KR20220137382A - Genetic polymorphic markers for determining wrinkle type of skin and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 피부 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커, 이를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 키트 또는 마이크로어레이, 및 상기 유전자 다형성 마커 또는 마커들의 조합을 이용한 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다.The present invention provides a composition for diagnosing whether a skin type is prone to wrinkling, comprising a genetic polymorphic marker having significance associated with the degree of skin wrinkle, a probe capable of detecting it or an agent capable of amplifying it, and the composition comprising the composition A kit or microarray for diagnosing whether a skin type exists, and a method for providing information on whether a skin type is easily wrinkled using the genetic polymorphism marker or a combination of markers.
피부는 인체의 가장 바깥 층이며 외부 환경에 반응하여 유해 물질로부터 신체를 보호하고 다른 감각을 느끼며 체온 조절과 같은 다양한 기능을 수행하고, 피부의 적절한 기능은 질병으로부터 신체를 보호하고 매력을 유지하는 데 필수적이다. The skin is the outermost layer of the human body and responds to the external environment to protect the body from harmful substances, sense different senses, and perform various functions such as thermoregulation, and the proper function of the skin is to protect the body from disease and maintain attractiveness. It is essential.
피부 주름은 가장 대표적인 피부 노화 특징 중 하나이며, 피부 주름의 변화는 환경적 요인과 연령, 성별 및 유전자 변이와 같은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있다. 피부 주름에 대한 기존의 전장유전체연관분석연구(GWAS, Genome-wide association study)들에 따르면, 주름의 생물학적 경로와 기능적으로 연관된 유전자 내에 위치하고 있는 유전자 변이가 피부 주름과 유의하게 관련되어 있음이 밝혀지고 있다. 그러나, 기존의 GWAS 연구들은 대부분 유럽인을 대상으로 하였으며 아시아 인종에 대한 연구는 거의 없기에 아시아 인종의 피부 주름 연관 유전적 변이에 대한 이해는 낮다. Skin wrinkles are one of the most representative skin aging characteristics, and changes in skin wrinkles can be influenced by environmental factors and factors such as age, gender, and genetic variation. According to the existing genome-wide association studies (GWAS) on skin wrinkles, it was found that genetic mutations located in genes functionally related to the biological pathway of wrinkles are significantly related to skin wrinkles, have. However, most of the existing GWAS studies have targeted Europeans, and there are few studies on Asian races, so the understanding of the genetic variation related to skin wrinkles in Asian races is low.
기존 GWAS 연구들 중 대부분은 피부 주름 정도를 정의할 때 평가자의 육안 판정에 의존하므로, 평가자에 따라 피부 주름 정도를 어떻게 정의하고 세분화하는지가 다를 수 있다는 한계가 존재한다. 반면 전문 피부 진단 기기를 이용한 피부 주름 평가는 평가자에 의한 편향을 최소화하고 모든 피평가자들에게 동일한 기준을 적용하여 피부 주름 정도를 수치화할 수 있다는 점에서 평가 방식에 대한 신뢰도를 확보할 수 있다. 또한 기기를 이용한 평가 방식은 보다 많은 수의 피평가자를 모집하고 평가하는 것이 용이하므로, 타당한 수준의 통계적 검정력을 얻기에 충분한 표본 크기에 좀 더 쉽게 도달할 수 있다는 장점을 갖는다.Since most of the existing GWAS studies rely on the visual judgment of the evaluator when defining the degree of skin wrinkling, there is a limit that how to define and subdivide the degree of skin wrinkle may differ depending on the evaluator. On the other hand, skin wrinkle evaluation using a professional skin diagnosis device can secure the reliability of the evaluation method in that it can quantify the degree of skin wrinkle by minimizing bias by the evaluator and applying the same standard to all evaluators. In addition, the evaluation method using a device has the advantage of being able to more easily reach a sample size sufficient to obtain a reasonable level of statistical power because it is easy to recruit and evaluate a larger number of subjects.
피부와 연관된 유전변이 및 유전자의 발굴은 생물학적 기전의 이해와 개인의 피부 특징을 이해하고 예측하는데 중요한 정보를 제공할 것으로 기대된다. 유전자 분석 연구는 질병이나 표현형과 관련성이 있는 유전지표를 발굴하는 연구에서, 발굴된 유전지표를 이용하여 미래의 질병이나 표현형을 예측하는 연구로 옮겨가고 있다. 특히 얼굴 형태나 피부 특성에 대한 유전자 분석 연구를 통해 얼굴 형태 변형이나 피부 노화를 예측하는 연구도 진행되고 있다 (Kemp et al., Molecules. 2017 Feb 26;22(3), 2017).The discovery of skin-related genetic mutations and genes is expected to provide important information for understanding biological mechanisms and understanding and predicting individual skin characteristics. Genetic analysis research is moving from research that discovers genetic indicators related to diseases or phenotypes to researches that predict future diseases or phenotypes using the discovered genetic indicators. In particular, research on predicting facial shape transformation or skin aging through genetic analysis research on facial shape or skin characteristics is also underway (Kemp et al., Molecules. 2017 Feb 26;22(3), 2017).
이러한 배경 하에 본 발명자들은 유전정보와 피부타입 정보의 빅데이터 구축을 통한 한국인 피부 특성 분류체계를 구축하고자 하였으며, 개체의 피부 특성을 결정하는 유전적 특징을 파악하여 과학적 피부 분류 기준을 구축하고, 이를 근거로 한 개인 맞춤형 유효성분을 개발하여, 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발에 기여하고자 예의 노력한 결과, 피부 주름과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성 (SNP) 마커를 선별하고 유전정보를 바탕으로 주름 정도를 진단하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors tried to build a classification system for Korean skin characteristics through the construction of big data of genetic information and skin type information. As a result of diligent efforts to contribute to the development of customized cosmetics for each skin characteristic through various product segmentation by developing individualized active ingredients based on the The present invention was completed by confirming a method for diagnosing the degree of wrinkles based on the information.
본 발명의 하나의 목적은 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for diagnosing whether a skin type is prone to wrinkles.
본 발명의 또 하나의 목적은 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles, comprising a probe capable of detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles or an agent capable of amplifying it will do
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit or microarray for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles comprising the composition.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 확인하는 단계를 포함하는 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of providing information on whether or not a skin type is prone to wrinkle formation, comprising the step of identifying a polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in the present invention is applicable to each other description and embodiment as well. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be considered that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 주름 정도 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 제공한다.As one aspect for achieving the object of the present invention, the present invention provides a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for diagnosing the degree of skin wrinkles.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 주름 정도 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 주름 정도 진단용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing the degree of skin wrinkles, comprising a probe capable of detecting or amplifying a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for diagnosing the degree of skin wrinkles.
상기 피부 주름 정도에 따라 개체의 피부 타입을 구분할 수 있다.The skin type of an individual may be classified according to the degree of skin wrinkle.
본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 구체적으로 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.‘유전자 다형성 마커'는 일반적으로 동일한 유전자 위치(염기)에서 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 관찰되는 경우를 말하며, 일반적으로 개인에 따라서 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자(major allele), 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele) 의 경우가 존재한다. 본 발명에서는 "다형성 마커"와 혼용될 수 있으며, 하위 대립 유전자의 염기와 염기 부위를 의미하거나, 염색체의 number와 base position과 함께 정의될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. As used herein, the term "polymorphism" refers to a case in which two or more alleles exist at one locus, and among polymorphic sites, only a single base differs from person to person. It is called (single nucleotide polymorphism, SNP). Preferred polymorphic markers have two or more alleles exhibiting an incidence of at least 1%, more specifically at least 10% or 20%, in a selected population. A 'genetic polymorphic marker' is usually two or more alleles at the same locus (base). It refers to a case in which alleles are observed, and generally, depending on the individual, a major allele/major allele, a major allele/minor allele, and a lower allele. The case of a minor allele/minor allele exists. In the present invention, it may be used interchangeably with "polymorphic marker", and may mean a base and a base region of a lower allele, or may be defined together with the number and base position of a chromosome, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다. 또한, 염색체의 number와 base position이 동일한 둘 이상의 염기의 조합을 의미하며, 상기 염기는 특정한 집단의 개체들에서 발생 빈도가 높은 상위 대립유전자(major allele)와 상기 상위 대립유전자 보다 발생 빈도가 낮은 하위 대립유전자(minor allele)를 포함한다.As used herein, the term "allele" refers to several types of one gene present at the same locus of homologous chromosomes. Alleles are also used to indicate polymorphism, for example, SNPs have two types of alleles. In addition, it refers to a combination of two or more bases having the same chromosome number and base position, and the base is a higher allele with a higher frequency of occurrence in a specific group of individuals and a lower with lower frequency of occurrence than the upper allele contains minor alleles.
