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KR20230169414A - 세포 미소구획 및 제조 방법 - Google Patents

세포 미소구획 및 제조 방법 Download PDF

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KR20230169414A
KR20230169414A KR1020237041046A KR20237041046A KR20230169414A KR 20230169414 A KR20230169414 A KR 20230169414A KR 1020237041046 A KR1020237041046 A KR 1020237041046A KR 20237041046 A KR20237041046 A KR 20237041046A KR 20230169414 A KR20230169414 A KR 20230169414A
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microcompartment
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케뱅 알렉상드리
피에르 나수아
로랑 꼬네
가엘 르셰
에르완 베자르
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유니베르시떼 드 보르도
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄
앵스띠뛰 도프띠끄 테오리끄 에 아플리끄
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Abstract

본 발명은 연속하여, 내강 주변에 조직화된, 적어도 하나의 다능성 세포 층, 세포외 매트릭스 층, 및 외부 히드로겔 층을 포함하는 세포 미소구획에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

세포 미소구획 및 제조 방법{CELLULAR MICROCOMPARTMENT AND PREPARATION METHODS}
본 발명은 인간 세포의 다능성을 유지시킬 수 있는 세포 미소구획에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 3차원 (3D) 세포 배양 구획을 수득하기 위한 제조 방법에 관한 것이다.
다능성 세포는 중요한 인간 세포 자원으로 여겨지고, 그의 배양은, 특히 의료 및 제약 분야에서 관심이 증가되고 있다. 따라서, 대량으로 다능성 세포를 생산하는 것은 현재 사용되는 많은 세포주 보다 더 관련성 있는 세포 모델에 찬성하여 동물 모델의 사용을 감소시키고 있는, 제약 산업이 표현하는 새로운 요구를 충족하게 될 것이다. 제약 회사에서 개발한 고속 대량 검사는 이미 대량의 인간 다능성 세포를 사용한다. 유사하게, 인간에서 세포 요법 및 조직 조작은 산업적 분량의 인간 다능성 세포의 이용가능성에 의존적이다.
현재, 인간 다능성 세포는 일반적으로 세포가 정상적으로 진화하는 3D 배지와는 매우 상이한, 2차원 (2D) 환경, 예컨대 페트리 디쉬에서 배양된다. 이러한 2D 배양된 세포의 취급은 종종 정교하고, 정제, 효소 탈착 등의 특정한 단계를 요구한다. 더 나아가서, 이들 세포는 저장하는 것이 어렵고 냉동 후에 매우 낮은 생존율을 갖는다. 그러나, 액체 배양에 적합하고, 대량으로 냉동된 다능성 세포 배양물을 수송하는 통상의 캐리어의 능력은 연구소 및 제약 산업 둘 모두에 주요한 도전을 의미한다.
이러한 상황에 대응하여, 특히 인간 다능성 줄기 세포 배양 시스템의 처리량, 효율성 및 품질을 증가시키는 것을 추구하는 3차원 배양 시스템이 개발되었다.
그러나, 현행 3D 배양 시스템은 전체적으로 만족스럽지 않다. 비제어적인 융합 현상이 종종 관찰되고, 그 결과로서 그의 크기 (> 200 ㎛ 직경)가 배양 배지의 확산을 불충분하게 만드는 세포 응집체가 생성된다. 따라서, 이러한 3D 배양 시스템 내에서, 세포 분화는 제어하는 것이 어렵고/어렵거나, 세포 사멸율이 매우 높다. 일반적으로, 3D 세포로부터 유래된 생성물의 균질성 결여 및 이러한 기술의 비용은 아무리 불만족스럽더라도, 2D 배양과 비교하여 이 기술을 경쟁력없게 만든다.
따라서, 기초 연구 및 산업적으로 쉽게 사용될 수 있는, 제어된 표현형을 갖는 대량의 다능성 세포를 제공할 수 있는 3D 세포 배양 시스템에 대한 필요성이 존재한다.
3D 세포 배양을 위한 세포 미소구획의 개발에 힘쓰는 동안에, 본 발명자는 그의 표현형을 유지하면서 인간 다능성 세포의 대량 액체 현탁 배양을 가능하게 하는 시스템을 개발하였다. 개발된 미소구획은 야생형 분화를 피하고 다능성을 유지하도록 그들 표현형을 제어하고 세포를 보호하면서, 2D 배양에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용하여, 액체 배지에서 세포를 배양하는 것을 가능하게 한다. 보다 상세하게, 본 발명자가 개발한, 미소구획, 또는 캡슐은, 연속적으로, 실질적으로 동심 방식으로 조직화된, 히드로겔 쉘, 세포외 매트릭스 층 및 중심 내강을 둘러싼 인간 다능성 세포의 하나 이상의 층을 포함한다. 본 발명에 따른 캡슐의 히드로겔 쉘은, 현행 배양 시스템과 달리, 액체 현탁 배양 동안 융합 또는 충돌과 연관된 물리적 응력으로부터 세포를 보호한다. 특히 유리하게, 본 발명에 따른 미소구획의 "낭포 (cyst)"로의 조직화는 그를 높은 세포 생존률로 냉동될 수 있게 한다. 또한, 세포가 미소구획 내에서 직접적으로 사용 전에 분화될 수 있거나, 또는 3D 및 2D 배양 둘 모두에서, 다능성 단계로 사용될 수 있다. 발명자는 또한 그들이 함유하는 세포의 표현형을 제어하고 냉동시키는데 적합한, 낭포 형태를 수득하고 유지하는 것이 보장되는, 이러한 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법을 개발하였다.
