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KR20230163470A - 통증 ＆ 염증성 장애의 치료 - Google Patents

통증 ＆ 염증성 장애의 치료 Download PDF

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KR20230163470A
KR20230163470A KR1020237036646A KR20237036646A KR20230163470A KR 20230163470 A KR20230163470 A KR 20230163470A KR 1020237036646 A KR1020237036646 A KR 1020237036646A KR 20237036646 A KR20237036646 A KR 20237036646A KR 20230163470 A KR20230163470 A KR 20230163470A
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KR
South Korea
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polypeptide
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chain
clostridial neurotoxin
pain
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KR1020237036646A
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미카일 칼리니체프
신디 페리에
크리스틴 파브르
실비 코네트
요하네스 크루프
마크 엘리엇
재클린 캐롤라인 마이그넬
호단 아흐메드 이브라힘
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입센 바이오팜 리미티드
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Abstract

본 발명은 통증 또는 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 상응하는 치료 방법 및 용도가 또한 제공된다.

Description

통증 ＆ 염증성 장애의 치료
본 발명은 요법에 사용하기 위한 폴리펩티드, 예를 들어 통증 또는 염증성 장애의 치료를 위한 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
클로스트리디아(Clostridia) 속의 박테리아는 독소가 전달되는 뉴런 및 다른 세포를 중독시킬 수 있는 매우 강력하고 특이적인 단백질 독소를 생산한다. 이러한 클로스트리디움 독소의 예는 씨. 테타니(C. tetani) (TeNT) 및 씨. 보툴리눔(C. botulinum) (BoNT) 혈청형 A-G 및 X에 의해 생산된 신경독소 (WO 2018/009903 A2 참조), 뿐만 아니라 씨. 바라티이(C. baratii) 및 씨. 부티리쿰(C. butyricum)에 의해 생산된 신경독소를 포함한다. 테타누스 및 보툴리눔 독소 둘 다는 이환된 뉴런의 기능, 구체적으로 신경전달물질의 방출을 억제함으로써 작용한다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부에서 작용하고 말초 신경계에서 콜린성 전달을 억제하는 반면에, 테타누스 독소는 중추 신경계에서 작용한다.
사실상, 클로스트리디움 신경독소는 단일-쇄 폴리펩티드로서 합성되며, 이는 단백질분해적 절단 사건에 의해 번역후 변형되어 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄를 형성한다. 절단은 종종 쇄간 디술피드 결합을 제공하는 시스테인 잔기 사이에 위치하는 활성화 부위로 지칭되는 특이적 절단 부위에서 일어난다. 독소의 활성 형태는 이러한 2-쇄 형태이다. 2개의 쇄는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄) 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)로 불린다. H-쇄는 N-말단 전위 성분 (HN 도메인) 및 C-말단 표적화 성분 (HC 도메인)을 포함한다. 절단 부위는 L-쇄 및 전위 도메인 성분 사이에 위치된다. HC 도메인의 그의 표적 뉴런에의 결합 및 결합된 독소의 엔도솜을 통한 세포 내로의 내재화 후, HN 도메인은 엔도솜 막을 거쳐 및 시토졸 내로 L-쇄를 전위시키고, L-쇄는 프로테아제 기능 (또한 비-세포독성 프로테아제로도 알려짐)을 제공한다.
비-세포독성 프로테아제는 SNARE 단백질 (예를 들어 SNAP-25, VAMP 또는 신탁신)로 공지된 세포내 수송 단백질을 단백질분해적으로 절단함으로써 작용한다. 두문자어 SNARE는 용어 가용성 NSF 부착 수용체(Soluble NSF Attachment Receptor)로부터 유래되며, 여기서 NSF는 N-에틸말레이미드-감수성 인자(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)를 의미한다. SNARE 단백질은 세포내 소포 융합에 필수적이고, 따라서 세포로부터의 소포 수송을 통한 분자의 분비에 필수적이다. 프로테아제 기능은 아연-의존성 엔도펩티다제 활성이고 SNARE 단백질에 대한 높은 기질 특이성을 나타낸다. 따라서, 일단 목적되는 표적 세포로 전달되면, 비-세포독성 프로테아제는 표적 세포로부터의 세포 분비를 억제할 수 있다. 클로스트리디움 신경독소의 L-쇄 프로테아제는 SNARE 단백질을 절단하는 비-세포독성 프로테아제이다.
SNARE 단백질의 편재적 성질의 관점에서, 클로스트리디움 신경독소 예컨대 보툴리눔 독소는 광범위한 요법에 성공적으로 이용되어 왔다.
클로스트리디움 신경독소는 알려진 가장 강력한 독소의 일부이다. 예로서, 보툴리눔 신경독소는 혈청형에 따라 0.5 내지 5 ng/kg 범위의 마우스에 대한 중앙 치사 용량 (LD50) 값을 갖는다. 따라서, 상기 독소의 사용은 위험이 없지 않다. 독소가 투여 부위로부터 떨어져서 주변 조직 또는 전신 순환계로 확산되는 것은 극단적인 경우에 생명을 위협할 수 있는 클로스트리디움 신경독소 치료의 바람직하지 않은 부작용의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 이는 클로스트리디움 신경독소를 고용량, 농도, 및/또는 주사 부피로 사용하는 경우에 특히 우려될 수 있다. 상업적 BoNT/A 치료제에 대해 보고된 유해 효과는 무력증, 전신 근육 약화, 복시, 안검하수증, 연하곤란, 발성장애, 구음장애, 요실금, 및 호흡 곤란을 포함한다. 연하 및 호흡 곤란은 생명을 위협할 수 있으며, 독소 효과의 확산과 관련된 사망이 보고되었다.
본 발명은 상기 언급된 문제들 중 하나 이상을 극복한다.
발명의 개요
본 발명자들은 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소가 통증을 치료하는 데 효과적이라는 것을 발견하였다. SNARE 단백질 절단을 초래하는 촉매 활성이 클로스트리디움 신경독소 요법의 기초가 되는 본질적인 작용 메카니즘인 것으로 여겨졌기 때문에, 이러한 발견은 특히 놀라운 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 요법과 연관된 독성 부작용을 피하고, 보다 안전한 (실질적으로 비-독성) 치료제를 구성한다. 유리하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 치료제와 비교하여 더 많은 양으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 감소된 독성은 제품 수명 내내 제조 및 취급의 용이성을 허용하고, 의사가 대상체에서 독성을 회피하는 것을 목표로 하는 복잡한 (예를 들어 개인맞춤형) 투여 요법 계산을 수행할 필요를 제거한다.
동등하게 놀랍게도, 본 발명자들은 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소가 염증성 장애를 치료하는 데 효과적이라는 것을 발견하였다.
상세한 설명
한 측면에서, 본 발명은 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드 (예를 들어 진통 폴리펩티드)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
한 측면에서, 본 발명은 방광 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드 (예를 들어 진통 폴리펩티드)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
한 측면에서, 본 발명은 방광 통증 증후군을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드 (예를 들어 진통 폴리펩티드)를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 대상체에게 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)를 투여하는 것을 포함하는, 통증을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 대상체에게 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)를 투여하는 것을 포함하는, 방광 통증을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 대상체에게 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)를 투여하는 것을 포함하는, 방광 통증 증후군을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 통증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)의 용도를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 방광 통증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)의 용도를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 방광 통증 증후군을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드 (예를 들어, 진통 폴리펩티드)의 용도를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
방광 통증은 바람직하게는 간질성 방광염에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된다. 방광 통증 증후군은 바람직하게는 간질성 방광염이다.
본 발명의 폴리펩티드는 방광의 감각 뉴런의 활성을 (예를 들어, 치료 전의 동일한 대상체에서의 감각 뉴런의 활성, 예컨대 주어진 기간 동안의 평균 활성과 비교할 때) 감소 또는 억제함으로써 방광 통증을 치료할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 방광의 감각 뉴런의 팽창-유발 활성 및/또는 방광의 감각 뉴런의 화학물질-유발 활성을 감소 또는 억제할 수 있다. 방광의 감각 뉴런은 바람직하게는 구심성 신경이다. 구심성 신경은 1개 이상의 감각 섬유 (예를 들어 신경 섬유의 다발)를 포함할 수 있다. 용어 "섬유"는 바람직하게는 뉴런의 축삭을 지칭한다. 이러한 구심성 신경은 방광 벽에서의 화학적 및/또는 기계적 자극 (예를 들어 방광 충만과 관련됨)을 감지하는 구심성 신경일 수 있다. 바람직하게는, 구심성 신경은 골반 및/또는 하복 신경의 1개 이상의 섬유를 포함한다. 예를 들어, 구심성 신경은 골반 신경 및/또는 하복 신경일 수 있다.
통증 (예를 들어 방광 통증)을 치료하는 경우에, 폴리펩티드는 적어도 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 통증 (예를 들어 방광 통증)을 치료하는 경우에, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인), 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함한다. 유리하게는, 이러한 폴리펩티드는 상기 성분 중 하나가 부재한 폴리펩티드와 비교할 때 통증을 치료하는 데 보다 효과적이었다.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 치료되는 통증 (예를 들어 방광 통증)은 통각과민, 이질통 및/또는 내장통 중 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 통각과민, 이질통 및 내장통 모두가 치료될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 진통 특성을 갖는다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 진통 폴리펩티드이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 통증을 치료하기 위해 뉴런 성장도 뉴런 복구도 촉진하지 않는다. 다시 말해서, 바람직하게는, 폴리펩티드는 하기 수단: 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 통증을 치료하지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 염증성 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
본 발명의 폴리펩티드는 항염증 특성을 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 항염증 폴리펩티드일 수 있다.
폴리펩티드가 본원에 기재된 바와 같은 염증성 장애를 치료하는 데 사용되는 경우에, 폴리펩티드는 보툴리눔 신경독소 혈청형 X (BoNT/X) L-쇄, BoNT/X HN 도메인, 및/또는 BoNT/X HC 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)일 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) (바람직하게는 BoNT/B HC 도메인)을 포함한다. 상응하는 치료 방법 및 용도가 또한 제공된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 염증성 상태를 치료하기 위해 뉴런 성장도 뉴런 복구도 촉진하지 않는다. 다시 말해서, 바람직하게는, 폴리펩티드는 하기 수단: 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 염증성 상태를 치료하지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 하부 요로 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하부 요로 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
관련 측면에서, 본 발명은 하부 요로 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도를 제공하며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다.
하부 요로 장애는 바람직하게는 방광 장애이다.
본 발명의 폴리펩티드는 방광의 감각 뉴런의 활성을 (예를 들어, 치료 전의 동일한 대상체에서의 감각 뉴런의 활성과 비교할 때) 감소 또는 억제함으로써 하부 요로 장애 (예를 들어, 방광 장애)를 치료할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 방광의 감각 뉴런의 팽창-유발 활성 및/또는 방광의 감각 뉴런의 화학물질-유발 활성을 감소 또는 억제할 수 있다. 방광의 감각 뉴런은 바람직하게는 구심성 신경이다. 구심성 신경은 1개 이상의 감각 섬유 (예를 들어 신경 섬유의 다발)를 포함할 수 있다. 이러한 구심성 신경은 방광 벽에서의 화학적 및/또는 기계적 자극 (예를 들어 방광 충만과 관련됨)을 감지하는 구심성 신경일 수 있다. 바람직하게는, 구심성 신경은 골반 및/또는 하복 신경의 1개 이상의 섬유를 포함한다. 예를 들어, 구심성 신경은 골반 신경 및/또는 하복 신경일 수 있다.
방광의 감각 뉴런 (예를 들어 구심성 신경)의 활성을 억제함으로써, 폴리펩티드는 하부 요로 장애와 연관된 절박의 감각 증상을 감소시키거나 억제할 수 있다. 절박의 감각 증상은 전형적으로 방광 통증 증후군 (예를 들어 간질성 방광염), 과민성 방광 및/또는 배뇨근 과다활동과 연관된다.
따라서, 하부 요로 장애는 감각 뉴런-연관 장애, 예를 들어 구심성 신경-연관 장애, 특히 구심성 신경-연관 방광 장애일 수 있다. 구심성 신경-연관 장애는 구심성 신경이 원인이 되든 또는 다르게든 역할을 하는 것인 장애일 수 있다. 일부 실시양태에서, 구심성 신경-연관 장애는 구심성 신경 과다활성 및/또는 구심성 충동에 대한 변경된 중심 역치에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 장애이다. 후자는 중심 억제 경로에 대한 손상 또는 구심성 신경의 감작을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 신경영양 인자 예컨대 신경 성장 인자 (NGF) 또는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 수준이 증가되어 감각 뉴런에 영향을 미칠 수 있다. 연관된 증상은 배뇨 반사의 활성화를 포함할 수 있다. PAG (수도관주위 회색질(periacqueductal gray), 배뇨의 제어에 관여하는 중심 구조 중 하나)에 연결된 영역인 도역에서의 신호전달은 비간섭성 발화 역치로 변경되어, 구심성 충동 및 절박감에 대한 변경된 중심 역치를 초래할 수 있다.
구심성 신경-연관 장애의 예는 방광 통증 증후군 (바람직하게는 간질성 방광염), 과민성 방광 및 배뇨근 과다활동을 포함할 수 있다.
방광 통증 증후군은 미국에서 약 6-14M의 환자 (즉, 성인 미국 인구의 5-11%)에게 영향을 미치는 만성 방광 건강 문제이다. 국제 요실금 학회 (ICS)는 방광 통증 증후군을 만성 (>6개월) 골반 통증, 방광과 관련된 것으로 지각되는 압박 또는 불편함을 특징으로 하고, 적어도 하나의 다른 비뇨기 증상, 예컨대 지속적인 배뇨 충동 또는 빈도를 동반하는 상태로서 정의한다. 빈도는 정상보다 더 자주 소변을 보려는 욕구이다. 평균적인 사람은 전형적으로 하루에 7회 이하로 배뇨하고, 야간에 화장실에 가기 위해 1회 초과로 일어날 필요가 없다. 방광 통증 증후군 환자는 빈번하게 주간 및 야간에 배뇨해야 할 수 있고, 빈도가 보다 심각해짐에 따라 이는 절박을 초래한다. 일부 환자의 경우, 이러한 배뇨 충동은 배뇨 직후에도 결코 사라지지 않는다. 간질성 방광염은 보다 중증 또는 진행성 형태의 방광 통증 증후군으로서 정의될 수 있고, "전형적인 세포경검사 및 조직학적 특색"의 존재를 추가로 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 비-간질성 방광염 방광 통증 증후군 환자와 비교할 때, 간질성 방광염 환자는 탈락된 상피, 궤양화, 농뇨 및/또는 점막하 염증의 보다 높은 발생률 및 정도를 가질 수 있다. 간질성 방광염은 만성 점막하 염증성 질환으로서 기재될 수 있다.
배경으로서, 소변은 신장의 네프론에 의해 형성되고, 요도를 통해 배출되기 전에 저장을 위해 방광으로 수송된다. 이러한 주기적 채움 및 비움 과정은 배뇨로서 공지되어 있다. 방광이 채워짐에 따라, 이는 구심성 신호 (구심성 신경에 의해 전달됨)를 시뮬레이션하면서 신장된다. 반대로, 원심성 신호는 각각 방광 근조직의 수축 및 요도 괄약근의 이완을 유도한다. 기계수용체 이외에도, 다양한 심리학적 인자 (예를 들어, 스트레스, 허용되는 환경에 대한 감각, 및 정서 상태)가 배뇨의 시기 및 환경에서 결정적인 역할을 한다.
과민성 방광은 ICS에 의해, 요로 감염 또는 다른 검출가능한 질환의 부재 하에, 요실금을 동반하거나 (OAB-습윤) 동반하지 않는 (OAB-건조), 통상적으로 증가된 주간 빈도 및/또는 야간뇨를 동반하는 요절박으로 기재된다.
배뇨근 과다활동은 특발성 배뇨근 과다활동 또는 신경성 배뇨근 과다활동일 수 있다. 상기 과다활동은 (1) 요실금을 초래하거나 초래하지 않을 수 있는 상성; 또는 (2) 종종 완전한 방광 비움을 초래하는 단일 불수의 배뇨근 수축인 말기일 수 있다.
신경성 배뇨근 과다활동은 임상적으로 관련된 신경계 질환의 환경에서, 최대 방광용적(cystometric capacity) 근처에서 또는 최대 방광용적에서 발생하는 불수의 배뇨근 수축과 연관될 수 있다. 이들 수축은 일반적으로 억제될 수 없어, 요실금 또는 심지어 반사 방광 비움 (반사 배뇨)을 유발한다. 상기 장애는 다발성 경화증 (MS) 및 척수 손상 (SCI)과 같은 상태를 갖는 환자에서 빈번하게 관찰된다. 따라서, 본 발명에 따라 치료되는 대상체는 SCI 및/또는 MS를 가질 수 있다.
하부 요로 장애를 치료하는 경우에, 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 방광 벽으로의 주사, 예를 들어 배뇨관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
하부 요로 장애 (예를 들어 방광 장애)를 치료하는 경우에, 폴리펩티드는 적어도 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 하부 요로 장애 (예를 들어 방광 장애)를 치료하는 경우에, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인), 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함한다. 유리하게는, 이러한 폴리펩티드는 상기 성분 중 하나가 부재한 폴리펩티드와 비교할 때 하부 요로 장애를 치료하는 데 보다 효과적이었다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 하부 요로 장애를 치료하기 위해 뉴런 성장도 뉴런 복구도 촉진하지 않는다. 다시 말해서, 바람직하게는, 폴리펩티드는 하기 수단: 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 하부 요로 장애를 치료하지 않는다.
용어 "뉴런 성장 및/또는 뉴런 복구를 촉진한다"는 뉴런 성장 및/또는 뉴런 복구 속도의 증가를 포괄한다. 용어 "뉴런 성장 및/또는 뉴런 복구"는 손상된 뉴런 회로를 재구축함으로써, 뉴런의 네트워크 또는 집단에서 활성 및/또는 뉴런 통신을 회복하는 것을 포괄한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "뉴런 복구"는 특정 뉴런의 복구뿐만 아니라 뉴런 회로의 복구를 포괄한다. 상기 용어는 또한 뉴런 가소성을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "뉴런 가소성"은 축삭 발아, 수지상 발아, 신경발생 (예를 들어 새로운 뉴런의 생산), 성숙, 분화 및/또는 시냅스 가소성 (예를 들어 시냅스 강도, 활성, 해부학 및/또는 연결성에 대한 변화를 포함함)을 포괄한다. 용어 "뉴런 성장 및/또는 뉴런 복구를 촉진한다"는 또한 기능적 시냅스의 확립을 (예를 들어 손상 부위에서 또는 그 근처에서) 촉진하는 것을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "뉴런 성장"은 축삭 및/또는 수상돌기의 성장을 포함한 뉴런의 임의의 부분의 성장을 포괄한다. 상기 용어는 대상체에서의 신경돌기 길이, 신경돌기 수 (예를 들어, 세포당 신경돌기의 수)의 증가, 및/또는 뉴런의 세포체 또는 세포막으로부터의 돌출부, 예를 들어 뉴런의 축삭 성장 및/또는 축삭 발아, 예를 들어 뉴런의 길이 및/또는 수의 증가를 포괄한다. 상기 축삭 성장은 뉴런 사이의 연결 및/또는 화학적 소통을 촉진할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 통증 또는 염증성 장애를 치료하기 위한 신경면역 반응을 촉진하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 하부 요로 장애를 치료하기 위한 신경면역 반응을 촉진하지 않는다. 이와 관련하여 신경면역 반응은 소교세포 반응을 포괄한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 통증 또는 염증성 상태를 치료하기 위해 소교세포 반응을 촉진하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하부 요로 장애를 치료하기 위해 소교세포 반응을 촉진하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 통증은 뇌 장애와 연관되거나 또는 그에 의해 유발된 통증이 아니다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 염증성 장애는 염증성 뇌 장애가 아니다. 이와 관련하여 사용된 용어 "뇌 장애"는 "뇌 질환"과 상호교환가능하다. 이와 관련하여 사용된 "뇌 장애"는 뇌 내부 또는 외부로부터 기원하는 장애를 포괄하고, 뇌 조직 손상을 유발하는 신체 손상과 연관된 장애를 포함한다. 이와 관련하여 포괄되는 뇌 장애의 예는 외상성 뇌 손상, 암 (예를 들어 뇌 종양), 감염성 질환 (예를 들어 뇌염, 수막염, 뇌 농양, 및 뇌염), 졸중, 신경변성 장애 (예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨병 관련 장애, 운동 뉴런 질환 (예를 들어 근위축성 측삭 경화증), 프리온 질환, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조, 운동실조, 할러보르덴-스파츠병, 및 전두측두엽 변성), 뇌 동맥류, 다발성 경화증, 무산소 손상, 독성 손상 및 대사 손상 중 어느 하나 (또는 그 초과)를 포함한다. 뇌 장애는 외상성 뇌 손상, 암, 감염성 질환 (예를 들어 뇌염, 수막염, 뇌 농양, 및 뇌염), 졸중, 신경변성 장애 (예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨병 관련 장애, 운동 뉴런 질환 (예를 들어 근위축성 측삭 경화증), 프리온 질환, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조, 운동실조, 할러보르덴-스파츠병, 및 전두측두엽 변성), 뇌 동맥류, 다발성 경화증, 무산소 손상, 독성 손상 및/또는 대사 손상에 의해 유발될 수 있다.
활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 비-세포독성 프로테아제 활성을 갖는다. 구체적으로, 활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 엔도펩티다제 활성을 가지며, 표적 세포에서 세포외유출(exocytic) 융합 장치의 단백질을 절단할 수 있다. 세포외유출 융합 장치의 단백질은 바람직하게는 SNARE 단백질, 예컨대 SNAP25, 시냅토브레빈/VAMP, 또는 신탁신이다.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄와 관련하여 본원에 사용된 용어 "촉매 불활성"은 상기 L-쇄가 비-세포독성 프로테아제 활성을 실질적으로 나타내지 않음을 의미하고, 바람직하게는 클로스트리디움 신경독소 L-쇄와 관련하여 본원에 사용된 용어 "촉매 불활성"은 상기 L-쇄가 비-세포독성 프로테아제 활성을 나타내지 않음을 의미한다. 한 실시양태에서, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 표적 세포에서 세포외유출 융합 장치의 단백질을 절단하지 않는 것이다. 용어 "실질적으로 비-세포독성 프로테아제 활성이 없는"은 클로스트리디움 신경독소 L-쇄가 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 비-세포독성 프로테아제 활성의 5% 미만, 예를 들어 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 비-세포독성 프로테아제 활성의 2%, 1% 미만 또는 바람직하게는 0.1% 미만을 갖는 것을 의미한다. 비-세포독성 프로테아제 활성은 시험 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 SNARE 단백질과 함께 인큐베이션하고, 동일한 조건 하에 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄에 의해 절단된 SNARE 단백질의 양과 비교할 때 시험 클로스트리디움 신경독소 L-쇄에 의해 절단된 SNARE 단백질의 양을 비교함으로써 시험관내에서 결정될 수 있다. 상용 기술, 예컨대 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 절단된 SNARE 단백질의 양을 정량화할 수 있다. 적합한 시험관내 검정은 본원에 참조로 포함된 WO 2019/145577 A1에 기재되어 있다.
세포-기반 및 생체내 검정은 또한 L-쇄 및 기능적 세포 결합 및 전위 도메인을 포함하는 클로스트리디움 신경독소가 비-세포독성 프로테아제 활성을 갖는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 발가락 외전 점수 (DAS) 검정, 후근 신경절 (DRG) 검정, 척수 뉴런 (SCN) 검정, 및 마우스 횡격 신경 편측횡경막 (PNHD) 검정과 같은 검정은 관련 기술분야에서 상용적이다. 비-세포독성 프로테아제 활성을 결정하기 위한 적합한 검정은 문헌 [Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001 또는 Donald et al. (2018), Pharmacol Res Perspect, e00446, 1-14]에 기재된 것일 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
촉매 불활성 L-쇄는 상기 촉매 활성을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서, 촉매 활성 L-쇄 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같음)는 L-쇄의 촉매 활성을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 도입하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 촉매 불활성 L-쇄는 활성 부위 잔기의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 치환 또는 결실일 수 있지만, 치환, 특히 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 글루탐산은 글루타민으로 치환될 수 있고/거나, 히스티딘은 티로신으로 치환될 수 있고/거나, 아르기닌은 글루타민으로 치환될 수 있고/거나, 티로신은 페닐알라닌으로 치환될 수 있다. 대안적으로, 임의의 잔기는 알라닌으로 치환될 수 있다.
촉매 불활성 BoNT/A L-쇄는 H223, E224, H227, E262, R363, 및/또는 Y366, 바람직하게는 적어도 E224 및 H227에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/A L-쇄는 E224에서의 글루타민으로의 치환 (E224Q) 및 H227에서의 티로신으로의 치환 (H227Y)을 포함할 수 있다. 위치 넘버링은 서열식별번호(SEQ ID NO): 60의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 60과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 60의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 60이 메티오닌을 포함하는 경우, 위치 넘버링은 상기 정의된 바와 같을 것이다 (예를 들어, His223은 서열식별번호: 60의 His223일 것임). 대안적으로, 메티오닌이 서열식별번호: 60에 부재하는 경우, 아미노산 잔기 넘버링은 -1만큼 변형되어야 한다 (예를 들어, His223은 서열식별번호: 60의 His222일 것임). 유사한 고려사항이 본원에 기재된 다른 폴리펩티드 서열의 위치 1에서의 메티오닌이 존재/부재하는 경우에 적용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 상용적인 기술을 사용하여 정확한 아미노산 잔기 넘버링을 용이하게 결정할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/B L-쇄는 E231 및/또는 H234, 바람직하게는 E231 및 H234에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/B L-쇄는 E231에서의 글루타민으로의 치환 (E231Q) 및 H234에서의 티로신으로의 치환 (H234Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 52의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 52와 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 52의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/C L-쇄는 H229, E230 및/또는 H233, 바람직하게는 H229, E230 및 H233에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/C L-쇄는 H229에서의 글리신으로의 치환 (H229G), E230에서의 트레오닌으로의 치환 (E230T), 및 H233에서의 아스파라긴으로의 치환 (H233N)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 53의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 53과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 53의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/D L-쇄는 H229, E230, H233 및/또는 H236, 바람직하게는 적어도 E230 및 H236에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/D L-쇄는 적어도 E230에서의 글루타민으로의 치환 (E230Q) 및 H236에서의 티로신으로의 치환 (H236Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 54의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 54와 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 54의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/E L-쇄는 E213 및/또는 H216, 바람직하게는 E213 및 H216에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/E L-쇄는 E213에서의 글루타민으로의 치환 (E213Q) 및 H216에서의 티로신으로의 치환 (H216Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 55의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 55와 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 55의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/F L-쇄는 E228 및/또는 H231, 바람직하게는 E228 및 H231에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/F L-쇄는 E228에서의 글루타민으로의 치환 (E228Q) 및 H231에서의 티로신으로의 치환 (H231Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 56의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 56과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 56의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/G L-쇄는 E231 및/또는 H234, 바람직하게는 E231 및 H234에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/G L-쇄는 E231에서의 글루타민으로의 치환 (E231Q) 및 H234에서의 티로신으로의 치환 (H234Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 57의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 57과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 57의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 BoNT/X L-쇄는 E228 및/또는 H231, 바람직하게는 E228 및 H231에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄는 E228에서의 글루타민으로의 치환 (E228Q) 및 H231에서의 티로신으로의 치환 (H231Y)을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 59의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 59와 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 59의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
촉매 불활성 TeNT L-쇄는 E234, R372 및/또는 Y375, 바람직하게는 적어도 R372 및 Y375 (예를 들어 E234, R372 및 Y375)에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 촉매 불활성 TeNT L-쇄는 R372에서 글루타민 또는 알라닌 (R372Q 또는 R372A), 보다 바람직하게는 알라닌으로의 치환, 및 Y375에서의 페닐알라닌 (Y375F)으로의 치환을 포함한다. 위치 넘버링은 서열식별번호: 58의 아미노산 위치에 상응하고, 폴리펩티드를 서열식별번호: 58과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열식별번호: 58의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 전장 클로스트리디움 신경독소 (단 L-쇄는 촉매 불활성임) 또는 비-세포독성 프로테아제 활성을 갖지 않는 클로스트리디움 신경독소의 단편 (예를 들어, HN 도메인 및/또는 HC 도메인)을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 비-세포독성 프로테아제 활성을 갖지 않는다. 그러나, L-쇄가 촉매 활성을 갖는 본 발명의 대안적 폴리펩티드 (그러나 상기 폴리펩티드에 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있고, 따라서 독성이 거의 없는/없는 것 [예를 들어 비-세포독성 활성이 거의 없는/없는 것]과 연관됨)에 관한 것인, "촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄를 포함하고 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여된 폴리펩티드"라는 표제의 본원의 섹션을 참조한다.
용어 "클로스트리디움 신경독소"는 씨. 보툴리눔 (보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F, G, 및 X), 씨. 테타니 (파상풍 신경독소), 씨. 부티리쿰 (보툴리눔 신경독소 혈청형 E), 및 씨. 바라티이 (보툴리눔 신경독소 혈청형 F)에 의해 생산된 독소를 포괄한다. 참조 BoNT/A 서열은 서열식별번호: 51로 제시된다. 참조 BoNT/B 서열은 서열식별번호: 52로 제시된다. 참조 BoNT/C 서열은 서열식별번호: 53으로 제시된다. 참조 BoNT/D 서열은 서열식별번호: 54로 제시된다. 참조 BoNT/E 서열은 서열식별번호: 55로 제시된다. 참조 BoNT/F 서열은 서열식별번호: 56으로 제시된다. 참조 BoNT/G 서열은 서열식별번호: 57로 제시된다. 참조 TeNT 서열은 서열식별번호: 58로 제시된다. 참조 BoNT/X 서열은 서열식별번호: 59로 제시된다. 용어 "클로스트리디움 신경독소"는 또한 비-클로스트리디움 미생물에 의해 발현된, 새로 발견된 보툴리눔 신경독소 단백질 패밀리 구성원, 예컨대, BoNT/X와 가장 가까운 서열 동일성을 갖는 엔테로코쿠스(Enterococcus) 코딩된 독소, W89-W90에서 VAMP2를 절단하는, BoNT/Wo로 불리는 웨이셀라 오리자에(Weissella oryzae) 코딩된 독소 (NCBI 참조 서열: WP_027699549.1), VAMP2 및 SNAP25를 절단하는, 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium) 코딩된 독소 (진뱅크(GenBank): OTO22244.1), 및 크리세오박테리움 피페로(Chryseobacterium pipero) 코딩된 독소 (NCBI 참조 서열: WP_034687872.1)를 포괄할 수 있다.
