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KR20220131621A - Aptamer-based particles and method for manufacturing the same - Google Patents

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KR20220131621A
KR20220131621A KR1020210036446A KR20210036446A KR20220131621A KR 20220131621 A KR20220131621 A KR 20220131621A KR 1020210036446 A KR1020210036446 A KR 1020210036446A KR 20210036446 A KR20210036446 A KR 20210036446A KR 20220131621 A KR20220131621 A KR 20220131621A
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KR
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aptamer
particles
molecule
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same
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김성천
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김성천
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Abstract

본 발명은 압타머 약물(AM)을 포함하는 입자에 있어서, 상기 AM 및 양이온성 분자를 접촉시켜 정전기적 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 형성된 기본입자 및 상기 기본입자 외면을 음이온성 분자로 코팅하는 특징으로 하는 응용입자에 관한 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법으로, 본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 압타머기반 입자는 압타머 약물의 표적화에 따른 세포 선택적 효능을 구현하였다. The present invention relates to a particle containing an aptamer drug (AM), wherein the AM and the cationic molecule are contacted to condense the AM by electrostatic interaction and the outer surface of the basic particle is coated with an anionic molecule As can be seen through the present invention, the aptamer-based particles of the present invention are aptamer-based particles related to applied particles and a manufacturing method thereof.

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Description

압타머기반 입자 및 이의 제조방법{Aptamer-based particles and method for manufacturing the same}Aptamer-based particles and method for manufacturing the same

본 발명은 압타머 약물(AM)을 포함하는 압타머기반 입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 AM 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 AM를 이용한 표적화, 약물 효능 및 입자화를 동시에 구현할 수 있도록 제형화하여 개선된 약물 효능 및 영상 진단을 실시할 수 있어 치료 안전성을 확보할 수 있는 압타머 약물(AM)의 약제 제형 및 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an aptamer-based particle containing an aptamer drug (AM) and a method for preparing the same. The present invention relates to an AM composition, and more particularly, it is formulated so that targeting, drug efficacy, and particleization using AM can be implemented at the same time, so that improved drug efficacy and imaging can be performed, thereby securing treatment safety. The present invention relates to pharmaceutical formulations and methods for preparing an aptamer drug (AM).

상업화되는 약물 전달체는 생물학적 위험성이 낮고, 비면역원성이며, 변형 및 대량생산이 가능하고, 전달할 수 있는 약물의 크기에도 비교적 제한이 없다. 특히, 양이온성 분자 등을 이용하는 방법이 제조방법의 간편성이나 상대적으로 낮은 위험성 때문에 많이 연구되고 있다. Commercially available drug delivery systems have low biological risk, are non-immunogenic, can be modified and mass-produced, and are relatively unrestricted in the size of the drug that can be delivered. In particular, a method using a cationic molecule or the like has been studied a lot because of the simplicity of the preparation method and the relatively low risk.

압타머(aptamer, Ap)는 고전적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성(base pairing) 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 핵산 분자이다. 압타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합하여 표적의 활성 또는 결합 상호작용을 조정할 수 있는데, 예를 들어, 결합을 통하여 압타머는 그의 표적이 기능하는 능력을 차단할 수도 있다. 무작위 서열 올리고뉴클레오티드의 풀로부터의 시험관 내 선발 공정에 의해 발견되는 바와 같이, 압타머는 성장인자, 전사인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체를 비롯한 많은 종류의 단백질에 대하여 생성되었다. 전형적인 압타머는 크기가 10∼15 kDa(20∼45개의 뉴클레오티드)이며, 그의 표적에 몰 내지 하위 몰(sub-nanomolar)의 친화도로 결합한다. 일련의 구조 연구에 의하면 압타머는 항체-항원 복합체에서 친화성 및 특이성을 작동시키는 동일한 유형의 결합 상호작용 (예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성에 의한 접촉, 입체 배제)을 이용한다.An aptamer (Ap) is a nucleic acid molecule having a specific binding affinity for a molecule through an interaction other than the classical Watson-Crick base pairing. An aptamer may specifically bind to a selected target to modulate the activity or binding interaction of the target, for example, through binding, the aptamer may block its target's ability to function. As discovered by an in vitro selection process from a pool of random sequence oligonucleotides, aptamers have been generated for many types of proteins, including growth factors, transcription factors, enzymes, immunoglobulins and receptors. Typical aptamers are 10-15 kDa (20-45 nucleotides) in size and bind their target with molar to sub-nanomolar affinity. A series of structural studies have shown that aptamers utilize the same types of binding interactions (eg, hydrogen bonding, electrostatic complementarity, contact by hydrophobicity, steric exclusion) that drive affinity and specificity in the antibody-antigen complex.

그러나, 뉴클레아제-내성 이외의 특징, 예를 들어, 표적 친화성을 증가시킬 목적은 압타머 내로의 화학적 치환으로 달성할 수 있다. 화학적 치환은 다양한 특징, 예를 들어, 증가된 표적 친화성을 갖는 압타머를 선발할 목적으로 압타머를 선발하는 핵산 라이브러리 내로 도입시킨다. 그러나, 핵산 라이브러리 내로의 화학적 치환 도입은 "광범위한" 접근법인데, 여기서, 주어진 종류의 모든 뉴클레오티드는 동시에 치환되어 소기의 목적을 달성할 수도 있다.However, the purpose of increasing characteristics other than nuclease-resistance, eg, target affinity, can be achieved by chemical substitution into the aptamer. Chemical substitutions are introduced into a nucleic acid library that selects aptamers for the purpose of selecting aptamers with various characteristics, for example, increased target affinity. However, the introduction of chemical substitutions into a nucleic acid library is a "broadcast" approach, in which all nucleotides of a given type may be substituted simultaneously to achieve the desired purpose.

특히 압타머는 적은 양으로도 표적분자와 효과적으로 결합하는 성질을 가지고 있어 약학적 유효성분으로 압타머 또는 표적화 운반체를 포함하는 AM은 질병 치료에 다양한 가능성을 가지고 있다. 그러나 압타머는 그 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있다는 문제점이 있다.In particular, the aptamer has the property of effectively binding to the target molecule even in a small amount, so AM containing the aptamer or targeting carrier as a pharmaceutically active ingredient has various possibilities for disease treatment. However, there is a problem that the aptamer has a property of being decomposed in a short time in vivo because its stability is very low.

본 발명은 상기 AM을 특히 양이온성 분자와 접촉시켜 AM을 응축하여 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 핵산을 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와주는 방법을 개발하였다. 뉴클레아제 내성 이외의 AM의 특징을 변경시켜, 예를 들어, 그렇게 하는데 필요한 화학적 치환의 수를 최소화하면서 특정 치료제 및/또는 진단제 기준을 달성하기에 더 유익하다. The present invention has developed a method for protecting the nucleic acid from enzymatic degradation by contacting the AM with a cationic molecule to form particles by condensing the AM, and to quickly penetrate into the cell and escape from the endosome. . Altering characteristics of AM other than nuclease resistance, for example, is more beneficial to achieve specific therapeutic and/or diagnostic criteria while minimizing the number of chemical substitutions required to do so.

따라서, 본 발명은 분자나 입자, 즉 이온성 분자를 이용한 AM 전달체에 관한 것으로, 이들 필요성 및 기타 필요성을 충족시키는 재료 및 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention relates to AM carriers using molecules or particles, i.e., ionic molecules, and provides materials and methods that meet these and other needs.

본 발명의 목적은 압타머 약물(AM)을 전달하는 입자를 생성하는 조성물 및 방법을 제공하는 데 있다. It is an object of the present invention to provide compositions and methods for producing particles that deliver an aptamer drug (AM).

본 발명은 압타머는 그 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있다는 문제점을 해결하는 방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a method for solving the problem that the aptamer has a property of being decomposed in a short time in vivo due to very low stability.

본 발명은 상기 입자에서, 특히 양이온성 분자는 핵산을 압축하여 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 핵산을 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 하는 방법을 제공한다. The present invention provides a method for protecting nucleic acids from enzymatic degradation by forming particles by compressing nucleic acids in the particles, particularly cationic molecules, and rapidly penetrates into cells and exits from endosomes .

본 발명은 최종적으로 환자의 질환 특징 및/또는 환자의 유전자형/표현형에 적합하도록 하는, 치료가 필요한 환자에서 암과 같은 질환 치료는 최적화된 다중의 표적화 분자와 다중의 치료분자로부터 압타머 표적화약물을 제조하여 달성하는 방법을 제공하는 데 있다.The present invention finally provides an aptamer-targeting drug from multiple targeting molecules and multiple therapeutic molecules optimized for treatment of a disease such as cancer in a patient in need of treatment, which is adapted to the patient's disease characteristics and/or the patient's genotype/phenotype It is intended to provide a method of manufacturing and achieving this.

본 발명은 비침습적 방법으로 살아있는 세포나 조직 또는 손상을 가하지 않는 물체를 세포적 분자적 수준에서 생화학적 사건을 실시간으로 시각화하는 방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a method for real-time visualization of biochemical events at the cellular and molecular level in living cells, tissues, or objects that do not inflict damage in a non-invasive manner.

본 발명은 담즙산이 표면 수식된 이온성 분자 및 AM을 포함하되, AM 전달용 입자의 코어에 이온성 분자와 AM의 이온 복합체를 포함하고, 입자의 표면에 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 위치함으로써, 체내에서의 안정성을 향상시킬 수 있으며, 생체 내에서의 독성을 최소화하여 상기한 부작용을 감소시킬 수 있고, 경구 투여와 관련된 장애를 극복하는 방법을 제공하는 데 있다.According to the present invention, a bile acid comprises an ionic molecule and an AM surface-modified, wherein the core of a particle for AM delivery includes an ionic molecule and an ionic complex of AM, and a bile acid having a hydrophilic ionic group is positioned on the surface of the particle. , can improve stability in the body, can reduce the above-mentioned side effects by minimizing toxicity in vivo, and to provide a method for overcoming obstacles related to oral administration.

본 발명은 세포 내에서 목적하는 위치에 AM을 효과적으로 전달할 수 있는 AM 전달용 입자로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 분자 및 AM을 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 AM 전달용 입자를 제공하는 데 있다.The present invention is an AM delivery particle capable of effectively delivering AM to a desired location in a cell, comprising at least one ionic molecule and AM covalently bound to a bile acid or a bile acid derivative, and the covalently bound bile acid or bile acid derivative. is to provide an AM delivery particle having an ionic group.

본 발명의 다른 목적은 음이온성 분자에 표적화 분자를 공유 결합하여 AM의 능동적 약물전달체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an active drug delivery system for AM by covalently binding a targeting molecule to an anionic molecule.

본 발명은 천연 뉴클레오타이드 및 변형 뉴클레오타이드를 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(FAM) 및 약학적 유효성분을 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SAM)으로 구성된 압타머 약물(AM)을 전달하는 입자를 생성하는 조성물 및 방법을 제공하며, The present invention relates to an aptamer drug composed of an aptamer drug (FAM) containing an aptamer composed of natural nucleotides and modified nucleotides and an aptamer drug (SAM) containing an aptamer composed of a pharmaceutically active ingredient. Provided are compositions and methods for producing particles that deliver (AM),

상기 조성물은 AM과 접촉하여 이온성 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 복합체를 형성하는 양이온성 분자를 포함하는 기본입자(10) 및 상기 복합체의 조성물에 추가적으로 상기 형성된 복합체 층 외면에 코팅되고 (-)전하를 띄는 음이온성 분자를 포함하는 응용입자(20)에 대한 성분이며,The composition is coated on the outer surface of the formed complex layer in addition to the composition of the basic particles 10 and the complex comprising cationic molecules that contact the AM and condense the AM through ionic interaction to form a complex (-) It is a component for the applied particle 20 containing anionic molecules with a charge,

상기 방법은 약학적 유효성분으로 하는 AM을 양이온성 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 양이온성 분자는 정전기적 상호작용에 의해 AM을 응축하여 기본입자(10)를 형성하거나, 또는 약학적 유효성분으로 하는 AM을 양이온성 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키고, 상기 양이온성 분자는 정전기적 상호작용에 의해 AM을 응축하여 형성된 복합체 외면을 음이온성 분자를 정전기적 상호작용으로 코팅하여 상기 약물을 포함하는 응용입자(20)를 생성하는 과정을 포함한다.In the method, AM, which is a pharmaceutically active ingredient, is brought into contact with a composition containing a cationic molecule, and the cationic molecule condenses the AM by electrostatic interaction to form basic particles 10, or a pharmaceutically effective The component AM is brought into contact with a composition containing a cationic molecule, and the cationic molecule contains the drug by coating the anionic molecule with an electrostatic interaction on the outer surface of the complex formed by condensing the AM by electrostatic interaction It includes the process of generating the application particle 20 to do.

본 발명에서 압타머 약물(AM)은 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드를 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(FAM) 및 약학적 유효성분을 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SAM)로 구분할 수 있다.In the present invention, the aptamer drug (AM) is an aptamer drug (FAM) comprising an aptamer comprising natural nucleotides and modified nucleotides as a component, and an aptamer drug comprising an aptamer comprising a pharmaceutically active ingredient ( SAM) can be distinguished.

본 발명의 조성물에 인간혈청알부민(HSA), 양친매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 NaCl 및 CaCL2을 포함하는 염을 추가할 수 있으며 양이온 분자 용액에 상기 군에서 어느 하나 이상을 첨가하여 사용할 수도 있다.Human serum albumin (HSA), amphiphilic biopolymers, negatively charged nanoparticles, or salts containing NaCl and CaCL 2 may be added to the composition of the present invention, and any one or more from the above group may be added to the cationic molecule solution. may be

본 발명의 다수의 입자들을 포함하는 조성물이 제공된다.Compositions comprising a plurality of particles of the present invention are provided.

