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KR20240073034A - 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염, 및 그 제조에 사용되는 항체 유도체 및 화합물 또는 그것들의 염 - Google Patents

항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염, 및 그 제조에 사용되는 항체 유도체 및 화합물 또는 그것들의 염 Download PDF

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KR20240073034A
KR20240073034A KR1020247010602A KR20247010602A KR20240073034A KR 20240073034 A KR20240073034 A KR 20240073034A KR 1020247010602 A KR1020247010602 A KR 1020247010602A KR 20247010602 A KR20247010602 A KR 20247010602A KR 20240073034 A KR20240073034 A KR 20240073034A
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KR
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salt
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hydrophilic group
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KR1020247010602A
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유타카 마츠다
토모히로 와타나베
노리코 하타다
토모히로 후지
Original Assignee
아지노모토 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 항체와 기능성 물질의 결합 비율이 특정 범위로 제어되고, 또한 원하는 특성이 우수한 항체 및 기능성 물질의 컨쥬게이트 또는 그 염을 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 하기 식 (I):

[식 중,
Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 개재하여, Ig에 인접한 L1과 위치 선택적으로 결합하고 있고,
HG는, 친수성기 등을 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기 등의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
D는, 기능성 물질을 나타내고,
r은 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염, 및 그것들과 관련된 물질을 제공한다.

