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KR20230118148A - 암 치료에 유용한 하나 이상의 8-het-2-아미노벤자제핀유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-cea 항체를 포함하는 면역접합체 - Google Patents

암 치료에 유용한 하나 이상의 8-het-2-아미노벤자제핀유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-cea 항체를 포함하는 면역접합체 Download PDF

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KR20230118148A
KR20230118148A KR1020237022940A KR20237022940A KR20230118148A KR 20230118148 A KR20230118148 A KR 20230118148A KR 1020237022940 A KR1020237022940 A KR 1020237022940A KR 20237022940 A KR20237022940 A KR 20237022940A KR 20230118148 A KR20230118148 A KR 20230118148A
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KR
South Korea
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seq
amino acid
ethoxy
alkyldiyl
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020237022940A
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English (en)
Inventor
셸리 에린 애커먼
마이클 엔. 알론소
데이비드 도르난
마르친 코와네츠
로마스 쿠디르카
아서 리
윌리엄 말레트
브라이언 사피나
매튜 조우
Original Assignee
볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-CEA 항체를 포함하는 화학식 I의 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 반응성 작용기를 포함하는 8-Het-2-아미노벤자제핀 유도체 중간체 조성물을 제공한다. 이러한 중간체 조성물은 링커 또는 연결 모이어티를 통한 면역접합체의 형성에 적합한 기질이다. 본 발명은 추가로 면역접합체에 의해 암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

