KR20220133984A - 표적화된 핵산 캡쳐를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 서열의 증폭 및 분석을 위해 주형의 표적화된 간접적, 상승적 혼성체화 캡쳐를 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 캡쳐된 주형은 주형의 핵산 분자의 메틸화 패턴을 연구하기 위해서 바이설파이트 또는 다른 메틸화 시약으로 추가로 처리될 수 있다.
Description
교차 참조
본 출원은 2020년 1울 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/968,847, 2020년 3월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/987,232, 및 2020년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/988,859의 이익을 주장하며, 이 출원들은 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 다음의 동시 계류 중인 특허 출원에 관한 것이다: 2019년 11월 20일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2019/062508 (본원에 참조로 포함된다).
핵산 표적 캡쳐 방법은 특정 유전자, 엑손, 및 관심있는 다른 게놈 영역을, 예를 들면, 표적화된 시퀀싱을 위해 풍부하게 만들 수 있다. 하지만, 표적 캡쳐-기반 시퀀싱 방법은 번거롭고 긴 프로토콜 및 비용이 많이 드는 공정, 뿐만 아니라 작은 캡쳐 패널 (예를 들면, 500개 미만의 프로브)에 대한 낮은 온-타겟(on-target) 비율을 수반할 수 있다. 더욱이, 현재의 핵산 표적 캡쳐핵산 표적 캡쳐 방법은 낮은 회수율로 인해 저투입량 및 손상된 DNA에 적합하지 않을 수 있다.
바이설파이트 전환은 핵산 분자의 메틸화 패턴을 연구하기 위해 유용한 기술일 수 있다. 하지만, 바이설파이트 전환은, 예를 들어, 절단을 생성하여 핵산을 손상시킬 수 있다. 차세대 시퀀싱 (next-generation sequencing: NGS) DNA 라이브러리가 바이설파이트로 처리되면, 상당한 양의 핵산이 손상되고 후속 증폭 단계에서 회수될 수 없으며, 이로 인해 낮은 회수율을 제공한다. 더욱이, 바이설파이트 전환이 단일 가닥 또는 단편화된 DNA 및 감소된 서열 복잡성을 초래할 수 있기 때문에, 전환된 DNA는 통상적인 어댑터(adaptor)-결찰 기반 라이브러리 구성에 어려운 입력물이 될 수 있다. 전형적으로 작은 초기 투입량을 가진 바이설파이트 처리된 무세포 DNA (cfDNA) 또는 순환 종양 세포 DNA (ctDNA)는 낮은 회수율 (예를 들면, 바이설파이트 처리된 cfDNA에 대해 5% 이하)을 고려해볼 때 더 큰 도전을 제공할 수 있다. 메틸화된 시토신을 전환시키기 위해 메틸화-민감성 효소 처리가 또한 수행될 수 있다. 하지만, 효소-기반 접근법은 긴 다단계 공정 동안 메틸화 상태의 손실을 겪을 수 있으며, 낮은 회수율로 이어진다.
무세포 DNA에서 메틸화 분석은 조기 암 검출에 대해 큰 가능성을 가지고 있다. 초기 단계의 암 환자의 혈장에서, 종양 함유량은 0.1% 미만, 종종 최저 0.01% 또는 그 이하인 것으로 추정되며, 그러므로 고도로 민감성인 검정을 필요로 한다. 현재 2개의 주요 접근법이 암 스크리닝에 사용된다: 전체 게놈 바이설파이트 시퀀싱 (whole genome bisulfite sequencing: WGBS), 축소 대표 바이설파이트 시퀀싱 (reduced representation bisulfite sequencing: RRBS) 또는 친화도-기반 풍부화를 포함한 전반적인 접근법, 및 10,000개 또는 그 이상의 잠재적인 메틸화 마커를 함유하는 큰 표적화된 패널. 표적화된 메틸화 시퀀싱 (Targeted Methylation Sequencing: TMS)은 메틸화 마커의 가장 민감하고 특이적인 분석을 제공한다. 하지만, 통상적인 TMS의 민감성 및 특이성은 표적 풍부화의 낮은 효율 및 낮은 회수에 의해 손상되고, 큰 패널과 관련된 배경 잡음에 의해 추가로 방해된다. 작고 집중적인 암-특이적 메틸화 생체마커 패널을 사용한 심층 분석 방법이 필요하다.
그러므로, 더 효율적이고 사용하기 쉽고 빠르고 유연하고 실용적인 표적 핵산 캡쳐 방법 및 특히 저투입량 샘플, 예컨대 cfDNA에 대해 바이설파이트 처리된 핵산을 분석하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 본원에서 개시된 방법은 매우 낮은 DNA 투입량 샘플에 대한 증폭 전 및 바이설파이트 전환 전 혼성체화-기반 캡쳐에 사용될 수 있다.
다음 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 얻는 단계; 제1 브릿지(bridge) 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩(landing) 서열이 어댑터 앵커(anchor) 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는, 단계; 및 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계. 방법은 어댑터를 샘플 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시켜, 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 어댑터를 샘플 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시키고, 어댑터를 주형 핵산 분자의 3' 단부 또는 5' 단부에 각각 부착시켜, 각각의 단부에 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 어댑터 프라이머를 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 어댑터에 혼성체화하는 단계; 및 어댑터 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 연장 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다.
방법은 제1 브릿지 프로브의 제1 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 브릿지 프로브의 제2 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 제1 브릿지 결합 서열과 제2 브릿지 결합 서열 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 더 포함할 수 있다. 어댑터는 분자 바코드(barcode)를 포함할 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다.
제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다.
주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함할 수 있다. 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함할 수 있다.
다음 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다: 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되어, 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계; 및 제1 표적 특이적 영역의 혼성체화 및 제2 표적 특이적 영역의 혼성체화 이후, 주형 핵산 분자를 메틸화 검정 시약으로 처리하는 단계. 메틸화 검정 시약은 바이설파이드, 또는 메틸화된 시토신을 변형시키는 효소일 수 있다. 방법은 제3 브릿지 프로브의 제3 표적 특이적 영역를 주형 핵산 분자의 제3 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제3 브릿지 프로브의 제3 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제3 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제4 브릿지 프로브의 제4 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제4 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제4 브릿지 프로브의 제4 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제4 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 제1 브릿지 프로브를 혼성체화하고 제2 브릿지 프로브를 혼성체화하기 전에 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 어댑터 프라이머를 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 어댑터에 혼성체화하는 단계; 및 어댑터 프라이머의 3' 단부를 연장하여, 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 연장 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함할 수 있다.
어댑터 프라이머의 혼성체화는 바이설파이트로의 처리 전에 수행될 수 있다. 어댑터 프라이머의 혼성체화는 바이설파이트로의 처리 후에 수행될 수 있다. 어댑터 프라이머는 바이설파이트로의 처리 이후의 어댑터에 기초하여 디자인될 수 있으며, 어댑터에서 비-메틸화된 시토신은 처리 동안에 유라실로 전환된다. 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다. 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다.
방법은 제1 브릿지 프로브의 제1 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 제2 브릿지 프로브의 제2 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 제1 브릿지 결합 서열과 제2 브릿지 결합 서열 사이에 위치한 스페이서를 더 포함할 수 있다. 어댑터는 분자 바코드를 포함할 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함할 수 있다. 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함할 수 있다. 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함할 수 있다. 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함할 수 있다.
다음을 포함하는 키트가 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하도록 구성된 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브; 브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하도록 구성된 브릿지 결합 서열을 포함하는 어댑터 앵커 프로브; 및 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착하도록 구성된 어댑터.
다음을 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부가 어댑터에 부착된 주형 핵산 분자; 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역이 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화된 제1 브릿지 프로브; 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역이 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화된 제2 브릿지 프로브; 및 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열이 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열에 결합되고 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열이 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열에 결합된 어댑터 앵커 프로브.
다음을 포함하는 핵산 복합체가 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부가 어댑터에 부착되고, 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열이 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화되고 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열이 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화되고, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되고 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합된 주형 핵산 분자. 핵산 복합체를 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다.
복수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부하게 하도록 제1 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제1 풍부화된 샘플 및 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 고갈된 핵산을 포함하는 나머지 샘플을 생성하는 단계; 및 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부하게 하도록 나머지 샘플에 대한 제2 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제2 풍부화된 샘플을 생성하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널 및 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널이 상이한 순차적 풍부화 방법이 본원에서 개시된다.
방법은 제1 풍부화된 샘플의 제1 분석 및 제2 풍부화된 샘플의 제2 분석을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제1 분석은 서열 분석일 수 있고, 제2 분석은 메틸화 분석일 수 있다.
어떤 경우에, 제1 분석은 제1 서열 분석이고, 제2 분석은 제2 서열 분석이며, 제1 서열 분석은 제2 서열 분석과는 상이한 시퀀싱 깊이에서 수행된다.
어떤 경우에, 샘플은 cfDNA 샘플이다.
어떤 경우에, 하나 이상의 게놈 영역의 패널의 게놈 영역에 대한 표적 풍부화는 혼성체화에 의한 표적 풍부화를 포함한다.
어떤 경우에, 하나 이상의 게놈 영역의 패널의 게놈 영역에 대한 표적 풍부화: 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는, 단계; 및 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는, 단계.
어떤 경우에, 어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함한다.
청구항 73의 방법으로서, 결합 모이어티를 지지체에 부착시키고 결합 모이어티가 부착된 지지체를 결합되지 않은 핵산으로부터 분리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
어떤 경우에, 게놈 영역의 제2 패널은 프로모터 영역을 포함한다.
어떤 경우에, 게놈 영역의 제1 또는 제2 패널은 인트론 영역을 포함한다.
청구항 66, 75 또는 76의 방법으로서, 게놈 영역의 제1 또는 제2 패널은 엑손 영역을 포함하는, 방법.
어떤 경우에, 방법은 어댑터를 복수의 핵산 분자의 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시켜, 어댑터를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 더 포함한다.
어떤 경우에, 제2 풍부화된 샘플은 처리되고 시퀀싱 반응을 거친 바이설파이트이다.
어떤 경우에, 시퀀싱 반응의 유익한 판독값의 수는 샘플이 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부하게 하기 위한 단일 표적 풍부화를 거치면 그것으로부터 얻어질 수 있는 유익한 판독값의 수의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다.
어떤 경우에, 방법은 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부하게 하도록, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널 및 제2 패널에 상응하는 서열이 고갈된 핵산을 포함하는 제2 나머지 샘플에 대한 제3 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제3 풍부화된 샘플을 생성하는 단계를 더 포함하며, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널, 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널, 및 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널은 상이하다.
어떤 경우에, 방법은 제3 브릿지 프로브의 제3 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제3 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하며, 제3 브릿지 프로브의 제3 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제3 브릿지 결합 서열에 결합된다.
어떤 경우에, 방법은 제4 브릿지 프로브의 제4 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제4 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하며, 제4 브릿지 프로브의 제4 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제4 브릿지 결합 서열에 결합된다.
참조에 의한 포함
이 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 개개의 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에서 제시된다. 본 발명의 원칙이 활용되는 예시의 구체예를 제시하는 다음 상세한 설명, 및 다음과 같은 첨부된 도면을 참조하면 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해가 얻어질 것이다.
도 1은 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐의 한 구체예를 예시한다. 이 구체예에서, 간접적인 혼성체화 전에 주형 핵산 분자의 라이브러리가 구성된다.
도 2A-2B는 메틸화 시퀀싱을 위한 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐의 한 구체예를 예시한다. 도 2A는 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐를 나타내고 도 2B는 캡쳐된 주형화된 핵산 분자의 이후의 바이설파이트 전환을 나타낸다.
도 3은 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐 및 표적화된 메틸화 시퀀싱 (SICON-TMS)에 대한 작업 흐름을 나타낸다.
도 4는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 나타낸다.
도 5A-5D는 상이한 혼성체화 시스템의 개략도를 나타낸다. 도 5A는 비-상승적인 직접적 혼성체화를 예시한다. 도 5B는 상승적인 직접적 혼성체화를 예시한다. 도 5C는 상승적인 간접적 혼성체화를 예시한다. 도 5D는 비-상승적인 간접적 혼성체화를 예시한다.
도 6A-6B는 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열 사이에 스페이서가 있거나 없는 어댑터 앵커 프로브를 사용하는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 예시한다. 도 6A는 스페이서를 포함하는 어댑터 앵커 프로브로의 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 나타낸다. 도 6B는 스페이서가 없는 어댑터 앵커 프로브로의 상승적인 간접적 혼성체화를 나타낸다.
도 7은 상승적인 간접적 캡쳐 방법을 사용하는 15-표적 패널의 시퀀싱 범위를 나타낸다.
도 8A-8B는 2개의 상이한 혼성체화 방법을 사용하는 76개의 인간 유전자 표적 (인간 ID)의 패널의 시퀀싱 범위를 나타낸다. 도 8A는 상승적인 간접적 혼성체화에 의한 증폭 전 캡쳐에 의한 범위를 나타낸다. 도 8B는 직접적 혼성체화에 의한 증폭 후 캡쳐에 의한 범위를 나타낸다.
도 9는 비-암성 개체로부터 추출된 cfDNA의 상승적인 간접적 캡쳐 이후 표적화된 메틸화 시퀀싱 검정의 결과를 나타낸다.
도 10은 스파이크-인(spike-in) 메틸화된 DNA의 예상된 양과 측정된 값 사이의 선형 관계를 나타내는 표적화된 메틸화 시퀀싱 검정의 결과를 예시한다.
도 11A 및 11B는 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA 각각에서 DMR1의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA 각각에서 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 13A 및 13B는 건강한 개체의 혈장 cfDNA 및 결장암 환자의 혈장 cfDNA 각각에서 DMR1 및 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 14는 샘플로부터의 순차적 표적 풍부화에 대한 개략도를 예시한다.
도 15는 실시예 11의 CRC cfDNA 샘플에서 확인된 돌연변이를 예시한다.
도 16은 독립형 및 이중 분석 TMS로부터의 메틸화 점수를 예시한다.
도 17은 독립형 및 이중 분석 TMS로부터의 유익한 분자 수를 예시한다.
도 18은 개인 맞춤형 패널 분석에서 변이체 대립유전자 검출의 민감성을 예시한다.
도 19는 Point-n-SeqTM 기술의 시행을 예시한다.
