KR20220170775A - Recombinant vector for improving expression of target protein through suppressing intracellular immune response and the application thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 숙주세포 내의 면역 반응을 억제하여 목적 단백질의 발현을 향상시키기 위한 재조합 벡터과 이의 응용에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant vector and its application for enhancing the expression of a target protein by suppressing an immune response in a host cell.
세포는 바이러스의 침입으로부터 개체를 보호하기 위하여 cGAS-cGAMP-STING 경로를 통하여 사이토카인을 발현하고 세포사멸을 유도한다. cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)는 세포질 DNA(Cytosolic DNA)와 결합하여 활성화되고, 활성화된 cGAS는 2'3'-cGAMP(2'3'-cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate)을 생성시켜 선천성 면역 반응(innate immune responses)을 유도한다(비특허문헌 1). 선천성 면역 반응은 다양한 원인에 의해 세포가 손상된 경우에도 발생하는데, 특히, 미토콘드리아의 손상에 의해 미토콘드리아의 DNA가 세포질로 유출된 경우에도 바이러스 침입의 경우와 마찬가지로 STING 경로 활성화에 의해 세포사멸이 유도된다(비특허문헌 2).Cells express cytokines and induce apoptosis through the cGAS-cGAMP-STING pathway to protect individuals from virus invasion. Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is activated by binding to cytosolic DNA, and the activated cGAS generates 2'3'-cGAMP (2'3'-cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate), resulting in an innate immune response (innate immune responses) are induced (Non-Patent Document 1). The innate immune response occurs even when cells are damaged by various causes. In particular, when mitochondrial DNA is leaked into the cytoplasm due to mitochondrial damage, apoptosis is induced by STING pathway activation as in the case of viral invasion ( Non-Patent Document 2).
한편, 세포 및 생명체에서의 특정 유전자 기능을 연구하기 위해서 유전자 전달체인 재조합 DNA 벡터시스템을 이용하여 해당 유전자의 과발현 또는 저발현을 유도하는 방법이 가장 일반적으로 사용된다. 이에 따라 유전자의 기능을 온전히 규명하기 위해서는 DNA 벡터 시스템의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있다. 그러나, 유전자 기능을 규명하기 위해 사용하는 DNA 벡터 자체가 cGAS를 활성화시킬 수 있으며, 이러한 cGAMP 시그널링은 크로스토크(cross-talk)가 매우 강하므로, 정작 보고자 하는 목적 유전자의 기능 연구에 큰 간섭을 줄 것으로 예상된다.On the other hand, in order to study the function of a specific gene in cells and organisms, a method of inducing over- or under-expression of a corresponding gene using a recombinant DNA vector system, which is a gene delivery system, is most commonly used. Accordingly, it can be said that the role of the DNA vector system is very important in order to fully identify the function of the gene. However, the DNA vector itself used to identify gene function can activate cGAS, and since this cGAMP signaling has very strong cross-talk, it will greatly interfere with the study of the target gene's function. It is expected.
뿐만 아니라, cGAS 경로는 세포치료제의 개발 및 생산 단계에서 발생하는 세포주의 세포사멸과도 관련성이 있을 것으로 추정된다. 유전공학 변형을 이용한 세포치료제 또는 유전자치료제 개발에 있어서 형질전환세포의 생존력이 낮은 문제로 인하여 상업화에 어려움이 있다. 현재 세포주를 사용하여 세포치료제를 개발할 때 방사선을 조사하여 생명체에 주입하기 때문에 세포 내에 자체적으로 DNA 조각들이 매우 많이 발생하며, 이로 인해 세포사멸(apoptosis)이 유도된다. 또한 2017년 FDA 승인을 받은 이후로 그 연구가 활발하게 진행되고 있는 대표적 면역세포치료제 CAR(chimeric antigen receptor)-T 치료제의 경우 대부분 in vitro에서는 효과를 나타냈지만 실제로 생체 내부에서는 유의미한 치료 효과를 나타내지 못하는 문제가 드러났는데, 이는 생체 내부에서 T 세포의 생존률 및 계속 증식 효율이 낮기 때문이라고 보고 있다. 면역세포치료의 성패를 결정하는 것은 주입된 T 세포의 단발적인 효과 보다는 생체 내부에서 T 세포의 계속 증식 가능 여부이기 때문에 CAR-T 세포의 생체 내부에서의 장기 생존은 반드시 해결해야 할 중요한 과제이다.In addition, the cGAS pathway is presumed to be related to apoptosis of cell lines that occurs during the development and production of cell therapy products. In the development of cell therapy products or gene therapy products using genetic engineering transformation, there are difficulties in commercialization due to the low viability of transformed cells. When cell therapy products are developed using current cell lines, since radiation is irradiated and injected into living organisms, a large number of DNA fragments are generated within the cell itself, which induces apoptosis. In addition, in the case of CAR (chimeric antigen receptor)-T treatment, a representative immune cell therapy drug that has been actively researched since receiving FDA approval in 2017, most of them showed an effect in vitro, but actually did not show a significant therapeutic effect in vivo. A problem has been revealed, which is believed to be due to the low survival rate and continued proliferation efficiency of T cells in vivo. Long-term survival of CAR-T cells in vivo is an important task that must be addressed because the success or failure of immune cell therapy is determined by the ability of T cells to continue to proliferate in vivo rather than the single-shot effect of injected T cells.
이에 본 발명자들은 목적 유전자의 온전한 기능을 연구할 수 있는 신규 벡터 시스템 개발, 및 나아가 세포치료제로 사용되는 세포의 생존율 증가를 위해 예의 연구하여, 생체 외 유전자(ex vivo gene) 주입에 의한 숙주세포의 면역반응과 세포사멸 신호전달의 활성화 차단을 통해 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention developed a new vector system capable of studying the intact function of a target gene, and furthermore, researched intensively to increase the survival rate of cells used as cell therapy products, and to improve host cell growth by injecting ex vivo genes. The present invention was completed by blocking activation of the immune response and cell death signaling.
본 발명의 일 목적은 숙주세포 내의 선천성 면역 반응을 억제하여 목적 단백질의 발현을 향상시킬 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a recombinant vector capable of enhancing the expression of a target protein by suppressing the innate immune response in a host cell.
또한 본 발명의 다른 목적은 형질전환체의 생존률 또는 제작 효율 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector for improving the viability or production efficiency of transformants.
또한 본 발명의 또 다른 기술적 과제는 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하여 유전자치료제 및 세포치료제의 효과를 증진시키는 것이다.Another technical problem of the present invention is to provide cells transformed with the vector to enhance the effects of gene therapy agents and cell therapy agents.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 제1 프로모터, 및 상기 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입할 수 있는 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 숙주세포 내의 STING(stimulator of interferon genes) 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 포함하는, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a first promoter and a multiple cloning site (MCS) operably linked to the first promoter and inserting a gene encoding a target protein. a first gene construct comprising; and a second gene construct comprising a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of a stimulator of interferon genes (STING) pathway in a host cell.
상기 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질은 Poxin(poxvirus immune nucleases) 또는 cia-cGAS RNA일 수 있다.A substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway may be Poxin (poxvirus immune nucleases) or cia-cGAS RNA.
또한, 상기 벡터는 상기 숙주세포 내의 선천성 면역반응을 억제하여 상기 숙주세포의 세포사멸을 감소시키는 것일 수 있다.In addition, the vector may reduce apoptosis of the host cell by suppressing the innate immune response in the host cell.
또한, 상기 벡터는 상기 숙주세포 내에서 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 도입 또는 발현시에 나타나는 사이토카인의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.In addition, the vector may reduce the expression of a cytokine that appears when a gene encoding the target protein is introduced or expressed in the host cell.
한편, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.On the other hand, in order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a transformant in which the recombinant vector for enhancing the expression of the target protein is introduced into a host cell.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.In addition, in order to achieve the above object, another aspect of the present invention provides a cell therapy agent comprising the transformant as an active ingredient.
