KR20240060975A - 재조합 sod3 단백질의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. HBD partial deletion (CKAA deletion)은 SOD3-WT과 비교시, homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하고, 또한 발현율은 약2배 향상시킬 수 있으며, enzyme activity를 유지시킨다. 또한, R213A, R213G, R213L mutants를 도입함으로써, 기존의 proteolytic cleavage (Furin)로 인한 HBD deletion도 억제할 수 있다. HSA fusion HBD partial deletion(CKAA deletion)은 HSA fusion SOD3-WT과 비교시, Homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하고, 또한 발현율은 약 2배 향상시킬 수 있으며, Enzyme activity도 잘 유지시킬 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
사람의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase ; SOD)는 3가지 유형이 있다. 사람의 SOD1은 세포의 세포질에 이량체(dimer) 형태로 구리 및 아연이 함유되어 기능을 발현하며 구리/아연 에스오디(Cu/Zn SOD)라 불리우고 SOD1 유전자 다형성 중에서 그 어떤 돌연변이체는 근위축성측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis ; ALS)과 관련되어 있다. 그리고 세포의 미토콘드리아에 존재하는 SOD2는 망간 에스오디(Mn SOD)라 불리면서 사량체(tetramer) 형태로 망간이 함유되는 특성을 가지고 있다. SOD3은 세포 바깥족(extra cellular)에서 사량체(tetramer) 형태로 구리와 아연이 함유되어 사람의 여러신체 부위에서 항산화 역할을 한다.
SOD3(Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질은 tetramer로 구성되어 활성을 띄는 것으로 보고가 되어있다. 하지만 해당 단백질은 non-specific interaction 및 disulfide bond로 인하여 High oligomerization이 유도되고, 또한 SOD3의 C-말단의 proteolytic cleavage로 인하여 heterogeneous SOD3가 유도되는 문제점을 가지고 있다.
SOD3의 독립 발현 시, 낮은 발현율로 인해 의약품 개발에 한계를 갖는다. 이에, K41N mutant는 glycosylation을 유도하여 SOD3의 발현율 향상을 유도하는 등 발현율을 향상하기 위한 다양한 연구가 보고되어 있다. 또한 SOD3는 half-life가 짧아 의약품으로써의 개발에 한계가 있고, 이에 HSA를 fusion하여 해결하는 방법으로 연구가 진행되고 있다.
선행기술문헌을 살펴보면 다음과 같다.
특허문헌 1 "EC SOD 및 세포 침투성 EC SOD와 이들의 용도"에는 EC SOD 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있다, (청구항 1) 또한, 인간 EC SOD에서 헤파린 도메인이 제거된 △HD/EC SOD 단백질과 HIV-1 Tat를 융합시킨 융합 단백질을 제조하여 실험에 이용하는 것이 기재되어 있다.(식별번호 [129]) 특허문헌 2 "세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(EC-SOD) 단백질의 세포 투과성을 증가시키는 방법"에는 헤파린 결합 도메인을 포함하는 EC-SOD 단백질과 아연 2가 양이온을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 EC-SOD 단백질의 세포 투과성을 증가시키는 방법이 기재되어 있다.(청구항 1) 특허문헌 3에는 "SOD3를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물"이 기재되어 있다. 살펴보면, C-말단 영역(아미노산 잔기 210번~215번)에 헤파린 결합 도메인(heparin binding domain)을 가지고 있는 SOD3 단백질을 대상으로 하고 있음을 알 수 있다.(식별번호 [0023])
특허문헌 4의 청구항 1에는 "HSA(human serum albumin)를 유효성분으로 포함하는 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(EC-SOD) 단백질 촉매활성 안정화용 조성물로서, 상기 조성물은 EC-SOD와 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물"이 기재되어 있다. 청구항 4에서는 청구항 1의 EC-SOD 가 인간 EC-SOD 유전자인 것을 기재하고 있다. 따라서 본 문헌에서는 HSA와 퓨젼되는 대상으로서의 EC-SOD가 인간 유전자이기 때문에 EC SOD의 헤파린 결합 도메인 변경이나 제거를 의도했다고 볼 수 없다.
