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KR20230002910A - 암 치료를 위한 ccr7 항체 약물 접합체 - Google Patents

암 치료를 위한 ccr7 항체 약물 접합체 Download PDF

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KR20230002910A
KR20230002910A KR1020227040613A KR20227040613A KR20230002910A KR 20230002910 A KR20230002910 A KR 20230002910A KR 1020227040613 A KR1020227040613 A KR 1020227040613A KR 20227040613 A KR20227040613 A KR 20227040613A KR 20230002910 A KR20230002910 A KR 20230002910A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cancer
seq
ccr7
antigen
Prior art date
Application number
KR1020227040613A
Other languages
English (en)
Inventor
바실리오스 아스콕시라키스
미셸 코울손
앤투 당
유안 두안
제시카 마코프스케
사빈 로트만
시아오리 왕
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
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Abstract

본 출원은 CCR7 항체 약물 접합체를 사용하여 소포림프종을 치료하는 조성물 및 방법을 개시한다. 또한, 치료를 필요로 하는 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 항체 약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하되, 암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여되는, 방법이 본원에 개시된다.

Description

암 치료를 위한 CCR7 항체 약물 접합체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 63/018351호의 이익을 주장하며, 이의 내용 전체는 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2020년 1월 31일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 PAT058794-WO-PCT_SL.txt이고 크기는 387,054 바이트이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 항-CCR7 항체, 항체 단편, 및 이의 면역접합체, 및 암의 치료 또는 예방을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
CC-케모카인 수용체 7(CCR7)은 1993년에 림프구-특이적 수용체로 처음 확인되었다(예를 들어, 문헌[Birkenbach et al., J Virol. 1993 Apr;67(4):2209-20] 참조). CCR7의 발현은 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포(Tcm), 조절 T 세포(Treg), 나이브 B 세포, NK 세포, 및 성숙한 항원 제시 수지상 세포(DC)와 같은 면역 세포의 하위집합으로 제한된다. CCR7은 림프 기관으로의 그리고 림프 기관 내로의 면역 세포의 귀소를 조절하여 면역과 내성의 균형을 맞추는 데 중요한 역할을 한다(예를 들어, 문헌[Foerster et al., Nat Rev Immunol. 2008 May;8(5):362-71] 참조).
CCR7은 2개의 리간드(CCL21 및 CCL19)가 있는 클래스 A의 로돕신-유사 G-단백질 결합 수용체(GPCR)이다. CCR7 구조가 완전히 규명된 것은 아니지만, 특정 모티프가 수용체 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Legler et al., Int J Biochem Cell Biol. 2014 Jul 1] 참조).
CCR7 및 암
CCR7(EBI1, BLR2, CC-CKR-7, CMKBR7, CD197, 및 CDw197이라고도 함)은 또한 B 세포 악성종양(예: CLL, MCL, 버킷 림프종), T 세포 악성종양(예: ATLL), HNSCC, ESCC, 위암종, NSCLC, 결장직장암종, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 및 자궁경부암을 비롯한 다수의 악성 종양에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 결장직장암종, ESCC, 췌장암, HNSCC, 및 위암에서의 CCR7의 과발현은 진행성 종양 병기, 림프절 전이, 및 낮은 생존률과 관련이 있었다(예를 들어, 문헌[Malietzis et al., Journal of Surgical Oncology 2015;112:86-92; Irino et al., BMC Cancer 2014, 14:291; Guo et al., Oncology Letters 5: 1572-1578, 2013; Xia et al., Oral Dis. 2015 Jan;21(1):123-31; Du et al., Gastric Cancer. 2016 Mar 16] 참조).
또한, 예를 들어 HNSCC에서의 CCR7 발현은 화학요법에 대한 내성에 역할을 하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Wang et al., JNCI J Natl Cancer Inst (2008) 100 (7): 502-512] 참조). 췌장암 및 비인두암종(NPC)과 같은 특정 암 유형에서 CCR7은 암 줄기-유사 세포 전이 및 구체 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Zhang et al., PLOS ONE 11 (8); Lun et al., PLOS ONE 7(12)] 참조). 세포 이동, 침습성, 및 EMT(상피-중간엽 전이)에서의 CCR7의 역할은 시험관내 및 생체내 유방암 및 췌장암과 같은 다양한 암 유형에서 설명된다(예를 들어, 문헌[Pang et al., Oncogene (2015), 1-13); Sperveslage et al., Int. J. Cancer: 131, E371-E381 (2012)] 참조). CCR7 신호전달에 필수적인 것으로 설명된 주요 경로는 b-아레스틴 매개 p38/ERK1/2 및 Rho 신호전달을 포함한다(예를 들어, 문헌[Noor et al., J Neuroinflammation 2012 Apr 25; 9:77] 참조).
암과 관련된 많은 프로세스가 CCR7 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. HNSCC에서 CCR7 발현은 CCR7 프로모터의 부위에 대한 직접 결합을 통해 NF-kB 및 AP1 전사 인자에 의해 유도되는 것으로 나타났다(문헌[Mburu et al., J. Biol. Chem. 2012, 287:3581-3590]). 특히, CCR7 발현은 종양 미세환경에서 다양한 인자에 의해 조절된다. 이러한 맥락에서, CCR7 발현은 HNSCC에서 b-디펜신 3/NF-kB 경로를 통해(예를 들어, 문헌[Mburu et al., Carcinogenesis vol.32 no.2 pp.168-174, 2010] 참조), 유방 종양 세포에서 엔도텔린 수용체 A 및 저산소증 유도 인자-1을 통해(예를 들어, 문헌[Wilson et al., Cancer Res 2006;66:11802-11807] 참조) 유도되는 것으로 알려져 있다.
항체 약물 접합체
항체 약물 접합체("ADC")는 암 치료에서 세포독성제의 국소 전달을 위해 사용되어왔다(예를 들어, 문헌[Lambert, Curr. Opinion In Pharmacology 5:543-549, 2005] 참조). ADC는 최소한의 독성으로 최대 효능이 달성될 수 있는 약물 모이어티의 표적 전달을 가능하게 한다. ADC는 세포증식억제 또는 세포독성 활성에 대해 선택된 약물에 연결된, 치료적 개입에 대해 표적화된 세포에 결합하는 능력에 대해 선택된 항체를 포함한다. 항체가 표적 세포에 결합함으로써 치료 효과가 필요한 부위에 약물이 전달된다.
표적 세포, 예를 들어 암 세포를 인식하고 이에 선택적으로 결합하는 많은 항체가 ADC에서의 사용에 대해 개시되어 있다. ADC에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 특정 관심 표적에 대한 항체 결합은 ADC 적용의 성공을 예측하기에 충분하지 않다. (표적 고유의 기능 외에) ADC의 치료 효과에 영향을 줄 수 있는 인자의 예는 맞춤형 미세 조정이 필요한 다양한 양태, 예컨대 표적 매개 특징(TMDD)과 효능 유도 노출 간의 균형으로서의 최적의 항체 친화도, Fc-매개 기능(항체-의존적 세포-매개 세포독성, ADCC)의 평가, 접합 방법(부위-특이적 또는 비특이적), 각 항체에 접합하는 약물/페이로드 분자의 비("DAR" 또는 "약물 항체 비"), 링커의 절단성 또는 안정성, ADC의 안정성, 및 ADC의 응집 경향을 포함한다.
효과적인 ADC 치료 조성물 및 방법으로서 사용하기 위한 개선된 특성을 갖는 항체, 부착 방법, 및 세포독성 페이로드에 대한 요구가 남아있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 항체 약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 개시하며, 여기서 암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식:
Figure pct00001
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, 본 출원은 암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체를 포함하는 조성물을 개시하며, 여기서 암은 치료를 필요로 하는 대상체에서 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식:
Figure pct00002
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 항체 약물 접합체의 용도를 개시하며, 여기서 암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식:
Figure pct00003
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 항체 약물 접합체의 용도를 개시하며, 여기서 암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식:
Figure pct00004
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이다.
일부 구현예에서, 암은 재발성 또는 불응성 소포림프종이다.
일부 구현예에서, CCR7에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
a. 서열번호 1의 HCDR1(중쇄 상보성 결정 영역 1), 서열번호 2의 HCDR2(중쇄 상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 3의 HCDR3(중쇄 상보성 결정 영역 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 LCDR1(경쇄 상보성 결정 영역 1), 서열번호 18의 LCDR2(경쇄 상보성 결정 영역 2), 및 서열번호 19의 LCDR3(경쇄 상보성 결정 영역 3)을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b. 서열번호 4의 HCDR1, 서열번호 5의 HCDR2, 및 서열번호 6의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 20의 LCDR1, 서열번호 21의 LCDR2, 및 서열번호 22의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c. 서열번호 7의 HCDR1, 서열번호 8의 HCDR2, 및 서열번호 9의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 23의 LCDR1, 서열번호 24의 LCDR2, 및 서열번호 25의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d. 서열번호 10의 HCDR1, 서열번호 11의 HCDR2, 및 서열번호 12의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 26의 LCDR1, 서열번호 27의 LCDR2, 및 서열번호 28의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e. 서열번호 33의 HCDR1, 서열번호 34의 HCDR2, 및 서열번호 35의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 49의 LCDR1, 서열번호 50의 LCDR2, 및 서열번호 51의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f. 서열번호 36의 HCDR1, 서열번호 37의 HCDR2, 및 서열번호 38의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 52의 LCDR1, 서열번호 53의 LCDR2, 및 서열번호 54의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
g. 서열번호 39의 HCDR1, 서열번호 40의 HCDR2, 및 서열번호 41의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 55의 LCDR1, 서열번호 56의 LCDR2, 및 서열번호 57의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
h. 서열번호 42의 HCDR1, 서열번호 43의 HCDR2, 및 서열번호 44의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 58의 LCDR1, 서열번호 59의 LCDR2, 및 서열번호 60의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
i. 서열번호 65의 HCDR1, 서열번호 66의 HCDR2, 및 서열번호 67의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 81의 LCDR1, 서열번호 82의 LCDR2, 및 서열번호 83의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
j. 서열번호 68의 HCDR1, 서열번호 69의 HCDR2, 및 서열번호 70의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 84의 LCDR1, 서열번호 85의 LCDR2, 및 서열번호 86의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
k. 서열번호 71의 HCDR1, 서열번호 72의 HCDR2, 및 서열번호 73의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 87의 LCDR1, 서열번호 88의 LCDR2, 및 서열번호 89의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
l. 서열번호 74의 HCDR1, 서열번호 75의 HCDR2, 및 서열번호 76의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 90의 LCDR1, 서열번호 91의 LCDR2, 및 서열번호 92의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
m. 서열번호 596의 HCDR1, 서열번호 597의 HCDR2, 및 서열번호 598의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 612의 LCDR1, 서열번호 613의 LCDR2, 및 서열번호 614의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
n. 서열번호 599의 HCDR1, 서열번호 600의 HCDR2, 및 서열번호 601의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 615의 LCDR1, 서열번호 616의 LCDR2, 및 서열번호 617의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
o. 서열번호 602의 HCDR1, 서열번호 603의 HCDR2, 및 서열번호 604의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 618의 LCDR1, 서열번호 619의 LCDR2, 및 서열번호 620의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
p. 서열번호 605의 HCDR1, 서열번호 606의 HCDR2, 및 서열번호 607의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 621의 LCDR1, 서열번호 622의 LCDR2, 및 서열번호 623의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 구현예에서, CCR7에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
a. 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
b. 서열번호 45의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 61의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
c. 서열번호 77의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 93의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
d. 서열번호 608의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 624의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
일부 구현예에서, CCR7에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
a. 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄;
b. 서열번호 47의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄;
c. 서열번호 79의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 95의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄; 또는
d. 서열번호 610의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 626의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 시스테인 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중쇄의 S152C, S375C, 또는 S152C와 S375C 둘 모두로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 일부 구현예에서, 상기 항체는 모노클론 항체이다.
일부 구현예에서, m은 1이다. 일 구현예에서, n은 약 3 내지 약 4이다. 일 구현예에서, 링커는 절단성(cleavable) 링커, 비절단성(non-cleavable) 링커, 친수성 링커, 전하전(procharged) 링커, 및 디카복실산계 링커로부터 선택된다.
일 구현예에서, 링커는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB), N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포-부타노에이트(설포-SPDB), N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 말레이미드 PEG NHS, N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카복실레이트(SMCC), N- 설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카복실레이트(설포-SMCC), 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 17-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14-테트라옥소-4,7,10,13-테트라아자헵타데칸-1-오에이트(CX1-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교제로부터 유도된다.
다른 구현예에서, 링커는 하기 화학식 IIA를 가지며,
[화학식 IIA]
Figure pct00005
;
식에서 *는 항체 상의 티올 작용기에 연결되고, **는 약물 모이어티의 티올 작용기에 연결되고;
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고; 알킬렌은 선형 또는 분지형이다.
다른 구현예에서, 링커는 하기 화학식을 가지며,
Figure pct00006
식에서 y는 1 내지 11이고; *는 항체 상의 티올 작용기에 연결되고, **는 약물 모이어티의 티올 작용기에 연결된다.
일 구현예에서, 약물 모이어티는 V-ATPase 억제제, 아폽토시스 촉진제, Bcl2 억제제, MCL1 억제제, HSP90 억제제, IAP 억제제, mTor 억제제, 미세소관 안정화제, 미세소관 불안정화제, 아우리스타틴, 아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, RNA 폴리머라제 억제제, 돌라스타틴, 메이탄시노이드, MetAP(메티오닌 아미노펩티다제), 단백질 CRM1의 핵 유출의 억제제, DPPIV 억제제, 프로테아솜 억제제, 미토콘드리아에서의 포스포릴 전달 반응 억제제, 단백질 합성 억제제, 키나제 억제제, CDK2 억제제, CDK9 억제제, 키네신 억제제, HDAC 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터칼레이터, DNA 마이너 그루브 바인더, 및 DHFR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 메이탄시노이드이고, 메이탄시노이드는 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1), N(2’)-데아세틸-N(2’)-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3), 또는 N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)이다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체 약물 접합체는 하기 화학식 VIII:
[화학식 VIII]
Figure pct00007
[식에서 L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고; 알킬렌은 선형 또는 분지형이고; n은 약 3 내지 약 4임]; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체 약물 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00008
[식에서 n은 약 3 내지 약 4이고, Ab는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체임]; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 염이 아닌 형태이다.
암 치료 또는 예방 방법의 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체 또는 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합하여 환자에게 투여된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료 화합물은 표준 치료 화학요법제, 공동자극 분자, 또는 체크포인트 억제제로부터 선택된다. 일 구현예에서, 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 항체 약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 개시하며, 여기서 암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
Figure pct00009
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이고,
항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 출원은 암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체를 포함하는 조성물을 개시하며, 여기서 암은 치료를 필요로 하는 대상체에서 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
Figure pct00010
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이고,
항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 항체 약물 접합체의 용도를 개시하며, 여기서 암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
Figure pct00011
또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 12의 정수이고,
항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 항체 약물 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00012
[식에서 n은 약 3 내지 약 4이고, Ab는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체임]; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 염이 아닌 형태이다.
일 구현예에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 예컨대 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL), 비호지킨 림프종(NHL), 예컨대 맨틀 세포 림프종(MCL), 버킷 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 및 소포림프종(FL), 위암종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 두경부암, 비인두암종(NPC), 식도암, 결장직장암종, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 신세포암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL)과 같은 말초 T 세포 림프종(PTCL), 맨틀 세포 림프종(MCL)과 같은 비호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 소포림프종(FL), 및 비소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 암은 재발성 또는 불응성 암이다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 0.2 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 0.4 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 0.8 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 1.2 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 1.6 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 2.4 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 3.6 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 4.8 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 6.0 mg/kg으로 투여된다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 3주마다 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 1회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 2회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 3회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 4회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 3회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 5회 사이클 동안 치료받는다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 정맥내 투여된다.
도 1은 대체 ADCC 리포터 분석을 이용한 CysMab 포맷의 비인간화 및 인간화 항-CCR7 항체의 시험관내 ADCC 활성에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 2는 대체 ADCC 리포터 분석을 이용한 DAPA Fc-돌연변이 버전의 비인간화 항-CCR7 항체의 시험관내 ADCC 활성에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 3은 ELISA 기반 분석을 이용한 CysMab.DAPA 포맷의 항-CCR7 항체에 의한 재조합 hCCR7 결합에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 4a 내지 도 4c는 작용 모드(도 4a) 및 길항 모드(도 4b, 도 4c)의 β-아레스틴 분석을 이용한 모체 항-CCR7 항체의 기능에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 5는 FACS 분석을 이용한 CysMab.DAPA 포맷의 항-CCR7 항체에 의한 CCR7 리간드와의 경쟁에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 6은 돌연변이 CCR7 단백질을 이용한 모체 항-CCR7 항체의 에피토프 매핑에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 페이로드-접합 2차 항체 단편과 복합체를 형성한 모체 항-CCR7 항체의 피기백 ADC(pgADC) 분석에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 8은 표적 음성 세포주를 이용한 페이로드-접합 2차 항체 단편과 복합체를 형성한 121G12 모체 Ab의 세포독성 효과의 피기백 ADC(pgADC) 사멸 분석에 대한 실험 데이터를 도시한다.
도 9는 항체 단독으로 또는 아우리스타틴 세포독소에 접합된 형태로, CysMab 야생형 Fc 포맷의 마우스 CCR7 교차반응성 121G12 모체 Ab를 사용한 CD4+ 및 CD8a+ T 세포 고갈을 나타내는 그래프를 도시하며, 그 효과는 DAPA 침묵 Fc 포맷으로 전환하여 복구된다.
도 10은 KE97 다발성 골수종 이종이식 모델에서 항체 약물 접합체 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 및 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 용량 반응 효능을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 11은 도 10보다 큰 시작 종양 부담에서 투약을 시작한 KE97 다발성 골수종 모델에서 항체 약물 접합체 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 및 121G12.sSPDB.DM4의 활성을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 12는 원발성 비소세포 폐 종양 모델 HLUX1934에서 접합체 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 생체내 활성을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 13은 KE97 다발성 골수종 이종이식 모델에서 접합된 모체 684E12.SMCC.DM1의 활성을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(2, 5, 또는 10 mg/kg) 또는 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4(10 mg/kg)의 단회 용량 처치 48시간 후의 KE97 종양에 걸친 포스포-히스톤 H3 IHC 이미지(도 14a) 및 정량화된 포스포-히스톤 H3 신호(도 14b)를 도시하며, 항-CCR7 ADC를 사용한 처치 후 유사분열 정지의 유도(포스포-히스톤 H3)를 보여준다.
도 15는 OCI-LY3 ABC-DLBCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 반응 효능을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 16은 Toledo GCB-DLBCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 반응 효능을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 17은 DEL ALCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 반응 효능을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 18은 HLUX1787 NSCLC 환자 유래 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 반응 효능을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 19a 및 도 19b는 일련의 DLBCL PDX 모델에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 효능이 CCR7 발현과 상관관계가 있음을 나타낸다. 반응 카테고리는 RECIST 기준으로부터 조정되었고 다음과 같이 정의되었다(이 순서대로 적용): 완전 반응 = CR = 최적평균반응 <-40% 및 최대종양퇴행 <-95%. 부분 퇴행 = PR = 최적평균반응 <-20% 및 최적최소반응 <-50%. 안정성 질환 = SD = 최적평균반응 <30% 및 최적최소반응 <35%. 진행성 질환 = PD = 상기 기준 중 어느 것도 충족하지 않음, 반응이 나타났지만 내성이 발생한 경우 CR-->PD, PR-->PD, SD-->PD 적용.
도 20은 OCI-Ly3 이종이식 종양 보유 NSG 마우스에서 비-GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 농도 시간 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 21a 및 도 21b는 원숭이에서 비-GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 농도 시간 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 22는 원숭이에서 GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 농도 시간 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 23은 재발성/불응성 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL) 환자에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 I/Ib상 공개 라벨, 다기관 용량 증량 연구의 연구 설계를 나타내는 그래프를 도시한다.
정의
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 다음의 용어 및 어구는 다음의 의미를 갖는다:
용어 "알킬"은 특정 수의 탄소 원자를 갖는 1가 포화 탄화수소 사슬을 지칭한다. 예를 들어, C1-6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 지칭한다. 알킬기는 직선형 또는 분지형일 수 있다. 대표적인 분지형 알킬기는 1, 2, 또는 3개의 분지를 갖는다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필(n-프로필 및 이소프로필), 부틸(n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸), 펜틸(n-펜틸, 이소펜틸, 및 네오펜틸), 및 헥실을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 "알킬렌"은 "알킬"의 2가 형태이다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 비공유적으로, 가역적으로 그리고 특정 방식으로 대응 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 천연 발생 IgG 항체는 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체계의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 모노클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 항이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체는 임의의 이소형/클래스(예를 들어, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2)를 가질 수 있다.
"상보성 결정 도메인" 또는 "상보성 결정 영역"("CDR")은 상호교환적으로 VL 및 VH의 초가변 영역을 지칭한다. CDR은 표적 단백질에 대한 특이성을 보유하는 항체 사슬의 표적 단백질 결합 부위이다. 각각의 인간 VL 또는 VH에는 3개의 CDR(N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된 CDR1 내지 3)이 존재하고, 이들은 가변 도메인의 약 15~20%를 구성한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 대해 구조적으로 상보적이며, 따라서 결합 특이성의 직접적인 원인이 된다. VL 또는 VH의 나머지 스트레치, 소위 프레임워크 영역은 아미노산 서열의 더 적은 변이를 나타낸다(문헌[Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000]).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 정의, 예를 들어 Kabat, Chothia, 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT)(월드와이드 웹사이트 www.imgt.org/), 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 또한 다음과 같은 문헌에 설명되어 있다: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); 및 Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); 및 Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
경쇄 및 중쇄는 둘 다 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 점이 이해될 것이다. 역으로, 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 도메인(CH1, CH2, 또는 CH3)은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 규칙에 따라, 불변 영역 도메인의 넘버링은 불변 영역 도메인이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가된다. N-말단은 가변 영역이고, C-말단에는 불변 영역이 있으며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장해, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 결합 단편의 예는 VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 단일쇄 Fvs(scFv), 카멜리드 항체, 이황화-결합 Fv(sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편; 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341:544-546, 1989]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 또는 항체의 다른 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결되어 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄(단일쇄 Fv("scFv")로 알려져 있음)로서 생성될 수 있도록 한다(예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988] 참조). 이러한 단일쇄 항체도 용어 "항원 결합 단편"에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항원 결합 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 단일 도메인 항체, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR, 및 비스-scFv로 통합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 피브로넥틴 타입 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 한 스캐폴드 내로 그라프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기술한 미국 특허번호 6,703,199 참조).
항원 결합 단편은, 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일쇄 분자로 통합될 수 있다(Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; 및 미국 특허번호 5,641,870).
본원에서 사용되는 용어 "모노클론 항체" 또는 "모노클론 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자 소스로부터 유래된 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 포함한다. 모노클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역이 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식세포계열 서열, 또는 인간 생식세포계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 예를 들어 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석에서 유래된 공통 프레임워크 서열을 포함하는 항체로부터 유래된다. 또한 친화성 성숙을 위해 또는 제조/페이로드 접합 목적을 위해 하나 이상의 CDR이 돌연변이된 인간 서열로부터 유래된 항체가 포함된다. 문헌[Kilpatrick et al., "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS," Hybridoma. 1997 Aug;16(4):381-9] 참조.
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제조의 촉진을 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인식"은 에피토프가 선형이든 입체형태이든 관계없이, 자신의 에피토프를 확인하고 이와 상호작용하는(예를 들어, 결합하는) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 용어 "에피토프"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산들로부터 형성되거나 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산들로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출되었을 때 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리하면 일반적으로 소실된다. 에피토프는 일반적으로 고유의 공간적 입체형태의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당해 분야의 기술, 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다(예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용 강도를 의미한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 여러 부위에서 항원과 약한 비공유 결합력을 통해 상호작용하며; 상호작용이 많을수록 친화도는 더 강하다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 그러나, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "상응하는 인간 생식세포계열 서열"은 인간 생식세포계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 암호화되는 공지된 모든 다른 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높게 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 또한 평가된 모든 다른 가변 영역 아미노산 서열과 비교하여 기준 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 프레임워크 영역 단독, 상보성 결정 영역 단독, 프레임워크 및 상보성 결정 영역, (위에 정의된 바와 같은) 가변 분절, 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 기타 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본원에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 알려진 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 정렬하여 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 핵산 또는 아미노산 서열은 기준 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT)(월드와이드 웹사이트 www.imgt.org/) 및 V-base(월드와이드 웹사이트 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 통해 결정될 수 있다.
항원(예를 들어, 단백질)과 항체, 항체 단편, 또는 항체-유래 결합제 간의 상호작용을 설명하는 맥락에서 사용될 때 어구 "특이적 결합" 또는 "선택적 결합"은 이종 집단의 단백질 및 기타 생물제제에서, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 또는 조직 샘플에서 항원의 존재를 결정짓는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 특정 지정된 면역분석 조건하에, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 백그라운드의 2배 이상 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 지정된 면역분석 조건하에, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 백그라운드의 10배 이상 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에는 실질적으로 유의미한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은 항체 또는 제제가 특정 단백질에 대한 특이성에 대해 선택되었음을 필요로 할 수 있다. 필요에 따라 또는 적절하게, 이 선택은 다른 종(예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 다른 하위유형으로부터의 분자와 교차반응하는 항체를 제외시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 특정의 목적하는 분자와 교차반응하는 항체 또는 항체 단편이 선택된다.
특정 단백질과 특이적으로 면역반응성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 다양한 면역분석 형식을 사용할 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 고상 ELISA 면역분석이 통상적으로 사용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역분석 형식 및 조건에 대한 설명은 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 일반적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 백그라운드 신호에 비해 적어도 2배, 더 일반적으로는 백그라운드에 비해 적어도 10배 내지 100배의 신호를 생성할 것이다.
용어 "평형 해리 상수(KD, M)"는 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 결합 속도 상수(ka, 시간-1, M-1)로 나눈 것을 지칭한다. 평형 해리 상수는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 구현예에서는 약 10-11 M, 10-12 M, 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수를 가질 것이다.
용어 "생체이용률"은 환자에 투여된 소정 양의 약물의 전신 이용률(즉, 혈액/혈장 수준)을 지칭한다. 생체이용률은 투여된 투약 형태로부터 전신 순환에 도달하는 약물의 시간(속도) 및 총량(정도)의 측정치를 나타내는 절대 용어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 방법 또는 조성물에 포함된 활성 약제의 속 또는 종, 뿐만 아니라 방법 또는 조성물의 의도된 목적에 대해 비활성인 임의의 부형제도 나타낸다. 일부 구현예에서, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 본 발명의 항체 약물 접합체 이외의 하나 이상의 추가 활성제의 포함을 명시적으로 배제한다. 일부 구현예에서, "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 어구는 본 발명의 항체 약물 접합체 및 제2 공동 투여제 이외의 하나 이상의 추가 활성제의 포함을 명시적으로 배제한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생, 합성, 및 비천연 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라 추후에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 구조가 다르지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 이 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산의 각 코돈(통상적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기술된 서열에 내재되어 있다.
폴리펩티드 서열에 있어서, "보존적으로 변형된 변이체"는, 소정 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실, 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자 외에도 존재하며 이들을 배제하지 않는다. 다음의 8개 군이 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 구현예에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미한 영향이나 변경을 일으키지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "최적화"는 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포, 피키아(Pichia) 세포, 진균 세포, 트리코데르마(Trichoderma) 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 또는 인간 세포에서 선호되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화하도록 변경된 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모체" 서열로도 알려진 시작 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 암호화되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 한 많이 유지하도록 조작된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한 퍼센트" 또는 "퍼센트 동일성"이라는 용어는 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 동일한 정도를 지칭한다. 두 서열은 비교되는 영역에 걸쳐 동일한 서열의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 갖는 경우 "동일"하다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정시 비교 창 또는 지정 영역에 걸쳐 최대로 일치되도록 비교 및 정렬한 경우, 두 서열이 동일 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율(즉, 특정 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 60%의 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성)을 갖는다면 두 서열은 "실질적으로 동일"하다. 임의로, 동일성은 적어도 약 30개의 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20개, 50개, 200개 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교의 경우, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열의 비교 대상인 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열과 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "비교 창"은 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 수의 인접 위치의 분절에 대한 참조를 포함하고, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법의 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 설명되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양의 값 임계 점수 T와 일치하거나 이를 충족시키는, 쿼리 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 식별하여 고득점 서열쌍(HSP)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 인접 단어 점수 임계값으로 지칭된다(상기 Altschul 등의 문헌). 이러한 초기 인접 단어 적중은 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한, 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 누적 점수는 파라미터 M(한 쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 채점 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향의 단어 적중의 확장은 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 X 양만큼 떨어지는 경우; 하나 이상의 음수 채점 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달한 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 또는 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 단어 길이 3, 기대값(E) 10, BLOSUM62 채점 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘이 제공하는 유사성의 한 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 또한, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12, 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 BLOSUM62 행렬 또는 PAM250 행렬, 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 제공)의 GAP 프로그램에 통합된 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)])을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 언급된 서열 동일성의 백분율 외에, 두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 후술하는 바와 같이, 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체와 면역학적으로 교차반응성이라는 것이다. 따라서, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환만이 상이한 경우에, 폴리펩티드는 일반적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 두 분자 또는 이들의 보체가 후술하는 바와 같이, 엄격한 조건하에 서로 혼성화한다는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되며, 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 합성, 천연 발생, 및 비천연 발생적이고, 기준 핵산과 결합 특성이 유사하며, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 제한 없이 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열뿐만 아니라 명백하게 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로는, 이하에 상술하는 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; 및 Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98]).