구체적으로, 본 발명의 유전자 다형성 마커들은 피부 주름과 연관유의성이 있는 것으로, 두 가지 대립유전자(allele) 중에서 하위 대립유전자(minor allele)를 하나 이상 보유하고 있는 경우, 피부 주름이 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자 (major allele)를 갖고 있는 개체에 비해 유의미성이 있다고 할 수 있다. 즉, 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)의 경우에는 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자 (major allele)를 보유하고 있는 경우와 비교하여 피부 주름 정도에 비해 그 정도가 높거나 혹은 낮은 피부 특성을 가짐을 알 수 있다. Specifically, the genetic polymorphism markers of the present invention are significantly related to skin wrinkles, and when one or more of the two alleles have a lower allele, the skin wrinkles are the major allele. allele) / can be said to be significant compared to individuals with a major allele. That is, in the case of a major allele/minor allele, and a minor allele/minor allele, the major allele/major allele ), it can be seen that the degree has higher or lower skin characteristics compared to the degree of skin wrinkles.
본 발명에서 용어, "rs_id"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.In the present invention, the term "rs_id" refers to rs-ID, an independent marker given to all SNPs initially registered by the NCBI, which has been accumulating SNP information since 1998. rs_id described in this table means a SNP marker, which is a polymorphic marker of the present invention.
본 발명에서 용어, "피부 타입"이란 측정 또는 진단하고자 하는 개체의 피부 타입을 의미하는 것으로, 본 발명의 SNP로 측정할 수 있는 피부 타입은 제한 없이 포함하나, 구체적으로 주름일 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면 본 발명자들은 피험자의 피부 타입을 주름이 적은 피부 또는 주름이 많은 피부로 분류하였다. 본 발명의 단일염기다형성 마커는 정확한 피부 타입을 측정할 수 있도록 하므로, 유효 성분과 접촉된 피부의 변화된 피부 타입에 대한 정보도 제공할 수 있는 바, 개인의 맞춤형 화장품 등의 제공이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term “skin type” refers to the skin type of an individual to be measured or diagnosed. The skin type that can be measured by the SNP of the present invention includes without limitation, but may specifically be a wrinkle. According to an embodiment of the present invention, the present inventors classified the subject's skin type into skin with few wrinkles or skin with many wrinkles. Since the single nucleotide polymorphism marker of the present invention can measure the exact skin type, it can also provide information on the changed skin type of the skin in contact with the active ingredient, so it is possible to provide personalized cosmetics, etc. It is not limited thereto.
또한, 본 발명의 목적상 상기 용어 '피부 주름'은 개인 피부 중 일부 부위의 탄력이 떨어져 피부가 접히는 모양이 관찰되는 것을 의미한다. 피부의 접힘으로 인해 주름 부위는 주변부 피부에 비해 음영이 지므로, 주변부 피부에 비해 상대적으로 어둡게 관찰된다. 또한 주름은 대부분 선형의 모양을 가지므로, 음영진 부위가 연결되어 일정 길이 이상으로 관찰될 때 주름으로 정의될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In addition, for the purpose of the present invention, the term 'skin wrinkle' means that the elasticity of some parts of an individual's skin is lowered and the skin folds are observed. Due to the fold of the skin, the wrinkled area is shaded compared to the surrounding skin, so it is observed to be relatively dark compared to the surrounding skin. In addition, since most wrinkles have a linear shape, they may be defined as wrinkles when shaded areas are connected and observed over a certain length, but is not limited thereto.
상기 단일염기다형성 마커는 표 1 내지 표 4에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다. 상기 표 1 내지 표 4에 표시된 단일염기다형성 마커는 피부 주름 정도와 연관성이 있는지 정도를 판단하는 것일 수 있다.The single nucleotide polymorphism marker may be one or more single nucleotide polymorphism markers selected from among the single nucleotide polymorphism markers shown in Tables 1 to 4. The single nucleotide polymorphism markers shown in Tables 1 to 4 may be used to determine the degree of correlation with the degree of skin wrinkles.
본 발명의 단일염기다형성 마커의 피부의 주름 정도는 각 마커들의 빈도 수를 측정하여 판단하였다. 이와 같은 유의성은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-value와 같은 p-값을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로 p-value가 0.01 미만일 수 있으며, 더 구체적으로 p-value가 0.001 미만일 수 있고, 보다 더 구체적으로 0.0001 미만일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The degree of skin wrinkling of the single nucleotide polymorphism marker of the present invention was determined by measuring the frequency of each marker. Such significance is characterized by, but is not limited to, a p-value such as, but not limited to, a p-value of less than 0.05, less than 0.01, less than 0.001, less than 0.0001, less than 0.00001, less than 0.000001, less than 0.0000001, less than 0.00000001, or less than 0.000000001. Specifically, the p-value may be less than 0.01, more specifically, the p-value may be less than 0.001, and more specifically, it may be less than 0.0001, but is not limited thereto.
본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커는 표 1 내지 표 4에 표시된 마커 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단일염기다형성 (SNP) 마커는 1개 이상일 수 있으며, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 등 주름을 판단할 수 있는 개수의 조합으로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The single nucleotide polymorphism (SNP) marker of the present invention may be any one or more selected from the markers shown in Tables 1 to 4, but is not limited thereto. The single nucleotide polymorphism (SNP) marker may be one or more, and may be used as a combination of a number such as two or more, three or more, four or more that can determine wrinkles, but is not limited thereto.
상기 마커는 SNP 그 자체, 또는 상기 SNP 위치를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴크레오티드, 또는 이의 상보적인 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The marker may be, but is not limited to, the SNP itself, or a polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences including the SNP position, or a polynucleotide consisting of a complementary sequence thereof.
구체적으로, 하나의 구체예로 단일염기다형성 마커는 표 1에 표시된 마커 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, in one embodiment, the single nucleotide polymorphism marker may be any one or more selected from the markers shown in Table 1, but is not limited thereto.
표 1에 표시된 마커 중 선택되는 마커를 설명하면 다음과 같을 수 있다.A marker selected from among the markers shown in Table 1 may be described as follows.
한 예로, SNP 아이디가 rs12695694의 경우, Chr.Position (GRCh ver. 37)이 "3:139000458"으로 기재되어 있고, Allele이 C>G 로 개시되어 있다면, 이는 인간의 3번 염색체의 139000458번째 염기가 C 또는 G 임을 나타내는 것이며, allele의 ">" 왼쪽에 위치하는 염기가 상위 대립유전자(major allele)를 오른쪽에 위치하는 염기가 하위 대립유전자(minor allele)를 의미하는 것일 수 있다.For example, if the SNP ID is rs12695694, if Chr.Position (GRCh ver. 37) is described as "3:139000458" and Allele is C>G, this is the 139000458th base of human chromosome 3 is C or G, and a base located to the left of ">" of an allele may mean a major allele, and a base located to the right of an allele may mean a minor allele.