본 발명의 입자가 AM 및 양이온성 분자로 구성된 기본입자 및 음이온성 분자를 포함하는 층을 포함하는 응용입자, 실질적으로 균질한 입자들의 집단을 포함하는 조성물이 제공된다.There is provided a composition comprising an applied particle, a substantially homogeneous population of particles, wherein the particles of the present invention comprise a layer comprising anionic molecules and primary particles composed of AM and cationic molecules.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 생성된 입자의 치료적 유효량을 개체에 투여하고, 이에 의해 암을 치료하는 과정을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.According to the present invention, there is provided a method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of particles produced according to the method of the present invention, thereby treating the cancer.

본 발명의 AM은 압타머(aptamer, Ap) 및 압타머 표적화약물을 포함한다.AM of the present invention includes an aptamer (aptamer, Ap) and an aptamer targeting drug.

압타머는 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한, 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능, 및 탁월한 약동학적 특성을 포함하는 다수의 특징들을 제공한다. 또한, 압타머는 항체에 비하여 특이적인 경쟁상의 장점과, 기타 단백질의 생물학적 특성이 있다. 특히 압타머를 이용한 치료법은 적은 양으로도 표적분자와 효과적으로 결합하는 성질을 가지고 있어 질병 치료에 다양한 가능성을 제공한다. Aptamers provide a number of characteristics, including high specificity and affinity, biological efficacy, and excellent pharmacokinetic properties, which make them desirable for use as therapeutic and diagnostic agents. In addition, aptamers have specific competitive advantages compared to antibodies and biological properties of other proteins. In particular, treatment using aptamers has the property of effectively binding to a target molecule even in a small amount, providing various possibilities for disease treatment.

최종적으로 환자의 질환 특징 및/또는 환자의 유전자형/표현형에 적합하도록 하는, 치료가 필요한 환자에서 암과 같은 질환 치료는 상기 최적화된 다중의 표적화분자(표적분자와 특이적으로 강력하게 결합하는 분자)와 다중의 치료분자로부터 압타머 표적화약물을 제조하여 달성될 수 있다. Treatment of a disease such as cancer in a patient in need of such treatment, finally adapted to the patient's disease characteristics and/or the patient's genotype/phenotype, is the optimized multiple targeting molecule (a molecule that specifically and strongly binds a target molecule) and by preparing an aptamer-targeting drug from multiple therapeutic molecules.

압타머 표적화약물은 i) 고도로 특이적이며, ii) 우수한 효능을 갖고 있고, iii) 통상적으로 선택되는 치료제에 비해 적은 부작용을 유발할 것이다. 이는 치료분자에 예를 들어 그의 의도하는 작용 부위에 대한 치료투여량에 대해 개선된 치료 및/또는 개선된 전달 특성을 부여함으로써 달성될 수 있다.Aptamer-targeting drugs are i) highly specific, ii) have excellent efficacy, and iii) will cause fewer side effects compared to commonly selected therapeutic agents. This may be achieved by conferring the therapeutic molecule with improved therapeutic and/or improved delivery properties, for example for therapeutic doses to its intended site of action.

AM에 방사능 물질, 자성 나노물질이나 형광소재가 결합하거나 부가된 영상소재는 표적화 형광 영상화나 magnetic resonance imaging (MRI)에서 좋은 소재로 제공될 수 있다. 영상소재를 포함하는 AM을 이용한 분자 영상은 비침습적 방법으로 살아있는 세포나 조직 또는 손상을 가하지 않는 물체를 세포적 분자적 수준에서 생화학적 사건을 실시간으로 시각화하는 방법을 제공할 수 있다. Imaging materials in which radioactive materials, magnetic nanomaterials, or fluorescent materials are combined or added to AM can be provided as good materials in targeted fluorescence imaging or magnetic resonance imaging (MRI). Molecular imaging using AM including imaging materials can provide a method for real-time visualization of biochemical events at the cellular and molecular level in living cells, tissues, or non-damaging objects in a non-invasive manner.

그러나 압타머는 그 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있다는 문제점이 있다. 본 발명은 상기 입자들에서, 특히 양이온성 분자는 핵산을 압축하여 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 핵산을 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 하는 방법을 제공한다. However, there is a problem that the aptamer has a property of being decomposed in a short time in vivo because its stability is very low. The present invention provides a method for protecting the nucleic acid from enzymatic degradation by forming particles by compressing the nucleic acid in the particles, particularly the cationic molecule, and rapidly penetrates into the cell to escape from the endosome .

본 발명의 양이온성 분자는 양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 다당류 및 양이온성 지질을 사용할 수 있으며 중량 평균 분자량은 100 내지 100,000인 분자로, 예를 들면 프로타민(Protamine, PS), 키토산(Chitosan, CS), 글리코키토산, 폴리-L-라이신 (PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 키토산, 글리코키토산 또는 PS일 수 있다.Cationic molecules of the present invention can use cationic polypeptides, cationic polysaccharides and cationic lipids, and have a weight average molecular weight of 100 to 100,000, for example, protamine (Protamine, PS), chitosan (Chitosan, CS) , glycochitosan, poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) and polyamidoamine (PAMAM: polyamidoamine) may be selected from the group consisting of, preferably chitosan, glycochitosan or PS.

본 발명의 음이온성 분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 음이온성 지질, 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates)일 수 있다.Anionic molecules of the present invention include heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, carboxymethyl cellulose, pectin, Carbopols, anionic lipids, It may be polyacrylates.

본 발명은 담즙산이 표면 수식된 이온성 분자 및 AM을 포함하되, AM 전달용 입자의 코어에 이온성 분자와 AM의 이온 복합체를 포함하고, 입자의 표면에 친수성의 이온성기를 가지는 담즙산이 위치함으로써, 체내에서의 안정성을 향상시킬 수 있으며, 생체 내에서의 독성을 최소화하여 상기한 부작용을 감소시킬 수 있고, 경구 투여와 관련된 장애를 극복할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.According to the present invention, a bile acid comprises an ionic molecule and an AM surface-modified, wherein the core of a particle for AM delivery includes an ionic molecule and an ionic complex of AM, and a bile acid having a hydrophilic ionic group is positioned on the surface of the particle. , it is possible to improve the stability in the body, it is possible to reduce the above-mentioned side effects by minimizing the toxicity in the body, and to overcome the obstacles associated with oral administration, and completed the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 내에서 목적하는 위치에 치료 AM을 효과적으로 전달할 수 있는 AM 전달용 입자로, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 이온성 분자 및 AM을 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 AM 전달용 입자를 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is an AM delivery particle capable of effectively delivering a therapeutic AM to a desired location in a cell, comprising at least one ionic molecule and AM covalently bound to a bile acid or a bile acid derivative, the covalent bond The proposed bile acid or bile acid derivative is to provide a particle for delivery of AM having an ionic group.

본 발명의 다른 목적은 음이온성 분자에 표적화 분자를 공유 결합하여 AM의 능동적 약물전달체를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide an active drug delivery system for AM by covalently binding a targeting molecule to an anionic molecule.

달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및/또는 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명에서 관행 또는 테스트로 사용되기는 하더라도, 대표적인 방법 및/또는 재료는 하기에 기술되어 있다. 서로 상충되는 경우라면, 정의를 포함하는 본 특허 명세서가 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예시는 단지 설명하는 것일 뿐 이들을 반드시 제한하려는 것은 아니다.Unless defined otherwise, all technical and/or scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein are used in practice or testing in the present invention, representative methods and/or materials are described below. In case of conflict, the present patent specification, including definitions, will control. Also, the materials, methods, and examples are illustrative only and not necessarily limiting.

본 발명은 압타머기반 입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 압타머기반 입자는 다음의 효과가 있다.The present invention relates to an aptamer-based particle and a method for preparing the same. The aptamer-based particles of the present invention have the following effects.

1) 본 발명의 압타머기반 입자는 생체 안정성이 뛰어나서 AM을 이용한 치료제 및 영상소재로 사용될 수 있는 장점이 있다.1) The aptamer-based particles of the present invention have excellent biostability and thus can be used as therapeutic agents and imaging materials using AM.

2) 본 발명의 압타머기반 입자는 AM과 양이온 분자로 구성된 입자에서 AM의 방출을 알부민 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 다로 조절하는 장점이 있다.2) The aptamer-based particles of the present invention have the advantage of controlling the release of AM from the particles consisting of AM and cationic molecules with any one or both selected from the group consisting of albumin and salts.

3) 본 발명의 압타머기반 입자는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체를 포함하고 있어서 경구투여 후 위장관을 안전하게 통과하고 소장말단의 ABST를 통하여 흡수되어 장간순환을 통해 간으로 이동하는 장점이 있다.3) The aptamer-based particles of the present invention contain a taurocholic acid (TCA)-hyaluronic acid (HA) conjugate, so after oral administration, it safely passes through the gastrointestinal tract, is absorbed through the ABST at the end of the small intestine, and enters the liver through the enterohepatic circulation. There are advantages to moving.

4) 본 발명의 압타머기반 입자 중 약학적으로 유효성분으로 하는 압타머 표적화약물은 세포에 대한 표적성을 가지고 있어 AM을 이용한 치료제로 사용될 수 있는 효과가 있다.4) Among the aptamer-based particles of the present invention, the aptamer-targeting drug used as a pharmaceutically active ingredient has a cell-targeting effect and thus can be used as a therapeutic agent using AM.

5) 본 발명의 압타머기반 입자는 독성이 없는 핵단백질인 PS을 사용하여 AM-PS 복합체를 제조하므로 세포독성이 없고 엔도솜 탈출이 원활히 일어나 AM 치료 효과가 뛰어난 장점이 있다.5) Since the aptamer-based particle of the present invention uses PS, which is a non-toxic nuclear protein, an AM-PS complex is prepared, there is no cytotoxicity, and the endosomal escape occurs smoothly, so that the AM treatment effect is excellent.

도 1은 압타머 약물(AM) 입자의 개념도로 기본입자(10)는 상기 AM과 양이온성 분자가 구성하는 복합체(a)이고 응용입자(20)는 상기 AM과 양이온성 분자가 구성하는 기본입자 층(21)과 음이온 분자 외곽층(22)을 포함하는 복합체이다.
도 2는 AM 입자를 제조하는 방법을 도시한 것으로 AM 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 분자로 상기 AM을 코팅하고 추가적으로 음이온성 분자를 2차 코팅하여 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
도 3은 제조한 Prot-TCA의 1H NMR이다.
도 4는 제조한 CS-TCA의 1H NMR이다.
도 5은 TCA, TCA-NPC 및 TCA-NH2에 대한 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다.
도 6은 제조한 HA-TCA의 1H NMR이다.
도 7은 30 ㎍ ApTNF-α, 90 ㎍ PS 및 0~2,000 ㎍의 HSA를 포함한 혼합물의 PCS 측정이고 PDI 등급:(a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. 분류가 없으면 PDI> 0.2 이다.
도 8은 ApTNF-α/PS 기본입자-DW 및 ApTNF-α/PS 기본입자-CM에서 PS의 양에 따른 입자 크기를 PCS 측정한 결과이고 PDI 등급:(a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. 분류가 없으면 PDI> 0.2이다
도 9는 다양한 ApTNF-α/PS 입자에서 제타 전위 측정이고 입자-DW1는 0 ㎍ HSA + 30㎍ ApTNF-α이고, 입자-DW2는 0 ㎍ HSA + 30 ㎍ 변형된 ApTNF-α이고, 입자-DW3는 100㎍ HSA + 30㎍ ApTNF-α 이며, 입자-CM는 1000㎍ HSA + 30㎍ ApTNF-α 이다.
도 10는 제조한 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW에 혼입된 성분의 정량화 결과이다.
도 11은 제조한 ApTNF-α/PS 기본입자가 AM를 봉입한 결과를 보여준다.
도 12는 제조한 ApTNF-α/PS/HA 응용입자의 전기영동 분석 결과이다.
도 13은 제조한 ApTNF-α/PS/HA 응용입자의 사이즈 분포를 나타낸다.
도 14는 제조한 ApTNF-α/PS 기본입자의 TEM 이미지를 보여준다.
도 15은 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자의 TEM 이미지를 보여준다.
도 16은 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자의 혈액내 안정성을 보여준다.
도 17는 제조한 free ApTNF-α와 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자에 대한 RNase 보호분석법 수행결과를 보여준다.
도 18은 pH 및 처리시간에 따른 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자의 크기 안정성 분석 결과를 보여준다.
도 19. ApGemHER2-S-S-DM1(A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(C) 및 ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(D)를 AM으로 하여 제조된 AM/PS/HA-TCA 응용입자에 의한 MDA-MB-453 세포의 생존곡선이다.
도 20. ApGemHER2-S-S-U15-ApFdUEpCAM(E), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(F), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) 및 ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)를 AM으로 하여 제조된 AM/PS/HA-TCA 응용입자에 의한 MDA-MB-453 세포의 생존곡선이다.
도 21는 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자의 담즙산 수용체에 의한 세포 흡수를 확인결과를 보여준다.
도 22는 제조한 AM/PS/HA-TCA 응용입자의 CD44 수용체의 HA에 의한 세포흡수율 및 CLSM 이미지 분석결과를 보여준다. a는 MDA-MB-231 cell의 CLSM image (scale bar = 20 μm)를 보여주며, b는 세포흡수 강도를 보여주며, c는 HepG2 cell의 CLSM 이미지(scale bar = 20 μm)를 보여준다.
도 23은 AM/PS/HA-TCA 응용입자에 의해 세포내로 전달된 AM이 엔도솜으로부터 탈출하여 세포질에 존재하는 것을 확인한 결과를 보여준다.1 is a conceptual diagram of an aptamer drug (AM) particle. The basic particle 10 is a complex (a) composed of the AM and a cationic molecule, and the applied particle 20 is a basic particle composed of the AM and a cationic molecule. It is a complex including a layer (21) and an anion molecular outer layer (22).
Figure 2 shows a method for producing AM particles, focusing on the characteristic that AM itself has an anion, coating the AM with a molecule having a positive charge, and additionally coating an anionic molecule to provide a method for producing particles do.
3 is 1H NMR of the prepared Prot-TCA.
4 is 1H NMR of the prepared CS-TCA.
5 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectra for TCA, TCA-NPC and TCA-NH2.
6 is 1H NMR of the prepared HA-TCA.
7 is a PCS measurement of a mixture containing 30 μg ApTNF-α, 90 μg PS and 0-2,000 μg HSA and PDI grades: (a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. Without classification, PDI > 0.2.
8 is a result of PCS measurement of particle size according to the amount of PS in ApTNF-α/PS basic particle-DW and ApTNF-α/PS basic particle-CM, and PDI grade: (a) PDI ≤ 0.1, (b) PDI ≤ 0.15, (c) PDI ≤ 0.2. Without classification, PDI > 0.2
9 is a measurement of zeta potential in various ApTNF-α/PS particles, particle-DW1 is 0 μg HSA + 30 μg ApTNF-α, particle-DW2 is 0 μg HSA + 30 μg modified ApTNF-α, particle-DW3 is 100 μg HSA + 30 μg ApTNF-α, and particle-CM is 1000 μg HSA + 30 μg ApTNF-α.
10 is a quantification result of components incorporated in the prepared ApTNF-α/PS/HSA particle-DW.
11 shows the result of encapsulating AM in the prepared ApTNF-α/PS basic particles.
12 is an electrophoretic analysis result of the prepared ApTNF-α/PS/HA application particles.
13 shows the size distribution of the prepared ApTNF-α/PS/HA application particles.
14 shows a TEM image of the prepared ApTNF-α/PS basic particles.
15 shows a TEM image of the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA application particles.
16 shows the blood stability of the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA application particles.
17 shows the results of performing an RNase protection assay for the prepared free ApTNF-α and the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA application particles.
18 shows the results of size stability analysis of the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA application particles according to pH and treatment time.
Figure 19. AM ApGemHER2-SS-DM1 (A), ApFdUEpCAM-SS-DM1 (B), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-DM1 (C) and ApFdUEpCAM-SS-DNA box-SS-DM1 (D). This is the survival curve of MDA-MB-453 cells by AM/PS/HA-TCA application particles prepared as
Figure 20. ApGemHER2-SSU 15 -ApFdUEpCAM (E), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-DM1 (F), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-PTX (G), ApGemHER2 -SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-MMAE(H) and ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-MMAF(I) to AM/PS/HA-TCA applied particles prepared as AM This is the survival curve of MDA-MB-453 cells.
21 shows the results of confirming the cell uptake of the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA application particles by bile acid receptors.
22 shows the cell uptake rate by HA of the CD44 receptor and the CLSM image analysis results of the prepared AM/PS/HA-TCA application particles. a shows the CLSM image (scale bar = 20 μm) of MDA-MB-231 cell, b shows the cellular uptake intensity, and c shows the CLSM image of HepG2 cell (scale bar = 20 μm).
23 shows the results of confirming that the AM delivered into the cell by the AM/PS/HA-TCA application particle escapes from the endosome and exists in the cytoplasm.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하어 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through non-limiting examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by the following examples.