본 발명의 벡터는 숙주세포 내에서의 사이토카인 발현을 억제하여 목적 단백질의 발현을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 숙주세포의 세포사멸도 억제하여 형질전환체의 생존률도 높일 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터를 이용하면 목적 단백질의 발현 효율이 높은 형질전환체를 높은 생존률로 수득할 수 있어, 종국적으로 목적 단백질의 발현을 더욱 향상시킬 수 있는 효과가 있다.The vector of the present invention can suppress cytokine expression in the host cell to improve the expression of the target protein, and also suppress apoptosis of the host cell to increase the survival rate of the transformant. Therefore, when the vector of the present invention is used, a transformant having high expression efficiency of the target protein can be obtained with a high survival rate, and finally, the expression of the target protein can be further improved.
특히, 본 발명의 벡터가 세포치료제의 플랫폼으로 이용된 경우, 본 발명의 벡터를 이용하여 제조된 형질전환체는 목적 단백질의 발현율이 높을 뿐만 아니라, 생존율이 높아 생체 내에서 장시간 효과를 나타낼 수 있고, 보관 및 유통에 용이한 장점이 있는바, 세포치료제의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.In particular, when the vector of the present invention is used as a platform for cell therapy products, the transformant prepared using the vector of the present invention not only has a high expression rate of the target protein, but also has a high survival rate, so it can show long-term effects in vivo. However, since it has the advantage of being easy to store and distribute, it can be usefully used as an active ingredient in cell therapy products.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the effects mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 구현예에 따른 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 외래 유전자의 도입이 STING 경로의 활성화 및 목적 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 STING 경로의 활성화가 숙주세포의 세포 세포사멸에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 STING 경로 억제제인 H-151의 처리에 따른 숙주세포 내에서의 목적 단백질의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 숙주세포 내에서 Poxin의 발현이 목적 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 숙주세포 내에서 Poxin의 발현이 STING 경로의 활성화에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Poxin을 발현하는 NK 세포인 Poxin-NK92 세포의 성공적인 제작 여부 및 상기 Poxin-NK92 세포에서 STING 경로의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 Poxin-NK92 세포에 독소루비신 또는 방사선 처리 후의 세포사멸 및 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10 및 도 11은 Poxin을 발현하는 CAR-NK 세포에 방사선 처리 후의 세포의 생존율과 세포 독성 및 세포 사멸을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 인간 cia-cGAS에 의한 STING 경로의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing the structure of a recombinant vector for enhancing the expression of a target protein according to an embodiment of the present invention.
2 is a schematic diagram showing the structure of a recombinant vector for enhancing the expression of a target protein according to another embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the result of confirming the effect of the introduction of a foreign gene on the activation of the STING pathway and the expression of the target protein.
Figure 4 shows the results of confirming the effect of activation of the STING pathway on cell apoptosis of host cells.
Figure 5 shows the result of confirming the expression change of the target protein in the host cell according to the treatment of H-151, a STING pathway inhibitor.
Figure 6 shows the result of confirming the effect of Poxin expression on the expression of the target protein in the host cell.
Figure 7 shows the results confirming the effect of Poxin expression on the activation of the STING pathway in the host cell.
Figure 8 shows the results of confirming whether Poxin-NK92 cells, which are NK cells expressing Poxin, were successfully prepared and changes in the STING pathway in the Poxin-NK92 cells.
Figure 9 shows the results of measuring apoptosis and cytotoxicity after doxorubicin or radiation treatment to the Poxin-NK92 cells.
10 and 11 show the results of measuring cell viability, cytotoxicity, and cell death after irradiation of CAR-NK cells expressing Poxin.
Figure 12 shows the results of confirming changes in the STING pathway by human cia-cGAS.
먼저, 본 발명에서 이용된 용어를 설명한다.First, terms used in the present invention will be explained.
본 발명에서 일컫는 '목적 단백질'은 본 발명의 벡터를 통해 숙주세포 내에서 발현시키고자 하는 임의의 단백질일 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 목적 단백질은 항원, 항원의 단편, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 수용체, 수용체의 단편, 항체, 단선 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 독소 단백질, 또는 이들의 변이체, 또는 이들의 일부 또는 전부가 융합된 단백질 등일 수 있다.The 'target protein' referred to in the present invention may be any protein to be expressed in a host cell through the vector of the present invention. For example, the protein of interest of the present invention may be an antigen, a fragment of an antigen, a hormone, a hormone analogue, an enzyme, an enzyme inhibitor, a receptor, a fragment of a receptor, an antibody, a monoclonal antibody, a fragment of an antibody, a structural protein, a toxin protein, or any of these It may be a variant, or a protein in which some or all of them are fused.
본 발명에서 일컫는 '숙주세포'는 상기 목적 단백질을 발현시키기 위하여 본 발명의 벡터를 내부로 도입시켜 고유의 전사 체계를 이용할 수 있는 세포를 의미하는 것으로서, STING 경로를 가지고 있는 것이라면 임의의 공지된 모든 종류의 세포일 수 있다.The 'host cell' referred to in the present invention refers to a cell capable of utilizing its own transcription system by introducing the vector of the present invention into the inside in order to express the target protein, and any known host cell having a STING pathway. It can be any kind of cell.
본 발명에서 일컫는 '프로모터'는 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본 인자(basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수도 있다.The term 'promoter' in the present invention refers to a DNA sequence that regulates the expression of an operably linked gene in a specific host cell. A possible enhancer may be further included.
본 발명에서 일컫는 '벡터'는 숙주세포에서 유전자를 발현시킬 수 있는 필수적인 요소들이 작동가능하게 연결된 DNA 제조물을 의미한다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.As used herein, a 'vector' refers to a DNA product in which essential elements capable of expressing a gene in a host cell are operably linked. Suitable vectors include expression control sequences such as promoters, operators, initiation codons, stop codons, polyadenylation signals and enhancers, as well as signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
이하, 본 발명의 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 측면은 목적 단백질의 발현 향상용 재조합 벡터를 제공한다.One aspect of the present invention provides a recombinant vector for enhancing the expression of a target protein.
상기 본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포 내의 STING(stimulator of interferon genes) 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함한다.The recombinant vector of the present invention includes a first gene construct including a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of a stimulator of interferon genes (STING) pathway in a host cell.
상기 STING 경로는 세포의 선천성 면역(innate immunity)을 위한 신호전달 경로이다. 바이러스의 핵산 등과 같이 외부에서 유전체가 세포 내로 도입되어 세포질에 노출되면, 이때 cGAS가 외래의 핵산을 인식하면서 선천성 면역 반응이 일어난다. 외래의 핵산과 결합한 cGAS는 cGAMP를 생성시키고 cGAMP는 STING을 활성화하며 세포사멸과 사이토카인의 발현을 유도한다.The STING pathway is a signaling pathway for cell innate immunity. When an external genome, such as a viral nucleic acid, is introduced into a cell and exposed to the cytoplasm, an innate immune response occurs while cGAS recognizes the foreign nucleic acid. cGAS combined with foreign nucleic acid generates cGAMP, which activates STING and induces apoptosis and cytokine expression.
상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질은 구체적으로 cGAS의 발현을 억제하는 물질, cGAS와 결합하여 활성을 억제하는 길항제, cGAS에 의해 생성된 2'3'-cGAMP를 분해하는 물질 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, STING 경로의 활성화를 억제하는 물질이라면 모두 포함된다. 상기 세포 내 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질은 예를 들어 Poxin(poxvirus immune nucleases) 또는 cia-cGAS RNA일 수 있다.Substances that block or inhibit the activation of the STING pathway in the host cells are specifically substances that inhibit the expression of cGAS, antagonists that bind to cGAS to inhibit activity, and substances that degrade 2'3'-cGAMP produced by cGAS. It may be the like, but is not limited thereto, and any substance that inhibits the activation of the STING pathway is included. Substances that block or inhibit activation of the intracellular STING pathway may be, for example, Poxin (poxvirus immune nucleases) or cia-cGAS RNA.
