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KR20230058408A - 암 면역 미세 환경 조절 물질 및 그에 따른 예방·진단·치료적 이용 - Google Patents

암 면역 미세 환경 조절 물질 및 그에 따른 예방·진단·치료적 이용 Download PDF

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KR20230058408A
KR20230058408A KR1020237007546A KR20237007546A KR20230058408A KR 20230058408 A KR20230058408 A KR 20230058408A KR 1020237007546 A KR1020237007546 A KR 1020237007546A KR 20237007546 A KR20237007546 A KR 20237007546A KR 20230058408 A KR20230058408 A KR 20230058408A
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KR
South Korea
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tctp
cells
seq
amino acid
antibody
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KR1020237007546A
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타다츠구 타니구치
쇼 한가이
히데유키 야나이
Original Assignee
고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠
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Abstract

본 발명은, 암 면역 미세 환경 조절 인자의 동정과, 당해 조절 인자의 치료적 이용법의 제공을 해결 과제로 한다. 구체적으로는, 본 발명은, 종양사세포로부터 방출되는 면역 조절 인자의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 유효 성분으로서 포함하는, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME)에의 골수 유래 면역 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC)의 축적 저해제이다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 TCTP(translationally controlled tumor protein)의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 포함하는, 상기 저해제이다.

Description

암 면역 미세 환경 조절 물질 및 그에 따른 예방·진단·치료적 이용
본 발명은, 암 면역 미세 환경 조절 물질 및 그것을 사용한 예방·진단·치료적 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, TCTP(translationally controlled tumor protein)의 기능 저해 물질 및 당해 물질을 포함하는 암의 치료제 또는 치료용 조성물, 및 당해 물질의 암 예방·진단·치료적 이용에 관한 것이다.
암에 대한 면역 응답 기구에 대해서는, 오랫동안 논의가 이루어지고, 다양한 연구 보고가 행해져 왔다. 최근의 연구에 의해, 겨우 그 구조 등의 이해가 진행되어 "암의 면역요법"이 주목을 받기에 이르렀다.
현재, 실제로 암 치료에 사용되고 있는 면역요법의 주된 것으로서는, "체크포인트 저해 항체 요법", "CAR-T세포 요법"을 들 수 있다. 그러나, 어느 것이든 그 효과에 대해서는, 어떤 종류의 암에서는 일정한 효과가 확인되고 있으나, 다른 많은 암의 치료에는 충분한 요법이라고는 말할 수 없는 것이 현재의 상황이다.
상기 두 가지 요법은, 모두(암을 공격하는) 림프구의 활성화에 의한 암 치료를 목적으로 한 것이다. 한편, 생체 내에서는, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME)으로 불리는, 암 세포를 공격하는 면역 기능 억제 기구가 알려져 있다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 암 면역 미세 환경은, "암의 요람"이라고도 불리며, 거기에서는, 암에 대한 면역 응답을 억제하는 기구가 존재한다는 점에서, 암 세포의 증식에 유리한 환경이 갖추어져 있는 것이 알려져 있다. 그 때문에, TIME에 있어서의 암 세포와 면역계 세포 사이에 있어서의 상호 작용 및 관련 분자간 상호작용을 해명하는 것이, 신규 면역요법의 개발로 이어질 것으로 기대된다.
그런데, 종양의 진행에 수반하는 상기 면역 억제 기능에 있어서 중요한 역할을 하는 세포로서, 골수 유래 면역 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC)를 들 수 있다. MDSC는 골수 중에 존재하고, 과립구, 수지상 세포 및 마크로파지 등으로 분화하기 전의 분화도가 상이한 전구 세포들의 집단이다. MDSC를 구성하는 세포 집단 중에서, 특히, 2종류의 세포 집단이, 마우스 및 인간에 있어서 동정되어 주목 받고 있다. 이들 2종류의 세포 중 하나는 표현형 및 형태학적 특징이 호중구와 유사한 다형핵 골수 유래 면역 억제 세포(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell: PMN-MDSC)이고, 다른 하나는 단핵구와 유사하고, 종양 관련 마크로파지(tumor-associated macrophage: TAM)로 분화하는 것이 알려져 있는 단핵구성 골수 유래 면역 억제 세포(monocytic myeloid-derived suppressor cell: M-MDSC)이다(비특허문헌 3). MDSC와 암의 관계에 관하여, 악성 종양에 있어서 MDSC의 발현량이 상승하여 TIME에 축적되는 것이나, 임상상의 암의 병기, 전이성 종양의 양 및 암의 예후와 직접 관련성을 나타내는 것이 보고되어 있고, MDSC가 실제, 림프구의 활성·증식을 억제한다는 점에서(비특허문헌 4), 종양의 진행에 있어서 그것을 촉진하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다.
그러나, TIME에 있어서의 MDSC의 축적 구조에 대해서는, 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다.
선행기술문헌
비특허문헌
비특허문헌 1: Binnewies 등, Nature medicine 24, 541-550, doi: 10.1038/s41591-018-0014-x(2018).
비특허문헌 2: Munn 등, Current opinion in immunology 39, 1-6, doi: 10.1016/j. coi. 2015.10.009(2016).
비특허문헌 3: Kumar 등, Trends in immunology 37, 208-220, doi: 10.1016/j. it. 2016.01.004(2016).
비특허문헌 4: Fleming 등, Frontiers in immunology 9, 398, doi: 10. 3389/fimmu. 2018.00398(2018).
비특허문헌 5: Hangai 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, 3844-3849, doi: 10.1073/pnas.1602023113(2016).
비특허문헌 6: Katoh 등, Cancer cell 24, 631-644, doi: 10.1016/j. ccr. 2013.10.009(2013).
비특허문헌 7: Hsu 등, Nature 445, 785-788, doi: 10.1038/nature05528(2007).
비특허문헌 8: Cans 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 13892-13897, doi: 10.1073/pnas. 2335950100(2003).
비특허문헌 9: Amson 등, Nature medicine 18, 91-99, doi: 10.1038/nm. 2546(2011).
비특허문헌 10: Gong 등, Nature reviews. Immunology 20, 95-112, 250 doi: 10.1038/s41577-019-0215-7(2020).
비특허문헌 11: Fujita 등, FEBS letters 582 1055-1060, doi: 10.1016/j. febslet. 2008.02.055(2008).
비특허문헌 12: Hiraoka 등, British journal of cancer.103, 1057-1065, (2010).
비특허문헌 13: Marjou 등, Genesis. 39(3), 186-93, (2004).
비특허문헌 14: Zhang 등, The Journal of Gene Medicine. 7(3), 354-65, (2005).
비특허문헌 1 5: Schroder 등, Scientific Reports. 8(1), 13399, (2018).
상기 사정을 감안하여, 본 발명은, 암 면역 미세 환경 조절 인자의 동정과, 당해 조절 인자의 저해에 따른 치료적 이용법의 제공을 해결 과제로 한다.
종양 세포는 증식 중에 돌연변이의 도입이나 주변의 환경 변화(예를 들어 저 산소 상태 등)에 따라 그 대부분이, 네크로시스(괴사)를 주로 하여 사멸하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 12). 본 발명자들은, 사멸(이하, 네크로시스(괴사)를 의미한다)한 종양 세포(이하, "종양사세포"라고도 기재한다)로부터 방출된 분자가, TIME 중의 MDSC의 면역 조절 인자로서 기능한다라는 작업 가설을 세우고, 예의 연구를 행한 결과, 종양사세포로부터 방출되는 Translationally controlled tumor protein(이하, TCTP)가, TIME 중에 있어서의 MDSC의 기능·동태를 제어하는, 신규 면역 조절 인자인 것을 처음으로 발견하였다.
구체적으로는, 본 발명자들은, 세포외 TCTP가, 주로 M-MDSC에 작용함으로써, CXCL1 패밀리 케모카인의 발현을 유도하는 것을 규명하였다. CXCL1 패밀리 케모카인은, PMN-MDSC를 TIME로 불러 모으고, TIME를 고도로 면역 억제적인 상태로 한다. 본 발명자들은, 항TCTP 모노클로날 항체 또는 TCTP 기능 저해 물질의 투여에 의해, TIME에의 PMN-MDSC의 유도가 저해되고, 종양의 증식이 억제되는 것을 규명하였다. 본 발명은, 종양이 TIME를 어떻게 구축하고 제어하는 것인가라고 하는 미해결 문제를, TCTP의 동정과 그 새로운 기능의 해명에 의해 규명하고, 그 저해법을 개발함으로써 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 이하의 (1) 내지 (13)이다.
(1) 종양사세포로부터 방출되는 면역 조절 인자의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 유효 성분으로서 포함하는, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME)에의 골수 유래 면역 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC)의 축적 저해제.
(2) 상기 골수 유래 면역 억제 세포가, 다형핵 골수 유래 면역 억제 세포(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell: PMN-MDSC)인, 상기 (1)에 기재된 저해제.
(3) 상기 면역 조절 인자가, TCTP(translationally controlled tumor protein)인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 저해제.
(4) 상기 TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질이 항체인, 상기 (3)에 기재된 저해제.
(5) 상기 TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질이 디하이드로아르테미시닌(dihydroartemisinin: DHA)인, 상기 (3)에 기재된 저해제.
(6) 암의 치료제 또는 치료용 조성물이며, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 저해제를 유효 성분으로서 포함하는, 상기 치료제 또는 치료용 조성물.
(7) 상기 암이, 대장암, 악성 흑색종 또는 섬유 육종인, 상기 (6)에 기재된 치료제 또는 치료용 조성물.
(8) 암의 진단 방법 또는 진단 보조 방법이며, 피험자 유래 샘플 중에 존재하는 TCTP mRNA 또는 TCTP 단백질의 양을 측정하는 것을 포함하는, 상기 진단 방법 또는 진단 보조 방법.
(9) 상기 샘플이 혈액 또는 조직인, 상기 (8)에 기재된 방법.
(10) CDR(complementarity determining region) 1 내지 3의 아미노산 서열이 하기 (A), (B) 또는 (C) 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편.
(A) 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는다.
(B) 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는다.
(C) 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 갖는다.
(11) TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체이며, 상기 (10)에 기재된 항체와 TCTP의 결합을 경합 저해하는 항체 또는 그 항원 결합 단편.
(12) 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 항체 또는 그 항원 결합 단편.
(13) Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일쇄 항체, scFv, scFv 이량체 또는 dsFv인 것을 특징으로 하는 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 단편.
또한, 본 명세서에 있어서 "~"의 부호는, 그 좌우의 값을 포함하는 수치 범위를 나타낸다.
본 발명에 의해, 신규한 암의 치료제 및 신규한 암의 치료법이 제공된다.
도 1은 사멸한 종양 세포로부터 방출되는 분자의 면역 세포에 미치는 영향의 검토. (a) SL4 세포의 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색 및 TUNEL 염색의 대표예를 나타낸다. 상부 도면의 테두리 내를 확대한 이미지를 하부 도면에 나타낸다. 화살표(arrowhead)는 괴사 병반을 나타낸다. 스케일 바는, 100μm. (b) PEC(2Х105 세포)를 SL4 세포(2Х106 세포)의 사세포 상청으로 2시간 자극한 후, 마이크로 어레이에 의해 PEC 내의 유전자 발현 변동을 해석하였다(n=2). 도면은, Volcano plot을 나타내고, 발현 변동하고 있는 유전자를 적색 또는 그린으로 나타냈다. (c) PEC(2Х105 세포)를 SL4 세포(2Х106 세포)의 사세포 상청으로 2시간 자극한 후, 발현한 Cxcl1 mRNA, Cxcl2 mRNA, Tnf mRNA 및 Il1b mRNA를 RT-qPCR로 정량한 결과이다(n=3). 데이터는 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 나타냈다.
도 2는 TCTP가 종양 증식에 미치는 영향의 검토(1). (a) PEC(2Х105 세포)를, 5 nM 또는 15 nM의 재조합 TCTP로 2시간 자극한 후, 발현한 Cxcl1 mRNA, Cxcl2 mRNA, Tnf mRNA 및 Il1b mRNA를 RT-qPCR로 정량한 결과를 나타낸다(n=3). (b) 종양을 갖지 않는 마우스(NTB; n=4) 및 SL4 세포 종양을 갖는 마우스(0일, n=4)의 혈청을 종양 이식 후 13일째(n=6) 및 21일째(n=7)에 회수하고, 혈청 중의 TCTP량을 면역블로팅으로 정량하였다. (c) TCTP WT SL4 세포(TCTP 발현 SL4 세포) 및 TCTP KO SL4 세포(TCTP 결손 SL4 세포)(각각, 2Х105 세포)를, 피하 주사에 의해 C57BL/6 마우스에 이식하였다(WT #1 및 KO #1; n=4, WT #2; n = 6, KO #2; n = 5). 그 후, 종양 체적을 시간에 따라 측정하였다. (d) TCTP WT B16F10 세포(TCTP 발현 B16F10 세포) 및 TCTP KO B16F10 세포(TCTP 결손 B16F10 세포)(각각, 1Х105 세포)를, 피하 주사에 의해 C57BL/6 마우스에 이식하였다(n=7). 그 후, 종양 체적을 시간에 따라 측정하였다. (e) TCTP WT Meth-A 유도 육종 세포(이하, Meth-A 세포) 및 TCTP KO Meth-A 세포(1Х105 세포)를, 피하 주사에 의해 C57BL/6 마우스에 이식하였다(n=7). 그 후, 종양 체적을 시간에 따라 측정하였다. (f) 타목시펜으로 처리한 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, villin-Cre ERT2 마우스(KO) 또는 처리하지 않은 마우스(WT)의 장상피세포 중의 TCTP 단백질 및 β-엑틴에 대하여 면역블로팅을 행하였다. (c) 내지 (e)에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 3은 TCTP가 종양 증식에 미치는 영향의 검토(2). (a) SL4 세포에 아포토시스(무혈청 및 아드리아마이신) 또는 괴사(동결 융해)를 유도하였다. 배양 상청을 회수하고, TCTP의 단백질의 양을 면역블로팅으로 측정하였다(n=3). (b) B16F10 종양(왼쪽) 또는 Meth-A 종양(우측)을 갖는 마우스 유래 혈청을, 종양 세포의 피하 이식 후, 0일(NTB; n=3) 및 21일(NTB; n=3)에 회수하고, TCTP의 단백질의 양을 면역블로팅으로 측정하였다. (c) 야생형(WT) 또는 TCTP 유전자 불활성형의 SL4 세포, B16F10 세포 및 Meth-A 세포 중에 있어서의 TCTP의 단백질 발현에 대하여 조사하였다. 각 세포주의 전체 세포 용해물을 준비하고, TCTP 및 β-엑틴에 대해서, 면역블로팅 해석을 행하였다. (d) 인비트로에서 증식시킨 TCTP WT SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포의 수의 경시 변화를 나타낸다(n=3). (e) TCTP WT SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를, 표준 상태(20%O2, 10% FBS), 저혈청 상태(0%O2, 1% FBS) 또는 저산소 상태(1%O2, 10% FBS)에서 배양하였다. 배양 후 72시간, 세포수를 카운트하였다. (f) TCTP WT SL4 세포, TCTP KO SL4 세포 및 TCTP cDNA를 도입한 TCTP KO SL4 세포(TCTP transduced)(각 2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스(n=5)에 피하 이식하고, 발생한 종양의 체적을 경시적으로 측정하였다. (g) 인비트로에서 증식시킨 TCTP WT Meth-A 세포 및 TCTP KO Meth-A 세포의 수의 경시적 변화를 나타낸다(n=3). (h) 인비트로에서 증식시킨 TCTP WT B16F10 세포 및 TCTP KO B16F10 세포의 수의 경시적 변화를 나타낸다(n=3). (b)에 대하여, *P<0.05, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). (f)에 대해서, Tukey의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(Repeated measures one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 4는 TCTP가 종양 증식에 미치는 영향의 검토(3), (a) 10주령의 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716 마우스(WT; n =6) 또는 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, villin-Cre ERT2 마우스(KO; n =5)에 발병한 장 폴립의 총 수, 1.0mm 미만의 직경의 장 폴립 수, 직경 1.0-2.0mm의 직경의 장 폴립 수, 2.0mm를 초과하는 직경의 장 폴립 수를 나타낸다. (b) 10주령의 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716 마우스(WT) 또는 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, villin-Cre ERT2 마우스(KO)에 발병한 장 폴립의 헤마톡실린/에오신 염색의 대표예를 나타낸다. 스케일 바는, 200μm. 화살표는 종양을 나타낸다. (c) TCTP WT 세포 또는 TCTP KO 세포에 치사량(100Gy)의 X선을 조사하고, TCTP WT(2Х105 세포)와 혼합하였다. 세포의 혼합물을 C57BL/6 마우스(n=6)의 피하에 이식하였다. 종양의 체적을 경시적으로 측정하였다. (a)에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). (C)에 대해서, Tukey의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(Repeated measures one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 5는 세포외 TCTP의 기능의 검토(1). (a) TCTP KO SL4 세포(Mock) 및 IL-2ss-TCTP SL4 세포(IL-2ss-TCTP)의 배양 상청을 회수하고, TCTP의 단백질량을 면역블로팅으로 측정하였다(n=3). (b) 배양 중인 TCTP KO SL4 세포, IL-2ss-TCTP SL4 세포 및 WT-TCTP SL4 세포의 수를 경시적으로 카운트하였다(n=4). (c) TCTP KO SL4 세포, IL-2ss-TCTP SL4 세포 또는 WT-TCTP SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하고(n=4), 경시적으로 종양 체적을 측정하였다. (d) WT-TCTP SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다(n=4). 