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KR20240120263A - 식도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

식도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240120263A
KR20240120263A KR1020230012762A KR20230012762A KR20240120263A KR 20240120263 A KR20240120263 A KR 20240120263A KR 1020230012762 A KR1020230012762 A KR 1020230012762A KR 20230012762 A KR20230012762 A KR 20230012762A KR 20240120263 A KR20240120263 A KR 20240120263A
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esophageal
organoids
medium
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organoid
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KR1020230012762A
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정영태
오병무
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재단법인대구경북과학기술원
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Abstract

본 발명은 식도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 식도의 중층편평상피(stratified squamous epithelium)을 재현하는 식도 오가노이드 제조용 배지 및 제조 방법을 제공하며, 이를 활용하여 식도 오가노이드의 장기 계대배양을 가능케 하며, 약물 처리 플랫폼으로 활용한다.

Description

식도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도{PRODUCING METHOD OF ESOPHAGEAL ORGANOID AND USES THEREOF}
본 발명은 식도 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
식도는 인두부터 위까지 이르는 동물의 장기로, 인두로 들어온 음식물을 연동운동을 통해 위로 전달한다. 특히 식도의 벽은 내강(lumen)을 둘러싸고 있으며 점막(mucosa), 점막하층(submucosa), 근섬유로 이루어진 두 근육층(muscularis propria), 결합조직으로 이루어진 외막(adventitia)으로 구성되어 있다. 점막은 여러 겹의 편평상피세포로 이루어진 중층편평상피(stratified squamous epithelium) 구조로 기저세포(basal cell)가 바닥에 위치하며 그 위로는 납작한 얇은 세포들이 여러 겹 적층된 분화된 세포들로 구성되어 있다.
한편, 식도는 식도염, 식도이완불능증, 식도암(esophageal cancer) 등으로 인한 손상 및 질병 등이 발생하여, 재생의학적인 치료법의 개발 시 많은 도움을 얻을 수 있으며 여러 약물치료 시 효과 검증 및 부작용 스크리닝을 필요로 한다.
오가노이드는 줄기세포로부터 자가 재생 및 분화를 통해 형성된 3차원 미니 구조물(수백 마이크로미터 내지 수 밀리미터)로 모(母) 기관의 조직학적 특성 및 생리학적 기능을 재현하여 미니 장기로도 불리우고 있다. 따라서, 식도의 조직학적 구조인 중층편평상피를 재현하는 식도 오가노이드의 개발은 식도의 질병 기전 연구 및 질병 모델링, 약물의 유효성 및 독성 평가에 큰 기여를 할 것이다.
미국공개특허 US 2021-0189349 A1 (2021.06.24 공개)
본 발명의 목적은 식도 오가노이드 (esophageal organoid) 배양용 배지 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드의 장기 계대배양 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식도 오가노이드를 이용한 항암 약물 독성 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표피성장인자 (epidermal growth factor; EGF), R-스폰딘1 (R-spondin1) 및 노긴 (noggin)이 함유된 줄기세포 배양용 기본 배지 (basal media)를 유효성분으로 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 (esophageal organoid) 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 분리된 식도 상피조직으로부터 기저세포를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출된 기저세포에 상기 배지 조성물을 첨가하여 현탁시킨 후 마트리겔 (matrigel)을 혼합하는 단계; 및 c) 상기 혼합된 혼합물을 배양하고 마트리겔이 굳으면, 상기 배지 조성물을 공급하는 단계;를 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조된 식도 오가노이드를 10 내지 20일마다 단일세포로 해체하여 배양하는 단계를 포함하는, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드의 장기 계대배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식도 오가노이드를 단일세포로 해체하여 식도 상피세포를 분리하는 단계; 상기 식도 상피세포를 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 배양물에 후보약물을 처리한 후, 식도 오가노이드 형성 여부를 분석하는 단계를 포함하는 항암 약물 독성 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 식도 오가노이드(esophageal organoid)의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 제조된 식도 오가노이드는 식도 줄기세포를 포함하는 식도 상피세포를 3차원 배양함으로써 식도와 조직학적으로 매우 유사한 중층편평상피 구조로 되어 있는 바, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 세포 및 동물실험을 대체할 수 있는 모델로 사용할 수 있다. 또한, 상기 식도 오가노이드는 안정적인 장기 계대배양이 가능하여 적은 양의 조직으로부터 다량의 세포를 얻을 수 있다.