특허문헌 5는 식물에서 발현이 최적화되도록 조정된 EC-SOD 유전자에 대한 것이다. 살펴보면, 서열번호 2는 표시되는 담배가 선호하는 코돈으로 변환된 SP와 HBD가 제거된 hEC-SOD의 염기서열이다.(식별번호 [0093]) 특허문헌 6의 청구항 1에는 SOD3를 과발현하는 중간엽 줄기세포가 기재되어 있다. 특허문헌 7의 청구항 1에는 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3, SOD3)를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭이 기재되어 있다. 특허문헌 8의 청구항 1에는 "BSA(bovine serum albumin) 및 FBS(fetal bovine serum)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(EC-SOD) 단백질 안정화용 조성물로서, 상기 조성물은 EC-SOD와 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물."이 기재되어 있다.
특허문헌 9에는 헤파린 결합 도메인이 제거된 재조합 EC SOD(extracellular superoxide dismutase) 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다.
특허문헌 10의 청구항 1에는 "세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(EC-SOD) 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 HSA(human serum albumin) 단백질을 접합시키는 단계를 포함하는 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(EC-SOD) 단백질의 안정화 방법"이 기재되어 있다. EC-SOD에 대한 기재를 살펴보면, 기본적으로 C-말단 영역(아미노산 잔기 210번~215번)에 헤파린 결합 도메인(heparin binding domain)을 가지고 있는 것으로 기재하고 있으며(식별번호 [0047]), 또한 청구항 3에 기재된 서열번호 9, 서열번호 22는 각각 서열번호 5의 19-240 fragment, 서열번호 7의 19-240 fragment이기 때문에 헤파린 결합 도메인을 포함하게 된다.(식별번호 [0048], 서열목록)
1. "The heparin-binding domain of extracellular superoxide dismutase is proteolytically processed intracellularly during biosynthesis" (J Biol Chem. 1999 May 21;274(21):14818-22.)
해결과제는, SOD3 단백질 생산시 발생되는 High oligomerization, proteolytic cleavage, 낮은 발현율을 해결하는 것이다.
해결수단 1은, 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법이다.
해결수단 2는, 상기 해결수단 1에서, R213G, R213A 또는 R213L 변이 중 어느 하나의 변이를 일으키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법이다.
해결수단 3은, 상기 해결수단 1에서, HSA(Human serum albumin)를 접합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법이다.
해결수단 4는, 상기 해결수단 2에서, HSA(Human serum albumin)를 접합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법이다.
해결수단 5는, 상기 해결수단 3에서, R213G, R213A 또는 R213L 변이 중 어느 하나의 변이를 일으키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법이다.
해결수단 6은, 상기 해결수단 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에 의하여 생산된 재조합 SOD3 단백질이다.
해결수단 7은, 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 발현 촉진 방법이다.
해결수단 8은, 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 안정화 방법이다.
본 발명의 효과는 다음과 같다 : HBD partial deletion (CKAA deletion)은 SOD3-WT과 비교시, homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하고, 또한 발현율은 약2배 향상시킬 수 있으며, enzyme activity를 유지시킨다. 또한, R213A, R213G, R213L mutants를 도입함으로써, 기존의 proteolytic cleavage (Furin)로 인한 HBD deletion도 억제할 수 있다.
본 발명의 효과는 다음과 같다 : HSA fusion HBD partial deletion(CKAA deletion)은 HSA fusion SOD3-WT과 비교시, Homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하고, 또한 발현율은 약 2배 향상시킬 수 있으며, Enzyme activity도 잘 유지시킬 수 있다.
도 1 및 2는 SOD3-CKAA deletion의 Expression test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3은 SOD3-CKAA deletion의 Tetramer formation test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4는 SOD3-CKAA deletion의 Proteolytic cleavage inhibition test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5는 SOD3-CKAA deletion의 Enzyme activity test 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6 및 7은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Expression test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Tetramer formation test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9 및 10은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Enzyme activity test 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6 및 7은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Expression test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Tetramer formation test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9 및 10은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Enzyme activity test 결과를 나타내는 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험, 실시예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. SOD3-CKAA deletion Construction and Test
1) SOD3-CKAA deletion Construction
하기의 표 1을 보면, SOD3 서열정보가 표시되어 있다. SOD3의 C-말단 HBD(Heparin binding domain) "RKKRRRESECKAA" , 그 뒤의 Linker "GGGGS", 그 뒤의 Histag "HHHHHH"를 확인할 수 있다.