핵산과 관련하여 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예: DNA) 분절 간의 기능적 관계를 나타낸다. 일반적으로, 이는 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있다(즉, 이들은 시스(cis)-작용성이다). 그러나, 인핸서와 같은 일부 전사 조절 서열은 전사를 강화하는 암호화 서열에 물리적으로 인접해 있거나 매우 근접한 위치에 있을 필요가 없다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 약물 접합체" 또는 "면역접합체"는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법제, 독소, 면역요법제, 이미징 프로브 등과 같은 다른 제제의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합, 또는 비공유적 상호 작용, 예컨대 정전기력을 통한 비공유적 상호작용일 수 있다. 항체 약물 접합체를 형성하기 위해, 당업계에 알려진 다양한 링커가 사용될 수 있다. 추가적으로, 항체 약물 접합체는 면역접합체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 융합 단백질 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 본래는 별개의 단백질(펩티드 및 폴리펩티드를 포함)을 암호화하는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 단편의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 융합 유전자의 번역은 원래 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 단백질을 생성한다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독소" 또는 "세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 해롭고, 세포 또는 악성종양의 감소, 억제, 또는 파괴 작용을 할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항암제"는 세포독성제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선요법제, 표적항암제, 및 면역요법제를 포함하는(이에 한정되지 않음), 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "약물 모이어티" 또는 "페이로드"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 접합된 화학적 모이어티를 지칭하고, 임의의 치료제 또는 진단제, 예를 들어 항암제, 항염증제, 항감염제(예를 들어, 항진균제, 항균제, 항기생충제, 항바이러스제), 또는 마취제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약물 모이어티는 세포독소와 같은 항암제일 수 있다. 특정 구현예에서, 약물 모이어티는 V-ATPase 억제제, HSP90 억제제, IAP 억제제, mTor 억제제, 미세소관 안정화제, 미세소관 불안정화제, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 메이탄시노이드, MetAP (메티오닌 아미노펩티다제), RNA 폴리머라제 억제제, 피롤로벤조디아제핀(PBD), 아마니틴, CRM1의 핵 유출의 억제제, DPPIV 억제제, 미토콘드리아에서의 포스포릴 전달 반응 억제제, 단백질 합성 억제제, 키나제 억제제, CDK2 억제제, CDK9 억제제, 프로테아솜 억제제, 키네신 억제제, HDAC 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터칼레이터, DNA 마이너 그루브 바인더, 및 DHFR 억제제로부터 선택된다. 이들 각각을 본 발명의 항체 및 방법에 적합한 링커에 부착시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457] 참조. 또한, 페이로드는 생물물리학적 프로브, 형광단, 스핀 표지, 적외선 프로브, 친화성 프로브, 킬레이터, 분광 프로브, 방사성 프로브, 지질 분자, 폴리에틸렌 글리콜, 중합체, 스핀 표지, DNA, RNA, 단백질, 펩티드, 표면, 항체, 항체 단편, 나노입자, 양자점, 리포솜, PLGA 입자, 당류, 또는 다당류일 수 있다.
용어 "메이탄시노이드 약물 모이어티"는 메이탄시노이드 화합물의 구조를 갖는 항체-약물 접합체의 하부구조를 의미한다. 메이탄신은 동아프리카 관목 Maytenus serrata로부터 처음 단리되었다(미국 특허번호 3,896,111). 그 후, 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생성한다는 것이 발견되었다(미국 특허번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 보고된 바 있다. 문헌[미국 특허번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533, 및 Kawai et al., (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451] 참조(각각은 참조로 명시적으로 포함됨). 접합에 유용한 특정 메이탄시노이드의 예는 DM1, DM3, 및 DM4를 포함한다.
"종양"은 악성이든 양성이든 신생물 세포 성장 및 증식, 그리고 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.
용어 "항종양 활성"은 종양 세포 증식 속도, 생존율, 또는 전이 활성의 감소를 의미한다. 예를 들어, 항종양 활성은 치료 중 발생하는 비정상 세포의 성장속도 감소 또는 종양 크기 안정성 또는 감소, 또는 치료가 없는 대조군과 비교하여 치료로 인한 더 긴 생존에 의해 나타날 수 있다. 이러한 활성은 이종이식 모델, 동종이식 모델, MMTV 모델, 및 항종양 활성을 조사하기 위한 당업계에 알려진 기타 공지된 모델을 비롯한(이에 한정되지 않음), 허용되는 시험관내 또는 생체내 종양 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "악성종양"은 비양성 종양 또는 암을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 조절되지 않거나 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 악성종양을 포함한다. 예시적인 암은 암종, 육종, 백혈병, 및 림프종을 포함한다.
용어 "암"은 원발성 악성 종양(예를 들어, 종양 세포가 원래 종양 부위 이외의 대상체 신체 부위로 이동하지 않은 종양), 및 2차 악성 종양(예를 들어, 종양 세포가 원래 종양 부위와 상이한 2차 부위로 이동하는 전이로부터 발생한 종양)을 포함한다.
용어 "CCR7"(BLR2, CC-CKR-7, CCR-7, CD197, CDw197, CMKBR7, EBI1, 또는 C-C 모티프 케모카인 수용체 7로도 알려짐)은 G 단백질-결합 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. 인간 CCR7의 핵산 및 아미노산 서열은 수탁번호 NP_001829, NP_001288643, NP_001288645, NP_001288646, NP_001288647(아미노산 서열), 및 NM_001838, NM_001301714, NM_001301716, NM_001301717, NM_001301718(뉴클레오티드 서열)로 GenBank에 게시되었다. 본원에서 사용되는 용어 "CCR7"은 CCR7 단백질의 모든 천연 발생 이소형, 또는 이의 변이체를 집합적으로 지칭하는 데 사용된다.
용어 "변이체"는 기준 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지거나, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 변이체는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 보유하면서, 기준 폴리펩티드에 대해 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애의 "치료"라는 용어는 일 구현예에서 질환 또는 장애의 개선(즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 진행의 둔화, 저지, 또는 감소)을 의미한다. 다른 구현예에서, "치료"는 환자가 식별하지 못할 수도 있는 것을 포함하여 적어도 하나의 물리적 파라미터의 완화 또는 개선을 의미한다. 또 다른 구현예에서, "치료"는 질환 또는 장애의 물리적(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다에 의한 조절을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애의 "예방"이라는 용어는 질환 또는 장애의 예방적 치료; 또는 질환 또는 장애의 발병이나 진행의 지연을 의미한다.
용어 "치료적으로 허용가능한 양" 또는 "치료 유효량"은 상호교환적으로, 목적하는 결과(즉, 종양 크기 감소, 종양 성장 억제, 전이 방지, 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충 감염의 억제 또는 예방)를 발생시키기에 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 허용가능한 양은 바람직하지 않은 부작용을 유도하거나 유발하지 않는다. 일부 구현예에서, 치료적으로 허용가능한 양은 환자의 상태를 고려하여 의료 제공자에 의해 허용될 수 있는 부작용만을 유도하거나 유발한다. 치료적으로 허용가능한 양은, 먼저 낮은 용량을 투여한 후, 원하는 효과가 달성될 때까지 해당 용량을 점진적으로 증가시켜 결정할 수 있다. 본 발명의 분자의 "예방적 유효 투여량" 및 "치료적 유효 투여량"은 각각, 암과 관련된 증상을 포함한 질환 증상의 발병을 방지하거나 이의 중증도를 감소시킬 수 있다.
용어 "공동 투여"는 개체의 혈액에 2가지 활성제가 존재함을 의미한다. 공동 투여되는 활성제는 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
본 발명은 CCR7에 결합하는 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 이의 약물 접합체, 즉, 항체 약물 접합체 또는 ADC를 제공한다. 특히, 본 발명은 CCR7에 결합하고 이러한 결합에 내재화하는 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 항체 약물 접합체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 바람직한 약동학적 특성 및 기타 바람직한 속성을 갖고 따라서 CCR7을 발현하는 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 항체 약물 접합체를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물, 및 암의 치료 또는 예방을 위한 이러한 약학적 조성물의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
항체 약물 접합체
본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편 또는 이의 기능적 등가물이 약물 모이어티에 연결된, 면역접합체라고도 하는 항체 약물 접합체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 이의 기능적 등가물은 링커에 의한 공유 부착을 통해 항암제인 약물 모이어티에 연결된다. 본 발명의 항체 약물 접합체는 효과적인 용량의 항암제(예를 들어, 세포독성제)를 CCR7을 발현하는 종양 조직에 전달할 수 있으므로, 더 큰 선택성(및 더 낮은 유효 용량)이 달성될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 면역접합체를 제공하며,
Figure pct00013
식에서 Ab는 본원에 기재된 CCR7 결합 항체를 나타내고;
L은 링커이고;
D는 약물 모이어티이고;
m은 1 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 2, 3, 또는 4이다. 일부 구현예에서, m은 1이고; 다른 구현예에서 m은 2, 3, 또는 4이다.
약물 대 항체 비는 특정 접합체 분자의 경우 정확한 값을 갖지만(예를 들어, 화학식 I의 n과 m의 곱), 이 값이 많은 분자를 함유하는 샘플을 설명하는 데 사용될 때에는 일반적으로 접합 단계와 관련된 어느 정도의 이질성으로 인해 종종 평균값일 것임이 이해된다. 면역접합체의 샘플에 대한 평균 로딩은 본원에서 약물 대 항체 비 또는 "DAR"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 약물이 메이탄시노이드인 경우 "MAR"로 지칭된다. 일부 구현예에서, DAR은 약 2 내지 약 6이고, 일반적으로는 약 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0이다. 일부 구현예에서, 샘플의 적어도 50 중량%는 평균 DAR ± 2를 갖는 화합물이고, 바람직하게는 샘플의 적어도 50%는 평균 DAR ± 1을 함유하는 접합체이다. 구현예는 DAR이 약 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 또는 3.9인 면역접합체를 포함한다. 일부 구현예에서, '약 n'의 DAR은 DAR에 대한 측정값이 n의 20% 이내임을 의미한다.
본 발명은 또한, 약물 모이어티에 연결 또는 접합된, 본원에 개시된 바와 같은 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 및 이의 기능적 등가물을 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 약물 모이어티 D는 하기 구조를 갖는 것들을 포함하는 메이탄시노이드 약물 모이어티이며,
Figure pct00014
식에서 물결선은 항체 약물 접합체의 링커에 대한 메이탄시노이드의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. 각 경우의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다. 아미드기를 황 원자에 부착시키는 알킬렌 사슬은 메타닐, 에타닐, 또는 프로필일 수 있다(즉, r은 1, 2, 또는 3임). (미국 특허번호 633,410, 미국 특허번호 5,208,020, Chari et al. (1992) Cancer Res. 52;127-131, Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623).
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성체가 본 발명의 면역접합체에 대해 고려된다(즉, 메이탄시노이드의 키랄 탄소에서의 R 및 S 배열의 임의의 조합). 일 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 입체화학을 갖는다.
Figure pct00015
일 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 N2'-데아세틸-N 2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1으로도 알려짐)이다. DM1은 하기 구조식으로 표시된다.
Figure pct00016
다른 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 N2'-데아세틸-N 2'-(4-머캅토-1-옥소펜필)-메이탄신(DM3로도 알려짐)이다. DM3는 하기 구조식으로 표시된다.
Figure pct00017
다른 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 N2'-데아세틸-N 2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜필)-메이탄신(DM4로도 알려짐)이다. DM4는 하기 구조식으로 표시된다.
Figure pct00018
약물 모이어티 D는 링커 L을 통해 항체 Ab에 연결될 수 있다. L은 공유 결합을 통해 약물 모이어티를 항체에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 가교제는 약물 모이어티와 항체를 연결하여 항체 약물 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 시약이다. 항체 약물 접합체는 약물 모이어티 및 항체 둘 다에 결합할 수 있는 반응성 작용기를 갖는 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 시스테인, 티올, 또는 아민, 예를 들어 N-말단 또는 아미노산 측쇄, 예컨대 항체의 라이신이 가교제의 작용기와 결합을 형성할 수 있다. 대안적으로, 링커-약물 모이어티(또는 약물-링커 모이어티, 두 용어는 상호교환적으로 사용됨)를 미리 형성하고 링커-약물 모이어티를 항체와 반응시켜 항체 약물 접합체를 제조할 수 있다. 일부 예에서, 링커 모이어티는 목적하는 링커-약물 모이어티를 얻을 때까지 여러 연결 모이어티를 사용하여 단계적으로 약물 상에 구축된다.
일 구현예에서, L은 절단성 링커이다. 다른 구현예에서, L은 비절단성 링커이다. 일부 구현예에서, L은 산-불안정성 링커, 광-불안정성 링커, 펩티다제 절단성 링커, 에스테라제 절단성 링커, 이황화 결합 절단성 링커, 친수성 링커, 전하전 링커, 글리코시다제 절단성 링커, 포스포디에스테라제 절단성 링커, 포스파타제 절단성 링커, 또는 디카복실산계 링커이다.
약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드)와 항체 사이에 비절단성 링커를 형성하는 적합한 가교제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 황 원자를 포함하는 비절단성 링커(예: SMCC) 또는 황 원자가 없는 비절단성 링커를 형성할 수 있다. 약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드)와 항체 사이에 비절단성 링커를 형성하는 바람직한 가교제는 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티를 포함한다. 본 발명에 따르면, 이러한 비절단성 링커는 말레이미도계 또는 할로아세틸계 모이어티로부터 유도되는 것으로 언급된다.
말레이미도계 모이어티를 포함하는 가교제는 N-석신이미딜-4-(말레이미도메틸)시클로헥산카복실레이트(SMCC), 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC), SMCC의 "장쇄" 유사체(LC-SMCC)인 N-석신이미딜-4-(말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트), κ-말레이미도운데콘산 N-석신이미딜 에스테르(KMUA), γ-말레이미도부티르산 N-석신이미딜 에스테르(GMBS), ε-말레이미도카프로산 N-석신이미딜 에스테르(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-석신이미드 에스테르(AMSA), 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트(SMPB), N-(-p-말레오미도페닐)이소시아네이트(PMIP), 및 MAL-PEG-NHS와 같은, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 함유하는 말레이미도계 가교제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 가교제는 말레이미도계 모이어티로부터 유도된 비절단성 링커를 형성한다. 말레이미도계 가교제의 대표적인 구조는 아래와 같다.
Figure pct00019
다른 구현예에서, 링커 L은 N-석신이미딜-4-(말레이미도메틸)시클로헥산카복실레이트(SMCC), 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC), 또는 MAL-PEG-NHS로부터 유도된다.
할로아세틸계 모이어티를 포함하는 가교제는 N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), N-석신이미딜 브로모아세테이트(SBA), 및 N-석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP)를 포함한다. 이러한 가교제는 할로아세틸계 모이어티로부터 유도된 비절단성 링커를 형성한다. 할로아세틸계 가교제의 대표적인 구조는 아래와 같다.
Figure pct00020
일 구현예에서, 링커 L은 N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA) 또는 N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)로부터 유도된다.
약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드)와 항체 사이에 절단성 링커를 형성하는 적합한 가교제는 당업계에 잘 알려져 있다. 이황화물 함유 링커는 생리학적 조건하에 발생할 수 있는 이황화물 교환을 통해 절단가능한 링커이다. 본 발명에 따르면, 이러한 절단성 링커는 이황화물계 모이어티로부터 유도되는 것으로 언급된다. 적합한 이황화물 가교제는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB), 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포-부타노에이트(설포-SPDB)를 포함하며, 그 구조는 아래와 같다. 이러한 이황화물 가교제는 이황화물계 모이어티로부터 유도된 절단성 링커를 형성한다.
Figure pct00021
N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP),
Figure pct00022
N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP),
Figure pct00023
N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB), 및
Figure pct00024
N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포-부타노에이트(설포-SPDB).
일 구현예에서, 링커 L은 N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB)로부터 유도된다.
약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드)와 항체 사이에 하전된 링커를 형성하는 적합한 가교제는 전하전 가교제로 알려져 있다. 일 구현예에서, 링커 L은 전하전 가교제 CX1-1으로부터 유도된다. CX1-1의 구조는 아래와 같다.
Figure pct00025
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 17-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14-테트라옥소-4,7,10,13-테트라아자헵타데칸-1-오에이트(CX1-1)
상기 표시된 각각의 가교제는 가교제의 한쪽 말단에, 항체의 1차 아민과 반응하여 아미드 결합을 형성하는 NHS-에스테르를 함유하고, 다른 쪽 말단에, 메이탄시노이드 약물 모이어티의 설프히드릴과 반응하여 티오에테르 또는 이황화 결합을 형성하는 말레이미드기 또는 피리디닐디설파이드기를 함유한다.
다른 구현예에서, 약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드)와 항체 사이에 절단성 링커를 형성하는 적합한 가교 모이어티는 하기 화학식 II로 표시되며,
[화학식 II]
Figure pct00026
;
식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이다.
이 구현예의 일 양태에서, y는 5, 7, 9, 또는 11이다. 이 구현예의 다른 양태에서, y는 5 미만이다.
또 다른 구현예에서, 화학식 I에 따른 적합한 가교 모이어티는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
Figure pct00027
식에서 y는 1 내지 11이다.
상기 표시된 가교 모이어티(즉, MBT, MPET, MEPET; MMTBT, MPPT, MPBT)의 경우, 말레이미드기는 항체에서 시스테인의 설프히드릴(또는 티올)과 반응하여 티오에테르 결합을 형성할 수 있도록 하고; 가교 모이어티의 티올 작용기는 메이탄시노이드 약물 모이어티의 티올에 연결되어 절단성 이황화 결합을 형성한다. 화학식 I의 연결 모이어티의 교차반응 특성(티올과 말레이미드가 교차반응할 수 있음)의 관점에서, 당업자는 연결 모이어티가 반응식 1에 도시된 바와 같이 약물 모이어티 상에 단계적으로 구축되어야 함을 이해할 것이다.
상기 구현예에 따르면, 가교 모이어티(즉, MBT, MPET, MEPET)로부터 생성되는 링커는 다음과 같이 표시될 수 있으며,
[화학식 IIA]
Figure pct00028
;
식에서 *는 항체 상의 티올 작용기에 연결되고, **는 약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1, DM3, 또는 DM4)의 티올 작용기에 연결된다.
상기 구현예에 따르면, 가교 모이어티(즉, MBT, MPET, MEPET)로부터 생성되는 링커는 다음과 같이 표시될 수 있으며,
Figure pct00029
식에서 y는 1 내지 11이고; *는 항체 상의 티올 작용기에 연결되고, **는 약물 모이어티(예를 들어, 메이탄시노이드 약물 DM1, DM3, 또는 DM4)의 티올 작용기에 연결된다.
바람직한 구현예에서, 링커는 하기 화학식을 가지며,
Figure pct00030
;
식에서 *는 항체 상의 티올 작용기에 연결되고, **는 메이탄시노이드 약물(DM1, DM3, 또는 DM4)의 티올 작용기에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식의 링커-약물 모이어티에 관한 것이며,
Figure pct00031
; 식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본원의 반응식 1에 개시된 바와 같은 상기 링커-약물 접합체의 단계적 형성에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 III, IV, 및 V 중 하나를 갖는 링커-약물 모이어티 화합물에 관한 것이며,
Figure pct00032
식에서 L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식으로부터 선택되는 링커-약물 모이어티 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00033
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식으로부터 선택되는 링커-약물 모이어티 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00034
다른 구현예에서, 본 발명의 링커-약물은 하기 화학식 중 어느 하나로 표시되며,
Figure pct00035
;
식에서 y는 1 내지 11, 바람직하게는 1 내지 5이다.
일 구현예에서, 본 발명의 링커-약물은 하기 구조식 중 어느 하나로 표시된다:
Figure pct00036
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되며,
Figure pct00037
Figure pct00038
식에서
Ab는 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 1차 아민과의 아미드 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 링커-약물(L-D-) 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 화학식 VI, VII, 및 VIII 중 어느 하나로 표시되며,
Figure pct00039
;
식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이고;
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 1차 아민과의 아미드 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 링커-약물(L-D-) 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 화학식 VI의 접합체의 석신이미드의 개방 형태에 상응하는 하기 화학식 VIA 또는 VIB를 가지며,
Figure pct00040
;
식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이고;
Ab는 항체 또는 항원 결합 단편이고;
Ab의 1차 아민과의 아미드 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 링커-약물(L-D-) 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 화학식 VII의 접합체의 석신이미드의 개방 형태에 상응하는 하기 화학식 VIIA 또는 VIIB를 가지며,
Figure pct00041
;
식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이고;
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 1차 아민과의 아미드 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 링커-약물(L-D) 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 화학식 VIII의 접합체의 석신이미드의 개방 형태에 상응하는 하기 화학식 VIIIA, VIIIB를 가지며,
Figure pct00042
;
식에서
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이고;
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 1차 아민과의 아미드 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 링커-약물(L-D-) 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일 구현예에서, n은 1 내지 10, 2 내지 8, 또는 2 내지 5의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 링커-약물 모이어티가 석신이미드를 통해 항체에 부착된 본원에 개시된 각각의 항체 약물 접합체는 또한, 화학식 VIA, VIB, VIIA, VIIB, VIIIA, 및 VIIIB에 일반적으로 표시된 바와 같은 석신이미드의 개방 형태로 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되며,
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
;
식에서
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 설프히드릴과의 티오에스테르 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 D-L 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 12, 또는 1 내지 8, 또는 바람직하게는 1 내지 4의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 구조식 중 어느 하나:
Figure pct00047
및 석신이미드의 상응하는 개방 형태로 표시되며,
식에서
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 설프히드릴과의 티오에스테르 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 D-L 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 12, 또는 1 내지 8, 또는 바람직하게는 1 내지 4의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 구조식 중 어느 하나:
Figure pct00048
;
및 석신이미드의 상응하는 개방 형태로 표시되며,
식에서
y는 1 내지 11, 바람직하게는 1 내지 5이고;
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 설프히드릴과의 티오에스테르 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 D-L 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 12, 또는 1 내지 8, 또는 바람직하게는 1 내지 4의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 화학식:
Figure pct00049
및 석신이미드의 상응하는 개방 형태로 표시되며,
식에서
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 설프히드릴과의 티오에스테르 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 D-L 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 12, 또는 1 내지 8, 또는 바람직하게는 1 내지 4의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 화학식으로 표시되며,
Figure pct00050
식에서
Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
Ab의 설프히드릴과의 티오에스테르 결합의 형성을 통해 Ab에 부착되는 D-L 기의 수를 나타내는 n은 1 내지 20의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 12의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 8의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 4의 정수이다. 특정 구현예에서, n은 3 또는 4이다. 다른 구현예에서, 평균 n 값은 약 3 내지 약 4이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종양 세포에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CCR7에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 P-카드헤린, 카드헤린 6, FGFR2, 또는 FGFR4에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 접합체 내 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 대 항체의 평균 몰비(즉, 메이탄시노이드 항체 비(MAR)로도 알려진 평균 n 값)는 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 8(예를 들어, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 또는 8.1), 약 2.5 내지 약 7, 약 3 내지 약 5, 약 2.5 내지 약 4.5(예를 들어, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5), 약 3.0 내지 약 4.0, 약 3.2 내지 약 4.2, 또는 약 4.5 내지 5.5(예를 들어, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 또는 약 5.5)이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 접합체는 실질적으로 높은 순도를 가지며, 다음 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) 접합체 종의 약 90% 초과(예를 들어, 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%), 바람직하게는 약 95% 초과가 단량체임, (b) 접합체 제제 내의 비접합 링커 수준이 약 10% 미만(예를 들어, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%)임(전체 링커 대비), (c) 접합체 종의 10% 미만(예를 들어, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만, 또는 0%)이 가교됨, (d) 접합체 제제 내의 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 수준이 약 2% 미만(예를 들어, 약 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 이하, 또는 0%)임(전체 세포독성제에 대한 mol/mol), 및/또는 (e) 보관시(예를 들어, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 또는 약 5년 후) 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 수준의 실질적 증가가 발생하지 않음. 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 수준의 "실질적 증가"는 특정 보관 시간(예를 들어, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 또는 약 5년) 후, 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 수준의 증가가 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2.0%, 약 2.2%, 약 2.5%, 약 2.7%, 약 3.0%, 약 3.2%, 약 3.5%, 약 3.7%, 또는 약 4.0% 미만임을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "비접합 링커"는 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)로부터 유도된 링커와 공유 연결된 항체로서, 링커를 통해 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)에 공유 결합되지 않은 항체를 지칭한다(즉, "비접합 링커"는 Ab-MCC, Ab-SPDB, 또는 Ab-CX1-1으로 표시될 수 있음).
1. 약물 모이어티
본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명의 항체 약물 접합체는 약물 모이어티, 예를 들어 항암제, 자가면역 치료제, 항염증제, 항진균제, 항균제, 항기생충제, 항바이러스제, 또는 마취제에 접합되는 항-CCR7 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물을 포함한다. 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 여러 동일한 또는 상이한 약물 모이어티에 접합될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체의 약물 모이어티는 V-ATPase 억제제, 아폽토시스 촉진제, Bcl2 억제제, MCL1 억제제, HSP90 억제제, IAP 억제제, mTor 억제제, 미세소관 안정화제, 미세소관 불안정화제, RNA 폴리머라제 억제제, 아마니틴, 피롤로벤조디아제핀, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 메이탄시노이드, MetAP(메티오닌 아미노펩티다제), 단백질 CRM1의 핵 유출의 억제제, DPPIV 억제제, Eg5 억제제, 프로테아솜 억제제, 미토콘드리아에서의 포스포릴 전달 반응 억제제, 단백질 합성 억제제, 키나제 억제제, CDK2 억제제, CDK9 억제제, 키네신 억제제, HDAC 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터칼레이터, DNA 마이너 그루브 바인더, 및 DHFR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체의 약물 모이어티는 PCT 공개번호 WO 2015/095301 및 WO2015/189791에 개시된 아우리스타틴이며, 두 출원은 모두 본원에 참조로 포함된다. 아우리스타틴 약물 모이어티-링커 구성체의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00051
(본 출원에 개시된 바와 같은 AURIX2); 및
Figure pct00052
(본 출원에 개시된 바와 같은 AURIX1).
일 구현예에서, 본 발명의 면역접합체의 약물 모이어티는 DM1, DM3, 또는 DM4와 같은(이에 한정되지 않음) 메이탄시노이드 약물 모이어티이다.
또한, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 사이토카인, 아폽토시스제, 항혈관형성제와 같은 단백질, 또는 예를 들어 림포카인과 같은 생물학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 세포독소, 약물(예를 들어, 면역억제제), 또는 방사성독소와 같은 약물 모이어티에 접합된다. 세포독소의 예는 탁산(예를 들어, 국제(PCT) 특허출원번호 WO 01/38318 및 PCT/US03/02675 참조), DNA-알킬화제(예를 들어, CC-1065 유사체), 안트라사이클린, 튜불리신 유사체, 듀오카마이신 유사체, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, 메이탄시노이드, 및 반응성 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 세포독성제(예를 들어, 문헌[Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000), Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000), Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991), Francisco et al., Blood (2003)(인쇄물 공보 전 전자 공보), 미국 특허번호 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738, 및 6,436,931, 미국 특허출원 공개번호 2001/0036923 A1, 계류 중인 미국 특허출원 일련번호 10/024,290 및 10/116,053, 및 국제(PCT) 특허출원번호 WO 01/49698]), 탁손, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, t. 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 치료제는 또한 예를 들어 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 제거제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오테파 클로람부실, 메이팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전 명칭은 다우노마이신) 및 독소루비신)), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 명칭은 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. (예를 들어, Seattle Genetics의 US20090304721 참조).
본 발명의 항체, 항체 단편(항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물에 접합될 수 있는 세포독소의 다른 예는 듀오카마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 이들의 유도체를 포함한다.
항체에 치료제를 접합하기 위한 다양한 유형의 세포독소, 링커, 및 방법이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264] 참조).
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 또한 방사성 동위원소에 접합되어 방사성 면역접합체라고도 하는 세포독성 방사성 약제를 생성할 수 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 요오드-131, 인듐-111, 이트륨-90, 및 루테튬-177을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 방사성 면역접합체의 제조 방법은 당업계에 확립되어 있다. 방사성 면역접합체의 예는 ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals) 및 BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)을 포함하여, 상업적으로 이용가능하며, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성 면역접합체를 제조하기 위해 유사한 방법들이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 거대고리 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며 문헌[Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; 및 Zimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재되어 있고, 각 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능성 등가물은 또한, 이종 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩티드)에 접합되어 융합 단백질을 생성할 수 있다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)(예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인, 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭됨) 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 또는 이의 단편). 일반적으로 문헌[미국 특허번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313] 참조(이들 특허 및 공개문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 항체 또는 이의 단편, 또는 암호화된 항체 및 이의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입, 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이유발 처리됨으로써 변경될 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 구성요소, 모티프, 섹션, 파트, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 접합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드(서열번호 628), 예컨대 pQE 벡터에 제공된 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)이며, 그 외 많은 것들이 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어 문헌[Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘(서열번호 628)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는, 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 혈구응집소("HA") 태그(문헌[]) 및 "FLAG" 태그(문헌[A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001])를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 효능을 향상시키기 위해 종양-침투 펩티드에 접합될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 진단 시약 또는 검출가능한 시약에 접합된다. 이러한 면역접합체는 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발달, 진행, 및/또는 중증도의 모니터링 또는 예측, 예컨대 특정 요법의 효능 확인에 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제와 같은(이에 한정되지 않음) 다양한 효소; 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴과 같은(이에 한정되지 않음) 보결분자단; Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 또는 피코에리트린과 같은(이에 한정되지 않음) 형광 물질; 루미놀과 같은(이에 한정되지 않음) 발광 물질; 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린과 같은(이에 한정되지 않음) 생체발광 물질; 요오드(131I, 125I, 123I, 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 64Cu, 113Sn, 및 117Sn과 같은(이에 한정되지 않음) 방사성 물질; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영술을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 비롯한(이에 한정되지 않음) 검출가능한 물질에 항체를 결합시켜 달성될 수 있다.
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물은 또한, 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
2. 링커
본원에서 사용되는 바와 같이, "링커"는 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편) 또는 기능적 등가물을 약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성 상태로 남아있는 조건에서, 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스테라제-유도 절단, 글리코시다제-유도 절단, 포스포디에스테라제-유도 절단, 포스파타제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단과 같은 절단에 취약할 수 있다(절단성 링커). 대안적으로, 링커는 절단에 실질적으로 저항성일 수 있다(예를 들어, 안정한 링커 또는 비절단성 링커). 일부 양태에서, 링커는 전하전 링커, 친수성 링커, 또는 디카복실산계 링커이다.
일 양태에서, 본 발명에 사용되는 링커는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB), N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포-부타노에이트(설포-SPDB), N-석신이미딜 요오도아세테이트(SIA), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB), 말레이미드 PEG NHS, N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카복실레이트(SMCC), N-설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카복실레이트(설포-SMCC), 또는 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 17-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14-테트라옥소-4,7,10,13-테트라아자헵타데칸-1-오에이트(CX1-1)와 같은 가교제로부터 유도된다.
비절단성 링커는 메이탄시노이드와 같은 약물을 안정한 공유 방식으로 항체에 연결할 수 있고 절단성 링커에 대해 상기 열거된 범주에 속하지 않는 임의의 화학적 모이어티이다. 따라서, 비절단성 링커는 산-유도 절단, 광-유도 절단, 펩티다제-유도 절단, 에스테라제-유도 절단, 및 이황화 결합 절단에 실질적으로 저항성이다. 또한, 비절단성은 메이탄시노이드와 같은 약물 또는 항체가 활성을 잃지 않는 조건에서, 산, 광불안정성 절단제, 펩티다제, 에스테라제, 또는 이황화 결합을 절단하는 화학적 또는 생리학적 화합물에 의해 유도되는 절단을 견디는 링커 내 또는 링커에 인접한 화학 결합의 능력을 의미한다.
산-불안정성 링커는 산성 pH에서 절단가능한 링커이다. 예를 들어, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특정 세포내 구획은 산성 pH(pH 4~5)를 가지며, 산-불안정성 링커를 절단하기에 적합한 조건을 제공한다.
광-불안정성 링커는 빛에 접근가능한 많은 체강 및 신체 표면에서 유용한 링커이다. 또한, 적외선은 조직을 투과할 수 있다.
일부 링커는 펩티다제에 의해 절단될 수 있다(즉, 펩티다제 절단성 링커). 특정 펩티드만이 세포 내부 또는 외부에서 쉽게 절단된다(예를 들어, 문헌[Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982) 및 Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)] 참조). 또한, 펩티드는 α-아미노산 및 펩티드 결합으로 구성되며, 펩티드 결합은 화학적으로 한 아미노산의 카복실레이트와 두 번째 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합이다. 카복실레이트와 라이신의 ε-아미노기 사이의 결합과 같은 다른 아미드 결합은 펩티드 결합이 아닌 것으로 이해되며, 비절단성인 것으로 간주된다.
일부 링커는 에스테라제에 의해 절단될 수 있다(즉, 에스테라제 절단성 링커). 다시 말하지만, 특정 에스테르만이 세포 내부 또는 외부에 존재하는 에스테라제에 의해 절단될 수 있다. 에스테르는 카복실산과 알코올의 축합에 의해 형성된다. 단순 에스테르는 단순 알코올, 예컨대 지방족 알코올, 작은 고리형 및 작은 방향족 알코올로 생성된 에스테르이다.
전하전 링커는 항체 약물 접합체에 혼입된 후에도 전하를 유지하는 하전된 가교제로부터 유도된다. 전하전 링커의 예는 US 2009/0274713에서 확인할 수 있다.
3. 접합 및 ADC의 제조
링커-페이로드를 항원 결합 모이어티에 접합시키는 많은 방법이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Antibody-Drug Conjugate, Methods in Molecular Biology, Vol. 1045, Editor L. Ducry, Humana Press (2013)]에서 검토). 통상적으로, 약물은 항체의 천연 라이신 또는 천연 시스테인 잔기에 접합된다. 생성된 제제는 복잡한 혼합물이다. 보다 최근에는 ADC 제제의 치료 지수 및 균질성을 개선하기 위해 부위-특이적 접합 방법이 사용되고 있다(검토: 문헌[Panowski, S.; Bhakta, S.; Raab, H.; Polakis, P.; Junutula, J. R. mAbs 2014, 6, 34]). 글리코엔지니어링(문헌[Zhou, Q. et al. Bioconjugate chemistry 2014, 25, 510; Zhu, Z. et al. mAbs 2014, 6, 1190]) 외에도, 부위-특이적 ADC를 제조하는 보다 일반적인 방법 중 일부는 조작된 시스테인(문헌[Junutula, J. R. et al., Nature biotechnology 2008, 26, 925; Shinmi, D. et al., Bioconjugate chemistry 2016, 27, 1324]), 비표준 아미노산(문헌[Tian, F. et al., Proceedings National Academy of Sciences USA 2014, 111, 1766; Axup, J. Y. et al., Proceedings National Academy of Sciences USA 2012, 109, 16101]), 또는 짧은 펩티드 서열(문헌[Drake, P. M. et al., Bioconjugate chemistry 2014, 25, 1331; Strop, P. et al., Chemistry & biology 2013, 20, 161; Beerli, R. R. et al., PloS one 2015, 10, e0131177; Grunewald, J. et al., Bioconjugate chemistry 2015, 26, 2554])을 항체 백본에 통합하는 것을 기반으로 한다. 이러한 방법은 화학양론 및 세포독소의 부착 부위에 대한 제어를 제공하여, 통상적으로 제조된 ADC에 비해 접합체의 약동학(PK), 안전성, 및 효능 프로파일이 더 우수하다.
본 발명의 접합체는 미국 특허번호 7,811,572, 6,411,163, 7,368,565 및 8,163,888, 미국 출원공개 2011/0003969, 2011/0166319, 2012/0253021 및 2012/0259100, 및 PCT 공개 WO2014/124316 및 WO2015/138615에 기재된 방법과 같은, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 특허 및 특허출원 공개의 전체 교시는 본원에 참조로 포함된다.
조작된 시스테인 항체 잔기에 대한 접합 방법
본 발명의 접합체는 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 항체로 조작된 시스테인 잔기를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 부위-특이적 접합체는 균질하고, 개선된 특성을 갖는다(문헌[Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925-932]).
포유동물 세포에서 발현된 항체의 조작된 시스테인은 생합성 중에 글루타티온(GSH) 및/또는 시스테인과 같은 부가물(이황화물)에 의해 변형되기 때문에(문헌[Chen et al. 2009]), 초기에 발현된 생성물의 조작된 시스테인은 티올 반응성 시약, 예컨대 말레이미도 또는 브로모- 또는 요오도-아세트아미드기에 대해 비반응성이다. 발현 후 조작된 시스테인 잔기에 페이로드를 접합시키기 위해서는, 이러한 이황화물 부가물을 환원시켜 글루타티온 또는 시스테인 부가물을 제거할 필요가 있으며, 이는 또한 일반적으로 발현 단백질 내 천연 이황화물의 환원을 수반한다. 부가된 조작된 시스테인의 탈보호는 먼저 항체를 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT), TCEP, 또는 환원된 시스테인에 노출시킨 다음, 항체의 모든 천연 이황화 결합을 재산화시켜 기능적 항체 구조를 복원 및/또는 안정화시키는 방법에 의해 달성될 수 있다.