이식 후 21일에 종양을 절제하고, 종양의 전체 용해물을 준비하였다. 준비된 용해물 중의, CXCL1(왼쪽, n=6) 및 CXCL2(우측, WT는 n=7, KO는 n=6)의 단백질량을 ELISA로 측정하였다. (e) TCTP KO SL4 세포(Mock) 또는 IL-2ss-TCTP SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 21일에 종양을 절제하고, 종양의 전체 용해물을 준비하였다. 준비된 용해물 중의, CXCL1(왼쪽, n=7) 및 CXCL2(우측, n=10)의 단백질량을 ELISA로 측정하였다. (c)에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, repeated measures one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test. (d) 및 (e)에 대해서, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). ND는, 미 검출인 것을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 6은 세포외 TCTP의 기능의 검토(2). (a) TCTP KO SL4 세포(좌측 도면), WT-TCTP 세포(WT TCTP의 cDNA를 발현하는 TCTP KO 세포; 중간 도면) 및 IL-2ss-TCTP SL4 세포(IL-2ss-TCTP의 cDNA를 발현하는 TCTP 분비형 세포; 우측 도면)의 TCTP 및 핵(DAPI)을 염색하였다. (b) PEC(2Х105 세포)를, TCTP KO SL4 세포의 배양 상청(Mock) 또는 IL-2SS-TCTP SL4 세포의 배양 상청(IL2ss-TCTP)에서 2시간 자극하였다. 그 후, 발현한 Cxcl1 및 Cxcl2 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다(n=3). (c) WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 21일에 종양을 절제하고, 종양의 전체 용해물을 준비하였다. 준비된 용해물 중의, G-CSF(왼쪽) 및 GM-CSF(우측)의 단백질량을 cytometric bead assay(CBA)을 사용하여 측정하였다. (d) TCTP WT B16F10 세포(WT) 또는 TCTP KO B16F10 세포(KO)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 17일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(n=4). CD45+ 세포 집단 중의 PMN-MDSC 또는 M-MDSC의 존재 비율을 %로 나타냈다. (e) TCTP WT Meth-A 세포(WT; n=3) 및 TCTP KO Meth-A 세포(KO; n=4)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 20일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다. CD45+ 세포 집단 중의 PMN-MDSC 또는 M-MDSC의 존재 비율을 %로 나타냈다. (f) TCTP KO SL4 세포를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 1, 4, 7, 10 및 13일에, SL4 종양을 갖는 마우스의 비장 및 골수 유래 다형핵 골수 유래 면역 억제 세포(이하, PMN-MDSC) 또는 PBS를 복강 내에 주입하였다. 종양 체적을 경시적으로 측정하였다. PBS; n=5, PMN-MDSC; n=4. (g) TCTP KO SL4 세포 및 IL-2ss-TCTP SL4 세포(2Х105 세포)를, 각각, C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 항Ly6G 항체 또는 컨트롤 IgG를 2일 간격으로 복강 내 투여하였다(n=5). (좌측 도면)종양 체적을 경시적으로 측정하였다. (우) CD45+ 세포 집단 중의 PMN-MDSC의 존재 비율을 %로 나타냈다. (h) TCTP WT SL4 세포(WT) 및 TCTP KO SL4 세포(KO)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다(n=3). 이식 후 18일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다. NK세포의 활성화 지표가 되는 마커(CD69, CD107a)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 결정하였다. (b 내지 f, h)에 대하여, *P<0.05, *P<0.01, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). (g)에 대해서, Tukey의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(Repeated measures one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 7은 TIME 중에 있어서의 TCTP의 면역 억제 기능의 검토. (a, b) WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 19일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(n=4). (a) (좌측 도면)대표적인 플롯을 나타낸다. (우측 도면)CD45+ 세포 집단 중의 PMN-MDSC(CD1lb+Ly6C+Ly6G+ 세포) 및 M-MDSC(CD1lb+Ly6ChighLy6G-세포)의 존재 비율을 %로 나타냈다. (b) CD45+ 세포 집단 중의 TAM(CD1lb+F4/80+ 세포) 및 DC(CD1lb-CD11c+ 세포)의 존재 비율을 %로 나타냈다. (c) TCTP KO SL4 세포 또는 IL-2ss-TCTP SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 19일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(n=4). (a) (좌측 도면)대표적인 플롯을 나타낸다. (우측 도면)CD45+ 세포 집단 중의 PMN-MDSC 및 M-MDSC의 존재 비율을 %로 나타냈다. (d) (좌측 도면)TCTPflox/flox, Apc+/Δ716 마우스(WT) 및 TCTPflox/flo, Apc+/Δ716, Villin-CreERT2 마우스(KO) 유래 대장암 조직의 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색 및 Ly6G 염색의 대표예를 나타낸다. 스케일 바는 100μm를 나타낸다. (우측 도면)WT 종양 조직 및 KO 종양 조직의 시야 중의 90,000μm2의 영역에 존재하는 Ly6G+ 세포수를 정량한 결과를 나타낸다(n=4). 파선으로 감싸지는 영역이 종양. (e) SL4 종양을 갖는 마우스의 비장으로부터 분리한 CD1lb+Ly6C+Ly6G+ 세포에 의한 T세포 증식의 억제 효과. 종양을 갖는 마우스(왼쪽) 또는 종양을 갖지 않는 마우스(우) 유래 CD1lb+Ly6C+Ly6G+ 세포의 존재하에서, 항CD3/CD28로 T세포를 자극하였다. 증식하는 T세포의 비율은, CFSE(카르복시플루오레세인디아세테이트숙신이미딜에스테르)의 희석에 의해 결정하였다(n=3). (a 내지 d)에 대하여, *P<0.05, *P<0.01, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 8은 T세포 및 NK세포의 세포수 및 그 항종양 활성에 대한 TCTP가 미치는 영향의 검토. (a) WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 19일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(WT는 n=7, KO는 n=6). CD45+ 세포 집단 중의 CD8+ T세포(CD3ε+NK1.1-CD8+ 세포) 및 NK세포(CD3ε-NK1.1+ 세포의 존재 비율을 %로 나타냈다. (b) TCTP KO 세포에 Mock-IRES-GFP 벡터(Mock) 또는 IL-2ss-TCTP-IRES-GFP 벡터(IL-2ss-TCTP)를 도입하였다. 그 후, GFP 양성 세포를 셀 소팅에 의해 분리하였다. Mock 또는 IL-2ss-TCTP 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 19일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(n=4). CD45+ 세포 집단 중의 CD8+ T세포(CD3ε+NK1.1-CD8+ 세포) 및 NK세포(CD3ε-NK1.1+ 세포의 존재 비율을 %로 나타냈다. (c 및 d) WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. (c) 항-아시알로(Asialo) GM1 항체(WT는 n=4, KO는 n=6) 또는 컨트롤 IgG(WT는 n=5, KO는 n=6)을, 이식전 1일, 이식 후 3일, 7일, 11일 및 15일에 복강 내에 투여하였다. (d) 항CD8α(n=5) 또는 컨트롤 IgG(n=6)을, 이식전 1일, 이식 후 2일, 5일, 8일 및 11일에 복강 내에 투여하였다. (e) WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 WT 마우스(WT는 n=5, KO는 n=6) 또는 RAG1 KO마우스(n=3)의 피하에 이식하였다. 항-아시알로 GM1 항체 또는 컨트롤 IgG를, 이식전 1일, 이식 후 3일, 7일 및 11일에 복강 내에 투여하였다. (a 내지 e)에 대하여, *P<0.05, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). 데이터는 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 9는 면역 체크포인트 분자의 발현 및 혈관 형성에 대한 TCTP의 영향의 검토. (a 및 b) WT SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후 21일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다. PD-L1(a) 및 PD-1(b)의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 결정하였다. (c) (좌측 도면)C57BL/6에 피하 이식한 TCTP WT SL4 종양 또는 TCTP KO SL4 종양의 CD31 염색 화상의 대표예를 나타낸다. 스케일 바는 100μm. (우측 도면)CD31포지티브 영역의 정량. NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. (c)에 대해서, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 10은 TCTP가 표적으로 하는 세포 및 TCTP 수용체의 동정(1). (a) SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스(n=3)의 피하에 이식하였다. 이식 후 21일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 각종 면역 세포(PMN-MDSC, M-MDSC, TAM, DC, T세포, B세포 및 NK세포)를 분리하고, 각 세포의 Cxcl1 mRNA를 qRT-PCR로 정량하였다. (b) TCTP WT SL4 세포(2Х105 세포) 및 TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스(n=3)의 피하에 이식하였다. 이식 후 21일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 그 후, M-MDSC를 분리하고, 각 세포의 Cxcl1 mRNA를 qRT-PCR로 정량하였다. (c) 각종 유전자형(WT(야생형), MyD88 KO(MyD88 결손형), IPS-I KO(IPS-I 결손형), STING KO(STING 결손형))의 마우스 유래 복강 삼출 세포(이하, PEC)를 재조합 TCTP로 자극하였다. Cxcl1 mRNA를 qRT-PCR로 정량하였다(n=3). (d) 각종 유전자형(WT, TLR2 KO(TLR2 결손형), TLR4 KO(TLR4 결손형))의 마우스 유래 PEC를 재조합 TCTP로 자극하였다. Cxcl1 mRNA를 qRT-PCR로 정량하였다(n=3). (b)에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). (a)에 대해서, Dunnett의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test). 데이터는 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 11은 TCTP가 표적으로 하는 세포 및 TCTP 수용체의 동정(2). (a) PEC(2Х105 세포) 또는 SL4 세포(1Х105 세포)를 재조합 TCTP로 2시간 자극하였다. 그 후, Cxcl1 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다(n=3). (b) TCTP WO SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포의 Cxcl1 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다. n=3. (c) SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다(n=3). 이식 후 21일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하였다. 그 후, 각종 면역 세포(PMN-MDSC, M-MDSC, TAM, DC, T세포, B세포 및 NK세포)를 분리하고, 각 세포의 Cxcl2 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다. (d) PEC(2Х105 세포)를 재조합 IL-1α로 2시간 자극하였다. 그 후, Cxcl1 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다(n=3). (e) TCTP와 TLR2의 결합에 관한 면역 침강 어세이. 일시적으로 TLR2-YFP 및 Flag-TCTP를 발현하는 HEK293T 세포를, 항GFP 항체로 면역 침강하고, 그 후, 항Flag 항체로 해석하였다(상부 도면), 전체 세포 용해물 중의 TLR2 및 TCTP를 검출하였다(하부 도면). (f) 다량체화한 NKκB 결합 모티프를 포함하는 루시페라아제리포터컨스트럭트 및 각종 단백질에 대한 발현 벡터를 HEK293T 세포에 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션 후 24시간에, HKE293T세포(2Х104 세포)를 96웰 플레이트에 시딩하고, 재조합 TCTP 또는 각 TLR에 대한 아고니스트(Pam3CSK4 300ng/ml, poly I: C 100μg/ml, poly U 10μg/ml, CpG-M 1μM)로 자극하였다. 자극 후 6시간에, 세포 용해물을 추출하고, 루시페라아제 어세이를 행하였다. (g 및 h) SL4 세포(g) 또는 IL-2ss-TCTP 세포(h)(2Х105 세포)를 WT 마우스(SL4는 n=7, IL-2ss-TCTP는 n=6) 또는 TLR2 KO마우스(SL4는 n=5, IL-2ss-TCTP는 n=6)의 피하에 이식하였다. 종양 체적을 경시적으로 측정하였다. (i) IL-2ss-TCTP SL4 세포(2Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하고, 그 후, 경시적으로 종양 체적을 측정하였다. 종양 이식 후, 2일 간격으로, O-vanillin(50mg/kg)을 경구 투여하였다. (b, f, g 내지 i) 에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). (c)에 대해서, Dunnett의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test). NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 12는 TCTP 중화 항체 및 TCTP 저해제의 종양 증식에의 영향의 검토(1). (a) TCTP WT SL4 세포(WT) 또는 TCTP KO SL4 세포(KO)의 전체 세포 용해물을 준비하고, 55F3E5(55F3)모노클로날 항체면역블로팅을 행한 결과를 나타낸다. (b) 55F3 항체 또는 컨트롤 IgG를 포함하는 SL4 세포의 사세포 상청으로 PEC(2Х105 세포)를 자극하였다. 2시간 자극 후, 발현한 Cxcl1 mRNA를 RT-qPCR로 정량하였다. n=3, Sup: 배양 상청. (c) TCTP WT SL4 세포 또는 TCTP KO SL4 세포(1Х510 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후, 매일, DHA(50mg/kg) 또는 DMSO를 복강 내에 투여하였다(n=6). (d) (좌측 도면)정상 대장 조직의 간질 영역 및 대장암 조직의 간질 영역에서의 TCTP의 발현량을 비교하였다. (우측 도면)정상 결장 음와와 종양 병소간의 비교를 행하였다. (e) TCGA 대장암 데이터 세트에 있어서의 CD8A, GZMB, PRF1 또는 CD69과 TCTP mRNA의 공발현 플롯(n=382). (f) TCGA 대장암 데이터 세트에 있어서의 세포 용해 활성(GZMA mRNA 및 PRF1 mRNA의 발현량의 기하 평균으로서 정의된다)과 TCTP mRNA의 공발현 플롯(n=382). Spearman r: 스피어만 순위 상관 계수(spearman correlation coefficients). *P<0.05, **P<0.01. (b)에 대해서, Dunnett의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test). (c)에 대해서, Tukey의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). (d)에 대해서, unpaire two-sided Student's t-test. NS는, 유의미한 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
도 13은 TCTP 중화 항체 및 TCTP 저해제의 종양 증식에의 영향의 검토(2). (a) SL4 세포(1Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. TCTP에 대한 모노클로날 항체(55F3)(n=5) 또는 컨트롤 IgG(n=6)을, 이식 후 1일로부터 2일마다 복강 내 투여하였다(200μg/마우스). 종양 체적을 경시적으로 측정하였다. (b) 이식 후 13일에, 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하고, 플로우사이토메트리 해석을 행하였다(n=5). 종축은, CD45+ 세포에 대한 PMN-MDSC의 존재 비율을 나타낸다. (c) SL4 세포(1Х105 세포)를 C57BL/6 마우스(n=6)의 피하에 이식하였다. DHA(50mg/kg)를, 이식 후, 매일 복강 내 투여하였다. 종양 체적을 경시적으로 측정하였다. (d) SL4 세포(1Х105 세포)를 C57BL/6 마우스(n=6)의 피하에 이식하였다. 55F3 항체 또는 컨트롤 IgG(각 200μg/마우스)를, 이식 후 1일로부터 매일 복강 내 투여하였다. 이식으로부터 10일후, 항PD-1모노클로날 항체(100μg) 또는 PBS를 투여하였다. 종양 체적을 경일적으로 측정하였다. (e) SL4 세포(1Х105 세포)를 C57BL/6 마우스의 피하에 이식하였다. 이식 후, DMSO, DHA, DHA와 항PD-1 항체(이상, 각 n=5) 또는 항PD-1 항체(n=6)를 투여하였다. DHA(50mg/kg) 또는 DMSO를, 이식 후, 매일 복강 내에 투여하였다. 이식 후 6일에, 항PD-1 항체(100μg) 또는 PBS를 투여하였다. (f) 건강한 사람(암에 이환되어 있지 않은 사람)(n=5) 및 대장암 환자(n=14) 유래 혈청 중에 있어서의 TCTP의 양을 면역블로팅으로 정량하였다. (g) (좌측 도면)인간 대장암 조직(CRC) 및 정상 대장 조직(Normal) 헤마톡실린 및 항TCTP 항체에 의해 염색상(染色像)의 대표예를 나타낸다. 스케일 바는 100μm. (우측 도면) 항TCTP 항체에 의한 상대적 염색 강도를 반정량하고, 대장암 조직과 정상 대장 조직의 염색 강도를 비교하였다(n=45). (h) T1/2(n=9) 및 T3/4(n=35)대장암 조직 중의 TCTP의 발현량을 비교하였다. (i) 인간 대장암 조직을 항CD15 항체 및 항TCTP 항체로 염색하였다. 시야 중의 40,000μm2의 영역 중에 존재하는 CD15+ 세포의 수를 카운트하고, 항TCTP 항체에 의한 상대적 염색 강도를 반정량하였다(n=27). CD15와 TCTP의 공발현 플롯이다. 스피어만 상관계수를 나타낸다. (j) TCGA 데이터베이스로부터 얻은 CRC 환자(n=376)의 DNA 카피수로 계층화한 TCTP의 FPKM(Fragments Per Kilobasse of transcript per Million mapped reads)을 나타낸다. Deep(n=4) 또는 shallow(n=14)의 환자는, 각각, TCTP 유전자의 2 또는 1개의 대립유전자가 결실되어 있다. gain(n=220) 또는 amplification(n=16)의 환자는, 각각, TCTP 유전자의 1개 또는 1개보다 많은 대립유전자를 획득하고 있다. Diploid, n=122. (k) TCTP 대립유전자가 증폭되어 있는 환자(n=19) 또는 증폭되어 있지 않은 환자(n=520)의 결장암 환자의 생존을 나타내는 TCGA 데이터의 Kaplan-Meier 그래프. (l) 본 발명의 정리도. (a 내지 c, f, h)에 대하여, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001, 독립표본 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-sided Student's t-test). Log-rank test(g). (d, e)에 대해서, Dunnett의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test). (j)에 대해서, Tukey의 다중 비교 분석 방법을 이용한 일원배치 분산분석(repeated measures one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). (g)에 대해서, 대응표본 양측 t-검정(paired two-sided t-test). 데이터는 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명한다.
