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KR20220155334A - 재조합 아데노-연관 바이러스 수율을 증진시키는 방법 - Google Patents

재조합 아데노-연관 바이러스 수율을 증진시키는 방법 Download PDF

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KR20220155334A
KR20220155334A KR1020227035439A KR20227035439A KR20220155334A KR 20220155334 A KR20220155334 A KR 20220155334A KR 1020227035439 A KR1020227035439 A KR 1020227035439A KR 20227035439 A KR20227035439 A KR 20227035439A KR 20220155334 A KR20220155334 A KR 20220155334A
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KR
South Korea
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alkyl
host cell
compound
vitamin
solution
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Application number
KR1020227035439A
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Inventor
얀 토마스 판텔리
카메론 태그 풀코
존 에버렛 앨런
밍양 지앙
레이첼 씨. 호간
Original Assignee
울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
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Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염, 또는 비타민 B, 또는 그의 임의의 조합(들)을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공한다. 숙주 세포를 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염, 또는 비타민 B, 또는 그의 임의의 조합(들)을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 숙주 세포에 의한 rAAV의 생산을 증가시키는 방법이 또한 제공된다.

Description

재조합 아데노-연관 바이러스 수율을 증진시키는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/990,099를 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV) 수율을 증진시키는 방법에 관한 것이고, 보다 특히, 본 발명은 rAAV 수율을 증진시키기 위한 화합물의 용도에 관한 것이다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 비-병원성의 복제-결손 파르보바이러스이다. 재조합 AAV 벡터 (rAAV)는 이들을 유전자 요법을 위한 벡터로서 매력적이게 만드는 많은 고유한 특색을 갖는다. 특히, rAAV 벡터는 치료 유전자를 분열 및 비-분열 세포로 전달할 수 있고, 이들 유전자는 표적화된 세포의 게놈 내로 통합되지 않으면서 연장된 기간 동안 지속될 수 있다. rAAV의 광범위한 치료 용도를 고려하면, 고-역가 rAAV 벡터 수율을 달성하는 방법을 포함한 rAAV 벡터 생산의 개선된 방법에 대한 지속적인 필요가 존재한다. 다양한 바이러스 벡터의 생산을 개선시키기 위한 이전의 시도는 세포 배양 첨가제, 예컨대 금속, 미량 보충물, 염 등의 사용을 수반하였다 (예를 들어, 문헌 [Williams, J. Gen. Virol., 9(3): 251-5 (1970), Weinbauer et al., Limnology and Oceanography, 54(3): 774-784 (2009), Yang et al., Hepatology, 48(5): 1396-403 (2008)], 및 미국 공개 번호 20150353899 참조).
발명의 요약
본 발명은, 부분적으로, 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)의 생산에 사용된 숙주 세포가 본원에 기재된 화합물을 포함하는 용액과 접촉하는 경우에 증가된 양의 rAAV를 생산할 것이라는 발견에 기초한다.
따라서, 한 측면에서, 숙주 세포를 화학식 (I)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법이 본원에 제공된다:
Figure pct00001
, 여기서:
Figure pct00002
는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
각각의 R1은 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
X는 CRcRd 또는 N이고;
Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00003
또는 그의 염.
또 다른 측면에서, 숙주 세포를 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 용액은 화학식 (I-A)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00004
, 여기서:
R2 및 R3은 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나,
또는 R2 및 R3은 함께 옥소를 형성할 수 있고;
R4는 수소, -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Re는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이다.
일부 실시양태에서, 용액은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함한다:
Figure pct00005
, 및 그의 임의의 조합(들).
특정 실시양태에서, 용액은 화학식 (I-B)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함한다:
Figure pct00006
, 여기서:
X는 CRcRd이고;
R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e는 각 경우에 독립적으로 -OH, -O-C1-6알킬, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, 및 C1-6알킬-O-C1-6알킬이고;
Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc 가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이다.
일부 실시양태에서, 용액은 화학식 (III)의 화합물을 포함한다:
Figure pct00007
.
또 다른 측면에서, 숙주 세포를 화학식 (II)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법이 본원에 제공된다:
Figure pct00008
, 여기서:
R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 C 또는 N이고;
R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00009
또는 그의 염.
또 다른 측면에서, 숙주 세포를 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 적어도 1종의 화합물은 화학식 (IV)의 화합물이다:
Figure pct00010
.
또 다른 측면에서, 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12로부터 선택된 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 rAAV를 수거 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
용액 중 본원에 기재된 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 또는 비타민 B12))의 농도는 10 mM 이상, 12 mM 이상, 15 mM 이상, 1 mM 이상, 0.5 mM 이상, 0.5 mM 초과, 0.5 mM 내지 15 mM, 또는 1 mM 내지 10 mM일 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 또는 비타민 B12))의 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분하다. 또 다른 실시양태에서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9 또는 비타민 B12))의 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분하다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 적어도 2일 동안 접촉시킨다.
숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HeLa, HEK293, COS, A549, BHK 또는 Vero 세포일 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 숙주 세포는 곤충 세포, 예를 들어 Sf9, Sf-21, Tn-368, 또는 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브(High-Five)) 세포일 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 HeLa 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포이다. 숙주 세포는 AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 rep 및 cap 유전자 (예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자)를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 예를 들어 헬퍼 플라스미드를 통해 또는 아데노바이러스로의 감염을 통해 공급된 헬퍼 바이러스 유전자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) rep 및 cap 유전자, 및 iii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9 또는 비타민 B12))을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9 또는 비타민 B12))을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 숙주 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공하며:
Figure pct00011
, 및 그의 임의의 조합(들),
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공하며:
Figure pct00012
, 및 그의 임의의 조합(들),
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며:
Figure pct00013
, 및 그의 임의의 조합(들),
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공하며:
Figure pct00014
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공하며:
Figure pct00015
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 하기를 포함하는 조성물을 제공하며:
Figure pct00016
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공하며:
Figure pct00017
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공하며:
Figure pct00018
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 하기를 포함하는 조성물을 제공하며:
Figure pct00019
,
여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
제공된 방법의 일부 실시양태에서, 용액은
Figure pct00020
또는 그의 염을 포함하지 않는다.
제공된 방법의 일부 실시양태에서, 용액은
Figure pct00021
또는 그의 염을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제공된 조성물은
Figure pct00022
또는 그의 염을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제공된 조성물은
Figure pct00023
또는 그의 염을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포, 및 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) AAV rep 및 cap 유전자, 및 iii) 임의로, 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 임의의 고려되는 방법에 의해 생산된 rAAV, 임의의 고려되는 방법에 의해 생산된 rAAV를 포함하는 조성물, 또는 숙주 세포 및 본원에 기재된 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 이들 및 기타 측면 및 특징들은 하기 상세한 설명 및 청구범위에서 기재된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특색 및 이점은 첨부 도면에 예시된 바와 같은, 하기 바람직한 실시양태의 기재로부터 분명해질 것이다. 참조된 바와 같이 요소는 상응하는 도면에서의 공통 특색을 확인시켜 준다.
도 1은 다양한 니아신아미드 농도 (0.1 mM 내지 40 mM)에서 HeLa 생산자 세포로부터 생산된 다양한 클레이드 E 및 F rAAV에 대한 정규화된 부피 재조합 AAV (rAAV) 역가의 요약 막대 그래프이다. mL당 게놈 카피로 측정된 바와 같은 역가 (GC/mL)를 니아신아미드의 부재 하의 rAAV 생산에 대해 정규화하였다.