따라서, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X, 및 TeNT (파상풍 신경독소)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소는 보툴리눔 신경독소, 예컨대 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 및 BoNT/X로부터 선택되는 보툴리눔 신경독소이다. 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소 HN 도메인은 BoNT A B, C1, D, E, F, G, X 또는 TeNT로부터의 HN 도메인일 수 있다. 유사하게, L-쇄는 BoNT A B, C1, D, E, F, G, X 또는 TeNT로부터의 L-쇄일 수 있으며, 단 상기 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어 촉매 불활성이 되도록 변형됨). 보다 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/A이다.
상기 논의된 바와 같이, (전장) 클로스트리디움 신경독소는 대략 100 kDa의 분자 질량을 갖는 중쇄 (H-쇄) 및 대략 50 kDa의 분자 질량을 갖는 경쇄 (L-쇄)인 2개의 폴리펩티드 쇄로부터 형성된다. H-쇄는 C-말단 표적화 성분 (수용체 결합 도메인 또는 HC 도메인) 및 N-말단 전위 성분 (HN 도메인)을 포함한다. 보툴리눔 신경독소 (BoNT)는 다수의 보조 단백질에 복합체화된 BoNT 그 자체로 이루어진, 큰 단백질 복합체 형태로 씨. 보툴리눔에 의해 생산된다. 현재 8종의 상이한 부류의 보툴리눔 신경독소, 즉 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F, G 및 X가 존재하며, 이들 모두는 유사한 구조 및 작용 방식을 공유한다. 상이한 BoNT 혈청형은 특이적 중화 항-혈청에 의한 불활성화에 기초하여 구별될 수 있으며, 이러한 혈청형에 의한 분류는 아미노산 수준에서의 백분율 서열 동일성과 상관된다. 주어진 혈청형의 BoNT 단백질은 아미노산 백분율 서열 동일성에 기초하여 상이한 하위유형으로 추가로 나누어진다.
통상적인 (촉매 활성) BoNT는 위장관에서 흡수되고, 일반 순환에 진입한 후, 콜린성 신경 말단의 시냅스전 막에 결합하고, 그의 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 방지한다. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토브레빈/소포-회합된 막 단백질 (VAMP)을 절단하고; BoNT/C1, BoNT/A 및 BoNT/E는 25 kDa의 시냅토솜-회합된 단백질 (SNAP-25)을 절단하고; BoNT/C1은 신탁신을 절단한다. BoNT/X는 SNAP-25, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5, Ykt6, 및 신탁신 1을 절단하는 것으로 밝혀졌다. 테타누스 독소는 씨. 테타니에 의해 단일 혈청형으로 생성된다. 씨. 부티리쿰은 BoNT/E를 생성하는 반면, 씨. 바라티이는 BoNT/F를 생성한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 10, 12, 14, 16, 18, 26, 34, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열의 단편을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 10, 12, 14, 16, 18, 26, 34, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열의 단편을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 10, 12, 14, 16, 18, 26, 34, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열의 단편을 포함할 수 있으며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성이다. 단편은 임의의 상기 서열식별번호의 촉매 불활성 L-쇄, HN 도메인 또는 HC 도메인일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 이와 관련하여 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소에 대한 언급은 또한 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 단편을 포괄한다. 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 ≤400, ≤350, ≤300, ≤250, ≤200, ≤150, ≤100 또는 ≤50개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 200개의 아미노산 잔기를 갖는다. 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 L-쇄의 20-400, 50-300 또는 100-200개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 그러나, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소에 대한 언급은 전장 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄에 대한 언급인 것이 바람직하다.
L-쇄 참조 서열의 예는 하기를 포함한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소: 아미노산 잔기 1-448
보툴리눔 유형 B 신경독소: 아미노산 잔기 1-440
보툴리눔 유형 C1 신경독소: 아미노산 잔기 1-441
보툴리눔 유형 D 신경독소: 아미노산 잔기 1-445
보툴리눔 유형 E 신경독소: 아미노산 잔기 1-422
보툴리눔 유형 F 신경독소: 아미노산 잔기 1-439
보툴리눔 유형 G 신경독소: 아미노산 잔기 1-441
파상풍 신경독소: 아미노산 잔기 1-457
최근에 확인된 BoNT/X의 경우, L-쇄는 그의 아미노산 1-439에 상응하는 것으로 보고되었으며, L-쇄 경계는 잠재적으로 대략 25개의 아미노산만큼 변동한다 (예를 들어 1-414 또는 1-464).
하위-혈청형에 따라 약간의 변이가 일어날 수 있으므로, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다. 예로서, US 2007/0166332 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 하기 약간 상이한 클로스트리디움 서열을 인용한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소: 아미노산 잔기 M1-K448
보툴리눔 유형 B 신경독소: 아미노산 잔기 M1-K441
보툴리눔 유형 C1 신경독소: 아미노산 잔기 M1-K449
보툴리눔 유형 D 신경독소: 아미노산 잔기 M1-R445
보툴리눔 유형 E 신경독소: 아미노산 잔기 M1-R422
보툴리눔 유형 F 신경독소: 아미노산 잔기 M1-K439
보툴리눔 유형 G 신경독소: 아미노산 잔기 M1-K446
파상풍 신경독소: 아미노산 잔기 M1-A457
적합한 클로스트리디움 신경독소 L-쇄가 본원에 기재된다.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 (또는 폴리펩티드)는 하기를 포함할 수 있다:
(i) BoNT/A L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) BoNT/B L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) BoNT/C1 L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) BoNT/D L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) BoNT/E L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) BoNT/F L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) BoNT/G L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) BoNT/X L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) TeNT L-쇄, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
상기 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 (또는 폴리펩티드)는 상기 중 어느 하나로 본질적으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 그로 이루어질 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어 L-쇄가 변형에 의해 불활성화됨).
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-448;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-440;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-441;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-445;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-422;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-439;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-441;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-457.
폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-448;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-440;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-441;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-445;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-422;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-439;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-441;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-457.
폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-448;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-440;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-441;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-445;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-422;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-439;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-441;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439 또는 1-464; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-457.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 6, 24, 32, 40, 74 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 6, 24, 32, 40, 74 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 L-쇄를 촉매 불활성화하도록 변형된 서열식별번호: 6, 24, 32 또는 40 중 어느 하나, 예를 들어 서열식별번호: 74 또는 76을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 코딩된 L-쇄를 촉매적으로 불활성화하도록 변형된 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다.
경쇄의 촉매 활성이 통증 치료에서의 효능에 요구되지 않았다는 것을 고려하면, L-쇄를 포함하지 않는 (또는 L-쇄의 단편만을 포함하는) 폴리펩티드가 통증을 치료할 수 있다는 것이 신뢰할 만하다. 유사한 이유로, L-쇄를 포함하지 않는 (또는 L-쇄의 단편만을 포함하는) 폴리펩티드가 염증성 상태를 치료할 수 있다는 것은 신뢰할 만하다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 둘 다를 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 중쇄 (H-쇄)를 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 상기 H-쇄는 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함한다. 이와 관련하여 클로스트리디움 신경독소 H-쇄에 대한 언급은 또한 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 단편을 포괄한다. 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 ≤800, ≤700, ≤600, ≤500, ≤400, ≤350, ≤300, ≤250, ≤200, ≤150, ≤100 또는 ≤50개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 200개의 아미노산 잔기를 갖는다. 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 단편은 클로스트리디움 신경독소 H-쇄의 20-800, 30-600, 40-400, 50-300 또는 100-200개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 그러나, H-쇄에 대한 언급은 전장 H-쇄에 대한 언급인 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)을 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 이와 관련하여 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인에 대한 언급은 또한 전위 도메인의 단편을 포괄한다. 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 단편은 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 ≤400, ≤350, ≤300, ≤250, ≤200, ≤150, ≤100 또는 ≤50개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 단편은 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 200개의 아미노산 잔기를 갖는다. 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 단편은 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인의 20-400, 50-300 또는 100-200개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 그러나, 전위 도메인에 대한 언급은 전장 전위 도메인에 대한 언급인 것이 바람직하다.
전위 도메인은 클로스트리디움 신경독소의 H-쇄의 아미노-말단 절반과 대략 동등한 H-쇄의 단편, 또는 무손상 H-쇄 내의 그 단편에 상응하는 도메인이다. 한 실시양태에서, H-쇄의 HC 기능은 HC 아미노산 서열의 결실에 의해 (DNA 합성 수준에서, 또는 뉴클레아제 또는 프로테아제 처리에 의한 합성후 수준에서) 제거될 수 있다. 대안적으로, HC 기능은 화학적 또는 생물학적 처리에 의해 불활성화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, H-쇄는 천연 클로스트리디움 신경독소 (즉, 홀로톡신)가 결합하는 표적 세포 상의 결합 부위에 결합할 수 없을 수 있다.
적합한 (참조) 전위 도메인의 예는 하기를 포함한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (449-871)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (441-858)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-866)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (446-862)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (423-845)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (440-864)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-863)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (458-879)
하위-혈청형에 따라 약간의 변이가 존재할 수 있으므로, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다. 예로서, US 2007/0166332 (본원에 참조로 포함됨)는 하기 약간 상이한 클로스트리디움 서열을 인용한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (A449-K871)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (A442-S858)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (T450-N866)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (D446-N862)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (K423-K845)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (A440-K864)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (S447-S863)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (S458-V879)
본 발명의 맥락에서, 전위 도메인을 포함하는 다양한 클로스트리디움 신경독소 HN 영역은 본 발명의 측면에서 유용할 수 있다. 클로스트리디움 신경독소의 중쇄로부터의 HN 영역은 대략 410-430개의 아미노산 길이이고, 전위 도메인을 포함한다. 연구는 클로스트리디움 신경독소 중쇄로부터의 HN 영역의 전체 길이가 전위 도메인의 전위 활성에 필요하지는 않다는 것을 보여주었다. 따라서, 이러한 실시양태의 측면은, 예를 들어 적어도 350개의 아미노산, 적어도 375개의 아미노산, 적어도 400개의 아미노산 및 적어도 425개의 아미노산의 길이를 갖는 전위 도메인을 포함하는 클로스트리디움 신경독소 HN 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 다른 측면은, 예를 들어 최대 350개의 아미노산, 최대 375개의 아미노산, 최대 400개의 아미노산 및 최대 425개의 아미노산의 길이를 갖는 전위 도메인을 포함하는 클로스트리디움 신경독소 HN 영역을 포함할 수 있다.
클로스트리디움 보툴리눔 및 씨. 테타니에서의 독소 생산의 유전적 기초에 대한 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Henderson et al. (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press]을 참조한다.
용어 HN은 자연 발생 신경독소 HN 부분, 및 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열 및/또는 합성 아미노산 잔기를 갖는 변형된 HN 부분을 포괄한다. 한 실시양태에서, 상기 변형된 HN 부분은 상기 언급된 전위 기능을 여전히 나타낸다.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 449-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 441-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 442-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 446-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 423-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 440-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 442-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 415-917, 440-892 또는 465-867에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 458-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 449-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 441-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 442-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 446-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 423-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 440-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 442-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 415-917, 440-892 또는 465-867에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 458-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 449-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 441-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 442-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 446-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 423-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 440-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 442-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 415-917, 440-892 또는 465-867에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 458-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함한다 (또는 그로 이루어진다). 이와 관련하여 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)에 대한 언급은 또한 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)의 단편을 포괄한다. 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인의 단편 (HC)은 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)의 ≤350, ≤300, ≤250, ≤200, ≤150, ≤100 또는 ≤50개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인의 단편 (HC)은 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 200개의 아미노산 잔기를 갖는다. 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인의 단편 (HC)은 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)의 20-350, 50-300 또는 100-200개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 그러나, 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)에 대한 언급은 전장 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC)에 대한 언급인 것이 바람직하다.
클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC) 참조 서열의 예는 하기를 포함한다:
BoNT/A - N872-L1296
BoNT/B - E859-E1291
BoNT/C1 - N867-E1291
BoNT/D - S863-E1276
BoNT/E - R846-K1252
BoNT/F - K865-E1274
BoNT/G - N864-E1297
TeNT - I880-D1315
최근에 확인된 BoNT/X의 경우, HC 도메인은 그의 아미노산 893-1306에 상응하는 것으로 보고되었고, 도메인 경계는 잠재적으로 대략 25개의 아미노산만큼 달라진다 (예를 들어 868-1306 또는 918-1306).
클로스트리디움 신경독소 H-쇄 (예를 들어 HC 도메인 부분)는 전위 촉진 도메인을 추가로 포함할 수 있다 (또는 그의 단편이 전위 촉진 도메인 단편일 수 있음). 상기 도메인은 표적 세포의 시토졸 내로의 L-쇄의 전달을 용이하게 하고, 예를 들어 WO 08/008803 및 WO 08/008805에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
예로서, 전위 촉진 도메인은 클로스트리디움 신경독소 HCN 도메인 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 보다 상세하게, 클로스트리디움 신경독소 HCN 전위 촉진 도메인은 적어도 200개의 아미노산, 적어도 225개의 아미노산, 적어도 250개의 아미노산, 적어도 275개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 이와 관련하여, 클로스트리디움 신경독소 HCN 전위 촉진 도메인은 바람직하게는 최대 200개의 아미노산, 최대 225개의 아미노산, 최대 250개의 아미노산, 또는 최대 275개의 아미노산의 길이를 갖는다. 구체적인 (참조) 예는 하기를 포함한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (872-1110)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (859-1097)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (867-1111)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (863-1098)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (846-1085)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (865-1105)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (864-1105)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (880-1127)
상기 서열 위치는 혈청형/하위유형에 따라 약간 달라질 수 있고, 적합한 (참조) 클로스트리디움 신경독소 HCN 도메인의 추가의 예는 하기를 포함한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (874-1110)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (861-1097)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (869-1111)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (865-1098)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (848-1085)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (867-1105)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (866-1105)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (882-1127)
적합한 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 본원에 기재된다.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 872-1296에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 859-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 867-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 863-1276에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 846-1251에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 865-1277에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 864-1297에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 868-1306, 893-1306 또는 918-1306에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 880-1315에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 872-1296에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 859-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 867-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 863-1276에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 846-1251에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 865-1277에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 864-1297에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 868-1306, 893-1306 또는 918-1306에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 880-1315에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
본 발명의 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 872-1296에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 859-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 867-1291에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 863-1276에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 846-1251에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 865-1277에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 864-1297에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 868-1306, 893-1306 또는 918-1306에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 880-1315에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 8, 22, 30, 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 8, 22, 30, 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 8, 22, 30, 38, 42, 44, 46, 48 또는 50 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 7, 21, 29, 37, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 7, 21, 29, 37, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 서열식별번호: 7, 21, 29, 37, 41, 43, 45, 47 또는 49 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다.
상기 기재된 임의의 촉진 도메인은 본 발명에서 사용하기에 적합한 이전에 기재된 임의의 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있다. 따라서, 예로서, 비-클로스트리디움 촉진 도메인은 비-클로스트리디움 전위 도메인 펩티드 또는 클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있다. 대안적으로, 클로스트리디움 신경독소 HCN 전위 촉진 도메인은 비-클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있다. 대안적으로, 클로스트리디움 신경독소 HCN 촉진 도메인은 클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있으며, 그의 예는 하기를 포함한다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (449-1110)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-1097)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (450-1111)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (446-1098)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (423-1085)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (440-1105)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (447-1105)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (458-1127)
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HC 도메인이 결여될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드에 바람직하게는 클로스트리디움 신경독소 홀로톡신의 마지막 50개의 C-말단 아미노산이 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드에 바람직하게는 클로스트리디움 신경독소 홀로톡신의 마지막 100개, 바람직하게는 마지막 150개, 보다 바람직하게는 마지막 200개, 특히 바람직하게는 마지막 250개, 가장 바람직하게는 마지막 300개의 C-말단 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 대안적으로, HC 결합 활성은 돌연변이유발에 의해 무효화/감소될 수 있으며 - 예로서, 편의상 BoNT/A를 참조하면, 강글리오시드 결합 포켓 내의 1 또는 2개의 아미노산 잔기 돌연변이 (W1266에서 L로 및 Y1267에서 F로)의 변형은 HC영역이 그의 수용체 결합 기능을 상실하게 한다. 유사한 돌연변이가 비-혈청형 A 클로스트리디움 펩티드 성분에 대해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 돌연변이 (W1262에서 L로 및 Y1263에서 F로)를 갖는 보툴리눔 B 또는 돌연변이 (W1224에서 L로 및 Y1225에서 F로)를 갖는 보툴리눔 E를 기반으로 한 구축물이 있다. 활성 부위에 대한 다른 돌연변이, 예를 들어 보툴리눔 유형 A 독소에서의 Y1267S 및 다른 클로스트리디움 신경독소에서의 상응하는 고도로 보존된 잔기는 HC 수용체 결합 활성의 동일한 제거를 달성한다. 이러한 돌연변이 및 다른 돌연변이에 대한 상세사항은 문헌 [Rummel et al. (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 펩티드는 대략 400-440개의 아미노산 잔기를 포함하고, 각각 대략 25 kDa의 2개의 기능적으로 별개의 도메인, 즉 N-말단 영역 (통상적으로 HCN 펩티드 또는 도메인으로 지칭됨) 및 C-말단 영역 (통상적으로 HCC 펩티드 또는 도메인으로 지칭됨)으로 이루어진다. 이러한 사실은 하기 간행물에 의해 확인되며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759; and Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643. 더욱이, C-말단 160-200개의 아미노산 잔기로 구성된 C-말단 영역 (HCC)이 클로스트리디움 신경독소의 그의 천연 세포 수용체, 즉 신경근 접합부의 신경 말단에의 결합을 담당한다는 것이 널리 문서화되어 있으며 - 이 사실은 또한 상기 간행물에 의해 확인된다. 따라서, 중쇄가 천연 클로스트리디움 신경독소가 결합하는 세포 표면 수용체에 결합할 수 없도록 기능적 중쇄 HC 펩티드 (또는 도메인)가 결여되어 있는 클로스트리디움 중쇄에 대한 본 명세서 전반에 걸친 언급은 클로스트리디움 중쇄가 간단하게 기능적 HCC 펩티드가 결여된다는 것을 의미한다. 다시 말해서, HCC 펩티드 영역은 부분적으로 또는 완전히 결실될 수 있거나, 또는 신경근 접합부에서의 신경 말단에 대한 그의 천연 결합 능력을 감소시키기 위해 달리 (예를 들어 통상적인 화학적 또는 단백질분해적 치료를 통해) 변형될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 클로스트리디움 신경독소 HN 펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 C-말단 펩티드 부분 (HCC)의 일부가 결여되어 있고, 따라서 천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 결합 기능이 결여되어 있다. 예로서, 한 실시양태에서, C-말단 연장된 클로스트리디움 HN 펩티드에 클로스트리디움 신경독소 중쇄의 C-말단 40개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 60개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 80개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 100개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 120개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 140개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 150개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 160개의 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 클로스트리디움 HN 펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 전체 C-말단 펩티드 부분 (HCC)이 결여되어 있고, 따라서 천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 결합 기능이 결여되어 있다. 예로서, 한 실시양태에서, 클로스트리디움 HN 펩티드에 클로스트리디움 신경독소 중쇄의 C-말단 165개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 170개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 175개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 180개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 185개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 190개의 아미노산 잔기, 또는 C-말단 195개의 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 추가의 예로서, 본 발명의 클로스트리디움 HN 펩티드에 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 클로스트리디움 HCC 참조 서열이 결여되어 있다:
보툴리눔 유형 A 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1111-L1296)
보툴리눔 유형 B 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1098-E1291)
보툴리눔 유형 C 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1112-E1291)
보툴리눔 유형 D 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1099-E1276)
보툴리눔 유형 E 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1086-K1252)
보툴리눔 유형 F 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1106-E1274)
보툴리눔 유형 G 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1106-E1297)
파상풍 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1128-D1315).
하위-혈청형에 따라 약간의 변이가 존재할 수 있는 바, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다.
다른 실시양태에서, HC 도메인의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 HCC 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN)을 포함할 수 있다.
촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 적합한 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 상기 폴리펩티드는 LHN으로 지칭될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 하기를 포함할 수 있다:
(i) BoNT/A L-쇄 및 BoNT/A HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) BoNT/B L-쇄 및 BoNT/B HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) BoNT/C1 L-쇄 및 BoNT/C1 HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) BoNT/D L-쇄 및 BoNT/D HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) BoNT/E L-쇄 및 BoNT/E HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) BoNT/F L-쇄 및 BoNT/F HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) BoNT/G L-쇄 및 BoNT/G HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) BoNT/X L-쇄 및 BoNT/X HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) TeNT L-쇄 및 TeNT HN 도메인, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
상기 폴리펩티드는 상기 중 어느 하나로 본질적으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 그로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-871;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-858;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-866;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-862;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-845;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-864;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-863;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-879.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 4, 20, 28, 36 또는 75 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 4, 20, 28, 36 또는 75 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 L-쇄를 촉매 불활성화하도록 변형된 서열식별번호: 4, 20, 28, 36 또는 75 중 어느 하나, 예컨대 서열식별번호: 75를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 19, 27 또는 35 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 19, 27 또는 35 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨). 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 코딩된 L-쇄를 촉매적으로 불활성화하도록 변형된 서열식별번호: 3, 19, 27 또는 35 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인), 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC) 또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인의 적어도 C-말단 부분 (HCC)을 포함하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인의 C-말단 부분이 결여되어 있다 (HCC). 유리하게는, 이러한 폴리펩티드에 내인성 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 능력이 결여되어 있고, 따라서 상기 폴리펩티드가 투여된 대상체에서 보다 적은 오프-타겟 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN)으로 본질적으로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어진다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-871;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-858;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-866;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-862;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-845;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-864;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-863;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-879.
바람직하게는, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인), 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어진다.
이와 관련하여 사용된 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 폴리펩티드가, 예를 들어 대상체에게 투여되는 경우에 폴리펩티드에 추가의 기능성을 부여하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하지 않음을 의미한다. 다시 말해서, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)"으로 본질적으로 이루어진" 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 잔기 (촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)의 것)를 추가로 포함할 수 있지만, 상기 1개 이상의 추가의 아미노산 잔기는, 예를 들어 대상체에게 투여되는 경우에, 폴리펩티드에 추가의 기능성을 부여하지 않는다. 추가의 기능성은 효소적 활성, 결합 활성 및/또는 임의의 생리학적 활성을 무엇이든 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN)으로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어진다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨);
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨); 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98%) 서열 동일성, 단 L-쇄는 촉매 불활성임 (예를 들어 L-쇄는 변형에 의해 불활성화됨).
폴리펩티드는 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 51의 잔기 1-871;
(ii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 52의 잔기 1-858;
(iii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 53의 잔기 1-866;
(iv) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 54의 잔기 1-862;
(v) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 55의 잔기 1-845;
(vi) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 56의 잔기 1-864;
(vii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 57의 잔기 1-863;
(viii) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917; 또는
(ix) L-쇄를 촉매 불활성화하도록 추가로 변형된 서열식별번호: 58의 잔기 1-879.
바람직하게는, 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인), 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-클로스트리디움 신경독소 서열이 그의 치료 효과를 달성하는 (예를 들어, 통증을 치료하는) 폴리펩티드의 능력을 파괴하지 않는 한, 임의의 클로스트리디움 신경독소 서열에 추가로 비-클로스트리디움 신경독소 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비-클로스트리디움 신경독소 서열은 촉매 활성, 예를 들어 효소적 활성을 갖는 것이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 촉매 활성 도메인 (예를 들어, 비-클로스트리디움 촉매 활성 도메인)을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 비-클로스트리디움 서열은 세포 수용체에 결합하는 것이 아니다. 다시 말해서, 한 실시양태에서, 비-클로스트리디움 서열은 세포 수용체에 대한 리간드가 아니다. 세포 수용체는 단백질성 세포 수용체, 예컨대 내재성 막 단백질일 수 있다. 세포 수용체의 예는 https://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports에서 이용가능한 문헌 [IUPHAR Guide to Pharmacology Database, version 2019.4]에서 찾아볼 수 있다. 비-클로스트리디움 신경독소 서열은 정제를 보조하는 태그, 예컨대 His-태그를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 표지 또는 표지를 부가하기 위한 부위, 예컨대 소르타제 수용자 또는 공여자 부위를 포함하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및/또는 HC 도메인에 부가적인 치료제 또는 진단제 (예를 들어, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 소분자 치료제 또는 진단제)를 포함하지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 공유 또는 비-공유 회합된 치료제 또는 진단제를 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 추가의 치료제 또는 진단제를 위한 전달 비히클로서 기능하지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 존재하는 임의의 L-쇄가 촉매 불활성이라는 조건 하에 하기 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 변형된 클로스트리디움 신경독소 또는 그의 유도체 또는 변형된 클로스트리디움 신경독소 단편 또는 유도체 단편을 포함할 수 있다 (또는 그로 이루어질 수 있다). 변형된 클로스트리디움 신경독소 또는 유도체 (또는 변형된 클로스트리디움 신경독소 단편 또는 유도체 단편)는 클로스트리디움 신경독소 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)의 천연 (비변형된) 형태와 비교하여 변형된 1개 이상의 아미노산을 함유할 수 있거나, 또는 클로스트리디움 신경독소 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)의 천연 (비변형된) 형태에 존재하지 않는 1개 이상의 삽입된 아미노산을 함유할 수 있다. 예로서, 변형된 클로스트리디움 신경독소 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)는 천연 (비변형된) 클로스트리디움 신경독소 서열 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)에 비해 1개 이상의 도메인에 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 변형은 독소 (또는 독소 단편)의 기능적 측면을 변형시킬 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형된 클로스트리디움 신경독소, 또는 변형된 클로스트리디움 신경독소 유도체, 또는 클로스트리디움 신경독소 유도체 또는 변형된 클로스트리디움 신경독소 단편 또는 유도체 단편 (예를 들어, 촉매 불활성 L-쇄, HN 도메인 및/또는 HC 도메인)이거나 또는 그를 포함하며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다.
본 발명의 폴리펩티드는 중쇄의 아미노산 서열에서 1개 이상의 변형을 갖는 변형된 클로스트리디움 신경독소 또는 클로스트리디움 신경독소 단편 (예를 들어, HC 도메인) (예컨대, 변형된 HC 도메인)을 포함할 수 있고 (또는 그로 이루어질 수 있고), 여기서 상기 변형된 중쇄는 천연 (비변형된) 클로스트리디움 신경독소 또는 클로스트리디움 신경독소 단편보다 더 높거나 더 낮은 친화도로 표적 신경 세포에 결합하며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. HC 도메인에서의 이러한 변형은 표적 신경 세포의 강글리오시드 수용체 및/또는 단백질 수용체에 대한 결합을 변경시키는 HC 도메인의 강글리오시드 결합 부위 또는 단백질 (SV2 또는 시냅토태그민) 결합 부위에서의 잔기를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변형된 클로스트리디움 신경독소의 예는 WO 2006/027207 및 WO 2006/114308에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
변형된 클로스트리디움 신경독소 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)는 클로스트리디움 신경독소의 등전점을 상기 1개 이상의 변형이 결여되어 있는 동등한 비변형 클로스트리디움 신경독소 (또는 클로스트리디움 신경독소 단편)와 비교할 때 증가시키는 1개 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있으며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. 적합한 변형된 클로스트리디움 신경독소 (단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이도록 변형됨)는 하기 및 WO 2015/004461 A1 및 WO 2016/110662 A1에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 서열은 본원에 기재된 서열식별번호: 42 및 62를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편 (예를 들어, BoNT/A HC 도메인 또는 그의 단편)을 포함할 수 있다. 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274, 및 THR 1277로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 변형을 포함하는 것일 수 있다.
변형은 서열식별번호: 2로 제시된 촉매 불활성 BoNT/A와 비교할 때 변형일 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기 넘버링은 서열식별번호: 2와의 정렬에 의해 결정된다. 서열식별번호: 2 (뿐만 아니라 본원에 기재된 변형된 BoNT/A 폴리펩티드 또는 그의 단편에 상응하는 서열식별번호)의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 2가 메티오닌을 포함하는 경우, 위치 넘버링은 상기 정의된 바와 같을 것이다 (예를 들어, ASN 886은 서열식별번호: 2의 ASN 886일 것임). 대안적으로, 메티오닌이 서열식별번호: 2에 부재하는 경우, 아미노산 잔기 넘버링은 -1만큼 변형되어야 한다 (예를 들어, ASN 886은 서열식별번호: 2의 ASN 885일 것임). 유사한 고려사항이 본원에 기재된 다른 폴리펩티드 서열의 위치 1에서의 메티오닌이 존재/부재하는 경우에 적용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 상용적인 기술을 사용하여 정확한 아미노산 잔기 넘버링을 용이하게 결정할 것이다.
아미노산 잔기 넘버링을 결정하기 위한 본원에 기재된 정렬은 서열 상동성 및/또는 % 서열 동일성을 결정하기 위한 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 변형을 위해 지시된 아미노산 잔기(들)는 표면 노출된 아미노산 잔기(들)이다.
변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 및 THR 1277로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 변형을 포함할 수 있다.
용어 "1개 이상의 아미노산 잔기(들)"는 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편과 관련하여 사용되는 경우에 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 지시된 아미노산 잔기(들)를 의미한다. 따라서, 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 지시된 아미노산 잔기(들)에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 (바람직하게는 7개)의 변형을 포함할 수 있다. 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 1-30, 3-20, 또는 5-10개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 용어 "1개 이상의 아미노산 잔기(들)"는 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편과 관련하여 사용되는 경우에 지시된 아미노산 잔기(들) 모두를 의미한다.
바람직하게는, 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은, 지시된 아미노산 잔기(들)에서의 1개 이상의 아미노산 변형(들) 이외에, 서열식별번호: 2와 비교할 때 임의의 추가의 아미노산 변형을 함유하지 않는다.