본 발명에서 “압타머 약물(AM)”은 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드를 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(FAM) 및 약학적 유효성분을 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SAM)로 구분하였다.In the present invention, “aptamer drug (AM)” refers to an aptamer drug (FAM) comprising an aptamer comprising natural nucleotides and modified nucleotides as a component and an aptamer comprising an aptamer comprising a pharmaceutically active ingredient. Classified by drug (SAM).

본 발명에서 "유효성분"이란 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 질병의 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. In the present invention, the term "active ingredient" includes those having the activity of preventing or treating a disease when the composition is administered to an individual, compared to the case where it is not. The subject may be one or more selected from the group consisting of a mammal, for example, a human, a mouse, a hamster, a dog, a cat, a horse, a cow, a pig, and a goat.

본 발명에서 "서방성 약학 조성물(controlled release pharmaceutical compositions)"이란 용어는 상기 AM를 함유하는 조성물을 의미하는 것으로, 이는 상대적으로 긴 시간동안 상기 AM의 점진적 방출을 제공하게 제조되었다. 그럼으로써, 상기 AM의 농도는 같은 함량의 같은 약물을 함유하는 속방성 조성물보다 더 균일한 농도로 오랜 시간 동안 혈액내에 유지하게 된다. 서방성 약학 조성물은 속방성 약학 조성물과 다른 약학조성물 또는 지연방출성(extended release), 지효성(sustained release), 지연 방출성(delayed release), 서방성(controlled release) 또는 특정 시점에서 펄스-방출성(pulsed-release) 과 같은 것으로 대신할 수 있는 약학 조성물을 의미한다.As used herein, the term "controlled release pharmaceutical compositions" refers to a composition containing the AM, which is formulated to provide a gradual release of the AM over a relatively long period of time. Thereby, the concentration of the AM is maintained in the blood for a long time at a more uniform concentration than the immediate-release composition containing the same amount of the same drug. The sustained-release pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition different from the immediate-release pharmaceutical composition, or has extended release, sustained release, delayed release, controlled release, or pulse-release at a specific time point. (pulsed-release) refers to a pharmaceutical composition that can be substituted for the same.

"서방성 약학 조성물"은 특정 유형의 조성물에 국한되지 않는다. 예를 들면, 하나 이상의 개별 단위를 함유하는 고형의 경구용 약학 조성물과 같은 다양한 유형의 서방성 약학 조성물이 사용될 수 있다. 상기 개별 단위는 과립제, 펠렛, 소형 정제 또는 비즈(bead) 형태일 수 있다. 과립제, 펠렛, 소형 정제 또는 비즈는 캡슐, 봉지 또는 대안으로 정제(tablet)로 압축되어 채워질 수 있다.A “sustained release pharmaceutical composition” is not limited to a particular type of composition. Various types of sustained release pharmaceutical compositions may be used, such as, for example, solid oral pharmaceutical compositions containing one or more individual units. The individual units may be in the form of granules, pellets, small tablets or beads. Granules, pellets, small tablets or beads may be compressed and filled into capsules, sachets or alternatively tablets.

도 1은 본 발명에 의한 AM을 포함하는 기본입자(10) 및 응용입자(20)의 개념도로, 기본입자(10)는 음전하를 갖는 AM과 양이온성 분자가 정전기적 상호작용으로 구성하는 복합체(a)이고 응용입자(20)는 AM과 양이온성 분자가 구성하는 기본입자(10)의 층(21)과 음이온 분자 외곽층(22)을 포함하는 복합체(b)이다.1 is a conceptual diagram of a basic particle 10 and an applied particle 20 containing AM according to the present invention, wherein the basic particle 10 is a complex ( a) and the applied particle 20 is a complex (b) including the layer 21 of the basic particle 10 composed of AM and cationic molecules and the outer layer 22 of the anion molecule.

상기 AM는 압타머 및 압타머 표적화약물로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상이고 선택된 한 종류 이상일 수도 있다.The AM is at least one selected from the group consisting of aptamers and aptamer-targeting drugs, and may be at least one selected type.

상기 AM의 양 말단에 영상소재 및 중성 또는 양이온성 분자로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상이 부착될 수 있다. AM에 영상 소재와 중성 분자인 콜레스테롤이 부착된다면 AM은 압타머의 표적화 기능와 내포한 약학적 유효 성분에 의한 약학적 기능, 영상 소재에 의한 영상화 기능 그리고 콜레스테롤에 의한 핵산의약품의 보호 기능을 동시에 함게 보유할 수 있다.Any one or more selected from the group consisting of an imaging material and a neutral or cationic molecule may be attached to both ends of the AM. If an imaging material and a neutral molecule, cholesterol, are attached to the AM, the AM simultaneously possesses the targeting function of aptamer, the pharmaceutical function by the contained pharmaceutically active ingredient, the imaging function by the imaging material, and the protection function of the nucleic acid drug by cholesterol. can do.

상기 AM는 그 자체로는 인체 내 뉴클레로타이드로 구성된 압타머를 분해시키는 효소에 대해 무방비 상태이기 때문에 그 효능을 온전히 표적 조직 내부로 전달하기 힘들고 신장 여과 기능에 의해 배출되는 문제점이 있다. 따라서 본 발명은 AM을 우수한 약물로 개발하기 위해, 상기 문제점을 극복하는 방법을 하기와 같이 제공하고 있다.Since the AM itself is defenseless against the enzyme that decomposes the aptamer composed of nucleotides in the human body, it is difficult to fully deliver its efficacy into the target tissue, and there is a problem in that it is discharged by the renal filtration function. Therefore, the present invention provides a method for overcoming the above problems in order to develop AM as an excellent drug as follows.

도 2는 본 발명에 의한 AM을 포함하는 입자를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 본 발명에서는 AM 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 분자로 상기 AM을 코팅하여 기본입자(10)를 제조하고 추가적으로 음이온성 분자를 2차 코팅하여 응용입자(20)를 제조하는 방법을 제공한다. 2 shows a method for preparing particles comprising AM according to the present invention. In the present invention, paying attention to the characteristic that AM itself has an anion, the AM is coated with a positively charged molecule to prepare the basic particle 10, and additionally, the anionic molecule is secondary coated to prepare the applied particle 20 provides

좀 더 구체적으로 살펴보면, 상기 양이온성 분자는 상기 AM과 정전기적 상호작용으로 응축된 기본입자(10)를 형성한다.More specifically, the cationic molecules form the basic particles 10 condensed by the electrostatic interaction with the AM.

AM이 n개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있으며 분자당 n-1개의 음전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다.AM consists of n nucleotides and has n-1 negative charges per molecule or 1.8 × 10 25 negative charges per mole.

상기 양이온성 분자에서 대표적인 물질인, 프로타민(PS) 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌(70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 AM과 복합체를 형성하면 PS는 AM 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 PEC(Poly-Electrolyte Complex)라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다.Protamine (PS), a representative material in the cationic molecule, has a molecular weight of 5.8 kDa and is rich in basic amino acids, particularly arginine (70-80%), so that the cation per mole is 1.26 ± 10 25 . Thus, when complexed with AM, PS neutralizes the negative charge of the AM phosphate group. These substances, commonly called Poly-Electrolyte Complexes (PECs), are composed of polymers of biological macromolecules containing groups that can dissociate in water and interact to form charged components.

상기 AM와 양이온성 분자의 전하 비율(charge ratio)이 1:0.4 이상으로 하는 방법을 제공할 수도 있다.A method may be provided in which the AM and the cationic molecule have a charge ratio of 1:0.4 or more.

상기 AM과 PS의 정전기적 상호작용으로 응집하는 기본입자의 상호간의 결합은 AM과 PS 각각의 전하(charge)에 따라 결정되며 본 발명의 입자에서는 상기 AM과 PS (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75일 수 있다.The bond between the basic particles agglomerated by the electrostatic interaction of the AM and PS is determined according to the respective charges of AM and PS, and in the particle of the present invention, the weight ratio of AM and PS (μg/mL) is 30 :15 to 150, preferably 30:15 to 90, more preferably 30:75.

상기 기본입자(10)와 응용입자(20)를 구성하는 상기 복합체에서 AM과 양이온성 분자의 정전기적 상호작용으로 AM의 원만한 방출을 위해 인간혈청알부민(HSB), 양치매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 NaCl 및 CaCl2을 포함하는 염에서 선택된 어느 하나를 사용할 수도 있다.In the complex constituting the basic particle 10 and the applied particle 20, human serum albumin (HSB), amphipathic biopolymer, negatively charged for smooth release of AM due to electrostatic interaction between AM and cationic molecules. Any one selected from the group consisting of nanoparticles or a salt containing NaCl and CaCl 2 may be used.

본 발명에서 제시하는 기본입자(10)에 있어서, AM과의 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 분자를 더 포함한다. 즉 음전하의 AM은 양이온성 분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 분자 내부에 봉입된 이온 복합체를 형성하고, 형성된 이온 복합체는 입자의 코어 부분에 위치한다. In the basic particle 10 presented in the present invention, in order to form an ionic complex with AM, it necessarily further contains a cationic molecule. That is, the negatively charged AM forms an ionic complex enclosed in the cationic molecule due to the electrostatic interaction with the cationic molecule, and the formed ionic complex is located in the core portion of the particle.

상기 AM과 양이온성 분자의 접촉으로 형성되는 기본입자(10)의 층(21)은 강한 양전하를 띠고 있어 세포에 부착력이 증가하고 질환의 병변인 표적 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다. The layer 21 of the basic particles 10 formed by the contact of the AM with the cationic molecule has a strong positive charge, so there is a problem in that adhesion to cells is increased and it is difficult to pass through the target tissue barrier, which is a lesion of a disease.

본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 분자를 사용하여 2차로 상기 양이온성 분자층(21) 외면에 코팅하여 음이온성 분자층(22)을 형성하여 응용입자(20)를 제조할 수 있다.In the present invention, in order to solve this problem, anionic molecules having good biocompatibility and negatively charged are secondarily coated on the outer surface of the cationic molecular layer 21 to form the anionic molecular layer 22 to form the applied particles 20 ) can be prepared.

상기 음이온성 분자층 코팅단계는 음이온성 분자를 넣어 상기 양이온 분자층(21) 외면에 상기 음이온성 분자층(22)을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.The anionic molecular layer coating step is a step of coating the anionic molecular layer 22 on the outer surface of the cationic molecular layer 21 by adding anionic molecules by electrostatic attraction.

상기 기본입자(10)와 응용입자(20)의 조성물 및 제조방법을 자세히 살펴보면 하기와 같다.A detailed look at the composition and manufacturing method of the basic particle 10 and the applied particle 20 is as follows.

먼저, 상기 AM은 압타머, 압타머 표적화약물 및, 압타머 영상소재를 포함한다. First, the AM includes an aptamer, an aptamer-targeting drug, and an aptamer imaging material.

