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KR20240051277A - PD-L1, CD137, 및/또는 TGFβ에 대한 이중특이체 및 삼중특이체 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

PD-L1, CD137, 및/또는 TGFβ에 대한 이중특이체 및 삼중특이체 결합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240051277A
KR20240051277A KR1020247011119A KR20247011119A KR20240051277A KR 20240051277 A KR20240051277 A KR 20240051277A KR 1020247011119 A KR1020247011119 A KR 1020247011119A KR 20247011119 A KR20247011119 A KR 20247011119A KR 20240051277 A KR20240051277 A KR 20240051277A
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하이춘 후앙
익 로이
창 훙 첸
한 리
디 센
밍 레이
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노바록 바이오테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 개시는 PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/CD137 이중특이체), PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ 이중특이체), PD-L1, TGFβ 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체), 및 CD137, TGFβ 및 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체)을 제공한다. 본 개시는 또한 이들 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 및 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

PD-L1, CD137, 및/또는 TGFβ에 대한 이중특이체 및 삼중특이체 결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 국제 특허 출원은 2021년 9월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/240,404호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본을 대신하여 XML 포맷으로 제공되며, 이는 본 명세서에 참조로서 통합된다. 상기 서열 목록이 포함된 XLM 파일의 명칭은 122863-5008_Sequence_Listing_ST.26.xml이다. 상기 텍스트 파일의 크기는 약 108000 바이트이며, 이는 2022년 8월 28일 또는 그 즈음에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술 분야
본 개시는 면역요법 분야에 포함되며, PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/CD137 이중특이체), PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ 이중특이체), 및 PD-L1, TGFβ, 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체)에 관한 것이다. 본 개시는 또한 CD137, TGFβ, 및 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체)에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이들 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이를 생산하는 세포에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이들 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 및 면역요법을 위해 PD-1/PD-L1 축 및/또는 CD137 축을 조절하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
면역 관문은 자가 내성을 유지하면서 면역 반응의 내구성을 조절하고 제어하기 위해 면역 세포가 보유하는 억제 경로 세트를 지칭한다. 종양 미세환경에서의 면역 관문 분자(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, Lag-3, VISTA, B7-H3, TIGIT, CD73, LAIR1)의 상향 조절은 효과기 T 세포의 항종양 활성을 제한하는 중요한 메커니즘으로서 인식된다.
프로그램된 세포 사멸-1(PD-1)은 암 면역요법을 위해 표적화된 주요 면역 T 세포 수용체 관문 수용체 중 하나이다. PD-1 및 이의 리간드인 프로그램된 사멸 리간드-1와 프로그램된 사멸 리간드-2(각각 PD-L1 및 PD-L2)는 T 세포 활성화, 내성 및 면역병리학 간의 균형을 조절하는 공동 억제 인자로서 작용한다. 암이 없는 경우, PD-1/PD-L1 축은 정상 조직에서 과도한 염증을 방지하는 기능을 하며, 자가 항원에 대한 면역 내성을 유지하는 데 도움이 된다. 암이 존재하는 경우, PD-1 경로는 종양 및 말초 조직 둘 모두에서 종양 면역 내성의 주요 메커니즘을 제공하도록 전복된다. 축은 종양 세포 생존을 강화시킴으로써 암 발생 및 진행을 촉진하도록 용도가 변경된다.
PD-l 리간드, PD-L1(분화 클러스터 274(CD274)로도 알려짐) 또는 B7 상동체 1(B7-H1), 및 PD-L2(B7-DC 또는 CD273으로도 알려짐)는 일반적으로 수지상 세포 또는 대식세포의 표면 상에서 발현된다. PD-L1은 또한 종양 미세환경(TME)에서 종양 세포 또는 비형질전환 세포에서 과발현된다. PD-1의 PD-L1과의 상호작용은 T 세포 수용체(TCR) 신호전달 및 CD28 공동 자극의 억제를 초래하며, 궁극적으로 T 세포 불활성화 및 증식 능력의 상실을 초래한다. 종양 미세환경에서의 PD-L1 발현은 암세포가 PD-1/PD-L1 관문 경로를 회피 메커니즘으로서 활용하여 환자의 항원 특이적 T 세포 면역 반응을 예방하거나 피할 수 있게 한다.
PD-1 수용체 또는 이의 리간드를 항체로 차단하게 되면 암세포의 회피 전략이 상실되고 항종양 면역 반응이 강화되거나 촉진된다. 현재까지, 6개의 PD-1/PD-L1 면역 관문 억제제(ICI)가 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 취득하였다: 3개의 PD-1 억제제(니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 세미플리맙), 및 3개의 PD-L1 억제제(아테졸리주맙, 두발루맙, 및 아벨루맙).
면역 반응의 PD-1/PD-L1 관문 억제를 무효화하기 위한 치료 단클론 항체를 이용한 암 면역요법은 광범위한 악성 종양의 치료에 혁신을 가져왔다. 그러나, 일부 초기 반응자는 결과적으로 단일요법에 대한 획득 내성을 나타내고 재발성 질환을 경험하며, 상당한 수의 환자는 일차 내성을 나타내고 PD-1/PD-L1 면역 관문 차단에 반응하지 않는다. 관문 억제제 요법 내성에 대한 보고된 유병률을 고려 시, 불응성 또는 재발성 암 환자를 위한 추가 치료제에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
CD137(4-1BB 또는 TNFRSF9)은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. CD137은 선천성 및 적응성 면역 세포 둘 모두에서 발현한다. 이는 종양 미세환경(TME)에서 다면적인 역할을 한다. 이는 TME 중 T 세포 상에서 일반적으로 상향조절되고, CD8 및 CD4 T 세포 활성화, 증식 및 생존에 대한 공동 자극을 제공한다. 이는 또한, TME에서의 다른 세포 기능, 예컨대 NK 세포의 CD8 T 세포와의 상호작용 촉진, 및 DC 세포 상에서의 종양 항원 제시 향상을 조절한다. CD137 작용제는 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있으며, PD1/PD-L1 차단 항체를 포함하는, 다른 항종양 제제와 상승적으로 작용할 수 있다.
TGFβ의 분비는 면역 회피 및 종양 진행에 대한 또 다른 주요 기여자이다. TGFβ는 T 세포 증식을 방지함으로써 종양 진행 및 면역 억제를 촉진하고 T 세포 및 NK 세포 둘 모두의 효과기 기능을 감소시킨다. 이는 또한 T 조절 세포의 기능을 향상시키고 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도한다.
PD1, CD137, 및 TGFβ는 독립적으로 면역 억제 또는 면역 자극 경로를 조절하기 때문에, PD1 및 CD137, PD1 및 TGFβ를 표적화하거나, PD1, CD137 및 TGFβ를 표적화하는 것은 특히 면역 배제 및 면역 결핍 종양에 대한 항종양 효능을 증가시킬 가능성이 있다.
본 개시는, 예를 들어 PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/CD137 이중특이체), PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ 이중특이체), 및 PD-L1, TGFβ, 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체)을 포함하는 다중특이체 결합 단백질을 제공함으로써 전술한 니즈를 해결한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질이며: (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷(예를 들어, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Y-형 대칭 또는 비대칭 항체)의 항체 스캐폴드 모듈; (b) CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질이며: (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈, 및 (c) CD137에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함하는 결합 단백질이다.
본 개시는 또한 CD137, TGFβ, 및 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체)을 포함하는, 인간 CD137에 결합하는 결합 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 CD137에 결합하는 결합 단백질, 및 CD137을 자극하고 지속적인 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 예시적인 일 구현예에서, 결합 단백질은 CD137에 결합할 수 있으며, CD137에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 (a) CD137에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈, 및 (c) PD-L1에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함하는 결합 단백질이다.
PD-1/PD-L1 차단제의 사용에 기인하는 면역요법의 발전에도 불구하고, PD-L1 및 T 세포 상의 공자극 표적 둘 모두에 결합하고/하거나 TGFβ를 중화시킴으로써 종양 미세환경에서의 면역억제를 역전시킬 수 있는 단백질에 대한 필요성이 존재한다. 3개의 TGFβ 이소형인 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3은 많은 종양에서 높게 발현되며, 이는 주로 선천성 및 적응성 면역 시스템 모두를 억제함으로써 암 진행을 촉진한다. 그리고 이들의 혈청 농도는 불량한 예후와 상관된다. 종양 미세환경에서, TGFβ는 기질 변형, 혈관형성, 및 상피-중간엽 전이(EMT)의 유도에 의해 종양 진행을 촉진한다. TGFβ 신호전달은 Treg 세포의 분화를 유도하고 골수 세포를 통한 전이를 유도한다. 또한, TGFβ1은 T 세포 및 NK 세포 기능을 직접적으로 억제할 수 있다.
결합 단백질은 단일 항원의 2개 또는 3개의 에피토프 또는 하나 초과의 표적 항원에 동시에 결합함으로써, 단일특이적 치료 항체 또는 융합 단백질에 의해 달성될 수 없는 다수의 기계적 기능 및 잠재적 상승 효과를 발휘할 수 있다. 유리하게는, 2개 또는 3개의 항원에 결합하는 결합 단백질의 사용은 다수의 치료제의 사용과 연관된 위험성보다 낮은 독성 위험성을 가질 수 있다.
대체적으로, 본원에 개시된 본 개시의 이중특이체 및 삼중특이체는 중쇄 이종이량체화를 촉진하기 위한 변형이 있거나 없는 천연 IgG 스캐폴드에 기초하며, 항체 Fab 또는 scFv 단편 및/또는 IgG 스캐폴드에서 IgG 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 첨부된 TGFβRII 수용체의 세포외 도메인(ECD)으로부터 제조된 융합 단백질로부터 유래된 항원 결합 부위에 의해 기인하는 2개 또는 3개의 결합 특이성(예를 들어, PD-L1, CD137 및/또는 TGFβ)을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체, PD-L1/TGFβ 이중특이체 또는 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) scFv 포맷의 항-CD137을 갖거나,
(b) scFv 포맷의 항-PD-L1을 갖거나.
(c) IgG 스캐폴드에서 항체 경쇄의 N-말단에 융합된 scFv를 갖거나,
(d) IgG 스캐폴드에서 항체 중쇄의 N-말단에 융합된 scFv를 갖거나,
(e) IgG 스캐폴드에서 항체 경쇄의 C-말단에 융합된 scFv를 갖거나,
(f) IgG 스캐폴드에서 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 scFv를 갖거나,
(g) 1가 또는 2가 포맷으로 존재하는 CD137의 scFv를 갖거나,
(h) IgG 스캐폴드에서 경쇄의 C-말단에 융합된 인간 TGFβRII를 함유하거나,
(i) IgG 스캐폴드에서 중쇄의 C-말단에 융합된 인간 TGFβRII를 함유한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체, PD-L1/TGFβ 이중특이체, 및 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 고갈된 PD-1+ CD8 T 세포를 표적화하고 기능장애 종양 침윤 림프구(TIL)를 재활성화하는 면역요법을 제공한다. PD-L1에 결합하는 이러한 결합 단백질은 PD-1/PD-L1 내성에 기여하는 고갈된 TCD8+ 세포 및/또는 조절 T 세포가 풍부한 미세환경을 특징으로 하는 고형 종양에서의 치료제로서 특히 유익할 수 있다. 실제로, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 차단은 TME에 존재하는 면역억제 신호를 감소시키고 항종양 면역을 향상시키며, 이는 결과적으로 환자 생존을 연장시키는 지속적인 임상 반응을 생성한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 본 개시된 결합 단백질은 PD-L1 및 CD137 또는 인간 TGFβ에 이중특이체인, 4가 분자이다.
다른 구현예에서, PD-L1에 결합하는 본 개시된 결합 단백질은 PD-L1 및 CD137와 인간 TGFβ 둘 모두에 특이적인 분자이다.
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 종양 미세환경에서 CD137 발현 면역 세포를 표적화하는 면역요법을 제공하도록 설계된다. CD137에 결합하는 결합 단백질은 고형 종양에서의 치료제로서 특히 유익할 수 있다. 실제로, CD137 신호전달 축의 활성화은 TME에 존재하는 T 효과기 기능을 향상시키고 항종양 면역을 향상시킬 것이며, 이는 결과적으로 환자 생존을 연장시키는, 지속적인 임상 반응을 생성할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시된 결합 단백질은 CD137 및 PD-L1과 인간 TGFβ 둘 모두에 결합한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시된 PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 1 및 3으로부터 선택되는 항-PD-L1 항체 중쇄(HC) 가변 영역 서열의 3개의 CDR 및 서열번호 2 및 4로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열의 3개의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 서열 세트를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은, CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 다음의 조합으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(b) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 다음을 포함한다:
(a) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(b) CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 여기에서 제1 및 제2 항원 결합 부위는 PD-L1에 결합하고, 항체 스캐폴드 모듈은:
(i) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열; 또는
(ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 여기에서 제1 및 제2 항원 결합 부위는 PD-L1에 결합하고, 항체 스캐폴드 모듈은:
서열번호 45에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 표 1에 개시된 하나 이상의 중쇄 가변 영역 CDR 및/또는 표 2에 개시된 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1에 특이적이거나,
(b) 시노몰구스 PD-L1과 교차 반응하거나,
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해하거나,
(d) T 세포의 PD-1/PD-L1 관문 매개 억제를 억제-해제함.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 내인성 수준의 PD-L1을 발현하는 인간 세포 및 인간 PD-L1을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 특이적으로 결합한다. PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 또한 나노몰 수준의 EC50 값으로 인간 또는 시노몰구스 PD-L1을 과발현하는 세포에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 시노몰구스 원숭이 PD-L1(cynoPD-L1)과 교차 반응하고, 마우스 PD-L1(mu-PD-L1)에 대한 교차 반응성 결합을 나타내지 않는다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 인간 PD-1/PD-L1 결합 상호작용을 파괴한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 T 세포의 PD-1/PD-L1 관문 매개 억제를 억제-해제하지 않는다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 T 세포의 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하는 FcgR과의 가교 결합 활성을 제거/최소화하도록 조작된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 PD-L1에 결합하는 전술한 결합 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 전술한 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 PD-L1에 결합하는 결합 단백질 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 PD-L1에 결합하는 본 개시된 결합 단백질 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, CD137에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 16, 18, 및 20으로부터 선택되는 항-CD137 항체 중쇄(HC) 가변 영역 서열의 3개의 CDR 및 서열번호 17, 19, 및 21로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열의 3개의 CDR로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 서열 세트를 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은, CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 16, 18, 또는 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 또는 서열번호 16, 18, 또는 20과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 17, 19, 또는 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 또는 서열번호 17, 19, 또는 21과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 서열번호 16, 18, 또는 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 17, 19, 또는 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합하는 결합 단백질은 다음의 조합으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열;
(b) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 및
(c) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 이는:
(a) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(c) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 여기에서 제1 및 제2 항원 결합 부위는 CD137에 결합하고, 항체 스캐폴드 모듈은:
(i) 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열;
(ii) 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열; 또는
(iii) 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질이 제공되며, 여기에서 제1 및 제2 항원 결합 부위는 CD137에 결합하고, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 75에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호 76에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD137 항체는 표 3에 개시된 하나 이상의 중쇄 가변 영역 CDR 및/또는 표 4에 개시된 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 CD137에 특이적이거나,
(b) 시노몰구스 CD137과 교차 반응하거나,
(c) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나,
(d) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나;
(e) CD137 신호전달을 위한 가교 결합 의존성 작용제 활성을 보유하거나,
(f) 가교 결합 의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 내인성 수준의 CD137을 발현하는 인간 세포 및 인간 CD137을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 0.2 내지 1.1 nM의 범위(예를 들어, 0.2 nM, 0.3 nM, 0.4 nM, 0.5 nM, 0.6 nM, 0.7 nM, 0.8 nM, 0.9 nM, 1.0 nM 또는 1.1 nM)의 EC50 값으로 인간 또는 시노몰구스 CD137을 과발현하는 세포에 결합한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 신속 온 및 신속 오프 동역학 특성을 갖는다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 시노몰구스 원숭이 CD137(cynoPD-L1)과 교차 반응하고, 마우스 CD137(mu-CD137)에 대한 교차 반응성 결합을 나타내지 않는다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 CD137 리간드/CD137 결합 상호작용을 파괴한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 CD137 신호전달에 대한 가교 결합 의존성 작용제 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 가교 결합 의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 T 세포의 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하는 FcgR과의 가교 결합 활성을 제거/최소화하도록 조작된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 CD137에 결합하는 전술한 결합 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 전술한 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 CD137에 결합하는 결합 단백질 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 CD137에 결합하는 본 개시된 결합 단백질 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질이며: (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 42에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 45에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 하나의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 2개의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 항체 스캐폴드 모듈을 가지며, 이는 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 인터링커는 서열번호 58에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 인터링커는 서열번호 59에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체에 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 scFv이며, 여기에서 서열은 직접 또는 scFv 융합 링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 글리신 및 세린을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Ser를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트이다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 59에 제시된 서열 세트를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 59에 제시된 서열 세트이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은 서열번호 56에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 제1 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 38에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 44에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 45에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 46에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 47에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 50에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 적어도 하나의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역의 Fc 침묵 돌연변이는 L234AL235A 또는 N297A이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, PD-L1/CD137 이중특이체(예를 들어, 1923Ab8, 1923Ab11, 1923Ab12, 1923Ab13, 및 1923Ab18)는 PD-L1과 이의 수용체 PD-1 간의 상호작용 및 CD137과 이의 리간드 간의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다. 본 개시된 PD-L1/CD137 이중특이체는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈로서 본원에 개시된 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab2 또는 1923Ab3) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열 및 CD137 제1 결합 모듈로서 본원에 개시된 CD137에 결합하는 결합단백질(예를 들어, 1923Ab4, 1923Ab5 또는 1923Ab6) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 PD-L1에 결합하고 PD-1/PD-L1 결합 상호작용을 파괴하고 T 세포의 PD-1/PD-L1 관문 매개 억제를 억제-해제하는 결합 단백질을 포함한다. 본원에서 예시된 바와 같이, 비제한적인 예에서, PD-L1에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 단쇄 가변 단편(예를 들어, 링커 펩티드와 연결된 PD-L1에 결합하는, 본 개시된 결합 단백질 중 하나의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질)(scFv)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 CD137에 결합하는 본 개시된 결합 단백질 중 하나로부터 유래된 단편으로 이루어진 CD137-결합 모듈을 포함한다. 일 구현예에서, CD137 결합 모듈은 본원에 개시된 CD137에 결합하는 결합 단백질 중 하나로부터 유래된 결합 단편의 형태일 수 있다. 본원에서 예시된 바와 같이, 비제한적인 예에서, CD137 결합 모듈은 단쇄 가변 단편(예를 들어, 링커 펩티드와 연결된, CD137에 결합하는, 본 개시된 결합 단백질 중 하나의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질)을 포함할 수 있다. 대안적으로, CD137 결합 모듈은 IgG 분자의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab8은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬을 포함하는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 2개의 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 부착된 1923Ab4로부터 유래된 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)(서열번호 53)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab11은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬을 포함하는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 2개의 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 부착된 1923Ab4로부터 유래된 scFv 단편(VL이 VH에 선행함)(서열번호 54)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab12는 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 Fab의 경쇄 각각의 N-말단에 부착된 1923Ab4로부터 유래된, 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)(서열번호 56)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab13은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 Fab의 중쇄 각각의 N-말단에 부착된 1923Ab4로부터 유래된, 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)(서열번호 56)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab18은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬을 포함하는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 부착된 1923Ab4로부터 유래된, 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)(서열번호 55)을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 다음의 조합으로부터 선택되는 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 38을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 서열;
(b) 서열번호 44를 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 서열;
(c) 서열번호 45를 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 46을 포함하는 경쇄 서열;
(d) 서열번호 47을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 서열; 및
(e) 서열번호 50을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40를 포함하는 경쇄 서열.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 서열번호 38, 42, 44, 45, 47, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 또는 서열번호 38, 42, 44, 45, 47, 또는 50과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 서열번호 40 및 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열, 또는 서열번호 40 또는 46과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 단편 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, CD137 결합 모듈은 CD137/CD137 리간드 상호작용을 차단하고, CD137 신호전달 및 T 세포 활성화에 대한 가교 결합 의존성 작용 활성을 갖는 scFv 서브유닛이다. 일부 구현예에서, CD137 결합 모듈은 이황화 결합으로 안정화된 scFv 서브유닛이다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는, CD137 scFv 결합 모듈이 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합되어 PD-L1/CD137 이중특이체를 생성하는 IgG 포맷을 갖는, 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/CD137 이중특이체는, T 세포의 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하는 FcR과의 가교 결합 활성을 제거/최소화하도록 조작된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 PD-L1/CD137 이중특이체 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 본 개시된 PD-L1/CD137 이중특이체 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/CD137 이중특이체 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/CD137 이중특이체 서열 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/CD137 이중특이체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/CD137 이중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/CD137 이중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 전술한 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질이며: (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 42에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 45에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 하나의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 2개의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 항체 스캐폴드 모듈을 가지며, 이는 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 인터링커는 서열번호 58에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 인터링커는 서열번호 59에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체에 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, TGFβRII 서열의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시되어 있다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 2개의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하며, 여기에서 PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은, N-말단에서 C-말단으로, 서열번호 40에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서,PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 적어도 하나의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역의 Fc 침묵 돌연변이는 L234A L235A 또는 N297A이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시는 PD-L1과 이의 수용체 PD-1 및 격리자 TGFβ 사이의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있는 PD-L1/TGFβ 이중특이체(예를 들어, 1923Ab20)를 제공한다. 개시된 PD-L1/TGFβ 이중특이체는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈로서, 본원에 개시된 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab2 또는 1923Ab3) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부 및 TGFβRII의 전장 세포외 도메인 또는 TGFβRII의 절단부(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 절단부)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하되, 해당 서열은 TGFβ의 생물학적 활성에 결합하고 이를 중화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질에 부착된 제1결합 모듈은 인간 TNFβRII 수용체의 ECD로부터 유래된 재조합 TGFβ 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체 1923Ab20은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab를 갖는 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬을 갖는 인간 IgG1 Fc(서열번호 61), 및 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 각각 부착된 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드(서열번호 67)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 표 5에 개시된 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 표 6에 개시된 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 서열번호 51을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 40을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ은 서열번호 42, 45, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 또는 서열번호 42, 45, 및 51과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 서열번호 39 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열, 또는 서열번호 39 및 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 단편 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1에 특이적이고 인간 TGFβ에 결합하거나;
(b) 시노몰구스 PD-L1과 교차 반응하거나;
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해하거나;
(d) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나;
(e) 인간 TGFβ를 격리한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 항체 기반 면역요법에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 본 개시된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 서열 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ 이중특이체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ 이중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 전술한 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 또한, PD-L1, TGFβ, 및 CD137에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는: (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈, 및 (c) CD137에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 PD-L1에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈, 인간 TGFβ에 결합하고 이의 활성을 중화시킬 수 있는 TGFβ 수용체 II 결합 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 제1 결합 모듈, 및 CD137에 결합하는 제2 결합 모듈을 포함하는 재조합 단백질의 형태로 작제된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, (i) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 42에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 45에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 하나의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 항체 스캐폴드 모듈을 가지며, 이는 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제1 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제1 결합 모듈 인터링커는 서열번호 59에 제시된 바와 같은, N-말단에서 C-말단까지의 서열이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체에 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 TGFβRII의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 scFv이며, 여기에서 서열은 직접 또는 scFv 융합 링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 글리신 및 세린을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Ser를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트이다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 59에 제시된 서열 세트를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 59에 제시된 서열 세트이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 56에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 항체 스캐폴드 모듈을 가지며, 이는 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제2 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제2 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58에 제시되어 있다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제2 결합 모듈 인터링커는 서열번호 59에 제시되어 있다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체에 둘 이상의 제2 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유 부착된다(예를 들어, 하나의 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈에서 중쇄의 C-말단에 부착될 수 있고, 다른 결합 모듈은 동일한 중쇄의 N-말단에 부착될 수 있다). 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 가지며, 여기에서 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 가지며, 여기에서 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 제2 결합 모듈을 가지며, 여기에서 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되며, 다른 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 scFv이다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 53에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 54에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 55에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 56에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 제1 결합 모듈 및 2개의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 서열번호 38에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 39에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 서열번호 50에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 39에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 서열번호 51에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열; 및 서열번호 52에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 제1 결합 모듈 및 하나의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는: 서열번호 41에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열; 서열번호 39에 제시된, 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, N-말단에서 C-말단으로: 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 43에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하는 구조를 갖는다.
예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 적어도 하나의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역의 Fc 침묵 돌연변이는 L234A L235A 또는 N297A이다. 예시적인 일 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시는 1) PD-L1과 이의 수용체 PD-1 사이의 상호작용을 차단하고/하거나; 2) CD137 신호전달에 대한 가교 결합 의존성 작용 활성을 보유하고/하거나, 3) TGFβ의 면역억제 활성을 중화시키는. PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체(예를 들어, 1923Ab7, 1923Ab9, 1923Ab10, 1923Ab17 및 1923Ab19)을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, 항체 스캐폴드 모듈로서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab2 또는 1923Ab3) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열, 및 제1 결합 모듈로서, 본원에 개시된 인간 TGFβRII 수용체의 ECD로부터 유래된 TGFβ 결합 아미노산 서열, 및 CD137 제2 결합 모듈로서, 본원에 개시된 CD137에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab4, 1923Ab5, 또는 1923Ab6) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, PD-1/PD-L1 결합 상호작용을 파괴하고 T 세포의 PD-1/PD-L1 관문 매개 억제를 억제-해제하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다. PD-L1 항체 스캐폴드 모듈은 IgG 분자의 형태(예를 들어, 1923Ab7, 1923Ab9, 1923Ab10, 1923Ab17, 1923Ab19)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, CD137/CD137 리간드 상호작용을 차단하고 CD137 신호전달에 대한 작용 활성을 보유하는 CD137 제2 결합 모듈을 추가로 포함한다. 대안적인 구현예에서, CD137 제2 결합 모듈은 scFv(예를 들어, 1923Ab7, 1923Ab9, 1923Ab10, 1923Ab17 및 1923Ab19)를 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 제2 결합 모듈(예를 들어, CD137 scFv)을 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된 제2 결합 모듈(예를 들어, CD137 scFv)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 제2 결합 모듈은 CD137에 대한 1가 결합에 기여한다. 대안적인 구현예에서, CD137에 결합하는 제2 결합 모듈은 CD137에 대한 2가 결합에 기여한다.