도 1은 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐의 한 구체예를 예시한다. 이 구체예에서, 간접적인 혼성체화 전에 주형 핵산 분자의 라이브러리가 구성된다.
도 2A-2B는 메틸화 시퀀싱을 위한 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐의 한 구체예를 예시한다. 도 2A는 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐를 나타내고 도 2B는 캡쳐된 주형화된 핵산 분자의 이후의 바이설파이트 전환을 나타낸다.
도 3은 주형 핵산 분자의 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐 및 표적화된 메틸화 시퀀싱 (SICON-TMS)에 대한 작업 흐름을 나타낸다.
도 4는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 나타낸다.
도 5A-5D는 상이한 혼성체화 시스템의 개략도를 나타낸다. 도 5A는 비-상승적인 직접적 혼성체화를 예시한다. 도 5B는 상승적인 직접적 혼성체화를 예시한다. 도 5C는 상승적인 간접적 혼성체화를 예시한다. 도 5D는 비-상승적인 간접적 혼성체화를 예시한다.
도 6A-6B는 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열 사이에 스페이서가 있거나 없는 어댑터 앵커 프로브를 사용하는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 예시한다. 도 6A는 스페이서를 포함하는 어댑터 앵커 프로브로의 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 나타낸다. 도 6B는 스페이서가 없는 어댑터 앵커 프로브로의 상승적인 간접적 혼성체화를 나타낸다.
도 7은 상승적인 간접적 캡쳐 방법을 사용하는 15-표적 패널의 시퀀싱 범위를 나타낸다.
도 8A-8B는 2개의 상이한 혼성체화 방법을 사용하는 76개의 인간 유전자 표적 (인간 ID)의 패널의 시퀀싱 범위를 나타낸다. 도 8A는 상승적인 간접적 혼성체화에 의한 증폭 전 캡쳐에 의한 범위를 나타낸다. 도 8B는 직접적 혼성체화에 의한 증폭 후 캡쳐에 의한 범위를 나타낸다.
도 9는 비-암성 개체로부터 추출된 cfDNA의 상승적인 간접적 캡쳐 이후 표적화된 메틸화 시퀀싱 검정의 결과를 나타낸다.
도 10은 스파이크-인(spike-in) 메틸화된 DNA의 예상된 양과 측정된 값 사이의 선형 관계를 나타내는 표적화된 메틸화 시퀀싱 검정의 결과를 예시한다.
도 11A 및 11B는 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA 각각에서 DMR1의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA 각각에서 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 13A 및 13B는 건강한 개체의 혈장 cfDNA 및 결장암 환자의 혈장 cfDNA 각각에서 DMR1 및 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다.
도 14는 샘플로부터의 순차적 표적 풍부화에 대한 개략도를 예시한다.
도 15는 실시예 11의 CRC cfDNA 샘플에서 확인된 돌연변이를 예시한다.
도 16은 독립형 및 이중 분석 TMS로부터의 메틸화 점수를 예시한다.
도 17은 독립형 및 이중 분석 TMS로부터의 유익한 분자 수를 예시한다.
도 18은 개인 맞춤형 패널 분석에서 변이체 대립유전자 검출의 민감성을 예시한다.
도 19는 Point-n-SeqTM 기술의 시행을 예시한다.
메틸화 및 돌연변이 분석을 사용하는 CfDNA 기반 액체 생검이 암 조기 검출 및 관리에 사용될 수 있다. 제한된 양의 핵산 샘플로부터의 조합된 분석을 위한 시스템 및 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 제한된 DNA 샘플로부터의 조합된 표적화된 메틸화 시퀀싱 (TMS) 및 돌연변이 분석을 위한 시스템 및 방법이 본원에서 제공된다. 이들 시스템 및 방법은 양이 적을 수 있는 cfDNA 샘플에 특히 유용할 수 있다.
암 게놈에서의 광범위하지만 조직-특이적인 메틸화 변화는 초기 또는 재발 암 환자의 혈장에서 순환 종양 (ctDNA)의 민감성 검출에 사용될 수 있다. 하지만, 메틸화 분석의 민감성은 공정에서 메틸화 마커를 회수하는데 있어서의 낮은 효율에 의해 손상될 수 있고, 낮은 검출 민감성을 보충하기 위해 노이즈가 많은(noisy) 비-특이적 마커를 포함하는 접근법에 의해 특이성이 때때로 더 저해된다. 더욱이, 메틸화 분석이 조기 암 검출에 대한 이점을 가질 수 있지만, 작동 가능한 돌연변이는 치료 선택을 안내하고 검정 특이성을 더 증가시키기 위한 정보를 직접적으로 제공할 수 있다. 제한된 임상 혈액 샘플로부터의 cfDNA의 수율은 적은 양일 수 있으며, 이것은 하나의 샘플로부터 다수의 분석을 수행하기 위한 주요 과제가 될 수 있고, 따라서 메틸화 및 돌연변이 둘 다를 검출할 수 있는 검정은 임상 연구 및 진단 검정에 개선을 제공할 수 있다.
본 개시물은 cfDNA에서 표적화된 메틸화 및 돌연변이 조합 분석을 위해 디자인된 개선된 기술을 제공한다: 시토신 전환 및 증폭 전에 cfDNA로부터 직접적으로 표적 분자의 풍부화를 특징으로 하는 Point-n-Seq. 이 기술은 적어도 10, 100, 1000개 또는 1000개 초과의 마커의 메틸화 또는 돌연변이 상태를 조사하는 작은 집중 패널을 활성화할 수 있다. 22개의 유전자로부터 100개의 메틸화 마커 및 350개 초과의 핫스팟(핫스팟) 돌연변이를 커버하도록 디자인된 결장직장암 (CRC) 패널이 본원에서 제공된다. Point-n-Seq TMS는 cfDNA를 사용하는 작은 집중 메틸화 및 돌연변이 조합 패널 시퀀싱에 사용될 수 있다. Point-n-Seq TMS는 연구 및 임상적 사용을 위해 실용적이고 비용 효과적인 메틸화 검정을 개발하는데 사용될 수 있다.
극도로 효율적인 전환 전/증폭 전 캡쳐 Point-n-Seq를 활용하는 것이 질환 집중 메틸화 및 돌연변이 패널 풍부화에 사용될 수 있다. Point-n-Seq TMS는 cfDNA를 사용하여 작은 집중 메틸화 및 돌연변이 패널을 분석하는 것을 가능하게 한다. Point-n-Seq TMS는 연구 및 임상적 사용을 위한 실용적이고 비용 효과적인 메틸화 검정에서 사용될 수 있다.
시퀀싱을 위한 핵산의 상승적인 간접적 캡쳐 (SICON-SEQ, Point-n-SEQ로도 불림)를 위한 시스템 및 방법이 또한 본원에서 제공된다. 본원에서 기재된 시스템 및 방법은 핵산 물질의 효율적인 캡쳐 및 풍부화를 허용한다. SICON-SEQ/Point-n-SEQ는 주형 핵산 물질로의 어댑터의 부착에 의해 라이브러리 구성 후 캡쳐 풍부화를 위해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, SICON-SEQ는 라이브러리 구성 전에 수행될 수 있다. SICON-SEQ는 어댑터 부착에 의해 라이브러리 구성 없이 수행될 수 있다. 본원에서 개시된 SICON-SEQ 방법은 짧은 처리 시간 및 단순한 작업 흐름을 허용할 수 있다. SICON-SEQ는 저투입량 샘플, 예컨대 무세포 DNA (cfDNA)를 처리하는데 사용될 수 있으며, 그러므로 메틸화 시퀀싱 분석에 적합할 수 있다.
주형 핵산으로의 하나 이상의 브릿지 프로브의 혼성체화를 통한 주형 핵산 분자와 어댑터 앵커 프로브의 간접적 혼성체화를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다. 하나 이상의 브릿지 프로브는 주형 핵산 분자의 특정 표적 서열에 혼성체화하도록 디자인될 수 있으며, 이로써 표적 주형에 혼성체화될 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 차례로 하나 이상의 브릿지 프로브에 혼성체화하도록 디자인될 수 있으며, 이로써 3개 이상의 혼성체화된 핵산 분자의 조립체를 생성할 수 있다. 다중 구조 혼성체화 조립체는 상승 작용하여 조립체에 더 많은 안정성을 제공할 수 있다. 혼성체화된 주형 핵산 분자는 메틸화 시퀀싱을 위해 순차적으로 바이설파이트로 처리될 수 있다.
다음을 포함하는 키트가 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브; 브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하는 브릿지 결합 서열을 포함하는 어댑터 앵커 프로브; 및 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착되도록 구성된 어댑터.
I. 혼성체화에 의한 간접적 캡쳐
표적 프로브 혼성체화는 주형 핵산과 혼성체화 조립체를 형성하는 2개 이상의 프로브의 상승적 상호작용에 의해 촉진될 수 있다. 다중 복합 조립체는 주형과 표적 프로브, 예컨대 브릿지 프로브의 혼성체화 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 브릿지 프로브는 주형의 표적 영역에 혼성체화하는 표적 특이적 영역 및 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열 (BBS)에 혼성체화하는 어댑터 랜딩 서열 (ALS)을 포함할 수 있다. 주형과 브릿지 프로브 사이 및 브릿지 프로브와 어댑터 앵커 프로브 사이의 혼성체화는 다중 복합 조립체를 형성할 수 있다.
2개 초과의 브릿지 프로브 사전 표적 영역이 본원에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 75, 10 0개 이상의 브릿지 프로브가 주형과 어댑터 앵커 프로브를 연결하는데 사용될 수 있다. 시퀀싱 (SICON-SEQ) 방법을 위한 핵산의 상승적인 간접적 캡쳐는 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 것을 더 포함할 수 있으며, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합될 수 있다 (도 1). 어떤 경우에, SICON-SEQ는 라이브러리를 생성하기 위해 주형 핵산 분자로의 어댑터의 부착 후 실행될 수 있다 (도 1). 라이브러리는 차세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리일 수 있다.
브릿지 프로브는 표적 특이적 영역과 어댑터 랜딩 서열을 연결하는 링커를 더 포함할 수 있다. 어댑터 앵커는 브릿지 결합 서열 사이에 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서의 존재는 혼성체화 캡쳐의 효율을 개선하고 캡쳐의 특이성을 증가시킬 수 있다.
주형 핵산은 무세포 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA (ctDNA)와 같은 저투입량 샘플로부터 캡쳐되고 풍부화될 수 있다. 캡쳐 및 풍부화는 브릿지 프로브와의 혼성체화를 통한 어댑터 앵커 프로브와의 간접적인 회합에 의해 실행될 수 있다. 브릿지 프로브 및/또는 어댑터 앵커 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
다음을 포함하는 키트가 본원에서 개시된다: 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브; 브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하는 브릿지 결합 서열을 포함하는 어댑터 앵커 프로브; 및 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착되도록 구성된 어댑터.
II. 메틸화 분석을 위한 작업 흐름
핵산의 메틸화 분석을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 메틸화 분석은 바이설파이트 처리에 의해 실행될 수 있다. 바이설파이트 처리된 핵산은 핵산의 메틸화를 연구하는데 사용될 수 있다. 바이설파이트 처리는 비메틸화된 시토신을 유라실로 전환시킬 수 있다. 시토신의 메틸화 (예를 들면, 5'-메틸시토신)은 바이설파이트가 메틸화된 시토신을 유라실로 전환시키는 것을 방지할 수 있다.
주형 핵산 분자는 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브/어댑터 앵커 프로브를 사용하는 혼성체화 캡쳐 전에 또는 후에 바이설파이트로 처리될 수 있다. 어떤 경우에, 혼성체화된 주형 핵산 분자는 바이설파이트로 처리될 수 있다. 이중 가닥 서열의 형성 (예를 들면, 주형의 TS와 캡쳐 프로브의 TSR 사이에서) 바이설파이트 처리 동안에 유라실로의 혼성체화된 영역 내의 시토신의 전환으로부터 보호할 수 있다. 주형으로의 캡쳐 프로브의 혼성체화 또는 주형 및 어댑터 앵커 프로브로의 브릿지 프로브의 혼성체화에 의해 형성된 이중 가닥 서열은 유라실로의 혼성체화된 영역 내의 시토신의 바이설파이트 전환으로부터의 보호를 제공할 수 있다. 게다가, 바이설파이트 처리가 비-메틸화된 시토신을 유라실로 전환시킬 수 있기 때문에, TS 영역에서 유라실로의 시토신의 전환으로부터의 보호는 비-바이설파이트 전환된 DNA에 어닐링 (anneal)되도록 디자인된 증폭 프라이머의 사용을 허용할 수 있다. 사전 바이설파이트 전환 캡쳐를 위해, 프로브는 또한 비전환된 서열에 대해 디자인될 수 있다. 비전환된 시토신으로 어닐링되는 프로브 및 프라이머가 디자인하고 더 나은 혼성체화를 제공하기 더 쉬울 수 있다.
어떤 경우에, 효소 처리가 메틸화 분석을 위해 수행될 수 있다. 효소는 메틸화-민감성 또는 메틸화 의존성 효소일 수 있다. 효소는 제한 효소일 수 있다. 효소는 메틸화-민감성 제한 엔도뉴클레아제일 수 있다. 다른 경우에, 메틸화 분석은 메틸화된 핵산을 풍부하게 하기 위해 메틸화 부위에 특이적으로 결합하는 특이적 항체 또는 단백질을 사용하여 실행될 수 있다.
a. 주형 핵산의 혼성체화 캡쳐 이후 메틸화 처리 또는 풍부화
주형 핵산 (예를 들면, DNA)는 본원에서 기재된 바와 같이 상승적인 간접적 혼성체화 및 후속적인 시퀀싱 (SICON-SEQ)에 사용될 수 있다 (예를 들면, 도 3 참조). 주형 핵산 (예를 들면, DNA)는, 예를 들면, 게놈 DNA, 또는 cfDNA일 수 있다. 주형 핵산 (예를 들면, DNA)는 캡쳐 프로브에 직접적으로 혼성체화되거나 또는 본원에서 기재된 바와 같이, 예를 들면, 도 1 및 2A에서 예시된 바와 같이, 브릿지 프로브 혼성체화에 의해 어댑터 앵커 프로브 (또는 보편적 앵커 프로브)에 간접적으로 결합될 수 있다. 혼성체화 캡쳐된 주형 핵산 (예를 들면, DNA)는, 예를 들면, 표적화된 메틸화 시퀀싱 (SICON-TMS)을 위해 바이설파이트로 처리되고, 연장되고, 이후에 증폭될 수 있다 (도 2B). 어떤 경우에, 캡쳐된 주형 핵산은 메틸화-민감성 효소로 처리될 수 있다. 또 다른 경우에, 캡쳐된 주형 핵산 분자의 메틸화된 핵산은 주형 핵산 분자에서 메틸화된 CpG 부위를 표적화하는 항체 또는 단백질에 특이적으로 결합함으로써 풍부화될 수 있다. SICON-TMS는 큰 범위의 핵산 물질의 양과 호환 가능한 임상 샘플일 수 있다. 어떤 경우에, SICON-TMS는 5 ng 미만, 4 ng 미만, 3 ng 미만, 2 ng 미만, 또는 1 ng 미만의 핵산 분자를 가진 서열 샘플을 사용할 수 있다.
캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 표적 특이적 서열 또는 표적 특이적 영역 (TSR)은 주형 핵산 분자의 표적 서열에 기초하여 디자인될 수 있고, 주형 핵산 분자의 표적 서열은 바이설파이트 처리 후 비-메틸화된 시토신을 유지할 수 있다.
어떤 경우에, 바이설파이트 처리는 브릿지 프로브의 표적 특이적 서열의 분리 전에 일어날 수 있다. TS 및 TSR 부위에서 비메틸화된 시토신은 주형으로의 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 TS 및 TSR의 혼성체화 이후에 일어나는 바이설파이트 처리 동안에 유라실로의 전환으로부터 보호될 수 있다. 후속적으로, 혼성체화된 주형은 바이설파이트로 처리될 수 있으며 그 동안 혼성체화된 TSR-TS 영역 내의 비-메틸화된 시토신은 유라실로 전환되지 않는 반면에, 단일 가닥 영역 내의 비-메틸화된 시토신은 유라실로 전환된다. TS 영역에서 유라실로의 시토신의 전환에 대한 보호는 비-바이설파이트 전환된 DNA에 어닐링되도록 디자인된 프로브의 사용을 허용할 수 있다.
어떤 경우에, 바이설파이트 처리는 주형 핵산 서열로부터 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브의 분리 후 수행될 수 있다. 프라이머 결합 부위 (예를 들면, 어댑터 및/또는 주형) 내의 하나 이상의 시토신 잔기는 바이설파이트 전환으로부터 보호될 수 있다. 바이설파이트 전환 후, 어댑터 내의 프라이머 결합 부위는 하나 이상의 유라실을 포함할 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 유라실을 포함하는 어댑터 서열에 상보적이도록 디자인될 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 유라실을 포함하는 어댑터 서열에 100% 상보적이거나, 또는 하나 이상의 유라실을 포함하는 어댑터 서열에 100% 미만으로 상보적일 수 있다.
주형은 바이설파이트 처리 후 하나 이상의 유라실을 포함할 수 있다. 어댑터에 어닐링되는 프라이머는 가닥 연장을 위해 하나 이상의 유라실을 포함하는 주형을 사용할 수 있다. 연장된 가닥은 하나 이상의 유라실과 염기쌍을 형성하는 하나 이상의 아데닌을 포함할 수 있다. 연장 생성물은 주형으로부터 변성될 수 있다. 프라이머는 하나 이상의 아데닌을 포함하는 영역 내의 연장 생성물에 어닐링되고 연장될 수 있다. 프라이머는, 예를 들면, 어댑터 프라이머와 함께 주형의 증폭에 사용될 수 있다.
메틸화 처리 또는 풍부화는 어댑터의 부착 전에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 주형으로의 제1 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 주형으로의 제2 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다.
b. 주형 핵산의 혼성체화 캡쳐 전 메틸화 처리 또는 풍부화
주형 핵산 분자는 캡쳐 프로브 또는 브릿지 프로브로의 혼성체화 전에 바이설파이트 처리될 수 있다. DNA는 비메틸화된 시토신을 유라실로 전환시키기 위해 바이설파이트로 처리될 수 있다. 바이설파이트 처리된 DNA는 상승적인 간접적 혼성체화 및 후속적 시퀀싱 (SICON-SEQ)에 대한 입력물로서 사용될 수 있다. 프로브의 TSR은 기존의 비-메틸화된 시토신이 유라실로 전환된 주형에 어닐링하도록 디자인될 수 있다. 혼성체화 캡쳐 후, 연장이 수행될 수 있으며 표적 증폭이 뒤따른다. 어떤 경우에, 캡쳐된 주형 핵산은 메틸화-민감성 효소로 처리될 수 있다. 또 다른 경우에, 캡쳐된 주형 핵산 분자의 메틸화된 핵산은 주형 핵산 분자 내의 메틸화된 CpG 부위를 표적화하는 항체 또는 단백질에 특이적으로 결합함으로써 풍부화될 수 있다.
메틸화 처리 또는 풍부화는 어댑터의 부착 전에 주형 핵산 분자에 대해 수행될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 주형으로의 제1 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다. 메틸화 처리 또는 풍부화는 주형으로의 제2 어댑터의 부착 후에 주형 핵산 분자에 적용될 수 있다.
III. 고체상 추출
예를 들면, 어댑터 앵커 프로브가 주형에 결찰되기 전에 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 (또는 브릿지 프로브를 통해 어댑터 앵커 프로브와 회합된 주형)을 선택하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 고체상 추출을 이용할 수 있다. 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브를 고체 지지체에 결합시키기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 어댑터 앵커 프로브가 브릿지 프로브와 독립적으로 주형에 부착 (예를 들면, 결찰)될 가능성에 의해 부최적의 특이성이 도입될 수 있다. 이러한 비-특이적 결찰 생성물, 뿐만 아니라 미결합 프로브를 감소시키기 위해, 라벨 (예를 들면, 비오틴) 및 캡쳐 모이어티 (예를 들면, 스트렙타비딘 비드)가 활용될 수 있다.
브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브는 라벨을 포함할 수 있다. 개시된 방법은 라벨에 의해 브릿지 프로브, 어댑터 앵커 프로브, 또는 주형 핵산 분자, 브릿지 프로브, 및 어댑터 앵커 프로브를 포함하는 혼성체화 복합체로 캡쳐하는 단계를 더 포함할 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 라벨은 핵산 서열, 예컨대 폴리 A 또는 폴리 T, 또는 특이적 서열일 수 있다. 핵산 서열은 길이가 약 5 내지 30개의 염기일 수 있다. 핵산 서열은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 라벨은 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브의 3' 단부에 있을 수 있다. 라벨은 항체, 예컨대 5-브로모유리딘, 및 비오틴에 의해 인식될 수 있는 펩타이드, 또는 변형된 핵산일 수 있다. 라벨은 "클릭(click)" 화학과 같은 반응에 의해 브릿지 프로브, 또는 어댑터 앵커 프로브에 컨쥬게이션될 수 있다. "클릭" 화학은 DNA와 유사한 생체분자로의 형광 염료와 유사한 리포터 분자의 컨쥬게이션(conjugation)을 허용할 수 있다. 클릭 화학은 공유 결합 생성물 (예를 들면, 1,5-이치환된 1,2,3-트리아졸)을 수득할 수 있는 아지드와 알킨 사이의 반응일 수 있다. 구리가 촉매의 역할을 할 수 있다.
라벨은 고체 지지체 상에 캡쳐될 수 있다. 고체 지지체는 자성일 수 있다. 고체 지지체는 비드, 유동 셀(cell), 유리, 플레이트, 하나 이상의 미세유체 채널을 포함하는 디바이스(device), 또는 컬럼을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 자성 비드일 수 있다.
고체 지지체 (예를 들면, 비드)는 라벨에 결합할 수 있는 하나 이상의 캡쳐 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들면, 그것으로 코팅될 수 있다). 캡쳐 모이어티는 스트렙타비딘일 수 있고, 스트렙타비딘은 비오틴에 결합할 수 있다. 캡쳐 모이어티는 항체일 수 있다. 항체는 라벨에 결합할 수 있다. 캡쳐 모이어티는 핵산, 예를 들면, DNA 및/또는 RNA를 포함하는 핵산일 수 있다. 핵산 캡쳐 모이어티는, 예를 들면, 어댑터 앵커 프로브 또는 브릿지 프로브 상의 서열에 결합할 수 있다. 어떤 경우에, 고체 표면에 결합된 항-RNA/DNA 하이브리드(hybrid) 항체가 캡쳐 모이어티로 사용될 수 있다.
라벨 및 캡쳐 모이어티는 하나 이상의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 통해 결합할 수 있다. 고체 지지체 상의 브릿지 프로브, 어댑터 앵커 프로브, 또는 혼성체화 복합체의 캡쳐 이후, 고체 지지체는 샘플로부터, 예를 들면, 미결합된 주형을 제거하기 위해 세척될 수 있다. 어떤 경우에, 세척 단계가 수행되지 않는다. 세척은 엄중하거나 부드러울 수 있다. 주형 핵산 분자에 혼성체화되는 캡쳐된 브릿지 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브는, 예를 들면, 라벨이 비오틴이고 캡쳐 모이어티가 스트렙타비딘일 때 유리 비오틴을 샘플에 추가함으로써 용출될 수 있다.
연장 단계 (예를 들면, 어댑터에 어닐링되는 어댑터 프라이머의 연장)는 브릿지 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브가 고체 지지체 상에 캡쳐된 동안 또는 브릿지 프로브 (및 혼성체화된 주형) 또는 어댑터 앵커 프로브 (및 간접적으로 혼성체화된 주형)의 용출이 고체 지지체로부터 용출될 때 수행될 수 있다.
주형, 브릿지 프로브, 및 어댑터 앵커 프로브 혼성체화 이후 스트렙타비딘 비드를 사용하여 클린업(Cleanup)이 수행될 수 있으며, 어댑터 앵커 프로브의 3' 단부가 비오티닐화된다. 혼성체화 복합체 및 유리 어댑터 앵커 어댑터는 둘 다 비드에 결합할 수 있다. 미결합된 주형 및 브릿지 프로브는 세척될 수 있다. 제1 및 또는 제2 브릿지 프로브의 5' 단부 또는 3' 단부가 비오티닐화될 수 있다. 스트렙타비딘 비드는 어댑터 앵커 프로브 및 주형의 무작위 결찰을 방지할 수 있는 혼성체화되지 않은 어댑터 앵커 어댑터 및 주형을 제거하는데 사용될 수 있다.
IV. 주형 핵산 분자
주형 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA는 게놈 DNA (gDNA), 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, cDNA, cfDNA, 또는 합성 DNA일 수 있다. DNA는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 단편화된 DNA, 또는 손상된 DNA일 수 있다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, microRNA, snRNA, piRNA, 작은 비암호화 RNA, 폴리솜 RNA, 인트론 RNA, pre-mRNA, 바이러스 RNA, 또는 무세포 RNA일 수 있다.
주형 핵산은 자연 발생하거나 합성될 수 있다. 주형 핵산은 변형된 헤테로환식 염기를 가질 수 있다. 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스, 또는 다른 헤테로환일 수 있다. 주형 핵산은 변형된 당 모이어티를 가질 수 있다. 변형된 당 모이어티는 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 펩타이드 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 트레오스 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 잠금(locked) 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 헥시톨 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 유연한 핵산을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 글리세롤 핵산을 포함할 수 있다.
주형 핵산 분자는 저투입량 (예를 들면, 1 ng의 핵산 물질) 샘플, 예컨대 무세포 DNA (cfDNA) 및 순환 종양 DNA (ctDNA)로부터 캡쳐되고 풍부화될 수 있다. 저투입량 샘플은 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 6 ng, 7 ng, 8 ng, 9 ng, 10 ng, 또는 그 이상의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 10 ng, 9 ng, 8 ng, 7 ng, 6 ng, 5 ng, 4 ng, 3 ng, 2 ng, 1 ng, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 200 pg 내지 10 ng의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 10 ng 미만의 핵산 물질을 가질 수 있다. 저투입량 샘플은 10 ng, 5 ng, 1 ng, 100 pg, 50 pg, 25 pg, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 어떤 경우에, 투입 샘플은 1 ng, 10 ng, 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 또는 그 이상의 핵산 분자를 가질 수 있다. 투입 샘플은 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 또는 그 이하의 핵산 물질을 가질 수 있다. 캡쳐 및 풍부화는 표적 프로브 혼성체화에 의해 실행될 수 있다. 표적 프로브는 캡쳐 프로브, 브릿지 프로브, 및/또는 어댑터 앵커 프로브일 수 있다. 표적 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
주형 핵산은 손상될 수 있다. 손상된 핵산은 변화된 또는 누락된(missing) 염기, 및/또는 변형된 백본을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 산화, 방사선, 또는 무작위 돌연변이에 의해 손상될 수 있다. 주형 핵산은 바이설파이트 처리에 의해 손상될 수 있다.
손상된 DNA에 대해, 본 발명은 이중 가닥 DNA 복구 단계를 제거할 수 있으며, 공정에서 더 적은 단계로부터의 더 적은 DNA 손실로 인한 더 높은 전환율 및 개선된 민감성을 제공한다.
손상된 (닉(nick)을 가진) dsDNA 또는 ssDNA가 라이브러리 구성을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 손상된 dsDNA에 대해, dsDNA는 변성될 수 있으며 그래서 적어도 하나의 손상되지 않은 가닥이 주형으로 사용될 수 있다. 주형은 캡쳐 프로브에 혼성체화되고 부착될 수 있으며 다양한 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
주형은 무세포 DNA (cfDNA) 또는 순환 종양 DNA (ctDNA)으로부터 유래될 수 있다. cfDNA는 공급원이 태아 또는 종양일 수 있다. 주형은 대상체의 액체 생검, 고체 생검, 또는 고정된 조직으로부터 유래될 수 있다. 주형은 cDNA일 수 있고 역전사에 의해 생성될 수 있다. 주형 핵산은, 제한되는 것은 아니지만, 혈장, 혈청, 가래, 타액, 소변, 또는 땀을 포함하는 유체 샘플로부터 유래될 수 있다. 유체 샘플은 주형 핵산의 메틸화 패턴을 연구하고 및/또는 주형 핵산의 조직 기원을 결정하기 위해 바이설파이트 처리될 수 있다. 주형 핵산은 간, 식도, 신장, 심장, 폐, 비장, 방광, 결장, 또는 뇌로부터 유래될 수 있다. 주형 핵산은 주형 핵산이 유래된 장기의 메틸화 패턴을 분석하기 위해 바이설파이트로 처리될 수 있다. 대상체는 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 아테롬성 동맥 경화증, 신경 장애, 및 암과 같은 메틸화 관련 질환으로 고통받을 수 있다.