상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질은 숙주세포에서 발현되는 외래의 유전자이지만, 이는 숙주세포의 생존율 증가 및 목적 단백질의 발현 증진을 위한 것으로서, 본 발명에서의 발현 향상 대상인 목적 단백질과는 구분된다.The substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell is a foreign gene expressed in the host cell, but this is for increasing the survival rate of the host cell and enhancing the expression of the target protein, which is the target protein to be improved in the present invention. is distinguished from
상기 Poxin 단백질 천연두 바이러스에서 유래한 것으로서, 2'3'-cGAMP을 절단하여 STING 경로를 통한 신호전달을 제한할 수 있다. 또한, 상기 Cia-cGAS로 알려진 circular RNA(circRNA)는 cGAS와 결합하여 세포질에 노출된 외래의 핵산에 의한 cGAS의 활성화를 억제하여 poxin과 유사하게 STING 경로를 차단할 수 있다.The poxin protein is derived from smallpox virus, and signaling through the STING pathway can be restricted by cutting 2'3'-cGAMP. In addition, the circular RNA (circRNA) known as Cia-cGAS binds to cGAS and suppresses the activation of cGAS by foreign nucleic acids exposed to the cytoplasm, thereby blocking the STING pathway similarly to poxin.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 제1 프로모터를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 프로모터는 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것이라면 임의의 공지된 모든 종류의 프로모터가 이용될 수 있다. 이때, 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자는 상기 제1 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된다는 것은, 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자의 발현이 상기 제1 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 연결된다는 것을 의미한다.The first gene construct may further include a first promoter capable of controlling the expression of a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell. As the first promoter, any known promoter may be used as long as it can control the expression of a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell. In this case, a gene encoding a substance that blocks or inhibits activation of the STING pathway in the host cell may be operably linked to the first promoter. The operably linked means that the expression of a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell is regulated by the first promoter.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자의 상류에 IRES(internal ribosome entry site) 영역을 더 포함할 수 있다. 상기 IRES 영역은 내부 리보솜 진입 부위 또는 리보솜 결합 부위로서 mRNA 상에서 고리(loop) 구조를 형성하여 mRNA의 번역(translation)의 개시하는 부분이다. 상기 IRES 영역이 더 포함되는 경우에는 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자가 mRNA로 전사되고 난 이후의 번역 과정의 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 IRES 영역은 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질이 Poxin 등과 같은 단백질인 경우에, 그 발현을 더욱 향상시키기 위해 이용될 수 있다.The first gene construct may further include an internal ribosome entry site (IRES) region upstream of a gene encoding a substance that blocks or inhibits activation of the STING pathway in the host cell. The IRES region is an internal ribosome entry site or a ribosome binding site, and forms a loop structure on mRNA to initiate translation of mRNA. When the IRES region is further included, a gene encoding a substance that blocks or inhibits activation of the STING pathway in the host cell is transcribed into mRNA and then the efficiency of the translation process can be further improved. Therefore, the IRES region can be used to further enhance the expression of a protein such as Poxin, which blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 목적 단백질의 발현을 향상시키기 위한 용도, 또는 형질전환체의 생존률 또는 제작 효율을 증진하기 위한 용도로 사용할 수 있다. 상기 목적 단백질을 발현시키기 위하여 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주세포에 도입하는 경우에는 그 유전자 또는 벡터 자체가 숙주세포의 세포질에 노출된 외래의 핵산으로 인식되어 cGAS를 활성화시킬 수 있고, 결국 STING 경로를 활성화시켜 숙주세포의 선천성 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 벡터는 상기 제2 유전자 컨스트럭트로부터 상기 숙주세포 내의 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질이 발현되어, 숙주세포 내에서 외래 핵산의 도입에 의한 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하여 숙주세포의 사이토카인 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 나아가 숙주세포의 세포사멸도 감소시킬 수 있다.The recombinant vector of the present invention can be used to enhance the expression of a target protein or to improve the survival rate or production efficiency of a transformant. When a gene encoding the target protein or a vector containing the gene is introduced into a host cell to express the target protein, the gene or vector itself is recognized as an exogenous nucleic acid exposed to the cytoplasm of the host cell and activates cGAS. and, eventually, by activating the STING pathway, the innate immune response of the host cell can be induced. However, in the vector of the present invention, a substance that blocks or inhibits the activation of the STING pathway in the host cell is expressed from the second gene construct, thereby blocking or inhibiting the activation of the STING pathway by introduction of foreign nucleic acid in the host cell. Inhibition not only reduces the expression of cytokines in the host cell, but also can reduce apoptosis of the host cell.
뿐만 아니라, 상기와 같이 외래 핵산에 의해 유도된 cGAMP에 의한 신호전달은 다른 신호전달 경로와의 크로스토크(crosstalk)가 매우 강하므로, 목적 단백질의 발현에 간섭을 줄 가능성이 매우 크다. 그러나, 본 발명의 재조합 벡터는 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하여 상기와 같은 cGAMP 신호전달에 의한 크로스토크가 감소되므로 목적 단백질을 다른 요소에 의한 간섭 없이 발현시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터를 이용하는 경우 목적 단백질의 세포 및 생명체 내에서의 역할을 정확하게 분석할 수 있다.In addition, since the signal transduction by cGAMP induced by the foreign nucleic acid as described above has a very strong crosstalk with other signal transduction pathways, it is very likely to interfere with the expression of the target protein. However, since the recombinant vector of the present invention blocks or inhibits the activation of the STING pathway and thus reduces the cross-talk caused by cGAMP signaling, the target protein can be expressed without interference by other factors. Therefore, when using the recombinant vector of the present invention, the role of the target protein in cells and organisms can be accurately analyzed.
한편, 상기 목적 단백질은, 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 본 발명의 재조합 벡터에 포함시켜 본 발명의 재조합 벡터 내에서 발현되도록 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 재조합 벡터와는 별개의 벡터 또는 구별되는 기타 방법에 의해 숙주세포 내에 도입될 수 있다.Meanwhile, the target protein may be expressed in the recombinant vector of the present invention by including the gene encoding the target protein in the recombinant vector of the present invention, but is not limited thereto, and is separate from the recombinant vector of the present invention. It can be introduced into the host cell by a vector of or by another method that is distinguished.
상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 본 발명의 재조합 벡터에 포함시켜, 본 발명의 재조합 벡터 내에서 발현되도록 구성하는 경우, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 더 포함할 수 있다.When the gene encoding the target protein is included in the recombinant vector of the present invention to be expressed in the recombinant vector of the present invention, the recombinant vector of the present invention includes a multiple cloning site (MCS) It may further include a second gene construct.
상기 다중 클로닝 부위는 본 발명의 벡터를 통해 발현시키고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입되는 부위로서, 많은 제한 효소 인식 부위를 함유하는 부분이며, 클로닝 또는 서브클로닝을 포함하는 과정 동안 일반적으로 사용될 수 있다. 상기 다중 클로닝 부위 내의 제한 효소 인식 부위는 목적에 따라 다양하게 구성할 수 있고, 이러한 제한 효소 인식 부위의 유연성으로 인해 다양한 활용을 위한 목적 유전자의 클로닝이 가능할 수 있다.The multi-cloning site is a site into which a gene encoding a target protein to be expressed through the vector of the present invention is inserted, contains a number of restriction enzyme recognition sites, and is generally used during a process including cloning or subcloning. can Restriction enzyme recognition sites in the multi-cloning site can be configured in various ways according to the purpose, and due to the flexibility of such restriction enzyme recognition sites, cloning of target genes for various uses may be possible.
또한, 상기 제2 유전자 컨스트럭트는 상기 다중 클로닝 자리에 삽입된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하기 위한 제2 프로모터를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 프로모터는 상기 다중 클로닝 자리에 삽입된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것이라면 임의의 공지된 모든 종류의 프로모터가 이용될 수 있다. 특히, 상기 다중 클로닝 부위는 상기 제1 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 다중 클로닝 부위가 상기 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다는 것은, 상기 다중 클로닝 부위에 삽입된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 상기 제1 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 연결된다는 것을 의미한다. 따라서 상기 제1 유전자 컨스트럭트의 경우, 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 상기 다중 클로닝 자리의 어느 곳에 삽입되더라도 상기 제1 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있다.In addition, the second gene construct may further include a second promoter for regulating expression of a gene encoding a target protein inserted into the multiple cloning site. As the second promoter, any known promoter may be used as long as it can control the expression of the gene encoding the target protein inserted into the multiple cloning site. In particular, the multiple cloning site may be operably linked to the first promoter. When the multi-cloning site is operably linked to the first promoter, it means that the expression of the gene encoding the target protein inserted into the multi-cloning site is regulated by the first promoter. Therefore, in the case of the first gene construct, even if a gene encoding a target protein is inserted anywhere in the multiple cloning site, its expression can be controlled by the first promoter.