일부 구현예에서, 제2 결합 모듈은 CD137 scFv이고 이황화 결합으로 안정화될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 TGFβ 제1 결합 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시된 TGFβ 제1 결합 모듈은 인간 TGFβRII 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. TGFβ 제1 결합 모듈은 종양 미세환경에 존재하는 TGFβ의 생물학적 활성을 중화시키는 기능을 한다. 대안적인 구현예에서, TGFβ 제1 결합 모듈은 인간 TGFβ에 결합할 수 있는 인간 TNFβRII 수용체의 절단된 버전(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 절단)을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 TGFβ 제1 결합 모듈(들)이 링커를 통해 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착되는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 대칭인 분자 설계(예를 들어, 1923Ab7, 1923Ab17 및 1923Ab19)를 갖는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 비대칭 설계(예를 들어, 1923Ab9 및 1923Ab10)를 특징으로 한다. 본 개시된 비대칭 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 중쇄의 이종이량체화를 유도하기 위해, 노브-인투-홀(KIH) 기술이 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab7은 1923Ab3의 2개의 Fab를 갖는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬(서열번호 61)을 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab4로부터 유래된 CD137 scFv(VH가 VL에 선행함)(서열번호 53) 형태의 2개의 제2 결합 모듈(이들 각각은 2개의 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab9는 1923Ab3의 2개의 Fab를 갖는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이 및 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 불변 사슬(예를 들어, Fc 불변 사슬은 서열번호 62 및 63에 제시됨)을 갖는 이종이량체 인간 IgG1 Fc, 1923Ab4로부터 유래된 CD137 scFv(VH가 VL에 선행함)(서열번호 53) 형태의 하나의 제2 결합 모듈(노브 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab10은 1923Ab3의 2개의 Fab를 갖는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이 및 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 사슬(예를 들어, Fc 불변 사슬은 서열번호 62 및 63에 제시됨)을 갖는 이종이량체 인간 IgG1 Fc, 1923Ab4로부터 유래된 CD137 scFv(VL이 VH에 선행함)(서열번호 54) 형태의 하나의 제2 결합 모듈(노브 Fc 불변 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab17은 1923Ab3의 2개의 Fab를 갖는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 사슬(서열번호 61)을 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab4로부터 유래된 이황화 결합 안정화 CD137 scFv(VH가 VL에 선행함)(서열번호 55) 형태의 2개의 제2 결합 모듈(이들 각각은 Fc 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab19는 1923Ab3의 2개의 Fab를 갖는 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 사슬(서열번호 61)을 갖는 인간 IgG1 Fc, TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 1923Ab4로부터 유래된 2개의 CD137 제2 결합 모듈 이황화 결합 안정화 scFv(VH가 VL에 선행함)(서열번호 56)(이들 각각은 Fc 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 표 7에 개시된 중쇄 및/또는 경쇄 서열로부터 유래된 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다. 대안적인 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 표 7에 따라 쌍을 이룬 2개의 중쇄 및 경쇄 서열의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 다음의 조합으로부터 선택되는 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 38을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 서열;
(b) 서열번호 48을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 49를 포함하는 경쇄 서열;
(c) 서열번호 50을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 서열; 및
(d) 서열번호 51을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호 52를 포함하는 경쇄 서열.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 2개의 상이한 가변 중쇄 서열(노브-인투-홀 포맷을 사용하여 이종이량체화되도록 설계됨) 및 가변 경쇄 서열을 포함하며, 이들은 다음의 조합으로부터 선택된다: (a) 서열번호 41을 포함하는 제1 중쇄 서열, 서열번호 42를 포함하는 제2 중쇄 서열 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 서열; 및 (b) 서열번호 43을 포함하는 제1 중쇄 서열, 서열번호 42를 포함하는 제2 중쇄 서열 및 서열번호 39를 포함하는 경쇄 서열.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, 서열번호 38, 41, 42, 43, 48, 50 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 또는 서열번호 38, 41, 42, 43, 48, 50 또는 51과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
다른 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, 서열번호 39, 49 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열, 또는 서열번호 39, 49 또는 52와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는, T 세포의 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하는 FcgR과의 가교 결합 활성을 제거/최소화하도록 조작된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1, CD137 및 TGFβ에 결합할 수 있거나;
(b) 시노몰구스 PD-L1 및 CD137과 교차 반응하거나;
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(d) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나; (e) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나;
(f) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나;
(g) TGFβ 신호전달을 억제하고 이의 생물학적 활성을 중화시키거나;
(h) CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성을 보유하거나;
(i) PD-L1 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시키거나;
(j) CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시킨다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 본원에 개시된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 서열 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 전술한 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 또한, CD137, TGFβ, 및 PD-L1에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는: (a) CD137에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 포맷의 항체 스캐폴드 모듈; (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈, 및 (c) PD-L1에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, 본 개시는 또한, CD137에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈, 인간 TGFβ에 결합하고 이의 활성을 중화시킬 수 있는 TGFβ 수용체 II 결합 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 제1 결합 모듈, 및 PD-L1에 결합하는 제2 결합 모듈을 포함하는 재조합 단백질의 형태로 작제된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체를 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는, CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 16, 서열번호 18, 또는 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 17, 서열번호 19, 또는 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은, 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열, 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 75에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 76에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 하나의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 2개의 제1 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 항체 스캐폴드 모듈을 가지며, 이는 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제1 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58에 제시되어 있다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 59에 제시된 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체에 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈 서열의 상이한 말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 TGFβRII의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 scFv이며, 여기에서 서열은 직접 또는 scFv 융합 링커를 통해 서로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 글리신 및 세린을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열 Gly-Gly-Gly-Ser를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 58에 제시된 서열 세트이다. 예시적인 일 구현예에서, scFv 융합 링커는 서열번호 59에 제시된 서열 세트를 포함한다. CD137 항체가 스캐폴드 모이어티를 제공하는 예시적인 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 구현예에서, 제2 결합 모듈은 서열번호 57을 포함하는 PD-L1에 결합하는 scFv이다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 2개의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 여기에서 해당 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제2 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 선택적으로, 여기에서 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 제2 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58에 제시되어 있다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 59에 제시된 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체에 둘 이상의 제2 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유적으로 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 가지며, 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 하나의 제2 결합 모듈을 가지며, 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 2개의 제2 결합 모듈을 가지며, 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되며, 다른 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착된다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 scFv이다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로: 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 제2 결합 모듈은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함한다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 2개의 제1 결합 모듈 및 2개의 제2 결합 모듈을 갖는다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열 및 제2 결합 모듈은 서열번호 48을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열 및 제1 결합 모듈은 서열번호 49를 포함하는 구조를 갖는다.
예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 적어도 하나의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역의 Fc 침묵 돌연변이는 L234A L235A 또는 N297A이다. 예시적인 일 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 항체 스캐폴드 모듈의 불변 영역은 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시는 1) CD137과 이의 리간드 사이의 상호작용을 차단하고; 2) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하고; 3) TGFβ의 면역억제 활성을 중화시키는 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체(1923Ab16)를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는, 항체 스캐폴드 모듈로서, CD137에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab4, 1923Ab5 또는 1923Ab6) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열, 및 제1 결합 모듈로서, 본원에 개시된 인간 TGFβRII 수용체의 ECD로부터 유래된 TGFβ 결합 아미노산 서열, 및 PD-L1 제2 결합 모듈로서, 본원에 개시된 PD-L1에 결합하는 결합 단백질(예를 들어, 1923Ab2, 또는 1923Ab3) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는, CD137/CD137 리간드 상호작용을 차단하고 CD137 신호전달에 대한 작용 활성을 보유하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다. CD137 항체 스캐폴드 모듈은 IgG 분자(예를 들어, 1923Ab16) 또는 이의 결합 단편의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는, PD-1/PD-L1 결합 상호작용을 파괴하고 T 세포의 PD-1/PD-L1 관문 매개 억제를 억제-해제하는 PD-L1 제2 결합 모듈을 추가로 포함한다. 대안적인 구현예에서, PD-L1 제2 결합 모듈은 scFv(예를 들어, 1923Ab16)를 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1삼중특이체는 CD137 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된 PD-L1 scFv 제2 결합 모듈을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1 제2 결합 모듈은 PD-L1에 대한 1가 결합에 기여한다. 대안적인 구현예에서, PD-L1 제2 결합 모듈은 PD-L1에 대한 2가 결합에 기여한다.
일부 구현예에서, PD-L1 scFv 제2 결합 모듈은 이황화 결합으로 안정화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 TGFβ 제1 결합 모듈로서 본원에서 예시된 종양 미세환경 조절제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시된 TGFβ 제1 결합 모듈은 인간 TGFβRII 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. TGFβ 제1 결합 모듈은 종양 미세환경에 존재하는 TGFβ의 생물학적 활성을 중화시키는 기능을 한다. 대안적인 구현예에서, TGFβ 제1 결합 모듈은 인간 TGFβ에 결합할 수 있는 인간 TNFβRII 수용체의 절단된 버전(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 절단)을 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 TGFβ 제1 결합 모듈(들)이 링커를 통해 CD137 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착되는 CD137 항체 결합 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 대칭인 분자 설계를 갖는다. 대안적인 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 비대칭인 설계를 특징으로 한다. 본 개시된 비대칭 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 중쇄의 이종이량체화를 유도하기 위해, 노브-인투-홀(KIH) 기술이 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 1923Ab16은 1923Ab4의 2개의 Fab를 갖는 CD137 항체 스캐폴드 모듈, L234A L235A 돌연변이를 갖는 2개의 Fc 사슬(서열번호 61)을 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab3으로부터 유래된 2개의 PD-L1 제2 결합 모듈 scFv(VH가 VL에 선행함)(서열번호 57)(이들 각각은 Fc 사슬 각각의 C-말단에 별도로 부착됨), 및 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리펩티드(서열번호 67)로서 2개의 TGFβ 제1 결합 모듈(이들 각각은 Fab의 경쇄 각각의 C-말단에 별도로 부착됨)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는, T 세포의 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하는 FcgR과의 가교 결합 활성을 제거/최소화하도록 조작된 Fc 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1, CD137 및 TGFβ에 결합할 수 있거나;
(b) 시노몰구스 PD-L1 및 CD137과 교차 반응하거나;
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(d) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(e) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나;
(f) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나;
(g) TGFβ 신호전달을 억제하고 이의 생물학적 활성을 중화시키거나;
(h) CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성을 보유하거나;
(i) PD-L1 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시키거나;
(j) CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시킨다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 중 적어도 하나, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클 및/또는 부형제를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은 암의 항체 기반 면역요법에 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 환자의 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 본원에 개시된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 개시는 또한 본원에 기술된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 서열 중 적어도 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나, 또는 상기 벡터 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시의 전술한 발명의 내용뿐만 아니라, 아래의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독될 때 더 잘 이해될 것이다. 본 개시를 예시하기 위한 목적으로, 도면에 도시된 내용은은 현재의 바람직한 구현예이다. 그러나, 본 개시는 도시된 배열, 구현예 및 기구에 정확히 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1a-k는 PD-L1에 결합하거나 CD137에 결합하는 인간 결합 단백질의 VH 및 VL 도메인, PD-L1/CD137 이중특이체, PD-L1/TGFβ 이중특이체, 및 PD-L1/CD137/TGFβ 삼중특이체의 HC 및 LC 서열, 및 개시된 삼중특이체를 제조하는 데 사용된 scFv 서브유닛의 아미노산 서열을 제공한다. 항-PD-L1 및 항-CD137의 CDR 서열(Kabat 넘버링)은 이들 각각의 가변 도메인 서열에 밑줄이 그어져 있다. 서열 식별자가 제공된다.
도 2a-b는 ELISA에 의한, 인간, 마우스 및 cyno PD-L1 단백질에 대한 PD-L1 단일특이체, A) 1923Ab2 및 B) 1923Ab3의 결합 활성을 나타낸다.
도 3은 이미지 결합 검정에 의한, 인간 PD-L1-발현 HEK293T에서의 PD-L1 단일특이체의 결합 활성을 나타낸다.
도 4a-b는 PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정에 의한, PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단하기 위한, PD-L1 단일특이체, A) 1923Ab2 및 B) 1923Ab3의 활성을 나타낸다.
도 5a-c는 이미지 결합 검정에 의한, 인간, 마우스 및 cyno CD137-발현 HEK293T에 대한 CD137 단일특이체의 결합 활성을 나타낸다.
도 6은 이미지 결합 검정에 의한, 인간, CD137-발현 HEK293T 세포에 대한 CD137 항체의 결합 활성의 비교를 나타낸다.
도 7은 바이오층 간섭계(BLI)에 의한, CD137에 대한 CD137L 결합을 차단하기 위한 CD137 단일특이체의 활성을 나타낸다.
도 8은 인간 CD137 및 NFκB 루시페라아제 리포터를 발현하는 HEK293T CD137 리포터 세포에 대한 CD137 단일특이체의 가교 결합의 효과를 나타낸다.
도 9는 IFNγ 분비를 유도하기 위해 항-CD3으로 자극된 인간 PBMC에 대한 CD137 단일 특이체의 가교 결합의 효과를 나타낸다.
도 10a는 4개의 인간/마우스 하이브리드 CD137 발현 작제물의 개략도를 도시한다. 인간 CRD 영역을 이들의 마우스 카운터파트로 대체하고 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 도 10b-f는 인간 CD137 야생형(10b) 및 인간/마우스 하이브리드 CD137 단백질 msCRD1(10c), msCRD2(10d), msCRD3(10f) 및 msCRD4(10f)에 대한 우렐루맙-NR(PC2), 우토밀루맙-NR(PC3) 및 1923Ab4의 결합 활성을 나타낸다.
도 11a는 인간 및 마우스 CD137의 CRD4 도메인의 서열 정렬을 나타낸다. 인간 CD137의 5개의 발현 작제물을 인간 아미노산 서열을 마우스 아미노산 서열로 변화시킴으로써 M1-M5로 표시된 바와 같이 생성하였으며, HEK293T 세포 상에서 일시적으로 발현시켰다. 도 11b-g는 인간 CD137 WT(11b), 및 5개의 돌연변이된 인간 CD137 단백질, M1(11c), M2(11d), M3(11e), M4(11f) 및 M5(11g)에 대한 우렐루맙-NR(PC2) 및 1923Ab4의 결합 활성을 나타낸다.
도 12는 HDX-MS에 의해 식별된, 인간 CD137에 대한 1923Ab4의 에피토프 영역(음영 막대로 도시됨)을 나타낸다. 박스형 영역은 CD137 시스테인-풍부 도메인(CRD) 영역을 정의한다.
도 13a-13l은 다음의 개시된 이중특이체 및 삼중특이체의 구조적 특징부를 도시한다: 1923Ab7(a); 1923Ab8(b), 1923Ab9(c), 1923Ab10(d), 1923Ab11(e), 1923Ab12(f), 1923Ab13(g), 1923Ab16(h), 1923Ab17(i), 1923Ab18(j), 1923Ab19(k) 및 1923Ab20 (l).
도 14a-14b는 개시된 이중특이체 항체(a) 및 개시된 삼중특이체 항체(b)를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 나타낸다.
도 15는 결합 단백질을 작제하는 데 사용되는 항체 스캐폴드 모듈 및 결합 모듈의 구조적 및 기능적 하위성분에 대한 상세한 설명을 제공한다.
도 16a-16b는 이미지 결합 검정(a) 및 유세포 계측법(b)에 의한, 인간 CD137-발현 HEK293T에서의 이중특이체 및 삼중특이체 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 17a-17b는 HEK293T CD137 리포터 세포(a) 및 Jurkat T CD137 리포터 세포(b)를 사용한, CD137 신호전달에 대한 이중특이체 및 삼중특이체의 작용 활성을 나타낸다.
도 18a-18b는 표적 세포의 존재(a) 또는 표적 세포의 부재(b) 하에서의, Jurkat T CD137 리포터 세포를 사용한, 이중특이체 및 삼중특이체에 의한 CD137 신호전달의 표적 세포 의존성 활성화를 나타낸다.
도 19a-19b는 항체의 상이한 영역에서 CD137의 scFv를 융합함으로써 생성된 (a) 삼중특이체 및 (b) 이중특이체의 표적 세포 의존성 활성화 CD137 신호전달을 나타낸다. Jurkat T 세포 CD137 리포터 세포를 사용하여 CD137 신호전달 활성을 평가하였다.
도 20은 PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정에 의한, PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단하기 위한 이중특이체 및 삼중특이체의 활성을 나타낸다.
도 21은 TGFβ 차단 리포터 검정에 의한, TGFβ 유도 신호전달을 차단하기 위한 삼중특이체의 억제 활성을 나타낸다.
도 22a-22b는 IFNγ 분비를 유도하기 위해 항-CD3으로 자극된 인간 PBMC에 대한 이중특이체 및 삼중특이체의 효과를 나타낸다.
도 23a-23b는 내인성 PD-L1을 발현하는 NUGC4 종양 세포와 공동 배양된 인간 CD8 T 세포에 대한, (a) T 세포 매개 사멸 활성 및 (b) 이중특이체 및 삼중특이체의 IFNγ 분비의 유도를 나타낸다.
도 24는 CMV 회수 검정에서 CMV 용해물로 자극된 인간 PBMC에 대한 이중특이체 및 삼중특이체의 항원 특이적 T 세포 활성화의 활성을 나타낸다. T 세포 활성화의 표시로서 IFNγ의 분비 수준을 측정하였다.
도 25는 1923Ab18 또는 비히클 대조군으로 치료했을 경우, MC38-h-PD-L1 종양 보유 hCD137 및 hDP-L1 이중 녹-인 마우스에서의 종양 성장을 나타낸다. 21일차에의 상이한 치료군으로부터의 종양 크기에 대한 일원 ANOVA 분석을 도표화하였다.
도 26a-26e는 1923Ab18 또는 비히클 대조군으로 치료했을 경우, MC38-h-PD-L1 종양 보유 hCD137 및 hDP-L1 이중 녹-인 마우스로부터의 종양 침윤 림프구의 분석을 나타낸다. (a) CD3+CD45+, (b) CD4+CD3+, (c) CD8+CD3+, (d) CD3+ 중 Treg, 및 (e) CD8/Treg 비율의 백분율을 요약하였다.
PD-1 및 이의 리간드인 프로그램된 사멸 리간드-1와 프로그램된 사멸 리간드-2(PD-L1 및 PD-L2)는 T 세포 활성화, 내성 및 면역병리학 간의 균형을 조절하는 공동 억제 인자로서 작용한다. PD-1/PD-L1 신호전달 축에 대한 표적화는 집중적인 치료 탐색 영역이다. 본 개시는 암의 치료에 사용될 수 있는, PD-L1에 결합하는 결합 단백질(PD-L1 단일특이체), PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/CD137 이중특이체), PD-L1 및 TGFβ에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ 이중특이체), 및 PD-L1, TGFβ, 및 CD137에 결합하는 결합 단백질(PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체)을 포함하는, PD-L1에 결합하는 결합 단백질을 제공한다. 유리하게는, 본원에 개시된 결합 단백질은 PD-L1의 억제를 가능하게 함으로써, 투여량 제형을 보다 적게 하고, 투여의 빈도를 낮추고/낮추거나 이의 효과를 높이며, 비용 감소 및 효율 증가를 가져온다. 본 개시가 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의된다. 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 다른 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
본 개시 전체에 걸쳐, 다음의 약어가 사용된다:
mAb 또는 Mab 또는 MAb - 단클론 항체.
CDR - 면역글로불린 가변 영역의 상보성 결정 영역.
VH 또는 VH - 면역글로불린 중쇄 가변 영역.
VL 또는 VL - 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
Fc 또는 Fc 영역- CH2 및 CH3 도메인 및 힌지 영역의 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역.
Fab 또는 Fab 단편- VH, CH1 및 VL, CL 영역으로 이루어진 항체의 1가 항원 결합 단편.
FR - 항체 프레임워크 영역, CDR 영역을 제외한 면역글로불린 가변 영역,
본원에 기술된 바와 같이, 용어 "PD-L1"은 변이체, 이소형, 상동체, 이종상동체, 및 파라로그를 포함한다. 예를 들어, 인간 PD-L1 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우, 인간 이외의 종으로부터의 PD-L1 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 PD-L1 단백질에 특이적인 항체는 인간 PD-L1 단백질에 특정적일 수 있으며, 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타낼 수 있거나, 특정 다른 종으로부터의 PD-L1과 교차 반응할 수 있지만 다른 모든 종과 교차 반응하지 않을 수 있다(예를 들어, 원숭이 PD-L1과는 교차 반응하지만 마우스 PD-L1과는 교차 반응하지 않음). 용어 "인간 PD-L1"은 인간 서열 PD-L1, 예컨대 NCBI 수탁 번호 NP_054862를 갖는 인간 PD-L1의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. PD-L1은 B7 단백질 계열의 구성원이며, B7.1 및 B7.2와 약 20%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 인간 PD-L1은 쥣과 및 시노몰구스 PD-L1 이종상동체와 각각 70% 및 93%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PD-1", "PD1", "프로그램된 세포 사멸 단백질 1", "CD279", 및 "분화 클러스터 279"(예를 들어, Genebank 수탁 번호 NP_005009(인간))는 T 세포 조절자의 연장된 CD28/CTLA-4 계열의 구성원인 I형 막 단백질을 의미한다. PD1은 세포외 IgV 도메인에 이어서 막관통 영역을 포함하고, 세포내 꼬리 PD1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식세포의 표면 상에서 발현된다.
용어 "CD137"은 4-1BB, 또는 TNFRSF9(TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9)를 지칭하며, 이는 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원이고, 선천성 및 적응성 면역 세포 둘 모두의 면역 세포의 활성화 후에 발현되는 공자극 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 4-1BB는 포유동물, 예를 들어 호모 사피엔스(인간)(NCBI 수탁 번호 NP_001552)로부터 유래될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 용어 "CD137"은 변이체, 이소형, 상동체, 이종상동체, 및 파라로그를 포함한다. 예를 들어, 인간 CD137 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우, 인간 이외의 종으로부터의 CD137 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 CD137 단백질에 특이적인 항체는 인간 CD-137 단백질에 완전히 특이적일 수 있으며, 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타낼 수 있거나, 특정 다른 종으로부터의 CD137과 교차 반응할 수 있지만 다른 모든 종과 교차 반응하지 않을 수 있다(예를 들어, 원숭이 CD137과는 교차 반응하지만 마우스 4-1BB과는 교차 반응하지 않음). 용어 "cyno CD137"은 시노몰구스 원숭이 CD137, 예컨대 NCBI 수탁 번호 XP_005544945.1을 갖는 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "마우스 CD137"은 마우스 서열 4-1BB, 예컨대 NCBI 수탁 번호 NP_035742.1을 갖는 마우스 4-1BB의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 본 개시의 인간 CD137 서열은, 예를 들어, 보존된 돌연변이 또는 보존되지 않은 영역에서의 돌연변이를 가짐으로써 NCBI 수탁 번호 NP_001552의 인간 CD137과 상이할 수 있으며, 본 개시의 CD137은 NCBI 수탁 번호 NP_001552의 인간 CD137과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환 성장 인자 베타", "TGF-베타", 또는 "TGFβ"는 자연 발생 TGF-베타 단백질 및 변이체 및 모방체를 포함하는 합성 단백질을 포함하는, TGF-베타 1, TGF-베타 2, 및 TGF-베타 3을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 TGF-베타 단백질을 지칭할 수 있다. TGF-베타 단백질은 포유류 TGF-β-1, 2, 및 3, 인히빈, 액티빈, 및 골 형성 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는, 구조적으로 유사한 조절 단백질의 수퍼패밀리의 구성원이다. 성숙 TGF-베타는 일반적으로 2개의 공유 결합된 TGF-베타 분자를 함유하는, 이량체 성숙 TGF-베타 분자와 같은 동종이량체로서 존재한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TGFβ 수용체 II"("TGFβRII")는, 예를 들어, 서열번호 74를 포함하거나, 서열번호 74의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 TGFβ(예를 들어, NCBI 참조 서열(RefSeq) 수탁 번호 NP_001020018 또는 NP_003233.4의 아미노산 서열)에 결합하는, 야생형 인간 TGFβ 수용체 2형 이소형 A 서열 또는 이소형 B 서열, 또는 이의 일부를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. TGFβRII는 야생형 서열의 TGFβ 결합 활성의 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 99%를 유지할 수 있다. 발현된 TGFβRII의 폴리펩티드에는 신호 서열이 결여되어 있다.
본원에서의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 이중특이체 항체, 및 삼중특이체 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에서의 용어 "항체 스캐폴드 모듈"은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 Y-형상 항체를 지칭한다. 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 항체 스캐폴드는 이의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상에 부착된 하나 이상의 결합 모듈을 가질 수 있다. 항체 결합 스캐폴드는 2개의 Fab 및 2개의 불변 영역 서열을 갖는 Fc 부분을 포함한다.