암 치료에 유용한 하나 이상의 8-HET-2-아미노벤자제핀 유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-CEA 항체를 포함하는 면역접합체
관련 출원의 상호 참조
본 정규 출원은 2020년 12월 11일에 출원된 미국 가출원 제63/124,328호의 우선권의 이익을 주장하고, 이는 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자로 제출되고 본원에 그 전체가 참고로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2021년 12월 3일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 17019_010WO1_SL.txt이고, 크기가 55,248 바이트이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 분자에 접합된 항-암배아 항원(CEA: Carcinoembryonic Antigen) 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
항체 및 면역 아쥬반트의 전달을 위한 새로운 조성물 및 방법은 접근 불가능한 종양에 도달하고/하거나 암 환자 및 다른 대상체에 대한 치료 옵션을 확장하기 위해 필요하다. 본 발명은 이러한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-CEA 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 반응성 작용기를 포함하는 8-Het-2-아미노벤자제핀 유도체 중간체 조성물에 관한 것이다. 이러한 중간체 조성물은 면역접합체의 형성에 적합한 기질이고, 항체는 하기 화학식을 갖는 8-Het-2-아미노벤자제핀(HxBz) 모이어티에 링커 L에 의해 공유로 결합될 수 있다:
상기 식 중, Het는 헤테로사이클릴디일 및 헤테로아릴디일로부터 선택되고; R1, R2, R3 및 R4 중 하나는 L에 부착된다. R1-4 및 X1-4 치환기는 본원에 정의되어 있다.
본 발명은 추가로 병, 특히 암의 치료에서의 이러한 면역접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티에 공유 부착된 링커에 공유 부착된 항-CEA 항체를 포함하는 면역접합체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티에 대한 접합에 의해 연결된 항-CEA 항체를 포함하는 면역접합체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암을 치료하기 위한 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티에 대한 접합에 의해 연결된 항-CEA 항체를 포함하는 면역접합체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티와 항-CEA 항체의 접합에 의해 면역접합체를 제조하는 방법이다.
도 1은 마우스에서의 생체내 이종이식 종양 모델을 보여준다. 처리 후 시간에 걸친 종양 부피는 CEA-고 인간 췌장 HPAF-II 종양을 보유하는 마우스의 종양 억제에서 면역접합체 IC-2의 효능을 아이소타입 면역접합체(ISAC) 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2와 비교하기 위해 측정되었다.
도 2a는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14(표 3a) 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고 MKN-45 세포와 인간 종래의 수지상 세포(cDC)-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 사이토카인 IL-12p70 유도의 그래프를 보여준다.
도 2b는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고 MKN-45 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 사이토카인 TNFα(종양 괴사 인자 알파) 유도의 그래프를 보여준다.
도 2c는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고 MKN-45 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 IL-6(인터류킨-6) 유도의 그래프를 보여준다.
도 2d는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고 MKN-45 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 사이토카인 IFNγ(인터페론 감마) 유도의 그래프를 보여준다.
도 2e는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고 MKN-45 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 사이토카인 CCL2 유도의 그래프를 보여준다.
도 3a는 CEA-고 HPAF II 세포에서의 면역접합체 IC-2의 다양한 농도로 처리된 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포에 의한 식세포작용의 그래프를 보여준다. CTG-표지된 종양- IC-2 면역 복합체를 2:1 효과기 대 표적 비로 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포와 항온처리하였다. 4시간 후, 식세포작용을 CTG 신호에 양성인 효과기 세포에 대한 유세포분석법 게이팅에 의해 측정하였다. 3명의 공여자로부터의 평균 +/- 표준 편차는 그래프에 도시되어 있다.
도 3b는 CEA-중 LoVo 세포에서의 면역접합체 IC-2의 다양한 농도로 처리된 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포에 의한 식세포작용의 그래프를 보여준다. CTG-표지된 종양- IC-2 면역 복합체를 2:1 효과기 대 표적 비로 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포와 항온처리하였다. 4시간 후, 식세포작용을 CTG 신호에 양성인 효과기 세포에 대한 유세포분석법 게이팅에 의해 측정하였다. 3명의 공여자로부터의 평균 +/- 표준 편차는 그래프에 도시되어 있다.
도 3c는 CEA-저 LS-174T 세포에서의 면역접합체 IC-2의 다양한 농도로 처리된 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포에 의한 식세포작용의 그래프를 보여준다. CTG-표지된 종양- IC-2 면역 복합체를 2:1 효과기 대 표적 비로 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포와 항온처리하였다. 4시간 후, 식세포작용을 CTG 신호에 양성인 효과기 세포에 대한 유세포분석법 게이팅에 의해 측정하였다. 3명의 공여자로부터의 평균 +/- 표준 편차는 그래프에 도시되어 있다.
도 3d는 CEA-음성 MDA-MB-231 세포에서의 면역접합체 IC-2의 다양한 농도로 처리된 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포에 의한 식세포작용의 그래프를 보여준다. CTG-표지된 종양- IC-2 면역 복합체를 2:1 효과기 대 표적 비로 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포와 항온처리하였다. 4시간 후, 식세포작용을 CTG 신호에 양성인 효과기 세포에 대한 유세포분석법 게이팅에 의해 측정하였다. 3명의 공여자로부터의 평균 +/- 표준 편차는 그래프에 도시되어 있다.
도 4a는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 TNFα(종양 괴사 인자 알파) 사이토카인 수준의 그래프를 보여준다.
도 4b는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 IL-6(인터류킨-6) 사이토카인 수준의 그래프를 보여준다.
도 4c는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 CXCL10 사이토카인 수준의 그래프를 보여준다.
도 4d는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 TNFα(종양 괴사 인자 알파) 사이토카인 수준의 그래프를 보여준다.
도 4e는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 CD40 표면 마커 유도 수준의 그래프를 보여준다.
도 4f는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 다양한 농도의 항온처리 후 분비된 CD86 표면 마커 유도 수준의 그래프를 보여준다.
본 발명의 소정의 실시형태에 상세히 참조가 이루어질 것이고, 이의 예는 동반된 구조 및 화학식에서 예시된다. 본 발명이 열거된 실시형태와 함께 기재될 것이지만, 이것은 본 발명을 이들 실시형태로 제한하도록 의도되지 않는다고 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 모든 대안, 변형 및 균등물을 다루도록 의도되고, 이들은 청구항에 의해 정의된 것과 같이 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
당업자는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 어떠한 방식으로든 기재된 방법 및 재료로 제한되지 않는다.
정의
용어 "면역접합체" 또는 "면역-자극 항체 접합체"는 링커를 통해 아쥬반트 모이어티에 공유 결합된 항체 작제물을 지칭한다. 용어 "아쥬반트"는 아쥬반트에 노출된 대상체에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 지칭한다.
"아쥬반트 모이어티"는 본원에 기재된 것과 같이 예를 들면 링커를 통해 항체 작제물에 공유 결합된 아쥬반트를 지칭한다. 아쥬반트 모이어티는 항체 작제물에 결합되면서 또는 대상체에 대한 면역접합체의 투여 후 항체 작제물로부터의 절단(예를 들면, 효소 절단) 후 면역 반응을 일으킬 수 있다.
"아쥬반트"는 아쥬반트에 노출된 대상체에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 지칭한다.
용어 "톨 유사 수용체" 및 "TLR"은 병원균-연관된 분자 패턴을 인식하고 선천성 면역에서 핵심 신호전달 요소로서 작용하는 고도로 보존된 포유류 단백질의 패밀리의 임의의 구성원을 지칭한다. TLR 폴리펩타이드는 류신 농후 반복부를 갖는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 TLR 신호전달에 관여된 세포내 도메인을 포함하는 특징적인 구조를 공유한다.
용어 "톨 유사 수용체 7" 및 "TLR7"은 공중에게 이용 가능한 TLR7 서열, 예를 들면 인간 TLR7 폴리펩타이드에 대해 GenBank 수탁 번호 AAZ99026 또는 쥣과 TLR7 폴리펩타이드에 대해 GenBank 수탁 번호 AAK62676과 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 초과의 서열 동일성을 공유하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
용어 "톨 유사 수용체 8" 및 "TLR8"은 공중에게 이용 가능한 TLR7 서열, 예를 들면 인간 TLR8 폴리펩타이드에 대해 GenBank 수탁 번호 AAZ95441 또는 쥣과 TLR8 폴리펩타이드에 대해 GenBank 수탁 번호 AAK62677과 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 초과의 서열 동일성을 공유하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"TLR 효능제"는 TLR 신호전달을 유도하기 위해 TLR(예를 들면, TLR7 및/또는 TLR8)에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 물질이다. TLR 신호전달에서의 임의의 검출 가능한 차이는 효능제가 TLR을 자극하거나 활성화한다는 것을 나타낼 수 있다. 신호전달 차이는 예를 들면 표적 유전자의 발현, 신호 전달 성분의 인산화, 핵 인자-κB(NF-κB)와 같은 하류 요소의 세포내 국재화, 소정의 성분(예컨대, IL-1 수용체 연관된 키나제(IRAK))과 다른 단백질 또는 세포내 구조의 회합 또는 키나제(예컨대, 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK))와 같은 성분의 생화학적 활성의 변화로서 표시될 수 있다.
"항체"는 면역글로불린 유전자로부터의 항원 결합 영역(상보성 결정 영역(CDR)을 포함) 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "항체"는 구체적으로 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사합체를 포함한다. 각각의 사합체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 디설파이드 결합에 의해 연결된 1개의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 1개의 "중"쇄(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬은 면역글로불린 도메인이라 지칭되는 구조 도메인으로 구성된다. 이 도메인은 크기 및 기능에 의해 상이한 카테고리, 예를 들면 경쇄 및 중쇄에서의 가변 도메인 또는 영역(각각 VL 및 VH) 및 경쇄 및 중쇄에서의 불변 도메인 또는 영역(각각 CL 및 CH)으로 분류된다. 각각의 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 파라토프라고 지칭되는 약 100개 내지 110개 또는 초과의 아미노산의 가변 영역, 즉 항원 결합 도메인을 정의한다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이것은 결국 각각 면역글로불린 종류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. IgG 항체는 4개의 펩타이드 사슬로 구성된 약 150 kDa의 큰 분자이다. IgG 항체는 약 50 kDa의 2개의 동일한 종류 γ 중쇄 및 약 25 kDa의 2개의 동일한 경쇄, 이에 따라 사합체 4차 구조를 함유한다. 2개의 중쇄는 디설파이드 결합에 의해 각각 서로에 연결되고 경쇄에 연결된다. 생성된 사합체는 Y-유사 형상을 함께 형성하는 2개의 동일한 절반을 갖는다. 포크의 각각의 끝은 동일한 항원 결합 도메인을 함유한다. 인간에서의 4개의 IgG 하위종류(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)가 있는데, 혈청에서의 풍부도의 순서로 명명된다(즉, IgG1은 가장 풍부함). 통상적으로, 항체의 항원 결합 도메인은 암 세포에 대한 결합의 특이성 및 친화도에서 가장 중요할 것이다.
"항체 작제물"은 (i) 항원 결합 도메인 및 (ii) Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 결합제는 항체의 적어도 항원-결합 영역을 단독으로 또는 항원-결합 작제물을 함께 구성하는 다른 성분과 포함하는 작제물인 항원-결합 항체 "단편"이다. 예를 들면, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 항체의 단일 아암의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 온화한 환원 조건을 사용하여 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 파괴하여 생긴 Fab' 단편, (v) 디설파이드-안정화된 Fv 단편(dsFv) 및 (vi) 2개의 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성되게 하는 합성 링커에 의해 연결된 Fv 단편의 2개의 도메인(즉, VL 및 VH)으로 이루어진 1가 분자인 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함하는 많은 상이한 유형의 항체 "단편"이 당해 분야에 알려져 있다.
항체 또는 항체 단편은 더 큰 작제물의 부분, 예를 들면 추가 영역에 대한 항체 단편의 접합체 또는 융합 작제물일 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 항체 단편은 본원에 기재된 것과 같은 Fc 영역에 융합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 단편(예를 들면, Fab 또는 scFv)은 예를 들면 막관통 도메인(선택적으로 개재하는 링커 또는 "스톡(stalk)"(예를 들면, 힌지 영역)과 함께) 및 선택적인 세포내 신호전달 도메인에 융합함으로써 키메라 항원 수용체 또는 키메라 T-세포 수용체의 부분일 수 있다.
"에피토프"는 항원 결합 도메인이 (즉, 항원 결합 도메인의 파라토프에서) 결합하는 항원의 임의의 항원 결정부위 또는 에피토프 결정부위를 의미한다. 항원 결정부위는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지고, 보통 특정 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. (1) IgG에 결합하는 FcγR, (2) IgA에 결합하는 FcαR 및 (3) IgE에 결합하는 FcεR의 Fc 수용체의 3개의 주요 종류가 있다. FcγR 패밀리는 몇몇 구성원, 예컨대 FcγI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16A) 및 FcγRIIIB(CD16B)를 포함한다. Fcγ 수용체는 IgG에 대한 이의 친화도가 다르고, 또한 IgG 하위종류(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)에 대한 상이한 친화도를 갖는다.
본원에 언급된 것과 같은 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성"은 관심 있는 핵산 또는 아미노산 서열을 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 가장 긴 서열의 길이(즉, 어떤 것이 더 길든 관심 있는 서열 또는 기준 서열의 길이)에 의해 나눈 최적으로 정렬된 관심 있는 서열과 기준 서열 사이와 동일한(즉, 똑같은) 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 수이다. 서열의 정렬 및 퍼센트 동일성의 계산은 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램의 예는 CLUSTAL-W, T-Coffee 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열의 정렬을 위해), BLAST 프로그램(예를 들면, BLAST 2.1, BL2SEQ, BLASTp, BLASTn 및 기타) 및 FASTA 프로그램(예를 들면, FASTA3x, FASTM 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사성 조사를 위해)을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은 또한 예를 들면 Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997) 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))에 개시되어 있다. 서열의 퍼센트(%) 동일성은 또한 예를 들면 100 x [(동일한 위치)/min(TGA, TGB)]로서 또한 계산될 수 있고, TGA 및 TGB는 TGA 및 TGB를 최소화하는 정렬에서 펩타이드 서열 A 및 B에서의 잔기의 수와 내부 갭 위치의 합이다. 예를 들면, Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994)를 참조한다.
결합제는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 Ig 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 프레임워크 영역에 의해 연결된 3개의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 결합제는 Ig 중쇄 및 경쇄를 포함하는 당해 분야에 알려진 임의의 여러 가지의 유형의 결합제일 수 있다. 예를 들면, 결합제는 항체, 항원-결합 항체 "단편" 또는 T-세포 수용체일 수 있다.
"바이오시밀러"는 예를 들면CEA-표적화 항체, 예컨대 라베투주맙(CEA-CIDETM, MN-14, hMN14, Immunomedics) CAS 등록 번호 219649-07-7)과 유사한 활성 특성을 갖는 허가된 항체 작제물을 지칭한다.
"바이오베터"는 라베투주맙과 같은 이전에 허가된 항체 작제물의 개선인 허가된 항체 작제물을 지칭한다. 바이오베터는 이전에 허가된 항체 작제물에 비해 하나 이상의 변형(예를 들면, 변경된 글리칸 프로파일 또는 고유한 에피토프)을 가질 수 있다. 바이오베터는 동일하지 않지만 오리지널보다 우수한 기존의 생물의약품과 동일한 종류로부터의 재조합 단백질 약물이다. 바이오베터는 배타적으로 새로운 약물도 아니고 약물의 제너릭 버전도 아니다. 바이오시밀러 및 바이오베터는 둘 다 생물제의 변이체이고; 전자는 시조의 가까운 카피인 반면, 후자는 효능, 안전성 및 관용성 또는 투약 섭생의 면에서 개선된다.
"아미노산"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 아미노산은 천연 발생 α-아미노산 및 이의 입체이성질체뿐만 아니라 비천연(비천연 발생) 아미노산 및 이의 입체이성질체를 포함한다. 주어진 아미노산의 "입체이성질체"는 동일한 분자식 및 분자내 결합을 갖지만 결합 및 원자의 상이한 3차원 배열을 갖는 이성질체(예를 들면, l-아미노산 및 상응하는 d-아미노산)를 지칭한다. 아미노산은 글리코실화되거나(예를 들면, N-연결된 글리칸, O-연결된 글리칸, 포스포글리칸, C-연결된 글리칸 또는 글리피케이션) 또는 탈글리코실화될 수 있다. 아미노산은 본원에서 흔히 알려진 3철자 기호 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 추천된 1철자 기호에 의해 지칭될 수 있다.
천연 발생 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화된 것뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 천연 발생 α-아미노산은 제한 없이 알라닌(Ala), 시스테인(Cys), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 페닐알라닌(Phe), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소류신(Ile), 아르기닌(Arg), 리신(Lys), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 아스파라긴(Asn), 프롤린(Pro), 글루타민(Gln), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 발린(Val), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr) 및 이들의 조합을 포함한다. 천연 발생 α-아미노산의 입체이성질체는 제한 없이 D-알라닌(D-Ala), D-시스테인(D-Cys), D-아스파르트산(D-Asp), D-글루탐산(D-Glu), D-페닐알라닌(D-Phe), D-히스티딘(D-His), D-이소류신(D-Ile), D-아르기닌(D-Arg), D-리신(D-Lys), D-류신(D-Leu), D-메티오닌(D-Met), D-아스파라긴(D-Asn), D-프롤린(D-Pro), D-글루타민(D-Gln), D-세린(D-Ser), D-트레오닌(D-Thr), D-발린(D-Val), D-트립토판(D-Trp), D-티로신(D-Tyr) 및 이들의 조합을 포함한다.
천연 발생 아미노산은 변역후 변형에 의해 단백질에서 발견된 것, 예컨대 시트룰린(Cit)을 포함한다.
비천연(비천연 발생) 아미노산은 제한 없이 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 L-구성 또는 D-구성 중 어느 하나의 아미노산 유사체, 아미노산 모방체, 합성 아미노산, N-치환된 글리신 및 N-메틸 아미노산을 포함한다. 예를 들면, "아미노산 유사체"는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조(즉, 수소, 카복실 기, 아미노산 기에 결합된 탄소)를 갖지만 변형된 측쇄 기 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖는 비천연 아미노산, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드 및 메티오닌 메틸 설포늄일 수 있다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반 화학 구조와 다르지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학 화합물을 지칭한다.
"링커"는 화합물 또는 재료에서 2개 또는 초과의 모이어티를 공유 결합시키는 작용기를 지칭한다. 예를 들면, 연결 모이어티는 면역접합체에서 아쥬반트 모이어티를 항체 작제물에 공유 결합시키도록 작용할 수 있다.
"연결 모이어티"는 화합물 또는 재료에서 2개 또는 초과의 모이어티를 공유 결합시키는 작용기를 지칭한다. 예를 들면, 연결 모이어티는 면역접합체에서 아쥬반트 모이어티를 항체에 공유 결합시키도록 작용할 수 있다. 연결 모이어티를 단백질 및 다른 재료에 연결하기 위해 유용한 결합은 아미드, 아민, 에스테르, 카바메이트, 우레아, 티오에테르, 티오카바메이트, 티오카보네이트 및 티오우레아를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"2가"는 2개의 작용기를 연결하기 위한 2개의 부착점을 함유하는 화학 모이어티를 지칭하고; 다가 연결 모이어티는 추가의 작용기를 연결하기 위한 추가 부착점을 가질 수 있다. 2가 라디칼은 접미사 "디일"로 표시될 수 있다. 예를 들면, 2가 연결 모이어티는 2가 중합체 모이어티, 예컨대 2가 폴리(에틸렌 글리콜), 2가 사이클로알킬, 2가 헤테로사이클로알킬, 2가 아릴 및 2가 헤테로아릴 기를 포함한다. "2가 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기"는 분자 또는 재료에서 2개의 모이어티를 공유 연결하기 위한 2개의 부착점을 갖는 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기를 지칭한다. 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노, 아미도, 아실, 니트로, 시아노 및 알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
물결선("")은 규정된 화학 모이어티의 부착점을 나타낸다. 규정된 화학 모이어티가 존재하는 2개의 물결선을 가지면, 화학 모이어티가 이측으로 사용될 수 있다, 즉 왼쪽에서 오른쪽으로 읽히거나 오른쪽에서 왼쪽으로 읽힐 수 있다는 것으로 이해될 것이다.
"알킬"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖는 직선형(선형) 또는 분지형, 포화, 지방족, 라디칼을 지칭한다. 알킬은 임의의 수, 예를 들면 1개 내지 12개의 탄소를 포함할 수 있다. 알킬 기의 예는 메틸(Me, -CH3), 에틸(Et, -CH2CH3), 1-프로필(n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필(i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸(n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필(i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸(s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필(t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸(n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸(-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸(-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸(-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸(-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸(-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸(-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸(-CH(CH3)C(CH3)3, 1-헵틸, 1-옥틸 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.알킬 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. "치환된 알킬" 기는 할로, 하이드록시, 아미노, 옥소(=O), 알킬아미노, 아미도, 아실, 니트로, 시아노 및 알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알킬디일"은 2가 알킬 라디칼을 지칭한다. 알킬디일 기의 예는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), 프로필렌(-CH2CH2CH2-) 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 알킬디일 기는 또한 "알킬렌" 기로 지칭될 수 있다.
"알케닐"은 표시된 탄소 원자의 수 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합, sp2를 갖는 직선형(선형) 또는 분지형, 불포화, 지방족, 라디칼을 지칭한다. 알케닐은 2개 내지 약 12개 또는 초과의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알케닐 기는 "시스" 및 "트랜스" 배향 또는 대안적으로 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼이다. 예는 에틸레닐 또는 비닐(-CH=CH2), 알릴(-CH2CH=CH2). 부테닐, 펜테닐 및 이들의 이성질치를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 알케닐 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. "치환된 알케닐" 기는 할로, 하이드록시, 아미노, 옥소(=O), 알킬아미노, 아미도, 아실, 니트로, 시아노 및 알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알케닐렌" 또는 "알케닐디일"은 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예는 에틸레닐렌 또는 비닐렌(-CH=CH-), 알릴(-CH2CH=CH-) 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 표시된 탄소 원자의 수 및 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합, sp를 갖는 직선형(선형) 또는 분지형, 불포화, 지방족, 라디칼을 지칭한다. 알키닐은 2개 내지 약 12개 또는 초과의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 예를 들면, C2-C6 알키닐은 에티닐(-C≡CH), 프로피닐(프로파길, -CH2C≡CH), 부티닐, 펜티닐, 헥시닐 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 알키닐 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. "치환된 알키닐" 기는 할로, 하이드록시, 아미노, 옥소(=O), 알킬아미노, 아미도, 아실, 니트로, 시아노 및 알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알키닐렌" 또는 "알키닐디일"은 2가 알키닐 라디칼을 지칭한다.
용어 "카보사이클", "카보사이클릴", "카보사이클릭 고리" 및 "사이클로알킬"은 3개 내지 12개의 고리 원자 또는 표시된 원자의 수를 함유하는 포화 또는 부분 불포화, 단환식, 융합된 이환식 또는 브릿징된 다환식 고리 어셈블리를 지칭한다. 포화 단환식 카보사이클릭 고리는 예를 들면 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로옥틸을 포함한다. 포화 이환식 및 다환식 카보사이클릭 고리는 예를 들면 노르보르난, [2.2.2] 바이사이클로옥탄, 데카하이드로나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 카보사이클릭 기는 또한 고리에서 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지며 부분적으로 불포화될 수 있다. 부분 불포화된 대표적인 카보사이클릭 기는 사이클로부텐, 사이클로펜텐, 사이클로헥센, 사이클로헥사디엔(1,3-이성질체 및 1,4-이성질체), 사이클로헵텐, 사이클로헵타디엔, 사이클로옥텐, 사이클로옥타디엔(1,3-이성질체, 1,4-이성질체 및 1,5-이성질체), 노르보르넨 및 노르보르나디엔을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "사이클로알킬디일"은 2가 사이클로알킬 라디칼을 지칭한다.
"아릴"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 6개 내지 20개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄화수소 라디칼(C6-C20)을 지칭한다. 아릴 기는 단환식이거나, 이환식 또는 삼환식 기를 형성하도록 융합되거나, 바이아릴 기를 형성하도록 결합에 의해 연결될 수 있다. 대표적인 아릴 기는 페닐, 나프틸 및 바이페닐을 포함한다. 다른 아릴 기는 메틸렌 연결 기를 갖는 벤질을 포함한다. 일부 아릴 기는 페닐, 나프틸 또는 바이페닐과 같이 6개 내지 12개의 고리 구성원을 갖는다. 다른 아릴 기는 페닐 또는 나프틸과 같이 6개 내지 10개의 고리 구성원을 갖는다.
용어 "아릴렌" 또는 "아릴디일"은 모 방향족 고리계의 2개의 탄소 원자로부터의 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 6개 내지 20개의 탄소 원자의 2가 방향족 탄화수소 라디칼(C6-C20)을 의미한다. 일부 아릴디일 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴디일은 포화, 부분 불포화 고리 또는 방향족 카보사이클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 이환식 라디칼을 포함한다. 통상적인 아릴디일 기는 벤젠(페닐디일), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐렌, 인데닐렌, 인다닐렌, 1,2-디하이드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸 및 기타로부터 유래된 라디칼을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 아릴디일 기는 또한 "아릴렌"으로 지칭되고, 본원에 기재된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 고리"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 적어도 하나의 고리 원자가 질소, 산소, 인 및 황으로부터 선택된 이종원자이고(남은 고리 원자는 C임), 하나 이상의 고리 원자가 하기에 기재된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 독립적으로 치환되는, 3개 내지 약 20개의 고리 원자의포화 또는 부분 불포화(즉, 고리 내에 하나 이상의 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 가짐) 카보사이클릭 라디칼을 지칭한다. 헤테로사이클은 3개 내지 7개의 고리 구성원(2개 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1개 내지 4개의 이종원자)을 갖는 단환 또는 7개 내지 10개의 고리 구성원(4개 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1개 내지 6개의 이종원자)을 갖는 이환, 예를 들면 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1장, 3장, 4장, 6장, 7장 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 13권, 14권, 16권, 19권 및 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566에 기재되어 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 고리 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로사이클릭 고리의 예는 모르폴린-4-일, 피페리딘-1-일, 피페라지닐, 피페라진-4-일-2-온, 피페라진-4-일-3-온, 피롤리딘-1-일, 티오모르폴린-4-일, S-디옥소티오모르폴린-4-일, 아조칸-1-일, 아제티딘-1-일, 옥타하이드로피리도[1,2-a]피라진-2-일, [1,4]디아제판-1-일, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵타닐, 아자바이사이클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴노질리닐 및 N-피리딜 우레아를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 스피로 헤테로사이클릴 모이어티는 또한 이 정의의 범위 내에 포함된다. 스피로 헤테로사이클릴 모이어티의 예는 아자스피로[2.5]옥타닐 및 아자스피로[2.4]헵타닐을 포함한다. 2개의 고리 원자가 옥소(=O) 모이어티로 치환된 헤테로사이클릭 기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본원에서 헤테로사이클 기는 본원에 기재된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클릴디일"은 적어도 하나의 고리 원자가 질소, 산소, 인 및 황으로부터 선택된 이종원자이고(남은 고리 원자는 C임), 하나 이상의 고리 원자가 기재된 것과 같은 하나 이상의 치환기로 선택적으로 독립적으로 치환되는, 3개 내지 약 20개의 고리 원자의 2가 포화 또는 부분 불포화(즉, 고리 내에 하나 이상의 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 가짐) 카보사이클릭 라디칼을 지칭한다. 5원 및 6원 헤테로사이클릴디일의 예는 모르폴리닐디일, 피페리디닐디일, 피페라지닐디일, 피롤리디닐디일, 디옥사닐디일, 티오모르폴리닐디일 및 S-디옥소티오모르폴리닐디일을 포함한다.
용어 "헤테로아릴"은 5원, 6원 또는 7원 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 이종원자를 함유하는 5개 내지 20개의 원자의 융합된 고리계(이들의 적어도 하나는 방향족임)를 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리디닐(예를 들면, 2-하이드록시피리디닐을 포함함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐(예를 들면, 4-하이드록시피리미디닐을 포함함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴 기는 본원에 기재된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 독립적으로 치환된다.
용어 "헤테로아릴디일"은 5원, 6원 또는 7원 고리의 2가 방향족 라디칼을 지칭하고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 이종원자를 함유하는 5개 내지 20개의 원자의 융합된 고리계(이들의 적어도 하나는 방향족임)를 포함한다. 5원 및 6원 헤테로아릴디일의 예는 피리딜디일, 이미다졸릴디일, 피리미딜디일, 피라졸릴디일, 트리아졸릴디일, 피라지닐디일, 테트라졸릴디일, 푸릴디일, 티에닐디일, 이속사졸릴디일디일, 티아졸릴디일, 옥사디아졸릴디일, 옥사졸릴디일, 이소티아졸릴디일 및 피롤릴디일을 포함한다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 이것이 가능하면 탄소 결합(탄소-연결된) 또는 질소(질소-연결된) 결합될 수 있다. 예에 의해 제한 없이, 탄소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4 또는 5, 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에서 결합된다.
예에 의해 제한 없이, 질소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4 및 카바졸 또는 β-카볼린의 위치 9에서 결합된다.
용어 "할로" 및 "할로겐"은 홀로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 지칭한다.
용어 "카보닐"은 홀로 또는 또 다른 치환기의 일부로서 C(=O) 또는 -C(=O)-, 즉 산소에 이중 결합되고 카보닐을 갖는 모이어티에서 2개의 다른 기에 결합된 탄소 원자를 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이, "4차 암모늄염"이라는 구절은 알킬 치환기(예를 들면, C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸)로 4급화된 3차 아민을 지칭한다.
용어 "치료한다", "치료" 및 "치료하는"은 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수를 포함하는 손상, 병리학, 병태(예를 들면, 암) 또는 증상(예를 들면, 인지 장애)의 치료 또는 완화의 임의의 연속 표지, 예컨대 감소; 관해; 증상의 감소 또는 증상, 손상, 병리학 또는 병태가 환자에게 더 관용적이게 하는 것; 증상 진행 속도의 감소; 증상 또는 병태의 빈도 또는 지속기간의 감소; 또는 일부 경우에 증상의 발생의 예방을 지칭한다. 증상의 치료 또는 완화는 예를 들면 신체 검사의 결과를 포함하는 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수에 기초할 수 있다.
용어 "암", "신생물" 및 "종양"은, 세포가 세포 증식에 대한 상당한 제어 손실을 특징으로 하는 비정상 성장 표현형을 나타내도록, 자율적 비조절된 성장을 나타내는 세포를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 본 발명의 맥락에서 검출, 분석 및/또는 치료를 위한 관심 있는 세포는 암 세포(예를 들면, 암을 갖는 개체로부터의 암 세포), 악성 암 세포, 전전이성 암 세포, 전이성 암 세포 및 비전이성 암 세포를 포함한다. 실제로 모든 조직의 암이 알려져 있다. "암 부담"이라는 구절은 대상체에서의 암 세포 또는 암 부피의 양자를 지칭한다. 암 부피를 감소시키는 것은 따라서 대상체에서 암 세포 또는 암 세포 부피의 수를 감소시키는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "암 세포"는 암 세포이거나(예를 들면, 개체가 치료될 수 있는 임의의 암으로부터의, 예를 들면 암을 갖는 개체로부터 단리된), 암 세포, 예를 들면 암 세포의 클론으로부터 유래된 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들면, 암 세포는 확립된 암 세포주 유래일 수 있거나, 암을 갖는 개체로부터 단리된 1차 세포일 수 있거나, 암을 갖는 개체로부터 단리된 1차 세포로부터의 자손 세포 및 기타일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 또한 암 세포의 부분, 예컨대 세포이하 부분, 세포막 부분 또는 암 세포의 세포 용해물을 지칭할 수 있다. 고형 종양, 예컨대 암종, 육종, 교모세포종, 흑색종, 림프종 및 골수종 및 순환 암, 예컨대 백혈병을 포함하는 많은 유형의 암이 당업자에게 알려져 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "암"은 비제한적인 예로서 고형 종양 암(예를 들면, 피부, 폐, 전립선, 유방, 위, 방광, 결장, 난소, 췌장, 신장, 간, 교모세포종, 수모세포종, 평활근육종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종 및 신경내분비) 및 액체 암(예를 들면, 조혈 암); 암종; 연조직 종양; 육종; 기형종; 흑색종; 백혈병; 림프종; 및 최소 잔류 질환을 포함하고 원발성 종양 및 전이성 종양 둘 다를 포함하는 뇌암을 포함하는 임의의 형태의 암을 포함한다.
암의 "병원균"은 환자의 웰빙을 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 이것은 제한 없이 비정상 또는 제어되지 않는 세포 성장, 전이, 이웃하는 세포의 정상 기능의 방해, 비정상 수준의 사이토카인 또는 다른 분비 생성물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화, 신생물, 전악성상태, 악성상태 및 둘러싼 또는 먼 조직 또는 장기, 예컨대 림프절의 침윤을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "암 재발" 및 "종양 재발" 및 이의 문법적 변형어는 암의 진단 후 신생물 세포 또는 암성 세포의 추가의 성장을 지칭한다. 특히, 재발은 암성 조직에서의 추가의 암성 세포 성장이 발생할 때 발생할 수 있다. "종양 분산"은 유사하게 종양의 세포가 국소 또는 먼 조직 및 장기로 파종할 때 발생하고, 따라서, 종양 분산은 종양 전이를 포함한다. "종양 침윤"은 정상 장기 기능의 압축, 파괴 또는 예방에 의해 관여된 조직의 기능을 손상시키도록 종양 성장이 국소로 분산할 때 발생한다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "전이"는 원래의 암성 종양의 장기와 직접 연결되지 않은 장기 또는 신체 부분에서의 암성 종양의 성장을 지칭한다. 전이는 원래의 암성 종양의 장기와 직접 연결되지 않은 장기 또는 신체 부분에서의 암성 세포의 검출 불가능한 양의 존재인 미세전이를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 전이는 또한 몇몇 과정 단계, 예컨대 원래의 종양 부위로부터의 암 세포의 출발 및 암 세포의 다른 신체 부분으로의 이동 및/또는 침윤으로서 정의될 수 있다.
"유효량" 및 "치료학적 유효량"은 이것이 투여되는 치료 효과를 생성하는 면역접합체와 같은 물질의 용량 또는 양을 지칭한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 따라 달라질 것이고, 알려진 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다(예를 들면, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition (McGraw-Hill, 2006); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, (Pharmaceutical Press, London, 2012) 참조). 암의 경우에, 면역접합체의 치료학적 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 말초 장기로의 암 세포 침윤을 억제하고/하거나(즉, 약간의 정도로 느리게 하고 바람직하게는 중단시키고/시키거나); 종양 전이를 억제하고/하거나(즉, 약간의 정도로 느리게 하고 바람직하게는 중단시키고/시키거나); 어느 정도로 종양 성장을 억제시키고/시키거나, 어느 정도로 암과 연관된 증상의 하나 이상을 완화시킬 수 있다. 면역접합체가 성장을 예방하고/하거나 이미 있는 암 세포를 사멸할 수 있는 정도로, 이것은 세포증식억제 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 치료를 위해, 효능은 예를 들면 질환 진행에 대한 시간(TTP)을 평가하고/하거나 반응률(RR)을 결정함으로써 측정될 수 있다.
"수혜자", "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환 가능하게 사용되고, 진단, 치료 또는 치료법이 원해지는 임의의 포유동물 대상체(예를 들면, 인간)를 지칭한다. 치료 목적을 위해 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 염소, 돼지, 낙타 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 포유류는 인간이다.
본 발명의 맥락에서 "상승적 아쥬반트" 또는 "상승적 조합"은 2개의 면역 조절제, 예컨대 수용체 효능제, 사이토카인 및 아쥬반트 폴리펩타이드의 조합을 포함하고, 조합으로 단독으로 투여되는 것에 비해 면역력에 대한 상승 효력을 일으킨다. 특히, 본원에 개시된 면역접합체는 청구된 아쥬반트 및 항체 작제물의 상승적 조합을 포함한다. 투여 시 이 상승적 조합은 예를 들면 항체 작제물 또는 아쥬반트가 다른 모이어티의 부재 하에 투여될 때에 비해 면역력에 대한 더 큰 효과를 일으킨다. 추가로, 감소된 양의 면역접합체는 항체 작제물 또는 아쥬반트 중 어느 하나가 단독으로 투여될 때와 비교하여 (항체 작제물의 총 수 또는 면역접합체의 일부로서 투여된 아쥬반트의 총 수에 의해 측정된 것과 같이) 투여될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "투여하는"은 대상체에 대한 비경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 병변내, 비강내 또는 피하 투여, 경구 투여, 좌제로서의 투여, 국소 접촉, 척추강내 투여 또는 서방 장치, 예를 들면 미니-삼투압 펌프의 이식을 지칭한다.
숫자 값을 수식하기 위해 본원에 사용된 것과 같은 용어 "약" 및 "대략"은 숫자 값을 둘러싼 가까운 범위를 나타낸다. 따라서, "X"가 값이면, "약 X" 또는 "대략 X"는 0.9X 내지 1.1X, 예를 들면 0.95X 내지 1.05X 또는 0.99X 내지 1.01X의 값을 나타낸다. "약 X" 또는 "대략 X"의 언급은 구체적으로 적어도 값 X, 0.95X, 0.96X, 0.97X, 0.98X, 0.99X, 1.01X, 1.02X, 1.03X, 1.04X 및 1.05X를 나타낸다. 따라서, "약 X" 및 "대략 X"는 예를 들면 "0.98X"의 청구 제한에 대한 서술된 설명 뒷받침을 교시하고 제공하도록 의도된다.
CEA 항체
본 발명의 면역접합체는 암배아 항원(CEA, CD66e, CEACAM5)을 표적화하거나 이것에 결합하거나 이것을 인식하는 항체를 포함한다. 본원에 기재된 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 기능적 변이체가 본 발명의 실시형태의 범위에 포함된다. 본원에 사용된 것과 같이 용어 "기능적 변이체"는 기능적 변이체가 이것이 변이체인 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 생물학적 활성을 보유하는 모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인과 실질적인 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 항원 결합 도메인을 갖는 항체 작제물을 지칭한다. 기능적 변이체는 모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인과 유사하 정도로, 동일한 정도로 또는 더 높은 정도로 CEA를 발현하는 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 예를 들면 본원에 기재된 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 변이체(모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인)를 포함한다.
항체 작제물 또는 항원 결합 도메인과 관련하여, 기능적 변이체는 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인과 아미노산에서 예를 들면 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 초과 동일할 수 있다.
기능적 변이체는 예를 들면 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우에, 비보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체와 간섭하지 않거나 이의 생물학적 활성을 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있어서, 기능적 변이체의 생물학적 활성은 모 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인과 비교하여 증가된다.
본 발명의 면역접합체를 포함하는 항체는 Fc 조작된 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합을 조절하는 Fc 영역에서의 돌연변이는 SD(S239D), SDIE(S239D/I332E), SE(S267E), SELF(S267E/L328F), SDIE(S239D/I332E), SDIEAL(S239D/I332E/A330L), GA(G236A), ALIE(A330L/I332E), GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E), V9(G237D/P238D/P271G/A330R) 및 V11(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)의 돌연변이 중 하나 이상, 및/또는 E345R, E233, G237, P238, H268, P271, L328 및 A330의 아미노산에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Fc 수용체 결합을 조절하기 위한 추가 Fc 영역 변형은 예를 들면 US 2016/0145350호 및 US 7416726호 및 US 5624821호에 기재되어 있고, 이들은 본원에서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 면역접합체를 포함하는 항체는 글리칸 변이체, 예컨대 비푸코실화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합제의 Fc 영역은 자연적 비변형된 Fc 영역과 비교하여 Fc 영역의 변경된 글리코실화 패턴을 갖도록 변형된다.
본 발명의 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환은 당해 분야에 알려져 있고, 소정의 물리적 특성 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 특성 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 대해 교환된 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성/음으로 하전된 극성 아미노산(예를 들면, Asp 또는 Glu)에 대해 치환된 산성/음으로 하전된 극성 아미노산, 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들면, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val 등)에 대해 치환된 비극성 측쇄를 갖는 아미노산, 또 다른 염기성/양으로 하전된 극성 아미노산(예를 들면, Lys, His, Arg 등)에 대해 치환된 염기성/양으로 하전된 극성 아미노산, 극성 측쇄를 갖는 또 다른 비하전된 아미노산(예를 들면, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 등)에 대해 치환된 극성 측쇄를 갖는 비하전된 아미노산, 베타 분지된 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들면, Ile, Thr 및 Val)에 대해 치환된 베타 분지된 측쇄를 갖는 아미노산, 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들면, His, Phe, Trp 및 Tyr)에 대해 치환된 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 등일 수 있다.
항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 본질적으로 규정된 아미노산 서열 또는 본원에 기재된 서열로 이루어질 수 있어서, 다른 성분, 예를 들면 다른 아미노산은 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인 기능적 변이체의 생물학적 활성을 상당히 변경하지 않는다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 변형된 Fc 영역을 함유하고, 변형은 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 조절한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체(예를 들면, 적어도 2개의 아쥬반트 모이어티에 접합된 항체)는 Fc 영역에서 돌연변이가 결여된 자연적 항체와 비교하여 하나 이상의 Fc 수용체(예를 들면, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 및/또는 FcγRIIIB(CD16b))에 대한 결합을 조절하는(예를 들면, 결합을 증가시키거나 결합을 감소시키는) Fc 영역에서의 하나 이상의 변형(예를 들면, 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 FcγRIIB에 대한 항체의 Fc 영역의 결합을 감소시키는 Fc 영역에서의 하나 이상의 변형(예를 들면, 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 Fc 영역에서 돌연변이가 결여된 자연적 항체와 비교하여 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A) 및/또는 FcRγIIIA(CD16a)에 대한 동일한 결합을 유지시키거나 증가된 결합을 가지면서 FcγRIIB에 대한 항체의 결합을 감소시키는 항체의 Fc 영역에서의 하나 이상의 변형(예를 들면, 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환)을 함유한다. 일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 FcγRIIB에 대한 항체의 Fc 영역의 결합을 증가시키는 Fc 영역에서의 하나 이상의 변형을 함유한다.
일부 실시형태에서, 조절된 결합은 항체의 자연적 Fc 영역에 대한 항체의 Fc 영역에서의 돌연변이에 의해 제공된다. 돌연변이는 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 이들의 조합에 있을 수 있다. "자연적 Fc 영역"은 "야생형 Fc 영역"과 동의어이고, 자연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일하거나 자연적 항체(예를 들면, 세툭시맙)에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 자연적 서열 인간 Fc 영역은 자연적 서열 인간 IgG1 Fc 영역, 자연적 서열 인간 IgG2 Fc 영역, 자연적 서열 인간 IgG3 Fc 영역 및 자연적 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 천연 발생 변이체를 포함한다. 자연적 서열 Fc는 Fc의 다양한 알로타입을 포함한다(Jefferis et al., (2009) mAbs, 1(4):332-338).
일부 실시형태에서, 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합을 조절하는 Fc 영역에서의 돌연변이는 SD(S239D), SDIE(S239D/I332E), SE(S267E), SELF(S267E/L328F), SDIE(S239D/I332E), SDIEAL(S239D/I332E/A330L), GA(G236A), ALIE(A330L/I332E), GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E), V9(G237D/P238D/P271G/A330R) 및 V11(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)의 돌연변이 중 하나 이상, 및/또는 E233, G237, P238, H268, P271, L328 및 A330의 아미노산에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Fc 수용체 결합을 조절하기 위한 추가 Fc 영역 변형은 예를 들면 US 2016/0145350호 및 US 7416726호 및 US 5624821호에 기재되어 있고, 이들은 본원에서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체의 항체의 Fc 영역은 자연적 비변형된 Fc 영역과 비교하여 Fc 영역의 변경된 글리코실화 패턴을 갖도록 변형된다.
인간 면역글로불린은 각각의 중쇄의 Cγ2 도메인에서의 Asn297 잔기에서 글리코실화된다. 이 N-연결된 올리고사카라이드는 코어 헵타사카라이드, N-아세틸글루코사민4만노스3(GlcNAc4Man3)으로 구성된다. 헵타사카라이드의 엔도글리코시다제 또는 PNGase F에 의한 제거는 항체 Fc 영역의 형태학적 변경을 야기하는 것으로 알려져 있고, 이는 활성화 FcγR에 대한 항체-결합 친화도를 상당히 감소시키고 감소된 효과기 기능으로 이어질 수 있다. 코어 헵타사카라이드는 대개 갈락토스, 이분할 GlcNAc, 푸코스 또는 시알산으로 장식되고, 이는 활성화 및 억제성 FcγR에 대한 Fc 결합에 다르게 영향을 미친다. 추가적으로, α2,6-시알화가 생체내 소염 활성을 향상시키는 한편, 탈푸코실화가 개선된 FcγRIIIa 결합 및 항체-의존적 세포 독성 및 항체-의존적 식세포작용에서 10배 증가로 이어진다는 것이 입증되었다. 따라서, 특이적 글리코실화 패턴은 염증성 효과기 기능을 제어하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 변형은 돌연변이이다. 예를 들면, Asn297에서의 치환. 일부 실시형태에서, Asn297은 글루타민으로 돌연변이된다(N297Q). FcγR-조절된 신호전달을 조절하는 항체에 의해 면역 반응을 제어하는 방법은 예를 들면 미국 특허 제7,416,726호 및 미국 특허 출원 공보 제2007/0014795호 및 제2008/0286819호에 기재되어 있고, 이들은 본원에서 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체의 항체는 비천연 발생 글리코실화 패턴을 갖는 조작된 Fab 영역을 함유하도록 변형된다. 예를 들면, 하이브리도마는 증가된 FcRγIIIa 결합 및 효과기 기능이 가능하게 하는 특정 돌연변이를 갖는 비푸코실화된 mAb, 탈시알화된 mAb 또는 탈글리코실화된 Fc를 분비하도록 유전 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체의 항체는 비푸코실화되도록 조작된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체의 전체 Fc 영역은 상이한 Fc 영역과 교환되어서, 항체의 Fab 영역은 비천연적 Fc 영역에 접합된다. 예를 들면, IgG1 Fc 영역을 보통 포함하는 세툭시맙의 Fab 영역은 IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA에 접합될 수 있거나, IgG4 Fc 영역을 보통 포함하는 니볼루맙의 Fab 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 또는 IgG2에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비천연적 Fc 도메인을 갖는 Fc 변형된 항체는 또한 기재된 Fc 도메인의 안정성을 조절하는 IgG4 Fc 내의 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대 S228P 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비천연적 Fc 도메인을 갖는 Fc 변형된 항체는 또한 FcR에 대한 Fc 결합을 조절하는 본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, FcR에 대한 Fc 영역의 결합을 조절하는 변형은 자연적 비변형된 항체와 비교할 때 이의 항원에 대한 항체의 Fab 영역의 결합을 변경하지 않는다. 다른 실시형태에서, FcR에 대한 Fc 영역의 결합을 조절하는 변형은 자연적 비변형된 항체와 비교할 때 이의 항원에 대한 항체의 Fab 영역의 결합을 증가시킨다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체는 특이적으로 CEA를 인식하고 이에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 작제물을 포함한다.
암배아 항원(CEA, CD66e, CEACAM5)의 상승된 발현은 신생물의 다양한 생물학적 양태, 특히 종양 세포 부착, 전이, 세포 면역 기전의 차단 및 항-아폽토시스 기능을 가짐에 연루된다. CEA는 세포-표면 항원이고, 또한 많은 암종에 대한 혈액 마커로서 사용된다. MN-14 및 hMN14로도 알려진 라베투주맙(CEA-CIDETM, Immunomedics, CAS 등록 번호 219649-07-7)은 인간화된 IgG1 단일클론 항체이고, 결장직장암의 치료에 대해 연구되었다(Blumenthal, R. et al (2005) Cancer Immunology Immunotherapy 54(4):315-327). 캄프토테신 유사체에 접합된 라베투주맙(라베투주맙 고비테칸, IMMU-130)은 CEA를 표적화하고, 재발성 또는 불응성 전이성 결장직장암을 갖는 환자에서 연구되고 있다(Sharkey, R. et al (2018), Molecular Cancer Therapeutics 17(1):196-203; Dotan, E. et al (2017), Journal of Clinical Oncology 35(9):3338-3346). 또한, 131I에 접합된 라베투주맙은 결장암 및 다른 고형 악성상태의 치료를 위해 임상 실험에서 평가되었다(Sharkey, R. et al (1995), Cancer Research (Suppl.) 55(23):5935s-5945s; Liersch, T. et al (2005), Journal of Clinical Oncology 23(27):6763-6770; Sahlmann, C.-O. et al (2017), Cancer 123(4):638-649).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 6676924호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 hMN-14/라베투주맙 서열 번호 1의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIK 서열 번호 1
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hMN-14/라베투주맙 서열 번호 2-8의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 6676924호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 6676924호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 hMN-14/라베투주맙 서열 번호 9의 가변 중쇄(VH)를 포함한다.
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWVAEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSS 서열 번호 9
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hMN-14/라베투주맙 서열 번호 10-16의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 6676924호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 8642742호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 hPR1A3 서열 번호 17의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK 서열 번호 17
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hPR1A3 서열 번호 18-24의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 8642742호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hPR1A3 서열 번호 25-31의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 8642742호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 7232888호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 hMFE-23 서열 번호 32의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
ENVLTQSPSSMSASVGDRVNIACSASSSVSYMHWFQQKPGKSPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSMQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 서열 번호 32
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hMFE-23 서열 번호 33-40의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 7232888호). 실시형태는 서열 번호 33 및 서열 번호 34의 LFR1의 2개의 변이체를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hMFE-23 서열 번호 41의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 7232888호).
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 서열 번호 41
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hMFE-23 서열 번호 42-49의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 7232888호). 실시형태는 서열 번호 42 및 서열 번호 43의 HFR1의 2개의 변이체를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 SM3E 서열 번호 50의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다(US 7232888호).
ENVLTQSPSSMSVSVGDRVTIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 서열 번호 50
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 SM3E 서열 번호 51-56 및 38-39의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 7232888호). 실시형태는 서열 번호 51 및 서열 번호 52의 LFR1의 2개의 변이체를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 NP-4/아르시투모맙 서열 번호 57의 가변 경쇄를 포함한다.
QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK 서열 번호 57
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 NP-4/아르시투모맙 서열 번호 58-64의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 NP-4/아르시투모맙 서열 번호 65의 가변 중쇄(VH)를 포함한다.
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS 서열 번호 65.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 NP-4 서열 번호 66-72의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 7776330호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 M5A/hT84.66 서열 번호 73의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIK 서열 번호 73
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 M5A/hT84.66 서열 번호 74-80의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 7776330호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 M5A/hT84.66 서열 번호 81의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 7776330호).
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS 서열 번호 81
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 M5A/hT84.66 서열 번호 82-88의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 7776330호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 9617345호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 hAb2-3 서열 번호 89의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK 서열 번호 89
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hAb2-3 서열 번호 90-96의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 9617345호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 서열 번호 97의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 9617345호).
EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS 서열 번호 97
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 hAb2-3 서열 번호 98-104의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 US 9982063호(본원에 이 목적을 위해 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 A240VL-B9VH/AMG-211 서열 번호 105의 가변 경쇄(VL 카파)를 포함한다.
QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL 서열 번호 105
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 A240VL-B9VH/AMG-211 서열 번호 106-112의 경쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 경쇄 프레임워크(LFR) 서열을 포함한다(US 9982063호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 B9VH 서열 번호 113의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 9982063호).
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 서열 번호 113
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 서열 번호 114-121의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 9982063호). 실시형태는 서열 번호 117 및 서열 번호 118의 CDR-H2의 2개의 변이체를 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 E12VH 서열 번호 122의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 9982063호).
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFILNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 서열 번호 122
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 서열 번호 123-129의 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) 또는 중쇄 프레임워크(HFR) 서열을 포함한다(US 9982063호).