Description

항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염, 및 그 제조에 사용되는 항체 유도체 및 화합물 또는 그것들의 염
본 발명은, 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염, 및 그 제조에 사용되는 항체 유도체 및 화합물 또는 그것들의 염 등에 관한 것이다.
최근, 항체 약물 복합체(Antibody Drug Conjugate: ADC)의 연구 개발이 활발히 행하여지고 있다. ADC는 그 이름과 같이, 항체에 약물(예: 항암제)을 컨쥬게이션한 약물이며, 암세포 등에 대한 직접적인 살(殺) 세포 활성을 갖는다. 대표적인 ADC로는 Immnogene사와 Roche사가 공동 개발한 T-DM1(상품명: 카도사이라(등록상표))이 있다.
ADC는, 항체 중에 존재하는 특정한 아미노산 잔기의 측쇄 중의 관능기를 약물에 결합시킴으로써 제조되고 있다. ADC의 제조에 이용되는 이러한 관능기의 예는, 항체 중에 존재하는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기이다. 항체 중의 라이신기(예, 246/248위치, 288/290위치, 또는 317위치의 라이신 잔기)를 위치선택적으로 수식하는 기술로서, 몇 가지 기술이 보고되어 있다(예, 특허문헌 1 내지 4).
ADC에서는, 링커를 통하여 항체 및 약물이 연결되어 있다. ADC에서의 링커로는 여러 가지가 존재한다. 예를 들면, 항암제로서 사용되는 ADC에서는, 인간 혈장 중에서 안정하고, 또한, 암세포 내에서 약물을 방출하기 위해 특정 효소로 절단 가능한 구조를 갖는 링커로서, 발린-시트룰린으로 이루어지는 디펩타이드(Val-Cit: VC 구조)를 포함하는 링커가 존재한다. 이러한 디펩타이드를 포함하는 링커는, 하기 (A)에 나타내는 바와 같이, 인간 혈장 중에서는 안정하지만, 하기 (B)에 나타내는 바와 같이, 인간 암세포 내의 리소좀 중의 카텝신(cathepsin) B에 의해 VC 구조가 인식되어, 시트룰린의 카르복시 말단측에 존재하는 아미드 결합이 절단된다. 따라서, 이러한 디펩타이드를 포함하는 링커를 갖는 ADC는, 인간 암세포 내에서 약물을 방출하여 약효를 발현할 수 있다.
그러나, 상기한 바와 같은 디펩타이드를 포함하는 링커를 갖는 ADC는, 마우스 혈장 중에서는 불안정하다(비특허문헌 1 및 2). 이것은, 마우스 혈장 중에는, VC 구조를 인식하여, 시트룰린의 카르복시 말단측에 존재하는 아미드 결합을 절단하는 카르복실라제인 Ces1c가 존재하기 때문에, 상기와 같은 디펩타이드를 포함하는 링커가 Ces1c에 의해 혈장 중에서 절단되어 버리기 때문이다. 따라서, 상기한 바와 같은 디펩타이드를 포함하는 링커를 갖는 ADC에 대해서는, 마우스와 인간에서는 체내 동태가 크게 다르다. 그 때문에, 마우스에서는, 인간에 있어서의 약효를 평가하기 어렵다고 하는 문제가 있다.
상술한 바와 같이, 「항체-스페이서-VC 구조-스페이서-약물」이라는 구조를 갖는 ADC에 대해 마우스 혈장 중에서의 불안정성을 개선하기 위해, 링커(즉, 스페이서-VC 구조-스페이서)의 개변(改變)에 의한 ADC의 안정화가 시도되고 있고, 이러한 관점에서, 상기 링커를 통하여 항체 및 약물 또는 그 미믹(mimic)을 연결하고 있는 ADC가 보고되어 있다. 예를 들면, 상기 링커를, 항체 및 약물 또는 그 미믹을 연결하고 있는 주쇄 중이 아니라, 그 주쇄의 측쇄 중에 포함하는 ADC로서, 이하가 보고되어 있다(특허문헌 5).
Figure pct00004
Ab: 항체
Cbz: 벤질옥시카르보닐
Val: 발린 잔기
Cit: 시트룰린 잔기
그런데, 비특허문헌 3에는 ADC의 소수도(疎水度)가 높으면 높을수록, 혈장 클리어런스가 빨라지는 것, 및 ADC의 소수도는 HIC(Hydrophobic Interaction Chromatography)-HPLC로 평가 가능한 것이 기술되어 있다.
[특허문헌]
(특허문헌 1) 국제공개 제2018/199337호
(특허문헌 2) 국제공개 제2019/240288호
(특허문헌 3) 국제공개 제2019/240287호
(특허문헌 4) 국제공개 제2020/090979호
(특허문헌 5) 국제공개 제2015/038426호
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Dorywalska et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26(4), 650-659
(비특허문헌 2) Dorywalska et al., Mol Cancer Ther., 2016, 15(5), 958-70
(비특허문헌 3) Lyon et al., Nat Biotechnol., 2015, 33 (7), 733-5
본 발명의 목적은, 항체와 기능성 물질의 결합 비율을 특정 범위로 제어하면서, 원하는 특성이 우수한 항체 및 기능성 물질의 컨쥬게이트 또는 그 염을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 항체와 약물(또는 약물 미믹)을 연결하고있는 주쇄의 측쇄 중에 특정 구조의 링커를 포함하고, 또한, 면역 글로불린 단위와 기능성 물질의 결합의 평균 비율(기능성 물질/면역 글로불린 단위)을 원하는 범위(1.5 내지 2.5)에서 갖는 위치 선택적인 컨쥬게이트가, 우수한 성질을 갖는 것을 발견하였다. 예를 들어, 이러한 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 우수한 클리어런스(긴 체내 체류 시간), 낮은 응집률(높은 모노머 비율), 카텝신 B에 의한 높은 절단성(인간 세포 내에서의 기능성 물질의 높은 방출능), 및 마우스 혈장중에서의 높은 안정성을 갖는다. 이러한 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 컨쥬게이트 분자 표면에 노출되기 쉬운 측쇄 선단 또는 그 부근에 친수성기를 갖기 때문에 분자 전체의 친수성을 효율적으로 향상시킬 수 있고, 또한, 상기와 같은 우수한 성질을 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 또한, 이러한 위치 선택적인 컨쥬게이트의 제작에 유용한 항체 유도체 및 화합물을 개발하는데 성공하였다. 식 (I) 내지 (VII)과 같은 구조로 표시되는 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 항체 유도체, 및 화합물은, 식 (V)로 표시되는 구조 단위 중 X 및 Y를 제외하는 부분 구조 단위를 공유한다고 하는 기술적 특징을 갖는다. 본 발명자들은, 이러한 기술적 특징을 갖는 일련의 발명을 개발하는데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 선행 기술은, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트의 화학 구조, 및 이러한 화학 구조와 상술한 바와 같은 우수한 성질과의 관계성을 기재도 시사도 하고 있지 않다. 선행 기술은 또한, 이러한 위치 선택적인 컨쥬게이트의 제작에 이용할 수 있는 본 발명의 항체 유도체 및 화합물을 기재도 시사도 하고 있지 않다.
즉, 본 발명은, 이하와 같다.
제1 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(I):
Figure pct00005
[식 중,
Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 개재하여, Ig에 인접한 L1과 위치 선택적으로 결합하고 있고,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
D는, 기능성 물질을 나타내고,
2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율 r은, 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (I)로 표시되는 구조 단위는, 하기 식 (I'):
Figure pct00006
[식 중,
Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, D, 및 r은, 각각, 식 (I)로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 구조 단위라도 좋다.
제2 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(II):
Figure pct00007
[식 중,
Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 개재하여, Ig에 인접하는 L1과 위치 선택적으로 결합하고 있고,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
B2는, 생체 직교성 관능기를 나타내고,
2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율 r은, 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 유도체 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (II)로 표시되는 구조 단위는, 하기 식 (II'):
Figure pct00008
[식 중,
Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B2, 및 r은, 각각, 식 (II)로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 구조 단위라도 좋다.
제3 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(III):
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
B1은, 생체 직교성 관능기를 나타내고,
D는, 기능성 물질을 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기, 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (III)으로 표시되는 화합물은, 하기 식 (III'):
Figure pct00010
[식 중,
RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 D는, 각각, 식 (III)으로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 화합물이라도 좋다.
제4 실시형태에서는, 본 발명은, 상기 제3 실시형태에 따른 화합물 또는 그 염을 포함하는, 항체의 유도체화 시약을 제공한다.
제5 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(IV):
Figure pct00011
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
B1은, 제1 생체 직교성 관능기를 나타내고,
B2는, 제2 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (IV)로 표시되는 화합물은, 하기 식 (IV'):
[식 중,
RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 B2는, 각각, 식 (IV)로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 화합물이라도 좋다.
제6 실시형태에서는, 본 발명은, 상기 제5 실시형태에 따른 화합물 또는 그 염을 포함하는, 항체 또는 기능성 물질의 유도체화 시약을 제공한다.
제7 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(V):
Figure pct00013
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
X 및 Y는, 각각 독립적으로, 1가의 기를 나타낸다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 하기 식 (V)로 표시되는 화합물은, 하기 식 (V'):
Figure pct00014
[식 중,
RA, RB, 환 A, X 및 Y는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 화합물이라도 좋다.
제8 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(VI):
Figure pct00015
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
X는 1가의 기를 나타내고,
R2는, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L2는, 2가의 기를 나타내고,
B2는, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (VI)으로 표시되는 화합물은, 하기 식 (VI'):
Figure pct00016
[식 중,
RA, RB, 환 A, 및 X는, 각각, 식 (VI)으로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함되며,
R2는, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L2는, 2가의 기를 나타내고,
B2는, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 화합물이라도 좋다.
제9 실시형태에서는, 본 발명은, 하기 식(VII):
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
Y는, 1가의 기를 나타내고,
R1은, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1은, 2가의 기를 나타내고,
B1은, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
특정한 실시형태에서는, 식 (VII)로 표시되는 화합물은, 하기 식 (VII'):
Figure pct00018
[식 중,
RA, RB, 환 A, 및 Y는, 각각, 식 (VII)로 표시되는 것과 동일하고,
LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함되며,
R1은, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
L1은, 2가의 기를 나타내고,
B1은, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 화합물이라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 면역 글로불린 단위는, 인간 면역 글로불린 단위라도 좋다.
보다 바람직한 실시형태에서는, 상기 인간 면역 글로불린 단위는, 인간 IgG 항체라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 라이신 잔기는, Eu 넘버링(numbering)에 따르는 246/248위치, 288/290위치, 또는 317위치에 존재하는 것이라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 위치 선택적인 결합은, 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기, 및 L1 중의 카르보닐기의 결합에 의한 아미드 결합에 의해 달성되는 것이라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 r은, 1.9 내지 2.1이라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 친수성기는, 카복실산기, 설폰산기, 수산기, 폴리에틸렌글리콜기, 폴리사르코신기, 및 당 부분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 기라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 페닐렌기라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 기능성 물질은, 의약, 표지 물질 또는 안정화제라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 항체 유도체는, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 분석했을 때에, 2.6% 이하의 응집률을 나타내고 있어도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기(-LHG-) 는, 하기 식 (a):
-(C(RHG)2)n1-(C=O)n2-(NRHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
[식 중,
복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
n1은, 0 내지 3의 정수이고,
n2는, 0 또는 1의 정수이고,
n3은, 0 또는 1의 정수이고,
n4는, 0 내지 3의 정수이다.]로 표시되는 2가의 기라도 좋다.
보다 바람직한 실시형태에는, 식 (a)로 표시되는 2가의 기는, 하기 식 (a1), (a2), 또는 (a3):
(a1) -(C(RHG)2)-;
(a2) -(C(RHG)2)-(C=O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-; 또는
(a3) -(C=O)-(C(RHG)2)2-;
[식 중,
복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.]로 표시되는, 2가의 기라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 친수성기는, 각각 독립적으로, 카복실산기, 설폰산기, 또는 수산기라도 좋다.
보다 바람직한 실시형태에서는, 친수성기는, 카복실산기라도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 생체 직교성 관능기는, 말레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기 또는 테트라진 잔기라도 좋다.
본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 긴 체내 체류 시간, 높은 모노머 비율(낮은 응집률), 인간 세포 내에서의 기능성 물질의 높은 방출능, 및 마우스 혈장 중의 높은 안정성 등의 우수한 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 유도체 및 화합물 또는 그것들의 염, 및 시약은, 예를 들면, 상기 위치 선택적인 컨쥬게이트의 제조에 있어서의 합성 중간체로서 유용하다.
[도 1] 도 1은, 식 (I)로 표시되는 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 식 (II)로 표시되는 본 발명의 항체 유도체, 및 식 (III) 내지 (VII)로 표시되는 본 발명의 화합물의 상호 관계를 나타내는 도면이다. 이들 물질은, 식 (V)로 표시되는 구조 단위 중 X 및 Y를 제외한 부분 구조 단위를 공유한다. 또한, 이들 물질은, 도 1 중에 나타낸 스킴에 의해 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 합성 중간체 및 최종 합성물의 관계에 있는 일련의 발명을 제공한다.
[도 2] 도 2는, 식 (I)로 표시되는 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 식 (II)로 표시되는 본 발명의 항체 유도체, 및 식 (III) 및 (IV)로 표시되는 본 발명의 화합물의 합성 개요를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 식 (IV) 내지 (VII)로 표시되는 본 발명의 화합물의 합성 개요의 일례를 나타내는 도면이다. DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민; DMF: N,N-디메틸포름아미드
1. 일반적인 용어 정의
본 발명에서, 용어 「항체」는 이하와 같다. 또한, 용어 「면역 글로불린 단위」는, 이러한 항체의 기본 구성요소인 2가 단량체 단위에 대응하는 것으로, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단위이다. 따라서, 면역 글로불린 단위에 대해, 그 유래, 종류(폴리클로날 또는 모노클로날, 아이소타입 및 전장(全長) 항체 또는 항체 단편), 항원, 라이신 잔기의 위치, 및 위치 선택성의 정의, 예, 및 바람직한 예는, 이하에 설명하는 항체인 것과 동일하다.
항체의 유래는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 포유류, 조류 (예, 닭) 등의 동물로부터 유래하는 것이라도 좋다. 바람직하게는, 면역 글로불린 단위는 포유동물로부터 유래된다. 이러한 포유동물로서는, 예를 들어, 영장류 (예, 인간, 원숭이, 침팬지), 설치류(예, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼), 애완 동물 (예, 개, 고양이), 가축 (예, 소, 돼지, 염소), 사역 동물 (예, 말, 양)을 들 수 있고, 바람직하게는 영장류 또는 설치류이며, 보다 바람직하게는 인간이다.
항체의 종류는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체라도 좋다. 항체는 또한, 2가의 항체 (예, IgG, IgD, IgE), 또는 4가 이상의 항체 (예, IgA 항체, IgM 항체)라도 좋다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체로서는, 예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 소정의 당쇄(糖鎖)가 부가된 항체(예, N형 당쇄 결합 컨센서스 서열 등의 당쇄 결합 컨센서스 서열을 갖도록 개변된 항체), 이중 특이성 항체, Fc영역 단백질, Fc융합 단백질을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 아이소타입으로서는, 예를 들어, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, 및 IgY를 포함한다. 본 발명에서는, 모노클로날 항체로서, 전장 항체 또는 가변 영역 및 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 항체 단편을 이용할 수 있지만, 전장 항체가 바람직하다. 항체는, 바람직하게는 인간 IgG 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 인간 IgG 전장 모노클로날 항체이다.
항체의 항원으로서는, 임의의 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항원은 단백질[올리고펩타이드, 폴리펩타이드를 포함한다. 당 등의 생체분자로 수식된 단백질(예, 당단백질)이라도 좋다], 당쇄, 핵산, 저분자 화합물을 들 수 있다. 바람직하게는, 항체는, 단백질을 항원으로 하는 항체라도 좋다. 단백질로서는, 예를 들어, 세포막 수용체, 세포막 수용체 이외의 세포막 단백질(예를 들면, 세포외 기질 단백질), 리간드, 가용성 수용체를 들 수 있다.
보다 구체적으로, 항체의 항원인 단백질은, 질병 표적 단백질이라도 좋다. 질병 표적 단백질로서는, 예를 들어, 이하를 들 수 있다.
(1) 암 영역
PD-L1, GD2, PDGFRα(혈소판 유래 성장 인자 수용체), CD22, HER2, 포스파티딜세린(PS), EpCAM, 피브로넥틴, PD-1, VEGFR-2, CD33, HGF, gpNMB, CD27, DEC-205, 엽산 수용체, CD37, CD19, Trop2, CEACAM5, S1P, HER3, IGF-1R, DLL4, TNT-1/B, CPAAs, PSMA, CD20, CD105(엔도글린), ICAM-1, CD30, CD16A, CD38, MUC1, EGFR, KIR2DL1, 2, NKG2A, 테나신-C(tenascin-C), IGF(인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor)), CTLA-4, 메소텔린(mesothelin), CD138, c-Met, Ang2, VEGF-A, CD79b, ENPD3, 엽산 수용체 α, TEM-1, GM2, 글리피칸 3, 마크로파지 억제 인자(macrophage inhibitor factor), CD74, Notch1, Notch2, Notch3, CD37, TLR-2, CD3, CSF-1R, FGFR2b, HLA-DR, GM-CSF, EphA3, B7-H3, CD123, gpA33, Frizzled7 수용체, DLL4, VEGF, RSPO, LIV-1, SLITRK6, Nectin-4, CD70, CD40, CD19, SEMA4D(CD100), CD25, MET, Tissue Factor, IL-8, EGFR, cMet, KIR3DL2, Bst1 (CD157), P-카드헤린, CEA, GITR, TAM(종양 관련 마크로파지(tumor Associated macrophage)), CEA, DLL4, Ang2, CD73, FGFR2, CXCR4, LAG-3, GITR, Fucosyl GM1, IGF-1, 안지오포이에틴 2(Angiopoietin 2), CSF-1R, FGFR3, OX40, BCMA, ErbB3, CD137(4-1BB), PTK7, EFNA4, FAP, DR5, CEA, Ly6E, CA6, CEACAM5, LAMP1, 조직 인자, EPHA2, DR5, B7-H3, FGFR4, FGFR2, α2-PI, A33, GDF15, CAIX, CD166, ROR1, GITR, BCMA, TBA, LAG-3, EphA2, TIM-3, CD-200, EGFRvIII, CD16A, CD32B, PIGF, Axl, MICA/B, 톰센-프리덴라이히(Thomsen-Friedenreich), CD39, CD37, CD73, CLEC12A, Lgr3, 트랜스페린 수용체, TGFβ, IL-17, 5T4, RTK, 면역 억제 단백질(Immunne Supppressor Protein), NaPi2b, 루이스 혈액형 B항원, A34, 리실-옥시다제(Lysil-Oxidase), DLK-1, TROP-2, α9-인테그린, TAG-72(CA72-4), CD70
(2) 자가면역질환·염증성질환
IL-17, IL-6R, IL-17R, INF-α, IL-5R, IL-13, IL-23, IL-6, ActRIIB, β7-인테그린(Intergrin), IL-4αR, HAS, 에오탁신-1(Eotaxin-1), CD3, CD19, TNF-α, IL-15, CD3ε, 피브로넥틴(Fibronectin), IL-1β, IL-1α, IL-17, TSLP (흉선 기질 림프포이에틴(Thymic Stromal Lymphopoietin)), LAMP (알파4 베타 7 인테그란(Alpha4 Beta 7 Integran)), IL-23, GM-CSFR, TSLP, CD28, CD40, TLR-3, BAFF-R, MadCAM, IL-31R, IL-33, CD74, CD32B, CD79B, IgE(면역 글로불린 E), IL-17A, IL-17F, C5, FcRn, CD28, TLR4, MCAM, B7RP1, CXCR1, 2 리간즈(Ligands), IL-21, 카드헤린-11(Cadherin-11), CX3CL1, CCL20, IL-36R, IL-10R, CD86, TNF-α, IL-7R, Kv1.3, α9인테그린, LIFHT
(3) 뇌신경질환
CGRP, CD20, β-아밀로이드, β-아밀로이드 프로토피브린, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 수용체(Calcitonin Gene-Related Peptide Receptor), LINGO(Ig Domain Containing1), α시누클레인, 세포외 tau, CD52, 인슐린 수용체, tau 단백, TDP-43, SOD1, TauC3, JC 바이러스
(4) 감염증
클로스트리디움 디피실리 독소 B(Clostridium Difficiile toxin B), 사이토메갈로바이러스, RS바이러스, LPS, S.아우레우스 알파-톡신(S.Aureus Alpha-toxin), M2e 단백, Psl, PcrV, S.아우레우스 톡신(S.Aureus toxin), 인플루엔자 A, 알기네이트(Alginate), 황색 포도구균, PD-L1, 인플루엔자 B, 아시네토박터, F-단백질, Env, CD3, 병원성 대장균, 클레브시에라, 폐렴구균
(5) 유전성·희소질환
아밀로이드 AL, SEMA4D(CD100), 인슐린 수용체, ANGPTL3, IL4, IL13, FGF23, 부신 피질 자극 호르몬, 트랜스사이레틴, 헌팅틴
(6) 안질환
인자 D, IGF-1R, PGDFR, Ang2, VEGF-A, CD-105 (엔도글린(Endoglin)), IGF-1R, β아밀로이드
(7) 뼈·정형외과 영역
스클레로스틴(Sclerostin), 미오스타틴(Myostatin), 디코프-1(Dickkopf-1), GDF8, RNAKL, HAS, 시글렉-15(Siglec-15)
(8) 혈액 질환
vWF, 인자 IXa, 인자 X, IFNγC5, BMP-6, 페로포르틴(Ferroportin), TFPI
(9) 기타 질환
BAFF(B 세포 활성화 인자), IL-1β, PCSK9, NGF, CD45, TLR-2, GLP-1, TNFR1, C5, CD40, LPA, 프로락틴 수용체, VEGFR-1, CB1, 엔도글린, PTH1R, CXCL1, CXCL8, IL-1β, AT2-R, IAPP
모노클로널 항체의 구체예로서는, 특정의 키메라 항체(예, 리툭시맙, 바실릭시맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 실툭시맙, 디누툭시맙, 오르타톡사시맙), 특정의 인간화 항체(예, 다클리주맙, 팔리비주맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 나탈리주맙(IgG4), 토실리주맙, 에쿨리주맙(IgG2), 모가물리주맙, 페르투주맙, 오비누투주맙, 베돌리주맙, 펨브롤리주맙(IgG4), 메폴리주맙, 엘로투주맙, 다라투무맙, 익세키주맙(IgG4), 레슬리주맙(IgG4), 아테졸리주맙), 특정의 인간 항체(예, 아달리무맙(IgG1), 파니투무맙, 골리무맙, 우스테키누맙, 카나키누맙, 오파투무맙, 데노수맙(IgG2), 이필리무맙, 벨리무맙, 락시바쿠맙, 라무시루맙, 니볼루맙, 듀필루맙(IgG4), 세쿠키누맙, 에볼로쿠맙(IgG2), 알릴로쿠맙, 네시투무맙, 브로달루맙(IgG2), 올랄라투맙)을 들 수 있다(IgG 서브 타입으로 언급하고 있지 않은 경우, IgG1임을 나타낸다).
항체 중의 아미노산 잔기의 위치, 및 중쇄의 정상 영역의 위치(예, CH2 도메인)에 대해서는 EU 넘버링에 따른다 (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html을 참조). 예를 들어, 인간 IgG를 대상으로 하는 경우, 246위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 16번째 아미노산 잔기에 상당하고, 248위치의 라이신 잔기는 인간 IgG CH2 영역의 18번째 아미노산 잔기에 상당하고, 288위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 58번째 아미노산 잔기에 상당하고, 290위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 60번째 아미노산 잔기에 상당하고, 317위치의 라이신 잔기는, 인간 IgG CH2 영역의 87번째 아미노산 잔기에 상당하고, 246/248위치의 표기는, 246위치 또는 248위치의 라이신 잔기가 대상임을 나타낸다. 288/290위치의 표기는, 288위치 또는 290위치의 라이신 잔기가 대상임을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 항체를 구성하는 면역 글로불린 단위 중의 중쇄에서의 특정 라이신 잔기(예, 246/248위치, 288/290위치 또는 317위치의 라이신 잔기)를 위치 선택적으로 수식할 수 있다(예를 들어, 국제공개 제2018/199337호, 국제공개 제2019/240288호, 국제공개 제2019/240287호 및 국제공개 제2020/090979호 참조). 본 명세서에서, 「위치 선택적」 또는 「위치 선택성」이란, 항체에서 특정의 아미노산 잔기가 특정 영역에 편재되어 있지 않음에도 불구하고, 항체 중의 특정의 아미노산 잔기와 결합할 수 있는 소정의 구조 단위가, 항체 중의 특정 영역에 편재되는 것을 말한다. 따라서, 「위치 선택적으로 갖는」, 「위치 선택적인 결합」, 「위치 선택성에서의 결합」 등의 위치 선택성과 관련된 표현은, 1개 이상의 특정의 아미노산 잔기를 포함하는 표적 영역에서의 소정의 구조 단위의 보유율 또는 결합률이, 표적 영역에 있어서의 당해 특정의 아미노산 잔기와 동종인 복수개의 아미노산 잔기를 포함하는 비표적 영역에 있어서의 당해 구조 단위의 보유율 또는 결합률보다 유의한 수준에서 높은 것을 의미한다. 이러한 위치 선택성은, 50% 이상이며, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 100%라도 좋다.
본 발명에서는, 항체 중의 중쇄에 있어서의 특정의 라이신 잔기가 위치 선택적으로 수식되어 있는 한, 다른 위치의 특정의 아미노산 잔기가 추가로 위치 선택적으로 수식되어 있어도 좋다. 예를 들어, 항체에서의 소정 위치의 특정의 아미노산 잔기를 위치 선택적으로 수식하는 방법은, 국제공개 제2018/199337호, 국제공개 제2019/240288호, 국제공개 제2019/240287호 및 국제공개 제2020/090979호에 기재되어 있다. 이러한 특정 아미노산 잔기로서는, 수식하기 쉬운 측쇄(예, 아미노기, 카르복시기, 아미드기, 하이드록시기, 티올기)를 갖는 아미노산 잔기(예, 라이신 잔기, 아스파르긴산 잔기, 글루타민산 잔기, 아스파라긴 잔기, 글루타민 잔기, 스레오닌 잔기, 세린 잔기, 티로신 잔기, 시스테인 잔기)를 이용할 수 있는데, 바람직하게는, 아미노기를 포함하는 측쇄를 갖는 라이신 잔기, 하이드록시기를 포함하는 측쇄를 갖는 티로신 잔기, 세린 잔기, 및 스레오닌 잔기, 또는 티올기를 포함하는 측쇄를 갖는 시스테인 잔기이고, 보다 바람직하게는, 라이신 잔기라도 좋다 (즉, 246/248위치의 라이신 잔기, 288/290위치의 라이신 잔기, 및 317 위치의 라이신 잔기 중, 2개의 라이신 잔기가 위치 선택적으로 이중 수식될 수 있고, 3개의 라이신 잔기가 위치 선택적으로 삼중 수식되어 있어도 좋다).
(할로겐 원자)
할로겐 원자로서는, 예를 들면, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
(1가의 기)
1가의 기로서는, 예를 들면 1가의 탄화수소기, 및 1가의 복소환기를 들 수 있다. 　　　
1가의 기는, 1개 이상(예를 들어 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 후술하는 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋다.
(1가의 탄화수소기 및 이와 관련된 용어)
1가의 탄화수소기로서는, 예를 들면, 1가의 쇄상 탄화수소기, 1가의 지환식 탄화수소기, 및 1가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기란, 쇄상 구조만으로 구성된 탄화수소기를 의미하고, 주쇄에 환상 구조를 포함하지 않는다. 다만, 쇄상 구조는 직쇄상이라도 분기상이라도 좋다. 1가의 쇄상 탄화수소기로서는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐을 들 수 있다. 알킬, 알케닐, 및 알키닐은, 직쇄상, 또는 분기상 중 어느 것이라도 좋다.
알킬로서는, 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬이 바람직하고, 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 1 내지 4의 알킬이 더욱 바람직하다. 알킬이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬로서는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실을 들 수 잇다.
알케닐로서는, 탄소 원자 수 2 내지 12의 알케닐이 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 6의 알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 4의 알케닐이 더욱 바람직하다. 알케닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 2 내지 12의 알케닐로서는, 예를 들어, 비닐, 프로페닐, n-부테닐을 들 수 있다.
알키닐로서는, 탄소 원자 수 2 내지 12의 알키닐이 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 6의 알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 4의 알키닐이 더욱 바람직하다. 알키닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 2 내지 12의 알키닐로서는, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, n-부티닐을 들 수 있다.
1가의 쇄상 탄화수소기로서는, 알킬이 바람직하다.
1가의 지환식 탄화수소기란, 환 구조로서 지환식 탄화수소만을 포함하고, 방향족환을 포함하지 않는 탄화수소기를 의미하고, 지환식 탄화수소는 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 다만, 지환식 탄화수소만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 그 일부에 쇄상 구조를 포함하고 있어도 좋다. 1가의 지환식 탄화수소기로서는, 예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐을 들 수 있고, 이것들은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다.
사이클로알킬로서는, 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알킬이 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 6의 사이클로알킬이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 5 내지 6의 사이클로알킬이 더욱 바람직하다. 사이클로알킬이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알킬로서는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다.
사이클로알케닐로서는, 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알케닐이 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 6의 사이클로알케닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 5 내지 6의 사이클로알케닐이 더욱 바람직하다. 사이클로알케닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알케닐로서는, 예를 들어, 사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐을 들 수 있다.