IgG와 같은 예시적인 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역으로 산재된 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 종결부로부터 카르복시 종결부까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예를 들어, 집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체 제제의 생산 및/또는 보관 중에 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 일반적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 조절제 "단클론"은 해당 항체의 특성이 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 것을 나타내며, 임의의 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 사용되는 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술, 본원에 기술된 단클론 항체를 제조하기 위한 해당 방법 및 다른 예시적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐만 아니라, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 해당 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성인 재조합 항체를 지칭한다. 또한, 친화도 또는 특이성을 포함하는 항체 분자의 특정 특성을 변경하기 위해 상보성 결정 영역(CDR) 이식이 수행될 수 있다. 일반적으로, 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물의 항체("부모 항체")로부터 수득되고, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 수득됨으로써, 생성된 키메라 항체는 인간 대상체에서 효과기 기능을 유도할 수 있으며, 유래된 부모(예를 들어, 마우스) 항체보다 부정적인 면역 반응을 유도할 가능성이 적게 된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 당업자에게 공지된 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 어느 하나를 사용하여 만들어진 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히, 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있으며, 이는 다음의 문헌에 기술된 방법을 포함한다: Cole 등의 문헌[Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; Boerner 등의 문헌[J. Immunol, 147(I):86-95 (1991)]. 또한, van Dijk 및 van de Winkel의 문헌[Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 해당 항체를 생성하도록 변형되었지만 이의 내인성 유전자좌는 비활성화된 형질전환 동물, 예를 들어 면역화된 HuMab 마우스(HuMab 마우스와 관련하여, 예를 들어, miceNils Lonberg 등의 문헌[1994, Nature 368:856-859], WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187 참조), Xenomice(XENOMOUSETM 기술에 관련하여, 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조)또는 Trianni 마우스(예를 들어, WO 2013/063391, WO 2017/035252 및 WO 2017/136734 참조)에 표적 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 비인간(예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 햄스터) 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 가변 영역에서 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을 포함하도록 조작된 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 CDR 영역을 제외하고 전체적으로 인간 서열을 포함한다. 인간화 항체는 비-인간화 항체에 비해 대체적으로 인간에 대한 면역원성이 적으며, 따라서 특정 상황에서 치료적 이점을 제공한다. 당업자는 인간화 항체를 인지하고 있을 것이며, 또한 이의 생성을 위한 적절한 기술을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, Hwang, W. Y. K. 등의 문헌[Methods 36:35, 2005]; Queen 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989]; Jones 등의 문헌[Nature, 321:522-25, 1986]; Riechmann 등의 문헌[Nature, 332:323-27, 1988]; Verhoeyen 등의 문헌[Science, 239:1534-36, 1988]; Orlandi 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989]; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제6,180,370호; 및 Selick 등의 WO 90/07861을 참조하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합된다.
항체의 "부류(class)"는 이의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM; 그리고, 이들 중 몇몇은 하위 부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.
항체 또는 유사한 용어에서의 항체의 용어 "항원 결합 도메인"(또는 단순히 "결합 도메인")은 항원 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어, 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 다름을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward 등의 문헌[(1989) Nature 341: 544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합.
본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 특이적 항원 인식의 매개를 주로 담당하는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내의 짧은 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 각각의 VL 및 각각의 VH 내에는 3개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭됨)이 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, CDR 및 프레임워크 영역은 Kabat 넘버링 체계(Kabat E. A. 등의 문헌[1991, Sequences of proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Md])에 따라 주석이 달린다.
다른 구현예에서, 항체의 CDR은, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합되는 MacCallum RM 등의 문헌[(1996) J Mol Biol 262: 732-745]에 따라 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체의 CDR은, Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에서 사용되는, AbM 초가변 영역을 의미하는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다. CDR은 또한, Kabat 등의 문헌[1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]의 서열 비교에 의해 정의될 수 있는 한편, HVL는 Chothia 및 Lesk의 문헌[1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 기술된 바와 같은 가변 도메인의 3-차원 구조에 따라 구조적으로 정의된다. 이들 2개의 방법이 CDR을 다소 상이하게 식별하는 경우, 구조적 정의가 바람직하다. Kabat에 의한 정의에 따르면, 경쇄 가변 도메인에서, CDR-L1은 대략 잔기 24-34에, CDR-L2는 대략 잔기 50-56에, 그리고 CDR-L3는 대략 잔기 89-97에 위치하고; 중쇄 가변 도메인에서, CDR-H1은 대략 잔기 31-35, CDR-H2는 대략 잔기 50-65, 그리고 CDR-H3은 약 잔기 95-102에 위치한다. IMGT 및 NORTH는 CDR의 대안적인 정의를 제공한다(Lefranc MP.의 문헌[Unique database numbering system for immunogenetic analysis. Immunol Today (1997) 18:509]; 및 North B, Lehmann A, Dunbrack RLJ.의 문헌[A new clustering of antibody CDR loop conformations. J Mol Biol. (2011) 406:228-56]). 또한, CDR은 Chemical Computing Group(CCG) 넘버링에 따라 정의될 수 있다(Almagro 등의 문헌[Proteins 2011; 79:3050-3066] 및 Maier 등의 문헌[Proteins 2014; 82:1599-1610]). 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 주어진 항체에 특이적인, 고유한 기능적 특성을 정의한다.
항체의 "가변 도메인"(V 도메인)은 결합을 매개하고 특정 항체의 항원 특이성을 부여한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개-아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지는 않는다. 대신, V 영역은 본원에서 "초가변 영역"으로 지칭되는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역 또는 각각 9-12개의 아미노산 길이인 CDR에 의해 분리된 15-30개의 아미노산의, 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 비교적 불변인 신축부로 이루어진다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 사이에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 광 서열의 개시는 연관된 CDR의 개시를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시는 vhCDR(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시이고, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시는 vlCDR(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시이다.
"Fv"는 단단히 비공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 폴딩부로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터의 각각 3개의 루프)가 생성된다.
"단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. sFv에 대한 검토에 대해, Plueckthun의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg 및 Moore 편집, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드와 연결된다. 링커는 가요성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-종결부를 VL의 C-종결부와 연결하거나, 그 반대일 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 이황화 안정화된 scFv는 VH 또는 VL에서 특이적 잔기를 돌연변이시킴으로써 쌍을 이룬 시스테인을 도입함으로써 조작될 수 있다. 이들 잔기는 VH 및 VL의 인터페이스에 있다. 참조 문헌인 Weatherill, E. E. 등의 문헌 [Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation. Protein Eng Des Sel 25, 321-329]을 참조하며, 여기에서 NovaRock은 해당 실시예의 VH44-VL100을 사용하였다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 대체적으로 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래한다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), Vols. 1-3]에서의 하위그룹이다. 일 구현예에서, VL의 경우, 하위그룹은 Kabat 등의 문헌(전술함)에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH의 경우, 하위그룹은 Kabat 등의 문헌(전술함)에서와 같은 하위그룹 III이다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 216-238(EU 넘버링) 또는 226-251(Kabat 넘버링)로부터의 신장으로서 정의된다. 힌지는 3개의 별개의 영역, 즉 상부, 중간부(예를 들어, 코어), 및 하부 힌지로 추가로 분할될 수 있다.
본원에서의 용어 "Fc 영역" 및 "불변 영역"은 해당 불변 영역의 적어도 일 부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 해당 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실 말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 또한, Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 지칭된다.
항체 Fc 영역과 특정 Fc 수용체의 상호작용으로부터 유래되는 용어 "효과기 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개 식균작용(ADCP), 및 세포 표면 수용체의 하향조절과 같은 FcyR 매개 효과기 기능을 포함하나, 반드시 이에 한정되지는 않는다. 이러한 효과기 기능은 대체적으로 Fc 영역이 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 한다.
용어 "T 세포 의존성 세포 세포독성"(TDCC)은 분자가 종양 세포에 동시에 결합하여 세포독성 T 세포와 결합하고 T 세포와 표적 세포를 근접시킴으로써 세포 용해를 재유도할 경우의 일련의 이벤트를 나타낸다. ADCC 및 TDCC 둘 모두의 활성화는 표적 세포의 사멸을 초래한다. 그러나, 이들 두 가지 구별되는 유형의 세포독성 사이에는 일부 주요한 차이가 있다. ADCC 효과는 표적 세포의 표면 상에 부착된 항체의 불변 영역에 결합하기 위해 자연 살해(NK) 세포 상에서 발현된 Fcγ 수용체를 통해 매개된다. TDCC 효과는 표적 세포에 가까이 근접한 세포독성 T 세포와의 결합을 통해 매개된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 항체 수용체를 기술하며, 이는 B 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 및 비만 세포를 포함하는 특정 면역 세포의 막에 위치한 항원 인식에 관여한다. IgG의 Fc 부분을 인식하는 Fc 수용체는 Fc 감마 수용체(FcγR)로 불린다. FcγR 계열은 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태의 이들 수용체를 포함한다. IgG 결합에 대한 구조, 기능 및 친화도의 차이에 기초하여, FcγR은 3개의 주요 군으로 분류된다: FcγRI, FcγRII(FcγRIIa 및 FcγRIIb) 및 FcγRIII(FcγRIIIa 및 FcγRIIIb). 이들 중, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32a), 및 FcγRIIIa(CD16a)는 신호 전달 모티프, 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), FcγRI 및 FcγRIIIa의 γ 서브유닛, 또는 FcγRIIa의 세포질 테일을 함유하는 활성화 수용체이다. 항원-항체 복합체의 결합 후, 활성화 Fcγ 수용체(인간: FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB 및 쥣과: FcγRI, FcγRIII, FcγRIV)는 면역 효과기 기능을 촉발한다. 대조적으로, FcγRIIb(CD32b)는 억제 수용체이다. FcγRIIb의 가교 결합은 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)의 인산화 및 억제 신호전달을 유도한다(Patel 등의 문헌[Front Immunol. 2019; 10: 223]).
용어 "Fc 침묵화된"은 Fc gR 및 보체와의 결합 활성을 최소화/제거하도록 조작되어, Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거하도록 하는 Fc 영역을 지칭한다. Fc를 조작하기 위한 전략은 Fc 당질화의 변형, IgG 하위 부류의 혼성체 사용, 또는 힌지 및/또는 CH2 영역에서의 하나 이상의 돌연변이 도입을 포함한다. Fc를 침묵시키는 효과기 기능 및 각각의 돌연변이에 대한 중요한 잔기는, 예를 들어, Strohl, WR 및 Strohl LM의 문헌["Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 242], 국제 특허 출원 번호 WO2017008169A1 및 WO2021055669에서와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
인간 IgG1 Fc를 침묵시키도록 조작될 수 있는 부위에 대한 특이적이고 비제한적인 예는, 모두 EU 넘버링으로, L234, L235, G237, D265, N297, P329, P331을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 조절 세포" 또는 "Treg"는 CD8 양성(CD8+) 효과기 T 세포와 같은 다른 면역 세포의 증식, 활성화 및 세포독성 능력을 억압/억제함으로써 조절 역할을 하는 면역계의 세포를 지칭한다. 조절 T 세포(Treg)는 마스터 전사 인자 포크헤드 박스 P3(Foxp3)의 발현을 특징으로 한다. Treg 세포에는 2개의 주요 하위집합, 즉 흉선에서 발생하는 "천연" Treg(nTreg) 세포, 및 CD4+ Foxp3- 종래의 T 세포로부터 주변부에서 발생하는 "유도된" Treg(iTreg) 세포가 있다. 천연 Treg는 IL-2 수용체의 성분인 CD4 T 세포 공동 수용체 및 CD25 둘 모두를 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서, Treg는 CD4+ CD25+이다. 핵 전사 인자 포크헤드 박스 P3(FoxP3)의 발현은 자연 Treg 발생 및 기능을 결정하는 정의 특성이다. Treg 세포는 억제 사이토카인(예를 들어, IL-10, TGFβ, IL-35)의 분비, 수지상 세포 기능/성숙의 조절, 면역조절 표면 분자(예를 들어, CTLA-4, LAG-3)의 발현, 또는 세포용해(예를 들어, 그랜자임 A- 및/또는 B-매개)에 의한 억제를 포함하는 다수의 작용 모드에 의해 억제 효과를 발휘한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이체"는 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈을 포함하는 결합 단백질을 지칭하며, 여기에서 모듈은 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및/또는 수용체 단백질로부터 유래된다. 일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 PD-L1에 대한 결합 특이성을 갖고, 제1 결합 모듈은, 임의의 다른 항원, 예를 들어 세포 표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직 특이적 항원, 종양 미세환경 조절제, 사이토카인 등에 대한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 CD137에 대한 결합 특이성을 갖고, 제1 결합 모듈은, 임의의 다른 항원, 예를 들어 세포 표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직 특이적 항원, 종양 미세환경 조절제, 사이토카인 등에 대한 결합 특이성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삼중특이체"는 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈 및 제2 결합 모듈을 포함하는 결합 단백질을 지칭하며, 여기에서 모듈은 3개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및/또는 수용체 단백질로부터 유래된다. 일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 PD-L1에 대한 결합 특이성을 갖고, 제1 및 제2 결합 모듈은 (다른 결합 모듈의 항원과는 별도로) 임의의 다른 항원, 예를 들어 세포 표면 공자극 수용체(CD137을 포함하나 이에 한정되지는 않음), 수용체, 수용체 서브유닛, 조직 특이적 항원, 종양 미세환경 조절제, 사이토카인 등에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 CD137에 대한 결합 특이성을 갖고, 제1 및 제2 결합 모듈은 (다른 결합 모듈의 항원과는 별도로) 임의의 다른 항원, 예를 들어 세포 표면 공자극 수용체(PD-L1을 포함하나 이에 한정되지는 않음), 수용체, 수용체 서브유닛, 조직 특이적 항원, 종양 미세환경 조절제, 사이토카인 등에 대한 결합 특이성을 갖는다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 미표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우, 특이적 결합으로 표시된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은, 예를 들어, 10-4 M 이하, 대안적으로 10-5 M 이하, 대안적으로 10-6 M 이하, 대안적으로 10-7 M 이하, 대안적으로 10-8 M 이하, 대안적으로 10-9 M 이하, 대안적으로 10-10 M 이하, 대안적으로 10-11 M 이하, 대안적으로, 10-12 M 이하의 표적에 대한 Kd, 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-6 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M 범위의 Kd를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 친화도와 KD 값은 반비례 관계이다. 항원에 대한 높은 친화도는 낮은 KD 값으로 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은, 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합하다", 및 "선택적으로 결합하다"는 CD137, PDL1 및/또는 TGFβ의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab]Х[Ag]/[Ab-Ag]로서 정의된 해리 상수 Kd에 의해 주어지며, 여기에서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 미결합 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 미결합 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 방법은, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는, Harlow 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988], Coligan 등의 문헌(편집)[Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 Muller의 문헌[Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]을 참조한다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 공지된 표준 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 스크리닝의 사용(예컨대, BIAcoreTM SPR 분석 장치를 사용하는 분석)이다.
"에피토프"는 항체와 이의 항원(들) 사이의 상호작용 부위 또는 부위들을 나타내는 당업계의 용어이다. Janeway, C, Jr., P. Travers 등의 문헌[(2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3- 8. New York, Garland Publishing, Inc.]에 기술된 바와 같이: "항체는 대체적으로 단백질과 같은 큰 분자 표면 상의 작은 영역만은 인식한다. ?? [특정 에피토프]는 단백질 폴딩에 의해 합쳐진 [항원] 폴리펩티드 사슬의 상이한 부분으로부터의 아미노산으로 구성될 가능성이 있다. 이러한 종류의 항원 결정인자는, 인식된 구조가 항원의 아미노산 서열에서 불연속적이지만 3차원 구조에서 함께 모이는 단백질의 분절로 구성되기 때문에, 형태적 또는 불연속적 에피토프로 알려져 있다. 대조적으로, 폴리펩티드 사슬의 단일 분절로 이루어진 에피토프는 연속 또는 선형 에피토프"로 지칭된다"("An antibody generally recognizes only a small region on the surface of a large molecule such as a protein...[Certain epitopes] are likely to be composed of amino acids from different parts of the [antigen] polypeptide chain that have been brought together by protein folding. Antigenic determinants of this kind are known as conformational or discontinuous epitopes because the structure recognized is composed of segments of the protein that are discontinuous in the amino acid sequence of the antigen but are brought together in the three-dimensional structure. In contrast, an epitope composed of a single segment of polypeptide chain is termed a continuous or linear epitope")(Janeway, C. Jr., P. Travers 등의 문헌[(2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc.]).
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 다음의 식으로 계산된다: Koff/Kon = KD
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IC50"은 이들이 결합하는 항원의 생물활성의 50%를 중화시키는 데 필요한, 본원에 개시된 결합 단백질의 유효 농도를 지칭하는 것으로 의도된다.
제제 및 특정 활성(예를 들어, 세포에 대한 결합, 효소 활성의 억제, 면역 세포의 활성화 또는 억제)에 대한 "EC50"은 해당 활성에 대한 최대 반응 또는 효과의 50%를 생성하는, 제제의 효율적인 농도를 지칭한다. 제제 및 특정 활성에 관한 "EC100"은 해당 활성에 대한 실질적으로 최대 반응을 생성하는, 제제의 효율적인 농도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포 기능소실"은 PD-1, CTLA-4, T 세포 Ig 및 뮤신-도메인 함유(TIM)-3, 및 림프구-활성화 유전자 3과 같은 면역 관문 수용체의 연장된 항원 자극 유도 과발현에 의해 야기되는, 사이토카인을 증식시키고 분비하는 T 세포의 손상된 능력으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 T 세포 상의 "공자극 수용체"는 TCR 신호전달 및 사이토카인 자극으로 T 세포를 완전히 활성화시키기 위해 신호전달을 양석적으로 유도할 수 있는 세포 표면 분자를 지칭한다. 공동 신호전달 경로는 T 세포 프라이밍 및 활성화, 그리고 T 세포 분화, 효과기 기능, 및 생존을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 공자극 수용체는 통상적으로 2개의 군으로 분류된다: Ig 수용체 수퍼패밀리(IgSF) 및 TNF 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF).
용어 "결합 모듈"은 PD-L1, CD137, TGFβ, 또는 임의의 다른 표적에 결합하는 임의의 물질을 지칭하며, 이는 스캐폴드 모듈 자체와 비교하여 본 발명의 결합 단백질의 특이적 활성을 향상시킬 수 있다. 결합 모듈의 비제한적인 예는 안티칼린, 레페바디, 모노바디, scFv, Fab, scFab, 아피바디, 파이노머, DARPin, 나노바디, 펩티드 앱타머, 및 핵산 앱탐터를 포함한다.
용어 "Fab" 또는 "항원 결합 단편"은 항체의 2개의 동일한 단편을 지칭하며, 일반적으로 항체에 결합 특이성을 부여하는 효소 분해에 의해 제조된다. 항체의 파파인 분해는 중쇄(H) 사슬(VH)의 가변 영역 도메인 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 경쇄(L)로 이루어진 2개의 동일한 Fab 단편을 생성한다. 항체의 펩신 처리는 단일의 큰 F(ab)2 단편을 제공하며, 이는 2가 항원 결합 활성을 가지며 추가로 항원을 가교 결합할 수 있는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 종결부에서 추가의 몇몇 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다.
용어 "링커"는 2개의 화학적 엔티티 사이에 공유 결합을 형성하는 적어도 하나의 원자를 지칭한다. 용어 "링커"는 스캐폴드 모듈과 결합 모듈에 대한 다른 공유 결합 사이에 공유 결합을 형성하는 적어도 하나의 원자를 지칭할 수 있다. 스캐폴드 모듈 및 결합 모듈이 펩티드 결합을 오로지 통해서만 연결되는 경우, 해당 링커는 "펩티드 링커"로서 지칭된다. 그렇지 않은 경우, 링커는 "화학적 링커"로서 지칭된다. 또한, "가요성 펩티드 링커"는 대부분 작은, 비극성 또는 극성 아미노산을 포함하는 반면, "강성 펩티드 링커"는 알파-나선 형성 서열을 포함하고/하거나 프롤린 잔기가 풍부하다(Chen 등의 문헌[2013. Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369]).
용어 "스캐폴드 모듈"은 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 하나 이상의 결합 모듈에 대한 지지 구조로서 작용할 수 있는 단백질을 지칭한다. 결합 모듈은 링커를 통해 스캐폴드 모듈에 부착될 수 있고/있거나 결합 모듈은 스캐폴드 모듈에 존재하는 임의의 루프 영역 내에 통합될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 본원에서 단수 형태 "일", "하나", 및 "그"는 복수의 참조를 포함한다는 점에 유의한다.
T 세포 활성화 및 기능소실
T 세포 활성화
T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에서 MHC 복합체에 의해 나타나는 바와 같이 항원에 결합한다. TCR/MHC/항원의 결합은 T 세포의 초기 활성화를 촉발한다. T 세포 항원 수용체(TCR)/CD3 복합체를 통한 T 세포 신호전달은 다수의 효과기 경로를 활성화하는 신호 어레이를 촉발한다.
T 세포 활성화는, TCR/CD3 복합체 생성 신호 및 다른 세포 표면 수용체로부터 생성된 신호 둘 모두에 의해 양성적 및 음성적으로 조절되고/되거나 가용성 매개체에 의해 전달되어 T 세포가 적절한 리간드에 반응하고 적절한 지속시간 동안 반응하는 것을 보장한다. T 세포 활성화의 핵심 원칙은 오로지 TCR만을 통한 신호 전달이 무력 상태(공자극의 결여에 의해 유도될 수 있는 특정 항원에 대한 T 세포의 저반응 상태)를 초래한다는 것이다.
다수의 표면 수용체는 CD28, CD30, CD5, CD2, ICOS, OX40 및 4-1BB(CD137)를 포함하는 T 세포에 대한 공자극을 제공할 수 있는 것으로 기술되었다. CD28은 면역 반응의 유도 동안 발현되며, 이는 ICOS, OX40 및 CD137을 포함하는 여러 다른 공자극 분자의 발현을 촉진한다.
TCR-생성 조절 신호는 또한 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4) 및 예정 사멸-1(CD279로도 알려진 PD-1)과 같은 다른 공동 수용체의 결찰로부터의 신호에 의해 보완되며, 이들 모두는 TCR-촉발 T 세포의 증식 및 활성화를 제한하는 기능을 한다. 음성 조절자로서의 이들의 기능을 고려하여, CTLA-4 및 PD-1은 면역 관문으로서 기술된다. 활성화된 T 세포 상에서 발현된 PD-1의 PD-L1 리간드(B7-H1 또는 CD274로도 알려짐)와의 결찰은 주요 면역 관문을 활성화시킴으로써 T 세포 내성, 기능장애 및 T 세포 고갈을 초래하는 것으로 널리 알려져 있다.
염증성 사이토카인의 존재 하에서의 종양 항원 펩티드/MHC 클래스 I 복합체에 대한 장기간 노출은 고형 종양에 존재하는 T 세포에서 구별되는 표현형을 유도하고, 효과기 기능의 점진적인 손실, 억제 면역 관문 수용체의 높고 지속적인 발현, 불량한 증식 능력(Pauken KE 및 Wherry EJ의 문헌[Trends Immunol 2015; 36(4): 265-276 (2015)], Wherry EJ 및 Kurachi M의 문헌[Nat Rev Immunol 2015 15(8): 486-499 (2015)]), 대사 조절이상, 메모리 재호출 불량, 및 구별되는 전사 및 후생유전성 프로그램(McLane, L 등의 문헌[Ann. Rev. Immunol. 37:457 (2019)])으로 특징지어진다.
T 세포 기능소실
기능 장애 또는 만성적으로 자극된 T 세포는 암에서 반복적인 TCR 자극에 따라 발생하고 마우스 모델 및 인간에서 발견되는 뚜렷한 계통이다(Zajac AJ 등의 문헌[J.Exp.Med 188,2205-2213(1998)], Bakhli MY의 문헌[Cytokine, 71, 339-347 (2011)], Wherry 및 Kurachi의 문헌[Nat.Rev.Immunol 15, 486-499 (2015)]). 염증성 사이토카인의 존재 하에서의 종양 항원 펩티드/MHC 클래스 I 복합체에 대한 장기간 노출은 고형 종양에 존재하는 T 세포에서 구별되는 표현형을 유도하고, 효과기 기능의 점진적인 손실, 억제 면역 관문 수용체의 높고 지속적인 발현, 불량한 증식 능력(Pauken KE 및 Wherry EJ의 문헌[Trends Immunol 2015; 36(4): 265-276 (2015)], Wherry EJ 및 Kurachi M의 문헌[Nat Rev Immunol 2015 15(8): 486-499 (2015)]), 대사 조절이상, 메모리 재호출 불량, 및 구별되는 전사 및 후생유전성 프로그램(McLane, L 등의 문헌[Ann. Rev. Immunol. 37:457 (2019)])으로 특징지어진다.
면역억제 관문의 활성화로 인해 발생하는 음성 조절 신호는 TME에서 효과기 T 세포 기능장애의 주요 메커니즘인 것으로 여겨진다. 암 조사에서, 종양-항원 특이적 반응 및 동시 진행성 질환의 존재는 PD-1을 기능소실에 대한 마커로서 식별한다. 이전의 연구는 관문 차단이 T 세포 기능을 적어도 부분적으로 재활성화할 수 있음을 입증하였다(Fuertes Marraco SA 등의 문헌[Front Immunol 6, 310(2015)]). PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 T 세포 기능을 부분적으로 복원하는 것으로 입증되었다.
PD-1/PD-L1 경로
PD-1/PD-L1 경로는 광범위하게 연구되었다(Salmaninejad 등의 문헌(2019); Han 등의 문헌(2020); Makuku 등의 문헌(2021)). PD-1은 IgV-유사 세포외 도메인을 함유하는 288개의 아미노산, 이어서 막관통 영역 및 TCR 신호전달 및 조절을 위한 2개의 인산화 부위를 갖는 세포내 테일을 가진 55 kDa 막관통 단백질이다(Ishida, Agata, Shibahara, 및 Honjo). PD-L1은 이의 세포외 영역에 Ig- 및 IgC-유사 도메인을 가진 290개의 아미노산을 갖는 1형 막으로부터 통과하는 33-kDa 당단백질이다(Freeman 등의 문헌(2000)). PD-1 및 PD-L1은 면역 관문 단백질이다.
PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK), 활성화된 단핵구, 수지상 세포(DC), 대식세포, 및 미성숙 랑게르한스 세포와 같은 다양한 활성화된 면역 세포에서 발현된다. PD-1은 또한 항원에 일정하게 노출된 T 세포의 표면 상에서 상향조절되고, 기능소실된 T 세포의 마커 중 하나이다(Ahmadzadeh 등의 문헌(2009)). NFAT, NOTCH, FOXO1 및 IRF9를 포함하는 전사 인자는 PD-1 발현의 전사를 촉발한다(Staron 등의 문헌(2014)). IL-2, IL-21, IL-15, IL-7, 및 1형 IFN과 같은 사이토카인은 PD-1 발현을 향상시킬 수 있다. IL-6 및 IL-12는, 각각 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT3) 및 STAT4를 사용하여 비장 CD8 T 세포에서 PD-1 발현을 증가시킨다(Salmaninejad 등의 문헌(2019)).
PD-L1은 특히 염증성 조건 하에서 대식세포, B 세포, DC 및 일부 상피 세포와 같은 항원 제시 세포(APC)에 의해 구성적으로 발현된다(Sharpe 등의 문헌(2007)). 자가면역 손상을 방지하기 위해서는 말초 조직에서 PD-L1의 존재가 필요하다. 또한, PD-L1은 여러 유형의 종양 세포, 예컨대 비소세포 폐암(NSCLC), 혈액성 악성종양 및 바이러스 감염 세포에 의해, 항종양 반응을 회피하기 위한 "적응 면역 메커니즘"으로서 발현된다(Ohaegbulam 등의 문헌(2015)). 저산소증 유도 인자 a(HIF-1a), STAT3 및 NF-kB와 같은, 여러 전사 인자가 암세포에서 PD-L1의 전사 상향조절에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Chen 등의 문헌(2015)). 또한, IL-4, IL-10, TNFα, IFNη 및 성장 줄기 세포 인자뿐만 아니라 박테리아 LPS 및 VEGF와 같은 침윤된 면역 세포에 의해 생성된 사이토카인은 PD-L1 유전자의 발현을 상향조절한다(Ji 등의 문헌(2015)).
PD-1의 생리학적 역할은 기능적 T 세포의 억제 및 T 조절(Treg) 세포의 생성이다. PD-1/PD-L1과 같은 Treg 및 공동-억제 면역 관문은 면역계의 비정상적이고 만성적인 활성화 및 자가 항원에 대한 면역 반응성을 방지하기 위한 안전장치(fail-safe) 역할을 한다. 그러나, PD-1/PD-L1 경로는 항-종양 T 세포 반응을 회피하고 종양 면역 회피를 촉진하는 수단으로서, 암세포 또는 종양 연관 항원 제시 세포에 의해 공조되는 것으로 잘 알려져 있다(Hargadon 등의 문헌(2018)). 종양은 PD-L1을 발현함으로써 숙주 면역 감시를 피할 수 있다. PD-1과 PD-L1 간의 상호작용은 T 세포의 하향조절 및 이들의 세포자멸사, 및 종양 미세환경으로부터의 배제를 야기함으로써, 암세포가 면역 반응을 피할 수 있게 한다(Iwai 등의 문헌(2017)).
PD-1/PD-L1 표적화
PD-1은 공통의 구조: 면역글로불린 유사 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 면역수용체 티로신 기반 억제 및 신호전달 모티프를 함유하는 세포내 도메인을 공유하는 수용체의 B7/CD28 계열의 구성원이다. PD-1이 이의 리간드인 PD-L1에 의해 결합될 때, 이러한 상호작용은 신호를 세포 내로 전달하는 SRC 상동성 인산분해효소 SHP1 및 SHP2의 동원을 야기한다. PD-1은 주로 활성화된 T 세포, 적응 면역 반응의 주요 세포독성 효과기 상에서 발현되며, PD-1이 전달하는 신호는 T 세포 매개 면역 반응을 약화시키는 데 도움이 된다. 이전의 연구는 PD-1의 억제 효과를 차단하는 것이 종양 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증하였다. 이러한 상호작용을 차단하는 PD-1/PD-L1 관문 억제제는 면역 세포 증식을 증가시키고 신체의 자연 항종양 감시 시스템의 효능을 향상시킨다. 따라서, 면역 요법의 전달을 개인화하는 접근법에 있어서, 면역 관문에 대한 암의 회피 메커니즘을 이해하는 것은 중요하다.
세포독성 활성을 체크 상태로 유지하는 T 세포를 완전히 활성화시키기 위해서는 2개의 별도의 신호가 필요하다. 첫 번째 신호는 T 세포 수용체와 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 제시 항원 에피토프 사이의 상호작용으로부터 유래한다. 두 번째 신호는 T 세포 및 APC 표면 상의 공자극 수용체-리간드 쌍의 결합으로부터 유래한다. PD-1은 리간드 결합을 통해 T 세포 활성을 조절하는 공억제 수용체의 군에 속하며, 이는 T 세포를 기능소실으로 알려진 상태로 유도할 수 있으며, 해당 상태에서 이들은 증식할 수 없거나 이들의 효과기 기능을 수행할 수 없다.
PD-1/PD-L1 경로의 차단은 기능소실된 종양 침윤 T 림프구의 기능을 재생/복원하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 항-PD-1/PD-L1 및 항-CTLA-4 면역 관문 억제제를 사용하는 치료는 기능장애 TIL을 재활성화시키고 이들의 항-종양 효과를 증가시키는 것으로 보고되었다(Wherry 및 Kurachi의 문헌(2015); Zarour의 문헌(2016); Miller 등의 문헌(2019)).
CD137 공자극 경로
4-1BB 또는 TNFRSF9(TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9)로도 지칭되는 CD137은 활성화된 T 세포 상에서 발현되는 유도 가능한 공자극 수용체로서 처음 식별되었으며, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 30 kDa 막-스패닝 당단백질이다. 4-1BB에 대한 현재의 이해는, 관련 발현이 일반적으로 활성화 의존적이라는 것을 나타내며, 이는 활성화된 T 세포, 활성화된 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T(NKT) 세포, 조절 T 세포, 여포성 DC를 포함하는 수지상 세포(DC), 자극된 비만 세포, 분화 골수 세포, 단핵구, 호중구, 및 호산구를 포함하는, 광범위한 하위 면역 세포 세트를 포함한다는 것을 나타낸다. 4-1BB 발현은 또한 종양 혈관계 및 죽상경화성 내피 상에서 입증되었다. CD137(CD137L)을 자극하는 리간드는 활성화된 항원 제시 세포(APC), 골수 전구체 세포, 및 조혈 줄기 세포에서 발현된다(Wang 등의 문헌[Immunological Reviews , 2009, 229, 192-215]).
CD137은 미치료 T 세포의 표면 상에서는 검출되지 않는다. TCR 신호전달 자극 시, CD137 발현은 자극 후 2-3일차에 유도되고 피크에 도달하며, 3일 후에 감소한다. CD137은 활성화된 T 세포의 세포 표면 상에서 단량체 및 이량체 둘 모두로서 발현한다. TNFRSF 계열의 다른 구성원과의 상동성에 기초하여, 리간드 결합은 수용체 삼량체화를 유도하여 수용체를 활성화시킨다. TNFRSF의 일부 구성원은 세포 표면으로부터 세포외 도메인의 절단 후 가용성 형태로 존재할 수 있다. 가용성 4-1BB 및 가용성 4-1BBL은 자가면역 질환 및 암을 가진 일부 환자의 혈청에서 검출되었다(Wang 등의 문헌[Immunological Reviews, 2009, 229, 192-215]).
CD137은 이의 세포질 도메인에서 알려진 고유 효소 활성이 없는 TNF-수용체(TNFR) 수퍼패밀리의 구성원이다. 이는 TNFR-연관 인자(TRAF) 계열의 어댑터 단백질에 의존하여 신호를 세포 내로 형질도입시키기 위한 CD137 신호체를 구축한다. CD137L 삼량체의 결합에 의해 또는 작용제 단클론 항체와의 가교 결합에 의한 CD137 활성화 시, TRAF1, TRAF2, 및 TRAF3은 CD137의 세포질 도메인에 용이하게 동원되며, 이는 상이한 구성을 갖는 동종 및/또는 이종삼량체로서, CD137 신호체의 작제를 개시하며, 이는 NF-κB 및 ERK, JNK, 및 p38 MAP 키나아제를 포함하는 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나아제 캐스케이드의 하류 활성화를 초래한다(Bartkowiak 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 2018, 24, 1138-1151]).
CD137은 효과적인 T 세포 면역 반응의 지속 및 면역학적 기억의 생성에 중요한 역할을 한다. CD137의 발현 프로파일, 그리고 종양 면역과 관련된 림프구의 다수의 하위집합에서 강력한 효과기 반응을 강화하는 이의 고유한 능력은 CD137을 면역요법에 대한 독특하게 매력적인 표적으로 만든다.
마우스 및 인간 T 세포에 대한 다수의 연구는 CD137이 세포 증식, 생존 및 사이토카인 생성을 촉진함을 나타낸다. CD137 작용제 항체는 세포용해 T 림프구 반응을 현저하게 향상시키는 것으로 나타났다. 단일요법으로서 또는 관문 억제제와 같은 다른 요법과의 조합으로서의 작용제 CD137 항체는 예방 및 치료 설정에서 항-종양 혜택의 증거를 제공하였다. CD137의 자극은 생체 내에서 지속적인 항-종양 보호 T 세포 기억 반응을 유발하는 것으로 나타났다(Fisher 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother 2012, 61, 1721-1733]). 보다 최근에, CD137 작용제 항체는 종양 혈관계에서 세포 부착 분자 ICAM-1, VCAM-1, 및 E-셀렉틴의 발현을 증가킴으로써 종양 미세환경 내로의 T 세포 이동을 증가시키는 것으로 입증되었다(Palazon 등의 문헌[Cancer Research , 2011, 71(3), 8001-811]).
그러나, CD137-/- 마우스 및 작용제 CD137 항체 둘 모두가 향상된 항종양 활성을 나타낸다는 의문의 관찰은 CD137 신호전달의 단순한 활성화가 항종양 효과를 완전히 설명할 수 없다는 것을 나타낸다. 다수의 연구는 CD137L에 대한 결합 시의 CD137 신호전달을 보고하였다. 최근의 축적된 증거는 CD137L/CD137 상호작용이 양방향 신호전달을 야기한다는 것을 입증한다. CD137L은 주로 DC와 같은 활성화된 APC 상에서 발현되기 때문에, CD137L로부터의 역방향 신호전달은 DC의 발달 및 기능에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Kwon의 문헌[Immune Network, 2015, 15(3), 121-124]). 2017년, 연구 결과들은 이러한 역설적 결과를 설명하는, 종양의 항원 제시 수지상 세포(DC)에서의 CD137 리간드(CD137L)에 의한 역 신호전달을 입증하였다. 구체적으로, CD137L 역 신호전달은 IFNγ 생성 CD8+ 세포독성 T 림프구를 생성하는 데 중요한 역할을 하는 IL12-생성 CD103+ DC 및 1형 종양 연관 대식세포(TAM)의 종양내 분화를 억제하였다. 특히, CD137L 차단은 IL12 및 IFNγ의 수준을 증가시켰으며, 이는 종양 내에서 IFNγ 생성 CD8+ T 세포, IL12-생성 CD103+ DC, 및 1형 TAM의 종양내 분화를 추가로 촉진하였다. 따라서, DC에서 CD137L 역 신호전달을 차단하는 동시에 T 세포에서 CD137 신호전달을 활성화시키는 것은 C137 경로의 항-종양 활성을 완전히 유도해야 한다(Kang 등의 문헌[Cancer Research , 2017, 77 (21), 5989-6000]).
미치료 및 종양 보유 마우스에서의 CD137 작용제 항체의 높은 투여량은 간으로의 T 세포 침윤 및 간 염증 또는 손상의 징후인 아스파르테이트 아미노-전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 상승을 유도하는 것으로 보고되었다. 항-CD137 항체(우렐루맙, Bristol Myers)의 효능을 평가하는 임상 연구에 기초하면, CD137 활성의 활성화는 치료적 항종양 활성을 유도할 수 있다. 그러나, 간 독성은 임상 개발을 제한한다. 제2 항-CD137(우토밀루맙, Pfizer)의 임상 평가는 허용 가능한 안전성 프로파일을 나타냈지만, 임상 효능은 제한적이었다. 현재까지, CD137에 대해 승인된 치료적 항체는 없다.
PD/PD-L1 관문 및 CD137을 표적화하는 이중특이체
공자극 수용체는 T 세포의 효과기 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하기 때문에, 공자극 경로의 작용은 관문 억제 효능을 개선할 수 있으며, 지속적인 항종양 반응을 야기할 수 있다. PD-1/PD-L1 경로를 표적화하도록 설계된 이중특이체 분자 및 T 세포 공자극 분자는 관문을 해제하는 동시에 T 세포를 공자극하여 항종양 면역의 효율적인 유도를 제공할 수 있다. 분자 설계의 양태에 따르면, T 세포 활성화는 트랜스 결합을 통해 발생할 수 있으며, PD-L1 결합에 의존함으로써, 종양 미세환경에 대한 면역 활성을 효과적으로 제한할 수 있다. T 세포 상의 적절한 공자극 표적은 CD137, OX40, CD28, CD27, CD226, GITR, ICOS, TNFRSF25, LIGHT(TNFSF14), TIM-1, 및 LFA-1을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
종래의 전임상 실험 및 임상 데이터는 공자극 경로에 대한 작용이, 특히 다른 면역 활성화 전략과 조합하여 사용될 때, 암에서 T 세포 반응을 재활성화하기 위한 강력한 효과적인 전략일 수 있음을 명확하게 지지한다. PD-L1 및 T 세포 상의 공자극 분자에 대한 이중 특이체인 결합 단백질은 PD-L1-발현 항원 제시 세포(APC) 또는 종양 세포 및 활성화된 T 세포에 대한 동시 결합을 매개함으로써, 종양 침윤 T 세포 및 CD8+ 세포용해 T 세포와 같은 종양 특이적 T 세포의 조건부 활성화를 초래하여, 작용제 항-CD137 항체의 표적-외 종양 독성을 완화시킨다.
TGFβ
TGFβ 수퍼패밀리는 TGFβ, 결절, 액티빈, 좌골, 골 형성 단백질 및 성장 및 분화 인자를 포함하는, 구조적으로 연관된 단백질의 큰 군이다. TGFβ 신호전달은 Smad 및 비-Smad 경로를 통해 형질도입된다. TGFβ는 TME에서 면역 억제 및 면역감시 회피를 매개하는 데 중요한 기능을 갖는 다면 발현성 사이토카인이다. TGFβ는 종양에 의해 비정상적으로 생성되며, 주로 선천성 및 적응성 면역계 둘 모두를 억제함으로써 암 진행을 촉진한다. 항-종양 면역의 음성 조절자로서, TGF-β는 항-PD-1/PD-L1의 효능을 손상시키고 약물 내성을 유도한다.
대부분의 암종 환자 중 단지 약 10 내지 30%만이 항-PD-1/PD-L1 단독요법으로 치료받은 경우 객관적 반응을 보이는 것으로 보고되었으며, 이는 치료 전 종양 표본에서 PD-L1을 발현하는 환자만 선택적으로 등록하는 임상시험에서도 마찬가지였다(Lipson, EJ 등의 문헌[Semin. Oncol. 42(4):587 (2015)]). 이러한 반응의 결핍에 대한 하나의 가능한 설명은 면역억제 세포(예를 들어, 조절 T 세포(Treg)) 및 T 세포 프라이밍을 억제하거나 효과기 T 세포 기능을 억제하는 기능을 하는 다른 인자(예를 들어, 사이토카인 및 대사 경로)의 존재에 기인하는 종양 미세환경의 면역억제 성질이다. 항-PD-1/PD-L1 요법의 효과는 과활성 TGFβ 신호전달을 특징으로 하는 TME에서 제한되는 것으로 보고되었다(Tauriello DVF 등의 문헌[Nature, 554:538-543 (2018)]).
TGFβ 신호전달의 효과는 3개의 TGFβ 리간드(TGF-β1 내지 3)에 의해 매개되며, 이들 모두는 TGFβ 1형(TGFβR1) 및 2형 수용체 TGFβR2를 통해 동종이량체로서 존재한다. 종양 미세환경에서 TGFβ 신호전달의 균형에 밀접하게 관여하는 다수의 세포 상황 의존적 인자가 존재한다(Liu S 등의 문헌[Mol Med Rep 17: 699-704 (2018)]). TGFβ는 항종양 면역 반응을 억제하는 중요한 인자인 것으로 밝혀졌지만, T 세포 및 종양 유래 TGF-β의 정확한 역할에 대한 이해는 부족한 상황이다.
Treg, 단핵구 골수 유래 억제 세포(MDSC), 대안적으로 편광된 대식세포(M2 표현형), 및 이들의 연관 가용성 인자는 항-종양 면역을 억제할 수 있는 공지된 억제 메커니즘이다. MDSC는 종양 미세환경에서 TGFβ의 일차 공급원인 것으로 보고되었다.
Treg는 고형 종양에서 흔히 발견되며, 효과기 세포와 함께 사이토카인을 활성화하기 위한 경쟁 및 면역억제 사이토카인의 분비를 포함하는 여러 메커니즘에 의해 면역억제를 촉진할 수 있다. 예를 들어, Treg는 종양 미세환경에서 적응 면역 프라이밍 및 효과기 반응 둘 모두를 반전시키는 면역억제 인자인 형질전환 성장 인자-베타(TGFβ)의 수준에 기여한다.
종양 미세환경 조절제를 표적화하는 치료제의 설계는 종양 면역 요법을 최적화하는 데 사용되는 공인된 전략이다. 예를 들어, TGFβ와 면역 세포의 상호작용은 종양 미세환경 및 암 진행에서 중요한 조절 축으로서 식별되었다. TGFβ는 Treg의 분화를 유도하고, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 세포독성을 감소시키고, 면역 세포의 종양 침윤을 제한하고, 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제시를 억제함으로써 다수의 면역 세포의 기능을 조절한다(Yi, M 등의 문헌[J. Hematol. Oncol. 14(1):27 (2021)]). TGF-β 신호전달 경로의 억제를 위한 주요 전략은 이의 수용체에 대한 TGF-β의 결합을 방해하거나, 세포내 신호 전달을 차단하거나, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 발현을 방해하는 치료제를 설계하는 것이다.
종양 미세환경 조절제로서의 TGFβ
항-PD-1/PD-L1 면역요법의 효과는 과활성 TGFβ 신호전달을 특징으로 하는 TME에서 제한적이다. 전임상 연구의 데이터는 TGFβ의 차단 또는 길항이 TGFβ의 면역억제 효과에 기여하는 여러 인자를 잠재적으로 파괴할 수 있다는 전제를 뒷받침한다. Budhu 등의 연구는 T 세포의 항종양 활성이 종양 상주 조절 T(Treg) 세포에 의해 억제되었고, 면역억제는 해당 Treg 세포 표면 상의 TGFβ의 존재에 의존한다는 것을 발견하였다. TGF-β에 대한 차단 항체는 면역억제를 역전시키고 항종양 반응을 증강시켰다(S. Budhu 등의 문헌[Sci. Signal. 10, eaak9702 (2017)]). 다른 공개된 데이터는 TGFβ가, T 세포가 종양을 침윤시키는 것을 차단함으로써 항종양 면역 반응을 억제한다는 것을 시사한다. 요로상피암의 마우스 모델에서 수행된 연구는, TGF-β 신호전달 및 PD-L1을 표적화하는 항체와의 병용 요법이 종양에 침투하는 T 세포의 능력을 증가시키고, 종양 퇴행을 유도하고, 항종양 면역 반응을 강화시킨다는 것을 입증하였다(Mariathasan, S 등의 문헌[Nature 554, 544-548 (2018)]).
Tauriello, D.V.F. 등은 대장암과 연관된 4개의 돌연변이를 발현하는 마우스를 연구하였으며, 마우스에서의 전이가 간질에서 T 세포 침윤 및 활성 TGFβ의 감소를 특징으로 한다는 것을 발견하였다. PD-1-PD-L1 면역 관문의 억제는 모델 시스템에서 제한된 반응을 유발하였지만, TGFβ의 억제는 전이를 방지하는 강력하고 지속적인 세포독성 T 세포 반응을 유발하였다. 진행성 간 전이 질환을 갖는 마우스에서, TGFβ 신호전달의 차단은 종양이 항-PD-1/PD-L1 요법에 민감하게 만들었으며, 생존을 증가시켰다(Tauriello의 문헌[Nature 554, 544-548 (2018)]).
M7824(빈트라푸스프 알파(bintrafusp alfa))는 Merck KGaA, Darmstadt, Germany, 및 GlaxoSmithKline에서 개발 중인 이작용성 융합 단백질이다. M7824는 TGF-βRII(136개 아미노산)의 가용성 세포외 도메인의 N 종결부에 가요성 (Gly4Ser)4Gly 링커를 통해 유전자적으로 융합된 인간화 IgG1 단클론 항체 아벨루맙으로부터 유래된 VH 및 VL 서열을 포함한다. 이는 3개의 TGF-β(TGF-β1 내지 3) 리간드 이소형 모두에 대한 사이토카인 트랩으로서 기능한다.
여러 전임상 연구는 빈트라푸스프 알파가: (1) 인간 암종 세포에서 TGF-β-유도 상피-중간엽 전이의 예방 또는 역전(종양 세포 가소성의 이러한 변경은 인간 종양 세포를 면역 매개 공격뿐만 아니라 여러 화학요법제에 보다 취약하게 하는 것으로 나타남); (2) 자연 살해 및 T 세포의 표현형의 변경, 및 이에 따른 종양 세포에 대한 이의 세포용해 능력의 향상; (3) 항체 의존성 세포 매개 세포독성 메커니즘을 통한 인간 종양 세포의 향상된 용해의 매개; (4) Treg 세포의 억제 활성 감소; (5) 다수의 전임상 모델에서의 항종양 활성 매개; 및 (6) 방사선 및 PD-L1 및 TGF 베타 경로를 동시에 차단하도록 설계된 화학요법 및 여러 다른 면역치료제와 조합 시 항종양 활성 향상의 능력을 갖는다는 것을 입증하였다(Lind H 등의 문헌[J Immunother Cancer, Feb;8(1):e000433(2020)]). 항-PD-L1/TGFβ 트랩(빈트라푸스프)을 사용한 치료는 단일 제제 항-PD-L1 또는 TGFβ 트랩 단백질보다 우월한 것으로 보고된 상승적 항-종양 효과를 유도하는 것으로 나타났다(미국 특허 제9,676,863호).
관찰된 상승작용은 면역 세포 상의 PD-1과 종양 세포 상의 PD-L1 간의 상호작용의 동시 차단 및 종양 미세환경에서 TGFβ의 중화에 기인한다(미국 특허 제9,676,863호). 상승 효과는 2개의 주요 면역 회피 메커니즘의 동시 차단에 기초하는 것으로 추정된다. TGFβ의 고갈은 (종양 세포의 항-PD-L1 표적화의 결과로서) 종양 미세환경에서의 TGFβ 사이토카인 수준 및 PD-L1 수용체 매개 엔도시토시스를 통한 TGFβ의 파괴를 길항함으로써 달성된다(미국 특허 제9,676,863호).
PD/PD-L1 관문 및 TGFβ를 표적화하는 PD-L1 결합 단백질
PD-1/PD-L1 및 TGFβ의 이중 차단은 상승적 항-종양 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Chen, X 등의 문헌[Int. J. Cancer 143:2561 (2018)] 및 Yi, M 등의 문헌[J. Hematol. Oncol. 14(1):27 (2021)]). PD-1/PD-L1 축 및 TGFβ의 면역억제 효과가 상보적이고 독립적이라는 점을 고려하면, 항-PD-L1 면역요법의 효능을 향상시키기 위해 TGFβ 신호전달을 차단할 수 있는 PD-L1 결합 단백질을 설계하는 것이 합리적이다(Yi, M 등의 문헌[J. Hematol. Oncol. 14(1):27 (2021)]). 또한, PD-L1에 결합하고 TGF-β 경로 길항제를 포함하는 이중특이체 또는 삼중특이체 결합 단백질은 PD-1/PD-L1 단일요법에 내성이 있는 환자에게 효과적인 옵션을 제공할 수 있다(Kim 등의 문헌[J Hematol Oncol, 14:55 (2021)]).
항-PD-L1 면역요법의 효능을 향상시키기 위해, PD-1/PD-L1 축 및 TGFβ 신호전달 경로를 동시에 차단할 수 있는 결합 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 또한 CD137에 결합하여 T 세포 반응성을 촉진하는 공자극 신호를 제공할 수 있다.
PD-L1 단일특이체
일부 구현예에서, 본 개시된 PD-L1 단일특이체(1923Ab2 및 1923Ab3)은 인간 PD-L1에 특이적이다(예를 들어, 특이적으로 결합한다). 이들 결합 단백질 및 이의 단편은 고유한 CDR 서열 세트, PD-L1에 대한 특이성을 특징으로 하며, PD-1/PD-L1 신호전달의 강력한 억제 활성을 나타낸다. 보다 구체적으로, 일 양태에서, 본 개시는 인간 PD-L1에 결합하는 결합 단백질, 및 종양 미세환경에 국소화된 세포의 PD-L1 매개 활성을 조절하기 위한 단일 요법으로서 또는 다른 항암제와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다. 대안적인 구현예에서, 본 개시된 PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 또한 PD-1/PD-L1 관문 억제로부터 효과기 T 세포를 억제-해제/방출하도록 설계된 이중특이체 및 삼중특이체의 서브유닛으로서 사용될 수 있다.
대안적인 양태에서, 본 개시는, PD-L1에 결합하는 이중특이체 또는 삼중특이체의 설계를 위한, PD-L1에 결합하는 본 개시된 결합 단백질의 용도 및 PD-L1/PD-L1 관문을 억제하지 않고 T 세포 활성화를 촉진하는 이의 용도에 관한 것이다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 PD-L1에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는 (a) 표 1의 1923Ab2에 대한 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 표 2의 1923Ab2에 대한 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 PD-L1에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는 (a) 표 1의 1923Ab3에 대한 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 표 2의 1923Ab3에 대한 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 VH(예를 들어, 서열번호 1 및 3) 및 VL(예를 들어, 서열번호 2 및 4)을 포함하는 중쇄 영역 서열을 갖는 단클론, 키메라, 이중특이체 또는 삼중특이체일 수 있으며, 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc 침묵화 돌연변이(L234A L235A 또는 N297A)를 갖는 인간 IgG1-형이다.