본 발명의 제1 실시 형태는, 종양사세포로부터 방출되는 면역 조절 인자의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 유효 성분으로서 포함하는, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME)에의 골수 유래 면역 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC)의 축적 저해제(이하, "본 실시 형태에 따른 저해제"라고도 기재한다)이다.
여기서, 암 면역 미세 환경(이하, "TIME"라고도 기재한다)이라 함은, 암 내부에 있어서의, 암 세포와, 면역 세포를 중심으로 한 비(非)암 세포의 상호 작용 장소를 가리키고, 고도의 면역 억제를 비롯한 암의 생존에 유리한 환경을 구비한 암 내부의 미세 환경으로 정의된다(비특허문헌 1). 골수 유래 면역 억제 세포("MDSC"라고도 기재한다)라 함은, 감염증이나 암 등의 만성 염증에 있어서 출현하는, 미숙한 마이엘로이드계 세포이며, 강력한 면역 억제 활성을 갖는다. 단핵구성 골수 유래 면역 억제 세포("M-MDSC"라고도 기재한다) 및 다형핵 골수 유래 면역 억제 세포("PMN-MDSC"라고도 기재한다)가 주요 아집단을 이루고, 각각 단핵구 및 호중구와 형태 및 세포 표면 마커가 유사하다(비특허문헌 3). TIME에의 MDSC의 축적이라 함은, TIME 내 또는 TIME 부근에 PMN-MDSC 등의 MDSC가 국소적으로 존재하는 것을 의미한다.
여기서, 면역 조절 인자라 함은, 면역 응답을 촉진 또는 억제하고, 면역계의 기능에 영향을 주는 인자를 말한다.
본 발명자들은, 종양사세포로부터 방출되는 분자인 TCTP(translationally controlled tumor protein)가, TIME 중의 혈액계 세포에 작용하면, 그들 세포 중에서도 특히 M-MDSC로부터 CXCL1 및 CXCL2 등의 사이토카인이 현저하게 방출되는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, CXCL1 및 CXCL2는 PMN-MDSC 상의 CXCR2 수용체를 통하여, PMN-MDSC를 암 면역 미세 환경 내 또는 부근에 유도하는 것도 발견하였다. 암 미세 면역 환경 내 또는 부근에 유도된 PMN-MDSC는, T세포나 NK세포 등의 면역 세포에 의한 암 세포의 공격을 억제하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 이상의 TCTP-(M-MDSC)-CXCL1/2-(PMN-MDSC) 경로에 의해, PMN-MDSC가 TIME에 축적됨으로써 면역 세포에 의한 항종양 활성이 억제되고, 종양의 증식이 촉진되는 결과가 되는 것이 이번의 해석에 의해 새롭게 판명되었다. 따라서 TIME에의 MDSC(예를 들어, PMN-MDSC)의 축적을 저해하면, T세포나 NK세포 등의 축적이나 활성화를 촉구하여, 결과적으로는 종양의 증식을 저해 또는 억제할 수 있다.
TIME에의 PMN-MDSC 축적을 저해하기 위하여, 예를 들어 TCTP-(M-MDSC)-CXCL1/2-(PMN-MDSC) 경로를 차단하는 것을 생각할 수 있다. 이 경로를 차단하는 방법으로서, 예를 들어 TCTP(인간 TCTP에 관한 것으로, NCBI 등록번호; cDNA 서열: CCDS9397.1, 및 아미노산 서열: NP_003286.1)의 기능을 억제 또는 저해하는 물질의 사용 등을 들 수 있다. 여기서, TCTP의 기능으로서, 예를 들어 TCTP가 그 수용체(예를 들어, TLR2)과 결합하고, 세포(예를 들어, M-MDSC 등)로부터의 사이토카인(예를 들어, CXCL1/2)의 방출을 유도하는 기능 등을 들 수 있다.
TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질로서, 특별히 한정은 하지 않으나, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체, 펩타이드 압타머 등, 혹은 TCTP를 분해하는 혹은 분해를 유도하는 물질, 예를 들어 디하이드로아르테미시닌(dihydroartemisinin: DHA)이나 설트랄린(Sertraline) 등, TCTP의 발현을 억제 혹은 저해하는 물질, 예를 들어 siRNA, miRNA 등이 있다. 또한, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질로서, TCTP와 그 수용체(TLR2)와의 결합을 저해하는 물질, 예를 들어 TLR2 안타고니스트 등도 포함된다. 당해 저해 물질은, TCTP 또는 수용체(TLR2)와 상호 작용하거나, 혹은, 어느 하나를 분해 등 하는 물질이어도 좋다.
본 실시 형태에 따른 저해제는, 상기 TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 포함하는 것이어도 좋다.
본 발명의 제2 실시 형태는, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체(이하, "본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체"라고도 기재한다)이다.
본 명세서에 있어서의 "항체"는, 그 제조 방법 및 그 구조는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 나노 항체 등, 원하는 항원과 원하는 특성으로 결합하는 "항체" 모두가 포함된다.
본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체가 폴리클로날 항체의 경우, 예를 들어 면역 동물(한정은 하지 않으나, 예를 들어 토끼, 염소, 양, 닭, 모르모트, 마우스, 래트 또는 돼지 등)에 대하여, 항원 및 애주번트의 혼합물을 주입함으로써 제조할 수 있다. 통상은, 항원 및/또는 애주번트를 면역 동물의 피하 또는 복강 내에 복수회 주입한다. 애주번트로서, 한정은 하지 않으나, 예를 들어 완전 프로인트 및 모노 포스포릴 지질A 합성-트레할로스디코리노미콜레이트(MPL-TMD)가 포함된다. 항원의 면역 후, 면역 동물 유래 혈청으로부터, 통상적인 방법에 의해(예를 들어, Protein A를 보유지지한 세파로즈 등을 사용하는 방법 등) 항TCTP 항체를 정제할 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체가 모노클로날 항체의 경우, 예를 들어 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 "모노클로날"이라 함은, 실질적으로 균일한 항체의 집단(항체를 구성하는 중쇄, 경쇄의 아미노산 서열이 동일한 항체 집단)으로부터 얻어진 항체의 특성을 시사하는 것으로서, 항체가 특정한 방법(예를 들어, 하이브리도마법 등)에 의해 제작되는 것으로 한정적으로 해석되는 것이 아니다.
모노클로날 항체의 제작 방법으로서는, 예를 들어, 하이브리도마법(Kohler 및 Milstein, Nature 256495-4971975) 또는, 재조합법(미국 특허 제 4,816,567호) 등을 들 수 있다. 혹은, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체는, 파지 항체 라이브러리(예를 들어, Clackson등, Nature 352624-6281991; Marks등, J. Mol. Biol. 222581-5971991 등) 등으로부터 단리해도 좋다. 보다 구체적으로 설명하면 하이브리도마법을 사용하여 제조하는 경우, 그 제조 방법에는, 예를 들어 이하에 나타내는 4가지 공정이 포함된다: (i) 항원으로 면역 동물을 면역화하고, (ii) 모노클로날 항체 분비성(또는 잠재적으로 분비성)의 림프구를 회수하고, (iii) 림프구를 불사화 세포에 융합시키고, (iv) 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 세포를 선택한다. 면역 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 등이 선택 가능하다. 면역 후, 숙주 동물로부터 얻어진 림프구는 하이브리도마 세포를 수립하기 위해서, 폴리에틸렌글리콜 등의 융합제나 전기 융합법을 사용하여 불사화 세포주와 융합한다. 융합 세포로서는, 예를 들어 래트 혹은 마우스의 미엘로마 세포주가 사용된다. 세포융합을 행한 후, 융합하지 않은 림프구 및 불사화 세포주의 성장 또는 생존을 저해하는 기질을 포함하는 적절한 배지 중에 세포를 생장시킨다. 통상의 기술에서는, 효소의 하이포잔틴-구아닌포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)이 결여된 모세포를 사용한다. 이 경우, 아미노프테린이 HGPRT 결손 세포의 성장을 저해하고, 하이브리도마의 성장을 허용하는 배지(HAT 배지)에 첨가된다. 이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마로부터, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하고, 선택한 하이브리도마가 생장하는 배지로부터, 통상적인 방법에 따라, 원하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
이와 같이 하여 제조한 하이브리도마를 인비트로 배양하고, 혹은, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 등의 복수 중에서 인비보 배양하고, 원하는 항체를 배양 상청, 혹은, 복수로부터 제조할 수 있다.
나노 항체라 함은, 항체 중쇄의 가변 영역(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody ; VHH)으로 이루어지는 폴리펩타이드이다. 통상 인간 등의 항체는 중쇄와 경쇄로 구성되어 있지만, 라마, 알파카 및 낙타 등의 낙타과의 동물에서는, 중쇄만으로 이루어지는 단일쇄 항체(중쇄 항체)를 생산한다. 중쇄 항체는, 통상의 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체와 마찬가지로, 표적 항원을 인식하고, 항원에 결합할 수 있다. 중쇄 항체의 가변 영역은, 항원에의 결합 친화성을 갖는 최소 단위이며, 이 가변 영역 단편은 "나노 항체"라고 부르고 있다. 나노 항체는, 고내열성, 소화 내성, 상온 안정성이 있고, 유전자 공학적 방법에 의해 용이하게 대량으로 제조하는 것이 가능하다.
나노 항체는, 예를 들어 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 낙타과의 동물에 항원을 면역하고, 채취한 혈청으로부터 원하는 항체의 유무를 검출하고, 원하는 항체가가 검출된 면역 동물의 말초혈 림프구 유래 RNA로부터 cDNA를 제작한다. 얻어진 cDNA로부터 VHH를 코딩하는 DNA 단편을 증폭하고, 이것을, 파지미드에 삽입하여, VHH 파지미드 라이브러리를 준비한다. 제작한 VHH 파지미드 라이브러리로부터 수회의 스크리닝을 거져 원하는 나노 항체를 제작할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체는, 유전자 재조합 항체이어도 좋다. 유전자 재조합 항체로서는, 한정은 되지 않으나, 예를 들어 인간화 항체 및 인간 항체와의 키메라 항체 등을 들 수 있다. 키메라 항체라 함은, 예를 들어 다른 동물종 유래 가변 영역과 정상 영역을 연결한 항체(예를 들어, 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래 정상 영역에 결합시킨 항체) 등을 말하는 것으로(예를 들어, Morrison등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 6851-68551984. 등), 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다.
인간화 항체는, 프레임워크 영역(FR)에 인간 유래 서열을 갖고, 상호보완성 결정 영역(CDR)이 다른 동물종(예를 들어, 마우스 등) 유래 서열로 이루어지는 항체이다. 인간화 항체는, 먼저, 다른 동물종, 여기에서는 마우스로 설명하지만, 마우스 유래 항체 가변 영역으로부터 그 CDR을 인간 항체 가변 영역에 이식하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 재구성한 후, 이들 인간화된 재구성 인간 항체 가변 영역을 인간 항체 정상 영역에 연결함으로써 제작할 수 있다. 이러한 인간화 항체의 제작법은, 당분야에 있어서 주지의 방법이다(예를 들어, Queen등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-100331989. 등).
본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체의 항원 결합 단편이라 함은, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체의 일부분의 영역이며, TCTP에 결합하는 항체 단편을 가리키는 것으로, 단편으로서는, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv(variable fragment of antibody), 단일쇄 항체(중쇄, 경쇄, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 나노 항체 등), scFv(single chain Fv), diabody(scFv 이량체), dsFv(disulfide-stabilized Fv), 및, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체의 CDR을 적어도 일부에 포함하는 펩타이드 등을 들 수 있다.
Fab는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, 중쇄의 N 말단측 약 절반과 경쇄 전체가 디설파이드 결합으로 결합한, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab의 제작은, 항체 분자를 파파인으로 처리하여 단편을 취득하는 외에, 예를 들어 Fab를 코딩하는 DNA를 삽입한 적당한 발현 벡터를 구축하고, 이것을 적당한 숙주 세포(예를 들어, CHO세포 등의 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입 후, 세포 내에서 Fab를 발현시킴으로써 실시할 수 있다.
F(ab')2은, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab가 힌지 영역의 디설파이드 결합을 통하여 결합된 것보다 약간 큰, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. F(ab')2은, 항체 분자를 펩신으로 처리하여 단편을 취득하는 것 외에, Fab를 티오에테르 결합 혹은 디설파이드 결합시켜서 제작하는 것도 가능하며, 또한, Fab와 마찬가지로 유전자 공학적 방법에 의해서도 제작할 수 있다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단한, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'도, Fab 등과 마찬가지로 유전자 공학적인 방법에 의해 제작할 수 있다.
scFv는, 하나의 중쇄 가변 영역(VH)과 하나의 경쇄 가변 영역(VL)을 적당한 펩타이드 링커를 사용하여 연결한, VH-링커-VL 내지는 VL-링커-VH 폴리펩타이드이며, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv는, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 유전자 공학적 방법에 의해 제작할 수 있다.
디아바디(diabody)는, scFv가 이량체화한 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은, 동일 항원 결합 활성이어도 좋고 또는, 한쪽이 다른 항원 결합 활성이어도 좋다. 디아바디는, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 펩타이드 링커로 결합한 scFv를 코딩하는 cDNA를 구축하고, 유전자 공학적 방법에 의해 제작할 수 있다.
dsFv는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역중 각각 1개의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩타이드를, 해당 시스테인 잔기간 디설파이드 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv는, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 취득하고, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하여 유전자 공학적 방법에 의해 제작할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩타이드는, 중쇄 또는 경쇄의 CDR(CDR1 내지 3)의 적어도 1 영역 이상을 포함하도록 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩타이드는, 직접 또는 적당한 펩타이드 링커를 통하여 결합시킬 수 있다. CDR을 포함하는 펩타이드는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 발현 벡터에 삽입한다. 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 그 후에 도입되는 숙주 세포의 종류 등에 의해 적절히 선택하면 된다. 이들을 항체로서 발현시키기 위하여 적당한 숙주 세포(예를 들어, CHO세포 등의 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하여 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩타이드는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시 카르보닐법) 및 tBoc법(t-부틸옥시 카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
인간 항체(완전 인간 항체)는, 일반적으로 V 영역의 항원 결합 부위인 초가변 영역(Hypervariable region), V 영역의 기타 부분 및 정상 영역의 구조가, 인간의 항체와 동일한 구조를 갖는 것이다. 인간 항체는, 공지의 기술에 의해 당업자라면 용이하게 제작할 수 있다. 인간 항체는, 예를 들어 인간 항체의 H쇄 및 L쇄의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생산 마우스를 사용한 방법(예를 들어, Tomizuka등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-7272000. 등)이나, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래 인간 항체를 취득하는 방법(예를 들어, Siriwardena등, Opthalmology, 109, 427-4312002. 등을 참조)에 의해 취득할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체의 항원 결합 단편을 사용하여, 다중 특이성 항체를 구성할 수 있다. 다중 특이성이라 함은, 2개 이상의 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 것을 의미하고, 예를 들어 2개 이상의 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 단백질의 형태를 들 수 있다. 이것은 기지의 기술에 의해 당업자에 의해 실시된다. 다중 특이성을 구축하는 방법으로서는, 상이한 2종류의 항체 중쇄 분자가 헤테로 이량체를 형성하도록 단백 공학적 조작을 실시한 비대칭 IgG의 구축 기술, 항체로부터 얻은 저분자량의 항원 결합 단편끼리를 연결하는 또는 별도의 항체 분자와 연결하는 기술, 등으로 분류되는 방법이 복수 개발되어 있다. 구체적인 구축법의 예는, 예를 들어 이하의 문헌을 참고로 할 수 있다. Kontermann등, Drug Discovery Today, 20, 838-8472015.