본 발명에서 상기 벡터는 형질주입(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 방법에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. 형질주입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 해당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질주입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 형질주입과 형질도입은 혼용될 수 있으나, 양자 큰 의미로 숙주세포에 외래 유전자 전달의 형질전환(transformation)으로 해석됨이 바람직하고, 형질주입 또는 형질도입에 의해 외래 유전자가 도입된 세포는 형질전환체라고 한다.In the present invention, the vector may be introduced into cells by a method such as transfection or transduction. Transfection is performed by calcium phosphate-DNA co-precipitation method, DEAE-dextran-mediated transfection method, polybrene-mediated transfection method, electroporation method, microinjection method, liposome fusion method, lipofectamine and protoplast fusion method, etc. This can be done by several methods known in the art. In addition, transfection means the transfer of a gene into a cell using a virus or viral vector particles by infection (infection). In the present specification, transfection and transduction may be used interchangeably, but both are preferably interpreted as transformation of transfer of a foreign gene to a host cell in a broad sense, and cells into which a foreign gene has been introduced by transformation or transduction is called a transformant.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 목적 단백질 기능 확인용 또는 면역세포 치료제 제조 효율 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition comprising the recombinant vector for confirming the function of a target protein or for improving the production efficiency of an immune cell therapeutic agent.
본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 벡터는 상기한 바와 같다. 상기 벡터가 숙주세포의 선천적인 면역반응에 의해 생성되는 cGAMP 시그널링에 의한 반응을 억제할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 목적 단백질의 기능 규명 또는 숙주 세포의 생존력 증진 용도로 활용할 수 있다.The recombinant vector included in the composition of the present invention is as described above. Since the vector can suppress the response by cGAMP signaling generated by the innate immune response of the host cell, the composition of the present invention can be used to investigate the function of a target protein or to enhance the viability of the host cell.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 또는 세포를 제공한다. 상기 형질전환체는 STING 경로 활성화가 차단되어 세포사멸 및 사이토카인 발현이 억제되고, 숙주세포 자체의 선천성 면역반응이 억제된 것으로서 생존율이 증진된 것에 특징이 있다.In addition, the present invention provides a transformant or cell transformed with the recombinant vector. The transformant is characterized in that the STING pathway activation is blocked, cell death and cytokine expression are suppressed, and the innate immune response of the host cell itself is suppressed, and the survival rate is improved.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 숙주세포는 면역세포일 수 있으며, 상기 형질전환체는 면역세포치료제로 제공될 수 있다. 상기 숙주세포는 구체적으로 상기 숙주세포는 면역세포(예를 들어, T cell, NK cell, 대식세포, 수지상세포 등)일 수 있다.As one embodiment of the present invention, the host cell may be an immune cell, and the transformant may be provided as an immune cell therapy agent. Specifically, the host cells may be immune cells (eg, T cells, NK cells, macrophages, dendritic cells, etc.).
본 발명에서 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.In the present invention, "cell therapy product" refers to cells and tissues manufactured through isolation, culture, and special manipulation from a subject, and is a drug (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention, and is used to restore the function of cells or tissues. It refers to drugs used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferation and selection of living autologous, allogeneic, or heterogeneous cells in vitro or changing the biological characteristics of cells in other ways.
본 발명의 세포 치료제는 항암용 또는 감염성 질환 치료 또는 예방 용도일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 일반적인 세포치료제가 가능한 용도는 모두 적용될 수 있다.The cell therapy agent of the present invention may be used for anticancer or infectious disease treatment or prevention, but is not limited thereto, and all possible uses of general cell therapy agents may be applied.
일반적으로 항암 치료에 화학요법 및 방사선 요법을 병행하는 것이 일반적이다. 화학요법에 이용되는 항암제는 증식이 활발한 세포의 세포사멸을 유도하고 항암제의 치료 효과를 높이기 위한 방사선 조사는 이러한 세포사멸을 증가시킨다. 이때 항암제 및 방사선에 의해 세포사멸이 유도되는 세포는 암세포에 한정되는 것이 아니며, 면역치료를 위해 개체에 투여된 면역세포치료제에도 영향을 미칠 수 있다. 뿐만 아니라 세포치료제는 암유발인자 억제 등의 이유로 세포에 방사선을 처리한 후 치료 개체에 주입되는 경우도 많은데, 이러한 방사선 처리에 의해 세포치료제의 유효성분인 세포주의 세포사멸이 유도될 가능성도 높다In general, it is common to combine chemotherapy and radiation therapy with chemotherapy. Anticancer agents used in chemotherapy induce apoptosis of proliferating cells, and radiation to enhance the therapeutic effect of anticancer agents increases such apoptosis. At this time, cells whose apoptosis is induced by anticancer agents and radiation are not limited to cancer cells, and may also affect immune cell therapy agents administered to individuals for immunotherapy. In addition, there are many cases in which cell therapy products are injected into a subject to be treated after radiation treatment of cells for reasons such as suppression of cancer-inducing factors, and there is a high possibility that apoptosis of cell lines, which are active ingredients of cell therapy products, is induced by such radiation treatment
본 발명의 일 실시예에서 poxin 또는 Cia-cGAS RNA 발현 벡터가 주입된 면역세포치료제가 화학요법 및 방사성 요법과 병행될 수 있는지 확인하고자 본 발명의 벡터로 NK 세포를 형질전환하고 독소루비신 처리 또는 방사선을 조사 후에 세포사멸 정도, 생존율, 및 NK 세포의 세포독성을 확인하였으며, 그 결과 poxin 또는 Cia-cGAS RNA에 의해 cGAS-STING 경로가 차단된 NK 세포의 경우 독소루비신 처리 및 방사선 조사에도 불구하고 높은 생존율을 나타내었으며 암세포에 대한 세포 독성을 그대로 유지함을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, NK cells were transformed with the vector of the present invention and treated with doxorubicin or radiation in order to confirm whether the immunocytotherapeutic agent injected with the poxin or Cia-cGAS RNA expression vector can be combined with chemotherapy and radiation therapy. After irradiation, the degree of apoptosis, viability, and cytotoxicity of NK cells were confirmed. As a result, NK cells whose cGAS-STING pathway was blocked by poxin or Cia-cGAS RNA showed high survival rates despite doxorubicin treatment and irradiation. It was confirmed that the cytotoxicity to cancer cells was maintained.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 면역세포치료제는 세포사멸을 유도하는 항암제(예를 들어, 독소루비신 등) 및 방사능에 대한 저항성을 갖는 것으로서, 공지의 항암제와 병용투여되거나 방사선 치료와 병행되는 면역항암치료방법으로 제공될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the immunotherapeutic agent has resistance to anticancer agents (eg, doxorubicin, etc.) and radiation that induce apoptosis, and is administered in combination with known anticancer agents or combined with radiation therapy. It can be provided as a treatment method.
또한 상기 숙주 세포는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것일 수 있다 .즉 본 발명의 벡터에 추가적으로 제공되는 목적 단백질이 CAR일 수 있다. 상기 CAR는 본 발명의 벡터 내에 포함될 수 있고, 또는 본 발명의 벡터와 별개의 벡터 또는 기타 구별되는 방법에 의해 면역세포내에서 발현될 수 있다. 상기 CAR 발현을 위해 면역세포 외부에서 유전자가 도입되므로, 이러한 외래 유전자 도입이 면역세포의 세포사멸경로를 유도할 수 있으나, 본 발명은 이를 차단하여 세포사멸을 억제함으로써 CAR-면역세포의 생존율을 증가시킬 수 있다. 상기 형질전환체는 구체적으로 생존율이 증가된 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포일 수 있다.In addition, the host cell may express a chimeric antigen receptor (CAR). That is, the target protein additionally provided to the vector of the present invention may be a CAR. The CAR may be contained within the vector of the present invention, or may be expressed in immune cells by a vector separate from the vector of the present invention or by other distinct methods. Since a gene is introduced from outside the immune cell for the expression of the CAR, the introduction of such a foreign gene can induce the apoptosis pathway of the immune cell, but the present invention blocks it to inhibit apoptosis, thereby increasing the survival rate of CAR-immune cells can make it The transformants may be specifically CAR-T cells or CAR-NK cells with increased viability.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 숙주 세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생존율이 증가된 형질전환체 제조방법 및 형질전환체의 생존율 증가 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing a transformant with increased viability and a method for increasing the viability of a transformant, comprising the step of injecting the vector into a host cell.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 면역세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생존율이 증가된 면역세포치료제 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing an immune cell therapy product with increased survival rate, comprising the step of injecting the vector into immune cells.