일부 구현예에서, 본 개시된 항-PD-L1 항체는 Fc-조작되는 것이 유리하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는, PD-L1에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 여기에서 중쇄 서열은 서열번호 42 또는 45와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 서열은 서열번호 40과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 본 개시된 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-L1에 결합하고, 인간 PD-L1과 PD1 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있다.
일 구현예에서, 결합 단백질은 5 x 10-9 M 이하의 KD로, 바람직하게는 2 x 10-9 M 이하의 KD로, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합하는 결합 단백질, 또는 이의 단편에 관한 것으로서, 이는 PD-L1에 결합하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 항체(Tecentriq)와 교차 경쟁한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 결합 단백질, 또는 이의 단편은 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 인간 PD-L1에 특이적이거나, (b) 시노몰구스 PD-L1과 교차 반응하거나, (c) PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 방해하거나, (d) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 제거한다.
PD-L1/PD-1 상호작용의 파괴 및 PD-L1에 결합하는 본 개시된 결합 단백질에 의한 활성화 관문의 억제-해제를 다수의 시험관 내 검정을 사용하여 조사하였다. 항-PD-L1 모이어티의 생체활성은 PD-1/PD-L1 차단 검정을 사용하여, TCR 신호전달을 복원하는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 파괴하는 이의 능력으로 결정하였다.
CD137 단일특이체
일부 구현예에서, 본 개시된 CD137 단일특이체(1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6)은 인간 CD137에 특이적이다(예를 들어, 특이적으로 결합한다). 이들 결합 단백질 및 이의 단편은 고유한 CDR 서열 세트, CD137에 대한 특이성을 특징으로 하며, 단일요법으로서 또는 다른 항암제와 조합하여 암 면역요법에 유용하다. 본원에서 입증된 바와 같이, CD137에 결합하는 결합 단백질은 또한 PD1/PD-L1 관문 억제로부터 방출된 효과기 T 세포를 재활성화하도록 설계된 이중특이체 및 삼중특이체의 서브유닛으로서 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 개시는 인간 CD137에 결합하는 결합 단백질, 및 종양 미세환경에 대해 국소화된 세포의 CD137 매개 활성을 조절하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 CD137에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는 (a) 표 3의 1923Ab4에 대한 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 표 4의 1923Ab4에 대한 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 CD137에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는 (a) 표 3의 1923Ab5에 대한 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 표 4의 1923Ab5에 대한 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 CD137에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 이는 (a) 표 3의 1923Ab6에 대한 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 표 4의 1923Ab6에 대한 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질은 VH(예를 들어, 서열번호 16, 18 및 20) 및 VL(예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21)을 포함하는 중쇄 영역 서열을 갖는 단클론, 키메라, 이중특이체 또는 삼중특이체일 수 있으며, 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc 침묵화 돌연변이(L234A L235A 또는 N297A)를 갖는 인간 IgG1-형이다.
일부 구현예에서, 본 개시된 항-CD137 항체는 Fc-조작되는 것이 유리하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는, CD137에 결합하는 결합 단백질을 제공하며, 여기에서 중쇄 서열은 중쇄 서열: 서열번호 75와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 서열은 경쇄 서열: 서열번호 76과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
출원인은 보다 양호한 면역요법을 위한 표적-외 종양 독성 및 면역억제 환경을 극복하기 위해 원하는 프로파일을 나타내는, CD137에 결합하는 결합 단백질을 발견하고자 하였다. CD137에 결합하는 본 개시된 결합 단백질은 항-PD-1/PD-L1 내성에 기여하는 기능소실 T 세포 또는 조절 T 세포가 풍부한 종양 미세환경에 특히 유익할 수 있다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 결합 단백질 및 이의 단편은 단독으로 또는 조합하여 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 CD137에 특이적이거나,
(b) 시노몰구스 CD137과 교차 반응하거나,
(c) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나,
(d) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나,
(e) CD137 신호전달에 대한 가교 결합 의존성 작용제 활성을 보유하거나,
(f) 가교 결합 의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다.
일 구현예에서, 본 개시된 결합 단백질은 가교결합제의 존재 하에 CD137 신호전달을 활성화시킨다. 일차 PBMC를 사용하는 T 세포 활성화 검정에서, 이들은 가교결합 의존적 방식으로 항-CD3 자극 IFN-감마 방출을 강화시켰다.
일부 구현예에서, 본 개시된 결합 단백질은 인간 CD137 및 시노몰구스 CD137 둘 모두에 결합하는 것이 유리하다. 시노몰구스 원숭이(예를 들어, Macaca fascicularis)의 세포 상에서 발현된 CD137과의 교차 반응성은 대리 항체를 사용할 필요 없이 항체 분자의 동물 시험을 가능하게 하기 때문에 유리하다. CD137, 1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6에 결합하는 본 개시된 결합 단백질 모두는 주목할 만한 친화도로 시노몰구스 원숭이의 CD137에 결합한다. 본 개시된 항체는 마우스 CD137에 결합하지 않지만, 인간화 CD137 마우스가 이용 가능하며, 이는 생체 내 전임상 마우스 종양 모델에서 본 개시된 항체의 효능을 연구하는 데 사용될 수 있다.
다수의 시험관 내 검정을 사용하여 본 개시된 항-CD137 항체에 의한 T 세포 활성화를 조사하였다. 항-CD137 모이어티의 생체활성은, CD137을 과발현하고 NFκB 루시페라아제 리포터를 운반하는 검정 세포를 사용하여, 가교 결합 의존성 CD137 신호전달을 유도하는 능력으로 결정하였다. 또한, 가교 결합된 항-CD137은 PBMC에서 항-CD3 자극 IFNγ 방출을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 당업자는 보존적 아미노산 치환이 하나의 아미노산을, 예를 들어 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이라는 것을 인식할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에, 예를 들어, Watson 등의 문헌[Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Publication Company, 제4판 (1987)]에 기술되어 있다.
"보존적 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 결합 단백질의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류는 양호하게 정의되어 있으며, 이는 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 황 함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 포함한다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 대해 이전에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드의 임의의 고유 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다(MacLennan 등의 문헌[(1998) Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67]; Sasaki 등의 문헌[(1998) Adv Biophys 35: 1-24]). 본원에 개시된 결합 단백질에 대한 아미노산 치환은 공지된 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이 유발에 의해 이루어질 수 있다(미국 특허 제4,683,195호).
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 16, 18 또는 20에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 16, 18 또는 20의 가변 중쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 16, 18 또는 20의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 16, 18 또는 20의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 16, 18 또는 20에 제시된 결합 단백질 중쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 16, 18 또는 20에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 17, 19 또는 21에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 17, 19 또는 21에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 17, 19 또는 21의 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 17, 19 또는 21의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 17, 19 또는 21의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 17, 19 또는 21에 제시된 결합 단백질 경쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 16, 18 또는 29에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 17, 19 또는 21에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
PD-L1/CD137 이중특이체
소정의 구현예에서, 본 개시는 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈 및 항-CD137 항체로부터 유래된 CD137 제1 결합 모듈을 포함하는 PD-L1/CD137 이중특이체를 제공하며, 여기에서 이중특이체는 PD-L1-의존적 방식으로 CD137을 작용시키고 T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 표 5에 개시된 중쇄를 포함한다. 예를 들어, PD-L1/CD137 이중특이체는 1923Ab3의 VH로부터 유래된 CDR 서열 세트를 갖는 HC, 및 Fc 수용체 기능을 감소시키거나 제거하기 위해, 아미노산 변형이 있거나 없는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HC는 본원에 개시된 CD137, 예를 들어 1923Ab4에 결합하는 결합 단백질의 VH 및 VL 영역으로부터 유래된 CDR 서열 세트를 갖는 scFv를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 HC의 N-종결부 또는 C-종결부에 위치된 링커에 의해 HC에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 표 5에 개시된 경쇄를 포함한다. 예를 들어, PD-L1/CD137 이중특이체는 1923Ab3의 VL로부터 유래된 CDR 서열 세트를 갖는 LC를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, LC는 본원에 개시된 CD137, 예를 들어 1923Ab4에 결합하는 결합 단백질의 VH 및 VL 영역으로부터 유래된 CDR 서열 세트를 갖는 scFv를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 LC의 N-종결부 또는 C-종결부에 위치된 링커에 의해 LC에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab8(도 13b)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착된 1923Ab4로부터 유래된 2개의 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)을 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab8의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 본 개시된 결합 단백질의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 38 및 서열번호 40에 제공된다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab11(도 13e)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 scFv 단편(VL이 VH에 선행함)을 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab11의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 44 및 서열번호 40에 제공된다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab12(도 13f)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 Ab3 경쇄의 N-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)을 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab12의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 45 및 서열번호 46에 제공된다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab13(도 13g)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 Ab3 중쇄의 N-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)을 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab13의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 47 및 서열번호 40에 제공된다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체 1923Ab18(도 13j)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)을 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab18의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 50 및 서열번호 40에 제공된다.
항-PD-L1 모이어티의 생체활성은 PD-1/PD-L1 차단 검정을 사용하여, TCR 신호전달을 복원하는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 파괴하는 이의 능력으로 결정하였다. 항-CD137 모이어티의 생체활성은, CD137을 과발현하고 NFκB 루시페라아제 리포터를 운반하는 검정 세포를 사용하여, 가교 결합 의존성 CD137 신호전달을 유도하는 능력으로 결정하였다.
일부 구현예에서, PD-L1/CD137 이중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1에 특이적이고 인간 CD137에 결합하거나;
(b) 시노몰구스 PD-L1 및 CD137과 교차 반응하거나;
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해하거나;
(d) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(e) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나;
(f) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나;
(g) CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성을 보유하거나;
(h) PD-L1 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시키거나;
(i) CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시키거나;
(j) MC38-hPD-L1 동계 종양 모델을 사용하는 인간 PD-L1 및 CD137 녹-인에서 항-종양 효능을 나타내거나;
(k) 종양 미세환경에서 CD8+T 세포를 증가시키거나;
(l) 종양 미세환경에서 Treg 세포의 백분율을 감소시키거나;
(m) 종양 미세환경 외부에서의 표적-내 독성을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 이중특이체는 면역 세포 증식, 생존, 세포용해 활성 CD8 T 세포 및 사이토카인의 분비를 향상시키는 능력을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/CD137 이중특이체는 단일특이체 항체 조합에 비해 보다 높은 효능으로 CMV 리콜 검정에서 인간 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타난다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 결합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성을 갖는다: PD-1과 PD-L1의 상호작용 방해, T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호 제거, CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성 보유, PD-L1 의존성 방식으로의 T 세포 활성화, CD8 T 세포 활성화에 의한 PD-L1 발현 종양 세포 사멸, MC38-hPD-L1 동계 종양 모델을 사용하는 인간 PD-L1 및 CD137 녹-인에서의 항-종양 효능 입증, 종양 미세환경에서의 CD8+/T 세포 증가, 및 종양 내 Treg 세포의 백분율 감소.
특정 구현예에서, 이중특이체는 CD137 및 PD-L1 발현 세포에 결합하는 능력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PD-L1에 대한 이중특이체의 결합은 이의 PD-1과의 상호작용을 방해하며, Jurkat T 세포에서 TCR 신호전달의 복원을 야기한다. 또한, PD-L1에 결합된 이중특이체는 CD137 신호전달을 활성화하는 반면, 단일특이체 항-PD-L1 항체 단독으로는 CD137 신호전달을 유도하지 못한다. 또한, 이들은 PBMC에서 항-CD3 자극 IFNγ 방출을 향상시킨다. 보다 구체적으로, 이중특이체는 시험관 내에서 CD8+를 재유도하여 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시킨다. 일 구현예에서, 인간 CD137 및 인간 PD-L1 이중 녹-인 마우스에서 MC38 마우스 종양을 발현하는 인간 PD-L1을 사용하여, 본 개시된 이중특이체의 강력한 항-종양 효능을 입증하였다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50의 가변 중쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50에 제시된 결합 단백질 중쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 40 또는 46에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40 또는 46에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40 또는 46의 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40 또는 46의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 40 또는 46의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40 또는 46에 제시된 결합 단백질 경쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 38, 44, 45, 47 또는 50에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 40 또는 46에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
PD-L1/TGFβ 이중특이체
대안적인 구현예에서, 본 개시는 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈 및 인간 TGFβRII의 ECD로부터 유래된 종양 미세환경 조절제를 포함하는 PD-L1/TGFβ 이중특이체를 제공하며, 여기에서 이중특이체는 PD-1/PD-L1 관문을 억제-해제하고 종양 미세환경에서의 TGFβ의 면역억제 효과를 중화시킨다.
다른 구현예에서, 본 개시는 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 항체 스캐폴드 모듈 및 인간 TGFβ 수용체 II형의 ECD로부터 유래된 TGFβ 제1 결합 모듈을 포함하는 PD-L1/TGFβ 이중특이체를 제공하며, 여기에서 이중특이체는 PD-L1 및 TGFβ 둘 모두에 결합하고 TME에서의 TGFβ의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체 1923Ab20(도 13l)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 및 1923Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(a)는 1923Ab20의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 6은 중쇄 및 경쇄, 각각 서열번호 51 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 제공한다.
항-PD-L1 모이어티의 생체활성은 PD-1/PD-L1 차단 검정을 사용하여, TCR 신호전달을 복원하는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 파괴하는 이의 능력으로 결정하였다. 인간 TGFβ의 생체활성을 중화시키는 TGFβRII의 세포외 도메인(ECD)의 능력은 SBE(SMAD 결합 요소) 리포터 세포를 사용하여 TGFβ 유도 신호전달 캐스케이드를 차단하는 능력으로 결정하였다.
일부 구현예에서, 이중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 인간 PD-L1에 특이적이고 인간 TGFβ에 결합하거나; (b) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해하거나; (c) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나; (d) 인간 TGFβ에 결합하여 이의 생물학적 활성을 중화시키거나; (e) 종양 미세환경의 외부에서 독성을 감소시키거나; (f) 종양 미세환경에서 CD8+T 세포를 증가시키거나; (g) 종양 미세환경에서 Treg 세포의 백분율을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ 이중특이체는 면역 세포 증식, 생존, CD8 T 세포의 세포용해 활성 및 사이토카인의 분비를 향상시키는 능력을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 개시된 PD-L1/TGFβ 세포 이중특이체는 단일특이체 항체 조합에 비해 보다 높은 효능으로 CMV 리콜 검정에서 인간 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타난다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 결합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특성을 갖는다: PD-1과 PD-L1의 상호작용 방해, T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호 제거, PD-L1 의존성 방식으로의 T 세포 활성화, CD8 T 세포 활성화에 의한 PD-L1 발현 종양 세포 사멸, 종양 미세환경에서의 CD8+ T 세포 증가, 및 종양 내 Treg 세포의 백분율 감소.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ 이중특이체는 단독으로 또는 조합하여, 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: PD-1과 PD-L1의 상호작용 파괴, T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호 제거, TGFβ 신호전달 억제.
특정 구현예에서, 우렐루맙-NR과 조합된 본 개시된 이중특이체는 CMV 리콜 검정에서 인간 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타난다.
일 구현예에서, TGFβRII의 세포외 도메인(ECD)을 함유하는 본 개시된 항체는 SBE 리포터 유전자를 운반하는 HEK 세포에서 TGFβ 유도 신호전달을 차단한다.
특정 구현예에서, 이중특이체는 PD-L1 발현 세포에 결합하는 능력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PD-L1에 대한 이중특이체의 결합은 이의 PD-1과의 상호작용을 방해하며, Jurkat T 세포에서 TCR 신호전달의 복원을 야기한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 51의 가변 중쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 51의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 51의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 51에 제시된 결합 단백질 중쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 51에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 40에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40의 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 40의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 40에 제시된 결합 단백질 경쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 51에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 40에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체
특정 구현예에서, 본 개시의 결합 단백질은 삼중특이체이고, 이는 PD-L1에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈(항체로부터 유래됨), TGFβ 수용체 II 결합 단백질을 포함하는 제1 결합 모듈, 및 CD137에 결합하는 제2 결합 모듈(항체로부터 유래됨)을 포함하는 재조합 단백질의 형태로 작제된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈, TGFβ 수용체 2형의 ECD로부터 유래된 TGFβ 제1 결합 모듈, 및 항-CD137 항체로부터 유래된 CD137 제2 결합 모듈을 포함하는 삼중특이체를 제공하며, 여기에서 삼중특이체는 PD-L1, CD137에 결합하고, 또한 국소 미세환경으로부터 TGFβ를 고갈시킴으로써, PD-L1-의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab7(도 13a)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 scFv 단편(VH가 VL에 선행함), 및 1923Ab3 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab7의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 삼중특이체의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 7은 중쇄 및 경쇄, 각각 서열번호 38 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab9(도 13c)는 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이 및 노브-인-홀"(KiH) 돌연변이를 갖는 이종이량체 인간 IgG1 Fc, "노브" 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 하나의 scFv 단편(VH가 VL에 선행함), 및 1923Ab3 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab9의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 삼중특이체의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 7은 중쇄 1(노브)(서열번호 41), 중쇄 2(홀)(서열번호 42) 및 경쇄(서열번호 39)의 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab10(도 13d)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이 및 노브-인-홀"(KiH) 돌연변이를 갖는 이종이량체 인간 IgG1 Fc, "노브" 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 하나의 scFv 단편(VL이 VH에 선행함), 및 Ab3 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab10의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 삼중특이체의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 7은 중쇄 1(노브)(서열번호 43), 중쇄 2(홀)(서열번호 42) 및 경쇄(서열번호 39)의 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab17(도 13i)은 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함), 및 Ab3 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab17의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 삼중특이체의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 7은 중쇄 및 경쇄, 각각 서열번호 50 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체 1923Ab19(도 13k)는 PD-L1에 결합하는 1923Ab3으로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab3 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드, 및 1923Ab3 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab4로부터 유래된 2개의 이황화 결합 안정화 scFv 단편(VH가 VL에 선행함)을 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab19의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 삼중특이체의 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 7은 중쇄 및 경쇄, 각각 서열번호 51 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 제공한다.
천연 IgG-유사 구조 스캐폴드에 기초한 재조합체의 이종이량체화를 촉진하기 위해, 각각의 중쇄에서 "노브" 또는 "홀"을 생성하도록 CH3 도메인을 조작하여 이종이량체화를 촉진하는 단계를 포함하는 노브-인투-홀(KiH) 기술이 광범위하게 적용되었다. 일부 구현예에서, 특히 PD-L1에 결합하는 결합 단백질은 비대칭 설계를 특징으로 한다. "노브" 돌연변이의 일례는 CH3 도메인에서의 T366W를 포함하고, "홀" 돌연변이의 일례는 CH3 도메인에서의 T366S, L368A, Y407V를 포함한다. 일 구현예에서, 안정화 이황화 결합은 "노브"에서의 추가 S354C 돌연변이 및 "홀"에서의 추가 Y349C 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 모든 잔기 번호는 EU 넘버링에 따른다.
PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 생체활성은 PD-L1, TGFβ 또는 CD137에 의해 조절된 상응하는 신호전달 이벤트로 결정하였다. 일부 양태에서, 항-PD-L1 모이어티는 PD-1/PD-L1 차단 검정을 사용하여, PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 파괴하는 이의 능력으로 결정하였다. 항-CD137 모이어티의 생체활성은, CD137을 과발현하고 NFκB 루시페라아제 리포터를 운반하는 검정 세포를 사용하여, 가교 결합 의존성 CD137 신호전달을 유도하는 능력으로 결정하였다. 항-TGF-β 모이어티의 생체활성은 SBE(SMAD 결합 요소) 리포터 세포를 사용하여 TGFβ 유도 신호전달 캐스케이드를 차단하는 능력으로 결정하였다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 PD-L1, CD137 및 TGFβ에 결합할 수 있거나;
(b) 시노몰구스 PD-L1 및 CD137과 교차 반응하거나;
(c) PD-1과 PD-L1의 상호작용을 방해(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(d) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴(예를 들어, 감소 또는 방지)하거나;
(e) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타내거나;
(f) T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호를 억제-해제하거나;
(g) TGFβ 신호전달을 억제하고 이의 생물학적 활성을 중화시키거나;
(h) CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성을 보유하거나;
(pi) PD-L1 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시키거나;
(j) CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시킨다.
일부 구현예에서, PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체는 단독으로 또는 조합하여 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: PD-1 및 PD-L1의 상호작용 파괴, T 세포 PD-L1 매개 관문 억제 신호 제거, TGFβ 신호전달 억제, CD137 신호전달에 대한 PD-L1 의존성 작용 활성 보유, PD-L1 의존성 방식으로의 T 세포 활성화, 및 CD8 T 세포를 활성화에 의한 PD-L1 발현 종양 세포 사멸.
특정 구현예에서, 삼중특이체는 면역 세포 증식, 생존, 세포용해 활성 CD8 T 세포 및 사이토카인의 분비를 향상시키는 능력을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 개시된 삼중특이체는 단일특이체 항체 조합에 비해 보다 높은 효능으로 CMV 리콜 검정에서 인간 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타난다.
일 구현예에서, 삼중특이체는 SBE 리포터 유전자를 운반하는 HEK 세포에서 TGFβ 유도 신호전달을 차단한다.
특정 구현예에서, 삼중특이체는 CD137 및 PD-L1 발현 세포에 결합하는 능력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PD-L1에 대한 삼중특이체의 결합은 이의 PD-1과의 상호작용을 방해하며, Jurkat T 세포에서 TCR 신호전달의 복원을 야기한다. 또한, PD-L1 결합 이중특이체는 CD137 신호전달을 활성화시킨다. 또한, 이들은 PBMC에서 항-CD3 자극 IFNγ 방출을 향상시킨다. 보다 구체적으로, 삼중특이체는 시험관 내에서 CD8+를 재유도하여 PD-L1 발현 종양 세포를 사멸시킨다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51의 가변 중쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51에 제시된 결합 단백질 중쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 39 또는 52에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 39 또는 52에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 39 또는 52의 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 39 또는 52의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 39 또는 52의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 결합 단백질은 서열번호 39 또는 52에 제시된 결합 단백질 경쇄 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 38, 41, 42, 43, 50 또는 51에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 39 또는 52에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 결합 단백질의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
CD137/TGFβ/PD-L1 삼중특이체
특정 구현예에서, 본 개시의 결합 단백질은 삼중특이체이고, 이는 CD137에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈(항체로부터 유래됨), TGFβ 수용체 II 결합 단백질을 포함하는 제1 결합 모듈, 및 PD-L1에 결합하는 제2 결합 모듈(항체로부터 유래됨)을 포함하는 재조합 단백질의 형태로 작제된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 항-CD137 항체로부터 유래된 CD137에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈, TGFβ 수용체 2형의 ECD로부터 유래된 TGFβ 제1 결합 모듈, 및 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 제2 결합 모듈을 포함하는 삼중특이체를 제공하며, 여기에서 삼중특이체는 CD137, PD-L1에 결합하고, 또한 국소 미세환경으로부터 TGFβ를 고갈시킴으로써, PD-L1-의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, CD137/TGFβRII/PD-L1 삼중특이체 1923Ab16(도 13h)은 CD137에 결합하는 1923Ab4로부터의 2개의 Fab, L234A L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc, 1923Ab4 중쇄의 C-종결부에 부착하는 1923Ab3으로부터 유래된 2개의 scFv 단편(VL이 VH에 선행함), 및 Ab4 경쇄의 C-종결부에 부착하는 TGFβRII의 세포외 도메인을 암호화하는 2개의 폴리펩티드를 함유한다. 도 14(b)는 1923Ab16의 중쇄 및 경쇄에 대한 설명을 제공한다. 도 15는 하위구성요소에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다. 표 8은 중쇄 및 경쇄, 각각 서열번호 48 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 제공한다.
결합 단백질을 생산하는 방법
본원에 개시된 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 수용자는 가용성 재조합 인간 PD-L1 및/또는 CD137 단백질, 또는 이의 담체 단백질과 접합된 단편 또는 펩티드로 면역화될 수 있다. 임의의 적절한 면역화 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 보조제, 다른 면역 자극제, 반복 부스터 면역화, 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비인간 또는 인간 항-PD-L1 및/또는 CD137 항체의 생성을 위한 면역원으로서, 인간 PD-L1 및/또는 CD137의 임의의 적절한 공급원이 사용될 수 있다.
생물학적으로 활성인 항체를 생성하기에 충분한 항체를 생성하기 위해, PD-L1 및/또는 CD137 항원의 상이한 형태가 사용될 수 있다. 따라서, PD-L1 및/또는 CD137 항원을 유도하는 것은 단일 에피토프, 다수의 에피토프, 또는 전체 단백질 단독이거나 하나 이상의 면역원성 강화제와의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, 유도 항원은 단리된 가용성 전장 단백질, 또는 전장 서열 미만을 포함하는 가용성 단백질이다(예를 들어, PD-L1 및/또는 CD137의 특정 부분 또는 에피토프를 포함하는 펩티드로 면역화함). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부분"은 관심 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위한, 적절한, 아미노산 또는 핵산의 최소 수를 지칭한다. 관심 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전자 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 양이온성 지질과 같은 비-바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
마우스, 설치류, 영장류, 인간 등과 같은 다양한 포유류 숙주로부터 단클론 항체(mAb)를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 단클론 항체를 제조하기 위한 기술에 대한 설명은, 예를 들어, Sties 등(편집) 문헌[ BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (제4판) Lance Medical Publication, Los Altos, CA], 및 해당 문헌에 인용된 참고 문헌; Harlow 및 Lane 등의 문헌[(1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (제2판) Academic Press, New York, NY]에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 원하는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포는 통상적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화된다. Kohler 및 Milstein의 문헌[(196) Eur. J. Immunol. 6:511-519]을 참조한다. 불멸화의 대안적인 방법은 엡스타인 바 바이러스, 종양유전자, 또는 레트로바이러스, 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 이용한 형질전환을 포함한다. 예를 들어, Doyle 등(편집)의 문헌(1994 및 주기적 보완)[CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY]을 참조한다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 항원에 대한 원하는 특이성 및 친화도의 항체의 생산에 대해 스크리닝되고, 이러한 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강 내로의 주입을 포함하는 다양한 기술에 의해 향상될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, Huse 등의 문헌[(1989) Science 246: 1275-1281]에 개략적으로 기술된 일반 프로토콜에 따라, 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 단리할 수 있다. 따라서, 항체는 당업자에게 익숙한 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다.