본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체 및 그 항원 결합 단편으로서, 예를 들어 CDR(complementarity determining region) 1 내지 3의 아미노산 서열이 다음의 (A), (B) 또는 (C) 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 항체 및 그 항원 결합 단편을 들 수 있다.
(A) 55F3 항체의 CDR
중쇄 CDR1 아미노산 서열이, GYSIASDYAWN(서열 번호 1),
중쇄 CDR2 아미노산 서열이, YINYSGSTGYNPSLKS(서열 번호 2),
중쇄 CDR3 아미노산 서열이, FEAGY(서열 번호 3),
경쇄 CDR1 아미노산 서열이, KASQDINRYLS(서열 번호 4)
경쇄 CDR2 아미노산 서열이, RANRLVD(서열 번호 5) 및
경쇄 CDR3 아미노산 서열이, LQYNEFPLT(서열 번호 6)을 갖는다.
(B) 44E1 항체의 CDR
중쇄 CDR1 아미노산 서열이, GYTFTDHAIH(서열 번호 7),
중쇄 CDR2 아미노산 서열이, YISPGNGDLKYNEKFKG(서열 번호 8),
중쇄 CDR3 아미노산 서열이, GWTL(서열 번호 9),
경쇄 CDR1 아미노산 서열이, KSSQSLLYRSNQKNYLV(서열 번호 10)
경쇄 CDR2 아미노산 서열이, WAFTRES(서열 번호 11) 및
경쇄 CDR3 아미노산 서열이, QQHYSYPWT(서열 번호 12)을 갖는다.
(C) 51A 9 항체의 CDR
중쇄 CDR1 아미노산 서열이, GYSITSDYAWN(서열 번호 13),
중쇄 CDR2 아미노산 서열이, YINYSGSTGYNPSLKS(서열 번호 14),
중쇄 CDR3 아미노산 서열이, FEAGY(서열 번호 15),
경쇄 CDR1 아미노산 서열이, KASQDINSYLS(서열 번호 16)
경쇄 CDR2 아미노산 서열이, RANRLVD(서열 번호 17) 및
경쇄 CDR3 아미노산 서열이, LQYYEFPLT(서열 번호 18)을 갖는다.
또한, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체 및 그 항원 결합 단편으로서, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함하는 항체, 및 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 포함하는 항체 및 그들 항원 결합 단편, 및 이들 항체를 구성하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 각 아미노산 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80 % 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 항체이며, TCTP와 그 수용체의 결합을 저해하는 항체 및 그들의 항원 결합 단편을 포함한다.
55F3 항체의 중쇄 가변 영역
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTATGYSIASDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARFEAGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVT(서열 번호 19)
44E1 항체의 중쇄 가변 영역
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLQQSDAELVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWAKQKPEQGLEWIGYISPGNGDLKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKSGWTLWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVT(서열 번호 20)
51A9 항체의 중쇄 가변 영역
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTATGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISITRDTSKNKFFLQLNSVTTEDTATYYCARFEAGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVT(서열 번호 21)
55F3 항체의 경쇄 가변 영역
MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKCDIKMTQSPSSMSASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYGDMGIYYCLQYNEFPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLN(서열 번호 22)
44E1 항체의 경쇄 가변 영역
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSPVVSVGEKVTMSCKSSQSLLYRSNQKNYLVWYQLKPGQSPKLLIYWAFTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQHYSYPWTFGGGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLN(서열 번호 23)
51A9 항체의 경쇄 가변 영역
MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKCDIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCLQYYEFPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLN(서열 번호 24)
또한, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체에는, CDR(complementarity determining region) 1 내지 3의 아미노산 서열이 상기 (A), (B) 혹은 (C) 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 항체와 TCTP의 결합을 경합 저해하고, 또한, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체(이하, "본 실시 형태에 따른 경합 항체"라고도 기재한다)도 포함된다. 본 실시 형태에 따른 경합 항체는, 당업자에 있어서 주지의 경합 실험 등에 의해, 제조 및 취득할 수 있다. 구체적으로는, 제1 항TCTP 항체(본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체)와 TCTP의 결합이, 제2 항TCTP 항체에 의해 경합 저해를 받을 때, 제1 항TCTP 항체와 제2 항TCTP 항체는 실질적으로 동일 또는 극히 근방의 항원 부위에 결합하고 있는 것으로 판단된다. 당해 제2 항TCTP 항체가 TCTP의 기능을 억제 또는 저해할 경우에는, 당해 제2 항TCTP 항체는 본 실시 형태에 따른 경합 항체이며, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체에 포함된다. 또한, 상기 경합 실험 방법으로서, 예를 들어 Fab 단편 등을 사용하는 방법이 당해 기술 분야에 있어서, 통상 행해지고 있다. 예를 들어, WO95/11317, WO94/07922, WO2003/064473, WO2008/118356 및 WO2004/046733 등을 참조. 또한, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는지 여부는, 실시예에 개시되는 방법에 의해 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 따른 항TCTP 항체에는, TCTP의 부분 펩타이드인 EDGVTPYMIFFKDGLEMEKC(서열 번호 25)에 결합하고, 또한, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체도 포함된다.
본 발명의 제3 실시 형태는, 암의 치료제 또는 치료용 조성물이며, 본 발명의 저해제를 유효 성분으로서 포함하는, 상기 치료제 또는 치료용 조성물(이하, "치료제 등"이라고 기재한다)(본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등)이다.
본 발명의 실시 형태에 따른 암의 치료제로서, 유효 성분(예를 들어, TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질 등) 자체를 투여해도 좋지만, 일반적으로는, 유효 성분인 하나 또는 복수의 물질 외에, 1 또는 2 이상의 제제용 첨가물을 포함하는 치료 조성물의 형태로 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 치료제 등의 유효 성분으로서는, 상이한 복수의 본 발명의 저해제를 포함해도 좋다. 또한, 본 발명의 치료제 등에는, 다른 항암제나 면역 체크포인트 저해제 등의 기지의 성분이 배합되어 있어도 좋다.
본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등의 제형으로서는, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제, 현탁제, 좌제, 연고, 크림제, 겔제, 점착제, 흡입제, 주사제 등을 들 수 있다. 이 제제는 통상법에 따라 제조된다. 또한, 액체 제제에 있어서는, 사용시 물 또는 다른 적당한 용매에 용해 또는 현탁하는 것이어도 좋다. 또한, 정제, 과립제는 주지의 방법으로 코팅해도 좋다. 주사제의 경우에는, 유효 성분을 물에 용해시켜서 제조지만, 필요에 따라 생리 식염수 혹은 포도당 용액에 용해시켜도 좋고, 또한, 완충제나 보존제를 첨가해도 좋다.
경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제는, 임의의 제제 형태로 제공된다. 제제 형태로서는, 예를 들어 과립제, 세립제, 산제, 경캡슐제, 연캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제 혹은 액제 등의 형태의 경구 투여용 치료제 또는 치료용 조성물, 정맥 내 투여용, 근육 내 투여용 혹은 피하 투여용 등의 주사제, 점적제, 경피 흡수제, 경점막 흡수제, 점비제, 흡입제, 좌제 등의 형태의 비경구 투여용 치료제 또는 치료용 조성물로서 제조할 수 있다. 주사제나 점적제 등은, 동결 건조 형태 등의 분말 상태의 제형으로서 제조하고, 용시에 생리 식염수 등의 적절한 수성 매체에 용해하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등의 제조에 사용되는 제제용 첨가물의 종류, 유효 성분에 대한 제제용 첨가물의 비율, 혹은, 의약 또는 의약 조성물의 제조 방법은, 그 형태에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 제제용 첨가물로서는 무기 또는 유기물질, 혹은, 고체 또는 액체의 물질을 사용할 수 있고, 일반적으로는, 유효 성분 중량에 대하여 1중량% ~ 90중량% 사이에서 배합할 수 있다. 구체적으로는, 제제용 첨가물의 예로서 유당, 포도당, 만니톨, 덱스트린, 시클로덱스트린, 전분, 자당, 메타 규산 알루민산 마그네슘, 합성 규산알루미늄, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 히드록시프로필 전분, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 이온 교환 수지, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아라비아 고무, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 경질 무수 규산, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 트라간트, 벤토나이트, 비검, 산화티타늄, 소르비탄 지방산 에스테르, 라우릴 황산나트륨, 글리세린, 지방산 글리세린 에스테르, 정제 라놀린, 글리세로 젤라틴, 폴리소르베이트, 마크로골, 식물성 기름, 왁스, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 플루오로카본, 비이온성 계면 활성제, 프로필렌글리콜, 물 등을 들 수 있다.
경구 투여용 고형제제를 제조하기 위해서는, 유효 성분과 부형제 성분, 예를 들어 유당, 전분, 결정 셀룰로오스, 락트산 칼슘, 무수 규산 등과 혼합하여 산제로 하거나, 필요에 따라 백당, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘 등의 붕괴제 등을 더 첨가하여 습식 또는 건식 조립하여 과립제로 한다. 정제를 제조하기 위해서는, 이 산제 및 과립제를 그대로, 혹은, 스테아르산 마그네슘, 탈크 등의 활택제를 첨가하여 정제로 제조하면 된다. 이 과립 또는 정제는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 메타크릴산-메타크릴산 메틸 중합체 등의 장용제 기제로 피복하여 장용제 제제, 혹은, 에틸셀룰로오스, 카르나우바 왁스, 경화유 등으로 피복하여 지속성 제제로 할 수도 있다. 또한, 캡슐제를 제조하기 위해서는, 산제 또는 과립제를 경캡슐에 충전하거나, 유효 성분을 그대로, 혹은, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 참기름, 올리브유 등에 용해한 후 젤라틴 막으로 피복하여 연캡슐로 할 수 있다.
주사제를 제조하기 위해서는, 유효 성분을 필요에 따라 염산, 수산화나트륨, 유당, 락트산, 나트륨, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨 등의 pH 조정제, 염화나트륨, 포도당 등의 등장화제와 함께 주사용 증류수에 용해하고, 무균 여과하여 앰플에 충전하거나, 만니톨, 덱스트린, 시클로덱스트린, 젤라틴 등을 더 첨가하여 진공 동결 건조하고, 사용시 용해형 주사제로 해도 좋다. 또한, 유효 성분에 레티신, 폴리소르베이트80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등을 첨가하여 수중에서 유화시켜 주사제용 유제로 할 수도 있다.
직장 투여제를 제조하기 위해서는, 유효 성분을 카카오 버터, 지방산의 트리, 디 및 모노글리세라이드, 폴리에틸렌글리콜 등의 좌제용 기재와 함께 가습하여 용해하고 형에 흘려넣어 냉각하거나, 유효 성분을 폴리에틸렌글리콜, 대두유 등에 용해한 후, 젤라틴 막으로 피복하면 된다.
본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등의 투여량 및 투여 횟수는 특별히 한정되지 않고, 치료 대상 질환의 악화·진전의 방지 및/또는 치료의 목적, 질환의 종류, 환자의 체중이나 연령 등의 조건에 따라, 의사의 판단에 따라 적절히 선택하는 것이 가능하다.
일반적으로는, 경구 투여에 있어서의 성인 1일당 투여량은 0.01 내지 1000mg(유효 성분 중량) 정도이고, 1일 1회 또는 수회로 나누어, 혹은, 수일마다 투여할 수 있다. 주사제로서 사용하는 경우에는, 성인에 대하여 1일의 양 0.001 내지 100mg(유효 성분 중량)을 연속 투여 또는 간헐 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등은, 임플란트 및 마이크로 캡슐에 봉입된 송달 시스템 등의 서방성 제재로서, 체내로부터 즉시 제거되는 것을 방지할 수 있는 담체를 사용하여 제조해도 좋다. 그러한 담체로서, 에틸렌 비닐 아세트산염, 폴리산무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산 등의 생물 분해성, 생물 적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 재료는, 당업자에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 리포솜의 현탁액도 약학상 허용되는 담체로서 사용할 수 있다. 리포솜은, 한정은 하지 않으나, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG 유도 포스파티딜 에탄올(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로서, 사용하기 적합한 사이즈가 되도록, 적당한 포어 사이즈의 필터를 통하여 제조되고, 역상증발법에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등은, 투여방법 등의 설명서와 함께 키트의 형태로 제공해도 좋다. 키트 중에 포함되는 약제는, 당해 치료제 등의 구성 성분의 활성을 장기간 유효하게 지속하고, 용기 내측에 흡착되지 않으며, 또한, 구성 성분을 변질시키지 않는 재질로 제조된 용기에 의해 공급된다. 예를 들어, 봉착된 유리 앰플은, 질소 가스와 같은 중성이고 비반응성을 나타내는 가스의 존재 하에서 봉입된 버퍼 등을 포함해도 좋다.
또한, 키트에는 사용설명서가 첨부되어도 좋다. 당해 키트의 사용 설명은, 종이 등에 인쇄된 것이어도 좋고, CD-ROM, DVD-ROM 등의 전자적으로 판독 가능한 매체에 저장되어 사용자에 공급되어도 좋다.
본 발명의 제3 실시 형태는, 본 발명의 실시 형태에 따른 치료제 등(본 발명의 제2 실시 형태)을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법이다.
여기서 "치료"라 함은, 암에 걸린 포유 동물에 있어서 야기되는 병의 용태의 진행 및 악화를 저지 또는 완화하는 것을 의미한다. 또한, "예방"이라 함은, 암이 발병될 우려가 있는 포유 동물 환자에 있어서, 그 발병을 미리 저지하는 것을 의미한다. 예방 또는 치료의 대상이 되는 "포유 동물"은, 포유류로 분류되는 임의의 동물을 의미하고, 특별히 한정은 하지 않으나, 예를 들어 인간 외에, 개, 고양이, 토끼, 페럿 등의 애완 동물, 소, 돼지, 양, 말 등의 가축 동물 등이다. 특히 바람직한 "포유 동물"은, 인간이다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법의 대상이 되는 암(악성 종양/악성 신생물)로서는, 예를 들어 간세포암, 담관세포암, 신장세포암, 편평상피암, 기저세포암, 이행세포암, 선암, 악성 가스트리노마, 악성 흑색종, 섬유 육종, 점액육종, 지방육종, 평활근육종, 횡문근육종, 악성기형종, 혈관육종, 카포시육종, 골육종, 연골육종, 림프관육종, 악성수막종, 비호지킨림프종, 호지킨림프종, 백혈병, 뇌종양, 표피세포 유래 신생물(상피암종), 기저세포암종, 선암종, 입술암, 구강암, 식도암, 소장암 및 위암과 같은 위장암, 결장암, 직장암, 간암, 방광암, 췌장암, 난소암, 자궁목암, 폐암, 유방암, 편평표피세포암 및 기저세포암과 같은 피부암, 전립선암 및 신장세포암종 등이 포함되고, 또한, 전신의 상피, 간엽 또는 혈액 세포를 침범하는 다른 기지의 암도 포함된다.
본 발명의 제4 실시 형태는, 암의 진단 방법 또는 진단 보조 방법이며, 피험자 유래 샘플 중에 존재하는 TCTP mRNA 또는 TCTP 단백질의 양을 측정하는 것을 포함하는, 상기 진단 방법 또는 진단 보조 방법이다.
암이 발병되어 있는 피험자에 있어서는, 종양 조직이나 혈액 중에 있어서, TCTP 단백질 또는 TCTP mRNA의 양이 건강한 사람(암이 발병되어 있지 않은 것이 확인되어 있는 사람)보다도 유의미하게 증대하고 있다(예를 들어, 도 2b 등을 참조). 따라서, 피험자 유래 샘플 중에 있어서, TCTP mRNA의 양 또는 TCTP 단백질의 양이 건강한 사람의 샘플과 비교하여 유의미하게 높은 경우에, 당해 피험자에게 무엇인가 암이 발병되어 있을 가능성이 있다고 하는 판단을 할 수 있다.