그러므로 본 발명의 대상 주제는 연속적으로, 내강 주변에 조직화된,
- 인간 다능성 세포의 적어도 하나의 층;
- 세포외 매트릭스 층;
- 외부 히드로겔 층
을 포함하는 세포 미소구획이다.
유리하게, 배양 배지가 층 사이에 남아있는 공간을 채우게 된다.
본 발명의 다른 주제는
(a) RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 인간 다능성 줄기 세포를 인큐베이션시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 다능성 줄기 세포를 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 캡슐을 RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계;
(e) RHO/ROCK 경로 억제제를 제거하기 위해서 단계 (d)로부터의 캡슐을 세정하는 단계;
(f) 단계 (e)로부터의 캡슐을 3일 내지 20일, 우선적으로 5 내지 10일 동안, RHO/ROCK 경로 억제제 무함유 배양 배지에서 배양시키고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계
로 이루어진 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법이다.
본 발명의 다른 주제는
(a) 인간 분화 세포를 세포외 매트릭스 및 세포 리프로그래밍제와 혼합하는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 캡슐을 10일 내지 40일 동안 배양시키고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계
로 이루어진 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법이다.
도 1: 본 발명에 따라 낭포를 형성시킨 세포 미소구획의 사진 (A) 및 개략도 (B) (1: 히드로겔층; 2: 세포외 매트릭스 층; 3: 다능성 세포층; 4: 내강).
본 발명의 주제는 세포의 다능성이 유지되는, 인간 다능성 세포를 포함하는 3D 세포 미소구획이다.
세포 미소구획
본 발명에 따른 세포 미소구획은 그의 중공 중심, 또는 내강이, 우선적으로, 수성인 낭포를 형성한다. 본 발명의 문맥에서, "낭포"는 그들이 동일한 지점 주변에서 연속적으로 조직화된다는 의미에서, 실질적으로 동심적인 층을 함유하는 밀폐된 중공 구조체를 의미하는 것으로서, 외부 층이 내강을 둘러싼 세포층을 봉입하는 매트릭스층을 봉입시킨다. 일반적으로, 낭포를 구성하는 다능성 세포는 양극화된다. 낭포 내 이들 세포의 양극성은 단백질 TJP-1 또는 ZO-1에 의해 검출될 수 있고, 이들 둘은 내강에 인접하는 다능성 세포층의 내부/첨단 측면 상에 위치된다.
내강은 세포외 매트릭스 층 상에서 복제되고 발생되는 세포에 의해서, 낭포 형성 시에, 생성된다. 유리하게, 내강은 액체, 및 보다 특히 배양 배지를 함유한다.
본 발명의 문맥에서, "히드로겔 층"은 액체, 우선적으로 물에 의해 팽윤된 중합체 사슬의 매트릭스를 형성하는 3차원 구조를 의미한다. 유리하게, 사용되는 히드로겔은 세포에 유독하지 않다는 의미에서, 생체적합성이다. 더 나아가서, 히드로겔 층은 미소구획 내에 함유된 세포에게 산소의 확산 및 영양분이 공급될 수 있게 해야만 하고 그들이 생존할 수 있게 해야만 한다. 예를 들어, 외부 히드로겔 층은 알기네이트를 함유한다. 우선적으로, 외부 층은 오직 알기네이트만을 함유한다. 본 발명의 문맥에서, "알기네이트"는 β-D-만누로네이트 (M) 및 α-L-굴루로네이트 (G), 이의 염 및 유도체로부터 형성된 선형 다당류를 의미한다. 유리하게, 알기네이트는 80% 초과의 G 및 20% 미만의 M으로 구성된 소듐 알기네이트로서, 평균 분자 질량이 100 내지 400 KDa (예를 들어, PRONOVA® SLG100)이고 총 농도는 0.5 질량% 내지 5 질량%를 포함한다. 본 발명에 따라서, 히드로겔 층은 세포-무함유이다. 본 발명에 따른 세포 미소구획의 일 실시형태에서, 외부 층은 알기네이트를 포함한다.
차례로, 세포외 매트릭스 층은 소수의 세포를 함유할 수 있다. 실제로, 낭포 형성 시에, 세포가 매트릭스에 그들 공간을 생성시키고 증식되어서, 미소구획을 채우게 된다. 그러므로, 세포외 매트릭스 층과 다능성 세포 층 사이의 경계는 완벽하게 명확하지 않을 수 있다. 따라서 세포 층과 접촉하는 표면에서, 세포외 매트릭스는 소수의 다능성 세포를 함유할 수 있다. 반대로, 히드로겔과 접촉하는 세포외 매트릭스 층의 표면은 세포-무함유이다.
세포외 매트릭스 층은 미소구획 내 다능성 세포의 생존 및 낭포의 형성에 필수적이다.
우선적으로, 세포외 매트릭스 층은 미소구획의 내강을 향해서 지향된 면을 의미하는, 히드로겔 층의 내부면 상에서 겔을 형성한다. 세포외 매트릭스 층은 세포 배양에 필요한 세포외 화합물 및 단백질의 혼합물, 및 보다 특히 다능성 세포의 배양물을 포함한다. 우선적으로, 세포외 매트릭스는 구조 단백질, 예컨대 α1, α4 또는 α5 서브유닛, β1 또는 β2 서브유닛, 및 γ1 또는 γ3 서브유닛을 함유하는 라미닌, 엔탁틴, 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐을 비롯하여, 성장 인자 예컨대 TGF-베타 및/또는 EGF를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 매트릭스 층은 Matrigel® 및/또는 Geltrex®로 이루어지거나, 또는 이를 함유한다.
