KR20220140147A

KR20220140147A - 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체를 포함하는 모발 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20220140147A
Application number: KR1020210046286A
Authority: KR
Inventors: 안병철; 간가다란프라카시; 라먀락쉬미
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-10-18
Also published as: KR102691113B1; CN115245520A; EP4070782A2; US20220323492A1; EP4070782A3

Abstract

본 발명은 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체를 포함하는 모발 재생용 조성물에 관한 것으로, 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)는 모유두 세포로 잘 흡수되며, 모유두 세포의 증식을 촉진하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 모발 유도성 단백질의 수준을 증가시키는 활성을 갖기 때문에, 모유두 세포의 증식 및 모발 증가 효과가 우수하여 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 포함하는 조성물을 모발 재생용으로 제공된다.

Description

대식세포 유래 세포외 소포체 유사체를 포함하는 모발 재생용 조성물{Composition for hair regeneration comprising macrophage-derived extracellular vesicle mimetics}

본 발명은 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체를 포함하는 모발 재생용 조성물에 관한 것이다.

탈모는 유전적 요인 또는 환경적 요인으로 인하여 모발이 탈피하여 발병되는 것으로, 유전적 요인이 가장 중요한 요인으로 여겨지지만, 최근에는 사회적 스트레스의 증가 및 환경 오염으로 인하여 후천적 요인으로 인한 탈모가 증가하고 있다. 후천적인 요인으로는 과도한 스트레스나 두피근육의 긴장, 남성호르몬의 과잉분비 또는 여성호르몬의 과잉분비, 지루성 피부염 및 아토피성 체질, 물리적 자극, 과다한 지방의 섭취 및 공해, 또는 혈액으로부터 단백질, 비타민, 호르몬 등을 충분히 공급받지 못하거나, 모발 뿌리에 있는 혈관의 혈액순환이 감소되는 경우 등의 요인이 있으며, 현대인은 남녀노소 거의 누구나 식생활의 불균형, 유해성 공기, 오염된 식수, 산성비 등의 공해와 약물남용, 스트레스 등 많은 환경적 정신적 요인 등등의 후천적 요인으로 인하여 유아에서부터 노인층에 이르기까지 탈모, 두피염증, 비듬, 지성모발, 건성모발 증상으로 발전하는 일이 증가되고 있다.

이러한 탈모를 개선하기 위해, 전세계적으로 노력이 지속되고 있으며, 혈행촉진제, 카로틴 용해제, 살균제, 각질용해제, 국소자극에 의한 혈액순환촉진, 모포기능강화, 항남성호르몬제, 항지루제, 아미노산 및 비타민류 등을 복수의 성분으로 조합하여 사용하여 왔으나 아직까지는 뚜렷한 효과를 나타내는 것은 보고되고 있지 않았다. 또한 상기와 같은 현대인의 탈모를 방지하기 위하여, 탈모방지용 샴푸나 탈모방지용 세제 및 약품이 인조 화공약품이 개발되고 있으나, 이 역시 탈모방지에는 큰 효과가 없을 뿐만 피부를 약화시키고 탈모, 빈모증세를 가중시키는 폐단이 어이지고 있는 상황이다.

한국공개특허공보 제20-2012-0007026호 (2012. 10. 11. 공고) 한국공개특허공보 제10-2017-0044999호 (2017. 04. 26. 공고)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 모유두 세포의 증식에 유효한 효과를 나타내고, 모발 증식을 촉진하는 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 포함하는 조성물을 모발 재생용으로 제공하는 것이다.