하나의 구체예로, 표 1에서 선택되는 마커는 인간의 2번 염색체의 119633160번째 염기가 G 또는 T인(rs7597233), 상기 119633160번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 119632252번째 염기가 G 또는 A인(rs12612325), 상기 119632252번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 119599377번째 염기가 A 또는 T인(rs13005242), 상기 119599377번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 119632724번째 염기가 G 또는 A인(rs12621139), 상기 119632724번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 119628722번째 염기가 G 또는 T인(rs1438842), 상기 119628722번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 139000458번째 염기가 C 또는 G인(rs12695694), 상기 139000458번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 139002193번째 염기가 A 또는 T인(rs9853827), 상기 139002193번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 139006664번째 염기가 C 또는 G인(rs6802174), 상기 139006664번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 138997688번째 염기가 G 또는 A인(rs9866054), 상기 138997688번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 139004920번째 염기가 G 또는 A인(rs10212419), 상기 139004920번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 139021139번째 염기가 C 또는 T인(rs4894405), 상기 139021139번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 4번 염색체의 146537655번째 염기가 A 또는 G인(rs117927610), 상기 146537655번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 4번 염색체의 124239525번째 염기가 C 또는 T인(rs6832894), 상기 124239525번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 20303599번째 염기가 C 또는 T인(rs7033540), 상기 20303599번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 20308808번째 염기가 C 또는 A인(rs57500604), 상기 20308808번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기에 기재된 마커는 표 1에서 일부만을 예시로 기재한 것일 뿐이며, 다른 위치의 염색체에서도 상기와 동일한 방법으로 선택될 수 있다. In one embodiment, the marker selected from Table 1 is the 119633160th base of human chromosome 2 G or T (rs7597233), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 119633160; The 119632252 base of human chromosome 2 is G or A (rs12612325), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 119632252; Base 119599377 of human chromosome 2 is A or T (rs13005242), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 119599377; The 119632724 base of human chromosome 2 is G or A (rs12621139), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 119632724; Base 119628722 of human chromosome 2 is G or T (rs1438842), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 119628722; The 139000458th base of human chromosome 3 is C or G (rs12695694), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences comprising base 139000458; The 139002193 base of human chromosome 3 is A or T (rs9853827), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences comprising base 139002193; The 139006664 base of human chromosome 3 is C or G (rs6802174), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences comprising base 139006664; Base 138997688 of human chromosome 3 is G or A (rs9866054), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 138997688; The 139004920 base of human chromosome 3 is G or A (rs10212419), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 139004920; Base 139021139 of human chromosome 3 is C or T (rs4894405), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences comprising base 139021139; Base 146537655 of human chromosome 4 is A or G (rs117927610), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 146537655; Base 124239525 of human chromosome 4 is C or T (rs6832894), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences comprising base 124239525; The 20033599 base of human chromosome 9 is C or T (rs7033540), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 20303599; The 20308808 base of human chromosome 9 is C or A (rs57500604), said a polynucleotide consisting of 5-100 contiguous DNA sequences including base 20308808; and one or more polynucleotides selected from the group consisting of their complementary polynucleotides, but is not limited thereto. The above-described markers are only partially described in Table 1 as examples, and may be selected in the same manner as above in chromosomes at other positions.
또 하나의 구현예로 표 1과 마찬가지로 표 2에 표시된 단일염기다형성(SNP) 마커 중 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. As another embodiment, as in Table 1, any one or more of the single nucleotide polymorphism (SNP) markers shown in Table 2 may be selected, but the present invention is not limited thereto.
또 하나의 구현예로 표 1과 마찬가지로 표 3에 표시된 단일염기다형성(SNP) 마커 중 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment, as in Table 1, any one or more of the single nucleotide polymorphism (SNP) markers shown in Table 3 may be selected, but the present invention is not limited thereto.
또 하나의 구현예로 표 1과 마찬가지로 표 4에 표시된 단일염기다형성(SNP) 마커 중 어느 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment, as in Table 1, any one or more of the single nucleotide polymorphism (SNP) markers shown in Table 4 may be selected, but the present invention is not limited thereto.
표 2 내지 표 4에 표시된 단일염기다형성 마커는 상기에서 설명한 바와 같이 해석 및 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The single nucleotide polymorphism markers shown in Tables 2 to 4 may be interpreted and selected as described above, but are not limited thereto.
본 발명의 목적상 상기 용어'피부 주름 정도'는 피부 주름으로 인해 일정 길이 이상의 선형의 부위가 주변부 피부에 비해 상대적으로 어둡게 관찰될 때 모든 대상 영역을 합산하여 전체 측정 부위 대비 비율을 측정한 결과를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 표 1 내지 표 4에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하여 주름 생성이 쉬운지 여부를 판단하는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 주름 생성이 쉬운 피부 타입은 노화 진행이 빨라서 피부 면적 당 주름이 많이 생성되는 비율이 높은 피부 타입을 의미한다. For the purpose of the present invention, the term 'skin wrinkle degree' refers to the result of measuring the ratio of the total measurement site by summing all the target areas when a linear area of a certain length or more is observed relatively dark compared to the surrounding skin due to skin wrinkles. mean, but not limited thereto. Specifically, it means determining whether wrinkles are easy to generate using any one or more single nucleotide polymorphism (SNP) markers selected from Tables 1 to 4. More specifically, a skin type that is easy to generate wrinkles refers to a skin type that has a high rate of generation of wrinkles per skin area due to rapid aging.
본 발명의 상기 대립유전자는 각각의 개체에서 염색체의 number가 동일하고, 그 중에서 SNP의 상위 대립유전자(major allele) 및 하위 대립유전자(minor allele)가 존재하고, 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 하위 대립유전자로 하나씩 늘어감에 따라 상위 대립유전자는 하나씩 줄어갈 수 있으며, 상위 대립유전자로 하나씩 늘어감에 따라 하위 대립유전자는 하나씩 줄어갈 수 있다. 다만, 하위대립유전자 및 상위대립유전자가 늘어나고 줄어들 수 있는 범위는 i) 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자(major allele), ii) 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), iii) 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)의 3가지 타입 안에서 일 수 있으며, 상기 3가지 타입의 범위 내에서 대립 유전자가 줄어들거나, 늘어날 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The allele of the present invention is chromosomal in each individual The number is the same, and among them, a major allele and a minor allele of the SNP exist, and as the bases of the polymorphic site of the polymorphic marker increase one by one to the lower allele, the upper allele is one by one It can decrease by one, and as one increases to the upper allele, the lower allele can decrease by one. However, the range in which the lower allele and upper allele can increase and decrease is i) major allele/major allele, ii) major allele/minor allele ), iii) may be within three types of lower alleles/minor alleles, and the allele may decrease or increase within the range of the three types, but is not limited thereto. .
또한, 본 발명에서 상기 마커는 개체의 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 하위 대립유전자 (minor allele)가 하나씩 늘어감에 따라 표현형(주름)의 증감 변화 정도를 판단할 수 있는 마커이다. 더욱 구체적으로, 두 가지 대립유전자(allele) 중에서 하위 대립유전자(minor allele)를 하나 이상 보유하고 있는 (1) 상위 대립유전자(major allele)/하위 대립유전자(minor allele), (2) 하위 대립유전자(minor allele)/하위 대립유전자(minor allele)의 경우)를 갖는 개인은 일반적인 개인인 상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자(major allele)를 보유하고 있는 사람과 비교하여, 피부 주름 정도가 높거나 혹은 낮은 피부 특성을 가진다고 판단할 수 있다.In addition, in the present invention, the marker is a marker capable of determining the degree of increase or decrease in the phenotype (wrinkle) as the base allele of the polymorphic site of the polymorphic marker increases one by one. More specifically, (1) a major allele/minor allele, and (2) a lower allele carrying one or more minor alleles among the two alleles (minor allele/in the case of minor allele), the degree of skin wrinkling is lower than that of those carrying the major allele/major allele, which is a common individual. It can be judged to have high or low skin characteristics.