본 발명에 따라서, 세포 미소구획은 인간 다능성 줄기 세포의 하나 이상의 층을 함유한다. 다능성 줄기 세포, 또는 다능성 세포는 전체의 본래 유기체에 존재하는 모든 조직을 형성하는 능력을 갖지만 그와 같은 전체의 유기체를 형성할 수는 없는 세포이다.
특정한 실시형태에서, 캡슐화된 세포는 다능성 줄기 세포, 예컨대 유도 다능성 줄기 (IPS) 세포, 성체 포유동물의 피부 및 골수에 존재하는 다계통-분화 스트레스 내성 (multilineage-differentiating stress enduring) (MUSE) 세포, 또는 배아 줄기 (ES) 세포이다.
본 발명의 문맥에서, "유도 다능성 줄기 세포" (IPS 세포)는 배아 줄기 세포의 것과 부분적으로 유사한 다능성 및 자가-재생의 잠재성 및 형태를 갖고 분화되는 체액 세포의 유전자 리프로그래밍에 의해 수득된 다능성 줄기 세포로서 정의된다. 이들 세포는 특히 다능성 마커, 예컨대 알칼리 포스파타제 염색 및 단백질 NANOG, SOX2, OCT4 및 SSEA3/4의 발현에 양성이다. 유도 다능성 줄기 세포를 수득하기 위한 방법은 당업자에게 충분하게 공지되어 있고, 특히 Yu 등 (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi 등 (Cell, 2007, 131(5): 861-872) 및 Nakagawa 등 (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106)의 논문에 기술되어 있다.
배아 줄기 세포의 경우에, 상기 다능성 줄기 세포는 배반포의 내부 세포괴로부터 유래되고, 유기체의 모든 조직의 형성을 유도시키는 능력을 갖는 세포이다. 배아 줄기 세포의 다능성은 마커 예컨대 전사 인자 OCT4 및 NANOG 및 표면 마커 예컨대 SSEA3/4, Tra-1-60 및 Tra-1-81의 존재에 의해서 평가될 수 있다. 배아 줄기 세포는 예를 들어, Chung 등 (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117)이 설명한 기술을 사용하여, 그들이 기원된 배아를 파괴하지 않고 수득될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 법적 또는 윤리적 이유로, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포를 배제하는 것으로 정의된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 미소구획에 사용되는 인간 다능성 줄기 세포는 체세포로부터 다능성으로 유도된다.
유리하게, 세포층은 상기 세포에 의해 생성되는 세포 및 매트릭스의 적어도 95 부피%, 우선적으로 적어도 96%, 97%, 98%, 99%를 함유한다. 세포는 본질적으로 다능성 세포이다. "본질적으로"는 세포층에 함유된 세포의 적어도 90%가 다능성 세포이고, 우선적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%가 다능성 세포라는 것을 의미한다.
유리하게, 낭포의 내강은 배양 배지를 함유한다. 특히, 다능성 세포의 현탁 배양을 가능하게 하는 임의의 배지, 및 특히 2D 배양에서 통상적으로 사용되는 임의의 배양 배지를 사용할 수 있다.
우선적으로, 세포 미소구획은 밀폐된다. 세포 미소구획에 이의 크기 및 형상을 제공하는 것은 외부 히드로겔 층이다. 미소구획은 세포 캡슐화에 적합한 임의의 형상을 가질 수 있다.
유리하게, 세포 미소구획의 치수는 제어된다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획은 구형 형상을 갖는다. 우선적으로, 이러한 미소구획의 직경은 10 ㎛ 내지 1 ㎜, 보다 우선적으로 50 ㎛ 내지 500 ㎛를 포함하고, 보다 더 우선적으로는 500 ㎛ 미만, 바람직하게 400 ㎛ 미만이다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획은 장방형 형상을 갖는다. 특히, 미소구획은 타원형 또는 관형 형상을 가질 수도 있다. 유리하게, 이러한 타원형 또는 관형 미소구획의 최소 치수는 10 ㎛ 내지 1 ㎜, 더 우선적으로 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 보다 더 우선적으로 500 ㎛ 미만, 우선적으로 400 ㎛ 미만을 포함한다. "최소 치수"는 미소구획의 중심과 히드로겔 층의 외부 표면 상의 지점 간 최소 거리의 2배를 의미한다.
특정한 실시형태에서, 외부 히드로겔 층의 두께는 미소구획의 반경의 5 내지 40%를 의미한다. 세포외 매트릭스 층의 두께는 미소구획의 반경의 5 내지 80%를 의미하고 유리하게 히드로겔 쉘의 내부 면에 부착된다. 다능성 세포층의 두께는 미소구획의 반경의 약 10%를 의미한다. 다능성 세포층은 세포외 매트릭스 층과 적어도 한 지점에서 접촉하고, 배양 배지가 채워진 공간이 매트릭스 층과 낭포 사이에 존재할 수 있다. 그러면 내강은 미소구획의 반경의 5 내지 30%를 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 층의 "두께"는 미소구획의 중심에 대해서 방사상으로 확장되는 상기 층의 치수이다.
특정한 예에서, 세포 미소구획은 반경이 100 ㎛인 구형 형상을 갖는다. 히드로겔 층은 5 ㎛ 내지 40 ㎛의 두께를 갖는다. 세포외 매트릭스 층은 5 ㎛ 내지 약 80 ㎛의 두께를 갖는다. 다능성 세포의 층은 10 내지 30 ㎛의 두께를 갖고, 내강은 대략 5 내지 30 ㎛의 반경을 갖는다.
