  585. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제434항 내지 제462항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    리소솜 알파-글루코시다제 코딩 서열은 핵산 작제물의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 대상체에서 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  586. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 대상체에 제463항 내지 제520항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제는 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  587. 제585항 또는 제586항에 있어서, 폼페병은 유아 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  588. 제585항 또는 제586항에 있어서, 폼페병은 후기 발병 폼페병인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  589. 제585항 내지 제588항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 치료적으로 유효한 수준의 순환 리소솜 알파-글루코시다제를 수득하는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  590. 제585항 내지 제589항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근, 심장, 또는 중추신경계 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  591. 제585항 내지 제590항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근 및 심장 조직 내 글리코겐 축적을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  592. 제585항 내지 제591항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  593. 제585항 내지 제592항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  594. 제593항에 있어서, 신생아 세포는 출생 후 24주 이내의 인간 대상체이고, 선택적으로, 신생아 세포는 출생 후 12주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  595. 제593항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 8주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  596. 제593항에 있어서, 신생아 대상체는 출생 후 4주 이내의 인간 대상체인, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  597. 제585항 내지 제592항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신생아 대상체가 아닌, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  598. 제554항 내지 제597항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 발현이 증가되는, 방법.
  599. 제554항 내지 제598항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제를 인코딩하는 에피솜 발현 벡터를 대조군 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법과 비교하여 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준이 증가되는 방법.
  600. 제554항 내지 제599항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1 μg/mL, 적어도 약 2 μg/mL, 적어도 약 3 μg/mL, 적어도 약 4 μg/mL, 적어도 약 5 μg/mL, 적어도 약 6 μg/mL, 적어도 약 7 μg/mL, 적어도 약 8 μg/mL, 적어도 약 9 μg/mL, 또는 적어도 약 10 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득하는 방법.
  601. 제554항 내지 제600항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 2 μg/mL 또는 적어도 약 5 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득하는 방법.
  602. 제554항 내지 제601항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 2 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득하는 방법.
  603. 제554항 내지 제602항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 혈청 수준을 수득하는 방법.
  604. 제554항 내지 제603항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 적어도 약 40%, 정상의 적어도 약 45%, 정상의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%의 리소솜 알파-글루코시다제 활성 수준을 달성하는 방법.
  605. 제554항 내지 제604항 중 어느 한 항에 있어서,
    (I) 대상체는 유아 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 1% 또는 약 1% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하거나;
    (II) 대상체는 후기 발병 폼페병을 갖고, 방법은 정상의 적어도 약 40% 또는 정상의 약 40% 초과의 리소솜 알파-글루코시다제 발현 또는 활성 수준을 달성하는, 방법.
  606. 제554항 내지 제605항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  607. 제554항 내지 제606항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 1년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  608. 제554항 내지 제607항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  609. 제554항 내지 제608항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성의 적어도 50%인, 방법.
  610. 제554항 내지 제609항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 2년차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  611. 제554항 내지 제610항 중 어느 한 항에 있어서, 리소솜 알파-글루코시다제의 발현 또는 활성은 투여 후 24주차에 대상체에 대해 측정된 피크 발현 수준에서의 다중 도메인 치료적 단백질의 발현 또는 활성의 적어도 60%인, 방법.
  612. 제554항 내지 제611항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 핵산 작제물을 투여하기 전에 대상체의 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  613. 제612항에 있어서, 기존 AAV 면역력은 기존 AAV8 면역력인, 방법.
  614. 제612항 또는 제613항에 있어서, 기존 AAV 면역력을 평가하는 단계는 총 항체 면역 검정 또는 중화 항체 검정을 사용하여 면역원성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  615. 제542항 내지 제614항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되는, 방법.
  616. 제542항 내지 제614항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 동시에 투여되지 않는, 방법.
  617. 제616항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 전에 투여되는, 방법.
  618. 제616항에 있어서, 핵산 작제물은 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 후에 투여되는, 방법.
  619. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  620. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  621. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  622. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  623. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  624. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  625. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  626. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  627. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  628. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  629. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  630. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  631. 폼페병의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  632. 폼페병의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  633. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물 - 이때, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인임 -; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  634. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  635. 제619항 내지 제634항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제작된, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단.
  636. 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단으로서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하고, 선택적으로, 전달 도메인은 CD63-결합 전달 도메인 또는 TfR-결합 전달 도메인인, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단.
  637. 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단으로서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 CD63-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단.
  638. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  639. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  640. 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는, 핵산을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입하는 방법.
  641. 리소솜 알파-글루코시다제 단백질에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌의 표적 유전자 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 다중 도메인 치료적 단백질을 신생아 대상체의 신생아 세포의 표적 게놈 유전자좌로부터 발현시키는 방법.
  642. 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되는, 리소솜 알파-글루코시다제 결핍의 치료 방법.
  643. 조직 내 글리코겐 축적 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되고, 조직 내 글리코겐 축적을 감소시키는, 조직 내 글리코겐 축적 감소 방법.
  644. 폼페병의 치료를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 치료 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 폼페병을 치료하는, 폼페병의 치료 방법.
  645. 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소를 필요로 하는 신생아 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법으로서, 신생아 대상체에
    (a) 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 작용제 또는 뉴클레아제 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 - 이때, 뉴클레아제 작용제는 표적 게놈 유전자좌 내의 뉴클레아제 표적 부위를 표적화함 -;을 투여하는 단계를 포함하며,
    뉴클레아제 작용제는 뉴클레아제 표적 부위를 절단하고, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되어 변형된 표적 게놈 유전자좌를 생성하고, 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질은 변형된 표적 게놈 유전자좌로부터 발현되며, 이로 인해 대상체에서의 폼페병의 징후 또는 증상 발병을 예방 또는 감소시키는, 폼페병의 징후 또는 증상 발병의 예방 또는 감소 방법.
  646. 제638항 내지 제645항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제작된 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단.
  647. 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입된 핵산 작제물을 포함하는 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단으로서, 핵산 작제물은 표적 게놈 유전자좌 내로 삽입되는 리소솜 알파-글루코시다제에 융합된 TfR-결합 전달 도메인을 포함하는 다중 도메인 치료적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는, 신생아 세포 또는 신생아 세포 집단.
KR1020247026318A 2022-02-02 2023-02-02 폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입 KR20240135629A (ko)

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