본 발명의 실시형태에서, CEA-표적화 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 PR1A3 VH 서열 번호 130의 가변 중쇄(VH)를 포함한다(US 8642742호).
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSS 서열 번호 130
일부 실시형태에서, 항체 작제물은 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항체 작제물은 항체이다. 소정의 실시형태에서, 항체 작제물은 융합 단백질이다. 항원 결합 도메인은 단일-사슬 가변 영역 단편(scFv)일 수 있다. 합성 펩타이드를 통해 항체 경쇄의 V 도메인에 연결된 항체 중쇄의 가변(V) 도메인을 포함하는 절두된 Fab 단편인 단일-사슬 가변 영역 단편(scFv)은 일상적 재조합 DNA 기술 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 유사하게, 디설파이드 안정화된 가변 영역 단편(dsFv)은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체 작제물 또는 항원 결합 도메인은 항-CEA 항체의 항원 결합 도메인의 하나 이상의 가변 영역(예를 들면, 2개의 가변 영역)을 포함할 수 있고, 각각의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 변형된 Fc 영역을 함유하고, 변형은 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 조절한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 TGFβ1에 결합할 수 있는 형질전환 성장 인자 베타 1(TGFβ1) 수용체 또는 이의 단편의 포함에 의해 변형된다. 예를 들면, 수용체는 TGFβ 수용체 II(TGFβRII)일 수 있다. 일부 실시형태에서, TGFβ 수용체는 인간 TGFβ 수용체이다. 일부 실시형태에서, IgG는 본원에 포함된 US 9676863호에 기재된 것과 같은 TGFβRII 세포외 도메인(ECD)에 대한 C-말단 융합을 갖는다. "Fc 링커"는 IgG를 TGFβRII 세포외 도메인에 부착시키기 위해 사용될 수 있다. Fc 링커는 표적에 대한 결합 특이성을 유지시키면서 분자의 적절한 3차원 폴딩이 가능하게 하는 짧은 가요성 펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, TGFβ 수용체의 N-말단은 (Fc 링커에 의해 또는 이것 없이) 항체 작제물의 Fc에 융합된다.　일부 실시형태에서, 항체 작제물 중쇄의 C-말단은 (Fc 링커에 의해 또는 이것 없이) TGFβ 수용체에 융합된다. 일부 실시형태에서, 항체 작제물 중쇄의 C-말단 리신 잔기는 알라닌으로 돌연변이된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 글리코실화된다.
일부 실시형태에서, 면역접합체에서의 항체는 조작된 시스테인이 접합에 이용 가능하지만, 면역글로불린 폴딩 및 어셈블리를 방해하지 않거나 항원 결합 및 효과기 기능을 변경하지 않는 부위에서의 시스테인 치환을 통한 항체에 대한 아쥬반트, 표지 또는 약물 모이어티의 부위 특이적 접합을 제공하는 시스테인 조작된 항체이다(Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541호; US 7723485호; US 2012/0121615호; WO 2009/052249호). "시스테인 조작된 항체" 또는 "시스테인 조작된 항체 변이체"는 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 항체이다. 시스테인-조작된 항체는 균질한 화학량론(예를 들면, 단일 조작된 시스테인 부위를 갖는 항체에서의 항체당 2개 이하의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티)으로 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물로서 8-Het-2-아미노벤자제핀 아쥬반트 모이어티에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표 3의 면역접합체를 제조하기 위해 사용된 시스테인-조작된 항체는 경쇄의 149-리신 부위에서 도입된 시스테인 잔기(LC K149C)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 시스테인-조작된 항체는 중쇄의 118-알라닌 부위(EU 넘버링)에서 도입된 시스테인 잔기(HC A118C)를 갖는다. 이 부위는 대안적으로 순차적 넘버링에 의해 121로 숫자 매겨지거나 카밧 넘버링에 의해 114로 숫자 매겨진다. 다른 실시형태에서, 시스테인-조작된 항체는 카밧 넘버링에 따라 G64C 또는 R142C에서의 경쇄에서 도입되거나 카밧 넘버링에 따라 D101C, V184C 또는 T205C에서의 중쇄에서 도입된 시스테인 잔기를 갖는다.
8-Het-2-아미노벤자제핀 아쥬반트 화합물
본 발명의 면역접합체는 8-Het-2-아미노벤자제핀 아쥬반트 모이어티를 포함한다. 본원에 기재된 아쥬반트 모이어티는 면역 반응을 일으키는 화합물(즉, 면역자극제)이다. 일반적으로, 본원에 기재된 아쥬반트 모이어티는 TLR 효능제이다. TLR은 척추동물에서의 선천성 면역 반응의 개시를 담당하는 유형-I 막관통 단백질이다. TLR은 박테리아, 바이러스 및 진균으로부터의 여러 가지의 병원균-연관된 분자 패턴을 인식하고 침범 병원균에 대해 제1선 방어로서 작용한다. TLR은 세포 발현 및 이것이 개시시키는 신호전달 경로의 차이로 인해 중첩하지만 구별되는 생물학적 반응을 일으킨다. TLR은 (예를 들면, 천연 자극 또는 합성 TLR 효능제에 의해) 관여되면 신호 전달 캐스케이드를 개시시키고, 이는 어댑터 단백질 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(MyD88)을 통한 핵 인자-κB(NF-κB)의 활성화 및 IL-1 수용체 연관된 키나제(IRAK)의 동원으로 이어진다. 이후, IRAK의 인산화는 TNF-수용체 연관된 인자 6(TRAF6)의 동원으로 이어지고, 이는 NF-κB 억제제 I-κB의 인산화를 생성시킨다. 그 결과, NF-κB는 세포 핵에 진입하고, 프로모터가 NF-κB 결합 부위, 예컨대 사이토카인을 함유하는 유전자의 전사를 개시시킨다. TLR 신호전달에 대한 추가 조절 방식은 TNF-수용체 연관된 인자 6(TRAF6)의 TIR-도메인 함유 어댑터 유도 인터페론-β(TRIF)-의존적 유도 및 TRIF 및 TRAF3을 통한 MyD88 독립적 경로의 활성화를 포함하여서 인터페론 반응 인자 3(IRF3)의 인산화로 이어진다. 유사하게, MyD88 의존적 경로는 또한 IRF5 및 IRF7을 포함하는 몇몇 IRF 패밀리 구성원을 활성화하는 반면, TRIF 의존적 경로는 또한 NF-κB 경로를 활성화한다.
통상적으로, 본원에 기재된 아쥬반트 모이어티는 TLR7 및/또는 TLR8 효능제이다. TLR7 및 TLR8은 둘 다 단핵구 및 수지상 세포에서 발현된다. 인간에서, TLR7은 또한 형질세포양 수지상 세포(pDC) 및 B 세포에서 발현된다. TLR8은 대부분 골수성 기원의 세포, 즉 단핵구, 과립구 및 골수성 수지상 세포에서 발현된다. TLR7 및 TLR8은 바이러스 침습에 반응하기 위한 수단으로서 세포 내의 "외래" 단일-가닥 RNA의 존재를 검출할 수 있다. TLR8 효능제에 의한 TLR8-발현 세포의 처리는 높은 수준의 IL-12, IFN-γ, IL-1, TNF-α, IL-6 및 다른 염증성 사이토카인을 생성시킬 수 있다. 유사하게, TLR7 효능제에 의한 TLR7-발현 세포, 예컨대 pDC의 자극은 높은 수준의 IFN-α 및 다른 염증성 사이토카인을 생성시킬 수 있다. TLR7/TLR8 관여 및 생성된 사이토카인 생성은 수지상 세포 및 다른 항원-제시 세포를 활성화할 수 있어서, 종양 파괴로 이어지는 다양한 선천성 면역 반응 및 후천성 면역 반응 기전을 유도한다.
본 발명의 예시적인 8-Het-2-아미노벤자제핀 화합물(Hx)은 표 1에 기재되어 있다. 각각의 화합물은 합성되고 정제되고 질량 분광법에 의해 규명되었고, 표시된 질량을 갖는 것으로 나타났다. 추가 실험 절차는 실시예에서 발견된다. 인간 TLR7 또는 인간 TLR8을 발현하는 인간 배아 신장(HEK) 293 NFKB 리포터 세포에 대한 활성은 실시예 202에 따라 측정되었다. 표 1의 8-Het-2-아미노벤자제핀 화합물은 암 및 다른 장애를 치료하기 위해 유용한 치료 활성을 예측할 수 있는 TLR8 효능제 선택도의 놀랍고 예상치 못한 특성을 입증한다.
8-HET-2-아미노벤자제핀-링커 화합물
본 발명의 면역접합체는 항-CEA 항체와 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물, HxBzL의 접합에 의해 제조된다. 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물은 링커 단위에 공유 부착된 8-Het-2-아미노벤자제핀(HxBz) 모이어티를 포함한다. 링커 단위는 면역접합체의 안정성, 투과성, 용해도 및 다른 약동학, 안전성 및 효능 특성에 영향을 미치는 작용기 및 아단위를 포함한다. 링커 단위는 항체의 반응성 작용기와 반응하는, 즉 접합하는 반응성 작용기를 포함한다. 예를 들면, 항체의 친핵성 기, 예컨대 리신 측쇄 아미노는 HxBzL 링커 화합물의 친전자성 반응성 작용기와 반응하여 면역접합체를 형성한다. 또한, 예를 들면 항체의 시스테인 티올은 Hx-링커 화합물의 말레이미드 또는 브로모아세타미드 기와 반응하여 면역접합체를 형성한다.
HxBzL 링커 화합물에 적합한 친전자성 반응성 작용기는 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 에스테르 및 N-하이드록시설포숙신이미딜(설포닐-NHS) 에스테르(아민 반응성); 카보디이미드(아민 및 카복실 반응성); 하이드록시메틸 포스핀(아민 반응성); 말레이미드(티올 반응성); 할로겐화 아세타미드, 예컨대 N-요오도아세타미드(티올 반응성); 아릴 아지드(1차 아민 반응성); 불화 아릴 아지드(탄소-수소(C-H) 삽입을 통해 반응성); 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르(아민 반응성); 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르(아민 반응성); 이미도에스테르(아민 반응성); 이소시아네이트(하이드록실 반응성); 비닐 설폰(티올, 아민 및 하이드록실 반응성); 피리딜 디설파이드(티올 반응성); 및 벤조페논 유도체(C-H 결합 삽입을 통해 반응성)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가 시약은 Hermanson, Bioconjugate Techniques 2nd Edition, Academic Press, 2008에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 면역접합체의 설계, 제조 및 사용에 대한 제한 및 도전에 대한 해결책을 제시한다. 일부 링커는 혈류에서 불안정할 수 있어서, 표적 세포에서의 내재화 전에 허용 불가능한 약의 아쥬반트/약물을 방출한다(Khot, A. et al (2015) Bioanalysis 7(13):1633-1648). 다른 링커는 혈류에서의 안정성을 제공할 수 있지만, 세포내 방출 유효성은 부정적으로 영향을 받을 수 있다. 원하는 세포내 방출을 제공하는 링커는 통상적으로 혈류에서 불량한 안정성을 갖는다. 대안적으로 말하면, 혈류 안정성 및 세포내 방출은 통상적으로 역으로 관련된다. 게다가, 표준 접합 공정에서, 항체에 로딩된 아쥬반트/약물 모이어티의 양, 즉 약물 로딩, 접합 반응에서 형성된 응징체의 양 및 얻을 수 있는 최종 정제된 접합체의 수율이 상호관련된다. 예를 들면, 응집체 형성은 일반적으로 항체에 접합된 아쥬반트/약물 모이어티 및 이의 유도체의 당량의 수와 양으로 상관된다. 높은 약물 로딩 하에, 형성된 응집체는 치료 분야를 위해 제거되어야 한다. 그 결과, 약물 로딩-매개된 응집체 형성은 면역접합체 수율을 감소시키고 공정 확장이 어려워지게 할 수 있다.
예시적인 실시형태는 화학식 II의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물을 포함한다:
상기 식 중, Het는 헤테로사이클릴디일 및 헤테로아릴디일로부터 선택되고;
R1, R2, R3 및 R4는 H, C1-C12 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴, C2-C9 헤테로사이클릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 및 선택적으로
-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C1-C12 알킬디일)-OR5;
-(C3-C12 카보사이클릴);
-(C3-C12 카보사이클릴)-*;
-(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C3-C12 카보사이클릴)-NR5-C(=NR5)NR5-*;
-(C6-C20 아릴);
-(C6-C20 아릴디일)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-N(R5)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
-(C2-C20 헤테로사이클릴);
-(C2-C20 헤테로사이클릴)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-C(=NR5a)NR5-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C6-C20 아릴디일)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴);
-(C1-C20 헤테로아릴디일)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C1-C20 헤테로아릴)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-C(=O)-*;
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-C(=O)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-C(=O)N(R5)2;
-C(=O)N(R5)-*;
-C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)R5;
-C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)CO2R5;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=NR5a)N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5C(=NR5a)R5;
-C(=O)NR5-(C1-C8 알킬디일)-NR5(C2-C5 헤테로아릴);
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-N(R5)-*;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-*;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-N(R5)2;
-N(R5)-*;
-N(R5)C(=O)R5;
-N(R5)C(=O)-*;
-N(R5)C(=O)N(R5)2;
-N(R5)C(=O)N(R5)-*;
-N(R5)CO2R5;
-NR5C(=NR5a)N(R5)2;
-NR5C(=NR5a)N(R5)-*;
-NR5C(=NR5a)R5;
-N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-N(R5)-(C2-C5 헤테로아릴);
-N(R5)-S(=O)2-(C1-C12 알킬);
-O-(C1-C12 알킬);
-O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-O-C(=O)N(R5)2;
-O-C(=O)N(R5)-*;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*; 및
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-OH
로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되거나;
또는 R2 및 R3은 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
X1, X2, X3 및 X4는 결합, C(=O), C(=O)N(R5), O, N(R5), S, S(O)2 및 S(O)2N(R5)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 H, C6-C20 아릴, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴디일, C1-C12 알킬 및 C1-C12 알킬디일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 2개의 R5 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
R5a는 C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
별표 *은 L의 부착 부위를 나타내고, R1, R2, R3 및 R4 중 하나는 L에 부착되고;
L은
Q-C(=O)-PEG-;
Q-C(=O)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
Q-C(=O)-PEG-O-;
Q-C(=O)-PEG-O-C(=O)-;
Q-C(=O)-PEG-C(=O)-;
Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-;
Q-C(=O)-PEG-N(R6)-;
Q-C(=O)-PEG-N(R6)-C(=O)-;
Q-C(=O)-PEG-N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
Q-C(=O)-PEG-N+(R6)2-PEG-C(=O)-PEP-;
Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
Q-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
Q-C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
Q-C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-;
Q-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-;
Q-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
Q-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-C(=O);
Q-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-C(=O)-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-C(=O)-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
Q-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
Q-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
Q-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-; 및
Q-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고;
R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
PEG는 화학식 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-을 갖고; m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수이고;
Gluc는 하기 화학식을 갖고;
PEP는 하기 화학식을 갖고;
AA는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택되거나, AA 중 하나 이상 및 인접한 질소 원자는 5원 고리 프롤린 아미노산을 형성하고, 물결선은 부착점을 나타내고;
Cyc는 F, Cl, NO2, -OH, -OCH3 및 하기 구조를 갖는 글루쿠론산으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 C6-C20 아릴디일 및 C1-C20 헤테로아릴디일로부터 선택되고;
R7은 -CH(R8)O-, -CH2-, -CH2N(R8)- 및 -CH(R8)O-C(=O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 H, C1-C6 알킬, C(=O)-C1-C6 알킬 및 -C(=O)N(R9)2로부터 선택되고, R9는 H, C1-C12 알킬 및 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수로부터 얻어지거나, 2개의 R9 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
y는 2 내지 12의 정수이고;
z는 0 또는 1이고;
Q는 F, Cl, NO2 및 SO3 -로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 N-하이드록시숙신이미딜, N-하이드록시설포숙신이미딜, 말레이미드 및 페녹시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
알킬, 알킬디일, 알케닐, 알케닐디일, 알키닐, 알키닐디일, 아릴, 아릴디일, 카보사이클릴, 카보사이클릴디일, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴디일, 헤테로아릴 및 헤테로아릴디일은 F, Cl, Br, I, -CN, -CH3, -CH2CH3, -CH=CH2, -C≡CH, -C≡CCH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -C(CH3)2OH, -CH(OH)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH2OH, -CH2CH2SO2CH3, -CH2OP(O)(OH)2, -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2CF3, -CH2CHF2, -CH(CH3)CN, -C(CH3)2CN, -CH2CN, -CH2NH2, -CH2NHSO2CH3, -CH2NHCH3, -CH2N(CH3)2, -CO2H, -COCH3, -CO2CH3, -CO2C(CH3)3, -COCH(OH)CH3, -CONH2, -CONHCH3, -CON(CH3)2, -C(CH3)2CONH2, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NHCOCH3, -N(CH3)COCH3, -NHS(O)2CH3, -N(CH3)C(CH3)2CONH2, -N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3, -NHC(=NH)H, -NHC(=NH)CH3, -NHC(=NH)NH2, -NHC(=O)NH2, -NO2, =O, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2OCH3, -OCH2CH2OH, -OCH2CH2N(CH3)2, -O(CH2CH2O)n-(CH2)mCO2H, -O(CH2CH2O)nH, -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OP(O)(OH)2, -S(O)2N(CH3)2, -SCH3, -S(O)2CH3 및 -S(O)3H로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 독립적으로 및 선택적으로 치환된다.
화학식 II의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물의 예시적인 실시형태는 Q가 하기로부터 선택된 것을 포함한다:
화학식 II의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물의 예시적인 실시형태는 Q가 하나 이상의 F로 치환된 페녹시인 것을 포함한다.
화학식 II의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물의 예시적인 실시형태는 Q가 2,3,5,6-테트라플루오로페녹시인 것을 포함한다.
8-Het-2-아미노벤자제핀-링커(HxBzL) 화합물의 예시적인 실시형태는 표 2a 및 표 2b로부터 선택된다. 각각의 화합물은 합성되고 정제되고 질량 분광법에 의해 규명되었고, 표시된 질량을 갖는 것으로 나타났다. 추가 실험 절차는 실시예에서 발견된다. 표 2a 및 표 2b의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물은 암 및 다른 장애를 치료하기 위해 유용한 치료 활성을 예측할 수 있는 TLR8 효능제 선택도의 놀랍고 예상치 못한 특성을 입증한다. 표 2의 화학식 II 화합물인 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 중간체는 표 3a 및 표 3b의 면역접합체를 형성하기 위해 실시예 201의 방법에 의해 항체와의 접합에 사용된다.
CEA 면역접합체
면역-자극 항체 접합체, 즉 면역접합체는 종양-침윤 골수성 세포를 활성화하고 넓은 선천성 및 적응성 항-종양 면역 반응을 개시시키기 위해 TLR7/8 효능제를 종양으로 지시한다(Ackerman, et al., (2021) Nature Cancer 2:18-33.
CEA(CEACAM5)는 다수의 고형 종양에서 고도로 발현된 잘 검증된 세포-표면 항원이다. 튼튼한 세포 표면 발현, 낮은 내재화 비율 및 제한된 정상 조직 발현을 포함하는 CEA의 양호한 특성은 그 항원이 CEA-발현 암을 치료하기 위해 다기능적 접근법에서 면역접합체에 대한 적합한 표적일 수 있다는 것을 제시한다.
면역접합체의 예시적인 실시형태는 링커에 의해 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀(Hx) 모이어티에 공유 부착된 항-CEA 항체를 포함하고, 화학식 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
상기 식 중,
Ab는 CEA에 결합하는 항원 결합 도메인을 갖는 항체 작제물이고;
p는 1 내지 8의 정수이고;
Hx는 하기 화학식을 갖는 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티이고;
Het는 헤테로사이클릴디일 및 헤테로아릴디일로부터 선택되고;
R1, R2, R3 및 R4는 H, C1-C12 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴, C2-C9 헤테로사이클릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 및 선택적으로
-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C1-C12 알킬디일)-OR5;
-(C3-C12 카보사이클릴);
-(C3-C12 카보사이클릴)-*;
-(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C3-C12 카보사이클릴)-NR5-C(=NR5)NR5-*;
-(C6-C20 아릴);
-(C6-C20 아릴디일)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-N(R5)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
-(C2-C20 헤테로사이클릴);
-(C2-C20 헤테로사이클릴)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-C(=NR5a)NR5-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C6-C20 아릴디일)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴);
-(C1-C20 헤테로아릴)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-(C1-C20 헤테로아릴)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
-(C1-C20 헤테로아릴)-N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-C(=O)-*;
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-C(=O)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-C(=O)N(R5)2;
-C(=O)N(R5)-*;
-C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)R5;
-C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)CO2R5;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=NR5a)N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5C(=NR5a)R5;
-C(=O)NR5-(C1-C8 알킬디일)-NR5(C2-C5 헤테로아릴);
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-N(R5)-*;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-*;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
-N(R5)2;
-N(R5)-*;
-N(R5)C(=O)R5;
-N(R5)C(=O)-*;
-N(R5)C(=O)N(R5)2;
-N(R5)C(=O)N(R5)-*;
-N(R5)CO2R5;
-NR5C(=NR5a)N(R5)2;
-NR5C(=NR5a)N(R5)-*;
-NR5C(=NR5a)R5;
-N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-N(R5)-(C2-C5 헤테로아릴);
-N(R5)-S(=O)2-(C1-C12 알킬);
-O-(C1-C12 알킬);
-O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
-O-C(=O)N(R5)2;
-O-C(=O)N(R5)-*;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*; 및
-S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-OH
로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되거나;
또는 R2 및 R3은 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
X1, X2, X3 및 X4는 결합, C(=O), C(=O)N(R5), O, N(R5), S, S(O)2 및 S(O)2N(R5)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 H, C6-C20 아릴, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴디일, C1-C12 알킬 및 C1-C12 알킬디일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 2개의 R5 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
R5a는 C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
별표 *은 L의 부착 부위를 나타내고, R1, R2, R3 및 R4 중 하나는 L에 부착되고;
L은
-C(=O)-PEG-;
-C(=O)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
-C(=O)-PEG-O-;
-C(=O)-PEG-O-C(=O)-;
-C(=O)-PEG-C(=O)-;
-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-;
-C(=O)-PEG-N(R6)-;
-C(=O)-PEG-N(R6)-C(=O)-;
-C(=O)-PEG-N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
-C(=O)-PEG-N+(R6)2-PEG-C(=O)-PEP-;
-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
-C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
-C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
-C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-;
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-;
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-C(=O);
-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-C(=O)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-C(=O)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-; 및
-숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고;
R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
PEG는 화학식 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-; m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수이고;
Gluc는 하기 화학식을 갖고;
PEP는 하기 화학식을 갖고;
AA는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택되거나, AA 중 하나 이상 및 인접한 질소 원자는 5원 고리 프롤린 아미노산을 형성하고, 물결선은 부착점을 나타내고;
Cyc는 F, Cl, NO2, -OH, -OCH3 및 하기 구조를 갖는 글루쿠론산으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 C6-C20 아릴디일 및 C1-C20 헤테로아릴디일로부터 선택되고;
R7은 -CH(R8)O-, -CH2-, -CH2N(R8)- 및 -CH(R8)O-C(=O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 H, C1-C6 알킬, C(=O)-C1-C6 알킬 및 -C(=O)N(R9)2로부터 선택되고, R9는 H, C1-C12 알킬 및 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수로부터 얻어지거나, 2개의 R9 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
y는 2 내지 12의 정수이고;
z는 0 또는 1이고;
알킬, 알킬디일, 알케닐, 알케닐디일, 알키닐, 알키닐디일, 아릴, 아릴디일, 카보사이클릴, 카보사이클릴디일, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴디일, 헤테로아릴 및 헤테로아릴디일은 F, Cl, Br, I, -CN, -CH3, -CH2CH3, -CH=CH2, -C≡CH, -C≡CCH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -C(CH3)2OH, -CH(OH)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH2OH, -CH2CH2SO2CH3, -CH2OP(O)(OH)2, -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2CF3, -CH2CHF2, -CH(CH3)CN, -C(CH3)2CN, -CH2CN, -CH2NH2, -CH2NHSO2CH3, -CH2NHCH3, -CH2N(CH3)2, -CO2H, -COCH3, -CO2CH3, -CO2C(CH3)3, -COCH(OH)CH3, -CONH2, -CONHCH3, -CON(CH3)2, -C(CH3)2CONH2, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NHCOCH3, -N(CH3)COCH3, -NHS(O)2CH3, -N(CH3)C(CH3)2CONH2, -N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3, - NHC(=NH)H, -NHC(=NH)CH3, -NHC(=NH)NH2, -NHC(=O)NH2, -NO2, =O, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2OCH3, -OCH2CH2OH, -OCH2CH2N(CH3)2, -O(CH2CH2O)n-(CH2)mCO2H, -O(CH2CH2O)nH, -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OP(O)(OH)2, -S(O)2N(CH3)2, -SCH3, -S(O)2CH3 및 -S(O)3H로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 독립적으로 및 선택적으로 치환된다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체가 라베투주맙 및 아르시투모맙, 또는 이의 바이오시밀러 또는 바이오베터로부터 선택된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체 작제물이 하기를 포함하는 것을 포함한다:
a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
b) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
c) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
d) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
e) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
f) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
g) 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
h) 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 또는
i) 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체 작제물이 서열 번호 1, 17, 32, 50, 57, 73, 89 및 105로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 9, 41, 65, 81, 97, 113, 122 및 130으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체 작제물이 서열 번호 1, 17, 32, 50, 57, 73, 89 및 105로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 9, 41, 65, 81, 97, 113, 122 및 130으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체 작제물이 서열 번호 105로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 118로부터의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) CDR-H2를 포함하는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 항체 작제물이 서열 번호 105로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 113으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 것을 포함한다
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 Het가 피리딜디일, 피리미딜디일, 피라졸릴디일, 피페라지닐디일, 피페리디닐디일 및 피라지닐디일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X1이 결합이고, R1이 H인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X2가 결합이고, R2가 C1-C8 알킬인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X2 및 X3이 각각 결합이고, R2 및 R3이 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5, -(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2, -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2로부터 독립적으로 선택된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2가 C1-C8 알킬이고, R3이 -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2가 -CH2CH2CH3이고, R3이 -CH2CH2CH2NHCO2(t-Bu), -OCH2CH2NHCO2(사이클로부틸) 및 -CH2CH2CH2NHCO2(사이클로부틸)로부터 선택된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2 및 R3이 각각 독립적으로 -CH2CH2CH3, -OCH2CH3, -OCH2CF3, -CH2CH2CF3, -OCH2CH2OH 및 -CH2CH2CH2OH로부터 선택된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2 및 R3이 각각 -CH2CH2CH3인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2가 -CH2CH2CH3이고, R3이-OCH2CH3인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X3-R3이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다:
.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X4가 결합이고, R4가 H인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R1이 L에 부착된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R2 또는 R3이 L에 부착된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X3-R3-L이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다:
상기 식 중, 물결선은 N에 대한 부착점을 나타낸다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R4가 C1-C12 알킬인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 R4가 -(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*인 것을 포함하고; 별표 *은 L의 부착 부위를 나타낸다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 -C(=O)-PEG- 또는 -C(=O)-PEG-C(=O)-인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 항체의 시스테인 티올에 부착된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 PEG에 대해 m이 1 또는 2이고, n이 2 내지 10의 정수인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 PEP를 포함하고, PEP가 디펩타이드이고, 하기 화학식을 갖는 것을 포함한다:
.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 AA1 및 AA2가 H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, -CH2SO3H 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 독립적으로 선택되거나; AA1 및 AA2가 5원 고리 프롤린 아미노산을 형성하는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 AA1이 -CH(CH3)2이고, AA2가 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2인 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 AA1 및 AA2가 GlcNAc 아스파르트산, -CH2SO3H 및 -CH2OPO3H로부터 독립적으로 선택된 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 PEP가 하기 화학식을 갖는 것을 포함한다:
.
상기 식 중, AA1 및 AA2는 천연 발생 아미노산의 측쇄로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 PEP를 포함하고, PEP가 트리펩타이드이고, 하기 화학식을 갖는 것을 포함한다:
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화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 PEP를 포함하고, PEP가 테트라펩타이드이고, 하기 화학식을 갖는 것을 포함한다:
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화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는
AA1이 Abu, Ala 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택되고;
AA2가 Nle(O-Bzl), Oic 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되고;
AA3이 Ala 및 Met(O)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
AA4가 Oic, Arg(NO2), Bpa 및 Nle(O-Bzl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 PEP를 포함하고, PEP가 Ala-Pro-Val, Asn-Pro-Val, Ala-Ala-Val, Ala-Ala-Pro-Ala(서열 번호 131), Ala-Ala-Pro-Val(서열 번호 132) 및 Ala-Ala-Pro-Nva(서열 번호 133)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 PEP를 포함하고, PEP가 하기 구조로부터 선택되는 것을 포함한다:
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화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 L이 하기 구조로부터 선택되는 것을 포함한다:
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상기 식 중, 물결선은 R5에 대한 부착을 나타낸다.
화학식 Ia를 갖는 화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태:
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화학식 Ia의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X4가 결합이고, R4가 H인 것을 포함한다.
화학식 Ia의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X2 및 X3이 각각 결합이고, R2 및 R3이 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5, -(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2, -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2로부터 독립적으로 선택되는 것을 포함한다.
화학식 Ib-Ii로부터 선택된 화학식 Ia의 면역접합체의 예시적인 실시형태:
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화학식 Ia의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X2 및 X3이 각각 결합이고, R2 및 R3이 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5로부터 독립적으로 선택되는 것을 포함한다.
화학식 Ia의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 X2 및 X3이 각각 결합이고, R2가 C1-C8 알킬이고, R3이 -O-(C1-C12 알킬) 및 -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5로부터 선택되는 것을 포함한다.
본 발명은 화학식 I 실시형태의 특징의 모든 합당한 조합 및 순열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 면역접합체 화합물은 면역자극 활성을 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 항체-약물 접합체는 유효량의 8-Het-2-아미노벤자제핀 약물을 종양 조직에 선택적으로 전달하고, 이에 의해 더 높은 선택도(즉, 더 낮은 효과적인 용량)는 비접합된 8-Het-2-아미노벤자제핀에 비해 치료 지수("치료 윈도우")를 증가시키면서 달성될 수 있다.
약물 로딩은 화학식 I의 면역접합체에서의 항체당 HxBz 모이어티의 수인 p로 표시된다. 약물(HxBz) 로딩은 항체당 1개 내지 약 8개의 약물 모이어티(D)의 범위일 수 있다. 화학식 I의 면역접합체는 1 내지 약 8의 약물 모이어티의 범위와 접합된 항체의 혼합물 또는 수집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 리신 및 시스테인과 같은 반응성 또는 이용 가능한 아미노산 측쇄 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 실시형태에서, 유리 시스테인 잔기는 본원에 기재된 방법에 의해 항체 아미노산 서열로 도입된다. 이러한 양태에서, p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 및 이의 범위, 예컨대 1 내지 8 또는 2 내지 5일 수 있다. 임의의 이러한 양태에서, p 및 n은 동일하다(즉, p = n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 또는 이들 사이의 일부 범위). 화학식 I의 예시적인 면역접합체는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유리 시스테인 잔기는 조작의 사용 없이 사슬내 디설파이드 결합을 형성하는 항체에 이미 존재하고, 이 경우에 이미 있는 유리 시스테인 잔기는 항체를 약물에 접합하도록 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 하나 이상의 유리 시스테인 잔기를 생성하기 위해 항체의 접합 전에 환원 조건에 노출된다.
일부 면역접합체에 대해, p는 항체에 대한 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 소정의 예시적인 실시형태에서처럼 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 시스테인 티올 기의 오직 하나 또는 제한된 수를 가질 수 있거나, 약물이 부착될 수 있는 충분히 반응성인 티올 기의 오직 하나 또는 제한된 수를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체에서의 하나 이상의 리신 아미노 기는 화학식 II의 Hx-링커 화합물과의 접합에 이용 가능하고 반응성일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 더 높은 약물 로딩, 예를 들면 p > 5는 소정의 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성의 소실을 야기할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 면역접합체에 대한 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 항체는 반응성 친핵성 기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 나타내도록 변성 조건으로 처리된다.
면역접합체의 로딩(약물/항체 비)은 상이한 방식으로 예를 들면 (i) 항체에 대한 Hx-링커 중간체 화합물의 몰 과량의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한 및 (iii) 최적화된 항체 반응성에 대한 부분 또는 제한 환원 변성 조건에 의해 제어될 수 있다.
항체의 하나 초과의 친핵성 기가 약물과 반응하는 경우에, 생성된 생성물이 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 면역접합체 화합물의 혼합물이라는 것으로 이해되어야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별 면역접합체 분자는 질량 분광법에 의해 혼합물에서 확인되고 HPLC, 예를 들면 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다(예를 들면, McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004 참조). 소정의 실시형태에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질한 면역접합체는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
화학식 I의 면역접합체의 예시적인 실시형태는 표 3a 및 3b 항-CEA, HxBz 면역접합체로부터 선택된다. 시험관내 면역접합체 활성의 평가는 실시예 203의 방법에 따라 수행되었다.
면역접합체의 조성물
본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 복수의 면역접합체 및 선택적으로 이에 대한 담체, 예를 들면 약학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물, 예를 들면 약학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한 조성물 또는 제형을 제공한다. 면역접합체는 조성물에서 동일하거나 상이할 수 있고, 즉 조성물은 항체 작제물에서 동일한 위치에 연결된 동일한 수의 아쥬반트를 갖는 면역접합체 및/또는 항체 작제물에서 상이한 위치에 연결된 동일한 수의 Hx 아쥬반트를 갖거나, 항체 작제물에서 동일한 위치에 연결된 상이한 수의 아쥬반트를 갖거나, 항체 작제물에서 상이한 위치에 연결된 상이한 수의 아쥬반트를 갖는 면역접합체를 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 면역접합체 화합물을 포함하는 조성물은 면역접합체 화합물의 혼합물을 포함하고, 면역접합체 화합물의 혼합물에서의 항체당 평균 약물(Hx) 로딩은 약 2 내지 약 5이다.
본 발명의 면역접합체의 조성물은 평균 아쥬반트 대 항체 작제물 비(DAR)가 약 0.4 내지 약 10일 수 있다. 당업자는 항체 작제물에 접합된 8-Het-2-아미노벤자제핀 아쥬반트의 수가 본 발명의 다수의 면역접합체를 포함하는 조성물에서 면역접합체마다 변할 수 있고, 이에 따라 아쥬반트 대 항체 작제물(예를 들면, 항체) 비가 약물(아쥬반트) 대 항체 비(DAR)라 지칭될 수 있는 평균으로서 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 아쥬반트 대 항체 작제물(예를 들면, 항체) 비는 임의의 적합한 수단에 의해 평가될 수 있고, 이들 중 많은 것이 당해 분야에 알려져 있다.
접합 반응으로부터의 면역접합체의 제조에서 항체당 아쥬반트 모이어티의 평균 수(DAR)는 종래의 수단, 예컨대 질량 분광법, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 규명될 수 있다. p의 면에서 조성물에서의 면역접합체의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. 일부 경우에, 다른 약물 로딩을 갖는 면역접합체로부터의 p가 소정의 값인 균질한 면역접합체의 분리, 정제 및 규명은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 면역접합체는 비경구 투여, 예컨대 IV 투여 또는 체강 또는 장기의 내강으로의 투여를 위해 제형화될 수 있다. 대안적으로, 면역접합체는 종양내로 주사될 수 있다. 주사용 조성물은 흔히 약학적으로 허용 가능한 담체에 용해된 면역접합체의 용액을 포함할 것이다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물 및 하나 이상의 염, 예컨대 염화나트륨의 등장성 용액, 예를 들면 링거액이 있다. 게다가, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 관습대로 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 완하성 고정유를 사용할 수 있다. 게다가, 지방산, 예컨대 올레산은 마찬가지로 주사제의 제조에 사용될 수 있다. 이 조성물은 바람직하게는 멸균이고 일반적으로 원치 않는 물질이 없다. 이 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균화 기법에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건을 근사화하는 데 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 및 기타를 함유할 수 있다.
조성물은 임의의 적합한 농도의 면역접합체를 함유할 수 있다. 조성물에서의 면역접합체의 농도는 널리 변할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 및 기타에 기초하여 선택될 것이다. 소정의 실시형태에서, 주사를 위한 용액 제형에서의 면역접합체의 농도는 약 0.1%(w/w) 내지 약 10%(w/w)의 범위일 것이다.
면역접합체의 생물학적 활성
면역접합체 IC-2는 세포주의 패널에서 표면 발현된 CEA에 다르게 결합하고, 하기 표에 기재된 것과 같이 CEA 전사체 수준과 상관된다.
인간 결장직장암 어레이(n=247), 비소세포 폐암 어레이(n=69) 및 위/위식도암 어레이(n=114)를 CEA31 IHC 검정(Ventana/Cell Marque)으로 염색하였다. H-점수는 (1+ 염색 강도를 갖는 퍼센트 세포) + (2+ 염색 강도를 갖는 2X 퍼센트 세포) + (3+ 염색 강도를 갖는 3X 퍼센트 세포)로서 계산된다. 세포당 IC-2 결합 부위는 주어진 종양 세포가 결합하는 IC-2 분자의 수를 나타내고, 세포의 표면에 대한 항원 발현의 수준과 상관된다. 생존가능 종양 세포를 수확하고 100 nM에서의 Alexa Flour 488 표지된 IC-2 또는 Alexa Flour 488 표지된 hIgG1 아이소타입 대조군으로 표지한 후, 유세포분석법 분석하였다. IC-2 결합 부위는 Bangs Laboratories로부터의 QSC 비드를 사용하여 결정되었다. 비특이적 결합 부위는 IC-2 결합 부위로부터 hIgG1 아이소타입 대조군 결합 부위를 공제함으로서 수정되었다.
도 1은 마우스에서의 생체내 이종이식 종양 모델을 보여준다. 처리 후 시간에 걸친 종양 부피는 CEA-고 인간 췌장 HPAF-II 종양을 보유하는 마우스의 종양 억제에서 면역접합체 IC-2의 효능을 아이소타입 면역접합체(ISAC) 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2와 비교하기 위해 측정되었다. 면역접합체 IC-2는 0.5 mg/kg만큼 낮은 용량 수준에서 CEA-고 인간 췌장 HPAF-II 종양의 용량 의존적 성장 억제를 나타낸다. 아이소타입 ISAC는 IC-2와 동일한 아쥬반트-링커인 HxBzL-5에 접합된 항-CD20 항체(리툭시맙)의 면역접합체이다. 아이소타입 ISAC는 IC-2와 동일한 아쥬반트 링커(HxBzL-5)를 갖는다. 아이소타입 ISAC는 오프 타깃, 음성 대조군으로서 작용하여 아주 적은 종양 성장 억제를 보여주거나 종양 성장 억제를 보여주지 않는다. 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2는 또한 이 연구에서 아주 적은 종양 성장 억제를 보여주거나 종양 성장 억제를 보여주지 않는다. 이 결과는 선천성 효과기 세포의 용량 의존적 종양 동원 및 면역-자극 사이토카인의 유도를 입증하고, 본 발명의 면역접합체가 CEA-발현 암을 치료하는 데 있어서 효과적일 수 있다는 것을 제시한다.
도 2a-도 2e는 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2에 의한 CEA-고, 위암 MKN-45 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서의 다양한 사이토카인의 유도의 그래프를 보여준다. 사이토카인 IL-12p70(도 2a), TNFα(종양 괴사 인자 알파)(도 2b), IL-6(인터류킨-6)(도 2c), IFNγ(인터페론 감마)(도 2d) 및 CCL2(도 2e)의 상청액으로 세포에 의해 분비된 수준을 측정하였다. 이 사이토카인의 유도는 암에 대한 면역 반응을 개시하는 것에 관련된다. 다양한 농도의 면역접합체 IC-2, IC-3, IC-4, IC-6, IC-14 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2를 18시간 동안 CEA-고 MKN-45 세포 및 cDC-농후화된 1차 세포 조제물(E:T = 10:1)과 항온처리하고, 이후 상청액을 회수하였다. LegendPlex 사이토카인 비드 어레이 키트를 사용하여 분비된 사이토카인 수준을 결정하였다. 시험된 면역접합체는 아쥬반트의 기능으로서 유도된 사이토카인의 수준의 면에서 변한다. 자연적 CEA.9-G1fhL2 항체는 아주 적은 사이토카인 분비를 유도하거나 사이토카인 분비를 유도하지 않아서, TLR7/8 활성화 아쥬반트에 대한 의존성을 입증한다.
도 3a-도 3d는 CEA-고 HPAF II 세포(도 3a), CEA-중 LoVo 세포(도 3b), CEA-저 LS-174T 세포(도 3c) 및 CEA-음성 MDA-MB-231 세포(도 3d)에서의 면역접합체 IC-2의 다양한 농도로 처리된 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포에 의한 식세포작용의 그래프를 보여준다. CTG-표지된 종양- IC-2 면역 복합체를 2:1의 효과기 대 표적 비로 M-CSF 분화된 단핵구-유래된 대식세포와 항온처리하였다. 4시간 후, 식세포작용을 CTG 신호에 양성인 효과기 세포에 대한 유세포분석법 게이팅에 의해 측정하였다. 3명의 공여자로부터의 평균 +/- 표준 편차는 그래프에 도시되어 있다. 항체 의존적 세포 식세포작용(ADCP)은 항체-옵소닌화된 표적 세포가 표적 세포의 내재화 및 분열로 이어지는 식세포작용을 유도하기 위해 대식세포의 표면에서 FcγR을 활성화하는 기전이다. 면역접합체 IC-2는 CEA-고 HPAF II(EC50 = 9.2 ± 2.3 nM) 및 CEA-중 LoVo(EC50 = 11.4 ± 3.5 nM)의 용량 의존적 식세포작용을 유도한다. 최소 ADCP는 CEA-저 LS-174T에 대해 관찰된다. IC-2는 CEA-음성 MDA-MB-231의 ADCP를 유도하지 않는다. 이 결과는 IC-2에 의한 ADCP의 유도가 표적 종양 세포에 의한 중/고 CEA 발현에 의존적이라는 것을 입증한다.
도 4a-도 4f는 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에 의한 다양한 농도의 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2의 항온처리 후 상청액에서의 분비된 사이토카인 수준 및 세포 표면 마커의 유도의 그래프를 보여준다. 면역접합체 IC-2 및 네이키드 항체 CEA.9-G1fhL2를 18시간 동안 CEA-양성 종양 세포(HPAF-II, LoVo 또는 LS174-T) 및 cDC-농후화된 1차 세포 조제물(E:T = 10:1)과 항온처리하고, 이후 상청액 및 세포를 회수하였다. 상청액에서의 분비된 사이토카인 수준(도 4a-도 4d)을 LegendPlex 사이토카인 비드 어레이 키트를 사용하여 결정하였다. 세포 표면 마커의 유도(도 4e-도 4f)를 유세포분석법에 의해 결정하였다. 암 세포와 cDC-농후화된 1차 세포 단리물의 공동배양에서, CEA-표적화된 면역접합체 IC-2는 암에 대한 면역 반응을 개시시키는 것과 관련된 사이토카인 TNF알파(도 4a), IL-6(도 4b), IL-12p70(도 4c) 및 CXCL10(도 4d)의 분비를 유도한다. 추가적으로, CD40(도 4e) 및 CD86(도 4f) 항원의 표면 수준은 선천성 면역력의 활성화(골수성 세포)와 일치하여 상승된다. 사이토카인의 수준 및 표면 마커 유도는 CEA-고 HPAF-II 및 CEA-중 LoVo 세포와 유사하지만, CEA-저 LS-174T 세포에 의해 현저히 감소된다. 사이토카인 및 표면 마커 연구는 CEA-발현 종양 세포 및 항-CEA ISAC IC-2에 노출될 때 골수성 세포의 활성화를 입증한다. CEA-고 HPAF-II 세포 및 CEA-중 LoVo 세포에 의해 활성화가 관찰된다. CEA-저 LS-174T 세포 및 CEA-음성 MDA-MB-231 세포에 의해 활성화가 낮거나 검출 가능하지 않다. 자연적 항체 CEA.9-G1fhL2는 골수성 활성화를 유도하지 않는다. 도 4a-도 4f로부터의 결과는 인간 암과 관련된 CEA 발현 수준에 대한 IC-2 활성의 의존성을 입증한다. 자연적 CEA.9-G1fhL2 항체는 아주 적은 사이토카인 분비를 유도하거나 사이토카인 분비를 유도하지 않아서, TLR7/8 활성화 페이로드에 대한 의존성을 입증한다.
면역접합체에 의해 암을 치료하는 방법
본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들면 암을 갖고 암에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 (예를 들면, 본원에 기재된 것과 같은 조성물로서) 치료학적 유효량의 본원에 기재된 것과 같은 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 표 3a 및 표 3b로부터 선택된 면역접합체(IC)를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 면역접합체가 예를 들면 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 다양한 과증식성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 예시적인 과증식성 장애는 양성 또는 악성 고형 종양 및 조혈 장애, 예컨대 백혈병 및 림프성 악성상태를 포함한다.
또 다른 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 면역접합체가 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 면역접합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 면역접합체를 제공한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들면 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서의 면역접합체의 용도를 제공한다. 일 실시형태에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이고, 상기 방법은 유효량의 약제를 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들면 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
암종은 상피 조직에서 기원하는 악성상태이다. 상피 세포는 신체의 외부 표면을 덮고, 장 동공에 늘어서고, 선상 조직의 내벽을 형성한다. 암종의 예는 선암(선상(분비) 세포에서 시작하는 암, 예컨대 유방, 췌장, 폐, 전립선, 위, 위식도 연접부 및 결장의 암), 부신 암종; 간세포 암종; 신장 세포 암종; 난소 암종; 제자리 암종; 유관 암종; 유방의 암종; 기저 세포 암종; 편평 세포 암종; 이행성 세포 암종; 결장 암종; 비인두 암종; 다실 낭종성 신세포 암종; 오트 세포 암종; 대세포 폐 암종; 소세포 폐 암종; 비소세포 폐 암종; 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암종은 전립선, 췌장, 결장, 뇌(보통 속발성 전이로서), 폐, 유방 및 피부에서 발견될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비소세포 폐 암종을 치료하는 방법은 CEA(예를 들면, 라베투주맙 또는, 이의 바이오시밀러 또는 이의 바이오베터)에 결합할 수 있는 항체 작제물을 포함하는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
연조직 종양은 결합 조직으로부터 유래된 희귀 종양의 매우 다양한 그룹이다. 연조직 종양의 예는 포상 연부 육종; 혈관종형 섬유성 조직구종; 연골점액양 섬유종; 골격 연골육종; 골격외 점액양 연골육종; 투명 세포 육종; 결합조직성 소원형-세포 종양; 피부섬유육종 홍염; 자궁내막 기질 종양; 유잉 육종; 섬유종증(유건종); 연소성 섬유육종; 위장 기질 종양; 골 거대 세포 종양; 건활막 거대 세포 종양; 염증성 근섬유아세포 종양; 자궁 횡문종; 횡문근육종; 지방모세포종; 전형적 지방종; 방추 세포 또는 다형성 지방종; 비정형 지방종; 연골 지방종; 잘 분화된 지방육종; 점액양/원형 세포 지방육종; 다형성 지방육종; 점액양 악성 섬유성 조직구종; 고등급 악성 섬유성 조직구종; 점액섬유육종; 악성 말초 신경초 종양; 중피종; 신경모세포종; 골연골종; 골육종; 원시 신경외배엽 종양; 페포 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 양성 또는 악성 신경초종; 활막 육종; 에반 종양; 결절성 근막염; 유건종-유형 섬유종증; 고립성 섬유성 종양; 피부섬유육종 홍염(DFSP); 혈관육종; 상피모양 혈관내피종; 건활막 거대 세포 종양(TGCT); 색소성 융모결절성 활막염(PVNS); 섬유이형성증; 점액섬유육종; 섬유육종; 활막 육종; 악성 말초 신경초 종양; 신경섬유종; 연조직의 다형성 선종; 및 섬유아세포, 근섬유아세포, 조직구, 혈관 세포/내피 세포 및 신경초 세포로부터 유래된 신생물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
육종은 중배엽 기원의 세포, 예를 들면 골에서 또는 연골, 지방, 근육, 혈관, 섬유성 조직 또는 다른 결합 또는 지지 조직을 포함하는 신체의 연조직에서 생기는 희귀 암 유형이다. 육종의 상이한 유형은 암이 형성하는 곳에 기초한다. 예를 들면, 골육종은 골에서 형성되고, 지방육종은 지방에서 형성되고, 횡문근육종은 근육에서 형성된다. 육종의 유형은 아스킨 종양; 포도상 육종; 연골육종; 유잉 육종; 악성 혈관내피종; 악성 신경초종; 골육종; 및 연조직 육종(예를 들면, 포상 연부 육종; 혈관육종; 낭상육종 엽상피부섬유육종 홍염(DFSP); 유건종 종양; 결합조직성 소원형-세포 종양; 상피모양 육종; 골격외 연골육종; 골격외 골육종; 섬유육종; 위장 기질 종양(GIST); 혈관주위세포종; 혈관 육종(더 흔히 "혈관육종"이라고 지칭됨); 카포시 육종; 횡문근육종; 지방육종; 림프관육종; 악성 말초 신경초 종양(MPNST); 신경섬유육종; 활막 육종; 및 미분화된 다형성 육종)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
기형종은 예를 들면, 모발, 근육 및 골을 포함하는 몇몇 상이한 유형의 조직을 함유할 수 있는(예를 들면, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 임의의 및/또는 모든 3개의 생식 층으로부터 유래된 조직을 포함할 수 있는) 생식 세포 종양의 유형이다. 기형종은 가장 흔하게는 여성에서는 난소에서 생기고, 남성에서는 고환에서 생시고, 아동에서는 꼬리뼈에서 생긴다.
흑색종은 멜라닌세포(멜라닌 색소를 만드는 세포)에서 시작하는 암의 유형이다. 흑색종은 점(피부 흑색종)에서 시작할 수 있지만, 또한 다른 색소침착된 조직, 예컨대 눈 또는 장에서 시작할 수 있다.
메르켈 세포 암종은 얼굴, 두부 또는 경부에서 살색 또는 멍든 붉은색의 결절로서 보통 보이는 희귀 피부암 유형이다. 메르켈 세포 암종은 또한 피부의 신경내분비 암종이라 칭한다. 일부 실시형태에서, 메르켈 세포 암종을 치료하는 방법은 CEA(예를 들면, 라베투주맙 또는, 이의 바이오시밀러 또는 이의 바이오베터)에 결합할 수 있는 항체 작제물을 포함하는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 메르켈 세포 암종은 투여가 발생할 때 전이된다.
백혈병은 혈액-형성 조직, 예컨대 골수에서 시작하고 많은 수의 비정상 혈액 세포가 생성되고 혈류로 진입하게 하는 암이다. 예를 들면, 백혈병은 보통 혈류에서 성숙하는 골수 유래된 세포에서 기원할 수 있다. 백혈병은 얼마나 빨리 질환이 발생하고 진행하는지(예를 들면, 급성 대 만성) 및 이환된 백혈구의 유형(예를 들면, 골수성 대 림프성)에 대해 명명된다. 골수성 백혈병은 또한 골수기원 또는 골수아구성 백혈병이라 칭해진다. 림프성 백혈병은 또한 림프아구성 또는 림프구성 백혈병이라 칭해진다. 림프성 백혈병 세포는 팽윤될 수 있는 림프절에서 수집될 수 있다. 백혈병의 예는 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
림프종은 면역계의 세포에서 시작하는 암이다. 예를 들면, 림프종은 보통 림프계에서 성숙하는 골수 유래된 세포에서 기원할 수 있다. 림프종의 2개의 기본적인 카테고리가 있다. 림프종의 하나의 카테고리는 리드-스텐베르크(Reed-Sternberg) 세포라 불리는 세포의 유형의 존재로 표시된 호지킨 림프종(HL)이다. 현재 HL의 6개의 인식된 유형이 있다. 호지킨 림프종의 예는 결절성 경화증 전통적 호지킨 림프종(CHL), 혼합 세포성 CHL, 림프구-결실 CHL, 림프구-농후 CHL 및 결절성 림프구 우세 HL을 포함한다.
림프종의 다른 카테고리는 면역계 세포의 큰 다양한 암 그룹을 포함하는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 비호지킨 림프종은 게으른 (느리게 진행) 과정을 갖는 암 및 공격적 (빠르게 진행) 과정을 갖는 암으로 추가로 나눠질 수 있다. 현재 NHL의 61개의 인식된 유형이 있다. 비호지킨 림프종의 예는 AIDS 관련된 림프종, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포 림프종, 모세포 NK-세포 림프종, 버킷 림프종, 버킷 유사 림프종(작은 비절단 세포 림프종), 만성 림프구성 백혈병/작은 림프구성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 미만성 대형 B-세포 림프종, 장병증-유형 T-세포 림프종, 소포성 림프종, 간비장 감마-델타 T-세포 림프종, T-세포 백혈병, 림프아구성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연계 림프종, 비강 T-세포 림프종, 소아 림프종, 말초 T-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 형질전환된 림프종, 치료 관련된 T-세포 림프종 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
뇌암은 뇌 조직의 임의의 암을 포함한다. 뇌암의 예는 신경교종(예를 들면, 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종 및 기타), 수막종, 뇌하수체 선종 및 전정 신경초종, 원시 신경외배엽 종양(수모세포종)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 면역접합체는 단독으로 또는 치료에서 다른 제제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역접합체는 적어도 하나의 추가 치료제, 예컨대 화학치료제와 공동투여될 수 있다. 이러한 병용 치료는 조합된 투여(여기서 2개 또는 초과의 치료제는 동일한 제형 또는 별개의 제형에 포함됨) 및 별개의 투여(이 경우에 면역접합체의 투여는 추가 치료제 및/또는 아쥬반트의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 발생할 수 있음)를 포함한다. 면역접합체는 또한 방사선 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 면역접합체(및 임의의 추가 치료제)는 경구, 비경구, 폐내 및 비강내, 및 원하면 국소 치료에 대해 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 점적은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성인지에 따라 예를 들면 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 비제한적인 예로서 다양한 시점에 걸친 단일 투여 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 점적을 포함하는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