일 예로, 표 1에 표시된 마커 중 개체의 3번 염색체의 139000458번째 염기에서 상위 대립유전자 C이고, 하위 대립 유전자가 G인 경우(rs12695694), C/C를 보유하고 있는 사람과 비교하여, C/G 또는 G/G를 보유하는 경우에 effect size가 마이너스(-)이므로 눈 밑 주름이 적은 것으로 판단할 수 있고, 개체의 2번 염색체의 119633160번째 염기에서 상위 대립유전자 G이고, 하위 대립 유전자가 T인 경우(rs7597233), G/G를 보유하고 있는 사람과 비교하여, G/T 또는 T/T를 보유하는 경우에 effect size가 플러스(+)이므로 눈 밑 주름이 많은 것으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.For example, among the markers shown in Table 1, when the upper allele C at the 139000458th base of the individual's chromosome 3 and the lower allele is G (rs12695694), compared with those who have C / C, C / If you have G or G/G, the effect size is negative (-), so it can be judged that the under-eye wrinkles are small, and the upper allele G is the upper allele G at the 119633160th base of the individual's chromosome 2, and the lower allele is T (rs7597233), compared with those who have G/G, in the case of holding G/T or T/T, the effect size is positive (+), so it can be judged that there are many wrinkles under the eyes. not limited
더욱 구체적으로, 본 발명에서 상기 마커는 개체의 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 하위 대립유전자 (minor allele)가 하나씩 늘어감에 따라 표현형(주름)의 증감 변화 정도를 판단할 수 있는 마커이다. More specifically, in the present invention, the marker is a marker capable of determining the degree of increase or decrease in the phenotype (wrinkle) as the bases of the polymorphic site of the polymorphic marker of the individual increase by one minor allele.
일 예로, 표 1에 표시된 마커 중 개체의 3번 염색체의 139000458번째 염기의 소수 대립유전자인 G가 증가하는 경우(rs12695694) effect size가 마이너스(-)이므로 눈 밑 주름이 적은 것으로 판단할 수 있고, 개체의 2번 염색체의 119633160번째 염기의 소수 대립유전자인 T가 증가하는 경우(rs7597233) effect size가 플러스(+)이므로 눈 밑 주름이 많은 것으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As an example, when G, the minor allele of the 139000458th base of the individual's chromosome 3 among the markers shown in Table 1 increases (rs12695694), the effect size is negative (-), so it can be determined that there are few wrinkles under the eyes, If T, the minor allele of base 119633160 of chromosome 2 of the individual increases (rs7597233), the effect size is positive (+), so it can be determined that there are many wrinkles under the eyes, but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 단일염기다형성 마커는 하위 대립유전자(minor allele)인 하기 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 눈 밑 주름이 많은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:Specifically, when the single nucleotide polymorphism marker includes one or more of the following bases, which are minor alleles, it may be a number of wrinkles under the eyes, but is not limited thereto:
인간의 2번 염색체의 119633160번째 염기가 T; 인간의 2번 염색체의 119632252번째 염기가 A; 인간의 2번 염색체의 119599377번째 염기가 T; 인간의 2번 염색체의 119632724번째 염기가 A; 인간의 2번 염색체의 119628722번째 염기가 T; 인간의 4번 염색체의 146537655번째 염기가 G; 인간의 4번 염색체의 124239525번째 염기가 T.Base 119633160 of human chromosome 2 is T; Base 119632252 of human chromosome 2 is A; Base 119599377 of human chromosome 2 is T; The 119632724 base of human chromosome 2 is A; Base 119628722 of human chromosome 2 is T; Base 146537655 of human chromosome 4 is G; Base 124239525 of human chromosome 4 is T.
또한, 상기 단일염기다형성 마커는 하위 대립유전자(minor allele)인 하기 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 눈 밑 주름이 적은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:In addition, when the single nucleotide polymorphism marker includes one or more of the following bases, which are minor alleles, it may have fewer wrinkles under the eyes, but is not limited thereto:
인간의 3번 염색체의 139000458번째 염기가 G; 인간의 3번 염색체의 139002193번째 염기가 T; 인간의 3번 염색체의 139006664번째 염기가 G; 인간의 3번 염색체의 138997688번째 염기가 A; 인간의 3번 염색체의 139004920번째 염기가 A; 인간의 3번 염색체의 139021139번째 염기가 T; 인간의 9번 염색체의 20303599번째 염기가 T; 인간의 9번 염색체의 20308808번째 염기가 A.Base 139000458 of human chromosome 3 is G; Base 139002193 of human chromosome 3 is T; Base 139006664 of human chromosome 3 is G; Base 138997688 of human chromosome 3 is A; The 139004920 base of human chromosome 3 is A; Base 139021139 of human chromosome 3 is T; The 20033599 base of human chromosome 9 is T; The 20308808 base of human chromosome 9 is A.
또 다른 일 예로, 표 3에 표시된 마커 중 개체의 12번 염색체의 89110410번째 염기의 소수 대립유전자인 C가 증가하는 경우(rs72620727) effect size가 마이너스(-)이므로 눈 옆 주름이 적은 것으로 판단할 수 있고, 개체의 9번 염색체의 16794418번째 염기의 소수 대립유전자인 A가 증가하는 경우(rs12376135) effect size가 플러스(+)이므로 눈 옆 주름이 많은 것으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another example, if the minor allele C of the 89110410 base of chromosome 12 of the individual among the markers shown in Table 3 increases (rs72620727), the effect size is negative (-), so it can be determined that the wrinkles around the eyes are small. In the case of an increase in A, the minor allele of the 16794418th base of chromosome 9 (rs12376135), the effect size is positive (+), so it can be determined that there are many wrinkles around the eyes, but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 단일염기다형성 마커는 하위 대립유전자(minor allele)인 하기 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 눈 옆 주름이 많은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:Specifically, when the single nucleotide polymorphism marker includes one or more of the following bases, which are minor alleles, it may have many lateral wrinkles, but is not limited thereto:
인간의 9번 염색체의 16794418번째 염기가 A; 인간의 9번 염색체의 16795241번째 염기가 C; 인간의 9번 염색체의 16795790번째 염기가 C; 인간의 14번 염색체의 30435055번째 염기가 T; 인간의 15번 염색체의 28232737 번째 염기가 G; 인간의 15번 염색체의 28233207번째 염기가 G; 인간의 15번 염색체의 28233905번째 염기가 T; 인간의 15번 염색체의 28233913번째 염기가 C.Base 16794418 of human chromosome 9 is A; Base 16795241 of human chromosome 9 is C; The 16795790 base of human chromosome 9 is C; Base 30435055 of human chromosome 14 is T; The 28232737 base of human chromosome 15 is G; The 28233207 base of human chromosome 15 is G; The 28233905 base of human chromosome 15 is T; The 28233913th base of human chromosome 15 is C.
또한, 상기 단일염기다형성 마커는 하위 대립유전자(minor allele)인 하기 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 눈 옆 주름이 적은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:In addition, when the single nucleotide polymorphism marker includes one or more of the following bases, which are minor alleles, the lateral wrinkles may be small, but the present invention is not limited thereto:
인간의 12번 염색체의 89110410번째 염기가 C; 인간의 19번 염색체의 3548231번째 염기가 G; 인간의 19번 염색체의 3540539 번째 염기가 C; 인간의 19번 염색체의 3542983번째 염기가 T; 인간의 19번 염색체의 3550926번째 염기가 G; 인간의 19번 염색체의 3537184번째 염기가 G.Base 89110410 of human chromosome 12 is C; Base 3548231 of human chromosome 19 is G; Base 3540539 of human chromosome 19 is C; The 3542983 base of human chromosome 19 is T; Base 3550926 of human chromosome 19 is G; Base 3537184 of human chromosome 19 is G.