또한, 본 발명은 상기 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the CAR-T cells or CAR-NK cells.
또한, 상기 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.In addition, a cancer treatment method comprising administering the CAR-T cells or CAR-NK cells to a subject is provided.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 공지의 항암제를 개체에 투여하는 단계 및/또는 개체에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.As one embodiment of the present invention, the method may further include administering a known anticancer agent to the subject and/or irradiating the subject with radiation.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 각 단계는 순차로 또는 동시에 수행될 수 있고, 각 단계의 선후에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, each of the above steps may be performed sequentially or simultaneously, and there is no limitation on the precedence or precedence of each step.
또한, 본 발명은 상기 벡터의 세포치료제 제조 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the vector for producing a cell therapy product.
한편, 암의 치료에는 화학요법 및 방사선 요법을 병행하는 것이 일반적이다. 화학요법에 이용되는 항암제는 증식이 활발한 세포의 세포사멸을 유도하고 항암제의 치료 효과를 높이기 위한 방사선 조사는 이러한 세포사멸을 증가시킨다. 이때 항암제 및 방사선에 의해 세포사멸이 유도되는 세포는 암세포에 한정되는 것이 아니며, 면역치료를 위해 개체에 투여된 면역세포치료제에도 영향을 미칠 수 있다.Meanwhile, in the treatment of cancer, it is common to combine chemotherapy and radiation therapy. Anticancer agents used in chemotherapy induce apoptosis of proliferating cells, and radiation to enhance the therapeutic effect of anticancer agents increases such apoptosis. At this time, cells whose apoptosis is induced by anticancer agents and radiation are not limited to cancer cells, and may also affect immune cell therapy agents administered to individuals for immunotherapy.
이에, 본 발명자들은 poxin 또는 Cia-cGAS RNA 발현 벡터가 주입된 면역세포치료제가 화학요법 및 방사성 요법과 병행될 수 있는지 확인하고자 상기 벡터로 NK 세포를 형질전환하고 독소루비신 처리 또는 방사선을 조사 후에 세포사멸 정도, 생존율, 및 NK 세포의 세포독성을 확인하였다. 그 결과 poxin 또는 Cia-cGAS RNA에 의해 cGAS-STING 경로가 차단된 NK 세포의 경우 독소루비신 처리 및 방사선 조사에도 불구하고 높은 생존율을 나타내었으며 암세포에 대한 세포 독성을 그대로 유지함을 확인할 수 있었다.Accordingly, the present inventors transformed NK cells with the vectors to confirm that immunocytotherapeutic agents injected with poxin or Cia-cGAS RNA expression vectors can be combined with chemotherapy and radiation therapy, and apoptosis after doxorubicin treatment or irradiation. The degree, viability, and cytotoxicity of NK cells were confirmed. As a result, it was confirmed that NK cells in which the cGAS-STING pathway was blocked by poxin or Cia-cGAS RNA exhibited a high survival rate despite doxorubicin treatment and irradiation and maintained cytotoxicity to cancer cells.
이에, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 생존력이 증가된 형질전환체 제조하는 방법을 제공하고, 상기 벡터를 면역세포에 주입하여 화학요법 및/또는 방사선 요법과 병행될 수 있는 면역세포치료제를 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a method for preparing a transformant with increased viability using the vector, and provides an immune cell therapy agent that can be combined with chemotherapy and/or radiation therapy by injecting the vector into immune cells. can
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the present invention have been described in detail, and for those skilled in the art, it is clear that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples.
다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
재조합 벡터의 제작Construction of recombinant vectors
[1-1] [1-1] pEGFP-N1 벡터의 준비Preparation of pEGFP-N1 vector
pEGFP-N1 벡터(Addene, 미국)을 구입하여 준비하였다.A pEGFP-N1 vector (Addene, USA) was purchased and prepared.
[1-2] [1-2] pcN-IP 벡터 및 pSK-cia-cGAS 벡터의 제작Construction of pcN-IP vector and pSK-cia-cGAS vector
먼저, pcDNA3.1TM/HisA 벡터(Invitrogen, 미국)의 다중 클로닝 부위의 EcoRI 제한효소 자리와 XbaI 제한효소 자리 사이에 서열번호 1의 염기서열을 갖는 IRES-Kozak-FLAG-Poxin 유전자 컨스트럭트를 각각 삽입하여 Poxin을 발현하는 pcN-IP 벡터를 제작하였다.First, an IRES-Kozak-FLAG-Poxin gene construct having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 between the EcoR I restriction enzyme site and the Xba I restriction enzyme site of the pcDNA3.1 TM /HisA vector (Invitrogen, USA) multi-cloning site A pcN-IP vector expressing Poxin was constructed by inserting each of the vectors.
또한, pBluescript SK 벡터(Addene, 미국)의 다중 클로닝 부위의 XbaI 제한효소 자리와 NotI 제한효소 자리에 서열번호 2의 염기서열을 갖는 인간 cia-cGAS 유전자를 삽입하여 cia-cGAS를 발현하는 pSK-hcia-cGAS 벡터를 각각 제작하였다. In addition, pSK expressing cia-cGAS by inserting the human cia-cGAS gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 into the Xba I restriction enzyme site and the Not I restriction enzyme site of the multiple cloning site of the pBluescript SK vector (Addene, USA) -hcia-cGAS vectors were respectively constructed.
구체적인 벡터 도면과 관련 서열 및 재조합된 벡터의 단백질 발현 확인은 도 1과 도 2에 나타내었다.Detailed vector drawings, related sequences, and protein expression confirmation of the recombinant vectors are shown in FIGS. 1 and 2 .
목적 단백질의 발현에 STING 경로가 미치는 영향 확인Confirmation of the effect of the STING pathway on the expression of the target protein
STING(stimulator of interferon genes) 경로가 외부에서 도입된 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.It was confirmed how the STING (stimulator of interferon genes) pathway affects the expression of externally introduced genes.
[2-1] [2-1] 외래 유전자의 도입이 STING 경로에 미치는 영향 확인Confirmation of the effect of foreign gene introduction on the STING pathway
먼저, 외부에서 도입된 유전자가 STING 경로에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, STING 경로를 가지고 있는 THP1 세포(한국세포주은행)와 STING 경로를 가지고 있지 않은 HEK293T 세포(ATCC)에 각각 상기 실시예 [1-1]에서 제작한 pEGFP-N1 벡터를 0, 1, 2, 4, 6 및 8UG의 양으로 도입하고 24시간을 배양한 다음, STING 경로의 변화를 STING 경로 상의 단백질들의 발현을 통해 확인하였다.First, in order to confirm the effect of the gene introduced from the outside on the STING pathway, THP1 cells (Korea Cell Line Bank) that have the STING pathway and HEK293T cells (ATCC) that do not have the STING pathway were tested according to the above example [1]. -1] was introduced in an amount of 0, 1, 2, 4, 6, and 8UG and cultured for 24 hours, and then changes in the STING pathway were confirmed through the expression of proteins on the STING pathway.
그 결과, 도 3의 (A) 및 (B)에 도시된 바와 같이, STING 경로를 가지고 있지 않은 HEK293T 세포에서는 외부에서 도입된 pEGFP-N1 벡터에 의해 GFP가 아무런 제약 없이 잘 발현되는 것으로 확인되었으나, STING 경로를 가지고 있는 THP1 세포에서는 외부에서 도입된 pEGFP-N1 벡터에 의해 STING 경로 상의 단백질들이 화성화되는 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, 상기 pEGFP-N1 벡터의 도입량이 증가할수록 STING 경로 상의 단백질들의 발현이나 활성화 정도, 그리고 목적 단백질인 GFP의 발현양이 점점 감소하는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in (A) and (B) of FIG. 3 , it was confirmed that GFP was well expressed without any restriction by the pEGFP-N1 vector introduced from the outside in HEK293T cells that do not have the STING pathway. In THP1 cells having the STING pathway, it was confirmed that proteins on the STING pathway were activated by the pEGFP-N1 vector introduced from the outside, and as the introduction amount of the pEGFP-N1 vector increased, the expression or activation of proteins on the STING pathway increased. It was confirmed that the degree and the expression level of the target protein, GFP, gradually decreased.