도 1은 식도 오가노이드 제조방법 시스템 개요를 나타낸다.
도 2는 식도 오가노이드 배양배지에서 식도 오가노이드를 배양한 결과(A)와 계대배양한 결과(B 및 C)를 나타낸다.
도 3은 식도 오가노이드의 중층편평상피 구조를 H&E 염색을 통해 조직학적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 식도 오가노이드의 상피세포마커 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 식도 오가노이드를 약물 스크리닝에 활용할 수 있는 용도를 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 식도염, 식도이완불능증, 식도암(esophageal cancer) 등으로 인한 손상 및 질병 등이 발생하여, 재생의학적인 치료법의 개발을 위하여, 식도처럼 식도 상피세포로부터 유래하며 중층편평상피와 비슷한 구조를 나타내는 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 표피성장인자 (epidermal growth factor; EGF), R-스폰딘1 (R-spondin1) 및 노긴 (noggin)이 함유된 줄기세포 배양용 기본 배지 (basal media)를 유효성분으로 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 (esophageal organoid) 배양용 배지 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 Wnt-3a, B27, N2, N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine), 글루타맥스 (glutamax), Y-27632, HGF, FGF, VEGF, 항생-항진균제 및 뉴레글린 (Neureglin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 줄기세포 배양용 기본 배지 (basal media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 항생-항진균제는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신 (gentamicin), 니스타틴 (nystatin) 및 암포테리신 (amphotericin)으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 식도 오가노이드는 지속적인 계대 배양이 가능할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 내에서 “오가노이드 (organoid)”란 사람과 동물 등에서 획득한 줄기세포를 포함하는 식도 상피세포로부터 유래하는 3D 입체구조를 가지는 세포 집합체를 의미하며, 인공적인 배양과정을 통해 제조한 원발 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다.
본 명세서 내에서 “식도”란 식도 상피를 포함하는 식도 점막, 점막하층, 근섬유로 이루어진 두 근육층, 결합조직으로 이루어진 외막으로 이루어진 기관을 의미한다.
본 명세서 내에서 “식도 오가노이드”란 중층편평상피 구조를 띤 식도처럼 식도 상피세포로부터 유래하며, 중층편평상피와 비슷한 구조를 나타내는 식도 오가노이드를 포함한다.
본 명세서 내에서 “배지”란 인 비트로 (in vitro) 에서 세포가 오가노이드로 성장, 생존, 분화하는데 필요한 구성성분들을 포함하고 있으며, 이를 가능하게 하는 배양액을 의미하며, 오가노이드 분야에서 사용되는 배양 및 분화에 적절한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 또는 해당분야의 기술적 수준에 따라 배지의 종류와 배양 조건에 변화를 줄 수 있다. 식도 오가노이드 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 송분을 포함하는 배양 최소 배지일 수 있다.
본 명세서 내에서 “계대”는 오가노이드를 건강한 상태로 장기간 지속적으로 배양하기 위해 단일세포 또는 오가노이드로 분리한 후, 다시 새로운 배양 용기로 옮기거나 하여 오가노이드 배양을 이어가는 것을 의미한다. 한차례 세포군을 나누거나 배양용기를 교체하는 것을 1계대라고 한다.