사이클로알키닐로서는, 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알키닐이 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 6의 사이클로알키닐이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 5 내지 6의 사이클로알키닐이 더욱 바람직하다. 사이클로알키닐이 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 3 내지 12의 사이클로알키닐로서는, 예를 들어, 사이클로프로피닐, 사이클로부티닐, 사이클로펜티닐, 사이클로헥시닐을 들 수 있다.
1가의 지환식 탄화수소기로서는, 사이클로알킬이 바람직하다.
1가의 방향족 탄화수소기란, 방향족환 구조를 포함하는 탄화수소기를 의미한다. 다만, 방향족환만으로 구성되어 있을 필요는 없고, 그 일부에 쇄상 구조나 지환식 탄화수소를 포함하도 있어도 좋고, 방향족환은 단환, 다환 중 어느 것이라도 좋다. 1가의 방향족 탄화수소기로서는, 탄소 원자 수 6 내지 12의 아릴이 바람직하고, 탄소 원자 수 6 내지 10의 아릴이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 6의 아릴이 더욱 바람직하다. 1가의 방향족 탄화수소기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 탄소 원자 수 6 내지 12의 아릴로서는, 예를 들어, 페닐, 나프틸을 들 수 있다.
1가의 방향족 탄화수소기로서는, 페닐이 바람직하다.
이것들 중에서도, 1가의 탄화수소기로서는, 알킬, 사이클로알킬, 아릴이 바람직하다.
(1가의 복소환기 및 이와 관련된 용어)
1가의 복소환기란, 복소환식 화합물의 복소환으로부터 수소 원자 1개를 제거한 기를 말한다. 1가의 복소환기는, 1가의 방향족 복소환기, 또는 1가의 비방향족 복소환기이다. 복소환기를 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 유황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 유황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
1가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자 수 1 내지 15의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자 수 1 내지 9의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 1 내지 6의 방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 1가의 방향족 복소환기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 1가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 푸리닐, 안트라퀴놀릴, 카르바조닐, 플루오레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 및 프탈라지닐을 들 수 있다.
1가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자 수 2 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 2 내지 6의 비방향족 복소환기가 더욱 바람직하다. 1가의 비방향족 복소환기가 치환기를 갖는 경우, 상기 탄소 원자 수에 치환기의 탄소 원자 수는 포함되지 않는다. 1가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 옥시라닐, 아지리디닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라지닐, 디하이드로옥사지닐, 테트라하이드로옥사지닐, 디하이드로피리미디닐, 및 테트라하이드로피리미디닐을 들 수 있다.
이것들 중에서도, 1가의 복소환기로서는, 5원 또는 6원의 복소환기가 바람직하다.
(2가의 기)
2가의 기는, 2가의 직쇄 탄화수소기, 2가의 환상 탄화수소기, 2가의 복소환기, -C(=O)-, -C(=S)-, -NR7-, -C(=O)-NR7-, -NR7-C(=O)-, -C(=S)-NR7-, -NR7-C(=S)-, -O-, -S-, -(O-R8)m-, 및 -(S-R8)m1-로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기, 또는 이것들의 2개 이상(예를 들면 2 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 5개, 특히 바람직하게는 2 또는 3개)의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 기이다. R7은, 수소 원자, 또는 후술하는 치환기를 나타낸다. R8은, 2가의 직쇄 탄화수소기, 2가의 환상 탄화수소기, 또는 2가의 복소환기를 나타낸다. m1은, 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 1 내지 8의 정수이고, 보다 바람직하게는 1 내지 6의 정수이고, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고, 특히 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
2가의 직쇄 탄화수소기는, 직쇄 알킬렌, 직쇄 알케닐렌, 또는 직쇄 알키닐렌이다.
직쇄 알킬렌은, 탄소 원자 수 1 내지 6의 직쇄 알킬렌이고, 탄소 원자 수 1 내지 4의 직쇄 알킬렌이 바람직하다. 직쇄 알킬렌으로서는, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, n-헥실렌을 들 수 있다.
직쇄 알케닐렌은, 탄소 원자 2 내지 6의 직쇄 알케닐렌이며, 탄소 원자 수 2 내지 4의 직쇄 알케닐렌이 바람직하다. 직쇄 알케닐렌으로서는, 예를 들면, 에틸레닐렌, n-프로피닐렌, n-부테닐렌, n-펜테닐렌, n-헥세닐렌을 들 수 있다.
직쇄 알키닐렌은 탄소 원자 수 2 내지 6의 직쇄 알키닐렌이며, 탄소 원자 수 2 내지 4의 직쇄 알키닐렌이 바람직하다. 직쇄 알키닐렌으로서는, 예를 들면 에티닐렌, n-프로피닐렌, n-부티닐렌, n-펜티닐렌, n-헥시닐렌을 들 수 있다.
2가의 직쇄 탄화수소기로서는, 직쇄 알킬렌이 바람직하다.
2가의 환상 탄화수소기는, 아릴렌, 또는 2가의 비방향족 환상 탄화수소기이다.
아릴렌으로서는, 탄소 원자 수 6 내지 14의 아릴렌이 바람직하고, 탄소 원자 수 6 내지 10의 아릴렌이 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 6의 아릴렌이 특히 바람직하다. 아릴렌으로서는, 예를 들면, 페닐렌, 나프틸렌, 안트라세닐렌을 들 수 있다.
2가의 비방향족 환상 탄화수소기로서는, 탄소 원자 수 3 내지 12의 단환식 또는 다환식인 2가의 비방향족 환상 탄화수소기가 바람직하고, 탄소 원자 수 4 내지 10의 단환식 또는 다환식인 2가의 비방향족 환상 탄화수소기가 보다 바람직하고, 탄소수 5 내지 8의 단환식인 2가의 비방향족 환상 탄화수소기가 특히 바람직하다. 2가의 비방향족 환상 탄화수소기로서는, 예를 들면, 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌, 사이클로옥틸렌을 들 수 있다.
2가의 환상 탄화수소기로서는, 아릴렌이 바람직하다.
2가의 복소환기는, 2가의 방향족 복소환기, 또는 2가의 비방향족 복소환기이다. 복소환을 구성하는 헤테로 원자로서, 산소 원자, 유황 원자, 질소 원자, 인 원자, 붕소 원자 및 규소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 산소 원자, 유황 원자 및 질소 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
2가의 방향족 복소환기로서는, 탄소 원자 수 3 내지 15의 2가의 방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 9의 2가의 방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 6의 2가의 방향족 복소환기가 특히 바람직하다. 2가의 방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤디일, 푸란디일, 티오펜디일, 피리딘디일, 피리다진디일, 피리미딘디일, 피라진디일, 트리아진디일, 피라졸디일, 이미다졸디일, 티아졸디일, 이소티아졸디일, 옥사졸디일, 이소옥사졸디일, 트리아졸디일, 테트라졸디일, 인돌디일, 푸린디일, 안트라퀴논디일, 카르바졸디일, 플루오렌디일, 퀴놀린디일, 이소퀴놀린디일, 퀴나졸린디일, 및 프탈라진디일을 들 수 있다.
2가의 비방향족 복소환기로서는, 탄소 원자 수 3 내지 15의 비방향족 복소환기가 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 9의 비방향족 복소환기가 보다 바람직하고, 탄소 원자 수 3 내지 6의 비방향족 복소환기가 특히 바람직하다. 2가의 비방향족 복소환기로서는, 예를 들어, 피롤디온디일, 피롤린디온디일, 옥실란디일, 아지리딘디일, 아제티딘디일, 옥세탄디일, 티에탄디일, 피롤리딘디일, 디하이드로푸란디일, 테트라하이드로푸란디일, 디옥솔란디일, 테트라하이드로티오펜디일, 피롤린디일, 이미다졸리딘디일, 옥사졸리딘디일, 피페리딘디일, 디하이드로피란디일, 테트라하이드로피란디일, 테트라하이드로티오피란디일, 모르폴린디일, 티오모르폴린디일, 피페라진디일, 디하이드로옥사진디일, 테트라하이드로옥사진디일, 디하이드로피리미딘디일, 및 테트라하이드로피리미딘디일을 들 수 있다.
2가의 복소환기로서는, 2가의 방향족 복소환기가 바람직하다.
바람직하게는, 2가의 기는, 알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR7-, -C(=O)-NR7-, -NR7-C(=O)-, -O-, 및 -(O-R8)m-로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가의 기이거나, 또는,
알킬렌, 아릴렌, -C(=O)-, -NR7-, -C(=O)-NR7-, -NR7-C(=O)-, -O-, 및 -(O-R8)m1-로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 기를 포함하는 주쇄 구조를 갖는 2가의 기이며,
R7이, 수소 원자 또는 알킬이고,
R8이, 알킬렌 또는 아릴렌이고,
m1이, 1 내지 5의 정수(즉, 1, 2, 3, 4 또는 5)라도 좋다.
알킬렌, 아릴렌, 알킬은, 상술한 것과 동일하다.
2가의 기에 있어서의 주쇄 구조는, 1개 이상(예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 후술하는 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋다.
(치환기)
치환기의 예는 다음을 포함한다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 1가의 탄화수소기;
(iii) 1가의 복소환기;
(iv) 아랄킬;
(v) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 1가의 탄화수소기를 나타낸다.); 또는
(vi) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일하거나 또는 다르고, 수소 원자, 또는 1가 탄화수소기를 나타낸다.);
(vii) 니트로기, 황산기, 설폰산기, 시아노기 및 카르복실기.
상기 치환기에 있어서의 할로겐 원자, 1가의 탄화수소기, 및 1가의 복소환기의 정의, 예, 및 바람직한 예는 각각, 상술한 것과 동일하다.
아랄킬이란, 아릴알킬을 말한다. 아릴알킬에 있어서의 아릴 및 알킬의 정의, 예 및 바람직한 예는 상술한 바와 같다. 아랄킬로서는, 탄소 원자 수 3 내지 15의 아랄킬이 바람직하다. 이러한 아랄킬로서는, 예를 들면 벤조일, 페네틸, 나프틸메틸, 나프틸에틸을 들 수 있다.
바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬, 페닐 또는 나프틸;
(iii) 탄소 원자 수 3 내지 15의 아랄킬;
(iv) 5원 또는 6원의 복소환;
(v) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.);
(vi) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일하거나 또는 다르고, 수소 원자, 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.); 또는
(vii) 상기 (vii)에서 열거한 것과 동일한 기.
보다 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일하거나 또는 다르고, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 12의 알킬을 나타낸다.); 또는
(v) 상기 (vii)에 열거한 것과 동일한 기.
보다 더욱 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬을 나타낸다.);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일하거나 또는 다르고, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬을 나타낸다.); 또는
(v) 상기 (vii)에 열거한 것과 동일한 기.
특히 바람직하게는, 치환기는 이하라도 좋다:
(i) 할로겐 원자;
(ii) 탄소 원자 수 1 내지 4의 알킬;
(iii) Ra-O-, Ra-C(=O)-, Ra-O-C(=O)-, 또는 Ra-C(=O)-O-(Ra는, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다.);
(iv) NRbRc-, NRbRc-C(=O)-, NRbRc-C(=O)-O-, 또는 Rb-C(=O)-NRc-(Rb 및 Rc는, 동일하거나 또는 다르고, 수소 원자, 또는 탄소 원자 수 1 내지 4의 알킬을 나타낸다.); 또는
(v) 상기 (vii)에 열거한 것과 동일한 기.
(친수성기)
친수성기는, 식 (I) 내지 (VII) 또는 그 하위 개념의 식으로 표시되는 구조 단위를, 보다 친수성으로 할 수 있는 기이다. 친수성기를, 당해 구조 단위 중의 소정 부위에 가짐으로써, 마우스 혈장 중에서 컨쥬게이트를 보다 안정화할 수 있다. 이러한 친수성기로서는, 예를 들면, 카복실산기, 설폰산기, 수산기, 폴리에틸렌글리콜기, 폴리사르코신기, 당 부분을 들 수 있다. 친수성기는 컨쥬게이트 중에 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개) 포함되어 있어도 좋다.
폴리에틸렌글리콜(PEG)기는, -(CH2-CH2-O-)k1-로 표시되는 2가의 기이다. 컨쥬게이트가 폴리에틸렌글리콜기를 갖는 경우, 컨쥬게이트는, 폴리에틸렌글리콜기 중 한쪽의 결합손이 수소 원자, 또는 1가의 기(예를 들어, 1가 탄화수소기)와 결합한 1가의 기를 갖고 있어도 좋다. k1은, 예를 들면 3 이상의 정수, 바람직하게는 4 이상의 정수, 보다 바람직하게는 5 이상의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 6 이상의 정수라도 좋다. k1은 또한, 15 이하의 정수, 바람직하게는 12 이하의 정수, 보다 바람직하게는 10 이하의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 9개 이하의 정수라도 좋다. 보다 구체적으로는, k1은, 3 내지 15의 정수, 바람직하게는 4 내지 12의 정수, 보다 바람직하게는 5 내지 10의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 4 내지 9의 정수라도 좋다.
폴리사르코신기는, -(NCH3-CH2-CO-)k2-로 표시되는 2가의 기이다. 폴리사르코신기는, PEG의 대안으로서 사용할 수 있다. k2는, 예를 들어 3 이상의 정수, 바람직하게는 4 이상의 정수, 보다 바람직하게는 5 이상의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 6 이상의 정수라도 좋다. k2는 또한, 15 이하의 정수, 바람직하게는 12 이하의 정수, 보다 바람직하게는 10 이하의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 9개 이하의 정수라도 좋다. 보다 구체적으로는, k2는, 3 내지 15의 정수, 바람직하게는 4 내지 12의 정수, 보다 바람직하게는 5 내지 10의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 4 내지 9의 정수라도 좋다.
당 부분은 단당, 올리고당(예, 이당, 삼당, 사당, 오당) 또는 다당이다. 당 부분은 알도오스 또는 알도오스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 당 부분은, 리보오스, 데옥시리보오스, 자일로오스, 아라비노오스, 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 또는 프룩토오스, 또는 아미노당(예, 글루코사민) 등의 단당, 또는 이러한 단당을 포함하는 올리고당 또는 다당이라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 당 부분은, 저분자량의 친수성기라도 좋다. 저분자 친수성기란, 분자량 1500 이하의 친수성기를 말한다. 저분자 친수성기의 분자량은, 바람직하게는 1200 이하, 1000 이하, 800 이하, 700 이하, 600 이하, 500 이하, 400 이하, 300 이하, 200 이하, 또는 100 이하라도 좋다. 저분자 친수성기로서는, 카복실산기, 설폰산기, 수산기, 및 상기 분자량을 만족하는 폴리에틸렌글리콜기, 폴리사르코신기, 당 부분(예, 단당, 올리고당)을 들 수 있다.
(생체 직교성 관능기)
생체 직교성 관능기는, 생체 구성 성분(예, 아미노산, 단백질, 핵산, 지질, 당, 인산)과는 반응하지 않거나, 생체 구성 성분에 대한 반응의 속도가 느리지만, 생체 구성 성분 이외의 성분에 대해 선택적으로 반응하는 기를 말한다. 생체 직교 관능기는, 당해 업계에 잘 알려져 있다(예, Sharpless K.B.et al., Angew.Chem.Int.Ed.40, 2004(2015); Bertozi CR.et. Science 291,2357(2001); Bertozzi C. R. et al., Nature Chemical Biology 1, 13(2005) 참조).
본 발명에서는, 생체 직교성 관능기로서, 단백질에 대한 생체 직교성 관능기가 사용된다. 본 발명의 시약에 의해 유도체화되야 할 티올기 도입 항체는, 단백질이기 때문이다. 단백질에 대한 생체 직교 관능기는, 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산 잔기의 측쇄와 반응하지 않거나, 또는 당해 측쇄에 대한 반응 속도가 느리지만, 목적하는 관능기와 반응하는 기이다. 단백질을 구성하는 천연의 20종의 아미노산은, 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글라이신(G), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 스레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y), 발린(V), 아스파라긴산(D), 글루탐산(E), 아르기닌(R), 히스티딘(H) 및 라이신(K)이다. 이것들의 천연의 20종의 아미노산 중, 측쇄가 없는(즉, 수소 원자인) 글라이신, 및 측쇄가 탄화수소기인(즉, 유황 원자, 질소 원자, 및 산소 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 헤테로원자를 측쇄에 포함하지 않는) 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 및 발린은, 정상 반응에 대해 불활성이다. 따라서 단백질에 대한 생체 직교 관능기는, 정상 반응에 대해 불활성인 측쇄를 갖는 이들의 아미노산의 측쇄에 더하여, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 프롤린, 세린, 스레오닌, 트립토판, 티로신, 아스파라긴산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신의 측쇄에 대해 반응하지 않거나, 또는 반응 속도가 느리지만, 목적하는 관능기와 반응하는 기이다.
이러한 생체 직교성 관능기로서는, 예를 들면, 아지드 잔기, 알데히드 잔기, 티올 잔기, 알켄 잔기(바꿔 말하면, 탄소 원자간 이중 결합을 갖는 최소 단위인 비닐렌(에테닐렌) 부분)을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 알킨 잔기(바꿔 말하면, 탄소 원자간 삼중 결합을 갖는 최소 단위인 에티닐렌 부분을 갖고 있으면 좋다. 이하 동일), 할로겐 잔기, 테트라진 잔기, 니트론 잔기, 히드록실아민 잔기, 니트릴 잔기, 히드라진 잔기, 케톤 잔기, 보론산 잔기, 시아노벤조티아졸 잔기, 알릴 잔기, 포스핀 잔기, 말레이미드 잔기, 디설파이드 잔기, 티오에스테르 잔기, α-할로카르보닐 잔기(예, α위치에 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 갖는 카르보닐 잔기. 이하 동일), 이소니트릴 잔기, 시드논 잔기, 셀레늄 잔기가 언급된다.
보다 구체적으로는, 생체 직교성 관능기는, 하기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하고 있어도 좋다.
[여기서,
R1a, 단일 또는 복수의 R1b, 및 단일 또는 복수의 R1c는, 동일하거나 다르고, 상술한 치환기, 또는 전자 흡인기이며,
·는, 결합손이다.]
전자 흡인기로서는, 예를 들면, 할로겐 원자, 할로겐 원자로 치환된 알킬(예, 트리플루오로메틸), 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트, 니트로, 시아노, 페닐기, 케토기(예, 아실)를 들 수 있고, 할로겐 원자, 보론산 잔기, 메실, 토실, 트리플레이트가 바람직하다.
특정한 실시형태에서는, 생체 직교성 관능기는 보호되어 있어도 좋다. 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기란, 미보호의 생체 직교성 관능기, 또는 보호된 생체 직교성 관능기를 말한다. 미보호의 생체 직교성 관능기는, 상술한 생체 직교성 관능기에 해당한다. 보호된 생체 직교성 관능기는, 보호기의 절단에 의해 생체 직교성 관능기를 생성하는 기이다. 보호기의 절단은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서의 특정 처리에 의해 행할 수 있다. 이러한 특정 처리로서는, 예를 들면, (a) 산성 물질, 염기성 물질, 환원제, 산화제, 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 물질에 의한 처리, (b) 빛으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 물리화학적 자극에 의한 처리, 또는 (c) 자가분해성의 절단성 부분을 포함하는 절단성 링커를 사용한 경우의 방치를 들 수 있다. 이러한 보호기 및 그 절단 조건은, 당해 분야에서의 기술 상식이다(예, G.Leriche, L.Chisholm, A.Wagner, Bioorganic & Medicinal Chemistry. 20, 571(2012); Feng P. et al., Jounal of American Chemical Society. 132, 1500(2010).; Bessodes M.et al., Journal of Controlled Release, 99, 423(2004).; DeSimone, J.M., Journal of American Chemical Society. 132, 17928(2010); Thomson, D.H., Journal of Controlled Release, 91, 187(2003); Schoenmarks, R.G., Journal of Controlled Release, 95, 291(2004)).
보호된 생체 직교성 관능기로서는, 예를 들어, 디설파이드 잔기, 에스테르 잔기, 아세탈 잔기, 케탈 잔기, 이민 잔기, 비시날 디올(vicinal diol) 잔기를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 보호된 생체 직교성 관능기는, 이하로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 화학 구조에 대응하고 있어도 좋다.
Figure pct00020
[여기서, 결합에 직교하는 파선은, 절단 부위를 나타내고,
단일 또는 복수의 R2a는, 동일하거나 다르고, 수소 원자, 또는 상기 치환기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
·는, 결합손이다.]
바람직하게는, 보호되어 있어도 좋은 생체 직교성 관능기는 비보호의 생체 직교성 관능기이다.
(기능성 물질)
기능성 물질은, 항체에 임의의 기능을 부여하는 물질인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 약물, 표지 물질, 친화성 물질, 수송용 물질, 안정화제를 들 수 있지만, 바람직하게는 약물, 표지 물질, 친화성 물질 또는 수송용 물질이라도 좋고, 혹은 약물 또는 표지 물질이라도 좋다. 기능성 물질은 또한, 단일의 기능성 물질이라도 좋고, 2개 이상의 기능성 물질이 연결된 물질이라도 좋다.
약물로서는, 임의의 질병에 대한 약물이라도 좋다. 이러한 질환으로서는, 예를 들면, 암(예, 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 신장암, 간암, 갑상선암, 전립선암, 방광암, 난소암, 자궁암, 골암, 피부암, 뇌종양, 흑색종), 자가 면역 질환·염증성 질환(예, 알레르기 질환, 류마티스관절염, 전신성 에리테마토데스), 뇌신경 질환(예, 뇌경색, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증), 감염증(예, 세균 감염증, 바이러스 감염증), 유전성·희소 질환(예, 유전성 구상 적혈구증, 비(非)디스트로피 근긴장증), 안질환(예, 가령 황반변성증, 당뇨병 망막증, 망막 색소 변성증), 골·정형외과 영역의 질환(예, 변형성 관절증), 혈액 질환(예, 백혈병, 자반병), 기타 질환(예, 당뇨병, 고지혈증 등의 대사 이상증, 간 질환, 신장 질환, 폐 질환, 순환기계 질환, 소화기관계 질환)을 들 수 있다. 약물은, 질병 예방 또는 치료제, 부작용의 완화약이라도 좋다.
보다 구체적으로는, 약물은, 항암제라도 좋다. 항암제로서는, 예를 들어, 화학 요법제, 독소, 방사성 동위체 또는 그것을 포함하는 물질을 들 수 있다. 화학 요법제로서는, 예를 들어, DNA 손상제, 대사 길항약, 효소 저해제, DNA 인터칼레이트제, DNA 절단제, 토포이소머라아제 저해제, DNA 결합 저해제, 튜불린 결합 저해제제, 세포 상해성 뉴클레오시드, 백금 화합물을 들 수 있다. 독소로서는, 예를 들어, 세균 독소(예, 디프테리아 독소), 식물 독소(예, 리신)을 들 수 있다. 방사성 동위체로서는, 예를 들어, 수소 원자의 방사성 동위체(예, 3H), 탄소 원자의 방사성 동위체(예, 14C), 인 원자의 방사성 동위체(예, 32P), 유황 원자의 방사성 동위체(예, 35S), 이트륨의 방사성 동위체(예, 90Y), 테크네튬의 방사성 동위체(예, 99mTc), 인듐의 방사성 동위체(예, 111In), 요오드 원자의 방사성 동위체(예, 123I, 125I, 129I, 131I), 사마륨의 방사성 동위체(예, 153Sm), 레늄의 방사성 동위체(예, 186Re), 아스타틴의 방사성 동위체(예, 211At), 비스무트의 방사성 동위체(예, 212Bi)를 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 약물로서 오리스타틴(MMAE, MMAF), 메이탄신(DM1, DM4), PBD(피롤로벤조디아제핀), IGN, 캠토테신 유연체, 칼리키아마이신, 듀오카마이신, 에리불린, 안트라사이클린, dmDNA31, 튜불라이신을 들 수 있다.
표지 물질은, 표적(예, 조직, 세포, 물질)의 검출을 가능하게 하는 물질이다. 표지 물질로서는, 예를 들어, 효소(예, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 루시페라아제, β갈락토시다아제), 친화성 물질(예, 스트렙트아비딘, 비오틴, 디곡시게닌, 압타머), 형광 물질(예, 플루오레세인, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질), 발광 물질(예, 루시페린, 에쿼린, 아크리디늄에스테르, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄, 루미놀), 방사성 동위체(예, 상술한 것), 또는 그것을 포함한 물질을 들 수 있다.
친화성 물질은, 표적에 대한 친화성을 갖는 물질이다. 친화성 물질로서는, 예를 들면 항체 등의 친화성 단백질 또는 펩타이드, 앱타머, 렉틴, 표적 핵산에 대한 상보쇄(相補鎖)를 들 수 있다. 친화성 물질은, 바람직하게는, 친화성 단백질 또는 친화성 펩타이드이고, 보다 바람직하게는 항체라도 좋다. 기능성 물질로서 사용되는 항체가 유래하는 동물의 종류는, 상술한 것과 동일하다.
기능성 물질로서 사용되는 항체의 종류는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체라도 좋다. 항체는 또한, 2가의 항체(예, IgG, IgD, IgE), 또는 4가 이상의 항체(예, IgA 항체, IgM 항체)라도 좋다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체로서는, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 소정의 당쇄가 부가된 항체(예, N형 당쇄 결합 컨센서스 서열 등의 당쇄 결합 컨센서스 서열을 갖도록 개변된 항체), 이중 특이적 항체, Fc영역 단백질, Fc융합 단백질을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 아이소타입으로서는, 예를 들어, IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE, 및 IgY를 들 수 있다. 기능성 물질로서 사용되는 항체로서는, 예를 들어, 전장 항체 및 그 프래그먼트(프래그먼트 항체)를 포함한다. 프래그먼트 항체는, 원하는 항원에 대한 결합성을 유지하고 있으면 좋고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, scFv를 들 수 있다.
기능성 물질로서 사용되는 항체의 항원성은, 본 발명의 항체, 항체 유도체, 및 컨쥬게이트에 있어서의 면역 글로불린 단위의 항원성과 동일해도 달라도 좋고, 다른 것이 바람직하다. 또한, 기능성 물질로서 사용되는 항체의 유래는, 당해 면역 글로불린 단위의 유래와, 동일해도 달라도 좋고, 다른 것이 바람직하다. 따라서, 기능성 물질로서 사용되는 항체는, 상술한 모노클로날 항체의 구체예에서 언급된, 특정 키메라 항체, 특정 인간화 항체, 또는 특정 인간 항체, 또는 이것들로부터 유래된 항체라도 좋다. 기능성 물질로서 사용되는 항체는 또한, 상술한 모노클로날 항체의 구체예에서 언급된 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 또는 이것들로부터 유래된 항체라도 좋다.
수송용 물질은, 화합물의 수송능을 갖는 물질이다. 수송용 물질로서는, 단백질 외각(예, 멀티머) 중에 화합물을 내포할 수 있는 물질(예, 인간 페리틴 등의 페리틴, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자)이 바람직하다.
안정화제는, 항체의 안정화를 가능하게 하는 물질이다. 안정화제로서는, 예를 들어, 디올류, 글리세린, 비이온 계면 활성제, 음이온 계면 활성제, 천연계 계면 활성제, 사카리드 및 폴리올류를 들 수 있다.
기능성 물질은 또한, 펩타이드, 단백질, 핵산, 저분자 유기 화합물, 당쇄, 지질, 고분자 중합체, 금속(예, 금), 킬레이터라도 좋다. 펩타이드로서는, 예를 들면, 세포막 투과 펩타이드, 혈액 뇌관문 투과성 펩타이드, 펩타이드 의약품을 들 수 있다. 단백질로서는, 예를 들어, 효소, 사이토카인, 프래그먼트 항체, 렉틴, 인터페론, 혈청 알부민, 항체를 들 수 있다. 핵산으로서는, 예를 들어, DNA, RNA, 인공 핵산을 들 수 있다. 핵산은 또한, 예를 들어, RNA 간섭 유도성 핵산(예, siRNA), 앱타머, 안티센스를 들 수 있다. 저분자 유기 화합물로서는, 예를 들어, 단백질 분해 유도 키메라 분자, 색소, 광분해성 화합물을 들 수 있다.
특정한 실시형태에서는, 기능성 물질은, 방향족 환을 갖는 물질이라도 좋다. 방향족 환을 갖는 물질로서는, 예를 들어, 모노메틸아우리스타틴(monomethylauristatin)[예, 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF)], 또는 엑사테칸(Exatecan)을 들 수 있다.
(염)
본 발명에 있어서, 용어 「염」으로서는, 예를 들면, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 및 아미노산과의 염을 들 수 있다. 무기산과의 염으로서는, 예를 들면, 염화수소, 브롬화수소, 인산, 황산, 질산과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염으로서는, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 락트산, 타르타르산, 푸마르산, 옥살산, 말레산, 구연산, 숙신산, 말산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산과의 염을 들 수 있다. 무기 염기와의 염으로서는, 예를 들어, 알칼리 금속(예, 나트륨, 칼륨), 알칼리 토류 금속(예, 칼슘, 마그네슘), 및 아연, 알루미늄 등의 다른 금속, 및 암모늄과의 염을 들 수 있다. 유기 염기와의 염으로서는, 예를 들면, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 프로필렌디아민, 에틸렌디아민, 피리딘, 에탄올아민, 모노알킬에탄올아민, 디알킬에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민과의 염을 들 수 있다. 아미노산과의 염으로서는, 예를 들어, 염기성 아미노산(예, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 오르니틴), 및 산성 아미노산(예, 아스파라긴산, 글루탐산)과의 염을 포함한다. 염은, 바람직하게는, 무기산(예, 염화수소)과의 염, 또는 유기산(예, 트리플루오로아세트산)과의 염이다.
2. 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염
본 발명은, 상기 식 (I)로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염을 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트의 위치 선택성은, 상술한 바와 같다.
본 발명과 관련하여 제시되는 식 (I) 및 다른 식에서, -(하이픈)은, 그 양측에 존재하는 2개의 단위(예, 원자, 기)가 공유 결합하고 있는 것을 나타낸다.
항체는, 상술한 바와 같은 면역 글로불린 단위를 포함한다. 이러한 항체로서는, 예를 들면, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 간 및 중쇄와 경쇄 간에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgG 항체, IgD 항체 및 IgE 항체, 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 간 및 중쇄와 경쇄 간에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgA 항체, 8개의 중쇄 및 8개의 경쇄를 포함하고, 또한 중쇄 간 및 중쇄와 경쇄 간에 디설파이드 결합을 갖는 면역 글로불린 단위를 포함하는 IgM 항체를 들 수 있고, IgG 항체(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)가 바람직하다. 항체는, 바람직하게는, 인간 IgG 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 인간 IgG 전장 모노클로날 항체이다.
위치 선택적 결합은, 바람직하게는 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기와, 그것과 결합가능한 원자 또는 기(예, 카르보닐기, 티오카르보닐기) 사이의 결합에 의해 달성되는 것이 바람직하고, 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기와 카르보닐기 사이의 아미드 결합에 의해 달성되는 것이 보다 바람직하다.
식 (I)에서, HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타낸다. 친수성기, 및 1가의 기는, 상술한 바와 같다. 바람직하게는, HG는, 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고 있어도 좋다.
RA는, 발린 잔기의 측쇄(즉, -CH(CH3)2)를 나타낸다. 혹은, RA는, 페닐알라닌 잔기, 스레오닌 잔기, 류신 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄라도 좋다. RA에 있어서의 아미노산 잔기의 입체 배치는, L체라도 D체라도 좋고, L체가 바람직하다.
RB는, 시트룰린 잔기의 측쇄 (즉, -CH2CH2CH2NHCONH2), 또는 알라닌 잔기의 측쇄 (즉, -CH3)를 나타낸다. 혹은, RB는, 글루탐산 잔기, 글루타민 잔기, 라이신 잔기, 아르기닌 잔기, 스레오닌 잔기, 또는 메티오닌 잔기의 측쇄라도 좋다. RB에 있어서의 아미노산 잔기의 입체 배치는, 각각, L체라도 D체라도 좋고, L체가 바람직하다.
RA 및 RB의 조합은, RA가 발린 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 시트룰린 잔기 또는 알라닌 잔기의 측쇄인 것이 바람직하다. 혹은, RA 및 RB의 조합의 바람직한 다른 예는 이하와 같다:
(a) RA가 발린 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 글루탐산 잔기, 라이신 잔기, 아르기닌 잔기 또는 스레오닌 잔기의 측쇄인 것;
(b) RA가 페닐알라닌 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 라이신 잔기, 아르기닌 잔기, 또는 글루타민 잔기의 측쇄인 것;
(c) RA가 스레오닌 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 스레오닌 잔기, 또는 메티오닌 잔기의 측쇄인 것;
(d) RA가 류신 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 글루탐산 잔기의 측쇄인 것; 및
(e) RA가 알라닌 잔기의 측쇄이고, 또한, RB가 알라닌 잔기의 측쇄인 것.