면역접합체는 임의의 적합한 투약 섭생, 예컨대 라베투주맙, 이의 바이오시밀러 및 이의 바이오베터에 사용된 투약 섭생을 사용하여 임의의 치료학적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 예를 들면, 상기 방법은 대상체에게 약 100 ng/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량을 제공하도록 면역접합체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 면역접합체 용량은 약 5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg 또는 약 100 μg/kg 내지 약 1 mg/kg의 범위일 수 있다. 면역접합체 용량은 약 100, 200, 300, 400 또는 500 μg/kg일 수 있다. 면역접합체 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg일 수 있다. 면역접합체 용량은 또한 특정한 접합체뿐만 아니라 치료되는 암의 유형 및 중증도에 따라 이 범위 밖일 수 있다. 투여 빈도는 주마다 단일 용량 내지 다중 용량의 범위이거나 더 빈번할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역접합체는 달마다 약 1회 내지 주마다 약 5회 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역접합체는 주마다 1회 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 (예를 들면, 상기에 기재된 것과 같은 조성물로서) 면역접합체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 예방되는 소정의 암에 민감하다.
본 발명의 일부 실시형태는 상기에 기재된 것과 같은 암을 치료하는 방법을 제공하고, 암은 유방암이다. 유방암은 상이한 유방 부위에서 기원할 수 있고, 다수의 상이한 유형의 유방암이 규명되었다. 예를 들면, 본 발명의 면역접합체는 유관 제자리 암종; 침윤성 유관 암종(예를 들면, 관상 암종; 수질 암종; 점액성 암종; 유두 암종; 또는 유방의 사상엽 암종); 소엽 제자리 암종; 침윤성 소엽 암종; 염증성 유방암; 및 다른 형태의 유방암, 예컨대 삼중 음성(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 과량의 HER2 단백질에 음성인 시험) 유방암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유방암을 치료하는 방법은 CEA 또는 CEA를 과발현하는 종양에 결합할 수 있는 항체 작제물(예를 들면, 라베투주맙, 이의 바이오시밀러 또는 바이오베터)을 포함하는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 암은 TLR7 및/또는 TLR8에 의해 유도된 전염증성 반응에 민감하다.
일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 면역접합체는 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 방광암, 요로암, 요로상피 암종, 폐암, 비소세포 폐암, 메르켈 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 위암 또는 유방암을 치료하는 것을 필요로 하는 환자에게 투여된다. 메르켈 세포 암종 암은 전이성 메르켈 세포 암종일 수 있다. 유방암은 삼중-음성 유방암일 수 있다. 식도암은 위식도 연접부 선암종일 수 있다.
실시예
실시예 L-2 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피라졸-1-일]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-2의 합성
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2- 디옥사보롤란-2-일)피라졸-1-일]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-2a의 제법
THF(15 mL) 중의 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1H-피라졸(1 g, 5.15 mmol, 1 eq)의 용액에 0℃에서 PPh3(1.35 g, 5.15 mmol, 1 eq) 및 DEAD(0.89 g, 5.15 mmol, 0.94 mL, 1 eq)를 첨가하고, 25℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 이후 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-하이드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(3.02 g, 5.15 mmol, 1 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 20 mL로 희석하고, EtOAc(50 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(20 mL * 3)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 에틸 아세테이트: MeOH = 10:1)에 의해 정제하여 HxBzL-2a(3.5 g, 4.59 mmol, 89.04% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피라졸-1-일]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-2c의 제법
HxBzL-2a(625 mg, 819 umol, 2.5 eq), 2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBzL-2b(120 mg, 328 umol, 1 eq), 물(0.3 mL) 중의 Na2CO3(69.5 mg, 655 umol, 2 eq)의 용액과 DMF(3 mL) 중의 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐(II) 디클로라이드, Pd(dppf)Cl2(23.9 mg, 32.8 umol, 0.1 eq)의 혼합물을 탈기시키고, 이후 N2 하에 5시간 동안 120℃로 가열하였다. 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 35% 내지 65%, 10분)에 의해 정제하여 HxBzL-2c(300 mg, 290 umol, 88.4% 수율, TFA)를 황색의 고체로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피라졸-1-일]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-2d의 제법
물(3 mL) 및 MeCN(0.5 mL) 중의 HxBzL-2c(300 mg, 325 umol, 1 eq)의 용액에 HCl(12 M, 407 uL, 15 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켜 화합물 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피라졸-1-일]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(200 mg, 222 umol, 68.1% 수율, HCl)을 무색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-2의 제법
DCM(1 mL) 및 DMA(1 mL) 중의 HxBzL-2d(80.0 mg, 88.7 umol, 1 eq, HCl) 및 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(119 mg, 443 umol, 5 eq)의 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드, EDCI(84.9 mg, 443 umol, 5 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 25% 내지 50%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-2(30 mg, 24.8 umol, 28.01% 수율, TFA)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.20 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.65-7.61 (m, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.55-7.52 (m, 1H), 7.40 (s, 1H), 4.36 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.96 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.89-3.82 (m, 4H), 3.74 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.63-3.52 (m, 36H), 3.42 (s, 2H), 2.95 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.76 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1094.4 (계산치); LC/MS [M+H] 1094.3 (관찰치).
실시예 L-4 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[4-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]피페라진-1-일]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-4의 합성
2-아미노-N-에톡시-N-프로필-8-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-4b의 제법
디옥산(10 mL) 중의 2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-4a(0.5 g, 1.37 mmol, 1 eq), 4,4,5,5-테트라메틸-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란(520 mg, 2.05 mmol, 1.5 eq), Pd(dppf)Cl2(99.9 mg, 137 umol, 0.1 eq), KOAc(335 mg, 3.41 mmol, 2.5 eq)의 혼합물을 N2 하에 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 미정제 HxBz-4b를 정제 없이 다음 단계에 사용하고(564 mg, 1.36 mmol, 99.96% 수율), 검정색의 액체로서 얻었다.
tert-부틸 4-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]피페라진-1-카복실레이트, HxBz-4의 제법
디옥산(4 mL) 및 물(0.5 mL) 중의 HxBz-4b(0.45 g, 1.09 mmol, 1 eq), Pd(dppf)Cl2(39.8 mg, 54.4 umol, 0.05 eq), K2CO3(376 mg, 2.72 mmol, 2.5 eq), tert-부틸 4-(5-브로모피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(374 mg, 1.09 mmol, 1 eq)의 혼합물을 N2 하에 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 디옥산을 제거하고, 잔류물을 EtOAc(10 mL) 및 물(5 mL)로 희석하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1, 이후 EA:MeOH = 1.5:1)에 의해 정제하고, 이후 Prep-HPLC,칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 30% 내지 55%, 8분에 의해 추가로 정제하여 HxBz-4(0.35 g, 637 umol, 58.5% 수율)를 갈색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.74 (s, 2H), 7.72-7.63 (m, 2H), 7.60 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 3.99 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.93-3.88 (m, 4H), 3.77 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.60-3.51 (m, 4H), 3.43 (s, 2H), 1.80-1.75 (m, 2H), 1.51 (s, 9H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 550.3 (계산치); LC/MS [M+H] 550.2 (관찰치).
2-아미노-N-에톡시-8-(2-피페라진-1-일피리미딘-5-일)-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-3의 제법
DCM(5 mL) 중의 HxBz-4(20 mg, 36.4 umol, 1 eq)의 혼합물에 HCl/EtOAc(4 M, 5 mL, 550 eq)를 첨가하고, 이것을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 HxBz-3(10.5 mg, 21.4 umol, 58.9% 수율, 99.233% 순도, HCl)을 백색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.70 (s, 2H), 7.65-7.47 (m, 3H), 7.32 (s, 1H), 4.14-3.96 (m, 4H), 3.86 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.64 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 3.25-3.21 (m, 4H), 1.71-1.62 (m, 2H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 450.3 (계산치); LC/MS [M+H] 450.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[3-[2-아미노-4-[3-(tert-부톡시카보닐아미노)프로필-에톡시-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]페닐]설포닐아제티딘-3-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-4a의 제법
DMF(3 mL) 중의 HxBz-3(110 mg, 176 umol, 1 eq)의 혼합물에 DIEA(63.5 mg, 491 umol, 2.8 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(99.2 mg, 140 umol, 0.8 eq)을 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 Prep-HPLC(칼럼: Waters Xbridge Prep OBD C18 150 * 40 mm * 10 um; 이동상: [물(10mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 20% 내지 55%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-4a(28 mg, 24 umol, 13.7% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-4의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(0.3 mL) 중의 HxBzL-4a(78 mg, 78.8 umol, 1 eq)와 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(106 mg, 394 umol, 5 eq)의 혼합물에 EDCI(75.5 mg, 394 umol, 5 eq)를 첨가하고, 이후 이것을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 40%, 10분)에 의해 정제하여 HxBzL-4(39.8 mg, 26.4 umol, 33.5% 수율, 95.944% 순도, 2TFA)를 무색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.75 (s, 2H), 7.76-7.55 (m, 3H), 7.45 (s, 1H), 4.02-3.73 (m, 16H), 3.68-3.58 (m, 36H), 3.37 (s, 2H), 2.99 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.85-1.74 (m, 2H), 1.25-1.20 (m, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1218.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1218.3 (관찰치).
실시예 L-5 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-5의 합성
5-브로모-2-(브로모메틸)피리미딘, HxBz-5b의 제법
THF(10 mL) 중의 (5-브로모피리미딘-2-일)메탄올, HxBz-5a(300 mg, 1.59 mmol, 1.0 eq)의 용액에 PPh3(499 mg, 1.90 mmol, 1.2 eq) 및 CBr4(631 mg, 1.90 mmol, 1.2 eq)를 일 부분으로 N2 하에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 10시간 동안 교반하였다. 물(10 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(10 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 8/1)에 의해 정제하여 HxBz-5b(290 mg, 1.15 mmol, 72.4% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.81 (s, 2H), 4.59 (s, 2H).
tert-부틸 N-[(5-브로모피리미딘-2-일)메틸]-N-tert-부톡시카보닐-카바메이트, HxBz-5c의 제법
DMF(3 mL) 중의 HxBz-5b(290 mg, 1.15 mmol, 1.0 eq)와 tert-부틸 N-tert-부톡시카보닐카바메이트(250 mg, 1.15 mmol, 1.0 eq)의 혼합물에 Cs2CO3(562 mg, 1.73 mmol, 1.5 eq)를 부분으로 N2 하에 20℃에서 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 물(5 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(5 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(5 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 5/1)에 의해 정제하여 HxBz-5c(350 mg, 901 umol, 78.3% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 1.48 (s, 18H).
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]-N-tert-부톡시카보닐-카바메이트, HxBz-5d의 제법
디옥산(10 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBz-5c(184 mg, 473 umol, 1.0 eq)와 2-아미노-N-에톡시-N-프로필-8-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드(195 mg, 474 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 Pd(dppf)Cl2ㆍCH2Cl2(19.3 mg, 23.7 umol, 0.05 eq) 및 K2CO3(163 mg, 1.18 mmol, 2.5 eq)를 일 부분으로 N2 하에 첨가하고, 혼합물을 탈기시키고, N2 하에 2시간 동안 90℃로 가열하였다. 디옥산(10 mL)을 진공에서 제거하고, 물(20 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(10 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(10 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 0/1 내지 에틸 아세테이트/메탄올 = 10/1)에 의해 정제하여 HxBz-5d(280 mg, 470.83 umol, 99.35% 수율)를 회색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.08 (s, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.59 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.38 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.83-1.75 (m, 2H), 1.47 (s, 18H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-5의 제법
EtOAc(5 mL) 중의 HxBz-5d(20.0 mg, 33.6 umol, 1.0 eq)의 용액에 HCl/EtOAc(4 M, 8.41 uL, 1.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 20℃에서 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 1% 내지 30%, 8분)에 의해 정제하여 HxBz-5(6.2 mg, 9.84 umol, 29.2% 수율, 98.8% 순도, 2TFA)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.22 (s, 2H), 7.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 4.00 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.46 (s, 2H), 1.85-1.77 (m, 2H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 395.2 (계산치); LC/MS [M+H] 395.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-5a의 제법
DMF(0.5 mL) 중의 HxBz-5(70 mg, 149 umol, 1.0 eq, 2HCl)와 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(127 mg, 179 umol, 1.2 eq)의 혼합물에 DIEA(77.4 mg, 599 umol, 104 uL, 4.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 80 * 40 mm * 3 um; 이동상: [물(0.04% HCl)-ACN]; B%: 12% 내지 39%, 5.5분)에 의해 정제하여 HxBzL-5a(50.0 mg, 53.4 umol, 35.7% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.14 (s, 2H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.00 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.85-3.71 (m, 8H), 3.69-3.58 (m, 38H), 3.47 (s, 2H), 2.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.85-1.76 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
HxBzL-5의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-5a(60 mg, 61.7 umol, 1.0 eq, HCl)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(99.3 mg, 370 umol, 6.0 eq)의 혼합물에 EDCI(71.0 mg, 370 umol, 6.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 45%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-5(38.0 mg, 30.5 umol, 49.3% 수율, 93.3% 순도)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.11 (s, 2H), 7.83-7.79 (m, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.76-7.71 (m, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.00 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.85-3.75 (m, 5H), 3.70-3.57 (m, 38H), 3.47 (s, 2H), 2.99 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 4 Hz, 2H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1163.3 (계산치); LC/MS [M+H] 1163.3 (관찰치).
실시예 L-7 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]설포닐]아제티딘-3-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-7의 합성
tert-부틸 ((1-((5-브로모피리딘-3-일)설포닐)아제티딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-7b의 제법
DCM(20 mL) 중의 tert-부틸 N-(아제티딘-3-일메틸)카바메이트(762 mg, 4.09 mmol, 1.05 eq)와 5-브로모피리딘-3-설포닐 클로라이드, HxBz-7a(1 g, 3.90 mmol, 2.26 mL, 1 eq)의 혼합물에 Et3N(789 mg, 7.80 mmol, 1.09 mL, 2 eq)을 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(20 mL)에 첨가하고, 이후 진공에서 농축시켜 DCM을 제거하였다. 원하는 고체를 혼합물로부터 침전시키고 여과시켜 원하는 생성물 HxBz-7b(1.1 g, 2.71 mmol, 69.45% 수율)를 백색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ 9.09 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.40 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.90 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.80 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.52 (dd, J = 6.0, 8.0 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.52 (m, 1H), 1.34 (s, 9H).
tert-부틸 ((1-((5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-3-일)설포닐)아제티딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-7c의 제법
디옥산(15 mL) 중의 HxBz-7b(0.75 g, 1.85 mmol, 1 eq) 4,4,5,5-테트라메틸-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란, Pin2B2, 비스(피나콜레이토)디보론, CAS 등록 번호 78183-34-3(703 mg, 2.77 mmol, 1.5 eq) KOAc(362 mg, 3.69 mmol, 2 eq)의 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(67.5 mg, 92.3 umol, 0.05 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 진공에서 농축시켰다. HxBz-7c(0.85 g, 미정제)를 황색의 오일로서 제공하였다.
tert-부틸 ((1-((5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리딘-3-일)설포닐)아제티딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-7d의 제법
디옥산(15 mL) 중의 HxBz-7c(0.85 g, 1.87 mmol, 1 eq)와 2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBzL-2b(755 mg, 2.06 mmol, 1.1 eq)의 혼합물에 H2O(3 mL) 중의 K2CO3(518 mg, 3.75 mmol, 2 eq) 및 Pd(dppf)Cl2(68.6 mg, 93.7 umol, 0.05 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이것을 100℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(50 mL)에 부었다. 수성 상을 에틸 아세테이트(150 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 5/1, 0/1 내지 EtOAc/MeOH=10/1)에 의해 정제하였다. HxBz-7d(1 g, 1.63 mmol, 87.05% 수율)를 미백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ 9.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.42 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.55-7.51 (m, 2H), 7.49-7.45 (m, 1H), 7.30 (s, 1H), 3.96 (q, J = 7.6 Hz 2H), 3.90 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 6.0, 8.0 Hz, 2H), 3.35 (s, 2H),3.06 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.69-2.58 (m, 1H), 1.77 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
2-아미노-8-[5-[3-(아미노메틸)아제티딘-1-일]설포닐-3-피리딜]-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-7의 제법
CH3CN(10 mL) 및 H2O(10 mL) 중의 HxBz-7d(0.8 g, 1.31 mmol, 1 eq)의 혼합물에 TFA(1.49 g, 13.1 mmol, 967 uL, 10 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 85℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 CH3CN을 제거하고, 수성물을 MTBE(20 * 3)로 추출하여 버리고, 이후 수상을 바로 동결 건조시켜 HxBz-7(0.9 g, 1.22 mmol, 93.07% 수율, 2TFA)을 미백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.24 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 9.04 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.50 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 2H), 7.77-7.72 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 4.06-3.94 (m, 4H), 3.79-3.70 (m, 4H), 3.45 (s, 2H), 3.12 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.83-2.73 (m, 1H), 1.79 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 513.2 (계산치); LC/MS [M+H] 513.2 (관찰치).
1-(1-((5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리딘-3-일)설포닐)아제티딘-3-일)-3-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-2-아자헥사트리아콘탄-36-오산, HxBzL-7a의 제법
THF(10 mL) 중의 HxBz-7(451 mg, 638 umol, 1 eq)의 혼합물에 Et3N(161 mg, 1.60 mmol, 222 uL, 2.5 eq)을 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5 mL)에 붓고, 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 pH 조정하고, 이후 MTBE(10 mL)로 추출하여 버리고, 수성 상을 DCM/i-PrOH(20 mL * 3)로 추가로 추출하였다. 합한 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켜 HxBzL-7a(0.6 g, 569.68 umol, 89.25% 수율)를 연황색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-7의 제법
DCM(10 mL) 및 DMA(1.5 mL) 중의 HxBzL-7a(0.6 g, 570 umol, 1 eq)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(611 mg, 2.28 mmol, 4 eq)의 혼합물에 EDCI(437 mg, 2.28 mmol, 4 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 여과시키고, prep-HPLC 칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 30% 내지 50%, 10분에 의해 정제하여 HxBzL-7(370 mg, 288.76 umol, 50.69% 수율)을 백색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.24 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 9.03 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.51 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.91-7.84 (m, 2H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.03-3.91 (m, 4H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.66-3.49 (m, 40H), 3.47 (s, 2H), 3.21 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.01-2.92 (m, 2H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.29 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.78 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1281.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1281.6 (관찰치).
실시예 L-12 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(사이클로부톡시-카보닐아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-12의 합성
사이클로부틸 N-[2-[[2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]옥시에틸]카바메이트, HxBz-15b의 제법
DCM(4 mL) 및 DMA(2 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-15a(250 mg, 611 umol, 1.0 eq)와 사이클로부틸 N-[2-(프로필아미노-옥시)에틸]카바메이트(201 mg, 794 umol, 1.3 eq, HCl)의 혼합물에 EDCI(468 mg, 2.44 mmol, 4.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이것을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. DCM(4 mL)을 진공에서 제거하고, 물(10 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(10 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(5 mL * 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 0/1 내지 에틸 아세테이트/메탄올 = 10/1)에 의해 정제하여 HxBz-15b(190 mg, 313 umol, 51.2% 수율)를 갈색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.08 (s, 2H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 4.74-4.67 (m, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.96 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.33 (s, 2H), 2.20 (dd, J = 2.8, 5.2 Hz, 2H), 1.94-1.86 (m, 2H), 1.82-1.75 (m, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.38 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
사이클로부틸 N-[2-[[2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]옥시에틸]카바메이트, HxBz-15의 제법
DCM(5 mL) 중의 HxBz-15b(190 mg, 313 umol, 1.0 eq)의 용액에 CF3COOH(535 mg, 4.69 mmol, 347 uL, 15 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. DCM(5 mL)을 진공에서 제거하고, 잔류물을 물(10 mL)로 희석하고, 수성 상을 MTBE(5 mL * 4)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하고, 이후 수성 상을 동결 건조시켜 HxBz-15(130 mg, 169 umol, 54.1% 수율, 95.7% 순도, 2TFA)를 갈색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ = 9.21 (s, 2H), 7.85-7.76 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.66 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.96 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.91-1.83 (m, 2H), 1.81-1.74 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H), 1.57-1.47 (m, 1H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 508.3 (계산치); LC/MS [M+H] 508.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(사이클로부톡시카보닐아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-12a의 제법
DMF(1.5 mL) 중의 HxBz-15(105 mg, 181 umol, 1.0 eq, 2HCl)와 Et3N(73.2 mg, 723 umol, 100 uL, 4.0 eq)의 혼합물에 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,4,5,6-펜타플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, PFP-PEG10-CO2H(131 mg, 181 umol, 1.0 eq)를 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 이것을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 이후 또 다른 0.5시간 동안 25℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물(5 mL)로 희석하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(3 mL * 2)로 추출하여 버리고, 이후 수성 상을 DCM/iPrOH=3/1(5 mL * 3)로 추가로 추출하고, 합한 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켜 HxBzL-12a(100 mg, 95.4 umol, 52.7% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-12의 제법
DCM(1 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-12a(100 mg, 95.4 umol, 1.0 eq)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시 나트륨(128 mg, 477 umol, 5.0 eq)의 혼합물에 EDCI(91.4 mg, 477 umol, 5.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-12(35.1 mg, 25.6 umol, 26.9% 수율, 93.3% 순도)를 연황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.12 (s, 2H), 7.84-7.77 (m, 3H), 7.52 (s, 1H), 4.75-4.67 (m, 3H), 3.99 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.82 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.70-3.57 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 3.01-2.97 (m, 2H), 2.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.24-2.14 (m, 2H), 1.96-1.86 (m, 2H), 1.84-1.75 (m, 2H), 1.73-1.61 (m, 1H), 1.59-1.49 (m, 1H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1276.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1276.6 (관찰치).
실시예 L-13 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(사이클로부틸카바모일아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-13의 합성
tert-부틸 ((5-(2-아미노-4-((2-(3-사이클로부틸우레이도)에톡시)(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-일)메틸)카바메이트, HxBz-16a의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(2 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-15a(250 mg, 611 umol, 1 eq) 1-사이클로부틸-3-[2-(프로필아미노옥시)에틸]우레아(231 mg, 916 umol, 1.5 eq, HCl)의 용액에 EDCI(351 mg, 1.83 mmol, 3 eq)를 첨가하고, 이것을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 DCM을 제거하였다. 잔류물을 물(10 mL)로 희석하고, EtOAc(20 mL * 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(20 mL * 2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 에틸 아세테이트: MeOH = 5:1)에 의해 정제하여 HxBz-16a(230 mg, 380 umol, 62.1% 수율)를 갈색의 고체로서 제공하였다.
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-[2-(사이클로부틸카바모일아미노)에톡시]-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-16의 제법
물(2 mL) 및 MeCN(2 mL) 중의 HxBz-16a(230 mg, 0.38 mmol, 1 eq)의 용액에 TFA(432 mg, 3.79 mmol, 0.28 mL, 10 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 물(2 mL)로 희석하고, MTBE(3mL * 3)로 추출하여 버리고, 수성 상을 감압 하에 농축시켜 HxBz-16(230 mg, 371 umol, 97.8% 수율, TFA)을 갈색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.21 (s, 2H), 7.84-7.73 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.01-3.89 (m, 3H), 3.75 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.33 (br s, 2H), 2.19-2.10 (m, 2H), 1.81-1.68 (m, 4H), 1.64-1.55 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 507.3 (계산치); LC/MS [M+H] 507.2 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(사이클로부틸카바모일아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-13a의 제법
THF(1 mL) 중의 HxBz-16(100 mg, 136 umol, 1 eq, 2TFA) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(96.2 mg, 0.14 mmol, 1 eq)의 용액에 Et3N(41.3 mg, 0.41 mmol, 56.8 uL, 3 eq)을 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 조정하고, EtOAc(5 mL 3회)로 추출하여 버리고, 수성물을 DCM/i-PrOH(10 mL * 3, 3/1)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 미정제 생성물 HxBzL-13a(120 mg, 115 umol, 84.2% 수율)를 황색의 오일로서 얻고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
HxBzL-13의 제법
DMA(0.5 mL) 및 DCM(1.5 mL) 중의 HxBzL-13a(70 mg, 66.9 umol, 1 eq) 및 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(71.7 mg, 267 umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(51.3 mg, 267 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이것을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하였다. 이후, 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-13(20 mg, 13.3 umol, 19.9% 수율, 2TFA)을 무색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.09 (s, 2H), 7.80-7.71 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.95 (br t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.75 (br t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.68-3.57 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 2.97 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.15 (br d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.83-1.68 (m, 4H), 1.64-1.52 (m, 2H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1275.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1275.2 (관찰치).
실시예 L-14 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-14의 합성
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필], HxBz-14의 제법
DMF(4 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-14a(0.25 g, 611 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 Et3N(185 mg, 1.83 mmol, 255 uL, 3.0 eq), 사이클로부틸 N-[3-(프로필아미노)프로필]카바메이트(170 mg, 678 umol, 1.11 eq, HCl) 및 헥사플루오로포스페이트 아자벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄, HATU(232 mg, 611 umol, 1.0 eq)를 일 부분으로 0℃에서 첨가하고, 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 물로 희석하고, EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 3/1)에 의해 정제하여 HxBz-14(0.28 g, 462 umol, 75.71% 수율)를 황색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.04 (s, 2H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.84-4.84 (m, 1H), 4.64 (s, 4H), 3.54-3.47 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.22-3.07 (m, 2H), 2.32-2.28 (m, 2H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.88-1.79 (m, 3H), 1.75-1.60 (m, 3H), 1.48 (s, 9H), 0.90 (s, 3H). LC/MS [M+H] 606.3 (계산치); LC/MS [M+H] 606.2 (관찰치).
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필]카바메이트, HxBz-13의 제법
CH3CN(3 mL) 및 H2O(1 mL) 중의 HxBz-14(0.26 g, 429 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 TFA(489 mg, 4.29 mmol, 318 uL, 10.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물(10 mL)로 희석하고, 혼합물을 MTBE(10 mL x 2)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하였다. 물 층을 동결 건조시켜 HxBz-13(0.2 g, 323 umol, 75.20% 수율, TFA)을 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.21 (s, 2H), 7.84-7.71 (m, 3H), 7.12 (s, 1H), 4.85-4.85 (m, 1H), 4.47 (s, 2H), 3.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.15 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 2.30-2.25 (m, 2H), 2.08-2.00 (m, 2H), 1.89-1.66 (m, 6H), 1.01-0.88 (m, 3H). LC/MS [M+H] 506.3 (계산치); LC/MS [M+H] 506.2 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-14a의 제법
THF(3 mL) 중의 HxBz-13(0.1 g, 161 umol, 1.0 eq, TFA)의 혼합물에 Et3N(48.9 mg, 484 umol, 67.4 uL, 3.0 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, TFP-PEG10-CO2H(114 mg, 161 umol, 1.0 eq)를 일 부분으로 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 5-6으로 조정하였다. 이후, 혼합물을 물(5 mL)로 희석하고, MTBE(10 mL x 3)로 세척하였다. 이후, 물 층을 DCM:i-PrOH=3:1(20 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBzL-14a(0.15 g, 129 umol, 80.11% 수율, TFA)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-14의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-14a(0.15 g, 129 umol, 1.0 eq, TFA)의 혼합물에 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(139 mg, 517 umol, 4.0 eq) 및 EDCI(149 mg, 776 umol, 6.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 이후, 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-14(75.3 mg, 59.1 umol, 45.71% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.09 (s, 2H), 7.82-7.67 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 4.86-4.82 (m, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.48 (m, 40H), 3.38 (s, 2H), 3.22-3.06 (m, 2H), 2.97 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.64-2.58 (m, 2H), 2.32-2.25 (m, 2H), 2.09-1.95 (m, 2H), 1.91-1.80 (m, 3H), 1.75-1.61 (m, 3H), 0.93 (s, 3H). LC/MS [M+H] 1274.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1274.3 (관찰치).
실시예 L-15 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-15의 합성
2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-11b의 제법
DMA(150 mL) 및 DCM(150 mL) 중의 N-에톡시프로판-1-아민(9.6 g, 68.8 mmol, 1.3 eq, HCl)과 2-아미노-8-브로모-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-11a(14.8 g, 52.9 mmol, 1.0 eq)의 혼합물에 EDCI(40.6 g, 211 mmol, 4.0 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 NaHCO3로 약 9로 조정하고 감압 하에 농축시켜 45℃에서 DCM을 제거하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(100 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(1000 mL x 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 MTBE/PE=1/1로 25℃에서 미분쇄하여 HxBz-11b(12.5 g, 34.1 mmol, 64.5% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 7.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.26-7.22 (m, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.17-7.14 (m, 1H), 3.92 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 1.79-1.70 (m, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
2-아미노-N-에톡시-N-프로필-8-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-11c의 제법
디옥산(10 mL) 중의 HxBz-11b(500 mg, 1.37 mmol, 1.0 eq), Pin2B2(416 mg, 1.64 mmol, 1.2 eq), KOAc(335 mg, 3.41 mmol, 2.5 eq)와 Pd(dppf)Cl2(99.9 mg, 136 umol, 0.1 eq)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하고, 이후 혼합물을 N2 분위기 하에 95℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 얼음물(w/w = 1/1)(10 mL)에 붓고, 5분 동안 교반하였다. 수성 상을 MTBE(10 mL x 1)로 추출하고, 이후 수성 상을 DCM/i-PrOH=3/1(10 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 합한 유기 상(DCM/i-PrOH)을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켜 HxBz-11c(490 mg, 미정제)를 생성시키고, 검정색의 고체로서 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
메틸 5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-카복실레이트, HxBz-11의 제법
디옥산(15 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBz-11c(390 mg, 944 umol, 1.0 eq), 메틸 5-브로모피리미딘-2-카복실레이트(266 mg, 1.23 mmol, 1.3 eq), Pd(dppf)Cl2(69.0 mg, 94.3 umol, 0.1 eq), K3PO4(401 mg, 1.89 mmol, 2.0 eq)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하고, 이후 N2 분위기 하에 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 5% 내지 30%, 8분)에 의해 정제하여 HxBz-11(105 mg, 161 umol, 17.1% 수율, TFA)을 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.30 (s, 2H), 7.89 (dd, J = 2.0, 2.0 Hz, 1H), 7.83-7.74 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 4.06 (s, 3H), 4.00 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.45 (s, 2H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.21 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 424.1 (계산치); LC/MS [M+H] 424.1 (관찰치).
5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카복실산, HxBzL-15a의 제법
EtOH(5 mL) 및 H2O(0.5 mL) 중의 HxBz-11(330 mg, 779 umol, 1.0 eq)의 용액에 LiOH.H2O(131 mg, 3.12 mmol, 4.0 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 HCl(4 M)로 약 6으로 조정하고 진공에서 농축시켜 EtOH를 제거하였다. 잔류물을 물(10 mL)로 희석하였다. 수성 상을 DCM/i-PrOH=3/1(10 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켜 HxBzL-15a(200 mg, 488 umol, 62.7% 수율)를 황색의 고체로서 제공하였다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[[5-[2-아미노-4-[3-(3,3-디메틸부타노일아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]설포닐]아제티딘-3-일]메틸-메틸-아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-15b의 제법
DMF(5 mL) 중의 HxBzL-15a(195 mg, 332 umol, 0.8 eq)와 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, tBuOOC-PEG10-NH2(390 mg, 666 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 Et3N(126 mg, 1.25 mmol, 173 uL, 3.0 eq) 및 HATU(158 mg, 415 umol, 1.0 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 80 * 40 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 25% 내지 50%, 7분)에 의해 정제하여 HxBzL-15b(80 mg, 66.4 umol, 16.0% 수율, TFA)를 황색의 오일로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-15c의 제법
MeCN(2 mL) 및 H2O(1 mL) 중의 HxBzL-15b(80 mg, 66.4 umol, 1.0 eq, TFA)의 용액에 HCl(12 M, 83.0 uL, 15.0 eq)을 첨가하고, 이것을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 잔류물을 생성시키고, 잔류물을 동결 건조시켜 HxBzL-15c(60 mg, 62.7 umol, 94.4% 수율, HCl)를 무색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-15의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-15c(60 mg, 60.4 umol, 1.0 eq, 2HCl) 및 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(64.7 mg, 241 umol, 4.0 eq)의 용액에 EDCI(46.3 mg, 241 umol, 4.0 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-15(36 mg, 31.3 umol, 51.9% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.27 (s, 2H), 7.90-7.81 (m, 2H), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.98 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.78-3.75 (m, 2H), 3.73-3.72 (m, 2H), 3.70-3.56 (m, 36H), 3.46 (s, 2H), 2.96 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.84-1.71 (m, 2H), 1.21 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1149.4 (계산치); LC/MS [M+H] 1149.5 (관찰치).
실시예 L-16 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-16의 합성
메틸 (2S)-1-(5-브로모피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-16b의 제법
DMF(8 mL) 중의 5-브로모피리미딘-2-카복실산, HxBzL-16a(400 mg, 1.97 mmol, 1.0 eq), Et3N(598 mg, 5.91 mmol, 822 uL, 3.0 eq)과 메틸 (2S)-피롤리딘-2-카복실레이트(342 mg, 2.07 mmol, 1.05 eq, HCl)의 혼합물에 HATU(749 mg, 1.97 mmol, 1.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 30분 동안 교반하고, 이후 25℃로 가열하고, 또 다른 0.5시간 동안 교반하였다. 물(20 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(20 mL * 4)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(10 mL * 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 4/1)에 의해 정제하여 HxBzL-16b(320 mg, 1.02 mmol, 51.7% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
(2S)-1-(5-브로모피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실산, HxBzL-16c의 제법
MeOH(5 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBzL-16b(320 mg, 1.02 mmol, 1.0 eq)의 용액에 LiOHㆍH2O(171 mg, 4.07 mmol, 4.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이것을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl(4 M)로 pH = 7까지 켄칭하고, MeOH(5 mL)를 진공에서 제거하고, 원하는 고체를 수성 상으로부터 침전시키고, 여과시키고 건조시켜 HxBzL-16c(300 mg, 미정제)를 연황색의 고체로서 제공하였다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-(5-브로모피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-16d의 제법
DMF(1 mL) 중의 HxBzL-16c(200 mg, 666 umol, 1.0 eq), Et3N(168 mg, 1.67 mmol, 232 uL, 2.5 eq)과 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(390 mg, 666 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 HATU(253 mg, 666 umol, 1.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 이것을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 이후 25℃로 가열하고, 또 다른 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 60%, 10분)에 의해 정제하여 HxBzL-16d(300 mg, 346 umol, 51.8% 수율)를 무색의 오일로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-(5-브로모피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-16e의 제법
MeCN(1 mL) 및 H2O(3 mL) 중의 HxBzL-16d(300 mg, 345 umol, 1.0 eq)의 용액에 HCl(12 M, 864 uL, 30 eq)을 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 HxBzL-16e(250 mg, 307.99 umol, 89.09% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-16f의 제법
디옥산(3 mL) 및 H2O(0.3 mL) 중의 HxBzL-16e(150 mg, 185 umol, 1.0 eq), 2-아미노-N-에톡시-N-프로필-8-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드(91.6 mg, 222 umol, 1.2 eq), Pd(dppf)Cl2(13.5 mg, 18.5 umol, 0.1 eq) 및 K2CO3(63.8 mg, 462 umol, 2.5 eq)의 용액을 탈기시키고, 이후 N2 하에 2시간 동안 95℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 80 * 40 mm * 3 um; 이동상: [물(0.04% HCl)-ACN]; B%: 5% 내지 45%, 7분)에 의해 정제하여 HxBzL-16f(110 mg, 108 umol, 58.4% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-16의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-16f(110 mg, 108 umol, 1.0 eq)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(145 mg, 540 umol, 5.0 eq)의 혼합물에 EDCI(103 mg, 540 umol, 5.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-16(66.5 mg, 50.9 umol, 47.1% 수율, 95.3% 순도)을 연황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.28-9.24 (m, 2H), 7.91-7.81 (m, 2H), 7.80-7.74 (m, 1H), 7.50-7.47 (m, 1H), 4.00 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.88 (dt, J = 3.2, 5.6 Hz, 4H), 3.81-3.74 (m, 4H), 3.70-3.53 (m, 37H), 3.50-3.32 (m, 5H), 3.02-2.96 (m, 2H), 2.16-1.97 (m, 4H), 1.84-1.76 (m, 2H), 1.23(t, 7.2 Hz, 3H), 1.03(t, 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1246.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1246.7 (관찰치).
실시예 L-21 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(디메틸카바모일아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-21의 합성
tert-부틸 ((5-(2-아미노-4-((2-(3,3-디메틸우레이도)에톡시)(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-일)메틸)카바메이트, HxBz-20a의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(1 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-14a(250 mg, 611 umol, 1 eq)와 1,1-디메틸-3-[2-(프로필아미노옥시)에틸]우레아(165 mg, 733 umol, 1.2 eq, HCl)의 혼합물에　EDCI(468 mg, 2.44 mmol, 4 eq)를 첨가하고, 이것을　25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 DCM을 제거하고, 잔류물을 물(10mL)로 희석하고, 혼합물의 pH를 수성 Na2CO3로 약 8로 조정하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(10 mL * 4)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(20 mL * 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 0/1, 에틸 아세테이트/메탄올 = 1/0, 3/1)에 의해 정제하여 HxBz-20a(260 mg, 447.75 umol, 73.33% 수율)를 황색의 고체로서 제공하였다.
HxBz-20의 제법
EtOAc(3.00 mL) 중의 HxBz-20a(130 mg, 224 umol, 1 eq)의 용액에 HCl/EtOAc(4 M, 3.00 mL, 53.60 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 HxBz-20(115 mg, 207.77 umol, 92.81% 수율, 2HCl)을 연적색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.22 (s, 2H), 7.86-7.80 (m, 2H), 7.80-7.74 (m, 1H), 7.50 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.45 (s, 2H), 3.38-3.34 (m, 2H), 2.74 (s, 6H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 481.3 (계산치); LC/MS [M+H] 481.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(디메틸카바모일아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-21a의 제법
DMF(1.00 mL) 중의 HxBz-20(65.0 mg, 117 umol, 1 eq, 2HCl)의 용액에 Et3N(48.0 mg, 470 umol, 4 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-21a(83.0 mg, 117 umol, 1 eq)를 첨가하고, 이후 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(10 mL)로 희석하고, 혼합물의 pH를 TFA를 계속해서 첨가함으로써 약 6으로 조정하고, MTBE(10 mL)로 추출하여 버리고, 수성물을 DCM:i-PrOH = 3:1(20 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBzL-21a(95 mg, 93.03 umol, 79.22% 수율)를 연황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-21의 제법
DCM(2.00 mL) 및 DMA(0.10 mL) 중의 HxBzL-21a(90.0 mg, 88.1 umol, 1 eq) 및 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(95.0 mg, 353 umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(68.0 mg, 353 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 5% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-21(51 mg, 37.41 umol, 42.45% 수율, TFA)을 연황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.10 (s, 2H), 7.83-7.70 (m, 3H), 7.48 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.78-3.74 (m, 2H), 3.65-3.55 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 3.37-3.34 (m, 2H), 2.97 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.72 (m, 1H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1249.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1249.6 (관찰치).
실시예 L-23 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-하이드록시에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-23의 합성
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[2-하이드록시에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]카바메이트, HxBz-22a의 제법