주형 핵산은 남성 또는 여성 대상체로부터 유래될 수 있다. 대상체는 유아일 수 있다. 대상체는 청소년일 수 있다. 대상체는 청년일 수 있다. 대상체는 노인일 수 있다.
주형 핵산은 인간, 래트, 마우스, 다른 동물, 또는 특정 식물, 박테리아, 조류, 바이러스, 등으로부터 유래될 수 있다. 주형 핵산은 영장류로부터 유래될 수 있다. 영장류는 침팬지 또는 고릴라일 수 있다. 다른 동물은 히말라야 원숭이(rhesus macaque)일 수 있다. 주형은 또한 숙주-병원체, 박테리아 집단, 등을 포함하는 상이한 종의 게놈의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 주형은 둘 이상의 종의 게놈으로부터 발현되는 RNA로부터 만들어진 cDNA일 수 있다.
주형 핵산은 표적 서열을 포함할 수 있다. 표적 서열은 엑손이다. 표적 서열은 인트론일 수 있다. 표적 서열은 프로모터를 포함할 수 있다. 표적 서열은 이전에 공지될 수 있다. 표적 서열은 이전에 부분적으로 공지될 수 있다. 표적 서열은 이전에 공지되지 않을 수 있다. 표적 서열은 염색체, 염색체 아암(arm), 또는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자는 병태, 예를 들면, 암과 관련된 유전자일 수 있다. 주형 핵산 분자는, 예를 들면, 자가 결찰 비율을 감소시키기 위해 혼성체화 전에 탈인산화될 수 있다.
V. 브릿지 프로브
브릿지 프로브는 주형 핵산 분자를 표적 서열 및 어댑터 앵커 프로브와 혼성체화하는데 사용될 수 있다. 브릿지 프로브는 어댑터 앵커 프로브와 주형의 간접적인 회합을 추가로 허용하여 그것들의 부착을 촉진할 수 있다. 유리 어댑터 앵커 프로브와 주형의 결찰 비율은 상호작용의 무작위성으로 인해 매우 낮을 수 있다. 하지만, 혼성체화된 브릿지 프로브는 유리 어댑터 앵커 프로브와의 결찰 확률과 비교하여 어댑터 앵커 프로브와 주형 사이에서의 결찰 확률을 증가시킬 수 있다. 브릿지 프로브는 DNA를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 RNA를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 유라실 및 메틸화된 시토신을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 유라실을 포함하지 않을 수 있다.
브릿지 프로브는 표적 서열에 혼성체화하는 표적 특이적 영역 (TSR)을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 어댑터 앵커 프로브의 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 어댑터 랜딩 서열 (ALS)을 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 TSR과 ALS를 연결하는 링커를 포함할 수 있다. TSR은 브릿지 프로브의 3' 부분에 위치할 수 있다. TSR은 브릿지 프로브의 5' 부분에 위치할 수 있다.
브릿지 프로브는 하나 이상의 분자 바코드를 포함할 수 있다. 브릿지 프로브는 하나 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 비오틴일 수 있다. 결합 모이어티는 지지체에 부착될 수 있다. 지지체는 지지체는 비드일 수 있다. 비드는 스트렙타비딘 비드일 수 있다.
브릿지 프로브는 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 300개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 90개의 뉴클레오타이드, 약 80개, 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
다수의 브릿지 프로브는 샘플에서 다수의 표적 서열에 어닐링하는데 사용될 수 있다. 브릿지 프로브는 유사한 용융 온도를 갖도록 디자인될 수 있다. 일련의 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 15℃ 이내, 약 10℃ 이내, 약 5℃ 이내, 또는 약 2℃ 이내일 수 있다. 하나 이상의 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 75℃, 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃, 또는 약 40℃일 수 있다. 브릿지 프로브에 대한 용융 온도는 약 40℃ 내지 약 75℃, 약 45℃ 내지 약 70℃, 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 52℃ 내지 약 58℃일 수 있다.
특정 브릿지 프로브 주위에서 하나 이상의 브릿지 프로브와 함께 어댑터 앵커 프로브를 사용하는 것은 상승 효과를 통해 표적 서열로의 특정 브릿지 프로브의 혼성체화를 안정화시키는 것을 도울 수 있다. 다수의 브릿지 프로브 조립체를 형성하기 위한 혼성체화 온도는 단일 브릿지 프로브의 용융 온도보다 더 높을 수 있다. 더 높은 온도는 낮은 온도에서 일어날 수 있는 비특이적 혼성체화를 감소시킴으로써 더 양호한 캡쳐 특이성을 초래할 수 있다. 혼성체화 온도는 개개의 브릿지 프로브의 용융 온도보다 약 5℃, 약 10℃, 약 15℃, 또는 약 20℃ 더 높을 수 있다. 혼성체화 온도는 브릿지 프로브의 용융 온도보다 약 5℃ 내지 약 20℃ 더 높을 수 있거나, 또는 복수의 브릿지 프로브의 평균 용융 온도보다 약 5℃ 내지 약 20℃ 더 높을 수 있다.
다수의 브릿지 프로브에 대한 혼성체화 온도는 약 75℃, 약 70℃, 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 또는 약 50℃일 수 있다. 다수의 브릿지 프로브에 대한 혼성체화 온도는 약 50℃ 내지 약 75℃, 55℃ 내지 약 75℃, 60℃ 내지 약 75℃, 또는 65℃ 내지 약 75℃일 수 있다.
브릿지 프로브는 라벨을 더 포함할 수 있다. 라벨은 형광성일 수 있다. 형광 라벨은 유기 형광 염료, 금속 킬레이트 화합물, 탄소 나노튜브, 양자점(quantum dot), 금 입자, 또는 형광 광물일 수 있다. 라벨은 방사성일 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 브릿지 프로브는 라벨링된 핵산 바인더(binder) 분자에 결합할 수 있다. 핵산 바인더 분자는 항체, 항생제, 히스톤, 항체, 또는 뉴클레아제일 수 있다.
브릿지 프로브는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 15개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 링커는 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
링커는 비-핵산 폴리머 (예를 들면, 탄소 스트링(string))를 포함할 수 있다. 링커 비-뉴클레오타이드 폴리머는 약 30개의 유닛, 약 25개의 유닛, 약 20개의 유닛, 약 15개의 유닛, 약 10개의 유닛, 또는 약 5개의 유닛을 포함할 수 있다.
브릿지 프로브는 3' 및/또는 5' 단부에서 차단될 수 있다. 브릿지 프로브는 5' 포스페이트가 없을 수 있다. 브릿지 프로브는 3' OH가 없을 수 있다. 브릿지 프로브는 3'ddC, 3'반전된(inverted) dT, 3'C3 스페이서, 3' 아미노, 또는 3' 인산화를 포함할 수 있다.
VI. 어댑터 앵커 프로브
어댑터 앵커 프로브 또는 보편적 앵커 프로브는 하나 이상의 브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하는 하나 이상의 브릿지 결합 서열을 포함할 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 BBS 사이에 스페이서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 스페이서의 존재는 혼성체화 캡쳐의 효율을 개선하고 캡쳐의 특이성을 증가시킬 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 하나 이상의 브릿지 프로브가 혼성체화할 수 있는 브릿지 결합 서열 (BBS)을 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 1 내지 100개의 BBS를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 샘플을 구별하기 위한 지표를 포함할 수 있다. 분자 바코드 또는 지표는 어댑터 서열의 5' 및 BBS의 5'일 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 120개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 90개의 뉴클레오타이드, 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 약 20 내지 약 70개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
브릿지 프로브로의 어댑터 앵커 프로브의 용융 온도는 약 65℃, 약 60℃, 약 55℃, 약 50℃, 약 45℃, 또는 약 45℃ 내지 약 70℃일 수 있다.
어댑터 앵커 프로브는 라벨을 포함할 수 있다. 라벨은 형광성일 수 있다. 형광 라벨은 유기 형광 염료, 금속 킬레이트 화합물, 탄소 나노튜브, 양자점, 금 입자, 또는 형광 광물일 수 있다. 라벨은 방사성일 수 있다. 라벨은 비오틴일 수 있다. 어댑터 앵커 프로브는 라벨링된 핵산 바인더 분자에 결합할 수 있다. 핵산 바인더 분자는 항체, 항생제, 히스톤, 항체, 또는 뉴클레아제일 수 있다.
VII. 어댑터/어댑터 프라이머
하나 이상의 어댑터는 라이브러리의 구성을 위해 복수의 주형 핵산에 부착될 수 있다. 라이브러리는 신세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리일 수 있다. 하나의 어댑터가 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착될 수 있다. 2개의 어댑터가 주형 핵산 분자의 5' 단부 및 3' 단부에 부착될 수 있다. 하나 이상의 어댑터가 결찰에 의해 주형 핵산에 부착될 수 있다. 하나 이상의 어댑터의 부착은 주형 핵산과 표적 프로브의 혼성체화 전에 수행될 수 있다. 어떤 경우에, 어댑터는 혼성체화 후 캡쳐된 주형 핵산에 추가될 수 있다. 하나 이상의 어댑터는 분자 바코드 (MB)를 포함할 수 있다.
하나 이상의 어댑터 프라이머는 주형 핵산 분자에 부착된 하나 이상의 어댑터에 혼성체화될 수 있다. 어떤 경우에, 어댑터는 어댑터 앵커 프로브 또는 캡쳐 프로브에 통합된다. 어떤 경우에, 부착, 추가, 또는 통합된 어댑터는 증폭을 위한 프라이머 혼성체화를 위한 부위를 제공할 수 있다. 제1 어댑터 (AD1)는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브를 통해 주형에 부착될 수 있다. AD1에 대한 프라이머는 주형에 상보적인 가닥을 합성하는데 활용될 수 있다. 제2 어댑터 (AD2)는 주형을 더 증폭시키기 위해 주형의 5' 단부 및/또는 상보적 가닥의 3' 단부에 부착될 수 있다. 라이브러리는 AD1 프라이머 및 AD2 프라이머를 사용하여 구성될 수 있다. 선택적 증폭은 AD1 프라이머 및 TSR 또는 그것의 플랭킹(flanking) 영역에 대한 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.
어댑터는 단일 가닥 핵산일 수 있다. 어댑터는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 어댑터는 부분적 듀플렉스(duplex)일 수 있으며, 짧은 가닥보다 더 긴 긴 가닥을 갖거나, 또는 동일한 길이의 2개의 가닥을 갖는다.
VIII. 효소
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제의 예는 Klenow 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제, Bca 폴리머라제, phi 29 DNA 폴리머라제, Vent 폴리머라제, Deep Vent 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 폴리머라제, T7 폴리머라제, 또는 대장균(E. coli) DNA 폴리머라제 1을 포함한다.
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 리가제의 예는 CircLigase, CircLigase II, 대장균 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, DNA 리가제 I, DNA 리가제 II, DNA 리가제 III, DNA 리가제 IV, Taq DNA 리가제, 또는 Tth DNA 리가제를 포함한다.
본원에서 기재된 방법 및 키트에서 사용될 수 있는 메틸화-민감성 또는 메틸화-의존성 제한 효소의 예는 Aat II, Acc II, Aor13H I, Aor51H I, BspT104 I, BssH II, Cfr10 I, Cla I, Cpo I, Eco52 I, Hae II, Hap II, Hha I, Mlu I, Nae I, Not I, Nru I, Nsb I, PmaC I, Psp1406 I, Pvu I, Sac II, Sal I, Sma I, 및 SnaB I을 포함한다.
IX. 증폭 생성물의 다운스트림(downstream) 분석
본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 증폭된 생성물은 서던 블롯팅, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (예를 들면, 실시간 PCR (RT-PCR), 디지털 PCR (dPCR), 액적 디지털 PCR (ddPCR), 정량적 PCR (Q-PCR), nCounter 분석 (Nanostring technology), 겔 전기영동, DNA 마이크로어레이, 질량 분석법 (예를 들면, tandem 질량 분석법, 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS), 연쇄 종결 시퀀싱 (Sanger 시퀀싱), 또는 차세대 시퀀싱을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 추가로 분석될 수 있다.
차세대 시퀀싱은 454 시퀀싱 (ROCHE) (파이로시퀀싱(pyrosequencing) 사용), 가역적 종결자 염료를 사용하는 시퀀싱 (ILLUMINA 시퀀싱), 반도체 시퀀싱 (THERMOFISHER ION TORRENT), 단일 분자 실시간 (SMRT) 시퀀싱 (PACIFIC BIOSCIENCES), 나노포어(nanopore) 시퀀싱 (예를 들면, OXFORD NANOPORE 또는 GENIA의 기술을 사용함), 가파이로인산분해(pyrophosphorolyis)를 사용하는 미세액적 단일 분자 시퀀싱 (BASE4), 단일 분자 전자적 검출 시퀀싱, 예를 들면, 핵산 (DNA/RNA)이 나노갭(nanogap)을 통과함에 따라 나노전극을 통한 터널 전류를 측정하고 전류 차이를 계산하는 것 (QUANTUM BIOSYSTEMS의 QUANTUM SEQUENCING), GenapSys Gene Electornic Nano-Integrated Ultra-Sensitive (GENIUS) 기술 (GENAPYS), QIAGEN의 GENEREADER, 특이적 형광단에 의해 확인되는 중심 결정된 염기 (또는 염기의 쌍)를 가진 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드의 순차적 혼성체화 및 결찰을 사용하는 시퀀싱 (SOLiD 시퀀싱)을 포함할 수 있다. 시퀀싱은 쌍 형성 단부(paired-end) 시퀀싱일 수 있다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 시퀀싱될 수 있는 샘플로부터의 표적 서열의 수는 약 5, 10, 15, 25, 50, 100, 1000, 10,000, 100,000, 또는 1,000,000개, 또는 약 5 내지 약 100, 약 100 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 10,000, 약 10,000 내지 약 100,000, 또는 약 100,000 내지 약 1,000,000개일 수 있다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 핵산 라이브러리는 하나 초과의 샘플로부터 생성될 수 있다. 각각의 라이브러리는 샘플과 관련된 상이한 지표를 가질 수 있다. 예를 들어, 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브는 핵산이 동일한 샘플로부터 유래된 것으로 확인하는데 사용될 수 있는 지표를 포함할 수 있다 (예를 들면, 동일한 제1 지표를 포함하는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 제1 세트는 제1 대상체로부터의 제1 샘플의 제1 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 동일한 제2 지표를 포함하는 캡쳐 프로브 또는 어댑터 앵커 프로브의 제2 세트는 제2 대상체로부터의 제2 샘플의 제2 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 제1 및 제2 라이브러리는 모집되고, 시퀀싱될 수 있고, 지표는 시퀀싱된 핵산이 어느 샘플로부터 유래되었는지 식별하는데 사용될 수 있다). 본원에서 기재된 방법을 사용하여 생성된 증폭된 생성물은 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 또는 10,000개의 샘플로부터 각각 상이한 지표를 가진 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있고, 라이브러리는 모집되고, 예를 들면, 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱될 수 있다.