상기 염기들은 표 1 또는 표 3만을 일 예로 기재한 것이며, 구체적으로 기재하지는 않았으나, 표 2 또는 표 4을 통해서도 주름에 관여하는 마커를 상기와 동일하게 도출할 수 있다.The bases are described as examples only in Table 1 or Table 3, and although not specifically described, the markers involved in wrinkles can be derived from Table 2 or Table 4 in the same manner as above.
본 발명에서 용어, "피부의 주름 정도 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브"는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 피부 주름 정도를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다. 또한, 상기 용어는 '주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용'의 용어와 혼용되어 사용할 수 있다. As used herein, the term "probe capable of detecting a marker for diagnosing the degree of skin wrinkle" refers to a composition capable of diagnosing the degree of skin wrinkle by identifying it through a hybridization reaction specifically with the polymorphic region of the gene as described above, The specific method of the gene analysis is not particularly limited, and any gene detection method known in the art to which the present invention pertains may be used. In addition, the term may be used interchangeably with the term 'for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles'.
본 발명에서 용어, "피부의 주름 정도 진단용 마커를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 피부 주름 정도를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 구체적으로 상기 피부의 주름 정도 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다. 또한, 상기 용어는 '주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부 진단용'의 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.As used herein, the term "agent capable of amplifying a marker for diagnosing the degree of skin wrinkle" refers to a composition capable of diagnosing the degree of skin wrinkle by identifying the polymorphic region of the gene as described above through amplification, specifically, the skin It refers to a primer capable of specifically amplifying the polynucleotide of a marker for diagnosing the degree of wrinkles. In addition, the term may be used interchangeably with the term 'for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles'.
상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.The primers used for amplifying the polymorphic marker are prepared under suitable conditions (e.g., 4 different nucleoside triphosphates and a polymerization agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and template-directing DNA under an appropriate temperature. Refers to a single-stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form stable hybrids with the template. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but must be sufficiently complementary to hybridize to the template.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 정도를 통해 피부 타입을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. As used herein, the term "primer" refers to a nucleotide sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and is a start for template strand copying. A short sequence that functions as a branch. Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and temperature. By performing PCR amplification, the skin type can be predicted by the degree of production of the desired product. PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.
본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The probes or primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, "encapsulation", substitution of one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (eg, methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 주름 정도 진단용 조성물을 포함하는 피부의 주름 정도 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. As another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing the degree of skin wrinkles, comprising the composition for diagnosing the degree of skin wrinkles. The kit may be an RT-PCR kit or a DNA chip kit, but is not limited thereto.
본 발명의 키트는 피부 타입 진단용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 피부 타입을 진단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 피부 타입 진단용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 피부 타입 진단용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 구체적으로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 피부 타입 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.The kit of the present invention can diagnose the skin type by amplifying the SNP polymorphic marker, which is a marker for skin type diagnosis, or by checking the expression level of the SNP polymorphic marker and the mRNA expression level. As a specific example, the kit for measuring the mRNA expression level of the marker for skin type diagnosis in the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR. In addition to each primer pair specific for the gene of a skin type diagnostic marker, the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs) , enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. In addition, a primer pair specific for a gene used as a quantitative control may be included. Also specifically, the kit of the present invention may be a kit for diagnosing a skin type including essential elements necessary for performing a DNA chip. A DNA chip kit is a method in which nucleic acid species are attached in a gridd array to a generally flat solid support plate, typically a glass surface no larger than a microscope slide, and the nucleic acids are uniformly arranged on the chip surface, so that the DNA chip It is a tool that allows multiple hybridization reactions between the nucleic acids on the chip surface and the complementary nucleic acids contained in the solution treated on the chip surface to enable massively parallel analysis.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 주름 정도 진단용 조성물을 포함하는 피부의 주름 정도 진단용 마이크로어레이를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a microarray for diagnosing the degree of skin wrinkles, comprising the composition for diagnosing the degree of skin wrinkles.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.The microarray may include DNA or RNA polynucleotides. The microarray consists of a conventional microarray except that the polynucleotide of the present invention is included in the probe polynucleotide.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 피부 타입 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25~30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.Methods for preparing microarrays by immobilizing probe polynucleotides on a substrate are well known in the art. The probe polynucleotide refers to a hybridizable polynucleotide, and refers to an oligonucleotide capable of sequence-specific binding to a complementary strand of a nucleic acid. The probe of the present invention is an allele-specific probe. A polymorphic site exists in nucleic acid fragments derived from two members of the same species, so that it hybridizes to a DNA fragment derived from one member but does not hybridize to a fragment derived from another member. . In this case, the hybridization conditions should be sufficiently stringent to hybridize only one of the alleles by showing a significant difference in the hybridization intensity between alleles. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms. The probe of the present invention can be used in a method for diagnosing a skin type by detecting an allele. The diagnostic methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids, such as Southern blotting, and may be provided in a form previously bound to a substrate of a DNA chip in a method using a DNA chip. The hybridization may be usually performed under stringent conditions, for example, a salt concentration of 1M or less and a temperature of 25° C. or higher. For example, conditions of 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) and 25-30° C. may be suitable for allele-specific probe hybridization.
본 발명의 피부 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.The process of immobilizing the probe polynucleotide related to the skin diagnosis of the present invention on a substrate can also be easily prepared using this conventional technique. In addition, hybridization of nucleic acids on microarrays and detection of hybridization results are well known in the art. The detection is, for example, labeling a nucleic acid sample with a label capable of generating a detectable signal including a fluorescent substance, for example, a substance such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing on a microarray and generating from the labeling material. The hybridization result can be detected by detecting the signal to be used.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 수득한 DNA에서 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 주름 정도에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method comprising: (a) amplifying the polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker in DNA obtained from a sample isolated from an individual or hybridizing it with a probe; and (b) identifying the base of the amplified or hybridized polymorphic site of step (a).
본 발명의 용어, "개체"란 피부 주름 정도에 대한 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다. 상기 검체에서 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term “subject” refers to a subject for diagnosing the degree of skin wrinkles. DNA may be obtained from the sample, such as hair, urine, blood, various body fluids, isolated tissues, isolated cells, or samples such as saliva, but is not limited thereto.
상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.Any method known to those skilled in the art can be used for the method of obtaining genomic DNA in step (a).
상기 (a) 단계의 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. Any method known to those skilled in the art may be used for amplifying the polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker or hybridizing with a probe from the DNA obtained in step (a). For example, it can be obtained by amplifying a target nucleic acid through PCR and purifying it. Others include ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), transcription amplification (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)) and self-maintaining sequence replication (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)) and nucleic acid-based sequence amplification (NASBA) can be used.
상기 방법 중 (b)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.Among the methods, determining the base of the polymorphic site in step (b) includes sequencing analysis, microarray hybridization, allele specific PCR, and dynamic allele-specific hybridization. , DASH), PCR extension assay, SSCP, PCR-RFLP assay or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g. Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing method, Bio- Plex systems (BioRad), CEQ and SNPstream systems (Beckman), Molecular Inversion Probe array technologies (eg, Affymetrix GeneChip), and BeadArray Technologies (eg, Illumina GoldenGate and Infinium assays). . One or more alleles in polymorphic markers can be identified, including microsatellites, SNPs, or other types of polymorphic markers, by the above methods or other methods available to those skilled in the art. Determination of the base of such a polymorphic site can be specifically performed through a SNP chip.
상기 방법은 추가적으로 (c) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 상기 단일염기다형성 마커에 따른 하위 대립유전자(minor allele)인 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 주름이 많은 것 또는 적은 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추가적으로 (c) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 상기 단일염기다형성 마커에 따른 상위 대립유전자(major allele)인 염기를 하나 이상 포함하는 경우, 주름이 많은 것 또는 적은 것으로 판단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method is to additionally (c) determine that there are many or few wrinkles when the base of the amplified or hybridized polymorphic site contains one or more bases that are minor alleles according to the single nucleotide polymorphism marker. can, but is not limited thereto. In addition, (c) additionally (c) if the base of the amplified or hybridized polymorphic site includes one or more bases that are major alleles according to the single nucleotide polymorphism marker, it may be determined that there are many or few wrinkles. However, it is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "SNP 칩"은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.As used herein, the term "SNP chip" refers to one of the DNA microarrays that can check each base of hundreds of thousands of SNPs at once.
TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.The TaqMan method comprises the steps of (1) designing and manufacturing a primer and a TaqMan probe to amplify a desired DNA fragment; (2) labeling probes of different alleles with FAM dye and VIC dye (Applied Biosystems); (3) using the DNA as a template, and performing PCR using the primers and probes; (4) after the PCR reaction is completed, analyzing and confirming the TaqMan assay plate with a nucleic acid analyzer; and (5) determining the genotype of the polynucleotides of step (1) from the analysis result.
상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.In the above, the sequencing analysis may use a conventional method for determining the nucleotide sequence, and may be performed using an automated gene analyzer. In addition, allele-specific PCR refers to a PCR method of amplifying a DNA fragment in which the SNP is located with a primer set including a primer designed with the 3' end of the base in which the SNP is located. The principle of the method is, for example, when a specific base is substituted from A to G, a primer containing A as a 3' end base and a reverse primer capable of amplifying a DNA fragment of an appropriate size are designed to perform PCR In the case of performing the reaction, when the base at the SNP position is A, the amplification reaction is normally performed and a band at the desired position is observed, and when the base is substituted with G, the primer can bind to the template DNA, but 3 ' This is taking advantage of the fact that the amplification reaction is not performed properly due to the inability to perform complementary binding at the end. DASH may be performed by a conventional method, and specifically may be performed by a method by Prince et al.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 dTTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.On the other hand, PCR extension analysis first amplifies a DNA fragment containing a base in which the single nucleotide polymorphism is located with a pair of primers, and then inactivates all nucleotides added to the reaction by dephosphorylating, and here a SNP-specific extension primer; A primer extension reaction is performed by adding a dNTP mixture, dideoxynucleotide, reaction buffer and DNA polymerase. In this case, the extension primer uses the 3' end of the base immediately adjacent to the 5' direction of the base at which the SNP is located, the dNTP mixture excludes a nucleic acid having the same base as the dideoxynucleotide, and the dideoxynucleotide represents the SNP It is selected from one of the base types. For example, when there is a substitution from A to G, when a mixture of dGTP, dCTP and dTTP and ddATP are added to the reaction, the primer is extended by DNA polymerase at the base where the substitution has taken place, and after a few bases, A The primer extension reaction is terminated by ddATP at the position where the base first appears. If the substitution does not occur, since the extension reaction is terminated at that position, it is possible to determine the type of base representing the SNP by comparing the lengths of the extended primers.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.In this case, as a detection method, when the extension primer or dideoxynucleotide is fluorescently labeled, the SNP can be detected by detecting fluorescence using a gene analyzer (eg, ABI's Model 3700, etc.) used for general sequencing. In the case of using a non-labeled extension primer and dideoxynucleotide, the SNP can be detected by measuring the molecular weight using a matrix assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) technique.
본 발명의 피부 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커들을 통하여 개인의 피부 주름 정도에 대한 정보를 제공해 줄 수 있으며, 더 나아가서는 개인에게서 관찰되는 유전자 다형성 마커들의 정보에 따라 피부 주름 정도를 완화시켜줄 수 있는 맞춤형 성분 또는 제품을 개발할 수 있을 것이다.It is possible to provide information on the degree of skin wrinkling of an individual through the genetic polymorphic markers having a significance associated with the degree of skin wrinkling of the present invention, and furthermore, it is possible to alleviate the degree of skin wrinkle according to the information of the genetic polymorphic markers observed in the individual. We will be able to develop custom ingredients or products that can be used.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
한국인(여성)에서 유전정보에 따라 얼굴 피부 주름 정도(수치)에 차이가 나타나는 유전체 부위(유전자 변이)를 발굴하고자 하였다. 본 발명은 주름에 연관되어 있는 유전체 부위(유전자 변이)를 발굴하기 위한 것으로, 후보 유전자를 미리 선별하지 않고 유전체전장수준을 스크리닝 할 수 있는 microarray genotyping chip (Illumina社 제품)을 활용하였다. The purpose of this study was to discover genomic regions (gene mutations) in which differences in the degree (number) of facial skin wrinkles according to genetic information were found in Koreans (females). The present invention is to discover genomic regions (gene mutations) related to wrinkles, and utilizes a microarray genotyping chip (product of Illumina) that can screen the full-length level of the genome without selecting candidate genes in advance.
본 발명에서 주름 정도를 평가하기 위하여 이미지 기반의 피부진단 전문기기(PIE社 Janus3)를 활용하였으며, 피부 주름 정도(수치)에 영향을 줄 수 있는 외부효과를 최소화하기 위하여 나이와 BMI, 군집 주성분 수치로 보정 후 활용하였다.In order to evaluate the degree of wrinkles in the present invention, an image-based specialized skin diagnosis device (PIE's Janus3) was used. was used after correction.
유전체 부위(유전자 변이)와 피부 주름 정도(수치)와의 연관성을 확인하기 위하여 선형회귀분석을 활용하여 상관유의성 및 유전적 효과를 수치화하였다.In order to confirm the correlation between the genomic region (gene mutation) and the degree of skin wrinkles (number), correlation significance and genetic effect were quantified using linear regression analysis.
실시예 1: 피부의 특성 분류 및 유전자 채취Example 1: Characterization of skin and gene extraction
일반적인 피부 주름 정도를 설명할 수 있는 유전자 다형성 마커를 도출해내기 위하여, 20~70대의 건강한 한국인 여성을 모집하였다. 또한, 피부 측정을 위하여 모든 분석 대상은 클렌징 또는 비누를 얼굴 세안을 하고 피부가 측정 환경에 적응할 수 있도록 어떠한 제품도 바르지 않고 30분간 대기한 후에 피부 주름 정도를 평가하였으며, 평가에는 이미지 기반의 피부진단 전문기기(PIE社 Janus3)를 활용하였다 (측정 및 분석은 기기 제조사의 매뉴얼에 따라 수행함). 구체적으로, 분석 대상자는 머리띠 착용 및 검은 천을 옷 위에 두른 후 얼굴을 기기에 내장된 이마 받침대와 턱 받침대에 고정하고 눈을 감은 상태로 측정을 위한 자세 유지하고, Janus 3 기기에 내장된 카메라를 통해 분석 대상자의 안면부에 대한 고해상도 이미지를 촬영하였다. Janus 3 자체에서 제공하는 프로그램은 양 눈 부위를 기준으로 눈의 바깥쪽 옆 영역과 눈 아래 영역을 정의하며, 해당 영역 내 모든 주름 부위를 추출하고 수치화하였다. 특히 주름이 많이 생기는 눈가 부위를 타겟하여, 눈 밑 주름과 눈 옆 주름으로 나누어 분석하였다.In order to derive genetic polymorphic markers that can explain the general degree of skin wrinkles, healthy Korean women in their 20s and 70s were recruited. In addition, for skin measurement, all analysis subjects washed their faces with cleansing or soap and waited for 30 minutes without applying any products so that the skin could adapt to the measurement environment, and then the degree of skin wrinkles was evaluated. A specialized device (PIE's Janus3) was used (measurement and analysis were performed according to the device manufacturer's manual). Specifically, after wearing a headband and putting a black cloth over clothes, the subject fixed their face on the forehead and chin rests built into the device, and maintained the posture for measurement with eyes closed, using the camera built into the Janus 3 device. A high-resolution image of the facial part of the subject to be analyzed was taken. The program provided by Janus 3 itself defines the outer lateral area of the eye and the area under the eye based on both eye areas, and extracts and quantifies all wrinkle areas within the area. In particular, by targeting the area around the eyes where wrinkles occur a lot, the analysis was divided into wrinkles under the eyes and wrinkles around the eyes.