도 2는 다양한 니아신아미드 농도에서 상이한 HeLa 생산자 세포 클론으로부터 생산된 클레이드 E 및 F rAAV의 정규화된 부피 rAAV 역가 (GC/mL)의 데이터 포인트의 3차 다항식 피팅이다.
도 3은 인자 IX 트랜스진을 코딩하는 클레이드 E rAAV (AAVrh10-FIX)를 생산할 수 있는 HeLa 생산자 세포주로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 혈관 스케일링의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 2개의 통상의 용기 규모: 3 mL-딥 웰 (24-DW) 및 100 mL 진탕 플라스크 (플라스크)를 사용하였다. 니아신아미드를 지시된 농도 (1 mM 내지 50 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 4a는 인자 IX 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 E AAV (AAVrh10-FIX)를 생산할 수 있는 HeLa 생산자 세포주 클론으로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 니아신아미드를 지시된 농도 (5 mM 내지 40 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 4b는 글루코스 6-포스파타제 (G6Pase) 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 E AAV (AAV8-G6Pase)를 생산할 수 있는 제1 HeLa 생산자 세포주 클론으로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 니아신아미드를 지시된 농도 (5 mM 내지 40 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 4c는 글루코스 6-포스파타제 (G6Pase) 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 E AAV (AAV8-G6Pase)를 생산할 수 있는 제2 HeLa 생산자 세포주 클론으로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 니아신아미드를 지시된 농도 (1 mM 내지 40 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 4d는 인자 VIII 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 E AAV (AAVhu37-FVIII)를 생산할 수 있는 HeLa 생산자 세포주 클론으로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 니아신아미드를 지시된 농도 (1 mM 내지 40 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 5는 말단절단된 ATP7B 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 F AAV (AAV9-ATP7B)를 생산할 수 있는 2종의 HeLa 생산자 세포주 클론으로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 클론을 2L 생물반응기에서 배양하였다. 니아신아미드를 지시된 농도 (3 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
도 6은 30 mL 플라스크에서 배양된 HEK293 세포로부터의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과를 도시하는 막대 그래프이다. HEK293 세포를 오르니틴 트랜스카르브아밀라제를 코딩하는 재조합 클레이드 E AAV (rAAV8-OTC)를 생산할 수 있는 플라스미드로 형질감염시켰다. 니아신아미드를 지시된 농도 (0.03 mM 내지 30 mM)로 첨가하고, rAAV 수율 (GC/mL)을 측정하였다.
상세한 설명
본 발명은 부분적으로, 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)의 생산에 사용된 숙주 세포가 화합물, 예컨대 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (I-A)의 화합물, 화학식 (I-B)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 화학식 (IV)의 화합물, 또는 그의 임의의 하나의 염, 또는 B 비타민이 숙주 세포 배양물에 첨가되는 경우에 증가된 양의 rAAV를 생산할 것이라는 발견에 기초한다.
I. 방법에 사용된 화합물
한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공한다:
Figure pct00024
여기서:
Figure pct00025
는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
각각의 R1은 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
X는 CRcRd 또는 N이고;
Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00026
또는 그의 염.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N인 화합물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고, R1이 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고, R1이 각 경우에 독립적으로 C1-6알킬-OH, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고, R1이 C1-6알킬-OH (예를 들어, -CH2OH)인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고; R1이 -C(O)N(Ra)2이고; Ra가 수소 (예를 들어, -C(O)NH2)인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고; R1이 -C(O)ORb이고; Rb가 각 경우에 독립적으로 수소 또는 메틸 (예를 들어, C(O)OH 및 -C(O)OCH3)인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 CRcRd이고; Rc가 수소이고; Rd가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고; 각각의 R1이 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 선택된 것인 화합물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 CRcRd이고; Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고; Rd가 -OH이고; R1이 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 CRcRd이고; Rc가 수소이고; Rd가 -OH이고; R1이 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 CRcRd이고; Rc가 수소이고; Rd가 -OH이고; R1이 -OH인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 N이고; n이 1이고; R1이 각 경우에 독립적으로 C1-6알킬-OH, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로부터 독립적으로 선택된 (예를 들어, R1이 각 경우에 독립적으로 -CH2OH, -C(O)NH2, -C(O)OH, 및 -C(O)OCH3로부터 독립적으로 선택된) 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I)의 화합물은 X가 CRcRd이고; Rc가 수소이고; Rd가 -OH이고; n이 5이고; R1이 -OH인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I-A)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I-A)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00027
, 여기서:
R2 및 R3은 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나,
또는 R2 및 R3은 함께 옥소를 형성할 수 있고;
R4는 수소, -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Re는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하는 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (I-A)의 화합물은 R4가 -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2 (예를 들어, -NH2, -OH, 및 -OCH3)로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R4가 -NH2, -OH, 및 -OCH3로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하고, R4가 -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2로부터 선택된 것인 화합물 (예를 들어, -NH2, -OH, 및 -OCH3)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하고, R4가 -NH2, -OH, 및 -OCH3로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하고, R4가 -NH2인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하고, R4가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하고, R4가 -OCH3인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (I-A)의 화합물은 R4가 수소, -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2 (예를 들어, -NH2, -OH, 및 -OCH3)로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R4가 수소, -NH2, -OH, 및 -OCH3로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소이고, R4가 수소, -NH2, -OH, 및 -OCH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소이고, R4가 수소인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소이고, R4가 -NH2인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소이고, R4가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 둘 다 수소이고, R4가 -OCH3인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은 R2 및 R3이 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나, 또는 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성할 수 있고; R4가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은, R2 및 R3이 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나, 또는 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성할 수 있고; R4가 -OCH3인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-A)의 화합물은, R2 및 R3이 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나, 또는 R2 및 R3이 함께 옥소를 형성할 수 있고; R4가 -NH2인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다:
Figure pct00028
, 및 그의 임의의 조합(들).
특정 실시양태에서, 숙주 세포를 니아신아미드, 니아신, 메틸-니코티네이트, 니코티닐 알콜 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00029
, 및 그의 임의의 조합(들).