본 발명은 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 유효성분으로 포함하는 모발 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 유효성분으로 포함하는 모발 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 크기의 막 필터를 순차적으로 사용하여 대식세포를 압출하여 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 포함하는 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 압출된 용액을 2,000 내지 5,000 g에서 5분 내지 30분 동안 원심분리하는 단계; 및 (c) 상등액을 회수하여 50,000 내지 150,000 g에서 30분 내지 90분 동안 원심분리하여 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 분리하는 단계를 포함하는 모발 재생용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)는 모유두 세포로 잘 흡수되며, 모유두 세포의 증식을 촉진하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 모발 유도성 단백질의 수준을 증가시키는 활성을 갖기 때문에, 모유두 세포의 증식 및 모발 증가 효과가 우수하여 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 포함하는 조성물을 모발 재생용으로 제공될 수 있다.

도 1은 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)의 제조 방법(A), 단백질 성분 분석(B), 형태(C) 및 크기(D)를 분석한 결과이다.
도 2는 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)가 모유두 세포로 흡수되는지 확인하기 위해 형광 이미지로 분석한 결과이다.
도 3은 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)가 모유두 세포의 증식에 영향을 미치는지 확인하기 위해 모유두 세포의 세포 증식의 변화를 분석한 결과이다.
도 4는 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)가 모발 유동성 단백질(A) 및 증식 마커(B)의 수준에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 5는 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)가 모발 성장인자에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 동물모델에 투여할 경우의 세포외 소포체 유사체의 위치를 분석한 결과이다.
도 7은 본원 발명에 따라 제조된 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)가 진피 재생(A,B) 및 모발 신장(C,D)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 세포외 소포체 유사체는 대식세포를 필터로 압출시켜 인위적으로 제조된 소낭으로, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖으로 자연적으로 분비되는 엑소좀과 구별된다.

상기 세포외 소포체 유사체는 100 nm 내지 300 nm의 크기를 가질 수 있으며, 구체적으로, 135.51 nm 내지 261.5 nm의 크기일 수 있다.

상기 세포외 소포체 유사체는 막 결합 단백질인 CD63을 갖고 있을 수 있다.

상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포에서 β-카테닌(β-catenin), VRCN(Versican) 및 ALP의 수준을 증가시킬 수 있고, 인산화 AKT(pAKT) 및 인산화 ERK(pERK)의 수준을 증가시킬 수 있고, Bcl-2 및 PCNA의 수준을 증가시킬 수 있다.

상기 모유두 세포는 모낭의 기저부에 존재하는 세포로, 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당한다. 따라서 모유두세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 방지할 수 있다. 모발의 성장은 모유두(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다.

상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포 내로 흡수되어 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다.

상기 세포외 소포체 유사체에는 모발 재생용 약물을 담지할 수 있으며, 예컨대 모발 재생용 약물은 미녹시딜일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.

상기 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 세럼, 에멀젼, 에센스, 파우더, 파운데이션, 스프레이, 마스크팩, 시트팩, 수면팩, 워시오프팩 및 필오프팩로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 제형화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 화장료 조성물은 피부 외용제로서, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

상기 (a) 단계에서 대식세포를 모발 재생용 약물을 함유하는 용액에 혼합하는 과정을 포함할 수 있으며, 상기 모발 재생용 약물은 미녹시딜일 수 있다.

b) 단계에서, 상기 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 0.45 μm 필터로 여과한 후에 원심분리로 분리할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예> 실험 재료 및 방법

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 세포 배양

쥐 대식세포주인 Raw 264.7은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Raw 264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 함유된 DMEM-고농도 글루코오스(HyClone, Logan, UT, USA)에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다.

2. 모유두 세포 배양

모유두(dermal papilla, DP) 세포는 모발 이식을 받을 환자들로부터 채취되었으며, 헬싱키 선언의 원칙에 따라 모든 환자의 동의를 얻은 후에 수행되었다(IRB 번호 : KNU-2018-0161). DP 세포는 10% FBS 및 1% 항생제가 보충된 DMEM-저농도 글루코오스가 있는 100 mm 접시에서 37℃ 조건으로 배양되었다.