본 실시 형태에 있어서, 피험자 유래 샘플로서, 한정은 하지 않으나, 예를 들어 혈액(혈청 등, 혈액 유래 성분도 포함한다), 악성 종양이 의심되는 조직 등을 사용할 수 있다. 샘플 중의 TCTP 단백질의 양을 측정하는 방법으로서, 당업자라면 적절한 방법을 용이하게 선택하는 것이 가능하고, 예를 들어 ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay)법이나 웨스턴 블로팅법 등의 면역학적 측정법을 사용할 수 있다. 또한, 샘플 중의 TCTP mRMA의 양을 측정하는 방법으로서, 당업자라면 적절한 방법을 용이하게 선택하는 것이 가능하고, 예를 들어 실시간 PCR(RT-qPCR)법 등을 들 수 있다.
본 명세서가 영어로 번역되어, 단수형의 "a", "an" 및 "the"의 단어가 포함되는 경우, 문맥상 명백하게 그렇지 않은 것이 나타나 있지 않은 한, 단수뿐만 아니라 복수의 것도 포함하는 것으로 한다.
이하, 실시예를 들어 더욱 본 발명을 설명하나, 본 실시예는, 어디까지나 본 발명의 실시 형태의 예시에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예
1. 방법
1-1. 마우스
C57BL/6 마우스 및 BALB/c 마우스는 CLEA Japan으로부터 구입하였다. ApcΔ716 마우스는 이미 보고된 바에 따라 제작하고(19), C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. TCTP flox 마우스는, 중앙 연구원(대만)의 Hsin-Fang Yang-Yen 박사에게 공여받고, C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. Villin-CreERT2 마우스는 퀴리 연구소(프랑스)의 Sylvie Robine 박사에게 공여받고, C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. MyD88 및 IPS-I 결손 마우스는 오사카대학의 Shizuo Akira 박사에게 공여받아 C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. TLR2 및 TLR4 결손 마우스는, 가부시끼가이샤 오리엔탈바이오서비스로부터 구입하고, C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. STING 결손 마우스는, 마이애미 대학(미국)의 Glen N. Barber 박사에게 공여받고, C57BL/6 마우스의 백그라운드로 사용하였다. RAG1 녹아웃마우스는, 신슈 대학의 Shinsuke Taki 박사에게 공여받았다. 특별히 정하지 않는 한, 본 실시예에 있어서 수컷 및 암컷(6-12주령)을 사용하였다. 모든 동물 실험은, 동경 대학 동물 실험 위원회의 승인을 얻어서 행했다.
1-2. 세포
RAW264.7 세포, 마우스 멜라노마 세포주 B16F10 세포, 마우스 섬유아세포주 Meth-A 세포 및 HEK293T 세포는, 이화학연구소 바이오 리소스 연구센터(일본)로부터 입수하였다. 마우스 대장암세포주 SL4 세포주는, T Irimura 박사(준텐도대학(順天堂大學))로부터 공여받았다. RAW264.7 세포, B16F10 세포 및 HEK293T 세포는, 10% FBS(HyClone)를 첨가한 DMEM(나카라이테스크사) 중에서 유지하였다. Meth-A 세포는, 10% FBS를 첨가한 RPMI(나카라이테스크사) 중에서 유지하였다. SL4 세포는, 10% FBS를 첨가한 DMEM-F12(Gibco) 중에서 유지하였다. 복강 침출 세포(peritoneal exudate cells: PEC)의 준비에 대해서는, 마우스 복강 내에 4% 티오글리콜레이트(DIFCO 용액)를 2ml를 투여하고, 4일 후, 복강을 PBS로 세정하여 PEC를 회수하였다. 세포를 10% FBS를 첨가한 RPMI 중, 페트리디쉬 상에서 하루밤 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 RPMI 배지로 세정하고, 그 후의 실험에 사용하였다.
1-3. 종양 침윤 세포(tumor-infiltrating cells)의 플로우사이토메트리 해석 및 형광 활성화 셀 소팅
종양 침윤 세포는, 마우스에의 종양의 피하 이식 후 회수하고, 플로우사이토메트리에 의해 해석하였다. 절제한 종양을 미세하게 절단하고, 콜라게나제(0. 75mg/ml, cat#11088882001, Roche), DNase I((40μg/ml, cat#11284932001, Roche) 및 디스파제(0.5mg/ml, cat#17105041, ThermoFisher Scientific)로 처리한 후, 격렬하게 교반(180 rpm, 37℃, 1시간)하였다. 얻어진 세포 현탁액을 셀 스트레이너(cat#352340, Falcon)에 통과시키고, RBC 용해 버퍼(cat#00-4333-57, Invitrogen)로 처리하였다. PBS로 세정 후, 최초에 세포를 항CD16/32 항체(clone 93, cat#101302, BioLegend)와 함께 빙상에서 5분간 인큐베이트하였다. 그 후, 세포를 PFE(2% FBS 및 1 mM of EDTA 을 첨가한 PBS) 중, 빙상에서 20분간 염색하고, LSR Fortessa(BD Biosciences)로 해석하였다. 종양 침윤 세포의 셀 소팅은 FACSAria II(BD Biosciences)를 사용하여 실시하였다. 얻어진 데이터는, FlowJo 소프트웨어(BD BioSciences)로 해석하였다.
이하에 나타내는 항체를 플로우사이토메트리 해석 또는 형광 활성화 셀 소팅에 사용했다: Ly6C-AF488(clone HK1. 4, cat#128022, BioLegend), NK1.1-FITC(clone PK136, cat#553164, PharMingen), CD1lb-PE(clone M1/70, cat#101208, BioLegend)CD3ε-PE(clone 145-2C11, cat#12-0031-81, eBioscience), CD11c-APC(clone N418, cat#17-0114-81, eBioscience), B220-APC(clone RA3-6B2, cat#20-0452-U025, TONBO biosciences), F4/80-PerCP/Cy5.5(clone BM8, cat#123128, BioLegend), CD8α-PerCP/Cy5.5(clone 53-6.7, cat#100734, BioLegend), Ly6G-PE/Cy7(clone 1A 8, 127618, BioLegend), CD4-PE/Cy7(clone GK1.5, cat#100422, BioLegend), CD45. 2-Pacific Blue(clone 104, cat#109820, BioLegend), anti-CD16/32(clone 93, cat#101302, BioLegend), PD-1-APC(clone 29F.1A 12, cat#135209, BioLegend), PD-L1-APC(clone 10F. 9G2, cat#124311, BioLegend).
1-4. 배양 상청의 준비
배양 상청은 이미 보고된 바(비특허문헌 5)를 따라서 준비하였다. SL4 세포를, PGE2(프로스타글란딘 E2)를 제거하기 위해서, 인도메타신(10μM)과 함께 밤새 인큐베이트하고, 108 세포/ml의 농도로 PBS에 현탁하고, 37℃의 항온조와 액체질소를 사용하여 동결-융해를 5회 행하였다. 그 후, 세포를 8,000Хg로 5분간 원심하여 괴사를 일으킨 세포편을 제거하였다. 배양 상청은, 0.45μm의 멤브레인 필터(Millipore)를 통과시켜서 여과하여 얻었다.
1-5. 시약
LPS(O55: B5)는, SIGMA-Aldrich(cat# L2637)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는, FASMAC로부터 구입하였다. 인도메타신은, WAKO(cat#093-02473)로부터 구입하였다. 재조합 IL-1α는, Peprotech(cat#211-11A)로부터 구입하였다. 재조합 TCTP는 ORIGENE(cat# TP301664)로부터 구입하였다. TUNEL 염색은, in situ Apoptosis Detection Kit(cat# MK500, TaKaRa)을 사용하여 실시하였다. 재조합 TCTP의 엔도톡신 레벨은, LAL Endotoxin Assay Kit, Chromogenic, ToxinSensor(cat# L00350, Genscript)로 어세이하여, 엔도톡신 레벨<0.1 EU/μg인 것을 확인하였다.
1-6. TCTP의 동정
괴사 세포의 배양 상청은, 먼저 DNase I 용액(0.5 U/μl; TaKaRa Bio), RNase A(0. 25mg/ml; MACHEREY-NAGEL) 또는 PBS로 처리하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 프로테이나제K 처리에 대해서는, 배양 상청을 프로테이나제 K(100μg/ml; TaKaRa Bio)로, 37도에서 1시간 처리하였다. 그 후, 프로테이나제 K로 처리한 샘플은, 빙상에서 20분간 APMSF(5 mM; 나카라이테스크)로 처리하고, 프로테이나제 K를 불활성화하였다. 사이토카인의 mRNA의 유도는, 프로테이나제 K 처리만으로 소실되었다는 점에서, 활성화 인자는 단백질인 것이 시사되었다. 이어서, 배양 상청을 이온교환 크로마토그래피(Hitrap Capto S컬럼(cat#17544105, GE healthcare) 또는 Hitrap Capto Q컬럼(cat#11001302, GE healthcare)에 통과시켰다. Hitrap Capto S column 또는 Hitrap Capto Q column은, 먼저, 1ml의 DDW로 세정한 후, 30ml의 PBS로 평형화하였다. 그 후, 5ml의 SL4 세포 배양 상청을 충전하고, 5ml의 PBS로 세정하였다. 플로우 스루를 회수하고, 거기에 PEC를 첨가하였다. RT-qPCR 해석에 의해, Hitrap Capto S컬럼의 플로우 스루는 사이토카인 mRNA를 유도하지만, Hitrap Capto Q컬럼의 플로우 스루는 유도하지 않는 것을 알았다. 이것은, 동정 대상 분자가 Hitrap Capto Q컬럼에 결합하는 것을 시사하고 있다.
상기 결과에 기초하여, 이온교환 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 조합한 이하의 정제 수순을 행하였다. 먼저, Hitrap Capto S컬럼을 1ml의 DDW로 세정한 후, 30ml의 PBS로 평형화하였다. 컬럼에 5ml에 SL4 세포 배양 상청을 충전한 후, 5ml의 PBS로 세정하였다. 플로우 스루를 회수하고, Hitrap Capto S 컬럼과 마찬가지로 평형화한 Hitrap Capto Q컬럼에 충전하였다. 이어서, 컬럼을 20ml의 PBS로 세정하고, 5ml의 0.4 M NaCl로 용출하였다. 용출액은, Spin-X UF 10k MWCO(cat# CLS431488, MERCK)로 농축하였다. 마지막으로, AKTA purifier(GE Healthcare)에 접속한 Superdex 200 Increase 10/300 GL컬럼을 사용하고, 사이즈 배제 크로마토그래피를 행하였다. 컬럼의 2배 용량의 PBS로, 컬럼을 평형화하고, 상기 농축한 용출액을 컬럼에 충전하였다. AC-5700P MicroCollector(ATTO)을 사용하여, 용출되는 액적(18방울)을 연속적으로 48웰 플레이트의 웰에 회수하였다. 각 구획을 PEC 또는 RAW264.7 세포에 첨가하고, Cxcl1, Cxcl2, Tnf 및 Il1b mRNA의 양을 RT-qPCR로 결정하였다. 18 내지 27개째까지의 구획분을, SilverQuest(cat# LC6070, invitrogen)을 사용하여 은염색을 행하고, 사이토카인의 유도 활성과 일치하는 가장 진한 밴드를 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry)에 제공하였다.
1-7. RT-qPCR
조직 또는 세포의 총RNA는 NucleoSpin RNA II(MACHEREY NAGEL)을 사용하여 추출하고, PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa Bio)을 사용하여 역전사하였다. RT-qPCR 반응은, TB Green Premix Ex TaqTM II(TaKaRa Bio)을 사용하여, LightCycler 480(Roche Life Science) 또는 LightCycler 96(Roche Life Science)을 사용히여 행하였다. 얻어진 값은 Gapdh mRNA의 발현량에 대하여 정규화하였다. 프라이머는 이하에 나타내는 서열의 것을 사용하였다.
Gapdh
포워드; 5'-ctcatgaccacagtccatgc-3'(서열 번호 26)
리버스; 5'-cacattgggggtaggaacac-3'(서열 번호 27)
Tnf
포워드; 5'-tcataccaggagaaagtcaacctc-3'(서열 번호 28)
리버스; 5'-gtatatgggctcataccagggttt-3'(서열 번호 29)
Cxcl1
포워드; 5'-agaccatggctgggattcac-3'(서열 번호 30)
리버스; 5'-agcttcagggtcaaggcaag-3'(서열 번호 31)
Cxcl2
포워드; 5'-tccagagcttgagtgtgacg-3'(서열 번호 32)
리버스; 5'-tcagttagccttgcctttgttc-3'(서열 번호 33)
Cxcr2
포워드; 5'-gacaccctcatgagaaccaagc-3'(서열 번호 34)
리버스; 5'-gttaaggcagctgtggaggaag-3'(서열 번호 35)
Il1b
포워드; 5'-gtggaccttccaggatgagg-3'(서열 번호 36)
리버스; 5'-cggagcctgtagtgcagttg-3'(서열 번호 37)
1-8. CRISPR/Cas9
TCTP KO SL4 세포, TCTP KO B16F10 세포 및 TCTP KO Meth-A 세포는, CRISPR 디자인 툴(http: //www. genome-engineering. org, accessed May 2017)을 사용하고, CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의해 제작하였다. TCTP 유전자의 게놈 서열을 표적화하였다(5'-CGGGCGGAAAAGGCCGACGC-3'(서열 번호 38) 및 5'-AGGCCCGCCATTTCCCGCGC-3'(서열 번호 39)). TCTP 유전자의 제1 엑손은 서열 번호 38 및 서열 번호 39의 2개의 서열에 의해 끼워져 있었다. 이들 가이드 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드는, 각각, pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Addgene) 및 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459) V2.0(Addgene)의 BbsI 사이트에 클로닝하였다. 양쪽의 발현 벡터 컨스트럭트(construct)를 SL4 세포에 도입하였다. 컨스트럭트(construct)가 도입된 세포는, 퓨로마이신에서 선택하고, 계속하여 GFP 발현 세포를 FACSAria II(BD Biosciences) 또는 SH800S(SONY)를 사용한 단일 세포 소팅에 제공하였다.
1-9. 면역블로팅
면역블로팅 해석은, 이미 보고된 바를 따라 행하였다(Inoue등, Nature 434, 243-249, doi: 10.1038/nature03308(2005)). β-엑틴(cat# A5441)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. TCTP 항체(cat# ab133568 및 cat# ab37506)은 abcam으로부터 구입하였다. TCTP 항체(cat#5128S)는 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다. β-엑틴은 로딩 컨트롤로서 사용하였다. 혈청 중의 TCTP량을 결정하기 위해서, 혈청을 TCTP 항체(ab133568)에 의한 면역블로팅 해석에 제공하였다. 재조합 TCTP(cat# TP301664, OriGene)는 TCTP량의 측정을 위하여 사용하였다. 항체 토끼 IgG-HRP(cat# NA934V, GE healthcare) 또는 항마우스 IgG-HRP(cat# NA931V, GE healthcare)는 2차 항체로서 사용하였다. 면역블로팅 시그널은 FUSION Solo S(Vilber-Lourmat)로 검출하고 FUSION Capt Advanced software(Vilber-Lourmat)로 해석하였다.
1-10. 인비트로에 있어서의 세포의 증식 해석
WT SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포(2. 5Х105 세포), B16F10 세포(1. 2Х105 세포) 또는 Meth-A 세포(2. 5Х105 세포)는, 6웰 플레이트에 각 웰에 시딩하였다. 3일마다, 세포의 8분의 1을 새로운 6웰 플레이트에 계대 하였다. 세포수는 3, 6 및 9일째에 산출하였다.
1-11. 피하 이식한 종양의 증식 어세이
마우스의 피하에, 2Х105개의 SL4 세포, 1Х105개의 B16F10 세포 또는 5Х105개의 Meth-A 세포를 이식하였다. 종양 체적은, 평균 체적=ðab2/6(a 및 b는, 각각, 긴 직경 및 짧은 직경)로 산출하였다.
1-12. Apc+/Δ716 대장암 모델
TCTPflox/flox, Apc+/Δ716 마우스 또는 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, Villin-CreERT2 마우스는, 4mg/마우스의 타목시펜에서 5주령으로부터 1주간에 1회 처리하였다. 이 마우스의 장내의 종양을 스테레오스코프(stereoscope)(Leica S9 D, Leica)를 사용하여 10주령 시에 해석하였다.
1-13. TCTP 도입주의 확립
인간 IL-2 펩타이드(MYRMQLLSCIALSLALVTNS: 서열 번호 40)의 코드 DNA를 마우스TCTP cDNA의 5' 말단에 융합시켰다. IL-2ss-TCTP 및 WT TCTP의 각 cDNA 프래그먼트는, pMXs-IRES-GFP레트로바이러스 발현 벡터에 삽입하였다. TCTP KO SL4 세포에의 레트로바이러스에 의한 벡터의 도입은, 이미 보고된 바를 따라 행하였다(Chiba등, Elife. 2014 Aug 22; 3: e04177. doi: 10. 7554/eLife.04177.) 그 후, GFP 양성 세포를 Cell Sorter SH800S(SONY)로 선별하였다. Mock 세포 또는 IL-2ss-TCTP 도입 세포는, 2Х106 세포상을 시딩한 60mm 배양 디쉬로부터 회수한 배양 상청에 대하여, 상술한 면역블로팅 해석을 실시함으로써 동정하였다.