DCM(6 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-14a(0.35 g, 855 umol, 1.0 eq)와 2-(프로필아미노옥시)에탄올(200 mg, 1.28 mmol, 1.5 eq, HCl)의 혼합물에 EDCI(492 mg, 2.56 mmol, 3.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 DCM을 제거하고, 잔류물을 H2O(10 mL)로 희석하였다. 혼합물의 pH를 수성 NaHCO3로 약 8로 조정하였다. 이후, 수성 상을 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 유기 층을 염수, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 에틸 아세테이트/MeOH=1/0, 10/1)에 의해 정제하여 HxBz-22a(0.37 g, 725 umol, 84.77% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.08-9.01 (m, 2H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.54-7.46 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 4.56-4.49 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 2H), 3.81-3.74 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-(2-하이드록시에톡시)-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-22의 제법
H2O(4 mL) 및 CH3CN(0.5 mL) 중의 HxBz-22a(0.35 g, 685 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 TFA(1.17 g, 10.3 mmol, 761 uL, 15.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 MTBE(10 mL x 2)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하였다. 이후, 물 층을 동결 건조시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 1% 내지 20%, 8분)에 의해 추가로 정제하여 HxBz-22(0.32 g, 501umol, 73.11% 수율, 2TFA)를 백색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.20 (s, 2H), 7.84-7.72 (m, 3H), 7.56 (s, 1H), 4.47 (s, 2H), 4.03-3.96 (m, 2H), 3.79 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.74-3.66 (m, 2H), 3.53-3.36 (m, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 411.2 (계산치); LC/MS [M+H] 411.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-하이드록시에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-23a의 제법
THF(6 mL) 중의 HxBz-22(0.23 g, 560 umol, 1.0 eq, 2TFA)의 혼합물에 Et3N(170 mg, 1.68 mmol, 234 uL, 3.0 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(396 mg, 560 umol, 1.0 eq)을 일 부분으로 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(5 ml)로 희석하고, 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 조정하였다. 수성 상을 EtOAc(10 mL)로 추출하여 버렸다. 물 층을 DCM:i-PrOH=3:1(20 mL x 2)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBzL-23a(0.53 g, 미정제, TFA)를 생성시키고 황색의 오일로서 얻었다.
4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-하이드록시에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-23의 제법
DCM(4 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-23a(0.35 g, 329 umol, 1.0 eq, TFA)와 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(352 mg, 1.31 mmol, 4.0 eq)의 혼합물에 EDCI(378 mg, 1.97 mmol, 6.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 이후, 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 50%, 10분)에 의해 정제하여 HxBzL-23(80.4 mg, 68.2 umol, 20.75% 수율)을 연황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.08 (s, 2H), 7.82-7.70 (m, 3H), 7.56 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.06-3.97 (m, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.74-3.69 (m, 2H), 3.65-3.57 (m, 36H), 3.46 (s, 2H), 3.02-2.92 (m, 2H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1179.4 (계산치); LC/MS [M+H] 1179.3 (관찰치).
실시예 L-27 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(이소프로폭시카보닐아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-27의 합성
이소프로필 N-[2-[[2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]옥시에틸]카바메이트, HxBz-27a의 제법
DCM(5 mL) 및 DMA(3 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-14a(350 mg, 855 umol, 1.0 eq)와 이소프로필 N-[2-(프로필아미노옥시)에틸]카바메이트(268 mg, 1.11 mmol, 1.3 eq, HCl)의 혼합물에 EDCI(656 mg, 3.42 mmol, 4.0 eq)를 첨가하고, 이것을　25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 30℃에서 농축시켰다. 잔류물을 얼음물(w/w = 1/1)(10 mL)에 붓고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 수성 NaHCO3로 약 8로 조정하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(20 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(10 mL x 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 1/1, 에틸 아세테이트/메탄올 = 1/0, 10/1)에 의해 정제하여 HxBz-27a(460 mg, 772 umol, 90.3% 수율)를 황색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.04 (s, 2H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.32 (s, 1H), 4.74-4.68 (m, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.94 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.30-3.26 (m, 2H), 1.76 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 0.98 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
이소프로필 N-[2-[[2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]옥시에틸]카바메이트, HxBz-27의 제법
MeCN(0.5 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBz-27a(410 mg, 688 umol, 1.0 eq)의 용액에 TFA(1.18 g, 10.3 mmol, 764 uL, 15.0 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 CH3CN을 제거하였다. 수성 상을 MTBE(5 mL x 3)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하였다. 수상을 동결 건조시켜 HxBz-27(400 mg, 553 umol, 80.3% 수율, 2TFA)을 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.21 (s, 2H), 7.86-7.74 (m, 3H), 7.51 (s, 1H), 4.76-4.63 (m, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.98 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 1.78 (sxt, J = 7.2 Hz, 2H), 1.12 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 496.2 (계산치); LC/MS [M+H] 496.1 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(이소프로폭시카보닐아미노)에톡시-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-27a의 제법
THF(2 mL) 중의 HxBz-27(130 mg, 180 umol, 1.0 eq, 2TFA)의 용액에 Et3N(54.5 mg, 539 umol, 75.0 uL, 3.0 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(127 mg, 180 umol, 1.0 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 물(10 mL)로 희석하고, 혼합물의 pH를 TFA로 약 6으로 조정하였다. 수성 상을 MTBE(5 mL x 3)로 추출하여 버렸다. 수상을 DCM/i-PrOH = 3/1(10 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 유기 상을 진공에서 농축시켜 HxBzL-27a(180 mg, 174 umol, 96.7% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-27의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-27a(180 mg, 174 umol, 1.0 eq)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(186 mg, 695 umol, 4.0 eq)의 혼합물에 EDCI(266 mg, 1.39 mmol, 8.0 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-27(91 mg, 66.0 umol, 38.0% 수율, TFA)을 황색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.08 (s, 2H), 7.82-7.73 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 4.75-4.66 (m, 3H), 3.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.75 (br t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.66-3.56 (m, 36H), 3.45-3.42 (m, 2H), 2.96 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.84-1.70 (m, 2H), 1.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1264.4 (계산치); LC/MS [M+H] 1264.7 (관찰치).
실시예 L-32 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[프로필-[2-(피롤리딘-1-카보닐아미노)에톡시]카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-32의 합성
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[프로필-[2-(피롤리딘-1-카보닐아미노)에톡시]카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]카바메이트, HxBzL-32a의 제법
DCM(4 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-14a(0.25 g, 611 umol, 1.3 eq)의 혼합물에 N-[2-(프로필아미노옥시)에틸]피롤리딘-1-카복사미드(118 mg, 469 umol, 1.0 eq, HCl) 및 EDCI(270.12 mg, 1.41 mmol, 3.0eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 혼합물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 100 * 40 mm * 5 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 7% 내지 38%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-32a(0.1 g, 165 umol, 35.09% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.08 (s, 2H), 7.88-7.68 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 4.54 (s, 2H), 4.02-3.89 (m, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.36 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.19-3.07 (m, 4H), 1.86-1.68 (m, 6H), 1.47 (s, 9H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-프로필-N-[2-(피롤리딘-1-카보닐아미노)에톡시]-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBzL-32b의 제법
H2O(4 mL) 및 CH3CN(0.5 mL) 중의 HxBzL-32a(0.09 g, 148 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 TFA(254 mg, 2.23 mmol, 165 uL, 15.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 MTBE(10 mL x 3)로 추출하여 버렸다. 물 층을 동결 건조시켜 HxBzL-32b(0.1 g, 136 umol, 91.76% 수율, 2TFA)를 생성시키고 황색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.21 (s, 2H), 7.86-7.70 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.48-3.43 (m, 2H), 3.37 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.13 (s, 4H), 1.81-1.71 (m, 6H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[프로필-[2-(피롤리딘-1-카보닐아미노)에톡시]카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-32c의 제법
THF(2 mL) 중의 HxBzL-32b(70 mg, 82.5 umol, 1.0 eq, 3TFA)의 혼합물에 Et3N(25.0 mg, 247 umol, 34.4 uL, 3.0 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(69.9 mg, 98.9 umol, 1.2 eq)을 일 부분으로 0℃에서 첨가하고, 이후 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(5 mL)로 희석하고, pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 조정하였다. 이후, 혼합물을 EtOAc(10 mL)로 추출하여 버렸다. 물 층을 DCM:i-PrOH=3:1(10 mL x 2)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBzL-32c(0.1 g, 미정제, TFA)를 생성시키고 황색의 오일로서 얻었다.
HxBzL-32의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-32c(0.1 g, 86.1 umol, 1.0 eq, TFA)의 혼합물에 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(115 mg, 431 umol, 5.0 eq) 및 EDCI(116 mg, 603 umol, 7.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다. 이후, 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Synergi C18 150 * 25 * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-32(46.4 mg, 33.4 umol, 38.78% 수율, TFA)를 황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.09 (s, 2H), 7.85-7.66 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.90-3.84 (m, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.58 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 3.37 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.13 (s, 4H), 3.01-2.93 (m, 2H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.86-1.68 (m, 6H), 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1275.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1275.6 (관찰치).
실시예 L-33 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]설포닐]아제티딘-3-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-33의 합성
에틸 2-아미노-8-(5-((3-(((tert-부톡시카보닐)아미노)메틸)아제티딘-1-일)설포닐)피리딘-3-일)-3H-벤조[b]아제핀-4-카복실레이트, HxBz-32b의 제법
디옥산(50 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 tert-부틸 N-[[1-[[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-3-피리딜]설포닐]아제티딘-3-일]메틸]카바메이트, HxBz-32a(5 g, 11.0 mmol, 1 eq) 및 에틸 2-아미노-8-브로모-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트(3.41 g, 11.0 mmol, 1 eq)의 용액에 K2CO3(3.05 g, 22.1 mmol, 2 eq) 및 Pd(dppf)Cl2(403 mg, 551 umol, 0.05 eq)를 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 물(100 mL)로 희석하고, EtOAc(50 mL x 3)로 추출하였다. 유기 층을 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBz-32a를 생성시키고, 이것을 25℃에서 15분 동안 CH3CN으로 미분쇄하여 HxBz-32b(5.5 g, 9.90 mmol, 89.75% 수율)를 생성시키고 회색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ 9.29 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50-7.41 (m, 2H), 7.04-6.85 (m, 3H), 4.25 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.82 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.58-3.52 (m, 2H), 2.99-2.85 (m, 4H), 2.56-2.51 (m, 1H), 1.35-1.30 (m, 12H).
2-아미노-8-(5-((3-(((tert-부톡시카보닐)아미노)메틸)아제티딘-1-일)설포닐)피리딘-3-일)-3H-벤조[b]아제핀-4-카복실산, HxBz-32c의 제법
MeOH(40 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBz-32b(3.2 g, 5.76 mmol, 1 eq)의 용액에 LiOH.H2O(725 mg, 17.3 mmol, 3 eq)를 첨가하고, 이후 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 EtOH를 제거하였다. 혼합물의 pH를 0℃에서 HCl(12 M)로 약 5로 조정하고, 이후 여과시키고, 필터 케이크를 감압 하에 건조시켜 미정제 생성물을 생성시켰다. 미정제 생성물을 25℃에서 20분 동안 CH3CN으로 미분쇄하여 HxBz-32c(2.7 g, 5.12 mmol, 88.86% 수율)를 생성시키고 회색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400MHz) δ 9.34 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.98-7.92 (m, 2H), 7.89-7.83 (m, 2H), 3.83 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.59-3.49 (m, 4H), 2.90 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.54 (m, 1H), 1.30 (s, 9H).
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[5-[3-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]아제티딘-1-일]설포닐-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필]카바메이트, HxBz-32d의 제법
DMF(10.0 mL) 중의 HxBz-32c(400 mg, 758 umol, 1 eq)의 용액에 HATU(317 mg, 834 umol, 1.1 eq), DIEA(490 mg, 3.79 mmol, 660 uL, 5 eq) 및 사이클로부틸 N-[3-(프로필아미노)프로필]카바메이트(380 mg, 1.52 mmol, 2 eq, HCl)를 첨가하고, 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(50 mL)로 희석하고, EtOAc(30 mL x 3)로 추출하였다. 유기 층을 염수(20 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 잔류물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 1 g SepaFlash® Silica Flash Column, 35 mL/분에서의 0% 내지 30% 에틸 아세테이트/MeOH의 용리제)에 의해 정제하여 HxBz-32d(340 mg, 469.69 umol, 61.95% 수율)를 연황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.42 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.58-7.50 (m, 2H), 7.49-7.43 (m, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.85-4.76 (m, 1H), 3.90 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.64-3.56 (m, 2H), 3.54-3.48 (m, 2H), 3.47-3.39 (m, 2H), 3.32 (br s, 2H), 3.22-3.02 (m, 4H), 2.70-2.57 (m, 1H), 2.35-2.01 (m, 4H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.77-1.47 (m, 4H), 1.37 (s, 9H), 1.05-0.76 (m, 3H).
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[5-[3-(아미노메틸)아제티딘-1-일]설포닐-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필]카바메이트, HxBz-32의 제법
CH3CN(2.00 mL) 및 H2O(1.00 mL) 중의 HxBz-32d(340 mg, 470 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(428 mg, 3.76 mmol, 278 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 100 * 40 mm * 5 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 5% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBz-32(400 mg, 470 umol, 99.98% 수율, 2TFA)를 연황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.24 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 9.04 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.13 (br s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 4.03 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.73 (dd, J = 5.6, 8.4 Hz, 2H), 3.59-3.43 (m, 4H), 3.38 (br s, 2H), 3.12 (br d, J = 7.6 Hz, 4H), 2.83-2.73 (m, 1H), 2.37-2.12 (m, 2H), 2.00-2.10 (m, 4H), 1.78-1.43 (m, 4H), 1.05-0.83 (m, 3H). LC/MS [M+H] 624.3 (계산치); LC/MS [M+H] 624.2 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]설포닐]아제티딘-3-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-33a의 제법
THF(2.00 mL) 중의 HxBz-32(200 mg, 235 umol, 1 eq, 2TFA)의 용액에 Et3N(71.0 mg, 704 umol, 98.0 uL, 3 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(166 mg, 235 umol, 1 eq)을 첨가하고, 이후 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 물(10 mL)로 희석하고, 혼합물의 pH를 TFA를 계속해서 첨가함으로써 약 6으로 조정하고, MTBE(10 mL)로 추출하여 버리고, 수성 상을 DCM:i-PrOH=3:1(20 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켜 HxBzL-33a(210 mg, 180.36 umol, 76.81% 수율)를 연황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-33의 제법
DCM(4.00 mL) 및 DMA(0.20 mL) 중의 HxBzL-33a(210 mg, 180 umol, 1 eq) 및 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설폰산(178 mg, 721 umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(138 mg, 721 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.2%FA)-ACN]; B%: 15% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-33(98 mg, 68.13 umol, 37.77% 수율, FA)을 백색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.23 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 9.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.48 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.91-7.67 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 3.93 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.66-3.55 (m, 40H), 3.54-3.48 (m, 4H), 3.40 (br s, 2H), 3.25-3.08 (m, 4H), 2.97 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.29 (br t, J = 6.0 Hz, 3H), 1.93-1.80 (m, 3H), 1.77-1.52 (m, 4H), 1.01-0.88 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1392.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1392.3 (관찰치).
실시예 L-34 사이클로부틸 (2-((2-아미노-8-(2-(39-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-3,37-디옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-2,36-디아자노나트리아콘틸)피리미딘-5-일)-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카보사미도)옥시)에틸)카바메이트, HxBzL-34의 합성
DMF(1 ml) 중의 사이클로부틸 (2-((2-아미노-8-(2-(아미노메틸)피리미딘-5-일)-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카보사미도)옥시)에틸)카바메이트, HxBzL-34a(23.6 mg, 0.046 mmol, 1 eq) 및 1-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-3-옥소-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-데카옥사-4-아자헵타트리아콘탄-37-오산(31.7 mg, 0.046 mmol, 1 eq)의 용액에 DIPEA(49 μl, 0.28 mmol, 6 eq), 이어서 ((7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, CAS 등록 번호 156311-83-0(59 mg, 0.113 mmol, 2.4 eq)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이후 농축시키고, prep-HPLC에 의해 정제하여 HxBzL-34(4.9 mg, 0.0042 mmol, 9%)를 생성시켰다. LC/MS [M+H] 1170.6 (계산치); LC/MS [M+H] 1170.9 (관찰치).
실시예 L-37 사이클로부틸 (2-((2-아미노-8-(2-(38-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-3,37-디옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-2,36-디아자옥타트리아콘틸)피리미딘-5-일)-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카보사미도)옥시)에틸)카바메이트, HxBzL-37의 합성
DMF(0.5 ml) 중의 사이클로부틸 (2-((2-아미노-8-(2-(아미노메틸)피리미딘-5-일)-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카보사미도)옥시)에틸)카바메이트, HxBzL-37a(12.4 mg, 0.024 mmol, 1 eq) 및 1-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-3-아자헥사트리아콘탄-36-오산(16.3 mg, 0.024 mmol, 1 eq)의 교반된 용액에 DIPEA(25.5 μl, 0.15 mmol, 6 eq), 이어서 PyAOP(31.0 mg, 0.059 mmol, 2.4 eq)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, LC/MS에 의해 모니터링하고, 이후 농축시키고, prep-HPLC에 의해 정제하여 HxBzL-37(6.7 mg, 0.0058 mmol, 24%)을 생성시켰다. LC/MS [M+H] 1156.6 (계산치); LC/MS [M+H] 1156.9 (관찰치).
실시예 L-38 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-2-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-38의 합성
tert-부틸 N-[(5-브로모-2-피리딜)메틸]카바메이트, HxBz-36b의 제법
CH3CN(250 mL) 중의 5-브로모피리딘-2-카발데하이드, HxBz-36a(5.00 g, 26.9 mmol, 1 eq) 및 tert-부틸 카바메이트(6.30 g, 53.8 mmol, 2 eq)의 용액에 TFA(9.19 g, 80.6 mmol, 5.97 mL, 3 eq) 및 Et3SiH(31.3 g, 268.8 mmol, 42.9 mL, 10 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이것을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 수성 Na2CO3(200 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 (200 mL)로 희석하고, EtOAc(100 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:0 내지 1:1)에 의해 정제하였다. HxBz-36b(9 g, 미정제)를 연황색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.59 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.50 (br s, 1H), 4.58-4.29 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)
tert-부틸 N-[[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-2-피리딜]메틸]카바메이트, HxBz-36c의 제법
디옥산(80 mL) 중의 HxBz-36b(8.00 g, 27.9 mmol, 1 eq), Pin2B2(8.49 g, 33.4 mmol, 1.2 eq), Pd(dppf)Cl2(1.02 g, 1.39 mmol, 0.05 eq)와 KOAc(5.47 g, 55.7 mmol, 2 eq)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하였다. 혼합물을 N2 분위기 하에 90℃에서 2 시간 동안 교반하고, 이후 후처리 없이 다음 단계에 바로 사용하고, HxBz-36c(9.4 g, 미정제)를 흑갈색의 오일로서 얻었다.
에틸 2-아미노-8-[6-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트, HxBz-36d의 제법
디옥산(80 mL) 및 H2O(8 mL) 중의 HxBz-36c(9.30 g, 27.82 mmol, 2 eq), 에틸 2-아미노-8-브로모-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트(4.30 g, 13.9 mmol, 1 eq), Pd(dppf)Cl2(509 mg, 695 umol, 0.05 eq)와 K2CO3(3.84 g, 27.8 mmol, 2 eq)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하고, 이후 이것을 N2 분위기 하에 90℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 H2O(50 mL)로 희석하고, EtOAc(50 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(30 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:0 내지 0:1) 및 이후 (SiO2, EtOAc:MeOH = 1:0 내지 5:1)에 의해 정제하여 HxBz-36d(2.40 g, 5.50 mmol, 39.5% 수율)를 생성시키고 연황색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.76 (s, 1H), 8.10 (br d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.58-7.33 (m, 4H), 4.40 (s, 2H), 4.32 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.38 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
2-아미노-8-[6-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-36e의 제법
EtOH(30 mL) 중의 HxBz-36d(2.40 g, 5.50 mmol, 1 eq)의 용액에 H2O(6 mL) 중의 LiOH.H2O(923 mg, 22.0 mmol, 4 eq)의 용액을 첨가하고, 이후 이것을 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 0℃에서 1 M HCl의 첨가에 의해 5-6으로 조정하고, 이후 감압 하에 농축시켜 EtOH를 제거하였다. 잔류물을 H2O(10 mL)로 희석하고 여과시키고, 필터 케이크를 감압 하에 건조시켜 HxBz-36e(1.88 g, 4.60 mmol, 83.7% 수율)를 생성시키고 회색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 9.01 (s, 1H), 8.50 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.83 (s, 2H), 7.75 (s, 1H), 7.73-7.66 (m, 1H), 4.41 (br s, 2H), 3.51 (s, 2H), 1.40 (s, 9H).
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-2-피리딜]메틸]카바메이트, HxBz-36f의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(3 mL) 중의 HxBz-36e(0.35 g, 857 umol, 1 eq) 및 N-에톡시프로판-1-아민(144 mg, 1.03 mmol, 1.2 eq, HCl)의 용액에 EDCI(493 mg, 2.57 mmol, 3 eq)를 첨가하고, 이후 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 DCM을 제거하였다. 잔류물을 H2O(10 mL)로 희석하고, 혼합물의 pH를 0℃에서 수성 Na2CO3의 첨가에 의해 약 9로 조정하고, EtOAc(10 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(5 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:0 내지 0:1) 및 이후 (SiO2, EtOAc:MeOH = 1:0 내지 3:1)에 의해 정제하여 HxBz-36f(0.33 g, 669 umol, 78.0% 수율)를 연황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.76 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.11 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.29 (s, 1H), 4.40 (s, 2H), 3.95 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 1.82-1.70 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
2-아미노-8-[6-(아미노메틸)-3-피리딜]-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-36의 제법
CH3CN(3 mL) 및 H2O(3 mL) 중의 HxBz-36f(0.33 g, 669 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(610 mg, 5.35 mmol, 396 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하였다. 잔류물을 H2O(5 mL)로 희석하고, MTBE(5 mL x 3)로 추출하여 버렸다. 수상을 감압 하에 농축시켜 HxBz-36(0.33 g, 530.95 umol, 79.42% 수율, 2TFA)을 연황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.79-7.67 (m, 3H), 7.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 1.83-1.72 (m, 2H), 1.26-1.16 (m, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 394.2 (계산치); LC/MS [M+H] 394.2 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-2-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-38a의 제법
THF(3 mL) 중의 HxBz-36(0.15 g, 241 umol, 1 eq, 2TFA)의 용액에 TEA(73.3 mg, 724 umol, 3 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(171 mg, 241 umol, 1 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이것을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 5-6으로 조정하고, 이후 H2O(10 mL)로 희석하고, EtOAc(5 mL x 3)로 추출하여 버렸다. 수상을 DCM:i-PrOH = 3:1(5 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-38a(0.23 g, 219 umol, 90.9% 수율, TFA)를 무색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.33 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.75-7.69 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.83-3.74 (m, 4H), 3.71 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.66-3.50 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.58 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
HxBzL-38의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(0.3 mL) 중의 HxBzL-38a(0.18 g, 172 umol, 1 eq, TFA)의 용액에 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(184 mg, 687 umol, 4 eq) 및 EDCI(132 mg, 687 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이것을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 DCM을 제거하고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-38(116.7 mg, 91.4 umol, 53.2% 수율, TFA)을 백색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.01 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.57 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.84-7.79 (m, 2H), 7.75-7.68 (m, 1H), 7.45 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.82-3.72 (m, 4H), 3.67-3.51 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.96 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1162.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1162.5 (관찰치).
실시예 L-39 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3 -(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-2-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-39의 합성
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[6-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필]카바메이트, HxBz-38b의 제법
DMF(5 mL) 중의 2-아미노-8-[6-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-38a(0.35 g, 857 umol, 1 eq) 및 사이클로부틸 N-[3-(프로필아미노)프로필]카바메이트(258 mg, 1.03 mmol, 1.2 eq, HCl)의 용액에 HATU(326 mg, 857 umol, 1 eq) 및 DIEA(332 mg, 2.57 mmol, 448 uL, 3 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 H2O(20 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, EtOAc(20mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, MeOH/에틸 아세테이트 = 1/5)에 의해 정제하여 HxBz-38b(0.45 g, 744.12 umol, 86.84% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다.
사이클로부틸 N-[3-[[2-아미노-8-[6-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필]카바메이트, HxBz-38의 제법
MeCN(5 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBz-38b(0.45 g, 744 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(679 mg, 5.95 mmol, 441 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이것을 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 MeCN을 제거하고, 이후 MTBE(5 mL)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하였다. 수성 층을 농축시켜 잔류물을 생성시키고, 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBz-38(0.4 g, 646 umol, 86.89% 수율, TFA)을 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.99 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 2.4, 8.2 Hz, 1H), 7.80-7.66 (m, 3H), 7.59 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (br s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.54 (br t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.47 (br s, 2H), 3.36 (br s, 2H), 3.13 (br s, 2H), 2.42-1.96 (m, 2H), 1.92-1.79 (m, 3H), 1.77-1.59 (m, 3H), 0.94 (br s, 3H). LC/MS [M+H] 505.3 (계산치); LC/MS [M+H] 505.3 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4 -[3-(사이클로부톡시카보닐아미노)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-2-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-39a의 제법
THF(5 mL) 중의 HxBzL-39(0.15 g, 204 umol, 1 eq, 2TFA)의 용액에 Et3N(62.1 mg, 614 umol, 85.49 uL, 3 eq) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(145 mg, 205 umol, 1 eq)을 첨가하고, 이후 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O(5 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 혼합물의 pH를 TFA로 약 6으로 조정하고, 이후 EtOAc(10 ml)로 추출하여 버리고, 수성 상을 DCM/PrOH=3/1(20 mL x 3)로 추가로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물, HxBzL-39a(0.2 g, 191 umol, 93.46% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-39의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(1 mL) 중의 HxBzL-39a(0.2 g, 191 umol, 1 eq) 및 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(154 mg, 574 umol, 3 eq)의 용액에 EDCI(110 mg, 574 umol, 3 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 DCM을 제거하고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-39(0.08 g, 62.83 umol, 32.83% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.03 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.61 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 2H), 7.73 (br s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.73 (s, 3H), 3.85 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.67-3.50 (m, 38H), 3.64 (br s, 1H), 3.38 (br s, 2H), 3.13 (br s, 2H), 2.95 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.35-1.96 (m, 2H), 1.94-1.81 (m, 3H), 1.77-1.64 (m, 4H), 0.93 (br s, 3H). LC/MS [M+H] 1273.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1273.7 (관찰치).
실시예 L-40 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-40의 합성
부틸 (2S)-1-(5-브로모피리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-40a의 제법
DMF(10 mL) 중의 5-브로모피리딘-2-카복실산(2.00 g, 9.90 mmol, 1.0 eq), Et3N(2.50 g, 24.7 mmol, 3.45 mL, 2.5 eq)과 tert-부틸 (2S)-피롤리딘-2-카복실레이트(2.06 g, 9.90 mmol, 1.0 eq, HCl)의 혼합물에 HATU(3.76 g, 9.90 mmol, 1.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 이후 25℃로 가열하고, 또 다른 0.5시간 동안 교반하였다. 물(30 mL)을 첨가하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(30 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(30 mL * 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 20/1, 2/1)에 의해 정제하여 HxBzL-40a(3.40 g, 9.57 mmol, 96.6% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.96-7.92 (m, 2H), 5.03 (dd, J = 3.2, 8.4 Hz, 1H), 3.91-3.85 (m, 2H), 2.33-2.28 (m, 2H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.55-1.48 (m, 9H).
tert-부틸 (2S)-1-[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-40b의 제법
디옥산(30 mL) 중의 HxBzL-40a(3.40 g, 9.57 mmol, 1.0 eq), 4,4,5,5-테트라메틸-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란(2.92 g, 11.5 mmol, 1.2 eq), Pd(dppf)Cl2(700 mg, 957 umol, 0.1 eq) 및 AcOK(2.35 g, 23.9 mmol, 2.5 eq)의 용액을 탈기시키고, 이후 N2 하에 3시간 동안 100℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 HxBzL-40b(3.60 g, 미정제)를 검정색의 오일로서 제공하고, 이것을 정제 없이 다음 단계에 바로 사용하였다.
에틸 2-아미노-8-[6-[(2S)-2-tert-부톡시카보닐피롤리딘-1-카보닐]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트, HxBzL-40c의 제법
디옥산(45 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBzL-40b(3.60 g, 8.95 mmol, 1.0 eq), 에틸 2-아미노-8-브로모-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트(2.77 g, 8.95 mmol, 1.0 eq), Pd(dppf)Cl2(655 mg, 895 umol, 0.1 eq) 및 K3PO4 (3.80 g, 17.9 mmol, 2.0 eq)의 용액을 탈기시키고, 이후 N2 하에 2시간 동안 95℃로 가열하였다. 디옥산(45 mL)을 제거하고, 수성 상을 에틸 아세테이트(30 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(30 mL * 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 0/1)에 의해 정제하여 HxBzL-40c(1.60 g, 3.17 mmol, 35.4% 수율)를 연황색의 고체로서 제공하였다.
2-아미노-8-[6-[(2S)-2-tert-부톡시카보닐피롤리딘-1-카보닐]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBzL-40d의 제법
MeOH(10 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBzL-40c(1.60 g, 3.17 mmol, 1.0 eq)의 용액에 LiOHㆍH2O(399 mg, 9.51 mmol, 3.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이것을 25℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 pH = 7까지 HCl(4 M)로 켄칭하고, 이후 MeOH(10 mL)를 제거하고, 침전물을 여과시키고 건조시켜 HxBzL-40d(1.10 g, 2.31 mmol, 72.8% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.32-8.26 (m, 1H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95-7.65 (m, 5H), 5.04-5.01 (m, 1H), 3.79-3.82 (m, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.36-2.27 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.89-1.77 (m, 2H), 1.45-1.23 (m, 9H).
tert-부틸 (2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-40e의 제법
DCM(4 mL) 및 DMA(2 mL) 중의 HxBzL-40d(200 mg, 420 umol, 1.0 eq)와 N-에톡시프로판-1-아민(64.5 mg, 462 umol, 1.1 eq, HCl)의 혼합물에 EDCI(322 mg, 1.68 mmol, 4.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. DCM(4 mL)을 제거하고, 물(8 mL)을 첨가하고, 이후 수성 상의 pH를 포화 NaHCO3로 약 8로 조정하고, 에틸 아세테이트(5 mL * 3)로 추출하고, 합한 유기 상을 염수(5 mL * 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1, 0/1 내지 에틸 아세테이트/메탄올 = 10/1)에 의해 정제하여 HxBzL-40e(200 mg, 356 umol, 84.8% 수율)를 갈색의 오일로서 제공하였다.
(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실산, HxBzL-40f의 제법
MeCN(1 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBzL-40e(200 mg, 356 umol, 1.0 eq)의 용액에 HCl(12 M, 890 uL, 30 eq)을 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 HxBzL-40f(175 mg, 346 umol, 97.2% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-40g의 제법
DMF(2 mL) 중의 HxBzL-40f(175 mg, 346 umol, 1.0 eq), tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(203 mg, 346 umol, 1.0 eq)와 Et3N(105 mg, 1.04 mmol, 145 uL, 3.0 eq)의 혼합물에 HATU(132 mg, 346 umol, 1.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 0℃에서 첨가하고, 이것을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 이후 25℃로 가열하고, 또 다른 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 50%, 10분)에 의해 정제하여 HxBzL-40g(150 mg, 126 umol, 36.5% 수율, TFA)를 연황색의 오일로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-40h의 제법
MeCN(0.2 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBzL-40g(150 mg, 140 umol, 1.0 eq)의 용액에 HCl(12 M, 349 uL, 30 eq)을 일 부분으로 N2 하에 25℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반한다 반응 혼합물을 진공에서 농축시켜 CH3CN을 제거하고, 수성 상을 동결 건조시켜 HxBzL-40h(140 mg, 137.64 umol, 98.48% 수율)를 갈색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-40의 제법
DCM(1.5 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-40h(140 mg, 138 umol, 1.0 eq)와 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(185 mg, 688 umol, 5.0 eq)의 혼합물에 EDCI(132 mg, 688 umol, 5.0 eq)를 일 부분으로 N2 하에 20℃에서 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-40(46.3 mg, 35.5 umol, 25.8% 수율, 95.5% 순도)을 연황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.28 (dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.84 (s, 2H), 7.82 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.16 (dd, J = 4.4, 8.0 Hz, 1H), 4.00 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.90-3.84 (m, 3H), 3.77 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.68-3.56 (m, 36H), 3.53-3.43 (m, 6H), 3.22-3.14 (m, 2H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.42-2.35 (m, 1H), 2.13-1.96 (m, 3H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1245.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1245.4 (관찰치).
실시예 L-42 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-42의 합성
(R)-tert-부틸 1-(5-브로모피리미딘-2-카보닐)피롤리딘- 2-카복실레이트, HxBzL-42b의 제법
DMF(3 mL) 중의 5-브로모피리미딘-2-카복실산, HxBzL-42a(200 mg, 985 umol, 1 eq)의 용액에 DIEA(509 mg, 3.94 mmol, 686 uL, 4 eq) 및 HATU(412 mg, 1.08 mmol, 1.1 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 10분 동안 교반하고, tert-부틸 (2S)-피롤리딘-2-카복실레이트(186 mg, 1.08 mmol, 1.1 eq)를 혼합물에 첨가하고, 이것을 25℃에서 또 다른 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 20 mL로 희석하고, EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(20 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 1/1)에 의해 정제하여 HxBzL-42b(200 mg, 561 umol, 56.99% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.18-9.10 (m, 2H), 4.70-4.41 (m, 1H), 3.75-3.48 (m, 2H), 2.42-1.87 (m, 4H), 1.56-1.30 (m, 9H)
(R)-tert-부틸 1-(5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-42c의 제법
디옥산(5 mL) 중의 HxBzL-42b(200 mg, 561 umol, 1 eq) 및 Pin2B2(214 mg, 842 umol, 1.5 eq)의 용액에 KOAc(110 mg, 1.12 mmol, 2 eq) 및 Pd(dppf)Cl2(41.1 mg, 56.2 umol, 0.1 eq)를 보호된 N2 하에 첨가하고, 이후 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 갈색의 고체로서 얻은 미정제 생성물 HxBzL-42c(230 mg, 미정제)를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
(R)-tert-부틸 1-(5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-42d의 제법
디옥산(5 mL) 중의 HxBzL-42c(230 mg, 570 umol, 1 eq) 및 2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드(209 mg, 570 umol, 1 eq)의 용액에 보호된 N2 하에 물(0.2 mL) 중의 K2CO3(158 mg, 1.14 mmol, 2 eq)의 용액 및 Pd(dppf)Cl2(41.7 mg, 57 umol, 0.1 eq)를 첨가하고, 이후 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 에틸 아세테이트: MeOH =5:1)에 의해 정제하여 HxBzL-42d(240 mg, 427 umol, 74.8% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
(R)-1-(5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실산, HxBzL-42e의 제법
H2O(5 mL) 및 MeCN(2 mL) 중의 HxBzL-42d(240 mg, 427 umol, 1 eq)의 용액에 HCl(12 M, 355 uL, 10 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-42e(170 mg, 336 umol, 78.7% 수율)를 제공하고 황색의 오일로서 얻었다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-42f의 제법
DMF(2 mL) 중의 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-의 용액에 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(167 mg, 284 umol, 1.2 eq) 및 HxBzL-42e(120 mg, 237 umol, 1 eq) 및 DIEA(91.9 mg, 711 umol, 124 uL, 3 eq)의 용액에 HATU(90.1 mg, 237 umol, 1 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이것을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 45%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-42f(120 mg, 112 umol, 47.2 % 수율)를 연황색의 오일로서 생성시켰다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-42g의 제법
H2O(3 mL) 중의 HxBzL-42f(115 mg, 107 umol, 1 eq)의 혼합물에 HCl(12 M, 89.2 uL, 10 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-42g(105 mg, 103 umol, 96.3% 수율)를 무색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.39-9.04 (m, 2H), 7.88-7.80 (m, 2H), 7.78-7.74 (m, 1H), 7.48 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.90-4.62 (m, 1H), 4.03-3.95 (m, 2H), 3.92-3.80 (m, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.72-3.67 (m, 2H), 3.66-3.57 (m, 38H), 3.48-3.38 (m, 4H), 3.29-3.11 (m, 2H), 2.47 (dt, J = 2.8, 6.2 Hz, 2H), 2.15-1.98 (m, 4H), 1.84-1.73 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H)
HxBzL-42의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-42g(105 mg, 103 umol, 1 eq) 및 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(111 mg, 413 umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(79.1 mg, 413 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 잔류물 압력 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-42(60.0 mg, 44.1 umol, 42.8% 수율, TFA)를 연황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.27-9.21 (m, 2H), 7.89-7.81 (m, 2H), 7.77-7.72 (m, 1H), 7.48-7.44 (m, 1H), 5.05-4.62 (m, 1H), 3.99 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.89-3.83 (m, 4H), 3.76 (br t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.66-3.53 (m, 36H), 3.50-3.42 (m, 4H), 3.28-3.20 (m, 2H), 3.16-3.05 (m, 1H), 2.99-2.94 (m, 2H), 2.46-2.26 (m, 1H), 2.12-1.97 (m, 3H), 1.82-1.74 (m, 2H), 1.21 (dt, J = 1.8, 7.2 Hz, 3H), 1.04-0.98 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1246.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1246.4 (관찰치).
실시예 L-43 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-43의 합성
tert-부틸 (2R)-1-(5-브로모피리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-43b의 제법
DMF(50 mL) 중의 5-브로모피리딘-2-카복실산, HxBzL-43a(2.19 g, 10.8 mmol, 1 eq)의 혼합물에 HATU(4.53 g, 11.9 mmol, 1.1 eq) 및 Et3N(3.29 g, 32.5 mmol, 4.52 mL, 3 eq)을 첨가하고, 이후 tert-부틸 (2R)-피롤리딘-2-카복실레이트(2.25 g, 10.8 mmol, 1 eq, HCl)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(150 mL)와 물(100 mL)에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 2/1)에 의해 정제하여 HxBzL-43b(3.8 g, 10.7 mmol, 98.8% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.76-8.61 (m, 1H), 8.17-8.13 (m, 1H), 7.91-7.74 (m, 1H), 5.07-4.51 (m, 1H), 3.96-3.67 (m, 2H), 2.43-2.27 (m, 1H), 2.18-1.90 (m, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 6H).
tert-부틸 (2R)-1-[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란- 2-일)피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-43c의 제법
디옥산(80 mL) 중의 tert HxBzL-43b(3.5 g, 9.85 mmol, 1 eq), 4,4,5,5-테트라메틸-2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란, Pin2B2, 비스(피나콜레이토)디보론, CAS 등록 번호 78183-34-3(3.75 g, 14.8 mmol, 1.5 eq), KOAc(2.42 g, 24.6 mmol, 2.5 eq)의 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(721 mg, 985 umol, 0.1 eq)를 첨가하고, 이후 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 후처리 및 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. HxBzL-43c(3.96 g, 9.84 mmol, 100.00% 수율)를 검정색의 액체로서 얻었다.
에틸 2-아미노-8-[6-[(2R)-2-tert-부톡시카보닐피롤리딘-1-카보닐]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트, HxBzL-43d의 제법
디옥산(100 mL) 및 H2O(8 mL) 중의 HxBzL-43c(3.96 g, 9.84 mmol, 1 eq), 에틸 2-아미노-8-브로모-3H-1-벤자제핀-4-카복실레이트(3.04 g, 9.84 mmol, 1 eq), Pd(dppf)Cl2(360 mg, 492 umol, 0.05 eq)와 K2CO3(3.40 g, 24.6 mmol, 2.5 eq)의 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 EtOAc(100 mL)에 용해시키고, 물(50 mL)에 의해 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1, EA:MeOH = 5:1)에 의해 정제하여 HxBzL-43d(4 g, 7.93 mmol, 80.5% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 9.07-8.72 (m, 1H), 8.29-8.16 (m, 1H), 8.12-7.78 (m, 2H), 7.62-7.40 (m, 3H), 5.17-4.47 (m, 1H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.04-3.75 (m, 2H), 3.67-2.94 (m, 2H), 2.49-2.27 (m, 1H), 2.22-1.88 (m, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.43-1.34 (m, 9H).
2-아미노-8-[6-[(2R)-2-tert-부톡시카보닐피롤리딘-1-카보닐]-3-피리딜]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBzL-43e의 제법
THF(20 mL) 및 H2O(40 mL) 중의 HxBzL-43d(3.5 g, 6.94 mmol, 1 eq)의 혼합물에 LiOH.H2O(582 mg, 13.9 mmol, 2 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 THF를 제거하고, 이후 혼합물의 pH를 HCl(4 M)로 약 5로 조정하고, 형성된 고체는 혼합물을 형성하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과된 케이크를 진공에서 건조시키고, HxBzL-43e(3.3 g, 6.93 mmol, 99.8% 수율)를 백색의 고체로서 얻었다.