3. 대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(MAC-EM) 제조

Raw 264.7 세포주는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM-고농도 글루코오스(HyClone, Logan, UT, USA)에서 배양되었다. 배양된 세포가 포화될 때, Avanti Polar Lipids (AL, USA) 압출기를 사용하여 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 폴리카보네이트 막 필터(nucleopore track-etched 막)를 순차적으로 사용하여 대식세포를 압출하여 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics, EM)를 제조하였다. 세포외 소포체 유사체는 0.45 μm 필터를 통해 여과되었고, 이어서 2번의 원심분리를(3000g X 10 분, 4000g X 20 분) 순차적으로 시행하였고 이어서 초원심분리(100000 X 60 분)를 시행하였다. 최종적으로 밀도 구배 초원심분리기를 처리하여 순수한 EM(Opti-prep 밀도 구배 배지 60 %)을 수득하고, BCA 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 단백질을 측정하였다.

4. 웨스턴 블롯 분석

세포외 소포체 유사체(EM) 및 세포 용해물에 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA)을 포함하는 방사선 면역 침전 분석 버퍼(Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA))를 처리하였다. 10% SDS-PAGE를 사용하여 동일한 양의 단백질을 로딩하고, 분리하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 블롯은 1차 항체와 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체로 조사되었다. 신호는 제조사의 지침에 따라 향상된 화학 발광(GE Healthcare, USA)을 사용하여 감지되었다. 블롯 이미지는 Picasa3 (version 3.9.1.4.1; Google, CA, USA) 및/또는 PowerPoint program (Microsoft, USA)을 사용하여 준비되었다.

5. 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)

MAC-EM 펠렛은 100 μL의 2% 파라포름알데히드에 재현탁되었다. 그 후, 10 μL EM 펠렛을 탄소 코팅된 Formvar에서 EM 그리드로 20분 동안 부착하였다. 세척하기 위해 멸균 집게를 사용하여 그리드를 PBS(100 μL) 방울로 옮기고, 50 μL의 1% 글루타르알데히드를 처리하고, 25℃ 내지 30℃에서 5분 동안 배양하고, 증류수로 2분 동안 세척하였다. 샘플을 2% 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색한 다음, 증류수로 2분 동안 세척하였다. 이러한 단계를 7번 더 반복하였다. EM을 이미지화하기 위해서 HT 7700 투과 전자 현미경(Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하기 전에 샘플을 완전히 건조하였다.

6. 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)

MAC-EM 크기는 NTA (Nano Sight LM10, Malvern)에 의해 결정되었다. 샘플을 희석하기 위해, MAC-EM은 500 배의 milli-Q 정제수에 용해되었다. 샘플은 완전히 기포가 없는 캐비티에 삽입되었다. 측정은 필드당 20 내지 60 입자의 임계값과 비교되었다. 모든 측정은 3번 수행되었다.

7. MAC-EM 흡수 분석

형광 염료인 DiD(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt)로 표지된 MAC-EM을 CO₂ 배양기에서 DP 세포와 함께 4 시간 동안 배양하였다. 실온에서 샘플을 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 DAPI로 장착하였다. 형광 이미지는 고감도 초고해상도 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 800 with AiryScan, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 촬영하였다.

8. 세포 증식 분석

DP 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5000개 세포로 접종한 다음, 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양한 후, 다양한 농도의 MAC-EM을 첨가하였다. 이어서, 10 μL의 세포 계수 키트-8 시약(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 세포에 첨가하고, 2 시간 동안 배양하였다. 제조사의 지침에 따라 450 nm에서 ELISA 판독기를 사용하여 세포 증식을 측정하였다.

9. RNA 추출 및 RT-PCR

RNA 분리는 Triazole 시약을 사용하여 수행되었으며, 기존 PCR을 통해 cDNA 키트(ABI, USA)를 사용하여 RNA를 cDNA로 변환하였다. 1% 아가로오스 겔을 사용하여 전기영동 하고, PCR 산물을 분리하고, 자외선 하에서 밴드 강도를 관찰하였다.