항체 약물 접합체의 제조를 위해 조작된 Cys 잔기로 항체를 환원시키고 재산화시키기 위해 여러 방법이 사용될 수 있다. 고농도의 CuSO4를 사용하여 이전에 문헌에 설명된 재산화 프로토콜을 따르려는 시도는 단백질 침전을 초래했다(문헌[Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925-932]). 본 발명자들은 환원 및 항체 재산화를 위한 여러 상이한 방법으로 항체 약물 접합체를 성공적으로 제조하고 수득했다.
일례로, 새로 제조된 DTT를 정제된 Cys 돌연변이 항체에 10 mM의 최종 농도로 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 DTT와 함께 인큐베이션한 후, 매일 완충액을 교환하면서 혼합물을 3일 동안 PBS에 대해 4℃에서 투석하여 DTT를 제거하고 항체의 천연 이황화 결합을 재산화시킨다. 대안적인 방법은 PBS로 평형화된 Sephadex G-25와 같은 탈염 컬럼을 통해 환원제를 제거하는 것이다. 단백질이 완전히 환원되면, 1 mM의 산화 아스코베이트(데하이드로-아스코브산)를 탈염된 샘플에 임의로 첨가하고 20~24시간 동안 재산화 인큐베이션을 수행한다.
다른 예시적인 방법에서, 조작된 Cys 잔기의 탈보호는 단백질 A-세파로스 수지에 결합된 항체에 20 mM 농도의 완전히 환원된 시스테인을 첨가함으로써 달성된다. Cys 부가물의 환원은 실온에서 약 30~60분 동안 인큐베이션하여 달성되고, 이후 환원제는 50개의 PBS 베드로 수지를 세척함으로써 신속하게 제거된다. 환원된 항체의 재산화는 세척된 슬러리를 실온에서 인큐베이션함(촉진제로서 50~2000 nM의 CuCl2가 첨가되거나 첨가되지 않음)으로써 달성된다. 황산구리의 사용을 제외하고, 본원의 예는 결과가 유사한 본원에 기재된 각각의 프로토콜을 사용한다. 재산화는 쇄내 이황화물을 복원하는 반면, 투석, 탈염, 또는 단백질 A 크로마토그래피는 환원제뿐만 아니라 항체의 조작된 시스테인에 처음에 연결된 시스테인 및 글루타티온을 제거한다. 재산화 과정을 모니터링하기 위해 일반적으로 HPLC 역상 크로마토그래피를 사용한다. 80℃로 가열된 PLRP-S 컬럼(4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, Agilent)에 항체를 로딩하고, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30~45% CH3CN의 선형 구배 및 215, 254, 및 280 nm에서의 피크 검출을 사용하여 1.5 mL/분으로 용리시킨다.
재산화 후, 미리 형성된 링커-약물 모이어티에 항체를 접합한다. 예를 들어, 미리 형성된 링커-약물 모이어티(예를 들어 MMTBT-DM4; MPET-DM4; MBT-DM4; MEPET-DM4, MPBT-DM1; 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 링커-약물 모이어티)를 PBS 완충액(pH 7.2) 중의 항체에 대해 10 몰당량으로 재산화 Cys 돌연변이 항체에 첨가한다. 인큐베이션은 1시간 동안 수행된다. 접합 과정은 접합된 항체를 접합되지 않은 항체와 분리할 수 있는 역상 HPLC로 모니터링된다. 80℃로 가열된 PRLP-S 컬럼(4000 Å, 50 mm x 2.1 mm, Agilent)에서 접합 반응 혼합물을 분석하고, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30~60% 아세토니트릴의 선형 구배에 의해 1.5 mL/분의 유량으로 컬럼의 용리를 수행한다. 컬럼으로부터의 단백질 용리는 280 nm, 254 nm, 및 215 nm에서 모니터링된다.
일 구현예에서, 시스테인 접합체에 대한 링커-약물 모이어티의 예는 반응식 1 내지 3에 따라 제조될 수 있다.
Figure pct00053
반응식 1
식에서
약물 모이어티는 티올 작용기를 통해 링커에 부착되고;
L1은 메틸렌기 중 하나가 산소로 대체될 수 있는 C1-6알킬렌이고;
L2는 C1-6알킬렌 또는 -(CH2CH2O)y-CH2-CH2-이고(y는 1 내지 11임);
X는 -C(O)-NH-, -NHC(O)-, 또는 트리아졸이고;
알킬렌은 선형 또는 분지형이고;
RG1 및 RG2는 X기를 형성하는 2개의 반응기이다.
아미드 또는 트리아졸을 형성하는 반응기는 당업계에 잘 알려져 있다.
링커-약물 모이어티를 미리 형성하는 일례는 반응식 2에 표시되어 있으며, 식에서 약물 모이어티는 DM4이고; RG1은 아미노기이고 RG2는 활성화된 산으로서, 아미드 결합(X)이 형성된다.
Figure pct00054
반응식 2
링커-약물 모이어티를 미리 형성하는 다른 예는 반응식 3에 표시되어 있으며, 식에서 약물 모이어티는 DM4이고; RG1은 아지드기이고 RG2는 알킨기로서, 테트라졸(X)이 형성된다.
Figure pct00055
반응식 3
Cys 돌연변이 항체에 연결된 말레이미드를 갖는 다양한 약물 모이어티의 접합 효율은 사용되는 약물 모이어티의 용해도에 따라 다르지만, 많은 반응에서 90% 초과의 접합체가 생성된다. 응집 상태를 평가하기 위해, 생성된 접합체를 PBS 중 0.1 ml/분의 유량으로 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(GE, Superdex200, 3.2/30)에서 분석한다. 모든 접합체는 주로 단량체이다. 대부분의 접합체는 3% 미만의 이량체 및 올리고머 물질을 함유하며, 이는 말레이미드가 연결된 약물 모이어티를 Cys 돌연변이 항체에 접합해도 응집을 일으키지 않음을 나타낸다.
면역접합체는 또한, 일반적으로 약물 대 항체 비(DAR)로 지칭되는, 항체 결합 모이어티에 대한 약물 모이어티의 평균 로딩 측면에서 특성화된다. DAR 값은 예를 들어, 환원 및 탈글리코실화된 샘플에 대한 LC-MS 데이터로부터 외삽된다. LC/MS는 ADC 내의 항체에 부착된 페이로드(약물 모이어티)의 평균 분자 수의 정량화를 가능하게 한다. HPLC는 항체를 경쇄와 중쇄로 분리하고, 또한 쇄당 링커-페이로드 기의 수에 따라 중쇄(HC)와 경쇄(LC)를 분리한다. 질량 스펙트럼 데이터는 혼합물의 성분 종, 예를 들어 LC, LC+1, LC+2, HC, HC+1, HC+2 등의 확인을 가능하게 한다. LC 및 HC 쇄의 평균 로딩으로부터, ADC에 대한 평균 DAR을 계산할 수 있다. 주어진 면역접합체 샘플에 대한 DAR은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 사량체 항체에 부착된 약물(페이로드) 분자의 평균 수를 나타낸다.
천연 시스테인 항체 잔기에 대한 접합 방법
본원에 기재된 바와 같은 링커-약물 모이어티는 또한 항체의 부분 환원을 포함하는 절차를 사용하여 비조작 항체의 천연 시스테인 잔기에 접합될 수 있다(문헌[Doronina, S. O., Toki, B. E., Torgov, M. Y., Mendelsohn, B. A., Cerveny, C. G., Chace, D. F., DeBlanc, R. L., Gearing,R. P., Bovee, T. D., Siegall, C. B., Francisco, J. A., Wahl, A. F., Meyer, D. L., and Senter, P. D. (2003) Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nat. Biotechnol. 21, 778-784]). 다음의 프로토콜은 이러한 접합체를 제조할 수 있는 방법에 대한 비제한적인 예이다: TCEP를 10 mM의 최종 농도로 첨가하고 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 항체의 쇄간 이황화 결합 및 쇄내 이황화 결합(일반적으로 5 내지 10 mg/ml의 농도)을 2 mM의 EDTA를 함유한 PBS에서 먼저 부분적으로 환원시킨다. 탈염 및 1% w/v의 PS-20 세정제 첨가 후, 부분 환원된 항체(1~2 mg/ml)를 항체 10 mg당 0.5 내지 1 mg의 말레이미드 함유 링커 페이로드 화합물과 4℃에서 밤새 반응시킨다. 생성된 접합체는 표준 방법에 의한 단백질 A 크로마토그래피로 정제되고 PBS로 완충액 교환되고, 일반적으로 약물 대 항체 비, 응집 경향, 및 소수성에 대한 질량 분석(MS), 분석용 크기 배제 크로마토그래피(AnSEC), 및 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피(AnHIC), 및 활성 분석에 의해 프로파일링된다.
라이신 항체 잔기에 대한 가교를 위한 1단계형 방법
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 항체의 라이신 잔기에 약물을 가교시키는 1단계형 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은, 하나 이상의 공용매를 임의로 함유하는 적합한 pH의 실질적으로 수성인 매질에서 항체, 약물, 및 가교제를 조합하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시켜 항체 및 약물을 포함하는 제1 혼합물을 형성한 다음, 항체 및 약물을 포함하는 제1 혼합물을 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시켜 (i) 접합체(예를 들어, Ab-MCC-DM1, Ab-SPDB-DM4, 또는 Ab-CX1-1-DM1), (ii) 유리 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4), 및 (iii) 반응 부산물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 1단계형 방법은 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 6 이상(예를 들어, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 7, 약 7 내지 약 9, 약 7 내지 약 8.5, 약 7.5 내지 약 8.5, 약 7.5 내지 약 8.0, 약 8.0 내지 약 9.0, 또는 약 8.5 내지 약 9.0)의 pH를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 세포 결합제를 약물(DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0의 pH를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포 결합제를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 7.8의 pH(예를 들어, 7.6 내지 8.0의 pH, 또는 7.7 내지 7.9의 pH)를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
1단계형 방법(즉, 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계)은 당업계에 알려진 임의의 적합한 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 1단계형 방법은 약 20℃ 이하(예를 들어, -10℃(예를 들어 세포독성제 및 이작용성 가교제를 용해시키는 데 사용되는 유기 용매의 존재에 의해 용액이 동결되는 것이 방지되는 경우) 내지 약 20℃, 약 0℃ 내지 약 18℃, 약 4℃ 내지 약 16℃), 실온(예를 들어, 약 20℃ 내지 약 30℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃), 또는 고온(예를 들어, 약 30℃ 내지 약 37℃)에서 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 1단계형 방법은 약 16℃ 내지 약 24℃(예를 들어, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 또는 약 25℃)의 온도에서 수행된다. 다른 구현예에서, 1단계형 방법은 약 15℃ 이하(예를 들어, 약 -10℃ 내지 약 15℃, 또는 약 0℃ 내지 약 15℃)의 온도에서 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 15℃, 약 14℃, 약 13℃, 약 12℃, 약 11℃, 약 10℃, 약 9℃, 약 8℃, 약 7℃, 약 6℃, 약 5℃, 약 4℃, 약 3℃, 약 2℃, 약 1℃, 약 0℃, 약 -1℃, 약 -2℃, 약 -3℃, 약 -4℃, 약 -5℃, 약 -6℃, 약 -7℃, 약 -8℃, 약 -9℃, 또는 약 -10℃(예를 들어 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, 설포-SPDB SPDB, 또는 CX1-1)를 용해시키는 데 사용되는 유기 용매의 존재에 의해 용액이 동결되는 것이 방지되는 경우)의 온도에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 -10℃ 내지 약 15℃, 약 0℃ 내지 약 15℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 10℃ 내지 약 15℃, 또는 약 5℃ 내지 약 10℃의 온도에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음, 약 10℃의 온도(예를 들어, 8℃ 내지 12℃의 온도, 또는 9℃ 내지 11℃의 온도)에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 접촉 단계는 항체를 제공한 다음, 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시켜 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 제1 혼합물을 형성하고, 이어서 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 제1 혼합물을 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시킴으로써 수행된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항체는 반응 용기에 제공되고, 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)은 반응 용기에 첨가되고(따라서 항체와 접촉됨), 이어서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)는 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물에 첨가된다(따라서 항체 및 약물을 포함하는 혼합물과 접촉됨). 일 구현예에서, 항체는 반응 용기에 제공되고, 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)은 항체를 용기에 제공한 직후에 반응 용기에 첨가된다. 다른 구현예에서, 항체는 반응 용기에 제공되고, 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)은 항체를 용기에 제공한 후 일정 시간 간격(예를 들어, 공간에 세포 결합제를 제공한 후 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 1일 이상) 이후에 반응 용기에 첨가된다. 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)은 빠르게(즉, 약 5분, 약 10분과 같은 짧은 시간 간격 내에) 또는 천천히(예를 들어, 펌프를 사용하여) 첨가될 수 있다.
항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물은 이어서, 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 직후에 또는 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 후 약간 이후(예를 들어, 약 5분 내지 약 8시간 이상) 시점에 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)는 항체를 포함하는 반응 용기에 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 첨가한 직후에, 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물에 첨가된다. 대안적으로, 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물은 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 후 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간 이상 이후에 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉될 수 있다.
항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물이 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉된 후, 반응은 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간 이상(예를 들어, 약 30시간, 약 35시간, 약 40시간, 약 45시간, 또는 약 48시간) 동안 진행된다.
일 구현예에서, 1단계형 방법은 임의의 미반응 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4) 및/또는 미반응 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)를 ?칭시키는 ?칭 단계를 추가로 포함한다. ?칭 단계는 일반적으로 접합체의 정제 전에 수행된다. 일 구현예에서, 혼합물을 ?칭제와 접촉시켜 혼합물을 ?칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "?칭제"는 유리 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4) 및/또는 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 반응하는 시약을 지칭한다. 일 구현예에서, 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4) 내 미반응기(예: 티올)가 ?칭되도록 하기 위해 말레이미드 또는 할로아세트아미드 ?칭제, 예컨대 4-말레이미도부티르산, 3-말레이미도프로피온산, N-에틸말레이미드, 요오도아세트아미드, 또는 요오도아세트아미도프로피온산이 사용될 수 있다. ?칭 단계는 약물(예를 들어, DM1)의 이량체화를 방지하는 데 도움이 될 수 있다. 이량체화된 DM1은 제거하기 어려울 수 있다. 극성의 하전된 티올 ?칭제(예: 4-말레이미도부티르산 또는 3-말레이미도프로피온산)로 ?칭하면, 과량의 미반응 DM1이 극성의 하전된 수용성 부가물로 전환되어 정제 단계 중에 공유 연결 접합체로부터 쉽게 분리될 수 있다. 비극성 및 중성 티올 ?칭제로 ?칭하는 것도 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 혼합물을 미반응 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 반응하는 ?칭제와 접촉시켜 혼합물을 ?칭한다. 예를 들어, 미반응 SMCC를 ?칭하기 위해 혼합물에 친핵체를 첨가할 수 있다. 친핵체는 바람직하게는 라이신, 타우린, 및 하이드록실아민과 같은, 아미노기 함유 친핵체이다.
바람직한 구현예에서, 반응(즉, 항체를 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)과 접촉시킨 다음 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시키는 단계)은 혼합물을 ?칭제와 접촉시키기 전에 완료될 때까지 진행된다. 이와 관련하여, ?칭제는 항체 및 약물(예를 들어, DM1 또는 DM4)을 포함하는 혼합물이 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉된 후 약 1시간 내지 약 48시간(예를 들어, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 또는 약 25시간 내지 약 48시간) 후에 혼합물에 첨가된다.
대안적으로, 혼합물의 pH를 약 5.0(예를 들어, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 또는 5.2)까지 낮추어 혼합물을 ?칭한다. 다른 구현예에서, pH를 6.0 미만, 5.5 미만, 5.0 미만, 4.8 미만, 4.6 미만, 4.4 미만, 4.2 미만, 4.0 미만까지 낮추어 혼합물을 ?칭한다. 대안적으로, pH를 약 4.0(예를 들어, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 또는 4.2) 내지 약 6.0(예를 들어, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2), 약 4.0 내지 약 5.0, 약 4.5(예를 들어, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 또는 4.7) 내지 약 5.0까지 낮춘다. 일 구현예에서, 혼합물의 pH를 4.8까지 낮추어 혼합물을 ?칭한다. 다른 구현예에서, 혼합물의 pH를 5.5까지 낮추어 혼합물을 ?칭한다.
일 구현예에서, 1단계형 방법은 불안정하게 결합된 링커를 항체로부터 방출시키는 유지 단계를 추가로 포함한다. 유지 단계는 접합체의 정제 전에(예를 들어, 반응 단계 후, 반응 단계와 ?칭 단계 사이, 또는 ?칭 단계 후에) 혼합물을 유지하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 (a) 항체를 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)과 접촉시켜 항체 및 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 포함하는 혼합물을 형성한 다음, 항체 및 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 포함하는 혼합물을 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시켜 (i) 접합체(예를 들어, Ab-MCC-DM1, Ab-SPDB-DM4, 또는 Ab-CX1-1-DM1), (ii) 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4), 및 (iii) 반응 부산물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계, (b) 단계 (a)에서 제조된 혼합물을 유지하여 불안정하게 결합된 링커를 세포 결합제로부터 방출하는 단계, 및 (c) 혼합물을 정제하여 정제된 접합체를 제공하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 (a) 항체를 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)과 접촉시켜 항체 및 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 포함하는 혼합물을 형성한 다음, 항체 및 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 포함하는 혼합물을 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 용액에서 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시켜 (i) 접합체, (ii) 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4), 및 (iii) 반응 부산물을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계, (b) 단계 (a)에서 제조된 혼합물을 ?칭시켜 미반응 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4) 및/또는 미반응 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)를 ?칭하는 단계, (c) 단계 (b)에서 제조된 혼합물을 유지하여 불안정하게 결합된 링커를 세포 결합제로부터 방출하는 단계, 및 (d) 혼합물을 정제하여 정제된 접합체(예를 들어, Ab-MCC-DM1, Ab-SPDB-DM4, 또는 Ab-CX1-1-DM1)를 제공하는 단계를 포함한다.
대안적으로, 유지 단계는 접합체의 정제 후에 수행될 수 있고, 이어서 추가 정제 단계가 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 반응은 유지 단계 전에 완료될 때까지 진행된다. 이와 관련하여, 유지 단계는 항체 및 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 포함하는 혼합물이 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉된 후 약 1시간 내지 약 48시간(예를 들어, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 또는 약 24시간 내지 약 48시간) 후에 수행될 수 있다.
유지 단계는 안정하게 결합된 링커를 항체로부터 실질적으로 방출하지 않으면서 불안정하게 결합된 링커를 방출하기 위해 용액을 적절한 기간(예를 들어, 약 1시간 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 또는 약 1시간 내지 약 4시간) 동안 적절한 온도(예를 들어, 약 0℃ 내지 약 37℃)에서 유지하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 유지 단계는 용액을 약 20℃ 이하(예를 들어, 약 0℃ 내지 약 18℃, 약 4℃ 내지 약 16℃), 실온(예를 들어, 약 20℃ 내지 약 30℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃), 또는 고온(예를 들어, 약 30℃ 내지 약 37℃)에서 유지하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 유지 단계는 용액을 약 16℃ 내지 약 24℃(예를 들어, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 또는 약 25℃)의 온도에서 유지하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 유지 단계는 용액을 약 2℃ 내지 약 8℃(예를 들어, 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 또는 약 10℃)의 온도에서 유지하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 유지 단계는 용액을 약 37℃(예를 들어, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃)의 온도에서 유지하는 것을 포함한다.
유지 단계의 지속시간은 유지 단계가 수행되는 온도 및 pH에 따라 다르다. 예를 들어, 유지 단계의 지속시간은 고온에서 유지 단계를 수행함으로써 실질적으로 감소될 수 있으며, 최대 온도는 세포 결합제-세포독성제 접합체의 안정성에 의해 제한된다. 유지 단계는 용액을 약 1시간 내지 약 1일(예를 들어, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 또는 약 24시간), 약 10시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 14시간 내지 약 24시간, 약 16시간 내지 약 24시간, 약 18시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 5시간 내지 약 1주, 약 20시간 내지 약 1주, 약 12시간 내지 약 1주(예를 들어, 약 12시간, 약 16시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일), 또는 약 1일 내지 약 1주 동안 유지하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 유지 단계는 용액을 최대 1주 동안 최소 12시간 동안 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 유지하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 유지 단계는 용액을 밤새(예를 들어, 약 12시간 내지 약 24시간, 바람직하게는 약 20시간) 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 유지하는 것을 포함한다.
유지 단계를 위한 pH 값은 바람직하게는 약 4 내지 약 10이다. 일 구현예에서, 유지 단계를 위한 pH 값은 약 4 이상, 약 6 미만(예를 들어, 4 내지 5.9) 또는 약 5 이상, 약 6 미만(예를 들어, 5 내지 5.9)이다. 다른 구현예에서, 유지 단계를 위한 pH 값은 약 6 내지 약 10(예를 들어, 약 6.5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8)의 범위이다. 예를 들어, 유지 단계를 위한 pH 값은 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 또는 약 10일 수 있다.
특정 구현예에서, 유지 단계는 혼합물을 25℃ 및 약 6~7.5의 pH에서 약 12시간 내지 약 1주 동안 인큐베이션하거나, 혼합물을 4℃ 및 약 4.5~5.9의 pH에서 약 5시간 내지 약 5일 동안 인큐베이션하거나, 또는 혼합물을 25℃ 및 약 4.5~5.9의 pH에서 약 5시간 내지 약 1일 동안 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
1단계형 방법은 접합체의 용해도 및 회수를 높이기 위해 반응 단계에 수크로스를 첨가하는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 수크로스는 약 0.1%(w/v) 내지 약 20%(w/v)(예를 들어, 약 0.1%(w/v), 1%(w/v), 5%(w/v), 10%(w/v), 15%(w/v), 또는 20%(w/v))의 농도로 첨가된다. 바람직하게는, 수크로스는 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)(예를 들어, 약 0.5%(w/v), 약 1%(w/v), 약 1.5%(w/v), 약 2%(w/v), 약 3%(w/v), 약 4%(w/v), 약 5%(w/v), 약 6%(w/v), 약 7%(w/v), 약 8%(w/v), 약 9%(w/v), 약 10%(w/v), 또는 약 11%(w/v))의 농도로 첨가된다. 또한, 반응 단계는 완충제의 첨가를 포함할 수도 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 석시네이트 완충제, 및 포스페이트 완충제를 포함한다. 일 구현예에서, 완충제는 HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)), POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 데하이드레이트), HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산), HEPPS(EPPS)(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산), TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 1단계형 방법은 혼합물을 정제하여 정제된 접합체(예를 들어, Ab-MCC-DM1, Ab-SPDB-DM4, 또는 Ab-CX1-1-DM1)를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 정제 방법을 사용하여 본 발명의 접합체를 정제할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 접선 유동 여과(TFF), 비흡착 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 흡착 여과, 선택적 침전, 또는 임의의 다른 적합한 정제 방법, 및 이들의 조합을 사용한다. 다른 구현예에서, 접합체를 상기 정제 방법에 적용하기 전에, 접합체는 먼저 하나 이상의 PVDF 막을 통해 여과된다. 대안적으로, 접합체는 접합체를 상기 정제 방법에 적용한 후에 하나 이상의 PVDF 막을 통해 여과된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 접합체는 하나 이상의 PVDF 막을 통해 여과된 후, 접선 유동 여과를 사용하여 정제된다. 대안적으로, 접합체는 접선 유동 여과를 사용하여 정제된 후, 하나 이상의 PVDF 막을 통해 여과된다.
Pellicon 타입 시스템(Millipore, Billerica, MA), Sartocon Cassette 시스템(Sartorius AG, Edgewood, NY), 및 Centrasette 타입 시스템(Pall Corp., East Hills, NY)을 포함하여 임의의 적합한 TFF 시스템이 정제를 위해 사용될 수 있다.
임의의 적합한 흡착 크로마토그래피 수지가 정제를 위해 사용될 수 있다. 바람직한 흡착 크로마토그래피 수지는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피, 고정 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC), 염료 리간드 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 하이드록시아파타이트 수지의 예는 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT 타입 I 및 타입 II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), HA Ultrogel 하이드록시아파타이트(Pall Corp., East Hills, NY), 및 세라믹 플루오로아파타이트(CFT 타입 I 및 타입 II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 포함한다. 적합한 HCIC 수지의 예는 MEP Hypercel 수지(Pall Corp., East Hills, NY)이다. 적합한 HIC 수지의 예는 부틸-세파로스, 헥실-세파로스, 페닐-세파로스, 및 옥틸 세파로스 수지(모두 GE Healthcare, Piscataway, NJ), 및 Macro-prep 메틸 및 Macro-Prep t-부틸 수지(Biorad Laboratories, Hercules, CA)를 포함한다. 적합한 이온 교환 수지의 예는 SP-세파로스, CM-세파로스, 및 Q-세파로스 수지(모두 GE Healthcare, Piscataway, NJ), 및 Unosphere S 수지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 포함한다. 적합한 혼합 모드 이온 교환기의 예는 Bakerbond ABx 수지(JT Baker, Phillipsburg NJ)를 포함한다. 적합한 IMAC 수지의 예는 킬레이팅 세파로스 수지(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 Profinity IMAC 수지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 포함한다. 적합한 염료 리간드 수지의 예는 블루 세파로스 수지(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 Affi-gel 블루 수지(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 포함한다. 적합한 친화성 수지의 예는 단백질 A 세파로스 수지(예를 들어, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ) 및 항체가 적절한 렉틴 결합 부위를 갖는 렉틴 친화성 수지, 예를 들어 렌틸 렉틴 세파로스 수지(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 포함한다. 적합한 역상 수지의 예는 C4, C8, 및 C18 수지(Grace Vydac, Hesperia, CA)를 포함한다.
임의의 적합한 비흡착 크로마토그래피 수지가 정제를 위해 사용될 수 있다. 적합한 비흡착 크로마토그래피 수지의 예는 SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL™ 수지(예를 들어, S-200 및 S-300), SUPERDEX™ 수지(예를 들어, SUPERDEX™ 75 및 SUPERDEX™ 200), BIO-GEL® 수지(예를 들어, P-6, P-10, P-30, P-60, 및 P-100), 및 당업자에게 알려진 다른 수지를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
라이신 항체 잔기에 대한 가교를 위한 2단계형 방법 및 1-포트 방법
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 미국 특허 7,811,572 및 미국 특허출원 공개번호 2006/0182750에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 이 방법은 (a) 본 발명의 항체를 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 접촉시켜 항체에 링커(즉, Ab-SMCC, Ab-SPDB, 또는 Ab-CX1-1)를 공유 부착시킴으로써 링커가 결합된 항체를 포함하는 제1 혼합물을 제조하는 단계; (b) 제1 혼합물을 임의로 정제 방법에 적용하여 링커가 결합된 항체의 정제된 제1 혼합물을 제조하는 단계; (c) 링커가 결합된 항체를 약 4 내지 약 9의 pH를 갖는 용액에서 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)과 반응시킴으로써 제1 혼합물에서 링커가 결합된 항체에 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 접합시켜 (i) 접합체(예를 들어, Ab-MCC-DM1, Ab-SPDB-DM4, 또는 Ab-CX1-1-DM1), (ii) 유리 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4), 및 (iii) 반응 부산물을 포함하는 제2 혼합물을 제조하는 단계; 및 (d) 제2 혼합물을 정제 방법에 적용하여 제2 혼합물의 다른 성분으로부터 접합체를 정제하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 정제 단계 (b)는 생략될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 정제 방법이 단계 (b) 및 (d)에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단계 (b) 및 (d) 모두에 TFF가 사용된다. 다른 구현예에서, 단계 (b)에 TFF가 사용되고 단계 (d)에 흡착 크로마토그래피(예를 들어, CHT)가 사용된다.
라이신 항체 잔기에 대한 가교를 위한 1단계형 시약 및 인시튜 방법
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 미국 특허 6,441,163 및 미국 특허출원 공개번호 2011/0003969 및 2008/0145374에 기재된 바와 같이, 미리 형성된 링커-약물 화합물(예를 들어, SMCC-DM1, 설포-SMCC-DM1, SPDB-DM4, 또는 CX1-1-DM1)을 본 발명의 항체에 접합시킨 후, 정제 단계를 수행함으로써 제조될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 정제 방법이 사용될 수 있다. 링커-약물 화합물은 약물(예를 들어, DM1, DM3, 또는 DM4)을 가교제(예를 들어, SMCC, 설포-SMCC, SPDB, 설포-SPDB, 또는 CX1-1)와 반응시켜 제조된다. 링커-약물 화합물(예를 들어, SMCC-DM1, 설포-SMCC-DM1, SPDB-DM4, 또는 CX1-1-DM1)은 항체에 접합되기 전에 임의로 정제를 거친다.
항-CCR7 항체
본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 실시예에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클론 항체 또는 이의 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서 본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 13, 45, 77, 또는 608의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서 본 발명은 또한 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 하기 표 1 및 4에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체는 하기 표 1 및 4에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 VH CDR을 포함한다(또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 29, 61, 93, 또는 624의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 하기 표 1 및 4에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 하기 표 1 및 4에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 이상의 VL CDR을 포함한다(또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명의 다른 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은, 돌연변이되었으나, 표 1 및 4에 기재된 서열에 표시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90, 또는 95%의 CDR 영역 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 1 및 4에 기재된 서열에 표시된 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역에 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현용으로 최적화될 수 있다.
본 출원의 텍스트 전체에 걸쳐, 명세서의 텍스트와 서열 목록 사이에 차이가 존재할 경우, 명세서의 텍스트가 우선한다.
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본 발명의 다른 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 암호화하는 핵산이 돌연변이되었으나, 표 1 및 4에 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 또는 95%의 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 표 1 및 4에 기재된 서열에 표시된 가변 영역과 비교할 때 가변 영역에 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산이 돌연변이되었지만, 표 1 및 4에 열거된 항체와 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유한다.
이들 각각의 항체는 CCR7에 결합할 수 있으므로, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열(아미노산 서열 및 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어, 본 발명의 다른 CCR7-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭된" CCR7-결합 항체는 당업계에 알려진 결합 분석(예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹선에 기재된 다른 분석)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 사슬이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 서열번호 13, 45, 77, 및 608로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 29, 61, 93, 및 624로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 모노클론 항체로서 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (i) 서열번호 15, 47, 79, 및 610으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 발현 시스템의 세포내 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열번호 31, 63, 95, 및 626으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물의 세포내 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 모노클론 항체; 또는 (ii) 이의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 표 1 및 4에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 CCR7-결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 1, 4, 7, 10, 33, 36, 39, 42, 65, 68, 71, 및 74에 제시되어 있다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 2, 5, 8, 11, 34, 37, 40, 43, 66, 69, 72, 및 75에 제시되어 있다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 3, 6, 9, 12, 35, 38, 41, 44, 67, 70, 73, 및 76에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 17, 20, 23, 26, 49, 52, 55, 58, 81, 84, 87, 및 90에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 18, 21, 24, 27, 50, 53, 56, 59, 82, 85, 88, 및 91에 제시되어 있다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 19, 22, 25, 28, 51, 54, 57, 60, 83, 86, 89, 및 92에 제시되어 있다.
이들 각각의 항체가 CCR7에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다(즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음). 이러한 "혼합 및 매칭된" CCR7-결합 항체는 당업계에 알려진 결합 분석 및 실시예에 기재된 분석(예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 본 발명의 모노클론 항체에 대해 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 새로운 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 CCR7에 특이적으로 결합하는 항체로서, 서열번호 1, 4, 7, 10, 33, 36, 39, 42, 65, 68, 71, 74, 596, 599, 602, 및 605로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 2, 5, 8, 11, 34, 37, 40, 43, 66, 69, 72, 75, 597, 600, 603, 및 606으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열번호 3, 6, 9, 12, 35, 38, 41, 44, 67, 70, 73, 76, 598, 601, 604, 및 607로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열번호 17, 20, 23, 26, 49, 52, 55, 58, 81, 84, 87, 90, 612, 615, 618, 및 621로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 18, 21, 24, 27, 50, 53, 56, 59, 82, 85, 88, 91, 613, 616, 619, 및 622로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 19, 22, 25, 28, 51, 54, 57, 60, 83, 86, 89, 92, 614, 617, 620, 및 623으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 단리된 모노클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 1의 중쇄 CDR1; 서열번호 2의 중쇄 CDR2; 서열번호 3의 중쇄 CDR3; 서열번호 17의 경쇄 CDR1; 서열번호 18의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 19의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 4의 중쇄 CDR1; 서열번호 5의 중쇄 CDR2; 서열번호 6의 중쇄 CDR3; 서열번호 20의 경쇄 CDR1; 서열번호 21의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 7의 중쇄 CDR1; 서열번호 8의 중쇄 CDR2; 서열번호 9의 중쇄 CDR3; 서열번호 23의 경쇄 CDR1; 서열번호 24의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 10의 중쇄 CDR1; 서열번호 11의 중쇄 CDR2; 서열번호 12의 중쇄 CDR3; 서열번호 26의 경쇄 CDR1; 서열번호 27의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 33의 중쇄 CDR1; 서열번호 34의 중쇄 CDR2; 서열번호 35의 중쇄 CDR3; 서열번호 49의 경쇄 CDR1; 서열번호 50의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 51의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 36의 중쇄 CDR1; 서열번호 37의 중쇄 CDR2; 서열번호 38의 중쇄 CDR3; 서열번호 52의 경쇄 CDR1; 서열번호 53의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 54의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 39의 중쇄 CDR1; 서열번호 40의 중쇄 CDR2; 서열번호 41의 중쇄 CDR3; 서열번호 55의 경쇄 CDR1; 서열번호 56의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 57의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 42의 중쇄 CDR1; 서열번호 43의 중쇄 CDR2; 서열번호 44의 중쇄 CDR3; 서열번호 58의 경쇄 CDR1; 서열번호 59의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 60의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 65의 중쇄 CDR1; 서열번호 66의 중쇄 CDR2; 서열번호 67의 중쇄 CDR3; 서열번호 81의 경쇄 CDR1; 서열번호 82의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 83의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 68의 중쇄 CDR1; 서열번호 69의 중쇄 CDR2; 서열번호 70의 중쇄 CDR3; 서열번호 84의 경쇄 CDR1; 서열번호 85의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 86의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 71의 중쇄 CDR1; 서열번호 72의 중쇄 CDR2; 서열번호 73의 중쇄 CDR3; 서열번호 87의 경쇄 CDR1; 서열번호 88의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 89의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 74의 중쇄 CDR1; 서열번호 75의 중쇄 CDR2; 서열번호 76의 중쇄 CDR3; 서열번호 90의 경쇄 CDR1; 서열번호 91의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 92의 경쇄 CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 596의 HCDR1, 서열번호 597의 HCDR2, 및 서열번호 598의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 612의 LCDR1, 서열번호 613의 LCDR2, 및 서열번호 614의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 599의 HCDR1, 서열번호 600의 HCDR2, 및 서열번호 601의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 615의 LCDR1, 서열번호 616의 LCDR2, 및 서열번호 617의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 602의 HCDR1, 서열번호 603의 HCDR2, 및 서열번호 604의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 618의 LCDR1, 서열번호 619의 LCDR2, 및 서열번호 620의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 605의 HCDR1, 서열번호 606의 HCDR2, 및 서열번호 607의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 621의 LCDR1, 서열번호 622의 LCDR2, 및 서열번호 623의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 608의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 624의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 서열번호 610의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 626의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, CCR7에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1 및 4에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이다.
1. 에피토프 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 확인
본 발명은 또한, 표 1 및 4에 기재된 항-CCR7 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 표 1 및 4에 기재된 항체와 교차경쟁하는 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공한다. 따라서, 예를 들어 BIACORE 또는 당업자에게 알려진 결합 측정 분석을 통해 CCR7 결합 분석에서 본 발명의 다른 항체와 교차경쟁(예를 들어, 통계적으로 유의미한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제)하는 능력에 기초하여 추가의 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이 확인될 수 있다. CCR7(예를 들어, 인간 CCR7)에 대한 본 발명의 항체 및 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 CCR7에 대한 결합에 대해 해당 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 경쟁할 수 있음을 보여주며; 이러한 항체는 비제한적인 이론에 따라, 경쟁 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 동일한 또는 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 인접하거나 중첩되는) CCR7 단백질 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 표 1 및 4에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)과 동일한 CCR7 상의 에피토프에 결합하는 항체는 인간 또는 인간화 모노클론 항체이다. 이러한 인간 또는 인간화 모노클론 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
2. Fc 영역의 프레임워크의 추가 변경
본 발명의 면역접합체는, 예를 들어 항체의 특성을 향상시키기 위해 VH 및/또는 VL 내에 프레임워크 잔기에 대한 변형을 추가로 포함하는 변형된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키도록 이루어진다. 예를 들어, 한 가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 생식세포계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식세포계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이들의 생식세포계열 배열로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생식세포계열 서열로 "역돌연변이"될 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 접근법은 "탈면역화"라고도 하며, Carr 등의 미국 특허공개 20030153043호에 더 상세히 기술되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에 이루어진 변형에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 일반적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포독성(ADCC)을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경하도록, 즉 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 이러한 구현예 각각을 이하 더 상세히 설명한다.