tert-부틸 (2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실레이트, HxBzL-43f의 제법
DCM(5 mL) 및 DMA(5 mL) 중의 HxBzL-43e(0.4 g, 839 umol, 1 eq)와 N-에톡시프로판-1-아민(117 mg, 839 umol, 1 eq, HCl)의 혼합물에 EDCI(483 mg, 2.52 mmol, 3 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 DCM을 제거하고, 잔류물을 EtOAc(20 mL)와 물(20 mL)에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1, EA:MeOH = 5:1)에 의해 정제하여 HxBzL-43f(0.32 g, 570 umol, 67.9% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 9.06-8.77 (m, 1H), 8.26-8.17 (m, 1H), 8.07-7.87 (m, 1H), 7.53- 7.36 (m, 3H), 7.30 (s, 1H), 5.17-4.50 (m, 1H), 4.01-3.69 (m, 6H), 3.01-2.88 (m, 2H), 2.45- 2.30 (m, 1H), 2.18-2.03 (m, 2H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.36 (s, 6H), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카복실산, HxBzL-43g의 제법
H2O(5 mL) 중의 HxBzL-43f(260 mg, 463 umol, 1 eq)의 혼합물에 HCl(12 M, 579 uL, 15 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 HxBzL-43g(0.25 g, 461 umol, 99.6% 수율, HCl)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-43h의 제법
DMF(5 mL) 중의 HxBzL-43g(200 mg, 369 umol, 1 eq, HCl)와 tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(216 mg, 369 umol, 1 eq)의 혼합물에 HATU(154 mg, 406 umol, 1.1 eq) 및 DIEA(143 mg, 1.11 mmol, 193 uL, 3 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이것을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 25% 내지 51%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-43h(340 mg, 286 umol, 77.6% 수율, TFA)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리딘-2-카보닐]피롤리딘-2-카보닐]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-43i의 제법
H2O(20 mL) 중의 HxBzL-43h(340 mg, 286 umol, 1 eq, TFA)의 혼합물에 HCl(12 M, 358 uL, 15 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 잔류물로 농축시켰다. 미정제물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-43i(220 mg, 209 umol, 72.9% 수율, HCl)를 황색의 오일로서 생성시켰다.
HxBzL-43의 제법
DMA(0.3 mL) 및 DCM(3 mL) 중의 HxBzL-43i(180 mg, 171 umol, 1 eq, HCl)와 나트륨;2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(183 mg, 683 umol, 4 eq)의 혼합물에 EDCI(164 mg, 854 umol, 5 eq)를 첨가하고, 이것을 15℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 45%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-43(94 mg, 72.6 umol, 42.5% 수율, 96.2% 순도)을 무색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 9.10-8.85 (m, 1H), 8.43-8.16 (m, 1H), 8.11-7.94 (m, 1H), 7.91- 7.71 (m, 3H), 7.48 (s, 1H), 5.18-4.65 (m, 1H), 4.07-3.72 (m, 8H), 3.69-3.39 (m, 40H), 3.30- 3.13 (m, 2H), 3.00-2.97 (m, 2H), 2.59-2.23 (m, 1H), 2.19-1.66 (m, 5H), 1.25-1.21 (m, 3H), 1.05-1.00 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1245.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1245.4 (관찰치).
실시예 L-44 2-아미노-8-(2-(38-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-3,37-디옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-2,36-디아자옥타트리아콘틸)피리미딘-5-일)-N-에톡시-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카복사미드, HxBzL-44의 합성
2-아미노-8-(2-(아미노메틸)피리미딘-5-일)-N-에톡시-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카복사미드, HxBz-5(0.0283 g, 0.072 mmol, 1 eq.) 및 1-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-2-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-3-아자헥사트리아콘탄-36-오산, HxBzL-44a(0.0478 g, 0.072 mmol, 1 eq.)를 디메틸포름아미드, DMF에 용해시켰다. 디이소프로필에틸아민, DIPEA(0.075 mol, 0.43 mmol, 6 eq.)를 첨가한 후, ((7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, CAS 등록 번호 156311-83-0(0.091 g, 0.18 mmol, 2.4 eq.)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 교반하고, 이후 농축시키고, RP-HPLC에 의해 정제하여 HxBzL-44(0.0346 g, 0.033 mmol, 46%)를 생성시켰다. LC/MS [M+H] 1043.53 (계산치); LC/MS [M+H] 1043.84 (관찰치).
실시예 L-47 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[프로필(1H-피라졸-5-일메톡시)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-47의 합성
5-(클로로메틸)-1H-피라졸, HxBz-41b의 제법
DCM(10 mL) 중의 1H-피라졸-5-일메탄올, HxBz-41a(4 g, 40.8 mmol, 1 eq)의 용액에 티오닐 클로라이드, SOCl2(9.70 g, 81.55 mmol, 5.92 mL, 2 eq)를 첨가하고, 이후 0℃ 내지 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 HxBz-41b(4.5 g, 38.6 mmol, 94.70% 수율)를 백색의 고체로서 얻었다. LC/MS [M+H] 117.0 (계산치); LC/MS [M+H] 117.0 (관찰치).
tert-부틸 N-프로필-N-(1H-피라졸-5-일메톡시)카바메이트, HxBz-41c의 제법
DMF(20 mL) 중의 HxBz-41b(3.01 g, 17.2 mmol, 1 eq)의 용액에 NaH(1.03 g, 25.7 mmol, 60% 순도, 1.5 eq)를 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 이 온도에서 0.5시간 교반하고, 이후 KI(285 mg, 1.72 mmol, 0.1 eq) 및 5-(클로로메틸)-1H-피라졸(2 g, 17.16 mmol, 1 eq)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 NH4Cl 20 mL의 첨가에 의해 켄칭하고, EtOAc(20mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex luna C18(250 * 70mm, 15 um); 이동상: [물(0.1% TFA) -ACN]; B%: 20% 내지 45%, 20분)에 의해 정제하여 HxBz-41c(0.6 g, 2.35 mmol, 13.69% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다. LC/MS [M+H] 256.1 (계산치); LC/MS [M+H] 256.1 (관찰치).
N-(1H-피라졸-5-일메톡시)프로판-1-아민, HxBz-41d의 제법
MeCN(2 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBz-41c(0.5 g, 1.96 mmol, 1 eq)의 용액에 TFA(2.23 g, 19.58 mmol, 1.45 mL, 10 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 MeCN을 제거하였다. 수성 상을 MTBE 20 mL로 추출하여 과량의 TFA를 제거하였다. 물 층을 동결건조시켜 HxBz-41d(0.25 g, 미정제, TFA)를 황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 7.10 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.30-3.20 (m, 2H), 1.78-1.71 (m, 2H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 2H). LC/MS [M+H] 156.1 (계산치); LC/MS [M+H] 156.1 (관찰치).
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[프로필(1H-피라졸-5-일메톡시)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]카바메이트, HxBz-41f의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(1 mL) 중의 HxBz-41d(0.2 g, 743 umol, 1 eq, TFA 염) 및 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-41e(304 mg, 743 umol, 1 eq)의 용액에 EDCI(854 mg, 4.46 mmol, 6 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 NaHCO3로 켄칭하여 pH = 약 8로 조정하고, 이후 EtOAc(30 mL x 4)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(30 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, MeOH/에틸 아세테이트 = 1/5)에 의해 정제하여 HxBz-41f(0.35 g, 640.30 umol, 86.19% 수율)를 황색의 고체로서 생성시켰다. LC/MS [M+H] 547.3 (계산치); LC/MS [M+H] 547.3 (관찰치).
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-프로필-N-(1H-피라졸-5-일메톡시)-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-41의 제법
MeCN(2 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBz-41f(0.35 g, 640 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(584 mg, 5.12 mmol, 379 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA) -ACN]; B%: 1% 내지 25%, 8분)에 의해 정제하여 HxBz-41(0.25 g, 371 umol, 57.88% 수율, 2TFA)을 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 9.20 (s, 2H), 7.82-7.78 (m, 1H), 7.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 3.80 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.26 (s, 2H), 1.88-1.73 (m, 2H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 447.2 (계산치); LC/MS [M+H] 447.2 (관찰치).
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[프로필(1H-피라졸-5-일메톡시)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-47a의 제법
THF(10mL) 중의 HxBz-41(0.2 g, 296 umol, 1 eq, 2TFA)의 용액에 Et3N(90.0 mg, 889 umol, 124 uL, 3 eq) 및 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-tert-부톡시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, t-Bu-COO-PEG10-COOTFP(226 mg, 296 umol, 1 eq)를 첨가하고, 이후 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O 5 mL의 첨가에 의해 켄칭하고, 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 조정하고, 수성 상을 EtOAc(10 ml * 2)로 추출하여 부산물을 제거하고, 수상을 DCM/PrOH = 10/1(20 mL x 3)로 추가로 추출하고, 합한 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 화합물 HxBzL-47a를 황색의 오일로서 생성시켰다. LC/MS [M+H] 1043.56 (계산치); LC/MS [M+H] 1043.6 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[프로필(1H-피라졸-5-일메톡시)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-47b의 제법
MeCN(2 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBzL-47a(0.2 g, 192 umol, 1 eq)의 용액에 HCl(12 M, 320 uL, 20 eq)을 첨가하고, 이후 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA) -ACN]; B%: 5% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-47b(0.13 g, 132 umol, 68.69% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다. LC/MS [M+H] 987.5 (계산치); LC/MS [M+H] 987.6 (관찰치).
HxBzL-47의 제법
DCM(1 mL) 및 DMA(1 mL) 중의 HxBzL-47b(0.1 g, 101 umol, 1 eq) 및 2,3,5,6-테트라플루오로페놀(67.3 mg, 405umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(77.7 mg, 405 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 20% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-47(0.0216 g, 19.0 umol, 18.78% 수율)을 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 9.10 (s, 2H), 7.78 (dd, J = 1.6, 8.0 Hz, 1H), 7.71-7.66 (m, 2H), 7.57 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.28-7.24 (m, 1H),6.31 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.68-3.55 (m, 36H), 3.26 (s, 2H), 3.02-2.91 (m, 2H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.80 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1135.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1135.6 (관찰치).
실시예 L-52 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부틸카바모일옥시)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-52의 합성
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부틸카바모일옥시)프로필-프로필- 카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]카바메이트, HxBz-45b의 제법
DMF(3 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBz-45a(180 mg, 440 umol, 1 eq)의 용액에 HATU(167 mg, 440 umol, 1 eq) 및 DIPEA(284 mg, 2.20 mmol, 383 uL, 5 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 이 온도에서 5분 동안 교반하고, 이후 3-(프로필아미노)프로필 N-사이클로부틸카바메이트(110 mg, 440 umol, 1 eq, HCl)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 25분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 H2O(15 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 이후 EtOAc(10 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(5 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건: 칼럼: Phenomenex luna C18 250 * 50 mm * 10 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 25% 내지 55%, 10분)에 의해 정제하여 HxBz-45b(0.15 g, 208 umol, 47.4% 수율, TFA)를 생성시키고 황색의 오일로서 얻었다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.07 (s, 2H), 7.86-7.65 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 4.09-4.06 (m, 3H), 3.63-3.56 (m, 2H), 3.51-3.45 (m, 2H), 3.36 (br s, 2H), 2.25-2.21 (m, 2H), 2.04-1.87 (m, 4H), 1.78-1.61 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 0.98-0.94 (m, 3H).
3-[[2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카보닐]-프로필-아미노]프로필 N-사이클로부틸카바메이트, HxBz-45의 제법
EtOAc(1 mL) 중의 HxBz-45b(0.15 g, 208 umol, 1 eq, TFA)의 용액에 HCl/EtOAc(4 M, 10 mL, 192 eq)를 첨가하고, 이후 15℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 HxBz-45(135 mg, 미정제, 2HCl)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.21 (s, 2H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.16-3.97 (m, 3H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.51-3.45 (m, 2H), 3.38 (br s, 2H), 2.26-2.20 (m, 2H), 2.04-1.85 (m, 4H), 1.75-1.53 (m, 4H), 1.01-0.89 (m, 3H). LC/MS [M+H] 506.3 (계산치); LC/MS [M+H] 506.3 (관찰치).
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부틸카바모일옥시)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-52a의 제법
DMF(1 mL) 중의 HxBz-45(75 mg, 130 umol, 1 eq, 2HCl)의 용액에 트리에틸아민, Et3N, TEA(39.4 mg, 389 umol, 54.1 uL, 3 eq) 및 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-tert-부톡시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트(98.9 mg, 130 umol, 1 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 약 6으로 조정하고, 이후 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건: 칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 25% 내지 55%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-52a(0.13 g, 107 umol, 82.4% 수율, TFA)를 생성시키고 연황색의 오일로서 얻었다. LC/MS [M+H] 1102.6 (계산치); LC/MS [M+H] 1102.6 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[3-(사이클로부틸카바모일옥시)프로필-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-52b의 제법
CH3CN(1 mL) 및 H2O(5 mL) 중의 HxBzL-52a(0.13 g, 107 umol, 1 eq, TFA)의 용액에 TFA(97.5 mg, 855 umol, 63.3 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 CH3CN을 제거하였다. 수상을 MTBE(5 mL x 3)로 추출하여 버렸다. 수상을 감압 하에 농축시켜 HxBzL-52b(0.14 g, 미정제, TFA)를 연황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.09 (s, 2H), 7.85-7.78 (m, 1H), 7.77-7.69 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.76-3.69 (m, 3H), 3.66-3.58 (m, 38H), 3.50-3.45 (m, 2H), 3.37 (br s, 2H), 2.60 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.51 (m, 2H), 2.35-2.07 (m, 2H), 2.06-1.81 (m, 4H), 1.75-1.66 (m, 4H), 0.98-0.91 (m, 3H)
HxBzL-52의 제법
DCM(2 mL) 및 DMA(0.2 mL) 중의 HxBzL-52b(0.13 g, 112 umol, 1 eq, TFA)의 용액에 (2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-페닐)설포닐옥시나트륨(90.1 mg, 336 umol, 3 eq) 및 EDCI(85.9 mg, 448 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이후 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 DCM을 제거하고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건: 칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-52(32.3 mg, 25.4 umol, 22.6% 수율)를 생성시키고 연황색의 오일로서 얻었다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.08 (s, 2H), 7.83-7.67 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.70-3.55 (m, 36H), 3.51-3.45 (m, 3H), 3.38 (br s, 2H), 3.32 (br s, 2H), 2.97 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.25-2.20 (m, 2H), 2.07-1.84 (m, 4H), 1.80-1.54 (m, 4H), 1.10-0.82 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1274.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1274.7 (관찰치).
실시예 L-53 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-53의 합성
tert-부틸 ((5-브로모피리딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-39b의 제법
MeOH(10 mL) 중의 (5-브로모-3-피리딜)메탄아민, HxBz-39a(1 g, 5.35 mmol, 1 eq) 및 TEA(649 mg, 6.42 mmol, 893 uL, 1.2 eq)의 용액에 Boc2O(1.40 g, 6.42 mmol, 1.47 mL, 1.2 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 1/1)에 의해 정제하여 HxBz-39b(1.5 g, 5.22 mmol, 97.7% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다.
tert-부틸 ((5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-39c의 제법
디옥산(10 mL) 중의 HxBz-39b(750 mg, 2.61 mmol, 1 eq) 및 Pin2B2(995 mg, 3.92 mmol, 1.5 eq)의 용액에 N2 하에 KOAc(513 mg, 5.22 mmol, 2 eq) 및 Pd(dppf)Cl2(191 mg, 262 umol, 0.1 eq)를 첨가하고, 이후 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBz-39c(800 mg, 2.39 mmol, 91.7% 수율)를 갈색의 오일로서 생성시키고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
tert-부틸 ((5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리딘-3-일)메틸)카바메이트, HxBz-39d의 제법
디옥산(3 mL) 중의 HxBz-39c(800 mg, 2.39 mmol, 1 eq) 및 2-아미노-8-브로모-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드(877 mg, 2.39 mmol, 1 eq)의 용액에 물(3 mL) 중의 K2CO3(992 mg, 7.18 mmol, 3 eq)의 용액 및 Pd(dppf)Cl2(175 mg, 239 umol, 0.1 eq)를 보호된 N2 하에 첨가하고, 이후 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 50/1 내지 에틸 아세테이트: MeOH = 5:1)에 의해 정제하여 HxBz-39d(900 mg, 1.82 mmol, 76.2% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
2-아미노-8-(5-(아미노메틸)피리딘-3-일)-N-에톡시-N-프로필-3H-벤조[b]아제핀-4-카복사미드, HxBz-39의 제법
CH3CN(2 mL) 및 H2O(2 mL) 중의 HxBz-39d(350 mg, 709 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(646 mg, 5.67 mmol, 420 uL, 8 eq)를 첨가하고, 이것을 N2 분위기 하에 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 생성시키고, H2O(15 mL)를 첨가하고, 수성 상을 MTBE(20 mL x 3)로 추출하여 버리고, 수성 상을 동결 건조시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna C18 150 * 30 mm * 5um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 5% 내지 35%, 9분)에 의해 정제하여 HxBz-39(201 mg, 396 umol, 55.9 % 수율, TFA)를 생성시키고 연황색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.33-8.27 (m, 1H), 7.80-7.72 (m, 3H), 7.46 (s, 1H), 4.31 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 7.2 z, 2H), 3.44 (s, 2H), 1.82-1.74 (m, 2H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 394.2 (계산치); LC/MS [M+H] 394.2 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]-3-피리딜]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-53a의 제법
THF(5 mL) 중의 HxBz-39(150 mg, 296 umol, 1 eq, TFA) 및 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산(209 mg, 296 umol, 1 eq)의 용액에 Et3N(89.7 mg, 887 umol, 123 uL, 3 eq)을 첨가하고, 이것을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 0℃에서 TFA로 4 내지 5로 조정하고, H2O(5 ml)를 첨가하고, EtOAc(10 mL)로 추출하여 버리고, 수성물을 DCM/i-prOH(20 mL * 3, 3/1)로 추가로 추출하고, 유기 층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-53a(200 mg, 214 umol, 72.4% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다.
HxBzL-53의 제법
DCM(3 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-53a(0.13 g, 139 umol, 1.0 eq)의 혼합물에 2,3,5,6-테트라플루오로페놀(92.5 mg, 557 umol, 4.0 eq) 및 EDCI(133 mg, 696 umol, 5.0 eq)를 일 부분으로 25℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고 여과시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA) -ACN]; B%: 25% 내지 55%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-53(78 mg, 65.2 umol, 46.85% 수율, TFA)을 연황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.79-7.72 (m, 2H), 7.49-7.37 (m, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.98 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.81-3.73 (m, 4H), 3.64-3.54 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.96 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.59-2.50 (m, 2H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J = 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1082.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1082.6 (관찰치).
실시예 L-61 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-61의 합성
N-부트-3-에닐-4-니트로-N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61b의 제법
DMF(150 mL) 중의 4-니트로-N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61a(12 g, 49.1 mmol, 1.0 eq)의 용액에 Cs2CO3(40.0 g, 123 mmol, 2.5 eq), KI(8.16 g, 49.1 mmol, 1.0 eq) 및 4-브로모부트-1-엔(19.9 g, 147 mmol, 15.0 mL, 3.0 eq)을 첨가하고, 이후 N2 하에 40℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물(w/w = 1/1)(150 mL)에 붓고, 10분 동안 교반하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(100 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(100 mL x 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 10/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61b(11 g, 36.9 mmol, 75.1% 수율)를 황색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.51-8.36 (m, 2H), 8.14-7.94 (m, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.10-4.96 (m, 2H), 3.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.15 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.31 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67-1.44 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 299.1 (계산치); LC/MS [M+H] 299.0 (관찰치).
4-니트로-N-[2-(옥시란-2-일)에틸]-N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61c의 제법
DCM(200 mL) 중의 HxBzL-61b(13.5 g, 45.3 mmol, 1.0 eq)의 용액에 메타-클로로퍼벤조산, m-CPBA(18.4 g, 90.5 mmol, 85% 순도, 2.0 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과액을 포화 NaHSO3(30 mL x 1) 및 염수(100 mL)로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 3/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61c(12 g, 38.2 mmol, 84.4% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. LC/MS [M+H] 315.1 (계산치); LC/MS [M+H] 315.0 (관찰치).
N-[4-(에틸아미노)-3-하이드록시-부틸]-4-니트로- N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61d의 제법
THF(100 mL) 중의 HxBzL-61c(7 g, 22 mmol, 1.0 eq)의 용액에 에탄아민(33.5 g, 445 mmol, 48.6 mL, 60% 순도, 20 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이후 30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 45℃에서 농축시켰다. 미정제 생성물 HxBzL-61d(8 g, 22.3 mmol, 99.95% 수율)를 황색의 고체로서 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. LC/MS [M+H] 360.1 (계산치); LC/MS [M+H] 360.2 (관찰치).
tert-부틸 N-에틸-N-[2-하이드록시-4-[(4-니트로페닐)설포닐-프로필-아미노]부틸]카바메이트, HxBzL-61e의 제법
THF(70 mL) 및 H2O(10 mL) 중의 HxBzL-61d(7.6 g, 21.1 mmol, 1.0 eq)의 용액에 NaHCO3(3.55 g, 42.3 mmol, 1.64 mL, 2.0 eq) 및 Boc2O(9.23 g, 42.3 mmol, 9.71 mL, 2.0 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 얼음물(w/w = 1/1)(50 mL)에 붓고, 10분 동안 교반하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(50 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(50 mL x 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 2/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61e(8.6 g, 18.7 mmol, 88.5% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.46-8.39 (m, 2H), 8.13-8.04 (m, 2H), 3.78-3.70 (m, 1H),3.39-3.2 (m, 3H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.20-3.14 (m, 2H), 3.10-3.00 (m, 1H), 1.79-1.69 (m, 1H), 1.65-1.53 (m, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.09(t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.90 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
tert-부틸 N-[2-(1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4-[(4-니트로페닐)설포닐-프로필-아미노]부틸]-N-에틸-카바메이트, HxBzL-61f의 제법
THF(50 mL) 중의 HxBzL-61e(5 g, 10.9 mmol, 1.0 eq)와 이소인돌린-1,3-디온(1.76 g, 12.0 mmol, 1.1 eq)의 혼합물에 트리페닐포스핀, PPh3(4.28 g, 16.3 mmol, 1.5 eq) 및 디에틸아조디카복실레이트, DEAD(2.84 g, 16.3 mmol, 2.97 mL, 1.5 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음물(w/w = 1/1)(50 mL)에 붓고, 10분 동안 교반하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(30 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수(30 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 1/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61f(8.8 g, 미정제)를 황색의 고체로서 제공하였다. LC/MS [M+H] 589.2 (계산치); LC/MS [M+H] 589.2 (관찰치).
tert-부틸 N-[2-아미노-4-[(4-니트로페닐)설포닐-프로필-아미노]부틸]-N-에틸-카바메이트, HxBzL-61g의 제법
MeOH(50 mL) 중의 HxBzL-61f(4.4 g, 7.47 mmol, 1.0 eq)의 용액에 NH2NH2.H2O(2.25 g, 44.9 mmol, 2.18 mL, 6.0 eq)를 20℃에서 첨가하고, 이후 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과액을 진공에서 농축시켜 HxBzL-61g(3.4 g, 7.41 mmol, 99.2% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. LC/MS [M+H] 459.2 (계산치); LC/MS [M+H] 459.2 (관찰치).
N-[3-아미노-4-(에틸아미노)부틸]-4-니트로-N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61h의 제법
EtOAc(30 mL) 중의 HxBzL-61g(2.9 g, 6.32 mmol, 1.0 eq)의 용액에 HCl/EtOAc(4 M, 29.0 mL, 18.3 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 HxBzL-61h(2.7 g, 미정제, 2HCl)를 황색의 고체로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.35 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.78-3.69 (m, 1H), 3.45-3.31 (m, 4H), 3.17-3.05 (m, 4H), 2.12-1.99 (m, 2H), 1.57-1.43 (m, 2H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.80 (t, J = 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 359.17 (계산치); LC/MS [M+H] 359.1 (관찰치).
N-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸]-4-니트로-N-프로필-벤젠설폰아미드, HxBzL-61i의 제법
THF(30 mL) 중의 HxBzL-61h(2.7 g, 7.53 mmol, 1.0 eq)와 Et3N(1.91 g, 18.8 mmol, 2.62 mL, 2.5 eq)의 혼합물에 카보닐디이미다졸, CDI(2.44 g, 15.1 mmol, 2.0 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 얼음물(w/w = 1/1)(50 mL)에 붓고, 10분 동안 교반하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(30 mL x 3)로 추출한다. 합한 유기 상을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 0/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61i(300 mg, 780 umol, 10.4% 수율)를 황색의 오일로서 생성시켰다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.39 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.99-3.95 (m, 1H), 3.77-3.63 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.48-3.38 (m, 1H), 3.35-3.23 (m, 2H), 3.22-3.04 (m, 4H), 1.98-1.74 (m, 2H), 1.66-1.45 (m, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
1-에틸-4-[2-(프로필아미노)에틸]이미다졸리딘-2-온, HxBzL-61j의 제법
MeCN(10 mL) 중의 HxBzL-61i(300 mg, 780 umol, 1.0 eq)의 용액에 LiOH.H2O(196 mg, 4.68 mmol, 6.0 eq) 및 메틸 2-설파닐아세테이트(0.45 g, 4.24 mmol, 384 uL, 5.43 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 H2O(20 mL)로 희석하고, 이후 수상의 pH를 HCl(1 M)로 3 내지 4로 조정하고, 이후 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하여 부산물을 제거하고, 이후 수상을 동결 건조하여 HxBzL-61j(180 mg, 763 umol, 97.8% 수율, HCl)를 무색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 3.83-3.73 (m, 1H), 3.65 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.28-3.13 (m, 3H), 3.12-3.03 (m, 2H), 3.02-2.93 (m, 2H), 2.01-1.84 (m, 2H), 1.79-1.67 (m, 2H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
tert-부틸 N-[[5-[2-아미노-4-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸]카바메이트, HxBzL-61l의 제법
DMF(6 mL) 중의 2-아미노-8-[2-[(tert-부톡시카보닐아미노)메틸]피리미딘-5-일]-3H-1-벤자제핀-4-카복실산, HxBzL-61k(210 mg, 513 umol, 1.0 eq)의 용액에 HATU(205 mg, 539 umol, 1.05 eq), DIEA(331 mg, 2.56 mmol, 447 uL, 5.0 eq) 및 HxBzL-61j(145 mg, 615 umol, 1.2 eq, HCl)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 얼음물(w/w = 1/1)(10 mL)에 붓고, 5분 동안 교반하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(10 mL x 3)로 추출한다. 합한 유기 상을 염수(10 mL x 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피(칼럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카 겔, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0, 1/0, 에틸 아세테이트/메탄올 = 1/0, 3/1)에 의해 정제하여 HxBzL-61l(300 mg, 508 umol, 99.0% 수율)을 황색의 고체로서 제공하였다. LC/MS [M+H] 591.3 (계산치); LC/MS [M+H] 591.3 (관찰치).
2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸]-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBzL-61m의 제법
EtOAc(5 mL) 중의 HxBzL-61l(300 mg, 508 umol, 1.0 eq)의 용액에 HCl/EtOAc(4 M, 6.00 mL, 47.3 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 1% 내지 30%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-61m(142 mg, 198 umol, 38.91% 수율, 2TFA)을 황색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.22 (s, 2H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.15 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.75-3.60 (m, 2H), 3.57-3.50 (m, 4H), 3.39 (s, 2H), 3.28-3.18 (m, 3H), 2.02-1.97 (s, 1H), 1.88-1.83 (m, 1H), 1.81-1.65 (m, 2H), 1.15-1.10 (m, 3H), 1.01-0.95 (m, 3H). LC/MS [M+H] 491.28 (계산치); LC/MS [M+H] 491.3 (관찰치).
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-61n의 제법
DMF(1 mL) 중의 HxBzL-61m(90 mg, 125 umol, 1.0 eq, 2TFA) 및 Et3N(38.02 mg, 376 umol, 52.3 uL, 3.0 eq)의 용액에 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-tert-부톡시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, t-Bu-COO-PEG10-COOTFP(95.5 mg, 125 umol, 1.0 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 물(10mL)을 첨가하고, 이후 혼합물의 pH를 TFA로 약 6으로 조정하였다. 수성 상을 MTBE(5 mL x 3)로 추출하여 부산물을 제공하였다. 수상을 DCM/i-PrOH=3/1(10 mL x 3)로 추가로 추출하였다. 유기 상(DCM/i-PrOH)을 진공에서 농축시켜 HxBzL-61n(130 mg, 120 umol, 95.5% 수율)을 황색의 오일로서 제공하였다.
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[2-(1-에틸-2-옥소-이미다졸리딘-4-일)에틸-프로필-카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-61o의 제법
MeCN(0.5 mL) 및 H2O(1 mL) 중의 HxBzL-61n(100 mg, 92.0 umol, 1.0 eq)의 용액에 TFA(83.9 mg, 735 umol, 54.5 uL, 8.0 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켜 잔류물을 생성시키고, 잔류물을 물(10mL)로 희석하고, 수성 상을 MTBE(10 mL)로 추출하여 과량의 TFA를 제거하고, 수상을 황색의 오일로서 HxBzL-61o(100 mg, 87.3 umol, 94.9% 수율, TFA)로 동결건조시켰다.
HxBzL-61의 제법
DCM(1 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-61o(100 mg, 87.3 umol, 1.0 eq, TFA) 및 나트륨 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(70.2 mg, 262 umol, 3.0 eq)의 용액에 EDCI(67.0 mg, 349 umol, 4.0 eq)를 첨가하고, 이후 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 10% 내지 35%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-61(30 mg, 23.8 umol, 27.3% 수율)을 황색의 오일로서 제공하였다. 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.10 (s, 2H), 7.81-7.68 (m, 3H), 7.14 (s, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.88 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.68-3.59 (m, 37H), 3.55-3.50 (m, 3H), 3.40 (s, 2H), 3.26-3.20 (m, 3H), 2.98 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.06-1.82 (m, 2H), 1.80-1.67 (m, 2H), 1.15-1.10 (m, 3H), 1.01-0.93 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1259.5 (계산치); LC/MS [M+H] 1259.6 (관찰치).
실시예 L-65 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸카바모일옥시메틸]페닐]카바모일]-4-우레이도-부틸]카바모일]-2-메틸-프로필]아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]-2,3,5,6-테트라플루오로-벤젠설폰산, HxBzL-65의 합성
4-((S)-2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 ((5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-일)메틸)카바메이트, HxBzL-65a의 제법
DMF(0.5 mL) 중의 2-아미노-8-[2-(아미노메틸)피리미딘-5-일]-N-에톡시-N-프로필-3H-1-벤자제핀-4-카복사미드, HxBz-5(41.2 mg, 96 umol, 1 eq, HCl) 및 Et3N(29.0 mg, 287 umol, 39.9 uL, 3 eq)의 용액에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-3-메틸-1-(((S)-1-((4-((((4-니트로페녹시)카보닐)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-1-옥소부탄-2-일)카바메이트, Fmoc-Val-Cit-PNC(110 mg, 143 umol, 1.5 eq)를 0℃에서 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 피페리딘(24.4 mg, 287 umol, 28.3 uL, 3 eq)을 혼합물에 첨가하고, 25℃에서 또 다른 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 5% 내지 30%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-65a(60 mg, 75.0 umol, 78.4% 수율)를 황색의 오일로서 제공하였다. LC/MS [M+H] 800.4 (계산치); LC/MS [M+H] 800.6 (관찰치).
tert-부틸 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸카바모일옥시메틸]페닐]카바모일]-4-우레이도-부틸]카바모일]-2-메틸-프로필]아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, HxBzL-65b의 제법
THF(2 mL) 중의 HxBzL-65a(60 mg, 65.7 umol, 1 eq, TFA)의 용액에 Et3N(19.9 mg, 197 umol, 27.4 uL, 3 eq) 및 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-tert-부톡시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트, t-Bu-COO-PEG10-COOTFP(50.1 mg, 66 umol, 1 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 2 mL로 희석하고, 이후 수성 상의 pH를 TFA로 5 내지 6으로 조정하고, DCM/i-prOH(5 mL x 3, 3/1)로 추출하고, 합한 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-65b(90 mg, 64.4 umol, 98.2% 수율)를 황색의 오일로서 생성시키고, 이것을 추가의 정제 없이 다음 단계로 사용하였다. LC/MS [M+H] 1396.8 (계산치); LC/MS [M+H] 1396.7 (관찰치).
3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸카바모일옥시메틸]페닐]카바모일]-4-우레이도-부틸]카바모일]-2-메틸-프로필]아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-65c의 제법
물(3 mL) 및 MeCN(1 mL) 중의 HxBzL-65b(90 mg, 64 umol, 1 eq)의 용액에 TFA(73.5 mg, 644 umol, 47.7 uL, 10 eq)를 첨가하고, 이후 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 2 mL로 희석하고, 이후 수성 상의 pH를 TFA로 5 내지 6으로 조정하고, DCM/i-prOH(5 mL x 3, 3/1)로 추출하고, 합한 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에 농축시켜 HxBzL-65c(100 mg, 미정제)를 생성시키고 황색의 오일로서 얻었다. LC/MS [M+H] 1340.7 (계산치); LC/MS [M+H] 1340.6 (관찰치).
HxBzL-65의 제법
DCM(1 mL) 및 DMA(0.5 mL) 중의 HxBzL-65c(100 mg, 74.6 umol, 1 eq) 및 나트륨 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-벤젠설포네이트(80.0 mg, 298 umol, 4 eq)의 용액에 EDCI(57.2 mg, 298 umol, 4 eq)를 첨가하고, 이후 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 prep-HPLC(TFA 조건; 칼럼: Phenomenex Luna 80 * 30 mm * 3 um; 이동상: [물(0.1% TFA)-ACN]; B%: 15% 내지 40%, 8분)에 의해 정제하여 HxBzL-65(20 mg, 12.75 umol, 17.09% 수율)를 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.08 (s, 2H), 7.83-7.78 (m, 1H), 7.77-7.71 (m, 2H), 7.65 (br d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.42-7.34 (m, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.54-4.48 (m, 1H), 4.23-4.18 (m, 1H), 4.02-3.98 (m, 2H), 3.87 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.80-3.75 (m, 2H), 3.65-3.60 (m, 36H), 3.52-3.49 (m, 2H), 3.47 (s, 2H), 3.21-3.14 (m, 2H), 2.98 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.61-2.53 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 1H), 2.02-1.88 (m, 1H), 1.85-1.71 (m, 3H), 1.70-1.52 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.05-0.99 (m, 9H). LC/MS [M+H] 1568.6 (계산치); LC/MS [M+H] 1568.6 (관찰치).
실시예 L-70 2,3,5,6-테트라플루오로페닐 1-(5-(2-아미노-4-(에톡시(프로필)카바모일)-3H-벤조[b]아제핀-8-일)피리미딘-2-일)-3-옥소-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카옥사-2-아자헥사트리아콘탄-36-오에이트, HxBzL-70
실시예 L-5의 절차에 따라, 50 ml의 DCM 중의 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-아미노-4-[에톡시(프로필)카바모일]-3H-1-벤자제핀-8-일]피리미딘-2-일]메틸아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산, HxBzL-5a(5.00 g, 5.35 mmol, 1.00 equiv.)의 용액에 2,3,5,6-테트라플루오로페놀(1.77 g, 10.7 mmol, 2.00 equiv.), 프로판포스폰산 무수물(PPAA, T3P), CAS 등록 번호 68957-94-8(MeCN 중의 50 중량% 용액, 17.0 g 용액, 26.8 mmol, 5.00 equiv.) 및 N-메틸이미다졸, NMI(2.15 mL, 26.8 mmol, 5.00 equiv.)를 순차적으로 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하고, 이후 20% 수성 NaCl(50 mL)로 희석하였다. 수성 층을 DCM(25 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층을 물(25 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과시키고 진공에서 농축시켜 미정제 HxBzL-70을 어두운 갈색의 오일의 형태로 얻었다. 재료를 Biotage 칼럼(250 mL, MeCN/물 2:8 중의 7.5 mM HCl, v/v)에 로딩하고, 구배 단(20 칼럼 부피 MeCN/물 2:8, 이후 15 칼럼 부피 MeCN/물 3:7)을 사용하여 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 이후 추출시키고(2 x 300 mL DCM), 진공에서 농축시켜 순수한 HxBzL-70(5.34 g, qNMR에 의해 55.6 중량% 순도, 56% 수율)을 진황색의 오일의 형태로 제공하고, 이것을 질소 하에 -20℃에서 저장한 후, 이것을 DMA로 희석하여 HxBzL-70의 20 mM 용액을 만들었다. LC/MS [M+H] 1083.1 (계산치); LC/MS [M+H] 1083.1 (관찰치).
실시예 201 면역접합체(IC)의 제법
리신-접합된 면역접합체를 제조하기 위해, 항체를 G-25 SEPHADEXTM 탈염 칼럼(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스) 또는 ZebaTM Spin Desalting Column(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 pH 8.3에서 100 mM 붕산, 50 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산을 함유하는 접합 완충제로 완충제 교환하였다. 이후, 용리물을 각각 완충제를 사용하여 약 1 내지 10 mg/ml의 농도로 조정하고, 이후 멸균 여과시켰다. 항체를 20 내지 30℃로 예비 가온시키고, 5 내지 20 mM의 농도로 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸아세타미드(DMA)에 용해된 2-20(예를 들면, 7-10) 몰 당량의 테트라플루오로페닐(TFP) 또는 설폰 테트라플루오로페닐(설포닐TFP) 에스테르, 화학식 II의 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커(HxBzL) 화합물과 신속히 혼합하였다. 반응이 약 16시간 동안 30℃에서 진행되게 하고, 면역접합체(IC)를 표 3a 및 표 3b의 면역접합체(IC)를 제공하도록 pH 7.2에서 포스페이트 완충 식염수(PBS)에서 평형화된 2개의 연속 G-25 탈염 칼럼 또는 ZebaTM Spin Desalting Column 위로 실행함으로써 반응물질로부터 분리하였다. 아쥬반트-항체 비(DAR)는 XEVOTM G2-XS TOF 질량 분광기(Waters Corporation)에 연결된 ACQUITYTM UPLC H-클래스(Waters Corporation, 메사추세츠주 밀포드)에서 C4 역상 칼럼을 사용하여 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 결정된다.
시스테인-접합된 면역접합체를 제조하기 위해, 항체를 ZebaTM Spin Desalting Column(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 2 mM EDTA와 PBS, pH 7.2를 함유하는 접합 완충제로 완충제 교환하였다. 사슬간 디설파이드는 2 내지 4 몰 과량의 Tris (2-카복시에틸) 포스핀(TCEP) 또는 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 37℃에서 30분 내지 2시간 동안 환원시켰다. 과량의 TCEP 또는 DTT를 접합 완충제와 예비 평형화된 ZebaTM Spin Desalting 칼럼을 사용하여 제거하였다. 완충제 교환된 항체의 농도를 접합 완충제를 사용하여 대략 5 내지 20 mg/ml로 조정하고, 멸균 여과시켰다. 말레이미드-HxBzL 화합물을 5 내지 20 mM의 농도로 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸아세타미드(DMA)에 용해시켰다. 접합을 위해, 항체를 10 내지 20 몰 당량의 말레이미드-HxBzL과 혼합하였다. 일부 경우에, 20%(v/v)까지 추가 DMA 또는 DMSO를 접합 완충제에서 말레이미드-HxBzL의 용해도를 개선하기 위해 첨가하였다. 반응이 대략 30분 내지 4시간 동안 20℃에서 진행하게 하였다. 생성된 접합체를 2개의 연속 ZebaTM Spin Desalting Column을 사용하여 비반응된 말레이미드-HxBzL로부터 정제하였다. 칼럼을 포스페이트-완충 식염수(PBS), pH 7.2와 예비 평형화하였다. 아쥬반트 대 항체 비(DAR)는 XEVOTM G2-XS TOF 질량 분광기(Waters Corporation)에 연결된 ACQUITYTM UPLC H-클래스(Waters Corporation, 메사추세츠주 밀포드)에서 C4 역상 칼럼을 사용하여 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 예측된다.
접합을 위해, 항체는 항체의 안정성 또는 항원-결합 특이성에 부정적으로 영향을 미치지 않는 당해 분야에 알려진 수성 완충제 시스템에 용해될 수 있다. 포스페이트 완충 식염수가 사용될 수 있다. HxBzL 화합물은 본원에서 어딘가에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 극성 비양성자성 용매를 포함하는 용매 시스템에 용해된다. 일부 이러한 양태에서, HxBzL은 pH 8 Tris 완충제(예를 들면, 50 mM Tris)에서 약 5 mM, 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM 또는 약 50 mM 및 이의 범위, 예컨대 약 5 mM 내지 약 50mM 또는 약 10 mM 내지 약 30 mM의 농도로 용해된다. 일부 양태에서, 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 중간체는 DMSO(디메틸설폭사이드), DMA(디메틸아세타미드), 아세토니트릴 또는 또 다른 적합한 이극성 비양성자성 용매에 용해된다.
대안적으로 접합 반응에서, 당량 과량의 HxBzL 용액은 희석되고, 항체 용액과 배합될 수 있다. HxBzL 용액은 적합하게는 적어도 하나의 극성 비양성자성 용매 및 적어도 하나의 극성 양성자성 용매에 희석될 수 있고, 이의 예는 물, 메탄올, 에탄올, n-프로판올 및 아세트산을 포함하였다. 항체에 대한 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 중간체의 몰 당량은 약 1.5:1, 약 3:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 15:1 또는 약 20:1 및 이의 범위, 예컨대 약 1.5:1 내지 약 20:1, 약 1.5:1 내지 약 15:1, 약 1.5:1 내지 약 10:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 3:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 15:1 또는 약 5:1 내지 약 10:1일 수 있다. 반응은 적합하게는 당해 분야에 알려진 방법, 예컨대 LC-MS에 의해 완료에 대해 모니터링될 수 있다. 접합 반응은 통상적으로 약 1시간 내지 약 16시간의 범위에 완료한다. 반응이 완료한 후, 반응을 켄칭하기 위해 반응 혼합물에 시약이 첨가될 수 있다. 항체 티올 기가 티올-반응성 기, 예컨대 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 중간체의 말레이미드와 반응하면, 비반응된 항체 티올 기는 캡핑 시약과 반응할 수 있다. 적합한 캡핑 시약의 예는 에틸말레이미드이다.
접합 후, 면역접합체는 예를 들면 비제한적인 예로서 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 한외여과, 원심분리 한외여과, 접선 흐름 여과 및 이들의 조합과 같은 당해 분야에 알려진 정제 방법에 의해 비접합된 반응물질 및/또는 접합체 응집체로부터 정제되고 분리될 수 있다. 예를 들면, 면역접합체를 20 mM 숙신산나트륨(pH 5)에 희석하는 것이 정제에 선행할 수 있다. 희석된 용액은 양이온 교환 칼럼에 적용된 후, 예를 들면 적어도 10 칼럼 부피의 20 mM 숙신산나트륨(pH 5)으로 세척된다. 접합체는 적합하게는 완충제, 예컨대 PBS로 용리될 수 있다.
실시예 202 HEK 리포터 검정
인간 TLR7 또는 인간 TLR8(InvivoGen, 캘리포니아주 샌 디에고)을 발현하는 인간 배아 신장(HEK293) 리포터 세포를 세포 전파 및 실험을 위해 벤더 프로토콜에 의해 사용하였다. 간단히, 세포를 10% FBS, ZEOCINTM 및 블라스티시딘이 보충된 DMEM에서 5% CO2에서 80-85% 포화상태로 성장시켰다. 이후, 세포를 HEK 검출 배지 및 면역자극 분자를 함유하는 기질에 의해 4x104개의 세포/웰로 96웰 편평 플레이트에서 시딩하였다. 620-655 nm 파장에서 플레이트 판독기를 사용하여 활성을 측정하였다.　
실시예 203 시험관내 면역접합체 활성의 평가
이 실시예는 본 발명의 면역접합체가 면역 활성화를 일으키는 데 효과적이고, 따라서 암의 치료에 유용하다는 것을 보여준다.
a) 인간 항원 제시 세포의 단리: 인간 골수성 항원 제시 세포(APC)를 CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 및 HLA-DR에 대한 단일클론 항체를 함유하는 ROSETTESEPTM Human Monocyte Enrichment Cocktail(Stem Cell Technologies, 캐나다 밴쿠버)을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 혈액 공여자(Stanford Blood Center, 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 얻은 인간 말초 혈액으로부터 음성 선택하였다. 후속하여, 미성숙 APC를 CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 및 HLA-DR에 대한 단일클론 항체를 함유하는 CD16 고갈이 없는 EASYSEPTM Human Monocyte Enrichment Kit(Stem Cell Technologies)를 사용하여 음성 선택을 통해 90% 초과의 순도로 정제하였다.
b) 골수성 APC 활성화 검정: 2 x 105개의 APC를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL(밀리리터당 마이크로그램) 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 피루브산나트륨, 비필수 아미노산 및 표시된 경우 다양한 농도의 비접합된(네이키드) 항체 및 본 발명의 면역접합체(상기 실시예에 따라 제조된 것과 같음)가 보충된 Iscove 변형 둘베코 배지, IMDM(Lonza)을 함유하는 96웰 플레이트(Corning, 뉴욕주 코닝)에서 항온처리하였다. 무세포 상청액을 전염증성 반응의 판독으로서 TNFα 분비를 측정하기 위해 ELISA를 통해 18시간 후 분석하였다.
c) PBMC 활성화 검정: 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 혈액 공여자(Stanford Blood Center, 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 얻은 인간 말초 혈액으로부터 단리하였다. PBMC를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비로 CEA-발현 종양 세포(예를 들면, MKN-45, HPAF-II)와의 공동배양물에서 96웰 플레이트(Corning, 뉴욕주 코닝)에서 항온처리하였다. 세포를 다양한 농도의 비접합된(네이키드) 항체 및 본 발명의 면역접합체(상기 실시예에 따라 제조된 것과 같음)에 의해 자극하였다. 무세포 상청액을 제조사의 가이드라인(BioLegend®, 캘리포니아주 샌 디에고)에 따라 LegendPlexTM 키트를 사용하여 사이토카인 비드 어레이에 의해 분석하였다.
d) 인간 종래의 수지상 세포의 단리: 인간 종래의 수지상 세포(cDC)를 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 혈액 공여자(Stanford Blood Center, 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 얻은 인간 말초 혈액으로부터 음성 선택하였다. 간단히, 세포를 처음에 세포 조제물로부터 T 세포를 제거하기 위해 ROSETTESEPTM Human CD3 Depletion Cocktail(Stem Cell Technologies, 캐나다 밴쿠버)을 사용하여 농후화하였다. 이후, cDC를 EASYSEPTM Human Myeloid DC Enrichment Kit(Stem Cell Technologies)를 사용하여 음성 선택을 통해 추가로 농후화하였다.
e) cDC 활성화 검정: 8 x 104개의 APC를 10:1의 효과기(cDC) 대 표적(종양 세포) 비로 ISAC 표적 항원을 발현하는 종양 세포와 공동배양하였다. 세포를 10% FBS 및 표시된 경우 다양한 농도의 본 발명의 표시된 면역접합체(상기 실시예에 따라 제조된 것과 같음)가 보충된 RPMI-1640 배지를 함유하는 96웰 플레이트(Corning, 뉴욕주 코닝)에서 항온처리하였다. 약 18시간의 밤샘 항온처리 후, 무세포 상청액을 수집하고, BioLegend LEGENDPLEX 사이토카인 비드 어레이를 사용하여 사이토카인 분비(TNFα를 포함)에 대해 분석하였다.
골수성 세포 유형의 활성화를 상이한 골수성 집단이 사용된 기재된 검정 이외의 다양한 스크린 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 이것은 건강한 공여자 혈액으로부터 단리된 단핵구, M-CSF 분화된 대식세포, GM-CSF 분화된 대식세포, GM-CSF+IL-4 단핵구-유래된 수지상 세포, 건강한 공여자 혈액으로부터 단리된 종래의 수지상 세포(cDC) 및 면역억제 상태로 극성화된 골수성 세포(골수성 유래된 억제자 세포 또는 MDSC라고도 칭함)를 포함할 수 있다. MDSC 극성화된 세포의 예는 면역억제 상태를 향해 분화된 단핵구, 예컨대 M2a MΦ(IL4/IL13), M2c MΦ(IL10/TGFb), GM-CSF/IL6 MDSC 및 종양-교육된 단핵구(TEM)를 포함한다. TEM 분화는 종양 조건화 배지(예를 들면, 786.O, MDA-MB-231, HCC1954)를 사용하여 수행될 수 있다. 1차 종양-연관된 골수성 세포는 또한 해리된 종양 세포 현탁액(Discovery Life Sciences)에 존재하는 1차 세포를 포함한다.
골수성 세포의 기재된 집단의 활성화의 평가는 단일배양으로서 또는 면역접합체가 항체의 CDR 영역을 통해 결합할 수 있는 관심 있는 항원을 발현하는 세포와의 공동배양으로서 수행될 수 있다. 18-48시간 동안 항온처리 후, 활성화는 유세포분석법을 사용하여 세포 표면 공동자극 분자의 상향조절에 의해 또는 분비된 전염증성 사이토카인의 측정에 의해 평가될 수 있다. 사이토카인 측정을 위해, 무세포 상청액을 수확하고, 유세포분석법을 사용하여 사이토카인 비드 어레이(예를 들면, Biolegend로부터의 LegendPlex)에 의해 분석하였다.
본원에 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 참고로 포함된 것으로 개별적으로 및 구체적으로 표시되고 본원에 그 전체가 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
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Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 131 Ala Ala Pro Ala 1 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 132 Ala Ala Pro Val 1 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Nva <400> 133 Ala Ala Pro Xaa 1