I. 압타머 I. Aptamers

압타머(aptamer, Ap)는 고전적인 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대해 고도의 특이적 결합 친화도를 보이는 핵산 분자이다. 압타머의 제조방법으로는, "SELEX™"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX 방법은 표적 분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 분자의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.Aptamers (Ap) are nucleic acid molecules that exhibit a high degree of specific binding affinity for molecules through interactions other than classical Watson-Crick base pairing. As a method for preparing an aptamer, the "SELEX™" (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method is widely used. The SELEX method relates to the in vitro development of a nucleic acid molecule having high specific binding affinity to a target molecule. to U.S. Patent Application No. 07/536,428 (now abandoned), filed on June 11, 1990, U.S. Patent No. 5,475,096 (titled "Nucleic Acid Ligands"), and U.S. Patent No. 5,270,163 (titled "") Nucleic Acid Ligands").

SELEX 법에서는 라운드 수를 늘리거나, 경합물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압타머가 농축되어, 선별되어 온다. 따라서, SELEX의 라운드 수를 조절하고/하거나 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 다른 압타머, 결합 형태가 다른 압타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 다른 압타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되는데, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 발생시킴으로써 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 수행할 수 있게 된다.In the SELEX method, by increasing the number of rounds or using a competitive material, an aptamer with stronger binding force to the target material is concentrated and selected. Therefore, by adjusting the number of rounds of SELEX and/or changing the competition state, aptamers with different binding strength, aptamers with different binding forms, and aptamers with the same binding force or binding form but different nucleotide sequences may be obtained. . In addition, the SELEX method includes an amplification process by PCR, and in the process, SELEX with more diversity can be performed by generating a mutation by using a manganese ion or the like.

SELEX에서 얻어지는 압타머는 표적분자에 대하여 친화성이 높은 핵산이며, 그것은 표적분자의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 압타머는 반드시 표적분자의 기능에 작용하는 것은 아니다. The aptamer obtained from SELEX is a nucleic acid having high affinity for the target molecule, and it does not mean that it binds to the active site of the target molecule. Therefore, the aptamer obtained from SELEX does not necessarily act on the function of the target molecule.

이와 같이 하여 선택된 활성이 있는 압타머에 기초하여, 보다 높은 활성을 갖는 압타머를 획득하기 위해서 또한 프라이머를 바꿔 SELEX를 행할 수 있다. 구체적인 방법은, 어떤 서열이 정해져 있는 압타머의 일부를 랜덤 서열로 한 주형(template)이나 10∼30% 정도의 랜덤 서열을 도핑한 주형을 제작하여, 재차 SELEX를 행하는 것이다.Based on the aptamer having the activity selected in this way, SELEX can also be performed by changing the primer in order to obtain an aptamer having a higher activity. A specific method is to prepare a template in which a part of an aptamer whose sequence is determined as a random sequence or a template doped with about 10 to 30% of a random sequence, and perform SELEX again.

SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 80개 뉴클레오타이드 정도의 길이로 용이하게 화학 합성을 할 수 있는 50개 뉴클레오타이드 정도 이하의 길이까지 짧게 할 필요가 있다. SELEX에 의해 얻어지는 압타머는 그 프라이머 설계에 따라서, 그후의 최소화 작업 용이성이 결정된다. 프라이머를 설계하지 않으면, SELEX에 의해서 활성이 있는 압타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그후의 개발이 불가능하게 된다. The aptamer obtained by SELEX needs to be shortened to a length of about 80 nucleotides and less than about 50 nucleotides that can be easily chemically synthesized. The aptamer obtained by SELEX is determined by its primer design, and the ease of subsequent minimization work is determined. If the primer is not designed, even if an active aptamer can be selected by SELEX, subsequent development becomes impossible.

SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2차원 및 3차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 임의의 화학적 화합물과 함께(단량체 또는 중합체 상관없이) 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다양성을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. The SELEX method provides that a nucleic acid has sufficient ability to form a variety of two-dimensional and three-dimensional structures, and sufficient capacity to act as a ligand (i.e., to form specific binding pairs) with any chemical compound (whether monomer or polymer). , on the basis of retaining the chemical diversity available within the monomer.

SELEX 방법으로 얻어진 압타머의 표적분자와의 결합에 중요한 부분을, 상기와 같은 시행착오를 반복함으로써 특정할 수 있었던 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하더라도, 많은 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니다. In the case where an important part for binding the aptamer obtained by the SELEX method to the target molecule could be specified by repeating the trial and error as described above, even if a new sequence is added to both ends of the sequence, the activity does not change in many cases. The length of the new sequence is not particularly limited.

압타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 변형이 용이하다. 압타머는 MFOLD 프로그램을 이용하여 이차 구조를 예측하거나, X선 해석이나 NMR 해석에 의해서 입체 구조를 예측함으로써, 어떤 뉴클레오타이드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또 어디에 새로운 뉴클레오타이드를 삽입할 수 있는지 어느 정도 예측할 수 있다. 예측된 새로운 서열의 압타머는 용이하게 화학 합성할 수 있으며, 그 압타머가 활성을 유지하고 있는지 어떤지 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다.Aptamers are easy to modify because they can be chemically synthesized. The aptamer predicts the secondary structure using the MFOLD program or predicts the three-dimensional structure by X-ray analysis or NMR analysis. have. An aptamer of a predicted new sequence can be easily chemically synthesized, and whether the aptamer maintains activity can be confirmed by an existing assay system.

본 발명의 압타머가 표적분자에 결합하여, 표적분자와 다른 물질의 결합을 저해하는 데에 있어서 중요한 부분이지만, 이들 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하더라도, 많은 경우 활성은 변화하지 않는다.Although the aptamer of the present invention is an important part in inhibiting the binding of the target molecule to other substances by binding to the target molecule, even if new sequences are added to both ends of these sequences, the activity does not change in many cases.

본 발명은 또한 소정의 서열(예컨대, 스템 부분, 내부 루프 부분, 헤어핀 루프 부분 및 단일쇄 부분에서 선택되는 부분에 대응하는 서열: 이하, 필요에 따라서 고정서열로 생략함)을 포함하는 압타머를 고도로 설계 또는 변형 가능한 압타머의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides an aptamer comprising a predetermined sequence (e.g., a sequence corresponding to a portion selected from a stem portion, an inner loop portion, a hairpin loop portion, and a single chain portion: hereinafter, abbreviated as a fixed sequence if necessary) A method for preparing a highly designable or deformable aptamer is provided.

상기 압타머는 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한, 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능, 및 탁월한 약동학적 특성을 포함하는 다수의 특징들을 갖는다. 또한, 압타머는 항체에 비하여 특이적인 경쟁 상의 장점과, 기타 단백질의 생물학적 특성, 예를 들어, 하기를 제공한다:The aptamers have a number of characteristics, including high specificity and affinity, biological efficacy, and excellent pharmacokinetic properties, which make them desirable for use as therapeutic and diagnostic agents. Aptamers also provide specific competitive advantages over antibodies and other biological properties of proteins, such as:

1) 속도 및 제어. 1) Speed and control.

압타머는 전적으로 시험관 내 공정에 의해 생성되어, 치료제 리드 (lead)를 포함하는 초기리드의 신속한 생성을 허용한다. 시험관 내 선발은 압타머의 특이성 및 친화성이 엄격하게 제어되게 하며, 독성 및 비-면역원성 표적 둘 모두에 대한 리드를 포함하는 리드의 생성을 허용한다.Aptamers are generated by an entirely in vitro process, allowing rapid generation of initial leads, including therapeutic leads. In vitro selection allows the specificity and affinity of the aptamer to be tightly controlled, and allows generation of reads comprising leads to both toxic and non-immunogenic targets.

2) 독성 및 면역원성. 2) Toxicity and immunogenicity.

압타머는 치료용으로 허용가능한 독성 및 면역원성의 결여가 입증되었다. 다수의 단일클론 항체의 효능은 항체 그 자체에 대한 면역 반응에 의해 심하게 제한될 수 있는 반면, 압타머에 대한 항체를 유도하는 것은 극도로 어려운데, 가장 유망하게는, 이는 압타머가 MHC를 통하여 T-세포에 의해 제시될 수 없고, 면역 반응은 일반적으로 핵산 단편을 인식하지 않도록 훈련되기 때문이다.Aptamers have demonstrated therapeutically acceptable toxicity and lack of immunogenicity. While the efficacy of many monoclonal antibodies can be severely limited by the immune response to the antibody itself, eliciting antibodies to the aptamer is extremely difficult, and most promisingly, it is Because it cannot be presented by the cell, the immune response is usually trained not to recognize nucleic acid fragments.

3) 투여. 3) dosing.

가장 최근에 승인된 항체 치료제는 정맥내 주 (전형적으로 2-4시간에 걸쳐)으로 투여되는 반면, 압타머는 피하 주사로 투여될 수 있다 (피하 투여를 통한 압타머의 생체 이용률은 원숭이 연구에서 >80%이다. 우수한 용해도 (>150 ㎍/mL) 및 비교적 작은 분자량 (압타머: 10-50 kDa; 항체: 150 kDa)에 의해, 0.5 mL 미만의 부피로 매주 용량의 압타머가 주사에 의해 전달될 수도 있다. 또한, 압타머의 작은 크기에 의해 항체 또는 항체 단편이 관통되지 않게 하는 영역으로 압타머가 관통하게 되며, 이는 압타머 기재의 치료제 또는 예방제의 또 다른 장점이다.While the most recently approved antibody therapeutics are administered as an intravenous infusion (typically over 2-4 hours), aptamers can be administered by subcutaneous injection (bioavailability of aptamers via subcutaneous administration is > in monkey studies). With good solubility (>150 μg/mL) and relatively small molecular weight (aptamer: 10-50 kDa; antibody: 150 kDa), a weekly dose of aptamer in a volume of less than 0.5 mL can be delivered by injection. In addition, the small size of the aptamer allows the aptamer to penetrate into a region that does not allow the antibody or antibody fragment to penetrate, which is another advantage of the aptamer-based therapeutic or prophylactic agent.

4) 확장성(scalability) 및 비용. 4) scalability and cost.

치료용 압타머는 화학적으로 합성되며, 따라서 생산 수요를 충족시키기 위하여 필요한 경우 손쉽게 대량생산이 가능하다. 바이오 의약품 생산 확대의 어려움이 현재 몇몇 바이오 의약품의 이용가능성을 제한하고 있다. 대규모 단백질 생산 공장의 자본 비용이 크은 반면, 단일한 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 연간 100 kg 이상을 생산할 수 있으며 상대적으로 작은 규모의 초기 투자금이 필요하다. 킬로그램 규모의 압타머의 합성에서 현재의 상품 원가는 $100/g으로 계산되며, 계속적인 개선에 의해 5년 후에 상품 원가가 <$20/g으로 낮춰지리라 기대된다.Therapeutic aptamers are chemically synthesized and, therefore, can be easily mass-produced if necessary to meet production demands. Difficulty in expanding biopharmaceutical production currently limits the availability of some biopharmaceuticals. While the capital cost of a large-scale protein production plant is high, a single large-scale oligonucleotide synthesizer can produce more than 100 kg per year and requires a relatively small initial investment. In the synthesis of kilogram-scale aptamers, the current product cost is calculated as $100/g, and it is expected that the product cost will be lowered to <$20/g after 5 years by continuous improvement.

5) 안정성. 5) Stability.

치료용 압타머는 화학적으로 강건하다. 치료용 압타머는 본질적으로 열 및 변성제와 같은 요인에의 노출 이후 활성을 회복하도록 개조되며, 실온에서 동결 건조 분말로서 장기간 >(1년) 보관될 수 있다.Therapeutic aptamers are chemically robust. Therapeutic aptamers are essentially adapted to restore activity after exposure to factors such as heat and denaturants, and can be stored for long periods of time >(1 year) as lyophilized powders at room temperature.

또한, 압타머 발견 과정은 리드 변형, 예를 들어, 압타머 서열 최적화 및 압타머 길이의 최소화를 손쉽게 허용한다). 부가적으로, 2' 변형체, 예를 들어, 2'-플루오로 및 2'-0-Me는 압타머의 표적과의 결합 상호작용을 손상시킴이 없이 뉴클레아제에 대한 안정화에 이용될 수 있다.In addition, the aptamer discovery process readily allows for read modification, e.g., aptamer sequence optimization and minimization of aptamer length). Additionally, 2' variants, such as 2'-fluoro and 2'-0-Me, can be used for stabilization against nucleases without impairing the binding interaction of the aptamer with the target. .

특히 압타머를 이용한 치료법은 적은 양으로도 표적분자와 효과적으로 결합하는 성질을 가지고 있어 질병 치료에 다양한 가능성을 가지고 있다. 그러나 압타머는 그 안정성이 매우 낮아서 생체 내에서 단시간에 분해되는 성질을 가지고 있다는 문제점이 있다.In particular, the treatment using an aptamer has the property of effectively binding to a target molecule even in a small amount, so it has various possibilities for disease treatment. However, there is a problem that the aptamer has a property of being decomposed in a short time in vivo because its stability is very low.

상기 분자들에서, 특히 양이온성 분자는 핵산을 압축하여 입자를 형성함으로써 효소 분해로부터 핵산을 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 뉴클레아제 내성 외에도 및/또는 뉴클레아제 내성 이외의 핵산 약물의 특징을 변경시켜, 예를 들어, 그렇게 하는데 필요한 화학적 치환의 수를 최소화하면서 특정 치료제 및/또는 진단제 기준을 달성하는 것이 유익하다. In these molecules, in particular, cationic molecules protect the nucleic acid from enzymatic degradation by compressing the nucleic acid to form particles, and quickly penetrate into the cell and help to escape from the endosome . In addition to nuclease resistance and/or altering the characteristics of a nucleic acid drug other than nuclease resistance, for example, it is beneficial to achieve certain therapeutic and/or diagnostic criteria while minimizing the number of chemical substitutions required to do so. .

II. 압타머 표적화약물II. Aptamer targeting drug

‘압타머 표적화약물’은 표적분자에 결합하는 압타머 및 활성제로 구성된 치료분자로 구성되며 생체내에 투입시 화학적 또는 생화학적 반응을 통하여 생체 질환의 일부 또는 전부를 경감 또는 치유할 수 있거나, 질병의 악화 방지를 시킬 수 있다. An 'aptamer-targeting drug' is composed of a therapeutic molecule composed of an aptamer and an active agent that binds to a target molecule, and can alleviate or cure some or all of a biological disease through a chemical or biochemical reaction when injected into a living body, or It can prevent deterioration.