또한, 본 발명은 a) 분리된 식도 상피조직으로부터 기저세포를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출된 기저세포에 상기 배지 조성물을 첨가하여 현탁시킨 후 마트리겔 (matrigel)을 혼합하는 단계; 및 c) 상기 혼합된 혼합물을 배양하고 마트리겔이 굳으면, 상기 배지 조성물을 공급하는 단계;를 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 식도 오가노이드는 평균 입경이 50 내지 500 μm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 식도 오가노이드는 시토케라틴 14 (cytokeratin 14), 시토케라틴 5 (cytokeratin 5), 시토케라틴 1 (cytokeratin 1) 및 로리크린 (loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 기저세포 마커 또는 분화된 세포 마커를 발현할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 내에서 “분화”는 세포가 분열하여 증식하며 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 조직 특이적으로 구체화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 특정 기관에 필요한 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능을 갖추는 과정을 의미하며, 예를 들어 식도 줄기세포가 식도 상피세포로 변하는 과정뿐만 아니라, 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변화는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 모든 것이 분화에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식도 오가노이드를 10 내지 20일마다 단일세포로 해체하여 배양하는 단계를 포함하는, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드의 장기 계대배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식도 오가노이드를 단일세포로 해체하여 식도 상피세포를 분리하는 단계; 상기 식도 상피세포를 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 배양물에 후보약물을 처리한 후, 식도 오가노이드 형성 여부를 분석하는 단계를 포함하는 항암 약물 독성 스크리닝 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항암 약물은 시스플라틴 (cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 5-플루오로우라실 (5-FU) 및 이리노테칸 (Irinotecan)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 식도 오가노이드의 형성 배지 제조
식도 오가노이드 배양배지는 다음과 같은 조성물을 포함한다. DMEM/F12 또는 Advanced DMEM/F12에 1X 페니실린/스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1X N2, 1X B27, 1X 글루타맥스(glutamax), 1 μM N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 1 μM Y-27632, 50 ng/ml EGF, 100 μg/ml R-스폰딘1(R-spondin1) 및 100 μg/ml 노긴(noggin), 20 ng/ml HGF, 20 ng/ml FGF, 50 ng/ml Wnt3a 및 20 ng/ml 뉴레글린(Neureglin)의 혼합했으며, 이들 구성성분의 농도는 제시된 농도의 1/10 내지 10 배 사이 정도에서 조절할 수 있으며, 그 외의 성분들을 추가할 수 있다.
< 실시예 2> 인간 및 동물의 3차원 식도 오가노이드 제조
1. 인간 및 동물 식도 조직으로부터 식도 기저세포 분리
환자의 식도 검체 또는 동물의 식도를 인산염완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 깨끗이 씻어준 후 빈 관의 한쪽 벽을 길게 잘라 평평하게 편다. 평평하게 열린 관을 DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium; Gibco, #12430112)에 디스파아제(dispase; Stem cell, #07913)를 넣은 후 37 ℃, 5 % 이산화탄소가 공급되는 세포배양기에서 1 내지 2시간 동안 효소적으로 해리시켰다.
효소적으로 해리된 인간 및 동물 식도 조직으로부터 상피세포를 분리하기 위해 실체현미경으로 관찰하며 포셉을 이용해 식도 상피조직만 벗겨냈다. 깨끗하게 벗겨낸 상피 조직을 0.25 % 트립신-EDTA(0.25 % Trypsin-EDTA; Gibco, # 25200-072)용액에 넣고 37 ℃, 5 % 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 5분 동안 효소적으로 해리시켰다.
효소적으로 해리된 인간 및 동물 식도 상피조직을 파이펫팅으로 잘 풀어 식도 기저세포를 추출한 후, 2 % 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 PBS를 첨가하여 0.25 % 트립신/0.05 % EDTA를 중화시켰다. 이후, 상피조직으로부터 떨어져 나온 기저세포를 40 μm cell strainer (SPL, #93040)를 통과시킨 후 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 원심분리된 식도 기저세포를 Advanced DMEM/F12 배지를 사용하여 현탁시키고, 세포수를 측정하였다.
2. 식도의 3차원 오가노이드 제작
상기에서 추출한 식도 기저세포를 7 내지 14일 동안 3차원 배양하여 식도 오가노이드를 제작하였다. 구체적으로, 1,000 내지 10,000개의 식도 기저세포를 50 μl의 식도 오가노이드 배양배지로 현탁한 후 마트리겔(matrigel, Coring, #356231)과 1:1의 비율로 섞어 i) 돔 모양으로 24 웰 플레이트에 분주한 후 37 ℃, 5 % 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 30 내지 60분간 배양하여 마트리겔이 굳으면 식도 오가노이드 배양 미디어를 첨가; 또는 ii) 24 웰 세포배양 트랜스웰(Corning, #3470) 위에 분주한 후 37 ℃, 5 % 이산화탄소가 공급되는 세포 배양기에서 30 내지 60분간 배양하여 마트리겔이 굳으면 세포배양 트랜스웰 하단 부분에 식도 오가노이드 배양배지를 공급하였다.
그 결과, 도 2A, 2B에서 나타난 바와 같이, 식도 오가노이드 배양배지에서 쥐의 식도 오가노이드가 50 내지 200 μm 크기로 성장하였다.