Claims (58)

  1. 링커에 의해 하나 이상의 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티에 공유 부착된 항체를 포함하고, 화학식 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는 면역접합체:

    상기 식 중,
    Ab는 CEA에 결합하는 항원 결합 도메인을 갖는 항체 작제물이고;
    p는 1 내지 8의 정수이고;
    HxBz는 하기 화학식을 갖는 8-Het-2-아미노벤자제핀 모이어티이고;

    Het는 헤테로사이클릴디일 및 헤테로아릴디일로부터 선택되고;
    R1, R2, R3 및 R4는 H, C1-C12 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴, C2-C9 헤테로사이클릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 및 선택적으로
    -(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -(C1-C12 알킬디일)-OR5;
    -(C3-C12 카보사이클릴);
    -(C3-C12 카보사이클릴)-*;
    -(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
    -(C3-C12 카보사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -(C3-C12 카보사이클릴)-NR5-C(=NR5)NR5-*;
    -(C6-C20 아릴);
    -(C6-C20 아릴디일)-*;
    -(C6-C20 아릴디일)-N(R5)-*;
    -(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
    -(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
    -(C2-C20 헤테로사이클릴);
    -(C2-C20 헤테로사이클릴)-*;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-C(=NR5a)NR5-*;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-NR5-(C6-C20 아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -(C2-C9 헤테로사이클릴)-(C6-C20 아릴디일)-*;
    -(C1-C20 헤테로아릴);
    -(C1-C20 헤테로아릴)-*;
    -(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -(C1-C20 헤테로아릴)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -(C1-C20 헤테로아릴)-NR5-C(=NR5a)N(R5)-*;
    -(C1-C20 헤테로아릴)-N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -C(=O)-*;
    -C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -C(=O)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
    -C(=O)N(R5)2;
    -C(=O)N(R5)-*;
    -C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-*;
    -C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)N(R5)-*;
    -C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)R5;
    -C(=O)N(R5)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=O)N(R5)2;
    -C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)CO2R5;
    -C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)C(=NR5a)N(R5)2;
    -C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5C(=NR5a)R5;
    -C(=O)NR5-(C1-C8 알킬디일)-NR5(C2-C5 헤테로아릴);
    -C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-N(R5)-*;
    -C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-*;
    -C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -C(=O)NR5-(C1-C20 헤테로아릴디일)-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-C(=O)NR5-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*;
    -N(R5)2;
    -N(R5)-*;
    -N(R5)C(=O)R5;
    -N(R5)C(=O)-*;
    -N(R5)C(=O)N(R5)2;
    -N(R5)C(=O)N(R5)-*;
    -N(R5)CO2R5;
    -NR5C(=NR5a)N(R5)2;
    -NR5C(=NR5a)N(R5)-*;
    -NR5C(=NR5a)R5;
    -N(R5)C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -N(R5)-(C2-C5 헤테로아릴);
    -N(R5)-S(=O)2-(C1-C12 알킬);
    -O-(C1-C12 알킬);
    -O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -O-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*;
    -O-C(=O)N(R5)2;
    -O-C(=O)N(R5)-*;
    -S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-*;
    -S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)2;
    -S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-NR5-*; 및
    -S(=O)2-(C2-C20 헤테로사이클릴디일)-(C1-C12 알킬디일)-OH
    로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되거나;
    또는 R2 및 R3은 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
    X1, X2, X3 및 X4는 결합, C(=O), C(=O)N(R5), O, N(R5), S, S(O)2 및 S(O)2N(R5)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R5는 H, C6-C20 아릴, C3-C12 카보사이클릴, C6-C20 아릴디일, C1-C12 알킬 및 C1-C12 알킬디일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 2개의 R5 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
    R5a는 C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    별표 *은 L의 부착 부위를 나타내고, R1, R2, R3 및 R4 중 하나는 L에 부착되고;
    L은
    -C(=O)-PEG-;
    -C(=O)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
    -C(=O)-PEG-O-;
    -C(=O)-PEG-O-C(=O)-;
    -C(=O)-PEG-C(=O)-;
    -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-;
    -C(=O)-PEG-N(R6)-;
    -C(=O)-PEG-N(R6)-C(=O)-;
    -C(=O)-PEG-N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
    -C(=O)-PEG-N+(R6)2-PEG-C(=O)-PEP-;
    -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
    -C(=O)-PEG-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
    -C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
    -C(=O)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-;
    -C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-;
    -C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
    -C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-C(=O);
    -C(=O)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-C(=O)-Gluc-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-O-C(=O)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-N(R5)-C(=O)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-C(=O)-PEP-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)N(R6)-PEG-SS-(C1-C12 알킬디일)-OC(=O)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)-;
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-; 및
    -숙신이미딜-(CH2)m-C(=O)-PEP-N(R6)-(C1-C12 알킬디일)N(R6)C(=O)-(C2-C5 모노헤테로사이클릴디일)-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고;
    R6은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    PEG는 화학식 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-을 갖고; m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수이고;
    Gluc는 하기 화학식을 갖고;