변형은 하기로부터 선택될 수 있다:
i. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
ii. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 비하전된 아미노산 잔기로의 치환;
iii. 비하전된 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
iv. 염기성 아미노산 잔기의 삽입; 및
v. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 결실.
상기 나타낸 바와 같은 변형은 상응하는 비변형된 BoNT/A 또는 그의 단편과 비교할 때 증가된 양성 표면 전하 및 증가된 등전점을 갖는 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편을 생성한다.
등전점 (pI)은 주어진 단백질의 특이적 특성이다. 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 단백질은 아미노산의 특정 서열 (단백질의 경우 아미노산 잔기로도 지칭됨)로 이루어진다. 20개의 표준 세트의 각각의 아미노산은 상이한 측쇄 (또는 R 기)를 가지며, 이는 단백질에서의 각각의 아미노산 잔기가 상이한 화학적 특성, 예컨대 전하 및 소수성을 나타냄을 의미한다. 이들 특성은 주위 화학적 환경, 예컨대 온도 및 pH에 의해 영향을 받을 수 있다. 단백질의 전반적인 화학적 특징은 이들 다양한 인자의 합계에 좌우될 것이다.
특정 아미노산 잔기 (하기 상술됨)는 주위 pH에 따라 전기 전하를 나타낼 수 있는 이온화가능한 측쇄를 보유한다. 이러한 측쇄가 주어진 pH에서 하전되는지 아닌지는 관련 이온화가능한 모이어티의 pKa에 좌우되며, 여기서 pKa는 접합체 염기로부터의 명시된 양성자에 대한 산 해리 상수 (Ka)의 음의 로그이다.
예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기는 대략 4.1의 pKa 값을 갖는 측쇄 카르복실산 기를 갖는다 (정확한 pKa 값은 온도, 이온 강도 및 이온화성 기의 미세환경에 좌우될 수 있음). 따라서, 이들 측쇄는 7.4의 pH (종종 "생리학적 pH"로 지칭됨)에서 음전하를 나타낸다. 낮은 pH 값에서, 이들 측쇄는 양성자화되고, 그들의 전하를 잃을 것이다.
반대로, 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기는 대략 10-12의 pKa 값을 갖는 질소-함유 측쇄 기를 갖는다. 따라서, 이들 측쇄는 7.4의 pH에서 양전하를 나타낸다. 이들 측쇄는 높은 pH 값에서 탈-양성자화되고, 그들의 전하를 잃을 것이다.
따라서, 단백질 분자의 전체 (순) 전하는 단백질에 존재하는 산성 및 염기성 잔기의 수 (및 그의 표면 노출 정도) 및 주위 pH에 좌우된다. 주위 pH를 변화시키는 것은 단백질 상의 전체 전하를 변화시킨다. 따라서, 모든 단백질에 대해, 양전하 및 음전하의 수가 동일하고, 단백질이 전체 순 전하를 나타내지 않는 주어진 pH가 있다. 이 점은 등전점 (pI)으로 공지되어 있다. 등전점은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙할 것인 단백질 생화학의 표준 개념이다.
따라서, 등전점 (pI)은 단백질이 0의 순 전하를 나타내는 pH 값으로 정의된다. pI의 증가는 단백질이 0의 순 전하를 나타내기 위해 보다 높은 pH 값이 요구됨을 의미한다. 따라서, pI의 증가는 주어진 pH에서 단백질의 순 양전하의 증가를 나타낸다. 반대로, pI의 감소는 단백질이 0의 순 전하를 나타내는 데 보다 낮은 pH 값이 요구됨을 의미한다. 따라서, pI의 감소는 주어진 pH에서 단백질의 순 양전하의 감소를 나타낸다.
단백질의 pI의 측정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙할 것이다. 예로서, 단백질의 pI는 단백질에 존재하는 각각의 아미노산의 평균 pKa 값으로부터 계산될 수 있다 ("계산된 pI"). 이러한 계산은 관련 기술분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 ExPASy로부터의 컴퓨트(Compute) pI/MW 도구 (https://web.expasy.org/compute_pi/)를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 본 발명에 따라 pI를 계산하기 위한 바람직한 방법이다. 상이한 분자 사이의 pI 값의 비교는 동일한 계산 기술/프로그램을 사용하여 이루어져야 한다.
적절한 경우에, 단백질의 계산된 pI는 등전 포커싱 기술을 사용하여 실험적으로 확인될 수 있다 ("관찰된 pI"). 이 기술은 전기영동을 사용하여 단백질을 그의 pI에 따라 분리한다. 등전 포커싱은 전형적으로 고정된 pH 구배를 갖는 겔을 사용하여 수행된다. 전기장이 가해지면, 단백질은 순 전하가 0인 pH에 도달할 때까지 pH 구배를 통해 이동하며, 이 지점이 단백질의 pI이다. 등전 포커싱에 의해 제공된 결과는 전형적으로 성질상 상대적으로 저-해상도이며, 따라서 본 발명자들은 계산된 pI에 의해 제공된 결과 (상기 기재된 바와 같음)가 사용하기에 보다 적절하다고 믿고 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "pI"는 달리 언급되지 않는 한 "계산된 pI"를 의미한다.
단백질의 pI는 그의 표면 상에 나타난 염기성 및/또는 산성 기의 수를 변경시킴으로써 증가 또는 감소될 수 있다. 이는 단백질의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, pI의 증가는 산성 잔기의 수를 감소시킴으로써, 또는 염기성 잔기의 수를 증가시킴으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 촉매 불활성 BoNT/A (예를 들어 서열식별번호: 2) 또는 그의 단편의 것보다 적어도 0.2, 0.4, 0.5 또는 1 pI 단위 더 높은 pI 값을 가질 수 있다. 바람직하게는, 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 적어도 6.6, 예를 들어 적어도 6.8의 pI를 가질 수 있다.
20종의 표준 아미노산의 특성을 하기 표에 나타냈다:
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하기 아미노산은 하전된 아미노산으로 간주된다: 아스파르트산 (음성), 글루탐산 (음성), 아르기닌 (양성) 및 리신 (양성).
7.4의 pH에서, 아스파르트산 (pKa 3.1) 및 글루탐산 (pKa 4.1)의 측쇄는 음전하를 갖는 반면, 아르기닌 (pKa 12.5) 및 리신 (pKa 10.8)의 측쇄는 양전하를 갖는다. 아스파르트산 및 글루탐산은 산성 아미노산 잔기로 지칭된다. 아르기닌 및 리신은 염기성 아미노산 잔기로 지칭된다.
하기 아미노산은 비하전된 극성 (이들이 수소 결합에 참여할 수 있음을 의미함) 아미노산으로 간주된다: 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 및 트립토판.
하기 아미노산은 비하전된 소수성 아미노산으로 간주된다: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린 및 글리신.
아미노산 삽입에서, 추가의 아미노산 잔기 (정상적으로 존재하지 않는 것)는 BoNT/A 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편 내로 혼입되어, 상기 서열에서 아미노산 잔기의 총 수를 증가시킨다. 아미노산 결실에서, 아미노산 잔기는 클로스트리디움 독소 아미노산 서열로부터 제거되어, 상기 서열에서의 아미노산 잔기의 총 수를 감소시킨다.
바람직하게는, 변형은 유리하게는 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편에서 동일한 수의 아미노산 잔기를 유지하는 치환이다. 아미노산 치환에서, BoNT/A 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편의 일부를 형성하는 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 대체된다. 대체 아미노산 잔기는 상기 기재된 바와 같은 20개의 표준 아미노산 잔기 중 하나일 수 있다. 대안적으로, 아미노산 치환에서 대체 아미노산은 비-표준 아미노산 (상기 기재된 20개의 표준 세트의 일부가 아닌 아미노산)일 수 있다. 예를 들어, 대체 아미노산은 염기성 비-표준 아미노산, 예를 들어 L-오르니틴, L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 또는 리신, 아르기닌 및 오르니틴의 D-이성질체일 수 있다. 비-표준 아미노산의 단백질 내로의 도입 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이. 콜라이(E. coli) 영양요구성 발현 숙주를 사용하는 재조합 단백질 합성을 포함한다.
한 실시양태에서, 치환은 산성 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환, 산성 아미노산 잔기의 비하전된 아미노산 잔기로의 치환, 및 비하전된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 치환이 산성 아미노산 잔기의 비하전된 아미노산 잔기로의 치환인 경우, 산성 아미노산 잔기는 그의 상응하는 비하전된 아미드 아미노산 잔기로 대체된다 (즉, 아스파르트산은 아스파라긴으로 대체되고, 글루탐산은 글루타민으로 대체됨).
바람직하게는, 염기성 아미노산 잔기는 리신 잔기 또는 아르기닌 잔기이다. 다시 말해서, 치환은 리신 또는 아르기닌으로의 치환이다. 가장 바람직하게는, 변형은 리신으로의 치환이다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 클로스트리디움 독소 HCN 도메인에 위치한 4 내지 40개의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 바람직하게는 또한 pI가 적어도 6.6이다. 상기 변형된 BoNT/A는 바람직하게는 ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026 및 ASN 1052로부터 선택된 적어도 4개의 아미노산의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 아미노산의 리신 잔기 또는 아르기닌 잔기로의 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변형된 BoNT/A 또는 그의 단편은 ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052 및 GLN 1229로부터 선택된 적어도 5개의 아미노산의 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변형은 아미노산의 리신 잔기 또는 아르기닌 잔기로의 치환을 포함한다.
아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의한 단백질의 변형 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예로서, 아미노산 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 (예를 들어 비변형된 BoNT/A 또는 그의 단편을 코딩하는) DNA 서열의 변형에 의해 도입될 수 있다. 이는 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여, 예를 들어 목적하는 아미노산(들)을 코딩하는 DNA (올리고뉴클레오티드)의 짧은 가닥을 사용하여 폴리머라제 효소의 사용으로 원래 코딩 서열을 대체하는 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 또는 유전자의 일부를 다양한 효소 (예를 들어, 리가제 및 제한 엔도뉴클레아제)에 의해 삽입/결실시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 변형된 유전자 서열은 화학적으로 합성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 42에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 및/또는 서열식별번호: 41에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 42에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 42로 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 41에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 41로 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 62에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 62에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 62로 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
서열식별번호: 42는 변형된 BoNT/A 단편의 예이고, 서열식별번호: 62는 촉매 불활성인 변형된 BoNT/A 폴리펩티드의 예이다. 이러한 변형된 BoNT/A 폴리펩티드 및 단편은 본 발명에 사용하기에 특히 바람직하다. 서열식별번호: 42 및 62로 제시된 폴리펩티드는 야생형 BoNT/A와 비교할 때 폴리펩티드의 등전점을 증가시키는 다수의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 갖는다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 증가된 순 양전하는 폴리펩티드와 음이온성 세포외 성분 사이의 정전기적 상호작용을 촉진함으로써, 폴리펩티드와 세포 표면 사이의 결합을 촉진하여 투여 부위에서의 체류 및/또는 작용 지속기간을 증가시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 서열식별번호: 42 및 62를 사용한 처리가 상기 변형이 결여되어 있는 동등한 폴리펩티드에 비해 개선될 것으로 예상된다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 42 또는 62에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고/거나 서열식별번호: 41에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드는 위치 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229, 및 886 중 1개 이상 (바람직하게는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상, 보다 바람직하게는 전부)에서의 치환을 포함한다.
바람직하게는, 서열식별번호: 42 또는 62에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고/거나 서열식별번호: 41에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드는 위치 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229, 및 886 중 1개 이상에서 리신 또는 아르기닌 (보다 바람직하게는 리신)을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 위치 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229, 및 886 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두에서 리신 또는 아르기닌 (보다 바람직하게는 리신)을 포함한다. 가장 바람직하게는, 폴리펩티드는 위치 930, 955, 991, 1026, 1052, 1229, 및 886 모두에서 리신 또는 아르기닌 (보다 바람직하게는 리신)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 클로스트리디움 신경독소 HC 도메인은 Y1117, F1252, H1253, 및 L1278로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 변형된 BoNT/A HC 도메인이다. 예를 들어, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 하기 변형 Y1117V, F1252Y, H1253K, 및 L1278F 또는 L1278H 중 1개 이상 (바람직하게는 2개 이상)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 하기 변형을 포함한다: Y1117V 및 H1253K; 또는 Y1117V, F1252Y, H1253K, 및 L1278F; 또는 Y1117V, F1252Y, H1253K, 및 L1278H.
바람직하게는, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 하기 변형을 포함한다: Y1117V 및 H1253K; 또는 Y1117V, F1252Y, H1253K, 및 L1278H.
변형은 서열식별번호: 2로 제시된 촉매 불활성 BoNT/A와 비교할 때 변형일 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기 넘버링은 서열식별번호: 2와의 정렬에 의해 결정된다. 서열식별번호: 2의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 2가 메티오닌을 포함하는 경우, 위치 넘버링은 상기 정의된 바와 같을 것이다 (예를 들어, Y1117은 서열식별번호: 2의 Y1117에 대해 정렬될 것이다). 대안적으로, 메티오닌이 서열식별번호: 2에 부재하는 경우, 아미노산 잔기 넘버링은 -1만큼 변형되어야 한다 (예를 들어, Y1117은 서열식별번호: 2의 Y1116에 대해 정렬될 것임). 유사한 고려사항이 본원에 기재된 다른 폴리펩티드 서열의 위치 1에서의 메티오닌이 존재/부재하는 경우에 적용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 상용적인 기술을 사용하여 정확한 아미노산 잔기 넘버링을 용이하게 결정할 것이다.
변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46, 48 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46, 48 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46, 48 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 99% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46, 48 또는 50 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46 또는 50 중 어느 하나에 대해 적어도 99% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 46 또는 50 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있으며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이고, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 99% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이고, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45, 47 또는 49 중 어느 하나에 의해 코딩된 것이다.
변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있으며, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이고, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45 또는 49 중 어느 하나에 대해 적어도 99% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이고, 단 변형된 BoNT/A HC 도메인은 상기 기재된 바와 같은 변형을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 BoNT/A HC 도메인은 서열식별번호: 45 또는 49 중 어느 하나에 의해 코딩된 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 하이브리드 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소 (또는 하이브리드 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소의 단편)를 포함할 수 있으며 (또는 그로 이루어질 수 있으며), 단 L-쇄는 (존재하는 경우에) 촉매 불활성이다. 하이브리드 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 또는 그의 하위유형으로부터의 경쇄의 적어도 일부, 및 또 다른 클로스트리디움 신경독소 또는 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 중쇄의 적어도 일부를 포함한다. 한 실시양태에서, 하이브리드 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 경쇄의 전체 경쇄 및 또 다른 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 중쇄를 함유할 수 있으며, 단 L-쇄는 (존재하는 경우에) 촉매 불활성이다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 클로스트리디움 신경독소는 하나의 클로스트리디움 신경독소 하위유형의 중쇄의 일부 (예를 들어 결합 도메인) 및 또 다른 클로스트리디움 신경독소 하위유형으로부터의 중쇄의 또 다른 일부를 함유할 수 있다. 유사하게 또는 대안적으로, 치료 요소는 상이한 클로스트리디움 신경독소로부터의 경쇄 부분을 포함할 수 있으며, 단 L-쇄는 (존재하는 경우에) 촉매 불활성이다. 이러한 하이브리드 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소는, 예를 들어 주어진 클로스트리디움 신경독소 하위유형에 대해 면역학적으로 저항성인 대상체, 주어진 클로스트리디움 신경독소 중쇄 결합 도메인에 대한 평균보다 더 낮은 농도의 수용체를 가질 수 있는 대상체, 또는 막 또는 소포 독소 기질 (예를 들어, SNAP-25, VAMP 및 신탁신)의 프로테아제-저항성 변이체를 가질 수 있는 대상체에게 이러한 클로스트리디움 신경독소의 치료 이익을 전달하는 수단으로서 유용하다. 하이브리드 및 키메라 클로스트리디움 신경독소는 US 8,071,110에 기재되어 있으며, 상기 공보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소, 또는 키메라 클로스트리디움 신경독소이거나 또는 그를 포함하며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/A 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 (바람직하게는 그로 이루어진) 키메라 클로스트리디움 신경독소일 수 있다. 적합한 키메라 및/또는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소는 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/191315 A1에 교시된 것일 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어 변형에 의해 불활성화됨). 이러한 바람직한 서열은 서열식별번호: 44 및 61을 포함한다.
촉매 불활성 BoNT/A LHN 도메인은 BoNT/B HC 도메인에 공유 연결될 수 있다. 상기 키메라 BoNT/A는 본원에서 "BoNT/AB" 또는 "BoNT/AB 키메라"로도 지칭된다.
LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 BoNT/A의 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 제1 아미노산 잔기에 상응할 수 있고, HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 BoNT/B에서 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 제2 아미노산 잔기에 상응할 수 있다.
본원에서 "BoNT/A의 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 제1 아미노산 잔기"에 대한 언급은 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 N-말단 잔기를 의미한다.
본원에서 "BoNT/B의 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 제2 아미노산 잔기"에 대한 언급은 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 N-말단 잔기 다음의 아미노산 잔기를 의미한다.
"310 나선"은 α-나선, β-시트 및 역회전과 함께, 단백질 및 폴리펩티드에서 발견되는 2차 구조의 유형이다. 310 나선 내의 아미노산은 각각의 완전한 회전이 3개의 잔기 및 이들 사이의 분자간 수소 결합을 분리하는 10개의 원자에 의해 완료되는 우측 나선 구조로 배열된다. 각각의 아미노산은 나선 내의 120° 회전 (즉, 나선은 회전당 3개의 잔기를 가짐), 및 나선 축을 따른 2.0 Å (= 0.2 nm)의 전위에 상응하고, 수소 결합을 만듦으로써 형성된 고리 내에 10개 원자를 갖는다. 가장 중요하게는, 아미노산의 N-H 기는 앞선 아미노산 3개의 잔기의 C = O 기와의 수소 결합을 형성하며; 이러한 반복된 i + 3 → i 수소 결합은 310 나선을 정의한다. 310 나선은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙한 구조 생물학에서의 표준 개념이다.
이러한 310 나선은 실제 나선을 형성하는 4개의 잔기 및 이들 4개의 잔기의 각각의 단부에 하나씩 있는 2개의 캡 (또는 전이) 잔기에 상응한다. 본원에 사용된 용어 "LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선"은 이들 6개의 잔기로 이루어진다.
구조 분석 및 서열 정렬을 수행함으로써, LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선을 확인하였다. 상기 310 나선은 그의 N-말단에서 (즉, LHN 도메인의 C-말단 부분에서) α-나선에 의해 및 그의 C-말단에서 (즉, HC 도메인의 N-말단 부분에서) β-가닥에 의해 둘러싸인다. 310 나선의 제1 (N-말단) 잔기 (캡 또는 전이 잔기)는 또한 상기 α-나선의 C-말단 잔기에 상응한다.
LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선은 예를 들어 보툴리눔 신경독소의 공중 이용가능한 결정 구조, 예를 들어 보툴리눔 신경독소 A1 및 B1 각각에 대해 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA) 및 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)로부터 결정될 수 있다.
또한 공중 이용가능한 인 실리코 모델링 및 정렬 도구가 다른 신경독소에서 LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 위치를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 상동성 모델링 서버 LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns, http://loopp.org), PHYRE (Protein Homology/analogY Recognition Engine, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 및 로제타(Rosetta) (https://www.rosettacommons.org/), 단백질 중첩 서버 슈퍼포즈(SuperPose) (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), 정렬 프로그램 클러스탈 오메가(Clustal Omega) (http://www.clustal.org/omega/), 및 분자 및 세포 생물학자를 위한 인터넷 자원(Internet Resources for Molecular and Cell Biologists)에 열거된 다수의 다른 도구/서비스(http://molbiol-tools.ca/)가 있다. 특히, "HN/HCN" 접합부 주위의 영역은 구조적으로 고도로 보존되어, 이를 상이한 혈청형을 중첩시키는 이상적인 영역으로 만든다.
예를 들어, 하기 방법론이 다른 신경독소에서 이러한 310 나선의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다:
1. 구조적 상동성 모델링 도구 LOOP (http://loopp.org)를 사용하여 BoNT/A1 결정 구조를 기반으로 한 다른 BoNT 혈청형의 예측된 구조 (3BTA.pdb)를 수득하였다;
2. 이에 따라 수득된 구조적 (pdb) 파일을 단지 HCN 도메인의 N-말단 단부 및 그 앞의 약 80개 잔기 (이는 HN 도메인의 일부임)만을 포함하여, 이에 의해 구조적으로 고도로 보존된 "HN/HCN" 영역을 보유하도록 편집하였다;
3. 단백질 중첩 서버 슈퍼포즈 (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)를 사용하여 3BTA.pdb 구조 상에 각각의 혈청형을 중첩시켰다;
4. 중첩된 pdb 파일을 검사하여 BoNT/A1의 HC 도메인의 시작부에 310 나선을 위치시키고, 이어서 다른 혈청형 내의 상응하는 잔기를 확인하였다;
5. 상응하는 잔기가 정확한지 확인하기 위해 다른 BoNT 혈청형 서열을 클러스탈 오메가로 정렬시켰다.
이러한 방법에 의해 결정된 LHN, HC 및 310 나선 도메인의 예가 하기에서 제시된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
구조 분석 및 서열 정렬을 사용하여, LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선 다음의 β-가닥이 모든 보툴리눔 및 파상풍 신경독소에서 보존된 구조이고, LHN 및 HC 도메인을 분리하는 310 나선의 제1 잔기로부터 시작할 때 제8 잔기에서 (예를 들어, BoNT/A1의 경우 잔기 879에서) 시작하는 것으로 밝혀졌다.
BoNT/AB 키메라는 BoNT/B로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 BoNT/A로부터의 LHN 도메인 (촉매 불활성 L-쇄를 가짐)을 포함할 수 있으며,
· 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 BoNT/A의 HC 도메인의 시작부 (N-말단)에 위치한 β-가닥에 대해 N-말단으로 제8 아미노산 잔기에 상응하고,
· 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 BoNT/B의 HC 도메인의 시작부 (N-말단)에 위치한 β-가닥에 대해 N-말단으로 제7 아미노산 잔기에 상응한다.
BoNT/AB 키메라는 BoNT/B로부터의 HC 도메인에 공유 연결된 BoNT/A로부터의 LHN 도메인 (촉매 불활성 L-쇄를 가짐)을 포함할 수 있으며,
· 여기서 LHN 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 BoNT/A의 LHN 도메인의 말단 (C-말단)에 위치한 α-나선의 C-말단 아미노산 잔기에 상응하고,
· 여기서 HC 도메인의 N-말단 아미노산 잔기는 BoNT/B의 LHN 도메인의 말단 (C-말단)에 위치한 α-나선의 C-말단 아미노산 잔기에 대해 C-말단 바로 옆인 아미노산 잔기에 상응한다.
BoNT/AB 키메라의 설계 과정의 근거는 2차 구조가 손상되지 않고, 이에 의해 3차 구조에 대한 임의의 변화를 최소화하도록 보장하기 위한 것이었다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, BoNT/AB 키메라에서 310 나선의 4개의 중심 아미노산 잔기를 파괴하지 않음으로써 키메라 신경독소에 대한 최적 입체형태를 보장하는 것으로 가정된다.
BoNT/A로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 2 또는 61의 아미노산 잔기 1 내지 872 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/A로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 2 또는 61의 아미노산 잔기 1 내지 872 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/A로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 2 또는 61의 아미노산 잔기 1 내지 872에 상응한다.
BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다.
바람직하게는, 촉매 불활성 LHN 도메인은 BoNT/A의 아미노산 잔기 1 내지 872 (서열식별번호: 2 또는 61)에 상응하고, HC 도메인은 BoNT/B의 아미노산 잔기 860 내지 1291 (서열식별번호: 52)에 상응한다.
바람직하게는, BoNT/B HC 도메인은 천연 BoNT/B 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 BoNT/B 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 추가로 포함한다. BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 WO 2013/180799 및 WO 2016/154534 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함한다.
BoNT/B HCC서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199L, E1191M 및 S1199Y, E1191M 및 S1199F, E1191Q 및 S1199L, E1191Q 및 S1199Y, E1191Q 및 S1199F, E1191M 및 S1199W, E1191M 및 W1178Q, E1191C 및 S1199W, E1191C 및 S1199Y, E1191C 및 W1178Q, E1191Q 및 S1199W, E1191V 및 S1199W, E1191V 및 S1199Y, 또는 E1191V 및 W1178Q로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 치환 돌연변이의 조합을 추가로 포함한다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 또한 E1191M, S1199W 및 W1178Q인 3개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다.
바람직하게는, BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199Y인 2개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다.
변형은 서열식별번호: 52로 제시된 비변형된 BoNT/B와 비교할 때의 변형일 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기 넘버링은 서열식별번호: 52와의 정렬에 의해 결정된다. 서열식별번호: 52의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 52가 메티오닌을 포함하는 경우, 위치 넘버링은 상기 정의된 바와 같을 것이다 (예를 들어, E1191은 서열식별번호: 52의 E1191일 것임). 대안적으로, 메티오닌이 서열식별번호: 52에 부재하는 경우, 아미노산 잔기 넘버링은 -1만큼 변형되어야 한다 (예를 들어, E1191은 서열식별번호: 52의 E1190일 것임). 유사한 고려사항이 본원에 기재된 다른 폴리펩티드 서열의 위치 1에서의 메티오닌이 존재/부재하는 경우에 적용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 상용적인 기술을 사용하여 정확한 아미노산 잔기 넘버링을 용이하게 결정할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 61에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 61에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 61로 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
본 발명에 사용하기 위한 키메라 및/또는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/A 폴리펩티드의 일부 및 BoNT/B 폴리펩티드의 일부를 포함할 수 있으며, 그의 예는 서열식별번호: 44로서 본원에 기재된 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 44에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 및/또는 서열식별번호: 43에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 44에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 44로 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 43에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩티드는 서열식별번호: 43으로 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
적합한 키메라 클로스트리디움 신경독소는 BoNT/FA를 포함할 수 있으며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 BoNT/FA 또는 그의 단편을 포함할 수 있으며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. BoNT/FA의 촉매 불활성 형태는 본원에서 서열식별번호: 26 및 34로서 기재된다. BoNT/FA의 적합한 단편은 또한 본원에서 서열식별번호: 28, 30, 및 32로서 기재된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 키메라 클로스트리디움 신경독소일 수 있다. 적합한 키메라 및/또는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소는 본원에 참조로 포함되는 WO 2020/065336 A1에 교시된 것일 수 있으며, 단 L-쇄는 촉매 불활성이다 (예를 들어, 변형에 의해 불활성화됨). 이러한 바람직한 서열은 본원에 기재된 서열식별번호: 63-70을 포함한다.
키메라 클로스트리디움 신경독소는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 하기를 포함할 수 있다:
(i) BoNT/A 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(ii) BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(iii) BoNT/C 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(iv) BoNT/D 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(v) BoNT/E 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(vi) BoNT/F 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(vii) BoNT/G 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분; 또는
(viii) TeNT 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분.
한 실시양태에서, 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소 도메인으로부터의 그의 부분은 시냅토태그민 I 및/또는 II (Syt I/II)에 결합하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 키메라 클로스트리디움 신경독소는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.
촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 63-70 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 63-70 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 63-70 중 어느 하나를 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다). 이들 폴리펩티드 중에서, 서열식별번호: 63-66이 가장 바람직하다.
촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하기 N-말단 아미노산 서열 MGS를 포함할 수 있다. 서열식별번호: 63-66이 상기 N-말단 아미노산 서열을 함유하는 경우, 상기 서열은 임의적이다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 63-66에 MGS로 제시된 N-말단 아미노산 서열이 결여되어 있다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 63-66은 MGS로 제시된 N-말단 아미노산 서열을 포함한다.
BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 1 내지 899 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 1 내지 899 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 1 내지 899에 상응할 수 있다.
BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 4 내지 899 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 4 내지 899 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 잔기 4 내지 899에 상응할 수 있다.
BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 1 내지 866 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 1 내지 866 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 1 내지 866에 상응할 수 있다.
BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 4 내지 866 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 4 내지 866 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/X로부터의 촉매 불활성 LHN 도메인은 서열식별번호: 65의 아미노산 잔기 4 내지 866에 상응할 수 있다.
BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 52의 아미노산 잔기 860 내지 1291에 상응한다.
바람직하게는, BoNT/B HC 도메인은 천연 BoNT/B 서열과 비교하여 인간 Syt II에 대한 BoNT/B 신경독소의 결합 친화도를 증가시키는 효과를 갖는 HCC 서브도메인에서의 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실을 추가로 포함한다. BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 WO 2013/180799 및 WO 2016/154534 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함한다.
BoNT/B HCC서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199L, E1191M 및 S1199Y, E1191M 및 S1199F, E1191Q 및 S1199L, E1191Q 및 S1199Y, E1191Q 및 S1199F, E1191M 및 S1199W, E1191M 및 W1178Q, E1191C 및 S1199W, E1191C 및 S1199Y, E1191C 및 W1178Q, E1191Q 및 S1199W, E1191V 및 S1199W, E1191V 및 S1199Y, 또는 E1191V 및 W1178Q로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 치환 돌연변이의 조합을 추가로 포함한다.
BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 또한 E1191M, S1199W 및 W1178Q인 3개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다.
바람직하게는, BoNT/B HCC 서브도메인에서의 적합한 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실은 E1191M 및 S1199Y인 2개의 치환 돌연변이의 조합을 포함한다.
변형은 서열식별번호: 52로 제시된 비변형된 BoNT/B와 비교할 때의 변형일 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기 넘버링은 서열식별번호: 52와의 정렬에 의해 결정된다. 서열식별번호: 52의 위치 1에서의 메티오닌 잔기의 존재가 임의적이기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 잔기 넘버링을 결정할 때 메티오닌 잔기의 존재/부재를 고려할 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 52가 메티오닌을 포함하는 경우, 위치 넘버링은 상기 정의된 바와 같을 것이다 (예를 들어, E1191은 서열식별번호: 52의 E1191일 것임). 대안적으로, 메티오닌이 서열식별번호: 52에 부재하는 경우, 아미노산 잔기 넘버링은 -1만큼 변형되어야 한다 (예를 들어, E1191은 서열식별번호: 52의 E1190일 것임). 유사한 고려사항이 본원에 기재된 다른 폴리펩티드 서열의 위치 1에서의 메티오닌이 존재/부재하는 경우에 적용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 상용적인 기술을 사용하여 정확한 아미노산 잔기 넘버링을 용이하게 결정할 것이다.