시퀀싱은 적어도 100, 1000, 5000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 또는 10,000,000개의 서열 판독값을 생성할 수 있다. 시퀀싱은 약 100개의 서열 판독값 내지 약 1000개의 서열 판독값, 약 1000개의 서열 판독값 내지 약 10,000개의 서열 판독값, 약 10,000개의 서열 판독값 내지 약 100,000개의 서열 판독값, 약 100,000개의 서열 판독값 내지 약 1,000,000개의 서열 판독값, 또는 약 1,000,000개의 서열 판독값 내지 약 10,000,000개의 서열 판독값을 생성할 수 있다.
시퀀싱의 깊이는 약 1x, 5x, 10x, 50x, 100x, 1000x, 또는 10,000x일 수 있다. 시퀀싱의 깊이는 약 1x 내지 약 10x, 약 10x 내지 약 100x, 약 100x 내지 약 1000x, 또는 약 1000x 내지 약 10000x일 수 있다.
X. 생물정보학 분석
시퀀싱 데이터의 생물정보학적 분석을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 불완전환 바이설파이트 전환을 가진 분자를 배제하는 방법, 및 매우 낮은 질환 분자 함유량을 가진 샘플에서 메틸화 패턴을 분석하는 방법.
a. 불완전한 바이설파이트 전환을 가진 분자의 배제
불완전한 C>T 전환을 나타내는 분자를 배제하기 위한 필터링(filtering) 기술이 분자 수 및 메틸화 분율 데이터의 견고성을 향상시키는데 사용된다.
각각 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)에 대해 맵핑된(mapped) 시퀀싱 판독값은 게놈 내 판독 시작 및 끝의 뉴클레오타이드 위치 및 고유한 분자 식별자 정보를 사용하여 중복 제거될 수 있다. 중복 제거는 또한 시작 및 끝 위치 정보 단독으로 낮은 정확도로 실행될 수 있다.
중복 제거된 판독값은 CH 맥락에서 비전환된 C's의 수에 따라 필터링되며, 여기서 C는 시토신을 나타내고, H는 3개의 뉴클레오타이드, C (시토신), A (아데닌) 또는 T (티민) 중 하나를 나타낸다. CH 맥락에서 T로 비전환된 C's의 존재는 분자의 불완전한 바이설파이트 또는 효소 처리의 높은 가능성을 나타낸다. CH 맥락에서 비전환된 C's의 수가 미리 설정된 임계치보다 높을 때, 판독값은 폐기된다. 어떤 경우에, CH 맥락에서 비전환된 C's의 임계 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개이다. 어떤 경우에, CH 맥락에서 비전환된 C's의 퍼센트가 (CH 맥락에서 C's의 전체 수의 퍼센트로서) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50%보다 높으면 판독값은 폐기될 수 있다.
b. SICON TMS 분석
메틸화 시퀀싱 데이터의 분석을 위한 현재의 방법은 다운스트림 분석을 위한 2개의 메트릭(metric) 중 하나 또는 둘 다를 계산하는 단계를 수반할 수 있다: (1) 개개의 CpG 부위에서의 메틸화 분율; (2) 관심있는 게놈 영역의 메틸화 밀도. (1)에 대해, CpG 부위에서 메틸화된 C's의 수는 CpG 부위를 커버하는 분자의 총 수로 나누어질 수 있다. (2)에 대해, 한정된 게놈 영역에서 CpG 부위의 모든 메틸화 분율의 평균이 계산될 수 있다. 상기 개념에 대한 약간의 변형으로서, 영역의 분자에서 메틸화 패턴의 차이를 고려하기 위한 노력으로 메틸화 하플로타입(ha산점도ype) 로드 (MHL)가 도입될 수 있다. 본질적으로, MHL은 분자의 혼합물에 대한 평균 측정값을 나타내며, 블록 길이를 설명하기 위해 중량이 추가된다. 이들 방법은 질환-유래된 물질 및 건강한 정상-유래된 물질 둘 다를 포함하는 시퀀싱된 모든 분자에서 DNA 분자에 대한 평균 측정값을 취한다.
조직 시퀀싱 데이터에서, 모든 분자에 대한 평균을 취하는 것은 보통 충분하고 필수적인 접근법이다. 예를 들어, 종양 생검 조직의 경우에, 종양 함유량은 적당히 높을 수 있다 (예를 들면, 20% 이상). 종양과 정상 조직 간의 메틸화 수준의 유의한 차이는 종양-정상 혼합 조직의 평균과 순수한 정상 조직의 평균에 반영될 수 있다. 대부분의 바이설파이트 시퀀싱 데이터가 각각의 게놈 영역에서 낮은 복잡성을 나타내기 때문에 평균은 종종 필요상 수행된다. 예를 들어, 30x는 전체 게놈 바이설파이트 시퀀싱에서 깊은 범위로 간주될 수 있고 많은 연구에서는 훨씬 더 낮은 범위를 나타낸다. 영역 내 많은 CpG 부위에 대한 평균은 낮은 범위로 인한 변동성을 제거하고 측정의 견고성을 향상시킬 수 있다. 매우 낮은 질환 분자 함유량을 나타내는 샘플, 예컨대 종양 환자로부터의 혈장 cfDNA를 사용하는 액체 생검의 맥락에서, 종양 함유량은 종종 0.1% 미만이며, 건강한 정상-유래된 분자와 질환-유래된 분자의 혼합물에 대한 평균은 정상 분자에 의해 지배될 수 있다. 다시 말하면, 종양-유래된 메틸화 정보는 평균을 취하는 행동에서 정상-유래된 분자에 의해 압도된다.
메틸화 시퀀싱 데이터를 분석하기 위한 방법이 본원에서 "SICON TMS 분석"으로 기재되어 있다. 간략히 말하면, 각각의 시퀀싱된 분자에서 CpG 부위의 수가 계수되고, 이들 부위의 메틸화 분율이 계산된다. CpG 수 및 메틸화 분율로 이루어진 데이터 쌍은 다운스트림 분류 모델에서 하나의 데이터 포인트를 나타낸다. 평균-기반 방법과 비교하면, 질환-유래된 분자 및 정상-유래된 분자로부터의 메틸화 정보의 평균이 수행되지 않는다. 따라서 질환-유래된 분자 및 정상 세포-유래된 분자의 메틸화 프로파일은 별도로 보관될 수 있다. 결과로 얻어진 각각의 판독값은 검정에 의해 캡쳐된 고유한 DNA 분자로부터의 CpG 메틸화 정보를 함유할 수 있다. 2개의 메트릭이 각각의 판독값으로부터 수거된다:
1) N: 판독값에서 CpG의 총 수;
2) M: 판독값에서 메틸화된 CpG의 수.
1)과 2)로부터, 제3의 메트릭이 다음과 같이 계산된다:
3) f = M/N, 현재의 판독값에서 메틸화된 CpG의 분율.
검정에서 모든 DMR 상의 각각의 분자에 대한 데이터 쌍 (N, f)이 수거된다. f (y 축) 대 N (x 축)을 나타내는 산점도가 DMR에 대해 생성될 수 있으며, DMR의 모든 판독값은 플롯에서 점으로 나타난다. 예를 들어, 도 11은 정상 결장 조직 (도 11A) 및 결장암 조직 게놈 DNA (도 11B)에서 DMR1의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 그것은 정상 결장 조직에서 초메틸화된 DNA 분자가 없고 결장암 조직에서 대량의 초메틸화된 분자가 존재하는 DMR을 입증한다. 도 12A 및 12B는 각각 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA에서 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 그것은 정상 결장 조직에서 약간의 초메틸화된 DNA 분자가 존재하고 (도 12A) 결장암 조직에서 대량의 초메틸화된 분자가 존재하는 (도 12B) DMR을 입증한다. 도 13은 건강한 개체 (도 13A) 및 결장암 환자 (도 13B)의 혈장 cfDNA에서 DMR1 및 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 각각의 DMR로부터의 도 13B의 상부에서 예시된 초메틸화된 분자의 수는 액체 생검으로부터의 질환 검출을 위한 근거가 된다.
여러 추가의 분석이 실행될 수 있다. 예를 들어, 필터가 초메틸화된 분자를 계수하는데 적용될 수 있다. 초메틸화된 분자를 위한 필터: f>f0인 (즉, 산점도의 상부에서) 모든 분자를 계수하기 위해 임계치 f0이 선택될 수 있다. 이들 판독값은 질환 조직 (예컨대 결장암)의 특징인 초메틸화된 판독값이다. 초메틸화 필터 임계치 (f0)는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9로 설정될 수 있다. 어떤 경우에, 초메틸화 필터 임계치 (f0)는 정상 조직, 또는 건강한 대상체의 샘플에서 메틸화의 분석에 기초하여 설정될 수 있다. 예를 들어, 초메틸화 필터 임계치 (f0)는 정상 조직 샘플, 또는 건강한 대상체의 샘플에서 평균 메틸화 분율로부터 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 표준 편차로 설정될 수 있다.
분자는 또한 강력한 신호에 대해 필터링될 수 있다. 강력한 신호를 가진 분자에 대한 필터: 분자 수의 견고성을 향상시키도록 N>N0인 판독값만을 유지하기 위해 추가적인 임계치 N0이 선택될 수 있다. 임계치 N0은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 30으로 설정될 수 있다.
초메틸화된 분자 및 강력한 신호에 대한 필터링은 각각의 DMR에 대해 강력한 초메틸화된 분자만이 계수된다는 것을 보장할 수 있다. 이것은 분석의 품질, 및/또는 민감도를 개선할 수 있다.
어떤 경우에, 임계치 f0 및 N0은 모든 DMR에 대해 동일하다. 어떤 경우에, 임계치 f0 및 N0은 개개의 DMR에 대해 맞춰 조정될 수 있다. 어떤 경우에, 임계치 f0은 모든 DMR에 대해 동일할 수 있고 임계치 N0는 개개의 DMR에 대해 맞춰 조정될 수 있다. 어떤 경우에, 임계치 N0는 모든 DMR에 대해 동일할 수 있고 임계치 f0은 개개의 DMR에 대해 맞춰 조정될 수 있다. 어떤 경우에, 임계치 f0 및 N0 둘 다는 개개의 DMR에 대해 맞춰 조정될 수 있다.
검정에서 모든 DMR에 대한 강력한 초메틸화된 분자 수는 기계 학습 분류기 방법을 사용하여 샘플의 질환 상태를 결정하기 위한 모델에 반영될 수 있다.
XI. 순차적 표적 풍부화
본 발명은 분할 없이 동일한 DNA 투입량으로부터의 서열의 2개 이상의 패널을 풍부화시키는데 사용될 수 있는 순차적 혼성체화-기반 풍부화의 방법을 제공한다. 도 14는 순차적 풍부화를 수행하는 방법을 예시한다. 어떤 경우에, 순차적 풍부화 방법은 복수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 얻는 단계 및 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위한 제1 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제1 풍부화된 샘플을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 표적 풍부화는 또한 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 고갈된 핵산을 포함하는 나머지 샘플 (또는 제1 나머지 샘플)을 생성할 수 있다. 이 나머지 샘플은 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위한 나머지 샘플에 대한 제2 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제2 풍부화된 샘플을 생성하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널 및 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널은 일반적으로 상이하다. 어떤 경우에, 게놈 영역의 제3, 제4 또는 추가의 패널을 이용하여 표적 풍부화의 제3, 제4, 또는 추가의 라운드가 수행될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 게놈 영역의 패널은 돌연변이 핫스팟(hotspot), 종양 유전자, 종양 억제자 유전자, 종양 유전자 엑손, 종양 억제자 엑손, 또는 조절 영역과 관련된 1-50,000, 5-10000, 또는 5-5000개의 게놈 영역의 패널을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 게놈 영역의 패널은 유전자 외적 변형, 인트론, 프로모터, 또는 다른 조절 서열을 가진 차등적으로 메틸화된 영역과 관련된 5-5000개의 게놈 영역의 패널을 포함한다. 어떤 경우에, 패널은 암에서 초메틸화와 관련된 50-500개의 게놈 영역을 포함한다.
Point-n-Seq가 증폭 전 및 전환 전 풍부화 기술이기 때문에, 풍부화된 샘플은 시퀀싱에 의해 분석될 수 있거나, 또는 메틸화를 평가하기 위해 시퀀싱 전에 바이설파이드 처리 (또는 효소 처리)될 수도 있다. 어떤 경우에, 제1 풍부화된 샘플은 돌연변이를 평가하기 위해 시퀀싱에 의해 분석될 수 있지만 제2 풍부화된 샘플은 메틸화를 평가하기 위해 시퀀싱 전에 바이설파이드 (또는 효소) 처리된다. 어떤 경우에, 제1 풍부화된 샘플 및 제2 풍부화된 샘플은 둘 다 게놈 변화에 접근하기 위해 간단한 시퀀싱에 의해 평가되지만, 샘플은 상이한 깊이로 시퀀싱될 수 있다. 어떤 경우에, 제1 풍부화된 샘플의 분석은 제2 표적 풍부화 단계를 수행하기 전에 수행될 수 있다. 제1 풍부화된 샘플의 분석 결과는 제2 풍부화 단계를 위한 제2 패널을 선택하는데 사용될 수 있다.