일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경(예를 들어 증가 또는 감소)되도록 변형된다. 이 접근법은 Bodmer 등의 미국 특허 5,677,425호에 추가로 기술되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편은 약물 모이어티에 대한 접합 부위로서, 변형되거나 조작된 아미노산 잔기, 예를 들어 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다(문헌[Junutula JR, et al., Nat Biotechnol 2008, 26:925-932]). 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 위치에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하는 변형된 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 시스테인 치환 부위는 항체 또는 항체 단편의 불변 영역에 존재하므로, 다양한 항체 또는 항체 단편에 적용될 수 있고, 이들 부위는 안정적이고 균질한 접합체를 제공하도록 선택된다. 변형된 항체 또는 단편은 1개, 2개 이상의 시스테인 치환을 가질 수 있고, 이들 치환은 본원에 기재된 바와 같은 다른 변형 및 접합 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 시스테인을 항체의 특정 위치에 삽입하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Lyons et al., (1990) Protein Eng., 3:703-708, WO 2011/005481, WO2014/124316, WO 2015/138615] 참조). 특정 구현예에서, 변형된 항체는 항체 중쇄의 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 191, 195, 197, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400, 및 422번 위치로부터 선택된 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 일부 구현예에서, 변형된 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편 경쇄의 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199, 및 203번 위치로부터 선택된 불변 영역에 하나 이상의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 인간 카파 경쇄이다. 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 2개 이상의 아미노산의 시스테인 치환의 조합을 포함하며, 이 조합은 항체 중쇄의 375번 위치, 항체 중쇄의 152번 위치, 항체 중쇄의 360번 위치, 또는 항체 경쇄의 107번 위치에서의 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며, 치환은 항체 중쇄의 375번 위치, 항체 중쇄의 152번 위치, 항체 중쇄의 360번 위치, 항체 경쇄의 107번 위치, 항체 경쇄의 165번 위치, 또는 항체 경쇄의 159번 위치이고(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 인간 카파쇄이다. 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 불변 영역에 2개의 아미노산의 시스테인 치환의 조합을 포함하며, 이 조합은 항체 중쇄의 375번 위치 및 항체 중쇄의 152번 위치에서의 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 항체 중쇄의 360번 위치에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함한다(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨). 다른 특정 구현예에서, 변형된 항체 또는 이의 항체 단편은 항체 경쇄의 107번 위치에 하나의 아미노산의 시스테인 치환을 포함하며(위치는 EU 시스템에 따라 넘버링됨), 경쇄는 카파쇄이다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 면역접합체에 유용한 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 변형되거나 조작된 항체, 예컨대 천연 서열의 적어도 하나의 아미노산 대신, Pcl, 피롤리신, 펩티드 태그(예컨대, S6, A1, 및 ybbR 태그), 및 비천연 아미노산을 비롯한 하나 이상의 (시스테인 이외의) 다른 반응성 아미노산을 도입하도록 변형된 항체를 포함하므로, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 대한 접합을 위한 항체 또는 항원 결합 단편 상의 반응 부위에 상보적 반응성을 제공한다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 약물에 대한 접합 부위로서 Pcl 또는 피롤리신(문헌[W. Ou, et al., (2011) PNAS 108 (26), 10437-10442; WO2014124258]) 또는 비천연 아미노산(문헌[J.Y. Axup, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109 (2012), pp. 16101-16106]; 검토를 위해 문헌[C.C. Liu and P.G. Schultz (2010) Annu Rev Biochem 79, 413-444; C.H. Kim, et al., (2013) Curr Opin Chem Biol. 17, 412-419] 참조)을 포함하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 효소 접합 방법을 위한 펩티드 태그가 항체에 도입될 수 있다(문헌[Strop P., et al., Chem Biol. 2013, 20(2):161-7; Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. 2010 Dec;14(6):790-6; Rabuka D, et al., Nat Protoc. 2012, 7(6):1052-67]). 또 다른 예는 조효소 A 유사체의 접합을 위한 4'-포스포판테테이닐 트랜스퍼라제(PPTase)의 사용이다(WO2013184514 및 문헌[Gruenewald et al., (2015) Bioconjugate Chem. 26 (12), 2554-62]). 이러한 변형되거나 조작된 항체를 페이로드 또는 링커-페이로드 조합과 접합시키는 방법은 당업계에 알려져 있다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역 내로 도입된다. 이 접근법은 Ward 등의 미국 특허 6,165,745호에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모항체의 항원-결합 능력을 유지하도록 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 Winter 등의 미국 특허 5,624,821호 및 5,648,260호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 소멸된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 예를 들어 Idusogie 등의 미국 특허 6,194,551호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로서, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이 접근법은 예를 들어 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 기술되어 있다. 동종이형 아미노산 잔기는 IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같은 카파 이소형 경쇄의 불변 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 돌연변이를 포함하는 항체 융합 단백질 복합체는 감소된 항체-의존적 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 매개하거나, ADCC 또는 CDC를 매개하지 않는다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 A234 및 A235로 치환된다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 N267은 A267로 치환된다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 D265 및 P329는 A265 및 A329로 치환된다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 중쇄는 임의로, D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A 중 어느 하나로부터 선택되는, 감소된 이펙터 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역접합체는 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A 중 어느 하나로부터 선택되는, 감소된 이펙터 기능을 부여하는 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로서, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이 접근법은 예를 들어 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 하나 이상의 동종이형 아미노산 잔기로 대체된다. 동종이형 아미노산 잔기는 또한, IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같은 카파 이소형 경쇄의 불변 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화 항체(즉, 글리코실화가 결여된 항체)가 제조될 수 있다. 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 Co 등의 미국 특허 5,714,350호 및 6,350,861호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 항체는 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, Ward의 미국 특허 6,277,375호에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 Presta 등의 미국 특허 5,869,046호 및 6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 회수 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
3. CCR7 항체의 생성
항-CCR7 항체 및 이의 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 재조합 발현, 화학적 합성, 및 항체 사량체의 효소적 분해를 비롯한(이에 한정되지 않음) 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 생성될 수 있는 반면, 전장 모노클론 항체는 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생성에 의해 얻을 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 알려진 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등에서 일어날 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 분절을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14, 46, 78, 및 609로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30, 62, 94, 및 625로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16, 48, 80, 또는 611의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 32, 64, 96, 또는 627의 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항-CCR7 항체의 가변 영역 서열만을 암호화할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 암호화할 수 있다. 일부 폴리뉴클레오티드 서열은 예시된 마우스 항-CCR7 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 마우스 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩티드 분절을 암호화한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 드노보(de novo) 고상 DNA 합성에 의해, 또는 항-CCR7 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 기존의 서열(예를 들어, 아래 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접 화학 합성은 문헌[Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포아미다이트 방법; 및 미국 특허번호 4,458,066의 고체 지지체 방법과 같은, 당업계에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR을 통해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은 예를 들어 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 상기 항-CCR7 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에 제공된다. 항-CCR7 항체 사슬 또는 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스 기반 발현 벡터와 비바이러스 발현 벡터 둘 모두 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터(일반적으로는, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 포함), 및 인간 인공 염색체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조). 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서의 항-CCR7 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNATM3.1/His, pEBVHis A, B & C(Invitrogen, San Diego, CA), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현을 위한 당업계에 알려진 여러 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 기반 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바 바이러스, 백시니아 바이러스 벡터, 및 셈리키 포레스트 바이러스(SFV; Semliki Forest virus) 기반 벡터를 포함한다. 상기 Brent 등의 문헌; 문헌[Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 문헌[Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992] 참조.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 일반적으로, 발현 벡터는 항-CCR7 항체 사슬 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도 조건인 경우를 제외하고는, 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 유도성 프로모터가 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터, 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 발현 산물이 숙주 세포에 의해 더 잘 허용되는 암호화 서열에 대한 집단의 편향 없이 비유도 조건하에 증식될 수 있다. 프로모터 외에도, 항-CCR7 항체 사슬 또는 단편의 효율적인 발현을 위한 다른 조절 요소가 또한 필요하거나 요구될 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 ATG 개시 코돈 및 인접 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 사용되는 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함함으로써 발현 효율이 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서를 사용할 수 있다.
발현 벡터는 삽입된 항-CCR7 항체 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 또한 제공할 수 있다. 삽입된 항-CCR7 항체 서열은 벡터에 포함되기 전에 신호 서열에 연결되는 경우가 더 많다. 항-CCR7 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 수용하는 데 사용되는 벡터는 때때로 불변 영역 또는 그 일부를 또한 암호화한다. 이러한 벡터는 가변 영역을 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현되도록 하여 온전한 항체 또는 이의 단편의 생성을 유도한다. 일반적으로, 이러한 불변 영역은 인간 불변 영역이다.
항-CCR7 항체 사슬을 보유 및 발현하기 위한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. E. coli는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현하는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스, 및 다른 엔테로박테리아세애, 예컨대 살모네라, 세라티아, 및 다양한 슈도모나스 종을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 숙주 세포와 공존할 수 있는 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 일반적으로 포함하는 발현 벡터를 제조하는 것도 가능하다. 또한, 많은 다양한 잘 알려진 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께, 일반적으로 발현을 제어하며, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 항-CCR7 폴리펩티드를 발현시키기 위해 효모와 같은 다른 미생물이 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합하여 곤충 세포가 사용될 수도 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-CCR7 폴리펩티드를 발현시키고 생성하기 위해 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주(예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 골수종 하이브리도마 클론), 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주(예를 들어, 아래에 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸성 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸성 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하여, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 왔다. 폴리펩티드를 발현시키기 위해 포유동물 조직 세포 배양을 사용하는 것은 예를 들어 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 일반적으로 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 일반적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 항시적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 항시적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 항시적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 극초기 CMV 프로모터), 항시적 CMV 프로모터, 및 당업계에 알려진 프로모터-인핸서 조합을 포함하나 이로 한정되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물 세포의 경우 염화칼슘 형질감염이 통상적으로 사용되는 반면, 다른 세포 숙주의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 사용될 수 있다(일반적으로, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed.] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스틱(ballistic) 방법, 비로좀, 면역리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합(문헌[Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997]), 제제-강화 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하기 위해서는 안정적인 발현이 필요한 경우가 많다. 예를 들어, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선별마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 항-CCR7 항체 사슬 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주가 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 선별 배지로 전환하기 전에 세포를 강화 배지에서 1~2일 동안 성장시킬 수 있다. 선별마커의 목적은 선별에 대한 저항성을 부여하는 것이며, 선별마커의 존재는 선별 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 가능하게 한다. 안정적으로 형질감염된 저항성 세포는 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
치료적 용도
본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 항체 약물 접합체는 고형암 또는 헴 악성종양과 같은 암의 치료 또는 예방을 포함하는(이에 한정되지 않음) 다양한 용도에 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 항체 약물 접합체는 종양 성장 억제, 분화 유도, 종양 부피 감소, 및/또는 종양의 종양원성 감소에 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 항체 약물 접합체는 생물학적 샘플에서 CCR7의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 조직은 다른 조직에 비해 더 높은 수준으로 CCR7을 발현하는 정상 및/또는 암 조직을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 CCR7의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이 방법은 항원에 대한 항체의 결합이 가능한 조건하에 생물학적 샘플을 항-CCR7 항체와 접촉시키는 단계, 및 항체와 항원 간에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CCR7의 증가된 발현과 관련된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이 방법은 시험 세포를 항-CCR7 항체와 접촉시키는 단계; CCR7 항원에 대한 항-CCR7 항체의 결합을 검출함으로써 시험 세포 상의 CCR7의 발현 수준을 (정량적 또는 정성적으로) 결정하는 단계; 및 시험 세포에서의 CCR7의 발현 수준을 대조 세포(예를 들어, 시험 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 이러한 정상 세포와 유사한 수준으로 CCR7을 발현하는 세포) 상의 CCR7의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 세포와 비교하여 시험 세포에서 더 높은 수준의 CCR7 발현은 CCR7의 증가된 발현과 관련된 장애의 존재를 나타낸다. 특정 구현예에서, 시험 세포는 CCR7의 증가된 발현과 관련된 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 얻는다. 특정 구현예에서, 장애는 암 또는 종양과 같은 세포 증식성 장애이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 시험 세포에서 CCR7 유전자의 복제 수를 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 기재된 것과 같은 진단 또는 검출 방법은 세포 표면에서 발현된 또는 표면에서 CCR7을 발현하는 세포로부터 수득된 막 제제에서 발현된 CCR7에 대한 항-CCR7 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 세포 표면에서 발현된 CCR7에 대한 항-CCR7 항체의 결합을 검출하기 위한 예시적인 분석은 "FACS" 분석이다.
CCR7에 대한 항-CCR7 항체의 결합을 검출하기 위해 특정 다른 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석, 및 면역조직화학(IHC)과 같은, 당업계에 잘 알려진 항원-결합 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 항-CCR7 항체는 표지된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자 고밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 항-CCR7 항체는 불용성 기질 상에 고정된다. 고정화는 용액에 유리 상태로 남아있는 임의의 CCR7 단백질로부터 항-CCR7 항체를 분리하는 것을 수반한다. 이는 통상적으로, 수불용성 기질 또는 표면에의 흡착에 의해(Bennich 등의 미국 특허 3,720,760호) 또는 공유 결합에 의해(예를 들어, 글루타르알데히드 가교를 이용) 분석 절차 전에 항-CCR7 항체를 불용화시킴으로써, 또는 예를 들어 면역침전에 의해 항-CCR7 항체와 CCR7 단백질 간의 복합체 형성 후에 항-CCR7 항체를 불용화시킴으로써 달성된다.
진단 또는 검출의 상기 임의의 구현예는 항-CCR7 항체 대신 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 환자의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 환자의 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체를 제공한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 환자의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 용도를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 항체 약물 접합체로 치료되는 질환은 암이다. 특정 구현예에서, 암은 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 및 항체 약물 접합체가 결합하는 CCR7 발현 세포를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 암은 건강한 환자에 비해 CCR7의 발현 증가를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, CCR7의 발현은 CCR7 RNA의 증가에 의해 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 암은 CCR7의 DNA 복제 수의 증가를 특징으로 한다. CCR7 발현 수준을 측정하거나 결정하는 다른 방법은 당업자에게 알려져 있다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 질환의 예는 만성 림프구성 백혈병(CLL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 예컨대 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL), 비호지킨 림프종(NHL), 예컨대 맨틀 세포 림프종(MCL), 버킷 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 및 소포림프종(FL), 위암종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 두경부암, 비인두암종(NPC), 식도암, 결장직장암종, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 신세포암, 및 자궁경부암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 암은 고형암이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 암은 내성 암 및/또는 재발성 암이다. 특정 양태에서, 예를 들어 내성 암은 티로신 키나제 억제제, EGFR 억제제, Her2 억제제, Her3 억제제, IGFR 억제제, 및 Met 억제제에 내성이 있다.
일부 구현예에서, 암은 재발성 또는 불응성(R/R) 암이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R CLL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R PTCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R DLBCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R MCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R FL이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 성장 억제 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 대상체는 종양이 있거나 종양이 제거되었다. 특정 구현예에서, 종양은 EGFR 억제제, Her2 억제제, Her3 억제제, IGFR 억제제, 및 Met 억제제를 비롯한(이에 한정되지 않음) 다른 티로신 키나제 억제제에 내성이 있다.
특정 구현예에서, 종양은 항-CCR7 항체가 결합하는 CCR7을 발현한다. 특정 구현예에서, 종양은 인간 CCR7을 과발현한다. 특정 구현예에서, 종양은 CCR7 유전자의 증가된 복제 수를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체로 치료하기 위한 환자를 선택하는 방법으로서, 상기 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 이 방법은 티로신 키나제 억제제 내성 암 환자를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 티로신 키나제 억제제 내성 암은 EGFR 억제제, Her2 억제제, Her3 억제제, IGFR 억제제, 및/또는 Met 억제제에 내성이 있는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 내성 암은 Her2 내성 암인 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 암은 드노보 내성 암인 것으로 고려되고, 또 다른 양태에서 암은 재발성 암인 것으로 고려된다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 방법은 드노보 내성 또는 재발성 암 환자를 선택하는 단계 및 CCR7의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 재발성 암 또는 종양은 처음에는 CCR7 발현 암 또는 종양이 아니었지만, 티로신 키나제 억제제로 치료받은 후 티로신 키나제 내성 또는 재발성 암 또는 종양인 CCR7 양성 암이 되는 것으로 고려된다.
질환의 치료 또는 예방을 위해, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 적절한 투여량은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 이전 요법, 환자의 임상 기록 등과 같은 다양한 요인에 따라 다르다. 항체 또는 제제는 1회 투여되거나, 수 일에서 수 개월까지 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 투여되거나, 또는 치료가 이루어지거나 질병 상태의 완화(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투약 스케줄은 환자의 신체 내 약물 축적 측정으로부터 계산될 수 있으며, 개별 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 치료 의사는 체액 또는 조직에서 측정된 약물의 체류 시간 및 농도에 기초하여 투약 반복률을 추정할 수 있다.
병용 요법
특정 예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체는 다른 치료제, 예컨대 다른 항암제, 항알레르기제, 항오심제(또는 항구토제), 진통제, 세포보호제, 및 이들의 조합과 조합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체는 항암 특성을 갖는 제2 화합물과 약학적 조합 제형으로, 또는 병용 요법으로서의 투약 요법으로 조합된다. 약학적 조합 제형 또는 투약 요법의 제2 화합물은 서로 부정적으로 영향을 미치지 않도록 이 조합의 항체 또는 면역접합체에 대해 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체, 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편), 또는 항체 약물 접합체는 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, CCR7 다운스트림 신호전달 경로 억제제, IAP 억제제, Bcl2 억제제, Mcl1 억제제, 및 기타 CCR7 억제제와 조합하여(이에 한정되지 않음) 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조합"은 단일 투여 단위 형태의 고정 조합을 지칭하거나, 또는 2가지 이상의 치료제가 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에서 개별적으로 투여될 수 있고, 특히 이러한 시간 간격을 통해 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 시너지 효과를 나타낼 수 있는 병용 투여를 위한 비고정 조합 또는 부품 키트를 지칭한다.
용어 "병용 요법"은 본 개시에 기재된 치료적 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 2가지 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 이들 치료제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 고정된 비율의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐로 공동 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 활성 성분에 대해 다중 또는 개별 용기(예를 들어, 캡슐, 분말, 및 액체)로 공동 투여하는 것을 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 목적하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 또한, 이러한 투여는 거의 동시에 또는 서로 다른 시간에 각 유형의 치료제를 순차적으로 사용하는 것도 포함한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에 기재된 병태 또는 장애의 치료 또는 예방에 있어서 약물 조합의 이로운 효과를 제공할 것이다.
병용 요법은 "시너지 효과"를 제공할 수 있고 "시너지적"임을 입증할 수 있다. 즉, 활성 성분들이 함께 사용될 때 달성되는 효과가 화합물을 개별적으로 사용함으로써 발생하는 효과의 합보다 크다. 시너지 효과는 활성 성분이 (1) 공동 제형화되어 조합된 단위 투약 제형으로 동시에 투여되거나 전달될 때; (2) 개별 제형으로서 교대로 또는 병행하여 전달될 때; 또는 (3) 일부 다른 요법에 의해 전달될 때, 얻을 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우, 시너지 효과는 화합물이 순차적으로, 예를 들어 개별 주사기로 서로 달리 주사하여 투여되거나 전달될 때 얻을 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는, 각각의 활성 성분의 유효 투여량이 순차적으로, 즉 연속하여 투여되는 반면, 병용 요법에서는 2가지 이상의 활성 성분의 유효 투여량이 함께 투여된다.
병용 요법에서의 사용을 위해 고려되는 일반적인 화학요법제는 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 황산블레오마이신(Blenoxane®), 부설판(Myleran®), 부설판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(Paraplatin®), 카무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 시클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 사이타라빈, 사이토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 사이타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 아이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토퓨린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 마일로타그, 파클리탁셀(Taxol®), 피닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카무스틴 임플란트가 있는 폴리페프로산 20(Gliadel®), 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포시드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 비노렐빈(Navelbine®), 및 페메트렉시드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체를 하나 이상의 티로신 키나제 억제제(BTK 억제제, EGFR 억제제, Her2 억제제, Her3 억제제, IGFR 억제제, 및 Met 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 티로신 키나제 억제제는 이브루티닙(PCI-32765); 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®); 리니파닙(N-[4-(3-아미노-1H-인다졸-4-일)페닐]-N'-(2-플루오로-5-메틸페닐)우레아(ABT 869로도 알려짐, Genentech에서 입수 가능); 수니티닙 말레이트(Sutent®); 보수티닙(4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴(SKI-606으로도 알려져 있고, 미국 특허번호 6,780,996에 기재되어 있음); 다사티닙(Sprycel®); 파조파닙(Votrient®); 소라페닙(Nexavar®); 작티마(ZD6474); 및 이마티닙 또는 이마티닙 메실레이트(Gilvec® 및 Gleevec®)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제는 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®), 제피티닙(Iressa®); N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드, Tovok®); 반데타닙(Caprelsa®); 라파티닙(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); 카너티닙 디하이드로클로라이드(CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙(TAK165); 펠리티닙(EKB569); 아파티닙(BIBW2992); 네라티닙(HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 및 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀(PKI166, CAS 187724-61-4)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
EGFR 항체는 세툭시맙(Erbitux®); 파니투무맙(Vectibix®); 마투주맙(EMD-72000); 니모투주맙(hR3); 잘루투무맙; TheraCIM h-R3; MDX0447(CAS 339151-96-1); 및 ch806(mAb-806, CAS 946414-09-1)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2 수용체)(Neu, ErbB-2, CD340, 또는 p185로도 알려짐) 억제제는 트라스투주맙(Herceptin®); 퍼투주맙(Omnitarg®); 트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla®); 네라티닙(HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-클로로-4-[(피리딘-2-일)메톡시]페닐]아미노]-3-시아노-7-에톡시퀴놀린-6-일]-4-(디메틸아미노)부트-2-엔아미드, PCT 공개번호 WO 05/028443에 기재되어 있음); 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); (2E)-N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3S)-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드(BIBW-2992, CAS 850140-72-6); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS 599626, CAS 714971-09-2); 카너티닙 디하이드로클로라이드(PD183805 또는 CI-1033); 및 N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Her3 억제제는 LJM716, MM-121, AMG-888, RG7116, REGN-1400, AV-203, MP-RM-1, MM-111, 및 MEHD-7945A를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
MET 억제제는 카보자니티닙(XL184, CAS 849217-68-1); 포레티닙(GSK1363089, 이전 명칭 XL880, CAS 849217-64-7); 티반티닙(ARQ197, CAS 1000873-98-2); 1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-N-(5-(7-메톡시퀴놀린-4-일옥시)피리딘-2-일)-5-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디하이드로-1H-피라졸-4-카복사미드(AMG 458); 크리조티닙(Xalkori®, PF-02341066); (3Z)-5-(2,3-디하이드로-1H-인돌-1-일설포닐)-3-({3,5-디메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(SU11271); (3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-({3,5-디메틸-4-[(4-메틸피페라진-1-일)카보닐]-1H-피롤-2-일}메틸렌)-N-메틸-2-옥소인돌린-5-설폰아미드(SU11274); (3Z)-N-(3-클로로페닐)-3-{[3,5-디메틸-4-(3-모르폴린-4-일프로필)-1H-피롤-2-일]메틸렌}-N-메틸-2-옥소인돌린-5-설폰아미드(SU11606); 6-[디플루오로[6-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸로[4,3-b]피리다진-3-일]메틸]-퀴놀린(JNJ38877605, CAS 943540-75-8); 2-[4-[1-(퀴놀린-6-일메틸)-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피라진-6-일]-1H-피라졸-1-일]에탄올(PF04217903, CAS 956905-27-4); N-((2R)-1,4-디옥산-2-일메틸)-N-메틸-N'-[3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-옥소-5H-벤조[4,5]시클로헵타[1,2-b]피리딘-7-일]설파미드(MK2461, CAS 917879-39-1); 6-[[6-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸로[4,3-b]피리다진-3-일]티오]-퀴놀린(SGX523, CAS 1022150-57-7); 및 (3Z)-5-[[(2,6-디클로로페닐)페틸]설포닐]-3-[[3,5-디메틸-4-[[(2R)-2-(1-피롤리디닐메틸)-1-피롤리디닐]카보닐]-1H-피롤-2-일]메틸렌]-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(PHA665752, CAS 477575-56-7)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
IGF1R 억제제는 BMS-754807, XL-228, OSI-906, GSK0904529A, A-928605, AXL1717, KW-2450, MK0646, AMG479, IMCA12, MEDI-573, 및 BI836845를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Yee, JNCI, 104; 975 (2012)] 참조.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체를 하나 이상의 CCR7 다운스트림 신호전달 경로 억제제(β-아레스틴 억제제, GRK 억제제, MAPK 억제제, PI3K 억제제, JAK 억제제 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K) 억제제는 이델라리십(Zydelig, GS-1101, Cal-101), 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸설포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린(GDC 0941로도 알려져 있고, PCT 공개번호 WO 09/036082 및 WO 09/055730에 기재되어 있음); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴(BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로도 알려져 있고, PCT 공개번호 WO 06/122806에 기재되어 있음); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민(BKM120 또는 NVP-BKM120으로도 알려져 있고, PCT 공개번호 WO2007/084786에 기재되어 있음); 토자세르팁(VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온(GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-하이드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-시클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온(PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온(LY294002, CAS 154447-36-6)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체를 하나 이상의 아폽토시스 촉진제(IAP 억제제, Bcl2 억제제, MCl1 억제제, 트레일(Trail) 제제, Chk 억제제를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, IAP 억제제는 LCL161, GDC-0917, AEG-35156, AT406, 및 TL32711을 포함하나 이에 한정되지 않는다. IAP 억제제의 다른 예는 WO04/005284, WO 04/007529, WO05/097791, WO 05/069894, WO 05/069888, WO 05/094818, US2006/0014700, US2006/0025347, WO 06/069063, WO 06/010118, WO 06/017295, 및 WO08/134679(이들은 모두 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
BCL-2 억제제는 베네토클락스(GDC-0199, ABT-199, RG7601로도 알려져 있음); 4-[4-[[2-(4-클로로페닐)-5,5-디메틸-1-시클로헥센-1-일]메틸]-1-피페라지닐]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-모르폴리닐)-1-[(페닐티오)메틸]프로필]아미노]-3-[(트리플루오로메틸)설포닐]페닐]설포닐]벤즈아미드(ABT-263으로도 알려져 있고, PCT 공개번호 WO 09/155386에 기재되어 있음); 테트로카신 A; 안티마이신; 고시폴((-)BL-193); 오바토클락스; 에틸-2-아미노-6-시클로펜틸-4-(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸)-4H크로몬-3-카복실레이트(HA14-1); 오블리머센(G3139, Genasense®); Bak BH3 펩티드; (-)-고시폴 아세트산(AT-101); 4-[4-[(4'-클로로[1,1'-바이페닐]-2-일)메틸]-1-피페라지닐]-N-[[4-[[(1R)-3-(디메틸아미노)-1-[(페닐티오)메틸]프로필]아미노]-3-니트로페닐]설포닐]-벤즈아미드(ABT-737, CAS 852808-04-9); 및 나비토클락스(ABT-263, CAS 923564-51-6)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
DR4(TRAILR1) 및 DR5(TRAILR2)를 포함하는 아폽토시스촉진 수용체 작용제(PARA)는 둘라너민(AMG-951, RhApo2L/TRAIL); 마파투무맙(HRS-ETR1, CAS 658052-09-6); 렉사투무맙(HGS-ETR2, CAS 845816-02-6); 아포맙(Apomab®); 코나투무맙(AMG655, CAS 896731-82-1); 및 티가투주맙(CS1008, CAS 946415-34-5, Daiichi Sankyo에서 입수 가능)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
체크포인트 키나제(CHK) 억제제는 7-하이드록시스타우로스포린(UCN-01); 6-브로모-3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(3R)-3-피페리디닐-피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-아민(SCH900776, CAS 891494-63-6); 5-(3-플루오로페닐)-3-우레이도티오펜-2-카복실산 N-[(S)-피페리딘-3-일]아미드(AZD7762, CAS 860352-01-8); 4-[((3S)-1-아자바이시클로[2.2.2]옥트-3-일)아미노]-3-(1H-벤즈이미다졸-2-일)-6-클로로퀴놀린-2(1H)-온(CHIR 124, CAS 405168-58-3); 7-아미노닥티노마이신(7-AAD), 이소그라눌라티미드, 탈브로모히메니알디신; N-[5-브로모-4-메틸-2-[(2S)-2-모르폴리닐메톡시]-페닐]-N'-(5-메틸-2-피라지닐)우레아(LY2603618, CAS 911222-45-2); 설포라판(CAS 4478-93-7, 4-메틸설피닐부틸 이소티오시아네이트); 9,10,11,12-테트라하이드로-9,12-에폭시-1H-디인돌로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][1,6]벤조디아조신-1,3(2H)-디온(SB-218078, CAS 135897-06-2); 및 TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL(서열번호 629)), 및 CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
추가 구현예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 약물 접합체를 하나 이상의 면역조절제(예를 들어, 공동자극 분자의 활성화제 또는 면역 체크포인트 분자의 억제제 중 하나 이상)와 조합하여 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 면역조절제는 공동자극 분자의 활성화제이다. 일 구현예에서, 공동자극 분자의 작용제는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제(예를 들어, 작용성 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 가용성 융합체)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 면역조절제는 면역 체크포인트 분자의 억제제이다. 일 구현예에서, 면역조절제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 또는 CTLA4, 또는 이들의 임의의 조합을 억제한다. 용어 "억제" 또는 "억제제"는 소정의 분자, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제의 특정 파라미터, 예를 들어 활성의 감소를 포함한다. 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 활성(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1 활성) 억제는 이 용어에 포함된다. 따라서, 억제는 100%일 필요는 없다.
억제 분자의 억제는 DNA, RNA, 또는 단백질 수준에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제 분자의 발현을 억제하기 위해 억제 핵산(예를 들어, dsRNA, siRNA, 또는 shRNA)이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 억제 신호의 억제제는 억제 분자에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 가용성 리간드(예를 들어, PD-1-Ig 또는 CTLA-4 Ig), 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타, 또는 이들의 조합에 결합하는 항체 또는 이의 단편(본원에서 "항체 분자"라고도 함)이다.
일 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv 단편(svFv))이다. 또 다른 구현예에서, 항체 분자는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는, 구체적으로는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 중쇄 불변 영역, 보다 구체적으로는 IgG1 또는 IgG4(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4)의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역(Fc)을 갖는다. 일 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4이다. 일 구현예에서, 불변 영역은 항체 분자의 특성을 바꾸기 위해(예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가 또는 감소시키기 위해) 변경, 예를 들어 돌연변이된다.
특정 구현예에서, 항체 분자는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 분자의 형태이다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1에 대한 제1 결합 특이성, 및 제2 결합 특이성, 예를 들어 TIM-3, LAG-3, 또는 PD-L2에 대한 제2 결합 특이성을 갖는다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1 및 TIM-3에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 또는 PD-L1 및 LAG-3에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 및 PD-L1에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 PD-1 및 PD-L2에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 TIM-3 및 LAG-3에 결합한다. 상기 분자들의 임의의 조합은 다중특이적 항체 분자, 예를 들어 PD-1 또는 PD-1에 대한 제1 결합 특이성, 및 TIM-3, LAG-3, 또는 PD-L2 중 둘 이상에 대한 제2 및 제3 결합 특이성을 포함하는 삼중특이적 항체에서 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 면역조절제는 PD-1, 예를 들어 인간 PD-1의 억제제이다. 다른 구현예에서, 면역조절제는 PD-L1, 예를 들어 인간 PD-L1의 억제제이다. 일 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제는 PD-1 또는 PD-L1에 대한 항체 분자이다. PD-1 또는 PD-L1 억제제는 단독으로, 또는 다른 면역조절제와 조합하여, 예를 들어 LAG-3, TIM-3, 또는 CTLA4의 억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예시적 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 또는 PD-L1 항체 분자는 LAG-3 억제제, 예를 들어 항-LAG-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. 다른 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 또는 PD-L1 항체 분자는 TIM-3 억제제, 예를 들어 항-TIM-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. 또 다른 구현예에서, PD-1 또는 PD-L1의 억제제, 예를 들어 항-PD-1 항체 분자는 LAG-3 억제제, 예를 들어 항-LAG-3 항체 분자, 및 TIM-3 억제제, 예를 들어 항-TIM-3 항체 분자와 조합하여 투여된다. PD-1 억제제(예를 들어, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 중 하나 이상)와 면역조절제의 다른 조합도 본 발명에 속한다. 당업계에 알려지거나 본원에 개시된 임의의 항체 분자가 체크포인트 분자의 억제제의 상기 조합에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, PD-1 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 피딜리주맙으로부터 선택되는 항-PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 니볼루맙의 다른 명칭은 MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538, 또는 BMS-936558을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(CAS 등록 번호: 946414-94-4)이다. 니볼루맙은 PD1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클론 항체이다. 니볼루맙(클론 5C4), 및 PD1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클론 항체는 미국 특허번호 8,008,449 및 PCT 공개번호 WO2006/121168에 개시되어 있다.