일반적으로, 외부 히드로겔 층의 존재는 세포 층에 최대 크기를 부여하고, 낭포의 내강에 가장 가까운 것을 의미하는, 층에서 세포의 비제어적인 분화 및/또는 세포의 무산소성 사멸을 초래할 수 있는, 세포의 비제어적인 증식을 봉입에 의해서 제한한다. 2D에서, 페트리 디쉬 상에, 콜로니는 원반형이고, 원반형 중심의 세포는 그를 둘러싼 세포의 압박 하에서 분화되거나 또는 사멸하는 경향이 있고 (분열에 의해 생성된 각각의 새로운 세포는 공간의 결여로 인해 콜로니로부터 배제됨), 모서리의 세포가 분화되는 경향이 있고 오직 적당한 거리의 밴드만이 최적 표현형을 갖는다. 본 명세서에서 제시하는 미소구획의 토폴로지로서, 캡슐에 의해 형성된 구형의 내부 표면은 기계적 응력의 관점 및 소형 분자의 확산 둘 모두에 최적으로 균등하게 모든 세포가 위치되는 "모서리 없는" 줄기 세포의 "콜로니" (다능성 세포 층)를 생성시키는 것을 가능하게 한다. 유리하게, 미소구획의 세포 밀도는 미소구획 당 1 내지 수천개 세포, 우선적으로 100 ㎛ 반경 미소구획 당 50 내지 1000개 세포를 포함한다.
세포 미소구획의 제조 방법
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포 미소구획을 수득하는 것을 가능하게 하는 세포 미소구획의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특별히, 본 발명은 미소구획의 형성 동안 히드로겔 캡슐 내부에서 다능성 세포로 리프로그래밍되어질 것인 분화된 세포, 또는 다능성 줄기 세포로부터 직접적으로 낭포로 조직화된 다능성 줄기 세포를 함유하는 세포 미소구획을 제조하는 것을 제안한다.
히드로겔 캡슐 내에 다능성 줄기 세포 및 세포외 매트릭스를 함유하는 세포 미소구획을 제조하는 임의의 방법이 본 발명에 따른 제조 방법의 실행을 위해 사용될 수 있다. 특히, 하기에 기술된 단계에 따라서, 2016년에 Alessandri 등 ("A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604)이 기술한 미세유체 방법 및 장치를 개조하여 미소구획을 제조하는 것이 가능하다.
제1 실시형태에서, 본 발명에 따른 제조 방법은
(a) 인간 다능성 줄기 세포를 RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 인큐베이션시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 다능성 줄기 세포를 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 캡슐을 RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계;
(e) RHO/ROCK 경로 억제제를 제거하기 위해서 단계 (d)로부터의 캡슐을 세정하는 단계;
(f) 단계 (e)로부터의 캡슐을, 낭포가 수득될 때까지, 3일 내지 20일, 우선적으로 5일 내지 10일 동안 배양시키고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
하나 이상의 RHO/ROCK ("Rho-associated protein kinase") 경로 억제제, 예컨대 티아조비빈 (C15H13N5OS) 및/또는 Y-27632 (C14H21N3O)를 함유하는 배지에서의 인큐베이션 단계 (a) 및 배양 단계 (d)는 외부 히드로겔 층이 상기 세포외 매트릭스 주변에 형성될 때 세포외 매트릭스에 세포 부착 및 다능성 줄기 세포의 생존을 촉진한다. 그러나, RHO/ROCK 경로 억제제가 낭포의 형성을 방해하지 않도록, 이들 단계는 시간 제한적인 것이 바람직하다.
따라서, 우선적으로, 인큐베이션 단계 (a)는 수 분 내지 수 시간, 우선적으로 2분 내지 2시간, 보다 우선적으로 10분 내지 1시간을 포함하는 시간 동안 수행된다.
유사하게, 우선적으로, 배양 단계 (d)는 2시간 내지 48시간을 포함하는 시간 동안, 우선적으로 6시간 내지 24시간을 포함하는 시간 동안, 보다 우선적으로 12시간 내지 18시간을 포함하는 시간 동안 수행된다.
단계 (e)는 RHO/ROCK 경로 억제제의 모든 흔적의 제거를 보장하기 위해 필수적이다. 단계 (e)는 예를 들어, RHO/ROCK 경로 억제제가 없는 연속 배양 배지에서의 세정, 우선적으로 수 회의 세정에 의해서 수행된다.
유리하게, 단계 (f)는 다능성 세포 층 및 내강이 미소구획의 반경의 10 내지 95%와 동일한 누적 두께를 갖는 세포 미소구획을 수득하기에 충분한 시간 동안, 다시 말해서, 2개 세포로부터 약 수천개 세포로 계대가능한 충분한 시간 동안 수행된다. 다능성 줄기 세포 배양에 적합한 임의의 배양 배지, 특히 염수 포스페이트 완충액 예컨대 Roswell Park Memorial Institute 배지를 사용해도 된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 (b) 이전에, 우선적으로 효소-무함유 시약에 의해서 단계 (a)의 다능성 줄기 세포를 해리시키는 단계로 이루어진 중간 단계 (a')를 포함한다. 유리하게, 상기 시약은 캡슐화 단계 이전에, 특히 다능성 세포에 특이적인 배지에서의 연속 세정을 통해서 세정되거나 또는 억제된다. 예를 들어, 사용되는 시약은 EDTA 또는 EGTA 예컨대 ReLeSR®을 함유하는 등-삼투 완충액이다. 물론, 효소를 함유하는 시약 또는 트립신을 사용하는 것도 가능하지만, 그러면 이 단계의 종료 시에 다능성 세포의 생존율이 효소-무함유 시약의 사용과 비교하여 저하될 수 있다. 모든 경우에서, 세정 단계는 세포 해리에 사용되는 시약의 임의의 흔적을 제거하기 위해 필요하다.