표적 풍부화는 본원에서 개시되거나, 또는 해당 분야에서 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 표적 풍부화는 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 포함한다. 본원에서 기재된 바와 같이 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 방법은 일반적으로 어댑터를 복수의 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시켜, 어댑터를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다.
본원에서 기재된 순차적 표적 풍부화는 고도로 효율적일 수 있다. 예를 들어, 제2 풍부화된 샘플가 바이설파이트 처리되고 시퀀싱 반응을 거칠 때, 시퀀싱 반응의 유익한 판독값의 수는 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위해 단일 표적 풍부화를 거치는 경우 샘플로부터 얻어질 수 있는 유익한 판독값의 수의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%일 수 있다.
본원에서 기재된 순차적 표적 풍부화 방법은 임의의 핵산 샘플에 대해 일반화될 수 있다. 방법은 제한된 핵산 샘플의 분석에 특히 유용할 수 있다.
XII. 적용
a. 핵산 특징의 검출
본원에서 기재된 방법 및 키트를 사용하여 생성된 증폭된 핵산 생성물은 하나 이상의 핵산 특징에 대해 분석될 수 있다. 하나 이상의 핵산 특징은 하나 이상의 메틸화 이벤트일 수 있다. 메틸화는 CpG 디뉴클레오타이드에서 시토신의 메틸화일 수 있다. 메틸화된 염기는 5-메틸시토신일 수 있다. 비-CpG 맥락에서 시토신이 메틸화될 수 있다. 메틸화된 또는 비메틸화된 시토신은 CpG 섬에 있을 수 있다. CpG 섬은 높은 빈도의 CpG 부위를 가진 게놈의 영역일 수 있다. CpG 섬은 적어도 200 bp, 또는 약 300 내지 약 3000 bp일 수 있다. CpG 섬은 CpG 디뉴클레오타이드 함유량이 적어도 60%일 수 있다. CpG 섬은 유전자의 프로모터 영역에 있을 수 있다. 메틸화는 5-hmC (5-하이드록시메틸시토신), 5-fC (5-포르밀시토신), 또는 5-caC (5-카르복실시토신)일 수 있다. 본원에서 기재된 방법 및 키트는 고체 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들면, 무세포 DNA를 포함하는 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액으로부터의 DNA의 메틸화 패턴을 검출하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 핵산 특징은 데 노보(de novo) 돌연변이, 넌센스(nonsense) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 삽입, 치환, 점 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP), 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV), 데 노보 단일 뉴클레오타이드 변이체, 결실, 재배열, 증폭, 염색체 전위, 중간 결실, 염색체 역위, 이형접합성 상실, 기능 상실, 기능 획득, 우성 음성, 또는 치사 돌연변이일 수 있다. 증폭된 핵산 생성물은 생식계열 돌연변이 또는 체세포 돌연변이를 검출하기 위해 분석될 수 있다. 하나 이상의 핵산 특징은 병태, 예를 들면, 암, 자가면역 질환, 신경학적 질환, 감염 (예를 들면, 바이러스 감염), 또는 대사 질환과 관련이 있을 수 있다.
b. 진단/검출/모니터링
개시된 방법 및 키트는 또한 질환 또는 병태를 진단 또는 검출하는데 사용될 수 있다. 질환 또는 병태는 메틸화 이상과 직결될 수 있다. 병태는 심리적 장애일 수 있다. 병태는 노화일 수 있다. 병태는 질환일 수 있다. 병태 (예를 들면, 질환)는 암, 신경학적 질환 (예를 들면, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 자폐 스펙트럼 장애, 레트 증후군(Rett Syndrome), 조현병), 면역 결핍, 피부병, 자가면역 질환 (예를 들면, 베체트 안 질환(Ocular Behcet's disease), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 류머티스성 관절염 (RA), 다발성 경화증, 감염 (예를 들면, 바이러스 감염), 또는 대사 질환 (예를 들면, 과혈당증, 고지질혈증, 2형 진성 당뇨병)일 수 있다. 암은, 예를 들면, 결장암, 유방암, 간암, 방광암, 윌름스 암(Wilms cancer), 난소암, 식도암, 전립선암, 골암, 또는 간세포 암종, 교아종, 유방암, 편평세포 폐암, 갑상선 암종, 또는 백혈병일 수 있다 (예를 들면, Jin and Liu (2018) DNA methylation in human disease. Genes & Diseases, 5:1-8 참조). 병태는 벡위드-위데만 증후군(Beckwith-Wiedemann Syndrome), 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 또는 안젤만 증후군(Angelman syndrome)일 수 있다.
본원에서 제공된 방법 및 키트를 사용하여 생성된 무세포 DNA의 메틸화 패턴은 암의 마커로서 사용될 수 있다 (예를 들면, Hao et al., DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2015116837 참조). 무세포 DNA의 메틸화 패턴은 DNA의 기원의 조직을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2005019477). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 메틸화 하플로타입 정보를 결정하는데 사용될 수 있고 무세포 DNA의 조직 또는 세포 기원을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, Seioighe et al, (2018) DNA methylation haplotypes as cancer markers. Nature Genetics 50, 1062-1063; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2015116837; 미국 특허 출원 공개 번호 20170121767 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 암에 걸린 대상체 및 암이 없는 대상체에서, 예를 들면, 무세포 DNA의 메틸화 수준을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, Vidal et al. A DNA methylation map of human cancer at single base-pair resolution. Oncogenomics 36, 5648-5657; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2014043763 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 메틸화 수준을 결정하거나 무세포 DNA 혼합물에 대한 상이한 조직의 분획적 기여를 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2016008451 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는, 예를 들면, 메틸화 하플로타입의 비교 패턴 및 풍부화에 기초하여 무세포 DNA의 기원의 조직에, 예를 들면, 혈장에서 사용될 수 있다 (예를 들면, Tang et al., (2018) Tumor origin detection with tissue-specific miRNA and DNA methylation markers. Bioinformatics 34, 398-406; 국제 PCT 출원 공개 번호 WO2018119216 참조). 본원에서 기재된 방법 및 키트는 암 세포를 정상 세포와 구별하고 기원의 조직에 따라 상이한 암 유형을 분류하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 20170175205A1 참조). 본원에서 제공된 방법 및 키트는 모체 샘플을 사용하여 태아 DNA 또는 태아 이상을 검출하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, Poon et al. (2002) Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry, 48: 35-41 참조).
개시된 방법은 병태를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 병태는 질환일 수 있다. 병태는 암, 신경학적 질환 (예를 들면, 알츠하이머 병), 면역 결핍, 피부병, 자가면역 질환 (예를 들면, 베체트 안 질환), 감염 (예를 들면, 바이러스 감염), 또는 대사 질환일 수 있다. 암은 차도가 있을 수 있다. 개시된 방법이 낮은 수준의 이상을 검출하기 위해 cfDNA 및 ctDNA를 사용할 수 있기 때문에, 본 발명은 질환을 모니터링하는 상대적으로 비침습성인 방법을 제공할 수 있다. 개시된 방법은 치료 또는 요법을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 치료 또는 요법은 병태, 예를 들면, 질환, 예를 들면, 암, 또는 본원에서 개시된 임의의 병태에 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 방법은 바이설파이트 전환 및 증폭 전에 cfDNA로부터 직접적으로 표적 분자의 풍부화를 허용할 수 있다. 방법은 또한 주어진 질환에 대해 1 내지 ~1000개의 마커의 메틸화 상태를 조사하는 작은 집중 패널의 개발을 가능하게 할 수 있다. 어떤 경우에, 주어진 질환에 대해 1 내지 약 10000개의 차등적으로 메틸화된 영역의 메틸화 상태를 조사하는 패널에 대한 키트가 생산될 수 있다.
실시예
실시예 1
상승적인 간접적 혼성체화에 의한 캡쳐
시퀀싱 (SICON-SEQ) 실험을 위한 핵산의 상승적인 간접적 캡쳐를 상이한 서열을 가진 2개의 브릿지 프로브 및 어댑터 앵커 프로브/보편적 앵커 프로브 (UP, 서열 번호: 1)로 수행하였다. 2개의 브릿지 프로브 (EGFR-BP2, 서열 번호: 2 및 EGFR-BP3, 서열 번호: 3)를 EGFR 게놈 서열을 표적화하도록 디자인하였다. 각각의 브릿지 프로브는 약 25bp의 표적화 서열 (TS1 또는 TS2) 영역, 적어도 15개의 티민을 포함하는 링커, 및 어댑터 앵커 프로브 상의 브릿지 결합 서열에 상보적이도록 디자인된 20 bp를 가진 랜딩 서열 (LS1 또는 LS2, 이탤릭체)을 포함하였다. 어댑터 앵커 프로브는 브릿지 프로브의 랜딩 서열 중 하나에 혼성체화하도록 디자인되는 2개의 브릿지 결합 서열 (BBS1 또는 BBS2)을 포함하였다. 어댑터 앵커 프로브는 핵산 서열의 5'에서 추가로 비오티닐화된다. 도 4는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 제공한다.
혼성체화 캡쳐를 위해, 단편화된 (피크 크기 160bp) gDNA 20ng을 EGFR에 대한 2개의 브릿지 프로브 (각각 1 fmole), 뿐만 아니라 20 ul의 최종 용액 부피의 하나의 보편적 앵커 프로브 (200 fmole)와 혼합하였다. DNA 투입량 및 혼성체화 프로브를 95℃에서 30 min 동안 혼성체화 완충액에서 변성시키고, 65℃로 서서히 냉각시켰다. 혼성체화 복합체는 유전자 증폭기(thermo cycler)에서 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 혼성체화 완충액은 100ng/ul의 블로킹 DNA, 1ug/ul 소 혈청 알부민 (BSA), 1ug/ul 피콜(Ficoll), 1ug/ul 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 0.075M 나트륨 시트레이트, 0.75 M NaCl, 5x SSC 및 1X 덴하르트 용액(Denhardt's solution)을 포함한다.
캡쳐/클린업하기 위해서, 혼성체화 조립체를 실온에서 10 min 동안 스트렙타비딘 비드 (Thermo Fisher Dynabeads M270 Streptavidin)와 함께 인큐베이션하였다. 클린업을 3회 세척으로 실행하였다 (세척 1: 5X SSPE, 1%SDS; 세척 2: 2X SSPE, 0.1% SDS; 세척 3: 0.1X SSPE, 0.01% 트리톤).
풍부화된 DNA를 EGFR 표적화 서열에 대한 프라이머 (서열 번호: 4 & 5)를 사용하는 qPCR에 의해 평가하였다. 캡쳐된 EGFR DNA에 대한 qPCR 결과를 캡쳐 풍부화되지 않은 gDNA의 동일한 부분과 비교하였다. 65% 내지 90% 초과의 EGFR이 회복되었다.
실시예 2
상이한 혼성체화 계획에 의한 캡쳐
다양한 혼성체화 시스템의 캡쳐 성능을 결정하기 위해서, 4가지 유형의 혼성체화 계획을 테스트하였다: 비-상승적인 혼성체화, 직접적 (도 5A), 상승적인, 직접적 혼성체화 (도 5B), 상승적인 간접적 혼성체화 (도 5C), 및 비-상승적인 간접적 혼성체화 (도 5D).
비-상승적인 직접적 방법은 표적 특이적 서열 (사선, 도 5A)을 포함하는 비오티닐화된 캡쳐 프로브 (120bp, 서열 번호: 6)의 혼성체화를 수반한다. 상승적인 직접적 방법은 4개의 짧은 비오티닐화된 캡쳐 프로브 (서열 번호: 7-10)의 혼성체화를 수반하고, 각각 25bp의 표적 특이적 서열 (사선, 도 5B)을 함유한다. 상승적인 간접적 방법은 비오틴이 없는 4개의 짧은 브릿지 프로브 (서열 번호: 12-15)를 활용하였고 (도 5C), 각각 상승적인 직접적 방법에서 사용된 캡쳐 프로브 중 하나와 동일한 표적 특이적 서열을 포함하였다. 각각의 브릿지 프로브 (BP)는 보편적 앵커 프로브 (서열 번호: 11)에서 브릿지 결합 서열 중 하나와 상보적이도록 디자인된 2개의 상이한 랜딩 서열 (점선 및 사선) 중 하나를 포함하였다. 비-상승적이지만 간접적인 방법 (도 5D)을 상승적인, 직접적 혼성체화에서 사용된 동일한 보편적 앵커 프로브와 쌍 형성된 짧은 브릿지 프로브 (서열 번호: 16)를 사용하여 테스트하였다. 실험에 사용된 캡쳐 프로브 또는 보편적 앵커 프로브 (UP)를 5' 단부에서 비오티닐화시켰다.
혼성체화 반응 전에, 10ng의 cfDNA를 사용하여 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 prep 키트를 사용하여 동반된 프로토콜의 단계를 따라 NGS 라이브러리를 구성하였다. 라이브러리 구성 후, 혼성체화-기반 캡쳐를 비드 정제 없이 결찰 혼합물로 직접적으로 수행하여 라이브러리를 풍부화하였다. 풍부화된 라이브러리를 qPCR 분석하였다.
캡쳐 전과 후의 EGFR 존재의 퍼센트를 비교함으로써 캡쳐 효율을 평가하였다. 캡쳐 후의 ct를 2.5ng의 인간 gDNA 라이브러리 (캡쳐 투입량의 적절한 부분)와 비교하였다. 캡쳐 효율 PCR을 EGFR (서열 번호: 17), 및 NGS 어댑터 P7 서열 (서열 번호: 18)에 대해 디자인된 프라이머를 사용하여 실행하였다. 백그라운드 (전체 DNA 존재)를 모든 DNA 라이브러리를 증폭시킬 수 있는 프라이머 (서열 번호: 18, 19)를 사용하여 qPCR에 의해 평가하였다. 모든 백그라운드 델타 ct를 "C" 프로브 디자인으로부터 얻어진 평균 CT에 대해 표준화하였다.