BoNT/A로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 60의 아미노산 잔기 873 내지 1296 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/A로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 60의 아미노산 잔기 873 내지 1296 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/B로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 60의 아미노산 잔기 873 내지 1296에 상응한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드가 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 것인 경우에, 사용된 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄, BoNT/X 전위 도메인 (HN 도메인), 및 BoNT/A 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리펩티드가 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 것인 경우에, 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄, BoNT/X 전위 도메인 (HN 도메인) 및 (i) BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인); (ii) BoNT/D 수용체 결합 도메인 (HC 도메인); 또는 (iii) BoNT/F 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함할 수 있다.
유사하게, 한 실시양태에서, 폴리펩티드가 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 것인 경우에, 사용된 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄, BoNT/X 전위 도메인 (HN 도메인), 및 BoNT/A 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리펩티드가 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 것인 경우에, 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄, BoNT/X 전위 도메인 (HN 도메인) 및 (i) BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인); (ii) BoNT/D 수용체 결합 도메인 (HC 도메인); 또는 (iii) BoNT/F 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함할 수 있다.
BoNT/D로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 54의 아미노산 잔기 865 내지 1276 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/D로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 54의 아미노산 잔기 865 내지 1276 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/D로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 54의 아미노산 잔기 865 내지 1276에 상응한다.
BoNT/F로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 56의 아미노산 잔기 866 내지 1278 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. BoNT/F로부터의 HC 도메인은 서열식별번호: 56의 아미노산 잔기 866 내지 1278 또는 그에 대해 적어도 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, BoNT/F로부터의 HC 도메인은 위치 1241에서 히스티딘의 리신으로의 치환 (H1241K)을 갖는 서열식별번호: 56의 아미노산 잔기 866 내지 1278에 상응한다.
바람직하게는, 키메라 클로스트리디움 신경독소는 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인 (LHN 도메인), 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인) 또는 그의 부분 및 Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys (서열식별번호: 71) (여기서, a = 1-10이고, b = 4-15임)를 포함할 수 있다 (바람직하게는 그로 이루어질 수 있다). 서열식별번호: 71은 BoNT/C1 활성화 루프에 기초한 활성화 루프 컨센서스 서열이다.
또한, 본 발명의 임의의 폴리펩티드는 Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys (서열식별번호: 71) (여기서, a = 1-10이고, b = 4-15임)를 포함할 수 있다. 상기 활성화 루프는 본원에 기재된 폴리펩티드에 존재하는 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및/또는 전위 도메인 (HN 도메인)에 존재하는 임의의 활성화 루프 서열을 적합하게 대체할 수 있다.
Xaa 또는 Yaa가 서열식별번호: 71과 관련하여 사용되는 경우, 이는 임의의 아미노산일 수 있다. 위치 Xaa 및 Yaa에서의 아미노산의 수는 각각 문자 'a' 및 'b'로 표시된다. 한 실시양태에서, 'a' 및 'b'는 활성화 루프의 단백질분해적 절단을 가능하게 하고 활성 2-쇄 클로스트리디움 신경독소를 생성하는 임의의 정수일 수 있다. 한 실시양태에서, 'a'는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 한 실시양태에서, 'b'는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 한 실시양태에서, 'a'는 ≤12, ≤11, ≤10, ≤9, ≤8, ≤7, ≤6, ≤5 또는 ≤4이다. 한 실시양태에서, 'b'는 ≤20, ≤19, ≤18, ≤17, ≤16, ≤15, ≤14, ≤13, ≤12, ≤11, ≤10 또는 ≤9이다.
한 실시양태에서, 'a'는 1 내지 12, 예를 들어 1 내지 10이다. 바람직하게는 'a'는 1-7, 예컨대 2-4이다. 보다 바람직하게는 'a'는 3이다. 한 실시양태에서, 'b'는 1-20, 예를 들어 4-15이다. 바람직하게는 'b'는 6-10이다. 보다 바람직하게는 'b'는 8이다.
Xaa 또는 Yaa가 한 가지 유형의 아미노산으로만 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 위치 Xaa에 존재하는 1개 이상의 잔기는 표준 아미노산: 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 알라닌, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 및 페닐알라닌으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 위치 Yaa에 존재하는 1개 이상의 잔기는 표준 아미노산: 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 알라닌, 글리신, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 및 페닐알라닌으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, 위치 Yaa의 아미노산 (보다 바람직하게는 서열식별번호: 71의 Arg 잔기의 C-말단 바로 옆)은 프롤린이 아니다.
대안적으로/추가로, 위치 Xaa 또는 Yaa에 존재하는 1개 이상의 잔기는 비-표준 아미노산 (상기 기재된 20의 표준 세트의 일부가 아닌 아미노산)으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예로서, 비-표준 아미노산은 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린, α-메틸 세린, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노-프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시-프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸-트레오닌, 히드록시-에틸시스테인, 히드록시에틸호모-시스테인, 니트로-글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐-알라닌, 4-아자페닐-알라닌, L-오르니틴, L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산, 또는 리신, 아르기닌 및/또는 오르니틴의 D-이성질체, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함할 수 있다. 비-표준 아미노산의 단백질 내로의 도입 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이. 콜라이 영양요구성 발현 숙주를 사용하는 재조합 단백질 합성을 포함한다.
서열식별번호: 71에 포함된 서열 Ile-Asp/Glu-Gly-Arg는 놀랍게도 WO 2020/065336 A1에서 엔테로키나제에 의해 인식되는 것으로 밝혀진 부위 (뿐만 아니라 인자 Xa)를 지칭한다. 상기 문헌은 Ile-Asp/Glu-Gly-Arg에서 절단함으로써, 이에 따라 2-쇄 폴리펩티드를 생산하는 적합한 방법을 기재한다. 바람직하게는, 서열은 Ile-Asp-Gly-Arg, 예를 들어 Cys-(Xaa)a-Ile-Asp-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys이다. 엔테로키나제 및 인자 Xa는 서열식별번호: 71의 Arg에 대해 C-말단 바로 옆인 펩티드 결합 (즉, Arg와 Yaa 사이의 펩티드 결합)을 가수분해하는 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 71의 Ile에 대해 바로 N-말단인 Xaa에서의 아미노산 잔기는 비하전된 소수성 아미노산, 바람직하게는 알라닌이다. 일부 실시양태에서, 'a'는 적어도 2이고, Xaa는 적어도 C-말단의 비하전된 극성 아미노산 및 그의 N-말단 바로 옆에 하전된 염기성 아미노산을 포함한다. 하전된 염기성 아미노산은 바람직하게는 리신이다. 따라서, 'a'가 적어도 2인 실시양태에서, Xaa는 적어도 Lys-Ala를 포함할 수 있고, 여기서 Ala는 서열식별번호: 71의 Ile에 대해 N-말단 바로 옆이다.
한 실시양태에서, Xaa는 서열 HKA를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 71의 Arg에 대해 C-말단 바로 옆인 Yaa에서의 아미노산 잔기는 비하전된 극성 아미노산, 바람직하게는 세린이다. 일부 실시양태에서, 'b'는 적어도 2이고, Yaa는 적어도 N-말단의 비하전된 극성 아미노산 및 그의 C-말단 바로 옆에 비하전된 소수성 아미노산을 포함한다. 비하전된 소수성 아미노산은 바람직하게는 류신이다. 따라서, 'b'가 적어도 2인 실시양태에서, Yaa는 적어도 Ser-Leu를 포함할 수 있고, 여기서 Ser은 서열식별번호: 71의 Arg에 대해 C-말단 바로 옆이다.
한 실시양태에서, Yaa는 서열 SLYNKTLDC를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 72에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 72에 대해 적어도 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 72에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 72에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는 서열식별번호: 72를 포함하는, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 72로 이루어진 활성화 루프를 포함한다.
활성화 루프는 또한 서열식별번호: 72의 변이체, 예컨대 서열식별번호: 73 또는 그에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열일 수 있다. 서열식별번호: 73은 엔테로키나제 인식 부위 IDGR이 IEGR로 돌연변이된 서열식별번호: 72의 변이체이다. 한 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 73에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는 서열식별번호: 73을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 73으로 이루어진 활성화 루프를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 활성화 루프 (예를 들어 서열식별번호: 71, 72 또는 73)는 추가의 또는 대안적 프로테아제 부위를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 부위는 서열식별번호: 77로 제시된다. 상기 변형된 활성화 루프의 예는 서열식별번호: 78로 제시된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본원에서의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 활성화 루프를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본원의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 78로 이루어진 활성화 루프를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 재표적화된 클로스트리디움 신경독소를 포함할 수 있으며 (또는 그로 이루어질 수 있으며), 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. 재표적화된 클로스트리디움 신경독소에서, 클로스트리디움 신경독소는 표적화 모이어티 (TM)로 공지된 외인성 리간드를 포함하도록 변형된다. TM은 목적하는 표적 세포에 대한 결합 특이성을 제공하도록 선택되고, 재표적화 과정의 일부로서 클로스트리디움 신경독소의 천연 결합 부분 (예를 들어 HC 도메인, 또는 HCC 도메인)은 제거될 수 있다. 재표적화 기술은, 예를 들어: EP-B-0689459; WO 1994/021300; EP-B-0939818; US 6,461,617; US 7,192,596; WO 1998/007864; EP-B-0826051; US 5,989,545; US 6,395,513; US 6,962,703; WO 1996/033273; EP-B-0996468; US 7,052,702; WO 1999/017806; EP-B-1107794; US 6,632,440; WO 2000/010598; WO 2001/21213; WO 2006/059093; WO 2000/62814; WO 2000/04926; WO 1993/15766; WO 2000/61192; 및 WO 1999/58571에 기재되어 있으며; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 재표적화된 클로스트리디움 신경독소이며, 단 존재하는 임의의 L-쇄는 촉매 불활성이다. 본 발명의 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HC 도메인이 결여될 수 있고, 또한 임의의 기능적으로 동등한 TM이 결여될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드가 정제를 위한 태그 (예를 들어 His-태그) 및/또는 링커를 갖는 실시양태에서, 상기 태그 및/또는 링커는 임의적이다.
본 발명의 폴리펩티드는 자연 발생 클로스트리디움 신경독소 복합체에 존재하는 복합체화 단백질이 없을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 핵산 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리펩티드 (상기 기재된 바와 같음)는 재조합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA)이 제공된다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 벡터의 일부로서 제조된다. 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 핵산 서열로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 하기로부터 선택된 프로모터를 갖는다:
프로모터 유도제 전형적인 유도 조건
Tac (하이브리드) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
AraBAD L-아라비노스 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 오퍼레이터 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
또 다른 바람직한 실시양태에서, 벡터는 하기로부터 선택된 프로모터를 갖는다:
프로모터 유도제 전형적인 유도 조건
Tac (하이브리드) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
AraBAD L-아라비노스 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 오퍼레이터 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
T5-lac 오퍼레이터 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
핵산 분자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 화학적 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 분자 생물학 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 DNA 구축물은 바람직하게는 인 실리코 설계되고, 이어서 통상적인 DNA 합성 기술에 의해 합성된다.
상기 언급된 핵산 서열 정보는 이용될 궁극적인 숙주 세포 (예를 들어 이. 콜라이) 발현 시스템에 따른 코돈-바이어싱을 위해 임의로 변형된다.
용어 "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산"은 본원에서 동의어로 사용된다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열이다.
본 발명의 폴리펩티드 (및 특히 그의 임의의 클로스트리디움 신경독소 부분)는 단일-쇄로서 또는 2-쇄로서 존재할 수 있다. 그러나, 폴리펩티드는 촉매 불활성 L-쇄가 디-술피드 결합을 통해 H-쇄 (또는 그의 성분, 예를 들어 HN 도메인)에 연결된 2-쇄로서 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명은 발현 숙주에서 본원에 기재된 핵산을 발현시키고, 숙주 세포를 용해시켜 단일-쇄 폴리펩티드를 함유하는 숙주 세포 균질물을 제공하고, 단일-쇄 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 촉매 불활성 경쇄 및 중쇄를 갖는 단일-쇄 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드를, 폴리펩티드의 활성화 루프 내의 펩티드 결합을 가수분해하는 프로테아제와 접촉시킴으로써 (단일-쇄) 폴리펩티드를 상응하는 2-쇄 폴리펩티드로 전환시키는 것을 포함하는 (예를 들어 여기서 촉매 불활성 경쇄 및 중쇄는 디술피드 결합에 의해 함께 연결됨), 본원에 기재된 폴리펩티드를 단백질분해적으로 프로세싱하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 2-쇄 폴리펩티드를 제공한다.
본원에 사용된 "대상체"는 포유동물, 예컨대 인간 또는 다른 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, "대상체"는 인간 대상체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "장애"는 또한 "질환"을 포괄한다. 한 실시양태에서, 장애는 질환이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 예방적 치료 (예를 들어 장애 [예를 들어 통증]의 발병을 예방하기 위함) 뿐만 아니라 교정적 치료 (이미 장애 [예를 들어 통증]를 앓고 있는 대상체의 치료)를 포괄한다. 바람직하게는 본원에 사용된 "치료하다" 또는 "치료하는"은 교정적 치료를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 장애 (예를 들어 통증) 및/또는 그의 증상에 적용된다. 하부 요로 장애의 치료와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 그의 증상, 예컨대 통증 및/또는 소변 충동 (일명 절박)을 치료하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하부 요로 장애와 연관된 통증을 치료한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 대상체에게 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 대상체에게 치료 유효량으로 투여된다.
"치료 유효량"은 상기 장애 (예를 들어 통증) (또는 그의 증상)를 치료하기 위해 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합되어 투여되는 경우에 장애 또는 그의 증상의 이러한 치료를 실시하기에 충분한 폴리펩티드의 임의의 양이다.
"예방 유효량"은 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합되어 투여되는 경우에 장애 (예를 들어 통증) (또는 그의 증상)의 발병 또는 재발을 억제하거나 지연시키는 폴리펩티드의 임의의 양이다. 일부 실시양태에서, 예방 유효량은 장애 (예를 들어 통증)의 발병 또는 재발을 전적으로 예방한다. 발병을 "억제하는" 것은 장애의 발병 (예를 들어, 장애가 통증인 경우) (또는 그의 증상)의 가능성을 감소시키거나, 또는 발병을 전적으로 예방하는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 (예를 들어 유해한 손상 [예컨대 UV 또는 화학적 손상] 또는 외상성 손상 [예컨대 수술]을 통해) 통증의 발병 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 통증 발병 적어도 1시간, 6시간, 12시간 또는 24시간 전에 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 대상체에게 투여하기 위한 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 제약 조성물의 일부로서 제제화될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 아주반트, 추진제 및/또는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 경구적, 비경구적, 연속 주입, 흡입 또는 국소 적용을 위해 제제화될 수 있다. 주사에 적합한 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 전에 적합한 비히클에 용해 또는 현탁화되는 건조 분말의 형태일 수 있다.
국소 전달되어야 하는 폴리펩티드의 경우에, 폴리펩티드는 크림으로서 (예를 들어 국소 적용을 위해), 또는 피하 주사를 위해 제제화될 수 있다.
국부 전달 수단은 에어로졸, 또는 다른 스프레이 (예를 들어 네뷸라이저)를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드의 에어로졸 제제는 폐 및/또는 다른 비강 및/또는 기관지 또는 기도 통로로의 전달을 가능하게 한다.
본 발명의 폴리펩티드는 이환 기관의 신경지배에 관여하는 척수 분절의 수준에서 척주에서의 척수강내 또는 경막외 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
투여 경로는 복강경 및/또는 국부 주사를 통한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료할 부위에 또는 그 근처에, 바람직하게는 치료할 부위에 투여된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 척수강내로 또는 척수내로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 경로는 신경주위, 신경내, 척수내 및/또는 척수강내일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 말초 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 피내로 피하로 또는 근육내로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 피내로 투여된다.
본 발명의 폴리펩티드의 투여를 위한 투여량 범위는 목적하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 생성하는 것이다. 요구되는 투여량 범위는 클로스트리디움 신경독소 또는 조성물의 정확한 성질, 투여 경로, 제제의 성질, 대상체의 연령, 대상체의 상태의 성질, 정도 또는 중증도, 존재하는 경우에 금기, 및 담당의의 판단에 좌우된다는 것이 인지될 것이다. 이들 투여량 수준에서의 변화는 최적화를 위한 표준 경험적 루틴을 사용하여 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드의 투여량은 균일 용량이다. 균일 용량은 50 pg 내지 250 μg, 바람직하게는 100 pg 내지 100 μg의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 균일 용량은 적어도 50 pg, 100 pg, 500 pg, 1 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 μg 또는 50 μg일 수 있다. 상기 용량은 단일 균일 용량일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 250 μg 초과의 양으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 500 μg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g 또는 5 g 초과의 양으로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10 g, 5 g, 1 g, 500 mg, 100 mg, 10 mg 또는 1 mg 이하의 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 251 μg 내지 10 g, 251 μg 내지 5 g, 251 μg 내지 1 g, 251 μg 내지 500 mg, 251 μg 내지 100 mg, 251 μg 내지 10 mg, 또는 251 μg 내지 1000 μg, 예를 들어 251 μg 내지 500 μg의 양으로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 500 μg 내지 5 g, 예를 들어 1 mg 내지 1 g 또는 1 g 내지 3 g의 양으로 투여된다. 이는 본 발명의 폴리펩티드의 비-독성 (예를 들어, 실질적으로 비-독성) 성질에 의해 가능해진다.
유체 투여 형태는 전형적으로 폴리펩티드 및 발열원-무함유 멸균 비히클을 이용하여 제조된다. 클로스트리디움 신경독소는 사용되는 비히클 및 농도에 따라 비히클 중에 용해 또는 현탁될 수 있다. 용액의 제조에서, 폴리펩티드는 비히클 중에 용해될 수 있고, 용액은 필요한 경우에 염화나트륨의 첨가에 의해 등장성으로 제조되고, 무균 기술을 사용하여 멸균 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 후에 적합한 멸균 바이알 또는 앰플 내로 충전하고 밀봉된다. 대안적으로, 용액 안정성이 충분한 경우에, 그의 밀봉된 용기 내의 용액은 오토클레이빙에 의해 멸균될 수 있다. 유리하게는 첨가제 예컨대 완충제, 가용화제, 안정화제, 보존제 또는 살박테리아제, 현탁화제 또는 유화제 및 또는 국부 마취제가 비히클 중에 용해될 수 있다.
사용 전에 적합한 비히클 중에 용해 또는 현탁되는 건조 분말은 사전-멸균된 성분을 멸균 구역에서 무균 기술을 사용하여 멸균 용기 내로 충전함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 성분은 멸균 구역에서 무균 기술을 사용하여 적합한 용기 내로 용해될 수 있다. 이어서 생성물은 동결 건조되고, 용기는 무균적으로 밀봉된다.
본원에 기재된 투여 경로에 적합한 비경구 현탁액은, 멸균 성분이 용해되는 대신에 멸균 비히클 중에 현탁되고 멸균이 여과에 의해 달성될 수 없는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 성분은 멸균 상태로 단리될 수 있거나 또는 대안적으로는 이는 단리 후에, 예를 들어 감마선 조사에 의해 멸균될 수 있다.
유리하게는, 현탁화제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈이 조성물(들)에 포함되어 성분의 균일한 분포를 용이하게 한다.
본 발명에 따른 투여는 마이크로입자 캡슐화, 또는 고압 에어로졸 충돌을 포함한 다양한 전달 기술의 이점을 취할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 치료 요법의 일부로서 반복적으로 (예를 들어, 최대 5, 10, 15 또는 20회) 투여된다. 반복 투여는 적어도 2회, 예를 들어 적어도 5, 10, 15 또는 20회 투여를 의미한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 대상체를 치료하기 위해 (예를 들어, 대상체에서 통증을 치료하기 위해) 2회 이상 투여될 수 있다. 이는 계속적인 치료가 전형적으로 필요한 만성 상태, 예컨대 만성 통증의 치료에 특히 적절하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 매주, 매월 2회, 매월, 2개월마다, 6개월마다 또는 매년, 바람직하게는 적어도 매년 2회 또는 매년 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 10년, 5년, 2년 또는 1년의 기간에 2회 이상 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 1년의 기간에 2회 이상 투여된다. 치료는 적어도 6개월, 1년, 2년, 3년, 5년, 10년, 15년, 20년, 25년 또는 30년 동안 계속될 수 있다.
폴리펩티드는 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및/또는 HC 도메인에 부가적인 추가의 치료제 또는 진단제 (예를 들어 핵산, 단백질, 펩티드 또는 소분자 치료제 또는 진단제)와 함께 투여되지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 추가의 진통제 및/또는 항염증제와 함께 투여되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 공유 회합된 치료제와 함께 투여되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 비-공유 회합된 치료제와 함께 투여되지 않는다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 1종 이상의 유형의 통증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 통증은 만성 또는 급성 통증일 수 있다. 통증은 하기 4가지 카테고리의 통증으로부터 선택된 한가지 이상일 수 있다: 침해수용성 통증; 신경병증성 통증; 혼합형 통증; 및 미지의 기원의 통증. 침해수용성 통증은 통각수용기 (통증 수용체)에 대한 공지된 유해 자극에 의해 유발될 수 있고, 체성 또는 내장성일 수 있다. 신경병증성 통증은 신경계에서의 원발성 병변 또는 기능장애에 의해 개시되거나 또는 그에 의해 유발된 통증일 수 있다. 혼합 통증은 침해수용성 통증과 신경병증성 통증의 조합일 수 있다.
본 발명에 의해 치료되는 통증 (예를 들어 만성 통증)의 예는 신경병증성 통증, 염증성 통증, 두통 통증, 체성통, 내장통, 연관통, 이질통, 혼합 통증 및 수술후 통증을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "통증"은 통상적으로 신체 장애와 연관된 임의의 불쾌한 감각 경험을 의미한다. 신체 장애는 임상의에게 명백할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 통증은 2가지 유형: 만성 및 급성이다. "급성 통증"은 돌연 발병이 있는 짧은 기간의 통증이다. 급성 통증의 한 유형은, 예를 들어 피부 또는 다른 표재성 조직에 대한 손상 시 느껴지는, 예컨대 절단 또는 화상에 의해 유발되는 피부 통증이다. 피부 통각수용기는 피부 바로 아래에서 끝나고, 높은 밀집의 신경 종말로 인해, 단기간의 명확하고 국재화된 통증을 일으킨다. "만성 통증"은 급성 통증이 아닌 통증이다.
본 발명의 폴리펩티드는 하기 신경병증성 통증 상태 중 임의의 것에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. "신경병증성 통증"은 불편함을 유발하는, 말초 신경계, 중추 신경계 또는 둘 다로부터의 비정상적 감각 입력을 의미한다. 신경병증성 통증의 증상은 지속적인 자발적 통증, 뿐만 아니라 이질통 (정상적으로는 통증성이 아닌 자극에 대한 통증성 반응), 통각과민 (통상적으로 단지 경미한 불편감을 유발하는 통증성 자극, 예컨대 핀 찌름(pin prick)에 대한 강조된 반응), 또는 통각과민증 (짧은 불편감이 장기간 중증 통증이 되는 경우)을 수반할 수 있다. 신경병증성 통증은 하기 중 임의의 것에 의해 유발될 수 있다:
1. 외상성 손상, 예컨대, 예를 들어 신경 압박 손상 (예를 들어, 신경 압착, 신경 신장, 신경 포착 또는 불완전한 신경 횡절단); 척수 손상 (예를 들어, 척수의 반절편); 사지 절단; 좌상; 염증 (예를 들어, 척수의 염증); 또는 수술 절차.
2. 허혈성 사건, 예를 들어 졸중 및 심장 발작.
3. 감염원.
4. 예를 들어 약물, 알콜, 중금속 (예를 들어, 납, 비소, 수은), 공업용 작용제 (예를 들어, 용매, 접착제로부터의 흄) 또는 아산화질소를 포함한 독성제에 대한 노출.
5. 예를 들어, 염증성 장애, 신생물성 종양, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 라임병, 나병, 대사 질환, 신경종과 같은 말초 신경 장애, 단일신경병증 또는 다발신경병증을 포함한 질환.
신경병증성 통증의 유형은 하기를 포함한다:
1. 신경통.
신경통은 통상적으로 신경 구조에서 임의의 입증가능한 병리학적 변화 없이 1개 이상의 특정 신경의 과정을 따라 방사되는 통증이다. 신경통의 원인은 다양하다. 화학적 자극, 염증, 외상 (수술 포함), 인근 구조 (예를 들어, 종양)에 의한 압박, 및 감염은 모두 신경통으로 이어질 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 원인은 알려지지 않거나 확인불가능하다. 신경통은 노인에서 가장 흔하지만, 임의의 연령에서 발생할 수 있다. 신경통은, 비제한적으로, 삼차 신경통, 포진-후 신경통, 포진후 신경통, 설인두 신경통, 좌골신경통 및 비정형 안면 통증을 포함한다.
신경통은 신경 또는 신경들의 분포에서의 통증이다. 예는 삼차 신경통, 비정형 안면 통증 및 포진후 신경통 (대상포진 또는 헤르페스에 의해 유발됨)이다. 이환된 신경은 턱으로부터 이마까지의 얼굴 영역에서의 접촉, 온도 및 압력을 감지하는 것을 담당한다. 상기 장애는 일반적으로, 통상적으로 2분 미만 동안 및 얼굴의 한 측면 상에서만 극심한 통증의 짧은 에피소드를 유발한다. 통증은 "찌르는(stabbing)", "날카로운(sharp)", "번쩍이는(like lightning)", "작열하는(burning)", 및 심지어 "가려운(itchy)"과 같은 다양한 방식으로 설명될 수 있다. TN의 비정형 형태에서, 통증은 또한 중증 또는 단지 동통으로서 나타나고, 연장된 기간 동안 지속될 수 있다. TN과 연관된 통증은 경험될 수 있는 가장 극심한 통증 중 하나로 인식된다.
식사, 말하기, 얼굴 씻기, 또는 임의의 가벼운 접촉 또는 감각과 같은 단순한 자극이 (심지어 부드러운 산들바람의 감각도) 발작을 촉발할 수 있다. 발작은 군발성으로 또는 분리된 발작으로서 발생할 수 있다.
증상은 각각의 에피소드에 대해 동일한 위치에서, 통상적으로 신체의 표면 상에 또는 그 근처에 있는 어디에나 위치하는 날카로운, 찌르는 통증 또는 일정한 작열통; 특정 신경의 경로를 따른 통증; 통증으로 인한 이환된 신체 부분의 손상된 기능, 또는 수반되는 운동 신경 손상으로 인한 근육 약화; 피부의 증가된 감수성 또는 이환된 피부 영역의 무감각 (국부 마취제 예컨대 노보카인 샷과 유사한 느낌)을 포함하고; 임의의 접촉 또는 압력은 통증으로 해석된다. 움직임은 또한 고통스러울 수 있다.
삼차 신경통은 신경통의 가장 흔한 형태이다. 이는 얼굴의 주요 감각 신경인 삼차 신경에 영향을 미친다 ("삼차"란 문자 그대로 "3개 기점"을 의미하며, 이는 신경의 3개 분지로의 분할을 지칭함). 이 상태는 얼굴의 측부 상의 삼차 신경에 의해 공급된 영역을 따라, 얼굴의 측부 상의 중증 통증의 갑작스런 짧은 발작을 수반한다. 통증 발작은 고통스러운 틱 (동통성 틱(tic douloureux))으로 고전적으로 지칭되는 안면 찌푸림을 야기하기에 충분히 심각할 수 있다. 때때로, 삼차 신경통의 원인은 혈관 또는 신경 상의 작은 종양 압박이다. 다발성 경화증 (뇌 및 척수에 영향을 미치는 염증성 질환), 관절염의 특정 형태, 및 당뇨병 (고혈당)과 같은 장애는 또한 삼차 신경통을 유발할 수 있지만, 원인이 항상 확인되지는 않는다. 이 상태에서, 씹거나, 말하거나, 삼키거나, 또는 얼굴의 영역을 접촉하는 것과 같은 특정 움직임은 극심한 통증의 연축을 촉발할 수 있다.
관련되지만 다소 흔하지 않은 신경통은 설인 신경에 영향을 미치며, 이는 인후에 감각을 제공한다. 이 신경통의 증상은 인후에 위치한 통증의 짧은 쇼크-유사 에피소드이다.
신경통은 헤르페스바이러스의 유형인 수두-대상포진 바이러스에 의해 유발되는 대상포진과 같은 감염 후에 발생할 수 있다. 이 신경통은 대상포진 발진이 치유된 후에 일정한 작열통을 생성한다. 통증은 이환 부위의 움직임 또는 접촉에 의해 악화된다. 대상포진으로 진단된 이들 모두가 대상포진보다 더 고통스러울 수 있는 대상포진후 신경통을 경험하는 것은 아니다. 통증 및 감수성은 수개월 또는 심지어 수년 동안 지속될 수 있다. 통증은 통상적으로 임의의 접촉, 그러나 특히 가벼운 접촉에 대해 허용되지 않는 감수성의 형태이다. 포진후 신경통은 얼굴에 제한되지 않고; 이는 신체 상의 어디에서나 발생할 수 있지만, 통상적으로 대상포진 발진의 위치에서 발생한다. 우울증은 질병 동안 통증 및 사회적 고립으로 인해 드물지 않다.
포진후 신경통은 원래 헤르페스 감염의 징후가 사라진 후에 오래 심신을 약하게 할 수 있다. 신경통을 유발할 수 있는 다른 감염성 질환은 매독 및 라임병이다.
당뇨병은 신경통의 또 다른 흔한 원인이다. 이러한 아주 흔한 의학적 문제는 성인기 동안 20명의 미국인 중 거의 1명에게 영향을 미친다. 당뇨병은 신경에 순환을 공급하는 작은 동맥을 손상시켜, 신경 섬유 기능부전 및 때때로 신경 손실을 초래한다. 당뇨병은 삼차 신경통, 손목 터널 증후군 (손 및 손목의 통증 및 무감각), 및 대퇴감각이상증 (외측 대퇴 피부 신경에 대한 손상으로 인한 넓적다리 무감각 및 통증)을 포함한 거의 모든 신경통을 생성할 수 있다. 혈당의 엄격한 제어는 당뇨병성 신경 손상을 예방할 수 있고, 신경통이 발생한 대상체에서 회복을 가속화할 수 있다.