1-14. 효소 결합 면역 흡착 어세이(Enzyme-linked Immunosorbent assay: ELISA)
종양은, 이식으로부터 21일째에 절제하고, 용해 버퍼(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 1mM APMSF) 중에서 미세하게 썰었다. 그 후, 빙상에서 30분간 인큐베이션하고, 용해물을 원심 하고, ELISA를 위하여 상청을 회수하였다. TIME 중의 마우스 CXCL1 및 CXCL2의 생산량은, ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하고, 첨부의 사용설명서에 따라서 정량하였다.
1-15. PMN-MDSC의 면역 억제 활성 평가
T세포는, 종양을 갖지 않는 마우스의 비장세포로부터 Pan T cell isolation kit II(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수집하였다. 준비된 세포는, CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit(Thermo Fischer Scientific)를 사용하고, 첨부의 사용설명서에 따라서 CFSE 염색을 행하였다. PMN-MDSC는, SL 세포(2Х105 세포)를 피하 이식한 마우스의 비장세포로부터, 이식으로부터 17-19일째에, 항Ly6-G 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 수집하였다. 호중구는, PMN-MDSC와 마찬가지 방법에 의해, 종양을 갖지 않는 C57BL/6 마우스로부터 수집하였다. CFSE에서 표지한 1Х105 세포의 T세포 및 5Х104 세포, 2. 5Х104 세포 혹은 1. 25Х104 세포의 PMN-MDSC를 96웰 플레이트에 시딩하였다. T세포의 증식은, Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28(Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 3일간 유도하고, 그 후, T세포에 있어서의 CFSE 희석율을 평가하기 위하여 플로우사이토메트리 해석을 행하였다.
1-16. 인비보에 있어서의 CD8+T세포, NK세포 및 PMN-MDSCs의 제거
NK세포의 제거에 대해서는, 항-아시알로 GM1(cat#014-09801, WAKO) 또는 래트 컨트롤 IgG(cat#31933, Thermofisher)를 종양 세포의 이식 후 1, 3, 7, 11 및 15일에 복강 내 투여하였다(200μg/마우스). CD8+T세포의 제거에 대해서는, 항CD8α(clone 2. 43, cat# BE0061, Bio X Cell) 또는 래트 컨트롤 IgG(cat#31933, Thermofisher)를 종양 세포의 이식 후 1, 3, 7 및 11일에 복강 내 투여하였다(100μg/마우스). NK세포 및 CD8+T세포의 제거에 대해서는, RAG1 KO마우스에 항-아시알로 GM1(cat#014-09801, WAKO) 또는 래트 컨트롤 IgG(cat#31933, Thermofisher)를 복강 내 투여하였다(200μg/마우스). PMN-MDSC의 제거에 대해서는, 항anti-Ly6G 항체(cat# BE0075-1, Bio X Cell) 또는 래트 컨트롤 IgG를 종양 세포의 이식 후 1, 3, 5, 7, 9 및 11일에 복강 내 투여하였다.
1-17. 디하이드로아르테미시닌(dihidroartemisinin: DHA) 또는 o-바닐린(o-vanillin) 처리
DHA(Selleck, TX, USA)는 DMSO에 용해시키고, 종양의 이식 후 1일째로부터 매일 복강 내 투여(50mg/kg)하였다. 항PD-1 항체 및 DHA의 조합 투여에 대해서는, 6일째에 DHA 투여를 중지하였다. O-바닐린(cat#120804-10G, 머크(Merck))은, 먼저 DMSO에 500mg/ml이 되도록 용해시키고, 그 후 PBS로 최종 농도 50mg/ml이 되도록 희석하였다. 희석한 용액을 종양의 이식 후 1일째로부터 2일마다 경구 투여(50mg/kg)를 행하였다.
1-18. 모노클로날 항체의 제작
1-18-1. 항체의 제작
TCTP에 대한 마우스 모노클로날 항체는, 가부시끼가이샤 모노클로날 항체 연구소(http: //www. monoclo. com; 일본, 나가노)에 위탁하고, 표준적인 하이브리도마법에 의해 제작하였다. BALB/c 마우스를 인간 TCTP의 일부의 서열인 합성 펩타이드(EDGVTPYMIFFKDGLEMEKC: 서열 번호 25)로 면역 하였다. 항체의 스크리닝은, TCTP에 대하다 면역블로팅 해석 및 면역 침강 해석에 기초하여, 스크리닝을 행하였다. 그 결과, 항체 55F3, 44E1 및 51A 9을 얻었다. 항체에 의한 처리에 대해서는, 55F3 또는 컨트롤 IgG(cat#0107-01, SouthernBiotech)을 마우스당 200μg 복강 내 투여하였다.
1-18-2. 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 결정
제작한 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은, PLoS ONE e0218717, 14: 2019을 참고로 하여 결정하였다.
하이브리도마 세포로부터 총RNA를 추출하고, 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 특이적인 RT(역전사) 프라이머(mIGK RT, mIGHG RT, Template-switch oligo F)를 사용하여, cDNA를 합성하였다. 계속해서, 제작한 cDNA를 주형으로 하고, 이어서 특이적 프라이머(ISPCR, mIGK PCR, mIGHG PCR)를 사용하여 PCR 반응을 행하였다. 얻어진 cDNA를 TA 클로닝(pTA2 vector, TOYOBO) 하고, 서열 결정을 행하였다.
상세한 실험 조건은 이하와 같다.
(1) cDNA의 제작
역전사 반응에 사용한 프라이머
Template-switch oligo F: 5'-aagcagtggtatcaacgcagagtacatGGG-3'(G는 리보구아닌)(서열 번호 41)
mIGK RT: 5'-ttgtcgttcactgccatcaatc-3'(서열 번호 42)
mIGL RT: 6'-ggggtaccatctaccttccag-3'(서열 번호 43)
mIGHG RT: 5'-agctgggaaggtgtgcacac-3'(서열 번호 44)
반응액(I)(cDNA합성 반응)
2μL 50 ng/μL 총RNA
1μL 10μM 역전사 반응용 프라이머(mIGK RT, mIGL RT 또는 mIGHG)
1μL 10 mM dNTPs.
이상을 8울 스트립 튜브 중에서 혼합하였다.
반응액(II) (cDNA 합성 반응)
2. 2μL H2O
2μL 5ХSMARTScribe buffer
1μL 20 mM DTT
0. 3μL 100μM template-switch oligo F.
0.5μL 100 U/μL SMARTScribe Reverse Transcriptase
이상을 8울 스트립 튜브 중에서 혼합하였다.
반응액(I)을 서멀 사이클러에서, 72℃, 3분간 열처리하였다. 열처리　후, 6μL의 반응액(II)을 반응액(I)에 첨가한 후, 혼합액을 서멀 사이클러에서, 42℃, 60분간 인큐베이트하였다. 그 후, 70℃, 5분간 열처리하고, 반응을 정지하였다.
(2) 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 결정
합성한 cDNA를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행하였다. 얻어진 증폭 산물을 사용하여, 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 DNA 서열을 결정한 후, 그것이 코딩하는 아미노산 서열을 결정하였다.
프라이머
ISPCR F: 5'-aagcagtggtatcaacgcagag-3'(서열 번호 45)
mIGK PCR: 5'-acattgatgtctttggggtagaag-3'(서열 번호 46)
mIGL PCR: 5'-atcgtacacaccagtgtggc-3'(서열 번호 47)
mIGHG PCR: 5'-gggatccagagttccaggtc-3'(서열 번호 48)
반응액
25μL 2ХPCR buffer(KOD FX용)
10μL 2mM dNTPs
3μL RT 반응으로부터 얻은 합성된 cDNA
2. 5μL 10μM 유니버설 포워드 프라이머 ISPCR
2. 5μL 10μM 리버스 PCR 프라이머(mIGK PCR, mIGL PCR 또는 mIGHG PCR)
6μL H2O
1μL KOD FX(1 U/μL)
PCR 사이클
98℃, 30초 반응시킨 후,
98℃, 15초,
63 내지 57.5℃, 30초(각 사이클에 있어서 온도를 0.5℃씩 저하시킨다)
72℃, 30초,
이상의 반응을 10 사이클 행하고, 또한,
98℃, 15초,
56℃, 30초,
72℃, 30초,
이상의 반응을 15 사이클 행한 후,
72℃에서 7분간 반응시킨 후, 4℃에서 정치하였다.
결정한 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을, 항체 시퀀스 데이터베이스(http: //www. abybank. org/kabat/ 및 http: //www. bioinf. org. uk/abs/info. html#cdrid 등)와 대조하여, Kabat의 정의에 따른 CDR에 상당하는 아미노산 서열을 특정하였다.
1-19. 대장암 환자로부터 얻은 데이터의 해석.
640명의 대장암 환자의 TDGA 데이터 세트를 cBioPortal(https: //www. cbioportal. org/, accessed December 2019)로부터 다운로드하고, cBioportal platform에 있어서 GISTIC 2.0 해석을 행하였다.
1-20. 병리학적 해석
SL4 종양 및 ApcΔ716 마우스 종양 유래 대장은, 4% 파라포름알데히드를 포함하는 PBS 중에 보존하고, 파라핀 포매를 행하였다. CD31(cat# ab28364, abcam) 또는 Ly6G(cat#127601, Biolegend)에 대한 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색, TUNEL 염색 및 3, 3'-디아미노 벤지딘(3, 3'-diaminobenzidine: DAB) 염색은, 동경대 의과학연구소의 병리 코어 연구소(laboratory)에서 실시하였다. 대장암 환자의 대장 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 및 동일한 환자의 정상 대장 상피의 샘플 준비 및 해석은 가나자와 대학에서 행해졌다. 상기 해석은 가나자와 대학의 Human Genome/Gene Analysis Research Ethics Committee of Kanazawa University(2016-086-433)에서 승인되고, 문서에 의한 동의를 환자로부터 얻었다.
TCTP(cat#133568, abcam) 또는 CD15(cat# M363129, Dako)를 DAB 염색을 위하여 사용하였다. 간단하게 설명하면 파라핀 포매 샘플을, 크실렌으로 2회 인큐베이션하여 탈 파라핀화한 후, 에탄올 계열로 탈수하고, PBS 중에서 재수화시켰다. 열처리에 의한 에피토프의 부활화(賦活化)는, 항원 부활화 시약의 pH9(cat#415211, NICHIREI BIOSCIENCES INC)을 사용하여, 121℃에서 10분간 행하였다. 내재성의 퍼옥시다아제를 실활시키기 위해서, REAL Peroxidase-Blocking solution(cat# S2023, DAKO)을 첨부의 사용설명서에 따라서 사용하고, 그 후 1% BSA/TBST로, 실온에서 30분 블로킹을 행하였다. 절편은, TCTP 항체 또는 CD15 항체와 함께, 실온에서, 1시간 인큐베이션하였다. 1차 항체의 검출은, Histofine simple stain MAX-PO(MULTI)(cat#424151, NICHIREI BIOSCIENCES INC.)을 사용하고, 기질로서 DAB(cat#415171, NICHIREI BIOSCIENCES INC.)를 사용하여 실시하였다. 샘플은, 헤마톡실린(at no. 415081, NICHIREI BIOSCIENCES INC.)으로 대비 염색을 행하였다. TCTP로부터의 시그널 강도의 정량은, 이미 보고된 바에 따라 ImageJ Fiji(Bio Protoc. 2019 Dec 20; 9(24): e3465.)을 사용하여 실시하였다. 정상 결장 점막 중에서의 평균 강도를 1로 하였다. CD31 양성 영역의 정량은, BZ-9000 현미경 및 세포 카운트 소프트웨어의 BZ-H4C(Keyence)를 사용하여 행하였다.
1-21. 마이크로 어레이
PEC는 네크로시스를 일으킨 세포(2Х106개의 SL4 세포)의 배양 상청로 자극하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 총RNA를 추출하고, Clariom S Array(Thermo Fisher Scientific)에 의한 해석에 사용하였다. Volcano plot은, Transcriptome Analysis Console(TAC) software V4.0(ThermoFisher Scientific)으로 작성하였다. 마이크로 어레이 데이터는, Gene Expression Omnibus(GEO) database(accession No. GSE150465)에 등록하였다.
1-22. 면역 염색
세포는, 35mm의 글래스 바텀 디쉬(MATSUNAMI)에서 하룻밤 배양한 후, PBS로 세정하고, 4% 파라포름알데히드/PBS로 15분간 고정하였다. 그 후, PBS로 세정한 후, 0.5% Triton X-100/PBS로 15분간, 막투과 처리를 행하고, 3% BSA/PBS로 블로킹하였다. 계속해서, 항TCTP 항체(ab37506)과 함께 2시간 인큐베이션하고, 세정 후, 2차 항체(Alexa Fluor 594 Goat anti-rabbit IgG, cat# A-11012, Invitrogen)로 처리하고, 면역 염색을 행하였다. PBS로 세정한 후, 핵의 대비 염색은, VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI(cat# H-1500, VECTOR LABORATORIES, INC)를 사용하여 행하고, 바로, ECLIPSE Ti 현미경(NIKON)을 구비한 C2si 공초점 현미경 시스템(NIKON)으로 해석을 행하였다.
1-23. PMN-MDSC의 양자 이식(adoptive transfer)
골수세포 및 비장세포는, SL4 세포(2Х105 세포)를 피하 이식 후 17일째의 마우스(종양을 갖는)로부터 수집하였다. Ly-6G+ 세포는, anti-Ly6-G MicroBead Kit, mouse(Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리하였다. TCTP KO SL4 세포(2Х105 세포)를 피하 이식한 1, 4, 7, 10 및 13일째의 마우스에, 분리한 Ly-6G+ 세포(4Х106 세포)를 정맥 내에 주입하였다.
1-24. 면역 침강
HEK293T 세포(5Х106개)를 시딩한 후, pCXNII-FLAG-hTCTP(2μg)만 또는, pCXNII-FLAG-hTCTP(2μg) 및 pcDNA3.1-hTLR2-YFP(2μg)을, X-tremeGENE9(Roche Life Science)를 사용하여, HEK293T 세포에 일과적으로 형질 도입 하였다. pcDNA3.1-hTLR2-YFP 벡터는 Douglas Golenbock 박사에게 공여받았다.
그 후, 용해 버퍼(20 mM Tris-HCL pH7. 5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF)를 사용하여 세포 용해물을 준비하였다. 1mg의 세포 용해물에 대하여, 1μg의 항GFP 항체(598; MBL) 및 30μl의 Dynabeads Protein G for immunoprecipitation(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 면역 침강을 행하였다. 그 후, 면역 침강물에 대하여, 항GFP 항체 또는 항FLAG M2 항체(Sigma Aldrich)를 사용하여 면역블로팅을 행하였다.
1-25. 루시페라아제 리포터 어세이
마우스 TLR3, TLR7, TLR9 및 인간 CD14 cDNA는, pCXNII-HA 벡터에 클로닝하였다. 인간 TLR2 cDNA 컨스트럭트(construct)(pcDNA3.1-hTLR2-YFP), 마우스 TLR3 cDNA 컨스트럭트(construct)(pCXNII-HA-mTLR3), 마우스 TLR7 cDNA 컨스트럭트(construct)(pCXNII-HA-mTLR7) 또는 마우스 TLR9 cDNA 컨스트럭트(construct)(pCXNII-HA-mTLR9)는, NFκB 루시페라아제 리포터(pNFκB-Luc(Stratagene))와 함께, HEK293T 세포에 형질 이입하였다. TLR2 자극에 관해서는, 인간 CD4 cDNA 컨스트럭트(construct)(pCXNII-HA-hCD14)를 동시 형질 이입하였다. 형질 이입으로부터 24시간 후, 2Х104 세포를 96웰 디쉬에 시딩하였다. 24시간 후, 세포를 재조합 TCTP 또는 각 TLR 아고니스트로 처리하였다. 그 후, 루시페라아제 활성을, Pikka Gene Dual Assay kit(cat# PD-11, TOYO B-Net)를 사용하고, MicroLumat Plus LB96V(Berthold Technologies)을 사용하고, 첨부의 사용설명서에 따라서 측정하였다.
1-26. G-CSF 및 GM-CSF의 정량
G-CSF(cat#560152, BD Biosciences) 및 GM-CSF(cat#558347, BD Biosciences)의 정량은, cytometric bead assay(CBA)를 사용하고, 첨부의 사용설명서에 따라 행하였다.