① partial HBD : CKAA deletion
; HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"가 갖는 partial HBD SOD3가 형성된다.
② partial HBD - point mutation : CKAA deletion - R213G
; HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK G RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3가 형성된다.
③ partial HBD - point mutation : CKAA deletion - R213A
; HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK A RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3가 형성된다.
④ partial HBD - point mutation : CKAA deletion - R213L
; HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK L RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3가 형성된다.
| 구분 | 서열정보 |
| SOD3 | WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRAKLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKRRRESECKAAGGGGSHHHHHH |
| SOD3-CKAA deletion-WT | WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKRRRESEGGGGSHHHHHH |
| SOD3-CKAA deletion -R213G |
WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKGRRESEGGGGSHHHHHH |
| SOD3-CKAA deletion -R213A |
WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKARRESEGGGGSHHHHHH |
| SOD3-CKAA deletion -R213L |
WTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENGNAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKLRRESEGGGGSHHHHHH |
2) SOD3-CKAA deletion Test
① Expression test
도 1 및 2는 SOD3-CKAA deletion의 Expression test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1은 SDS-PAGE 분석 그래프이고, 도 2는 단백질 발현 수율 분석 그래프이다.
살펴보면, SOD3-WT 에서는 high oligomerization 패턴이 확인되었다. 그러나 SOD3-HBD_deletion(HBD 완전 제거) 및 partial deletion에서는 High oligomerization이 확인되지 않았다. 또한 Partial deletion construction은 약 2배 이상 발현율이 향상되는 것을 확인하였다.
② Tetramer formation test
도 3은 SOD3-CKAA deletion의 Tetramer formation test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3은 SE-HPLC 분석 그래프이다.
살펴보면, SOD3-WT에서는 high oligomerization 패턴이 확인되었으나, SOD3-HBD_deletion 및 partial deletion에서는 High oligomerization 확인되지 않고, homogenous tetramer가 형성되는 것을 확인하였다.
③ Proteolytic cleavage inhibition test
도 4는 SOD3-CKAA deletion의 Proteolytic cleavage inhibition test 결과를 나타내는 그래프이다.
SOD3의 HBD는 Furin 에 의해 proteolytic cleavage 가 일어난다. 이에 따라 재조합 SOD3 생산 시, heterogeneous SOD3가 생산된다. R213G는 Furin cleavage를 저해하는 mutant로 보고가 되었다. (비특허 1 참조)
살펴보면, In silico library를 통해 도입한 R213L, R213A도 Furin cleavage가 일어나지 않음을 확인하였다.
④ Enzyme activity test
도 5는 SOD3-CKAA deletion의 Enzyme activity test 결과를 나타내는 그래프이다.
살펴보면, SOD3-HBD deletion construct 는 활성이 약 70% 감소되었으나, SOD3-CKAA deletion variants 는 SOD3-WT과 유사 활성 갖는 것을 확인하였다.
3) 평가 분석 고찰
SOD3는 tetramer를 형성함으로써, 기능을 유지하는 것으로 알려져 있다. SOD3의 HBD (Heparin binding domain)는 heparin binding과 disulfide bridge를 통한 SOD3 interaction의 기능을 갖는다.
그러나 재조합 SOD3를 생산함에 있어, HBD는 disulfide bridge로 인한 high oligomerization을 유도 하여 heterogeneous protein이 생산된다. 또한, proteolytic cleavage (Furin)로 인한 HBD deletion으로 heterogeneous protein이 생산된다. 해당 문제를 해결하기 위해, HBD deletion construct와 HBD partial deletion (CKAA deletion) constructs를 디자인하였다.
HBD deletion construct 은 SOD3-WT 과 비교시, homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하였다. 그러나 발현율 및 enzyme activity가 감소함을 확인하였다.
HBD partial deletion (CKAA deletion)은 SOD3-WT과 비교시, homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하였고, 또한 발현율은 약2배 향상되었으며, enzyme activity는 유지되는 것을 확인하였다. 또한 R213A, R213G와 R213L mutants를 도입함으로써, 기존의 proteolytic cleavage (Furin)로 인한 HBD deletion도 억제할 수 있었다.