일반적인 개인 (상위 대립유전자(major allele)/상위 대립유전자 (major allele)를 보유)의 피부 주름 정도는 동일한 유전자 위치(염기)에서 두 가지 대립유전자가 관찰되는 분석대상 11,079명을 대상으로 측정한 피부 주름 정도의 눈 밑 또는 눈 옆 평균을 의미하며 그 값은 분석 영역 내에서 주변부 피부에 비해 상대적으로 어두우며 일정 길이 이상으로 관찰되는 부위의 비율로 도출하였다. The degree of skin wrinkle in a general individual (having a major allele/major allele) was measured on 11,079 analysis subjects in which two alleles were observed at the same gene location (base). It means the average of wrinkles under the eyes or the sides of the eyes, and the value was derived as the ratio of areas observed over a certain length that were relatively dark compared to the surrounding skin within the analysis area.
유전자 채집은 타액 수집을 통하여 이루어졌으며, 효과적인 유전자 채집을 위해 모든 분석 대상은 채집 전 30분부터는 물을 포함한 어떠한 음식물 섭취를 금하였다. Gene collection was done through saliva collection, and for effective gene collection, all analysis subjects were prohibited from ingesting any food including water from 30 minutes before collection.
상기 피험자 중 ① 임신, 수유 중 또는 6 개월 이내에 임신을 계획하고 있는 경우, ② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1 개월 이상 사용한 경우, ③ 동일한 시험에 참가한 뒤 6 개월이 경과되지 않는 경우, ④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우, ⑤ 시험 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 경우, ⑥ 시험 시작 3 개월 이내에 시험 부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우, ⑦ 시험 부위에 시술(피부 박피술, 보톡스, 기타 피부관리)을 받거나 6 개월 이내 계획한 경우, ⑧ 만성 소모성 질환이 있는 경우 (천식, 당뇨, 고혈압 등), ⑨ 아토피 피부염을 가지는 경우, ⑩ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우는 피험자에서 제외하였다.Among the above subjects, ① Pregnant, lactating, or planning to become pregnant within 6 months, ② If a skin exfoliant containing steroids has been used for more than 1 month for the treatment of skin diseases, ③ If 6 months have not elapsed since participating in the same test ⑥ If you have sensitive or hypersensitive skin, ⑤ If there are skin abnormalities such as spots, acne, erythema, telangiectasia, etc. In case of use, ⑦ If the test site has undergone treatment (dermabrasion, botox, other skin care) or planned within 6 months, ⑧ If you have a chronic wasting disease (asthma, diabetes, high blood pressure, etc.), ⑨ If you have atopic dermatitis, ⑩ Other cases judged to be difficult due to the judgment of the main investigator were excluded from the subjects.
실시예 2: 피부의 특성에 따른 유전자형 분석Example 2: Genotyping according to skin characteristics
유전자 분석을 위한 타액으로부터의 유전자 추출은 QIAamp mini prep kit (QIAGEN)을 이용하여 human genomic DNA를 추출하였으며, 그 품질은 흡광도 (OD 260/280) 또는 1.7, 농도 50ng/ul, 1x TAE 1% agarose gel을 통한 band 검사를 통해 확인하였으며 품질을 통과한 건에 한하여 유전자 분석을 수행하였다.For gene extraction from saliva for gene analysis, human genomic DNA was extracted using QIAamp mini prep kit (QIAGEN), and the quality was absorbance (OD 260/280) or 1.7, concentration 50ng/ul, 1x TAE 1% agarose It was confirmed through the band test through the gel, and genetic analysis was performed only on cases that passed the quality.
Illumina社 microarray genotyping chip을 이용하여 유전자 분석이 진행되었으며, 구체적으로는 동일 회사의 global screening array 제품을 이용하여 분석 대상자들의 유전자를 분석하였다.Gene analysis was performed using Illumina's microarray genotyping chip, and specifically, the genes of the subjects were analyzed using the global screening array product of the same company.
Illumina社 microarray genotyping chip 유전자 분석 실험은 제공되는 매뉴얼에 따라 진행되었으며, 제공되는 시약을 사용하여 genomic DNA 증폭 (amplification), DNA 조각화 (fragmentation), 침전 (precipitation), 혼성화 (hybridization), 염색 (staining), 세척 (washing), 코팅 (coating), 스캐닝 (scanning)의 과정을 수행하였다.Illumina's microarray genotyping chip gene analysis experiment was performed according to the provided manual, and using the provided reagents, genomic DNA amplification, DNA fragmentation, precipitation, hybridization, and staining were performed. , washing, coating, and scanning were performed.
실험이 완료된 microarray genotyping chip은 iScan Control Software (Illumina)를 이용하여 스캔하였으며, 스캔이 완료되면 idat 파일이 자동으로 생성되어 GenomeStudio (Illumina) 프로그램을 이용하여 데이터 품질관리 (sample call rate 98%, marker call rate 98%) 및 유전자정보 확인을 수행하였다.The microarray genotyping chip on which the experiment was completed was scanned using the iScan Control Software (Illumina), and when the scan was completed, the idat file was automatically created and data quality management (sample call rate 98%, marker call) was performed using the GenomeStudio (Illumina) program. rate 98%) and genetic information was confirmed.
본 실험에서는 유전자 분석 이후 데이터 품질관리를 통과한 데이터만 활용하였다.In this experiment, only data that passed data quality control after genetic analysis were used.
실시예 3: 피부 타입별 유전자형 분석을 이용한 피부 주름 정도 연관유의성 유전자 다형성 마커 도출Example 3: Derivation of significant genetic polymorphism markers associated with skin wrinkle degree using genotyping analysis for each skin type
피부 주름 정도와 연관유의성을 갖는 유전자 다형성 마커들을 도출하기 위하여 분석대상들의 유전자 다형성 마커를 이용한 선형회귀분석을 진행하였으며, 분석을 위하여 PLINK v 1.90 및 SNP & Variation suite(Golden Helix, Inc., Bozeman, Montana, USA) 프로그램을 사용하였다.Linear regression analysis was performed using the polymorphic markers of the analytes to derive genetic polymorphic markers that had correlational significance with the degree of skin wrinkling. For the analysis, PLINK v 1.90 and SNP & Variation suite (Golden Helix, Inc., Bozeman, Montana, USA) program was used.
실험을 통하여 확인된 유전자 다형성 마커들을 활용하여 추가적인 유전자 다형성 마커에 대한 정보를 확보하기 위하여 Imputation 분석을 Beagle v 5.1 프로그램을 사용하여 진행하였으며, 해당 분석을 진행하기 위하여 기준이 되는 참조데이터는 국제 공개 유전체데이터 database인 1000 Genomes project에 등록되어 있는 정보를 활용하였다.Imputation analysis was performed using the Beagle v 5.1 program to secure information on additional genetic polymorphism markers using the genetic polymorphism markers identified through the experiment. The information registered in the data database, 1000 Genomes project, was used.
Imputation은 실험으로 확보한 유전자 다형성 마커 정보를 토대로 분석되지 않은 유전자 다형성 마커 정보를 추론하는 통계학적 기법이다. Imputation is a statistical technique for inferring unanalyzed genetic polymorphic marker information based on experimentally obtained genetic polymorphic marker information.
분석대상 유전자 다형성 마커들의 품질관리를 위하여 각 유전자 다형성 마커들이 하위 대립유전자 빈도 (minor allele frequency) 또는 0.01 및 하디-웨인버그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium) 또는 0.000001 기준을 넘는 것에 한하여 활용하였다. For quality control of the polymorphic markers of the gene to be analyzed, only those that exceed the criteria of minor allele frequency or 0.01 and Hardy-Weinberg equilibrium or 0.000001 were used for each polymorphic marker.