일 실시형태에서, 단계 (a'), (b), (c), (d) 또는 (e) 중 적어도 하나, 우선적으로 단계 (a'), (b), (c), (d) 및 (e)의 전부는 0 내지 8℃를 포함하는 온도에서 수행된다. 실질적으로 4℃와 동일한 온도의 유지는 외부 환경으로부터의 신호의 전달을 포함하여, 세포의 생물학적 프로세스가 휴면기가 되도록 할 수 있다. 이것은 세포 탈착에 의해 유도될 수 있는, 세포 사멸의 현상을 제한하는 것을 가능하게 만든다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법은
(a) 분화된 인간 세포를 히드로겔 층을 투과하지 않는 세포 리프로그래밍제 및 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 캡슐을 10일 내지 40일 동안 배양시키고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획을 제조하기 위한 방법은
(a) 분화된 인간 세포를 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 캡슐을 히드로겔 층을 투과하는 세포 리프로그래밍제와 인큐베이션시키고, 캡슐을 10일 내지 40일 동안 배양시키고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계
로 이루어진 단계를 포함한다.
예를 들어, 사용되는 분화된 세포는 섬유아세포이다.
당업자는 본 발명에서 "리프로그래밍제"라고 하는, 특별한 인자에 의해서 배아 단계와 연관된 유전자의 발현을 재활성화시킴으로써 분화된 세포를 줄기 세포로 리프로그래밍하는 방법을 알고 있다. 예로서, Takahashi 등, 2006 ("Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors" Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676), Ban 등, 2009 ("Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome" Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009; 85(8):348-62) 및 발명의 명칭 "Production of reprogrammed pluripotent cells"의 국제 공개 특허 출원 WO2010/105311에 기술된 방법이 포함된다.
리프로그래밍제는 유리하게 생성물을 농축시키고 모든 세포와의 접촉을 촉진하기 위해서, 분화된 세포와 함께 캡슐화된다. 히드로겔 층을 투과하는 리프로그래밍제의 경우에, 캡슐화 단계 이후에 배양 배지에 상기 작용제를 첨가하는 것이 가능하다.
리프로그래밍제는 다능성 단계까지 연속적인 표현형 변화를 세포에게 부여하는 것이 가능하다. 유리하게, 리프로그래밍 단계 (a)는 이들 표현형 변화를 촉진하는 특별한 배양 배지를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 세포는 세린/트레오닌 단백질 키나제 수용체 억제제 (예컨대 생성물 SB-431542 (C22H16N4O3)), 하나 이상의 RHO/ROCK ("Rho-associated protein kinase") 경로 억제제 예컨대 티아조비빈 및/또는 Y-27632, 섬유아세포 성장 인자 예컨대 FGF-2, 아스코르브산, 및 항생제 예컨대 트리코스타틴 A (C17H22N2O3)가 보충된 이글 (Eagle)의 최소 필수 배지 (DMEM) 중에 10% 인간 또는 소 혈청을 포함하는 제1 배지에서 배양된다. 다음으로 배양 배지는 다능성 세포의 복제를 촉진하는 배지, 예컨대 mTeSR®1로 교체된다.
유리하게, 단계 (b)의 캡슐은 각각 1 내지 500개의 분화된 세포, 우선적으로 50 내지 200개를 함유한다.
일 실시형태에서, 단계 (a), (b), (c) 또는 (d) 중 적어도 하나, 우선적으로 모든 단계 (a), (b), (c) 및 (d)는 0 내지 4℃를 포함하는 온도에서 수행된다. 4℃ 또는 그 이하로 온도의 유지는 외부 환경으로부터의 신호의 전달을 포함하여, 세포의 생물학적 프로세스를 휴면기로 만드는 것을 가능하게 한다. 이것은 세포 탈착에 의해 유도될 수 있는, 세포 사멸의 현상을 제한하는 것을 가능하게 한다.
단계 (d) 동안 수득된 미소구획은 바람직한 낭포 형태를 갖는 세포 미소구획을 단리하기 위해 분류될 수 있다. 이러한 분류 단계는 아직 형성되고 있는 중인 미소구획으로부터 이미 바람직한 낭포 형태를 갖는 세포 미소구획을 분리하기 위해서, 연속적으로 수행될 수 있다. 이러한 분류 단계는 리프로그래밍이 아직 진행중이고/이거나 낭포 조직화가 아직 완료되지 않은 다른 미소구획을 파괴하지 않으면서, 단순한 형태학적 분석을 통해서 수행될 수 잇다.
일반적으로, 본 발명의 방법으로 수득된 세포 미소구획은 사용 전에 냉동될 수 있다. 실제로, 낭포 형태는 미소구획 내에서 세포 생존을 촉진하고, 해동 이후에, 생존율은 80%를 초과한다. 유리하게, 냉동은 미소구획을 신속하게 유리로 만들고 세포의 지질막 내에 결정 형성의 위험성을 제한하기 위해서 액체 질소를 사용하여 수행된다. 세포 미소구획은 세포 생존을 촉진하는 냉동 완충액 중에 현탁될 수 있다. 예를 들어, 배아를 냉동시키는데 통용되는 냉동 완충액을 사용하는 것이 가능하다.
그렇게 냉동된 세포 미소구획은 이후에 필요에 따라 해동될 수 있다.