아울러, STING 경로의 하위 신호 체계인 Type1 IFN의 발현 또한, 도 3의 (C)에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포에서는 큰 영향이 없었으나, THP1 세포에서는 상기 pEGFP-N1 벡터의 도입량이 증가할수록 증가되는 것으로 확인되었다.In addition, the expression of
상기와 같은 결과로부터 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자의 도입에 의하여 숙주세포 내의 STING 경로가 활성화되면 Type1 IFN의 발현이 향상되고, 그로 인해 목적 단백질의 발현이 억제됨을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the STING pathway in the host cell is activated by introduction of a foreign gene encoding the target protein, the expression of
[2-2] [2-2] STING 경로가 세포 생존률에 미치는 영향 확인Determining the effect of the STING pathway on cell viability
한편, 외부에서 도입된 유전자에 의하여 활성화된 STING 경로가 숙주세포의 생존률에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 [2-1]에서와 같이 pEGFP-N1 벡터를 0, 1 및 2UG의 양으로 도입하고 24시간을 배양한 각각의 세포들에서, STING 경로의 활성화 여부를 다시 한번 확인함과 동시에 세포 사멸 관련 요소들의 변화를 함께 확인하였다.On the other hand, in order to confirm how the STING pathway activated by the gene introduced from the outside affects the viability of the host cell, as in Example [2-1], the pEGFP-N1 vector was prepared in 0, 1, and 2UG amounts. In each of the cells introduced into and cultured for 24 hours, activation of the STING pathway was confirmed once again, and changes in apoptosis-related factors were also confirmed.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 [2-1]에서 확인된 것과 동일하게 STING 경로가 존재하는 THP1 세포에서만 pEGFP-N1 벡터의 도입에 의해 STING 경로가 활성화되었을 뿐만 아니라, 세포사멸성(apoptotic) 요소인 Bim, P21, Pim1, Noxa, PARP의 발현이 증가하고 항-세포사멸성(anti-apoptotic) 요소인 Bcl-xl의 발현이 감소되는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 4, the introduction of the pEGFP-N1 vector not only activated the STING pathway only in THP1 cells in which the STING pathway existed, as was confirmed in Example [2-1], but also activated the STING pathway in the cells. It was confirmed that the expression of Bim, P21, Pim1, Noxa, and PARP, which are apoptotic factors, increased, and the expression of Bcl-xl, an anti-apoptotic factor, decreased.
상기와 같은 결과로부터, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자의 도입에 의하여 STING 경로가 활성화되면, Type1 IFN의 발현에 의해 목적 단백질의 발현이 억제될 뿐만 아니라, 숙주세포의 세포 생존률 자체도 현저히 감소됨을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the STING pathway is activated by introducing a foreign gene encoding a target protein, the expression of the target protein is suppressed by the expression of
[2-3] [2-3] STING 경로 억제제의 처리에 의한 목적 단백질의 발현 변화 확인Confirmation of changes in target protein expression by treatment with STING pathway inhibitors
또한, 인위적으로 STING 경로의 활성화를 억제하면 외부에서 도입된 유전자로부터 목적 단백질의 발현이 어떻게 변하는지 확인하기 위하여, STING 억제제인 H-151을 이용하여 그 처리 유무에 따른 GFP의 발현양을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 [2-1]에서와 같이 THP1 세포에 pEGFP-N1 벡터를 1UG의 양으로 도입하고 1uM의 H-151을 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양한 다음, STING 경로의 변화와 함께 목적 단백질인 GFP의 발현양을 확인하였다.In addition, in order to confirm how the expression of a target protein changes from an externally introduced gene when the activation of the STING pathway is artificially suppressed, the expression level of GFP according to the presence or absence of the treatment was measured using the STING inhibitor H-151. . Specifically, as in Example [2-1], the pEGFP-N1 vector was introduced into THP1 cells in an amount of 1 UG, treated with 1 uM H-151, cultured for 24 hours or 48 hours, and then the STING pathway was changed. In addition, the expression level of the target protein, GFP, was confirmed.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 외래 유전자의 도입에 의하여 활성화되던 STING 경로가 H-151의 처리에 의해 억제되었고, 그에 따라 목적 단백질인 GFP의 발현양 또한 증가되었으며(도 5의 3번, 4번 레인 및 7번, 8번 레인), 상기와 같이 STING 경로가 억제됨으로써 시간이 경과할수록 목적 단백질인 GFP의 발현양 또한 점점 증가되는 것으로 확인되었다(도 5의 4번 및 8번 레인).As a result, as shown in FIG. 5, the STING pathway, which was activated by the introduction of foreign genes, was inhibited by the treatment of H-151, and accordingly, the expression level of the target protein, GFP, was also increased (No. 3 in FIG. 5). ,
상기와 같은 결과로부터, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자의 도입에 의한 STING 경로의 활성화를 억제하면, 숙주세포의 생존률도 향상될 뿐만 아니라, 목적 단백질 자체의 발현 역시도 향상됨을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that suppressing the activation of the STING pathway by introduction of a foreign gene encoding a target protein not only improves the survival rate of the host cell, but also improves the expression of the target protein itself.
Poxin을 이용한 목적 단백질의 발현 향상Improvement of target protein expression using poxin
[3-1] [3-1] 숙주세포 내 Poxin의 발현이 목적 단백질의 발현에 미치는 영향 확인Confirmation of the effect of poxin expression in the host cell on the expression of the target protein
THP1 세포에 상기 실시예 [1-1]에서 제작한 pEGFP-N1 벡터를 2UG의 양으로 도입하는 한편, 상기 실시예 [1-2]에서 제작한 pcN-IP 벡터를 공벡터인 pcDNA3.1TM/HisA 벡터와 함께 총 4UG의 양이 되도록 조합하여 함께 도입하고, 48시간 동안 배양한 다음, 목적 단백질인 GFP의 발현양을 확인하였다.The pEGFP-N1 vector prepared in Example [1-1] was introduced into THP1 cells in an amount of 2 UG, while the pcN-IP vector prepared in Example [1-2] was used as an empty vector, pcDNA3.1 TM /HisA vector was combined and introduced together in a total amount of 4 UG, cultured for 48 hours, and then the expression level of the target protein, GFP, was confirmed.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 공벡터인 pcDNA3.1TM/HisA 벡터의 양이 감소하고 pcN-IP 벡터의 양이 늘어날수록, 즉 THP1 세포 내에서 발현되는 Poxin의 양이 늘어날수록 목적 단백질인 GFP의 발현양 또한 점점 증가되는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 6, as the amount of pcDNA3.1 TM /HisA vector, which is an empty vector, decreases and the amount of pcN-IP vector increases, that is, as the amount of Poxin expressed in THP1 cells increases, the target It was also confirmed that the expression level of GFP, a protein, was gradually increased.
또한, THP1 세포에 상기 실시예 [1-2]에서 제작한 pcN-IP 벡터와, 상기 pcN-IP 벡터에서 Poxin의 유전자를 Poxin의 활성을 제거한 Poxin(H17A) 변이체의 유전자로 변경하여 제작한 pcN-ImutP 벡터를 각각 2UG의 양으로 도입하고, 12, 24, 48 및 72시간 동안 배양한 다음, STING 경로의 변화를 각각 확인하였다.In addition, the pcN-IP vector prepared in Example [1-2] and the pcN-IP vector prepared by changing the Poxin gene in the pcN-IP vector to the gene of a Poxin (H17A) variant in which Poxin activity was removed were used in THP1 cells. -ImutP vectors were introduced in an amount of 2 UG, respectively, and cultured for 12, 24, 48, and 72 hours, and changes in the STING pathway were respectively confirmed.