3. 식도 오가노이드의 장기 계대배양
상기에서 제작한 식도 오가노이드를 장기간에 걸쳐 여러 차례 계대배양하며 성장할 수 있다. 식도 오가노이드 배양배지에서 생장한 식도 오가노이드는 14일 마다 단일세포로 해체하여 장기간의 계대배양을 실시하였다. 구체적으로는 DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium; Gibco, #12430112)에 디스파아제(dispase, Stem cell, #07913)를 넣은 후 37 ℃, 5 % 이산화탄소가 공급되는 세포배양기에서 1 내지 2시간 동안 마트리겔 내에 생성된 오가노이드를 효소적으로 해리시켰다. 이후 트립신 처리부터는 상기의 과정을 반복하여 다음 세대의 오가노이드를 형성시켰다. 장기 계대배양 결과는 도 2C, 2D에 나타난 것과 같다.
< 실험예 1> 식도 오가노이드의 구조적, 조직학적 생체 모방성 확인
식도는 점막고유판(lamina propria) 윗부분에 하나 이상의 상피세포층으로 이루어진 중층편평상피 구조를 형성하고 있다. 기저막(basal layer)에는 줄기세포의 특징이 강하고 활발하게 분열하는 기저세포(basal cell)가 존재하며, 기저세포로부터 분열, 생성된 세포들은 상층부로 이동하며 분화한다. 표면 근처로 갈수록 점점 더 분화되어 납작하며 각질이 풍부한 세포들이 존재하는 구조적 특징을 보인다.
상기 실시예 2에서 제작된 식도 오가노이드가 실제 식도의 조직학적 구조를 재현하는지 확인하기 위하여, H&E 염색 및 면역형광염색을 실시하였다.
1. H&E 염색
식도 오가노이드를 4 % 파라포름알데히드(fromaldehyde solution, Sigma, #47608)에 고정시킨 후 식도 오가노이드를 cryo 몰드(15ⅹ15ⅹ5 mm, Tissue-tek, #4566)에서 O.C.T. 컴파운드(O.C.T. compound, Scigen, #4583)와 혼합하고 드라이아이스를 이용하여 고형화시켰다. 이후, 고형화된 식도 오가노이드는 냉동조직절편기(Leica, #CM3050S)를 이용해 10 μm 두께로 절단하여 슬라이드를 준비하고 -20 ℃에서 보관하였다. 준비된 슬라이드는 상온에서 5분간 방치한 후 PBS로 살짝 씻어준 후 헤마톡실린과 에오신 염색 키트(Hematoxylin and eosin stain kit, Vector laboratories, #H-3502)를 이용하여 H&E 염색을 수행하였다. 구체적으로, 헤마톡실린으로 상온에서 5분간 염색하고, 증류수로 15초동안 2번 씻어내고, 블루잉 용액(bluing reagent)으로 상온에서 10 내지 15초간 염색하고, 증류수에서 15초동안 2번 씻어내고, 100 % 에탄올에 10초간 담근 후 에오신(eosin)으로 상온에서 2 내지 3분 동안 염색하고, 100 % 에탄올로 10초간 씻어내고, 100 % 에탄올로 1 내지 2분간 3회 탈수시켰다. 그 후, 덮개를 씌우고 상온에 보관하여 현미경으로 관찰했다.
그 결과, 도 3에 따를 때, 식도의 중층편평상피의 나이테가 감싼 듯한 구조가 H&E 염색된 식도 오가노이드에서 항상 관찰되었다.