1-27. 세포사의 유도
아포토시스를 유도하기 위해서, 혈청 기아 및 아드리아마이신 처리를 행하였다. 혈청 기아에 관해서는, SL4 세포(5Х104 세포)를 48웰 디쉬에 시딩하여, 12시간 후에, 배지를 혈청 프리 배지로 교환하였다. 혈청 기아로부터 72시간 후, 배양 상청을 회수하였다. 아드리아마이신 처리에 관해서는, SL4 세포를 혈청 기아와 마찬가지로 시딩하였다. 12시간 후, 아드리아마이신(50μM)을 포함하는 배지에서 세포를 24시간 처리하고, 배양 상청을 회수하였다.
네크로시스를 유도하기 위해서, SL4 세포(1Х107 세포)를 1ml의 PBS에 현탁하였다. 동결 융해를 상기 "1-4. 배양 상청의 준비"에 기재한 바와 같이 실시하였다. 컨트롤로서, PBS 중에서 동결 융해와 동일한 시간만큼 인큐베이트한 SL4 세포의 상청을 사용하였다. 저 산소 처리(1%O2, 5% CO2)는, 멀티 가스 인큐베이터(MCO-5MUV-PJ, Panasonic)를 사용하여 행하였다.
1-28. 인간 혈청 중의 TCTP의 정량
대장암 환자의 및 비 암환자의 혈청은, Bionbank Japan으로부터 입수하였다. 본 연구는, 동경 대학의 윤리 위원회에 의해 승인되었다(20-239). TCTP의 정량은 면역블로팅에 의해 행하였다.
1-29. 피하 종양 모델에의 종양사세포의 투여
10cm 디쉬 상의 TCTP WT 세포 또는 TCTP KO 세포에, 치사량의 X선(100 Gy)을 조사하였다. TCTP WT SL4 세포(2Х105 세포)에, 동일한 양의 상기 TCTP WT 세포 또는 TCTP KO 세포를 혼합하고, C57BL/6 세포에 피하 이식하였다.
1-30. 통계 처리
샘플 사이즈 및 통계적 검정은, 도면의 설명에 기재한 바와 같이 행하였다. 데이터는, 별도로 정하지 않는 한, 값의 평균값 ±표준오차(s. e. m.)로 표시하였다. 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 후의 Dunnet 다중 비교 분석 혹은 일원배치 분산분석 후의 Tukey 다중 비교 분석, 스피어만 상관계수 계산, 로그 순위법(log-rank test) 및 양측 스튜던트 t-검정은, Prism 8.0(GraphPad Software)을 사용하여 행하였다. 모든 α수준은, 0.05, p<0.05을 유의미한 차이 있음으로 하였다.
2. 결과
2-1. 면역 조절 인자로서의 종양 세포 유래 TCTP의 동정
상당수의 종양 세포는, 종양이 증식하는 동안에 사멸(대부분이 괴사(네크로시스))하고 있으므로, 괴사 세포의 환경이, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME) 내의 MDSC(myeloid-derived suppressor cell, 골수 유래 면역 억제 세포)의 면역 조절 인자로서 기능하고 있다라는 작업 가설을 세웠다. 종양사세포 유래 면역 조절 인자를 동정하기 위한 어프로치로서, 먼저, 괴사한 SL4 세포(마우스 대장암 세포주)의 배양 상청 모델을 사용하였다(비특허문헌 5)(도 1a). SL4 세포 배양 상청을 마우스의 PEC에 폭로하면, 복수의 사이토카인 mRNA의 발현이 유도되었다. 이들 mRNA를 마이크로 어레이(도 1b) 및 RT-qPCR(도 1c)로 해석하였다. mRNA의 발현 유도가 확인된 사이토카인 중, Cxcl1 및 Cxcl2는, MDSC 등의 조혈 세포의 이동을 제어하는 것이 알려져 있으므로, Cxcl1 및 Cxcl2에 착안하였다. CXCL1 및 CXCL2에 공통의 리셉터인 CXCR2는, 마우스에 있어서 PMN-MDSC의 이동에 중요한 것이 알려져 있다(비특허문헌 6).
종양사세포에 유래하는 케모카인 중, Cxcl1 및 Cxcl2의 발현을 유도하는 것을 동정하기 위해서, SL4 세포의 배양 상청으로부터, 이온교환 크로마토그래피와 사이즈 배제 크로마토그래피를 사용하여, 목적으로 하는 분자의 단리를 시도하였다. SL4 세포의 배양 상청을 음이온 교환 컬럼(Hitrap Q) 및 양이온 교환 컬럼(Hitrap S)에 통과시켰다. Hitrap S컬럼으로부터의 플로우 스루를 회수하고, Hitrap Q컬럼에 충전하였다. Hitrap Q에 결합한 구획을 회수하고, 사이즈 배제 컬럼(Superdex 200)에 충전하였다. 얻어진 각 구획분을 PEC(Cxcl1, Cxcl2, Il1b; 2Х105 세포) 또는 RAW264.7 세포(Tnf; 2Х105 세포)에 첨가하고, 2시간 인큐베이트하였다. Cxcl1, Cxcl2, Tnf 및 Il1b의 mRNA를 RT-qPCR법으로 정량하였다. 각 mRNA 발현량의 피크 구획분에 대해서, SDS-PAGE 및 은염색을 행하고, 가장 다량의 단백에 대하여 액체 크로마토그래피 질량 분석(LC-MS)을 행한 바, TCTP(Tumor cell-derived translationally controlled tumor protein)가 상기 각 mRNA의 유도 인자의 후보인 것이 밝혀졌다. TCTP는 진핵세포의 세포질에 존재하는 것이 보고되어 있지만(비특허문헌 7, 비특허문헌 8 및 비특허문헌 9), 세포 외부에 존재하는 TCTP의 기능은 지금까지 알려져 있지 않았다.
PEC를, 재조합 TCTP로 자극한 후, 발현한 mRNA를 RT-qPCR로 정량한 바, Cxcl1 및 Cxcl2 및 다른 사이토카인(Tnf 및 Il1b)의 mRNA가 유도되는 것이 관찰되었다(도 2a). 이 결과로부터, TCTP가 면역 활성화 기능을 갖는 것이 확인되었다. 흥미롭게도, TCTP mRNA의 발현량은 종양 샘플에 있어서 상승하고 있는 것이 보고되었다(Du등, Oncotarget 8, 101922-101935, doi: 10.18632/oncotarget. 21747(2017)). 그러나, TCTP가 종양의 진행에 있어서 기능하고 있는지 여부, 기능하고 있다고 한다면 어떻게 기능하고 있는지에 대해서는, 명확하게 밝혀져 있짖 않았다.
TCTP는 죽은 종양 세포(종양사세포)의 배양 상청 중에 풍부하게 존재하고 있는 것에 대하여, 살아 있는 종양 세포(종양생세포)는 대부분 TCTP를 방출하지 않고 있었다(도 3a). 또한, 도 2b에 도시한 바와 같이, 혈청 중의 TCTP 단백질의 양은, SL4 세포를 피하 이식한 C57BL/6 마우스에 있어서 경시적으로 상승하고 있었다. 이 결과로부터, 인비보에 있어서, 빈사 상태에 있는 종양 세포로부터 TCTP가 방출되는 것이 시사되었다. 마찬가지로, B16F10 멜라노마 및 Meth-1 섬유 육종 종양을 갖는 마우스의 혈청 중에 있어서도 TCTP 단백질량의 상승이 관찰되었다(도 3b).
2-2. 종양 유래 TCTP의 종양 성장에의 기여
상기 결과에 기초하여, TCTP 발현 SL4 세포 및 TCTP 결손 SL4 세포에 의해 형성되는 종양의 증식에 대하여, TCTP가 어떤 영향을 주는지에 대하여 검토를 행하였다. TCTP 발현 SL4 세포(TCTP WT SL4: WT)와 TCTP 결손 SL4 세포(TCTP KO SL4: KO)의 전체 세포 용해물을 준비하고, TCTP 및 β-엑틴에 대하여 면역블로팅을 행하고, TCTP KO SL4에 있어서 TCTP가 결손되어 있는 것을 확인하였다(도 3c). TCTP WT SL4 세포 및 TCTP KO SL4 세포의 증식 속도는, 인비트로에서는, 표준 조건, 저 산소 조건 및 저혈청 조건에 있어서, 동일 정도였다(도 3d 및 e). 이에 대하여, TCTP WT SL4 세포와 TCTP KO SL4 세포를, C57BL/6 마우스에 피하 주사에 의해 이식하고, 인비보에서 발생한 종양의 체적을 경시적으로 측정한 바, TCTP KO SL4 세포 유래 종양 증식은, TCTP WT SL4 세포 유래 종양에 비하여, 현저하게 느려져 있는 것을 알았다(도 2c). 또한, TCTP KO SL4 세포에 TCTP 유전자를 재이입하고, 다시 TCTP 단백질을 발현시키면, 인비보에 있어서의 종양의 증식 속도가 회복되는 것이 확인되었다(도 3f). 또한, B16F10 세포 및 Meth-A 세포의 TCTP 유전자를 파괴하여(도 3c), 상기와 마찬가지의 검토를 행하였다. 그 결과, SL4 세포와 마찬가지로, 야생형주와 TCTP 유전자 결손주의 인비트로에 있어서의 증식 속도는 동일 정도였으나(도 3g 및 h), 마우스 생체 내에 이식한 종양의 증식은, TCTP 유전자 결손주 유래 종양쪽이, 야생형주 유래 종양보다도 현저하게 느려져 있었다(도 2d 및 e).
이상의 결과는, 인비보에 있어서, TCTP가 종양의 증식을 촉진하는 것을 나타내고 있다.
종양사세포 유래 TCTP가 종양 성장을 촉진하는지 여부를 검토하였다. 치사량의 X선을 조사한 TCTP WT SL4 세포(dead WT cells)를 투여하면, TCTP WT SL4 세포 종양의 성장을 촉진하였으나, 치사량의 X선을 조사한 TCTP KO SL4 세포(dead KO cells)를 투여해도 종양의 성장은 촉진되지 않았다(도 4c).
또한, 종양 진행에 있어서의 TCTP의 역할을 규명하기 위해서, 종양 억제 인자인 Apc 유전자의 결손 변이(ApcΔ716)에 의해 촉진되는 대장 종양의 모델을, TCTP 유전자의 존재 하 또는 비존재 하에서 검토하였다(도 2f). 타목시펜에 의해 TCTP 유전자의 발현을 조절하는 것이 가능한 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, villin-Cre ERT2 마우스를 사용하였다(도 2f). 이 마우스에서는 타목시펜 투여에 의해 장 관상피세포 특이적으로 TCTP 유전자의 결손이 발생한다. 그 결과, 타목시펜 처리한 마우스(TCTP 결손 마우스)와 처리하지 않고 있는 마우스(TCTP 유전자를 보유지지하는 마우스)의 장에 발생한 종양의 총 수를 비교한 바, 양자에 유의미한 차이는 인정되지 않았다(도 4a, Total). 한편, 종양의 직경이 2.0mm를 초과하는 종양의 수가, TCTP 결손 마우스에 있어서 현저하게 저하되어 있었다(도 4a, 2.0mm<). 이 결과는, TCTP는 종양의 발생률(발생 빈도)에는 영향을 미치지 않으나, 종양의 증식을 촉진하고 있는 것을 나타내고 있고, 상기한 암세포 이식 마우스 모델을 사용한 실험 결과와 일치하고 있다. 즉, TCTP는, 종양 발생률에 관여하는 것이 아니라, 발생한 암의 증식을 촉진시킨다는 것을 의미하고 있다.
3. 세포외 TCTP의 역할의 검토
이어서, 세포 외부에 방출된 TCTP가 종양의 증식을 촉진하는지 여부를 검토하였다. 세포 외부에 TCTP를 분비시키기 위해서, 레트로바이러스 유전자 트랜스퍼 벡터를 사용하여, 인간 IL-2 시그널 서열을 융합한 키메라 TCTP 단백질을 코딩하는 cDNA를 TCTP KO SL4 세포 중에서 발현시킨 세포(IL-2ss-TCTP SL4 세포)를 세포 배지에서 증식시켰다. 인비트로에 있어서, TCTP 단백질은 배양 상청에 검출되고(도 5a), 세포 내에는 검출되지 않았다(도 6a). 이어서, TCTP KO SL4 세포의 배양 상청 및 IL-2SS-TCTP SL4 세포의 배양 상청으로 PEC를 자극하고, 사이토카인의 유도가 보이는지를 조사하였다. 그 결과, IL-2ss-TCTP SL4 세포의 배양 상청의 자극에 의해, Cxcl1 및 Cxcl2 mRNA의 발현량의 상승이 확인되었다(도 6b, IL2ss-TCTP). 인비트로에 있어서의 IL-2ss-TCTP SL4 세포의 증식 속도는, TCTP KO SL4 세포와 동일 정도였으나(도 5b), 인비보에 있어서의 IL-2ss-TCTP SL4 세포 유래 종양 증식 속도는, TCTP KO SL4 세포 유래 종양보다도 유의미하게 빨라져 있었다(도 5c).
이상의 결과로부터, 세포 외부에 방출된 TCTP는, 면역 조절 인자로서 기능하고, 인비보에 있어서의 종양 증식을 촉진시키는 인자로서 기능하고 있는 것이 나타났다.
지금까지의 결과에 기초하여 고찰하면, 사멸해 가는 종양 세포로부터 방출되는 TCTP가, CXCL1 및 CXCL2를 유도하고, 이들이, PMN-MDSC를 TIME에 불러들이고, TIME에 있어서의 항종양 면역 응답을 억제하여 종양의 증식을 촉진시키는 가능성이 생각된다.
실제로, TCTP KO SL4 종양 내와 TCTP WT SL4(TCTP 발현 SL4) 종양 내에 있어서의 CXCL1의 양을 비교하면, TCTP WTSL4 종양에 있어서, CXCL1 발현량이 유의미하게 높았다(도 5d). 마찬가지의 결과가 CXCL2에 있어서도 인정되었다(도 5d). 또한, IL-2ss-TCTP 종양 내의 CXCL1/2의 양도 TCTP KO SL4 종양 내에 있어서의 발현량보다도 유의미하게 높았다(도 5e). 이 결과는, 세포외 TCTP가 TIME 내에서 이들의 케모카인을 유도하는 것을 나타내고 있다.
이어서, TCTP WT SL4 종양 및 TCTP KO SL4 종양으로부터 종양 침윤성의 면역 세포를 준비하고, 플로우사이토메트리로 해석하였다. 도 7a에 도시한 바와 같이, TCTO KO SL4 종양 내에서, 마우스의 PMN-MDSC를 나타내는 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포가 극적으로 감소되어 있는 것이 확인되었다. 한편, M-MDSC를 나타내는 CD1lb+Ly6ChighLy6G- 세포 및 CD1lb+Ly6C-Ly6G-F4/80+ 종양 관련 마크로파지(tumor-associated macrophage: TAM) 등의 골수계 세포는, 그러한 극적인 변화를 나타내지 않았다(도 7a 및 b). PMN-MDSC의 양은, TCTP KO 종양과 비교하여, IL-2ss-TCTP 종양 내에서 상승하고 있었던 것에 대하여, M-MDSC의 수에는 거의 차이가 보이지 않았다(도 7c). WT형 종양과 TCTP KO형 종양 사이에서, MDSC의 증식을 촉진하는 G-CSF 및 GM-CSF의 발현 레벨에 유의미한 차이가 없었던 것은 주목할만하다(도 6c). 이 결과는, G-CSF 및 GM-CSF가 TCTP KO 종양에 있어서의 PMN-MDSC의 세포수의 감소의 주된 원인이 아니라는 것을 나타내고 있다. 마찬가지로, PMN-MDSC의 세포수의 감소는, B16F10 및 Meth-A 종양에 있어서도 인정되었다(도 6d 및 e). 흥미롭게도, PMN-MDSC를 나타내는 ly6G+ 세포의 현저한 감소는, 종양 이식 모델인 상술한 TCTPflox/flox, Apc+/Δ716, villin-Cre ERT2 마우스의 de novo 종양에 있어서도 관찰되었다(도 7d).
상기 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포가, 실제로 PMN-MDSC를 나타내는 것을 확인하기 위해서, SL4 종양을 갖는 마우스 유래 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포 및 SL4 종양을 갖지 않는 마우스 유래 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포를, 인비트로에 있어서의 T세포 증식 어세이에 제공하였다. 도 7e에 도시한 바와 같이, SL4 종양을 갖는 마우스로부터 분리한 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포의 존재 하에서, 항CD3/CD28 항체로 T세포를 자극하고, T세포의 증식을 관찰한 바, CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포의 존재량에 의존하여, T세포의 증식이 억제되었다. 이에 대하여, 종양을 갖지 않는 마우스 유래 CD1lb+Ly6ClowLy6G+ 세포를 사용하여 동일한 실험을 행하였으나, T세포의 증식 억제 효과는 인정되지 않았다. 또한, SL4 종양을 갖는 마우스로부터 채취한 PMN-MDSC로 양자면역(adaptive immunity)을 유도하면, TCTP KO SL4 종양의 증식이 유의미하게 증대하였다(도 6g). 이상의 결과는, TCTP KO 종양의 증식 지체가, PMN-MDSC에 의해 유도되는 것을 시사하고, 면역 억제적 TIME의 진전을 유도하는 TCTP-PMN-MDSC 경로의 존재를 지지하는 것이다.