본 발명은 압타머 및 그것에 결합한 치료분자를 포함하는 압타머 표적화약물을 제공한다. 본 발명의 압타머 표적화약물에서 압타머와 치료분자 사이의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 본 발명의 접합체는 본 발명의 압타머와 1개 이상(예컨대, 2개 또는 3개)의 동종 또는 이종의 활성제로 구성된 치료분자가 결합한 것일 수 있다. 활성제는 본 발명의 압타머에 어떠한 기능을 새롭게 부가하는 것, 또는 본 발명의 압타머가 유지할 수 있는 어떠한 특성을 변화(예컨대, 향상)시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. The present invention provides an aptamer-targeting drug comprising an aptamer and a therapeutic molecule bound thereto. In the aptamer-targeting drug of the present invention, the binding between the aptamer and the therapeutic molecule may be a covalent bond or a non-covalent bond. The conjugate of the present invention may be a combination of the aptamer of the present invention and a therapeutic molecule composed of one or more (eg, two or three) homologous or heterogeneous active agents. The active agent is not particularly limited as long as it can newly add any function to the aptamer of the present invention or change (eg, improve) any property that the aptamer of the present invention can maintain.

상기 압타머 표적화약물이 종양 특이 표적이 되기 위해서 종양세포 표면 항원 및 수용체들은 다음과 같은 특성을 갖추어야 이상적이다. 첫째, 정상세포에서는 발현되지 않고 종양세포에서만 발현되어야 한다. 그러나 실제로는 대부분의 항원들이 정상세포에서도 발현되고 다만 상대적으로 종양세포에서 과발현될 뿐이며 따라서 표적 종양세포 표면에 위치하는 수용체의 밀집도(density)가 중요하다. 둘째, 모든 표적 종양세포에서 균질(homogenous)하게 발현되어야 한다. 그러나 잘 알려진 대로 종양세포들은 조직학적, 유전자적, 분자생물학적으로 이질성(heterogeneity)을 보이기 때문에 같은 종양 내에서도 서로 다른 표현형(phenotype)을 보이는 경우가 많다. 따라서 항원의 발현 역시 균질하지 않다. 마지막으로 혈액 내로 유리되어서는 안 된다. 그런 경우 유리된 항원이 세포표면 항원과 경쟁하여 표적화 접합체와 결합함으로써 약물의 효과를 떨어뜨리게 된다.In order for the aptamer-targeting drug to become a tumor-specific target, tumor cell surface antigens and receptors should ideally have the following characteristics. First, it should be expressed only in tumor cells, not in normal cells. However, in reality, most antigens are expressed in normal cells and only relatively overexpressed in tumor cells. Therefore, the density of receptors located on the surface of target tumor cells is important. Second, it must be expressed homogenously in all target tumor cells. However, as is well known, since tumor cells show histological, genetic, and molecular heterogeneity, they often show different phenotypes even within the same tumor. Therefore, antigen expression is also not homogeneous. Finally, it must not be released into the blood. In such a case, the free antigen competes with the cell surface antigen and binds to the targeting conjugate, thereby reducing the effect of the drug.

A. 표적분자 및 압타머A. Target Molecules and Aptamers

*상기 표적분자는 약물을 전달하고자 하는 표적세포에 특이적인 분자이며, 예를 들면 암세포의 경우 상기 표적 분자는 세포, 암 세포, 암 줄기세포, 또는 암 표적분자로 분자로 표적 지향성을 부여하는 암 특이적 성분을 의미한다. * The target molecule is a molecule specific to a target cell to which a drug is to be delivered. For example, in the case of cancer cells, the target molecule is a cell, cancer cell, cancer stem cell, or cancer target molecule that provides target directivity to the molecule. specific ingredients.

본 발명에서는 표적세포에 특이적인 분자인 표적분자에 특이적으로 결합하는 분자를 표적화분자로 지칭하였다. 대표적인 예로 압타머와 항체일 수 있다.In the present invention, a molecule that specifically binds to a target molecule, which is a molecule specific to a target cell, is referred to as a targeting molecule. Representative examples may be aptamers and antibodies.

대부분의 세포 기반의 질환에서, 수용체 분자의 표적분자 기반 결합을 통한 질환-관련 세포의 표적화는 유망한 접근법 중 하나이다. 그러나, 임상적으로 관련된 표면 수용체(=표적분자)의 발현 수준은 환자마다 변동하며, 따라서 표준화된 표적분자 기반 약물의 효능은 매우 상이하다. 이는 그의 작용 방식이 두가지 상이한 에피토프/수용체를 동시에 표적으로 하는 이중-및 다중 특이적 표적분자에 대해 특이적으로 적용할 수 있음을 의미한다.In most cell-based diseases, targeting of disease-associated cells through target molecule-based binding of receptor molecules is one promising approach. However, the expression level of clinically relevant surface receptors (= target molecules) varies from patient to patient, and thus the efficacy of standardized target molecule-based drugs is very different. This means that its mode of action is specifically applicable to dual- and multi-specific target molecules that simultaneously target two different epitopes/receptors.

따라서, 각 환자의 특별/개별 상황에 특이적인 약물(발명에서, 이종-또는 다중 특이적 표적화분자)을 고안할 수도 있으며 임상적으로 매우 의미가 있을 것이다.Therefore, it is also possible to design drugs (in the present invention, heterologous- or multi-specific targeting molecules) that are specific to the particular/individual situation of each patient and would be very clinically meaningful.

환자의 질환-관련 세포상의 임상적으로 관련된 표면 수용체의 발현 프로파일을 근거로 하여, 일련의 표적분자를 특별하게 선택하여, 환자 특이적 약물로서 특이적 표적화분자에 조합한다. 그러한 선택된 표적분자는, 예컨대 표면 수용체의 발현 수준을 근거로 하여 각 질환-관련 세포, 예컨대 종양 세포에 따라 특정하게 선택된 것으로, 개별 환자의 필요내용 및 표현형을 반영하게 된다.Based on the expression profile of clinically relevant surface receptors on the patient's disease-associated cells, a series of target molecules are specifically selected and combined into specific targeting molecules as patient-specific drugs. Such selected target molecules are specifically selected for each disease-associated cell, such as a tumor cell, eg, based on the expression level of a surface receptor, and reflect the needs and phenotype of the individual patient.

압타머 표적화약물을 구성하는 모듈, 압타머와 치료분자 사이에 스페이서(spacer)를 둘 수도 있다. 압타머 표적화약물을 구성하는 압타머와 치료분자를 조합/연결하는 스페이서의 길이를 변경시킴으로써 선택성 및/또는 특이성 및/또는 효능에 따라 딱 맞는 유연성 및 거리를 선택할 수 있게 해 준다.A module constituting the aptamer-targeting drug, a spacer may be placed between the aptamer and the therapeutic molecule. By changing the length of the spacer that combines/connects the aptamer constituting the aptamer-targeting drug and the therapeutic molecule, it is possible to select the right flexibility and distance according to the selectivity and/or specificity and/or efficacy.

추가로, 페이로드(payload), 예컨대 활성제는 그 페이로드와 링커, 스페이서 또는 부가적인 핵산 가닥에 의해 첨가될 수 있다. 그러한 가능성은 치료적용의 폭을 증대시킨다.Additionally, a payload, such as an active agent, may be added to the payload by a linker, spacer or additional nucleic acid strand. Such possibilities increase the breadth of therapeutic applications.

선별된 환자 특이적 표적분자는 다양한 세포의 시험관내 검정/관련 기준(예를 들어, 최적 결합/결합 파트너, 최적 스페이서 길이, 부가적인 핵산가닥 등)에 대해 분석할 수 있다.Selected patient-specific target molecules can be assayed for in vitro assays/relevant criteria of various cells (eg, optimal binding/binding partner, optimal spacer length, additional nucleic acid strands, etc.).

그러한 접근법으로 매우 효율적인 표적분자의 결정이 가능하다. 그러한 표적분자 및 페이로드는 개선된 표적/전달(예를 들어, 종양 세포에 대한 페이로드)에 의해 부작용을 감소시킬 것이며, 표적 세포에 대한 개선된 표적화는 더 높은 특이성 및 표적 구성성분(두 종류 이상을 압타머를 포함)의 특이성을 근거로 할 수 있다.With such an approach, highly efficient target molecule determination is possible. Such target molecules and payloads will reduce side effects by improved targeting/delivery (eg, payloads to tumor cells), and improved targeting to target cells will result in higher specificity and reduced target components (both types). The above may be based on the specificity of the aptamer).

압타머의 더 높은 선택성 및 특이성은 "오프-표적(off-target)" 결합을 줄여주는 두 개의 압타머들의 조합에 의한 동시적인 결합(결합능)에 기인할 수도 있다.The higher selectivity and specificity of aptamers may be due to simultaneous binding (binding capacity) by the combination of two aptamers, which reduces "off-target" binding.

개체 유래의 각 세포는 발현되는 표면분자, 예컨대 수용체 측면에서 수량 면에서 그리고 종류 면에서 상이하다. 이는 특히 암 세포 및 비-암 세포의 경우에 그러하다. 따라서, 세포는 제시되는 표면분자에 의해 특징화할 수 있다.Each cell from an individual differs in quantity and type in terms of surface molecules expressed, such as receptors. This is particularly the case for cancer cells and non-cancer cells. Thus, cells can be characterized by the surface molecules presented.

특정 질환이 특정 세포표면 분자의 갯수 또는 신규 세표표면 분자의 발생과 연관되어 있을 수 있다. 그러한 질환에 의해 영향받는 개체는 특정 범위 내에 질환 및/또는 개체-특이적 세포 표면 마커 패턴을 표시하게 될 것이다. 이는 그러한 개체에게 표적화된 치료제를 구성하는 표적화분자를 제공하기 위해 고려되어야 할 사항이다. Certain diseases may be associated with the number of specific cell surface molecules or the development of new cell surface molecules. An individual affected by such a disease will display within a certain range a disease and/or individual-specific cell surface marker pattern. This should be considered in order to provide such a subject with a targeting molecule that constitutes a targeted therapeutic agent.

상기 표적화분자는 세포표면에 결합하는 화합물, 항체 또는 펩타이드, 압타머, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표적화분자는 적어도 하나의 표적분자를 포함한다. 다양한 표적화분자가 당업계에 공지되어 있으며, 압타머 표적화약물에 사용될 수 있다. The targeting molecule may be a cell surface-binding compound, antibody or peptide, aptamer, or a combination thereof. The targeting molecule includes at least one targeting molecule. A variety of targeting molecules are known in the art and can be used in aptamer targeting drugs.

상기 압타머 표적화약물이 목표로 하는 세포표면에 결합한 후 세포 내로 유입될 수 있는 장점이 있다.There is an advantage that the aptamer targeting drug can be introduced into the cell after binding to the target cell surface.

세포 내로 잘 유입되지 않는 압타머를 이용하여 압타머 표적화약물을 제조하는 경우 세포표면 또는 바깥 근처에서 약물이 유리되기 때문에 유리된 약물이 세포 내로 유입되지 못하는 경우가 생길 수 있다. 따라서 세포 내로 유입된 후 세포질 내에서 약물이 유리되는 경우에 비하여 세포 내 약물 농도가 낮을 수밖에 없다.When an aptamer-targeting drug is prepared using an aptamer that does not flow well into the cell, there may be a case where the released drug cannot flow into the cell because the drug is released on the cell surface or near the outside. Therefore, the intracellular drug concentration is inevitably lower than when the drug is released from the cytoplasm after being introduced into the cell.

발명에 보고된 특이적 표적분자/압타머는 예를 들어 종양학적 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 염증 질환, 자가면역 질환, 대사성(예를 들어, 내분비) 질환, 또는 신경학적(예를 들어, 신경퇴행적) 질환의 치료를 위한 의약 제조에 이용될 수 있다. Specific target molecules/aptamers reported in the present invention may be, for example, oncological diseases, cardiovascular diseases, infectious diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, metabolic (eg endocrine) diseases, or neurological (eg, neurological) diseases. degenerative) can be used in the manufacture of medicaments for the treatment of diseases.