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현시킨 경우에, 24시간과 48시간의 시점에서 THP1 세포 내에서 STING 경로의 활성화가 Poxin(H17A) 변이체를 발현시킨 경우보다 더욱 억제되는 것으로 확인되었고(도 7의 (A)), Type1 IFN의 발현 또한 Poxin(H17A) 변이체를 발현시킨 경우보다 감소되는 것으로 확인되었다(도 7의 (B)).As a result, as shown in FIG. 7, when Poxin was expressed, activation of the STING pathway in THP1 cells at 24 and 48 hours was found to be more suppressed than when the Poxin (H17A) variant was expressed. (Fig. 7 (A)), and the expression of
[3-2] [3-2] NK 세포에서의 Poxin 발현의 효과 확인 - STING 경로의 변화 확인Confirmation of the effect of Poxin expression in NK cells - Confirmation of changes in the STING pathway
서열번호 3의 염기서열을 갖는 Poxin 유전자를 pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 벡터(Clonetech, 미국)에 삽입하고, 이를 NK92 세포(ATCC)에 도입하여 Poxin을 발현하는 형질전환된 NK92 세포를 제작하였다. The poxin gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 was inserted into the pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 vector (Clonetech, USA) and introduced into NK92 cells (ATCC) to construct transformed NK92 cells expressing Poxin.
상기와 같이 형질전환된 NK92 세포(Poxin-NK92)는 벡터 내에 발현되는 zsGreen의 발현을 확인함으로써, 도 8a에 도시된 바와 같이, 상기와 같은 형질전환이 제대로 이루어졌음을 확인하였다.In the NK92 cells (Poxin-NK92) transformed as described above, expression of zsGreen expressed in the vector was confirmed, as shown in FIG. 8a , that the transformation was properly performed.
그리고 상기와 같이 형질전환된 Poxin-NK92 세포에 상기 실시예 [1-1]에서 사용한 pEGFP-N1 벡터를 0, 5 및 10UG의 양으로 도입하고, 48시간 동안 배양한 다음, STING 경로의 변화를 확인하였다.Then, the pEGFP-N1 vector used in Example [1-1] was introduced into the transformed Poxin-NK92 cells in an amount of 0, 5, and 10 UG, cultured for 48 hours, and changes in the STING pathway were observed. Confirmed.
그 결과, 도 8b에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현시킨 NK92 세포에서도 STING 경로의 활성화가 억제되는 것으로 확인되었고, 그에 따라 하위 신호 체계인 Type1 IFN의 발현도 감소되는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 8B , it was confirmed that the activation of the STING pathway was also suppressed in NK92 cells expressing Poxin, and accordingly, the expression of
[3-3] [3-3] NK 세포에서의 Poxin 발현의 효과 확인 - NK 세포의 세포사멸 및 세포독성 확인Confirmation of effect of Poxin expression in NK cells - Confirmation of apoptosis and cytotoxicity of NK cells
외부 자극에 의한 NK92 세포의 세포사멸을 확인하기 위하여, Poxin을 발현하는 NK92 세포와 Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포에 독소루비신을 농도 별로 처리하고, 24시간과 48시간 배양한 후, 각각의 세포를 AnnexinV와 7AAD로 염색하고 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여, 각 세포들의 세포사멸 정도를 확인하였다.In order to confirm apoptosis of NK92 cells by external stimulation, NK92 cells expressing Poxin and NK92 cells not expressing Poxin were treated with doxorubicin at different concentrations, cultured for 24 hours and 48 hours, and each cell was then treated with AnnexinV and 7AAD, and using flow cytometry, the degree of apoptosis of each cell was confirmed.
그 결과, 도 9a에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포는 독소루비신 처리 24시간 후부터 독소루비신 농도에 의존적으로 세포사멸 정도가 증가하는 반면, Poxin을 발현하는 NK92 세포(poxin-NK92)는 독소루비신 처리 48시간 후부터 세포사멸이 증가되었고, 그 정도 역시 Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포에 비하여 적은 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 9a, NK92 cells that do not express Poxin show an increased degree of apoptosis in a doxorubicin concentration-dependent manner after 24 hours of doxorubicin treatment, whereas NK92 cells that express Poxin (poxin-NK92) doxorubicin After 48 hours of treatment, apoptosis was increased, and the degree was also confirmed to be less than that of NK92 cells that do not express Poxin.
또한, 방사선 조사(irradiation)에 의한 NK92 세포의 세포사멸을 확인하였다. Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포와 Poxin을 발현하는 NK92 세포에 10Gy의 γ-선을 조사하고, 시간의 경과에 따른 세포의 세포사멸 정도를 확인하였다.In addition, apoptosis of NK92 cells by irradiation was confirmed. NK92 cells that do not express Poxin and NK92 cells that express Poxin were irradiated with 10 Gy of γ-rays, and the degree of apoptosis of cells over time was confirmed.
그 결과, 도 9b에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포는 γ-선 조사 후 1일 후부터 시간이 지날수록 세포사멸이 증가하는 반면, Poxin을 발현하는 NK92 세포(poxin-NK92)는 1일과 2일 뒤의 세포사멸에 차이가 없었으며, 그 정도도 Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포에 비하여 적은 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 9B, NK92 cells that do not express Poxin show increased apoptosis over time from 1 day after γ-irradiation, whereas NK92 cells that express Poxin (poxin-NK92) There was no difference in apoptosis after 1 day and 2 days, and it was confirmed that the degree was less than that of NK92 cells that do not express Poxin.
한편, γ-선 조사 후, Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포와 Poxin을 발현하는 NK92 세포(poxin-NK92)의 K562세포에 대한 세포독성(cytotoxicity)을 비교하였다. 세포독성을 확인하기 위하여 칼세인에 염색된 K562 세포를 표적 세포로 사용하였으며, 상기 NK 세포와 상기 K562 세포를 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1 및 0.625:1의 비율(E:T)로 4시간 동안 반응시킨 다음, 상등액 100ul을 취하여 상등액 내에 존재하는 칼세인의 양을 확인하였다. 대조군으로는 칼세인이 염색된 K562세포에 RPMI1640(10% FBS)만 처리한 군(spontaneous value)과 2% triton X-100(maximum value)을 처리한 군으로 이용하였으며, 세포독성의 정도는 아래와 같은 방법으로 계산하였다.On the other hand, after γ-ray irradiation, cytotoxicity of NK92 cells not expressing Poxin and NK92 cells expressing Poxin (poxin-NK92) to K562 cells was compared. In order to confirm cytotoxicity, calcein-stained K562 cells were used as target cells, and the NK cells and the K562 cells were used at ratios of 10: 1, 5: 1, 2.5: 1, 1.25: 1 and 0.625: 1 ( After reacting for 4 hours with E: T), 100ul of the supernatant was taken to confirm the amount of calcein present in the supernatant. As a control group, calcein-stained K562 cells were treated with only RPMI1640 (10% FBS) (spontaneous value) and 2% Triton X-100 (maximum value), and the degree of cytotoxicity was as follows. Calculated in the same way.
세포독성의 정도(%) = (조건에 따른 칼세인 release value-spontaneous value)/(maximum value-spontaneous value) x 100Degree of cytotoxicity (%) = (Calcein release value-spontaneous value according to conditions) / (maximum value-spontaneous value) x 100
그 결과, 도 9c에 도시된 바와 같이, γ-선 조사 후에도 Poxin이 발현되는 NK92 세포(poxin-NK92)가 Poxin을 발현하지 않는 NK92 세포 보다 높은 세포 독성을 유지하는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 9c , it was confirmed that Poxin-expressing NK92 cells (poxin-NK92) maintained higher cytotoxicity than Poxin-non-expressing NK92 cells even after γ-ray irradiation.
Poxin을 발현하는 CAR-NK 세포의 효과 확인Confirmation of the effect of CAR-NK cells expressing Poxin
한국 등록특허 제2,122,546호에서 제작한 항-코티닌 키메릭 항원 수용체를 발현하는 NK 세포(Cot-CAR-NK 세포)의 단일 세포를 자동화 고속유세포분리기(FacsAria Fusion)로 분리하고, 분리된 세포(clone No.: M2)를 대상으로 상기 실시예 [3-2]와 동일한 방법으로 Poxin을 발현하도록 형질전환하였다(Poxin-M2 세포). 형질전환된 Poxin-M2 세포와 대조군인 Poxin을 발현하지 않는 M2 세포에 각각 γ-선을 조사한 후 시간의 경과에 따른 NK 세포의 세포독성을 확인하였다. 세포독성을 확인하기 위하여 상기 실시예 [3-3]에서와 동일한 칼세인법을 이용하였으며, K562 세포를 표적 세포로 사용하여 상기 NK 세포와 상기 K562 세포를 5:1, 1:1 및 0.5:1의 비율(E:T)로 4시간 동안 반응시킨 다음, 세포독성의 정도를 평가하였다.A single cell of NK cells (Cot-CAR-NK cells) expressing an anti-cotinine chimeric antigen receptor prepared in Korean Patent No. 2,122,546 was isolated by automated high-speed flow cytometry (FacsAria Fusion), and the isolated cells (clone No.: M2) was transformed to express Poxin in the same manner as in Example [3-2] (Poxin-M2 cells). Transformed Poxin-M2 cells and control M2 cells that do not express Poxin were respectively irradiated with γ-rays, and NK cell cytotoxicity was confirmed over time. In order to confirm cytotoxicity, the same calcein method as in Example [3-3] was used, and the NK cells and the K562 cells were 5: 1, 1: 1 and 0.5: After reacting for 4 hours at a ratio of 1 (E:T), the degree of cytotoxicity was evaluated.