적용
본 발명에서 고려되는 세포 미소구획은 많은 적용 분야에서 사용될 수 있다. 실제로, 그들이 함유하는 세포는 외부 히드로겔 층의 단순 가수분해 및/또는 용해를 통해서 쉽게 회수될 수 있다. 더 나아가서, 대량의 관심 세포주를 수득하기 위해서, 필요에 따라서, 히드로겔 캡슐 내에서 또는 상기 히드로겔 캡슐의 가수분해/용해 이후에 다능성 세포를 분화시키는 것이 가능하다. 유리하게, 세포는 외부 히드로겔 층의 가수분해 이전을 의미하는, 미소구획 내에서, 하나 이상의 관심 세포 유형으로 분화된다.
세포 미소구획, 및 보다 정확하게 그들이 함유하는 세포는 3D 세포 네트워크 및 보다 통상적으로 2D 배양의 형태 모두에서, 연구 및 개발 목적을 위해 사용될 수 있다. 그들은 또한 치료적 목적, 예컨대 세포 요법, 조직 조작 등에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 다능성으로 유도되는 인간 세포로부터 세포 미소구획을 수득하기 위한 프로토콜.
사용된 용액:
용액 1, 2 μM 티아조비빈이 보충된 DMEMF12 배지 베이스.
용액 2, 1 μM 2 μM 티아조비빈이 보충된 마그네슘이 없고 칼슘이 없는 PBS.
용액 3, 무효소 세포 탈착 완충액: 2 μM 티아조비빈이 보충된 RelesR™.
용액 4, 다능성 줄기 세포 배양 배지: MTeSR1™ hES/hIPS 세포 배지 (STEMCELL™).
용액 4+, 2 μM 티아조비빈이 보충된 용액 4.
용액 5, Matrigel™.
용액 6, 2 μM 티아조비빈이 포함된 300 mM 솔비톨.
세포 용액:
90% 컨플루언스의 인간 IPS 세포 (초대 피부 섬유아세포로부터 수득; 정상, 인간, 성체 ATCC® PCS-201-012™ 및 CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (항목 번호 A16517), 실시예 2에 표시된 기술을 사용)의 25 ㎠ 페트리 디쉬를 사용하여 추천된 부피로 맞추었다. 모든 하기 단계는 히드로겔 쉘이 칼슘 배쓰에서 가교될 때까지 4℃에서 수행된다.
단계 1: 세포를 용액 1로 세정한다. 10분 내지 1시간 동안 대기한다.
단계 2: 4 mL의 용액 2로 2회 세정한다.
단계 3: 용액을 조심스럽게 흡입시킨다.
단계 4: 세포를 4 mL의 용액 3과 5-10분 동안 인큐베이션시킨다.
단계 5: 전단 응력을 감소시키기 위해서 와이드-팁 파이펫을 사용하여 2 mL의 용액 4+로 세포를 탈착시킨다.
단계 6: 세포 현탁액을 360 g 에서 5분 동안 원심분리시킨다.
단계 7: 상청액을 흡입시킨다.
단계 8: 0.5 mL의 용액 4+로 재현탁시킨다.
단계 9: 360 g 에서 다시 원심분리시키고 상청액을 흡입시킨다.
단계 10: 세포 펠렛을 70 μL의 용액 5 및 100 μL의 용액 6에 재현탁시킨다 (펠렛의 부피는 30 μL여야 함). 세포 용액이 준비된다.
캡슐화:
캡슐화 장치는 Alessandri 등, 2016 ("A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604)에 기술된 바와 같이 준비한다.
요약하면, 장치의 상이한 부분을 (오토클레이브에 의해서) 멸균시키고; i) 알기네이트 용액 (증류수 중 2 질량%의 PRONOVA®SLG100), ii) 중간 용액 (300 mM 솔비톨), iii) 세포 용액 (이전 단계에서 제조됨)의 3종의 필수 용액을 3개의 시린지 펌프 상에 로딩시키고; 3종의 용액을 그 외부 층이 알기네이트 용액이고 코어가 세포 용액인 액적으로 분쇄되는 제트를 형성하는 미세유체 주입기를 사용하여 동심으로 동시-주입시키며; 이들 액적은 쉘을 형성하도록 알기네이트 용액을 강화시키는 칼슘 배쓰 (100 mM)에서 수집한다.
세포 미소구획의 단분산도를 개선시키기 위해서, 알기네이트는 +2 kV DC 전류로 충전되었다. 직경이 2 ㎝인 덩어리 고리는 미세유체 주입기가 전계를 발생시키도록 둔 채로 제트의 축에 수직인 평면에 팁으로부터 500 ㎛에 위치된다.
이들 캡슐화 조건 하에서, Matrigel® 층이 자발적으로 형성된다는 것을 주의해야 한다.
캡슐화 이후 처리:
단계 1: 캡슐을 40 ㎛ 세포 체를 사용해 수집하고 나서 용액 1로 세정한 후 그들을 20 mL의 용액 4+가 포함된 75 ㎠ 플라스크에 저장한다.
단계 2: 플라스크는 12시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 유지시킨다.
단계 3: 낭포의 형성이 가능하도록 배지를 용액 4로 바꿔준다.
단계 4: 24시간 내지 72시간 이후에, 수십개 세포의 낭포가 캡슐에 형성된다. 세포 미소구획은 5일 내지 10일 이후에 성숙된다.
실시예 2: 인간 섬유아세포로부터 세포 미소구획을 수득하기 위한 프로토콜.
사용된 용액:
용액 1, DMEMF12 배지 베이스.
용액 2, 마그네슘이 없고 첨가된 칼슘이 없는 PBS.
용액 3, 트립신 EDTA 세포 탈착 완충액.
용액 4, 섬유아세포 배양 배지: DMEM 배지 베이스 중 10% 인간 혈청.