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타낸다. 2가의 방향족 환기는, 상술한 아릴렌 또는 2가의 방향족 복소환이다. 2개의 인접 원자(탄소 원자 및 질소 원자)가 결합하고 있는 2가의 방향족 환기의 위치는, 카텝신 B에 의해 시트룰린의 카르복시 말단측에 존재하는 아미드 결합이 절단되는 경우, π전자의 공역으로부터 -O-(C=O)-에 있어서의 산소 원자와 카르보닐기의 사이에서 절단이 발생하는 한(예, 배경 기술에 있어서의 「(B) 인간 암 세포 내의 리소좀 중에서 설명」으로 나타나는 절단 반응을 참조), 특별히 한정되지 않는다. 이러한 위치는, 당해 분야의 기술상식이며, 2가의 방향족 환기의 종류 등의 인자에 따라, 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다.
바람직하게는, 환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 단환식 방향족 환기라도 좋다. 2가의 방향족 환기는, 페닐렌기, 또는 2가의 단환식 방향족 복소환기이다.
보다 바람직하게는, 환 A는, 2가의 6원 환식 방향족 환기라도 좋다. 6원 환식 방향족 환기로서는, 예를 들면, 상술한 각종 기를 들 수 있다. 이 경우, 2개의 인접 원자가 결합하고 있는 2가의 6원 환식 방향족 환기의 위치는, 오르토 위치, 또는 파라 위치, 바람직하게는 파라 위치이다.
보다 더욱 바람직하게는, 환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 페닐렌기라도 좋다. 이 경우, 2개의 인접 원자가 결합하고 있는 페닐렌기의 위치는, 오르토 위치, 또는 파라 위치, 바람직하게는 파라 위치이다.
치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기에 있어서의 치환기는, 상술한 바와 같다. 이러한 치환기는, 상술한 바와 같은 전자 흡인기라도 좋다.
R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타낸다. 1가의 기는, 상술한 바와 같다. R1, 및 R2에 있어서의 1가의 기는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 1가의 탄화수소기가 바람직하고, 치환기를 갖고 있어도 좋은 알킬이 보다 바람직하고, 알킬이 보다 더욱 바람직하다. 알킬로서는, 상술한 것이 바람직하다.
특정한 실시형태에서는, R1, 및 R2로 표시되는 1가의 기는, 아미노기의 보호기라도 좋다. 이러한 보호기로서는, 예를 들면, 알킬카르보닐기(아실기)(예, 아세틸기, 프로폭시기, tert-부톡시카르보닐기 등의 부톡시카르보닐기), 알킬옥시카르보닐기(예, 플루오레닐메톡시카르보닐기), 아릴옥시카르보닐기, 아릴알킬(아랄킬)옥시카르보닐기(예, 벤질옥시카르보닐기)를 들 수 있다.
바람직한 실시형태에서는, R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, R1, 및 R2는, 각각 수소 원자라도 좋다.
L1, 및 L2로 표시되는 2가의 기는, 상술한 바와 같다.
특정한 실시형태에서는, L1, 및 L2로 표시되는 2가의 기는, 각각, 서로 반응가능한 2개의 생체 직교성 관능기의 반응에 의해 생성되는 부분을 포함하고 있어도 좋다. 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기의 조합은 잘 알려져 있기 때문에, 당업자는 이러한 조합을 적절히 선택하여, 서로 반응 가능한 2개의 생체 직교성 관능기의 반응에 의해 생성하는 부분을 포함하는 2가의 기를 적절히 설정할 수 있다. 서로 반응 가능한 생체 직교성 관능기의 조합으로서는, 예를 들면, 티올 잔기와 말레이미드 잔기의 조합, 푸란 잔기와 말레이미드 잔기의 조합, 티올 잔기와 할로카르보닐 잔기의 조합(치환 반응에 의해, 할로겐이 티올로 치환됨), 알킨 잔기(바람직하게는, 상술한 바와 같은 치환기에 의해 치환되어 있어도 좋은, 탄소 원자간 3중 결합을 갖는 환기)과 아지드 잔기의 조합, 테트라진 잔기와 알켄 잔기의 조합, 테트라진 잔기와 알킨 잔기의 조합, 티올 잔기와 다른 티올 잔기의 조합(디설파이드 결합)을 들 수 있다. 따라서, 상기 부분은, 티올 잔기와 말레이미드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 푸란 잔기와 말레이미드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 티올 잔기와 할로카르보닐 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 알킨 잔기와 아지드 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 또는 테트라진 잔기와 알켄 잔기의 반응에 의해 생성되는 기, 티올 잔기와 다른 티올 잔기의 조합에 의해 생성되는 디설파이드기라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 상기 부분은 하기 구조식 중 어느 하나의 구조식으로 표시되는 2가의 기라도 좋다.
Figure pct00021
[여기서, 흰색 원과 검은색 원은 결합손을 나타낸다.]
L1에서는, 흰색 원의 결합손이 Ig 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있는 경우, 검은색 원의 결합손이 「N-R1」중의 질소 원자(N) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있어도 좋고,
흰색 원의 결합손이 「N-R1」중의 질소 원자(N) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있는 경우, 검은색 원의 결합손이 Ig 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있어도 좋다.
L2에서는, 흰색 원의 결합손이 「N-R2」중의 질소 원자(N) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있는 경우, 검은색 원의 결합손이 기능성 물질(D) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있어도 좋고,
흰색 원의 결합손이 기능성 물질(D) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있는 경우, 검은색 원의 결합손이 「N-R2」중의 질소 원자(N) 결합부 측에 존재하는 원자에 결합하고 있어도 좋다.
D로 표시되는 기능성 물질은, 상술한 바와 같다.
r은, 2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율을 나타내고, 1.5 내지 2.5이다. 이러한 평균 비율은, 바람직하게는 1.6 이상, 보다 바람직하게는 1.7 이상, 보다 더욱 바람직하게는 1.8 이상, 특히 바람직하게는 1.9 이상이라도 좋다. 이러한 평균 비율은 또한, 바람직하게는 2.4 이하, 보다 바람직하게는 2.3 이하, 보다 더욱 바람직하게는 2.2 이하, 특히 바람직하게는 2.1 이하라도 좋다. 보다 구체적으로는, 이러한 평균 비율은, 바람직하게는 1.6 내지 2.4, 보다 바람직하게는 1.7 내지 2.3, 보다 더욱 바람직하게는 1.8 내지 2.2, 특히 바람직하게는 1 .9 내지 2.1이라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 응집하기 어렵다는 원하는 특성을 갖기 때문에, 응집률에 의해 특정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 그 염의 응집률은, 5% 이하라도 좋다. 본 발명에 의하면, 항체의 응집을 회피하기 쉽기 때문이다. 응집률은, 바람직하게는 4.8% 이하, 보다 바람직하게는 4.6% 이하, 보다 더욱 바람직하게는 4.4% 이하, 특히 바람직하게는 4.2% 이하, 4.0% 이하, 3.8% 이하, 3.6% 이하, 3.4% 이하, 3.2% 이하, 3.0% 이하, 2.8% 이하, 또는 2.6% 이하이다. 항체의 응집률은, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC에 의해 측정할 수 있다(실시예 및 ChemistrySelect, 2020, 5, 8435-8439를 참조).
바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 2.6% 이하의 응집률이라도 좋다. 응집률은 또한, 2.4% 이하, 2.2% 이하, 2.0% 이하, 1.8% 이하, 또는 1.6% 이하라도 좋다.
바람직하게는, 식 (I)로 표시되는 구조 단위는, 식 (I')로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (I')로 표시되는 Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, D, 및 r은, 각각, 식 (I)로 표시되는 것과 동일하다.
식 (I')에서, LHG는, 결합 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타낸다. 친수성기 및 2가의 기는 상술한 바와 같다. 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기는, LHG에 인접하는 질소 원자 및 탄소 원자를 연결하는 주쇄 중, 또는 당해 주쇄의 측쇄 중에 포함되어 있어도 좋고, 당해 주쇄의 측쇄에 포함되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기(-LHG-)는, 하기 식 (a)로 나타내는 2가의 기라도 좋다:
-(C(RHG)2)n1-(C=O)n2-(NRHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
(양 말단에 배치된 하이픈(-)은 결합손을 나타낸다.)
식 (a)에 있어서, 복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타낸다. 친수성기 및 1가의 기는, 상술한 바와 같다.
n1은, 0 내지 3의 정수이고, 바람직하게는 0 내지 2의 정수이고, 보다 바람직하게는 0 또는 1의 정수이다.
n2는, 0 또는 1의 정수이다.
n3은, 0 또는 1의 정수이다.
n4는, 0 내지 3의 정수이고, 바람직하게는 0 내지 2의 정수이고, 보다 바람직하게는 0 또는 1의 정수이다.
보다 더욱 바람직하게는, 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기(-LHG-) 는, 하기 식 (a1), (a2), 또는 (a3)으로 표시되는 2가의 기라도 좋다:
(a1) -(C(RHG)2)-;
(a2) -(C(RHG)2)-(C=O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-; 또는
(a3) -(C=O)-(C(RHG)2)2-.
식 (a1), (a2) 또는 (a3)에 있어서, 복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다. 친수성기, 및 탄소수 1 내지 6의 알킬기는 상술한 바와 같다.
식 (I')에서, RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타낸다. 친수성기, 및 1가의 기는, 상술한 바와 같다.
특정한 실시형태에서는, RHG1 및 RHG2로 표시되는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기는, 아미노기의 보호기라도 좋다. 아미노기의 보호기로서는, R1, 및 R2에 대해 상술한 것을 들 수 있다. 예를 들어, RHG1 및 RHG2 중 한쪽이, 수소 원자이고, 다른쪽이, 아미노기의 보호기라도 좋다.
혹은, RHG1 및 RHG2 중 한쪽이, 수소 원자이고, 다른쪽이, 친수성기를 포함하는 1가의 기라도 좋다. 친수성기를 포함하는 1가의 기로서는, 예를 들면, 친수성기를 포함하는 알킬기, 친수성기를 포함하는 카르복실기, 친수성기를 포함하는 알킬카르보닐기(예, 상술한 기), 친수성기를 포함하는 알킬옥시카르보닐기, 친수성기를 포함하는 옥시카르보닐기를 들 수 있다.
식 (I')에서, 적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다. 적어도 1개의 친수성기가 포함되는 부위 및 그의 조합으로서는, 예를 들어, 이하를 들 수 있다:
(i) LHG 단독;
(ii) RHG1 단독;
(iii) RHG2 단독;
(iv) LHG 및 LHG1의 조합;
(v) LHG 및 LHG2의 조합;
(vi) LHG1 및 LHG2의 조합; 및
(vii) LHG, LHG1 및 LHG2의 조합.
이들 LHG 부위, RHG1 부위, RHG2 부위의 각각에 1개의 친수성기가 포함되어 있어도 좋고, 2개 이상의 친수성기가 포함되어 있어도 좋다.
상기의 일련의 식에서 설명한 기호, 및 기호 중의 요소(예, 절단성 부위 등의 특정 요소, 또는 특정 식)의 정의, 예, 및 바람직한 예는, 다른 식에 대해서도 동일하다.
본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 예를 들면, 의약, 또는 시약(예를 들어, 진단약, 연구용 시약)으로서 유용하다.
본 발명의 컨쥬게이트 또는 그 염은, 의약 조성물의 형태에서 제공되어도 좋다. 이러한 의약 조성물은, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 그 염에 더하여, 의약상 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 좋다. 의약상 허용될 수 있는 담체로서는, 예를 들어, 수크로오스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 젖당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산 칼슘, 탄산 칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 수크로오스, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 스타치, 탄산수소 나트륨, 인산 칼슘, 구연산 칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴 황산 나트륨 등의 활제, 구연산, 멘톨, 그리실리신·암모늄염, 글리신, 오렌지분 등의 방향제, 벤조산 나트륨, 아황산 수소 나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 구연산, 구연산 나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산 알루미늄 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오 기름, 폴리에틸렌 글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 컨쥬게이트 또는 그 염은 또한, 안정성을 실현하는 임의의 수식(예, PEG화)을 갖고 있어도 좋다.
경구 투여에 적합한 제제는, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스와 같은 희석액에 유효량의 리간드를 용해시킨 액제, 유효량의 리간드를 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 사쉐제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 유효 성분을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 유효 성분을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시키고 유화시킨 유제 등이다.
의약 조성물은, 비경구적인 투여(예, 정맥 내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강 내 투여)에 적합하다. 이러한 비경구적인 투여에 적합한 의약 조성물로서는, 수성 및 비수성의 등장(等張)인 무균의 주사액제가 있고, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있고, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다.
의약 조성물의 투여량은, 유효 성분의 종류·활성, 병의 중증도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라 다르지만, 적절하게 설정할 수 있다.
일 실시형태에서는, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 생체 직행성 관능기를 위치선택적으로 갖는 항체 유도체 또는 그 염을, 기능성 물질과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 2). 이러한 반응은, 항체 유도체에서 생체 직행성 관능기와 기능성 물질 사이의 반응에 의해 진행시킬 수 있다.
기능성 물질이, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖는 경우, 기능성 물질의 당해 관능기와, 항체 유도체 중의 생체 직교성 관능기를 적절히 반응시킬 수 있다. 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기는, 생체 직교성 관능기의 구체적인 종류에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면, 적절한 관능기를, 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기로서 적절히 선택할 수 있다(예, Boutureira et al., Chem. Rev., 2015, 115, 2174-2195). 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기로서는, 예를 들어, 생체 직교성 관능기가 아지드 잔기인 경우는 알킨 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 티올 잔기인 경우는 말레이미드 잔기 및 디설파이드 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 알데히드 잔기 또는 케톤 잔기인 경우는 히드라진 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 노르보르넨 잔기인 경우는 아지드 잔기를 들 수 있고, 생체 직교성 관능기가 테트라진 잔기인 경우는 알킨 잔기를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 물론, 생체 직교성 관능기 및 그것과 반응하기 쉬운 관능기의 상기 조합에서는, 조합을 대체하는 것도 가능하다. 따라서, 상기 조합에 있어서의 최초의 예를 교환한 경우에는, 생체 직교성 관능기로서 알킨 잔기, 및 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기로서 아지드 잔기의 조합을 사용할 수 있다.
기능성 물질이, 항체 유도체 중의 생체 직교성 관능기와 반응하기 쉬운 관능기를 갖지 않는 경우, 약물은, 이러한 관능기를 갖도록 유도체화되어도 좋다. 유도체화는, 당해 분야의 기술 상식이다(예를 들어, 국제 공개 제2004/010957호, 미국 특허출원 공개 제2006/0074008호 명세서, 미국 특허출원 공개 제2005/0238649호 명세서). 예를 들어, 유도체화는 임의의 가교제를 사용하여 행해져도 좋다. 혹은, 유도체화는, 원하는 관능기를 갖는 특정 링커를 사용하여 행해져도 좋다. 본 발명에서는, 유도체화된 기능성 물질도, 기능성 물질의 일종에 지나지 않기 때문에, 간단히 「기능성 물질」이라고 부른다.
상기 반응은 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 조건(온화한 조건) 하에서 적절히 행할 수 있다. 예를 들어, 이러한 반응은, 적절한 반응계, 예를 들어 완충액에서, 실온(예, 약 15 내지 30℃)에서 행할 수 있다. 완충액의 pH는, 예를 들면 5 내지 9이며, 바람직하게는 5.5 내지 8.5이고, 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 완충액은, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들면 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 이러한 반응의 상세에 대해서는, 예를 들어, 문헌[G. J. L. Bernardes et al., Chem. Rev., 115, 2174 (2015); J. L. Bernardes et al., Chem. Asian. J., 4,630(2009); G. Davies et al., Nat. Commun., 5,4740(2014); Wagner et al., Bioconjugate. Chem., 25,825(2014)]을 참조할 것.
다른 실시형태에서는, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염은, 생체 직행성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염을, Ig(면역 글로불린 단위)를 갖는 원료 항체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 2).
상기 원료 항체는, 생체 직교성 관능기로 위치 선택적으로 변형된 라이신 잔기를 포함한다. 원료 항체에 있어서의 생체 직교성 관능기는, 생체 직행성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물에 있어서의 생체 직교성 관능기와 서로 반응할 수 있도록 선택할 수 있다. 원료 항체에 있어서의 생체 직교성 관능기로서는, 상술한 각종 생체 직행성 관능기를 이용할 수 있다. 범용성의 높이 등의 관점에서, 원료 항체에 있어서의 생체 직교성 관능기는, 레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기, 또는 테트라진 잔기라도 좋다.
특정한 실시형태에서는, 상기 원료 항체는, 하기 식 (VIII):
Figure pct00022
[식 중,
Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기와, Ig에 인접하는 카르보닐기와 사이에서 아미드 결합을 위치 선택적으로 형성하고,
L은, -(C(R)2)m-, -(O-C(R)2-C(R)2)m-, 및 -(C(R)2-C(R)2-O)m-로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2가의 기이고,
R은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬, 탄소 원자 수 2 내지 6의 알케닐, 또는 탄소 원자 수 2 내지 6의 알키닐이고,
m은, 0 내지 10의 정수이고,
B는, B1로 표시되는 생체 직교성 관능기와 반응 가능한 생체 직교성 관능기이고,
2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율 r은, 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 면역 글로불린 단위를 포함하고 있어도 좋다. 상기 식 (VIII)에서의 Ig 및 r에 대한 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 것과 동일하다.
m은, 바람직하게는 1 이상의 정수, 보다 바람직하게는 2 이상의 정수, 3 이상의 정수, 4 이상의 정수, 또는 5 이상의 정수라도 좋다. m은 또한, 바람직하게는 9 이하의 정수, 보다 바람직하게는 8 이하의 정수, 7 이하의 정수, 또는 6 이하의 정수라도 좋다. 특정한 경우, m은, 1 내지 8의 정수(바람직하게는 2 내지 6의 정수)라도 좋다.
B로 표시되는 생체 직교성 관능기는, 상술한 생체 직교성 관능기와 동일하다.
생체 직행성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염과 상기 원료 항체와의 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 상술한 조건(온화한 조건) 하에서 적절하게 행할 수 있다.
위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염의 생성의 확인은, 그 특정 원료 및 생성물의 분자량에도 의존하지만, 예를 들어, 환원 조건 하의 역상(逆相) HPLC, 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 위치 선택성의 확인은, 예를 들면, 펩타이드 맵핑에 의해 행할 수 있다. 펩타이드 맵핑은, 예를 들어, 프로테아제(예, 트립신, 키모트립신) 처리 및 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 프로테아제로서는, 엔도 프로테아제가 바람직하다. 이러한 엔도 프로테아제로서는, 예를 들어, 트립신, 키모 트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N을 들 수 있다. 컨쥬게이트 또는 그 염은, 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 정제 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
3. 항체 유도체 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (II)로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 유도체 또는 그 염을 제공한다. 본 발명의 항체 유도체의 위치 선택성은, 상술한 바와 같다.
식 (II)에서, Ig, HG, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, 및 r은, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소와 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
B2로 표시되는 생체 직교성 관능기는 상술한 바와 같다.
특정한 실시형태에서는, 생체 직교성 관능기는 말레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기 또는 테트라진 잔기라도 좋다. 이들 생체 직교성 관능기는, 반응 효율이 우수하고, 범용성이 높기 때문에 바람직하다.
바람직하게는, 식 (II)로 표시되는 구조 단위는, 식 (II')로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (II')로 표시되는 Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B2, 및 r은, 각각, 식 (II)로 표시되는 것과 동일하다.
식 (II')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I')에서 상술한 것과 동일하다.
본 발명의 항체 유도체 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염의 제조를 위한 중간체로서 유용하다.
본 발명의 항체 유도체 또는 그 염은, 예를 들면, 제1 생체 직행성 관능기 및 제2 생체 직행성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을, Ig(면역 글로불린 단위)를 갖는 원료 항체와 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 2). 원료 항체는 상술한 것과 동일하다.
제1 생체 직행성 관능기 및 제2 생체 직행성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염과 상기 원료 항체의 반응은, 단백질의 변성·분해(예, 아미드 결합의 절단)를 일으킬 수 없는 상술한 조건(온화한 조건) 하에서 적절히 행할 수 있다.
항체 유도체 또는 그 염의 생성의 확인은, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트에 대해 서술한 방법과 동일하게 행할 수 있다(위치 선택성의 확인도 동일). 항체 유도체 또는 그 염은, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트에 대해 서술한 것과 같은 임의의 정제 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
4. 생체 직교성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (III)으로 표시되는, 생체 직교성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
식 (III)에서, HG, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2 및 D는, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
B1은, 생체 직교성 관능기를 나타낸다. 생체 직교성 관능기는 상술한 바와 같다.
특정한 실시형태에서는, 생체 직교성 관능기는 말레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기 또는 테트라진 잔기라도 좋다. 이들 생체 직교성 관능기는, 반응 효율이 우수하고, 범용성이 높기 때문에 바람직하다.
바람직하게는, 식 (III)으로 표시되는 화합물은, 식 (III')으로 표시되는 화합물이라도 좋다. 식 (III')으로 표시되는 RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 D는, 각각, 식 (III)으로 표시되는 것과 동일하다.
식 (III')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식(I')에서 상술한 것과 동일하다.
식 (III)으로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트의 제조를 위한 중간체로서 유용하다. 식 (III)으로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 그 염은 또한, 예를 들어, 생체 분자(예, 항체와 같은 단백질, 당류, 핵산, 지질)와 같은 임의의 물질의 유도체화에 유용하다.
생체 직교성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 제1 생체 직행성 관능기 및 제2 생체 직행성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을, 기능성 물질과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 2). 기능성 물질의 상세는, 상술한 바와 같다.
제1 생체 직행성 관능기 및 제2 생체 직행성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염과 기능성 물질의 반응은, 적합한 반응계, 예를 들어 유기 용매계 또는 수용액(예, 완충액)계에서, 적당한 온도(예, 약 15 내지 200℃)에서 행할 수 있다. 반응계는, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들면 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 물론, 이러한 반응은, 상술한 온화한 조건 하에서 행할 수도 있다.
생체 직행성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의존하지만, 예를 들면, NMR, HPLC, 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 이러한 화합물 또는 그 염은, 크로마토그래피(예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 정제 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
5. 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (IV)로 표시되는, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
식 (IV)에서, HG, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2 및 D는, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
B1은, 제1 생체 직교성 관능기를 나타낸다. 제1 생체 직교성 관능기는, 생체 직교성 관능기에 대해 상술한 것과 동일하다.
B2는, 제2 생체 직교성 관능기를 나타낸다. 제2 생체 직교성 관능기는, 생체 직교성 관능기에 대해 상술한 것과 동일하다.
바람직하게는, 제2 생체 직교성 관능기는, 제1 생체 직교성 관능기와 반응하지 않거나, 또는 제1 생체 직교성 관능기에 대한 반응성이 낮은 생체 직교성 관능기라도 좋다. 이 경우, 식 (IV)로 표시되는 화합물 또는 그 염의 분자간 반응을 억제할 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 생체 직교성 관능기는, 서로 반응하지 않거나, 또는 서로의 반응성이 낮은 조합으로 이용할 수 있다. 생체 직교 관능기의 이러한 조합은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 바람직한 생체 직교성 관능기인 말레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기 및 테트라진 잔기에 대해, 이러한 조합의 예는, 이하와 같다.
[표 A]
표 A. 서로 반응하지 않거나, 또는 서로 반응성이 낮은 제1 및 제2 생체 직교성 관능기의 조합의 예
바람직하게는, 식 (IV)로 표시되는 화합물은, 식 (IV')로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (IV')로 표시되는 RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 B2는, 각각, 식 (IV)로 표시되는 것과 동일하다.
식 (IV')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I')에서 상술한 것과 동일하다.
식 (IV)로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 항체 유도체 및 식 (III)으로 표시되는 본 발명의 화합물의 제조를 위한 중간체로서 유용하다. 식 (IV)로 표시되는 본 발명의 화합물 또는 그 염은 또한, 예를 들어, 생체분자(예, 항체 등의 단백질, 당류, 핵산, 지질), 및 기능성 물질 등의 임의의 물질의 유도체화에 유용하다.
일 실시형태에서는, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염은, 생체 직행성 관능기를 갖는, 식 (VI)의 화합물 또는 그 염을, B1-L1-NH-R1로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 3). B1, L1 및 R1의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다.
다른 실시형태에서는, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염은, 생체 직행성 관능기를 갖는, 식(VII)의 화합물 또는 그 염을, 탄산비스(4-니트리페닐) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)과 반응시키고, 그 다음에, B2-L2-NH-R2로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 3). B2, L2 및 R2의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다.
상기 반응은 적절한 반응계, 예를 들어 유기 용매계 또는 수용액(예, 완충액)계에서, 적당한 온도(예, 약 15 내지 200℃)에서 행할 수 있다. 반응계는, 적절한 촉매를 포함하고 있어도 좋다. 반응 시간은, 예를 들면 1분 내지 20시간, 바람직하게는 10분 내지 15시간, 보다 바람직하게는 20분 내지 10시간, 보다 더욱 바람직하게는 30분 내지 8시간이다. 물론, 이러한 반응은, 상술한 온화한 조건 하에서 행할 수도 있다.
제1 생체 직행성 관능기 및 제2 생체 직행성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의존하지만, 예를 들어, NMR, HPLC 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 이러한 화합물 또는 그 염은, 크로마토그래피(예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 정제 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
6. 일련의 화합물 또는 그 염
(1) 화합물 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (V)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
식 (V)에서, HG, RA, RB 및 환 A는, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
X 및 Y는, 각각 독립적으로, 1가의 기를 나타낸다. 1가의 기는, 상술한 바와 같다.
바람직하게는, 식 (V)로 표시되는 화합물은, 식 (V')로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (V')로 표시되는 RA, RB, 환 A, X 및 Y는, 각각, 식 (IV)로 표시되는 것과 동일하다.
식 (V')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I')에서 상술한 것과 동일하다.
식 (V)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 항체 유도체 및 본 발명의 다른 화합물의 합성 중간체로서 유용하다.
식 (V)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들면, 하기 식 (V-1):
[식 중,
HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
RB는, 시트룰린 잔기 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타낸다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염을,
하기 식(V-2):
Figure pct00025
[식 중,
환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
X 및 Y는, 각각 독립적으로, 1가의 기를 나타낸다.]로 표시되는 화합물 또는 그 염과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 3). 식 (V-1)에서의 HG, RA 및 RB 및 식 (V-2)의 환 A, X 및 Y의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다. 이러한 반응은, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염의 제조에 대해 상술한 반응 조건과 동일한 조건 하에서 행할 수 있다.
(2) 식 (VI)으로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (VI)으로 표시되는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
식 (VI)에서, HG, RA, RB, 환 A, R2, 및 L2는, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
X로 표시되는 1가의 기는, 상술한 바와 같다.
B2로 표시되는 생체 직교성 관능기는, 상술한 바와 같다.