그 결과, 도 10b 내지 도 10d에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현하는 M2 세포(Poxin-M2 세포)가 Poxin을 발현하지 않는 M2 세포에 비해 γ-선 조사에도 불구하고 더욱 오랜 기간 동안 높은 세포독성을 유지하는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIGS. 10B to 10D , Poxin-expressing M2 cells (Poxin-M2 cells) have high cytotoxicity for a longer period of time despite γ-ray irradiation compared to M2 cells that do not express Poxin. was confirmed to be maintained.
또한, 형질전환된 Poxin-M2 세포와 대조군인 Poxin을 발현하지 않는 M2 세포에 각각 γ-선을 조사한 후, 상기 실시예 [3-3]에서와 동일한 방법으 시간의 경과에 따른 세포의 세포사멸 정도를 확인하였다.In addition, after irradiating γ-rays to the transformed Poxin-M2 cells and the control M2 cells that do not express Poxin, cell apoptosis over time was performed in the same manner as in Example [3-3]. The degree was confirmed.
그 결과, 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, Poxin을 발현하는 M2 세포(poxin-M2)의 세포사멸 정도가 Poxin을 발현하지 않는 M2 세포에 비하여 훨씬 적은 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIGS. 11A and 11B , it was confirmed that the degree of apoptosis of M2 cells expressing Poxin (poxin-M2) was much lower than that of M2 cells not expressing Poxin.
cia-cGAS를 이용한 목적 단백질의 발현 향상 가부 확인Confirmation of improvement of target protein expression using cia-cGAS
상기 실시예 [1-2] 에서 제작한 pSK-hcia-cGAS 벡터를 이용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)을 통해 인간 cia-cGAS의 mRNA를 제작하였다. 상기와 같이 얻어진 mRNA 5ug을 상기 실시예 [1-1]에서 제작된 pEGFP-N1 벡터 8ug과 함께 NK92 세포에 도입하였고, 상기와 같이 형질전환된 NK92 세포에서 STING 경로에 관련된 요소들의 mRNA 수준을 측정하였다. 이때, cia-cGAS의 대조군으로는 상기 인간 cia-cGAS의 mRNA와 동일한 방법으로 제작된 서열번호 4의 염기서열을 갖는 안티센스 cia-cGAS(AS cia-cGAS)를 사용하였다.Human cia-cGAS mRNA was prepared by in vitro transcription using the pSK-hcia-cGAS vector prepared in Example [1-2]. 5ug of the mRNA obtained as above was introduced into NK92 cells together with 8ug of the pEGFP-N1 vector prepared in Example [1-1], and the mRNA levels of elements related to the STING pathway were measured in the transformed NK92 cells. did At this time, as a control for cia-cGAS, antisense cia-cGAS (AS cia-cGAS) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 prepared in the same way as the human cia-cGAS mRNA was used.
그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 외부 자극인 pEGFP-N1 벡터가 도입되지 않은 NK92 세포에 비하여, pEGFP-N1 벡터와 대조군인 안티센스 cia-cGAS를 넣어준 군(EGFP-AS-hcia)에서 STING 경로에 관련된 요소들의 mRNA 수준이 증가되는 것으로 확인되었고, pEGFP-N1 벡터와 cia-cGAS mRNA를 넣어준 군(EGFP-hcia)에서 다시 STING 경로에 관련된 요소들의 mRNA 수준이 감소되는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 12, compared to NK92 cells in which the pEGFP-N1 vector, an external stimulus, was not introduced, in the group (EGFP-AS-hcia) into which the pEGFP-N1 vector and the control antisense cia-cGAS were added. It was confirmed that the mRNA level of elements related to the STING pathway was increased, and it was confirmed that the mRNA level of elements related to the STING pathway was decreased again in the group (EGFP-hcia) into which the pEGFP-N1 vector and cia-cGAS mRNA were introduced.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> Recombinant vector for improving expression of target protein through suppressing intracellular immune response and the application thereof <130> 2022-DPA-4791 <150> KR 10-2021-0081233 <151> 2021-06-23 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-Kozak-FLAG-Poxin Gene Construct <400> 1 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 60 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 120 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 180 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 240 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 300 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 360 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 420 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 480 tgcacatgct ttacatgtgt 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Claims (14)
를 포함하는, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.A first gene construct comprising a gene encoding a substance that blocks or inhibits activation of a stimulator of interferon genes (STING) pathway in a host cell;
Comprising, a recombinant vector for enhancing the expression of the target protein.
상기 STING 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질은 Poxin(poxvirus immune nucleases) 또는 cia-cGAS RNA인 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 1,
A material that blocks or inhibits the activation of the STING pathway is Poxin (poxvirus immune nucleases) or cia-cGAS RNA, the recombinant vector for enhancing the expression of the target protein.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 제1 프로모터를 더 포함하고,
상기 숙주세포 내의 STING(stimulator of interferon genes) 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자는 상기 제2 프로모터와 작동가능하도록 연결되는 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 1,
The first gene construct further comprises a first promoter,
A gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of a stimulator of interferon genes (STING) pathway in the host cell is operably linked to the second promoter, a recombinant vector for enhancing expression of a target protein.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주세포 내의 STING(stimulator of interferon genes) 경로의 활성화를 차단 또는 억제하는 물질을 암호화하는 유전자의 상류(upstream)에 IRES(internal ribosome entry site) 영역을 더 포함하는 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 3,
The first gene construct further comprises an internal ribosome entry site (IRES) region upstream of a gene encoding a substance that blocks or inhibits the activation of a stimulator of interferon genes (STING) pathway in the host cell. Phosphorus, a recombinant vector for enhancing the expression of a target protein.
상기 재조합 벡터는 제2 프로모터, 및 상기 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되고 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입할 수 있는 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 더 포함하는 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 1,
The recombinant vector includes a second gene construct comprising a second promoter and a multiple cloning site (MCS) operably linked to the second promoter and inserting a gene encoding a target protein; Which further comprises, a recombinant vector for enhancing the expression of the target protein.
상기 벡터는 상기 숙주세포 내의 선천성 면역반응을 억제하여 상기 숙주세포의 세포사멸을 감소시키는 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 1,
The vector suppresses the innate immune response in the host cell to reduce apoptosis of the host cell, the recombinant vector for enhancing the expression of the target protein.
상기 벡터는 상기 숙주세포 내에서 상기 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 도입 또는 발현시에 나타나는 사이토카인의 발현을 감소시키는 것인, 목적 단백질 발현 향상용 재조합 벡터.The method of claim 1,
The vector is a recombinant vector for enhancing the expression of a target protein, which reduces the expression of a cytokine that appears when the gene encoding the target protein is introduced or expressed in the host cell.
상기 형질전환체는 선천성 면역반응이 억제된 것인 형질전환체.The method of claim 8,
The transformant is a transformant in which the innate immune response is suppressed.
상기 형질전환체는 숙주세포가 면역세포인 것인, 세포치료제The method of claim 10,
The transformant is a cell therapy agent in which the host cell is an immune cell
상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포 및 수지상세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 세포치료제.The method of claim 11,
Wherein the immune cells are at least one selected from the group consisting of T cells, NK cells, macrophages and dendritic cells, cell therapy agent.
상기 형질전환체는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것인, 세포치료제.The method of claim 11,
The transformant is a cell therapy agent that expresses a chimeric antigen receptor (CAR).
상기 재조합 벡터를 면역세포에 주입하는 단계;를 포함하는 세포치료제 제조방법.Preparing the recombinant vector of any one of claims 1 to 7; and
Injecting the recombinant vector into immune cells; cell therapy preparation method comprising.
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