신경통과 연관될 수 있는 다른 의학적 상태는 만성 신기능부전 및 포르피린증 -- 신체에서 혈액의 정상 파괴 후에 생성된 특정 물질을 신체가 그 자체로 제거할 수 없는 유전성 질환이다. 특정 약물은 또한 이러한 문제를 야기할 수 있다.
2. 구심로차단.
구심로차단은 신체의 일부로부터의 감각 입력의 상실을 나타내고, 말초 감각 섬유 또는 중추 신경계로부터의 신경 중 어느 하나의 중단에 의해 유발될 수 있다. 구심로차단 통증 증후군은, 비제한적으로, 뇌 또는 척수에 대한 손상, 졸중후 통증, 환상 통증, 하반신마비, 상완 신경총 결출 손상, 요추 신경근병증을 포함한다.
3. 복합 부위 통증 증후군 (CRPS)
CRPS는 교감신경-유지 통증으로 인한 만성 통증 증후군이고, 2가지 형태로 존재한다. CRPS 1은 현재 용어 "반사 교감신경 이영양증 증후군"을 대신한다. 이는 경미한 또는 주요 손상 후에 팔 또는 다리에서 가장 자주 발생하는 만성 신경 장애이다. CRPS 1은 중증 통증; 손발톱, 골 및 피부에서의 변화; 및 이환된 사지에서의 접촉에 대한 증가된 감수성과 연관된다. CRPS 2는 용어 작열통을 대신하고, 신경에 대한 확인된 손상으로부터 발생한다. CRPS는, 비제한적으로, CRPS 유형 I (반사 교감신경 이영양증) 및 CRPS 유형 II (작열통)를 포함한다.
4. 신경병증.
신경병증은 신경에서의 기능적 또는 병리학적 변화이고, 임상적으로 감각 또는 운동 뉴런 이상을 특징으로 한다.
중추 신경병증은 중추 신경계의 기능적 또는 병리학적 변화이다.
말초 신경병증은 1개 이상의 말초 신경에서의 기능적 또는 병리학적 변화이다. 말초 신경은 당신의 중추 신경계 (뇌 및 척수)로부터 근육 및 다른 기관으로, 및 당신의 피부, 관절 및 다른 기관으로부터 다시 당신의 뇌로 정보를 전달한다. 말초 신경병증은 이들 신경이 뇌 및 척수로 및 그로부터 정보를 전달하는 데 실패하여 통증, 감각 상실, 또는 근육 제어 불능을 유발하는 경우에 발생한다. 일부 경우에, 혈관, 장 및 다른 기관을 제어하는 신경의 부전은 비정상적 혈압, 소화 문제, 및 다른 기본 신체 과정의 상실을 유발한다. 신경병증에 대한 위험 인자는 당뇨병, 중질 알콜 사용, 및 특정 화학물질 및 약물에 대한 노출을 포함한다. 일부 사람들은 신경병증에 대한 유전성 소인을 갖는다. 신경에 대한 장기간의 압력은 신경 손상 발생의 또 다른 위험이다. 압력 손상은 긴 부동성 (예컨대 긴 수술 절차 또는 긴 질병) 또는 캐스트, 스플린트, 브레이스, 목발 또는 다른 장치에 의한 신경의 압박에 의해 유발될 수 있다. 다발신경병증은 통상적으로 신체의 양측에 동등하게 영향을 미치는 광범위한 과정을 의미한다. 증상은 어떤 유형의 신경이 영향을 받는지에 좌우된다. 신경의 3가지 주요 유형은 감각, 운동 및 자율 신경이다. 신경병증은 모든 3가지 유형의 신경 중 어느 하나 또는 그의 조합에 영향을 미칠 수 있다. 증상은 또한 상태가 (손상으로부터) 전신에 영향을 미치는지 또는 단 하나의 신경에만 영향을 미치는지에 좌우된다. 만성 염증성 다발신경병증의 원인은 비정상적 면역 반응이다. 특이적 항원, 면역 과정 및 촉발 인자는 가변적이고, 많은 경우에 미지이다. 이는 다른 상태, 예컨대 HIV, 염증성 장 질환, 홍반성 루푸스, 만성 활성 간염 및 혈액 세포 이상과 연관되어 발생할 수 있다.
말초 신경병증은 단일 신경 또는 신경 군에 대한 기능 또는 병리학적 변화 (단일신경병증) 또는 다발성 신경에 영향을 미치는 기능 또는 병리학적 변화 (다발신경병증)를 수반할 수 있다.
말초 신경병증은 하기를 포함할 수 있다:
유전성 장애
샤르코-마리-투스병
프리드라이히(Friedreich) 운동실조
전신 또는 대사 장애
당뇨병 (당뇨병성 신경병증)
식이 결핍 (특히 비타민 B-12)
과도한 알콜 사용 (알콜성 신경병증)
요독증 (신부전으로 인함)
암
감염성 또는 염증성 상태
AIDS
간염
콜로라도 진드기열
디프테리아
길랑-바레 증후군
AIDS의 발생이 없는 HIV 감염
나병
라임(Lyme)
결절성 다발동맥염
류마티스 관절염
사르코이드증
쇼그렌 증후군
매독
전신 홍반성 루푸스
아밀로이드
독성 화합물에 대한 노출
접착제 또는 다른 독성 화합물의 냄새맡기
아산화질소
공업용 작용제 -- 특히 용매
중금속 (납, 비소, 수은 등)
진통제성 신병증과 같은 약물에 속발성인 신경병증
기타 원인
허혈 (감소된 산소/감소된 혈류)
저온에의 장기간 노출
a. 다발신경병증
다발신경병증은 다중 말초 신경에 대한 손상 또는 파괴에 의해 유발된 영역에 대한 운동 또는 감각의 상실을 수반하는 말초 신경병증이다. 다발신경병증성 통증은, 비제한적으로, 소아마비후 증후군, 유방절제술후 증후군, 당뇨병성 신경병증, 알콜 신경병증, 아밀로이드, 독소, AIDS, 갑상선기능저하증, 요독증, 비타민 결핍, 화학요법-유발 통증, 2',3'-디데옥시시티딘 (ddC) 치료, 길랑-바레 증후군 또는 파브리병을 포함한다.
b. 단일신경병증
단일신경병증은 단일 말초 신경 또는 신경 군에 대한 손상 또는 파괴에 의해 유발된 영역에 대한 운동 또는 감각의 상실을 수반하는 말초 신경병증이다. 단일신경병증은 손상 또는 외상으로 인한 국부 영역에 대한 손상에 의해 가장 종종 유발되지만, 때때로 전신 장애가 (다발성 단일신경염에 의한 것처럼) 고립된 신경 손상을 유발할 수 있다. 통상적인 원인은 직접적인 외상, 신경에 대한 장기간의 압력, 및 인근 신체 구조에 대한 종창 또는 손상에 의한 신경의 압박이다. 손상은 신경 또는 신경 세포의 일부 (축삭)의 미엘린 수초 (피복)의 파괴를 포함한다. 이러한 손상은 신경을 통한 임펄스의 전도를 늦추거나 방지한다. 단일신경병증은 신체의 임의의 부분을 수반할 수 있다. 단일신경병증성 통증은 좌골 신경 기능장애, 통상 비골 신경 기능장애, 요골 신경 기능장애, 척골 신경 기능장애, 두개 단일신경병증 VI, 두개 단일신경병증 VII, 두개 단일신경병증 III (압박형), 두개 단일신경병증 III (당뇨병형), 액와 신경 기능장애, 손목 터널 증후군, 대퇴 신경 기능장애, 경골 신경 기능장애, 벨 마비, 흉곽 출구 증후군, 손목 터널 증후군 및 제6 (돌발) 신경 마비를 비제한적으로 포함한다.
c. 전신 말초 신경병증
전신 말초 신경병증은 대칭적이며, 통상적으로 말초 신경계에 전체적으로 영향을 미치는 다양한 전신 질병 및 질환 과정으로 인한 것이다. 이들은 여러 카테고리로 추가로 세분된다:
i. 원위 축삭병증은 뉴런의 일부 대사성 또는 독성 착란(derangement)의 결과이다. 이들은 대사 질환, 예컨대 당뇨병, 신부전, 결핍 증후군, 예컨대 영양실조 및 알콜중독, 또는 독소 또는 약물의 효과에 의해 유발될 수 있다. 원위 축삭병증 (일명 역사성(dying back) 신경병증)은 말초 신경계 (PNS) 뉴런의 일부 대사성 또는 독성 착란으로부터 발생하는 말초 신경병증의 유형이다. 이는 대사 또는 독성 장애에 대한 신경의 가장 흔한 반응이고, 따라서 대사 질환, 예컨대 당뇨병, 신부전, 결핍 증후군, 예컨대 영양실조 및 알콜중독, 또는 독소 또는 약물의 효과에 의해 유발될 수 있다. 원위 축삭병증의 가장 흔한 원인은 당뇨병이고, 가장 흔한 원위 축삭병증은 당뇨병성 신경병증이다.
ii. 수초병증은 임펄스 전도의 급성 부전을 유발하는 수초에 대한 1차 공격으로 인한 것이다. 가장 흔한 원인은 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (AIDP; 일명 길랑-바레 증후군)이지만, 다른 원인은 만성 염증성 탈수초성 증후군 (CIDP), 유전적 대사 장애 (예를 들어, 백질이영양증) 또는 독소를 포함한다. 수초병증은 수초 또는 수초화 슈반 세포의 1차 파괴로 인한 것이며, 이는 축삭을 무손상으로 남기지만, 임펄스 전도의 급성 실패를 유발한다. 이 탈수초화는 신경을 통한 전기 임펄스의 전도를 늦추거나 완전히 차단한다. 가장 흔한 원인은 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (AIDP, 길랑-바레 증후군으로 보다 잘 공지됨)이지만, 다른 원인은 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 유전적 대사 장애 (예를 들어, 백질이영양증 또는 샤르코-마리-투스병), 또는 독소를 포함한다.
iii. 뉴런병증은 말초 신경계 (PNS) 뉴런의 파괴의 결과이다. 이들은 운동 뉴런 질환, 감각 뉴런병증 (예를 들어, 대상 포진), 독소 또는 자율신경성 기능장애에 의해 유발될 수 있다. 화학요법제 빈크리스틴과 같은 신경독소는 뉴런병증을 유발할 수 있다. 뉴런병증은 말초 신경병증을 유발하는 말초 신경계 (PNS)의 뉴런의 손상으로 인한 기능장애이다. 이는 운동 뉴런 질환, 감각 뉴런병증 (예를 들어, 대상 포진), 독성 물질 또는 자율신경성 기능장애에 의해 유발될 수 있다. 뉴런병증을 갖는 사람은 원인, 신경 세포에 영향을 미치는 방식, 및 가장 영향을 받은 신경 세포의 유형에 따라 상이한 방식으로 존재할 수 있다.
iv. 국소 포착 신경병증 (예를 들어, 손목 터널 증후군).
통증이 신경병증성 통증인 경우에, 한 실시양태에서, 사용된 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄, BoNT/X 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 BoNT/X 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 통증이 신경병증성 통증인 경우에, 사용된 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄 및 전위 도메인 (HN 도메인)을, 임의로 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 HC 도메인 (예를 들어, BoNT/B로부터의 HC 도메인)과 조합하여 포함하지 않는다. 바람직하게는, 통증이 신경병증성 통증인 경우에, 사용된 폴리펩티드는 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄 및 전위 도메인 (HN 도메인), 및 BoNT/B HC 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 하기 염증성 상태 중 임의의 것에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드는 하기 염증성 상태 중 하나 이상을 치료하는 데 사용될 수 있다.
A. 관절염성 장애
관절염성 장애는, 예를 들어 류마티스 관절염; 소아 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 통풍성 관절염; 경피증; 골관절염; 건선성 관절염; 강직성 척추염; 라이터 증후군 (반응 관절염); 성인 스틸병; 바이러스 감염으로 인한 관절염; 박테리아 감염으로 인한 관절염, 예컨대 예를 들어 임균성 관절염 및 비-임균성 박테리아 관절염 (패혈성 관절염); 3급 라임병; 결핵성 관절염; 및 진균 감염으로 인한 관절염, 예컨대 예를 들어 블라스토미세스증을 포함한다.
B. 자가면역 질환
자가면역 질환은, 예를 들어 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 악성 빈혈, 애디슨병, 제I형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 라이터 증후군 및 그레이브스병을 포함한다.
C. 결합 조직 장애
결합 조직 장애는, 예를 들어 척추관절염, 피부근염 및 섬유근육통을 포함한다.
D. 손상
예를 들어, 조직 또는 관절의 압궤, 천공, 신장을 포함한 손상에 의해 유발된 염증은 만성 염증성 통증을 유발할 수 있다.
E. 감염
예를 들어 결핵 또는 간질성 각막염을 포함한 감염에 의해 유발된 염증은 만성 염증성 통증을 유발할 수 있다.
F. 신경염
신경염은 신경 또는 신경 군에 영향을 미치는 염증 과정이다. 증상은 수반되는 신경에 의존하지만, 통증, 감각이상, 부전마비 또는 감각저하 (무감각)를 포함할 수 있다.
예는 하기를 포함한다:
a. 상완 신경염
b. 안구 바로 뒤에 놓인 시신경의 부분에 영향을 미치는 염증 과정인 안구후 신경병증.
c. 시신경에 영향을 미쳐 이환된 눈에서 갑작스런 감소된 시력을 유발하는 염증 과정인 시신경병증. 시신경염의 원인은 알려져 있지 않다. 시신경 (눈과 뇌를 연결하는 신경)의 갑작스런 염증은 미엘린 수초의 팽윤 및 파괴로 이어진다. 염증은 때때로 바이러스 감염의 결과일 수 있거나, 또는 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증에 의해 유발될 수 있다. 위험 인자는 가능한 원인과 관련된다.
d. 전정 신경에 영향을 미치는 염증 과정을 유발하는 바이러스 감염인 전정 신경염.
G. 관절 염증
관절의 염증, 예컨대 윤활낭염 또는 건염에 의해 유발된 염증은, 예를 들어 만성 염증성 통증을 유발할 수 있다.
H. 일광화상 및/또는 UV-유발 손상
본 발명의 폴리펩티드는 하기 두통 상태 중 임의의 것에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 두통 (의학적으로 두통(cephalgia)으로 공지됨)은 두부에서의 경도 내지 중증 통증의 상태이고; 때때로 경부 또는 상배부 통증도 또한 두통으로 해석될 수 있다. 이는 기저 국부 또는 전신 질환을 나타낼 수 있거나 또는 그 자체로 장애일 수 있다.
A. 근육/근원성 두통
근육/근원성 두통은 안면 및 경부 근육의 조임 또는 긴장을 수반하는 것으로 보이며; 이들은 이마로 방사될 수 있다. 긴장성 두통은 근원성 두통의 가장 흔한 형태이다.
긴장성 두통은 두부, 두피 또는 경부의 통증 또는 불편을 수반하는 상태이며, 통상적으로 이들 영역에서의 근육 긴장과 연관된다. 긴장성 두통은 경부 및 두피 근육의 수축으로부터 발생한다. 이러한 근육 수축의 한 원인은 스트레스, 우울증 또는 불안에 대한 반응이다. 머리를 움직이지 않고 장시간 동안 한 위치에 고정되도록 하는 임의의 활동은 두통을 유발할 수 있다. 이러한 활동은 타이핑 또는 컴퓨터의 사용, 손을 사용한 미세 작업, 및 현미경의 사용을 포함한다. 추운 방에서의 수면 또는 목이 비정상적으로 위치한 수면이 또한 이러한 유형의 두통을 촉발할 수 있다. 긴장성 두통은, 비제한적으로, 간헐성 긴장성 두통 및 만성 긴장성 두통을 포함한다.
B. 혈관성 두통
혈관성 두통의 가장 흔한 유형은 편두통이다. 다른 종류의 혈관성 두통은 강한 통증의 반복된 에피소드를 유발하는 군발성 두통, 및 고혈압으로 인한 두통을 포함한다.
1. 편두통
편두통은 일반적으로 재발성 두통을 수반하는 불균질 장애이다. 편두통은 다른 증상, 예컨대, 예를 들어 오심, 구토, 또는 광에 대한 감수성과 함께 발생하기 때문에 다른 두통과 상이하다. 대부분의 사람들에서, 혈전성 통증이 머리의 한쪽에서만 느껴진다. 임상 특색, 예컨대 전조 증상의 유형, 전구증의 존재, 또는 연관 증상, 예컨대 현기증은 상이한 기저 병리생리학적 및 유전적 메카니즘을 갖는 대상체의 하위군에서 나타날 수 있다. 편두통성 두통은, 비제한적으로, 전조가 없는 편두통 (통상의 편두통), 전조가 있는 편두통 (전형적 편두통), 월경 편두통, 편두통 유사증상 (무두통성 두통), 합병성 편두통, 복부 편두통 및 혼합 긴장성 편두통을 포함한다.
2. 군발성 두통
군발성 두통은 두부의 한 측면 (일측성)에 영향을 미치고, 눈의 눈물분비 및 비강 울혈과 연관될 수 있다. 이들은 클러스터로 발생하며, 수주 동안 동시에 매일 반복적으로 발생하고, 이어서 완화된다.
D. 고혈압 두통
E. 견인성 및 염증성 두통
견인성 및 염증성 두통은 통상적으로 졸중에서 부비동 감염까지의 범위의 다른 장애의 증상이다.
F. 호르몬 두통
G. 반동성 두통
약물 과다사용 두통으로도 공지된 반동성 두통은 약물이 너무 빈번하게 복용되어 두통을 완화시킬 수 없을 때 발생한다. 반동성 두통은 빈번하게 매일 발생하고, 매우 통증성일 수 있다.
H. 만성 부비동염 두통
부비동염은 부비동의 박테리아, 진균, 바이러스, 알레르기 또는 자가면역 염증이다. 만성 부비동염은 감기의 가장 흔한 합병증 중 하나이다. 증상은 하기를 포함한다: 비강 울혈; 안면 통증; 두통; 열; 전신 권태감; 진한 녹색 또는 황색 분비물; 굽힘 시 악화되는 안면 '충만감'의 느낌. 소수의 경우에, 만성 상악동염은 또한 치과 감염으로부터의 박테리아의 확산에 의해 야기될 수 있다. 만성 과형성 호산구성 부비동염은 만성 부비동염의 비감염성 형태이다.
I. 기질성 두통
J. 발작성 두통
발작성 두통은 발작 활성과 연관된 두통이다.
본 발명의 폴리펩티드는 하기 체성통 상태 중 임의의 것에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 체성통은 인대, 힘줄, 뼈, 혈관, 및 심지어 신경 자체로부터 유래된다. 이는 체성 통각수용기로 검출된다. 이들 영역에서의 통증 수용체의 부족은 피부 통증보다 더 긴 지속기간의 둔하고, 불량하게-국재화된 통증을 생성하며; 예는 염좌 및 골절을 포함한다. 추가의 예는 하기를 포함한다.
A. 과도한 근육 긴장
과도한 근육 긴장은, 예를 들어 염좌 또는 긴장에 의해 유발될 수 있다.
B. 반복 운동 장애
반복 운동 장애는 손, 손목, 팔꿈치, 어깨, 목, 등, 엉덩이, 무릎, 발, 다리, 또는 발목의 과사용으로부터 발생할 수 있다.
C. 근육 장애
체성통을 유발하는 근육 장애는, 예를 들어 다발근염, 피부근염, 루푸스, 섬유근육통, 류마티스성 다발근육통 및 횡문근융해증을 포함한다.
D. 근육통
근육통은 근육 통증이고, 많은 질환 및 장애의 증상이다. 근육통에 대한 가장 흔한 원인은 근육 또는 근육 군의 과다사용 또는 과다-스트레칭이다. 외상 병력이 없는 근육통은 종종 바이러스 감염으로 인한 것이다. 장기간 근육통은 대사성 근육병증, 일부 영양 결핍 또는 만성 피로 증후군의 지표일 수 있다.
E. 감염
감염은 체성통을 유발할 수 있다. 이러한 감염의 예는, 예를 들어 근육에서의 농양, 선모충증, 인플루엔자, 라임병, 말라리아, 록키산 홍반열, 조류 인플루엔자, 감기, 지역사회-획득 폐렴, 수막염, 원두, 중증 급성 호흡기 증후군, 독성 쇼크 증후군, 선모충증, 장티푸스열, 및 상기도 감염을 포함한다.
F. 약물
약물은 체성통을 유발할 수 있다. 이러한 약물은, 예를 들어 코카인, 콜레스테롤을 저하시키기 위한 스타틴 (예컨대 아토르바스타틴, 심바스타틴 및 로바스타틴), 및 혈압을 저하시키기 위한 ACE 억제제 (예컨대 에날라프릴 및 캅토프릴)를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 하기 내장통 상태 중 임의의 것에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 내장통은 신체의 내장 또는 기관으로부터 유래된다. 내장성 통각수용기는 신체 기관 및 내부 공동 내에 위치한다. 이들 영역에서 통각수용기가 훨씬 더 부족하기 때문에 체성통보다 통상적으로 더 아프고 더 긴 지속기간의 통증이 발생한다. 내장통은 국재화하기가 극히 어렵고, 내장 조직에 대한 여러 손상은 "연관된" 통증을 나타내며, 여기서 감각은 손상 부위와 완전히 무관한 영역에 국재화된다. 내장통의 예는 하기를 포함한다.
A. 기능성 내장통
기능성 내장통은, 예를 들어 과민성 장 증후군 및 만성 기능성 복부 통증 (CFAP), 기능성 변비 및 기능성 소화불량, 비-심장 가슴 통증 (NCCP) 및 만성 복부 통증을 포함한다.
B. 만성 위장 염증
만성 위장 염증은, 예를 들어 위염, 염증성 장 질환, 예컨대 예를 들어 크론병, 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 게실염 및 위장염; 간질성 방광염; 장 허혈; 담낭염; 충수염; 위식도 역류; 궤양, 신석증, 요로 감염, 췌장염 및 헤르니아를 포함한다.
C. 자가면역 통증
자가면역 통증은, 예를 들어 사르코이드증 및 혈관염을 포함한다.
D. 기질성 내장통
기질성 내장통은, 예를 들어 장의 외상성, 염증성 또는 퇴행성 병변으로부터 초래되거나 또는 감각 신경지배에 충돌하는 종양에 의해 생성된 통증을 포함한다.
E. 치료-유발 내장통
치료-유발 내장통은, 예를 들어 화학요법 요법에 수반되는 통증 또는 방사선 요법에 수반되는 통증을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 하기 연관통 상태에 의해 유발되거나 또는 달리 그와 연관된 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
연관통은 통증 자극 부위로부터 분리된 영역에 국재화된 통증으로부터 발생한다. 종종, 연관통은 신경이 그의 기원에서 또는 그 근처에서 압박 또는 손상될 때 발생한다. 이러한 상황에서, 손상이 다른 곳에서 기원하더라도, 통증의 감각은 일반적으로 신경이 제공된 영역에서 느껴질 것이다. 일반적인 예는 척수로부터 발생하는 신경근이 인접한 원판 물질에 의해 압박되는 추간판 탈출증에서 발생한다. 손상된 원판 자체로부터 통증이 발생할 수 있지만, 압박된 신경이 제공된 영역 (예를 들어, 넓적다리, 무릎 또는 발)에서도 통증이 느껴질 것이다. 영구적인 신경 손상이 발생하지 않았다면, 신경근에 대한 압력을 완화시키는 것이 연관통을 호전시킬 수 있다. 심근 허혈 (심장 근육 조직의 일부로의 혈류 손실)은 가능하게는 연관통의 가장 잘 공지된 예이고; 감각은 상부 흉부에서 제한된 느낌으로서, 또는 좌측 어깨, 팔 또는 심지어 손에서의 동통으로서 발생할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 수술후 통증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
수술후 (예를 들어 외과술후) 통증은 수술 절차로부터 발생하는 불쾌한 감각이다. 수술후 통증은 절개에 의한 조직의 손상, 절차 자체, 상처의 폐쇄, 및 절차 동안 적용되는 임의의 힘에 의해 유발될 수 있다. 수술 후의 통증 (예를 들어 수술후 통증)은 또한 수술에 수반되는 인자로부터 기인할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 대상체가 수술 테이블 상에 위치한 방식으로 인해 요통을 앓을 수 있거나, 또는 흉부 영역에서의 절개로 인해 흉통이 있을 수 있다. 또한 호흡 튜브의 삽입이 자극을 유발할 수 있기 때문에 전신 마취 후에 인후통이 발생할 수 있다. 그러나, 가장 흔한 것은 외과적 절개로부터 피부 및 근육을 절단함으로써 유발되는 수술후 통증이다.
예를 들어, 수술 절차 (또는 보다 특히, 외과적 절개)는 통증을 유발하는 '유해 자극'을 나타낼 수 있다. 조직 손상을 유발할 수 있는 자극인 유해 자극은 침해수용성 구심성 말단으로부터의 신경전달물질의 방출 및 감각 말단으로부터의 신경펩티드, 예컨대 물질 P 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)의 방출을 활성화시킬 수 있다. 이어서, 유해 정보는 말초 신경계로부터 중추 신경계로 변환되며, 여기서 통증이 개체에 의해 지각된다.
수술후 통증은 염증 및 신경 조직 손상의 조합에 의해 유발될 수 있다. 예를 들어, 조직 손상에 반응한 활성화된 비만 세포의 탈과립화는 프로테아제, 시토카인, 세로토닌 및 세포외 공간을 포함한 다양한 물질의 방출을 유발할 수 있다. 이들 물질은 1차 구심성 뉴런을 감작화 (보다 낮은 역치에서 활성화)시켜 통증 과민성을 생성할 수 있다. 조직은 광범위하게 신경지배되기 때문에, 신체의 임의의 영역은 수술로부터의 신경 손상에 취약하다.
수술에 대한 언급은 신체의 일부를 절개에 적용하는 것 (임의로 신체의 손상된 부분을 제거 또는 복구하는 것)을 포함하는, 대상체에서의 손상 또는 질환의 치료를 수반하는 의료 절차를 의미한다. 침습의 수준 (예를 들어 요구되는 외과적 절개의 수준)은 수술 유형마다 달라질 수 있지만, 수술이 완료되면 대상체에서 통증을 유발하는 침습의 수준을 갖는 수술이 포괄되는 것으로 의도된다.
수술은 피부 및/또는 근막 및/또는 근육에 대한 절개를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 수술은 피부에 대한 절개를 포함한다.
수술은 의사에 의해 수행될 수 있는 것으로 제한되지 않고, 또한 예를 들어 치과 수술을 포함한다. 수술의 비제한적 예는 충수절제술, 유방 생검, 유방 확대 또는 축소, 안면거상, 담낭절제술, 관상 동맥 우회술, 괴사조직제거 (예를 들어, 상처, 화상 또는 감염), 피부 이식, 기관 이식 및 편도선절제술을 포함한다.
바람직하게는, "수술후"는 수술 (예를 들어 외과술후) 후 최대 1일에 시작되는 기간을 지칭할 수 있다. 다시 말해서, 용어 "수술후"는 외과술후 1일 이하째에 시작되는 기간을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 용어 "수술후"는 외과술후 1-20시간째; 임의로 외과술후 2-15시간째; 임의로 외과술후 5-10시간째에 시작되는 시점을 지칭할 수 있다. 이러한 시간은 대상체에게 투여된 외과적 마취제로부터의 진통 효과가 감소하고 (예를 들어, 점감하고) 이에 따라 대상체가 통증을 지각하기 시작하는, 시간순 인터페이스에서의 시작하는 기간을 나타낼 수 있다.
또한, '수술'은 본원에서 '외과술'의 의미로 사용되기 때문에, 용어 "수술후"는 용어 "외과술후"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
유사하게, 용어 "수술후 통증"은 수술 (예를 들어, 외과술후) 후 최대 1일째에 시작되는 기간 동안 지각되는 (또는 보다 특히, 지각되기 시작하는) 통증을 지칭할 수 있다. 다시 말해서, 용어 "수술후 통증"은 외과술후 1일 이하째에 시작되는 기간 동안 대상체에 의해 지각되는 통증을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 용어 "수술후 통증"은 외과술후 1-20시간째; 임의로 외과술후 2-15시간째; 임의로 외과술후 5-10시간째에 시작되는 기간 동안 지각되는 통증을 지칭할 수 있다.
상기 기간은 외과술후 1-50주; 예를 들어 5-45주, 10-40주 또는 10-35주일 수 있다.
이는 용어 "수술전후"와 대조적이며, 이는, 예를 들어 대상체가 외과술을 받고 있는 기간 (예를 들어, 대상체가 수술실에 있는 시간) 또는 그 즈음의 기간, 적합하게는 외과술전 적어도 1시간에 시작되고/거나 외과술후 1시간 미만에 종료되는 기간을 지칭할 수 있다.
본 발명은 광범위한 통증 상태, 예를 들어 만성 통증 상태를 다룬다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 암성 및 비-암성 통증을 치료하기 위한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 신경병증성 통증을 치료하는 데 사용된다. 신경병증성 통증은 급성 또는 만성일 수 있다. 한 실시양태에서, 신경병증성 통증은 손상-유발 신경병증성 통증 (손상과 연관된 신경병증성 통증)이다. 한 실시양태에서, 신경병증성 통증은 화학요법-유발 신경병증성 통증 (화학요법과 연관된 신경병증성 통증)이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 염증성 통증을 치료하는 데 사용된다. 염증성 통증은 급성 또는 만성일 수 있다. 한 실시양태에서, 염증성 통증은 화상일 수 있다. 예를 들어, 염증성 통증은 UV 손상 (예를 들어 UV-B 손상)에 의해 유발될 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 방광 통증 증후군, 환상지통 또는 편두통을 치료하는 데 사용된다. 방광 통증 증후군은 간질성 방광염에 의해 유발되거나 또는 그와 연관될 수 있다.