특정 실시양태에서, 숙주 세포를 니아신아미드, 니아신, 메틸-니코티네이트, 니코티닐 알콜 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I-B)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (I-B)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00030
, 여기서:
X는 CRcRd이고;
R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e는 각 경우에 독립적으로 -OH, -O-C1-6알킬, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, 및 C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
여기서 Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 수소이고 Rd가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rd가 수소인 화합물이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 수소이고 Rd가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 수소이고 Rd가 -O-C1-6알킬인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 수소이고 Rd가 C1-6알킬인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 Rc가 수소이고 Rd가 -OH인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e는 -OH이고, Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e가 -OH이고, Rc가 수소이고, Rd가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (I-B)의 화합물은 R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e가 -OH이고, Rc가 수소이고, Rd가 -OH로부터 선택된 것인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다:
Figure pct00031
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 미오-이노시톨 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00032
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 미오-이노시톨 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (II)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00033
,
여기서:
R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택되고;
R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택되고;
Y는 C 또는 N이고;
R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로부터 선택되고;
A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로부터 선택되고;
여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00034
.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R6 및 R7이 수소인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R8 및 R9가 수소인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물은 R6 및 R7이 수소이고, R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R8 및 R9가 수소이고, R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고 R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고 R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R10 및 R11이 C1-6알킬인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R10 및 R11이 CH3인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 C1-6알킬이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 CH3이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 CH3이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 A가 C1-6알킬인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 A가 CH3인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 C이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6 및 R7이 수소이고; R8 및 R9가 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R8 및 R9가 수소이고; R6 및 R7이 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로부터 선택된 것인 화합물이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 Y가 N이고; A가 C1-6알킬이고; R10 및 R11이 CH3이고; R6, R7, R8, 및 R9가 수소인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화학식 (II)의 화합물은 R6, R7, R8, 및 R9가 수소이고, Y가 N이고, R10 및 R11이 CH3이고, A가 CH3인 화합물이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다:
Figure pct00035
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 콜린 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다:
Figure pct00036
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 콜린 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
II. 배양 조건
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 적어도 1종의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 0.5 mM 초과인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 0.5 mM 이상이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 0.5 mM 내지 15 mM (예를 들어, 0.5 mM 내지 14 mM, 0.5 mM 내지 13 mM, 0.5 mM 내지 12 mM, 0.5 mM 내지 11 mM, 0.5 mM 내지 10 mM, 0.5 mM 내지 9 mM, 0.5 mM 내지 8 mM, 0.5 mM 내지 7 mM, 0.5 mM 내지 6 mM, 0.5 mM 내지 5 mM, 0.5 mM 내지 4 mM, 0.5 mM 내지 3 mM, 0.5 mM 내지 2 mM, 0.5 mM 내지 1 mM, 1 mM 내지 15 mM, 2 mM 내지 15 mM, 3 mM 내지 15 mM, 4 mM 내지 15 mM, 5 mM 내지 15 mM, 6 mM 내지 15 mM, 7 mM 내지 15 mM, 8 mM 내지 15 mM, 9 mM 내지 15 mM, 10 mM 내지 15 mM, 11 mM 내지 15 mM, 12 mM 내지 15 mM, 13 mM 내지 15 mM, 및 14 mM 내지 15 mM)인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 1 mM 내지 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM, 3.5 mM, 4 mM, 4.5 mM, 5 mM, 5.5 mM, 6 mM, 6.5 mM, 7 mM, 7.5 mM, 8 mM, 8.5 mM, 9 mM, 9.5 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 또는 15 mM, 및 0.5 mM 내지 15 mM의 모든 소수 및 분수 값으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증가는 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 또는 5배, 및 1.2배 내지 5배의 모든 소수 및 분수 값일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증가는 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 또는 5배, 및 1.2배 내지 5배의 모든 소수 및 분수 값일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 적어도 2일 동안 접촉시킨다.
특정 실시양태에서, 방법은 rAAV를 수거 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 HeLa, HEK293, COS, A549, BHK, 및 Vero 세포로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 HeLa 세포이다. HeLa 세포의 의미 내에 포함되는 것은 무혈청 배지 뿐만 아니라 현탁 배양물에서 성장할 수 있는 HeLa 세포주의 서브클론인 임의의 클론 유도체, 예를 들어 HeLa S3 세포라는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고 용이하게 인지될 것이다.
또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포이다. HEK293 세포의 의미 내에 포함되는 것은 임의의 클론 유도체, 예를 들어 HEK293-F 세포, HEK293-T 세포, 또는 HEK-EXPI293 세포라는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고 용이하게 인지될 것이다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 Sf9, Sf-21, Tn-368, 및 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 rep 및 cap 유전자 (예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) rep 및 cap 유전자 (예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자), 및 iii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물, 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 또는 그의 임의의 조합(들)), 또는 그의 임의의 조합(들))을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 숙주 세포는 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 용액은 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용액은 생산 배지를 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 현탁 배양으로 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 부착 배양으로 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 1L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 2L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 3L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 250L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 500L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 숙주 세포를 2,000L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함한다.
III. 조성물
한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (I-A)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure pct00037
, 및 그의 임의의 조합(들).
일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포, 및 니아신아미드, 니아신, 메틸-니코티네이트, 니코티닐 알콜 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (I-B)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure pct00038
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 미오-이노시톨 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure pct00039
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포 및 콜린의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포, 및 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12 또는 그의 임의의 조합(들)으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 조성물을 제공한다.
IV. 화학적 정의
구체적 관능기 및 화학 용어의 정의는 하기에 보다 상세하게 기재된다. 화학 원소는 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.]의 표지 안쪽의 원소 주기율표, CAS 버전에 따라 확인되고, 구체적 관능기는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학의 일반적 원리, 뿐만 아니라 구체적 관능성 모이어티 및 반응성은 문헌 [Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기재되어 있다.
단수 관사는 그 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에 사용될 수 있다. 예로서 "유사체"는 하나의 유사체 또는 하나 초과의 유사체를 의미한다.
수치 범위가 열거되어 있는 경우에, 이는 범위 내의 각각의 값 및 하위-범위를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "C1-6알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C5-6 알킬을 포괄하는 것으로 의도된다.
하기 용어는 하기에 제시된 의미를 갖는 것으로 의도되며, 본 발명의 설명 및 의도된 범주를 이해하는데 유용하다.
"알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다 ("C1-20 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-12 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-10 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알킬"). C1-6 알킬 기의 예는 메틸 (C1), 에틸 (C2), n-프로필 (C3), 이소프로필 (C3), n-부틸 (C4), tert-부틸 (C4), sec-부틸 (C4), 이소-부틸 (C4), n-펜틸 (C5), 3-펜타닐 (C5), 아밀 (C5), 네오펜틸 (C5), 3-메틸-2-부타닐 (C5), 3급 아밀 (C5), 및 n-헥실 (C6)을 포함한다. 알킬 기의 추가의 예는 n-헵틸 (C7), n-옥틸 (C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 각 경우의 알킬 기는 독립적으로 임의로 치환되며, 즉 비치환되거나 ("비치환된 알킬") 또는 1개 이상의 치환기; 예를 들어 1 내지 5개의 치환기, 1 내지 3개의 치환기, 또는 1개의 치환기로 치환된다 ("치환된 알킬"). 특정 실시양태에서, 알킬 기는 비치환된 C1-10 알킬 (예를 들어, -CH3)이다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬이다. 통상의 알킬 약어는 Me (-CH3), Et (-CH2CH3), iPr (-CH(CH3)2), nPr (-CH2CH2CH3), n-Bu (-CH2CH2CH2CH3), 또는 i-Bu (-CH2CH(CH3)2)를 포함한다.
"옥소 기"는 -C(=O)-를 지칭한다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로 (F), 클로로 (Cl), 브로모 (Br) 및 아이오도 (I)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 할로겐 기는 플루오로 또는 클로로이다.