    PEP는 하기 화학식을 갖고;

    AA는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택되거나, AA 중 하나 이상 및 인접한 질소 원자는 5원 고리 프롤린 아미노산을 형성하고, 물결선은 부착점을 나타내고;
    Cyc는 F, Cl, NO2, -OH, -OCH3 및 하기 구조를 갖는 글루쿠론산으로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 C6-C20 아릴디일 및 C1-C20 헤테로아릴디일로부터 선택되고;

    R7은 -CH(R8)O-, -CH2-, -CH2N(R8)- 및 -CH(R8)O-C(=O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 H, C1-C6 알킬, C(=O)-C1-C6 알킬 및 -C(=O)N(R9)2로부터 선택되고, R9는 H, C1-C12 알킬 및 -(CH2CH2O)n-(CH2)m-OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, m은 1 내지 5의 정수이고, n은 2 내지 50의 정수이거나, 2개의 R9 기는 함께 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
    y는 2 내지 12의 정수이고;
    z는 0 또는 1이고;
    알킬, 알킬디일, 알케닐, 알케닐디일, 알키닐, 알키닐디일, 아릴, 아릴디일, 카보사이클릴, 카보사이클릴디일, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴디일, 헤테로아릴 및 헤테로아릴디일은 F, Cl, Br, I, -CN, -CH3, -CH2CH3, -CH=CH2, -C≡CH, -C≡CCH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -C(CH3)2OH, -CH(OH)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH2OH, -CH2CH2SO2CH3, -CH2OP(O)(OH)2, -CH2F, -CHF2, -CF3, -CH2CF3, -CH2CHF2, -CH(CH3)CN, -C(CH3)2CN, -CH2CN, -CH2NH2, -CH2NHSO2CH3, -CH2NHCH3, -CH2N(CH3)2, -CO2H, -COCH3, -CO2CH3, -CO2C(CH3)3, -COCH(OH)CH3, -CONH2, -CONHCH3, -CON(CH3)2, -C(CH3)2CONH2, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NHCOCH3, -N(CH3)COCH3, -NHS(O)2CH3, -N(CH3)C(CH3)2CONH2, -N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3, -NHC(=NH)H, -NHC(=NH)CH3, -NHC(=NH)NH2, -NHC(=O)NH2, -NO2, =O, -OH, -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2OCH3, -OCH2CH2OH, -OCH2CH2N(CH3)2, -O(CH2CH2O)n-(CH2)mCO2H, -O(CH2CH2O)nH, -OCH2F, -OCHF2, -OCF3, -OP(O)(OH)2, -S(O)2N(CH3)2, -SCH3, -S(O)2CH3 및 -S(O)3H로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 독립적으로 및 선택적으로 치환됨.
  2. 제1항에 있어서, 항체는 라베투주맙 및 아르시투모맙, 또는 이의 바이오시밀러 또는 바이오베터로부터 선택되는, 면역접합체.
  3. 제1항에 있어서, 항체 작제물은
    a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    b) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    c) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    d) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    e) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    f) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    g) 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    h) 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 또는
    i) 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 면역접합체.
  4. 제1항에 있어서, 항체 작제물은 서열 번호 1, 17, 32, 50, 57, 73, 89 및 105로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 9, 41, 65, 81, 97, 113, 122 및 130으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 면역접합체.
  5. 제1항에 있어서, 항체 작제물은 서열 번호 1, 17, 32, 50, 57, 73, 89 및 105로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 9, 41, 65, 81, 97, 113, 122 및 130으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 면역접합체.
  6. 제5항에 있어서, 항체 작제물은 서열 번호 105로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 118로부터의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR(상보성 결정 영역) CDR-H2를 포함하는, 면역접합체.
  7. 제6항에 있어서, 항체 작제물은 서열 번호 105로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 서열 번호 113으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 면역접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Het는 피리딜디일, 피리미딜디일, 피라졸릴디일, 피페라지닐디일, 피페리디닐디일 및 피라지닐디일로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역접합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 결합이고, R1은 H인, 면역접합체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2는 결합이고, R2는 C1-C8 알킬인, 면역접합체.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X2 및 X3은 각각 결합이고, R2 및 R3은 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5, -(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2, -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  12. 제11항에 있어서, R2는 C1-C8 알킬이고, R3은 -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5인, 면역접합체.
  13. 제12항에 있어서, R2는 -CH2CH2CH3이고, R3은 -CH2CH2CH2NHCO2(t-Bu), -OCH2CH2NHCO2(사이클로부틸) 및 -CH2CH2CH2NHCO2(사이클로부틸)로부터 선택되는, 면역접합체.
  14. 제12항에 있어서, R2 및 R3은 각각 독립적으로 -CH2CH2CH3, -OCH2CH3, -OCH2CF3, -CH2CH2CF3, -OCH2CH2OH 및 -CH2CH2CH2OH로부터 선택되는, 면역접합체.
  15. 제12항에 있어서, R2 및 R3은 각각 -CH2CH2CH3인, 면역접합체.
  16. 제12항에 있어서, R2는 -CH2CH2CH3이고, R3은 -OCH2CH3인, 면역접합체.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X3-R3은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역접합체:
    .
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X4는 결합이고, R4는 H인, 면역접합체.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 L에 부착된, 면역접합체.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2 또는 R3은 L에 부착된, 면역접합체.
  21. 제20항에 있어서, X3-R3-L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역접합체:

    상기 식 중, 물결선은 N에 대한 부착점을 나타냄.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 C1-C12 알킬인, 면역접합체.
  23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 -(C1-C12 알킬디일)-N(R5)-*이고; 별표 *은 L의 부착 부위를 나타내는, 면역접합체.
  24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(=O)-PEG- 또는 -C(=O)-PEG-C(=O)-인, 면역접합체.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 항체의 시스테인 티올에 부착된, 면역접합체.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PEG에 대해 m은 1 또는 2이고, n은 2 내지 10의 정수인, 면역접합체.
  27. 제26항에 있어서, n은 10인, 면역접합체.
  28. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 PEP를 포함하고, PEP는 디펩타이드이고, 화학식 을 갖는, 면역접합체.
  29. 제28항에 있어서, AA1 및 AA2는 H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, -CH2SO3H 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 독립적으로 선택되거나; AA1 및 AA2는 5원 고리 프롤린 아미노산을 형성하는, 면역접합체.
  30. 제28항에 있어서, AA1은 -CH(CH3)2이고, AA2는 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2인, 면역접합체.
  31. 제28항에 있어서, AA1 및 AA2는 GlcNAc 아스파르트산, -CH2SO3H 및 -CH2OPO3H로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  32. 제28항에 있어서, PEP는 하기 화학식을 갖는, 면역접합체:

    상기 식 중, AA1 및 AA2는 천연 발생 아미노산의 측쇄로부터 독립적으로 선택됨.
  33. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 PEP를 포함하고, PEP는 트리펩타이드이고, 화학식 을 갖는, 면역접합체.
  34. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 PEP를 포함하고, PEP는 테트라펩타이드이고, 화학식 을 갖는, 면역접합체.
  35. 제34항에 있어서,
    AA1은 Abu, Ala 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    AA2는 Nle(O-Bzl), Oic 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    AA3은 Ala 및 Met(O)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    AA4는 Oic, Arg(NO2), Bpa 및 Nle(O-Bzl)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역접합체.
  36. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 PEP를 포함하고, PEP는 Ala-Pro-Val, Asn-Pro-Val, Ala-Ala-Val, Ala-Ala-Pro-Ala(서열 번호 131), Ala-Ala-Pro-Val(서열 번호 132) 및 Ala-Ala-Pro-Nva(서열 번호 133)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역접합체.
  37. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 PEP를 포함하고, PEP는 하기 구조로부터 선택되는, 면역접합체:

    .
  38. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L은 하기 구조로부터 선택되는, 면역접합체:

    상기 식 중, 물결선은 R5에 대한 부착을 나타냄.
  39. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 Ia를 갖는, 면역접합체:
    .
  40. 제39항에 있어서, X4는 결합이고, R4는 H인, 면역접합체.
  41. 제39항에 있어서, X2 및 X3은 각각 결합이고, R2 및 R3은 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5, -(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2, -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-OC(O)N(R5)2로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  42. 제39항에 있어서, X2는 O인, 면역접합체.
  43. 제39항에 있어서, 화학식 Ib-Ii로부터 선택되는, 면역접합체:

    .
  44. 제43항에 있어서, X2 및 X3은 각각 결합이고, R2 및 R3은 C1-C8 알킬, -O-(C1-C12 알킬), -(C1-C12 알킬디일)-OR5, -(C1-C8 알킬디일)-N(R5)CO2R5 및 -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5로부터 독립적으로 선택되는, 면역접합체.
  45. 제43항에 있어서, X2 및 X3은 각각 결합이고, R2는 C1-C8 알킬이고, R3은 -O-(C1-C12 알킬) 및 -O-(C1-C12 알킬)-N(R5)CO2R5로부터 선택되는, 면역접합체.
  46. 표 2a 및 표 2b로부터 선택되는 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물.
  47. 항-CEA 항체와 표 2a 및 표 2b로부터 선택된 8-Het-2-아미노벤자제핀-링커 화합물의 접합에 의해 제조된 면역접합체.
  48. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체의 치료학적 유효량 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희석제, 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  49. 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법으로서, 암은 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 방광암, 요로암, 요로상피 암종, 폐암, 비소세포 폐암, 메르켈 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 위암 및 유방암으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 암은 TLR7 및/또는 TLR8 효능작용에 의해 유도된 전염증성 반응에 민감한, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 암은 CEA-발현 암인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 메르켈 세포 암종 암은 전이성 메르켈 세포 암종인, 방법.
  54. 제49항에 있어서, 암은 위식도 연접부 선암인, 방법.
  55. 제49항에 있어서, 면역접합체는 정맥내로, 종양내로 또는 피하로 환자에게 투여되는, 방법.
  56. 제49항에 있어서, 면역접합체는 체중 1 kg당 약 0.01 내지 20 mg의 용량으로 환자에게 투여되는, 방법.
  57. 암을 치료하기 위한 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 면역접합체의 용도로서, 암은 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 방광암, 요로암, 요로상피 암종, 폐암, 비소세포 폐암, 메르켈 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 위암 및 유방암으로부터 선택되는, 용도.
  58. 제1항의 화학식 I의 면역접합체를 제조하는 방법으로서, 제46항의 8-Het-2-아미노-티에노아제핀-링커 화합물은 항-CEA 항체와 접합되는, 방법.
KR1020237022940A 2020-12-11 2021-12-10 암 치료에 유용한 하나 이상의 8-het-2-아미노벤자제핀유도체에 대한 접합에 의해 연결된 항-cea 항체를 포함하는 면역접합체 KR20230118148A (ko)

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