실시예 2. HSA-SOD3-CKAA deletion Construction and Test
1) HSA-SOD3-CKAA deletion Construction
① HSA - partial HBD : HSA - CKAA deletion
; HSA(Human serum albumin)
"ASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSAS", HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE" 를 갖는 SOD3, Linker "GGGGS", Histag "HHHHHH"를 확인할 수 있다.
② HSA - partial HBD - point mutation : HSA - CKAA deletion - R213G
③ HSA - partial HBD - point mutation : HSA - CKAA deletion - R213A
④ HSA - partial HBD - point mutation : HSA - CKAA deletion - R213L
| 구분 | 서열정보 |
| HSA- SOD3-CKAA deletion-WT |
ASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSASWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENG NAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKRRRESEGGGGSHHHHHH |
| HSA- SOD3-CKAA deletion -R213G |
ASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSASWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENG NAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKGRRESEGGGGSHHHHHH |
| HSA- SOD3-CKAA deletion -R213A |
ASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSASWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENG NAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKARRESEGGGGSHHHHHH |
| HSA- SOD3-CKAA deletion -R213L |
ASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSASWTGEDSAEPNSDSAEWIRDMYANVTEIWQEVMQRRDDDGALHAACQVQPSATLDAAQPRVTGVVLFRQLAPRANLDAFFALEGFPTEPNSSSRAIHVHQFGDLSQGCESTGPHYNPLAVPHPQHPGDFGNFAVRDGSLWRYRAGLAASLAGPHSIVCRAVVVHAGEDDLGRGGNQASVENG NAGRRLACCVVGVCGPGLWERQAREHSERKKLRRESEGGGGSHHHHHH |
2) HSA-SOD3-CKAA deletion Test
① Expression test
도 6 및 7은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Expression test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6은 SDS-PAGE 분석 그래프이고, 도 7은 단백질 발현 수율 분석 그래프이다.
살펴보면, HSA-SOD3-WT 에서는 high oligomerization 패턴이 확인되었다. 그러나 HSA-SOD3-HBD_deletion(HBD 완전 제거) 및 HSA-partial deletion에서는 High oligomerization이 확인되지 않았다.
또한 HSA-Partial deletion construction은 약 2배 이상 발현율이 향상되는 것을 확인하였다.
② Tetramer formation test
도 8은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Tetramer formation test 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8은 SE-HPLC 분석 그래프이다.
살펴보면, HSA-SOD3-WT에서는 high oligomerization 패턴이 확인되었으나, HSA- SOD3-HBD_deletion 및 HSA-partial deletion에서는 High oligomerization이 확인되지 않고, homogenous tetramer가 형성되는 것을 확인하였다.
③ Enzyme activity test
도 9 및 도 10은 HSA-SOD3-CKAA deletion의 Enzyme activity test 결과를 나타내는 그래프이다.
살펴보면, HBD deletion constructs는 활성이 약 70% 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 SOD3-CKAA-deletion와 HSA-SOD3-CKAA-deletion construct는 SOD3-WT 과 유사활성을 갖는 것을 확인하였다.
또한 HSA-SOD3-HBD deletion construct는 활성이 약 70% 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 HSA-SOD3-CKAA deletion variants는 SOD3-WT과 유사 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한 HSA-SOD3-CKAA deletion variants는 HSA-SOD3-WT과 유사 활성 갖는 것을 확인하였다.
3) 평가 분석 고찰
의약품 개발을 목적으로, 안정성 및 Half-life 증가를 위해 HSA(Human serum albumin) fusion HBD deletion construct와 HSA fusion HBD partial deletion(CKAA deletion) Construct를 디자인하였다.
HSA fusion HBD deletion construct은 HSA fusion SOD3-WT 과 비교시, 약 80% Homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하였다. 하지만, 발현율 및 Enzyme activity가 감소되는 것을 확인하였다.
그러나 HSA fusion HBD partial deletion(CKAA deletion)은 HSA fusion SOD3-WT과 비교시, Homogeneous tetramer 형태의 SOD3 생산이 가능하였고, 또한 발현율은 약 2배 향상되었 으며, Enzyme activity도 잘 유지되는 것을 확인 하였다.