"반대이온" 또는 "음이온성 반대이온"은 전자 중성을 유지하기 위해 양이온성 4급 아미노 기와 연관된 음으로 하전된 기이다. 예시적인 반대이온은 할라이드 이온 (예를 들어, F-, Cl-, Br-, I-), NO3-, ClO4-, OH-, H2PO4-, HSO4-, 술포네이트 이온 (예를 들어, 메탄술포네이트, 트리플루오로메탄술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 벤젠술포네이트, 10-캄포르 술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 나프탈렌-1-술폰산-5-술포네이트, 에탄-1-술폰산-2-술포네이트 등) 및 카르복실레이트 이온 (예를 들어, 아세테이트, 에타노에이트, 프로파노에이트, 벤조에이트, 글리세레이트, 락테이트, 타르트레이트, 글리콜레이트 등)을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되고 모 화합물의 목적하는 약리학적 활성을 보유하는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 이러한 염은 비-독성이고, 무기 또는 유기 산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 이러한 염은 (1) 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 사용하여 형성되거나; 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등을 사용하여 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토류 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 대체되거나, 또는 유기 염기, 예컨대 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 함께 배위되는 경우에 형성된 염을 포함한다. 염은, 단지 예로서 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등; 및 화합물이 염기성 관능기를 함유하는 경우에는, 비-독성 유기 또는 무기 산의 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트 등을 추가로 포함한다. 용어 "제약상 허용되는 양이온"은 산성 관능기의 허용되는 양이온성 반대-이온을 지칭한다. 이러한 양이온의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등이다. 예를 들어, 문헌 [Berge, et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66(1): 1-79]을 참조한다.
이들 및 다른 예시적인 치환기는 상세한 설명 및 청구범위에 보다 상세하게 기재된다. 본 발명은 치환기의 상기 예시적인 목록에 의해 어떠한 방식으로든 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
V. 아데노-연관 바이러스
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 데펜도파르보바이러스 속 및 파르보바이러스 과의 작은 비외피보유 이십면체 바이러스이다. AAV는 대략 4.7 kb의 단일-가닥 선형 DNA 게놈을 갖는다. AAV는 혈청형 AAV-1 내지 AAV-12는 물론, 비인간 영장류 유래의 100종을 초과하는 혈청형들을 포함한 수많은 혈청학적으로 구별가능한 유형들을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Srivastava, J. Cell Biochem., 105(1): 17-24 (2008)] 및 [Gao et al., J. Virol., 78(12), 6381-6388 (2004)] 참조). 임의의 AAV 유형이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. AAV는 여러 조직 유형의 분열 및 정지 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 상이한 AAV 혈청형은 상이한 조직 향성을 나타낸다. AAV는 비-자율적으로 복제되고, 잠복기 및 감염기를 포함하는 생활 주기를 갖는다. 세포가 AAV로 감염된 후, 잠복기에, AAV는 프로바이러스로서 숙주의 게놈 내로 부위-특이적으로 통합된다. 감염기는 세포가 또한 헬퍼 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 (AV) 또는 단순 포진 바이러스)로 감염되지 않는 한 발생하지 않으며, 이는 AAV가 복제되도록 한다.
야생형 AAV 게놈은 AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호 서열을 함유하는 2개의 145 뉴클레오티드 역전된 말단 반복부 (ITR)를 함유한다. ITR이외에, 3종의 AAV 프로모터 p5, p19 및 p40이 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개 오픈 리딩 프레임의 발현을 구동시킨다. 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 연계되는 2종의 rep 프로모터는 rep 유전자로부터의 4종의 rep 단백질 (Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40)의 생산을 초래한다. rep 단백질은 게놈 복제를 담당한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, cap 유전자의 스플라이스 변이체인 3종의 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)을 코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 형성한다.
복제, 캡시드화 및 통합을 위한 시스-작용 신호가 ITR 내에 함유되어 있기 때문에, 4.3 kb 내부 게놈의 일부 또는 전부가 외래 DNA, 예를 들어 관심 외인성 단백질용 발현 카세트로 대체될 수 있다. 이 경우에 rep 및 cap 단백질 (예를 들어, AAV rep 및 cap 단백질)은 예를 들어 플라스미드 상에 트랜스로 제공된다. AAV 벡터를 생산하기 위해, AAV 복제를 허용하는 숙주 세포주는 전형적으로 rep 및 cap 유전자, ITR-플랭킹된 발현 카세트, 및 헬퍼 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스 (AV) 유전자 E1a, E1b55K, E2a, E4orf6, 및 VA에 의해 제공되는 헬퍼 기능을 발현해야 한다 (Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1-23, 2011). AAV 벡터의 생산은 또한 헬퍼 바이러스 입자의 생산을 초래할 수 있으며, 일부 실시양태에서, 이는 AAV 벡터의 사용 전에 제거 또는 불활성화되어야 한다. HEK293 세포, COS 세포, HeLa 세포, BHK 세포, Vero 세포는 물론, 곤충 세포를 포함한 수많은 세포 유형들이 AAV 벡터를 생산하는데 적합하다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,156,303, 5,387,484, 5,741,683, 5,691,176, 5,688,676, 8,163,543, 미국 공개 번호 20020081721, PCT 공개 번호 WO00/47757, WO00/24916 및 WO96/17947 참조). 이들 세포 유형들에서, AAV 벡터는 전형적으로 ITR-플랭킹된 발현 카세트를 함유하는 1종의 플라스미드, 그리고 추가의 AAV 및 헬퍼 바이러스 유전자를 제공하는 1종 이상의 추가의 플라스미드에 의해 생산된다. 특정 실시양태에서, 이들 세포 유형들에서, AAV 벡터는 ITR-플랭킹된 발현 카세트 및 AAV 바이러스 유전자를 함유하는 1종의 플라스미드 및 헬퍼 바이러스 유전자를 제공하는 1종 이상의 추가의 플라스미드에 의해 생산된다.
어떠한 혈청형의 AAV도 본 발명에 사용될 수 있다. 유사하게, 어떠한 AV 유형도 사용될 수 있을 것으로 고려되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 그의 목적하는 재조합 AAV 벡터 (rAAV)의 생산에 적합한 AAV 및 AV 유형을 확인할 수 있을 것이다. AAV 및 AV 입자는, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 아이오딕사놀 구배 또는 CsCl 구배에 의해 정제될 수 있다.
야생형 AAV의 게놈은 단일-가닥 DNA이고, 4.7 kb이다. AAV 벡터는 크기가 4.7 kb이거나, 또는 5.2 kb만큼 큰 초과크기의 게놈 또는 3.0 kb만큼 작은 것을 포함하여 4.7 kb보다 더 크거나 더 작은 단일-가닥 게놈을 가질 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 실질적으로 자가-상보성일 수 있어서, 바이러스 내에서는 게놈이 실질적으로 이중 가닥이다. 모든 유형의 게놈을 함유하는 AAV 벡터가 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다.
상기 논의된 바와 같이, AAV는 그의 생활 주기 중 감염기에 진입하기 위해 헬퍼 바이러스로의 공동-감염을 필요로 한다. 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 (AV), 및 단순 포진 바이러스 (HSV)를 포함하고, 배큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포에서 AAV를 생산하기 위한 시스템이 존재한다. 또한, 유두종 바이러스가 AAV를 위한 헬퍼 기능을 제공할 수 있음이 제안되었다 (예를 들어, 문헌 [Hermonat et al., Molecular Therapy 9, S289-S290 (2004)] 참조). 헬퍼 바이러스는 AAV 복제 허용을 생성시킬 수 있는 임의의 바이러스를 포함한다. AV는 대략 36 kb의 이중-가닥 DNA 게놈을 갖는 비외피보유 핵 DNA 바이러스이다. AV는 E1a, E1b55K, E2a, E4orf6, 및 VA 유전자를 제공하여 AAV 복제 및 캡시드화를 허용함으로써 세포 내의 잠복성 AAV 프로바이러스를 구출할 수 있다. HSV는 지질 이중층 외피에 랩핑되어 있는 이십면체 캡시드에 캡시드화된 상대적으로 큰 이중-가닥 선형 DNA 게놈을 갖는 바이러스의 패밀리이다. HSV는 감염성이며, 고도로 전파성이다. 하기 HSV-1 복제 단백질이 AAV 복제를 위한 HSV-1 헬퍼 기능에 전형적으로 필요한 것으로 확인되었다: 헬리카제/프리마제 복합체 (UL5, UL8, 및 UL52) 및 UL29 유전자에 의해 코딩된 DNA 결합 단백질 ICP8, 및 헬퍼 기능을 증진시키는 다른 단백질.