10. C57BL/6 마우스에서 피내 주사된 MAC-EM의 생체 분포 및 국소화

생후 5.5.주령의 C57BL/6 수컷 마우스(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)를 구입하였으며, 경북대학교에서 정한 관리 지침에 따라 실험을 수행하였다. MAC-EM 투여 사이의 최적 시간 간격을 결정하기 위해, DiD 표지된 MAC-EM(MSC-EVMs/DiD)를 마우스 피내 주사하고, MAC-EM이 머무르게 하고, 6, 24, 48 및 72 시간 후에 IVIS Lumina III In Vivo Imaging System (PerkinElmer)로 형광 이미지를 통해 분석하였다. 72 시간 후, 장기(심장, 폐, 간, 신장, 위, 비장, 장 및 피부)를 절제하고, IVIS Lumina III를 사용하여 신호를 관찰하고 정량화 하였다. 피부는 cryosection으로 처리되고, DAPI로 염색되었다. HF(hair follicles)의 DiD 신호는 고감도 초고해상도 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 800 with AiryScan, Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 이미지화되었다.

11. in vivo 실험

생후 5.5. 주령된 C57BL/6 수컷 마우스(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)를 구입하였다. 실험 이틀 전에 마우스를 마취하고 전기 면도기를 사용하여 머리의 등쪽 표면 털을 제거하였다. 동물은 대조군(PBS; n = 6), 처리군(MAC-EMs; n = 6), 및 미녹시딜군(n = 3)의 세 그룹으로 나누었다. 치료는 50 μg의 MAC-EM을 피내 주사하여 투여하였다. 대조군에 PBS 50 μL를 주사하고, 미녹시딜군에는 미녹시딜(minoxidil) 50 μL을 4 주 동안 주 2회로 등쪽 표면에 도포하였다. 처리 후, 마우스를 치사하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 등 피부에 처리된 영역을 수집하였다. ZEN Lite 현미경 소프트웨어(ZEN Lite 2.3, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 최소 6회 측정하여 피부 진피의 두께(n = 3)를 측정하였다.

12. 장기 배양(Organ culture)

인간 모낭(hair follicles, HF)은 상기와 같이 배양되고, 세명의 지원자의 모낭이 사용되었다. 이 후, 모낭은 PBS 및 MAC-EMs (0.1, 0.5, 또는 1 μg/mL)으로 처리되었다. 모간 신장은 3일 및 6일에 측정되었다. 6일 째에 거시적 이미지를 촬영하였다.

13. 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현되었다. MS Office Excel (Microsoft, USA) 또는 GraphPad Prism7 소프트웨어 버전 7.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 Student t-test 또는 단방향/양방향 ANOVA로 두 그룹의 데이터를 통계적으로 분석하였다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1. MAC-EM의 특성화

대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(이하, ‘MAC-EM’이라 함)를 제조하고 그 특징을 분석하기 위해, 도 1A에 나타난 바와 같이 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포를 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 폴리카보네이트 막 필터를 순차적으로 사용하여 압출하여 MAC-EM을 제조하였다. 제조된 MAC-EM을 0.45 μm 필터로 여과한 후에 원심분리를 통해 정제하여 순순한 MAC-EM을 수득하였다. MAC-EM의 특징을 분석하기 위해, 웨스턴 블롯을 통해 막 결합 단백질인 CD63와 세포질 단백질인 ALIX의 수준을 측정하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, CD63 및 ALIX 수준은 MAC-EM에서 높은 수준으로 측정되었으며, 미토콘드리아 및 소포체 마커 단백질인 칼넥신(calnexin)은 대식세포 및 MAC-EM에서 관찰되는 것으로 나타났다.