다른 적절한 기술은 파지, 효모, 바이러스 또는 유사한 벡터에서의 항체의 라이브러리의 선택을 포함한다. 예를 들어, Huse 등의 문헌(전술함); 및 Ward 등의 문헌[(1989) Nature 341:544-546]을 참조한다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 항체는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하여, 변형시키거나 변형시키지 않고 사용될 수 있다. 종종, 폴리펩티드 및 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합함으로써 표지된다. 매우 다양한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있으며 과학 및 특허 문헌 모두에서 광범위하게 보고되어 있다. 적절한 표지는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자성 입자 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린은, 유전자 이식 마우스에서 생산되거나(Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen 등의 문헌[(1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10023] 참조), 이로부터 만들어질 수 있다(Nils Lonberg 등의 문헌[(1994), Nature 368:856-859]; 및 Mendez 등의 문헌[(1997) Nature Genetics 15: 146-156]; 유전자이식 동물 및 이의 용도(TRANSGENIC ANIMALS AND METHODS OF USE)(WO 2012/62118), Medarex, Trianni, Abgenix, Ablexis, OminiAb, Harbour 및 다른 기술 참조).
일부 구현예에서, 생산된 항체가 PD-L1 및/또는 CD137에 결합하는 능력은 표면 플라스몬 공명(SPR), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광, 유세포 계측 분석, 주화성 검정, 및 세포 이동 분석과 같은 표준 결합 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 양태에서, 생산된 항체는 또한 PD-L1 차단 및/또는 CD137 수용체 신호 전달의 활성화로부터 PD-L1을 억제하고/하거나 CD137을 활성화하는 능력에 대해 평가될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 여기에서 친화도 크로마토그래피는 일반적인 정제 기술이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Lindmark 등의 문헌[1983 J. Immunol. Meth . 62:1-13] 참조). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다(예를 들어, Guss 등의 문헌[1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 통상적으로 아가로오스이지만, 다른 매트릭스 또한 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피 상의 크로마토그래피(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토그래피포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 일반적으로 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용하는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거칠 수 있다.
또한, 본 개시의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)로 제시되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일 부분(예를 들어, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 대해, 본원에서 정의된 바와 같은, 낮은, 중간, 및 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화되는 핵산이 포함된다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 일반적으로 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 항-PD-L1 및/또는 CD137 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 이의 보체를 암호화하는 핵산의 일 부분 또는 전부의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기술된 유형의 혼성화 핵산은, 예를 들어 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머, 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 세포
다른 구현예는, 본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포, 및 본 개시된 결합 단백질의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 전장 단클론 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 미니바디를 포함하는 임의의 원하는 형태의 결합 단백질을 암호화할 수 있다.
일부 구현예는 서열번호 1, 3, 16, 18, 및 20 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 결합 단백질 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예는 서열번호 2, 4, 17, 19, 및 21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 결합 단백질 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)은: (a) 서열번호 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; (b) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; (c) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; (d) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (e) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화한다.
다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은: (a) 서열번호 1과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 서열; (b) 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 4와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 서열; (c) 서열번호 16과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 17과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 서열; (d) 서열번호 18과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 19와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (e) 서열번호 20과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역 서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화한다.
본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(들)는 당업계에 공지된 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 조절 서열에 융합될 수 있으며, 당업계에 공지된 바와 같은 적절한 발현 벡터 또는 세포에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자 각각은 인간 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 독립적으로 융합되어, 온전한 항체의 생산을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분은 함께 융합되어, 단쇄 항체의 생산을 위한 템플릿을 제공할 수 있다.
재조합체의 생산의 경우, 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내에 삽입된다. 결합 단백질 또는 이의 단편을 발현시키기 위한 많은 적절한 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 개시된 결합 단백질 또는 이의 단편은 또한 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있으며, 여기에서 결합 단백질은 이종 폴리펩티드, 예컨대 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 종결부에서의 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와 융합된다. 선택된 이종 신호 서열은 일반적으로 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 원핵 세포의 경우, 신호 서열은 원핵 신호 서열로 치환될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리 인산분해효소, 페니실리나아제, 지질단백질, 열안정 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은, 예를 들어 효모 인버타아제 알파 인자(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α 인자 리더 포함), 산성 인산분해효소, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제, 또는 WO 90/13646에 기술된 신호로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유류 세포에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임에서 결합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA에 결찰된다.
발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터로 하여금 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)은 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 대체적으로, 복제 성분의 기점은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(일반적으로 SV40 기점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 식별을 용이하게 하기 위해 선택성 마커를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다. 일반적인 선별성 표지 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하거나, 대안적으로, 보체 영양요구성 결핍이거나, 다른 대안에서, 복합체 배지에 존재하지 않는 특정 영양소, 예를 들어, 바실루스(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세미화효소를 암호화하는 유전자를 공급한다.
세포 배양
본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질 또는 이의 단편을 생산하는 데 사용되는 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium((MEM), Sigma), RPMI-1640(Sigma), FreeStyleTM(Cibco) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이들 또는 다른 배지 중 어느 하나는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충액(예컨대 HEPES), 뉴클레오티드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 겐타마이신), 미량 원소(예컨대, 일반적으로 마이크로몰 또는 더 낮은 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 및 포도당 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현에 대해 선택된 세포에 대해 종래에 사용된 조건들을 포함하며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
비치료적 용도
본원에 기술된 결합 단백질은 친화도 정제제로서 유용하다. 이러한 프로세스에서, 결합 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 단백질 A 수지와 같은 고상 상에 고정된다. 고정된 결합 단백질은 정제될 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉하고, 그 후 지지체는, 고정된 결합 단백질에 결합된, PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137 단백질을 제외한, 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 적절한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 결합 단백질로부터 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137 단백질을 방출할 다른 적절한 용매로 세척된다.
본원에 개시된 결합 단백질은 또한 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 진단 검정에 유용하며, 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137 발현을 검출하는 데 유용하다. 결합 단백질은, 예를 들어, 주어진 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 질환의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 결합 단백질을 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 인공 기, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 예를 들어, 본 개시에 따른, 진단용으로서의 용도를 위해 결합 단백질에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900을 참조한다.
결합 단백질은 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137-연관 장애(예를 들어, PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 장애)를 진단하거나, 대상체에서 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137-연관 장애의 발생 위험이 증가되는지의 여부를 결정하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본원에 개시된 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137에 대한 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. "생물학적 샘플"은 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137을 잠재적으로 발현하는 세포의 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의도한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 방법은 환자 샘플 중의 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137의 수준을, 대조군 샘플(예를 들어, PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137-연관 장애를 갖지 않는 대상체)과 비교하여, 해당 환자가 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137-연관 장애를 갖거나 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137-연관 장애가 발생할 위험이 있는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 진단 목적으로 결합 단백질을 검출가능한 모이어티로 표지하는 것이 유리할 것이다. 방사성 동위원소, 형광 표지, 효소 기질 표지 등을 포함하는 다수의 검출가능한 표지가 이용 가능하다. 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 결합 단백질과 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질은 비오틴과 접합될 수 있으며, 전술한 3개의 넓은 카테고리의 표지 중 어느 하나는 아비딘과 접합될 수 있거나, 그 반대일 수도 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 해당 표지는 이러한 간접적인 방식으로 결합 단백질에 접합될 수 있다. 대안적으로, 결합 단백질과 표지의 간접 접합을 이루기 위해, 결합 단백질은 소형 합텐(예컨대, 디곡신)에 접합될 수 있으며, 전술한 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)에 접합된다. 이에 따라, 결합 단백질과 표지의 간접 접합이 이루어질 수 있다.
예시적인 방사성 동위원소 표지는 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I를 포함한다. 결합 단백질은, 예를 들어 Coligen 등의 문헌(편집)[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등 편집, Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs]에 기술된 기술을 사용하여, 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 방사성은, 예를 들어 섬광 계수를 통해 측정될 수 있다.
예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 이의 유도체로부터 유래된 표지를 포함하며, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드가 이용 가능하다. 형광 표지는, 예를 들어, Current Protocols in Immunology에 개시된 것과 같은, 공지된 기술을 통해 결합 단백질에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
당업계에는 양호하게 특성화된 다양한 효소 기질 표지가 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,275,149호 참조). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 변경은 분광광도계로 측정될 수 있는 기질의 색상 변화일 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하기 위한 기술은 전술한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 화학발광계를 사용하여 측정될 수 있는 빛을 방출할 수 있거나, 예를 들어, 형광 수용기에 에너지를 제공할 수 있다.
효소 표지의 예는 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제와 같은 루시퍼라아제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 산화효소(예컨대, 포도당 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 포도당-6-인산염 탈수소효소), 헤테로시디드 산화효소(예컨대, 우리카제 및 잔틴 산화효소), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다. 효소를 결합 단백질에 접합하기 위한 기술은, 예를 들어, O'Sullivan 등의 문헌[1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for the Use in Enzyme Immunoassay, Methods in Enzym.(J. Langone 및 H. Van Vunakis, 편집), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어: 기질로서 과산화수소를 갖는 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)(여기에서 과산화수소는 오토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3,5,5-테트라메틸 벤지딘 염산염(TMB)과 같은 염료 전구체를 산화시킴); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 인산염을 갖는 알칼리 인산분해효소(AP); 및 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제 또는 형광생성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다아제와 같은 발색 기질를 갖는 β-D-갈락토시다아제(β-D-Gal)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 결합 단백질은 표지되지 않은 상태로 사용되고, 결합 단백질에 결합하는 표지된 항체로 검출된다.
본원에 기술된 결합 단백질은 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, Zola의 문헌[Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조한다.
본원에 개시된 결합 단백질은 PD-L1, TGFβ, 및/또는 CD137이 이의 각각의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 결합 단백질을 세포(예를 들어, 포유류 세포) 또는 세포 환경에 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 수용체에 의해 매개되는 신호전달은 억제된다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. "세포 환경"은 세포를 둘러싸는 조직, 배지, 또는 세포외 기질을 의미한다.
조성물 및 치료 방법
본 개시는 또한, 예를 들어 본원에 개시된 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암과 같은 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화를 위한 다수의 치료적 용도를 갖는다.
본 개시는 또한 암의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 결합 단백질, 및 선택적으로 다른 면역 기반 요법을 포함하는 조성물 또는 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
개시된 결합 단백질은 또한 암을 치료하는 방법에서 단독으로(예를 들어, 단일 요법으로서) 또는 다른 면역치료제 및/또는 화학요법과 조합하여 유용하다.
결합 단백질은 단독으로 투여되거나 면역 매개 염증성 장애 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용한 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 결합 단백질을 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라, Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 제19판, Gennaro 편집, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995]에 기술된 것과 같은 통상적인 기술에 따른 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
통상적으로, 주사에 의한 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약학적 제제는 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 기밀 밀봉된 용기 중의 건조 동결건조된 분말 또는 물 없는 농축물로서 공급되거나 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 혼합된다. 약학적 제제가 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약학적 제제가 주사에 의해 투여되는 경우, 이는, 해당 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 양립 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등 중 어느 하나 또는 모두를 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이체 및 다중특이체 분자는 임의의 물질로 코팅되어, 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호할 수 있다.
조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 모드는 원하는 결과에 따라 상이할 것이다. 활성 화합물은 급속 방출로부터 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 제어 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 대체적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 편집, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
약학적 조성물 중 활성 성분의 투여량 수준은 대상체에게 독성 없이, 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 지속시간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 화합물 및/또는 물질, 나이, 성별, 중량, 병태, 치료 중인 환자의 전반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 기술분야에 공지된 유사한 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 과정의 억제에 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해, 예를 들어 생체 내로 환자에게 투여된다. 환자는, 바람직하게는 본원에 개시된 결합 단백질을 투여함으로써 교정되거나 완화될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 포함한다.
일부 양태에서, 종래의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산을 포유류 세포 또는 표적 조직에 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 항체를 암호화하는 핵산을 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 유도체를 암호화하는 핵산은 생체 내 또는 생체 외 유전자 요법 사용을 위해 투여된다. 다른 구현예에서, 유전자 전달 기술은 세포 기반 또는 동물 모델에서 항체의 활성을 연구하는 데 사용된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 전달된 후 에피솜 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 개시의 조작된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리케이션 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제 강화 흡수를 포함한다. 리포펙션 방법 및 리포펙션 시약은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner의 특허, WO 91/17424, WO 91/16024에 개시된 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체 외 투여) 또는 표적 조직(생체 내 투여)에 대한 전달일 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기술된 항체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포에 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 수송하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 활용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체 내), 시험관 내에서 세포를 치료하고 해당 변형된 세포가 환자에게 투여될 수 있다(생체 외). 본 개시의 폴리펩티드의 전달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 현재, 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직에서 유전자 전달의 가장 효율적이고 다양한 방법이다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법을 사용하면 숙주 게놈에서의 통합이 가능하며, 이는 종종 삽입된 이식유전자의 장기적 발현을 초래한다. 또한, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다. 식별된 모든 특허 및 간행물은, 예를 들어, 본 개시와 관련하여 사용될 수 있는 해당 간행물에 기술된 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 참조로서 명시적으로 통합된다. 이들 간행물은 단지 본 출원의 출원일 이전의 이들의 개시 내용에 대하여 제공된다. 이와 관련하여, 어떠한 내용도 본 발명자가 이전 발명으로 인해 또는 다른 이유로 이러한 개사를 고시할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 본 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예
일반 방법
면역침강, 크로마토그래피, 및 전기영동을 포함하는 단백질 정제 방법이 기술된다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]을 참조한다. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산, 및 단백질의 당질화가 기술된다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Ausubel 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17]; Sigma-Aldrich, Co.의 문헌[(2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89]; Amersham Pharmacia Biotech의 문헌[(2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]을 참조한다. 다클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기술된다. Coligan 등의 문헌 [(2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Harlow 및 Lane의 문헌[(1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow 및 Lane의 문헌(전술함)을 참조한다.
제조사의 절차에 따라, 항-PD-L1 또는 항-CD137 항체를 함유하는 하이브리도마 또는 세포 배양 상청액을 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE, cat. 번호 17040401)을 통해 정제하였다. 요약하면, 상청액을 DPBS(Gibco, cat. 번호 14190-136)로 5 CV로 평형화하고, 주변 온도 및 3분 체류 시간에서 주사기/주입 펌프(Legato 200, KDS)를 통해 로딩하였다. 컬럼을 5 CV의 DPBS로 세척하고, 4 CV의 pH 2.8 용리 완충액(Fisher Scientific, cat. 번호 PI21004)으로 용리를 수행하였다. 용리액을 분획하고, 분획을 1 M Tris-HCL, pH 8.5(Fisher Scientific, cat 번호 50-843-270)로 중화시키고, A280(DropSense96, Trinean)으로 분석하였다. 피크 분획을 풀링하고, 완충액을 DPBS로 교환하였다. 원심 필터(EMD Millipore, cat. 번호 UFC803024)를 DPBS에서 4,000 x g로 2분 동안 평형화시켰다. 정제된 샘플을 로딩하고, DPBS를 첨가하고, 총 DPBS 부피가 ≥ 6 DV에 도달할 때까지 샘플을 4,000 x g로 5 내지 10분 동안 회전시켰다. 최종 풀을 A280으로 분석하였다.
분자 생물학의 표준 방법이 기술된다. 예를 들어, Maniatis 등의 문헌 [(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook 및 Russell의 문헌[(2001) Molecular Cloning, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Wu의 문헌[(1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.]을 참조한다. 표준 방법은 또한 Ausbel 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.]에서 찾을 수 있으며, 이는 박테리아 세포 및 DNA 돌연변이 유발에서의 클로닝(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3), 및 생물정보학(Vol. 4 참조)을 기술한다.
인간 PD-L1 및 CD137을 발현하는 안정적인 세포주는 선택된 숙주 세포(즉, CHO-K1 또는 HEK293)를 전기천공 또는 지질 기반 형질감염을 사용하여, 호모 사피엔스 표적 단백질을 발현하는 pcDNA3.1 기반 플라스미드로 형질감염시킴으로써 생성되었다. 게네티신 또는 푸로마이신을 사용하여 통합된 세포를 선택하였다. 항생제 선택 7-10일 후, 안정적인 클론을 FACS 또는 표지된 항체를 사용하는 연속 희석으로 단리하였다. 증식 후, 유세포 계측법으로 표적 단백질 발현에 대해 안정적인 클론을 추가로 확인하였다. 지질 기반 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포에서 마우스 및 시노몰구스 표적을 각각 일시적으로 발현시켰다.
하이브리도마 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 서열을 아래에 기술된 바와 같이 결정하였다. 총 RNA를 Qiagen(Germantown, MD, USA)의 RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 1-2 x 106 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. CDNA는 Takara(Mountainview, CA, USA)의 SMARTer RACE 5'/3' 키트를 사용하여 5' RACE 반응을 수행함으로써 생성되었다. 적절한 면역글로불린의 3' 마우스 불변 영역에 대한 유전자 특이적 프라이머와 조합된 Takara Universal Primer Mix를 사용하여 중쇄 및 경쇄로부터 가변 영역을 증폭하기 위해 NEB(Ipswich, MA, USA)의 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 증폭된 가변 영역을 2% 아가로오스 겔 상에서 실행하고, 적절한 밴드를 절제한 다음, Qiagen의 Mini Elute Gel Extraction Kit를 사용하여 겔 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)의 Zero Blunt PCR Cloning Kit를 사용하여 클로닝하고, Takara의 Stellar Competent 대장균 세포로 형질전환시키고, LB Agar + 50 ug/ml 카나마이신 플레이트 상에 도말하였다. GeneWiz(South Plainfield, NJ, USA)로 직접 콜로니 생거(Sanger) 시퀀싱을 수행하였다. 생산적 재배열을 식별하고 번역된 단백질 서열을 분석하기 위해, IMGT V-QUEST를 사용하여 생성된 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였다. Kabat 넘버링에 기초하여 CDR을 결정하였다.
선택된 VH 또는 VL 사슬을 PCR 증폭시키고, 인간 IgG1(Uniprot P01857) 또는 인간 카파 경쇄(UniProt P01834)로부터의 불변 영역을 보유하는 pcDNA3.4-기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 공급사의 Expi293 발현 시스템 프로토콜에 따라 Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 원심분리로 배양 상청액을 수집하였다. 발현된 항체를 단백질 A 컬럼을 사용하는 1-단계 친화도 정제로 정제하고 완충액을 PBS pH 7.2로 교체하였다.
형광 활성화 세포 분류 검출 시스템(FACS®)을 포함하는, 유세포 계측 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, Owens 등의 문헌 [(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.]; Givan의 문헌[(2001) Flow Cytometry, 제2판; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.]; Shapiro의 문헌[(2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.]을 참조한다. 예를 들어 진단 시약으로서의 용도를 위해, 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드, 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키기에 적합한 형광 시약이 이용 가능하다. Molecular Probes의 문헌[(2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich의 문헌[(2003) Catalogue, St. Louis, Mo.]을 참조한다.
리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York]을 참조한다. 특정 작용 메커니즘을 갖는 항체의 특성화에 적절한 항체 기능 특성화의 표준 방법 또한 당업자에게 공지되어 있다.
예를 들어, 항원성 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, CDR 주석, 당질화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다.
본원에서 "아벨루맙-NR"(PC1)로 지칭되는 항-PD-L1 항체 기반 자체개발 항-PD-L1 항체(아벨루맙)를 미국 특허 제10,759,856호에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH 서열번호 24 및 VL 서열번호 25)에 기초하여 제조하였다. PC1 항체를 사용하여 본원에 개시된 항-PD-L1 특이적 항체를 평가하고 특성화하는 데 사용되는 기능적 검정을 설정하였다. 본원에서 "우렐루맙-NR"(PC2)로 지칭되는 항-CD137 항체 기반 자체개발 항-CD137 항체(우렐루맙)를 미국 특허 제7,288,638호에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH 서열번호 3 및 VL 서열번호 6)에 기초하여 제조하였다.
본원에서 "우렐루맙-NR"(PC2)로 지칭되는 항-CD137 항체 기반 자체개발 항-CD137 항체(우렐루맙)를 미국 특허 제7,288,638호에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH 서열번호 3 및 VL 서열번호 6)에 기초하여 제조하였다. 본원에서 "우토밀루맙-NR"(PC3)로 지칭되는 제2 자체개발 CD137 반응성 항체(우토밀루맙)를 미국 특허 제8,337,850호에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH 서열번호 43 및 VL 서열번호 45)에 기초하여 제조하였다. PC2 및 PC3 항체를 사용하여 실시예에 사용된 세포주에서의 CD137 발현을 확인하고, 본원에 개시된 항-CD137 특이적 항체를 평가하고 특성화하는 데 사용된 결합 및 기능적 검정을 설정하였다. 본 출원의 실시예 18 및 22는 본 개시된 이중특이체 및 삼중특이체가 우렐루맙-NR 및 우토밀루맙-NR에 비해 보다 강한 CD137 신호전달 및 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다.
표 9는 본원에서 사용되는 참조 서열을 제시한다.
실시예 1: PD-L1에 결합하는 결합 단백질의 생성
인간 항체 VH 및 VL 유전자를 발현하는 인간 Ig 유전자이식 마우스, Trianni 마우스를 면역화하여 완전한 인간 항-인간 PD-L1 항체를 생성하였다(예를 들어, WO 2013/063391, TRIANNI® 마우스 참조).
면역화 - 전술한 TRIANNI 마우스를 복강내(IP), 피하(SC), 꼬리 기저부 또는 발바닥 주사를 통해 재조합 인간 PD-L1 단백질로 주사하여 면역화시켰다.
안와후 출혈로 면역 반응을 모니터링하였다. ELISA, 유세포 계측법(FACS) 또는 이미징(아래에 기술됨)으로 혈장을 스크리닝하였다. 충분한 항-PD-L1 역가를 갖는 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스를 희생시키고 비장 및 림프절을 제거하기 전, 마우스에게 복강내, 꼬리 기저부, 발바닥 또는 정맥내로 면역원을 추가투여하였다.
항-PD-L1 항체를 생산하는 마우스의 선별 - PD-L1에 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 선별하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA, FACS 또는 이미징을 사용하여, 인간 PD-L1 단백질에 대한 결합, PD-L1을 발현하지 않는 대조군 세포(HEK293T 세포)가 아닌 PD-L1 단백질을 발현하는 세포(PD-L1 유전자로 형질감염된 HEK293T)에 대해 스크리닝하였다.
ELISA의 경우, 요약하면, 재조합 인간 PD-L1(AcroBiosystems, 카탈로그 번호: PD1-H5229)로 코팅된 ELISA 플레이트를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 검정 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 HRP-표지된 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 109-035-088)로 검출하고, 세척한 다음, ABTS 기질(Moss, 카탈로그 번호: ABTS-1000)로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
FACS의 경우, 요약하면, PD-L1-HEK293T 세포 또는 부모 HEK293T 세포를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2% PFA(Alfa Aesar, 카탈로그 번호: J61899)로 4℃에서 15분 동안 고정시킨 다음 세척하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 Alexa 647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(ThemoFisher Scientific, 카탈로그 번호: A-21445)로 검출하였다. 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius) 상에서 유세포 계측 분석을 수행하였다.
또한, 이미징으로 마우스 혈청을 시험하였다. 요약하면, PD-L1-HEK293T 세포를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 특이적 항체 결합을 이차 Alexa488 염소 항-마우스 항체 및 Hoechst(Invitrogen)로 검출하였다. 이미징 기기(Cytation 5, Biotek) 상에서 플레이트를 스캔하고 분석하였다.
PD-L1에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성 - 본 발명의 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 비장세포 및 림프절 세포를 면역화된 마우스로부터 단리하고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합하였다. 항원 특이적 항체의 생산에 대해 생성된 하이브리도마를 스크리닝하였다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장세포, 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 전기 융합으로 동일한 수의 Sp2/0 비-분비 마우스 IgG 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 융합하였다. 세포를 평평한 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 도말한 다음, 선별 배지(HAT 배지)에서 약 1주일 동안 인큐베이션하고, 이어서 하이브리도마 배양 배지로 전환하였다. 세포 도말 후 약 10-14일차에, 전술한 바와 같이 ELISA, 이미징 또는 FACS로 개별 웰의 상청액을 스크리닝하였다. 항체 분비 - 하이브리도마를 24-웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 항-PD-L1에 대해 여전히 양성인 경우, 양성 하이브리도마를 단일 세포 분류기를 사용하여 분류하여 서브클로닝하였다. 전술한 바와 같이 ELISA, 이미징 또는 FACS로 서브클론을 다시 스크리닝하였다. 그런 다음, 안정적인 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 정제 및 특성화를 위한 소량의 항체를 생성하였다.
실시예 2: 인간, 마우스 및 시노몰구스 PD-L1 단백질에 대한 PD-L1에 결합하는 mAb의 결합 특이성
상이한 종의 PD-L1 단백질에 대한 개시된 항-PD-L1 항체(1923Ab2 및 1923Ab3)의 결합 특이성을 ELISA로 평가하였다. 요약하면, 인간 재조합 PD-L1 단백질(Acro Biosystems, cat#: PD1-H5229), 시노몰구스 PD-L1 단백질(Acro Biosystems, cat#: PD1-C52H4) 및 마우스 PD-L1 단백질(Acro Biosystems, cat#: PD1-M5220)을 ELISA 플레이트에 직접 코팅하였다. 그런 다음, 1923Ab2 및 1923Ab3을 플레이트에 첨가하고, 이어서 퍼옥시다아제 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch, cat#: 115-036-071) 또는 퍼옥시다아제 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch, cat#: 109-036-098)으로 검출하였다. ABTS 기질(Moss, cat#: ABTS-1000)을 첨가한 후, Synergy Neo2 Multi-mode 판독기(Bioteck, SN#:180213F)를 사용하여 ELISA 플레이트를 판독하였다.