VI. rAAV의 생산
본 발명은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)를 생산하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 rAAV를 생산할 수 있는 임의의 세포 또는 세포들을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HeLa 세포, COS 세포, HEK293 세포, A549 세포, BHK 세포 또는 Vero 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 곤충 세포, 예를 들어 Sf9 세포, Sf-21 세포, Tn-368 세포 또는 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브) 세포이다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "세포" 또는 "세포주"는 나타낸 세포 또는 세포주의 변형되거나 조작된 변이체를 포함하는 것으로 이해된다.
상기 논의된 바와 같이, rAAV의 생산을 허용하기 위해, 숙주 세포에는 전형적으로 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) (예를 들어, 관심 이종 뉴클레오티드 서열에 플랭킹될 수 있음), AAV rep 및 cap 유전자 기능, 및 추가의 헬퍼 기능이 제공되어야 한다. 이들은 임의 수의 적절한 플라스미드 또는 벡터를 사용하여 숙주 세포에 제공될 수 있다. 추가의 헬퍼 기능은, 예를 들어 아데노바이러스 (AV) 감염에 의해, 모든 필요한 AV 헬퍼 기능 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해, 또는 HSV 또는 바큘로바이러스와 같은 다른 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 숙주 세포에 의한 rAAV 생산에 필요한 임의의 유전자, 유전자 기능, 또는 다른 유전 물질은 예를 들어 숙주 세포 내에 일시적으로 존재하거나 숙주 세포 게놈 내로 안정적으로 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 AAV rep 및 cap 유전자 기능 및 rAAV 벡터 게놈을 포함하는 생산자 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 생산시에 별개의 재조합 바이러스에 의해 rAAV 벡터 게놈이 제공되는 AAV rep 및 cap 유전자 기능을 포함하는 패키징 세포이다. 본 발명의 방법과 함께 사용하기에 적합한 rAAV 생산 방법은 문헌 [Clark et al., Human Gene Therapy 6:1329-1341 (1995), Martin et al., Human Gene Therapy Methods 24:253-269 (2013), Thorne et al., Human Gene Therapy 20:707-714 (2009), Fraser Wright, Human Gene Therapy 20:698-706 (2009), 및 Virag et al., Human Gene Therapy 20:807-817 (2009)]에 개시된 것을 포함한다.
VII. rAAV 입자의 정제
본 발명의 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 숙주 세포를 본원에 기재된 화합물 (예를 들어, 화학식 (I), (I-A), (I-B), (II), (III) 또는 (IV)의 화합물 또는 B 비타민 (예를 들어, 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9 및 비타민 B12)) 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시킨 후에 숙주 세포로부터 수거 및/또는 정제된다. rAAV 입자는 세포를 용해시킴으로써 숙주 세포로부터 수득될 수 있다. 숙주 세포의 용해는 감염 바이러스 입자를 방출시키기 위해 세포를 화학적으로 또는 효소적으로 처리하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 벤조나제 또는 DNAse와 같은 뉴클레아제, 트립신과 같은 프로테아제, 또는 세제 또는 계면활성제의 사용을 포함한다. 균질화 또는 분쇄와 같은 물리적 파괴, 또는 미세유동화기 압력 셀을 통한 압력 적용, 또는 동결-해동 주기가 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포 용해를 필요로 하지 않으면서 숙주 세포로부터 상청액을 수집할 수 있다. 본원에 사용된 "총 rAAV"는 숙주 세포에 의해 생산된 총 rAAV를 지칭하고, "분비된 rAAV"는 세포 용해를 필요로 하지 않으면서 숙주 세포로부터 수거될 수 있는 rAAV를 지칭한다.
rAAV 입자를 수거한 후에는, 예를 들어 세포 용해에 기인하는 세포 파편을 제거하기 위해 rAAV를 함유하는 샘플을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. AAV 입자의 최소 정제 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 2개의 예시적인 정제 방법은 염화세슘 (CsCl)- 및 아이오딕사놀-기반 밀도 구배 정제이다. 상기 방법 둘 다는 문헌 [Strobel et al., Human Gene Therapy Methods., 26(4): 147-157 (2015)]에 기재되어 있다. 최소 정제는 또한 예를 들어 AVB 세파로스(Sepharose) 친화성 수지 (지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 에이비(GE Healthcare Bio-Sciences AB), 스웨덴 웁살라)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 달성될 수 있다. AVB 세파로스 친화성 수지를 사용하는 AAV 정제 방법은, 예를 들어 문헌 [Wang et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 2:15040 (2015)]에 기재되어 있다. 정제 후, rAAV 입자를 여과하고, ≤-60℃에서 저장할 수 있다.
VIII. rAAV 입자의 정량화
rAAV 입자의 정량화는 AAV 감염이 시험관내에서 세포병변 효과를 일으키지 않으므로 감염 역가를 결정하는데 플라크 검정을 사용할 수 없다는 사실로 인해 복잡하다. 그러나, rAAV 입자는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (Clark et al., Hum. Gene Ther. 10, 1031-1039 (1999)) 또는 도트-블롯 하이브리드화 (Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828 (1989))를 포함한 다수의 방법을 사용하거나 고도로 정제된 벡터 제제의 광학 밀도 (Sommer et al., Mol. Ther. 7, 122-128 (2003))에 의해 정량화될 수 있다. DNase-저항성 입자 (DRP)는 써모사이클러 (예를 들어, 아이사이클러(iCycler) iQ 96-웰 블록 포맷 써모사이클러 (바이오-라드(Bio-Rad), 캘리포니아주 허큘레스)에서 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (DRP-qPCR)에 의해 정량화될 수 있다. rAAV 입자를 함유하는 샘플을 DNase I (100 U/ml; 프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)의 존재 하에 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 이어서 프로테이나제 K (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 소화 (10 U/mL)를 50℃에서 60분 동안 수행하고, 이어서 95℃에서 30분 동안 변성시켰다. 사용된 프라이머-프로브 세트는 rAAV 벡터 게놈의 비-천연 부분, 예를 들어 관심 단백질의 폴리(A) 서열에 특이적이어야 한다. PCR 생성물은 프라이머, 프로브 및 증폭된 서열의 길이 및 조성에 기초하여 임의의 적절한 순환 파라미터 세트를 사용하여 증폭될 수 있다. 대안적 프로토콜은, 예를 들어 문헌 [Lock et al., Human Gene Therapy Methods 25(2): 115-125 (2014)]에 개시되어 있다.
상기 설명 전반에 걸쳐, 장치, 기기 및 시스템이 특이적 구성성분을 갖거나, 수반하거나 또는 포함하는 것으로서 기재되는 경우에, 또는 프로세스 및 방법이 특이적 단계를 갖거나, 수반하거나 또는 포함하는 것으로서 기재되는 경우에, 추가적으로, 본 발명의 장치, 기기 및 시스템은 상기 열거된 구성성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지고, 본 발명의 프로세스 및 방법은 상기 열거된 프로세싱 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지는 것으로 고려된다.