용액 4+, 2 μM 티아조비빈이 보충된 용액 4.
용액 5, Matrigel™.
용액 6, 2 μM 티아조비빈이 포함된 300 mM 솔비톨.
세포 용액:
낮은 컨플루언스 밀도의 인간 섬유아세포 (초대 피부 섬유아세포; 정상, 인간, 성체 (ATCC® PCS-201-012®)의 25 ㎠ 페트리 디쉬를 사용하여 추천 부피 (1 내지 2백만개 세포)로 맞추었다. 모든 하기 단계는 쉘이 칼슘 배쓰에서 가교될 때까지 4℃에서 수행된다.
단계 1: 세포를 용액 2로 세정한다.
단계 2: 용액을 조심스럽게 흡입시킨다.
단계 3: 세포를 4 mL의 용액 3과 5-10분 동안 인큐베이션시킨다.
단계 4: 전단 응력을 감소시키기 위해서 와이드-팁 파이펫을 사용하여 2 mL의 용액 4+로 세포를 탈착시킨다.
단계 6: 세포 현탁액을 360 g 에서 5분 동안 원심분리시킨다.
단계 7: 상청액을 흡입시킨다.
단계 8: 0.5 mL의 용액 4+로 재현탁시킨다.
단계 9: 360 g 에서 다시 원심분리시키고 상청액을 흡입시킨다.
단계 10: 세포 펠렛을 90 μL의 용액 5 및 100 μL의 용액 6에 재현탁시킨다 (펠렛 부피는 10 μL여야 함).
단계 11: 6-웰 플레이트에 제공된 "CytoTune®-IPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit" (리프로그래밍 바이러스를 함유)의 내용물의 1/10을 첨가한다. 세포 용액이 준비된다.
캡슐화:
캡슐화는 실시예 1의 프로토콜에 따라서 수행된다.
캡슐화 이후 처리:
단계 1: 캡슐을 40 ㎛ 세포 체를 사용해 수집하고 나서 용액 1로 세정한 후에 그들을 20 mL의 용액 4+가 포함된 75 ㎠ 플라스크에 저장한다.
단계 2: 플라스크를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 유지시킨다.
단계 3: 배지를 매일 바꿔준다. 각각의 캡슐은 캡슐 형성시에 1 내지 10개 섬유아세포를 함유한다. 리프로그래밍 바이러스는 약 0.2%의 변형 효율성을 갖는다. 그러므로, 캡슐의 대부분은 존재시 매우 소수의 리프로그래밍된 세포를 함유한다. 낭포는 15일 내지 40일 이후에 형성되기 시작한다. 섬유아세포는 장방형을 갖고 낭포를 형성하지 않는다. 따라서, 형성된 모든 낭포는 IPS 세포로 형성된다.

Claims (15)

  1. 세포 미소구획으로서,
    세포 미소구획은 중심 내강 및 하기 연속적으로 배열된 동심적인 층: 인간 다능성 세포의 적어도 하나의 층, 세포외 매트릭스 층, 및 외부 히드로겔 층
    을 포함하는 낭포이고,
    내강은 중공이면서, 상기 세포외 매트릭스 상에 또는 내에 축적된 인간 다능성 세포에 의해 둘러싸여 있고,
    인간 다능성 세포는 양극화되고,
    세포 밀도는 미소구획당 1 내지 수 천개 세포이고, 세포 미소구획은 배양 5일 후에 중심 내강을 유지하는 것인, 세포 미소구획.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구획은 밀폐된 것인 세포 미소구획.
  3. 제 1 항에 있어서, 외부 층은 알기네이트를 포함하는 것인 세포 미소구획.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구획은 구형 또는 장방형 형상을 갖는 것인 세포 미소구획.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구획은 10 ㎛ 내지 1 ㎜ 의 직경 또는 최소 치수를 갖는 것인 세포 미소구획.
  6. 세포 미소구획의 제조 방법으로서, 세포 미소구획은 낭포이고, 방법은 하기를 포함하는 세포 미소구획의 제조 방법:
    (a) 인간 다능성 줄기 세포를 RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 단계 (a)로부터의 다능성 줄기 세포를 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 수득된 캡슐을 RHO/ROCK 경로 억제제를 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계;
    (e) RHO/ROCK 경로 억제제를 제거하기 위해서 단계 (d)로부터의 캡슐을 세정하는 단계;
    (f) 중심 내강 및 하기 연속적으로 배열된 동심적인 층: 인간 다능성 세포의 적어도 하나의 층, 세포외 매트릭스 층, 및 외부 히드로겔 층을 포함하는 세포 미소구획을 형성하기 위해, 단계 (e)로부터의 캡슐을 5일 내지 20일 동안 배양시키는 단계로서, 내강은 중공이면서, 상기 세포외 매트릭스 상에 또는 내에 축적된 인간 다능성 세포에 의해 형성된 것이고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계로서, 세포 미소구획은 배양 5일 후에 중심 내강을 유지하는 것인 단계.