바람직하게는, 식 (VI)으로 표시되는 화합물은, 식 (VI')으로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (VI')으로 표시되는 RA, RB, 환 A, X, R2, L2 및 B2는, 각각, 식 (IV)으로 표시되는 것과 동일하다.
식 (VI')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I')에서 상술한 것과 동일하다.
식 (VI)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 항체 유도체 및 본 발명의 소정 화합물의 합성 중간체로서 유용하다. 이러한 화합물 또는 그 염은 또한, 예를 들어 기능성 물질의 유도체화에 유용하다.
식 (VI)으로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들면, 식 (V)로 표시되는 화합물 또는 그 염을, 탄산비스(4-니트리페닐), 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)과 반응시키고, 그 다음에, B2-L2-NH-R2로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 3). B2, L2 및 R2의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다. 이러한 반응은, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염의 제조에 대해 상술한 반응 조건과 동일한 조건 하에서 행할 수 있다.
(3) 식 (VII)로 표시되는 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염
본 발명은 또한, 상기 식 (VII)로 표시되는 화합물 또는 그 염을 제공한다.
식 (VII)에서, HG, RA, RB, 환 A, R1, 및 L1은, 식 (I)에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I)에서 상술한 것과 동일하다.
Y로 표시되는 1가의 기는, 상술한 바와 같다.
B1로 표시되는 생체 직교성 관능기는, 상술한 바와 같다.
바람직하게는, 식 (VII)로 표시되는 화합물은, 식 (VII')로 표시되는 것이라도 좋다. 식 (VII')로 표시되는 RA, RB, 환 A, Y, R1, L1 및 B1은, 각각, 식 (III)으로 표시되는 것과 동일하다.
식 (VII')에서, LHG, RHG1, 및 RHG2는, 식 (I')에서 상술한 바와 같다. 따라서, 이들 요소 및 당해 요소에 관련된 다른 요소의 정의, 예 및 바람직한 예는, 식 (I')에서 상술한 것과 동일하다.
식 (VII)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들어, 본 발명의 위치 선택적인 컨쥬게이트, 항체 유도체, 및 본 발명의 소정 화합물의 합성 중간체로서 유용하다. 이러한 화합물 또는 그 염은 또한, 예를 들어, 생체분자(예, 항체 등의 단백질, 당류, 핵산, 지질) 등의 임의의 물질의 유도체화에 유용하다.
식 (VII)로 표시되는 화합물 또는 그 염은, 예를 들면, 식 (V)로 표시되는 화합물 또는 그 염을, B1-L1-NH-R1로 표시되는 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(도 3). B1, L1 및 R1의 정의, 예 및 바람직한 예는, 상술한 바와 같다. 이러한 반응은, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염의 제조에 대해 상술한 반응 조건과 동일한 조건 하에서 행할 수 있다.
식 (V), (VI), 또는 (VII)로 표시되는 화합물 또는 그 염의 생성의 확인은, 그 구체적인 원료 및 생성물의 분자량에도 의존하지만, 예를 들면, NMR, HPLC, 또는 질량 분석에 의해 행할 수 있다. 이러한 화합물 또는 그 염은, 크로마토그래피(예를 들면, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피) 등의 임의의 정제 방법에 의해 적절히 정제할 수 있다.
[실시예]
다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1에서의 이하의 펩타이드, Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH, Z-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH, Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH, SCA(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH는, 모두 동일한 방식으로 제조되었다. SCA(OtBu)는 숙신산 모노-tert-부틸(mono-tert-butyl succinate), SCA는 숙신산(succinic acid)의 약자이다.
Fmoc법에 의한 Cl-TCP(Cl) ProTide Resin(CEM사)을 이용한 펩타이드 고상 합성에 의해, N말단을 아세틸기로 캡핑한 것, N말단을 숙신산으로 캡핑한 것을 조제하고, 20% HFIP/디클로로메탄의 용액으로 밤새 교반함으로써, 아미노산 측쇄를 보호한 채로 수지로부터 절제를 행하였다. 수지를 필트레이션에 의해 제거하고, 용액을 농축한 후, 이것을 분취 HPLC로 정제하여 생성물인 펩타이드를 얻었다.
Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.50(brs,1H), 8.22(d,J=7.2Hz,1H), 8.05(d,J=8.0Hz,1H), 7.69(d,J=8.8Hz,1H), 5.95-5.93(m,1H), 5.38(brs,2H), 4.33-4.27(m,1H), 4.22-4.18(m,1H), 4.15-4.10(m,1H), 2.96-2.95(m,2H), 2.25-2.19(m,2H), 2.00-1.93(m,1H), 1.89-1.80(m,4H), 1.73-1.66(m,2H), 1.61-1.51(m,1H), 1.46-1.34(m,11H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.83(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 502.30[M+H]+
Z-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.50(brs,1H), 7.93-7.37(m,8H), 6.05-6.00(m-1H), 5.44(brs,2H), 5.08(s,2H), 4.17-3.81(m,3H), 3.00-2.90(m,2H), 2.31-2.27(m,2H), 2.10-1.34(m,16H), 0.89-0.83(m,6H).
MS(ESI) m/z: 594.30[M+H]+
Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.50(brs,1H), 8.21(d,J=7.2Hz,1H), 8.08(d,J=8.0Hz,1H), 8.04(d,J=8.0Hz,1H), 7.68(d,J=8.0Hz,1H), 5.95(brs,1H), 5.37(brs,2H), 4.32-4.19(m,3H), 4.16-4.11(m,1H), 2.98-2.94(m,2H), 2.27-2.13(m,4H), 2.00-1.79(m,5H), 1.76-1.52(m,5H), 1.42-1.36(m,20H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.82 (d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 687.35[M+H]+
SCA(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.70(brs,1H), 8.21(d,J=7.2Hz,1H), 8.05(d,J=8.0Hz,1H), 7.68(d,J=8.8Hz,1H), 5.96(brs,1H), 5.25(brs,2H), 4.35-4.30(m,1H), 4.21-4.18(m,1H), 4.15-4.10(m,1H), 2.98-2.94(m,2H), 2.40-2.28(m,4H), 2.24-2.18(m,2H), 2.01-1.93(m,1H), 1.90-1.81(m,1H), 1.73-1.63(m,2H), 1.61-1.51(m,1H), 1.40-1.31(m,20H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.83(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 616.30[M+H]+
Ac-Glu(OtBu)-Val-Ala-OH
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.50(brs,1H), 8.25(d,J=6.8Hz,1H), 8.03(d,J=8.0Hz,1H), 7.68(d,J=9.2Hz,1H), 4.33-4.27(m,1H), 4.22-4.16(m,2H), 2.23-2.18(m,2H), 1.99-1.94(m,1H), 1.89-1.80(m,4H), 1.73-1.65(m,1H), 1.39(s,9H), 1.27(d,J=7.2Hz,3H), 0.87(d,J=6.8Hz,3H), 0.83(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 416.20[M+H]+
실시예 1: 링커-페이로드 미믹(Linker-payload mimic)의 합성
(1-1) 링커-페이로드 미믹 (1)의 합성
링커-페이로드 미믹 (1)은 하기와 같이 합성하였다.
(1-1-1) 알코올 (2)의 합성
Figure pct00027
Ac-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH(19.9mg, 39.7μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(400μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(18.1mg, 47.6μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(6.27μL, 47.6μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 이어서, 4-아미노만델산메틸(8.63mg, 47.6μmol)을 첨가하여 실온에서 21.5시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물(fraction)을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (2)(28.5mg, quant)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ9.95(s,1H), 8.07(d,J=7.4Hz,1H), 7.99(d,J=8.0Hz,1H), 7.66(d,J=8.4Hz,1H), 7.50(d,J=8.4Hz,2H), 7.25(d,J=8.4Hz,2H), 5.92(brs,1H), 5.36(brs,2H), 5.01(s,1H), 4.34-4.29(m,1H), 4.26-4.20(m,1H), 4.14-4.10(m,1H), 3.53(s,3H), 3.00-2.83(m,2H), 2.18-2.13(m,2H), 1.94-1.89(m,2H), 1.84-1.23(m,17H), 0.79(d,J=6.8Hz,3H), 0.75(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 665.30[M+H]+
(1-1-2) 피렌 (3)의 합성
Figure pct00028
(1-1-1)에서 얻어진 알코올 (2)(28.5mg)를 N,N-디메틸포름아미드(430μL)에 용해시키고, 빙랭(氷冷) 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(26.6mg, 85.7μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(11.1μL, 64.4μmol)을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. LCMS로 반응을 추적한 바 원료의 잔존이 보였기 때문에, 탄산비스(4-니트로페닐)(13.3mg, 42.9μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(5.54μL, 32.2μmol)을 추가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하여, 사르코신-피렌(Sarcosin-Pyrene)(64.9mg, 215μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(8.7mg, 64μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(57.2μL, 333μmol)을 첨가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (3)(26.1mg, 26.3μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.09-10.07(m,1H), 8.63-8.60(m,1H), 8.33-7.65(m,13H), 7.60-7.57(m,2H), 7.37-7.32(m,2H), 5.94-5.91(m,1H), 5.72-5.70(m,1H), 5.37(brs,2H), 4.98-4.96(m,1H), 4.93-4.00(m,4H), 3.85-3.75(m,1H), 3.56-3.55(m,3H), 2.97-2.87(m,5H), 2.17-2.13(m,2H), 1.93-1.17(m,19H), 0.80-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 993.40[M+H]+
(1-1-3) 피렌 (4)의 합성
Figure pct00029
피렌 (3)(10.8mg, 10.9μmol)을 테트라히드로푸란(700μL), 물(400μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 1M 수산화리튬 수용액(109μL, 109μmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (4)(4.5mg, 4.6μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.05(brs,1H), 10.08-10.05(m,1H), 8.62-8.59(m,1H), 8.33-7.56(m,15H), 7.37-7.35(m,2H), 5.92(brs,1H), 5.61-5.60(m,1H), 5.36(brs,2H), 4.98-4.03(m,5H), 3.88-3.74(m,1H), 2.99-2.83(m,5H), 2.15-2.13(m,2H), 1.93-1.14(m,19H), 0.84-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 979.40[M+H]+
(1-1-4) 피렌 (5)의 합성
Figure pct00030
피렌 (4)(3.7mg, 3.8μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(400μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(1.9μL, 11μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(2.9mg, 5.6μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(1.3mg, 5.7μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (5)(1.3mg, 1.1μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.02-9.99(m,1H), 8.85-7.88(m,14H), 7.67-7.65(m,1H), 7.60-7.51(m,2H), 7.33-7.27(m,2H), 6.91-6.87(m,2H), 5.92-5.91(m,1H), 5.63-5.62(m,1H), 5.36(brs,2H), 5.07-4.92(m,2H), 4.35-3.76(m,5H), 3.18-3.14(m,1H), 2.99-2.83(m,7H), 2.17-2.13(m,2H), 1.95-1.89(m,1H), 1.85-1.72(m,4H), 1.66-1.45(m,3H), 1.40-1.17(m,15H), 1.05-1.01(m,2H), 0.83-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1143.45[M+H]+
(1-1-5) 링커-페이로드 미믹 (1)의 합성
Figure pct00031
피렌 (5)(2.2mg, 1.9μmol)에 1,4-디옥산(380μL), 4M 염화수소/디옥산 용액(95μL, 380μmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 빙랭 후, N,N-디이소프로필에틸아민(71.8μL, 418μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (1)(2.1mg, 1.9μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.06(brs,1H), 10.03-10.00(m,1H), 8.84-7.88(m,14H), 7.67-7.64(m,1H), 7.56-7.51(m,2H), 7.33-7.27(m,2H), 6.90-6.87(m,2H), 5.92-5.90(m,1H), 5.63-5.61(m,1H), 5.36(brs,2H), 5.08-4.96(m,2H), 4.35-3.76(m,5H), 3.18-3.14(m,1H), 2.97-2.83(m,7H), 2.20-2.16(m,2H), 1.93-1.88(m,1H), 1.81-1.78(m,4H), 1.69-1.53(m,3H), 1.35-1.17(m,6H), 1.08-1.01(m,2H), 0.81-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1087.45[M+H]+
(1-2) 링커-페이로드 미믹 (6)의 합성
링커-페이로드 미믹 (6)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00032
(1-2-1) 알코올 (7)의 합성
Figure pct00033
Z-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg, 84.3μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(1.5mL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(38.4mg, 101μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(13.3μL, 101μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 이어서, 4-아미노만델산메틸(18.3mg, 101μmol)를 첨가하고, 실온에서 16시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (7)(49.1mg, 64.9μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.04-9.95(m,1H), 8.40-7.28(m,12H), 6.00-5.97(m,1H), 5.43(brs,2H), 5.08-4.97(m,3H), 4.43-4.37(m,1H), 4.24-4.20(m,1H), 4.16-4.05(m,1H), 3.60-3.59(m,3H), 3.04-2.91(m,2H), 2.26-2.20(m,2H), 2.03-1.22(m,16H), 0.88-0.78(m,6H).
MS(ESI) m/z: 757.30[M+H]+
(1-2-2) 피렌 (8)의 합성
Figure pct00034
알코올 (7)(44.6㎎, 58.9μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(650μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(53.8mg, 177μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(22.5μL, 133μmol)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하고, 사르코신-피렌(89.1mg, 295μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(11.9mg, 88.4μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(77.7μL, 457μmol)을 첨가하고, 실온에서 18시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (8)(49.2mg, 45.3μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.11-9.97(m,1H), 8.64-8.60(m,1H), 8.36-7.95(m,11H), 7.82-7.74(m,1H), 7.65-7.57(m,2H), 7.49-7.19(m,8H), 5.91-5.90(m,1H), 5.72-5.70(m,1H), 5.36(brs,2H), 4.98-4.86(m,4H), 4.41-4.00(m,3H), 3.85-3.75(m,1H), 3.56-3.54(m,3H), 3.00-2.82(m,5H), 2.19-2.12(m,2H), 1.92-1.17(m,16H), 0.80-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1085.45[M+H]+
(1-2-3) 피렌 (9)의 합성
Figure pct00035
피렌 (8)(44.8mg, 41.3μmol)을 테트라하이드로푸란(3.75mL), 물(1.25mL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 수산화리튬 일수화물(8.7mg, 210μmol)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (9)(18.4mg, 17.2μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.02(brs,1H), 10.09-9.97(m,1H), 8.62-8.59(m,1H), 8.32-7.78(m,12H), 7.63-7.44(m,3H), 7.37-7.35(m,2H), 7.29-7.20(m,5H), 5.91(brs,1H), 5.61-5.60(m,1H), 5.36(brs,2H), 4.98-4.86(m,4H), 4.45-4.30(m,1H), 4.24-4.15(m,1H), 4.07-4.02(m,1H), 3.84-3.74(m,1H), 2.97-2.82(m,5H), 2.19-2.12(m,2H), 1.93-1.11(m,16H), 0.80-0.72(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1071.45[M+H]+
(1-2-4) 피렌 (10)의 합성
Figure pct00036
피렌 (9)(15.6mg, 14.6μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(1.0mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(5.0μL, 29μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(11.4mg, 21.9μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(4.8mg, 22μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (10)(15.4mg, 12.5μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.11-10.01(m,1H), 8.91-8.63(m,1H), 8.40-7.96(m,12H), 7.72-7.27(m,11H), 6.97-6.94(m,2H), 5.99(brs,1H), 5.71-5.69(m,1H), 5.43(brs,2H), 5.14-4.96(m,4H), 4.49-4.40(m,1H), 4.30-4.23(m,1H), 4.16-3.83(m,3H), 3.25-3.22(m,1H), 3.02-2.90(m,7H), 2.26-2.22(m,2H), 2.01-1.98(m,1H), 1.92-1.84(m,1H), 1.77-1.66(m,2H), 1.65-1.04(m,16H), 1.12-1.04(m,2H), 0.88-0.80(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1235.50[M+H]+
(1-2-5) 링커-페이로드 미믹 (6)의 합성
Figure pct00037
피렌 (10)(12.1mg, 9.79μmol)에 1,4-디옥산(2.0mL), 4M 염화수소/디옥산 용액(490μL, 1.96mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 빙랭 후, N,N-디이소프로필에틸아민(366μL, 2.15mmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (6)(6.0mg, 5.1μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.05(brs,1H), 10.04-9.94(m,1H), 8.84-8.57(m,1H), 8.32-7.89(m,12H), 7.72-7.20(m,11H), 6.90-6.86(m,2H), 5.90(brs,1H), 5.64-5.62(m,1H), 5.36(brs,2H), 5.07-4.88(m,4H), 4.42-4.29(m,1H), 4.21-4.15(m,1H), 4.08-3.76(m,3H), 3.18-3.14(m,1H), 2.95-2.82(m,7H), 2.21-2.16(m,2H), 1.92-0.97(m,13H), 0.82-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1179.50[M+H]+
(1-3) 링커-페이로드 미믹 (11)의 합성
링커-페이로드 미믹 (11)은 하기와 같이 합성하였다.
(1-3-1) 알코올 (12)의 합성
Figure pct00039
Ac-Glu(t-Bu)-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg, 72.8μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(800μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸)아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(33.2mg, 87.4μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(11.5μL, 87.4μmol)를 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 계속하여, 4-아미노만델산메틸(15.8mg, 87.4μmol)을 첨가하여 실온에서 16시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (12)(54.0mg, 63.5μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.00(s,1H), 8.26-7.88(m,3H), 7.68-7.60(m,1H), 7.57(d,J=8.4Hz,2H), 7.32(d,J=8.4Hz,2H), 6.00-5.97(m,1H), 5.43(brs,2H), 5.08(s,1H), 4.40-4.37(m,1H), 4.32-4.19(m,3H), 3.60(s,3H), 3.09-2.90(m,2H), 2.25-2.18(m,4H), 2.03-1.53(m,10H), 1.46-1.36(m,20H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.82(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 850.40[M+H]+
(1-3-2) 피렌 (13)의 합성
알코올 (12)(50.3mg, 59.2μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(650μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(54.0mg, 178μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(22.7μL, 133μmol)을 첨가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하여, 사르코신-피렌(89.5mg, 296μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(12.0mg, 88.8μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(78.1μL, 459μmol)을 첨가하고, 실온에서 18시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거하고 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (13)(34.0mg, 28.9μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.14-10.12(m,1H), 8.69-8.67(m,1H), 8.40-7.82(m,13H), 7.76-7.72(m,1H), 7.68-7.65(m,2H), 7.44-7.39(m,2H), 5.99(brs,1H), 5.79(d,J=6.4Hz,1H), 5.44(brs,2H), 5.05-4.97(m,2H), 4.44-4.08(m,4H), 3.93-3.80(m,1H), 3.63-3.62(m,3H), 3.05-2.92(m,5H), 2.25-2.14(m,4H), 2.00-1.28(m,30H), 0.87-0.80(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1178.50[M+H]+
(1-3-3) 피렌 (14)의 합성
Figure pct00041
피렌 (13)(30.7mg, 26.1μmol)을 테트라히드로푸란(2.25mL), 물(0.75mL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 수산화리튬 일수화물(5.5mg, 0.13mmol)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거하고 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (14)(17.2mg, 14.8μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.06(brs,1H), 10.13-10.10(m,1H), 8.69-8.66(m,1H), 8.40-7.85(m,13H), 7.77-7.73(m,1H), 7.67-7.64(m,2H), 7.44-7.42(m,2H), 5.99(brs,1H), 5.68-5.67(m,1H), 5.44(brs,2H), 5.05-4.96(m,2H), 4.46-4.10(m,4H), 3.92-3.81(m,1H), 3.05-2.90(m,5H), 2.25-2.14(m,4H), 2.03-1.29(m,30H), 0.88-0.80(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1164.55[M+H]+
(1-3-4) 피렌 (15)의 합성
Figure pct00042
피렌 (14)(14.7mg, 12.6μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(1.0mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(4.29μL, 25.2μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(9.8mg, 19μmol)를 첨가하였다. 다음에, N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(4.1mg, 19μmol)를 첨가하고 실온으로 되돌려서 3.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (15)(7.0mg, 9.2μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.08-10.05(m,1H), 8.92-7.95(m,15H), 7.75-7.73(m,1H), 7.63-7.59(m,2H), 7.40-7.34(m,2H), 6.97-6.94(m,2H), 6.00-5.98(m,1H), 5.70-5.69(m,1H), 5.43(brs,2H), 5.14-5.01(m,2H), 4.45-4.38(m,1H), 4.32-3.83(m,5H), 3.25-3.20(m,1H), 3.10-2.90(m,7H), 2.25-2.18(m,4H), 2.08-1.24(m,34H), 1.12-1.04(m,2H), 0.88-0.81(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1328.60[M+H]+
(1-3-5) 링커-페이로드 미믹 (11)의 합성
Figure pct00043
피렌 (15)(6.1mg, 4.6μmol)에 1,4-디옥산(920μL), 4M 염화수소/디옥산 용액(230μL, 918μmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 빙랭 후, N,N-디이소프로필에틸아민(172μL, 1.10mmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (11)(3.7mg, 3.0μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.04(brs,2H), 10.01-9.98(m,1H), 8.83-7.89(m,15H), 7.71-7.69(m,1H), 7.56-7.51(m,2H), 7.33-7.26(m,2H), 6.90-6.87(m,2H), 5.91-5.90(m,1H), 5.64-5.62(m,1H), 5.36(brs,2H), 5.08-4.92(m,2H), 4.35-4.32(m,1H), 4.25-3.76(m,5H), 3.18-3.14(m,1H), 2.99-2.82(m,7H), 2.21-2.15(m,4H), 1.93-1.17(m,16H), 1.05-1.01(m,2H), 0.82-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1216.45[M+H]+
(1-4) 링커-페이로드 미믹 (16)의 합성
링커-페이로드 미믹 (16)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00044
(1-4-1) 알코올 (17)의 합성
SCA(t-Bu)-Glu(t-Bu)-Val-Cit-OH(50.0mg, 81.2μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(890μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(37.0mg, 97.4μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(12.8μL, 97.4μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 이어서, 4-아미노만델산메틸(17.6mg, 97.4μmol)을 첨가하고 실온에서 16시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (17)(60.4mg, 77.5μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.01(s,1H), 8.13(d,J=7.2Hz,1H), 8.07(d,J=8.4Hz,1H), 7.73(d,J=8.8Hz,1H), 7.57(d,J=8.4Hz,2H), 7.32(d,J=8.4Hz,2H), 5.99(brs,1H), 5.43(brs,2H), 5.08(s,1H), 4.41-4.30(m,2H), 4.21-4.17(m,1H), 3.60(s,3H), 3.04-2.95(m,2H), 2.44-2.15(m,6H), 2.03-1.95(m,1H), 1.92-1.83(m,1H), 1.74-1.58(m,3H), 1.46-1.34(m,20H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.83(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 779.40[M+H]+
(1-4-2) 피렌 (18)의 합성
Figure pct00046
알코올 (17)(58.0㎎, 74.5μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(820μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(68.0mg, 223μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(28.5μL, 168μmol)을 첨가하고, 실온에서 6시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하고, 사르코신-피렌(113mg, 373μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(15.1mg, 112μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(98.3μL, 578μmol)을 첨가하고, 실온에서 17시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (18)(37.1mg, 33.5μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.15-10.13(m,1H), 8.70-8.67(m,1H), 8.40-8.03(m,11H), 7.90-7.86(m,1H), 7.75-7.72(m,1H), 7.68-7.64(m,2H), 7.44-7.39(m,2H), 5.99(brs,1H), 5.79(d,J=6.8Hz,1H), 5.44(brs,2H), 5.05-4.98(m,2H), 4.40-4.08(m,3H), 3.93-3.80(m,1H), 3.63-3.62(m,3H), 3.05-2.90(m,5H), 2.44-2.15(m,6H), 2.02-1.98(m,1H), 1.91-1.85(m,1H), 1.75-1.55(m,3H), 1.50-1.30(m,20H), 0.88-0.80(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1107.55[M+H]+
(1-4-3) 피렌 (19)의 합성
Figure pct00047
피렌 (18)(17.4mg, 15.7μmol)을 테트라하이드로푸란(675μL), 물(225μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 1M 수산화리튬 수용액(86.4μL, 86.4μmol)을 첨가하고, 빙랭 하에서 5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (19)(17.2mg, 15.7μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.06(brs,1H), 10.14-10.11(m,1H), 8.68-8.66(m,1H), 8.40-8.01(m,11H), 7.89-7.85(m,1H), 7.75-7.72(m,1H), 7.67-7.64(m,2H), 7.44-7.41(m,2H), 5.99(brs,1H), 5.68-5.67(m,1H), 5.44(brs,2H), 5.05-4.93(m,2H), 4.44-4.10(m,3H), 3.92-3.81(m,1H), 3.05-2.94(m,5H), 2.43-2.15(m,6H), 2.02-1.97(m,1H), 1.88-1.85(m,1H), 1.77-1.66(m,3H), 1.61-1.30(m,20H), 0.88-0.80(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1093.50[M+H]+