본 발명의 실시는 상기 예로부터 보다 완전히 이해될 것이며, 이는 단지 예시적 목적을 위해 본원에 제시되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: HeLa 세포를 사용한 rAAV 생산에 대한 상이한 농도의 니아신아미드의 효과
본 실시예에서, rAAV 생산에 대한 0.1 mM 내지 40 mM 범위의 다양한 농도의 니아신아미드의 효과를 다양한 HeLa 생산자 세포주에서 시험하였다. 실험은 3 mL 작업 부피, 세포 배양 생산 배지 중 0.2 x 106개 세포의 시딩 밀도, 및 200 vp/세포의 Ad5 감염 다중도 (MOI)로 24 딥-웰 플레이트 배양 시스템에서 실행하였다. 도 1은 다양한 니아신아미드 농도 (0.1 mM - 40 mM)에서 HeLa 생산자 세포로부터 생산된 다양한 클레이드 E 및 F rAAV에 대한 정규화된 부피 rAAV 역가의 요약 그래프를 보여준다. rAAV 역가의 증가는 0.1 mM부터 10 mM까지 관찰되었고, 가장 유의한 증가는 1 mM 내지 10 mM에서 관찰되었다. 본 분석에 포함된 캡시드 혈청형은 AAV8, AAV9, rh10, 및 hu37이었다.
도 2는 데이터 포인트의 3차 다항식 피팅을 사용할 때 다양한 니아신아미드 농도당 정규화된 부피 rAAV 역가 (GC/mL) 뿐만 아니라 예측 최대치의 그래프를 보여준다. rAAV 역가의 유의한 증가는 1 mM 내지 10 mM에서 관찰되었고, 5 mM에서 예측 최대치를 가졌다.
실시예 2: rAAV 생산에 대한 용기 규모의 효과
본 실시예에서, rAAV 생산에 대한 니아신아미드를 갖는 2개의 통상의 용기 (3 mL-딥 웰 ("24-DW") 및 100 mL 진탕 플라스크 ("플라스크"))를 사용한 규모의 효과를 시험하였다. 인자 IX 트랜스진을 코딩하는 클레이드 E rAAV (AAVrh10-FIX)를 생산할 수 있는 HeLa 생산자 세포주를 사용하여 분석을 수행하였다. 도 3은 상이한 규모에서 다양한 니아신아미드 농도에서의 rAAV 역가 (GC/mL)를 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 니아신아미드, 규모, 및 이들 사이의 상호작용의 인자를 검토하는 이원 ANOVA는 단지 니아신아미드로부터만 통계적으로 유의한 영향을 나타냈다 (p<0.0001). 규모 및 상호작용 인자는 유의하지 않았다 (각각 p=0.3915 및 p=0.1353). 던넷 시험을 수행하였으며, 이는 규모가 인자로서 제거될 때 모든 농도에서 유의성을 보여주었다.
실시예 3: 클레이드 E HeLa 클론을 사용한 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과
4개의 상이한 HeLa 클론을 실시예 1에 기재된 조건을 사용하여 시험하였다. 도 4a-d는 각각 클론 1 (AAVrh10-FIX) 추적 상청액, 클론 2 (AAV8-G6Pase) 상청액, 보충물이 없는 넓은 범위의 클론 3 (AAV8-G6Pase), 및 보충물 현탁액이 없는 넓은 범위의 클론 4 (AAVhu37-FVIII) (즉, 트리톤-용해된 샘플)에 대한 다양한 니아신아미드 농도당 rAAV 역가 (GC/mL)를 보여준다. 1 mM 내지 5 mM 니아신아미드가 첨가되었을 때 역가 증가가 4종의 클론 모두에서 나타났다.
실시예 4: 클레이드 F HeLa 클론을 사용한 rAAV 생산에 대한 니아신아미드의 효과
본 실시예에서, 말단절단된 ATP7B 트랜스진을 코딩하는 재조합 클레이드 F AAV (AAV9-ATP7B)를 발현하는 2종의 HeLa 생산자 세포주 클론에 대한 3 mM 니아신아미드의 효과를 2L 생물반응기에서 검사하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 생물반응기에 3 mM 니아신아미드를 첨가하는 것을 통해 두 클론에 대해 유의한 역가 증가가 관찰되었다.
실시예 5: HEK293 세포를 사용한 rAAV 생산에 대한 상이한 농도의 니아신아미드의 효과
본 실시예에서, rAAV 생산에 대한 0.03 mM 내지 30 mM 범위의 다양한 농도의 니아신아미드의 효과를 HEK293 세포로 시험하였다. 실험을 30 mL 플라스크에서 1.3 x 106 내지 2.0 x 106개 세포/mL의 형질감염 밀도를 사용하여 실행하였다. 본 실험에 사용된 HEK293 세포를 오르니틴 트랜스카르브아밀라제를 코딩하는 rAAV8 (rAAV8-OTC)을 생산할 수 있는 플라스미드로 형질감염시켰다. 도 6에 제시된 바와 같이, 0.3 mM 및 3 mM 니아신아미드 첨가에서 HEK293 세포에 의해 역가의 증가가 관찰되었다. 2L 생물반응기 규모로 반복된 실행은 또한 니아신아미드의 첨가 하에 HEK293 세포에 대한 역가의 증가를 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 6: HEK293 세포를 사용한 rAAV 생산에 대한 추가의 화합물의 효과
본 실시예에서, HEK293 세포에서의 rAAV 생산에 대한 니아신아미드 이외의 화합물의 효과를 검사하였다. 본 실시예에서 분석된 화합물은 니아신, 메틸 니코티네이트, 미오-이노시톨, 판토텐산, 피리독신, 콜린, 티아민, 글루코사민, 카페인, n-아세틸 글루코사민 및 티미딘을 포함하였다.
실험을 유사한 형질감염 및 배양 조건 하에 실시예 5에 기재된 것과 동일한 세포를 사용하여 24개의 딥-웰 플레이트에서 실행하였다. 시험된 각각의 화합물의 농도는 1 mM, 3 mM 및 9 mM이었다. 시험된 화합물 중에서, 니아신은 1 mM에서 역가의 20% 증가를 제공하였고, 메틸 니코티네이트는 3 mM에서 역가의 42% 증가를 제공하였고, 미오-이노시톨은 3 mM 및 9 mM에서 역가의 대략 20% 증가를 제공한 반면, 콜린은 3 mM에서 역가의 65% 증가를 제공하였다. 시험된 다른 화합물 중 어느 것도 시험된 3가지 농도 중 어느 것에서 rAAV 역가에 대해 유의한 이익을 제공하지 않았다.
본 실시예는 니아신, 메틸 니코티네이트, 미오-이노시톨 및 콜린을 포함한 대안적 화합물이 rAAV 역가를 부스팅할 수 있지만, 상기 화합물 중 어느 것도 조사된 다른 11종의 화합물보다 실질적으로, 놀랍도록 우수한 것으로 나타난 니아신아미드에 의해 제공된 수준의 이익을 제공하지는 않았다는 것을 보여준다.
넘버링된 실시양태
본원에 개시된 실시양태는 본 개시내용의 넘버링된　실시양태에 제공된 바와 같은 실시양태 P1 내지 P68을 포함한다.