통증을 치료하는 것은 바람직하게는 통증을 감소시키는 것을 의미한다. 즉, 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 대상체에서 통증을 감소시킨다.
보다 상세하게, (통증의 측면에서) "감소된" 또는 "감소하는"에 대한 언급은 바람직하게는 투여하기 전에 (투여전) 대상체에 의해 지각되는 통증의 수준과 비교할 때 본 발명의 폴리펩티드를 투여한 후에 (투여후) 대상체에 의해 지각되는 통증의 보다 낮은 수준을 의미한다. 예를 들어, 지각되는 통증의 수준은 투여전에 비해 투여후 적어도 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 95%만큼 감소될 수 있다. 예를 들어, 지각되는 통증의 수준은 투여후 적어도 75%; 바람직하게는 적어도 85%; 보다 바람직하게는 적어도 95%만큼 감소될 수 있다.
따라서, 대상체에 의한 통증 지각은 본 발명에 따른 치료 후에 감소될 수 있다. 통증 지각 (예를 들어 방광 통증 지각)은 이질통 및/또는 통각과민, 예컨대 이질통 및 통각과민을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체에 의한 통증 지각의 수준은 본 발명의 폴리펩티드를 사용한 치료 후에, 폴리펩티드를 투여받지 않은 (대조군) 대상체에서의 통증 지각의 수준과 비교하여 감소되거나 없어질 수 있다. 통증 지각은 투여 후 적어도 1일, 5일, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 동안 감소될 수 있다. 통증 지각은 투여 후 최대 1년, 6개월, 5개월, 4개월, 3개월, 2개월, 1개월, 2주, 1주, 5일 또는 1일 동안 감소될 수 있다. 예를 들어, 통증 지각은 투여 후 1일 내지 1년, 5일 내지 6개월 또는 1주 내지 3개월 동안 감소될 수 있다. 통증 지각은 폴리펩티드의 투여 후 적어도 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일까지 감소될 수 있다.
통증 지각을 평가하기 위한 다양한 수단이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 기계적 이질통 (정적 또는 동적)의 평가는 본원에 참조로 포함된 문헌 [Pogatzki-Zahn et al. (Pain Rep. 2017 Mar; 2(2): e588)]에 기재된 바와 같이 인간 통증 연구에 상용적으로 사용된다.
대상체에서 통증 지각을 평가하는 데 적합한 (그러나 비제한적인) 방법은 하기: 수치 등급화 척도 (NRS) 점수를 포함하지만; 관련 기술분야의 통상의 기술자는 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있는 다른 방법, 예컨대 감각 역치, 통증 지각 역치, 정적 기계적 이질통, 동적 기계적 이질통, 시간적 가중, 압력 통증 역치, 조건화 통증 조정, 및 온도 역치를 알고 있다.
통증 지각 척도의 다른 비제한적 예는 하기를 포함한다: 각각의 스케줄링된 시점에서의 SF-36 점수의 기준선으로부터의 변화; 연구 동안 복용된 구급 의약의 양 및 구급 의약의 최초 섭취까지의 시간. 이들은 "탐색적" 종점 또는 통증 지각 평가 척도로 간주될 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 후에, 통증 지각은 (a) 수치 등급화 척도 (NRS); (b) 자극-유발 NRS; (c) 통증성 영역의 온도; (d) 통증성 영역의 크기; (e) 진통 효과의 개시까지의 시간; (f) 피크 진통 효과; (g) 피크 진통 효과까지의 시간; (h) 진통 효과의 지속기간; 및 (i) SF-36 삶의 질 중 하나 이상에 의해 평가될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 통증 지각을 평가하는 이러한 방법을 알고 있다. 편의상, 수치 등급화 점수 및 삶의 질 설문지 단축 서식-36의 추가의 설명이 하기에 제공된다.
수치 등급화 척도 (NRS): 전형적으로 본 발명에 따른 통증 지각은 수치 등급화 척도 (NRS)를 사용한다. NRS는 대상체 통증 지각을 평가하기 위한 11-점 척도이다. 대상체는 그의 통증 강도에 가장 잘 맞는 0 내지 10의 수를 제공하도록 요청받는다. 0은 '전혀 통증 없음'을 나타내는 반면, 상한인 10은 '가능한 최악의 통증'을 나타낸다.
NRS는 자발적 평균 통증, 자발적 최악 통증 및 자발적 현재 통증을 포함한 통증의 수많은 양상을 평가하는 데 사용될 수 있다. 자발적 평균 통증은 대상체에게 일정 기간, 예를 들어 적어도 6시간, 12시간, 24시간, 또는 적어도 48시간에 걸쳐 대상체의 평균 통증 (예를 들어 지각된 통증)을 가장 잘 설명하는 수를 선택하도록 요청함으로써 평가된다. 자발적 최악 통증은 대상체에게 명시된 기간, 예를 들어 적어도 이전 6시간, 12시간, 24시간 또는 이전 48시간 동안 대상체의 최악의 통증을 가장 잘 설명하는 수를 선택하도록 요청함으로써 평가된다. 자발적 현재 통증은 대상체에게 대상체가 평가 시에 얼마나 많은 통증을 갖는지를 가장 잘 설명하는 수를 선택하도록 요청함으로써 평가된다.
NRS는 또한 다양한 상이한 자극에 반응하여 대상체의 통증 지각을 평가하는 데 사용될 수 있다. 자극에 반응한 통증 지각을 평가하기 위해, 대상체는 통증성 영역에 적용되는 다양한 성질의 자극을 받을 것이다. 대상체에게 투여전 및 자극후 그의 현재 NRS 점수가 무엇인지 요청할 것이다.
사용되는 자극의 예는 하기를 포함한다: (i) 가벼운 접촉 (본원에 기재된 바와 같은 폰 프라이 필라멘트의 적용 후 방사상 스포크 상의 통증성 영역의 표면 상의 통증을 측정함으로써 평가될 수 있음); (ii) 압력 통각계를 사용하여 증가하는 압력이 적용됨에 따라 대상체에게 NRS 점수를 제공하도록 요청함으로써 평가될 수 있는 압력 (압력 통증 역치); 및 (iii) 온도 (통증성 영역에 적용되는 써모드를 사용하여 따뜻한, 차가운 및 뜨거운 자극에 대해 대상체에게 NRS 점수를 요청함으로써 평가될 수 있음).
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 투여전의 대상체의 NRS 점수와 비교할 때 투여후의 대상체의 NRS 점수를 (예를 들어 ≥7의 등급에서 ≤6의 등급으로) 감소시킨다.
삶의 질 설문지 단축 서식-36 (SF-36): SF-36 삶의 질 설문지는 대상체의 통증 지각을 평가하는 데 사용될 수 있다. SF-36은 대상체 건강의 36-항목, 대상체-보고형 조사이다. SF-36은 8개의 척도 점수 (활력, 신체 기능, 신체 통증, 전반적 건강 지각, 신체적 역할 기능, 정서적 역할 기능, 사회적 역할 기능 및 정신 건강)로 이루어진다. 각각의 질문이 동일한 가중치를 보유한다는 가정 하에 각각의 척도를 0-100 척도로 직접 변환한다. SF-36에서 기록된 점수가 높을수록, 장애가 적다.
통증의 치료를 위한 임상 시험에서 통상적으로 시험되는 관련 파라미터는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 이러한 파라미터의 예는 본원에 기재된 바와 같은 NRS; 자극-유발 NRS; 통증성 영역의 온도; 통증성 영역의 크기; 진통 효과의 개시까지의 시간; 피크 진통 효과; 피크 진통 효과까지의 시간; 진통 효과의 지속기간; 및/또는 SF-36 삶의 질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 파라미터를 평가하는 방법은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상용 방법 및 절차를 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 투여전의 대상체의 SF-36 점수와 비교할 때 투여후 대상체의 SF-36 점수를 (예를 들어 ≤50의 점수에서 ≥50의 점수로) 증가시킨다.
한 실시양태에서, 대상체의 침해수용성 역치는 본 발명의 폴리펩티드의 투여 후에 증가된다. 용어 "침해수용성 역치"는 대상체가 통증을 지각하는 데 필요한 유해 자극의 수준을 지칭할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 의해 치료되는 염증성 장애는 신경계, 심혈관계, 호흡기계, 소화계, 외피계, 근골격계, 비뇨기계, 생식계, 내분비계 또는 림프계의 염증성 장애일 수 있다.
신경계의 염증성 장애는 중추 신경계 염증 (예를 들어 뇌염, 척수염, 수막염 또는 지주막염), 말초 신경계 염증 (예를 들어 신경염), 눈 염증 (예를 들어 누선염, 공막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 맥락망막염, 안검염, 결막염 또는 포도막염), 및 귀 염증 (예를 들어 외이염, 중이염, 미로염 및 유양돌기염)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
심혈관계의 염증성 장애는 심장염 (예를 들어 심내막염, 심근염 또는 심막염) 및 혈관염 (예를 들어 동맥염, 정맥염 또는 모세혈관염)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
호흡기계의 염증성 장애는 상부 호흡기계 염증성 장애 (예를 들어 부비동염, 비염, 인두염 또는 후두염), 하부 호흡기계 염증성 장애 (예를 들어 기관염, 기관지염, 세기관지염, 폐장염 또는 흉막염) 및 종격염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
소화계의 염증성 장애는 구강 염증 (예를 들어 구내염, 치은염, 치은구내염, 설염, 편도염, 타액선염/이하선염, 입술염, 치수염 또는 악간염), 위장관 염증 (예를 들어 식도염, 위염, 위장염, 장염, 결장염, 소장결장염, 십이지장염, 회장염, 맹장염, 충수염 또는 직장염), 및 보조 소화 기관의 염증 (예를 들어 간염, 상행 담관염, 담낭염, 췌장염 또는 복막염)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
외피계의 염증성 장애는 피부염 (예를 들어 모낭염), 연조직염 및 한선염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
근골격계의 염증성 장애는 관절염, 피부근염, 연부 조직 염증 (예를 들어 근염, 활막염/건활막염, 윤활낭염, 골부착부염, 근막염, 피막염, 상과염, 건염 또는 지방층염), 골연골염, 골염/골수염, 척추염, 골막염, 및 연골염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
비뇨기계의 염증성 장애는 신염 (예를 들어 사구체신염 또는 신우신염), 요관염, 방광염 및 요도염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
생식기계의 염증성 장애는 여성 생식기계의 염증 (예를 들어, 난소염, 난관염, 자궁내막염, 파라메트리티스, 자궁경부염, 질염, 외음부염 또는 유선염), 남성 생식기계의 염증 (예를 들어, 고환염, 부고환염, 전립선염, 정낭염, 귀두염, 포피염 또는 귀두포피염), 및 임신, 출산 및/또는 신생아와 연관된 염증 (예를 들어, 융모양막염, 제대결합조직염(funisitis) 또는 제대염(omphalitis))으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
내분비계의 염증성 장애는 인슐린염, 뇌하수체염, 갑상선염, 부갑상선염 및 부신염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
림프계의 염증성 장애는 림프관염 및 림프절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
바람직하게는, 염증성 장애는 복합 부위 통증 증후군, 자궁내막증, 류마티스 관절염, 방광염 및 신경염으로부터 선택된 하나 이상이다. 방광염은 바람직하게는 간질성 방광염이다. 신경염은 바람직하게는 말초 신경염이다.
촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 경쇄를 포함하고 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여된 폴리펩티드
본 발명의 주요 초점은 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄가 촉매 불활성인 폴리펩티드의 유용성에 있다. 그러나, 본 발명자들은 또한 촉매 활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하지만, 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여된 폴리펩티드가 또한 통증 (바람직하게는 방광 통증), 하부 요로 장애 및/또는 염증성 장애를 치료하기 위해 본 발명에 사용될 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 하기 측면이 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 통증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도를 제공한다.
따라서, 바람직한 측면에서, 본 발명은 방광 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 관련된 바람직한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 방광 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법을 제공한다. 관련된 바람직한 측면에서, 본 발명은 방광 통증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 하부 요로 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하부 요로 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 하부 요로 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 염증성 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도를 제공한다.
폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, 쇄가 촉매 불활성인 상기 기재된 실시양태는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) (즉, 촉매 활성 L-쇄)를 포함하는 폴리펩티드를 사용하는 측면에 동등하게 적용되며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있다. 물론, 상기 실시양태에서 촉매 불활성인 L-쇄에 대한 임의의 언급 및/또는 L-쇄의 비-세포독성 프로테아제 활성의 결여에 대한 임의의 언급은 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) (즉, 촉매 활성 L-쇄)를 포함하는 상기 언급된 측면에 적용되지 않으며, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있다.
바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소의 HCC 도메인 또는 HC 도메인은 상기 측면에 따른 클로스트리디움 신경독소에 부재한다.
상기 측면에서, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있고, 또한 임의의 기능적으로 등가인 외인성 리간드 표적화 모이어티 (TM)가 결여되어 있는 것이 바람직하다.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 (또는 폴리펩티드)는 하기를 포함할 수 있다:
(i) BoNT/A L-쇄;
(ii) BoNT/B L-쇄;
(iii) BoNT/C1 L-쇄;
(iv) BoNT/D L-쇄;
(v) BoNT/E L-쇄;
(vi) BoNT/F L-쇄;
(vii) BoNT/G L-쇄;
(viii) BoNT/X L-쇄; 또는
(ix) TeNT L-쇄.
상기 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 (또는 폴리펩티드)는 상기 중 어느 하나로 본질적으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 그로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439, 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성.
폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439, 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성.
폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어질 수 있다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-448에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-440에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-445에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-422에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-439에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-441에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-414, 1-439, 또는 1-464에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-457에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 6, 24, 32 또는 40 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 6, 24, 32 또는 40 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 6, 24, 32 또는 40 중 어느 하나를 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄는 서열식별번호: 5, 23, 31 또는 39 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다.
촉매 활성 L-쇄가 사용되는 경우에, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 HN 도메인을 포함할 수 있고, 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여될 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 LHN으로 지칭될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 하기를 포함할 수 있다:
(i) BoNT/A L-쇄 및 BoNT/A HN 도메인;
(ii) BoNT/B L-쇄 및 BoNT/B HN 도메인;
(iii) BoNT/C1 L-쇄 및 BoNT/C1 HN 도메인;
(iv) BoNT/D L-쇄 및 BoNT/D HN 도메인;
(v) BoNT/E L-쇄 및 BoNT/E HN 도메인;
(vi) BoNT/F L-쇄 및 BoNT/F HN 도메인;
(vii) BoNT/G L-쇄 및 BoNT/G HN 도메인;
(viii) BoNT/X L-쇄 및 BoNT/X HN 도메인; 또는
(ix) TeNT L-쇄 및 TeNT HN 도메인.
상기 폴리펩티드는 상기 중 어느 하나로 본질적으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 그로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
바람직하게는, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 HN 도메인으로 본질적으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어진다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 HN 도메인으로 본질적으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 하기를 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어진다:
(i) 서열식별번호: 51의 잔기 1-871에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(ii) 서열식별번호: 52의 잔기 1-858에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iii) 서열식별번호: 53의 잔기 1-866에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(iv) 서열식별번호: 54의 잔기 1-862에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(v) 서열식별번호: 55의 잔기 1-845에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vi) 서열식별번호: 56의 잔기 1-864에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(vii) 서열식별번호: 57의 잔기 1-863에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성;
(viii) 서열식별번호: 59의 잔기 1-867, 1-892, 또는 1-917에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%) 서열 동일성; 또는
(ix) 서열식별번호: 58의 잔기 1-879에 대한 70% (예를 들어 적어도 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성.
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 4, 20, 28, 또는 36 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 4, 20, 28, 또는 36 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 4, 20, 28, 또는 36 중 어느 하나를 포함한다 (보다 바람직하게는 그로 이루어진다).
클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 19, 27, 또는 35 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 19, 27, 또는 35 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다. 바람직하게는, 클로스트리디움 신경독소 L-쇄 및 전위 도메인을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 폴리펩티드는 서열식별번호: 3, 19, 27, 또는 35 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 것이다.
본 발명의 다양한 치료 용도에 관한 실시양태는 치료 방법에 동등하게 적용되는 것으로 의도되며, 그 반대도 마찬가지이다.
서열 상동성
전역 방법, 국부 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대, 예를 들어 분절 접근 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 서열 정렬 방법 중 임의의 것이 퍼센트 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하는 프로토콜은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내에 속하는 일상적인 절차이다. 전역 방법은 분자의 시작부터 끝까지 서열을 정렬하고, 개별적인 잔기 쌍의 점수를 합산하고 갭 페널티를 부과하는 것에 의해 최선의 정렬을 결정한다. 비제한적 방법은, 예를 들어 클러스탈(CLUSTAL) W (예를 들어 문헌 [Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)] 참조); 및 반복 정밀화 (예를 들어 문헌 [Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)] 참조)를 포함한다. 국부 방법은 모든 입력 서열이 공유하는 하나 이상의 보존된 모티프를 확인하는 것에 의해 서열을 정렬한다. 비제한적인 방법은, 예를 들어, 매치-박스(Match-box) (예를 들어, 문헌 [Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)] 참조); 깁스(Gibbs) 샘플링 (예를 들어, 문헌 [C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)] 참조); 얼라인-M(Align-M) (예를 들어, 문헌 [Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)] 참조)을 포함한다.
따라서, 퍼센트 서열 동일성은 통상적인 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992]을 참조한다. 간략하게, 2개의 아미노산 서열을 정렬하여 10의 갭 개방 페널티, 1의 갭 연장 페널티, 및 하기 제시된 바와 같은 헤니코프(Henikoff) 및 헤니코프의 "블로섬(blosum) 62" 점수화 매트릭스 (상기 문헌)를 사용하여 정렬 점수를 최적화하고 (아미노산은 표준 1-문자 코드에 의해 표시됨); 바람직하게는 이 방법은 본원에 기재된 바와 같이 서열을 본원에 기재된 서열식별번호와 정렬하여 아미노산 위치 넘버링을 정의하는 데 사용된다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "퍼센트 서열 동일성"은 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 따라서, % 동일성은 동일한 뉴클레오티드 / 아미노산의 수를 뉴클레오티드 / 아미노산의 총수로 나누고, 100을 곱한 것으로서 계산될 수 있다. % 서열 동일성의 계산은 갭의 수, 및 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 또한 고려할 수 있다. 2개 이상의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 특정한 수학적 알고리즘, 예컨대 BLAST를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙할 것이다.
서열 동일성을 결정하기 위한 정렬 점수
Figure pct00004
그 후, 퍼센트 동일성이 하기와 같이 계산된다:
Figure pct00005
실질적으로 상동성인 폴리펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 변화는 바람직하게는 부차적인 성질의 것, 즉 보존적 아미노산 치환 (하기 참조) 및 폴리펩티드의 폴딩 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 다른 치환; 소형 결실, 전형적으로는 1 내지 약 30개의 아미노산의 결실; 및 소형 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 최대 약 20-25개의 잔기의 소형 링커 펩티드, 또는 친화력 태그이다.
보존적 아미노산 치환
염기성: 아르기닌
리신
히스티딘
산성: 글루탐산
아스파르트산
극성: 글루타민
아스파라긴
소수성: 류신
이소류신
발린
방향족: 페닐알라닌
트립토판
티로신
소형: 글리신
알라닌
세린
트레오닌
메티오닌
20개의 표준 아미노산에 추가로, 비-표준 아미노산 (예컨대 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 α-메틸 세린)이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 제한된 개수의 비-보존적 아미노산, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산이 폴리펩티드 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
비-자연 발생 아미노산은, 비제한적으로, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노-프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시-프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸-트레오닌, 히드록시-에틸시스테인, 히드록시에틸호모-시스테인, 니트로-글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐-알라닌, 4-아자페닐-알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산 잔기를 단백질 내로 혼입시키기 위한 여러 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 화학적으로 아미노아실화된 억제인자 tRNA를 사용하여 넌센스 돌연변이가 억제되는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 이. 콜라이 S30 추출물 및 상업적으로 입수가능한 효소 및 다른 시약을 포함하는 무세포 시스템에서 수행된다. 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제한다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; 및 Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993]을 참조한다. 제2 방법에서는, 돌연변이된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 억제인자 tRNA의 미세주입에 의해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 번역이 수행된다 (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). 제3 방법에서는, 이. 콜라이 세포가 교체될 천연 아미노산 (예를 들어, 페닐알라닌)의 부재 및 원하는 비-자연 발생 아미노산(들) (예를 들어, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 하에 배양된다. 비-자연 발생 아미노산이 그의 천연 대응물을 대신하여 폴리펩티드 내로 혼입된다. 문헌 [Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994]을 참조한다. 시험관내 화학적 변형에 의해 자연 발생 아미노산 잔기가 비-자연 발생 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형이 부위-지정 돌연변이유발과 조합되어 치환 범위를 추가로 확장시킬 수 있다 (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
제한된 개수의 비-보존적 아미노산, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 비-자연 발생 아미노산, 및 비천연 아미노산이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 내의 필수 아미노산이 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기술에 의해 결정된 바와 같은, 구조의 물리적 분석에 의해 생물학적 상호작용의 부위 또한 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992]을 참조한다. 본 발명의 폴리펩티드의 관련된 성분 (예를 들어, 전위 또는 프로테아제 성분)과의 상동성의 분석으로부터 필수 아미노산의 정체가 추론될 수도 있다.
공지된 돌연변이유발 및 스크리닝 방법, 예컨대 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-7, 1988] 또는 [Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)]에 개시된 것을 사용하여 다중 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 시험될 수 있다. 간략하게, 상기 문헌의 저자들은 폴리펩티드 내의 2개 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선별한 후, 돌연변이된 폴리펩티드를 시퀀싱하여, 각각의 위치에서의 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 파지 디스플레이 (예를 들어, 문헌 [Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991]; 미국 특허 번호 5,223,409 (래드너(Ladner) 등); WIPO 공보 WO 92/06204 (휴즈(Huse)) 및 영역-지정 돌연변이유발 (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]이 본 개시내용에서 사용된 다수의 용어의 일반적인 사전을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제공한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 제한되지 않고, 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시양태의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 각각 임의의 핵산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3'으로의 배향으로 작성되고; 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카르복시로의 배향으로 작성된다.
본원에 제공된 제목은 본 개시내용의 다양한 측면 또는 실시양태의 제한이 아니다.
아미노산은 본원에서 아미노산의 명칭, 3문자 약어 또는 단일 문자 약어를 사용하여 지칭된다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 경우에, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 경우에, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 개시내용 및 청구범위에서, 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 및 3문자 코드가 사용될 수 있다. IUPACIUB 생화학적 명명법에 대한 연합 위원회 (JCBN: Joint Commission on Biochemical Nomenclature)에 따라 정의된 바와 같은 아미노산에 대한 3문자 코드. 유전자 코드의 축중성으로 인해 폴리펩티드가 1개를 초과하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 또한 이해된다.
용어의 다른 정의가 명세서 전반에 걸쳐 나타날 수 있다. 예시적인 실시양태가 더욱 상세하게 기재되기 전에, 본 개시내용이 기재된 특정한 실시양태에 제한되지 않고, 따라서 변경될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 개시내용의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 정의될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태를 기재하려는 목적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 이러한 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 사이 값이 또한 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 사이 값과 이러한 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 사이 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 개시내용에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위 내에 포함되거나 또는 범위에서 제외될 수 있고, 더 작은 범위 내에 한도 중 어느 하나 또는 둘 다가 포함되거나 또는 어느 것도 포함되지 않는 각각의 범위가 또한 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 제외된 한도를 조건으로 본 개시내용에 포함된다. 언급된 범위가 한도 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이러한 포함된 한도 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어 "클로스트리디움 신경독소"에 대한 언급은 복수의 이러한 후보 작용제를 포함하고, "클로스트리디움 신경독소"에 대한 언급은 1종 이상의 클로스트리디움 신경독소 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서의 어떠한 것도 이러한 간행물이 본원에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
이제 본 발명의 실시양태가 단지 예로서 하기의 도면 및 실시예를 참조로 기재될 것이다.
도 1은 BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여된 인간 뉴런 세포에서의 % SNAP25 절단을 보여준다.
도 2는 BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여된 래트 뉴런 세포에서의 % SNAP25 절단을 보여준다.
도 3 (a)는 꼬리로 매달린 마우스의 특징적인 놀람 반응을 보여준다. (b)는 발가락 외전 점수 (DAS) 검정에서 사용된 점수화를 보여준다.
도 4 (a)는 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (220-250 g)에서 만성 신경병증성 통증의 만성 협착 손상 (CCI) 모델을 사용한 연구에 대한 실험 개략도를 제시한다. BoNT/A(0) (60 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (30 pg/kg 족저내 (i.pl.) 투여), BoNT/A (60 pg/kg i.pl. 투여), 비히클 (젤라틴 포스페이트 완충제 (GPB) i.pl. 투여 - 음성 대조군) 또는 가바펜틴 (100 mg/kg p.o. 투여 - 양성 대조군)의 투여 전 및 후의 일수 (D)가 지시된다. 제0일 (D0)에 투여를 수행하고, D-14에 CCI 수술을 수행하였다. vF는 폰 프라이 시험이 지시된 날에 수행되었음을 나타낸다. (b)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 동측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여된 발)에서의 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. (c)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 반대측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여되지 않은 발)에서의 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. (d)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 래트에 대해 시간 경과에 따른 체중 변화를 보여준다.
도 5 (a)는 성체 수컷 스프라그-돌리 래트에서 급성 옥살리플라틴-유발 신경병증성 통증의 모델을 사용한 연구에 대한 실험 개략도를 제시한다. 옥살리플라틴 (10 mg/kg 복강내 (i.p.) 투여) 및 BoNT/A(0) (1000 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (50 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (100 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (160 pg/kg i.pl. 투여), 또는 비히클 (GPB i.pl. 투여 - 음성 대조군)을 제0일 (D0)에 투여하였다. 옥살리플라틴 치료에 대한 추가의 음성 대조군으로서, 래트의 하위세트에 5% 글루코스를 i.p. 및 GBP (i.pl. 투여)를 투여하였다. 둘록세틴 (100 mg/kg p.o. 투여 - 양성 대조군)을 D3에 시험하기 1시간 전에 투여하였다. 투여 후 일수 및 시간이 제시된다. PI는 발 침지 (저온) 시험이 지시된 날에 수행되었음을 나타낸다. (b)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 동측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여된 발)에서의 저온 감수성 (발 침지 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. (c)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 반대측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여되지 않은 발)에서의 저온 감수성 (발 침지 시험을 통해 측정됨)을 보여준다.
도 6 (a)는 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (180-210 g)에서 만성 옥살리플라틴-유발 신경병증성 통증의 모델을 사용한 연구에 대한 실험 개략도를 제시한다. 옥살리플라틴을 제-2일 (D-2)에 투여하였다. BoNT/A(0) (100 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (100 pg/kg i.pl. 투여), 또는 비히클 (GPB i.pl. 투여 - 음성 대조군)을 제0일에 투여하였다 (D0). 제3일에 프레가발린 (30 mg/kg p.o. 투여 - 양성 대조군). 투여 전 및 후의 일수가 제시된다. vF 및 CP는 폰 프라이 및 콜드 플레이트 시험 (각각)이 지시된 날에 수행되었음을 나타낸다. (b)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 동측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여된 발)에서의 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. (c)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대해 시간 경과에 따른 반대측 발 (즉, 대조군 조성물, BoNT/A 또는 BoNT/A(0)가 투여되지 않은 발)에서의 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. (d)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대한 시간 경과에 따른 열적 감수성 (콜드 플레이트 시험을 통해 측정됨)을 보여준다.
도 7 (a)는 성체 수컷 위스타 래트 (180-210 g)에서 급성 자외선-B (UV-B)-화상 유발 염증성 통증의 모델을 사용한 연구에 대한 실험 개략도를 제시한다. BoNT/A(0) (100 pg/kg i.pl. 투여), BoNT/A (100 pg/kg i.pl. 투여), 또는 비히클 (GPB i.pl. 투여 - 음성 대조군)을 제0일에 투여하였다 (D0). 인도메타신 (5 mg/kg p.o. 투여 - 양성 대조군)을 D3에 판독 1시간 전에 투여하였다. 래트를 제1일 (D1)에 UV-B (500 mJ/cm2)에 노출시켰다. vF는 폰 프라이 시험이 지시된 날에 수행되었음을 나타낸다. (b)는 (a)에 기재된 바와 같이 투여된 동물에 대한 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다.
도 8은 비히클, 촉매 활성 키메라 BoNT/XB (0.3 ng/kg, n=10), 촉매 활성 키메라 BoNT/XB (30 ng/kg, n=10), 촉매 불활성 키메라 BoNT/XB(0) (0.3 ng/kg, n=10), 촉매 불활성 키메라 BoNT/XB(0) (30 ng/kg, n=10), BoNT/A (160 pg/kg, n=10) 또는 인도메타신 (10 mg/kg, n=9)이 투여된 마우스에 대한 기계적 감수성 (폰 프라이 시험을 통해 측정됨)을 보여준다. 감수성은 비-처리된 동물 (기준선), BoNT 또는 비히클의 투여 2일 후 및 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 투여 전 (제0일 CFA, 제2일) 뿐만 아니라 CFA 투여 1일 후 (제1일 CFA, 제3일)에서 제시된다. **P<0.1, ***P<0.01 (반복 측정 이원 ANOVA 후의 비히클 대비 던넷 다중 비교).
도 9는 방광이 포스페이트 완충 염수 (PBS) 대조군, 또는 3 pM의: 재조합 BoNT/A (rBoNT/A); 디스포트(Dysport) (홀로톡신); 클로스트리디아로부터 단리된 비-복합체화된 BoNT/A (nBoNT/A), 촉매-활성 BoNT/A L-쇄 및 HC 도메인이 없는 전위 도메인 (LHN/A), 촉매 불활성 BoNT/A (BoNT/A(0)), 또는 촉매 불활성 BoNT/A L-쇄 (LC/A(0))로 처리된 방광 구심성 신경 발화 검정에서 구심성 방전 (정규화된 데이터의 곡선하 면적)을 보여준다. 통계적 유의성은 1-원 ANOVA에 이어서 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다: *P<0.05 대 대조군, ****P<0.0001 대 대조군, ####P<0.0001 대 임의의 다른 촉매 불활성 분자를 제외한 모든 군; $$$P<0.001 쌍별.