(1-4-4) 피렌 (20)의 합성
Figure pct00048
피렌 (19)(16.3mg, 14.9μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(1.0mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(5.1μL, 30μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(11.7mg, 22.4μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(4.9mg, 22μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (20)(12.1mg, 9.62μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.01-9.98(m,1H), 8.85-7.88(m,14H), 7.68-7.65(m,1H), 7.56-7.51(m,2H), 7.33-7.27(m,2H), 6.90-6.87(m,2H), 5.92-5.90(m,1H), 5.63-5.62(m,1H), 5.36(brs,2H), 5.08-4.92(m,2H), 4.36-3.76(m,5H), 3.18-3.14(m,1H), 3.00-2.83(m,7H), 2.36-2.08(m,6H), 1.95-1.89(m,1H), 1.84-1.78(m,1H), 1.68-1.50(m,3H), 1.42-1.17(m,24H), 1.07-0.97(m,2H), 0.81-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1257.55[M+H]+
(1-4-5) 링커-페이로드 미믹 (16)의 합성
Figure pct00049
피렌 (20)(10.5mg, 8.35μmol)에 아세트산에틸(1.7mL), 4M 염화수소/아세트산에틸(2.09mL, 8.36mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4.5시간 교반하였다. 빙랭 후, N,N-디이소프로필에틸아민(781μL, 4.59mmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (16)(7.5mg, 6.6μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.02(brs,2H), 10.04-9.98(m,1H), 8.85-7.89(m,14H), 7.65-7.62(m,1H), 7.56-7.52(m,2H), 7.33-7.27(m,2H), 6.90-6.87(m,2H), 5.92(brs,1H), 5.63-5.62(m,1H), 5.37(brs,2H), 5.08-4.93(m,2H), 4.36-3.76(m,5H), 3.18-3.14(m,1H), 3.02-2.80(m,7H), 2.38-2.16(m,6H), 1.96-1.77(m,2H), 1.70-1.17(m,9H), 1.06-0.98(m,2H), 0.81-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1145.45[M+H]+
(1-5) 링커-페이로드 미믹 (21)의 합성
링커-페이로드 미믹 (21)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00050
(1-5-1) 알코올 (22)의 합성
Figure pct00051
Ac-Glu(OtBu)-Val-Ala-OH(20.9mg, 50.3μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(700μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(29.0mg, 76.3μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(10.1μL, 76.7μmol)을 첨가하고, 실온에서 12분간 교반하였다. 이어서, 4-아미노만델산메틸(11.0mg, 60.7μmol)을 첨가하고 실온에서 18시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (22)(20.3mg, 35.1μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ9.98-9.89(m,1H), 8.32-8.18(m,1H), 8.07-7.85(m,1H), 7.73-7.59(m,1H), 7.55(d,J=8.4Hz,2H), 7.32(d,J=8.4Hz,2H), 5.08(s,1H), 4.45-4.34(m,1H), 4.32-4.27(m,1H), 4.20-4.09(m,1H), 3.59(s,3H), 2.24-2.20(m,2H), 2.01-1.96(m,1H), 1.90-1.80(m,4H), 1.72-1.67(m,1H), 1.39-1.36(m,9H), 1.30(d,J=7.2Hz,3H), 0.86(d,J=6.8Hz,3H), 0.82(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 579.30[M+H]+
(1-5-2) 피렌 (23)의 합성
Figure pct00052
알코올 (22)(17.5㎎, 30.2μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(174μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(18.9mg, 60.8μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(7.80μL, 45.4μmol)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하였다. LCMS를 확인했더니 원료가 남아 있었기 때문에, 탄산비스(4-니트로페닐)(9.5mg, 31μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(3.90μL, 22.7μmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하고, 사르코신-피렌(36.2mg, 120μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(6.3mg, 47μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(40.3μL, 235μmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (23)(12.9㎎, 14.2μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.05-10.02(m,1H), 8.61-8.60(m,1H), 8.30-7.78(m,12H), 7.67-7.64(m,1H), 7.57(d,J=8.8Hz,2H), 7.37-7.33(m,2H), 5.72-5.70(m,1H), 4.98-4.89(m,2H), 4.34-4.00(m,3H), 3.85-3.75(m,1H), 3.56-3.55(m,3H), 2.93-2.87(m,3H), 2.17-2.13(m,2H), 1.94-1.91(m,1H), 1.85-1.75(m,4H), 1.65-1.61(m,1H), 1.31-1.23(m,12H), 0.80-0.73(m,6H).
MS(ESI) m/z: 907.35[M+H]+
(1-5-3) 피렌 (24)의 합성
Figure pct00053
피렌 (23)(11.8mg, 13.0μmol)을 테트라히드로푸란(800μL), 물(400μL)에 용해한 후 빙랭하고, 1M 수산화리튬 수용액(65μL, 65μmol)을 첨가하고, 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH 6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (24)(8.9mg, 10.0μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.05(brs,1H), 10.04-9.91(m,1H), 8.63-8.60(m,1H), 8.33-7.77(m,12H), 7.69-7.55(m,3H), 7.37-7.35(m,2H), 5.61-5.60(m,1H), 4.98-4.86(m,2H), 4.26-4.03(m,3H), 3.84-3.74(m,1H), 2.93-2.87(m,3H), 2.18-2.13(m,2H), 1.95-1.92(m,1H), 1.85-1.77(m,4H), 1.67-1.62(m,1H), 1.31-1.24(m,12H), 0.81-0.75(m,6H).
MS(ESI) m/z: 893.35[M+H]+
(1-5-4) 피렌 (25)의 합성
Figure pct00054
피렌 (24)(6.7mg, 7.5μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(400μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(3.9μL, 22μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(5.9mg, 11μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(2.4mg, 11μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (25)(4.1mg, 3.9μmol)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ9.98-9.95(m,1H), 8.83-7.77(m,14H), 7.67-7.65(m,1H), 7.56-7.50(m,2H), 7.34-7.27(m,2H), 6.89-6.86(m,2H), 5.63-5.61(m,1H), 5.06-4.93(m,2H), 4.37-3.76(m,5H), 3.17-3.14(m,1H), 2.95-2.83(m,5H), 2.17-2.10(m,2H), 1.95-1.89(m,1H), 1.85-1.75(m,4H), 1.65-1.62(m,1H), 1.31-1.17(m,16H), 1.02-1.00(m,2H), 0.81-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1057.45[M+H]+
(1-5-5) 링커-페이로드 미믹 (21)의 합성
Figure pct00055
피렌 (25)(2.4mg, 2.3μmol)에 1,4-디옥산(454μL), 4M 염화수소/디옥산 용액(568μL, 2.27mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드(300μL)를 첨가한 후, 빙랭 하, N,N-디이소프로필에틸아민(214μL, 1.25mmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (21)(1.1mg, 1.1μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ11.99(brs,1H), 9.98-9.96(m,1H), 8.84-7.88(m,14H), 7.66-7.63(m,1H), 7.54-7.50(m,2H), 7.34-7.27(m,2H), 6.90-6.87(m,2H), 5.63-5.61(m,1H), 5.07-4.93(m,2H), 4.36-3.76(m,5H), 3.17-3.14(m,1H), 2.95-2.83(m,5H), 2.20-2.16(m,2H), 1.95-1.90(m,1H), 1.88-1.76(m,4H), 1.67-1.62(m,1H), 1.32-1.17(m,7H), 1.02-1.01(m,2H), 0.81-0.74(m,6H).
MS(ESI) m/z: 999.35[M-H]-
비교예 1: 링커-페이로드의 합성
(1-1) 링커-페이로드 (26)의 합성
링커-페이로드 (26)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00056
링커-페이로드 (26)은 하기 단계에 따라 합성하였다.
Figure pct00057
링커-페이로드 (26)의 MS 분석 결과는 하기와 같다.
MS(ESI) m/z: 1050.55[M+H]+
실시예 2: ADC 미믹의 합성
(2-1) ADC 미믹의 합성
이후의 비교예 및 실시예에서는, 티올기 도입 항체로서, 국제공개 제2019/240287호(WO2019/240287A1)의 실시예 81-7에 기재된 항체 유도체(티올기 도입 트라스투주맙)를 사용하였다. 이 항체 유도체는, 항체 중쇄의 246위치 또는 248위치의 라이신 잔기의 측쇄의 아미노기를 통하여, 트라스투주맙(인간화 IgG1 항체)에 티올기가 위치 선택적으로 도입되어 있는 하기 구조를 갖는다(라이신 잔기의 위치는 EU 넘버링에 따른다).
(상기 구조에서, 항체 중쇄로부터 연장되어 있는 NH-CH2-CH2-CH2-CH2-는, 라이신 잔기의 측쇄에 대응하고, 이 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기에 대하여 티올 함유기인 HS-CH2-CH2-C(=O)가 부가되어 있다. 본 항체는, 펩타이드 매핑법으로 다른 라이신 잔기에서의 수식이 검출되지 않았기 때문에, 항체 중쇄의 246위치 또는 248위치에서의 위치 선택성이 100%인 것으로 해석된다.)
티올기 도입 항체의 버퍼(pH 7.4 PBS 버퍼) 용액(20μM)에 실시예 1에서 합성한 링커-페이로드 미믹의 DMF 용액(10mM)을 10당량 첨가하고, 실온에서 2시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE 헬스케어사 제조)를 사용하여 정제하여 ADC 미믹을 얻었다.
실시예 1-1에서 합성한 링커-페이로드 미믹 (1)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 1을 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (1)이 2개 도입된 150350에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 실시예 1-2의 링커-페이로드 미믹 (6)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 2를 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (6)이 2개 도입된 150535에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 실시예 1-3의 링커-페이로드 미믹 (11)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 3을 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (11)이 2개 도입된 150609에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 실시예 1-4의 링커-페이로드 미믹 (16)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 4를 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (16)이 2개 도입된 150466에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 비교예 1의 링커-페이로드 미믹 (26)과 티올 함유 항체로부터 하기 구조의 ADC 미믹 5를 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (26)이 2개 도입된 150276에 피크가 확인되었다.
(2-2) ADC 미믹의 DAR 해석
실시예 2-1에서 합성한 ADC 미믹의 ESI-TOFMS 분석은 기보(WO2019/240287A1)에 따라 행하고, DAR은 2인 것을 확인하였다.
Figure pct00064
실시예 3: 소수성 컬럼 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의한, ADC 및 ADC 미믹의 소수성도의 평가
기보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)에 따라, HIC-HPLC 분석을 행하였다. 측정은 이하의 조건을 이용하여 행하였다. HIC 크로마토그램에서의, ADC의 머무름 시간(Retention Time)에 의해 ADC의 소수성도를 평가할 수 있다.
측정 시스템: Chromaster(등록 상표)(히타치사 제조)
컬럼：토소 바이오사이언스사 제조 Tosoh Biobuthyl NPR 2.5μm 4.6×35mm 컬럼
그라디언트(gradient): 용리액(溶離液) A/B의 선형 그라디언트
유속: 0.8mL/분
용리액 A: 1.1M(NH4)2SO4, 25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0)
용리액 B: 25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH6.0, 25v/v% 이소프로판올 첨가)
검출기: UV(280nm)
그 결과, 실시예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4에서 합성한 ADC 미믹은 머무름 시간이 빠른 경향인 것이 확인되어, 친수성도가 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4에서 합성한 ADC 미믹은, 혈장 클리어런스가 느리고, 체내에 머무름 시간이 길다고 생각되기 때문에, 바람직한 ADC인 것이 확인 하였다.
실시예 4: 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의한, ADC 및 ADC 미믹의 응집률의 평가
기보(ChemistrySelect, 2020, 5, 8435-8439)에 따라, SEC-HPLC 분석을 행하였다. 측정은 하기의 조건을 이용하여 행하였다.
측정 시스템: 1260HPLC system(Agilent사 제조)
컬럼: Agilent사 제조 AdvanceBio SEC 300Å 2.7㎛, 4.6mm×150mm
유속: 0.25mL/분
용리액: 100mM 인산이수소나트륨/인산수소나트륨, 250mM 염화나트륨의 수용액(pH 6.8), 10% v/v 이소프로판올
검출기: UV(280nm)
Figure pct00066
실시예 5: 효소 카텝신 B를 이용한, ADC 미믹의 평가
각종 ADC 미믹의 카텝신 B에 의한 절단능은 하기와 같이, ADC 미믹으로부터 탈락한 형광 분자의 양을 해석함으로써 평가하였다.
(5-1) 카텝신 B 절단성 시험
기보(Nature Communications 2018, 9, 2512)에 따라 하기와 같이 실시하였다. MES buffer(10mM MES, 40μM DTT, pH 5.0) 180μL에 대하여, 1mg/mL의 농도가 되도록 ADC 미믹을 첨가한 후, 6개의 에펜 튜브에 30μL씩 분주하였다. 6개의 샘플 중 3개는, 0℃에서 즉시 아세토니트릴을 100μL씩 첨가하여 볼텍스로 교반한 후 원심분리를 행함으로써, 침전물을 얻었다. 생성된 상등액을 회수하고, HPLC 분석을 행하였다. 남은 3개는 37℃에서 6시간 인큐베이션하였다. 각 샘플에 아세토니트릴을 100μL씩 첨가하여 볼텍스로 교반한 후 원심 분리를 행함으로써, 침전물을 얻었다. 생성된 상등액을 회수하고, HPLC 분석을 행하였다.
(5-2) HPLC 분석을 이용한, 탈락된 형광 분자의 양의 해석
측정은, 액체 크로마토그래피/형광 검출법을 이용하여, ADC 미믹으로부터 탈락한 형광 분자량을 측정하였다. 실시예 7-1에서 0℃에서 즉시 아세토니트릴을 첨가한 3개의 샘플을 0시간으로 하고, 실시예 7-1에 기재된 바와 같이 37℃에서 6시간 인큐베이션한 3개의 샘플을 6시간인 것으로 하고, 6시간 샘플과 0시간 샘플의 형광 강도의 차분을 해석하였다.
별도 피렌을 사용하여, HPLC에 의한 형광 강도의 영역 면적과, 농도의 상관을 산출하였다. 그 산출식을 이용하여 상기 각 ADC 미믹의 형광 강도의 차분을 농도로 변환하였다. 0시간의 농도를 100%로 했을 때의, 상기 형광 강도의 차분의 비율을 탈락율로서 산출하였다.
Figure pct00067
표 4에 나타낸 바와 같이, 합성한 ADC 미믹은 충분한 카텝신 B 절단능을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 6: 마우스 혈장을 이용한 ADC 미믹의 평가
(6-1) ADC 미믹의 혈장 중 안정성 시험
마우스 혈장(Charles River사 제조) 500μL에 대해, 0.1mg/mL의 농도가 되도록 ADC 미믹을 첨가한 후 멸균 여과를 행하였다. 이 용액을 6개의 에펜 튜브에 50μL씩 분주하였다. 6개 샘플 중 3개는, 37℃로 설정한 인큐베이터에서 4일간 보관하였다. 남은 3개는 -80℃의 냉동고에서 마찬가지로 4일간 보관하였다. 각 샘플에 아세토니트릴을 100μL씩 첨가하고 볼텍스로 교반한 후 원심 분리를 행함으로써, 침전물을 얻었다. 생성된 상등액을 회수하고, HPLC 분석을 행하였다.
(6-2) HPLC 분석을 이용한 탈락된 형광 분자의 양의 해석
측정은, 액체 크로마토그래피/형광 검출법을 이용하여, ADC 미믹으로부터 탈락한 형광 분자량을 측정하였다. 실시예 9-1에서 냉동고에 보관한 3개의 샘플을 Day=0인 것으로 하고, 실시예 9-1에서 37℃에서 보관한 3개의 샘플을 Day=4인 것으로 하고, Day=4와 Day=0의 형광 강도의 차이를 분석하였다.
형광 분자의 탈락율의 산출은 실시예 5-2에 따라 실시하였다.
결과는 하기 표와 같이 형광 분자의 탈락률을 평가하였다.
Figure pct00068
그 결과, 비교예 1에서 합성한 ADC 미믹에 대하여, 실시예 1-1, 1-2에서 합성한 ADC 미믹은 3배 이상의 안정성을 나타내고, 실시예 1-3, 1-4에서 합성한 ADC 미믹은 10배 이상의 안정성을 나타냈다.
실시예 7: 링커-페이로드(Linker-payload)의 합성
(7-1) 링커-페이로드 (35)의 합성
링커-페이로드 (35)는 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00069
(7-1-1) 카보네이트 (36)의 합성
Figure pct00070
(1-1-1)에서 얻어진 알코올 (2)(105mg, 0.158mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(2mL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(100mg, 0.329mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(83μL, 0.48mmol)을 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 19.5시간 교반하였다. 증발기(evaporator)로 N,N-디메틸포름아미드를 제거한 후, 얻어진 거친 생성물에 아세트산에틸(3mL)을 첨가하여 용해시킨 후, 디에틸에테르(3mL)를 첨가하였다. 얻어진 용액을 필트레이션에 의해 잔류물을 제거한 후, 진공 펌프에 의해 유기 용매를 제거하여, 카보네이트 (36)(102mg, 0.123mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 830.1[M+H]+, 852.1[M+Na]+
(7-1-2) 화합물 (37)의 합성
Figure pct00071
(7-1-1)에서 얻어진 화합물 (36)(69mg, 0.083mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(3.5mL)에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸(16mg, 0.10mmol), 시판의 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE, 61mg, 0.085mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이어서, 디이소프로필에틸아민(29μL, 0.17mmol)을 첨가한 후, 실온, 질소 분위기 하에서 22.5시간 교반하였다. 증발기로 유기 용매를 제거한 후, 아세토니트릴:물=1:1의 용액을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 (37)(79mg, 0.056mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1408.9[M+H]+
(7-1-3) 화합물 (38)의 합성
Figure pct00072
(7-1-2)에서 얻어진 화합물 (37)(97mg, 0.069mmol)을 테트라하이드로푸란(7mL), 물(2mL)에 용해시키고, 수산화리튬(1.0M, 1.4mL, 1.4mmol)을 빙랭 하에 첨가하고, 그대로 1시간 교반하였다. 반응 용액에 염산을 첨가하여 pH 6으로 조제한 후, 아세토니트릴:물=1:1을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 (38)(70mg, 0.050mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1394.7[M+H]+
(7-1-4) 화합물 (39)의 합성
Figure pct00073
(7-1-3)에서 얻어진 화합물 (38)(34mg, 0.024mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(3mL)에 용해시킨 후 빙랭하여, N,N-디이소프로필에틸아민(25μL, 0.14mmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(20mg, 0.038mmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(8.7mg, 0.040mmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 화합물 (39)(29mg, 0.019mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1558.9[M+H]+
(7-1-5) 링커-페이로드 (35)의 합성
Figure pct00074
(7-1-4)에서 얻어진 화합물 (39)(29mg, 0.019mmol)에 아세토니트릴(500μL), 85wt% 인산 수용액(0.50mL, 7.3mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 완결 후, 물(2mL)을 첨가하고, 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 (35)(18mg, 0.012mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1502.9[M+H]+
(7-2) 링커-페이로드 (40)의 합성
링커-페이로드 (40)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00075
(7-2-1) 화합물 (41)의 합성
Figure pct00076
(7-1-3)에서 얻어진 화합물 (38)(10mg, 0.0072mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(1mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(10μL, 0.057mmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(7.0mg, 0.013mmol)를 첨가하였다. 다음에 DBCO-헥실아민(4.7mg, 0.015mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(0.5mL) 용액을 첨가하고 실온으로 되돌려서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 화합물 (41)(5.8mg, 0.0034mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1696.0[M+H]+
(7-2-2) 링커-페이로드 (40)의 합성
Figure pct00077
(7-2-1)에서 얻어진 화합물 (41)(13mg, 0.0077mmol)에 아세토니트릴(500μL), 85wt% 인산 수용액(0.50mL, 7.3mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 완결 후, 물(2mL)을 첨가하고, 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 (40)(7.4mg, 0.0045mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1638.9[M+H]+
(7-3) 링커-페이로드 (42)의 합성
링커-페이로드 (42)는 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00078
(7-3-1) 카보네이트 (43)의 합성
Figure pct00079
(1-1-1)에서 얻어진 알코올 (2)(140mg, 0.165mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(4mL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(108mg, 0.355mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(100μL, 0.574mmol)을 첨가하고, 질소 분위기 하에서 실온에서 18시간 교반하였다. 증발기로 유기 용매를 제거한 후, 아세토니트릴:물=1:1의 용액을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제 하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 43(130mg, 0.128mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1015.6[M+H]+
(7-3-2) 화합물 (44)의 합성
Figure pct00080
(7-3-1)에서 얻어진 화합물 (43)(85mg, 0.084mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(2mL)에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸(20mg, 0.13mmol), 시판의 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE, 63mg, 0.088mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이어서, 디이소프로필에틸아민(75μL, 0.43mmol)을 첨가한 후, 실온, 질소 분위기 하에서 23시간 교반하였다. 증발기로 유기 용매를 제거한 후, 아세토니트릴:물=1:1의 용액을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 44(94mg, 0.059mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1593.6[M+H]+
(7-3-3) 화합물 (45)의 합성
Figure pct00081
(7-3-2)에서 얻어진 화합물 (44)(94mg, 0.059mmol)를 테트라히드로푸란(5mL), 물(2mL)에 용해시키고, 수산화리튬(1.0M, 0.6mL, 0.6mmol)을 빙랭 하에 첨가하고, 그대로 1시간 교반하였다. 반응 용액에 염산을 첨가하고, pH5로 조제한 후, 아세토니트릴:물=1:1을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 45(77mg, 0.049mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1579.7[M+H]+
(7-3-4) 화합물 (46)의 합성
Figure pct00082
(7-3-3)에서 얻어진 화합물 (45)(77mg, 0.049mmol)를 N,N-디메틸포름아미드(3mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(50μL, 0.29mmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(87mg, 0.17mmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(35mg, 0.16mmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 20시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 화합물 (46)(65mg, 0.037mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1744.7[M+H]+
(7-3-5) 링커-페이로드 (42)의 합성
Figure pct00083
(7-3-4)에서 얻어진 화합물 (46)(65mg, 0.037mmol)에 아세토니트릴(2mL), 85wt% 인산 수용액(1.00mL, 14.6mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 6시간 교반하였다. 반응 완결 후, 물(2mL)을 첨가하고, 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 (42)(49mg, 0.030mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1631.6[M+H]+
(7-4) 링커-페이로드 (47)의 합성
링커-페이로드 (47)는 하기와 같이 합성하였다.
(7-4-1) 화합물 (48)의 합성
Figure pct00085
(7-3-1)에서 얻어진 화합물 (43)(67mg, 0.066mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(2mL)에 용해시키고, 1-하이드록시벤조트리아졸(17mg, 0.11mmol), 시판의 엑사테칸 메실레이트(Exetacan mesylate)(CAS: 169869-90-3, 35mg, 0.066mmol)를 실온에서 첨가하였다. 이어서, 디이소프로필에틸아민(50μL, 0.29mmol)을 첨가한 후, 실온, 질소 분위기 하에서 4시간 교반하였다. 증발기로 유기 용매를 제거한 후, 아세토니트릴:물=1:1의 용액을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 48(57mg, 0.043mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1311.7[M+H]+
(7-4-2) 화합물 (49)의 합성
Figure pct00086
(7-4-1)에서 얻어진 화합물 (48)(57mg, 0.043mmol)을 테트라히드로푸란(3mL), 물(1.5mL)에 용해시키고, 수산화리튬(1.0M, 0.5mL, 0.5mmol)을 빙랭 하에 첨가하고, 그대로 1시간 교반하였다. 반응 용액에 염산을 첨가하고, pH5로 조제한 후, 아세토니트릴:물=1:1을 첨가하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조를 행함으로써, 화합물 49(45mg, 0.035mmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1297.6[M+H]+
(7-4-3) 화합물 (50)의 합성
Figure pct00087
(7-4-2)에서 얻어진 화합물 (49)(45mg, 0.035mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(3mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(30μL, 0.17mmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(55mg, 0.11mmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(22mg, 0.10mmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 18시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 화합물 (50)(22mg, 0.015mmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1462.7[M+H]+
(7-3-5) 링커-페이로드 (47)의 합성
Figure pct00088
(7-4-3)에서 얻어진 화합물 (50)(22mg, 0.015mmol)에 아세토니트릴(1mL), 85wt% 인산 수용액(1.0mL, 14.6mmol)을 순차 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 완결 후, 물(1mL)을 첨가하고, 반응액을 역상 분취 크로마토그래피로 정제하고, 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 (47)(18.8mg, 0.0139mmol)을 얻었다.
1H NMR(300MHz; DMSO-d6) δ10.04(s,1H), 8.10-8.05(m,4H), 7.80-7.77(m,2H), 7.59-7.55(m,2H), 7.35-7.30(m,3H), 6.99(d,J=8.8Hz,2H), 6.54-6.53(m,1H), 6.01(brs,1H), 5.74(d,J=9.0Hz,1H), 5.43(brs,4H), 5.33-5.28(m,2H), 4.29-4.15(m,4H), 3.19-2.98(m5H), 2.43-2.38(m,5H), 2.27-2.20(m,7H), 1.95-1.83(m,8H), 1.73-1.62(m,4H), 1.42-1.30(m,7H), 1.23-1.13(m,3H), 0.84(m,9H).
MS(ESI) m/z: 1349.2[M+H]+
(7-5) 링커-페이로드 (125)의 합성
하기에 나타낸 링커-페이로드 (125)는, 링커-페이로드 미믹(120)의 합성에 있어서, 사르코신-피렌 대신에 MMAE를 사용하여, 동일한 방법으로 합성하였다.
Figure pct00089
MS(ESI) m/z: 1968.14[M+H]+
(7-6) 링커-페이로드 (126)의 합성
하기에 나타내는 링커-페이로드 (126)는, 링커-페이로드 미믹 (35)의 합성에 있어서, MMAE 대신에 엑사테칸 메실레이트를 사용하여, 동일한 방법으로 합성하였다.
Figure pct00090
MS(ESI) m/z: 1220.50[M+H]+
실시예 8: ADC의 합성
(8-1) ADC4의 합성
이후의 비교예 및 실시예에서는, 티올기 도입 항체로서, 국제공개 제2019/240287호(WO2019/240287A1)의 실시예 81-7에 기재된 항체 유도체(티올기 도입 트라스투주맙)를 이용하였다. 이 항체 유도체는, 항체 중쇄의 246위치 또는 248위치의 라이신 잔기의 측쇄의 아미노기를 개재하여, 트라스투주맙(인간화 IgG1 항체)에 티올기가 위치 선택적으로 도입되어 있는 하기 구조를 갖는다(라이신 잔기의 위치는 EU 넘버링에 따른다).
(상기 구조에서, 항체 중쇄로부터 연장되어 있는 NH-CH2-CH2-CH2-CH2-는, 라이신 잔기의 측쇄에 대응하고, 이 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기에 대하여 티올 함유기인 HS-CH2-CH2-C(=O)가 부가되어 있다. 본 항체는, 펩타이드 매핑법으로 다른 라이신 잔기에서의 수식이 검출되지 않았기 때문에, 항체 중쇄의 246위치 또는 248위치에서의 위치 선택성이 100%인 것으로 해석된다.)
티올기 도입 항체의 버퍼(pH 7.4 PBS 버퍼) 용액(20μM)에 실시예 12-1에서 합성한 링커-페이로드 (35)의 DMF 용액(10mM)을 10당량 첨가하고, 실온에서 2시간 정치 후, NAP-5 Columns(GE Healthcare사 제조)를 사용하여 정제하여 ADC 4를 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 (35)가 2개 도입된 151414에 피크가 확인되었다.
(8-2) ADC5의 합성
(8-1)에 따라서, 링커-페이로드 (42)로부터 ADC5를 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 (42)가 2개 도입된 151673에 피크가 확인되었다.
(8-3) ADC6의 합성