그러한 질환의 비제한적 예시는, 알츠하이머병, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's ly 입자homas), B-세포 급성 및 만성 림프구 백혈병, Burkitt 림프종, Hodgkin's 림프종, 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 급성 및 만성 골수 백혈병, T-세포 림프종 및 백혈병, 다발성 골수종, 신경교종, Waldenstrom's 마크로글로불린혈증, 암종(예컨대, 구강, 소화관, 대장, 위장, 폐관, 폐, 유방, 난소, 전립선, 뇨관, 자궁내막, 자궁경부, 방광, 췌장, 뼈, 간, 담낭, 신장, 피부 및 고환), 흑색종, 육종, 신경교종 및 피부암, 급성 특발성 혈소판감소성 자반, 만성 특발성 혈소판감소성 자반, 피부근염, 시드남 무도병(Sydenham's chorea), 중증 근무력증, 전신성 루푸스 홍반, 루푸스 신염, 류마티스열, 다선성 증후군, 수포성 유천포창(bullous pe 입자higoid), 당뇨병, 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 사후-연쇄상구균성 신염(post-streptococcal nephritis), 결절성 홍반, Takayasu's 동맥염, 에디슨 질환(Addison's disease), 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증(sarcoidosis), 궤양성 장염(ulcerative colitis), 다형홍반, IgA 신증, 결정성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 강직성 척추염, 굿패스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 폐색성 혈전 혈관염(thromboangitis obliterans), 쇼렌 증후군(Sjogren's syndrome), 원발성 담즙 간경변(primary biliary cirrhosis), 하시모토병(Hashimoto's thyroiditis), 갑상선 중독증(thyrotoxicosis), 경피증(scleroderma), 만성 활동 간염, 다발성근염(polymyositis)/피부근염(dermatomyositis), 다연골염(polychondritis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 막을 형성하는 신증(membranous nephropathy), 근위축성 측색 경화증, 척수로(tabes dorsalis), 거세포 동맥염(giant cell arteritis)/다발성 근육통(polymyalgia), 악성 빈혈, 급속 진행성 사구체신염(rapidly progressive glomerulonephritis), 건선 또는 섬유성 폐렴을 포함한다.Non-limiting examples of such diseases include Alzheimer's disease, non-Hodgkin's ly particle homas, B-cell acute and chronic lymphocytic leukemia, Burkitt's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, hairy cell leukemia, acute and chronic myelogenous leukemia, T-cell lymphoma and leukemia, multiple myeloma, glioma, Waldenstrom's macroglobulinemia, carcinoma (e.g., oral cavity, digestive tract, colon, stomach, pulmonary tract, lung, breast, ovarian, prostate, ureter, endometrium, cervix, bladder, pancreas, bone, liver, gallbladder, kidney, skin and testes), melanoma, sarcoma, glioma and skin cancer, acute idiopathic thrombocytopenic purpura, chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, dermatomyositis, Sidnam's chorea (Sydenham's chorea), myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, rheumatic fever, polyglottic syndrome, bullous pe particle higoid, diabetes, Henoch-Schonlein purpura, post- Post-streptococcal nephritis, erythema nodosum, Takayasu's arteritis, Addison's disease, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, sarcoidosis, ulcerative colitis, erythema multiforme, IgA , polyarteritis nodosa, ankylosing spondylitis, Goodpasture's syndrome, thromboangitis obliterans, Sjogren's syndrome, primary biliary cirrhosis, Hashimoto's disease Hashimoto's thyroiditis, thyrotoxicosis, scleroderma, chronic active hepatitis, polymyositis/dermato myositis, polychondritis, Wegener's granulomatosis, membranous nephropathy, amyotrophic lateral sclerosis, tabes dorsalis, giant cell arteritis/polymyalgia ( polymyalgia), pernicious anemia, rapidly progressive glomerulonephritis, psoriasis or fibrous pneumonia.

수많은 세포 표면 마커 및 그의 리간드가 공지되어 있다. 예를 들어, 암 세포는 하기의 비제한적 예시의 세포 표면 마커 및/또는 리간드 중 하나 이상을 발현하는 것으로 보고된 바 있다: 탄산탈수 효소 IX, 알파-페토프로틴(alpha-fetoprotein), 알파-크티닌(alpha-ctinin)-4, A3(A33 항체에 특이적인 표적분자), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-표적분자, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-l-알파, 대장 특이적 표적분자-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 표적분자, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모막 성선자극 호르몬(chorionic gonadotropin)(HCG) 및 그의 서브유닛, HER2/neu, H㎍B-1, 산소결핍 유도 인자(HIF-1), HSP70-2M, HST-2 or la, IGF-1R, IFN-감마, IFN-알파, IFN-베타, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, 인슐린형 성장 인자-1(IGF-1), KC4-표적분자, KS-1-표적분자, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, 췌장암 뮤신(pancreatic cancer mucin), 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 전립선 산 포스파타아제(prostatic acid phosphatase), PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, 서르비빈(survivin), 서르비빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신(tenascin), TRAIL 수용체, TNF-알파, Tn-표적분자, 톰슨-프리덴리히(Thomson-Friedenreich) 표적분자, 종양 괴사 표적분자, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-1A-표적분자, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, C5, 혈관형성 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, 옹코진(oncogene) 마커 및 옹코진 생성물(참고문헌은, 예를 들어, Sensi 등, Clin. Cancer Res. 12(2006) 5023-5032; Parmiani et al, J. Immunol. 178(2007) 1975-1979; Novellino 등, Cancer Immunol. Immunother. 54(2005) 187-207).Numerous cell surface markers and their ligands are known. For example, cancer cells have been reported to express one or more of the following non-limiting examples of cell surface markers and/or ligands: carbonic anhydrase IX, alpha-fetoprotein, alpha-k. alpha-ctinin-4, A3 (target molecule specific to the A33 antibody), ART-4, B7, Ba-733, BAGE, BrE3-target molecule, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m , CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD1-1A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33 , CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27 , CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-l-alpha, colon-specific target molecule-p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP -1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, folate receptor, G250 target molecule, GAGE, GROB, HLA-DR, HM1.24, human chorionic gonadotropin (chorionic) gonadotropin) (HCG) and its subunits, HER2/neu, HμgB-1, anoxic inducible factor (HIF-1), HSP70-2M, HST-2 or la, IGF-1R, IFN-gamma, IFN- Alpha, IFN-beta, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, insulin-like growth factor-1 ( IGF-1), KC4-target molecule, KS-1-target molecule, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, macrophage migration inhibitory factor (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART- 2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, pancreatic cancer mucin, placental growth factor, p53, PLAGL2, prostatic acid phosphatase, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL -25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, survivin, survivin-2B, TAC, TAG-72, tenascin, TRAIL receptor, TNF-alpha, Tn-target molecule, Thompson- Thomson-Friedenreich target molecule, tumor necrosis target molecule, VEGFR, ED-B fibronectin, WT-1, 17-1A-target molecule, complement factor C3, C3a, C3b, C5a, C5, angiogenesis marker, bcl -2, bcl-6, Kras, cMET, oncogene markers and oncogene products (see, eg, Sensi et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 5023-5032; Parmiani et al, J. Immunol. 178 (2007) 1975-1979; Novellino et al., Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207).

따라서, 특정 세포표면 수용체 및 그의 리간드를 인식하는 압타머가 질환과 관련된 수많은/무리의 세포표면 마커를 특이적으로 그리고 선별적으로 표적화하며 그에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 세포표면 마커는 예를 들어 신호전달 이벤트 또는 리간드 결합과 관련된 세포(예를 들어, 질환-관련 세포)의 표면상에 위치된 폴리펩티드이다.Thus, aptamers that recognize specific cell surface receptors and their ligands can be used to specifically and selectively target and bind to numerous/groups of cell surface markers associated with disease. A cell surface marker is, for example, a polypeptide located on the surface of a cell (eg, a disease-associated cell) involved in a signaling event or ligand binding.

암/종양 치료를 위해 종양-관련 표적분자, 예컨대 [Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", Fleisher 편저, "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347(American Association of Clinical Chemists, 1979)] 및 US 4,150,149; US 4,361,544; 및 US 4,444,744 에 보고된 것과 같은 것을 표적으로 하는 압타머가 사용된다.tumor-associated target molecules for cancer/tumor therapy, such as Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer," eds. Fleisher, "The Clinical Biochemistry of Cancer," page 347 (American Association of Clinical Chemists, 1979) and US Pat. No. 4,150,149; US 4,361,544; and aptamers targeting those reported in US 4,444,744 are used.

종양 관련 표적분자(TAAs) 에 대한 보고서에는, 각각 발명에 식별되는 TAA 와 관련하여 참고문헌으로 포함되는 [Mizukami 등, Nature Med. 11(2005) 992-997; Hatfield 등, Curr. Cancer Drug Targets 5(2005) 229-248; Vallbohmer 등, J. Clin. oncol. 23(2005) 3536-3544; 및 Ren 등, Ann. Surg. 242(2005) 55-63)] 이 포함된다.Reports on tumor-associated target molecules (TAAs) include [Mizukami et al., Nature Med. 11 (2005) 992-997; Hatfield et al., Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005) 229-248; Vallbohmer et al., J. Clin. oncol. 23 (2005) 3536-3544; and Ren et al., Ann. Surg. 242 (2005) 55-63)].

림프종, 백혈병 또는 자가면역 질환과 연관된 질환에서, 표적으로 되는 표적분자은, CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 또는 1a, HM1.24, HLA-DR, 테나신(tenascin), VEGF, P1GF, EDB 피브로넥틴(fibronectin), 옹코진(oncogene), 옹코진 생성물(예를 들어, c-met 또는 PLAGL2), CD66a-d, 괴사 표적분자, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1(DR4) 및 TRAIL-R2(DR5) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In a disease associated with lymphoma, leukemia or autoimmune disease, the targeted target molecule is CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, CXCR4, B7, MUC1 or 1a, HM1.24, HLA-DR, tenascin, VEGF, P1GF, EDB fibronectin, oncogene, oncogene product (eg c-met or PLAGL2), CD66a-d, necrosis target molecule, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) and It may be selected from the group consisting of TRAIL-R2 (DR5).

BCMA/CD3, HER 패밀리의 상이한 표적분자들(EGFR, HER2, HER3) 의 조합, CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-베타/IL-8, IL-6 or IL-6R/ IL-21 또는 IL-21R, Lewis x-, Lewis b-및 Lewis y-구조로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적분자의 글리코에피토프에 대한 제1 특이성, Globo H-구조, KH1, Tn-표적분자, TF-표적분자 및 뮤신(Mucins), CD44, 글리코리피드(glycolipid) 및 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid), 예컨대 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알로테트라오실세라마이드의 탄수화무 구조 및 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB 수용체 타이로신 키나아제에 대한 제2 특이성, 제2 표적분자 결합 부위와 조합되어 있는 GD2 등과 같은 두가지 상이한 표적에 대한 수많은 이중특이적 항체가 공지되어 있으며, T-림프구 NK 세포, B-림프구, 수상 세포, 단핵구, 마크로파지, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c-FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린 및 M 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적분자의 수용성 리간드와의 조합이 VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 및 안지오포이에틴(angiopoietin), ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF 수용체 1/CD3, 및 CD19/CD16 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.BCMA/CD3, a combination of different target molecules of the HER family (EGFR, HER2, HER3), CD19/CD3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL-1-beta/IL-8, IL-6 or IL-6R/ IL-21 or IL-21R, Lewis x-, Lewis b- and Lewis y-structure, first specificity for a glycoepitope of a target molecule, Globo H-structure, KH1, Tn -target molecules, TF-target molecules and mucins, CD44, glycolipids and glycosphingolipids, such as Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, sialotetraosyl Numerous dual targets for two different targets, such as the carbohydrate-free structure of ceramide and a second specificity for an ErbB receptor tyrosine kinase selected from the group consisting of EGFR, HER2, HER3 and HER4, GD2 in combination with a second target molecule binding site Specific antibodies are known, T-lymphocytes NK cells, B-lymphocytes, dendritic cells, monocytes, macrophages, neutrophils, mesenchymal stem cells, neural stem cells, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-beta, vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT3, c-FMS/CSF1R, RET, c-Met, EGFR, Her2/neu, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, integrin and a combination with a water-soluble ligand of a target molecule selected from the group consisting of M particles VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, and angiopoietin (angiopoietin), ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF receptor 1/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/C D3, EGFR/IGF-1R, IL 17A/F, EGF receptor 1/CD3, and CD19/CD16.

압타머는 표적분자와 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있으며, 독특한 3차원 구조를 가진 올리고 핵산를 말한다. 그 자체가 진단 및 치료제로서 쓰여 왔으며, 또한 약물전달체계에서는 선택성을 높이기 위한 특이 리간드로도 사용되었다. An aptamer is an oligonucleotide capable of binding to a target molecule with high specificity and affinity, and having a unique three-dimensional structure. It has been used as a diagnostic and therapeutic agent itself, and has also been used as a specific ligand to increase selectivity in drug delivery systems.

표적화 분자, 대표적인 압타머는 표 1과 같다.Targeting molecules, representative aptamers are shown in Table 1.