도 2a 및 b는 본 개시된 항-PD-L1 항체의 결합 활성이 인간 및 시노몰구스 PD-L1 단백질에 대해서는 투여량 의존적 방식으로 나타나지만 마우스 PD-L1에는 그렇지 않다는 것을 나타내며; 이소형 대조군 mIgG 또는 hIgG1은 임의의 PD-L1 종에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 인간, 시노몰구스 PD-L1 단백질에 대한 본 개시된 항-PD-L1 항체의 ELISA 결합 EC50 값이 도 2a 및 도 2b에 제공된다.
실시예 3: 인간 PD-L1에 대한 재조합 항-PD-L1의 결합 친화도
재조합 항-PD-L1 항체를 발현시키고 인간 IgG1 또는 인간 IgG1 변이체의 불변 영역을 갖는 Expi293으로부터 정제하였다. 면역형광 이미징 검정을 사용하여 항-PD-L1 항체의 결합 친화도를 평가하였다.
HEK293T-PD-L1 세포 상에서 항-PD-L1 항체의 세포 결합 친화도를 시험하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 항-PD-L1 항체를 연속 희석하고 분석 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Cytation(Biotek, VT)을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
결합 결과는 1923Ab3이 세포 표면 상에서 PD-L1 발현에 대한 강한 결합을 나타낸다는 것을 보여주었다. 1923Ab3의 결합 친화도는 참조 항체인 아테졸리주맙(Roche)과 유사하다. 인간 PD-L1에 대한 1923Ab3 및 아테졸리주맙의 결합 EC50은 각각 0.18 nM 및 0.21 nM로 결정되었다(도 3 참조).
실시예 4: PD-1/PD-L1 상호작용에 대한 PD-L1 항체의 효과
Promega(Madison, USA)에 의해 개발된 PD-1/PD-L1 억제 생물검정으로 PD-L1 항체가 PD-1과 PD-L1의 상호작용에 미치는 효과를 결정하였다. 해당 검정은 다음과 같은 2개의 유전적으로 조작된 세포주로 이루어진 루시페라아제 세포 기반 검정이다: 세포 표면 상에서 인간 PD-1을 발현하는 Jurkat T 세포이며, NFAT 반응 요소(NFAT-RE)에 의해 유도되는 안정적으로 통합된 루시페라아제 리포터인 PD-1 효과기 세포, 및 세포 표면 인간 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포이며, 항원 비의존적 방식으로 동족 TCR을 활성화시키도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질인 인공 APC 세포. 이들 2개의 세포 유형이 공동 배양될 경우, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호 전달을 억제하여 발광 신호를 감소시킨다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항체의 첨가는 억제 신호를 제거하고, TCR의 활성화를 초래하며, 발광을 증가시킨다.
제조사의 프로토콜에 따라, 인공 APC CHO-K1 세포(Promega, Cat #: J109A)를 10% 열-불활성화 소태아 혈청(Sigma, Cat #: 17H165)을 함유하는 Ham의 F-12K 배지(ThermoFisher, Cat #: 21127022)를 사용하여 배양하였다. 이들 인공 APC 세포를 384 웰 백색 TC 처리된 플레이트(Corning, Cat #: 3570)에 도말하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고 연속 희석된 항체를 첨가하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, PD-1 효과기 세포(Promega, Cat#: J115A)를 10% 열 불활성화 소태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640(ThermoFisher, Cat #: 11875-085)을 사용하여 배양하였다. 효과기 세포를 인공 APC 세포 및 항체를 함유하는 백색 384 웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 실온으로 평형화시킨 후, One-Glo 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 발광을 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어로 데이터를 분석하였다.
도 4는 1923Ab2 및 1923Ab3 항체 둘 모두가 PD1/PD-L1 상호작용을 효율적으로 억제하여 해당 검정에서 발광 신호가 복원되었음을 나타낸다. PD1/PD-L1 차단에 대한 1923Ab2, 1923Ab3 및 아테졸리주맙의 IC50은 각각 0.90 nM, 0.43 nM 및 0.29-0.31 nM로 결정되었다.
실시예 5: CD137에 결합하는 결합 단백질의 생성
인간 항체 VH 및 VL 유전자를 발현하는 인간 Ig 유전자이식 마우스, Trianni 마우스를 면역화하여 완전한 인간 항-인간 CD137 항체를 생성하였다(예를 들어, WO 2013/063391, TRIANNI® 마우스 참조).
면역화 - 전술한 TRIANNI 마우스를 인간 CD137 유전자 및 재조합 인간 CD137 ECD 단백질로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 면역원으로 주사하여 면역화하였다. TRIANI 마우스를 복강내(IP), 피하(SC), 꼬리 기저부 또는 발바닥 주사를 통해 면역화시켰다.
안와후 출혈로 면역 반응을 모니터링하였다. ELISA, 유세포 계측법(FACS) 또는 이미징(아래에 기술됨)으로 혈장을 스크리닝하였다. 충분한 항-CD137 역가를 갖는 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스를 희생시키고 비장 및 림프절을 제거하기 전, 마우스에게 복강내, 꼬리 기저부, 발바닥으로 면역원을 추가투여하였다.
항-CD137 항체를 생산하는 마우스의 선별 - CD137에 결합하는 항체를 생산하는 마우스를 선별하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA, FACS 또는 이미징을 사용하여, 인간 CD137 단백질에 대한 결합, CD137을 발현하지 않는 대조군 세포(HEK293T 세포)가 아닌 CD137 단백질을 발현하는 세포(CD137 유전자로 형질감염된 HEK293T)에 대해 스크리닝하였다.
ELISA의 경우, 요약하면, 재조합 인간 CD137(R&D, catalog#: 9220-4B)로 코팅된 ELISA 플레이트를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 검정 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 HRP-표지된 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 109-035-088)로 검출하고, 세척한 다음, ABTS 기질(Moss, 카탈로그 번호: ABTS-1000)로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
FACS의 경우, 요약하면, CD137-HEK293T 세포 또는 부모 HEK293T 세포를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2% PFA(Alfa Aesar, 카탈로그 번호: J61899)로 4°C에서 15분 동안 고정시킨 다음 세척하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 Alexa 647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(ThemoFisher Scientific, 카탈로그 번호: A-21445)로 검출하였다. 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius) 상에서 유세포 계측 분석을 수행하였다.
또한, 이미징으로 마우스 혈청을 시험하였다. 요약하면, CD137-HEK293T 세포를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 특이적 항체 결합을 이차 Alexa488 염소 항-마우스 항체 및 Hoechst(Invitrogen)로 검출하였다. 이미징 기기(Cytation 5, Biotek) 상에서 플레이트를 스캔하고 분석하였다.
CD137에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성 - 본 발명의 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 비장세포 및 림프절 세포를 면역화된 마우스로부터 단리하고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합하였다. 항원 특이적 항체의 생산에 대해 생성된 하이브리도마를 스크리닝하였다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장세포, 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 전기 융합으로 이와 동일한 수의 Sp2/0 비분비 마우스 IgG 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 융합하였다. 세포를 평평한 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 도말한 다음, 선별 배지(HAT 배지)에서 약 1주일 동안 인큐베이션하고, 이어서 하이브리도마 배양 배지로 전환하였다. 세포 도말 후 약 10-14일차에, 전술한 바와 같이 이미징 또는 FACS로 개별 웰의 상청액을 스크리닝하였다. 항체 분비 - 하이브리도마를 24-웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 항-CD137에 대해 여전히 양성인 경우, 양성 하이브리도마를 단일 세포 분류기를 사용하여 분류하여 서브클로닝하였다. 전술한 바와 같이 이미징 또는 FACS로 서브클론을 다시 스크리닝하였다. 그런 다음, 안정적인 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 정제 및 특성화를 위한 소량의 항체를 생성하였다.
실시예 6: 인간, 마우스 및 시노몰구스 CD137에 대한 재조합 CD137 항체의 결합 친화도
인간, 마우스 또는 시노몰구스 CD137 발현 작제물로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여, 면역형광 이미징 검정을 이용한 항-CD137 mAb의 결합 친화도 분석을 수행하였다. 이들 세포주는 세포 표면 상에서 CD137 단백질의 특정 형태를 발현한다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 연속 희석된 항-CD137로 염색한 후 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Biotek Cytation을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
결과는 1923Ab4(도 5a), 1923Ab5(도 5b) 및 1923Ab6(도 5c) 항체가 세포 표면 상에서 인간 및 시노몰구스 CD137에 효율적으로 결합하였음을 나타낸다. 그러나, 이들 중 어느 것도 마우스 CD137에 대한 결합을 나타내지 않는다. 인간 CD137에 대한 1923Ab4, 1923Ab5, 및 1923Ab6의 결합 EC50은 각각 0.29 nM, 1.62 nM, 및 10.5 nM로서 결정되었다. 시노몰구스 CD137에 대한 1923Ab4, 1923Ab5, 및 1923Ab6의 결합 EC50은 각각 0.22 nM, 2.77 nM, 및 4.23 nM로서 결정되었다.
또한, PC2 우렐루맙-NR(BMS) 및 PC3 우토밀루맙-NR(Pfizer)을 포함하는 참조 항체에 대한 1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6 항체의 결합 친화도를 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 1923Ab4 항체는 인간 CD137에 대한 우렐루맙-NR 및 우토밀루맙-NR과 유사한 결합 친화도를 나타냈다(도 6). 1923Ab5 및 1923Ab6 항체는 참조 항체에 비해 더 약한 결합을 나타냈다.
실시예 7: CD137 리간드 경쟁
본 개시된 항-CD137 항체의 CD137에 대한 CD137 리간드 결합을 차단하는 능력을 평가하기 위해, 본 개시된 항체들인 1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6, 및 2개의 참조 항체인 PC2 우렐루맙-NR 및 PC3 우토밀루맙-NR을 바이오층 간섭계(Gator Bio, CA)로 시험하였다. 우렐루맙-NR 및 우토밀루맙-NR은 각각 비-리간드 및 리간드 차단 항체인 것으로 보고되었다.
요약하면, 스트렙타비딘 프로브(Probe Life, 카탈로그 번호: PL168-1600002)를 먼저 검정 완충액(0.02% Tween20 및 0.05% 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS)을 함유하는 96-웰 플레이트 내에 30초 동안 로딩하였다(베이스라인 단계). 그런 다음, 프로브를 CD137L His-Avi-Tag 단백질(BPS Bioscience, 카탈로그 번호: 100238; 10 ug/ml)을 함유하는 96-웰 내에 180초 동안 로딩하고(비오틴-CD137L을 포획하기 위한, 로딩 단계), 이에 이어서 30초 동안 베이스라인 단계를 수행하였다. 그 후, CD137L 로딩된 프로브를 180초 동안 CD137 단백질(R&D, 카탈로그 번호: 9220-4B; 10 ug/ml)에 결합시킨 다음, 개시된 항체 또는 참조 항체와 10 ug/ml의 농도로 180초 동안 결합시켰다.
제조사(Gator Bio, CA)가 제공한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하였다. 1923Ab5, 1923Ab6 및 우렐루맙-NR은 프로브 상에 로딩된 CD137/CD137L의 복합체에 결합하였다. 그러나, 1923Ab4 및 우토밀루맙-NR은 프로브 상에 로딩된 CD137/CD137L의 복합체에 대한 결합을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 1923Ab4 및 우토밀루맙-NR이 리간드 차단 활성을 갖는다는 것을 암시한다. 1923Ab5, 1923Ab6 및 우렐루맙-NR은 리간드 결합 부위에 위치되지 않은 CD137의 영역에 결합하였다(도 7).
실시예 8: NFκB 루시페라아제 리포터 검정에서의 항-CD137 항체의 가교 결합 의존성 작용 활성
NFκB 루시페라아제 리포터 검정을 사용하여 항체의 작용제 활성을 평가하였다. 인간 CD137 발현 플라스미드 및 NFκB 루시페라아제 리포터 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 293T 세포를 사용하여 항-CD137 항체의 작용 활성을 측정하였다. 이들 리포터 세포(HEK-CD137 리포터 세포)를 항-CD137 항체 또는 시험된 항-CD137 항체 및 3:1 비율의 가교 결합 항체(항-인간 Fcγ 단편 특이적(Jackson ImmunoResearch Lab, Cat #: 109-005-098)를 함유하는 혼합물로 자극하고, 37℃에서 5% CO2로 16시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 발광 신호를 Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek)로 측정하고, GraphPad Prism으로 데이터를 분석하였다.
대조군 항체로서 사용된 PC3 우토밀루맙-NR은 CD137 신호전달에 대한 가교 결합 의존성 작용제 항체인 것으로 보고되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, 이소형 대조군과 비교하여, 시험된 모든 항체는 가교 결합 항체의 부재 상태에서 매우 적은 작용 활성을 나타냈다. 그러나, 이소형 대조군을 제외한, 항-인간 Fcγ에 의해 가교 결합된 모든 시험된 항체는 NFκB 루시퍼라제 유전자 발현을 강력하게 활성화시켰다. 해당 결과는 1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6 항체의 작용 활성이 가교 결합 의존적임을 입증한다.
실시예 9: 인간 일차 T 세포 활성화 검정에서의 항-CD137 항체의 가교 결합 의존성 작용 활성
T 세포 활성화 검정에서 항체의 작용 활성을 추가로 확인하였다. 건강한 공여자로부터 인간 PBMC를 제조하였다. 이들 인간 PBMC를 10% FBS 및 0.5 ug/ml의 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325)이 보충된 RPMI1640 배지에서 1 x 106 세포/mL의 밀도로 배양하였다. 항-CD137 항체 또는 시험된 항-CD137 항체 및 3:1 비율의 가교 결합 항체를 함유하는 혼합물을 첨가하여 T 세포를 자극하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 3일 동안 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후, 제조사의 지침에 따른 프로토콜을 사용하여, 상청액을 사용하여 AlphaLISA(PerkinElmer, Cat #: AL217C /F)로 분비된 IFNγ를 측정하였다.
양성 대조군 항체로서 사용된 PC3 우토밀루맙-NR은 T 세포 활성화에 대한 가교 결합 의존성 작용제 항체인 것으로 보고되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 이소형 대조군과 비교하여, 본 개시된 항체로 치료된 PBMC는 가교 결합 항체의 부재 상태에서 IFNγ의 생산을 증가시키지 않았다. 그러나, 이소형 대조군을 제외하고, 항-인간 Fcγ에 의해 가교 결합된 모든 시험된 항체는 IFNγ의 생산을 강하게 자극하였다. 해당 결과는 1923Ab4, 1923Ab5 및 1923Ab6 항체가 가교 결합 의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킨다는 것을 입증한다.
실시예 10: 인간 CD137에 대한 1923Ab4의 결합 에피토프 영역의 식별
CD137의 세포외 영역은 종 사이에서 보존되는 4개의 시스테인-풍부 도메인(CRD1-4)을 함유한다. 1923Ab4 항체에 대한 결합을 위해 어떤 CRD 도메인이 요구되는지를 식별하기 위해, 개별 인간 CRD 도메인을 마우스 카운터파트로 교체함으로써 인간/마우스 혼성체 CD137 발현 작제물을 제조하였다(도 10a). 실시예 6은 1923Ab4가 세포 표면 상에서 인간 CD137에는 결합하지만 마우스 CD137에는 결합하지 않음을 나타낸다.
유세포 분석 기반 결합 검정으로 인간 CD137(WT) 또는 인간/마우스 혼성체 CD137 발현 작제물(msCRD1-4)로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 항-CD137 1923Ab4의 결합 분석을 수행하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 1923Ab4로 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. iQue Screener PLUS(Sartorius, MI)를 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
PC2 우렐루맙-NR 및 PC3 우토밀루맙-NR 둘 모두는 인간 CD137에 결합하지만 마우스 CD137에는 결합하지 않는다. 인간 CD137에 대한 PC2 및 PC3의 결합은 각각 CRD1 및 CRD3/4 도메인을 통해 이루어졌다. 해당 결합 실험에서, PC2는 인간 CRD1 도메인이 마우스 CRD1 도메인으로 교체되었을 경우에만 CD137에 대한 결합을 상실한 반면, PC3은 인간 CRD3 또는 CRD4 도메인이 마우스 카운터파트 도메인으로 교체되었을 경우 CD137에 대한 결합을 상실하였다(도 10b-f). 본 개시된 항체 1923Ab4는 msCRD2, msCRD3 및 msCRD4 발현 작제물로 형질감염된 세포에 대해 감소된 결합을 나타낸다(도 10b-f). 이러한 결과는 1923Ab4가 CRD2, CRD3 및 CRD4 영역을 통해 인간 CD137에 결합한다는 것을 시사한다.
도 11a에서, 인간 및 마우스 CRD4 영역의 서열 정렬은 5개의 구별되는 차이를 나타냈다. 인간 아미노산 서열을 마우스 아미노산 서열로 변경시킴으로써 추가의 발현 작제물(M1 내지 M5)을 제조하였다. 예를 들어, M1 영역의 인간 "CF" 서열을 부위 지향 돌연변이 유발로 마우스 "SL" 서열로 돌연변이시켰다.
유세포 분석 기반 결합 검정으로 인간 CD137(WT) 또는 돌연변이된 CD137 발현 작제물(M1-M5)로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 항-CD137 1923Ab4의 결합 분석을 수행하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 1923Ab4로 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. iQue Screener PLUS(Sartorius, MI)를 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 11d에서, PC2 우렐루맙-NR을 발현 대조군으로서 사용하였으며, 이의 결합 에피토프를 CRD1 도메인에 대해 맵핑하였다(Chin, SM 등의 문헌[Nat Commun, 2018 11월 8;9(1):4679]). CD137의 CRD4 도메인의 M2 영역에서의 "KRGI"(서열번호 81)의 인간 아미노산 서열에 대한 "NGTGV"(서열번호 77)의 마우스 아미노산 서열로의 변경은 본 개시된 항체 1923Ab4에 대한 이의 결합을 크게 감소시켰다. M1, M3, M4 및 M5에 대한 돌연변이 유발은 세포 표면 상에서 발현된 CD137 단백질에 대한 1923Ab4의 결합 활성을 변화시키지 않았다(도 11b, 11c 및 11e-g).
실시예 11: HDX 질량 분광분석을 사용한 인간 CD137에 대한 1923Ab4의 에피토프 맵핑
도메인 교체 및 돌연변이 유발 연구를 사용하여, 1923Ab4가 CRD2, CRD3 및 CRD4 도메인을 통해 인간 CD137에 결합하는 것을 입증하였다(실시예 10). 인간 CD137에 대한 1923Ab4의 결합 부위를 추가로 식별하기 위해, 수소 중수소 교환(HDX) 질량 분광분석을 사용하였다. 에피토프로서 정의되는, 항체에 결합된 인간 CD137의 영역은 수소/중수소 교환으로부터 보호된다. 분해된 펩티드의 질량 차이는 LC-MS로 측정된다.
우선적으로 재조합 CD137을 중수소 산화물 중에서 단독으로 또는 1923Ab4 항체와의 복합체로 인큐베이션하였다. 20℃에서 0초, 15초, 60초, 600초, 또는 3600초 동안 중수소 교환을 수행하였다. 교환 반응물을 낮은 pH로 퀀칭시키고, 단백질을 펩신/프롤릴 엔도펩티다아제/XIII으로 분해하였다. CD137의 분해된 펩티드에서의 중수소 수준을 LC-MS 상에서의 질량 시프트로부터 모니터링하였다.
재조합 CD137은 서열 AA46-51(KGVFRT; 서열번호 78), AA65-90(CTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELT; 서열번호 79) 및 AA104-107(DQKR; 서열번호 80)(도 12에서 음영 바로 도시된 영역)에서 1923Ab4 항체에 결합할 때 중수소 흡수의 유의한 감소를 나타냈다. 해당 데이터는 실시예 10에 기술된 도메인 교체 실험과 일치한다. 재조합 CD137은 서열 AA46-51(KGVFRT; 서열번호 78), AA65-90(CTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELT; 서열번호 79) 및 AA104-107(DQKR; 서열번호 80)에서 1923Ab4 항체에 결합할 때 중수소 흡수의 유의한 감소를 나타냈다. 도 12는 에피토프 맵핑 결과를 음영 바로 도시하여 요약한다. 해당 데이터는 실시예 10에 기술된 도메인 교체 실험과 일치한다.
실시예 12: PD-L1 또는 CD137에 대해 결합하는 scFv의 제조
도 1a에 나타낸 PD-L1에 대한 전체 인간 단클론 항체의 가변 영역을 사용하여 (N)-VL-링커-VH-(C) 또는 (N)-VH-링커-VL-(C)의 구조로 PD-L1에 결합하는 scFv를 제조하였다.
도 1b 및 1c에 나타낸 CD137에 대한 전체 인간 단클론 항체의 가변 영역을 사용하여 (N)-VL-링커-VH-(C) 또는 (N)-VH-링커-VL-(C)의 구조로 CD137에 결합하는 scFv를 제조하였으며, 여기에서 중쇄 가변 영역의 위치 44에서의 아미노산 잔기 "G"는 "C"로 치환될 수 있고, 경쇄 가변 영역의 위치 100에서의 아미노산 잔기 "G"는 "C"로 치환될 수 있다. scFv에서의 "G"로부터 "C"로의 이러한 아미노산 치환은 이중특이체 항체 또는 삼중특이체 항체의 하나의 표적 특이적 모이어티로서의 scFv의 안정성을 개선할 수 있다.
실시예 13: PD-L1/CD137 이중특이체의 분자 설계 및 생산
PD-L1에 결합하는 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 13 및 14에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 13j에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 대칭 이중특이체(PD-L1 x CD137)을 제조하였다:
1923Ab18
1. 중쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 50: 항-PD-L1 항체의 중쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C); 및
2. 경쇄: 항-PD-L1 항체 경쇄를 포함하는 서열번호 40.
1923Ab18의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 50)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1923Ab18의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 40)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 이중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 이중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BiRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 2-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 14: 비대칭 PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 분자 설계 및 생산
PD-L1에 결합하는 비대칭 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 13 및 14에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 13c에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 삼중특이체(PD-L1 x CD137 x TGFβRII)을 제조하였다:
1923Ab9
1. 중쇄(노브): 다음 성분을 포함하는 서열번호 41: 항-PD-L1 항체의 중쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C);
2. 중쇄(홀): 항-PD-L1 항체 성분의 중쇄를 포함하는 서열번호 42(N → C); 및
3. 경쇄: 항-PD-L1 항체 경쇄를 포함하는 서열번호 39.
1923Ab9의 중쇄(노브) 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 41)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터에 삽입하고, 1923Ab9의 중쇄(홀) 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 42)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하고, 1923Ab9의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 39)을 갖는 DNA 분절 3을 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 이중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 삼중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BioRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 3-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 15: PD-L1/TGFβ/CD137 삼중특이체의 분자 설계 및 생산
PD-L1에 결합하는 대칭 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 13 및 14에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 13i에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 삼중특이체(PD-L1 x CD137 x TGFβRII, 1923Ab17)을 제조하였다:
1923Ab17
1. 중쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 50: 항-PD-L1 항체의 중쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C); 및
2. 경쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 39: 항-PD-L1 항체의 경쇄, 링커 및 TGFβRII ECD.
1923Ab17의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 50)을 갖는 DNA 분절 (1)을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1923Ab17의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 39)을 갖는 DNA 분절 (2)를 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 삼중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 삼중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BioRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 2-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 16: PD-L1에 결합하는 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화: CD137에 대한 결합
실시예 13 내지 15에 기술된 바와 같이 이중특이체 및 삼중특이체 항체를 생성하고, 생산하고, 정제하였다. CD137에 대한 이들 항체의 결합 활성을 조사하기 위해, 인간 CD137 발현 작제물로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 면역형광 이미징 분석을 수행하였다. 이러한 세포주는 세포 표면 상에서 인간 CD137 단백질을 발현하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 이들 항체로 염색한 후 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Cytation 5(Biotek, VT)을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 16a에서, 1923Ab4와 비교하여, 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab9, 1923Ab10 및 1923Ab11을 포함하는 본 개시된 모든 이중특이체 및 삼중특이체 항체는 세포 표면 상에서 인간 CD137과 유사하게 결합하였다. 해당 결과는 항-CD137의 ScFv 포맷이 CD137에 대한 결합 활성을 유지하였음을 나타낸다.
본 연구진은 또한 ScFv 포맷으로서 1923Ab3을 사용하여 삼중특이체 항체를 생성하였다. 도 16b에서, 1923Ab7 및 1923Ab16 둘 모두는 유세포 계측법으로 측정된 세포 표면 상에서 인간 PD-L1에 유사하게 결합하였다. 해당 결과는 1923Ab3 및 1923Ab4 둘 모두가 본 개시된 이중특이체 및 삼중특이체 항체에서 ScFv 포맷으로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 17: PD-L1에 결합하는 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화: CD137 신호전달
이들 항체는 NFκB 루시페라아제 리포터 검정을 사용하여 CD137 신호 전달에 대한 작용제 활성을 측정함으로써 추가로 평가되었다. 인간 CD137 발현 플라스미드 및 NFκB 루시페라아제 리포터 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 293T 세포를 리포터 세포로서 사용하였다. 이들 리포터 세포를 PD-L1을 발현하는 293T 세포와 공동 배양하고, 항체로 자극하고, 37℃에서 5% CO2로 16시간 동안 인큐베이션하였다. ONE-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek, VT)로 발광 신호를 측정하고, GraphPad Prism으로 데이터를 분석하였다. CD137 신호전달의 활성화는 발광 신호의 증가를 초래하였다.