(13-1)에 따라서, 링커-페이로드 (47)로부터 ADC6을 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 (47)가 2개 도입된 151109에 피크가 확인되었다.
(8-4) ADC8의 합성
(13-1)에 따라서, 링커-페이로드 (125)로부터 ADC8을 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 (125)가 2개 도입된 150524에서 피크가 확인되었다.
(8-5) ADC11의 합성
(13-1)에 따라서, 링커-페이로드 (126)로부터 ADC11을 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 (126)가 2개 도입된 150615에서 피크가 확인되었다.
실시예 9: ADC의 HIC-HPLC 분석
실시예 3의 조건을 이용하여 HIC-HPLC 분석을 행하였다.
Figure pct00097
계속하여, HIC-HPLC를 사용하여 ADC의 소수성 평가를 행하였다. 측정은 실시예 3에 따라 행하였다. HIC 크로마토그램에 있어서의, ADC의 머무름 시간에 의해 ADC의 소수성도를 평가할 수 있다. 비교 대상으로 원료 항체이며 트라스투주맙(Trastuzumab)을 사용하였다.
엑소형 ADC인 ADC4, 5, 6은, HIC 크로마토그램에 있어서의 머무름 시간이 원료 항체와 손색이 없고, 보다 친수성의 ADC인 것을 알 수 있다.
실시예 10: 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의한 ADC의 응집률 평가
실시예 4에 따라서, SEC-HPLC 분석을 행하였다.
그 결과, (8-1), (8-2) 및 (8-3)에서 합성한 ADC는, 응집율이 낮은 경향인 것이 확인되어, 보다 안정성이 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예 8에서 합성한 ADC는, 바람직한 ADC인 것이 확인되었다.
실시예 11: 링커-페이로드 미믹의 합성
(11-1) 링커-페이로드 미믹 (56)의 합성
링커-페이로드 미믹 (56)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00100
(11-1-1) 알코올 (57)의 합성
Figure pct00101
Ac-Asp(OtBu)-Val-Cit-OH(51.7mg, 103μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(520μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(46.9mg, 123μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(15.9μL, 123μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 계속하여, 4-아미노만델산메틸(22.3mg, 123μmol)를 첨가하여 실온에서 19시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (57)(56.3mg, 86.5μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ9.99(s,1H), 8.27(d,J=8.4Hz,1H), 8.17(d,J=8.4Hz,1H), 7.59(d,J=8.8Hz,1H), 7.56(d,J=8.8Hz,2H), 7.31(d,J=8.8Hz,2H), 5.98(brs,1H), 5.41(brs,2H), 5.08(s,1H), 4.64-4.59(m,1H), 4.39-4.34(m,1H), 4.22-4.18(m,1H), 3.59(s,3H), 3.01-2.94(m,2H), 2.69-2.63(m,1H), 2.44-2.38(m,1H), 2.00-1.95(m,1H), 1.83(s,3H), 1.69-1.66(m,1H), 1.62-1.53(m,1H), 1.43-1.34(m,11H), 0.84(d,J=6.8Hz,3H), 0.79(d,J=6.8Hz,3H).
MS(ESI) m/z: 651.35[M+H]+
(11-1-2) 피렌 (58)의 합성
알코올 (57)(55.0mg, 84.5μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(423μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(77.1mg, 254μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(32.3μL, 190μmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하고, 사르코신-피렌(76.7mg, 254μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(17.1mg, 127μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(53.9μL, 317μmol)을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (58)(60.9mg, 62.2μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.14-10.11(m,1H), 8.68-8.66(m,1H), 8.39-8.01(m,10H), 7.89-7.85(m,1H), 7.67-7.58(m,3H), 7.44-7.39(m,2H), 5.98(brs,1H), 5.79-5.77(m,1H), 5.42(brs,2H), 5.04-4.97(m,2H), 4.65-4.59(m,1H), 4.39-4.36(m,1H), 4.28-4.07(m,2H), 3.92-3.82(m,1H), 3.62-3.61(m,3H), 2.99-2.91(m,5H), 2.69-2.63(m,1H), 2.44-2.38(m,1H), 2.01-1.97(m,1H), 1.83(s,3H), 1.70-1.60(m,2H), 1.44-1.30(m,11H), 0.86-0.77(m,6H).
MS(ESI) m/z: 979.45[M+H]+
(11-1-3) 피렌 (59)의 합성
Figure pct00103
피렌 (58)(24.9mg, 25.4μmol)을 테트라하이드로푸란(1.88mL), 물(625μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 1M 수산화리튬 수용액(30.5μL, 30.5μmol)을 첨가하고, 실온에서 50분간 교반하였다. 반응 종료 후, 0.1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (59)(8.3mg, 8.6μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ13.06(brs,1H), 10.13-10.09(m,1H), 8.68-8.65(m,1H), 8.39-8.00(m,10H), 7.88-7.84(m,1H), 7.67-7.59(m,3H), 7.44-7.41(m,2H), 5.98(brs,1H), 5.68-5.67(m,1H), 5.42(brs,2H), 5.04-4.93(m,2H), 4.64-4.61(m,1H), 4.41-4.35(m,1H), 4.32-4.09(m,2H), 3.91-3.80(m,1H), 2.99-2.91(m,5H), 2.70-2.64(m,1H), 2.44-2.38(m,1H), 2.01-1.98(m,1H), 1.83(s,3H), 1.70-1.57(m,2H), 1.45-1.30(m,11H), 0.86-0.77(m,6H).
MS(ESI) m/z: 965.45[M+H]+
(11-1-4) 피렌 (60)의 합성
Figure pct00104
피렌 (59)(7.2mg, 7.5μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(150μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(2.5μL, 14.9μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(5.8mg, 11.2μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(2.4mg, 11.2μmol)를 첨가하고 실온으로 되돌려서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (60)(5.7mg, 5.1μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ10.07-10.04(m,1H), 8.91-8.88(m,1H), 8.65-7.95(m,12H), 7.62-7.58(m,3H), 7.40-7.36(m,2H), 6.96-6.94(m,2H), 5.97(brs,1H), 5.70-5.68(m,1H), 5.41(brs,2H), 5.14-5.00(m,2H), 4.65-4.61(m,1H), 4.42-4.37(m,1H), 4.25-4.19(m,1H), 4.15-3.82(m,2H), 3.30-3.21(m,2H), 3.04-2.89(m,7H), 2.70-2.64(m,1H), 2.44-2.38(m,1H), 2.01-1.97(m,1H), 1.83(s,3H), 1.75-1.60(m,2H), 1.48-1.24(m,15H), 1.12-1.03(m,2H), 0.86- 0.78(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1129.50[M+H]+
(11-1-5) 링커-페이로드 미믹 (56)의 합성
피렌 (60)(4.7mg, 4.2μmol)에 아세토니트릴(208μL)을 첨가하고, 빙랭 하에서 85% 인산 용액(72.4μL, 1.25mmol)을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (56)(3.1mg, 2.9μmol)을 얻었다.
1H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.38(brs,1H), 10.05-10.01(m,1H), 8.91-8.88(m,1H), 8.65-7.94(m,12H), 7.63-7.58(m,3H), 7.40-7.34(m,2H), 6.96-6.93(m,2H), 6.00(brs,1H), 5.70-5.68(m,1H), 5.44(brs,2H), 5.15-4.99(m,2H), 4.64-4.60(m,1H), 4.43-4.37(m,1H), 4.25-4.22(m,1H), 4.15-3.82(m,2H), 3.30-3.21(m,2H), 3.04-2.89(m,7H), 2.73-2.69(m,1H), 2.46-2.44(m,1H), 2.04-1.96(m,1H), 1.84-1.83(m,3H), 1.77-1.59(m,2H), 1.44-1.04(m,8H), 0.86-0.77(m,6H).
MS(ESI) m/z: 1073.50[M+H]+
(11-2) 링커-페이로드 미믹 (66)의 합성
링커-페이로드 미믹 (1)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00106
(11-2-1) 알코올 (67)의 합성
Figure pct00107
Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Cit-OH(50.2mg, 47.3μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(237μL)에 용해시키고, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3,트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(21.6mg, 56.8μmol), 2,4,6-트리메틸피리딘(7.48μL, 56.8μmol)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 계속하여, 4-아미노만델산메틸(10.3mg, 56.8μmol)을 첨가하고 실온에서 20시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (67)(47.7mg, 39.1μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1220.65[M+H]+
(11-2-2) 피렌 (68)의 합성
Figure pct00108
(1-1-1)에서 얻어진 알코올 (67)(46.3mg, 37.9μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(380μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 탄산비스(4-니트로페닐)(34.6mg, 114μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(14.5μL, 85.3μmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 빙랭하고, 사르코신-피렌(34.5mg, 114μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(7.7mg, 56.9μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(24.2μL, 142μmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (68)(37.1mg, 24.0μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 775.30[M+H]+
(11-2-3) 피렌 (69)의 합성
Figure pct00109
피렌 (68)(20.3mg, 13.1μmol)을 테트라히드로푸란(983μL), 물(327μL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 1M 수산화리튬 수용액(31.4μL, 31.4μmol)을 첨가하고, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (69)(16.7mg, 10.9μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1534.85[M+H]+
(11-2-4) 피렌 (70)의 합성
Figure pct00110
피렌 (69)(14.9mg, 9.71μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(486μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(3.3μL, 19.4μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(7.6mg, 14.6μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(3.2mg, 14.6μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 1시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (70)(13.1mg, 7.71μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1698.90[M+H]+
(11-2-5) 링커-페이로드 미믹 (66)의 합성
Figure pct00111
피렌 (70)(5.25mg, 3.09μmol)에 아세토니트릴(309μL)을 첨가하고, 빙랭 하에서 85% 인산 용액(53.8μL, μ927mol)을 첨가하고, 실온에서 25시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (66)(3.7mg, 2.51μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1474.00[M+H]+
(11-3) 링커-페이로드 미믹 (11)의 합성
링커-페이로드 미믹 (11)은 하기와 같이 (1-3)과는 다른 경로로도 합성되었다.
Figure pct00112
(11-3-1) 알코올 (96)의 합성
Figure pct00113
실시예(1-3-1)에서 얻어진 알코올 (12)(80.0mg, 94.1μmol)를 테트라히드로푸란(7.0mL), 물(2.35mL)에 용해시키고, 빙랭 하에서 5분간 교반한 후, 1M 수산화리튬 수용액(226μL, 226μmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 1M 염산을 사용하여 약 pH6으로 조정하고, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 알코올 (96)(61.5mg, 73.6μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 836.40[M+H]+
(11-3-2) 알코올 (97)의 합성
Figure pct00114
알코올 (96)(60.5mg, 72.4μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(3.6mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(25μL, 145μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(56.5mg, 109μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(23.7mg, 109μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 알코올 (97)(68.0mg, 72.4μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1000.50[M+H]+
(11-3-3) 화합물 (98)의 합성
Figure pct00115
알코올 (97)(10.0mg, 10.0μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(0.1mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, 탄산비스(4-니트로페닐)(30.4mg, 100μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(3.8μL, 22.5μmol)을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 후, 순상(順相) 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 화합물 (98)(5.6mg, 4.8μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1163.50[M+H]+
(11-3-4) 피렌 (15)의 합성
Figure pct00116
화합물 (98)(10.0mg, 8.6μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(86μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, 사르코신-피렌(2.2mg, 7.2μmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(1.5mg, 11μmol), N,N-디이소프로필에틸아민(1.8μL, 11μmol)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 후, 순상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써 아세토니트릴을 제거하고, 동결 건조함으로써, 상기 피렌 (15)(3.0mg, 2.3μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1328.60[M+H]+
(11-3-5) 링커-페이로드 미믹 (15)의 합성
실시예 (1-3-5)와 동일한 방법으로 링커-페이로드 미믹 (15)는 합성하였다.
(11-4) 링커-페이로드 미믹 (120)의 합성
링커-페이로드 미믹 (120)은 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00117
(11-4-1) 화합물 (122)의 합성
Figure pct00118
21-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-4,7,10,13,16,19-헥사옥사헨에이코산산(121)(70.0mg, 154μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(7.72mL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(52.0μL, 309μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(120mg, 232μmol)를 첨가하였다. 다음에 N-(5-아미노펜틸)말레이미드 염산염(50.6mg, 232μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 4시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 화합물 (122)(83.4mg, 135μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 618.50[M+H]+
(11-4-2) 화합물 (123)의 합성
Figure pct00119
화합물 (122)(82.0mg, 133μmol)를 디클로로메탄(13.3mL), 트리플루오로아세트산(6.64mL)에 용해시키고, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 감압 농축에 의해 디클로로메탄 및 트리플루오로아세트산을 제거하여, 상기 화합물 (123)(71.8mg, quant)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 518.40[M+H]+
(11-4-3) 피렌 (124)의 합성
Figure pct00120
피렌 (14)(16.0mg, 14.0μmol)를 N,N-디메틸포름아미드(690μL)에 용해시킨 후 빙랭하고, N,N-디이소프로필에틸아민(9.3μL, 55.0μmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(11mg, 21.0μmol)를 첨가하였다. 다음에 PEG6(11.0mg, 21.0μmol)을 첨가하고 실온으로 되돌려서 2시간반 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 피렌 (124)(11.2mg, 6.73μmol)를 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1664.80[M+H]+
(11-4-4) 링커-페이로드 미믹 (120)의 합성
Figure pct00121
피렌 (124)(5.0mg, 3.0μmol)에 아세토니트릴(200μL)을 첨가하고, 빙랭 하에서 85% 인산 용액(60.0μL, 880μmol)을 첨가하고, 실온에서 25시간 교반하였다. 반응 종료 후, 역상 분취 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조함으로써, 링커-페이로드 미믹 (120)(2.4mg, 1.5μmol)을 얻었다.
MS(ESI) m/z: 1552.65[M+H]+
실시예 12: ADC 미믹의 합성
(12-1) ADC 미믹의 합성
이후의 실시예에서는, 실시예 2와 동일한 방법으로 ADC 미믹의 조제를 행하였다.
(11-1)의 링커-페이로드 미믹 (56)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 22를 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (56)이 2개 도입된 150322에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 (11-2)의 링커-페이로드 미믹 (66)과 티올 함유 항체로부터 하기 구조의 ADC 미믹 24를 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (66)이 2개 도입된 151125에 피크가 확인되었다.
마찬가지로 (11-4)의 링커-페이로드 미믹 (120)과 티올 함유 항체로부터, 하기 구조의 ADC 미믹 33을 합성하였다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 링커-페이로드 미믹 (120)이 2개 도입된 151279에 피크가 확인되었다.
(12-2) ADC 미믹의 DAR 해석
실시예 12-1에서 합성한 ADC 미믹의 ESI-TOFMS 분석은 기보(WO2019/240287A1)에 따라 행하고, DAR은 2인 것을 확인하였다.
Figure pct00125
실시예 13: 소수성 컬럼 크로마토그래피(HIC-HPLC)에 의한 ADC 및 ADC 미믹의 소수성도의 평가
기보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)에 따라, HIC-HPLC 분석을 행하였다. 측정은 하기의 조건을 이용하여 행하였다. HIC 크로마토그램에서의, ADC의 머무름 시간에 의해 ADC의 소수성도를 평가할 수 있다.
측정 시스템: Chromaster(등록상표)(히타치사 제조)
컬럼：토소 바이오사이언스사 제조 Tosoh Biobuthyl NPR 2.5μm 4.6×35mm 컬럼
그라디언트: 용리액 A/B의 선형 그라디언트
유속: 0.8mL/분
용리액 A: 1.1M (NH4)2SO4, 25mM Na2HPO4/NaH2PO4 (pH6.0)
용리액 B: 25mM Na2HPO4/NaH2PO4 (pH6.0, 25v/v% 이소프로판올 첨가)
검출기: UV(280nm)
그 결과, 실시예 11-1, 11-2, 11-4에서 합성한 ADC 미믹은 머무름 시간이 빠른 경향인 것이 확인되어, 친수성도가 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예 11-1, 11-2, 11-4에서 합성한 ADC 미믹은, 혈장 클리어런스가 느리고, 체내에 머무는 시간이 길다고 생각되기 때문에, 바람직한 ADC인 것이 확인되었다.
실시예 14: 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의한, ADC 및 ADC 미믹의 응집률의 평가
기보(ChemistrySelect, 2020, 5, 8435-8439)에 따라, SEC-HPLC 분석을 수행 하였다. 측정은 하기의 조건을 이용하여 행하였다.
측정 시스템: 1260 HPLC system(Agilent사 제조)
컬럼 : Agilent사 제조 AdvanceBio SEC 300Å 2.7㎛, 4.6mm×150mm
유속: 0.25mL/분
용리액: 100mM 인산이수소나트륨/인산수소나트륨, 250mM 염화나트륨 수용액(pH 6.8), 10% v/v 이소프로판올
검출기: UV(280nm)
Figure pct00127
실시예 15: 효소 카텝신 B를 이용한 ADC 미믹의 평가
각종 ADC 미믹의 카텝신 B에 의한 절단능은 하기와 같이, ADC 미믹에서 탈락한 형광 분자의 양을 해석함으로써 평가하였다.
(15-1) 카텝신 B 절단성 시험
실시예 5와 동일한 방법으로 시험을 행하였다.
(15-2) HPLC 분석을 이용한, 탈락한 형광 분자의 양의 해석
실시예 5와 동일한 방법으로 분석, 해석을 행하였다.
표 12에 나타낸 바와 같이, 합성한 ADC 미믹은 충분한 카텝신 B 절단을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 16: 마우스 혈장을 이용한 ADC 미믹의 평가
(16-1) ADC 미믹의 혈장 중 안정성 시험
실시예 6과 동일한 방법으로 시험을 행하였다.
(16-2) HPLC 분석을 이용한, 탈락한 형광 분자의 양의 해석
실시예 6과 동일한 방법으로 분석, 해석을 행하였다.
Figure pct00129
그 결과, 비교예 1에서 합성한 ADC 미믹에 대하여, 실시예 12-4에서 합성한 ADC 미믹은 2배 이상의 안정성을 나타내고, 실시예 12-1, 12-2에서 합성한 ADC 미믹은 10배 이상의 안정성을 나타내었다.
실시예 17: 링커-페이로드의 합성
실시예(7-3-5)에서 합성한 링커-페이로드 (42)의 NMR 스펙트럼 데이터는 다음과 같았다.
1H NMR(300MHz; DMSO-d6) δ12.06(brs,2H), 10.05-10.07(m,1H), 8.47-8.28(m,1H), 8.29-8.19(m,1H), 8.13-8.04(m,3H), 7.91-7.56(m,5H), 7.39-7.17(m,7H), 6.99(s,2H), 5.99(s,1H), 5.86-5.67(m,1H), 5.43-5.35(m,3H), 4.77-4.16(m,6H), 4.00-3.98(m,2H), 3.80-3.76(m,1H), 3.52-3.18(m,12H), 3.01-2.73(m,9H), 2.26-2.14(m,6H), 2.12-2.09(m,2H), 1.97-1.90(m,2H), 1.84(s,6H), 1.76-1.69(m,5H), 1.43-1.35(m,10H), 1.23-1.14(m,3H), 1.01-0.96(m,7H), 0.83-0.68(m,24H).
실시예 18: ADC의 합성
(18-1) 링커 중간체의 합성
(18-1-1) 링커 중간체 (115)의 합성
Figure pct00130
5-아지드펜탄산(800mg, 5.59mmol)을 THF(14mL)에 용해시키고, 클로로포름산이소부틸(808μL, 6.15mmol), N-메틸모르폴린(873μL, 8.39mmol)을 첨가하여 0℃에서 30분 교반한 후, 1M NaOH 수용액(4mL)에 용해한 히드라진 수화물(1.36g, 6.71mmol)을 첨가하여 실온에서 3시간 교반하였다. 감압 하 농축한 후, 1M NaOH 수용액을 첨가하고, 계내의 pH를 pH10으로 조정하고, 아세트산에틸로 세정 후, 수층에 1M HCl 수용액을 첨가하고, 계내의 pH를 3.0으로 조정하고, 아세트산 에틸을 첨가하여 세정하고, 얻어진 아세트산에틸 용액에 황산나트륨을 첨가하였다. 필트레이션에 의해 황산나트륨을 제거하고, 감압 하 농축 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 농축함으로써, 링커 중간체 (115)를 얻었다.
1H NMR(400MHz, 클로로포름-d) δ6.29(d,J=7.7Hz,1H), 4.56(td,J=8.0,4.9Hz,1H), 3.32(t,J=6.6Hz,2H), 2.53-2.38(m,3H), 2.36-2.16(m,3H), 2.12(s,2H), 1.96(dq,J)=14.7,7.6Hz,1H), 1.84-1.59(m,4H), 1.50(s,9H).
MS(ESI) m/z: 329[M+H]+
(18-1-2) 링커 중간체 (117)의 합성
Figure pct00131
링커 중간체(116)(2.41g, 5.59mmol)를 디클로로메탄(28mL)에 용해시키고, 티오페놀(627μL, 6.15mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시(3.49g, 6.71mmol), DIPEA(1.42mL, 8.39mmol)를 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 감압 하에 농축하고, 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=4:1)로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 링커 중간체 (117)를 얻었다(2.20g, 5.23mmol).
1H NMR(400MHz, 클로로포름-d) δ7.43(s,5H), 6.10(d,J=7.8Hz,1H), 4.55(td,J=7.7,4.9Hz,1H), 3.31(t,J=6.7Hz,2H), 2.87-2.63(m,2H), 2.28(dd,J=8.7,5.9Hz,2H), 2.16-1.98(m,1H), 1.83-1.58(m,4H), 1.50(s,9H), 1.37-1.22(m,2H), 0.91(t,J=6.7Hz,1H).
MS(ESI) m/z: 421[M+H]+
(18-1-3) 링커 중간체 (118)의 합성
Figure pct00132
링커 중간체(117)(2.20g, 5.23mmol)를 디클로로메탄(10mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(10mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반한 후, 감압 하 농축하여 디클로로메탄을 제거하고, 물을 첨가하여 동결 건조함으로써, 링커 중간체 (118)를 얻었다(1.98g, 5.43mmol).
1H NMR(400MHz, 클로로포름-d) δ7.44(s,J=6.3,4.6,2.4Hz,5H), 6.76(s,1H), 4.62(td,J=7.5,4.9Hz,1H), 3.31(t,J=6.6Hz,2H), 2.88(qt,J=16.8,6.8Hz,2H), 2.33(dt,J=12.4,6.8Hz,3H), 2.18(dq,J=14.4,7.4Hz,1H), 1.74(dq,J=11.8,7.5,6.9Hz,2H), 1.63(ddd,J = 17.7,10.5,4.8Hz,2H).
MS(ESI) m/z: 365[M+H]+
(18-1-4) 링커 중간체 (119)의 합성
Figure pct00133
링커 중간체 (118)(100mg, 0.274mmol)를 디클로로메탄(3mL)에 용해시키고 (40.6μL, 0.280mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시(150mg, 0.288mmol), DIPEA(70.1μL, 0.412mmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 1M HCl 수용액을 첨가하여 계내를 pH3으로 조정하고, 디클로로메탄을 첨가하여 희석하고, 물, 식염수로 세정 후, 황산나트륨을 첨가하였다. 필트레이션에 의해, 황산나트륨을 제거한 후, 감압 하 농축하고, 컬럼 크로마토그래피(헥산:아세트산에틸=4:1)로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 하 농축함으로써, 링커 중간체 (119)를 얻었다(84.7mg, 0.171mmol).
1H NMR(400MHz, 클로로포름-d) δ7.50-7.38(m,5H), 6.33(d,J=8.4Hz,1H), 4.78(tdd,J=7.8,4.6,3.0Hz,1H), 3.70-3.54(m,2H), 3.32(dt,J=9.1,6.7Hz,2H), 2.96-2.67(m,2H), 2.30(pd,J=7.1,4.5Hz,2H), 1.85-1.60(m,6H), 1.49(d,J=2.8Hz,9H).
MS(ESI) m/z: 495[M+H]+
(18-1-5) 링커 중간체 (120)의 합성
Figure pct00134
링커 중간체(119)(84.7mg, 0.171mmol)를 디클로로메탄(5mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산(5mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반한 후, 감압 하 농축하여 디클로로메탄을 제거하고, 물을 첨가하여 동결 건조시킨 후, 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 링커 중간체 (120)를 얻었다(46.8mg, 0.107 mmo).
1H NMR(400MHz, 메탄올-d4) δ7.44(dq,J=2.3,1.5Hz,5H), 4.69-4.57(m,1H), 3.79-3.67(m,2H), 3.40-3.30(m,2H), 2.89-2.71(m,2H), 2.44-2.23(m,4H), 2.08-1.95(m,1H), 1.82-1.61(m,4H).
MS(ESI) m/z: 439[M+H]+
(18-2) 아지드기를 갖는 친화성 시약 (18)의 조제
Figure pct00135
(상기 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열이다.)
기보(WO2019/240287A1)에 기재된 Ac-RGNCAYHKGQIIWCTYH-NH2(서열 번호 1, 30.9mg, 14.9μmol, 단, 4번째와 14번째의 2개의 시스테인은, 각각 분자 내에서 디설파이드 결합하고 있다.)를 디메틸포름아미드(468μL)에 용해하고, 실시예 18-1-5에서 합성한 링커 중간체 (120) 46.8mg, 0.107mmol), WSC·HCl(29.7mg, 0.155mmol)을 첨가하고, 실온에서 5시간 교반한 후, 역상 분취 크로마토그래피에 의해, 용출하였다. 생성물이 포함되는 분획물을 회수하고, 감압 하 농축함으로써 아세토니트릴을 제거한 후, 동결 건조를 행함으로써, 상기 수식 시약 (121)을 얻었다 (15.1mg, 6.02μmol).
(18-3) 2 분자의 펩타이드 시약을 트라스투주맙으로 도입
(상기 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열이다.)
계속해서, 실시예 18-2에서 조제한 펩타이드 시약 (121)을 사용하여, 트라스투주맙에 대하여 기보(WO2019/240287A1)의 수법에 따라, 컨쥬게이션을 실시하였다. 그 결과, 변형 시약 (121)이 도입된 항체를 얻었다. 펩타이드 시약 (121)이 도입된 항체의 DAR 분석은 기보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)에 따라, HIC-HPLC 분석을 행하고, 2개의 펩타이드 시약이 도입된 것을 확인하였다.
(18-4) 아지드기가 도입된 트라스투주맙(T-1)의 합성
(상기 아미노산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열이다.)
실시예 18-3에서 얻은 수식 시약 (121)이 도입된 항체에 대해서, 기보(WO2019/240287A1)의 수법을 참고로, 메톡시아민 용액을 첨가하고, 실온에서 3시간 진탕함으로써, 절단 반응을 행하였다. 그 결과, 아지드기가 도입된 항체를 얻었다. 분석은 기보(Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732)에 따라, HIC-HPLC 분석을 행하고, 아지드기가 도입되어 있는 것을 확인하였다.
(18-5) ADC7의 합성
아지드 도입 항체에 대하여, 링커-페이로드 (40)을 첨가하여, ADC (7)을 얻었다. ESI-TOFMS 분석을 행하고, 반응 생성물은 2개 링커-페이로드 (40)이 도입된 151276에서 피크가 확인되었다. 또한, ESI-TOFMS 분석을 기보(WO2019/240287A1)에 따라 행하고, DAR은 2인 것을 확인하였다.
실시예 19: 마우스 혈장을 이용한, ADC 평가
(19-1) ADC의 혈장 중 안정성 시험
마우스 혈장(Charles River사 제조) 500μL에 대하여, 0.1mg/mL의 농도가 되도록 ADC 미믹을 첨가한 후 멸균 여과를 행하였다. 이 용액을 6개의 에펜 튜브에 50μL씩 분주하였다. 6개 샘플 중 3개는, 37℃로 설정된 인큐베이터에서 4일간 보관하였다. 남은 3개는 -80℃의 냉동고 속에서 동일하게 4일간 보관하였다. 각 샘플에 아세토니트릴을 100μL씩 첨가하여 볼텍스로 교반한 후 원심 분리를 행함으로써, 침전물을 얻었다. 생성된 상등액을 회수하고, HPLC 분석을 행하였다.
(19-2) HPLC 분석을 이용한 탈락한 페이로드의 양의 분석
측정은, 액체 크로마토그래피 질량 분석법(탠덤 질량 분석법을 포함한다)을 이용하여, ADC로부터 탈락한 페이로드량을 측정하였다. 실시예 19-1에서 -80℃의 냉동고 속에서 동일하게 4일간 보관한 샘플을 0일째로 하고, 실시예 19-1에서 37℃에서 4일간 인큐베이션한 3개의 샘플을 4일째의 것으로 하고, 4일째 샘플과 0일째 샘플로부터 검출된 페이로드의 MS 강도를 추출 이온 크로마토그램에 의해 각각 산출하고, 그 차이를 해석하였다.
별도 MMAE를 사용하여, HPLC에 의한 TIC의 영역 면적과, 농도의 상관을 산출하였다. 그 계산식을 이용하여 상기 각 ADC의 형광 강도의 TIC를 농도로 변환하였다. Day0의 농도를 100%로 했을 때의, 상기 이온 크로마토그램의 차분의 비율을 탈락율로서 산출하였다.
그 결과, 실시예 7-1, 7-2, 7-3에서 합성한 ADC는 높은 안정성을 갖는 것을 알 수 있었다.
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Claims (26)