압타머의 염기서열과 표적분자Aptamer base sequence and target molecule 압타머 표적분자Aptamer target molecule 압타머의 염기서열(5’ → 3’) Base sequence of aptamer (5' → 3') AMPA receptor GluR2QflipAMPA receptor GluR2Qflip GGGCGAAUUCAACUGCCAUCUAGGCAGUAACCAGGAGUUAGUAGGACAAGUUUCGUCCGGGCGAAUUCAACUGCCAUCUAGGCAGUAACCAGGAGUUAGUAGGACAAGUUUCGUCC CD4 CD4 CUCAGACAGAGCAGAAACGACAGUUCAAGCCGAA CUCAGACAGAGCAGAAACGACAGUUCAAGCCGAA CTLA-4CTLA-4 GGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCCGACGUGCCGCAACUUCAACCCUGCACAACCAAUCCGCCCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGAUCCCCCCGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCCGACGUGCCGCAACUUCAACCCUGCACAACCAAUCCGCCCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGAUCCCCCC EGFR(E07) EGFR (E07) UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCG UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCG GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCp3GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCp3 EGFR(J18) EGFR (J18) GGCGCUCCGACCUUAGUCUCUGCAAGAUAAACCGUGCUAUUGACCACCCUCAACACACUUAUUUAAUGUAUUGAACGGACCUACGAACCGUGUAGCACAGCAGAGGCGCUCCGACCUUAGUCUCUGCCAAGAUAAACCGUGCUAUUGACCACCCUCAACACACUUAUUUAAUGUAUUGAACGGACCUACGAACCGUGUAGCACAGCAGA EGFRvIII(E17) EGFRvIII (E17) ACCAAAAUCAACGCAAAGAGCGCGCCUGCACGUCACCUCA ACCAAAAUCAACGCAAAGAGCGCGCCUGCACGUCACCUCA Erythrocyte membrane protein 1(PfEMP1)Erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) GGGAAUUCGACCUCGGUACCAACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCGUAGCAAGCUCUGCAGUCGGGGAAUUCGACCUCGGUACCAACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCGUAGCAAGCUCUGCAGUCG gp120 gp120 GGGAGACAAGACUAGACGGUGAAUGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCGAUUGGUUUGUUUCCCGGGAGACAAGACUAGACGGUGAAUGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCGAUUGGUUUGUUUCCC HER2HER2 AGCCGCGAGGGGAGGGAAGGGTAGGGCGCGGCTAGCCGCGAGGGGAGGGAAGGGTAGGGCGCGGCT HER3 HER3 GGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAUGUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUCGGGAAUUCCGCGUGUGCCAGCGAAAGUUGCGUAUGGGUCACAUCGCAGGCACAUGUCAUCUGGGCGGUCCGUUCGGGAUCCUC Human keratinocyte growth factorHuman keratinocyte growth factor CCCAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGG CCCAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGG GGGAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGGCAGACGACUCGCCCGAGGGAGGACGAUGCGGUGGUCUCCCAAUUCUAAACUUUCUCCAUCGUAUCUGGGCAGACGACUCGCCCGA L-selectinL-selectin UAACAACAAUCAAGGCGGGUUCACCGCCCCAGUAUGAGUA UAACAACAAUCAAGGCGGGUUCACCGCCCCAGUAUGAGUA Neruotensin-1(NTS-1) Neruotensin-1 (NTS-1) ACAGATACGGAACTACAGAGGTCAATTACGGTGGCCACGC ACAGATACGGAACTACAGAGGTCAATTACGGTGGCCACGC NF-κB NF-κB CAUACUUGAAACUGUAAGGUUGGCGUAUG CAUACUUGAAACUGUAAGGUUGGCGUAUG Phosphatidylcholine: cholesterol liposomesPhosphatidylcholine: cholesterol liposomes GGGAUCUACACGUGACUGACUUACGAGACUGUCUCGCCAAUUCCAGUGGGCCUGCGGAUCCUGGGAUCUACACGUGACUGACUUACGAGACUGUCUCGCCAAUUCCAGUGGGCCUGCGGAUCCU PSMA(A10) PSMA (A10) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACUCGCCCGAGGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCAGACUCGCCCGA Raf-1 Raf-1 GGGAGAUCGAAUAAACGCUCAAUUUGCCUCGACGGUCUGCGAAUAGAACGCGAACCGUGAUUAGUGUACAAGGAUUCGGUUUUCGACAUGAGGCCCCUGCAGGGCGGGGAGAUCGAAUAAACGCUCAAUUUGCCUCGACGGUCUGCGAAUAGAACGCGAACCGUGAUUAGUGUACAAGGAUUCGGUUUUCGACAUGAGGCCCCUGCAGGGCG RET receptor tyrosine kinase RET receptor tyrosine kinase GCGCGGGAATAGTATGGAAGGATACGTATACCGTGCAATCCAGGGCAACG GCGCGGGAATAGTATGGAAGGATACGTATACCGTGCAATCCAGGGCAACG TCF-1 TCF-1 GGGGAGCUCGGUACCGGUGCGAUCCCCUGUUUACAUUGCAUGCUAGGACGACGCGCCCGAGCGGGUACCGAUUGUGUCGUCGGAAGCUUUGCAGAGGAUCGGGGAGCUCGGUACCGGUGCGAUCCCCUGUUUACAUUGCAUGCUAGGACGACGCGCCCGAGCGGGUACCGAUUGUGUCGUCGGAAGCUUUGCAGAGGAUC Tenascin-C Tenascin-C GGGAGGACGCGUCGCCGUAAUGGAUGUUUUGCUCCCUG GGGAGGACGCGUCGCCGUAAUGGAUGUUUUGCUCCCUG TGF-β type III receptor TGF-β type III receptor GGGCCAGGCAGCGAGAGAUAAGCAGAAGAAGUAUGUGACCAUGCUCCAGAGAGCAACUUCACAUGCGUAGCCAAACCGACCACACGCGUCCGAGAGGGCCAGGCAGCGAGAGAUAAGCAGAAGAAGUAUGUGACCAUGCUCCAGAGAGCAACUUCACAUGCGUAGCCAAACCGACCACACGCGUCCGAGA Tumor necrosis factor superfamily member 4-1BBTumor necrosis factor superfamily member 4-1BB GGGAAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCGACCGAACGUGCCCUUCAAAGCCGUUCACUAACCAGUGGCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGUCCCCCCGGGAAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCGACCGAACGUGCCCUUCAAAGCCGUUCACUAACCAGUGGCAUAACCCAGAGGUCGAUAGUACUGGUCCCCCC Tumor necrosis factor superfamily member OX40Tumor necrosis factor superfamily member OX40 GGGAGGACGATGCGGCAGUCUGCAUCGUAGGAAUCGCCACCGUAUACUUUCCCACCAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGAGGGAGGACGATGCGGCAGUCUGCAUCGUAGGAAUCGCCACCGUAUACUUUCCCACCAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA VEGF VEGF CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCG Wilms tumor protein (WT1)Wilms tumor protein (WT1) GAUAUGGUGACCACCCCGGCGAUAUGGUGACCACCCCGGC αvβ3 integrin αvβ3 integrin GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAUUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCCUUCGACAGGAGGCUCACAAAAGGCGGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAUUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCCUUCGACAGGAGGCUCACAAAAGGC β-catenin β-catenin GGACGCGUGGUACCAGGCCGAUCUAUGGACGCUAUAGGCACACCGGAUACUUUAACGAUUGGCUAAGCUUCCGCGGGGAUCGGACGCGUGGUACCAGGCCGAUCUAUGGACGCUAUAGGCACACCGGAUACUUUAACGAUUGGCUAAGCUUCCGCGGGGAUC MUC1(DNA)MUC1 (DNA) GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG EpCAMEpCAM GCGACUGGUUACCCGGUCGGCGACUGGUUACCCGGUCG BAFFBAFF GGGAGGACGAUGCGGGAGGCUCAACAAUGAUAGAGCCCGCAAUGUUGAUAGUUGUGCCCAGUCUGCAGACGACUCGCCCGA′GGGAGGACGAUGCGGGAGGCUCAACAAUGAUAGAGCCCGCAAUGUUGAUAGUUGUGCCCAGUCUGCAGACGACUCGCCCGA′ Endothelial Integrin Alpha-V Beta-3Endothelial Integrin Alpha-V Beta-3 UUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCCUUCAACGCUGUGAAGGGCUUAUACGAGCGGAUUACCC Osteopontin Osteopontin CGGCCACAGAAUGAAAAACCUCAUCGAUGUUGCAUAGUUGCGGCCACAGAAUGAAAAACCUCAUCGAUGUUGCAUAGUUG Receptor Tyrosine Kinase(RET) Mutant(D4)Receptor Tyrosine Kinase (RET) Mutant (D4) GCGCGGGAAUAGUAUGGAAGGAUACGUAUACCGUGCAAUCCAGGGCAACGGCGCGGGAAUAGUAUGGAAGGAUACGUAUACCGUGCAAUCCAGGGCAACG PSMA(A10-3) PSMA (A10-3) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCGGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGC P-SelectinP-Selectin ACGCUCAACGAGCCAGGAACAUCGACGUCAGCAAACGCGAGCGCAACCAGUAACACC'ACGCUCAACGAGCCAGGAACAUCGACGUCAGCAAACGCGAGCGCAACCAGUAACACC' Carcinoembryonic AntigenCarcinoembryonic Antigen GCGGAAGCGUGCUGGGCUAGAAUAAUAAUAAGAAAACCAGUACUUUCGU'GCGGAAGCGUGCUGGGCUAGAAUAAUAAUAAGAAAACCAGUACUUUCGU'

B. 치료분자B. Therapeutic Molecules

압타머 표적화약물은 표적에 결합하는 압타머 및 치료분자를 구성성분으로 설계하여 제조할 수 있다. 상기 제조는 압타머를 중심으로 치료분자를 부가하거나 상기 표적화 약물에 추가적인 압타머와 치료분자를 부가할 수 있다, 상기 치료분자는 단일 치료분자로 구성할 수 있으며 이종 치료분자로 구성될 수도 있다.An aptamer-targeting drug can be prepared by designing an aptamer binding to a target and a therapeutic molecule as components. In the preparation, a therapeutic molecule may be added based on the aptamer, or an additional aptamer and a therapeutic molecule may be added to the targeting drug. The therapeutic molecule may consist of a single therapeutic molecule or may consist of heterogeneous therapeutic molecules.

상기 치료분자는 활성제 치료분자, 표적화 치료분자 및 핵산 치료분자가 있을 수 있다.The therapeutic molecule may include an active therapeutic molecule, a targeting therapeutic molecule, and a nucleic acid therapeutic molecule.

a. 활성제 치료분자a. active therapeutic molecule

상기 활성제 치료분자는 적어도 한 종류의 활성제를 포함한다. 상기 활성제는 치료제, 예방제, 진단제, 또는 영양제일 수 있다. 다양한 활성제가 당업계에 공지되어 있으며, 치료분자에 사용될 수 있다. The active agent therapeutic molecule comprises at least one kind of active agent. The active agent may be a therapeutic agent, a prophylactic agent, a diagnostic agent, or a nutritional agent. A variety of active agents are known in the art and can be used in therapeutic molecules.

상기 활성제는 단백질 또는 펩티드, 뉴클레오시드 유사체, 소분자, 핵산 분자, 지질, 당, 당지질, 당단백질, 지단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 활성제는 항원 또는 보조제, 방사능제 또는 영상 제제(예를 들면, 형광 분자)이다. 상기 활성제는 유기금속 화합물이다.The active agent may be a protein or peptide, a nucleoside analog, a small molecule, a nucleic acid molecule, a lipid, a sugar, a glycolipid, a glycoprotein, a lipoprotein, or a combination thereof. In some embodiments, the active agent is an antigen or adjuvant, a radioactive agent or an imaging agent (eg, a fluorescent molecule). The activator is an organometallic compound.

상기 활성제 치료분자는 활성제일 수 있다. 활성제는 세포에서 전달 및/또는 편재시키고자 하는 활성을 지닌 임의의 분자 또는 분자들의 조합을 가리킨다. 활성제에는, 이에 제한되지 않으나, 표지, 싸이토톡신(예를 들어, 슈도모나스 외독소, 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독소 등), 효소, 성장 인자, 전사인자, 약물, 방사핵종, 리간드, 항체, 항체 Fc-영역, 리포좀, 입자, 바이러스 입자, 싸이토카인 등이 포함된다.The active agent therapeutic molecule may be an active agent. An active agent refers to any molecule or combination of molecules having an activity that is desired for delivery and/or localization in a cell. Active agents include, but are not limited to, labels, cytotoxins (eg, Pseudomonas exotoxin, ricin, abrin, diphtheria toxin, etc.), enzymes, growth factors, transcription factors, drugs, radionuclides, ligands, antibodies, antibody Fc-regions, liposomes, particles, viral particles, cytokines, and the like.

활성제는 프로드러그를 포함하며, 부모 약물에 비해 종양 세포에 대해 더 세포독성이며, 효소적으로 활성화될 수 있거나 또는 더욱 활성인 부모 형태로 변환될 수 있는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 활성제로 사용될 수 있는 프로드러그에는, 이에 제한되지 않으나, 포스페이트-포함 프로드러그, 티오포스페이트-포함 프로드러그, 설페이트-포함 프로드러그, 펩티드-포함 프로드러그, D-아미노산-개질 프로드러그, 글리코실화된 프로드러그, b-락탐 포함 프로드러그, 임의치환된 페녹시아세트아미드-포함 프로드러그 또는 임의치환된 페닐아세트아미드-포함 프로드러그, 5-플루오로싸이토신 및 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 변환될 수 있는 여타 5-플루오로우리딘 프로드러그가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위해 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 발명에 기재된 화학치료제가 포함된다.Active agents include prodrugs, precursors or derivative forms of pharmaceutically active substances that are more cytotoxic to tumor cells than the parent drug and can be enzymatically activated or converted to the more active parent form. refers to Prodrugs that can be used as active agents include, but are not limited to, phosphate-comprising prodrugs, thiophosphate-comprising prodrugs, sulfate-comprising prodrugs, peptide-comprising prodrugs, D-amino acid-modified prodrugs, glycosylated prodrugs. a prodrug, a prodrug comprising b-lactam, an optionally substituted phenoxyacetamide-comprising prodrug or an optionally substituted phenylacetamide-comprising prodrug, 5-fluorocytosine and a more active cytotoxic free drug. Other 5-fluorouridine prodrugs that may be Examples of cytotoxic drugs that can be derivatized into prodrug form for use in the present invention include, but are not limited to, the chemotherapeutic agents described herein.

활성제는 세포 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 모든 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 세포독성 물질을 포함한다. 세포독성제에는, 이에 제한되지 않으나, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사활성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉 세이트, 아드리아미신, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide)), 독소루비신(Doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 여타 인터킬레이트제(intercalating agents)); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항산화제; 독소(toxin), 예컨대 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 예컨대 그의 단편 및/또는 변이체; 및 발명에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.Active agents include cytotoxic substances that inhibit or interfere with cell function and/or cause all cell death or destruction. Cytotoxic agents include, but are not limited to, radioactive isotopes (eg, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu); Chemotherapeutic agents or drugs (e.g., methotrexate, adriamycin, methotrexate, adriamycin, vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin ( Doxorubicin), melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin or other intercalating agents); growth inhibitory agents; enzymes and fragments thereof, such as nucleases; antioxidants; toxins, such as small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, such as fragments and/or variants thereof; and various anti-tumor or anti-cancer agents disclosed in the present invention.