  7. 제 6 항에 있어서, 단계 (b) 이전에 단계 (a)로부터의 다능성 줄기 세포를 해리시키는 중간 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 효소-무함유 시약에 의해서 해리되는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  9. 하기를 포함하는, 제 1 항에 따른 세포 미소구획의 제조 방법:
    (a) 인간 분화 세포를 세포외 매트릭스 및 세포 리프로그래밍제와 혼합시키는 단계;
    (b) 단계 (a)로부터의 혼합물을 히드로겔 층에 캡슐화시키는 단계;
    (c) 중심 내강 및 하기 연속적으로 배열된 동심적인 층: 인간 다능성 세포의 적어도 하나의 층, 세포외 매트릭스 층, 및 외부 히드로겔 층을 포함하는 세포 미소구획을 형성하기 위해, 단계 (b)로부터의 캡슐을 10일 내지 40일 동안 배양시키는 단계로서, 여기서 내강은 중공이면서, 상기 세포외 매트릭스 상에 또는 내에 축적된 인간 다능성 세포에 의해 형성된 것이고, 임의로는 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계로서, 여기서 세포 미소구획은 배양 5일 후에 중심 내강을 유지하는 것인 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 단계 (b)로부터의 각각의 캡슐은 1 내지 500개의 분화된 세포를 함유하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 세포 미소구획을 냉동시키는 후속 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 세포 미소구획을 냉동시키는 후속 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 세포 미소구획을 냉동시키는 후속 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 세포 미소구획을 냉동시키는 후속 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은 세포 미소구획을 냉동시키는 후속 단계를 포함하는 것인 세포 미소구획의 제조 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12146153B2 (en) 2016-11-23 2024-11-19 Universite de Bordeaux Cellular microcompartment and preparation processes

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020186206A1 (en) * 2019-03-13 2020-09-17 Membrane Protective Technologies, Inc. Methods and systems for protective supplementation during temperature depression
FR3098223A1 (fr) 2019-07-05 2021-01-08 Universite de Bordeaux Procede de production in vitro de neurones de mammiferes
FR3099882A1 (fr) * 2019-08-12 2021-02-19 Treefrog Therapeutics Unité tridimensionnelle creuse de tissu rétinien et utilisation dans le traitement des rétinopathies
FR3108623A1 (fr) * 2020-03-27 2021-10-01 Treefrog Therapeutics Procédé de caractérisation d’un micro-tissu biologique par imagerie
FR3114321A1 (fr) 2020-09-21 2022-03-25 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules humaines en cours de différenciation cardiaque, tissus obtenus à partir de ces microcompartiments et utilisations
FR3114322A1 (fr) 2020-09-21 2022-03-25 Treefrog Therapeutics Tissu cardiaque particulier et utilisation dans le traitement de pathologies cardiaque
FR3124193B3 (fr) * 2021-06-16 2023-09-22 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes
WO2022263601A1 (fr) * 2021-06-16 2022-12-22 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes
WO2023235884A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods
FR3138661A1 (fr) 2022-08-08 2024-02-09 Treefrog Therapeutics Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
WO2024033284A1 (fr) 2022-08-08 2024-02-15 Treefrog Therapeutics Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
FR3141945A1 (fr) 2022-11-15 2024-05-17 Treefrog Therapeutics Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
WO2024225435A1 (ja) * 2023-04-28 2024-10-31 株式会社セルファイバ 細胞カプセル、細胞集団、細胞産生物、細胞製剤及び細胞集団の製造方法
FR3151044A1 (fr) * 2023-07-11 2025-01-17 Treefrog Therapeutics Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions
FR3151338A1 (fr) 2023-07-18 2025-01-24 Treefrog Therapeutics Système d’encapsulation de cellules dans des compartiments de culture en trois dimensions
FR3151340A1 (fr) 2023-07-21 2025-01-24 Treefrog Therapeutics Différenciation neurale à partir de cellules pluripotentes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178427A1 (ja) * 2014-05-20 2015-11-26 国立大学法人 東京大学 中空マイクロファイバ

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102405280B (zh) 2009-03-20 2015-03-04 中胚层公司 重新设定的多能干细胞的制备
JP2012520672A (ja) * 2009-03-20 2012-09-10 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ マイクロキャリアー上の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）および多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞の培養
JP5365863B2 (ja) * 2009-08-21 2013-12-11 株式会社リコー トナーの製造装置及びトナーの製造方法
EP2489779B1 (en) * 2009-10-14 2019-01-09 The University of Tokyo Coated micro gel fibers
FR2986165B1 (fr) * 2012-01-31 2015-07-24 Capsum Procede de preparation de capsules rigidifiees
US20140127290A1 (en) * 2012-11-08 2014-05-08 Ohio State Innovation Foundation Microcapsules Encapsulating Living Cells
US10544036B2 (en) * 2013-04-30 2020-01-28 The Governing Council Of The University Of Toronto Microfluidic devices and methods for the extrusion of tubular structures
US9587221B2 (en) * 2013-11-11 2017-03-07 Auburn University Encapsulation and cardiac differentiation of hiPSCs in 3D PEG-fibrinogen hydrogels
CN107427537A (zh) * 2015-03-03 2017-12-01 哈佛学院院长及董事 产生功能性人体组织的方法
WO2016182022A1 (ja) * 2015-05-14 2016-11-17 公立大学法人横浜市立大学 高分子を細胞と共に凝集させる技術
FR3058892B1 (fr) 2016-11-23 2021-04-09 Univ Bordeaux Unite de tissu neural et utilisation d'une telle unite pour l'implantation dans le systeme nerveux d'un mammifere
FR3059009B1 (fr) 2016-11-23 2018-12-07 Universite de Bordeaux Microcompartiment cellulaire et procedes de preparation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015178427A1 (ja) * 2014-05-20 2015-11-26 国立大学法人 東京大学 中空マイクロファイバ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alessandri, K. et al., Lab on a Chip (2016) 16:1593-1604 (2016.03.21. 공개) *
Ashida, T. et al., Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology (2016) 44(6):1406-1409 (2015.07.06. 공개) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12146153B2 (en) 2016-11-23 2024-11-19 Universite de Bordeaux Cellular microcompartment and preparation processes

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