도 17a에서, 이소형 대조군 항체와 비교하여, 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab9, 1923Ab10 및 1923Ab11을 포함하는 본 개시된 모든 항체는 CD137 신호전달을 활성화시켰다. 1923Ab7, 1923Ab8 및 1923Ab11은 1923Ab9 및 1923Ab10에 비해 보다 강한 작용 활성을 나타냈다(도 17a). 해당 결과는 항-CD137의 2가 결합이 항-CD137의 1가 결합보다 더 강한 항-CD137 신호전달을 유도하였음을 입증한다.
본 연구진은 또한 ScFv 포맷으로서 1923Ab3을 사용하여 삼중특이체 항체를 생성하였다. 또한, 재조합 CD137 및 NFκB 루시페라아제 리포터를 발현하는 Jurkat T CD137 리포터 세포를 사용하여 CD137 신호전달에 대한 이들 항체의 작용 활성을 비교하였다. 요약하면, Jurkat T NFkB 리포터 세포주를 사용하여 CD137 신호전달의 활성을 측정하고, PD-L1 발현 HEK293T 세포를 표적 세포로서 사용하여 PD-L1을 제공하였다. 도 17b에서, 1923Ab7 및 1923Ab16 둘 모두는 Jurkat T CD137 리포터 세포에 의해 측정된 CD137 신호전달과 유사한 작용 활성을 나타냈다. 1923Ab16은 인간 PD-L1에 효과적으로 결합하여 CD137 신호전달을 활성화시킨다.
실시예 18: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - CD137 신호전달의 PD-L1 의존적 활성화
본 개시된 항체를 PD-L1 의존성 CD137 작용을 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 도 18은 표적 세포의 존재(18a) 또는 부재(18b) 하에서 Jurkat T CD137 리포터 세포를 사용하여, CD137을 유도하는 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab17 및 1923Ab18의 능력을 입증한다. 요약하면, CD137 발현 Jurkat T NFkB 리포터 세포주를 사용하여 CD137 신호전달의 활성을 측정하고, PD-L1 발현 HEK293T 세포를 표적 세포로서 사용하여 PD-L1을 제공하였다. 리포터 세포를 표적 세포와 공동 배양했을 경우, 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab17, 1923Ab18, 및 우렐루맙-NR을 포함하는 본 개시된 항체는 CD137 신호전달의 활성화를 나타냈다(도 18a). 그러나, 우렐루맙-NR을 제외하고는, 본 개시된 항체 중 어느 것도 표적 세포의 부재 상태에서 CD137 신호전달을 유도하지 않았다(도 18b). 우렐루맙은 Bristol Myers Squibb에 의해 개발된 가교결합 독립적 항체이다. 해당 항체는 임상적 효능을 나타내지만, 간 독성으로 인해 이의 개발은 제한적이다. 도 18a에서, 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab17 및 1923Ab18은 우렐루맙과 비교하여 PD-L1 의존성 CD137 신호전달의 보다 강한 유도(Emax)를 나타냈다.
실시예 19: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - 항-CD137의 scFv의 위치
본 개시된 이중특이체 및 삼중특이체 항체 내의 상이한 위치에서의 항-CD137의 ScFv의 융합이 CD137 작용에 미치는 효과를 조사하기 위해, PDL1 발현 세포의 존재 또는 부재 하에 Jurkat T CD137 리포터 세포를 사용하였다. 시험 항체의 구조는 도 13 및 14에 도시되어 있다. 1923Ab19는 항체 경쇄의 C-종결부에서 융합된 1923Ab4의 ScFv 포맷을 함유한다. 1923Ab12 및 1923Ab13은 항체 경쇄 및 중쇄의 N-종결부에서 융합된 1923Ab4의 ScFv 포맷을 각각 함유한다. 1923Ab17 및 1923Ab7은 대조군 삼중특이체 항체이다. 도 19a는 이중특이체 Ab 1923Ab19가 PDL1 발현 세포의 존재 하에서만 CD137 신호전달을 유도할 수 있음을 입증한다. 유사하게, n1923Ab12 및 1923Ab13은 또한 PD-L1 의존성 방식으로 CD137 신호전달을 유도하였다(도 19b).
실시예 20: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - PD-1/PD-L1 상호작용의 차단
이중특이체 및 삼중특이체 항체에서의 PDL1 결합 아암이 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 차단하는 효과를 조사하기 위해, Promega(Madison, USA)에 의해 개발된 PD-1/PD-L1 억제 생물검정을 실시예 4에 기술된 바와 같이 사용하였다. 도 20은 1923Ab3, 1923Ab7, 1923Ab8, 1923Ab17 및 1923Ab18을 포함하는 본 개시된 모든 항체가 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 효과적으로 차단한다는 것을 입증한다. 이러한 차단 활성은 PC1 아벨루맙-NR 및 아테졸리주맙과 같은 임상적으로 승인된 항-PD-L1 항체와 동등하다.
실시예 21: 삼중특이체 특성화 - TGFβ 활성 차단
보다 높은 수준의 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)는 면역 회피, 요법(화학요법, 방사선, 관문 억제제) 내성, 및 진행성 악성 종양에서의 불량한 결과와 연관된다. 종양 미세환경(TME)에서 TGFβ를 격리함으로써 TGFβ 신호전달을 억제하는 것은 비면역 세포의 표현형 변화 및 면역 세포의 향상된 활성화를 초래한다. 따라서, TGFβ의 차단은 면역계와 완전히 관여하는 데 있어서 본 개시된 이중특이체 항체에 이점을 제공한다. 이를 위해, 1923Ab7 및 1923Ab17과 같은 삼중특이체 항체를 생성하였다. TGF/SMAD 신호전달 경로 SBE 리포터 - HEK293 세포주(BPS Bioscience, CA)를 사용하여 이들 항체의 TGFβ 차단 활성을 조사하였다. 도 21은 1923Ab7 및 1923Ab17 둘 모두가 각각 3.6 pM 및 2.8 pM의 IC50 값으로 TGFβ-유도 신호 전달을 효과적으로 차단하였음을 입증한다.
실시예 22: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - 인간 PBMC를 사용한 T 세포 활성화
T 세포 활성화를 측정하기 위해, 건강한 공여자로부터 제조된 인간 PBMC를 사용하였다. 이들 인간 PBMC를 10% FBS 및 0.5 ug/ml의 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325)이 보충된 RPMI1640 배지에서 1 x 106 세포/mL의 밀도로 배양하였다. 본 개시된 항체를 첨가하여 T 세포를 자극하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 3일 동안 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후, 제조사의 지침에 따른 프로토콜을 사용하여, 상청액을 사용하여 AlphaLISA(PerkinElmer, Cat #: AL217C /F)로 분비된 IFNγ를 측정하였다.
도 22a에 도시된 바와 같이, CD3으로 공동 치료했을 경우, 이중특이체 Ab 1923Ab8은 단클론 항-CD137 Ab 1923Ab4 + Fc-가교결합제 또는 PC2 우렐루맙-NR 단독으로 치료된 PBMC와 동등한 강한 T 세포 활성화를 유도하였다. 실시예 18의 이전 데이터는 1923Ab8의 활성이 PDL-1 의존적임을 입증하였다. PBMC 및 활성화된 T 세포에서 항원 제시 세포 상의 PDL1의 발현이 보고된 바 있으며, 이를 고려하면, 해당 데이터는 이중특이체 Ab가 면역 세포 상의 PDL1에 결합하여 종양 항원 경험 T 세포가 존재하는 종양 미세환경 및 배수 림프절에서 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 시사한다.
도 22b는 삼중특이체 1923Ab7 및 이중특이체 1923Ab8 둘 모두가 강한 T 세포 활성화를 유도하였음을 입증한다. 그러나, 항-PDL1 및 TGFbRII를 함유하는 이중특이체 Ab 1923Ab20은 T 세포 활성화를 나타내지 않았다. PD1 경로의 차단 및 CD137의 활성화 둘 모두는 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 해당 결과는 검출된 T 세포 활성화가 PD-1/PD-L1 상호작용의 억제보다는 CD137 신호전달의 활성화로 인한 것임을 나타낸다.
실시예 23: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - T 세포 매개 세포독성 및 CD8 T 세포 활성화
PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포 매개 세포독성 효과를 조사하기 위해, GFP를 발현하는 NUGC-4 위 종양 세포를 사용하였다. 요약하면, NUGC4 GFP 세포를 48시간 동안 IFNγ로 전처리하여 PD-L1 발현을 유도하였다. 전처리 후, 세포를 세척하고 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325) 및 본 개시된 이중특이체 또는 삼중특이체 항체로 자극된 CD8 T 세포와 함께 72시간 동안 공동 배양하였다. Cytation(Biotek, VT)을 사용하여 녹색 형광 신호를 측정하였다. 사멸 백분율을 다음의 식으로 계산하였다:
사멸(%) = (항체가 없는 GFP 신호 - 항체로 치료된 GFP 신호)/항체가 없는 GFP 신호 * 100%.
도 23a는 1923Ab17 및 1923Ab18이 강한 T 세포 매개 세포독성을 유도하였음을 입증한다. 1923Ab17 또는 1923Ab18로 자극된 CD8 T 세포와 함께 72시간의 인큐베이션 시, 종양 세포의 약 50%가 사멸되었다. 동일한 실험으로부터의 배지를 사용하여 T 세포 활성화의 표시로서 IFNγ의 양을 측정하였다. 도 23b는 이소형 대조군 치료에 비해 1923Ab17 및 1923Ab18 치료 둘 모두가 강한 T 세포 활성화를 유도하였음을 입증한다. 이들 결과는 1923Ab17 및 1923Ab18이 CD8 T 세포를 활성화했을 뿐만 아니라 CD8 T 세포 매개 사멸을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 24: 이중특이체 및 삼중특이체의 특성화 - CMV 리콜 검정에서의 PBMC를 사용한 항원 특이적 T 세포 활성화
본 개시된 이중특이체 및 삼중특이체 항체의 항원 특이적 T 세포 활성화를 조사하기 위해, 건강한 공여자로부터 제조된 인간 PBMC를 사용하였다. CMV 용해물은 Microbix Biosystems(Cat #: EL-01-02-001.0)로부터 구입하였다. CMV 용해물 및 항체로 5일 동안 자극된 인간 PBMC를 사용하여 CMV 리콜 검정을 수행하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션하였다. 5일의 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고 제조사의 지침에 따른 프로토콜을 사용하여, AlphaLISA(PerkinElmer, Cat #: AL217C /F)로 IFNγ를 측정하였다. IFNγ의 양은 T 세포 활성화에 직접적으로 비례한다.
도 24는 본 개시된 모든 항체가 항원 특이적 T 세포 활성화를 활성화하였음을 입증한다. 이 중, 1923Ab7 및 1923Ab17은 시험관 내에서 가장 강한 T 세포 활성화를 유도하였다. 해당 결과는 삼중특이체 항체가 이중특이체 항체 또는 "PC2 우렐루맙-NR + 1923Ab3" 또는 "PC2 우렐루맙-NR + 1923Ab20"의 병용 치료보다 더 강한 항원 특이적 T 세포 활성화를 활성화시켰음을 나타낸다.
실시예 25: 인간 P-L1 및 인간 CD137에 대한 1923Ab17 및 1923Ab18의 결합 동역학
인간 PD-L1 및 CD137에 결합하는 1923Ab3, 1923Ab4, 1923Ab17 및 1923Ab18을 포함하는 본 개시된 항체의 능력을 평가하기 위해, Biacore3000으로 결합 동역학 실험을 수행하였다. 요약하면, CM5 센서 칩(GE Healthcare, cat# BR-1000-12)을, 유동 셀 2에 대한 애플리케이션 위저드(application wizard)에 따라 항-인간 IgG 항체(GE Healthcare, cat# BR-1008-39)와의 아민 커플링 화학반응을 통해 고정시켰다. 유동 셀 1은 변형되지 않은 상태로 유지되어, 시스템 상의 기기 노이즈 및 드리프트를 차감하기 위한 기준 셀로서 기능하였다. 이중 블랭크(Fc1 및 블랭크 분석물 완충액)로 Fc2-1 검출을 실행하고, 항체 샘플을 HBS-EP(GE Healthcare, cat# BR-1003-69)에서 1 ug/ml로 희석하고, 1분 포획에 대해 10 ul/ml의 유속으로 주입하였다. 1:4 희석, HBS-EP 중 0 nM까지 5 포인트로, PD-L1에 대해 10 nM 및 CD137에 대해 80 nM로 희석된 항원 인간 PD-L1(Acro Biosystems, cat# PD1-H5229) 및 CD137(Sino Biological, cat# 10041-H08H)을 50 ul/분으로 2분 동안 주입한 다음, 6분 동안 해리하였다.
BAEevalution 소프트웨어에서 물질 전달 모델과의 1:1 결합으로 데이터를 분석하였다. 평형 해리 상수(KD)를 기록하였다. 표 10 및 11은 해당 결과를 요약한다.
실시예 26: MC38-hPD-L1 마우스 종양 모델에서의 항-종양 효과 및 종양 침윤 림프구(TIL) 분석
체중이 16-20 g인 6-8주령의 암컷 B-hPD-L1/h4-1BB 마우스(Biocytogen)를 연구 시작 전 7일 동안 순응시켰다. 마우스는 전체 연구 기간 동안 고압 멸균된 건식 과립 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었으며, 상대 습도 40-70%의 20-26℃에서 12시간의 명/암 사이클 환경 하에 수용되었다. MC38 쥣과 결장 암종 세포주를 마우스 PD-L1 대신 인간 PD-L1을 과발현하도록 유전자적으로 변형시켰다. 세포를 5%의 분위기 37℃에서 10% 열 불활성화 FBS가 보충된 DMEM 중 단층 배양물로서 시험관 내에서 유지하였다. 세포를 수확하고, 종양 발생을 위해 100 μl의 PBS 중 5 x 105개 세포를 우측 전방 옆구리에 피하 이식하였다. 7일차에, 종양 보유 마우스를 평균 종양 크기가 약 100-150 mm3인 2개의 시험군에 무작위로 등록시켰다. 각각의 군은 5마리의 마우스로 구성되었다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원적으로 주 2회 측정하였고, 종양의 부피는 다음 식을 사용하여 mm3 단위로 표현하였다. V = 0.5 a Х b2, 식 중 a 및 b는 각각 종양의 장변(long) 치수 및 단변(short) 치수이다. 치료는 5 mg/kg의 1923Ab18 또는 음성 대조군으로서 PBS의 복강내 주사로 7, 11, 14 및 18일차에 시작하였다. 연구는 21일차에 종료되었다. 종료시 출혈을 수행하여 AST 측정을 위한 혈청을 제조하였다. 종양을 수확하고 TIL 분석을 위해 조직 보관 완충액 중에 보관하였다.
도 25는 두 치료군 모두에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 1923Ab18은 비히클 대조군 대비 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 이는 78%의 종양 성장 억제에 도달하였다.
종양 미세환경에서의 면역 세포에 대한 1923Ab18 항체의 효과를 결정하기 위해, 전술한 연구에서의 종양 샘플을 채취하였다. 면역 세포의 전체 침윤은 CD3+/CD45+ 종양 침윤 림프구의 양을 측정함으로써 결정하였다. 도 26a에 나타낸 바와 같이, 1923Ab18은 종양 미세환경 내로의 CD3+ 면역 세포의 침윤을 유의하게 증가시켰다. CD3+ 세포를 CD4+ 또는 CD8+ TIL로 추가로 나누었다. 도 26b 및 c는 1923Ab18이 CD8+ 세포의 침윤을 유의하게 유도하였지만 CD4+ 세포의 침윤은 유도하지 않았음을 입증한다. 종양 미세환경에서의 Treg 세포의 수준은 CD25+ FOXP3+ CD3+ 종양 침윤 림프구의 양을 측정함으로써 결정하였다. 도 26d에 나타낸 바와 같이, 1923Ab18은 종양 미세환경에서의 Treg의 수준을 유의하게 감소시켰다. 따라서, CD8/Treg 비율은 1923Ab18로 치료한 마우스의 종양 미세환경에서 유의하게 증가하였다(도 26e).
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는, 모든 경우에 용어 "약"을 동반하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 개시에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 대략적인 값이다. 적어도, 청구범위의 범주에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하여, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 개시에서 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터는 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 초래되는 소정의 오차를 포함한다.
본 개시를 설명하는 맥락에서 (특히 다음의 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "일", "하나", "그" 및 이와 유사한 참조는, 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원의 값의 범위의 인용은 단지 해당 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 간략화 방법으로서 기능하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 마치 개별적으로 인용되는 것과 동등하게 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는, 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 예 그리고 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시를 보다 잘 나타내기 위한 것이며, 청구된 본 개시의 범주에 대한 제한을 달리 제기하지 않는다. 본 명세서에서의 어떠한 언어라도 본 개시의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 개시의 대안적인 요소 또는 구현예의 군은 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 각각의 군의 구성원은 개별적으로 또는 해당 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 해당 군에 포함되거나 해당 군으로부터 삭제될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 임의의 포괄 또는 배제가 발생할 경우, 본 명세서는 수정된 군을 포함하는 것으로 간주되며, 이에 따라 첨부된 청구범위에 사용되는 모든 마쿠시(Markush) 군의 서면 설명을 충족시킨다.
본 개시의 특정 구현예는 본 개시를 수행하기 위해 발명자에게 공지된 최상의 모드를 포함하여 본원에 설명된다. 물론, 이들 설명된 구현예에 대한 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자는 본 개시가 본원에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시는 관련 법률에서 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 전술한 요소의 모든 가능한 변형에서의 이들의 임의의 조합은 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 한 본 개시에 포함된다.
본원에 개시된 특정 구현예는 "~로 이루어지는" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는" 이라는 언어를 사용하여 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 청구범위에 사용될 경우, 보정에 따라 출원되거나 추가되었는지의 여부에 관계없이, 전환 용어 "~로 이루어지는"은 해당 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전환 용어 "~로 본질적으로 이루어지는"은 해당 청구범위의 범위를 특정 재료 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 이렇게 청구된 본 개시의 구현예는 본질적으로 또는 명시적으로 본원에 설명되고 구현된다.
본원에 개시된 본 개시의 구현예는 본 개시의 원리를 예시하는 것임을 이해해야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형 또한 본 개시의 범주 내에 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 본 개시의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 도시되고 설명된 바와 같이 정확하게 이에 한정되지 않는다.
본 개시는 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예를 참조하여 본원에 설명되고 예시되었지만, 본 개시는 해당 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부 사항의 많은 변형은 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 본 개시의 진정한 범주 및 사상은 다음의 청구범위로 표시되는 것으로 의도된다. 본 출원에서 언급된 모든 참조 문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

Claims (105)

  1. PD-L1 및 TGFβ 또는 PD-L1 및 CD137에 결합하는 결합 단백질로서:
    (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈;
    (b) TGFβ 또는 CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함하는, 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 항원 결합 부위 및 상기 제2 항원 결합 부위는:
    (i) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 45에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 58 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 갖는 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  11. 제9항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  12. 제9항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 상기 항체 스캐폴드 모듈 서열의 상이한 말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 항원 결합 부위는 TGFβ에 결합하는, 결합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, TGFβRII의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 항원 결합 부위는 CD137에 결합하는, 결합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 제1 결합 모듈은 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 scFv이되, 상기 서열은 직접 또는 scFv 융합 링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  21. 제19항에 있어서, 제1 결합 모듈은 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 56에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  22. 제19항에 있어서, 제1 결합 모듈은 N-말단에서 C-말단으로:
    (1) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (2) CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (3) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  23. 제19항에 있어서, 제1 결합 모듈은 N-말단에서 C-말단으로:
    (1) 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열;
    (2) 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (3) 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  25. 제24항에 있어서:
    (1) 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나;
    (2) 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 44에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나;
    (3) 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 45에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 46에 제시된 서열을 포함하거나;
    (4) 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 47에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하거나;
    (5) 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 40에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  26. PD-L1, TGFβ, 및 CD137에 결합하는 결합 단백질로서:
    (a) PD-L1에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 PD-L1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈;
    (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈; 및
    (c) CD137에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함하는, 결합 단백질.
  27. 제26항에 있어서,
    제1 항원 결합 부위 및 상기 제2 항원 결합 부위는:
    (i) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  28. 제26항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2 또는 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  29. 제26항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열;
    (ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  30. 제26항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열, 및
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  31. 제26항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 45에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 40에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 상기 제1 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  36. 제34항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  37. 제34항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  38. 제26항 내지 제31항 및 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 상기 항체 스캐폴드 모듈 서열의 상이한 말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, TGFβRII의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  42. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제2 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 상기 제2 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  45. 제43항에 있어서, 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  46. 제45항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  47. 제43항에 있어서, 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  48. 제47항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  49. 제25항 내지 제40항 및 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 제2 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 상기 항체 스캐폴드 모듈 서열의 상이한 말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  50. 제41항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖되, 상기 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  51. 제41항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖되, 상기 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  52. 제42항에 있어서, 2개의 제2 결합 모듈을 갖되, 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, 다른 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  53. 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 모듈은 scFv인, 결합 단백질.
  54. 제26항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로:
    (1) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (2) CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (3) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  55. 제54항에 있어서, 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로:
    (1) 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열;
    (2) 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (3) 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  56. 제54항에 있어서, 제2 결합 모듈은 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 56에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  57. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈 및 2개의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  58. 제57항에 있어서,
    (1) 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 38에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하거나;
    (2) 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 50에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하거나;
    (3) 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 51에 제시된 서열을 포함하고; 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 52에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  59. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈 및 하나의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  60. 제59항에 있어서:
    (1) 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 41에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하거나;
    (2) 항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 43에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 42에 제시된 서열을 포함하고;
    항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 39에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  61. CD137, TGFβ, 및 PD-L1에 결합하는 결합 단백질로서:
    (a) CD137에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 CD137에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈;
    (b) TGFβ에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈; 및
    (c) PD-L1에 결합하는 제4 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 결합 모듈을 포함하는, 결합 단백질.
  62. 제61항에 있어서,
    제1 항원 결합 부위 및 상기 제2 항원 결합 부위는:
    (i) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 22, 및 CDR3: 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 24, CDR2: 서열번호 25, 및 CDR3: 서열번호 26를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) CDR1: 서열번호 27, CDR2: 서열번호 28, 및 CDR3: 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 30, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (iii) CDR1: 서열번호 32, CDR2: 서열번호 33, 및 CDR3: 서열번호 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 35, CDR2: 서열번호 36, 및 CDR3: 서열번호 37를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  63. 제61항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 16, 서열번호 18, 또는 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 또는
    서열번호 17, 서열번호 19, 또는 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  64. 61항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열;
    (ii) 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  65. 제61항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    (i) 서열번호 16에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 17에 제시된 경쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열;
    (ii) 서열번호 18에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 19에 제시된 경쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열; 또는
    (iii) 서열번호 20에 제시된 중쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64에 제시된 중쇄 불변 영역 서열,
    서열번호 21에 제시된 경쇄 가변 영역 서열,
    서열번호 65 또는 서열번호 66에 제시된 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  66. 제61항에 있어서,
    항체 스캐폴드 모듈은:
    서열번호 75에 제시된 중쇄 서열; 및 서열번호 76에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  68. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  70. 제69항에 있어서, 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제1 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 상기 제1 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  71. 제69항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  72. 제69항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  73. 제61항 내지 제66항 및 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 제1 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 상기 항체 스캐폴드 모듈의 상이한 말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  74. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  75. 제74항에 있어서, TGFβRII의 세포외 도메인은 서열번호 67에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  76. 제61항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  77. 제61항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경쇄 서열을 포함하며, 제2 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 결합 단백질.
  79. 제78항에 있어서, 제2 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 제2 결합 모듈 인터링커를 통해 서로 공유 부착되며, 상기 제2 결합 모듈 인터링커는 서열번호 58 또는 서열번호 59에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  80. 제78항에 있어서, 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  81. 제80항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  82. 제78항에 있어서, 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  83. 제82항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  84. 제61항 내지 제75항 및 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 제2 결합 모듈이 있는 경우, 각각은 상이한 항체 스캐폴드 모듈 서열 또는 상기 항체 스캐폴드 모듈 서열의 상이한 말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  85. 제76항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖되, 상기 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  86. 제76항에 있어서, 하나의 제2 결합 모듈을 갖되, 상기 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  87. 제77항에 있어서, 2개의 제2 결합 모듈을 갖되, 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되고, 다른 하나의 제2 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 C-말단에 공유 부착되는, 결합 단백질.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 모듈은 scFv인, 결합 단백질.
  89. 제61항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로:
    (a) CDR1: 서열번호 5, CDR2: 서열번호 6, 및 CDR3: 서열번호 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 8, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 10을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (b) CDR1: 서열번호 11, CDR2: 서열번호 12, 및 CDR3: 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 14, CDR2: 서열번호 9, 및 CDR3: 서열번호 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  90. 제89항에 있어서, 제2 결합 모듈은, N-말단에서 C-말단으로:
    (1) 서열번호 1에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 2에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (2) 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  91. 제61항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 모듈은 서열번호 57에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  92. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 결합 모듈 및 2개의 제2 결합 모듈을 갖는, 결합 단백질.
  93. 제92항에 있어서:
    항체 스캐폴드 모듈 및 제2 결합 모듈의 중쇄 서열은 서열번호 48에 제시된 서열을 포함하고; 여기에서 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈의 경쇄 서열은 서열번호 49에 제시된 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  95. 제94항에 있어서, 불변 영역은 Fc 침묵 돌연변이를 포함하는, 결합 단백질.
  96. 제95항에 있어서, Fc 침묵 돌연변이는 LALA 또는 N297A인, 결합 단백질.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역은 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 포함하는, 결합 단백질.
  98. 제94항에 있어서, 불변 영역은 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 또는 서열번호 64를 포함하는, 결합 단백질.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  100. 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  101. 상기 청구항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  102. 제101항에 있어서, 상기 청구항 중 어느 한 항에 제시된 서열을 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  103. 제101항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  104. 제102항의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제103항의 벡터를 포함하는, 세포.
  105. 상기 청구항 중 어느 한 항의 결합 단백질의 생산 방법으로서, 상기 방법은 제104항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
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