  1. 하기 식 (I):
    Figure pct00140

    [식 중,
    Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 개재하여, Ig에 인접하는 L1과 위치 선택적으로 결합하고 있고,
    HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
    RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
    RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
    환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
    R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
    D는, 기능성 물질을 나타내고,
    2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율 r은, 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 항체 및 기능성 물질의 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  2. 제1항에 있어서, 면역 글로불린 단위가 인간 면역 글로불린 단위인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  3. 제2항에 있어서, 인간 면역 글로불린 단위가 인간 IgG 항체인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  4. 제1항에 있어서, 라이신 잔기가, Eu 넘버링에 따르는 위치 246/248위치, 288/290위치, 또는 317위치에 존재하는, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  5. 제1항에 있어서, L1은 카르보닐기를 갖고,
    위치 선택적 결합이, 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기, 및 L1 중의 카르보닐기의 결합에 의한 아미드 결합에 의해 달성되는, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  6. 제1항에 있어서, r이, 1.9 내지 2.1인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  7. 제1항에 있어서, 친수성기가, 카복실산기, 설폰산기, 수산기, 폴리에틸렌글리콜기, 폴리사르코신기, 및 당 부분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트. 또는 그 염.
  8. 제1항에 있어서, 환 A가, 치환기를 갖고 있어도 좋은 페닐렌기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  9. 제1항에 있어서, 기능성 물질이, 의약, 표지 물질 또는 안정화제인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  10. 제1항에 있어서, 상기 위치 선택적인 컨쥬게이트는, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 분석했을 때에, 2.6% 이하의 응집률을 나타내는, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  11. 제1항에 있어서, 식 (I)로 표시되는 구조 단위가, 하기 식 (I'):
    Figure pct00141

    [식 중,
    Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, D, 및 r은, 각각, 식 (I)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
    RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  12. 제11항에 있어서, 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기(-LHG-)가, 하기 식(a):
    -(C(RHG)2)n1-(C=O)n2-(NRHG)n3-(C(RHG)2)n4- (a)
    [식 중,
    복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    n1은, 0 내지 3의 정수이고,
    n2는 0 또는 1의 정수이고,
    n3은 0 또는 1의 정수이고,
    n4는 0 내지 3의 정수이다.]로 표시되는 2가의 기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  13. 제12항에 있어서, 식 (a)로 표시되는 2가의 기가, 하기 식 (a1), (a2), 또는 (a3):
    (a1) -(C(RHG)2)-;
    (a2) -(C(RHG)2)-(C=O)-(NRHG)-(C(RHG)2)-; 또는
    (a3) -(C=O)-(C(RHG)2)2-;
    [식 중,
    복수의 RHG는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 탄소 원자 수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.]로 표시되는 2가의 기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 친수성기가, 각각 독립적으로, 카복실산기, 설폰산기 또는 수산기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  15. 제14항에 있어서, 친수성기가 카복실산기인, 위치 선택적인 컨쥬게이트 또는 그 염.
  16. 하기 식(II):
    Figure pct00142

    [식 중,
    Ig는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 면역 글로불린 단위를 나타내고, 또한, 2개의 중쇄 중의 라이신 잔기의 측쇄 중의 아미노기를 개재하여, Ig에 인접한 L1과 위치 선택적으로 결합하고 있고,
    HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
    RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
    RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
    환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
    R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
    B2는, 생체 직교성 관능기를 나타내고,
    2개의 중쇄당 상기 결합의 평균 비율 r은, 1.5 내지 2.5이다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 생체 직교성 관능기를 위치 선택적으로 갖는 항체 유도체 또는 그 염.
  17. 제16항에 있어서, 생체 직교성 관능기가, 말레이미드 잔기, 티올 잔기, 푸란 잔기, 할로카르보닐 잔기, 알켄 잔기, 알킨 잔기, 아지드 잔기 또는 테트라진 잔기인, 항체 유도체 또는 그 염.
  18. 제16항에 있어서, 식 (II)로 표시되는 구조 단위가, 하기 식 (II'):

    [식 중,
    Ig, RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B2, 및 r은, 각각, 식 (II)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
    RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 구조 단위를 포함하는, 항체 유도체 또는 그 염.
  19. 하기 식(III):
    Figure pct00144

    [식 중,
    HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
    RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
    RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
    환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
    R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
    B1은, 생체 직교성 관능기를 나타내고,
    D는, 기능성 물질을 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기 및 기능성 물질을 갖는 화합물 또는 그 염.
  20. 제19항에 있어서, 식(III)으로 표시되는 화합물이, 하기 식(III'):
    Figure pct00145

    [식 중,
    RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 D는, 각각, 식 (III)으로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
    RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염.
  21. 제19항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는, 항체의 유도체화 시약.
  22. 하기 식(IV):
    Figure pct00146

    [식 중,
    HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
    RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
    RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
    환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
    R1, 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L1, 및 L2는, 각각 독립적으로, 2가의 기를 나타내고,
    B1은, 제1 생체 직교성 관능기를 나타내고,
    B2는, 제2 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 제1 생체 직교성 관능기 및 제2 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염.
  23. 제22항에 있어서, 식 (IV)로 표시되는 구조 단위가, 하기 식 (IV'):
    Figure pct00147

    [식 중,
    RA, RB, 환 A, R1, R2, L1, L2, B1, 및 B2는, 각각, 식 (IV)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
    RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염.
  24. 제22항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하는, 항체 또는 기능성 물질의 유도체화 시약.
  25. 하기 (1), (2), 또는 (3)의 화합물 또는 그 염:
    (1) 하기 식(V):
    Figure pct00148

    [식 중,
    HG는, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하는 1가의 기를 나타내고,
    RA는, 발린 잔기의 측쇄를 나타내고,
    RB는, 시트룰린 잔기, 또는 알라닌 잔기의 측쇄를 나타내고,
    환 A는, 치환기를 갖고 있어도 좋은 2가의 방향족 환기를 나타내고,
    X 및 Y는, 각각 독립적으로, 1가의 기를 나타낸다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염;
    (2) 하기 식(VI):
    Figure pct00149

    [식 중,
    HG, RA, RB, 환 A, 및 X는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
    R2는, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L2는, 2가의 기를 나타내고,
    B2는, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염; 혹은
    (3) 하기 식(VII):
    Figure pct00150

    [식 중,
    HG, RA, RB, 환 A, 및 Y는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
    R1은, 수소 원자, 또는 1가의 기를 나타내고,
    L1은 2가의 기를 나타내고,
    B1은, 생체 직교성 관능기를 나타낸다.]로 표시되는, 생체 직교성 관능기를 갖는 화합물 또는 그 염.
  26. 제25항에 있어서, 상기 (1), (2) 또는 (3)의 화합물이, 각각, 하기 (1'), (2') 또는 (3')의 화합물인, 화합물 또는 그 염:
    (1') 하기 식(V'):
    Figure pct00151

    [식 중,
    RA, RB, 환 A, X 및 Y는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG는, 결합, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 2가의 기를 나타내고,
    RHG1, 및 RHG2는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 친수성기, 또는 친수성기를 포함하고 있어도 좋은 1가의 기를 나타내고,
    적어도 1개의 친수성기가, LHG, RHG1, 및 RHG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 부위에서 포함된다.]로 표시되는 화합물 또는 그 염;
    (2') 하기 식(VI'):
    Figure pct00152

    [식 중,
    RA, RB, 환 A, 및 X는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG, RHG1, 및 RHG2는, 각각, 식 (V')로 표시되는 것과 동일하고,
    R2, L2 및 B2는, 각각, 식 (VI)으로 표시되는 것과 동일하다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염; 혹은
    (3') 하기 식 (VII'):
    Figure pct00153

    [식 중,
    RA, RB, 환 A 및 Y는, 각각, 식 (V)로 표시되는 것과 동일하고,
    LHG, RHG1, 및 RHG2는, 각각, 식 (V')로 표시되는 것과 동일하고,
    R1, L1 및 B1은, 각각, 식 (VII)로 표시되는 것과 동일하다.]로 표시되는, 화합물 또는 그 염.
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