간접적, 상승적인 혼성체화 캡쳐는 비-상승적인 방법 및 직접적인 방법 중 어느 것보다 우수한 혼성체화 민감도 및 특이성을 입증하였다 (표 3). 상승적인 간접적 프로브 디자인이 가장 높은 캡쳐 효율 (평균 ~91%) 및 가장 낮은 배경 잡음을 입증하였다. 비-상승적인, 직접적 혼성체화는 훨씬 더 높은 (300x) 브릿지 프로브 농도에서 없음 내지 14.87% 회복을 나타냈지만, 200배 초과의 백그라운드 증가를 나타냈다. 혼성체화 온도를 낮추는 것은 캡쳐 효율에 도움이 되지 않지만, 대신에 배경 잡음을 극적으로 증가시켰다. 상승적이지만 간접적이지 않은 디자인에 대해, 브릿지 프로브 농도의 증가 및 혼성체화를 낮추는 것은 캡쳐 효율에 도움이 되지 않는다. 간접적인, 비-상승적인 방법에 대해, 캡쳐 풍부화가 검출되지 않았다.
실시예 3
스페이서가 있거나 없는 보편적 앵커 프로브에 의한 간접적 캡쳐
보편적 앵커 프로브 (UP) 상의 2개 이상의 브릿지 결합 서열 사이에서 스페이서의 존재가 간접적, 상승적인 혼성체화 캡쳐의 캡쳐 성능에 영향을 미치는지 여부를 알기 위해서 연구를 실행하였다. 동일한 브릿지 프로브를 두 경우 모두에 사용하였다.
표 4는 사용된 브릿지 프로브 및 UP의 서열을 나열한다. 도 6A는 스페이서를 가진 UP를 사용하는 상승적인 간접적 혼성체화의 개략도를 나타낸다. 도 6B는 스페이서가 없는 UP를 사용하는 상승적인 간접적 혼성체화를 나타낸다.
혼성체화 캡쳐에 대한 캡쳐 효율 및 배경 잡음을 결정하였다. 배경 잡음을 qPCR 결과를 평균 백그라운드 신호에 대해 표준화하여 계산하였다. 캡쳐 효율은 스페이서의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않지만, 스페이서가 없는 캡쳐 혼성체화의 배경 잡음은 스페이서가 있는 캡쳐보다 약 100배 더 높았다 (표 5). 따라서, 보편적 앵커 프로브 내의 스페이서는 고도로 특이적인 (낮은 백그라운드) 캡쳐를 가능하게 하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 4
상승적인 간접적 캡쳐 방법을 사용한 NGS 메트릭의 결정
3, 15, 및 76개의 표적 패널을 사용하여 차세대 시퀀싱 (NGS) 메트릭을 결정하였다. 맵핑된 비율을 인간 게놈에 대해 정렬된 시퀀싱 판독값의 퍼센트로 계산하였다. 3, 15, 및 76개의 표적 패널에 대한 맵핑된 비율은 각각 97%, 94%, 95%였다 (표 6). 캡쳐 프로브 및 100bp 플랭킹에 의해 커버된 영역에 대한 중복 제거된 맵핑된 판독값을 사용하여 온-타겟 비율을 계산하였다. 3, 15 및 76-표적과 같은 작은 패널에 대해, 통상적인 혼성체화-기반 DNA 풍부화는 실현 가능하지 않았다. 하지만, 연구에서는 50kb 초과를 가진 표준 표적 패널과 비교하여 15 및 76-표적 패널에 대해 83.6% 및 85.3%의 비슷하게 높은 온-타겟 비율을 나타냈다.
더욱이, 패널에 대한 균일성은 높았다 (위치의 >99%가 평균 범위의 0.2x보다 더 높은 판독값을 갖고, 0.5x 범위에 대해 95%보다 더 높다). 0.2 또는 0.5X 범위는 3개의 표적을 가진 마이크로패널에 적합하지 않았다. 15-표적 패널의 높은 균일성은 또한 GC 함유량이 높은 영역에서의 고른 범위에 의해 반영되었다 (도 7). 80% GC 함유량에서 영역의 범위는 평균 범위의 0.5x보다 더 높았다.
실시예 5
상승적 간접적 캡쳐 방법을 사용하는 인간 SNP의 NGS 메트릭의 결정
76개의 인간 ID 단일-뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 커버하기 위해 상승적 간접적 혼성체화 검정을 실행하였다. 20 ng의 인간 무세포 DNA (cfDNA)에서 증폭 전 혼성체화를 실행하였다. 결과를 상업적으로 이용 가능한 IDT xGen Hybridization 및 Wash Kit를 사용하여 증폭 후 혼성체화와 비교하였다. 동일한 76개의 ID SNP를 커버하는 xGen Human ID Research Panel V1.0을 캡쳐에 사용하였다. xGEN human ID panel을 사용하여 상업적 프로토콜에 따라 원래의 투입량으로서 20ng의 cfDNA를 사용하여 구성된 NGS 라이브러리에서 혼성체화-기반 캡쳐를 실행하였다.
76-표적 패널을 사용하여 차세대 시퀀싱 (NGS) 메트릭을 결정하였다 (표 7). 증폭 후 캡쳐의 표적 비율은 30.7% 온-타겟 비율로 낮았다. 그에 반해, 동일한 게놈 영역을 커버하는 SICON-MAS 패널의 온-타겟 비율은 88%였다.
실시예 6
증폭 후 방법과 SICON-SEQ의 비교
시퀀싱을 위한 핵산의 상승적 간접적 캡쳐 (SICON-SEQ)를 76개의 인간 유전자 표적의 패널에 대해 실행하였으며 단지 1시간의 증폭 전 캡쳐로 10 ng cfDNA 투입량으로부터의 1M 판독값에 대해 >80% 온-타겟 비율을 제공하였다. 회사 "I" 키트를 이용한 증폭 후 캡쳐를 동일한 패널에 사용하여 16시간의 증폭 후 캡쳐로 2배의 투입량 (20ng cfDNA)으로부터의 1M 판독값에 대해 단지 6-30%의 온-타겟 비율을 수득하였다. 회사 I 키트를 사용한 증폭 전 캡쳐를 실행하였지만, 임의의 결과를 생성하는데 실패하였다.
도 8A-8B는 상이한 퍼센트의 GC 함량의 영역에 대해 SICON-SEQ 및 IDT xGen Hybridization 및 Wash Kit에 의한 범위를 나타낸다. 낮은 GC 함량 (<30%)에서 높은 GC 함량 (>50%)을 가진 영역으로부터의 범위는 SICON-SEQ 검정에 대해 매우 균일하였다 (도 8A). 라이브러리 풍부화를 수득할 수 없는 IDT xGEN 키트 (도 8B)를 사용하는 캡쳐 프로토콜에 대해, 상이한 CG 함량을 가진 영역의 범위는 체계적으로 편향되어 있다.
실시예 7
SICON-TMS에 의한 메틸화 검정
SICON 표적화된 메틸화 시퀀싱 (SICON-TMS) 검정을 도 2A 및 2B에서 예시된 바와 같이 실행하였다. 샘플 cfDNA를 상이한 비-암성 개체로부터의 혈장의 3-5 ml로부터 추출하고 120개의 상이한 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)에 대해 조사하였다. 판독값은 cfDNA 투입량이 1ng만큼 낮더라도 투입량에 대해 거의 선형 (R2=0.9474) 관계를 나타냈다 (도 9).
실시예 8
SICON-TMS에 의한 cfDNA에서 메틸화된 DNA의 검출
60개의 상이한 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 조사하기 위해 SICON-TMS 검정을 실행하였다.
NEBNext Ultra II 키트 매뉴얼에 따라 cfDNA를 사용하여 신세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리를 먼저 구성하였다. 라이브러리 DNA (0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 또는 100%의 비율에서 메틸화된 DNA에 스파이크(spike)를 가진 cfDNA)를 혼성체화 캡쳐를 위해 투입하였다. 증폭되지 않은 DNA 20 ng을 프로브와 혼합하고 라이브러리/프로브 혼합물을 혼성체화 완충액에서 95℃에서 30 min 동안 변성시켰다. 혼합물을 60℃로 서서히 냉각시켰다. 혼성체화 혼합물을 유전자 증폭기에서 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 혼성체화 완충액은 100 ng/ul의 연어 정자 DNA, 1 ug/ul 소 혈청 알부민 (BSA), 1 ug/ul 피콜, 1 ug/ul 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 0.075M 나트륨 시트레이트, 0.75 M NaCl, 5x SSC 및 1X 덴하르트 용액을 함유하였다.
클린업을 위해서, 캡쳐된 조립체를 스트렙타비딘 비드 (Thermo Fisher Dynabeads M270 Streptavidin)와 함께 실온에서 10 min 동안 인큐베이션한 후 이어서 3회 세척하였다 (세척 1:5X SSPE, 1%SDS; 세척 2: 2X SSPE, 0.1%; 세척 3: 0.1X SSPE, 0.01% 트리톤). 클린업 조립체를 메틸화 분석을 위해 바이설파이트로 처리하였다.
도 10은 예상되는 스파이크-인 및 측정된 값의 관계를 나타낸다. SICON-TMS 검정은 0.01% 메틸화까지의 분석 민감도 및 선형성을 입증하였다. 메틸화 퍼센트는 예상된 값과 고도로 연관성이 있으며, R2는 0.99이고, 검정의 높은 정확도를 나타낸다.
실시예 9
SICON-TMS에 의한 cfDNA에서의 암 메틸화 패턴의 검출
정상 결장 조직 및 결장암 조직의 샘플, 뿐만 아니라 건강한 개체 및 결장암 환자로부터의 혈장 cfDNA의 샘플을 바이설파이트 처리하고 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독값을 각각의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)에 대해 맵핑하고 중복 제거하였다. 결과로 얻어진 각각의 판독값은 검정에 의해 캡쳐된 고유한 DNA 분자로부터의 CpG 메틸화 정보를 함유한다. 2개의 메트릭을 각각의 판독값에 대해 계산하였다:
1) N: 판독값에서 CpG의 총 수;
2) M: 판독값에서 메틸화된 CpG의 수.
1)과 2)로부터, 제3의 메트릭을 다음과 같이 계산하였다:
3) f = M/N, 현재의 판독값에서 메틸화된 CpG의 분율.
결과는 각각의 DMR에 대해 f (y 축) vs N (x 축)을 나타내는 산점도로 나타나며, DMR의 모든 판독값은 플롯에서 점으로 나타난다. 도 11은 정상 결장 조직 (도 11A) 및 결장암 조직 게놈 DNA (도 11B)에서 DMR1의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 그것은 정상 결장 조직에서 초메틸화된 DNA 분자가 없고 결장암 조직에서 대량의 초메틸화된 분자가 존재하는 DMR을 입증한다.
도 12A 및 12B는 각각 정상 결장 조직 및 결장암 조직 게놈 DNA에서 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 이들 도면은 정상 결장 조직에서 약간의 초메틸화된 DNA 분자가 존재하고 결장암 조직에서 대량의 초메틸화된 분자가 존재하는 DMR을 입증한다.
도 13A 및 13B는 각각 건강한 개체의 혈장 cfDNA 및 결장암 환자의 혈장 cfDNA에서 DMR1 및 DMR2의 분자 메틸화 산란 패턴을 나타낸다. 각각의 DMR로부터의 도 13B의 상부에서 예시된 초메틸화된 분자의 수는 액체 생검으로부터의 질환 검출을 위한 근거로 사용될 수 있다.
실시예 10
SICON-TMS에 의한 cfDNA에서의 암 메틸화 패턴 검출
100개의 메틸화 마커를 커버하는 Point-n Seq 결장직장암 (CRC) 패널을 3 단계로 디자인하였다. 먼저, 대략 1000개의 CRC-특이적 마커를 공용 데이터베이스로부터 확인하였다. 두 번째로, 건강한 집단의 베이스라인 cfDNA에서 높은 백그라운드 신호를 가진 마커를 제거하였다. 마지막으로, 환자 및 건강한 cfDNA 사이에서 가장 구별되는 마커를 함유하도록 목록을 확정하였다. SICON CRC 패널의 캡쳐는 고도로 효율적이며 높은 균일성 (94% > 0.5X, 100% > 0.2X) 및 온-타겟 비율 (>80%)을 초래한다. 20ng cfDNA 투입량에 대해, 1000개 초과의 중복 제거된 유익한 판독값을 높은 GC 함량에도 (> 80%) 각각의 마커에 대해 평균적으로 얻었다. 유익한 판독값의 산출량은 1ng 내지 40ng의 범위에 있는 cfDNA에 대해 선형이었다. 적정 연구에서, 20ng cfDNA에서 0.6pg (0.2X 게놈 당량) 메틸화된 DNA (0.003%)를 cfDNA 백그라운드에서 확실히 검출하였다. 결장직장 선암종에 걸린 환자의 혈장 샘플 - 초기 (I, n=7; II, n=7), 말기 (III, n=11; IV, n=3), 및 대조군 개체 (n=105) - 을 사용하는 예비 임상 연구에서, 메틸화된 신호의 평균 분율은 대조군, I기, II기, III기, IV기에 대해 0.0034%, 0.013%, 0.09%, 0.17%, 0.29%였다. I기 샘플의 메틸화 분율은 대조군과 유의하게 상이하였다 (P<0.001). 메틸화 분율을 사용하는 단순한 컷-오프(cut-off)로, Point-n Seq CRC 패널은 91%의 특이성에서 I기에 대해 86%, 단계 (II-IV)에 대해 100%의 민감도를 달성하였으며, AUC=0.96이었다.
실시예 11
CRC 혈장 샘플에서 Point-n-Seq SNV + 메틸 이중 캡쳐 분석
유전적 및 유전자 외적 대안을 말기 CRC 환자로부터의 혈장 샘플 (1ml)에서 균일화된 Point-n-Seq 검정에 의해 검출하였다. Point-n-Seq 결장직장암 (CRC) 패널을 22개의 유전자로부터 메틸화 마커 및 350개 초과의 핫스팟 돌연변이를 커버하도록 디자인하였다.
2회의 순차적인 표적 풍부화 라운드를 메틸화 마커 패널 및 돌연변이 핫스팟 패널을 사용하여 본원에서 기재된 바와 같이 상승적인 간접적 혼성체화 캡쳐에 의해 수행하였다. 간략히 말하면, 각각의 cfDNA 샘플 20μL를 PCR 튜브에 추가하였다. 20μL 미만의 DNA 부피에 대해, IDTE 또는 완충액 EB를 20μL의 최종 부피까지 추가하였다. 각각의 샘플에 대해 2.8 μL의 종결 prep 완충액 및 1.2 μL의 종결 prep 효소를 추가하였다. 튜브를 부드럽게 보텍싱하여 잘 혼합한 다음, 간단히 원심분리하였다. 튜브는 가열된 뚜껑이 구비된 유전자 증폭기를 20℃의 온도에서 30 min 동안, 이어서 65℃에서 30 min 동안 작동시켰다. 그 후 어댑터 용액 2.5 μL 및 결찰 혼합물 13 μL를 추가하고 혼합물을 20℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다.