다른 구현예에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙(상표명 KEYTRUDA, 이전 명칭 람브롤리주맙, Merck 3745, MK-3475, 또는 SCH-900475로도 알려짐)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클론 항체이다. 펨브롤리주맙은 예를 들어 문헌[Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, PCT 공개번호 WO2009/114335, 및 미국 특허번호 8,354,509]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙이다. 피딜리주맙(CT-011; Cure Tech)은 PD1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클론 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 모노클론 항체는 PCT 공개번호 WO2009/101611에 개시되어 있다. 다른 항-PD-1 항체는 미국 특허번호 8,609,089, 미국 공개번호 2010028330, 및/또는 미국 공개번호 20120114649에 개시되어 있다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514(Amplimmune)를 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 PDR001 또는 WO2015/112900에 개시된 임의의 다른 항-PD-1 항체이다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 면역어드헤신(예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 AMP-224이다.
일부 구현예에서, PD-L1 억제제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-L1 억제제는, 본원에 개시된 서열(또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어 특정된 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 이상 동일한 서열)을 갖는, 예를 들어 WO 2013/0179174에 개시된 YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, 또는 MDX-1105MSB-0010718C(A09-246-2라고도 함)로부터 선택된다.
일 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDX-1105이다. BMS-936559로도 알려진 MDX-1105는 PCT 공개번호 WO2007/005874에 기재된 항-PD-L1 항체이다.
일 구현예에서, PD-L1 억제제는 YW243.55.S70이다. YW243.55.S70 항체는 PCT 공개번호 WO 2010/077634에 기재된 항-PD-L1(서열번호 20 및 21에 각각 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)이다.
일 구현예에서, PD-L1 억제제는 MDPL3280A(Genentech/Roche)이다. MDPL3280A는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 모노클론 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클론 항체는 미국 특허번호 7,943,743 및 미국 공개번호 20120039906에 개시되어 있다.
다른 구현예에서, PD-L2 억제제는 AMP-224이다. AMP-224는 PD1과 B7-H1(예를 들어, PCT 공개번호 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시된 B7-DCIg; Amplimmune) 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다.
일 구현예에서, LAG-3 억제제는 항-LAG-3 항체 분자이다. 일 구현예에서, LAG-3 억제제는 BMS-986016이다.
약학적 조성물
면역접합체를 포함하는 약학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 본 발명의 면역접합체는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 조성물은 CCR7 발현 암(만성 림프구성 백혈병(CLL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 예컨대 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL), 비호지킨 림프종(NHL), 예컨대 맨틀 세포 림프종(MCL), 버킷 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 및 소포림프종(FL), 위암종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 두경부암, 비인두암종(NPC), 식도암, 결장직장암종, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 신세포암, 및 자궁경부암을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 치료 또는 예방하는 데 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 암은 재발성 또는 불응성(R/R) 암이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R CLL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R PTCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R DLBCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R MCL이다. 일부 구현예에서, 암은 R/R FL이다.
치료제 및 진단제의 제형은 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와, 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션, 또는 현탁액의 형태로 혼합하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000] 참조).
치료제에 대한 투여 요법의 선택은 개체의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 개체의 면역원성, 및 생물학적 기질 내 표적 세포의 접근성을 포함한 여러 인자에 따라 다르다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 허용가능한 부작용 수준에 맞게 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정 개체 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 다르다. 항체, 사이토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 데 있어서 지침을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000] 참조).
적절한 용량의 결정은 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에서 알려지거나 추측되거나 치료 또는 예방에 영향을 미칠 것으로 예상되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하여, 이후 임의의 부정적 부작용에 비해 원하는 효과 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 조금씩 증가한다. 중요한 진단 조치는 예를 들어 염증의 증상 또는 생성된 염증성 사이토카인의 수준의 조치를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 1일, 1주의 간격으로, 또는 주 1~7회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회, 6주에 1회, 7주에 1회, 또는 8주에 1회 투약함으로써 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 약물 접합체는 3주마다 1회 제공될 수 있다. 투약은 정맥내로, 피하로, 국소적으로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내로, 뇌내로, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 구체적인 용량 프로토콜은 바람직하지 않은 심각한 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투약 빈도를 포함하는 것이다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투여량은 환자의 체중(kg)에 투여될 용량(mg/kg)을 곱하여 계산될 수 있다. 본 발명의 면역접합체의 경우, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중을 기준으로 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다. 예를 들어, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중을 기준으로 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10.0 mg/kg 이하 또는 이상, 또는 상기 임의의 두 값 사이의 범위이다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 0.2 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 0.4 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 0.6 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 0.8 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 1.2 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 1.6 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 2.4 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 3.6 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 4.8 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 환자 체중을 기준으로 6.0 mg/kg일 수 있다.
본 발명의 면역접합체의 용량은 반복될 수 있고, 투여 간격은 약 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이하, 이상, 또는 상기 임의의 두 값 사이의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 주 2회, 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 또는 그 이하로 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체의 용량은 3주마다 반복된다. 일부 구현예에서, 환자는 1회 사이클, 2회 사이클, 3회 사이클, 4회 사이클, 5회 사이클 이상 동안 치료받을 수 있다.
특정 환자에 대한 유효량은 치료되는 병태, 환자의 전반적 건강, 투여의 방법, 경로 및 용량, 및 부작용의 심각성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다(예를 들어, 문헌[Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001] 참조).
투여 경로는 예를 들어 국소 또는 피부 적용, 피하, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 투여에 의한 주사 또는 주입, 또는 지속방출 시스템 또는 이식에 의한 것일 수 있다(예를 들어, 문헌[Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 미국 특허번호 6,350,466 및 6,316,024] 참조). 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 또는 주사 부위의 통증을 완화시키는 리도카인과 같은 국소 마취제, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제 함유 제형의 사용에 의해 폐 투여가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903 참조(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 조성물은 또한 당업계에 알려진 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 면역접합체에 대한 선택된 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 일반적으로 주사에 의한 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 나타낼 수 있으며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 국소, 표피, 또는 점막 투여 경로와 같은 비경구 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질내, 직장내, 설하, 또는 국소 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 주입에 의해 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 피하 투여된다.
본 발명의 면역접합체가 제어방출 또는 지속방출 시스템으로 투여되는 경우, 펌프를 사용하여 제어방출 또는 지속방출을 달성할 수 있다(상기 Langer의 문헌; 문헌[Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989] 참조). 고분자 재료를 사용하여 본 발명의 요법의 제어방출 또는 지속방출을 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983] 참조; 또한 문헌[Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 미국 특허번호 5,679,377; 미국 특허번호 5,916,597; 미국 특허번호 5,912,015; 미국 특허번호 5,989,463; 미국 특허번호 5,128,326; PCT 공개번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개번호 WO 99/20253] 참조). 지속방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 지속방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출성 불순물이 없고, 저장시 안정적이고, 무균이고, 생분해성이다. 제어방출 또는 지속방출 시스템은 예방 또는 치료 표적에 근접하여 위치할 수 있으므로, 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, 상기 Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984] 참조).
제어방출 시스템은 Langer의 검토(문헌[Science 249:1527-1533, 1990])에서 논의된다. 본 발명의 하나 이상의 면역접합체를 포함하는 지속방출 제형을 제조하기 위해, 당업자에게 알려진 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허번호 4,526,938, PCT 공개 WO 91/05548, PCT 공개 WO 96/20698, Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; 및 Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997] 참조(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨).
국소 투여의 경우, 본 발명의 면역접합체는 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼의 형태, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)] 참조. 분무 불가능한 국소 투약 형태의 경우, 국소 적용에 적합하고, 일부 예에서, 물보다 더 큰 동적 점도를 갖는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 일반적으로 사용된다. 적합한 제형은 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 살브 등을 제한 없이 포함하며, 이들은 필요에 따라 멸균되거나, 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 미치는 보조제(예를 들어, 보존제, 안정제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합된다. 다른 적합한 국소 투약 형태는 분무가능한 에어로졸 제제를 포함하며, 활성 성분은, 일부 예에서, 고체 또는 불활성 담체와 조합하여, 가압 휘발물(예를 들어, 프레온과 같은 가스 추진제)과의 혼합물 또는 스퀴즈병(squeeze bottle)으로 패키징된다. 필요에 따라, 보습제 또는 습윤제가 약학적 조성물 및 투약 형태에 첨가될 수도 있다. 이러한 추가 성분의 예는 당업계에 잘 알려져 있다.
비강내 투여의 경우, 면역접합체를 포함하는 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트, 또는 점적 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 사용을 위한 예방제 또는 치료제는 적절한 추진제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 기타 적합한 가스)를 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취분기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)가 화합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들어 사이토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 또는 방사선과의 공동 투여 또는 치료 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.] 참조). 유효량의 치료제는 증상을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 약 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킬 수 있다.
본 발명의 면역접합체와 조합하여 투여될 수 있는 추가 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 본 발명의 면역접합체와 5분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간의 간격, 약 1시간의 간격, 약 1 내지 약 2시간의 간격, 약 2시간 내지 약 3시간의 간격, 약 3시간 내지 약 4시간의 간격, 약 4시간 내지 약 5시간의 간격, 약 5시간 내지 약 6시간의 간격, 약 6시간 내지 약 7시간의 간격, 약 7시간 내지 약 8시간의 간격, 약 8시간 내지 약 9시간의 간격, 약 9시간 내지 약 10시간의 간격, 약 10시간 내지 약 11시간의 간격, 약 11시간 내지 약 12시간의 간격, 약 12시간 내지 18시간의 간격, 18시간 내지 24시간의 간격, 24시간 내지 36시간의 간격, 36시간 내지 48시간의 간격, 48시간 내지 52시간의 간격, 52시간 내지 60시간의 간격, 60시간 내지 72시간의 간격, 72시간 내지 84시간의 간격, 84시간 내지 96시간의 간격, 또는 96시간 내지 120시간의 간격을 두고 투여될 수 있다. 하나의 동일한 환자 방문 내에서 둘 이상의 요법이 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB; blood-brain barrier)은 많은 고친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물은 (필요한 경우) BBB 통과를 보장하기 위해, 예를 들어 리포솜으로 제형화될 수 있다. 리포솜 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331 참조. 리포솜은 특정 세포 또는 기관에 선택적으로 수송되어 표적 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴(예를 들어, Low 등의 미국 특허 5,416,016호); 만노시드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120(Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다(또한, 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조).
본 발명은 본 발명의 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물을 단독으로 또는 다른 요법과 조합하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 순환적으로 투여될 수도 있다. 요법(예를 들어, 제제) 중 하나에 대한 내성 발생의 감소, 요법(예를 들어, 제제) 중 하나의 부작용의 방지 또는 감소, 및/또는 요법의 효능 개선을 위해, 순환 요법은 일정 기간 동안의 제1 요법(예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여에 이은 일정 기간 동안의 제2 요법(예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 및 이러한 순차적 투여, 즉 사이클의 반복을 포함한다.
본 발명의 병용 요법의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다.
용어 "병행적으로"는 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확히 동시에 투여하는 것으로 제한되는 것이 아니라, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물이, 본 발명의 항체 약물 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여 이들이 달리 투여되는 경우보다 증가된 이익을 제공할 수 있도록 일정 순서로 일정 시간 간격 내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법은 동시에 또는 상이한 시점에 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않는 경우, 이들은 원하는 치료 효과 또는 예방 효과를 제공하도록 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로, 임의의 적합한 경로에 의해 개별적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 5분 미만의 간격, 15분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간 미만의 간격, 약 1시간의 간격, 약 1시간 내지 약 2시간의 간격, 약 2시간 내지 약 3시간의 간격, 약 3시간 내지 약 4시간의 간격, 약 4시간 내지 약 5시간의 간격, 약 5시간 내지 약 6시간의 간격, 약 6시간 내지 약 7시간의 간격, 약 7시간 내지 약 8시간의 간격, 약 8시간 내지 약 9시간의 간격, 약 9시간 내지 약 10시간의 간격, 약 10시간 내지 약 11시간의 간격, 약 11시간 내지 약 12시간의 간격, 24시간의 간격, 48시간의 간격, 72시간의 간격, 또는 1주의 간격을 두고 대상체에게 투여된다. 다른 구현예에서, 동일한 환자 방문 내에서 둘 이상의 요법(예를 들어, 예방제 또는 치료제)이 투여된다.
병용 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 약학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 개별 약학적 조성물로 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 동일한 약학적 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 병용 요법의 예방제 또는 치료제는 개별 약학적 조성물로 대상체에게 병행적으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1: 항-CCR7 항체의 생성
인간, 래트, 마우스, 및 시노몰구스 원숭이 CCR7에 대한 발현 구성체의 생성
GenBank 또는 Uniprot 데이터베이스로부터의 아미노산 서열을 기반으로 전장 인간, 시노, 및 마우스 CCR7 유전자를 합성하였다(서열번호 97, 서열번호 99, 서열번호 101). 다양한 래트 조직으로부터 단리된 mRNA를 사용하여 생성된 아미노산 서열 정보를 기반으로 래트 CCR7 cDNA 주형을 유전자 합성하였다(서열번호 103). 합성된 모든 DNA 단편을 적절한 발현 벡터에 클로닝하였다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
CCR7을 안정적으로 발현하는 세포주의 생성
레트로바이러스 형질도입을 이용하여 안정한 CCR7-발현 세포주를 생성하였다. 제조사의 권장사항에 따라 Fugene 6 형질감염 시약(Promega, USA, cat# E2692)을 사용하여 CCR7 레트로바이러스 발현 벡터 및 pCL-Eco 또는 pCL-10A1 패키징 벡터(Novus, USA, cat#NBP2-29540 또는 NBP2-2952)로 293T 세포를 공동 형질감염시켰다. 세포를 37℃ 가습 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 형질감염 48 후에 바이러스 상청액을 수집하였다. NIH/3T3 및 300.19 세포를 거의 융합된 단층으로 성장시켰다. 세포로부터 성장 배지를 제거하고, 8 ug 폴리브렌/ml(최종 농도)(EMD Millipore, cat#TR-1003-G)의 존재하에 바이러스 상청액을 첨가하였다. 37℃에서 3~6시간 동안 인큐베이션한 후, 신선한 배지를 첨가하였다. 이어서, 세포를 적절한 선택 조건하에 배양하여 안정한 CCR7-발현 세포주를 생성하였다.
바이러스-유사 입자(VLP)의 생성, 발현, 및 정제
10% FBS를 포함하는 DMEM에서 HEK293T 또는 NIH/3T3 세포를 유지하였다. VLP를 제조하기 위해, 세포를 4% FBS를 포함하는 DMEM으로 교환한 후, CCR7 발현 플라스미드와 레트로바이러스 Gag 발현 플라스미드(3:2의 μg 비)로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포 상청액을 수집하고 벤치탑 원심분리기에서 5분 동안 2500 x g로 원심분리하여 청징하고 얼음 위에서 보관하였다. Sorvall RC 6+ 초원심분리기의 Beckman Coulter SW 32 Ti 로터에서 Beckman Ultra-Clear 38 ml 원심분리 튜브(카탈로그 # 344058) 내 20% 수크로스 쿠션을 통해 100,000 x g로 초원심분리하여 VLP를 정제하였다. 생성된 펠릿을 300 μl의 저온 살균 PBS에 재현탁시키고 BCA Assay(Pierce 카탈로그 # 23225)를 사용하여 정량화하였다.
CCR7 면역원 스캐폴드의 구조 파생적 생성
G 결합 단백질 수용체 패밀리의 구성원은, 각각 다양한 길이의 연결 서열에 의해 연결된 7개의 막관통 나선(TM1…TM7)을 포함하는 막 단백질이다. 단백질의 아미노 말단은 세포 표면의 외측에 존재하며, 이는 단백질의 4개의 영역인 아미노 말단(N-말단) 및 3개의 세포외 루프 영역(EC1, EC2, 및 EC3)이 세포 표면에 잠재적으로 노출됨을 나타낸다. 따라서 이들 영역은 항체에 대한 항원으로서 이용가능하다.
이들 4개 항목 중 하나 이상의 조합을 가용성 단백질 스캐폴드에 삽입하여 CCR7의 세포외 노출 영역과 구조적으로 유사하게 할 수 있는 것으로 예상되었다.
CCR7의 최적 세포외 영역을 결정하기 위해, CXCR4 구조와 단백질 데이터뱅크 항목(3ODU, 3OE0, 3OE6, 3OE8, 3OE9)의 조합 및 모델링 소프트웨어를 이용한 가까운 상동체 CXCR4의 결정 구조(문헌[Wu et al., "Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists." (2010) Science 330: 1066-1071])를 사용하여 모델을 구축하였다. 연결하는 막관통 나선에 삽입된 아미노산은 단백질의 표면에 노출된 것으로 모델로부터 추정되었다. 이들 영역은 아래 표 3에서 확인된다.
Figure pct00071
Figure pct00072
루프 EC1과 EC3의 작은 크기 및 다른 3개 영역으로부터 EC3의 공간적 분리로 인해 우선적으로 N-말단 및 EC2 루프를 후보 에피토프로 사용하였다.
프레임워크 1, CDR-H3 또는 CDR3-H1에서와 같이 Fab의 다양한 루프 영역에 EC2 서열이 삽입된 마우스 Fab의 결정 구조 내 N-말단 서열의 융합 모델링은 두 서열에서 어느 정도의 유연성이 가정되면 CCR7의 이러한 영역의 구조에 합리적으로 유사하게 될 수 있음을 보여주었다.
마우스 면역화를 위한 면역원 스캐폴드 생성
표 3의 N-말단을 마우스 Fab 스캐폴드 중쇄의 N-말단에 융합하고(MGFTX1으로 명명), 24번 위치의 시스테인 잔기가 세린으로 돌연변이된 변형된 버전의 EC2 서열(표 3 및 서열번호 113의 밑줄 + 볼드체 표시된 서열)을 MGFTX1 스캐폴드의 CDR3에 이식하여 마우스 면역화를 위한 이식 구성체를 생성한 다음, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬 둘 다를 생성하여 최종 단백질 구성체를 생성하였다. 따라서, FabCCR7M1으로 명명된 구성체에는 마우스 면역 반응의 대상인 인간 서열과 조합된 면역 내성이 있어야 하는 마우스 프레임워크가 포함되었다.
N-말단 서열은 MGFTX1 스캐폴드의 중쇄와 직접 융합되었다. EC2의 삽입 지점은 이용가능한 구조적 또는 상동성 모델 데이터에 기초하여 CDR 루프의 중간 지점으로 선택되었다. 관련 서열을 암호화하는 재조합 DNA를 이용하는 표준 분자 생물학 방법론을 사용하여 Fab 이식 단백질을 생성하였다.
예를 들어, EC2를 함유하는 각 항체의 가변 영역 중쇄 CDR3에 삽입하여 합성하였다. 가변 영역을 암호화하는 DNA를 PCR을 통해 증폭하고, 생성된 단편을 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 및 Fc 영역을 포함하는 벡터에 서브클로닝하였다. 이러한 방식으로, N-말단의 융합 및 H3에 EC2의 삽입에 해당하는 FabCCR7M1 단백질을 제조하였다. 생성된 구성체는 표 3에 제시되어 있다. 중쇄 및 경쇄 벡터의 적절한 조합의 형질감염은 하나의 N-말단 및 하나의 EC2 분자를 함유하는 재조합 Fab의 발현을 야기한다.
이식을 위해 선택되는 CDR의 선택은 루프의 노출 및 N-말단에 대한 근접성의 파라미터에 기초하여 결정된다. 이때, 융합 및 이식 후 루프의 유연성으로 인해, 모델링 소프트웨어는 목적하는 파라미터를 제공할 CDR 및 CDR 내의 위치를 예측하는 데 부분적으로만 유용하다. EC2_C24S(표 3, 서열번호 110)와 조합된 MGFTX1 스캐폴드의 구조는 대부분의 서열에 대해 전자 밀도의 부족으로 판단되는 바와 같이 노출되고 유연한 서열을 보여주었다.
요약하면, DR 내 삽입 지점은 CDR 내의 이식이 천연 항원에 대한 어느 정도의 구조적 유사성을 제공할 것이라는 가정하에 구조적 기반으로 선택되었다.
하이브리도마 생성
다중 부위 반복 면역화(RIMMS)를 요구하는 절차(McIntyre GD. Hybridoma 1997)를 사용하여 Bcl-2 유전자이식 마우스(C57BL/6-Tgn (bcl-2) 22 WEHI 종)를 항원으로 면역화시켰다. 간략하게, 마우스의 말초 림프절(PLN)에 인접한 8개의 특정 부위에 1~3 μg의 CCR7 면역원을 주사하였다. 이 절차를 12일의 기간에 걸쳐 8회 반복하였다. 12일차에 시험 혈액을 수집하고 혈청 항체 역가를 FACS로 분석하였다. 일부 경우에, 인간 CCR7(서열번호 97)을 안정적으로 과발현하는 NIH3T3 또는 300.19 세포로 BALB/c 및/또는 C57Bl/6 마우스를 면역화시켰다. 동물에게 PBS 중 5X106개 세포를 3개월 동안 월 1회 피하 주사한 후, 인간 CCR7-발현 VLP(25 μg)로 정맥내 부스트를 실시하였다. 부스트 2일 후, 시험 혈액을 수집하고 혈청 항체 역가를 FACS로 분석하였다. 고역가 마우스에서 비장 및 풀링된 PLN을 꺼냈다. 림프구를 채취하기 위해, 비장과 PLN을 DMEM으로 2회 세척한 후, 70 미크론 스크린(Falcon #352350)을 통과시켜 해리시켰다. 생성된 림프구를 Cytofusion 배지(BTXpress Cytofusion® Electroporation Medium cat# 47001)에서 융합 전에 추가로 2회 세척하였다.
융합을 위해 F0 골수종 세포와 림프구를 1:4의 비로 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심분리하고 Cytofusion 배지에 현탁시킨 다음, 전기융합 챔버(Harvard Apparatus Coaxial chamber 9ML Part #470020)에 첨가하였다. CEEF-50B Hybrimune/Hybridoma 시스템(Cyto Pulse Sciences, Inc)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 전기융합을 수행하였다. 융합된 세포를 챔버에서 5분 동안 회복시키고, HAT(DMEM + 20% FBS, 1% Pen/Strep/Glu, 1X NEAA, 0.5X HFCS)가 없는 융합 배지에서 1/10으로 희석하고, 1시간 동안 37℃에 두었다. 4X HAT 배지(DMEM + 20% FBS, 1% Pen/Strep/Glu, 1X NEAA, 4X HAT, 0.5X HFCS)를 첨가하여 1X 용액을 제조하고, 밀도를 1.67X104개 세포/ml로 조정하였다. 세포를 60 μl/웰로 384웰 플레이트에 플레이팅하였다.
FACS 스크리닝
융합 10일 후, 유세포 분석을 사용하여 하이브리도마 플레이트를 CCR7-특이적 항체의 존재에 대해 스크리닝하여, CCR7을 안정적으로 과발현하거나 내인적으로 발현하는 세포주에 대한 후보 항체의 특이적 결합을 확인하였다. 세포를 PBS로 철저히 헹구고 Accutase(Millipore #SCR005)로 처리하여 성장 플레이트에서 세포를 들어 올리고 저온 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 제조사의 지침(FluoReporter Cell-Surface Biotinylation Kit, Thermo Fisher Scientific Cat# F-20650; PE-Cy7 Steptavidin, ThermoFisher Scientific Cat# SA1012)에 따라 비오틴화하고 형광 염료로 표지하였다. 세포를 FACS 완충액(1X DPBS, 3% FBS, 5 mM EDTA, 0.1% 아지드화나트륨)에 약 1X106개 세포/ml로 재현탁시켰다. 384웰 플레이트에 20 μL의 하이브리도마 상청액을 사전 접종하고 20 μL의 세포 현탁액을 첨가하였다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 저온 FACS 완충액으로 2회 세척하고 20 μL의 1:400 2차 항체 FACS 완충액(알로피코시아닌 접합 F(ab')2 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적; Jackson Immunoresearch, Cat# 109-136-098)에 재현탁시켰다. 4℃에서 45분 동안 추가로 인큐베이션한 후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 2 μg/ml의 요오드화프로피듐(Sigma Aldrich Cat# P4864-10ML)를 포함하는 20 uL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. FlowJo™ 소프트웨어를 사용하여 살아있는 단일 세포에 대해 기하 평균 형광 강도를 계산하였다.
항체 정제
뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체를 제조하였다. 추가적으로, 시스테인 돌연변이(예를 들어, 중쇄의 K360C 위치, 또는 E152C 및 S375C 위치의 시스테인)를 포함하는 키메라 버전을 본원에 더 상세히 기술된 바와 같은 약물 모이어티의 접합 및 ADC의 제조를 위해 설계하였다. 선택된 하이브리도마 mAb121G12, mAb506E15, mAb674J13, 및 mAb684E12 각각에 대한 최적화된 서열(예를 들어, 인간화, 바람직한 특성)의 생성을 위해 하이브리도마의 가변 영역(VH 및 VL) DNA 서열을 수득하였다. 뮤린 모노클론 항체로부터의 가변 영역 DNA를 표준 방법을 사용하여 각각의 선택된 하이브리도마 세포주로부터 수득된 RNA로부터 RACE를 통해 증폭시켰다. 뮤린 가변 중쇄/경쇄 각각에 대한 폴리펩티드 서열은 674J13, 121G12, 506E15, 및 684E12 하이브리도마 각각에 대해 서열번호 128/서열번호 144, 서열번호 160/서열번호 176, 서열번호 192/서열번호 208, 및 서열번호 224/서열번호 240에 각각 제시되어 있다. 각각의 하이브리도마에 대한 상응하는 파생 가변 중쇄/경쇄 뉴클레오티드 서열은 서열번호 129/서열번호 145, 서열번호 161/서열번호 177, 서열번호 193/서열번호 209, 및 서열번호 225/서열번호 241에 제시되어 있다. 키메라 항체의 제조를 위해, 하이브리도마 VL 및 VH 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 각각의 인간 야생형 또는 조작된 Cys 또는 D265A/P329A(DAPA) 돌연변이 중쇄 및 인간 경쇄 불변 영역 서열(IgG1, 카파)을 포함하는 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
항체의 인간화
본원에 더 상세히 기술된 바와 같은 약물 모이어티의 접합 및 ADC의 제조를 위한 시스테인 돌연변이(예를 들어, 중쇄의 K360C 위치, 또는 E152C 및 S375C 위치의 시스테인)를 포함시키기 위해 서열의 인간화 및 최적화(예를 들어, 번역후 변형, 비선호 부위 등의 제거)에 대해; 뿐만 아니라 Fc 이펙터 기능이 감소된 구성체 및 이들의 조합을 포함시키기 위해 Fc 이펙터 돌연변이(예를 들어, Fc 영역의 D265A/P329A 돌연변이)의 변형에 대해 가변 영역 구성체를 설계하였다.
크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)에 대한 코돈 최적화를 포함하여, GeneArt(Life Technologies Inc. Regensburg, Germany)에서 인간화 VL 및 VH 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 주문하였다. VL 및 VH 도메인을 암호화하는 서열을 GeneArt 유래 벡터로부터 포유동물 세포에서의 단백질 생성에 적합한 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄를 개별 발현 벡터에 클로닝하여 공동 형질감염시켰다.
PEI(폴리에틸렌이민, MW 25,000 선형, Polysciences, USA, cat# 23966)를 형질감염 시약으로 사용하여 Freestyle™ 293 발현 세포(Invitrogen, USA)에 벡터를 공동 형질감염시켜 재조합 항체(IgG1, 카파)를 생성하였다. 실온(RT)에서 900 ml의 세포 배양 등급 물에 1 g의 PEI를 용해시켜 PEI 스톡을 제조하였다. PEI의 용해를 용이하게 하기 위해, HCl을 첨가하여 pH 3~5로 산성화한 후, NaOH를 사용하여 7.05의 최종 pH로 중화시켰다. 마지막으로, 부피를 1 L로 조정하고 용액을 0.22 um 필터를 통해 여과 멸균하고, 분취하고, 추가 사용시까지 -80℃에서 동결시켰다.
5% CO2의 37℃ 가습 인큐베이터에서 오비탈 쉐이커 상의 진탕 플라스크(Corning, Tewksbury, MA) 내 Freestyle™ 293 배지(Gibco™, ThermoFisher scientific, USA, cat# 12338018)에서 Freestyle™ 293 세포(Gibco™, ThermoFisher scientific, USA, cat# R79007)를 배양하였다. 일시적 형질감염을 위해, 세포를 특정 밀도 또는 약 3x106개 세포/ml로 성장시킨 후, 1 ug 여과 멸균 DNA/ml의 배양물(0.5 ug의 중쇄 + 0.5 ug의 경쇄)을 OptiMem(ThermoFisher Scientific, USA, #11058021) 용액 중 2 ug의 PEI/1 ug의 DNA에 첨가하고, 실온에서 8분 동안 인큐베이션하였다. 약하게 회전시키면서 Freestyle™ 293 세포에 혼합물을 적가하였다. 형질감염 후, 세포를 상청액으로부터의 항체 정제 전에 1 내지 2주 동안 배양하였다. 항체 생성을 위한 안정한 세포주를 생성하기 위해, 벡터를 제조사의 권장사항에 따라 CHO 세포에 뉴클레오펙션(Nucleofector™ 96-well shuttle™; Lonza)을 통해 공동 형질감염시키고, 진탕 플라스크에서 최대 4주 동안 선택 조건하에 배양하였다. 원심분리를 통해 세포를 채취하고, 항체 정제를 위해 상청액을 회수하였다. 단백질 A, 단백질 G, 또는 MabSelect SuRe(GE Healthcare Life Sciences) 컬럼을 사용하여 항체를 정제하였다. 상청액의 로딩 전에, 수지를 PBS로 평형화시켰다. 샘플의 결합 후, 컬럼을 PBS로 세척하고, 항체를 Thermo (Pierce) IgG pH 2.8(cat# 21004)로 용리시켰다. 용리액 분획을 시트르산나트륨 삼염기성 데하이드레이트 완충액, pH 8.5(Sigma Aldrich cat# S4641-1Kg)로 중화시킨 후, 밤새 PBS, pH 7.2에 투석하였다.
항체의 요약
표 4는 뮤린 하이브리도마로부터 유래된 모체 및 인간화 항-CCR7 항체에 대한 관련 서열 정보를 나타낸다. 본 출원서 전체에 걸쳐, 항체를 설명할 때 용어 "하이브리도마" 및 "모체"는 상호교환적으로 사용되며, 하이브리도마로부터 유래된 Ab를 지칭한다.
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실시예 2: 항체 유도 ADCC 활성의 시험관내 평가
ADCC를 매개하는 후보 항체의 능력을 대체 ADCC 리포터 분석을 사용하여 평가하였다. CCR7 및 CD20 발현 JVM2 세포를 표적 세포로 사용하였다. JVM2 세포를 세척하고 8x104개 세포/ml로 재현탁시켰다. 이 분석에서 이펙터 세포는 CD16V158 및 NFAT 의존적 루시퍼라제 리포터를 안정적으로 발현하는 Jurka 세포주(Jurkat-V158)였고; 루시퍼라제의 발현은 CD16을 통한 표준 ADCC 신호전달의 대안이다. 간략하게, 현탁액에서 성장된 Jurkat-V158 세포를 회전 침강시켜 사용된 배지를 제거하고, 펠릿을 분석 배지에 재현탁시키고 1.6x106개 세포/ml로 조정하였다. 같은 부피의 이펙터와 표적 세포를 혼합하여 세포의 마스터 믹스를 생성하여 1:5 또는 1:20의 표적 대 이펙터 세포 비를 얻었다. 항체의 적정을 분석 웰 중 50 ug/mL의 최종 최고 농도로 분석 배지에서 희석하였다. 12.5 uL의 Ab 용액을 384웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가한 후, 12.5 ul의 마스터 세포 믹스를 첨가하였다. 항체와 세포를 피펫팅을 통해 잘 혼합하고, 5% CO2의 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 15 uL의 Bright Glo 기질(Promega #G7572)을 각 웰에 첨가하고 1050 rpm으로 실온에서 5분 동안 진탕시켰다. Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 발광 신호를 판독하였다.
CD20 표적화 항체가 양성 대조로서 포함되었고, 루시퍼라제 활성으로 측정시 상당한 NFAT 신호전달을 나타냈다. 유사하게, 후보 항-CCR7 항체는 유의미한 ADCC 활성을 유도했다(도 1).
아래 표는 JVM2 및 Jurkat-V158 세포를 사용한 ADCC 분석에서 시험된 다양한 항체 포맷에 대한 대표적인 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00126
정상 CCR7+ T 세포에 비해 충분한 안전 여유가 있는지 여부 및 ADCC 활성에 필요한 최소 수용체 밀도를 결정하기 위해 다양한 CCR7 수용체 수를 가진 다양한 세포주에 걸쳐 비인간화 506E15 항체를 대표적인 ADCC-가능 항-CCR7 항체로서 사용하여 ADCC 분석을 수행하였다. 아래 표는 데이터의 일부를 요약한 것이다.
Figure pct00127
데이터는 정상 T 세포의 CCR7 수용체 수준에 필적하는 매우 낮은 CCR7 수용체 수준이라도 유의미한 ADCC 활성을 가능하게 하기에 충분했음을 보여준다. 또한 CCR7+ 암세포와 NK 세포의 공동 배양 생존율 분석을 사용하여 ADCC를 평가했으며 유사한 결과가 수집되었다(여기서는 논의하지 않음).
이는 T 세포 고갈이 생체 내에서 관찰되었고 ADCC 메커니즘 기반인 것으로 확인된 후술하는 관찰과 일치한다. 이러한 결과는 ADCC 형태가 안전성 관점에서 CCR7에 적합하지 않다는 것을 보여준다. 결과적으로, 전반적인 온-타겟 안전성을 개선하기 위해 모든 후보를 Fc 침묵(DAPA) 포맷으로 전환하였다.
ADCC 시험관내 리포터 분석을 반복하였고, DAPA Fc-돌연변이 버전의 비인간화 항-CCR7 항체에 대한 ADCC 활성의 부족이 확인되었다(도 2).
실시예 3: 항체의 생화학적 특성평가
CCR7에 대한 항-CCR7 항체의 친화도
FACS를 사용하여 CCR7 및 이의 종 오솔로그에 대한 다양한 항체 및 ADC의 친화도를 측정하였다. 정제된 IgG를 적정하여 세포 표면 발현 CCR7 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다.
이를 위해, CCR7 양성 세포를 채취하고(Accutase로 부착 세포를 분리), FACS 완충액(PBS/ 3% FCS/ 0.02% 아지디화나트륨)으로 2회 세척하고, FACS 완충액 용액에서 약 2x106개 세포/ml로 희석하였다. 수용체의 내재화를 방지하기 위해 모든 후속 단계는 얼음 위에서 수행하였다. 100 μl 세포 현탁액/웰을 96웰 U자형-바닥 플레이트(Falcon)로 옮겼다. 약하게 흔들면서, 4℃에서 60분 동안 100 nM의 높은 값에서 시작하여, 수 log에 걸친 범위에서 연속 희석된 항체 농도의 항-CCR7 관심 항체와 함께 2x105개 세포/웰을 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 회전 침강시키고(1200 rpm, 2분, 4℃), FACS 완충액으로 3회 세척하였다. 형광단-접합 항-hFc 감마-APC(Jackson ImmunoResearch) 검출 항체를 1:400으로 첨가하고, 샘플을 약하게 흔들면서 암실의 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 세포를 0.2 μg/ml의 DAPI를 함유하는 100 μl의 FACS 완충액에 현탁시킨 다음, 유세포 분석기(BD LSRFortessa Cell Analyzer; Cat # 647177)로 판독하였다. 살아있는 단일 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 Flowjo 10.0.8에서 계산하고 EC50 결정을 위해 Graphpad Prism6로 내보냈다.
CCR7을 과발현하도록 조작된 동질유전자 세포 쌍, 및 CCR7 파라로그, 예를 들어 CCR9, CCR6, CXCR4, 및 CCR8을 발현하는 세포주에 대한 겉보기 결합 친화도를 측정함으로써 선택성을 평가하였다. 모든 항-CCR7 항체는 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 CCR7 발현 세포에 대해서만 특이적으로 결합한다.
Figure pct00128
유사한 실험에서, 건강한 공여자 및 시노몰구스 원숭이, Wistar 래트, 및 CD-1 마우스로부터의 여러 PBMC 배치로부터 정제된, 조작된 동질유전자 일치 세포주 세트(NIH3T3 시리즈) 및 CD4+ T 세포를 사용하여 항체의 교차반응성에 대해 시험하였다. 아래 표 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 모든 항체는 유사한 겉보기 친화도로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CCR7에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 비인간화 121G12 항체만이 설치류 교차반응성이 있다.
Figure pct00129
Figure pct00130
겉보기 친화도에 대한 수용체 밀도의 영향, 및 이에 따른 항체의 세포 결합에 대한 결합활성(avidity)의 기여를 결정하기 위해, 다양한 발현 수준을 갖는 인간 CCR7 발현 암 세포주 및 정상 CCR7-양성 PBMC-유래 T 세포를 사용하여 FACS 적정 실험을 수행하였다. 계수 표준으로서 Bangs Laboratories의 마이크로스피어를 사용하고 제조사의 지침에 따라 FACS를 통해 수용체 정량화를 수행하였다. 예시적인 결과를 아래 표 10에 나타낸다.
Figure pct00131
모든 항-CCR7 항체는 겉보기 친화도 및 결합 강도에 대한 결합활성의 실질적 기여가 수용체 밀도와 상관관계적으로 감소되었음을 나타낸다. 특히 121G12는 적응증-대표적 DEL 암세포와 비교하여 정상 CD4+ T 세포로 표시되는 바와 같은 낮은 CCR7 발현 세포에서 유의미하게 더 약한 결합을 나타낸다.
특히, 항-CCR7 항체 중 가장 강력한 결합활성 효과를 나타내는 121G12의 상대적으로 약한 친화도는 암세포에 대한 항체 결합을 편향시키는 방법으로 정상 세포와 암세포 간의 수용체 밀도차를 활용하는 데 최적이다.
ELISA에서의 재조합 hCCR7에 대한 결합
재조합 CCR7(Origene #TP306614)을 사용한 ELISA 기반 분석에서 결합 및 친화도를 또한 평가하였다. PBS에 희석된 3.5 μg/ml의 재조합 CCR7로 Maxisorp™ 384웰 플레이트(Thermo Nunc)를 코팅하였다. PBS 중 3% BSA(소혈청 알부민)로 실온에서 1시간 동안 차단하고 PBS-T(PBS 중 0.01% Tween 20)로 3회 세척한 후, 1차 항체를 연속 희석하여 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 겨자무 과산화효소(HRP; Jackson ImmunoResearch, Cat#115-035-098)에 접합된 1:5000 항-hFc 감마와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 이어서 PBS-T로 세척한 후 SureBlue Peroxidase substrate(KPL, #52-00-03) 기질을 첨가함으로써 결합 합체를 검출하였다. 15분 후, 650 nM에서의 흡광도를 기록하고 GraphPad Prism6에서 분석하였다.
시험된 모든 항-CCR7 항체는 재조합 hCCR7에 결합할 수 있다(표 11; 도 3).
Figure pct00132
이중 FabGraft에 대한 결합
CCR7의 N-말단 및 EC2를 포함하는 최소 에피토프 공간에 대한 결합을 평가하기 위해 FabGraft ELISA를 수행하였다. 간략하게, 5 μg/ml의 FabGraft로 Maxisorp™ 384웰 플레이트(Thermo Nunc)를 코팅하였다. 그 외에는 전술한 바와 같은 일반적인 ELISA 프로토콜 지침을 따랐다. 모든 항-CCR7 항체는 아래 표 12에 나타낸 바와 같이 이중 FabGraft에 결합할 수 있다.
Figure pct00133
VLP를 사용한 pH 의존성 ELISA
CCR7-결합 CCL19는 수용체-리간드 복합체를 내재화하는 것으로 알려져 있다. 그러나, CCR7은 세포 표면으로 재순환하는 반면, CCL19는 분해를 위해 리보솜으로 분류되어, 세포에 흡수된 CCR7 및 그 리간드에 대해 반대 결말을 나타낸다(Otero et al., J Immunol 2006; 177:2314-2323). 성공적인 항-CCR7 ADC의 경우, 항체가 리간드와 유사하게 거동하는 것, 예를 들어 빠르게 내재화되지만 CCR7과 함께 재순환하지 않는 것이 바람직하다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 낮은 pH 조건하에서 CCR7에 대해 더 약한 결합을 나타낼 pH-의존적 항체를 확실하게 선택하였다.
항-CCR7 항체의 pH 의존성을 평가하기 위해, CCR7-발현 바이러스-유사 입자(VLP)를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 간략하게, 25 μg/ml의 VLP로 Maxisorp™ 384웰 플레이트(Thermo Nunc)를 코팅하였다. 1차 항체를 pH 5.8(1:1; dH2O:0.1 M 시트레이트 완충액, 150 mM NaCl) 또는 pH 7.4 완충액에서 인큐베이션하였다. 그 외에는 전술한 바와 같은 일반적인 ELISA 프로토콜 지침을 따랐다.
각 후보에 대한 다수의 인간화 변이체 중에서, 중성(7.4) 및 산성(5.8) pH에서의 항체 결합의 비교는 모든 CCR7 후보 항체가 pH 7.4에서 개선된 친화도를 가짐을 보여주었다(표 13). 다른 특징들 중에서 우수한 pH 의존성에 기초하여 하기 개체를 선택하였다.
Figure pct00134
b아레스틴 분석
항-CCR7 항체의 기능을 결정하기 위해, 작용 기능의 평가를 위한 작용 모드 또는 길항 기능의 평가를 위한 길항 모드에서 DiscoverX의 PathHunter Flash Detection Kit(#93-0247)를 사용하여 β-아레스틴 분석을 수행하였다.
작용 모드에서는, CHO-flpin-hCCR7(ProLink로 태깅된 hCCR7을 발현하는 DiscoverX에서 제조한 세포주, β-아레스틴-EA)을 384웰 플레이트에서 100 ng/ml의 Dox를 함유하는 성장 배지(Ham's F-12/글루타맥스 배지; Invitrogen + 10% FBS + 0.5 mg/ml G418 + 0.2 mg/ml 히그로마이신B; Invitrogen + 5 μg/ml 블라스티시딘; Gibco)에 20 μl/웰로 접종하고(8x104개 세포/웰), 금속 덮개로 덮고, 37℃ 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 리간드 hCCL19(R&D, 361/MI-025/CF)를 사용하여 시험 항체 또는 양성 대조에 대해, 1x 분석 완충액(20 mM HEPES/0.1% BSA/1x HBSS pH 7.4) 중 5x 작업 용액의 연속 희석을 수행하였다. 항체 또는 리간드의 5x 작업 용액 5 μl를 각 웰에 첨가하고, 짧게 회전 침강시키고, 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 25 μl의 검출 시약을 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 흔들면서 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, 효소 활성에 대한 발광 신호를 Envision 기기로 측정하였다. 마지막으로, 엑셀을 사용하여 효소 활성을 분석하였다.
길항 모드에서는, CHO-flpin-hCCR7 세포를 전술한 바와 같이 접종하였다. 다음 날, 각 시험 항체 또는 양성 대조 MAB197(R&D 기준 항체; 리간드 길항제) 또는 음성 대조 hIgG에 대해, 1x 분석 완충액 중 6x 작업 용액(0.5 μM x 6 = 3.0 μM)을 제조하였다. 항체 또는 대조항체의 6x 작업 용액 5 μl를 각 웰에 첨가하고, 짧게 회전 침강시키고, 37℃/5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 중에, 1x 분석 완충액 중 6x 작업 용액의 연속 희석을 hCCL19에 대해 수행하였다. 인큐베이션 후, hCCL19의 6x 작업 용액 5 μl를 각 웰에 첨가하고, 짧게 회전 침강시키고, 37℃/5% CO2에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 25 μl의 검출 시약을 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 흔들면서 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, 효소 활성에 대한 발광 신호를 Envision 기기로 측정하고 엑셀에서 분석하였다.
모체 항-CCR7 항체 중 어느 것도 작용 모델에서 활성을 나타내지 않았다(도 4a). 그러나, 길항 포맷에서 수행된 경우, 506E15 및 121G12는 강력한 길항제, 예를 들어 리간드 차단 항체로서 확인되었다(도 4b, 4c). 674J12는 중성의 비리간드 차단 항체이다. 684E12는 약한 길항제이다.