MAC-EM의 모양을 분석하기 위해, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)으로 제조된 MAC-EM을 분석한 결과, MAC-EM의 모양이 둥근 것으로 확인되었다. 제조된 MAC-EM의 크기를 분석하기 위해, 나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis, NAT)를 수행한 결과, MAC-EM의 평균 직경은 200 ± 61.5 nm이고, 163 nm 크기의 MAC-EM가 가장 높은 분포를 갖는 것으로 나타났다. 상기 결과는 MAC-EM이 대식세포에서 성공적으로 제조되었음을 입증한다.

실시예 2. 모유두 세포에서 MAC-EM의 내재화

상기 MAC-EM이 모유두 세포(dermal papilla cell, 이하 ‘DP 세포’라 함) 내로 흡수되어 내재화되는지 확인하기 위해, 비표지된 MAC-EM(MAC-EM; 10 μg) 또는 표지된 MAC-EM(MAC-EM^DiD; 10 μg 또는 20 μg)를 DP 세포에 처리하고 1 시간 동안 배양하여 형광 이미지를 관찰하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, MAC-EM이 DP 세포 주변에 밀집되어 상호작용하는 것으로 나타났으며, DP 세포 내에 흡수되어 내재화되어 있음을 확인하였다. 상기 결과는 MAC-EM이 모유두 세포로 잘 흡수되는 것을 입증한다.

실시예 3. MAC-EM이 DP 세포의 증식에 미치는 영향

상기 MAC-EM이 DP 세포의 증식에 영향을 미치는지 평가하기 위해, 다양한 농도의 MAC-EM(2 - 24 μg)를 DP 세포에 처리하고 세포 증식 수준을 평가하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, MAC-EV로 처리한 경우, DP 세포의 증식이 용량 의존적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (p <0.01 및 p <0.001). 특히, 14 μg 내지 20 μg의 MAC-EM을 처리하는 경우에는 DP 세포의 증식이 대조군에 비해 약 2배 정도 우수하게 증가하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 MAC-EM의 처리가 DP 세포의 증식을 증가시키는 효과가 우수함을 입증한다.

실시예 4. MAC-EM이 모발 유도성 및 증식 마커에 미치는 영향

상기 MAC-EM이 DP 세포에서 모발 유도 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, MAC-EM을 DP 세포에 처리하고 모발 유도성 단백질인 β-카테닌(β-catenin), VRCN(Versican) 및 ALP의 수준을 조사하였다. 도 4A에 나타난 바와 같이, MAC-EM 처리 용량에 따라 3가지 모발 유도성 단백질 수준이 대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났다. 또한, MAC-EMA이 DP 세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해, MAC-EM을 DP 세포에 처리하고 증식 마커의 수준을 평가하였다. 도 4B에 나타난 바와 같이, MAC-EM을 처리한 경우에는 대조군에 비해 인산화 AKT(pAKT) 및 인산화 ERK(pERK)의 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 유사하게, 생존 및 증식 마커인 Bcl-2 및 PCNA의 수준도 대조군에 비해 MAC-EM을 처리한 경우가 증가하는 것으로 나타났다.

실시예 5. MAC-EM이 DP 세포에서 모발 성장인자에 미치는 영향

상기 MAC-EM이 DP 세포에서 모발 성장인자에 미치는 영향을 평가하기 위해, DP 세포에 MAC-EM을 처리하고, 모발 성장인자인 VEGF 및 KGF의 mRNA 발현을 측정하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, VEGF 및 KGF의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 MAC-EM의 처리 용량에 따라 증가하는 것으로 나타났다. VEGF는 대조군에 비해 MAC-EM을 10 μg 및 20 μg 처리하는 경우, 각각 3배, 6.5배 증가하는 것으로 나타났다. KGF는 대조군에 비해 MAC-EM를 10 μg 및 20 μg 처리하는 경우, 각각 2.5배, 3배 증가하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 MAC-EM 처리에 의해 성장 인자 유전자의 발현이 증가됨을 입증한다.