도 10은 제12일에 대조군 래트 (백색 막대), CYP 동물 (담회색 막대) 및 BoNT/AB(0)로 처리된 CYP 동물 (암회색 막대)에서의 침해수용성 역치 (a), 이질통 (b) 및 통각과민 (c)을 보여준다. 독립시편 스튜던트 t 검정, **p<0.001, ***p<0.0001 대 대조군 래트; ## p<0.001, ### p<0.0001 대 CYP-염수 래트.
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개시 Met 아미노산 잔기 또는 상응하는 개시 코돈이 하기 서열식별번호 중 임의의 것에 표시되는 경우에, 상기 잔기/코돈은 임의적이다.
서열식별번호: 1 - 재조합 촉매 불활성 BoNT/A (rBoNT/A(0))의 뉴클레오티드 서열
서열식별번호: 2 - rBoNT/A(0)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 3 - rLHN/A (경쇄 + 전위 도메인만)의 뉴클레오티드 서열.
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서열식별번호: 5 - rL/A의 뉴클레오티드 서열 (경쇄 단독)
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서열식별번호: 12 - rBoNT/C(0)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 48 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 49 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
서열식별번호: 50 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 51 - BoNT/A의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P10845
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서열식별번호: 53 - BoNT/C의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P18640
서열식별번호: 54 - BoNT/D의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P19321
서열식별번호: 55 - BoNT/E의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 Q00496
서열식별번호: 56 - BoNT/F의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 A7GBG3
서열식별번호: 57 - BoNT/G의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 Q60393
서열식별번호: 58 - TeNT의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P04958
서열식별번호: 59 - BoNT/X의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 60 - 비변형된 BoNT/A1의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 61 - mrBoNT/AB(0)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 63 - BoNT/XB(0) (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 64 - BoNT/XB(0)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 65 - BoNT/XB(0) 변이체 (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 66 - BoNT/XB(0) 변이체의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 67 - BoNT/XA(0)의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 68 - BoNT/XA(0) 변이체의 폴리펩티드 서열
서열식별번호: 69 - BoNT/XD(0)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 71 - C1 활성화 루프 컨센서스 서열
서열식별번호: 72 - C1 활성화 루프
서열식별번호: 73 - C1 활성화 루프 변이체
서열식별번호: 74 - rLC/A(0) (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 77 - 프리시전 프로테아제 부위
서열식별번호: 78 - C1 활성화 루프 변이체 2
서열식별번호: 1 - rBoNT/A(0)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00006
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서열식별번호: 3 - rLHN/A의 뉴클레오티드 서열
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서열식별번호: 5 - rL/A의 뉴클레오티드 서열
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서열식별번호: 30 - rHC/FA (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 36 - rLHN/F (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 38 - rHC/F (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 39 - rLC/F (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00044
서열식별번호: 40 - rLC/F (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00045
서열식별번호: 41 - 양이온성 rHC/A (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00046
서열식별번호: 42 - 양이온성 rHC/A (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
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서열식별번호: 43 - rHC/AB (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
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서열식별번호: 44 - rHC/AB (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00049
서열식별번호: 45 - rHC/A 변이체 Y1117V H1253K (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00050
서열식별번호: 46 - rHC/A 변이체 Y1117V H1253K (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00051
서열식별번호: 47 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00052
서열식별번호: 48 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00053
서열식별번호: 49 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (His-태그부착됨)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00054
서열식별번호: 50 - rHC/A 변이체 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00055
서열식별번호: 51 - BoNT/A의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P10845
Figure pct00056
서열식별번호: 52 - BoNT/B의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P10844
Figure pct00057
서열식별번호: 53 - BoNT/C의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P18640
Figure pct00058
서열식별번호: 54 - BoNT/D의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P19321
Figure pct00059
서열식별번호: 55 - BoNT/E의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 Q00496
Figure pct00060
서열식별번호: 56 - BoNT/F의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 A7GBG3
Figure pct00061
서열식별번호: 57 - BoNT/G의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 Q60393
Figure pct00062
서열식별번호: 58 - TeNT의 폴리펩티드 서열 - 유니프롯 P04958
Figure pct00063
서열식별번호: 59 - BoNT/X의 폴리펩티드 서열
Figure pct00064
서열식별번호: 60 - 비변형된 BoNT/A1의 폴리펩티드 서열
Figure pct00065
서열식별번호: 61 - mrBoNT/AB(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00066
서열식별번호: 62 - mrBoNT/A(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00067
서열식별번호: 63 - BoNT/XB(0) (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00068
서열식별번호: 64 - BoNT/XB(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00069
서열식별번호: 65 - BoNT/XB(0) 변이체 (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00070
서열식별번호: 66 - BoNT/XB(0) 변이체의 폴리펩티드 서열
Figure pct00071
서열식별번호: 67 - BoNT/XA(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00072
서열식별번호: 68 - BoNT/XA(0) 변이체의 폴리펩티드 서열
Figure pct00073
서열식별번호: 69 - BoNT/XD(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00074
서열식별번호: 70 - BoNT/XF(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00075
서열식별번호: 71 - C1 활성화 루프 컨센서스 서열
Figure pct00076
서열식별번호: 72 - C1 활성화 루프
Figure pct00077
서열식별번호: 73 - C1 활성화 루프 변이체
Figure pct00078
서열식별번호: 74 - rLC/A(0) (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00079
서열식별번호: 75 - rLHN/A(0) (His-태그부착됨)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00080
서열식별번호: 76 - rLC/X(0)의 폴리펩티드 서열
Figure pct00081
서열식별번호: 77 - 프리시전 프로테아제 부위
Figure pct00082
서열식별번호: 78 - C1 활성화 루프 변이체 2
Figure pct00083
실시예
실시예 1
BoNT/A(0)는 시험관내 및 생체내에서 촉매 불활성이다
BoNT/A(0) (서열식별번호: 2)의 촉매 활성을 BoNT/A 표적 SNARE 단백질인 SNAP25의 절단을 측정하는 시험관내 세포-기반 모델에서 시험하였다. 도 1은 야생형 BoNT/A (서열식별번호: 60)와 대조적으로, BoNT/A(0)가 인간 뉴런 검정에서 SNAP25를 절단하지 않는다는 것을 보여준다. 도 2는 래트 뉴런 검정에서의 이러한 결과를 확인한다.
확인을 위해, 생체내 DAS 검정을 BoNT/A 및 BoNT/A(0)를 사용하여 수행하였다. DAS 검정을 젤라틴 포스페이트 완충제 중에 제제화된 클로스트리디움 신경독소 20 μl를 마우스 비복근/가자미근 복합체 내로 주사하고, 이어서 아오키(Aoki)의 방법 (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)을 사용하여 발가락 외전 점수를 평가함으로써 수행하였다. DAS 검정에서, 마우스가 그의 뒷다리를 뻗고 그의 뒷발가락을 외전시키는 특징적인 놀람 반응을 도출하기 위해 마우스를 꼬리로 잠시 매달았다 (도 3a). 클로스트리디움 독소 주사 후, 다양한 정도의 발가락 외전을 5-점 척도로 점수화하였다 (0=정상 내지 4=발가락 외전의 최대 감소- 도 3b). 이는 신경근 접합부에서의 신경독소의 활성에 의해 유발된 마비의 기능성 척도를 제공한다. 또한, 투여 7일 이내에 마우스에서 체중 변화를 평가하였다. 이는 독성 및 투여 부위로부터의 독소 확산의 바람직하지 않은 효과의 척도를 제공한다. 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.
표 1. BoNT/A(0) 또는 BoNT/A의 투여 후 DAS 점수 (24시간 후) 및 체중 변화.
Figure pct00084
결과는 BoNT/A(0)가 생체내에서 촉매 불활성이고 독성의 어떠한 증상도 유발하지 않는다는 것을 확인한다. 따라서, BoNT/A(0)는 안전하고, 실질적으로 비-독성인 치료제이다.
실시예 2
촉매 불활성 BoNT를 사용한 만성 신경병증성 통증 (만성 협착 손상 (CCI) 래트 모델)의 치료
물질 & 방법
만성 협착 손상 (CCI)을 문헌 [Bennett and Xie (1988), Pain, 33(1):87-107]에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제-14일에, 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (220-250 g)를 마취시킨 후, 좌측 좌골 신경의 절편을 노출시키고, 실크 봉합사로 신경 상에 4개의 느슨한 결찰을 배치하였다. 제0일 (D0)에 래트에 BoNT/A (30 pg/kg), BoNT/A (60 pg/kg), BoNT/A(0) (60 pg/kg) 또는 비히클 (GPB) 중 어느 하나를 족저내 (i.pl.) 경로를 통해 투여한 반면 (n=10-11/군), 양성 대조군, 가바펜틴 (100 mg/kg)을 경구 (p.o.) 경로를 통해 투여하였다 (n=8/군). 가바펜틴으로 처리된 동물을 처리 1, 2 및 4시간 후에 시험하였다. BoNT/A, BoNT/A(0) 또는 비히클-처리된 동물을 제3일, 제5일 및 제9일에 시험하였다. 동물을 폰 프라이 시험에서 기계적 감수성에 대해 평가하였다.
결과
실험은 촉매 불활성 BoNT (BoNT/A(0))를 투여함으로써, 동측 발에서의 기계적 감수성이 감소되었음을 보여주었다 (도 4b). 또한, BoNT/A(0)는 동등하게 투여된 BoNT/A와 비교할 때 기계적 감수성을 감소시키는 데 보다 효과적이었다. 이후 시점에, BoNT/A(0)는 또한 가바펜틴보다 더 효과적이었다. 감소된 감수성이 BoNT/A(0) 투여의 결과임을 확인하기 위해, 반대측 발의 기계적 감수성을 또한 시험하였다. 결과는 조건 간에 반대측 발의 기계적 감수성의 차이가 유의하지 않았음을 보여주었다 (도 4c). 또한, BoNT/A(0)의 실질적인 비-독성의 확인으로서, 시간 경과에 따른 체중 변화는 비히클 또는 가바펜틴이 투여된 래트의 것과 동등하였다 (도 4d). 이는 촉매 활성 BoNT/A가 투여된 래트에서 관찰된 변화와 대조적이며, 이는 제9일에 통계적으로 유의하게 상이하였다.
결론적으로, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소는 놀랍게도 통증 (예를 들어 만성 신경병증성 통증)을 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 이러한 신경독소가 적합한 통증 치료제임을 시사한다.
실시예 3
촉매 불활성 BoNT를 사용한 급성 신경병증성 통증 (옥살리플라틴 래트 모델)의 치료
물질 & 방법
옥살리플라틴-유발 말초 감각 신경병증의 실험 모델을 옥살리플라틴의 복강내 주사에 의해 유도하였다 (Ling et al. (2007), Pain, 128(3):225-234; Ling et al. (2007), Toxicology, 20;234(3):176-84). 제0일에, 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (100-133 g)에 모의-처리 (5% 글루코스) 또는 옥살리플라틴 (10 mg/kg)의 i.p. 주사를 제공하였다. 직후에, 모의-처리된 동물은 비히클의 i.pl. 주사를 제공받은 반면, 옥살리플라틴-처리된 동물은 BoNT/A(0) (1000 pg/kg), BoNT/A (50 pg/kg), BoNT/A (100 pg/kg), BoNT/A (160 pg/kg) 또는 비히클 (GPB; n=10/군)의 i.pl. 주사를 제공받았다. D3에 양성 대조군인 둘록세틴 (100 mg/kg)을 p.o. 경로를 통해 제공하였다. 동물을 D3 및 D5에 열적 (저온) 감수성에 대해 평가하였다.
결과
실험은 촉매 불활성 BoNT (BoNT/A(0))를 투여함으로써, 동측 발에서의 저온 감수성이 감소되었음을 보여주었다 (도 5b). BoNT/A, BoNT/A(0) 또는 비히클로 처리된 군에 걸쳐 반대측 발의 열적 감수성에서 어떠한 차이도 없었다 (도 5c).
결론적으로, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소는 놀랍게도 급성 신경병증성 통증을 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 이러한 신경독소가 통증의 치료에 일반적으로 적용된다는 것을 시사한다.
실시예 4
촉매 불활성 BoNT를 사용한 만성 신경병증성 통증 (옥살리플라틴 래트 모델)의 치료
물질 & 방법
제-2일 (D-2)에 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (180 - 210 g)에 옥살리플라틴 (10 mg/kg)의 i.p. 주사를 제공한 후, 제0일에 i.pl. 경로를 통해 BoNT/A (100 pg/kg), BoNT/A(0) (100 pg/kg) 또는 비히클 (GPB)로 처리하였다 (n=11-12/군). 양성 대조군인 프레가발린을 D3에 투여하였다 (n=12). 동물을 제3일, 제6일 및 제9일에 기계적 감수성 (폰 프라이 시험) 및 열적 (저온) 감수성 (콜드 플레이트 시험)에 대해 시험하였다.
결과
실험은 촉매 불활성 BoNT (BoNT/A(0))를 투여함으로써, 동측 발에서의 기계적 감수성 (도 6b) 및 저온 감수성 (도 6d)이 감소되었음을 보여주었다.
결론적으로, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소는 놀랍게도 상이한 화학요법-유발 통증 모델에서 만성 신경병증성 통증을 감소시킬 수 있다.
실시예 5
촉매 불활성 BoNT를 사용한 염증성 통증 (UV-B 화상 래트 모델)의 치료
물질 & 방법
인간에서 뿐만 아니라 설치류 모델에서 자외선 (UV)-B 방사선은 기계적 및 열적 통각과민 둘 다를 유발한다. 성체 수컷 위스타 래트 (180-210 g)에 BoNT/A (100 pg/kg), BoNT/A(0) (100 pg/kg) 또는 비히클 (GPB; n=12/군)을 i.pl. 주사에 의해 투여하였다. 24시간 후, 동측 발의 발바닥 표면을 대략 5분 동안 자외선-B (UVB) 조사에 노출시켰으며, 500 mJ/cm2의 선량을 제공하였다. UVB 48시간 후 및 BoNT/A, BoNT/A(0) 또는 비히클 주사 72시간 후, 동물을 폰 프라이 시험에서 기계적 감수성에 대해 시험하였다. UVB-노출된 동물의 추가의 군에 양성 대조군, 인도메타신을 48시간 후에 주사하고, 주사 1시간 후에 폰 프라이 시험에서 시험하였다 (n=12/군).
결과
실험은 촉매 불활성 BoNT (BoNT/A(0))를 투여함으로써, 기계적 감수성이 감소되었음을 보여주었다 (도 7b). 결론적으로, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소는 놀랍게도 염증성 통증 (예를 들어 급성 염증성 통증)을 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 이러한 신경독소가 통증의 치료에 일반적으로 적용된다는 것을 확인한다.
촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소가 염증성 통증을 감소시켰다는 놀라운 발견은 그것이 기저 염증성 상태를 치료하는 데 (예를 들어 염증성 상태의 적어도 하나의 증상, 즉 연관된 통증을 치료하는 것을 포함함) 유용하다는 것을 나타냈다. 따라서, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소가 염증성 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다는 것은 신뢰할 만한 것으로 간주되었다.
실시예 6
촉매 불활성 키메라 BoNT를 사용한 염증성 통증 (CFA-유발 염증성 통증 모델)의 치료
물질 & 방법
BoNT 또는 비히클 투여 전에, 70마리의 성체 수컷 C57/BL6 마우스 (22-26 g)의 발 회피 역치 (PWT, g)를 증가하는 힘의 눈금 폰 프라이 필라멘트를 사용하여 연속 3일에 걸쳐 평가하였다. 마지막 2일의 평균을 기준선으로서 간주하였다. 제0일에, 기체 마취 하에, BoNT/XB (0.3 및 30 ng/kg), BoNT/XB(0) (0.3 및 30 ng/kg), BoNT/A (160 pg/kg) 또는 비히클 (840 μl/kg)을 좌측 뒷발의 족저내 발바닥 내로 주사하였다 (n=10/군). 제2일에, CFA 주사 전에, PWT를 재평가하였다. 이어서, 이소플루란 마취 하에, 고정된 20 μL 부피의 CFA (1.5 mg/mL)를 동일한 뒷발에 주사하였다. 제3일 (CFA 후 제1일), PWT 평가 1시간 전에, 인도메타신 군에 할당된 동물에게 인도메타신 (10 mg/kg, n=9)을 경구로 투여하였다.
결과
실험은 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄 및 전위 도메인 (BoNT/X LHN) 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 BoNT/X (HC 도메인)를 포함하는 촉매 불활성 키메라 BoNT (BoNT/XB(0))가 염증성 통증을 치료하는 데 효과적이었음을 보여주었다. 보다 상세하게, 도 8은 염증성 통증의 CFA-유발 후의 기계적 감수성이 30 ng/kg의 용량으로 촉매 활성 BoNT/XB 및 촉매 불활성 BoNT/XB(0)를 투여받은 마우스에서 감소되었음을 보여준다. 감수성의 감소는 BoNT/A 또는 양성 대조군 인도메타신의 것과 동등하였다.
BoNT/XB(0)가 염증성 통증을 감소시켰다는 놀라운 발견은 그것이 기저 염증성 상태를 치료하는 데 (예를 들어 염증성 상태의 적어도 하나의 증상, 즉 연관된 통증을 치료하는 것을 포함함) 유용하다는 것을 나타냈다. 따라서, 이는 염증성 상태를 치료하는 데 사용하기 위한 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소의 신뢰성에 대한 추가의 증거로 간주되었다.
실시예 7
촉매 불활성 키메라 BoNT를 사용한 아토피성 피부염의 치료
비히클 또는 BoNT/XB(0) (40 pg/마우스, 100 pg/마우스 또는 400 pg/마우스)를 칼시포트리올에의 노출 1일 전에 성체 C57/BL6 마우스의 등의 내측 부분에 피하로 투여하였다. 이어서, 마우스를 연속 5일에 걸쳐 칼시포트리올로 처리하였다. 연구 종료시, 동물을 안락사시키고, 등의 피부를 수집하고, 고정시키고, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 후, 표피 두께를 평가하였다. 면역표지를 수행하여 CD45+ 세포를 입증하였다.
실험은 촉매 불활성 BoNT/X L-쇄 및 전위 도메인 (BoNT/X LHN) 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 촉매 불활성 키메라 BoNT (BoNT/XB(0))가 아토피성 피부염, 모델 염증성 상태를 치료하는 데 효과적이라는 것을 보여주었다. 결과는 BoNT/XB(0)의 투여 후 진피 두께의 개선을 보여주었다. 진피 두께는 칼시포트리올에 대한 염증 반응인 섬유증의 지표이며, BoNT/XB(0) 처리된 동물에서 통계적으로 유의하게 감소된 것으로 나타났다. 또한, BoNT/XB(0)의 항염증 효과는 BoNT/XB(0) 처리된 동물에서 CD45-양성 세포의 수의 감소에 의해 확인된다 (CD45는 염증 세포에서 활성화 신호를 전달함).
따라서, BoNT/XB(0)는 항염증 특성을 가지며, 이에 따라 염증성 장애를 치료하는 데 있어서 유용한 것으로 결론지어진다.
실시예 8
마우스 생체외 모델에서 방광 통증 & 하부 요로 장애의 치료
물질 & 방법 (마우스 방광 신경 검정)
마우스를 인도적으로 도태시킨 후, 마우스의 전체 골반 영역을 절개하고, 완충제 용액을 지속적으로 관류하고, 카보젠으로 가스처리하고, 35℃에서 유지시킨 기관 조에 넣었다. 요관을 봉합사로 묶고, 요도 및 방광의 돔에 카테터삽입하고, 봉합사로 묶었다. 요도 카테터를 주입 펌프에 부착하여 방광을 채우도록 하는 한편, 돔 카테터에 부착된 탭을 사용하여 유체를 배출하도록 하였다. 방광으로부터 나오는 골반 및 위하 신경 섬유를 절개하고, 절단하고, 흡입 유리 전극에 삽입하여, 휴식 및 자극 (팽창을 유도하기 위한 방광 채움) 조건에서 신경 활성 (구심성 방전)을 기록하도록 하였다. 방광내 압력을 0에서 50 mm의 수은 (Hg)으로 천천히 증가시키고, 상응하는 신경 활성을 기록하였다. 압력-반응 곡선을 대조군 (PBS - 포스페이트 완충 염수) 및 모든 폴리펩티드 (재조합 BoNT/A (rBoNT/A); 디스포트 (홀로톡신); 클로스트리디아로부터 단리된 비-복합체화된 BoNT/A [nBoNT/A], 촉매 활성 BoNT/A L-쇄 및 HC 도메인이 없는 전위 도메인 [LHN/A], 촉매 불활성 BoNT/A [BoNT/A(0)], 또는 촉매 불활성 BoNT/A L-쇄 [LC/A(0)])에 대해 3 pM으로 플롯팅하고, 곡선하 면적 (AUC)을 계산하였다. 각각의 조건에 대해 4 내지 9개의 방광을 시험하였다. 일원 ANOVA에 이어 터키 다중 비교 검정을 사용하여 AUC를 통계적으로 비교하였다.
결과
대조군 (PBS)과 비교하여, 촉매 활성 BoNT/A (재조합, 천연, 복합체화) 및 LHN/A는 구심성 신경의 활성을 유의하게 억제할 수 있었다. BoNT/A의 촉매 불활성 형태 (BoNT/A(0)) 및 그의 경쇄 (LC/A(0))는 시험된 촉매 활성 분자와 비교하여 방광 구심성 신경의 신장-유발 발화를 억제하는 데 있어서 훨씬 더 큰 효과를 나타냈다. 또한, 전장 BoNT/A(0)는 경쇄 단독보다 유의하게 더 효과적이었다.
마우스 방광 구심성 신경 검정은 방광 팽창 동안 구심성 신경 발화 및 방광내 압력의 측정을 가능하게 한다. 방광 구심성 신경은 통증을 포함한 방광 감각을 전달하고, 방광 내의 증가된 압력에 의해 자극된다. 사용된 50 mm의 수은 (Hg)은 극도로 고통스러운 자극에 상응한다. 이들 데이터는 LHN/A가, 그리고 훨씬 더 큰 정도로, 촉매 불활성 BoNT/A (BoNT/A(0)) 및 경쇄 단독 (LC/A(0))이 방광 통증을 치료하는 데 유용하다는 것을 보여준다.
구심성 신경은 다른 하부 요로 장애, 예컨대 과민성 방광 (OAB), 방광 통증 증후군, 간질성 방광염 및 배뇨근 과다활동 (예를 들어 신경원성 배뇨근 과다활동 - NDO)에 관여한다. 구심성 신경은 상기 장애를 앓고 있는 대상체가 경험하는 절박의 감각 증상과 연관된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 상기 장애는 구심성 과민증, 다르게는 구심성 충동에 대한 변경된 중심 역치와 연관될 수 있다. 예를 들어, 후자는 OAB/NDO의 병리생리학을 설명할 수 있고, 특히 NDO에서 가능성이 있을 수 있는 중추 억제 경로에 대한 손상 또는 구심성 신경의 감작을 수반할 수 있다. 이 경우에, 신경영양 인자, 예컨대 신경 성장 인자 (NGF) 또는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 수준이 증가되고 감각 뉴런에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 또한 배뇨 반사의 활성화를 유발한다. 또한, 중추 경로 손상과 관련하여, 기능적 자기 공명 영상화 (MRI)는, OAB 환자에서 PAG (수도관주위 회색질, 배뇨의 제어에 관여하는 중심 구조 중 하나)에 연결된 영역인 도역에서의 신호전달이 비간섭성 발화 역치로 변경되어, 절박을 초래할 수 있다는 것을 제시하였다. 따라서, 방광 구심성 신경 활성을 감소시키는 것이 이들 장애 각각을 치료할 것이라는 것은 신뢰할 만하다.
실시예 9
래트 생체내 모델에서 방광 통증 & 하부 요로 장애의 치료
물질 & 방법
동물 모델
간질성 방광염 (IC)/방광 통증 증후군 (BPS)의 만성 래트 모델은 래트를 시클로포스파미드 (CYP)로 처리하는 것에 기초하여 개발되었다. 만성 방광염을 유도하기 위해, 제0일 (D0), D3 및 D6에, 래트를 칭량하고, 5 mL/kg의 최종 부피로 40 mg/kg의 용량으로 CYP의 복강내 (i.p.) 주사를 수행하였다. CYP를 염수 중에서 8 mg/mL의 최종 농도로 새로 제조하였다. 대조군 래트는 CYP와 동일한 실험 조건 하에 생리 염수를 제공받았다. 심각한 체중 감소는 발생하지 않았다. 이 모델은 이질통 (정상적으로는 무해한 자극에 대한 통증성 반응) 및 통각과민 (유해 자극에 대한 증가된 반응) 둘 다를 특징으로 하는 장기-지속성 내장통을 나타낸다.
폰 프라이 검정
내장통을 폰 프라이 검정을 사용하여 평가하였다 (문헌 [Deuis JR, Dvorakova LS, Vetter I. Methods Used to Evaluate Pain Behaviors in Rodents. Front Mol Neurosci. 2017;10:284. Published 2017 Sep 6. doi:10.3389/fnmol.2017.00284 및/또는 Minett MS, Eijkelkamp N, Wood JN. Significant determinants of mouse pain behavior [published correction appears in PLoS One. 2021 Jan 15;16(1):e0245813]. PLoS One. 2014;9(8):e104458. Published 2014 Aug 7. doi:10.1371/journal.pone.0104458] 참조). 모든 동물의 단일-실험자 시험을 포함한 표준화된 조건을 적용하여 변동성 거동-기반 통증 시험을 최소화하였다. 방광에 근접한 하복부에 증가하는 힘 (1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 및 26 g)의 8개의 보정된 폰 프라이 필라멘트의 세트를 5초의 자극간 간격으로 적용함으로써 맹검 방식으로 내장통을 평가하였다. 시험 전에, 각각의 동물의 기계적 자극을 위해 설계된 복부 영역을 면도하였다. 동물을 개별 투명 플렉시글라스(Plexiglas) 박스 아래의 들어올려진 와이어 메쉬 바닥에 놓고, 폰 프라이 시험을 시작하기 전에 적어도 30분 동안 순응시켰다. 이어서, 필라멘트를 필라멘트가 약간 구부러지도록 하기에 충분한 강도로 메쉬 바닥을 통해 1-2초 동안 적용하였다. 각각의 필라멘트를 3회 시험하였다. 탈감작을 피하기 위해 방광 부근의 하부 복부 영역 내의 상이한 영역을 자극하도록 주의하였다.
침해수용성 거동을 하기 제시된 바와 같이 각각의 동물 및 각각의 필라멘트에 대해 점수화하였다:
Figure pct00085
내장통
침해수용성 파라미터의 정의는 하기에 제공된다:
* 예를 들어, 주어진 폰 프라이 힘에서, 제1 적용에서 1, 제2 적용에서 1 및 제3 적용에서 2의 점수를 갖는 동물에 대해, 그의 점수의 합계는 4이다. 풀링된 최대 점수는 9 (3 + 3 + 3)이고, 풀링된 점수 4는 최대 반응의 44% (100 x 4/9)이다.
프로토콜 설계
하기 프로토콜을 수행하여 CYP-유발 IC/BPS의 만성 래트 모델에 대한 촉매 불활성 BoNT/A L-쇄 및 전위 도메인 (BoNT/A(0) LHN) 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 촉매 불활성 키메라 BoNT (BoNT/AB(0))의 효과를 평가하였다.
· D-1에, 새로운 환경으로 인한 스트레스의 수준을 감소시키기 위해, 래트를 최소 30분 동안 개별 플렉시글라스 박스 (폰 프라이 셋업) 및 폰 프라이 필라멘트의 적용에 순응시켰다.
· D0에, CYP 또는 염수를 처음 주사하기 전에, 침해수용성 거동에 대한 기초 값을 수득하기 위해 폰 프라이 시험을 수행하였다.
· D0, D3 및 D6에, 만성 방광염을 유도하여 IC/BPS를 모방하였다.
· D7 (처리 시작 전)에, 폰 프라이 시험을 수행하여 만성 방광염 유도를 평가하였다.
· D8에, BoNT/AB(0) 또는 염수 (대조군)를 방광에 투여함으로써 처리를 수행하였다.
· D10 및 D12에, 폰 프라이 시험을 수행하여 CYP-유발 만성 내장통에 대한 시험 (BoNT/AB(0)) 또는 염수의 효과를 분석하였다.
약리학적 처리
실험 전에, 동물을 처리군에 무작위로 배정하였다. 무작위화는 각각의 실험일에 각각의 군의 적어도 1마리의 동물을 갖고 동일한 군의 동물에 대해 폰 프라이 챔버에서 상이한 위치를 할당하도록 설계되었다.
결과
CYP의 효과는 보다 낮은 침해수용성 역치 및 이질통 (증가된 AUC 1-6 g) 및 통각과민 (즉, 증가된 AUC 6-26 g)과 연관된 증가된 침해수용성 점수를 특징으로 하였다. BoNT/AB(0) (300 pg/래트)를 사용한 처리는 염수-처리된 CYP 동물에 비해 처리 후 2 및 4일에 상응하는 D10 및 D12에 증가된 침해수용성 역치뿐만 아니라, D10 및 D12에 감소된 이질통 및 통각과민 AUC에서 나타난 바와 같이 내장통을 유의하게 감소시켰다.
이들 데이터는 촉매 불활성 BoNT/A L-쇄 및 전위 도메인 (BoNT/A(0) LHN) 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 촉매 불활성 키메라 BoNT (BoNT/AB(0))가 IC/BPS 생체내 모델에서 방광 통증을 치료하는 데 효과적이었음을 보여준다. 이는 실시예 8의 생체외 마우스 모델에서 구심성 신경 발화를 감소시키는 데 있어서의 BoNT/A(0)의 역할과 일치한다. 따라서, 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소는 방광 통증, 뿐만 아니라 임의의 하부 요로 장애, 예를 들어 통증 및/또는 구심성 신경이 수반되는 것 (예를 들어 과민성 방광 (OAB), 방광 통증 증후군, 간질성 방광염, 및 배뇨근 과다활동)을 치료하는 데 유용한 것으로 결론지어진다.