리간드를 사용한 FACS 경쟁 분석
CCR7 리간드와의 항체 경쟁을 확인하기 위해, 과잉의 리간드 농도의 존재하에 FACS 분석을 수행하였다. FACS 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 프로토콜에 일부 변경을 가했다. 예를 들어, CCL19는 1 μM의 일정 농도로 유지했지만, 1차 항체는 100 nM의 높은 값에서 시작하여, 수 log에 걸친 범위에서 DEL 세포에 동시에 적용하였다. 빙냉 FACS 완충액에서의 30분의 인큐베이션 시간 후, 세포를 세척하고, 2차 항-hFc.PE 항체를 15분 동안 적용하고, MFI를 전술한 바와 같이 결정하였다.
도 5는 인간화 CysMab.DAPA 674J13이 과잉의 CCL19의 존재에 의해 영향을 받지 않음을 나타내며, 이는 중성 기능을 확인시켜 준다. 인간화 CysMab.DAPA 121G12 및 506E15는 과잉의 리간드의 존재에 의해 결합 친화도에 실제로 크게 영향을 받는다.
다양한 수용체 밀도를 가진 세포주에 걸친 내재화 능력
성공적인 항-CCR7 ADC의 다른 양태는 CCR7의 차등 발현 분포의 최적 사용을 보장하는 것이다. 대표적 정상 CCR7 발현 세포로서, 건강한 공여자 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 단리하였다. 또한, 다양한 수용체 밀도를 나타내는 다수의 CCR7-양성 암 세포주를 선택하였다. CCR7+ 암세포보다 CCR7+ T 세포에서 더 약한 겉보기 FACS 결합 친화도를 갖는 항체를 의도적으로 선택하였다. 또한, 본원에 기재된 pHrodo 분석은 항-CCR7 항체에 낮은 pH-활성화 형광단 표지를 사용하여, 형광으로 측정시 세포 내로의 항체 흡수가 수용체 밀도와 상관관계를 갖는지 여부를 평가한다. 치료 창을 최대화하기 위해 정상 세포로의 항체 흡수를 최소화하는 것이 바람직하다.
간략하게, 제조사의 지침에 따라 말레이미드-pHrodo(ThermoFisher)를 사용하여 CysMab 포맷의 항-CCR7 항체를 표지화하여, DAR=4(약물, 예를 들어 형광단 대 항체 비)의 개체를 생성하였다. FACS 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다. 프로토콜에 일부 변경을 가했다. 예를 들어, 내재화를 가능하게 하기 위해, 1차 항체를 37℃의 배양 배지에서 6시간 동안 세포와 함께 5 μg/ml로 인큐베이션 한 후, 아지드화나트륨을 함유하는 빙냉 FACS 완충액으로 세척하여 반응을 정지시켰다.
아래 표 14는 일련의 세포주에 걸쳐 3개의 항체의 내재화 능력을 요약한 것이다. 비표적화 pHrodo-표지 항체를 대조로 사용하였고, 최대 400 MFI가 신호의 백그라운드 노이즈, 예를 들어 비표적 매개 항체-접합체 흡수를 구성하는 것으로 확인되었다. 데이터는 3가지 항-CCR7 항체 모두, 정상 CD4+ T 세포를 유지하면서 접합체를 효율적으로 내재화하고 축적하기 위해, 대부분의 CCR7+ 암 세포주에 대해 일반적인 범위의 CCR7 수용체 수준, 예를 들어 20,000개 초과의 수용체를 필요로 함을 보여준다.
Figure pct00135
Octet Red96 시스템을 사용한 에피토프 비닝
항-hCCR7 모체 항체의 에피토프 비닝은 생물층 간섭계(BLI)를 측정하는 Octet Red96 시스템(ForteBio, USA)을 사용하여 수행하였다. 제조사의 권장사항(Avidity, LLC, USA cat# BirA500)에 따라 BirA 비오틴 리가제를 사용하여 AviTag™를 통해 CCR7 면역원 스캐폴드를 비오틴화하였다. 사전 평형화된 스트렙타비딘 센서(ForteBio, USA)에 비오틴화 면역원 스캐폴드를 1.5 μg/mL로 로딩하였다. 이어서, 센서를 1X 동역학 완충액(ForteBio, USA) 중 100 nM 항체 A를 포함하는 용액으로 옮겼다. 센서를 1X 동역학 완충액으로 간단히 세척하고, 100 nM의 경쟁 항체를 함유하는 두 번째 용액으로 옮겼다. Octet Red96 시스템 분석 소프트웨어(버전 6.3, ForteBio, USA)를 사용하여 미가공 데이터로부터 결합 동역학을 결정하였다. 항체를 두 항체 A 및 경쟁 항체로서 전체 대응표본 조합으로 시험하였다.
Figure pct00136
CCR7 돌연변이를 이용한 에피토프 매핑
돌연변이 CCR7 세포주를 사용하여 추가 에피토프 매핑을 수행하였다. 인간 CCR7의 NIH/3T3 세포주 발현 돌연변이 변이체를 생성하였다. 돌연변이를 특정 위치에 도입하여 인간 CCR7 잔기를 상응하는 뮤린 CCR7 잔기로 교환하였다. 생성된 돌연변이는 D35E, F44Y, L47V, S49F, D198G, R201K, S202N, S204G, Q206D, A207T, M208L, I213V, T214S, E215A, 및 H216Q를 포함했다. 돌연변이 CCR7 플라스미드 구성체를 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성하고, NIH/3T3 세포에 도입하여 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하였다. 각 돌연변이 CCR7 세포주에 대한 후보 항체의 특이적 결합을 유세포 분석으로 평가하였다. 세포를 PBS로 철저히 헹구고 Accutase(Millipore #SCR005)로 처리하여 성장 플레이트에서 세포를 들어 올리고, 1x FACS 완충액(PBS 중 2% FBS + 0.1% NaN3)에서 약 1x105개 세포/90 μL로 재현탁시켰다. 96웰 U자형-바닥 플레이트에서, FACS 완충액 중 10x 항체 용액 10 μL를 사전 접종하고 90 μL의 세포 현탁액을 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 저온 PBS로 1회 세척하고 100 μL의 1:500 2차 항체 1x FACS 완충액(알로피코시아닌 접합 F(ab')2 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적; Jackson Immunoresearch, Cat# 109-136-098)에 재현탁시켰다. 4℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 100 μL의 1xFACS 완충액 + 4 μg/mL의 요오드화프로피듐(Life Technologies, Cat# P3566)에 재현탁시켰다. FlowJo를 사용하여 살아있는 단일 세포에 대해 기하 평균 형광 강도를 계산하고, WT CCR7 기하 평균 형광 강도의 %로 플롯팅하였다.
점돌연변이된 CCR7에 대한 EC50 기반 친화도는 모든 시험 항체가 상이한 결합 프로파일을 가짐을 보여주며, 이는 입체구조 에피토프의 다른 활용을 시사한다(도 6). 표시된 전체 항체 중에서, 506E15가 MAB197과 가장 유사한 결합 패턴을 가지며, 예를 들어 둘 모두 CCR7의 N-말단의 F44 또는 L47 잔기가 돌연변이된 경우 결합 친화도의 현저한 감소를 나타내지만, EC2 루프의 M208 또는 I213이 돌연변이된 경우에는 그렇지 않다. 121G12 및 674J13은 8개의 시험된 점돌연변이 중 적어도 4개에서 MAB197과 다르기 때문에 입체구조 에피토프 공간 내에서 다른 세트의 중요한 접촉점을 활용하는 것으로 보인다.
실시예 4: CCR7 항체 약물 접합체의 생성 및 특성평가
이하 섹션에서, uL와 μL는 마이크로리터를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, uM과 μM은 마이크로몰을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되고; um은 마이크로미터를 나타내기 위해 사용된다.
실시예 4A: 항체 약물 접합체 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 제조
Figure pct00137
Figure pct00138
정제된 121G12.CysMab.DAPA와 MPET.DM4의 접합:
출발 물질은 10 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 완충액 중 127 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 121G12.CysMab.DAPA 항체였다. 7.9 ml의 항체(1003 mg)에 16 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8(Teknova S1280)을 첨가하고, pH가 7 초과로 확인된 후, 실온에서 약하게 회전시키면서 25분 동안 100.3 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 항체를 흡수시켰다. 10 mg Ab/ml 베드로 로딩된 수지를 바틀탑 0.2 um 필터 유닛(Nalgene 567-0020)을 통한 진공 여과에 의해 15 베드 부피의 1xPBS 완충액(Hyclone SH30256.02)으로 세척한 후, 100.3 ml의 1x PBS에 재현탁시켜 50% 슬러리를 수득하였다.
13.6 g/L의 비율로 NaOH(Alfa Aesar A16037)가 첨가된 0.5 M 인산염 pH 8에 배합된 0.5 M 시스테인(Sigma G121-03) 4329 ul를 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 30분 동안 때때로 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 100.3 ml의 1xPBS(50% 슬러리)에 재현탁시키고, 1003 ul의 100 uM CuCl2(Aldrich 751944)를 첨가하여(순 500 nM Cu2+) 재산화를 개시하였다. 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 기준 말레이미드(실시예 3, WO2015/095301의 110 페이지)의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 60분), DMSO 중 MPET.DM4의 20 mM 스톡 3010 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 30분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(201 ml)을 20.1 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시킨 후, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 60 ml로 농축하였다. 이어서, 농축물을 1xPBS로 평형화된 24 x PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 농축물을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다.
안정성 연구를 위해, 동일하게 준비된 배치를 사용하여 물질을 모아 2 g의 출발 물질을 얻었다. 모인 물질을 10 mM 히스티딘 클로라이드 완충액 pH 5(JTBaker 2080-05의 히스티딘)에 대해 광범위하게 투석하고(Slidealyzer 플라스크, Thermo Scientific 87762), 약 30 mg/ml로 농축한 후, 수크로스(Millipore 1.00892.1003) 및 Tween 20(JTBaker 4116-04)을 각각 240 mM 및 0.02%(v/v)까지 첨가하였다. 안정성 연구에 필요한 것보다 과잉의 물질을 1xPBS로 다시 교환하였다. 샘플을 분취하고 액체 질소로 급속동결시키고, -80℃에서 보관하였다. 최종 농도는 안정성 시험을 위해 배합된 물질의 경우 23.9 mg/ml였고, 1xPBS에 배합된 물질의 경우 18.9 mg/ml였다.
생성된 샘플의 분석은 다음과 같다:
Figure pct00139
분석 방법: 농도는 10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280에 의해 결정하였다. 발열원은 TECAN Safire 플레이트 판독기의 Kinetic QCL 분석(Lonza Walkersville 50-650H) 판독값을 사용하여 결정하였다. 응집 퍼센트는 이동상[20 mM Tris 약 pH 7.65(10 mM Tris pH 7.4, 10 mM Tris pH 8로 제조), 200 mM NaCl, 0.02% 아지드화나트륨]으로 평형화된 KW-803 컬럼(TIC Cat# 6960940) 및 Shodex KW-G 가드(Thomson Instrument Company Cat# 6960955)에서 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정하고, 280 nm에서 데이터를 수집하였다. 샘플을 1xPBS에서 2 mg/ml로 희석하고, 50℃에서 10분 동안 PNGaseF(자체 제조)로 샘플을 탈글리코실화하고, 단백질 A 결합에 의해 PNGaseF를 제거하고, 1xPBS로 세척하고, 1% 포름산으로 용리시켜, DAR 결정을 위해 제조된 샘플의 분취액을 제조하였다. 이어서, 0.5 ml/분으로 흐르는 20% CH3CN/물 중 0.1% 포름산(Invitrogen)으로 평형화된 2.1x50 mm PLRP-S 컬럼(8 μm 입자, 1000 Å 기공 크기)에 샘플을 주입하였다. 컬럼을 3분 동안 20% CH3CN/물로 세척한 후, 0.1% 포름산 90% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 0.1분 구배로 용리시켰다. Agilent 1260 기기에서 질량 스펙트럼 데이터를 수집하여 110~180 kDa 범위에서 MassHunter Qualitative Analysis B.05.00으로 디콘볼루션하였다. 계산된 다양한 DAR 상태에 대응하는 피크 면적을 각 피크의 DAR에 따라 가중한 다음, 합산하고, DAR4 피크의 가중된 면적을 모든 가중 피크의 합으로 나누어 DAR 값을 얻었다.
링커 페이로드 MPET.DM4의 제조:
Figure pct00140
분석 방법
달리 명시되지 않는 한, 다음의 HPLC 및 HPLC/MS 방법을 중간체의 제조 및 실시예에 사용하였다.
LC/MS 분석은 Agilent 1200sl/6140 시스템에서 수행하였다.
컬럼: Waters Acquity HSS T3 C18, 50x2.0, 1.8 um
이동상: A) H 2 O + 0.05% TFA; B: 아세토니트릴 + 0.035% TFA
펌프 방법:
Figure pct00141
검출: 190 nm 내지 400 nm에서의 UV 다이오드 어레이
MS 스캔: 200 내지 1350 amu
ELSD: 60℃
MS 파라미터:
Figure pct00142
(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-클로로-14-하이드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤젠아시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일 N-(4-((2-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)에틸)디설파닐)-4-메틸펜타노일)-N-메틸-L-알라니네이트
Figure pct00143
단계 1: (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-클로로-14-하이드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤젠아시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일 N-(4-((2-아미노에틸)디설파닐)-4-메틸펜타노일)-N-메틸-L-알라니네이트의 제조
PBS 완충액(10.5 mL) 및 무수 THF(21 mL)에 용해된 DM4(480 mg, 0.62 mmol)에 2-(피리딘-2-일디설파닐)에탄-1-아민(151 mg, 0.68 mmol) 및 DIEA(0.27 mL, 1.54 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 수성 잔류물을 CH3CN(1 mL) 및 H2O(2 mL)로 희석하고, 0.05% TFA를 함유하는 10~60% 아세토니트릴-H2O로 용리되는 역상 ISCO로 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 목적 생성물을 수득하였다(555 mg, 93% 수율). 1H NMR (400 MHz, MeOD-d 4) δ ppm 0.83 (s, 3 H) 1.21 (d, J=5.0 Hz, 3 H) 1.25 (s, 3 H) 1.28 (s, 3 H) 1.30 (d, J=5.0 Hz, 3 H) 1.45-1.55 (m, 3 H) 1.67 (s, 3 H) 1.84-1.88 (m, 1 H) 1.95 - 2.01 (m, 1 H) 2.14 (dd, J=5.0 및 15.0 Hz, 1 H) 2.37-2.43 (m, 1 H) 2.53-2.59 (m, 1 H) 2.64 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) 2.82-2.89 (m, 5 H) 2.91 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 3.16 (dd, J=5.0 및 10.0 Hz, 2 H) 3.20 (s, 3 H) 3.23 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 3.35 (s, 3 H) 3.55 (d, J=5.0 Hz, 1 H) 3.58 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 4.15-4.20 (m, 1 H) 4.64 (dd, J=5.0 및 10.0 Hz, 1 H) 5.43 (q, J=5.0 Hz, 2 H) 5.66 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) ) 6.58 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) 6.65 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 6.66 (s, 1 H) 7.11 (bs, 1H) 7.28 (bs, 1H); MS m/z 855.3 (M+H), 유지 시간 0.988분.
단계 2: (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-클로로-14-하이드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤젠아시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일 N-(4-((2-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)에틸)디설파닐)-4-메틸펜타노일)-N-메틸-L-알라니네이트의 제조
무수 DMSO(7 mL)에 용해된 (14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-클로로-14-하이드록시-85,14-디메톡시-33,2,7,10-테트라메틸-12,6-디옥소-7-아자-1(6,4)-옥사지나나-3(2,3)-옥시라나-8(1,3)-벤젠아시클로테트라데카판-10,12-디엔-4-일 N-(4-((2-아미노에틸)디설파닐)-4-메틸펜타노일)-N-메틸-L-알라니네이트(555 mg, 0.57 mmol)에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로파노에이트(171 mg, 0.63 mmol) 및 DIEA(249 mL, 1.43 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, TFA를 사용하여 중화시켰다. 혼합물을 빙욕으로 0℃까지 냉각시킨 후, CH3CN(2 mL) 및 H2O(7 mL)를 첨가한 다음, 0.05% TFA를 함유하는 10~70% 아세토니트릴-H2O로 용리되는 역상 ISCO로 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 목적 생성물을 수득하였다(430 mg, 66% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 0.81 (s, 3 H) 1.23 (s, 3 H) 1.24 (s, 3 H) 1.25 (s, 1 H) 1.28 (d, J=5.0 Hz, 3 H) 1.31 (d, J=5.0 Hz, 3 H) 1.43-1.49 (m, 1 H) 1.61 (d, J=15.0 Hz, 1 H) 1.64 (s, 3 H) 1.81-1.87 (m, 1 H) 1.94 - 2.01 (m, 1 H) 2.19 (dd, J=5.0 및 15.0 Hz, 1 H) 2.30-2.36 (m, 1 H) 2.54 (t, J=5.0 Hz, 2 H) 2.61 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) 2.70 (t, J=5.0 Hz, 2 H) 2.88 (s, 3 H) 3.00 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 3.13 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 3.21 (s, 3 H) 3.55 (s, 3 H) 3.45 (q, J=5.0 Hz, 2 H) 3.49 (d, J=5.0 Hz, 1 H) 3.62 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 3.83 (t, J=5.0 Hz, 1 H) 3.98 (s, 3 H) 4.32 (m, 1 H) 4.80 (dd, J=5.0 및 10.0 Hz, 1 H) 5.28 (d, J=5.0 Hz, 1 H) 5.66 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) ) 6.22 (bs, 1 H) 6.42 (dd, J=10.0 및 15.0 Hz, 1 H) 6.50 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.66 (d, J=10.0 Hz, 1 H) 6.70 (s, 2H) 6.83(s, 1H); MS m/z 988.3 (M+H-H2O), 유지 시간 1.145분.
실시예 4B: 항체 약물 접합체 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 제조
Figure pct00144
Figure pct00145
22℃의 25 mM HEPES 완충액 pH 7.6(3 ml; 멸균) 및 디메틸아세트아미드(DMAc; 0.12 ml)의 교반 용액에 인산칼륨 완충액(10 mM, pH 6; 멸균) 중 121G12.DAPA; MW 약 145546 g/mol; 62 mg(0.426 μmol)의 용액(1.695 ml)을 첨가하였다. 0.242 ml의 DMAc에 용해된 메이탄시노이드 DM4(2.42 mg(3.101 μmol))를 첨가하였다. 0.970 ml의 DMAc에 용해된 링커 설포SPDB(0.970 mg(2.386 μmol, 분석을 위해 보정))를 첨가하였다. 18시간 후, 반응 혼합물을 SEC-UV 및 HPLC에 의해 반응 완료에 대해 분석하였다.
반응 혼합물을 세척을 위해 10 mM PBS-pH 7.4 완충액(멸균)을 사용하여 Amicon 막 세포(컷오프 30 kDa)를 통한 여과에 의해 소분자 부산물로부터 정제하고 완충액 교환하였다. 수득된 Amicon-잔류액을 합하고 10 mg/ml(UV)로 희석하여 10 mM PBS-pH 7.4 완충액 중 항체 약물 접합체 121G12.DAPA.sSPDB-DM4이 용액 2.9 ml를 수득하였다.
SEC-UV에 의해, 약물 항체 비는 n=3.6이고 단량체 순도는 98.7%인 것으로 결정되었다. 내독소 수준은 0.14 EU/mg이었다(BET Endosafe-시험).
실시예 4C: 항체 약물 접합체 684E12.SMCC.DM1의 제조
Figure pct00146
항체(모체 684E12) 용액(7.1 mg/mL, 3.4 mL, 약 47 μM, PBS, pH 7.4)에 DMA 중 2 mM DM1(0.17 mg) 100 μL 및 DMA 중 4 mM 설포-SMCC (0.15 mg) 50 μL를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 약하게 교반하였다. 인큐베이션 후, 반응 혼합물을 PBS, pH 7.4를 러닝 완충액으로 사용하여 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(GE Healthcare)에서 탈염을 통해 정제하고 멸균 여과하였다. 정제된 접합체를 MALDI-MS로 분석하였고 DAR은 2.6으로 추정되었다. 분석용 SEC는 샘플에 존재하는 3.7%의 응집(또는 96.3%의 단량체)을 나타냈으며, LAL 시험(PTS, Charles River Laboratories)은 내독소 값이 0.36 EU/mg인 것으로 결정하였다.
실시예 4D: 항체 약물 접합체 506E15.AURIX1의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 18.8 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 506E15.CysMab(WT Fc) 항체였다. 1.76 ml의 항체를 3 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 흡수시키고, 13.6 g/L의 비율로 NaOH(Alfa Aesar A16037)가 첨가된 0.5 M 인산염 pH 8에 배합된 0.5 M 시스테인(Sigma G121-03) 240 ul를 생성된 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 30분 동안 때때로 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 2 ml의 1xPBS(50% 슬러리)에 재현탁시키고, 60 ul의 100 uM CuCl2(Aldrich 751944)를 첨가하여(순 100 nM Cu2+) 재산화를 개시하였다. 420분 후, 추가 90 ul의 100 uM CuCl2를 첨가하여 재산화를 더욱 가속시켰다. 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 기준 말레이미드(실시예 3, WO2015/095301의 110 페이지)의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 565분), DMSO 중 AURIX1의 20 mM 스톡 220 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 70분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(6 ml)을 0.6 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 2.5 ml로 농축하고, 1xPBS로 평형화된 PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 농축물을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 22 mg(66%)였다.
실시예 4E: 항체 약물 접합체 506E15.CysMab.DAPA.AURIX2의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 10 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 506E15.CysMab.DAPA 항체였다. 2.0 ml의 항체를 2 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 흡수시키고, 13.6 g/L의 비율로 NaOH(Alfa Aesar A16037)가 첨가된 0.5 M 인산염 pH 8에 배합된 0.5 M 시스테인(Sigma G121-03) 160 ul를 생성된 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 30분 동안 때때로 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 2 ml의 1xPBS(50% 슬러리)에 재현탁시키고, 10 ul의 100 uM CuCl2(Aldrich 751944)를 첨가하여(순 250 nM Cu2+) 재산화를 개시하였다. 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 기준 말레이미드(실시예 3, WO2015/095301의 110 페이지)의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 295분), DMSO 중 AURIX2의 20 mM 스톡 80 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 85분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(4 ml)을 0.4 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 1xPBS로 평형화된 2 x PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 용리액을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 13.3 mg(67%)였다.
실시예 4F: 항체 약물 접합체 674J13.CysMab.AURIX1의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 9 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 674J13.CysMab(WT Fc) 항체였다. 57.6 ml의 항체에 200 mM까지 DTT(Invitrogen 15508-013)를 첨가하고, 용액을 75분 동안 인큐베이션하여 Ab를 강력하게 환원시켰다. 이어서, 환원된 Ab를 1xPBS로 평형화된 PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 농축물을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. PD10으로부터의 용리액을 모은 후, 새로운 PD10 컬럼에 다시 적용하여 DTT를 더 완전히 제거하였다. 별도의 실험에서, PD10 컬럼은 컬럼이 한 번만 사용되는 경우 크기 배제 메커니즘을 통해서만 관찰되는 것보다 DTT의 제거에 더 효과적임을 유의한다.
30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 AURIX1의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 180분), DMSO 중 AURIX1의 20 mM 스톡 290 ul를 6 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I) 수지와 함께 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 40분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(11.5 ml)을 1.2 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 2.5 ml로 농축하고, 1xPBS로 평형화된 PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 농축물을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 26 mg(41%)였다.
실시예 4G: 항체 약물 접합체 674J13.CysMab.DAPA.AURIX2의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 31.7 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 674J13.CysMab.DAR4.DAPA 항체였다. 9.5 ml의 항체를 30.1 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 흡수시키고, 생성된 슬러리에 1800 mg의 DTT(Invitrogen 15508-013)를 첨가하여 Ab를 강력하게 환원시켰다(순 200 mM DTT). 슬러리를 실온에서 20분 동안 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 2 ml의 1xPBS에 재현탁시키고, 실온에서 회전시키고, 구리는 첨가하지 않았다(이는 재산화를 과도하게 가속화함). 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 기준 말레이미드(실시예 3, WO2015/095301의 110 페이지)의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 80분), DMSO 중 AURIX2의 20 mM 스톡 903 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 50분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(60.2 ml)을 6.0 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 17.5 ml로 농축하고, 1xPBS로 평형화된 7 PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 농축물을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 243 mg(81%)였다.
실시예 4H: 항체 약물 접합체 121G12.CysMab.DAPA.AURIX1의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 16.7 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 121G12.CysMab.DAPA 항체였다. 3.6 ml의 항체를 6 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 흡수시키고, 생성된 슬러리를 실온에서 125분 동안 회전시킨 후, 13.6 g/L의 비율로 NaOH(Alfa Aesar A16037)가 첨가된 0.5 M 인산염 pH 8에 배합된 0.5 M 시스테인(Sigma G121-03) 544 ul를 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 60분 동안 때때로 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 2 ml의 1xPBS(50% 슬러리)에 재현탁시키고, 16 ul의 100 uM CuCl2(Aldrich 751944)를 첨가하여(순 250 nM Cu2+) 재산화를 개시하였다. 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 AURIX1의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 170분), DMSO 중 AURIX1의 20 mM 스톡 67 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 120분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(15 ml)을 1.5 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 5 ml로 농축하고, 1xPBS로 평형화된 2 x PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 용리액을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 54 mg(92%)였다.
실시예 4I: 항체 약물 접합체 121G12.CysMab.AURIX1의 제조
출발 물질은 1x 인산염 완충 식염수(1xPBS) 중 12.5 mg/ml(10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280)의 121G12.CysMab(Fc WT) 항체였다. 4.8 ml의 항체를 6 ml의 RMP 단백질 A 수지(GE Healthcare 1-223BPO/I)에 흡수시키고, 생성된 슬러리를 실온에서 125분 동안 회전시킨 후, 13.6 g/L의 비율로 NaOH(Alfa Aesar A16037)가 첨가된 0.5 M 인산염 pH 8에 배합된 0.5 M 시스테인(Sigma G121-03) 592 ul를 첨가하였다. 슬러리를 실온에서 60분 동안 때때로 회전시킨 후, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 50 베드 부피의 1xPBS로 바틀탑 0.2 um 필터 유닛을 통한 진공 여과에 의해 세척하였다. 세척된 수지를 2 ml의 1xPBS(50% 슬러리)에 재현탁시키고, 16 ul의 100 uM CuCl2(Aldrich 751944)를 첨가하여(순 250 nM Cu2+) 재산화를 개시하였다. 30 ul 분취량의 슬러리를 제거하고, RPLC에 의해 항체 피크를 이동시키는 것으로 알려진 AURIX1의 20 mM 스톡 1 ul를 첨가하고, 1분간 혼합하고, 10초 동안 7,000xg로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ul의 Thermo IgG 용리 완충액(Thermo Scientific 21009)을 첨가하고, 10초 동안 14,000xg로 회전시키고, 상청액을 채취하고, RPLC에 의해 생성물을 다음과 같이 분석함으로써 항체의 재산화를 시험하였다: 1.5 ml/분으로 흐르는 29.5% CH3CN/물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(Millipore TX1280P-1, Burdick and Jackson 407-4)으로 평형화한 가열된(80℃) 4.6x50 mm Agilent PLRP-S 컬럼(5 μm 입자, 4000 Å 기공 크기)에 2 ul의 샘플을 주입하였다. 컬럼을 44.5% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 5분 구배로 용리시키고, 280 nm에서 피크를 검출하였다. 접합을 위한 최적 시간은 주요 생성물 피크가 최대이고 나중에 용리된 피크가 최소화되고 이전에 용리된 피크가 아직 증가하지 않은 시간으로 정의된다.
RPLC 분석에서 재산화가 최적임을 나타내면(이 경우 160분), DMSO 중 AURIX1의 20 mM 스톡 67 ul를 첨가하고 슬러리를 실온에서 120분 동안 때때로 약하게 회전시켰다. 이어서, 적어도 10회 사이클의 여과 및 첨가에서 20 베드 부피의 1xPBS를 사용하여 슬러리를 세척하였다.
이어서, 슬러리를 0.5 베드 부피의 Thermo IgG 용리 완충액(폐기)으로 미리 용리된 프릿 컬럼(Pierce 7375021)으로 옮긴 후, 2 베드 부피의 동일한 완충액으로 용리시켰다. 전체 용리액(15 ml)을 1.5 ml의 0.5 M 인산나트륨 pH 8로 중화시키고, 3,000 x g의 스핀 농축기(Amicon UFC905024)를 사용하여 5 ml로 농축하고, 1xPBS로 평형화된 2 x PD-10 완충액 교환 컬럼(GE Healthcare 17-0851-01)에 적용하고, 2.5 ml의 용리액을 로딩하고, 제조사에 따라 3.5 ml의 1xPBS로 용리시켰다. 수율은 52 mg(89%)였다.
분석 방법: 농도는 10 mg/ml의 IgG 용액에 대해 13.7의 흡광 계수를 갖는 OD280에 의해 결정하였다. 발열원은 TECAN Safire 플레이트 판독기의 Kinetic QCL 분석(Lonza Walkersville 50-650H) 판독값을 사용하여 결정하였다. 응집 퍼센트는 이동상[20 mM Tris 약 pH 7.65(10 mM Tris pH 7.4, 10 mM Tris pH 8로 제조), 200 mM NaCl, 0.02% 아지드화나트륨]으로 평형화된 KW-803 컬럼(TIC Cat# 6960940) 및 Shodex KW-G 가드(Thomson Instrument Company Cat# 6960955)에서 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정하고, 280 nm에서 데이터를 수집하였다. 샘플을 1xPBS에서 2 mg/ml로 희석하고, 50℃에서 10분 동안 PNGaseF(자체 제조)로 샘플을 탈글리코실화하고, 단백질 A 결합에 의해 PNGaseF를 제거하고, 1xPBS로 세척하고, 1% 포름산으로 용리시켜, DAR 결정을 위해 샘플의 분취액을 제조하였다. 0.5 M TCEP를 함유하는 ¼ 부피의 5 M 아세트산암모늄 pH 5.0을 첨가하여 샘플을 환원시키고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 0.5 ml/분으로 흐르는 20% CH3CN/물 중 0.1% 포름산(Invitrogen)으로 평형화된 2.1x50 mm PLRP-S 컬럼(8 μm 입자, 1000 Å 기공 크기)에 샘플을 주입하였다. 컬럼을 3분 동안 20% CH3CN/물로 세척한 후, 0.1% 포름산 90% CH3CN/물까지(1.9분 동안 유지) 0.1분 구배로 용리시켰다. Agilent 1260 기기에서 질량 스펙트럼 데이터를 수집하여 15~60 kDa 범위에서 MassHunter Qualitative Analysis B.05.00으로 디콘볼루션하였다. 계산된 다양한 DAR 상태에 대응하는 피크 면적을 각 피크의 DAR에 따라 가중한 다음, 합산하고, DAR4 피크의 가중된 면적을 모든 가중 피크의 합으로 나누어 DAR 값을 얻었다.
생성된 샘플의 분석은 다음과 같다:
Figure pct00147
실시예 4J: 다른 CysMab 항체를 사용한 추가 접합체의 제조
실시예 4A에 기재된 방법은 또한 다른 시스테인 조작된 항체와의 MPET.DM4 접합체를 생성하는 데 사용된다.
상기 방법은 항체 PCT 공개번호 WO2016/203432에 개시된 NOV169N31Q(E152C-S375C), NEG0012(E152C-S375C), NEG0013(E152C-S375C), NEG0016(E152C-S375C), NEG0064(E152C-S375C), NEG0067(E152C-S375C), NOV169N31Q(K360C(HC)-K107C(LC)), NEG0012(K360C(HC)-K107C(LC)), NEG0013(K360C(HC)-K107C(LC)), NEG0016(K360C(HC)-K107C(LC)), NEG0064(K360C(HC)-K107C(LC)), 및 NEG0067(K360C(HC)-K107C(LC)) 항체를 사용하여 항-P-카드헤린 Ab.CysMab.MPET.DM4 접합체를 생성하는 데 사용된다.
실시예 5: 시험관내 ADC 특성평가
다양한 기능적 및 분석적 방법을 통해 항체 약물 접합체(ADC)를 특성평가하였다. ADC는 FACS에 의해 평가된 바와 같이 세포 상의 표적 CCR7 단백질에 대한 결합을 유지하였다. 모든 ADC의 경우, FACS 결합 분석에서의 기하 평균 형광 강도는 비접합 항체에 대한 값의 20% 이내였다. 분석용 SEC에 의해, ADC는 목적 분자량의 물질이 95%를 초과하는 것으로 나타났으며; 이것이 초기 반응 생성물에 대해 관찰되지 않은 경우, 예비 SEC의 사용으로 필요한 사양이 달성되었다. 다양한 DAR 종의 존재비를 합산하고 각 DAR 종에 대한 약물 분자의 수에 의해 가중치를 부여하여(예를 들어, 단일 DAR2 이온은 2로 카운트하고, 단일 DAR1 이온은 1로 카운트함), 탈글리코실화 환원 항체 샘플의 LCMS에 의해 약물 항체 비(DAR)를 평가하였다. 2개의 시스테인 돌연변이를 포함하는 불변 영역을 포함하는 접합체는 적어도 DAR 3.4이거나 DAR 3.4 초과였고, 가장 일반적으로는 DAR 3.8이거나 DAR 3.8 초과였다. 이는 보고된 접합체에 걸쳐 일관되었다.
실시예 6: 세포 증식 억제/세포 생존율 분석
상기에서, 형광단-접합 버전의 3가지 항-CCR7 항체 모두 CCR7을 내재화할 수 있고 일련의 세포주에 걸쳐 세포의 낮은 pH 부분에서 접합 형광단을 유효하게 축적할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 접합체가 독성 페이로드인 상황에서 세포 내에 접합체를 내재화하고 축적하는 항체의 능력을 나타낸다.
피기백 ADC(pgADC) 환경에서, 페이로드-접합 2차 항체 단편과 복합체를 형성한 항-CCR7 항체의 세포독성 효과를 4일 처치 후 세포 생존율을 평가하여 연구하였다. CCR7-특이적 IgG의 3배 희석을 제조하고, 일정량의 페이로드-결합 Fab 단편과 혼합하였다. 페이로드-결합 Fab 단편의 최종 농도는 0.5 μg/ml였다. Fab 시약은 MMAF 또는 사포린에 접합된 항-마우스 Fc 지정 Fab(Advanced Targeting Systems, Fab-Zap)이다. 실온에서 30분간 예비 인큐베이션한 후, 10 μl/웰의 항체-페이로드 복합체를 384웰 바닥 백색 플레이트에 3연속으로 첨가하였다. 각각의 CCR7(+) 세포를 현탁 세포에 대해 밀도가 1x106개/ml 미만이 되도록 그리고 부착 세포에 대해 80%의 밀집도에 도달하도록 접종하였다. 세포를 채취하고(Accutase로 부착 세포를 분리), 약 2x104개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 항체-페이로드 복합체 상부에서 384웰 플레이트에 첨가하였다(20 μl/웰). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 20 μl/웰의 CellTiter-Glo 용액(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay; Promega, #G7571)을 제조하고 세포에 첨가하였다. 생존 세포만이 발광으로 이어지는 루시퍼라제 반응(CellTiter-Glo 제공)에 필요한 ATP를 생성한다. 이에 따라, Envision 2104 Multilabel 판독기를 사용하여 22℃ 및 400 rpm에서 10분간의 인큐베이션 후 측정한 발광 신호로 세포 생존율을 결정하였다. IC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
도 7a 및 도 7b는 4개의 항-CCR7 항체 모두 MMAF-접합 시약을 사용한 피기백 분석 형식에서 CCR7+ KE97 세포의 농도-의존적 세포 사멸이 가능함을 보여준다. 아래 표는 피기백 페이로드의 수단으로 MMAF 또는 사포린을 사용한 실험으로부터의 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00148
표적 음성 세포주를 사용하여 pgADC 사멸의 특이성을 평가하였다. FabZap 시약을 사용한 예가 도 8에 도시되어 있다. CCR7 음성 NIH3T3 모세포 또는 mIgG 대조 항체와 대조적으로 KE97 및 NIH3T3.hCCR7 세포에서 121G12 pgADC 활성의 특이적인 CCR7-의존적 증가가 관찰된다.
실시예 7: 생체내 정상 마우스 조혈 세포에 대한 마우스-교차반응성 비접합 또는 AURIX1 접합 항-CCR7 항체의 영향
종에 걸친 정상적인 조직 발현은 혈액 및 림프 기관의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 비롯한, 조혈계로부터의 조혈계 세포로 제한되며, 이는 특히 ADCC 및 림프성 세포 고갈로 이어질 수 있는 야생형 Fc 포맷에서, ADC를 표적화하는 CCR7에 대한 잠재적 안전성 문제를 제시한다.
생체내 정상 조혈 세포에서 ADC에 의한 CCR7의 표적화 영향을 결정하기 위해, 야생형 또는 침묵(DAPA) Fc 포맷의 건강한 암컷 6~8주령 CD-1 마우스에서 비접합 또는 AURIX1 접합 마우스 교차반응성 121G12 모체 Ab를 평가하였다. 마우스에게 10 mg/kg의 최종 용량으로 121G12 parental.Cys-Mab.야생형 Fc.hIgG1(121G12.wt.Fc), 121G12 parental.Cys-Mab.DAPA.hIgG1(121G12.DAPA.Fc), 121G12 parental.Cys-Mab.야생형 Fc.hIgG1.AURIX1(121G12.wt.Fc.AURIX1), 또는 121G12.parental.Cys-Mab.DAPA.hIgG1.AURIX1(121G12.DAPA.Fc.AURIX1)의 단회 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
처치 후 25일 차에, 비장을 추출하고 gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotec Inc, San Diego, CA)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 이어서, 각 샘플당 100만개 세포를 BUV737 래트 항-마우스 CD8a 항체, 클론 53-6.7(1:100)(BD Biosciences, San Jose, CA, Cat# 564297), 및 BV510 래트 항-마우스 CD4, 클론 RM4-5(1:200)(BD Biosciences, San Jose, CA, Cat#563106)를 포함한 Ab의 혼합물로 염색하여 CD4+ 및 CD8a+ T 세포에서의 개별 처치의 영향을 결정하였다. 샘플을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 빙냉 HyClone 인산염 완충 식염수(Hyclone Laboratories, Logan, Utah)에서 세척하고, BD LSRFortessaTM 세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 평가하였다. 총 비장 세포 수를 사용하여 CD4+ 또는 CD8a+ T 세포 고갈을 결정하였다. T-검정을 사용하여 그룹 간의 유의성을 결정하였다.
표 17 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 10 mg/kg의 121G12.wt.FC 또는 121G12.wt.Fc.AURIX1 Ab를 사용한 처치 3일차까지 비장에서 CD4+ (FC 0.5~0.6) 및 CD8a+ T 세포(FC 0.3~0.5)의 강한 환원이 관찰되었으며, 이는 T 세포 고갈 영향이 AURIX1 페이로드의 존재와 무관하다는 것을 시사한다. 이러한 효과는 DAPA 돌연변이의 도입을 통한 Fc의 침묵화에 의해 복구되었다. 121G12.DAPA.Fc 및 121G12.DAPA.Fc.AURIX1은 둘 다 비처치 그룹에 비해 T 세포 집단에 영향을 미치지 못했다. 이들 데이터는 항-CCR7 ADC가 T 세포 고갈 안전성 문제를 가질 수 있고 이는 Fc의 DAPA 침묵화를 통해 복구될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00149
실험은 처치 25일차에 평가함. 배수 변화(FC) = 표시된 처치 그룹에 대한 25일차 평균 비장세포 수/3일차 비처치 대조 그룹에 대한 평균 비장세포 수. T-검정을 사용하여 비처치 그룹 대비 유의성을 결정(*p<0.05, ***p<0.001; NS=유의미하지 않음).
실시예 8: 직접 접합체의 항-CCR7 ADC 활성
다양한 페이로드와 직접 접합된 항체(ADC)의 결합 후 세포독성 효과 및 이들의 CCR7(+) 세포로의 내재화를 4일 처치 후 세포 생존율을 평가하여 연구하였다. ADC의 3배 희석을 384웰 바닥 백색 플레이트에 3연속으로 첨가하였다(10 μl/ml). 각각의 CCR7(+) 세포를 현탁 세포에 대해 밀도가 1x106개/ml 미만이 되도록 그리고 부착 세포에 대해 80%의 밀집도에 도달하도록 접종하였다. 세포를 채취하고(Accutase로 부착 세포를 분리), 약 2x104개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 항체 상부에서 384웰 플레이트에 첨가하였다(20 μl/웰). 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 20 μl/웰의 CellTiter-Glo 용액(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay; Promega, #G7571)을 제조하고 세포에 첨가하였다. Envision 판독기를 사용하여 22℃ 및 400 rpm에서 10분간의 인큐베이션 후 측정한 발광 신호로 세포 생존율을 결정하였다. IC50 값은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
아래 표는 AURIX1 또는 AURIX2에 접합된 야생형 Fc 또는 침묵(DAPA) Fc 포맷의 항-CCR7 CysMab 항체로 측정된 세포 생존율 효과의 예를 나타낸다.
Figure pct00150
ADC의 표적 특이성 및 수용체-수준 의존성에 대해 평가하기 위해, 다양한 CCR7 수용체 수준을 갖는 세포주에 걸쳐 ADC 활성을 시험하였다. 아래 표는 AURIX2에 접합된 CysMab.DAPA 포맷의 인간화 674J13 항체에 대한 예를 나타낸다. 세포주는 페이로드와 유사한 감수성에 기초하여 선택되었다.
Figure pct00151
pHrodo 실험에서 볼 수 있듯이, ADC 활성은 ADCC 형태보다 더 높은 정도의 수용체 수를 필요로 한다. 정확한 수용체 컷오프는 다양한 파라미터(예를 들어, 항체 결합활성, 페이로드 효능)에 따라 다르지만, 본원에 제시된 데이터는 일반 개념을 설명한다. DAPA 포맷의 결합활성-의존적 항-CCR7 항체의 사용은 본원에서 2,000개 미만의 CCR7 수용체를 갖는 암 세포주로 표시되는 정상 CCR7+ PBMC보다 암세포에 대해 ADC 결합활성을 편향시킨다.
실시예 9: 부위-특이적 MPET.DM4 ADC의 도입
DM4 접합 ADC는 ADC 분야에서 잘 확립되어 있다. DAR(약물 대 항체 비)이 약 4인, 재현성 있고 균질한 DAR-제어 ADC 배치를 생성하는 이점을 갖는 CysMab 버전의 항체를 사용하여 부위 특이적으로 접합된 MPET.DM4의 생성 및 사용을 설명한다. 비-부위-특이적 접합체는 소수성의 증가, 및 결과적으로 더 빠른 클리어런스, PK 프로파일의 악화, 및 독성의 증가를 비롯한 바람직하지 않은 생물물리학적 특징과 연관된, 높은 DAR을 갖는 유의미한 집단을 포함하는 경우가 많은 것으로 설명되었다. 이하, MPET.DM4 기반 항-CCR7 ADC의 다양한 시험관내 및 생체내 평가를 sSPDB.DM4 대응물과 비교하여 나타낸다.
실시예 10: MPET.DM4 대 sSPDB.DM4 ADC의 FACS 결합 친화도
비-부위-특이적 접합체에 비해 부위-특이적 접합체의 다른 잠재적인 개선은 구조적으로 필수 CSD 잔기 부근에 있는 라이신-접합 부위의 잠재적 간섭일 수 있다. 이러한 라이신 부위에 대한 페이로드 접합은 ADC의 결합 친화도에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 내인성 라이신 접합 sSPDB.DM4와 대비하여, 본원에 기재된 CysMab 접합 MPET.DM4를 사용하여 ADC의 결합 친화도를 시험하기 위해, 전술한 바와 같이 FACS에 의해 결합 친화도를 결정하였다. 아래 표는 일부 대표적인 친화도 데이터를 요약한 것으로, MPET.DM4 ADC와 대비하여 sSPDB.DM4 ADC의 결합 친화도의 경미한 감소를 나타낸다.
Figure pct00152
실시예 11: MPET.DM4 대 sSPDB.DM4 ADC의 시험관내 활성
ADC 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 alc 121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR3.9)의 세폭독성 효과를 전술한 바와 같이 시험관내 생존율 분석으로 평가하였다. 아래 표는 sSPDB.DM4에 비해 MPET.DM4 접합체의 유사한, 약간 개선된 활성을 보여준다. 이는 더 양호한 보존 친화도 또는 다른 인자의 결과일 수 있다.
Figure pct00153
다양한 적응증 환경을 포함하는 다양한 암 세포주에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 ADC를 추가로 시험하여, 수용체 밀도와 상관관계가 있는 실질적인 세포 사멸을 달성했다.
Figure pct00154
실시예 12: SCID-베이지 마우스에서 KE97 다발성 골수종 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 및 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 용량 의존적 생체내 효능
생체내 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 및 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 표적화된 항종양 활성을 입증하기 위해, 암컷 SCID-베이지 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 KE97 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 135 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=8). 마우스에게 0.5, 2, 또는 5 mg/kg의 최종 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4), 0.5, 2, 또는 5 mg/kg의 121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR 3.9), 또는 5 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
모든 시험 제제는 연구에서 내약성이 있었으며 어떤 처치 그룹에서도 독성 또는 체중 감소의 명백한 임상 증상은 관찰되지 않았다(표 23).
Figure pct00155
5 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4를 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 용량-의존적 항종양 효능을 나타냈고, ΔT/ΔC 값은 78.62%(0.5 mg/kg)인 반면, 2 및 5 mg/kg의 용량은 제1 용량 후 D9(이식 후 D23)까지 각각 33% 및 54%의 평균 퇴행을 나타냈다. 121G12.DAPA.sSPDB.DM4 처치도 용량-의존적 항종양 효능을 나타냈고, ΔT/ΔC 값은 85.38%(0.5 mg/kg) 및 13.77%(2 mg/kg)인 반면, 5 mg/kg 용량은 제1 용량 후 D9(이식 후 D23)까지 33%의 평균 퇴행을 나타냈다. 이식 후 D23 내지 D25까지, 대조 그룹 및 0.5 mg/kg 처치 그룹을 안락사시켰고, 나머지 그룹에 이식 후 D28에 2 또는 5 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 또는 2 또는 5 mg/kg의 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 제2 용량을 제공하였다. 이식 후 D42의 연구 종료일까지 2 및 5 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 뿐만 아니라 5 mg/kg의 121G12.DAPA.sSPDB.DM4에서 지속적인 종양 퇴행이 관찰되었다. 121G12.DAPA.sSPDB.DM4에 대해 2 mg/kg에서, 반응은 더 이질적이었고, 약 25%의 마우스가 지속적인 종양 퇴행을 나타낸 반면, 나머지 그룹은 안정성 질환 또는 종양 진행을 나타냈다(도 10, 표 23).
실시예 13: 더 큰 시작 종양 부피의 KE97 다발성 골수종 모델에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 대 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 효능 평가
제1 용량에서 더 큰 시작 종양 부피를 갖는 종양에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 121G12.DAPA.sSPDB.DM4(DAR3.9)의 효능을 비교하여 다양한 절단성 링커의 항종양 효능을 더 구별하기 위해 KE97 다발성 골수종 세포주를 사용하여 더 높은 바의 생체내 모델을 설정하였다. 암컷 SCID-베이지 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 KE97 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 450 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 2개의 처치 그룹에 무작위 배정하였다(n=8). 마우스에게 2 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 또는 121G12.DAPA.sSPDB.DM4의 IV 처치를 제공하였다.