실시예 6. C57BL/6 마우스에서 MAC-EM 처리 유지

동물 모델에서 상기 MAC-EM가 처리 부위에 유지되는지를 평가하기 위해, C57BL/6 마우스 동물모델에 DiD로 표지된 MAC-EM을 처리하고 형광 이미지로 MAC-EM의 위치를 측정하였다. C57BL/6 마우스의 등쪽 피부를 면도하고, MAC-EM^DiD를 피내 주사한 후, 6, 24, 48 및 72 시간 때를 이미지화 하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 이미징 기술을 통해 DiD 신호는 피내 주사 부위에서 72 시간 동안 관찰되었다. ex vivo 이미지에서는 MAC-EM 주입된 피부에서는 신호가 강하게 나타났고, 폐, 간, 위 및 장과 같은 다른 기관에서는 신호가 약하게 나타났다. 피부 조직의 형광 이미징에서는 대부분의 MAC-EM^DiD 신호가 모낭에서 방출되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 MAC-EM는 표적 결합 부위인 피부 모낭에 유지되는 것을 보여준다.

실시예 7. C57BL/6 마우스에서 MAC-EM 투여가 모낭에 미치는 영향

C57BL/6 마우스에서 MAC-EM이 모발 재생에 미치는 영향을 평가하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, MAC-EM를 투여한 경우, C57BL/6 마우스에서 모발 재생이 유도되는 것으로 나타났다. 진피의 깊이는 마우스에서 휴지기가 성장기로 전환되는 것과 직접적으로 관련이 있으며, 조직학적 부분의 진피의 길을 측정한 결과, MAC-EM를 투여한 경우가 대조군 보다 진피의 길이가 유의하게 증가된 것으로 나타났다 (p < 0.05). 미녹시딜 군에서도 대조군보다 진피의 길이가 유의하게 증가된 것으로 나타났으며, MAC-EM를 투여한 경우는 미녹시딜군과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.

또한, 다양한 농도의 MAC-EM(0, 0.1, 0.5, 및 1 μg/mL)을 처리하여 인간 두피에서 모낭의 모간 연장(hair shaft elongation)을 측정함으로써, MAC-EM의 투여가 모발 성장에 미치는 영향을 평가하였다. 도 7C 및 7D에 나타난 바와 같이, 투여 3일 후에는 모간 연장이 대조군 보다 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(p < 0.01 및 p < 0.001). 또한, 투여 6일 후에는 모간 연장이 대조군 보다 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (p < 0.01 및 p < 0.001). 상기 결과는 MAC-EM 투여가 인간 모낭에서 간 성장을 증가시킬 수 있음을 입증한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 유효성분으로 포함하는 모발 재생용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 135.51 nm 내지 261.5 nm 크기인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 막 결합 단백질인 CD63을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포에서 β-카테닌(β-catenin), VRCN(Versican) 및 ALP의 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포에서 인산화 AKT(pAKT) 및 인산화 ERK(pERK)의 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포에서 Bcl-2 및 PCNA의 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체는 모유두 세포 내로 흡수되어 세포의 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체 유사체에는 모발 재생용 약물을 담지하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
대식세포 유래 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 유효성분으로 포함하는 모발 재생용 화장료 조성물.
(a) 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 크기의 막 필터를 순차적으로 사용하여 대식세포를 압출하여 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 포함하는 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 압출된 용액을 2,000 내지 5,000 g에서 5분 내지 30분 동안 원심분리하는 단계; 및
(c) 상등액을 회수하여 50,000 내지 150,000 g에서 30분 내지 90분 동안 원심분리하여 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 분리하는 단계를 포함하는 모발 재생용 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 대식세포를 모발 재생용 약물을 함유하는 용액에 혼합하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 모발 재생용 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 상기 세포외 소포체 유사체(extracellular vesicle mimetics)를 0.45 μm 필터로 여과한 후에 원심분리로 분리하는 것을 특징으로 하는 모발 재생용 조성물의 제조 방법.