실시예 3. 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법
1) 상기 실시예 1에 따라, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법은, ① partial HBD(CKAA deletion) 형성단계 : HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"가 갖는 partial HBD SOD3를 형성하는 단계, ② partial HBD - point mutation(CKAA deletion - R213G) 형성단계 : HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK G RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3를 형성하는 단계, ③ partial HBD - point mutation(CKAA deletion - R213A) : HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK A RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3를 형성하는 단계, ④ partial HBD - point mutation(CKAA deletion - R213L) : HBD(Heparin binding domain)의 219-222AA(CKAA) 제거된 partial HBD인 "RKKRRRESE"에서 R213 mutant 처리하여 "RKK L RRESE"가 형성된 partial HBD & point mutation SOD3를 형성하는 단계를 선택적으로 포함한다.
2) 상기 실시예 2에 따라, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법은, ① HSA - partial HBD(HSA - CKAA deletion) 형성 단계, ② HSA - partial HBD - point mutation(HSA - CKAA deletion - R213G) 형성 단계, ③ HSA - partial HBD - point mutation(HSA - CKAA deletion - R213A) 형성 단계, ④ HSA - partial HBD - point mutation(HSA - CKAA deletion - R213L) 형성 단계를 선택적으로 포함한다.
실시예 4. 재조합 SOD3 단백질의 발현 촉진 방법
상기 실시예 1, 2, 3에 근거한다.
실시예 5. 재조합 SOD3 단백질의 안정화 방법
상기 실시예 1, 2, 3에 근거한다.
실시예 6. 실시예 3, 4, 5의 방법에 따라 생산된 SOD3 단백질
실시예 6는 상기 실시예 3의 생산 방법에 따라 생산된 SOD3 단백질이다.
Claims (8)
- 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법.
- 청구항 1에 있어서,
R213G, R213A 또는 R213L 변이 중 어느 하나의 변이를 일으키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법. - 청구항 1에 있어서,
HSA(Human serum albumin)를 접합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법. - 청구항 2에 있어서,
HSA(Human serum albumin)를 접합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법. - 청구항 3에 있어서,
R213G, R213A 또는 R213L 변이 중 어느 하나의 변이를 일으키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 SOD3 단백질의 생산 방법. - 청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에 의하여 생산된 재조합 SOD3 단백질.
- 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 발현 촉진 방법.
- 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD3, Extracellular superoxide dismutase 3) 단백질의 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin binding domain) 중 219-229 아미노잔 잔기를 제거하는 단계를 포함하는, 재조합 SOD3 단백질의 안정화 방법.
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| KR100676502B1 (ko) | 2003-10-31 | 2007-02-02 | 김태윤 | Ｅｃ ｓｏｄ 및 세포 침투성 ｅｃ ｓｏｄ와 이들의 용도 |
| KR101019470B1 (ko) | 2007-03-22 | 2011-03-07 | 신동헌 | Ｅｃ ｓｏｄ 단백질을 유효성분으로 하는 혈관신생에 의한질병의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR101749665B1 (ko) | 2014-10-21 | 2017-06-21 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(ec-sod) 단백질 안정화용 조성물 및 이를 이용한 ec-sod 안정화 방법 |
| KR101815317B1 (ko) | 2015-05-26 | 2018-01-30 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(ec-sod) 단백질 안정화용 조성물 및 이를 이용한 ec-sod 안정화 방법 |
| KR102245312B1 (ko) | 2015-09-15 | 2021-05-27 | 주식회사 강스템바이오텍 | Sod3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR101774931B1 (ko) | 2015-10-14 | 2017-09-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 식물에서의 발현이 최적화된 재조합 ec-sod 유전자와 이를 이용한 재조합 ec-sod 단백질의 대량 생산 방법 |
| KR101898198B1 (ko) | 2016-09-01 | 2018-09-12 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(ec-sod) 단백질의 세포 투과성을 증가시키는 방법 |
| KR101966330B1 (ko) | 2017-05-18 | 2019-04-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Sod3를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR102223576B1 (ko) | 2017-09-22 | 2021-03-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | N 말단 또는 c 말단의 알부민 접합을 이용한 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈(ec-sod) 단백질의 안정화 방법 |
| KR20210066005A (ko) | 2018-10-25 | 2021-06-04 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Sod3를 과발현시킨 줄기세포 유래 세포외 소낭의 신규한 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. "The heparin-binding domain of extracellular superoxide dismutase is proteolytically processed intracellularly during biosynthesis" (J Biol Chem. 1999 May 21;274(21):14818-22.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024096540A1 (ko) | 2024-05-10 |
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