2 mg/kg의 121G12.DAPA.sSPDB.DM4를 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 단회 용량 처치된 마우스의 75%(8마리 중 6마리)에서 부분적 퇴행/장기적 정체 상태를 나타냈다(도 11). 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4는 이 모델에서 121G12.DAPA.sSPDB.DM4를 훨씬 능가했다(D25 평균 종양 부피는 각각 524.83 ± 143.20 대 1337.13 ± 35.13, p<0.001; 독립표본 T-검정).
실시예 14: 원발성 환자 유래 비소세포폐암 HLUX1934 종양 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 생체내 효능
CCR7 발현 HLUX1934 원발성 비소세포폐암 이종이식 모델에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 항종양 활성을 평가하였다. 암컷 무흉선 누드 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 단편을 피하 이식하였다. 종양이 약 100 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(n=8). 마우스에게 10 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4), 또는 10 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 IV 처치를 제공하였다. 2주 후에 각 항체의 제2 용량을 전달하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
10 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4는 잠재적으로 HLUX1934 모델에서 오프-타겟에 대한 항체의 비특이적 결합으로 인해 비처치 그룹에 비해 종양 성장을 약간 지연시킨 것으로 보였다(ΔT/ΔC 값은 53.07%). 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 제2 용량의 투여로 지속된 더 뚜렷한 효능을 나타냈다. 10 mg/kg 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 뚜렷한 체중 감소 없이 양호한 내약성을 나타냈으며, 이식 후 D34에 ΔT/ΔC 값은 18.83%였다(도 12, 표 24).
Figure pct00156
실시예 15: SCID-베이지 마우스에서 KE97 다발성 골수종 이종이식 모델에 대한 684E12.SMCC.DM1의 생체내 효능
생체내 684E12.SMCC.DM1의 표적화된 항종양 활성을 입증하기 위해, 암컷 SCID-베이지 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 KE97 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 200 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=8). 마우스에게 2 또는 6 mg/kg의 최종 용량의 모체 684E12.SMCC.DM1(DAR2.6) 또는 6 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.SMCC.DM1의 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
모든 시험 제제는 연구에서 내약성이 있었으며 어떤 처치 그룹에서도 독성 또는 체중 감소의 명백한 임상 증상은 관찰되지 않았다. 2 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.SMCC.DM1 또는 모체 684E12.SMCC.DM1을 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 모체 684E12.SMCC.DM1의 6 mg/kg 처치는 투약 후 D11에 6.72%의 ΔT/ΔC 값을 나타냈다(p <0.0001, 일원 분산분석/Tukey 다중 비교 검정)(도 13).
실시예 16: KE97 종양 모델에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4에 의한 생체내 온-타겟 약력학적 마커 조절
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치 후 포스포-히스톤 H3 마커 양성 종양 세포의 축적을 사용하여 생체내 G2/M 정지를 유도하는 항-CCR7 ADC의 능력을 평가하였다.
연구를 수행하여 암컷 SCID-베이지 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 KE97 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 140 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=3). 마우스에게 2, 5, 또는 10 mg/kg의 최종 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4, 또는 10 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 단회 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다. 처치 48시간 후, 하기 면역조직화학 염색에 의해 포스포-히스톤 H3 수준의 평가를 위해 종양을 수집하였다.
면역조직화학에 의한 포스포-히스톤 H3 양성 핵의 축적을 측정하기 위해, 인간 히스톤 H3의 인산화 세린 10을 둘러싸는 잔기를 표적화하는 토끼 다클론 항체를 Ventana Medical Systems(Tuscon, AZ, Cat #760-4591)로부터 입수하였다. IHC 프로토콜은 가열 및 Ventana Discovery Cell Conditioner 1 항원 회복 시약에 대한 가벼운 노출(32분)을 포함했다. 샘플을 1차 항체(제조사에 의해 미리 희석)와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, OmniMap 항-토끼 HRP 2차 Ab(Ventana, Tuscon, AZ, Cat#760-4311)와 함께 12분 동안 인큐베이션하였다(제조사에 의해 미리 희석).
도 14a에서, 대표적인 비처치 및 이소형 대조 IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4는 때때로 포스포-히스톤 H3에 대해 양성인 종양 세포를 나타내지만, 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 투여 48시간 후에 포스포-히스톤 H3 면역염색의 강력한 용량-의존적 증가가 검출된다. MatLab(MathWorks, Natick MA)을 사용하여 신호의 정량화를 수행하였으며, 포스포-히스톤 H3 신호의 총 면적(μm2)을 핵의 총 면적(μm2)으로 정규화하여 처치 그룹 각각에 대해 아래에 나타낸 포스포-히스톤 H3 비(%)의 값을 생성하였다. 도 14b의 이들 데이터는 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4가 종양 이종이식편에서 강한 G2/M 정지를 야기할 수 있음을 나타내며, 이는 페이로드의 예상되는 작용 기전과 일치한다.
실시예 17: 121G12.CysMab.DAPA 항체의 생성 방법
본 실시예는 세포 배양물로부터 CCR7 항체 121G12.CysMab.DAPA를 생성하는 방법(Ab는 Ab를 암호화하는 벡터로부터 발현됨)을 설명한다. 세포 배양물에서 Ab가 발현되면, Ab는 다음과 같이 세포 배양물로부터 정제된다:
121G12.CysMab.DAPA 항체 약물 물질 중간체의 정제 방법에서 제1 단계는 인라인 심층 여과에 이은 0.2 μm 여과에 의한 세포 제거로 이루어진다.
제2 단계는 단백질 A 친화성 액체 크로마토그래피 단계로 이루어진다. 벌크 생성물의 총량에 따라, 이 단계는 여러 번 수행된다. 각각의 실행은 약 20 g/L 컬럼 부피의 최대 로딩을 허용한다. 용리는 약 pH 3.0의 50 mM 아세트산으로 수행된다. 조작 온도는 18~28℃이다. 모든 용리액을 모으고 바이러스 비활성화 단계 전에 2~8℃에서 보관한다.
단계 3은 "낮은 pH 처리" 바이러스 비활성화이다. 단계 2의 중간체 용액을 18~28℃로 조정하고, pH를 3.5(3.4~3.6의 범위)로 조정한다. 이어서, 생성물 중간체 용액을 70분(60~90분의 범위) 동안 바이러스 비활성화를 위해 유지한다. 유지 시간 후, 용액을 pH 6.0(5.8~6.2의 범위)으로 조정한다. 단계 종료시, 용액을 0.2 μm 여과와 함께 심층 여과하고 2~8℃에서 보관한다.
제4 단계는 통합된 온-컬럼 환원을 포함하는 결합/용리 모드의 양이온 교환 크로마토그래피이다. 역가에 따라, 이 단계는 여러 번 수행된다. 각각의 실행은 약 30 g/L 컬럼 부피의 로딩을 허용한다. 컬럼을 20 mM 석신산나트륨을 함유하는 완충액 A, pH 6.0으로 평형화한다. 온-컬럼 환원은 20 mM 인산나트륨, 1 mM EDTA, 7 mM L-시스테인, pH 7.1을 반응 완충액으로서 사용하여 수행된다. 환원 완충액을 완충액 A를 사용하여 제거하고, 완충액 A 및 10 mM 석신산나트륨, 300 mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 B, pH 6.0을 사용하여 10%에서 90%로의 선형 구배로 용리를 수행한다. 용리액 및 풀은 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 2~8℃에서 보관될 수 있다.
방법의 제5 단계는 관류(flow-through) 모드의 음이온 교환 크로마토그래피이다. 역가에 따라, 이 단계는 여러 번 수행된다. 각각의 실행은 약 350 g/L 컬럼 부피의 최대 로딩을 허용한다. 조작 온도는 18~28℃이다. 20 mM 석신산나트륨, 119 mM 염화나트륨, pH 6.0으로 평형화를 수행한다. 최종 여과물을 바이러스 제거 단계 전에 2~8℃에서 보관한다.
바이러스 여과, 단계 6은 0.1 μm 필터에 의한 예비여과에 이은 Planova 20N 나노필터에 의한 바이러스 여과로 이루어진다. 단계 5로부터의 중간체 용액의 온도를 바이러스 여과 전에 18~28℃로 조정한다. 조작 온도는 18~28℃이다. 나노여과 후, 중간체를 2~8℃ 또는 18~28℃에서 보관한다.
제7 단계, 한외여과/정용여과는 약 70 g/L까지의 농축 단계에 이은 10 mM 인산칼륨, pH 6.0에 의한 제1 정용여과 단계로 이루어진다. 7 이상의 정용여과 교환 계수를 목표로 한 다음 약 50 g/L로 희석한다. 최종 약물 물질 중간체는 0.2 μm 여과되고 2~8℃에서 보관된다.
마지막 제8 단계에서 최종 벌크 약물 물질 중간체를 적절한 용기에 분취량으로 채우고 동결 후 -60℃ 미만에서 보관한다.
Figure pct00157
실시예 18: NSG 마우스에서 OCI-LY3 ABC-DLBCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 의존적 생체내 효능
생체내 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 표적화된 항종양 활성을 입증하기 위해, 암컷 NSG 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 10x106개 세포를 피하 주사하여 ABC-DLBCL 모델, OCI-LY3 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 140 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=6). 연구 1일차 및 15일차에 마우스에게 0.5, 1, 또는 2 mg/kg의 최종 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4) 또는 2 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다. 모든 시험 제제는 연구에서 내약성이 있었으며 어떤 처치 그룹에서도 독성 또는 체중 감소의 명백한 임상 증상은 관찰되지 않았다(표 26).
2 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4를 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 용량-의존적 항종양 효능을 나타냈고, ΔT/ΔC 값은 74.6%(0.5 mg/kg) 및 10.7%(1 mg/kg)인 반면, 2 mg/kg 용량은 연구 28일차까지 65.9%의 평균 퇴행을 야기했다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg 그룹에서 6마리 중 3마리의 마우스가 완전 퇴행을 나타냈다(도 15).
Figure pct00158
실시예 19: SCID-bg 마우스에서 Toledo GCB-DLBCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 용량 의존적 생체내 효능
생체내 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 표적화된 항종양 활성을 입증하기 위해, 암컷 Scid-bg 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 GCB-DLBCL 모델, Toledo 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 100 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=4). 연구 1일차 및 15일차에 마우스에게 2 또는 5 mg/kg의 최종 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4) 또는 5 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다. 모든 시험 제제는 연구에서 내약성이 있었으며 어떤 처치 그룹에서도 독성 또는 체중 감소의 명백한 임상 증상은 관찰되지 않았다(표 27).
5 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4를 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치는 용량-의존적 항종양 효능을 나타냈고, ΔT/ΔC 값은 52.7%(2 mg/kg) 및 20.6%(5 mg/kg)였다(도 16, 표 27).
Figure pct00159
실시예 20: SCID-bg 마우스에서 DEL ALCL 이종이식 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 생체내 효능
생체내 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 표적화된 항종양 활성을 입증하기 위해, 암컷 Scid-bg 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106개 세포를 피하 주사하여 CCR7 양성 ALCL 모델, DEL 이종이식 모델을 확립하였다. 종양이 약 100 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=4). 연구 1일차 및 15일차에 마우스에게 2 mg/kg의 최종 용량의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4) 또는 2 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 isotype.MPET.DM4의 IV 처치를 제공하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
2 mg/kg의 비특이적 이소형 대조 hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4를 사용한 처치 후, 유의미한 항종양 효능은 관찰되지 않았다. 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg을 사용한 처치는 단회 용량 후 연구 14일차까지 40.2%의 평균 퇴행을 나타냈다(p<0.01). 15일차에 마우스에게 제2 용량을 제공하고 추가 3주 동안 마우스를 모니터링하였다. 1마리의 이상치 동물은 제2 용량의 처치에 반응하지 못했고, 종양 부담으로 인해 28일차까지 안락사시켜야 했다. 1마리의 추가 동물은 느린 질환 진행을 보였고 표적 발현 추적을 위해 28일차에 또한 제거되었다. 4마리 중 2마리의 마우스는 계속해서 종양 성장에 대한 지속적인 영향을 나타냈다(도 17). 모든 처치는 뚜렷한 체중 감소 없이 양호한 내약성을 나타냈다.
실시예 21: 원발성 환자 유래 비소세포폐암 HLUX1787 종양 모델에 대한 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 생체내 효능
CCR7 발현 HLUX1787 원발성 비소세포폐암 이종이식 모델에서 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4의 항종양 활성을 평가하였다. 암컷 NSG 누드 마우스에서 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양 단편을 피하 이식하였다. 종양이 약 150 mm3에 도달하면, 마우스를 종양 부피에 따라 처치 그룹에 무작위 배정하였다(그룹당 n=6). 1일차에 마우스에게 0.5, 2, 또는 5 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4(DAR4)의 IV 처치를 제공하고 2주 후 15일차에 제2 용량을 전달하였다. 모든 용량은 개별 마우스 체중에 맞추어 조정하였다.
더 낮은 용량의 접합 Ab에서는 유의미한 항종양 효능이 관찰되지 않았지만, 5 mg/kg의 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 처치에서는 부분 퇴행 또는 안정성 질환이 관찰되었다. 제2 용량 2주 후 지속적인 종양 효능이 관찰되었고, 처치의 D30에 1.3%의 ΔT/ΔC 값을 나타냈다(p<0.001; 일원 분산분석/Tukey 다중 비교 검정)(도 18). 모든 처치는 뚜렷한 체중 감소 없이 양호한 내약성을 나타냈다.
실시예 22: 인간 DLBCL PDX 모델에서의 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 활성
환자 집단에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4-유도 효능과 CCR7 역학과의 관계를 조사하기 위해, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4를 일련의 11개의 임의추출 DLBCL 환자 유래 이종이식편에 걸쳐 연구하였다(도 19). 이들 11개의 DLBCL PDX는 최대 3가지 이전 치료에 대한 내성/재발성 환자로부터 유래되었고, 그중 일부는 PDX 모델로 추가 치료를 받은 것이다. 이들 이전 치료는 리툭시맙과 조합된 다양한 화학치료 요법을 포함했다.
10 mg/kg i.v. Q2W의 용량 스케줄에서, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4는 약 64%의 전체 반응률을 나타내는, 7/11 DLBCL 모델에 대해 PR 또는 CR을 달성했다. 비처치 대조 종양을 사용하여 각 모델에 대한 CCR7 RNA 발현 수준을 결정하기 위해 정량적 PCR(RD-2019-00253)을 사용하였다. RNA 데이터와 종양 반응 데이터의 통합은 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 감수성과 표적 발현 사이의 상관관계를 시사한다(도 19).
요약하면, 이들 데이터는 DLBCL에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 전임상 활성의 증거를 제공하고, CCR7 표적 발현이 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4에 대한 감수성과 연관되어 있음을 시사한다.
실시예 23: 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 비-GLP 약동학
마우스 연구에서, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 i.v. 투여 후, 총 Ab 및 ADC에 대한 노출은 10 mg/kg 용량까지 거의 비례했다. 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 단회 용량 투여 72시간 후에 두 프로파일의 분리가 있었으며, 이는 ADC로부터 DM4의 탈접합을 나타낸다(도 20). 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 T1/2은 약 4~5일이었다. 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 제2 용량 후, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 축적비는 약 1.1~1.3이었다.
비GLP 원숭이 연구에서, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4를 투여한 후, 투여 약 72시간 후에 총 Ab 및 ADC의 농도 프로파일 분리가 관찰되었으며, 이는 DM4의 탈접합을 시사한다(도 21). DM4 및 s-메틸-DM4(sDM4)는 거의 모든 샘플에 대해 정량화 수준 미만(BLQ, 1.56 ng/ml)이었다. 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4는 2 내지 4 mg/kg 용량에서 용량 비례 관계를 나타냈다. 2 mg/kg의 두 가지 용량이 제공된 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 그룹 및 2 4 mg/kg의 두 가지 용량과 8 mg/kg의 두 가지 용량이 제공된 다른 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 그룹에서는 제안된 면역원성으로 인해 축적이 평가되지 않았다. 면역원성은 2 mg/kg의 제2 용량 및 4 mg/kg의 제2 용량 후에 관찰되었으며, 8 mg/kg 용량 후 면역원성의 추가 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 24: 시노몰구스 원숭이에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 GLP 반복 용량 약동학
전반적으로, 3주마다 제공된 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4에 대한 전신 노출은 4가지 주요 피분석물인 tAb, tADC, DM4, 및 sDM4로 측정시 시노몰구스 원숭이 GLP 연구에서 시험된 모든 용량에서 입증되었다. 약동학적 파라미터 추정치는 표 28에 요약되어 있다.
Figure pct00160
121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 투여 후, tADC의 농도는 총 Ab의 농도에 비해 더 빠르게 감소하였고, 이는 DM4의 탈접합을 시사한다(도 22). 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4는 1 mg/kg 내지 8 mg/kg의 용량 범위에 걸쳐 제1 용량 이후 대략 용량 비례적인 관계를 나타냈다. 용량 수준에 걸쳐 제2 용량 후에는 제안된 면역원성으로 인해 축적이 관찰되지 않았다. AUC168h를 기반으로 한 축적비는 8 mg/kg 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 제2 용량 후 0.34였다. 표적 매개 특징은 잠재적인 면역원성 효과 외에도 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 1 mg/kg 용량 수준의 클리어런스에 역할을 할 수 있다. tAb의 T1/2은 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 8 mg/kg 용량의 제1 용량 후 각각 37시간, 90시간, 및 94시간이었다. tADC의 T1/2은 모든 용량 후 약 3일이었다. 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 독성동역학에서 성별 차이는 나타나지 않았다.
DM4의 농도는 일반적으로 ADC의 농도의 0.008% 미만(몰비 0.4% 미만)으로 낮았으며, 이는 순환에서 최소 DM4를 나타낸다. DM4에 대한 노출은 대략 용량 비례적인 방식으로 증가했다. DM4에 대해 축적은 관찰되지 않았다. DM4의 T1/2은 약 3~4일이었고, sDM4는 거의 모든 샘플에 대해 BLQ였다. 따라서, sDM4에 대한 PK 파라미터는 추정되지 않았다.
실시예 25: 재발성/불응성 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL) 환자에 대한 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 I/Ib상 공개 라벨, 다기관 용량 증량 연구
연구 설계
연구 설계의 설명
이 연구는 FIH, 공개 라벨, I/Ib 상, 다기관 연구로서, 확장 파트로 이어지는, 단일 제제로서의 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 용량 증량 파트로 구성된다. 연구 설계는 도 23에 요약되어 있다. 증량 파트는 재발성/불응성 만성 림프구성 백혈병(r/r CLL) 및 비호지킨 림프종(r/r NHL) 환자를 대상으로 수행된다. 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 MTD/RD가 결정되면, 연구는 정의된 환자 집단에서 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4를 사용하는 확장 파트로 이어진다.
용량 증량 파트 동안 첫 3명의 피험자에 대해 시차적 접근 방식(staggered approach)이 등록에 사용되며 하기와 같이 진행된다:
· 첫 번째 피험자 투약, 최소 48 시간 대기
· 두 번째 피험자 투약, 최소 48 시간 대기
· 세 번째 피험자 투약
보건 당국이 모든 피험자의 시차를 요구하는 국가에서는 등록이 첫 3명의 피험자로 제한된다.
121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4는 3주마다 1회(Q3W) 정맥내 투여된다. 연구 약물은 피험자가 만성 림프구성 백혈병에 관한 국제 워크숍(iwCLL)의 2018년 개정 지침(Hallek et al, Blood; 131(25):2745-2760 (2018)) 또는 비호지킨 림프종의 반응 평가에 대한 권장사항(Lugano 분류)(Cheson et al, J Clin Oncol; 32(27):3059-68 (2014))에 따른 허용할 수 없는 독성, 진행성 질환을 경험할 때까지, 또는 임상시험자 또는 환자의 재량에 따라 치료가 중단될 때까지 투여된다. 예비 PK, PD, 안전성, 및 효능 결과를 포함한 이용가능한 비임상 및 임상 데이터에 의해 뒷받침되는 경우, 대체 투약 일정(예를 들어, 감소된 투약 빈도)이 연구 중에 적용될 수 있다.
NHL이 있는 청소년 피험자를 본 FIH 연구의 용량 확장 파트에 추가하는 것을 모색할 수 있다. 초기 안전성 프로파일과 약리학적 활성 용량이 성인 피험자에서 확인되면 청소년 피험자는 등록 자격이 있을 수 있다. 용량 증량 단계 동안 이러한 조건이 충족되면, 청소년 피험자가 참여할 수 있으며 성인에서 조사되는 동일한 용량 수준으로 등록된다.
확장 파트에서 조사해야 할 적응증
· 그룹 1: 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4, r/r 만성 림프구성 백혈병(CLL)
· 그룹 2: 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4, r/r 말초 T 세포 림프종(PTCL)
· 그룹 3: 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4, r/r 확산성 거대 B 세포 림프(DLBCL)
· 그룹 4: 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4, r/r 맨틀 세포 림프종(MCL)
· 그룹 5: 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4, r/r 소포림프종(FL)
확장 파트에서 적응증의 최종 선택 및 우선순위는 연구의 용량 증량 파트의 결과에 따라 결정된다.
용량 증량
용량 증량 동안, r/r CLL 및 r/r NHL이 있는 피험자는 MTD/RD에 도달할 때까지 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4로 치료받는다. 용량 증량은 조합된 집단에서 시작되지만, 다른 독성 프로파일이 관찰되는 경우 CLL 및 NHL에 대해 별도의 용량 증량이 허용된다. 용량 증량은 과용량 제어 증량(EWOC; Escalation with Overdose Control) 원칙에 따라 적응형 베이지안 계층적 로지스틱 회귀 모델(BHLRM)에 따른다. MTD/RD를 정의하기 위해서는 용량 증량 동안 약 28명의 피험자가 필요하다. RD는 확장을 위한 권장 요법(들) 및 용량(들)을 나타내며 CLL과 NHL 간에 차이가 있을 수 있다.
연구 치료의 안전성(용량-DLT 관계 포함) 및 내약성이 평가되며, 이러한 데이터의 검토를 기반으로 확장 파트에서 사용하기 위한 요법(들) 및 용량(들)이 확인된다. RD는 또한 PK, PD, 및 예비 항종양 활성에 대한 이용가능한 정보에 따라 결정된다.
용량 확장
각 질환 영역(NHL 또는 CLL)에 대한 RD가 결정되면, 연구 약물의 PK, PD, 및 안전성 프로파일을 추가로 특성화하고 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 예비 항종양 활성을 평가하기 위해 추가 피험자가 확장 파트에 등록된다.
용량 확장 파트는 모든 이용가능한 독성 정보(DLT가 아닌 이상사례 및 실험실 이상이 포함됨) 및 BHLRM로부터의 향후 피험자에 대한 위험 평가를 임상시험자 및 기타 연구 담당자가 고려한 후에만 시작될 수 있다. 이용가능한 PK, 예비 효능, 및 PD 정보도 고려된다.
확장 파트에서는 도 23에 도시된 바와 같이 종양 유형에 따라 피험자들이 다른 그룹으로 배정된다. 각 그룹은 약 20명의 피험자를 등록한다. 이러한 그룹 중 하나의 등록은 용량 증량 파트의 새로운 데이터에 대한 검토 및 확장 코호트의 데이터에 대한 진행 중인 검토를 기반으로 조기에 중단될 수 있다. 용량 증량 파트의 데이터는 연구의 확장 파트에서 적응증 우선순위 지정에 사용될 수 있다.
이론적 근거
연구 설계에 대한 근거
본 I/Ib상, 공개 라벨 연구의 설계는 r/r CLL 및 r/r NHL이 있는 피험자를 대상으로 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 안전성과 내약성을 특성화하고 향후 연구를 위한 권장 용량 및 요법을 결정하는 것을 목표로 한다. 용량 증량은 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 MTD 설정을 가능하게 하며, 베이지안 계층적 로지스틱 회귀 모델(BHLRM)에 따른다. BHLRM은 암 피험자의 MTD를 추정하는 잘 확립된 방법이다. 적응형 BHLRM은 연구에 대한 향후 피험자의 DLT 위험을 제어하기 위해 과용량 제어 증량(EWOC) 원칙에 따른다. 이는 이용가능한 이전 정보의 통합을 가능하게 하고, 임상 연구에서 관찰된 용량 제한 독성(DLT)에 대한 새로운 정보를 기반으로 모델 파라미터를 업데이트한다. 시험의 모든 단계에서 모델이 각 적응증에 권장하는 용량은 마지막 환자 그룹에서 관찰된 DLT의 수만이 아니라 이전 코호트의 이용가능한 모든 DLT 정보의 전체 이력을 기반으로 한다. 따라서 업데이트된 모델은 상기 언급된 바와 같은 각 질환 영역에 대해 현재 용량에서 다음의 예측 용량 수준까지 DLT의 확률에 대한 정보를 제공한다. 소규모 데이터세트에 대한 베이지안 응답 적응형 모델의 사용은 EMEA("Guideline on clinical trials in small populations", 2007년 2월 1일)에서 승인되었으며 많은 공개문헌에 의해 확인되었고(문헌[Babb et al, Statist Med; 17: 1103-1120 (1998), Neuenschwander et al, Statistics in medicine; 27(13), pp.2420-2439 (2008), Neuenschwander et al, Clinical Trials; 7(1), pp.5-18 (2010), Neuenschwander et al, In Statistical Methods in Drug Combination Studies. Zhao W and Yang H (eds), Chapman & Hall/CRC, 2014]), 해당 모델의 개발 및 적절한 사용은 FDA의 핵심 경로 구상(Critical Path Initiative)의 한 측면이다.
상이한 적응증(r/r CLL 및 r/r NHL)이 서로 다른 임상 증상을 가질 수 있다는 점을 감안할 때, MTD와 RD는 이러한 적응증 간에 다를 수 있다. 따라서, 본 연구는 이러한 두 질환 영역 각각에 대해 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 용량 수준에 걸쳐 DLT 반응률의 유사성 수준을 평가하는 모델을 사용하고 있다. CLL과 NHL에 대해 DLT 반응률이 유사한 경우, 모델을 통해 CLL과 NHL 간에 정보를 공유하여 MTD 추정치의 불확실성을 줄일 수 있다. 그러나, 이용가능한 안전성 데이터(DLT, SAE, 더 낮은 등급의 AE, 또는 후기 독성 포함)가 CLL과 NHL 간에 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 DLT 반응률과 독성 프로파일의 차이를 시사하는 경우, 연구 설계를 통해 CLL과 NHL 간의 잠재적인 추가 증량의 분리 및 각 적응증에 대한 별도의 MTD/RD 결정이 가능하다.
새로운 용량 수준에 대한 결정은 결정 시점에 이용가능한 PK, PD, 및 예비 활성 정보와 함께 피험자 내약성 및 안전성 정보(DLT 위험의 BHLRM 요약 포함)의 검토를 기반으로 용량 증량 회의에서 임상시험자 및 기타 연구 담당자에 의해 이루어진다.
연구의 확장 파트는 다중 군 설계와 함께 공개 라벨을 갖는다. 확장 파트의 목적은 r/r CLL, PTCL, DLBCL, MCL, 및/또는 FL에 대해 선택된 용량에서 단일 제제 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 안전성, 내약성, PK, PD, 및 예비 항종양 활성을 추가로 평가하는 것이다. 연구의 용량 증량 파트 결과는 확장 파트에서 적응증의 우선순위 정보를 제공할 수 있다.
진행성, 치료 내성 질환이 있는 청소년 피험자는 신규 약제를 테스트하는 임상 시험에 등록하기 위한 옵션이 상대적으로 제한적이다. 관련 메커니즘을 표적화하는 제제 및 체계적인 용량 결정 연구에 대한 더 많은 접근이 필요하다(문헌[Gore et al, J Clin. Oncol; 35(33):3781-3787 (2017), Leong et al, J Clin Pharmacol; 57 Suppl 10:S129-S135 (2017)]).
진행성 내성 또는 불응성 NHL 질환이 있는 청소년 피험자는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 초기 안전성 프로파일 및 약리학적 활성 용량이 성인에서 확인되면 본 임상 시험에 등록할 자격이 있을 수 있다. 12세 이상 피험자의 포함은 약물이 성인과 비교하여 청소년에서 유사한 독성 프로파일, 최대 허용 용량, 및 약동학적 파라미터를 갖는다는 것을 보여주는 공개문헌에 의해 뒷받침된다(문헌[Moreno et al, Nat Rev Clin Oncol; 14(8):497-507 (2017), Chuk et al, Clin Cancer Res; 23(1):9-12 (2017), Momper et al, JAMA Pediatr; 167(10):926-32 (2013), Leong et al, J Clin Pharmacol; 57 Suppl 10:S129-S135 (2017)]).
용량/요법 및 치료 기간에 대한 근거
ICH S9 지침에 따라, 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 시작 용량은 원숭이에 대한 GLP 반복 용량 독성 연구에서 관찰된 HNSTD(8 mg/kg)의 1/6을 기준으로 계산되었으며, 이는 0.4 mg/kg의 시작 용량을 제공한다. 0.4 mg/kg의 용량은 체표면적을 기준으로 약 6배, 및 GLP 원숭이 연구에서 8 mg/kg의 제1 용량 투여 후 관찰된 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 노출에 비해 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 Cmax에 대해 약 18배 및 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 AUC에 대해 9배의 안전 여유를 제공한다(표 29). 0.4 mg/kg의 용량에서, DM4 페이로드와의 다른 ADC를 사용한 임상 연구에서 이러한 이상사례를 경험한 피험자에서 관찰된 문헌에 보고된 노출에 기초하면 안구 독성이 발생할 것으로 예상되지는 않는다(문헌[Moore et al, Cancer; 123(16):3080-3087 (2017); Moore et al, J.Clin.Oncol: 32:15 (Suppl): 5571 (2014)]).
OCI-Ly3 이종이식 마우스 모델의 효능 및 PK 데이터의 예비적 종양 동역학 모델링은 7.5 ug/mL의 평균 농도가 종양 정체를 유발할 수 있음을 시사한다. 모델링 및 시뮬레이션에 기초하여, 인간 유효 용량은 1.1 mg/kg인 것으로 예측되며 이 용량에서 종양 정체가 달성될 것으로 예상된다.
3주마다 1회(Q3W) 투여되는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4는 진행성 종양 적응증에 적용되는 표준 안전 여유를 포함하여 시노몰구스 원숭이에서 관찰된 비임상 안전성, 내약성, 및 PK 데이터를 기반으로 선택되었다. 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 용량은 BHLRM의 사용 및 이용가능한 데이터의 임상 검토에 따라 순차적 코호트에서 증량될 것이다.
Figure pct00161
집단
본 연구는, 적응증에 대한 표준 치료 요법(CLL에 대한 항-CD20 요법, BTK 억제제, 및 베네토클락스; NHL에 대한 항-CD20 요법을 포함하는 2개 이상의 이전 치료 요법)을 받았지만 실패했거나, 승인된 요법에 대해 불내성 또는 부적격이고 치료 요법이 없는, 재발성 또는 불응성 CLL 및 NHL 환자를 대상으로 수행된다.
임상시험자 또는 피지명자는 하기의 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준 중 어느 것에도 해당되지 않는 환자에게만 본 연구의 치료가 제공되도록 해야 한다.
포함 기준
이 연구에 포함될 자격이 있는 피험자는 하기의 모든 기준을 충족해야 한다:
모든 CLL 환자의 경우:
1. 확인된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 진단
모든 NHL 환자의 경우:
2. 조직학적으로 확인된 B 세포 또는 T 세포 비호지킨 림프종(NHL) 진단
3. 생검이 가능한 질환 부위가 있어야 하고, 스크리닝 및 치료 중 연구에 필요한 생검을 실시할 의향이 있고 적합해야 함.
CLL 및 NHL 모두에 적용가능한 배제 기준
임의의 다음 기준을 충족하는 피험자는 본 연구에 포함될 자격이 없다.
1. 환자가 면역글로불린/모노클론 항체 투여를 견딜 수 없을 정도의 ADC, 모노클론 항체(mAb), 및/또는 그 부형제에 대한 아나필락시스 또는 기타 심각한 과민 반응/주입 반응의 병력
2. 메이탄신(DM1 또는 DM4) 기반 ADC로 치료한 임의의 이전 병력
3. 메이탄시노이드에 대한 알려진 불내성
4. 임의의 활성 또는 만성 각막 장애가 있는 환자
5. 망막 또는 안저의 모니터링을 방해하는 임의의 기타 병태가 있는 환자.
6. 활성 CNS 침범이 있는 환자는 CNS 침범이 효과적으로 치료된 경우 및 국소 치료가 등록 전 4주 초과인 경우를 제외하고 배제된다. CNS 질환에 대해 효과적으로 치료되었고 전신 요법하에서 안정적인 환자는 다른 모든 포함 및 배제 기준이 충족되는 경우 등록될 수 있다.
7. 손상된 심장 기능 또는 임상적으로 중요한 심장 질환
8. HIV 감염의 알려진 병력
9. 활성 HBV 또는 HCV 감염
치료
연구 치료
용어 "임상시험용 약물"은 본 연구의 경우 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4를 지칭한다.
임상시험용 및 대조 약물
Figure pct00162
연구 수행 중에 데이터가 나타남에 따라 대체 투약 요법이 선호될 수 있음을 본 연구로부터의 새로운 증거가 나타내는 경우, 해당 요법이 모색될 수 있다.
추가 연구 치료
환자는 치료받는 동안 방부제가 없는 윤활 점안액을 하루 4~6회 양 눈에(눈당 1~2방울) 적용해야 한다. 일회용 안약이 권장된다.
환자가 주입 반응을 경험하는 경우, 환자는 후속 투약일에 예비투약을 받을 수 있다. 관리가능한 2등급 주입 관련 반응 후, 모든 후속 환자는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 주입 적어도 30분 전에 아세트아미노펜/파라세타몰(650 mg PO) 및 디펜히드라민 하이드로클로라이드 또는 동등한 항히스타민제(25~50 mg PO 또는 IV)로 예비투약을 받는 것이 권장된다. 3등급 또는 관리 불가능한 2등급 주입 관련 반응 후, 모든 후속 환자는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 주입 전에 추가로 덱사메타손(10 mg PO 또는 IV) 또는 동등한 코르티코스테로이드로 예비투약을 받아야 한다.
급성 알레르기 반응은 기관의 표준 치료에 따라 필요에 따라 치료해야 한다. 용량 수정 지침이 포함되어 있다. 아나필락시스/아나필락시스유사 반응의 경우, 정상적인 심폐 상태를 회복하는 데 필요한 임의의 요법이 포함된다. 환자가 심각한 아나필락시스/아나필락시스유사 반응을 경험하면 즉시 주입을 중단해야 한다. 환자는 연구 담당자와 논의한 후에만 연구 치료를 재개할 수 있다. 피험자가 3등급 이상의 아나필락시스/아나필락시스유사 반응을 경험하는 경우, 피험자는 연구에서 영구적으로 중단된다.
환자는 심폐소생술이 가능한 시설에서 치료받아야 한다. 적절한 소생 장비가 갖춰져 있어야 하며 의사가 쉽게 사용할 수 있어야 한다.
임상시험자가 특정 상황에서 "알레르기 반응", "아나필락시스", 또는 "사이토카인 방출 증후군"과 같은 다른 범주가 더 적절하다고 판단하지 않는 한, "주입 관련 반응"의 CTCAE v5.0 범주를 사용하여 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 주입 반응을 설명해야 한다. 급성 사건이 사이토카인 방출 증후군인지 여부가 불확실한 경우, 실험실 평가를 위해 적절한 혈액 샘플을 수집해야 한다.
치료 군/그룹
모든 피험자는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 단일 제제를 받으며, 용량 증량 파트 동안 특정 코호트에 배정되거나 첫 스크리닝 방문시 적용가능한 확장 그룹에 배정될 것이다.
이 연구에서 피험자 무작위 배정은 없을 것이다.
치료 기간
각 사이클은 21일이 될 것이다. 해결되지 않은 AE로부터 회복하기 위해 예정된 용량이 지연될 수 있다. 이 경우, AE가 1등급 또는 기준선으로 해결되면 용량이 재개될 수 있으며, 사이클의 시작 및 후속 사이클은 그에 따라 변경된다. 피험자가 연구 약물(들)과 관련된 해결되지 않은 AE로 인해 예정된 용량의 예정된 날로부터 21일을 초과하는 용량 중단을 필요로 하면, 피험자가 임상적 혜택을 받고 있고 임상시험자의 의견으로는 연구 치료를 계속하는 것이 피험자에게 최선의 이익인 경우 외에는, 피험자는 연구 치료를 중단해야 한다. 피험자는 연구 담당자와 논의한 후 치료를 재개할 수 있다.
피험자가 (CLL 환자의 경우) 만성 림프구성 백혈병에 관한 국제 워크숍(iwCLL)의 2018년 개정 지침(Hallek et al, Blood; 131(25):2745-2760 (2018)) 또는 (NHL 환자의 경우) 비호지킨 림프종의 반응 평가에 대한 권장사항(Lugano 분류)(Cheson et al, J Clin Oncol; 32(27):3059-68 (2014))에 따른 허용할 수 없는 독성, 확인된 질환 진행을 경험할 때까지, 및/또는 임상시험자 또는 피험자의 재량에 따라 치료가 중단되거나, 동의 철회가 있을 때까지, 피험자는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4로 치료를 계속할 수 있다.
약물 관련 독성으로 인해 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 2회 이상의 용량을 건너뛰어야 하는 경우 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4를 영구적으로 중단해야 한다. 연구 중단 기준을 충족했지만 임상시험자의 평가에 따르면 안전성 문제 없이 임상적 이점(예: 다른 부위의 질환 축소 또는 증상 개선)의 증거가 있는 피험자는 임상시험자와 의료 모니터 사이의 문서화된 논의 후에 연구를 계속하는 것이 허용될 수 있다. 임상시험자는 연구 치료를 계속할 수 있는 옵션 및 다른 치료 옵션과 그 이점이 있는 경우 이를 환자에게 알려야 한다.
시작 용량
원숭이에 대한 GLP 독성 연구에서의 8 mg/kg Q3W의 HNSTD에 기초하여, FIH 시험에서 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4에 대해 계산된 시작 용량은 0.4 mg/kg이다. 0.4 mg/kg의 용량은 인체 노출에 대한 체표면적 규모 추정에 기초하여 약 6배의 안전 여유를 제공한다. 또한, 0.4 mg/kg의 시작 용량에서, 인간에서의 노출 안전 여유는 GLP 원숭이 연구의 8 mg/kg에서 관찰된 상응하는 노출과 비교하여 Cmax의 경우 약 18배, AUC의 경우 9배이다. 이 시작 용량은 예상치 못한 이상사례의 위험이 낮은 것으로 간주되었다. 예측된 유효 용량은 이종이식 마우스 모델을 기반으로 1.1 mg/kg이었지만, 더 낮은 용량에서 활성이 나타날 수 있다.
잠정 용량 수준
표 31은 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 인간 PK에 대한 초기 예측 및 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 전신 노출과 독성 간의 관계에 대한 예측을 기반으로, 이 시험 동안 평가될 수 있는 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4에 대한 시작 용량 및 잠정 용량 수준을 나타낸다. 더 낮은 용량 수준에 대한 용량 증분은 예상되는 유효 용량을 기준으로 선택되었다. 실제 용량 수준은 용량 증량 원격 회의 중에 참여 임상시험자와 논의한 후, BHLRM에 따른 이용가능한 독성, PK, 및 PD 데이터를 기반으로 결정된다. 표 31에 나타낸 잠정 용량 수준들 사이의 중간 용량 수준, 및/또는 6.0 mg/kg 초과의 용량을 포함하여, 연구 중에 추가 용량 수준이 추가될 수 있다. 시작 용량은 0.4 mg/kg이다.
Figure pct00163
확장 파트에 대한 용량 증량 및 용량 선택 지침
용량 증량은 확장 파트에서 사용할 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 용량을 설정하기 위해 수행된다. 구체적으로, 이는 최대 허용 용량(MTD)을 고려하여 안전성, 내약성, PK, 모든 이용가능한 효능, 및 PD의 검토를 통해 평가할 때 연구 담당자의 관점에서 가장 적절한 위험편익이 있는 하나 이상의 용량이다.
MTD는 치료 피험자의 33% 초과에서 DLT 평가 기간 동안 용량 제한 독성(DLT)을 유발할 위험이 25% 미만으로 추정되는 최고 용량이다. I상 확장을 위해 선택된 용량은 MTD 이하의 임의의 용량일 수 있으며, MTD 확인 없이 확정될 수 있다. 각 용량 증량 코호트는 새로 치료받은 1명 내지 6명의 피험자로 시작된다. 용량 증량 결정을 위해 평가가능한 것으로 간주되려면 적절한 노출과 후속 조치가 있어야 한다.
DLT 평가 기간 동안 임의의 피험자가 DLT를 경험하는 경우, DLT가 있는 임의의 질환 영역에 대해 최소 3명의 피험자를 포함하도록 최소 코호트 크기가 증가된다.
한 명 이상의 피험자가 중단되고 평가 기준을 충족하지 못하는 경우, 위험편익 평가를 지원하기 위해 대체 정책을 사용하여 동일한 코호트에 추가 피험자를 등록할 수 있다.
이전에 테스트되어 안전한 것으로 나타난 임의의 용량보다 높은 용량 수준에서 코호트의 첫 3명의 피험자 사이에 투약을 개시하는 것은 최소 48시간 시차를 둔다. 즉, 두 번째 및 세 번째 환자는 이전 환자가 주입을 받은 후 최소 48시간 후에만 첫 번째 주입을 받을 수 있고, 이는 연구 담당자의 문서화된 통신을 통해 확인된다.
코호트의 모든 피험자가 DLT 평가 기간을 완료하거나 중단하면 용량 증량 결정이 내려진다. 결정은 용량 증량 원격 회의에서 연구 담당자에 의해 이루어지며, 안전성 정보, PK, 이용가능한 PD, 및 예비 효능을 포함하여, 진행 중인 연구에서 평가된 모든 용량 수준에서 이용할 수 있는 모든 관련 데이터의 종합을 기반으로 한다.
연구 담당자가 내린 용량 증량 결정은 베이지안 계층적 로지스틱 회귀 모델(BHLRM)에 의해 EWOC 원칙을 충족하는 용량 수준을 초과하지 않는다. 모든 경우에, 후속 증량 코호트에 대한 용량은 선행 테스트된 안전 용량으로부터 100% 증가를 초과하지 않는다. 연구 담당자는 이용가능한 모든 임상 데이터를 고려하여 더 적은 용량 증가를 권장할 수 있다.
추가 증량 진행 전 또는 진행 중에 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4의 안전성, 내약성, PK, PD, 또는 항종양 활성을 보다 잘 이해하기 위해, (예를 들어, 선택 적응증에서) 1명 내지 6명의 피험자의 강화 코호트를 이전에 테스트되어 안전한 것으로 나타난 최고 용량 이하의 임의의 용량 수준으로 등록할 수 있다.
피험자를 과도한 독성 용량에 노출시킬 위험을 줄이기 위해, 2명의 피험자가 새로운 코호트에서 DLT를 경험할 경우, BHLRM은 현 코호트의 모든 피험자가 평가 기간을 완료하기를 기다리지 않고 모든 코호트의 최신 정보로 업데이트된다.
두 번의 DLT가 증량 코호트에서 발생할 경우, 해당 코호트에 대한 등록이 중단되고 후속 코호트는 EWOC 기준을 충족하는 더 낮은 용량 수준에서 개시된다.
두 번의 DLT가 강화 코호트에서 발생할 경우, 모든 관련 데이터를 재평가했을 때, 용량이 여전히 EWOC 기준을 충족하는 경우에만 추가 피험자가 공개 코호트에 등록될 수 있다. 대안적으로, 동일한 용량에 대한 모집을 계속할 수 없는 경우, EWOC 기준을 충족하는 더 낮은 용량으로 새로운 피험자 코호트를 모집할 수 있다.
새로 등록된 피험자에게 허용되지 않는 것으로 간주되는 용량인 경우에도, 진행 중인 피험자는 피험자에게 최선의 이익이 되는 경우 연구 담당자의 재량에 따라 해당 용량 수준에서 치료를 계속할 수 있다.
두 번의 DLT 발생 시나리오 외에도, 테스트 중인 현재 용량은 코호트가 완료되기 전에, DLT 관찰을 포함하되 이에 제한되지 않는 새로운 안전성 결과를 바탕으로 감량될 수 있다. 감량을 결정한 후, 후속 코호트의 데이터가 이를 뒷받침하는 경우(EWOC 기준이 충족됨) 재증량이 시행될 수 있다.
필요한 경우, 연구 설계를 통해 CLL과 NHL 간의 잠재적인 추가 증량의 분리 및 각 질환 영역에 대한 별도의 MTD/RD 결정이 가능하다. 연구를 시작할 때, 용량과 DLT 확률 간의 관계는 CLL과 NHL에 대해 동일한 것으로 가정된다. 그러나, 연구 과정에 걸쳐, BHLRM은 관찰된 DLT 정보를 바탕으로 CLL과 NHL 간에 상이한 DLT 확률을 추정할 수 있으며, 두 질환 영역에 대해 후속 코호트에 대한 상이한 용량 수준이 결정될 수 있다. 이 경우, 관련 질환 영역으로부터 환자를 모집하는 각각의 확인된 용량 수준에서 1명 내지 6명 환자의 코호트가 개시되며, 질환 영역에 걸쳐 최대 총 6명의 환자가 이전에 안전한 것으로 나타난 최고 용량 수준보다 높은 용량 수준으로 치료받는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야에 정통한 전문가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 명시되지 않는 한, 구체적으로 상세하게 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술, 및 조작은 당업자에게 자명한 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경기술, 및 거기에 인용된 추가의 참고문헌을 또한 참조한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 인용된 참고문헌은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 청구범위는 비제한적이고 하기에 제공된다.
특정 양태 및 청구범위가 본원에서 상세히 개시되어 있긴 하지만, 이는 예시만을 목적으로 예로서 주어진 것이고, 첨부된 청구범위의 범위, 또는 임의의 상응하는 향후 출원의 청구범위의 요지의 범위에 대해 제한하려는 것이 아니다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명에 다양한 치환, 변경, 및 변형이 이루어질 수 있음을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 양태의 지식을 가진 당업자에게는 통상적인 사항인 것으로 여겨진다. 다른 양태, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 당업자는 통상적인 범위를 넘지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명의 구체적 양태의 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 이후 출원되는 상응하는 출원에서 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인해 청구범위가 재작성될 수 있으며, 이는 청구범위의 요지를 포기하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
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cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtggtgac agtgccctcc agctctctgg gaacccagac ctatatctgc 600 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagtggagcc caagagctgc 660 gacaagaccc acacctgccc cccctgccca gctccagaac tgctgggagg gccttccgtg 720 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 780 tgcgtggtgg tggccgtgtc ccacgaggac ccagaggtga agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg agcagtacaa cagcacctac 900 agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaagtct ccaacaaggc cctggctgcc ccaatcgaaa agacaatcag caaggccaag 1020 ggccagccac gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc cctgtgatat cgccgtggag 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccccccagt gctggacagc 1200 gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agtccaggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcctga gccccggcaa g 1341 <210> 612 <211> 16 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 625 gacgtggtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcctgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtccggcca gtccctgctg gactccactg gcaagaccta cctgaactgg 120 ttcctgcagc ggcctggcca gtcccctcgg cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 agcggcgtgc ccgacagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct ggcagggcac ccacttcccc 300 cagaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcaag 336 <210> 626 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 626 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 627 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 627 gacgtggtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcctgtga ccctgggcca gcctgcctcc 60 atctcctgca agtccggcca gtccctgctg gactccactg gcaagaccta cctgaactgg 120 ttcctgcagc ggcctggcca gtcccctcgg cggctgatct acctggtgtc caagctggac 180 agcggcgtgc ccgacagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct ggcagggcac ccacttcccc 300 cagaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcaagcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagtggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657 <210> 628 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 628 His His His His His His 1 5 <210> 629 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 629 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Arg Ser Pro 1 5 10 15 Ala Met Pro Glu Asn Leu 20