조항:
1. 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
2. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
3. 통증 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
4. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 통증을 치료하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
5. 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
6. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
7. 염증성 장애 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
8. 조항 5 내지 7 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 염증성 상태를 치료하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
9. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 추가의 촉매 활성 도메인을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
10. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및/또는 HC 도메인에 부가적인 치료제 또는 진단제 (예를 들어, 공유 또는 비-공유 회합된 치료제 또는 진단제)를 포함하지 않는 것인, 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
11. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 추가의 치료제 또는 진단제와 함께 (예를 들어 순차적으로 또는 후속적으로) 투여되지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
12. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
13. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및 HC 도메인을 포함하며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
14. 조항 1 내지 12 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
15. 조항 1 내지 12 및 14 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
16. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
17. 조항 1 내지 12 및 14 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하거나 또는 그로 이루어진 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
18. 조항 1 내지 12, 15 및 17 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
19. 조항 1 내지 14, 16 및 17 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
20. 조항 1 내지 12, 14, 15, 17 또는 18 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 HN 도메인 및 HC 도메인 둘 다를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
21. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 비-클로스트리디움 촉매 도메인을 추가로 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
22. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 만성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
23. 조항 1 내지 21 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 급성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
24. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 염증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
25. 조항 24에 있어서, 염증성 통증이 일광화상, UV-유발 손상, 관절염성 장애, 자가면역 질환, 결합 조직 장애, 손상, 감염, 신경염, 관절 염증 또는 두통 (바람직하게는 근육/근원성 두통, 혈관성 두통, 고혈압 두통, 호르몬 두통, 반동성 두통, 만성 부비동염 두통, 기질성 두통 또는 발작성 두통)에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
26. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 신경병증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
27. 조항 26에 있어서, 신경병증성 통증이 신경통, 구심로차단, 복합 부위 통증 증후군 (CRPS) 또는 신경병증 (예를 들어 중추 또는 말초 신경병증)인 (또는 그에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인) 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
28. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 혼합 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
29. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 이질통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
30. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 내장통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
31. 조항 30에 있어서, 내장통이 기능성 내장통, 만성 위장 염증, 자가면역 통증, 기질성 내장통 또는 치료-유발 내장통인 (또는 그에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인) 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
32. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 두통 통증 (예를 들어 편두통)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
33. 조항 32에 있어서, 통증이 편두통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
34. 조항 32에 있어서, 두통 통증이 근육/근원성 두통, 혈관성 두통, 고혈압 두통, 호르몬 두통, 반동성 두통, 만성 부비동염 두통, 기질성 두통 또는 발작성 두통에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
35. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 수술후 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
36. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 연관통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
37. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 체성통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
38. 조항 37에 있어서, 통증이 과도한 근육 긴장, 반복 운동 장애, 근육 장애, 근육통, 감염 또는 약물에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 체성통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
39. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 방광 통증 증후군이고, 바람직하게는 방광 통증이 간질성 방광염에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
40. 조항 1 내지 23 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 환상지통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
41. 조항 5 내지 21 중 어느 한 조항에 있어서, 염증성 장애가 방광염, 자궁내막증, 류마티스 관절염, 복합 부위 통증 증후군 및 신경염으로부터 선택된 하나 이상인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
42. 조항 41에 있어서, 방광염이 간질성 방광염인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
43. 조항 41에 있어서, 신경염이 말초 신경염인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
44. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 250 μg 초과인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
45. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251 μg 내지 10 g인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
46. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251 μg 내지 1 g인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
47. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251-1000 μg인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
48. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 반복적으로 (예를 들어 통증 치료 요법의 일부로서) 투여되는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
49. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 피내로 투여되는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
50. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
51. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
52. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
53. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
54. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/A인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
55. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 변형된 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 키메라 클로스트리디움 신경독소 또는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소이고, 바람직하게는 폴리펩티드가 천연 클로스트리디움 신경독소 H-쇄를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
56. 조항 1 내지 53 및 55 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
57. 조항 1 내지 53, 55 및 56 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 비-클로스트리디움 표적화 모이어티 (TM)를 포함하는 재표적화된 클로스트리디움 신경독소인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
58. 조항 1 내지 53, 55 및 56 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HC 도메인이 결여되어 있고, 또한 임의의 기능적으로 동등한 외인성 리간드 표적화 모이어티 (TM)가 결여되어 있는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
59. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 대상체의 세포에서 발현되지 않고, 예를 들어 용도 또는 방법이 대상체의 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
60. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
61. 조항 60에 있어서, 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열(들)이 세포 수용체에 결합하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
62. 조항 60 또는 61에 있어서, 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열(들)이 세포 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
63. 조항 1 내지 53, 55 및 59 내지 62 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/A 경쇄 및 전위 도메인, 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
64. 조항 1 내지 55 및 59 내지 62 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 및 THR 1277로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 변형을 포함하는 변형된 BoNT/A HC 도메인을 포함하며, 여기서 변형은
i. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
ii. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 비하전된 아미노산 잔기로의 치환;
iii. 비하전된 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
iv. 염기성 아미노산 잔기의 삽입; 및
v. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 결실
로부터 선택된 것인
폴리펩티드, 방법 또는 용도.
65. 조항 1 내지 53 및 55 내지 62 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 보툴리눔 신경독소 혈청형 X (BoNT/X) L-쇄, BoNT/X HN 도메인, 및/또는 BoNT/X HC 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
66. 조항 1 내지 53, 59 내지 62 및 65 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
67. 조항 1 내지 53, 59 내지 62, 65 및 66 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
68. 조항 65 내지 67 중 어느 한 조항에 있어서, 통증이 염증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
69. 선행 조항 중 어느 한 조항에 있어서, 폴리펩티드가 Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys (서열식별번호: 71)를 포함하며, 여기서 a = 1-10이고, b = 4-15인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 기재된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 구체적 실시양태로 과도하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 및 생명공학 또는 관련 분야의 기술자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> IPSEN BIOPHARM LIMITED <120> TREATMENT OF PAIN & INFLAMMATORY DISORDERS <130> P68298WO-01 <150> PCT/GB2021/050783 <151> 2021-03-30 <150> TW110111559 <151> 2021-03-30 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of rBoNT/A(0) <400> 1 atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60 tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120 aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180 ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240 gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300 acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360 agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420 gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480 atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540 ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600 gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660 ctggcccatc aactgatcta cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720 cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780 gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840 gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900 aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960 tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020 ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080 ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140 aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200 tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260 ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320 agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380 gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440 atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500 cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560 agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620 aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680 cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740 cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800 gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860 gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920 ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980 gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040 ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100 aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160 gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220 gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280 aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340 atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400 attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460 aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520 gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580 cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640 ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700 ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760 tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820 ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880 gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940 ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000 tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060 aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120 attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180 cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240 gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300 tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360 aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420 ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480 atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540 tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600 ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660 gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720 gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780 ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840 agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888 <210> 2 <211> 1296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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ctttggtcac gaagttctga acctcacccg taacggctac 540 ggttccactc agtacatccg tttctctccg gacttcacct tcggttttga agaatccctg 600 gaagtagaca cgaacccact gctgggcgct ggtaaattcg caactgatcc tgcggttacc 660 ctggctcacg aactgattca tgcaggccac cgcctgtacg gtatcgccat caatccgaac 720 cgtgtcttca aagttaacac caacgcgtat tacgagatgt ccggtctgga agttagcttc 780 gaagaactgc gtacttttgg cggtcacgac gctaaattca tcgactctct gcaagaaaac 840 gagttccgtc tgtactacta taacaagttc aaagatatcg catccaccct gaacaaagcg 900 aaatccatcg tgggtaccac tgcttctctc cagtacatga agaacgtttt taaagaaaaa 960 tacctgctca gcgaagacac ctccggcaaa ttctctgtag acaagttgaa attcgataaa 1020 ctttacaaaa tgctgactga aatttacacc gaagacaact tcgttaagtt ctttaaagtt 1080 ctgaaccgca aaacctatct gaacttcgac aaggcagtat tcaaaatcaa catcgtgccg 1140 aaagttaact acactatcta cgatggtttc aacctgcgta acaccaacct ggctgctaat 1200 tttaacggcc agaacacgga aatcaacaac atgaacttca caaaactgaa aaacttcact 1260 ggtctgttcg agttttacaa gctgctgtgc gtcgacggca tcattacctc caaaactaaa 1320 tctgacgatg acgataaaaa caaagcgctg aacctgcagt gtatcaaggt taacaactgg 1380 gatttattct tcagcccgag tgaagacaac ttcaccaacg acctgaacaa aggtgaagaa 1440 atcacctcag atactaacat cgaagcagcc gaagaaaaca tctcgctgga cctgatccag 1500 cagtactacc tgacctttaa tttcgacaac gagccggaaa acatttctat cgaaaacctg 1560 agctctgata tcatcggcca gctggaactg atgccgaaca tcgaacgttt cccaaacggt 1620 aaaaagtacg agctggacaa atataccatg ttccactacc tgcgcgcgca ggaatttgaa 1680 cacggcaaat cccgtatcgc actgactaac tccgttaacg aagctctgct caacccgtcc 1740 cgtgtataca ccttcttctc tagcgactac gtgaaaaagg tcaacaaagc gactgaagct 1800 gcaatgttct tgggttgggt tgaacagctt gtttatgatt ttaccgacga gacgtccgaa 1860 gtatctacta ccgacaaaat tgcggatatc actatcatca tcccgtacat cggtccggct 1920 ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gacttcgttg gcgcactgat cttctccggt 1980 gcggtgatcc tgctggagtt catcccggaa atcgccatcc cggtactggg cacctttgct 2040 ctggtttctt acattgcaaa caaggttctg actgtacaaa ccatcgacaa cgcgctgagc 2100 aaacgtaacg aaaaatggga tgaagtttac aaatatatcg tgaccaactg gctggctaag 2160 gttaatactc agatcgacct catccgcaaa aaaatgaaag aagcactgga aaaccaggcg 2220 gaagctacca aggcaatcat taactaccag tacaaccagt acaccgagga agaaaaaaac 2280 aacatcaact tcaacatcga cgatctgtcc tctaaactga acgaatccat caacaaagct 2340 atgatcaaca tcaacaagtt cctgaaccag tgctctgtaa gctatctgat gaactccatg 2400 atcccgtacg gtgttaaacg tctggaggac ttcgatgcgt ctctgaaaga cgccctgctg 2460 aaatacattt acgacaaccg tggcactctg atcggtcagg ttgatcgtct gaaggacaaa 2520 gtgaacaata ccttatcgac cgacatccct tttcagctca gtaaatatgt cgataaccaa 2580 cgccttttgt ccactctaga agcacaccat catcaccacc atcaccatca ccat 2634 <210> 4 <211> 878 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide Sequence of rLHN/A <400> 4 Met Glu Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 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ttaatctgga atcgagcaaa 180 attgaggtta tcctgaaaaa cgccattgtc tacaactcca tgtacgagaa tttctccacc 240 agcttctgga ttcgcatccc gaaatacttc aacagcatta gcctgaacaa cgagtatact 300 atcatcaact gtatggagaa caacagcggt tggaaggtgt ctctgaacta tggtgagatc 360 atttggacct tgcaggacac ccaagagatc aagcagcgcg tcgtgttcaa gtactctcaa 420 atgatcaaca tttccgatta cattaatcgt tggatcttcg tgaccattac gaataaccgt 480 ctgaataaca gcaagattta catcaatggt cgcttgatcg atcagaaacc gattagcaac 540 ctgggtaata tccacgcaag caacaacatt atgttcaaat tggacggttg ccgcgatacc 600 catcgttata tctggatcaa gtatttcaac ctgtttgata aagaactgaa tgagaaggag 660 atcaaagatt tgtatgacaa ccaatctaac agcggcattt tgaaggactt ctggggcgat 720 tatctgcaat acgataagcc gtactatatg ctgaacctgt atgatccgaa caaatatgtg 780 gatgtcaata atgtgggtat tcgtggttac atgtatttga agggtccgcg tggcagcgtt 840 atgacgacca acatttacct gaactctagc ctgtaccgtg gtacgaaatt catcattaag 900 aaatatgcca gcggcaacaa agataacatt gtgcgtaata acgatcgtgt ctacatcaac 960 gtggtcgtga agaataaaga gtaccgtctg gcgaccaacg cttcgcaggc 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actgctggaa atgattatca atggcattcc gtatctgggt 360 gatcgtcgcg tgccgctgga agaatttaac accaatatcg cgagtgttac ggtcaacaaa 420 ctgatttcca atccgggtga agtcgaacgt aaaaaaggca tcttcgccaa cctgatcatc 480 ttcggcccgg gtccggtgct gaacgaaaat gaaaccattg atatcggtat tcagaaccat 540 tttgcctcac gcgaaggctt cggcggtatt atgcaaatga aattttgccc ggaatatgtg 600 tcggttttca acaatgttca ggaaaacaaa ggtgcaagca tctttaatcg tcgcggctat 660 ttctctgatc cggctctgat cctgatgcac caactgattt atgtgctgca cggcctgtat 720 ggtatcaaag tggatgacct gccgatcgtt ccgaacgaga aaaaattttt catgcagagc 780 accgacgcaa ttcaagctga agaactgtat acgtttggcg gtcaggaccc gtctattatc 840 accccgagca ccgacaaaag catctacgat aaagtgctgc aaaactttcg tggcattgtt 900 gaccgcctga ataaagtcct ggtgtgtatc tctgatccga acatcaacat caacatctac 960 aaaaacaaat tcaaagacaa atacaaattc gttgaagatt ctgaaggcaa atatagtatt 1020 gacgtcgaat cctttgataa actgtacaaa agtctgatgt tcggtttcac cgaaacgaac 1080 atcgcggaaa actacaaaat caaaacccgc gcctcctatt tcagcgactc tctgccgccg 1140 gttaaaatca aaaatctgct ggataacgaa 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tacatcgaca acaaaaacaa aatcatcaaa 2040 accattgata acgcgctgac gaaacgtaac gaaaaatggt cagatatgta cggcctgatt 2100 gttgcccagt ggctgagcac cgtcaacacg caattttaca ccatcaaaga aggtatgtac 2160 aaagcgctga attatcaggc gcaagccctg gaagaaatca tcaaataccg ctacaacatc 2220 tacagcgaaa aagaaaaatc taacatcaac atcgacttta atgatatcaa cagcaaactg 2280 aacgaaggta tcaaccaggc aatcgataac atcaacaact tcatcaacgg ctgctcagtg 2340 tcgtatctga tgaagaaaat gatcccgctg gctgttgaaa aactgctgga ttttgacaac 2400 accctgaaga aaaacctgct gaactacatc gatgaaaaca aactgtacct gatcggctca 2460 gccgaatacg aaaaatcgaa agtgaacaaa tacctgaaaa ccatcatgcc gtttgacctg 2520 agtatttaca ccaacgatac gatcctgatc gaaatgttca acaaatacaa ctccgaaatt 2580 ctgaacaata ttatcctgaa cctgcgttac aaagacaaca atctgatcga tctgagcggc 2640 tatggtgcaa aagttgaagt ctacgacggt gtcgaactga acgataaaaa ccagttcaaa 2700 ctgacctcat cggctaactc aaaaattcgt gtgacgcaga accaaaacat catcttcaac 2760 tcggtctttc tggacttcag cgtgtctttc tggattcgca tcccgaaata taaaaatgat 2820 ggcatccaga actacatcca taacgaatac 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tacgaaagca 1320 ccgcctcgcc tgtgcattcg cgttaacaac cgtgagttgt tctttgtggc atctgaaagc 1380 agctacaacg agaacgacat caacacccct aaagaaattg atgataccac gaacctgaat 1440 aacaattatc gcaacaatct ggacgaggtg atcctggatt acaattcgga aaccattccg 1500 caaattagca atcagacgct gaacaccctg gttcaggacg atagctacgt tccgcgttac 1560 gactccaatg gtactagcga gattgaagaa cacaacgtag tggacttgaa cgttttcttt 1620 tatctgcacg cccagaaggt tccggagggc gaaaccaata ttagcctgac cagctcgatc 1680 gacaccgcgc tgtctgagga gagccaagtc tacacctttt tcagcagcga gtttatcaac 1740 actattaaca agccagttca tgctgcattg tttatctctt ggattaacca ggtgattcgc 1800 gactttacga cggaggcgac ccagaagtct accttcgaca aaattgcaga catctccctg 1860 gtcgtcccat acgtcggcct ggcgttgaat attggcaatg aagttcaaaa agagaacttc 1920 aaagaagcgt tcgagctgct gggtgcaggc atcctgctgg agttcgtgcc ggaactgttg 1980 atcccgacca tcctggtgtt caccattaag agcttcattg gatcctccga gaataagaac 2040 aagatcatca aggcgatcaa taacagcctg atggagcgtg aaacgaagtg gaaagaaatc 2100 tatagctgga ttgttagcaa ttggctgact cgtattaaca cgcaattcaa 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Met Gly Ser Met Lys Leu Glu Ile Asn Lys Phe Asn Tyr Asn Asp Pro 1 5 10 15 Ile Asp Gly Ile Asn Val Ile Thr Met Arg Pro Pro Arg His Ser Asp 20 25 30 Lys Ile Asn Lys Gly Lys Gly Pro Phe Lys Ala Phe Gln Val Ile Lys 35 40 45 Asn Ile Trp Ile Val Pro Glu Arg Tyr Asn Phe Thr Asn Asn Thr Asn 50 55 60 Asp Leu Asn Ile Pro Ser Glu Pro Ile Met Glu Ala Asp Ala Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Asn Tyr Leu Asn Thr Pro Ser Glu Lys Asp Glu Phe Leu Gln 85 90 95 Gly Val Ile Lys Val Leu Glu Arg Ile Lys Ser Lys Pro Glu Gly Glu 100 105 110 Lys Leu Leu Glu Leu Ile Ser Ser Ser Ile Pro Leu Pro Leu Val Ser 115 120 125 Asn Gly Ala Leu Thr Leu Ser Asp Asn Glu Thr Ile Ala Tyr Gln Glu 130 135 140 Asn Asn Asn Ile Val Ser Asn Leu Gln Ala Asn Leu Val Ile Tyr Gly 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Ile Ala Asn Asn Ala Thr Tyr Gly Leu Tyr Ser Thr 165 170 175 Pro Ile Ser Asn Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Val Ser Phe Ser Pro 180 185 190 Phe Tyr Leu Lys Pro Phe Asp Glu Ser Tyr Gly Asn Tyr Arg Ser Leu 195 200 205 Val Asn Ile Val Asn Lys Phe Val Lys Arg Glu Phe Ala Pro Asp Pro 210 215 220 Ala Ser Thr Leu Met His Gln Leu Val Tyr Val Thr His Asn Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Arg Asn Phe Tyr Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Lys Ile 245 250 255 Glu Thr Ser Arg Gln Gln Asn Ser Leu Ile Phe Glu Glu Leu Leu Thr 260 265 270 Phe Gly Gly Ile Asp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Leu Ile Ile Lys Lys 275 280 285 Ile Ile Glu Thr Ala Lys Asn Asn Tyr Thr Thr Leu Ile Ser Glu Arg 290 295 300 Leu Asn Thr Val Thr Val Glu Asn Asp Leu Leu Lys Tyr Ile Lys Asn 305 310 315 320 Lys Ile Pro Val Gln Gly Arg Leu Gly Asn Phe Lys Leu Asp Thr Ala 325 330 335 Glu Phe Glu Lys Lys Leu Asn Thr Ile Leu Phe Val Leu Asn Glu Ser 340 345 350 Asn Leu Ala Gln Arg Phe Ser Ile Leu Val Arg Lys His Tyr Leu Lys 355 360 365 Glu Arg Pro Ile Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Tyr Ser Thr Leu Glu Gly Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp 385 390 395 400 Phe Gln Gly Gln Leu Leu Glu Ser Ser Tyr Phe Glu Lys Ile Glu Ser 405 410 415 Asn Ala Leu Arg Ala 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Ile Ile 1235 1240 1245 Val Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn 1250 1255 1260 Asn Asn Gly Gly Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ser Asn Asn 1265 1270 1275 Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Arg Lys Asn Thr 1280 1285 1290 Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly 1295 1300 1305 Trp Gln Glu Asn 1310 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 Activation Loop Consensus Sequence <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> Xaa is 1-10 residues of any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> Xaa is 4-15 residues of any amino acid <400> 71 Cys Xaa Ile Xaa Gly Arg Xaa Cys <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 Activation Loop <400> 72 Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Lys Thr Leu Asp 1 5 10 15 Cys <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 Activation Loop Variant <400> 73 Cys His Lys Ala Ile Glu Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Lys Thr Leu Asp 1 5 10 15 Cys <210> 74 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide Sequence of rLC/A(0) (His-tagged) <400> 74 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Gln 210 215 220 Leu Ile Tyr Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala 420 425 430 Ser His His His His His His His His 435 440 <210> 75 <211> 882 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide Sequence of rLHN/A(0) (His-tagged) <400> 75 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Gln 210 215 220 Leu Ile Tyr Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys 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265 270 Ile Asp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Leu Ile Ile Lys Lys Ile Ile Glu 275 280 285 Thr Ala Lys Asn Asn Tyr Thr Thr Leu Ile Ser Glu Arg Leu Asn Thr 290 295 300 Val Thr Val Glu Asn Asp Leu Leu Lys Tyr Ile Lys Asn Lys Ile Pro 305 310 315 320 Val Gln Gly Arg Leu Gly Asn Phe Lys Leu Asp Thr Ala Glu Phe Glu 325 330 335 Lys Lys Leu Asn Thr Ile Leu Phe Val Leu Asn Glu Ser Asn Leu Ala 340 345 350 Gln Arg Phe Ser Ile Leu Val Arg Lys His Tyr Leu Lys Glu Arg Pro 355 360 365 Ile Asp Pro Ile Tyr Val Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ser Tyr Ser Thr 370 375 380 Leu Glu Gly Phe Asn Ile Ser Ser Gln Gly Ser Asn Asp Phe Gln Gly 385 390 395 400 Gln Leu Leu Glu Ser Ser Tyr Phe Glu Lys Ile Glu Ser Asn Ala Leu 405 410 415 Arg Ala Phe Ile Lys Ile Ala Pro Arg Asn Gly Leu Leu Tyr Asn Ala 420 425 430 Ile Tyr Arg Asn Ser Lys 435 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreScission Protease Site <400> 77 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 78 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 Activation Loop Variant 2 <400> 78 Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly 1 5 10 15 Pro Leu Tyr Asn Lys Thr Leu Asp Cys 20 25

Claims (93)

  1. 방광 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
  2. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 방광 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
  3. 방광 통증 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
  4. 방광 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드.
  5. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 방광 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법.
  6. 방광 통증 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 방광 통증이 간질성 방광염에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  8. 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
  9. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
  10. 통증 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
  11. 통증을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드.
  12. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 통증을 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법.
  13. 통증 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 통증을 치료하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  15. 하부 요로 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
  16. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하부 요로 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
  17. 하부 요로 장애 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
  18. 하부 요로 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드.
  19. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하부 요로 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법.
  20. 하부 요로 장애 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하부 요로 장애가 방광 장애인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하부 요로 장애가 구심성 신경-연관 장애인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 장애가 방광 통증 증후군 (바람직하게는 간질성 방광염); 과민성 방광; 및 배뇨근 과다활동 (예를 들어 신경원성 배뇨근 과다활동) 중 하나 이상을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 하부 요로 장애를 치료하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  25. 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드.
  26. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 방법.
  27. 염증성 장애 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 용도.
  28. 염증성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드.
  29. 대상체에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 방법.
  30. 염증성 장애 치료용 의약의 제조에서의 폴리펩티드의 용도로서, 여기서 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄)를 포함하고, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 용도.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 뉴런 성장을 촉진함으로써, 뉴런 복구를 촉진함으로써, 또는 뉴런 성장 및 복구를 촉진함으로써 중 어느 것에 의해서도 염증성 상태를 치료하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 추가의 촉매 활성 도메인을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및/또는 HC 도메인에 부가적인 치료제 또는 진단제 (예를 들어, 공유 또는 비-공유 회합된 치료제 또는 진단제)를 포함하지 않는 것인, 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 추가의 치료제 또는 진단제와 함께 (예를 들어 순차적으로 또는 후속적으로) 투여되지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  36. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  37. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄, HN 도메인 및 HC 도메인을 포함하며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  38. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  39. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제36항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  40. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 본질적으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  41. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제36항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및/또는 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어지며, 여기서 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하거나 또는 그로 이루어진 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  42. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제36항, 제39항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄) 및 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인)으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  43. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제37항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 경쇄 (L-쇄), 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인 (HN 도메인) 및 클로스트리디움 신경독소 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)으로 이루어지며, 여기서 L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  44. 제1항 내지 제36항, 제38항, 제39항, 제41항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 HN 도메인 및 HC 도메인 둘 다를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 비-클로스트리디움 촉매 도메인을 추가로 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  46. 제1항 내지 제14항 및 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 만성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  47. 제1항 내지 제14항 및 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 급성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  48. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 염증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  49. 제48항에 있어서, 염증성 통증이 일광화상, UV-유발 손상, 관절염성 장애, 자가면역 질환, 결합 조직 장애, 손상, 감염, 신경염, 관절 염증 또는 두통 (바람직하게는 근육/근원성 두통, 혈관성 두통, 고혈압 두통, 호르몬 두통, 반동성 두통, 만성 부비동염 두통, 기질성 두통 또는 발작성 두통)에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  50. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 신경병증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  51. 제50항에 있어서, 신경병증성 통증이 신경통, 구심로차단, 복합 부위 통증 증후군 (CRPS) 또는 신경병증 (예를 들어 중추 또는 말초 신경병증)인 (또는 그에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인) 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  52. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 혼합 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  53. 제1항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 이질통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  54. 제1항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 내장통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  55. 제54항에 있어서, 내장통이 기능성 내장통, 만성 위장 염증, 자가면역 통증, 기질성 내장통 또는 치료-유발 내장통인 (또는 그에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인) 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  56. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 두통 통증 (예를 들어 편두통)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  57. 제56항에 있어서, 통증이 편두통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  58. 제56항에 있어서, 두통 통증이 근육/근원성 두통, 혈관성 두통, 고혈압 두통, 호르몬 두통, 반동성 두통, 만성 부비동염 두통, 기질성 두통 또는 발작성 두통에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  59. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 수술후 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  60. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 연관통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  61. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 체성통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  62. 제61항에 있어서, 통증이 과도한 근육 긴장, 반복 운동 장애, 근육 장애, 근육통, 감염 또는 약물에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 체성통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  63. 제1항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 방광 통증 증후군이고, 바람직하게는 방광 통증이 간질성 방광염에 의해 유발되거나 또는 그와 연관된 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  64. 제8항 내지 제14항 및 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 환상지통인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  65. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장애가 방광염, 자궁내막증, 류마티스 관절염, 복합 부위 통증 증후군 및 신경염으로부터 선택된 하나 이상인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  66. 제65항에 있어서, 방광염이 간질성 방광염인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  67. 제65항에 있어서, 신경염이 말초 신경염인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 250 μg 초과인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251 μg 내지 10 g인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251 μg 내지 1 g인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 폴리펩티드의 단일 용량이 251-1000 μg인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 반복적으로 (예를 들어 통증 치료 요법의 일부로서) 투여되는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 피내로 투여되는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  74. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호(SEQ ID NO): 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  75. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  76. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 단 폴리펩티드가 클로스트리디움 신경독소 L-쇄를 포함하는 경우에, L-쇄는 촉매 불활성인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  77. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 44, 46, 48, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 75 또는 76 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  78. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항 및 제31항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/A인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 변형된 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 키메라 클로스트리디움 신경독소 또는 하이브리드 클로스트리디움 신경독소이고, 바람직하게는 폴리펩티드가 천연 클로스트리디움 신경독소 H-쇄를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  80. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항 및 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HCC 도메인 또는 HC 도메인이 결여되어 있는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  81. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항, 제79항 및 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 비-클로스트리디움 표적화 모이어티 (TM)를 포함하는 재표적화된 클로스트리디움 신경독소인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  82. 제1항 내지 제77항, 제79항 및 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드에 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HC 도메인이 결여되어 있고, 또한 임의의 기능적으로 동등한 외인성 리간드 표적화 모이어티 (TM)가 결여되어 있는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 대상체의 세포에서 발현되지 않고, 예를 들어 용도 또는 방법이 대상체의 세포에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  85. 제84항에 있어서, 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열(들)이 세포 수용체에 결합하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 1개 이상의 비-클로스트리디움 신경독소 서열(들)이 세포 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  87. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항, 제79항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/A 경쇄 및 전위 도메인, 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)이고, 바람직하게는 BoNT/B HC 도메인이 E1191M; S1199Y; V1118M; Y1183M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환 돌연변이(들)를 포함하고, 보다 바람직하게는 BoNT/B HC 도메인이 E1191M 및 S1199Y에서의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  88. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제79항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 및 THR 1277로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 변형을 포함하는 변형된 BoNT/A HC 도메인을 포함하며, 여기서 변형은
    i. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
    ii. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 비하전된 아미노산 잔기로의 치환;
    iii. 비하전된 표면 노출된 아미노산 잔기의 염기성 아미노산 잔기로의 치환;
    iv. 염기성 아미노산 잔기의 삽입; 및
    v. 산성 표면 노출된 아미노산 잔기의 결실
    로부터 선택된 것인
    폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  89. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항 및 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 보툴리눔 신경독소 혈청형 X (BoNT/X) L-쇄, BoNT/X HN 도메인, 및/또는 BoNT/X HC 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  90. 제1항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항, 제83항 내지 제86항 및 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 상이한 (즉, 비-BoNT/X) 클로스트리디움 신경독소로부터의 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  91. 제11항 내지 제3항, 제7항 내지 제10항, 제14항 내지 제17항, 제21항 내지 제27항, 제31항 내지 제77항, 제83항 내지 제86항, 제89항 및 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 촉매 불활성 BoNT/X 경쇄 및 전위 도메인, 및 BoNT/B 수용체 결합 도메인 (HC 도메인)을 포함하는 키메라 보툴리눔 신경독소 (BoNT)인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 통증이 염증성 통증인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 Cys-(Xaa)a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)b-Cys (서열식별번호: 71)를 포함하며, 여기서 a = 1-10이고, b = 4-15인 폴리펩티드, 방법 또는 용도.
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