피부 주름 정도와 연관성을 보이는 유전자 다형성 마커들의 유의성은 선형회귀분석 F-statistics를 통해 평가하였으며, 그 기준은 P-value < 0.00000005 로 설정하였다. 또한 다소 완화된 기준인 0.00000005 ≤ P-value < 0.0001에 해당하는 경우, 피부 주름 정도와 약한 수준의 연관성을 보이는 유전자 다형성 마커들로 추가적으로 선별하였다.The significance of the genetic polymorphic markers correlated with the degree of skin wrinkling was evaluated through linear regression analysis F-statistics, and the criterion was set as P-value < 0.00000005. In addition, when 0.00000005 ≤ P-value < 0.0001, which is a somewhat relaxed criterion, genetic polymorphism markers showing a weak level of association with the degree of skin wrinkles were additionally selected.
피부 주름 정도에 영향을 줄 수 있는 외부효과를 최소화하고 유전자정보에 따른 효과를 도출하기 위하여 나이 또는 BMI 정보 또는 생활습관 (음주, 흡연, 식습관, 수면습관 등)의 정보로 피부 주름 정도를 보정하여 분석에 활용할 수 있다 (예: 선형회귀분석을 수행).In order to minimize external effects that may affect the degree of skin wrinkling and derive effects according to genetic information, the degree of skin wrinkles is corrected with information on age or BMI or lifestyle (drinking, smoking, eating habits, sleeping habits, etc.) It can be used for analysis (eg, performing linear regression analysis).
피부 주름 정도 연관유의성 유전자 다형성 마커들은 매우 다수가 도출되었으며, 해당 유전자 다형성 마커들은 인간 유전체 중에서 2, 3, 4, 9, 12, 14, 15, 19 번 염색체에 주로 위치하고 있음을 확인하였다. A very large number of genetic polymorphism markers related to skin wrinkle degree were derived, and it was confirmed that the polymorphic markers were mainly located on chromosomes 2, 3, 4, 9, 12, 14, 15, and 19 in the human genome.
피부 주름과 유의하게 관련된 SNP 마커 리스트는 하기 표 1 내지 표 4에 나타냈다. 구체적으로, 표 1 및 표 2는 눈 밑 주름 정도 연관 유전자 다형성 마커에 관한 것으로 유의수준(P)이 5.00E-8 미만인 것은 표 1에 나타내고, 5.00E-8 이상 1.00E-4 미만인 것은 표 2에 나타내었다. 또한, 표 3 및 표 4는 눈 옆 주름 정도 연관 유전자 다형성 마커에 관한 것으로 유의수준(P)이 5.00E-8 미만인 것은 표 3에 나타내고, 5.00E-8 이상 1.00E-4 미만인 것은 표 4에 나타내었다.A list of SNP markers significantly related to skin wrinkles is shown in Tables 1 to 4 below. Specifically, Tables 1 and 2 relate to polymorphic markers related to the degree of under-eye wrinkles. Those with a significance level (P) less than 5.00E-8 are shown in Table 1, and those with a significance level (P) of 5.00E-8 or more and less than 1.00E-4 are Table 2 shown in In addition, Tables 3 and 4 relate to polymorphic markers related to the degree of wrinkles around the eyes. Those with a significance level (P) less than 5.00E-8 are shown in Table 3, and those with a significance level (P) of 5.00E-8 or more and less than 1.00E-4 are shown in Table 4. indicated.
1) 미국국립보건원 (NIH) ID, 해당 홈페이지에서 서열확인가능1) National Institutes of Health (NIH) ID, you can check the sequence on the website
2) (major allele) > (minor allele) 의미2) Meaning of (major allele) > (minor allele)
3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)
4) 3가지의 유전형(M/M, M/m, m/m)에 대한 표현형 차이의 통계적 유의성 (M: major allele, m: minor allele)4) Statistical significance of phenotypic differences for three genotypes (M/M, M/m, m/m) (M: major allele, m: minor allele)
5) minor allele 이 하나씩 늘어감에 따라 표현형(눈 밑 주름)의 증감 변화 정도 (-: 눈 밑 주름 감소, +: 눈 밑 주름 증가), 주름 정도 = 전체면적 대비 주름이 일어나는 부위의 면적 비율, 단 주름 부위의 intensity 가중치와 threshold 값 적용, 시판기기이용 (Janus3, PIE社, Korea)5) As the minor allele increases one by one, the degree of increase or decrease of the phenotype (under-eye wrinkles) (-: reduction of under-eye wrinkles, +: increase of under-eye wrinkles), wrinkle degree = ratio of area where wrinkles occur to the total area, However, intensity weighting and threshold value applied to the wrinkle area, using commercially available equipment (Janus3, PIE, Korea)
6) Beagle v5.1 사용하여 분석6) Analyze using Beagle v5.1
1) 미국국립보건원 (NIH) ID, 해당 홈페이지에서 서열확인가능1) National Institutes of Health (NIH) ID, you can check the sequence on the website
2) (major allele) 또는 (minor allele) 의미2) Meaning (major allele) or (minor allele)
3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)3) minor allele frequency = (2mm + Mm)/2(MM + Mm + mm)
4) 3가지의 유전형(M/M, M/m, m/m)에 대한 표현형 차이의 통계적 유의성 (M: major allele, m: minor allele)4) Statistical significance of phenotypic differences for three genotypes (M/M, M/m, m/m) (M: major allele, m: minor allele)
5) minor allele 이 하나씩 늘어감에 따라 표현형(눈 옆 주름)의 증감 변화 정도 (-: 눈 옆 주름 감소, +: 눈 옆 주름 증가), 주름 정도 = 전체면적 대비 주름이 일어나는 부위의 면적 비율, 단 주름 부위의 intensity 가중치와 threshold 값 적용, 시판기기이용 (Janus3, PIE社, Korea)5) As the minor allele increases one by one, the degree of increase or decrease of the phenotype (wrinkle next to the eye) (-: decrease in wrinkles around the eyes, +: increase in wrinkles around the eyes), wrinkle degree = ratio of area where wrinkles occur to the total area, However, intensity weighting and threshold value applied to the wrinkle area, using commercially available equipment (Janus3, PIE, Korea)
6) Beagle v5.1 사용하여 분석6) Analyze using Beagle v5.1
그 결과, 총 8개의 유전체 부위(2, 3, 4, 9, 12, 14, 15, 19 번 염색체 =)에서 주로 피부 주름과의 연관성을 보이는 유전자 변이들이 확인되었다. As a result, genetic mutations mainly related to skin wrinkles were identified in a total of 8 genomic regions (chromosomes 2, 3, 4, 9, 12, 14, 15, 19 =).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims described below and their equivalents.
Claims (8)
A composition for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles, comprising a probe capable of detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) marker or a formulation capable of amplifying any one or more selected from Tables 1 to 4, .
The method of claim 1, wherein the single nucleotide polymorphism marker for diagnosing whether the skin type is prone to wrinkle formation comprises: a polynucleotide corresponding to one or more single nucleotide polymorphism markers selected from any one of Tables 1 to 4; and one or more polynucleotides selected from the group consisting of complementary polynucleotides thereof.
A kit for diagnosing whether the skin type is prone to wrinkles, comprising the composition of claim 1 or 2.
The kit for diagnosing skin wrinkles according to claim 3, wherein the kit is an RT-PCR kit or a DNA chip kit.
A microarray for diagnosing whether a skin type is easy to generate wrinkles, comprising the single nucleotide polymorphism (SNP) marker for diagnosing whether the skin type is easy to generate wrinkles according to claim 1 .
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 주름 생성이 쉬운 피부 타입 여부에 대한 정보의 제공 방법.
(a) amplifying the polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker for diagnosing the degree of skin wrinkles according to claim 1 in DNA obtained from a sample isolated from an individual or hybridizing it with a probe; and
(b) A method of providing information on whether a skin type is prone to wrinkling, comprising the step of identifying the base of the amplified or hybridized polymorphic site of step (a).
The method of claim 6, wherein the sample is hair, urine, blood, various body fluids, isolated tissues, isolated cells, or saliva.
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