Claims (22)

  1. 치료를 필요로 하는 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 항체 약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법[암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00164

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수임].
  2. 암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체를 포함하는 조성물[암은 치료를 필요로 하는 대상체에서 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00165

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수임].
  3. 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 항체 약물 접합체의 용도[암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00166

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수임].
  4. 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 항체 약물 접합체의 용도[암은 CCR7을 발현하는 소포림프종(FL)이고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00167

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수임].
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 재발성 또는 불응성 소포림프종인, 방법, 조성물, 또는 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 하기 식:
    Figure pct00168

    [식에서 n은 약 3 내지 약 4이고, Ab는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체임]; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 염이 아닌 형태인, 방법, 조성물, 또는 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체 또는 조성물은 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합하여 환자에게 투여되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료 화합물은 표준 치료 화학요법제, 공동자극 분자, 또는 체크포인트 억제제로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  10. 제9항에 있어서, 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING, 또는 CD83 리간드의 작용제로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  11. 제9항에 있어서, 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, 및/또는 TGFR 베타의 억제제로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  12. 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 대상체에게 항체 약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법[암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00169

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수이고,
    항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여됨].
  13. 암의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 접합체를 포함하는 조성물[암은 치료를 필요로 하는 대상체에서 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00170

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수이고,
    항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여됨].
  14. 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 항체 약물 접합체의 용도[암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00171

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수이고,
    항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여됨].
  15. 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료를 위한 항체 약물 접합체의 용도[암은 CCR7을 발현하고, 항체 약물 접합체는 하기 식
    Figure pct00172

    또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 식에서
    Ab는 인간 CCR7 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L은 링커이고;
    D는 약물 모이어티이고;
    m은 1 내지 8의 정수이고;
    n은 1 내지 12의 정수이고,
    항체 약물 접합체는 상기 대상체에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여됨].
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 하기 식:
    Figure pct00173

    [식에서 n은 약 3 내지 약 4이고, Ab는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체임]; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 염이 아닌 형태인, 방법, 조성물, 또는 용도.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 말초 T 세포 림프종(PTCL), 예컨대 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATLL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL), 비호지킨 림프종(NHL), 예컨대 맨틀 세포 림프종(MCL), 버킷 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 및 소포림프종(FL), 및 비소세포폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 재발성 또는 불응성 암인, 방법, 조성물, 또는 용도.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 약 3주마다 1회 투여되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 1회 사이클, 2회 사이클, 3회 사이클, 4회 사이클, 또는 5회 사이클 동안 치료받는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체는 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
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