2. 면역형광염색
식도 오가노이드를 4 % 파라포름알데히드(fromaldehyde solution, Sigma, #47608)에 고정시킨 후 식도 오가노이드를 cryo 몰드(15 ⅹ 15 ⅹ 5 mm, Tissue-tek, #4566)에서 O.C.T. 컴파운드(O.C.T. compound, Scigen, #4583)와 혼합하고 드라이아이스를 이용하여 고형화시켰다. 이후, 고형화된 식도 오가노이드는 냉동조직절편기(Leica, #CM3050S)를 이용해 10 μm 두께로 절단하여 슬라이드를 준비하고 -20 ℃에서 보관하였다. 준비된 슬라이드는 상온에서 5분간 방치한 후 PBS로 살짝 씻어준 후 0.1 % 트리톤 x-100(Triton X-100, 바이오세상, TR1020-500-00), 3 % 소혈청알부민(bovine serum albumin, MP biomedicals, #9048-46-8)이 포함된 PBS로 1시간동안 상온에서 차단하였다. 이후 슬라이드를 항체 희석용액(REAL antibody diluent solution, Agilent, #S2022)에 희석된 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 슬라이드를 0.1 % 트리톤 x-100/1 % 소혈청알부민이 포함된 PBS를 사용하여 3회 세척한 후, 상온에서 1시간동안 1 % 소태아혈청이 포함된 PBS에 희석된 2차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 그 후 PBS를 사용하여 3회 세척한 후 슬라이드를 PBS에 희석된 DAPI(Sigma, #10236276001) 용액으로 상온에서 10분간 인큐베이션 하였다. PBS를 사용하여 슬라이드를 3회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 따를 때, 식도 기저층 마커인 케라틴5(keratin 5) 및 분화된 세포들의 상부기저층(suprabasal) 마커인 로리크린(loricrin)이 식도 오가노이드의 서로 다른 위치에 염색이 된 것을 확인했다. 이는 식도 오가노이드 구조가 식도 상피와 유사하게 기저층과 상부기저층의 구조를 보인다는 것을 나타낸다.
< 실험예 2> 식도 오가노이드를 약물 스크리닝 플랫폼으로서의 활용 가능성 확인
식도 오가노이드가 약물의 독성 평가 플랫폼으로서 활용될 수 있는 용도를 점검하였다. 단일세포로 분리한 식도 상피세포를 상기 실시예 2에서 기술한 방식대로 오가노이드 형성 배지에 배양을 시작하였다. 이후, 항암 약물인 시스플라틴(Cispatin) 및 파클리탁셀(Paclitaxel)로 각각 1 내지 5 μM, 1 내지 10 nM의 농도로 처치하였다. 약물은 오가노이드 형성 기간 내내 계속 처치하였고, 배지를 2 내지 3일에 한번 갈 때 다시 새롭게 넣어주었다.
그 결과, 도 5에 따를 때, 약물을 처치한 경우, 식도 오가노이드의 형성이 감소하는 것을 관찰함으로써 식도 오가노이드를 약물의 유효성 및 독성 평가 및 스크리닝에 활용할 수 있음을 확인했다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 표피성장인자 (epidermal growth factor; EGF), R-스폰딘1 (R-spondin1) 및 노긴 (noggin)이 함유된 줄기세포 배양용 기본 배지 (basal media)를 유효성분으로 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 (esophageal organoid) 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Wnt-3a, B27, N2, N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine), 글루타맥스 (glutamax), Y-27632, HGF, FGF, VEGF, 항생-항진균제 및 뉴레글린 (Neureglin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 배양용 기본 배지 (basal media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM/F12 및 Advanced DMEM/F12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항생-항진균제는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신 (gentamicin), 니스타틴 (nystatin) 및 암포테리신 (amphotericin)으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 식도 오가노이드는 지속적인 계대 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  6. a) 분리된 식도 상피조직으로부터 기저세포를 추출하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 추출된 기저세포에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 첨가하여 현탁시킨 후 마트리겔 (matrigel)을 혼합하는 단계; 및
    c) 상기 혼합된 혼합물을 배양하고 마트리겔이 굳으면, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 공급하는 단계; 를 포함하는 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식도 오가노이드는 평균 입경이 50 내지 500 μm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 식도 오가노이드는 시토케라틴 14 (cytokeratin 14), 시토케라틴 5 (cytokeratin 5), 시토케라틴 1 (cytokeratin 1) 및 로리크린 (loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 기저세포 마커 또는 분화된 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드.
  10. 제9항에 따른 식도 오가노이드를 10 내지 20일마다 단일세포로 해체하여 배양하는 단계를 포함하는, 중층편평상피 구조를 가진 식도 오가노이드의 장기 계대배양 방법.
  11. 제9항에 따른 식도 오가노이드를 단일세포로 해체하여 식도 상피세포를 분리하는 단계;
    상기 식도 상피세포를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 배양물에 후보약물을 처리한 후, 식도 오가노이드 형성 여부를 분석하는 단계를 포함하는 항암 약물 독성 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항암 약물은 시스플라틴 (cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 5-플루오로우라실 (5-FU) 및 이리노테칸 (Irinotecan)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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