상술한 MDSC 양자 면역(adoptive immunity)의 결과는, 항종양 림프구가, TCTP KO 종양을 갖는 마우스에 있어서도, 여전히 활성화되어 있는 것을 시사하고 있다. 도 8b에 도시한 바와 같이, TIME 중의 CD8+ T세포의 수는, TCTP WT SL4 종양을 갖는 마우스와 비교하여, TCTP KO SL4 종양을 갖는 마우스에 있어서 유의미하게 증가되어 있었다. 한편, IL-2ss-TCTP 종양에 있어서는, TCTP KO 종양보다도 CD8+ 세포의 수가 적었다. 이에 더하여, 종양 내 NK세포의 활성화 마커(CD69 및 CD107a)도, TCTP WT SL4 종양을 갖는 마우스보다, TCTP KO SL4 종양을 갖는 마우스에 있어서 보다 상승되어 있었다(도 6h). 따라서, 이들 결과로부터, CD8+T세포 및 NK세포 모두가 종양에 대한 면역 응답의 유도에 관여하고 있는 것이 시사된다.
특히, TCTP KO SL4 종양의 증식은, CD8+T세포 및 NK세포 중 어느 하나를 제거함으로써 일부 회복하고(도 8c 및 d), 양쪽 세포를 제거함으로써, 종양의 증식이 촉진되었다(도 8e). 이상의 관찰 결과에 대하여는, MDSC의 레퍼토리가 결손된 것에 의해, CD8+T세포 및 NK세포 모두가 TIME 중의 TCTP KO 종양에 대하여 활성을 보유지지한 상태로 존재하고 있다라고 하는 설명이 가능하다. 한편, WT 종양에 있어서 CD8+T세포 및 NK세포가 소실시켜도, 종양 증식에는 영향이 발생하지 않았다. 이 결과는, 이들 이젝터 세포가, 보다 강력한 MDSC 레퍼토리에 의해, 이미 기능 부전 상태에 빠져 있는 것을 시사한다(도 8c 내지 e). 주목해야 할 것은, TAM, MDSC 및 간질 세포 상의 PD-L1의 발현량 및 TCTP WT 종양 및 TCTP KO 종양 중의 CD8+T세포 상의 PD-1의 발현량에는, 기본적으로 차이가 보이지 않았다는 것이다(도 9a 및 b). 또한, TCTP KO 종양 중의 내피세포(CD31+ 세포)의 밀도는, TCTP WT 종양 중의 밀도와 동일 정도였다(도 9c).
이상의 결과로부터, 종양 세포로부터 방출되는 TCTP에 의해 TIME에 도입되는 PMN-MDSC가, CD8+T세포 및 NK세포에 의한 항종양 면역 작용을 억제하여 적어도 일부에 있어서 종양 증식을 촉진하는 것이 시사된다.
4. TCTP가 작용하는 세포 및 수용체의 동정
지금까지의 결과로부터, TIME(암 면역 미세 환경)에 있어서, TCTP-CXCL1/2-PMN-MDSC 경로가 항종양 면역의 억제에 관여하고 있는 것이 생각된다. 따라서, 다음으로, 어떠한 세포종이 TIME에 있어서의 케모카인의 유도 요인이 되어 있는지를 검토하였다. TCTP WT SL4 종양의 TIME 및 TCTP KO SL4 종양의 TIME으로부터, 면역 세포의 서브셋을 선별하고, 케모카인의 mRNA 발현 레벨을 조사한 바, D1lb+Ly6ChighLy6G 세포(M-MDSC)가, 가장 많은 양의 Cxcl1 mRNA를 발현하고 있었다(도 10a). 여기서 주목해야 할 것은, TCTP KO SL4 종양으로부터 분리한 M-MDSC의 Cxcl1 mRNA의 발현 레벨이 현저하게 저하되어 있는 점이다(도 10b). 이 점, 인비트로에 있어서, SL4 종양 세포는, TCTP에 응답하지 않고, Cxcl1 mRNA의 발현을 유도하지 않았다(도 11a). 또한, 인비트로에 있어서, TCTP WT SL 세포와 TCTP KO SL4 세포에 있어서의 Cxcl1 mRNA의 발현 레벨은 동등하였다(도 11b). 따라서, 인비보에 있어서, 종양 세포 자체는, TCTP의 자극에 의해, CXCL1을 거의 유도하지 않는 것으로 생각된다. 또한, CXCL1/2 케모카인의 리셉터 유전자인 Cxcr2의 mRNA의 발현은, 다른 어떠한 세포보다도 PMN-MDSC에 있어서 현저하게 높았다(도 11c). 이들 결과는, TCTP가 M-MDSC에 작용하고, CXCL1/2 케모카인의 발현을 유도하고, 그 CXCL1/2 케모카인의 자극에 의해, CXCR2 발현 PMN-MDSC 세포가 TIME로 이동하고, 항종양 면역계의 억제가 일어남으로써 종양 성장이 촉진되는 것을 시사한다.
이어서, TCTP에 유도되는 케모카인이 고유한 수용체를 활성화하는지 여부에 대하여 검토를 진행하였다. 먼저, 몇 가지의 자연 면역 수용체에 있어서 공통으로 작용하는 어댑터 분자의 관여에 관하여 조사하였다. 도 10c에 도시한 바와 같이, TCTP에 의한 케모카인의 유도는, MyD88 유전자가 결손된 PEC에 있어서 소실되었으나, IPSI/MAVS 또는 STING 유전자가 결손된 PEC에서는 그러한 소실은 일어나지 않았다. MyD88는 Toll 유사 리셉터(Toll-like receptor: TLR)에 공통의 어댑터 분자이다. Toll 유사 리셉터 중, TLR2 및 TLR4는, 사세포로부터 방출되는 복수의 단백질을 인식할 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 10). 따라서, 야생형(WT) 마우스, TLR2 결손(TRL2 KO) 마우스 및 TLR4 결손(TLR4 KO) 마우스로부터 준비한 PEC를 재조합 TCTP로 자극하고, Cxcl1 mRNA 발현 레벨을 측정하였다. 그 결과, TCTP에 의한 Cxcl1 mRNA의 유도는, Tlr2-결손 PEC에서는 소실되었으나, Tlr4 결손 PEC에 있어서는, 소실되지 않았다(도 10d). 본 실험에 있어서, Tlr2-결손 PEC에 있어서의 재조합 IL-1α에 의한 Cxcl1 mRNA의 유도는 정상적으로 일어나고 있는 점에서, IL-1α는, TLR2에 의한 종양 증식에는 관여하지 않는 것이 시사되었다(도 11d). TCTP와 TLR2의 상호 작용은, 에피토프 태그화 TCTP와 TLR2의 공면역 침강에 의해 확인되었다(도 11e). 이 결과는, TCTP를 통하여 CXCL1/2의 발현을 유도하는 시그널의 수용체로서의 TLR2의 역할을 지지하는 것이다. 또한, 루시페라아제 리포터 어세이에 의해 나타낸 바와 같이, MyD88 경로를 통하여 시그널을 내는 TLR3, TLR7 및 TLR9 모두가 재조합 TCTP에 의해 활성화되지 않았다(도 11f).
Tlr2 결손 마우스에 이식된 SL4 종양은, WT 마우스에 이식된 SL4 종양과 비교하여 증식이 느린 것은 주목 할 만하다(도 11g). 또한, Tlr2 결손 마우스에 이식된 IL-2-ss-TCTP 종양도, 증식이 느렸다(도 11h). 또한, 선택적 TLR2 저해제인 O-vanillin은, IL-2ss-TCTP 종양의 증식을 억제하였다(도 11i). 이상의 결과는, 종양에 유래하는 TCTP에 의한 지속적이고 약한 시그널(감염 등에 의한 일과적이고 강한 시그널이 아니고)이, 충분히 발달한 TIME의 유도 및 유지에 있어서 중요하다는 것을 나타내고 있다.
5. TCTP의 저해에 의한 종양 증식에 대한 효과
이어서, TCTP의 저해 항체 및 저해제가, 종양의 증식에 어떤 영향을 미치는지 검토하였다. 인간 TCTP 펩타이드(서열 번호 25)에 대한 모노클로날 항체(55F3, 44E1, 51A 9)를 제작하였다. 서열 번호 25의 펩타이드는, 인간 TCTP 단백의 C 말단측 20개 잔기이다.
먼저, 55F3 항체(55F3)가 마우스 TCTP에 대하여 종 교차성이 있는 것을 확인하였다(도 12a). 55F3 또는 컨트롤 IgG를 포함하는 SL4 세포의 배양 상청으로 PEC를 자극한 바, 55F3을 포함하는 SL4 세포의 배양 상청으로 자극한 PEC로부터의 Cxcl1 mRNA의 발현이 억제되었다(도 12b). 이어서, SL4 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 주입에 의해 이식한 후, 55F3 또는 컨트롤 IgG(200μg/마우스)를, 이식 후 1일로부터 2일마다 복강 내 투여하고, 종양 체적을 측정하였다. 그 결과, 55F3을 투여한 것에 의해, SL4 종양 세포의 증식 속도가 저하되고(도 13a), TIME 중에 있어서의 PMN-MDSC의 양이 감소하였다(도 6b). 이 결과는, TCTP-CXCL1/2-MDSC 경로를 저해하면, 종양의 증식이 억제되는 것을 나타내고 있다.
또한, TCTP에 결합하고, TCTP의 프로테아좀에서의 분해를 촉진하는 것이 알려져 있는 디하이드로아르테미시닌(dihydroartemisinin: DHA)의 효과(비특허문헌 11)를 조사하였다. 도 6c에 도시한 바와 같이, DHA의 복강 내 투여에 의해, SL4 종양의 증식이 저해되는 것을 알았다. 한편, 이 DHA에 의한 종양 증식의 저해 효과는, TCTP KO 종양에서는 관찰되지 않았다는 점에서(도 12c), 종양의 증식 저해에 있어서 TCTP가 실제로 타깃이 되어 있다는 것이 나타났다. 이상의 결과는, TCTP 저해 물질(TCTP 안타고니스트)이 암 치료제로서 유효한 것을 나타내는 것이다.
TCTP의 기능 저해에 PD-1 면역 체크포인트의 저해를 조합하여 행한 경우, 종양의 증식에 어떤 영향이 미치는지를 검토하였다. PD-1 면역 체크포인트 항체로서는 클론 RMP1-14(BioLegend사)의 항체를 사용하였다. SL4 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 주입에 의해 이식한 후, 55F3 또는 DHA를, 이식 후 1일로부터 매일 복강 내 투여하였다. 이식으로부터 10일 후, 항PD-1 모노클로날 항체 투여하고, 종양 체적을 측정하였다. 그 결과, 55F3 또는 DHA와 PD-1 안타고니스트 항체를 병용 투여하면, 55F3 및 DHA 단독 투여의 경우보다, 종양 증식 억제 효과가 향상되는 것이 확인되었다(도 13d 및 e).
6. 인간 암에 있어서의 TCTP의 관여
인간의 암에 있어서의 TCTP의 역할에 대하여 검토하기 위해서, 인간 대장암(human colorectal cancer: CRC) 환자 유래 혈청 중에 있어서의 TCTP 단백질량을 측정하였다. 마우스 모델(도 2b 및 도 3g)과 마찬가지로, 암 환자 유래 혈청 샘플 중의 TCTP 단백질 양이 컨트롤 샘플 중의 양보다 많았다(도 13f). 또한, 정상 대장 조직과 비교하여, CRC 조직 중의 TCTP 단백질 양이 많았다(도 13g). 또한, TCTP의 발현량의 상승이, 암의 진행과 상관되어 있었다(도 13h). TCTP 단백질량의 상승은, 종양 병소에 있어서 확인되었으나, 간질 영역에서는 확인되지 않았다(도 12d). 이것은, TCTP의 발현은 종양 세포에 있어서 선택적으로 상승하는 것을 나타내고 있다. 또한, CRC 조직을 인간 PMN-MDSC 마커인 CD15에 대한 항체로 염색한 바, TCTP 단백질의 발현량과 CD15+ 세포의 수가, 양의 상관을 나타냈다(도 13i). 이 결과는, TCTP-OMN-MDSC 경로가 인간의 암에 있어서도 기능하고 있는 것을 시사하고 있다.
또한, The Cancer Genome Atlas(TCGA) 유래 데이터를 해석하였다. TCGA 데이터베이스로부터 얻은 CRC(colorectal cancer: 대장암) 환자(n=376)의 DNA 카피수로 분류한 TCTP의 mRNA 레벨을 도 13j에 나타낸다. Deep 또는 shallow의 환자는, 각각, TCTP 유전자의 1 또는 2개의 대립유전자가가 결실되어 있고, gain 또는 amplification의 환자는, 각각, TCTP 유전자의 1개 또는 1개보다 많은 대립유전자를 획득하고 있다. 이 해석 결과는, TCTP 유전자의 증폭이 대장암 환자의 약 5%로 인정되고, TCTP mRNA의 발현 레벨이 TCTP 유전자 카피수와 상관되어 있는 것을 나타낸다(도 13j). 또한, TCTP 발현 레벨은, 세포독성 T세포 또는 NK세포 마커(즉, CD8A, GZMB, PRF1 및 CD69)와 음으로 상관되어 있었다(도 12e). 이 음의 상관은, 세포독성 T세포 및 NK세포의 세포 용해성 반응(각각, GAMA mRNA 및 PRF1 mRNA 발현 레벨의 기하 평균으로서 정의된다)에 대해서도 인정되었다(도 12f). 또한, 주목해야 할 것은, TCTP 유전자가 증폭되어 있는 환자의 무진행 생존 기간(progression-free survival: PFS)은, 유의미하게 낮았다(도 13k).
이상의 지견에 기초하여, 종양 증식에 있어서의 TCTP의 기능을 도 1 3l에 정리하였다. TCTP는 종양의 사세포로부터 방출되고, M-MDSC 상의 TLR2 수용체에 결합하고, CXCL1/2 케모카인을 유도한다. 이들 케모카인은 PMN-MDSC를 TIME에 불러들이고, 항종양 면역 응답을 둔하게 하며, 또한 종양 성장을 촉진한다고 결론지을 수 있다.
본 발명은, 암의 치료제 및 치료 방법 등을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 의료 분야에 있어서의 이용이 크게 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo <120> Regulator for tumor immune microenvironment (TIME), and the use thereof for prevention, treatment or diagnosis. <130> TPC0389UVT <150> JP2020-147222 <151> 2020-09-02 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Phe Glu Ala Gly Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Leu Gln Tyr Asn Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 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Claims (13)

  1. 종양사세포로부터 방출되는 면역 조절 인자의 기능을 억제 또는 저해하는 물질을 유효성분으로서 포함하는, 암 면역 미세 환경(tumor immune microenvironment: TIME) 중 골수 유래 면역 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC)의 축적 저해제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 골수 유래 면역 억제 세포가, 다형핵 골수 유래 면역 억제 세포(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell: PMN-MDSC)인, 저해제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역 조절 인자가, TCTP(translationally controlled tumor protein)인, 저해제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질이 항체인, 청구항 3에 기재된 저해제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 물질이 디하이드로아르테미시닌(dihydroartemisinin: DHA)인, 저해제.
  6. 암의 치료제 또는 치료용 조성물이며, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 저해제를 유효 성분으로서 포함하는, 상기 치료제 또는 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암이, 대장암, 악성 흑색종 또는 섬유 육종인, 치료제 또는 치료용 조성물.
  8. 암의 진단 방법 또는 진단 보조 방법이며, 피험자 유래 샘플 중에 존재하는 TCTP mRNA 또는 TCTP 단백질의 양을 측정하는 것을 포함하는, 상기 진단 방법 또는 진단 보조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 또는 조직인, 방법.
  10. CDR(complementarity determining region) 1 내지 3의 아미노산 서열이 하기 (A), (B) 또는 (C) 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항원 결합 단편.
    (A) 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 5로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
    서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (B) 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
    서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    (C) 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
    서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
  11. TCTP의 기능을 억제 또는 저해하는 항체이며, 제10항에 기재된 항체와 TCTP의 결합을 경합 저해하는 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 인간화 항체인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일쇄 항체, scFv, scFv 이량체 또는 dsFv인 것을 특징으로 하는, 항원 결합 단편.
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