샘플 결합 비드를 적어도 15분 동안 실온으로 평형화시키고, 보텍싱하여 재현탁시켰다. 48 μL (~1.2x 부피)의 라이브러리 결합 비드를 39.5μL 결찰 반응에 추가하였다. 이것들을 적어도 10회 피펫팅하여 철저하게 혼합하고 간단히 원심분리하였다. 혼합물을 실온에서 10 min 동안 인큐베이션하고 적어도 2 min 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 자석 위에 배치하였다. 상층액을 제거하여 폐기하였다. 자석 위에서, 150 μL의 샘플 세척 완충액을 비드를 건드리지 않으면서 비드에 추가하고, 2 min 동안 인큐베이션하고, 상층액을 폐기하였다.
표적 캡쳐를 위해 돌연변이 캡쳐 패널을 함유하는 혼성체화 혼합물 및 프로브 결합 혼합물을 추가하고 부드럽게 보텍싱 또는 플리킹(flicking)하여 잘 혼합하였다. 혼합물을 2 min 동안 98 ℃로 가열한 다음, 2.5 ℃/s의 속도로 60 ℃까지 낮추고, 60 ℃에서 60 min 동안 인큐베이션하였다. 60 min 혼성체화 후 샘플을 30 sec 동안 자석 위에 배치하고 상층액을 조심스럽게 라벨링된 튜브로 옮기고, 제2 혼성체화 단계를 위해 저장하였다. 비드를 3회 세척하고 재현탁하고, DNA를 비드 위에서 증폭시켰다.
상기로부터 저장된 상층액을 TMS 캡쳐 패널을 함유하는 혼성체화 혼합물과 혼합하고, 돌연변이 캡쳐 패널에 대해 캡쳐 혼성체화를 수행하였다. 캡쳐된 TMS DNA를 바이설파이드 처리하고, 복구하고, 비드로부터 용출시킨 후 이어서 지표 PCR을 수행하였다. 2개의 증폭된 DNA 샘플을 시퀀싱을 위해 제조하고 Illumina 플랫폼 상에서 시퀀싱하였다.
도 14는 순차적인 표적 풍부화를 예시한다. 표 8은 DNA 투입량, 및 각각의 환자 샘플에 대한 메틸화된 신호의 분율 및 돌연변이 신호의 분율을 나열한다. 검출된 돌연변이의 상세한 설명은 도 15에 나타나있다. 표 8에서 나타난 바와 같이 Point-n-Seq CRC 돌연변이 및 메틸화 패널의 캡쳐는 고도로 효율적이며 광범위한 DNA의 시작량에서 초메틸화 및 돌연변이의 검출을 초래하였다. 또한, CRC 환자의 혈장 cfDNA를 사용하는 메틸화 및 돌연변이 조합 분석은 메틸화 상태 및 구동자 돌연변이 대립유전자 빈도로부터 일관된 종양 함유량 추정치를 나타냈다.
실시예 12
이중 분석으로부터의 메틸화 신호는 독립형 메틸화 (TMS) 분석과 비슷하다
순차적 표적 풍부화 방법으로부터 유래된 메틸화 신호를 평가하기 위해서 대조군 cfDNA로 스파이크된 세포주 HCT116의 gDNA로 적정 실험을 수행하였다. HCT116 gDNA는 0.001% 내지 10%의 범위의 농도에서 스파이크하였다. 동일한 DNA 투입량은 단독으로 TMS 분석 또는 순차적 SICON에 의한 돌연변이-TMS 이중 분석을 거쳤으며, 도 14에서 요약된 바와 같이 돌연변이 분석을 위한 풍부화 단계를 먼저 수행하고 TMS 분석을 위한 풍부화 단계를 두 번째로 수행하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 독립형 분석 및 이중 분석의 메틸화 점수는 비슷하며 메틸화 검정 민감도가 순차적 캡쳐 이중 분석에서 제2 캡쳐로서 손상되지 않았다는 것을 나타낸다. 도 17은 2nd 캡쳐 TMS 회복 (차등적으로 메틸화된 영역 (DMR) 당 시퀀싱으로부터의 유익한 분자 수)이 1st 캡쳐 TMS의 약 85%라는 것을 나타낸다.
실시예 13
종양에 정통한 개인 맞춤형 패널 분석
CRC 종양 gDNA는 전체 엑손 시퀀싱을 거치고 개인 맞춤형 패널을 제조하기 위해 114개의 단일 뉴클레오타이드 변이체를 선택하였다. CRC 종양 gDNA는 적정 실험에서 0.001%, 0.003%, 0.01, 0.03%, 및 0.1%의 농도에서 대조군 cfDNA로 스파이크되었다. 도 18에서 나타난 바와 같이 0.003%에서 스파이크된 샘플은 0%로부터 분리될 수 있으며 특정 개인 맞춤형 혼성체화-기반 검정에 대해 0.003%의 검출 한계를 시사한다. 더 큰 패널이 더 낮은 검출 한도를 초래할 것으로 예상된다.
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에서 나타나고 기재되어 있지만, 이러한 구체예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에서 벗어나지 않으면서 당업자에게 많은 변형, 변화, 및 치환이 이제 일어날 수 있다. 본원에서 기재된 본 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 한정하고 이들 청구범위 내의 방법과 구조 및 그것들의 동등물이 이에 의해 커버되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
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gaaagccaac aaggaaatcc tcgatgtgag tttctgcttt gctgtgtggg ggtccatggc 120
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 19
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 20
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 20
ttttttggca ccagacttaa tctaatttgc agagaacatg ataagagatt ttggcaccag 60
acttaatcta atttgcagag aacatgataa gaga 94
<210> 21
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 21
ttttttggca ccagacttaa tctaagcaga gaacatgata agagatggca ccagacttaa 60
tctaagcaga gaacatgata agaga 85
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 22
tctcttatca tgttctctgc tttttttttt tttttggtga gaaagttaaa attcccgtcg 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 23
ttagattaag tctggtgcca tttttttttt ttttttcaag gaattaagag aagcaacatc 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 24
tctcttatca tgttctctgc tttttttttt tttttgaaag ccaacaagga aatcctcgat 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 25
ttagattaag tctggtgcca tttttttttt tttttagttt ctgctttgct gtgtgggggt 60
Claims (83)
- 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에서 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 얻는 단계;
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및
제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계
를 포함하는 방법. - 제1 항에 있어서, 어댑터를 샘플 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착하여, 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2 항에 있어서, 어댑터를 샘플 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착하고, 어댑터를 각각 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자의 3' 단부 또는 5' 단부에 부착하여, 각 단부에 어댑터를 포함하는 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제2 항 또는 제3 항에 있어서, 어댑터 프라이머를 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 어댑터에 혼성체화하는 단계; 및 어댑터 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4 항에 있어서, 연장 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 제1 브릿지 결합 서열과 제2 브릿지 결합 서열 사이에 위치한 스페이서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터는 분자 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25 항에 있어서, 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26 항에 있어서, 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계;
제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되어, 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산을 생성하는 단계; 및
제1 표적 특이적 영역을 혼성체화하고 제2 표적 특이적 영역을 혼성체화한 후 주형 핵산 분자를 메틸화 검정 시약으로 처리하는 단계
를 포함하는 방법. - 제29 항에 있어서, 메틸화 검정 시약은 바이설파이드, 또는 메틸화된 시토신을 변형시키는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항에 있어서, 제3 브릿지 프로브의 제3 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제3 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제3 브릿지 프로브의 제3 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제3 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제31 항에 있어서, 제4 브릿지 프로브의 제4 표적 특이적 영역을 주형 핵산 분자의 제4 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제4 브릿지 프로브의 제4 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제4 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브를 혼성체화하고 제2 브릿지 프로브를 혼성체화하기 전에 어댑터를 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33 항에 있어서, 어댑터 프라이머를 제1 브릿지 프로브 및 제2 브릿지 프로브에 혼성체화된 주형 핵산 분자의 3' 단부에 부착된 어댑터에 혼성체화하는 단계; 및 어댑터 프라이머의 3' 단부를 연장시켜, 연장 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항에 있어서, 연장 생성물을 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항에 있어서, 어댑터 프라이머를 혼성체화하는 단계는 바이설파이트로 처리하기 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항에 있어서, 어댑터 프라이머를 혼성체화하는 단계는 바이설파이트로 처리한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34 항에 있어서, 어댑터 프라이머는 바이설파이트로 처리 이후의 어댑터에 기초하여 디자인되며, 어댑터 내 비-메틸화된 시토신은 처리 동안에 유라실로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제40 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화하기 전에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제40 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화한 후에 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브의 제1 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 브릿지 프로브의 제2 랜딩 서열을 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 제1 브릿지 결합 서열과 제2 브릿지 결합 서열 사이에 위치한 스페이서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제30 항 내지 제45 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터는 분자 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제46 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제47 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제48 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제49 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제47 항 내지 제50 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제50 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 브릿지 프로브는 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제52 항에 있어서, 결합 모이어티는 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53 항에 있어서, 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54 항에 있어서, 비드는 스트렙타비딘 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제52 항 내지 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 단일 가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 무세포 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제57 항에 있어서, 무세포 핵산은 무세포 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58 항에 있어서, 무세포 DNA는 순환 종양 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항 내지 제60 항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산 분자는 손상된 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 주형 핵산 분자의 표적 서열에 혼성체화하도록 구성된 표적 특이적 영역을 포함하는 브릿지 프로브;
브릿지 프로브의 어댑터 랜딩 서열에 혼성체화하도록 구성된 브릿지 결합 서열을 포함하는 어댑터 앵커 프로브; 및
주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착되도록 구성된 어댑터
를 포함하는 키트. - 5' 단부 또는 3' 단부가 어댑터에 부착된 주형 핵산 분자;
제1 표적 특이적 영역이 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화되는 제1 브릿지 프로브;
제2 표적 특이적 영역이 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화된 제2 브릿지 프로브; 및
제1 브릿지 결합 서열이 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열에 결합되고 제2 브릿지 결합 서열이 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열에 결합되는 어댑터 앵커 프로브
를 포함하는 조성물. - 주형 핵산 분자로서, 주형 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부가 어댑터에 부착되고, 주형 핵산 분자의 제1 표적 서열이 제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역에 혼성체화되고 주형 핵산 분자의 제2 표적 서열이 제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역에 혼성체화되고, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되고 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열이 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는, 주형 핵산 분자
를 포함하는 핵산 복합체. - 제64 항의 핵산 복합체를 포함하는 조성물.
- 복수의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 얻는 단계;
하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위해 제1 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제1 풍부화된 샘플 및 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널에 상응하는 서열이 고갈된 핵산을 포함하는 나머지 샘플을 생성하는 단계; 및
하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위해 나머지 샘플에서 제2 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제2 풍부화된 샘플을 생성하는 단계
를 포함하는, 순차적 풍부화 방법으로서, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널 및 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널은 상이한, 방법. - 제66 항에 있어서, 제1 풍부화된 샘플의 제1 분석 및 제2 풍부화된 샘플의 제2 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제67 항에 있어서, 제1 분석은 서열 분석이고, 제2 분석은 메틸화 분석인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제67 항에 있어서, 제1 분석은 제1 서열 분석이고, 제2 분석은 제2 서열 분석이며, 제1 서열 분석은 제2 서열 분석과 상이한 깊이의 시퀀싱으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 cfDNA 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 게놈 영역의 패널의 게놈 영역에 대한 표적 풍부화는 혼성체화에 의한 표적 풍부화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 게놈 영역의 패널의 게넘 영역에 대한 표적 풍부화:
제1 브릿지 프로브의 제1 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제1 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제1 브릿지 프로브의 제1 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제1 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계; 및
제2 브릿지 프로브의 제2 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제2 표적 서열에 혼성체화하는 단계로서, 제2 브릿지 프로브의 제2 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제2 브릿지 결합 서열에 결합되는 단계. - 제72 항에 있어서, 어댑터 앵커 프로브는 결합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제73 항에 있어서, 결합 모이어티를 지지체에 부착시키는 단계 및 부착된 결합 모이어티를 가진 지지체를 미결합된 핵산으로부터 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항에 있어서, 게놈 영역의 제1 패널 또는 제2 패널은 프로모터 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 또는 제75 항에 있어서, 게놈 영역의 제1 패널 또는 제2 패널은 인트론 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항, 제75 항 또는 제76 항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 영역의 제1 패널 또는 제2 패널은 게놈 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 내지 제77 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터를 복수의 핵산 분자의 5' 단부 또는 3' 단부에 부착시켜, 어댑터를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항 내지 제78 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 풍부화된 샘플은 바이설파이트 처리되고 시퀀싱 반응을 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79 항에 있어서, 시퀀싱 반응의 유익한 판독값의 수는 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위해 단일 표적 풍부화된 경우 샘플로부터 얻을 수 있는 유익한 판독값의 수의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66 항에 있어서, 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널에 상응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 풍부화하기 위해, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널 및 제2 패널에 상응하는 서열들이 고갈된 핵산을 포함하는 제2 나머지 샘플에 대한 제3 표적 풍부화를 수행하여, 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널에 상응하는 서열이 풍부화된 핵산을 포함하는 제3 풍부화된 샘플을 생성하는 단계를 더 포함하며, 하나 이상의 게놈 영역의 제1 패널, 하나 이상의 게놈 영역의 제2 패널, 및 하나 이상의 게놈 영역의 제3 패널은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제72 항에 있어서, 제3 브릿지 프로브의 제3 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제3 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하며, 제3 브릿지 프로브의 제3 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제3 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제72 항에 있어서, 제4 브릿지 프로브의 제4 표적 특이적 영역을 게놈 영역에 상응하는 서열을 가진 분자의 제4 표적 서열에 혼성체화하는 단계를 더 포함하며, 제4 브릿지 프로브의 제4 어댑터 랜딩 서열은 어댑터 앵커 프로브의 제4 브릿지 결합 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
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