실시양태 P1: 숙주 세포를 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법:
Figure pct00040
, 여기서:
Figure pct00041
는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
R1은 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
X는 CRcRd 또는 N이고;
Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
여기서 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00042
또는 그의 염.
실시양태 P2: 숙주 세포를 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법:
Figure pct00043
, 여기서:
Figure pct00044
는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
R1은 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
X는 CRcRd 또는 N이고;
Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
여기서 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00045
또는 그의 염.
실시양태 P3: 실시양태 P1 또는 P2에 있어서, X가 N인 방법.
실시양태 P4: 실시양태 P1-P3 중 어느 하나에 있어서, n이 1인 방법.
실시양태 P5: 실시양태 P1-P4 중 어느 하나에 있어서, R1이 C1-6알킬-OH, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P6: 실시양태 P1-P5 중 어느 하나에 있어서, R1이 CH2OH, -C(O)NH2, -C(O)OH, 및 -C(O)OCH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P7: 실시양태 P1 또는 P2에 있어서, X가 CRcRd인 방법.
실시양태 P8: 실시양태 P1, P2, 및 P7 중 어느 하나에 있어서, Rc가 수소이고, Rd가 -OH인 방법.
실시양태 P9: 실시양태 P1, P2 및 P7-P8 중 어느 하나에 있어서, n이 5인 방법.
실시양태 P10: 실시양태 P1, P2 및 P7-P9 중 어느 하나에 있어서, R1이 -OH인 방법.
실시양태 P11: 실시양태 P1 또는 P2에 있어서, 화합물이 화학식 (I-A)의 화합물 또는 그의 염인 방법:
Figure pct00046
, 여기서:
R2 및 R3은 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나,
또는 R2 및 R3은 함께 옥소를 형성할 수 있고;
R4는 수소, -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Re는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이다.
실시양태 P12: 실시양태 P11에 있어서, R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하는 것인 방법.
실시양태 P13: 실시양태 P11 또는 P12에 있어서, R4가 -NH2, -OH, 및 -OCH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P14: 실시양태 P11에 있어서, R2 및 R3이 둘 다 수소인 방법.
실시양태 P15: 실시양태 P11 또는 P14에 있어서, R4가 -OH인 방법.
실시양태 P16: 실시양태 P1, P2 및 P11 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법:
Figure pct00047
.
실시양태 P17: 실시양태 P1 또는 P2에 있어서, 화합물이 화학식 (I-B)의 화합물 또는 그의 염인 방법:
Figure pct00048
, 여기서:
X는 CRcRd이고;
R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e는 각 경우에 독립적으로 -OH, -O-C1-6알킬, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, 및 C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
여기서 Rc 및 Rd는 실시양태 P1에 정의된 바와 같다.
실시양태 P18: 실시양태 P17에 있어서, Rc가 수소이고, Rd가 -OH인 방법.
실시양태 P19: 실시양태 P17 또는 P18에 있어서, R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e가 -OH인 방법.
실시양태 P20: 실시양태 P17-P19 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00049
인 방법.
실시양태 P21: 숙주 세포를 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법:
Figure pct00050
, 여기서:
R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 C 또는 N이고;
R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00051
.
실시양태 P22: 숙주 세포를 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법:
Figure pct00052
, 여기서:
R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 C 또는 N이고;
R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 화합물은 하기가 아니다:
Figure pct00053
.
실시양태 P23: 실시양태 P21 또는 P22에 있어서, R6 및 R7이 수소인 방법.
실시양태 P24: 실시양태 P21-P23 중 어느 하나에 있어서, R8 및 R9가 수소인 방법.
실시양태 P25: 실시양태 P21-P24 중 어느 하나에 있어서, Y가 N인 방법.
실시양태 P26: 실시양태 P21-P25 중 어느 하나에 있어서, R10 및 R11이 CH3인 방법.
실시양태 P27: 실시양태 P21-P26 중 어느 하나에 있어서, A가 CH3인 방법.
실시양태 P28: 실시양태 P21-P27 중 어느 하나에 있어서, 화합물이
Figure pct00054
인 방법.
실시양태 P29: 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12로 이루어진 군으로부터 선택된 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법.
실시양태 P30: 실시양태 P1-P29 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 0.5 mM 초과인 방법.
실시양태 P31: 실시양태 P1-P29 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 0.5 mM 이상인 방법.
실시양태 P32: 실시양태 P1-P29 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 0.5 mM 내지 10 mM인 방법.
실시양태 P33: 실시양태 P1-P29 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 1 mM 내지 10 mM인 방법.
실시양태 P34: 실시양태 P1-P33 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
실시양태 P35: 실시양태 P1-P33 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
실시양태 P36: 실시양태 P1-P33 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
실시양태 P37: 실시양태 P1-P33 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 화합물의 최종 농도가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
실시양태 P38: 실시양태 P1-P37 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 화합물을 포함하는 용액과 적어도 2일 동안 접촉되는 것인 방법.
실시양태 P39: 실시양태 P1-P38 중 어느 하나에 있어서, rAAV를 수거 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 P40: 실시양태 P1-P39 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
실시양태 P41: 실시양태 P40에 있어서, 숙주 세포가 HeLa, HEK293, COS, A549, BHK 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P42: 실시양태 P41에 있어서, 숙주 세포가 HeLa 세포인 방법.
실시양태 P43: 실시양태 P41에 있어서, 숙주 세포가 HEK293 세포인 방법.
실시양태 P44: 실시양태 P1-P39 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
실시양태 P45: 실시양태 P44에 있어서, 숙주 세포가 Sf9, Sf-21, Tn-368 및 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P46: 실시양태 P1-P45 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 P47: 실시양태 P1-P46 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 rep 및 cap 유전자를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P48: 실시양태 P1-P47 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P49: 실시양태 P1-P48 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P50: 실시양태 P1-P49 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인 방법.
실시양태 P51: 실시양태 P1-P49 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인 방법.
실시양태 P52: 실시양태 P1-P49 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인 방법.
실시양태 P53: 실시양태 P1-P49 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인 방법.
실시양태 P54: 실시양태 P1-P53 중 어느 하나에 있어서, 용액이 세포 배양 배지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P55: 실시양태 P1-P53 중 어느 하나에 있어서, 용액이 생산 배지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 P56: 실시양태 P1-P55 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 현탁 배양으로 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P57: 실시양태 P1-P55 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 부착 배양으로 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P58: 실시양태 P1-P56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 1L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P59: 실시양태 P1-P56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 2L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P60: 실시양태 P1-56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 3L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P61: 실시양태 P1-P56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 250L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P62: 실시양태 P1-P56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 500L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P63: 실시양태 P1-P56 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포를 2,000L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 P64: 숙주 세포 및 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
실시양태 P65: 숙주 세포 및 화학식 (I-A)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
실시양태 P66: 숙주 세포 및 화학식 (I-B)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
실시양태 P67: 숙주 세포 및 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
실시양태 P68: 숙주 세포, 및 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12로 이루어진 군으로부터 선택된 B 비타민을 포함하는 조성물.
참조 포함
본원에 언급된 각각의 특허 및 과학 문헌의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명의 사상 또는 본질적인 특징들을 벗어나지 않고서 다른 특정한 형태로 본 발명을 구현할 수도 있다. 따라서, 상기 실시양태들은 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지고, 청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화는 그 안에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (86)

  1. 숙주 세포를 화학식 (I)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법:
    Figure pct00055
    , 여기서:
    Figure pct00056
    는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
    n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
    각각의 R1은 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
    Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
    X는 CRcRd 또는 N이고;
    Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
    여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
    Figure pct00057
    또는 그의 염.
  2. 숙주 세포를 화학식 (I)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법:
    Figure pct00058
    , 여기서:
    Figure pct00059
    는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
    n은 1 내지 5로부터 선택된 정수이고;
    각각의 R1은 각 경우에 독립적으로 -OH, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, C1-6알킬-O-C1-6알킬, -O-C1-6알킬, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
    Rb는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이고;
    X는 CRcRd 또는 N이고;
    Rc 및 Rd는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rc가 수소인 경우에, Rd는 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되고, Rc가 C1-6알킬, -OH, 및 -O-C1-6알킬로부터 선택되는 경우에, Rd는 수소이고;
    여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
    Figure pct00060
    또는 그의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X가 N인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1이 각 경우에 독립적으로 C1-6알킬-OH, -C(O)N(Ra)2, 및 -C(O)ORb로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1이 각 경우에 독립적으로 CH2OH, -C(O)NH2, -C(O)OH, 및 -C(O)OCH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, X가 CRcRd인 방법.
  8. 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Rc가 수소이고, Rd가 -OH인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, n이 5인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -OH인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용액이 화학식 (I-A)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00061
    , 여기서:
    R2 및 R3은 각 경우에 독립적으로 수소 또는 -OH이거나,
    또는 R2 및 R3은 함께 옥소를 형성할 수 있고;
    R4는 수소, -OH, -O-C1-6알킬, 및 -N(Re)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Re는 각 경우에 독립적으로 수소 또는 C1-6알킬이다.
  12. 제11항에 있어서, R2 및 R3이 함께 옥소를 형성하는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, R4가 -NH2, -OH 및 -OCH3로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, R2 및 R3이 둘 다 수소인 방법.
  15. 제11항 또는 제14항에 있어서, R4가 -OH인 방법.
  16. 제1항, 제2항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00062
    , 및 그의 임의의 조합(들).
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용액이 화학식 (I-B)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 것인 방법:
    Figure pct00063
    , 여기서:
    X는 CRcRd이고;
    R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e는 각 경우에 독립적으로 -OH, -O-C1-6알킬, C1-6알킬, C1-6알킬-OH, 및 C1-6알킬-O-C1-6알킬이고,
    여기서 Rc 및 Rd는 제1항에 정의된 바와 같다.
  18. 제17항에 있어서, Rc가 수소이고, Rd가 -OH인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, R5a, R5b, R5c, R5d, 및 R5e가 -OH인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 화합물
    Figure pct00064
    를 포함하는 것인 방법.
  21. 숙주 세포를 화학식 (II)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하는 방법:
    Figure pct00065
    , 여기서:
    R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Y는 C 또는 N이고;
    R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
    Figure pct00066
    또는 그의 염.
  22. 숙주 세포를 화학식 (II)의 적어도 1종의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법:
    Figure pct00067
    , 여기서:
    R6 및 R7은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R8 및 R9는 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, -CN, 할로겐, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Y는 C 또는 N이고;
    R10 및 R11은 각 경우에 독립적으로 수소, -OH, 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    A는 수소, C1-6알킬, 및 -C(O)N(Rf)2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Rf는 각 경우에 독립적으로 수소, C1-6알킬, C1-6알킬-C(O)OH, 및 C1-6알킬-OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서 적어도 1종의 화합물은 하기가 아니다:
    Figure pct00068
    또는 그의 염.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, R6 및 R7이 수소인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R8 및 R9가 수소인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 N인 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, R10 및 R11이 CH3인 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, A가 CH3인 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 화합물
    Figure pct00069
    를 포함하는 것인 방법.
  29. 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는, rAAV를 생산하거나 또는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민의 최종 농도가 0.5 mM 초과인 방법.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민의 최종 농도가 0.5 mM 이상인 방법.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민의 최종 농도가 0.5 mM 내지 10 mM인 방법.
  33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민의 최종 농도가 1 mM 내지 10 mM인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민의 최종 농도가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 적어도 1종의 화합물의 최종 농도가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하기에 충분한 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 적어도 2일 동안 접촉되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 수거 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 숙주 세포가 HeLa, HEK293, COS, A549, BHK 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 숙주 세포가 HeLa 세포인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 숙주 세포가 HEK293 세포인 방법.
  44. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 숙주 세포가 Sf9, Sf-21, Tn-368, 및 BTI-Tn-5B1-4 (하이-파이브(High-Five)) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 rep 및 cap 유전자를 포함하는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, ii) rep 및 cap 유전자, 및 iii) 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 적어도 1.2배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 분비된 rAAV를 생산하는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 적어도 1종의 화합물 또는 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉되지 않은 숙주 세포에 의해 생산된 것과 비교하여 1.2 내지 2.5배 더 많은 양의 총 rAAV를 생산하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 세포 배양 배지를 포함하는 것인 방법.
  55. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 생산 배지를 포함하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 현탁 배양으로 배양하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 부착 배양으로 배양하는 것을 포함하는 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 1L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  59. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 2L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  60. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 3L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  61. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 250L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  62. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 500L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  63. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 2,000L 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  64. 숙주 세포 및 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
  65. 숙주 세포 및 화학식 (I-A)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
  66. 숙주 세포 및 화학식 (I-B)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
  67. 숙주 세포 및 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물.
  68. 숙주 세포, 및 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 조성물.
  69. 숙주 세포를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는:
    Figure pct00070
    , 및 그의 임의의 조합(들),
    재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  70. 숙주 세포를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는:
    Figure pct00071
    , 및 그의 임의의 조합(들),
    rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  71. 숙주 세포 및 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 화합물을 포함하며:
    Figure pct00072
    , 및 그의 임의의 조합(들),
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 조성물.
  72. 숙주 세포를
    Figure pct00073
    를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  73. 숙주 세포를
    Figure pct00074
    를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  74. 숙주 세포 및
    Figure pct00075
    를 포함하며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 조성물.
  75. 숙주 세포를
    Figure pct00076
    를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  76. 숙주 세포를
    Figure pct00077
    를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  77. 숙주 세포 및
    Figure pct00078
    를 포함하며,
    여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 조성물.
  78. 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법이며, 여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  79. 숙주 세포를 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 및 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 rAAV 역가 수율을 증가시키는 방법이며, 여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 방법.
  80. 제69항, 제70항, 제72항, 제73항, 제75항, 제76항, 제78항 및 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 헬퍼 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  81. 숙주 세포, 및 비타민 B2, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 및 그의 임의의 조합(들)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 B 비타민을 포함하며, 여기서 숙주 세포는
    i) AAV 역전된 말단 반복부에 의해 플랭킹된 이종 뉴클레오티드 서열, 및
    ii) AAV rep 및 cap 유전자
    를 포함하는 것인 조성물.
  82. 제71항, 제74항, 제77항 및 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 헬퍼 유전자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  83. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
    Figure pct00079
    또는 그의 염을 포함하지 않는 것인 방법.
  84. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이
    Figure pct00080
    또는 그의 염을 포함하지 않는 것인 방법.
  85. 제64항 내지 제66항, 제71항 및 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00081
    또는 그의 염을 포함하지 않는 조성물.
  86. 제67항 또는 제77항에 있어서,
    Figure pct00082
    또는 그의 염을 포함하지 않는 조성물.
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