상기 활성제는 항감염제일 수 있다. 특정 치료제는 종양 또는 감염의 확립 또는 성장(전신 또는 국부)을 억제할 수 있다. 예는 붕소-함유 화합물(예를 들면, 카르보란), 화학치료제 뉴클레오타이드, 약물(예를 들면, 항생제, 항바이러스제, 항진균제), 엔다이인(예를 들면, 칼리키아마이신, 에스페라마이신, 다이네미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 및 케다르시딘 발색단), 중금속 착물(예를 들면, 시스플라틴), 호르몬 길항제(예를 들면, 타목시펜), 비특이적(비항체) 단백질(예를 들면, 당 올리고머), 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 표적 핵산 서열(예를 들면, mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), 펩티드, 광동력제(photodynamic agent)(예를 들면, 로다민 123), 방사성핵종(예를 들면, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 및 Cu-64), 독소(예를 들면, 리신), 및 전사 기저 약제를 포함한다. 상기 치료제는 소분자, 방사성핵종, 독소, 호르몬 길항제, 중금속 착물, 올리고뉴클레오타이드, 화학치료제 뉴클레오타이드, 펩티드, 비특이적(비항체) 단백질, 붕소 화합물 또는 엔다이인일 수 있다.The active agent may be an anti-infective agent. Certain therapeutic agents can inhibit the establishment or growth (systemic or local) of a tumor or infection. Examples include boron-containing compounds (eg, carborane), chemotherapeutic nucleotides, drugs (eg, antibiotics, antivirals, antifungals), endoynes (eg, calicheamicin, esperamicin, poly inemisin, neocarzinostatin chromophore, and kedarcidin chromophore), heavy metal complexes (eg, cisplatin), hormone antagonists (eg, tamoxifen), nonspecific (non-antibody) proteins (eg, sugar oligomers) , oligonucleotides (eg, antisense oligonucleotides that bind to a target nucleic acid sequence (eg, mRNA sequence)), peptides, photodynamic agents (eg, rhodamine 123), radionuclides (eg, For example, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 and Cu-64), toxins ( lysine), and transcriptional basis agents. The therapeutic agent may be a small molecule, a radionuclide, a toxin, a hormone antagonist, a heavy metal complex, an oligonucleotide, a chemotherapeutic agent nucleotide, a peptide, a non-specific (non-antibody) protein, a boron compound, or an endoyne.

상기 활성제는 세균 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 치료제는 항생제, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 활성제는 바이러스 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성제는 항생제 화합물, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 활성제는 진균 감염의 확립 또는 성장을 치료또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성제는 항진균 화합물, 방사성핵종 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.The active agent may treat or prevent the establishment or growth of a bacterial infection. The therapeutic agent may be an antibiotic, a radionuclide or an oligonucleotide. The active agent may treat or prevent the establishment or growth of a viral infection, for example, the active agent may be an antibiotic compound, a radionuclide or an oligonucleotide. The active agent may treat or prevent the establishment or growth of a fungal infection, for example, the active agent may be an antifungal compound, a radionuclide or an oligonucleotide.

상기 활성제는 암 치료제일 수 있다. 상기 암 치료제는 사멸 수용체 작용제, 예를 들면, TNF-관련 아포토시스-유도 압타머(TRAIL) 또는 Fas 압타머, 또는 사멸 수용체를 결합 또는 활성화시키거나, 달리 아포토시스를 유도하는 임의의 압타머 또는 항체를 포함할 수 있다. 적합한 사멸 수용체는 TNFR1, Fas, DR3, DR4, DR5, DR6, LTβR 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.The active agent may be a cancer therapeutic agent. The cancer therapeutic agent is a death receptor agonist, such as a TNF-associated apoptosis-inducing aptamer (TRAIL) or Fas aptamer, or any aptamer or antibody that binds or activates a death receptor or otherwise induces apoptosis. may include Suitable death receptors include, but are not limited to, TNFR1, Fas, DR3, DR4, DR5, DR6, LTβR, and combinations thereof.

전형적인 암 치료제, 예를 들면, 화학치료제, 사이토카인, 케모카인 및 방사선 치료제가 활성제로서 사용될 수 있다. 대부분의 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 및 기타 항종양제로 나눌 수 있다. 이들 약물 모두는 몇몇 방식으로 세포 분열 또는 DNA 합성 및 기능에 영향을 미친다. 활성제로서 사용될 수 있는 추가 치료제는 단클론 항체 및 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 이마티닙 메실레이트를 포함하는데, 이는 특정 유형의 암(만성 골수성 백혈병, 위장관 기질 종양)에서 분자 이상을 직접 표적화한다.　Typical cancer therapeutics, such as chemotherapeutic agents, cytokines, chemokines, and radiotherapeutic agents, can be used as active agents. Most chemotherapeutic drugs can be divided into alkylating agents, antimetabolites, anthracyclines, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, and other antitumor agents. All of these drugs affect cell division or DNA synthesis and function in some way. Additional therapeutic agents that can be used as active agents include monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors such as imatinib mesylate, which directly target molecular abnormalities in certain types of cancer (chronic myeloid leukemia, gastrointestinal stromal tumors).

대표적인 화학치료제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 택솔 및 이들의 유도체, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포시드, 에피포도필로톡신, 트라스투주맙, 세툭시맙, 및 리툭시맙, 베바시주맙, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 중 어느 것이라도 접합체에서 활성제로서 사용될 수 있다.Representative chemotherapeutic agents include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mechlorethamine, cyclophosphamide, chlorambucil, vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, taxol and derivatives thereof, irinotecan, topotecan, amsacrine, etoposide, etoposide phosphate, teniposide, epipodophyllotoxin, trastuzumab, cetuximab, and rituximab, bevacizumab, and combinations thereof. Any of these can be used as the active agent in the conjugate.

바람직한, 상기 활성제는 DM1, MMAE, MMAF, 독소루비신, 뉴클레오사이드 치료제, 뉴클레오사이드 유사체 폴리머 일 수 있다.Preferably, the active agent may be DM1, MMAE, MMAF, doxorubicin, a nucleoside therapeutic agent, a nucleoside analog polymer.

b. 표적화 치료분자b. targeted therapeutic molecules

상기 표적화 치료분자는 뉴클레오사이드 치료제를 포함하는 압타머일 수도 있다. 상기 압타머는 활성제 또는 이의 프로드럭을 구성성분으로 하여 제조할 수 있으며, 예를 들면, 상기 표적화-치료분자는 표적화 분자가 압타머이고, 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 치료제가 표적화 분자 압타머의 구성성분의 일부로, 하나 이상의 약물이 탑재된 단일가닥 핵산을 갖는 구조체일 수도 있다. 상기 표적화-치료분자는 뉴클레오사이드 치료제를 표적 세포로 전달하는 기능을 제공할 수 있다.The targeting therapeutic molecule may be an aptamer including a nucleoside therapeutic agent. The aptamer may be prepared using an active agent or a prodrug thereof as a component. For example, in the targeting-therapeutic molecule, the targeting molecule is an aptamer, and the nucleotide and nucleoside therapeutic agent are components of the targeting molecule aptamer. In some cases, it may be a construct having a single-stranded nucleic acid loaded with one or more drugs. The targeting-therapeutic molecule may provide a function of delivering a nucleoside therapeutic agent to a target cell.

상기 표적화 치료분자는 약제적 활성이 있는 뉴클레오시드 유사체를 구성성분으로 하여 제조되는 압타머 표적화 분자로 표적화 능력과 약물 운반 기능을 함께 수행할 수 있다. 상기 분자를 구성하는 약제적 활성이 있는 뉴클레오시드 유사체는 활성이 없으나, 상기 분자가 효소에 의해 분해되면서 방출된 약제적 활성이 있는 뉴클레오시드 유사체는 약제적 활성을 회복될 수 있다. The targeting therapeutic molecule is an aptamer-targeting molecule prepared by using a nucleoside analog having pharmaceutical activity as a component, and may perform both the targeting ability and the drug delivery function. Pharmaceutically active nucleoside analogs constituting the molecule are inactive, but the pharmacologically active nucleoside analogs released as the molecule is decomposed by enzymes can restore pharmaceutical activity.

"뉴클레오시드"는 펜토스(데옥시리보스, 리보스, 아라비노스, 크실로스 또는 리독소) 또는 헥 소스 설탕 잔기에 연결된 질소 함유 염기 잔기(퓨린 또는 피리미딘 염기)를 포함하는 분자를 의미한다. 뉴클레오시드를 형성하는 전형적인 퓨린 또는 피리미딘 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다. "뉴클레오시드"는 선택적으로 치환된 뉴클레오시드, 예를 들어 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. "뉴클레오시드"는 할로겐, 예컨대 불소로 치환된 임의로 치환된 헤테로 사이클릭 및 당 잔기를 갖는 분자를 또한 포함한다."Nucleoside" means a molecule comprising a pentose (deoxyribose, ribose, arabinose, xylose or redoxin) or nitrogen-containing base moiety (purine or pyrimidine base) linked to a hexose sugar moiety. Typical purine or pyrimidine bases that form nucleosides include adenine, guanine, cytosine, 5-methyl cytosine, uracil and thymine. "Nucleoside" includes optionally substituted nucleosides, eg, nucleosides substituted with halogen, eg, fluorine. "Nucleoside" also includes molecules having an optionally substituted heterocyclic and sugar moiety substituted with a halogen such as fluorine.

"뉴클레오시드 유사체"는 상기 정의된 바와 같이 "뉴클레오시드"의 당 및 염기 부분에 독립적으로 또는 함께 개질된 비천연 분자 또는 합성 화합물을 나타낸다. "Nucleoside analog" refers to a non-natural molecule or synthetic compound that has been modified independently or together with the sugar and base moieties of a "nucleoside" as defined above.

"뉴클레오시드 치료제"는 항바이러스, 항균 또는 항암 활성과 같은 입증된 치료학적 또는 약학적 활성을 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 의미한다."Nucleoside therapeutic" means a nucleoside or nucleoside analog having demonstrated therapeutic or pharmaceutical activity, such as antiviral, antibacterial or anticancer activity.

본 발명에서 고려되는 단량체 뉴클레오사이드 치료제는 아데포비어, 시도피비어, 클라드리빈(류스타틴으로도 공지 됨), 시타라빈, 도시플루리딘, 에노시타빈(베노일시토신 아라비 시드로도 공지됨), 플록스우린, 인산 플루다라빈, 젬시타빈 및 펜토스타틴; 바이옥신, 리바비린과 같은 항 바이러스 제제를 포함한다.The monomeric nucleoside therapeutics contemplated in the present invention are adefovir, cidofivir, cladribine (also known as leustatin), cytarabine, dosifluridine, enocitabine (also known as benoylcytosine arabicide). ), floxurin, fludarabine phosphate, gemcitabine and pentostatin; Including antiviral agents such as bioxin and ribavirin.

적합한 뉴클레오사이드 치료제는 하이드록실 그룹과 같은 중합 가능한 잔기를 갖는 것들이다. 예를 들어, 오탄당 부분은 3' 또는 5' 위치에서 히드록실기로 치환될 수 있다. Suitable nucleoside therapeutics are those having a polymerizable moiety such as a hydroxyl group. For example, the pentose moiety may be substituted with a hydroxyl group at the 3' or 5' position.

"무치환 뉴클레오시드"는 당 잔기의 1'-탄소 원자에서 부착된 핵 염기가 없는 뉴클레오시드를 의미한다. 무치환 뉴클레오시드의 당 하이드록실 그룹은 가변적으로 유도체화될 수 있으며, 즉 히드록실기는 에스테르화되거나 목적하는 작용기 또는 보호기로 치환될 수 있다. 적합한 치환기는 C1-35 직쇄 또는 측쇄, 치환 또는 비치환 알콕시 또는 알킬; C3-35 치환 또는 비치환 시클로 알킬 또는 시클로 알콕시; C2-35 치환 또는 비치환 알케닐 또는 알케닐 옥시기; 또는 할로겐. 알콕시, 알킬, 알켄 옥시, 알 케닐, 시클로 알콕시 또는 시클로 알킬기는 하나 이상의 히드록실, 아미노 또는 알콕시기로 치환 될 수 있거나, 또는 탄화수소 사슬에서 하나 이상의 O, N 또는 S 원자로 치환 될 수 있다. 바람직한 알킬기는 치환 또는 비치 환 된 C1-20 알킬기, 보다 바람직하게는 C1-12 알킬기, 예컨대 치환 또는 비치환된 메틸, 에틸 및 이소프로필이다. 바람직한 알콕시기는 치환 또는 비치환된 C1-20 알콕시기 보다 바람직하게는 C1-12 알콕시기, 예컨대 치환 또는 비치환 메톡시, 에톡시 및 이소프로필 옥시이다. 예시적인 치환체는 메 톡시 에틸 및 디메틸 아미노 에틸을 포함한다. 바람직한 알케닐 및 알케닐 옥시 그룹은 2 내지 20 개의 탄소 원자보다 바람직하게는 2 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는다."Unsubstituted nucleoside" means a nucleoside without an attached nucleobase at the 1'-carbon atom of the sugar moiety. The sugar hydroxyl group of an unsubstituted nucleoside can be variably derivatized, i.e., the hydroxyl group can be esterified or substituted with a desired functional group or protecting group. Suitable substituents include C1-35 straight or branched chain, substituted or unsubstituted alkoxy or alkyl; C3-35 substituted or unsubstituted cycloalkyl or cycloalkoxy; C2-35 substituted or unsubstituted alkenyl or alkenyl oxy group; or halogen. An alkoxy, alkyl, alkeneoxy, alkenyl, cycloalkoxy or cycloalkyl group may be substituted with one or more hydroxyl, amino or alkoxy groups, or may be substituted with one or more O, N or S atoms in the hydrocarbon chain. Preferred alkyl groups are substituted or unsubstituted C1-20 alkyl groups, more preferably C1-12 alkyl groups such as substituted or unsubstituted methyl, ethyl and isopropyl. Preferred alkoxy groups are substituted or unsubstituted C1-20 alkoxy groups more preferably C1-12 alkoxy groups such as substituted or unsubstituted methoxy, ethoxy and isopropyl oxy. Exemplary substituents include methoxy ethyl and dimethyl amino ethyl. Preferred alkenyl and alkenyl oxy groups have 2 to 10 carbon atoms rather than 2 to 20 carbon atoms.

"헤테로 사이클릭 유도체"는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체의 유도체를 지칭한다. 예시적인 헤테로시 클릭 유도체는 질소 함유 염기 잔기(퓨린 또는 피리미딘)를 포함하는 기본분자인 "뉴클레오시드 염기"를 포함한다. 이 용어는 임의로 치환된 뉴클레오사이드 염기, 예컨대 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 것들을 포함한다. 치료활성을 갖는 예시적인 헤테로시 클릭 유도체(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘 유도체)는 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 5-플루오로우라실 및 티오구아닌을 포함한다."Heterocyclic derivative" refers to a derivative of a nucleoside or nucleoside analog. Exemplary heterocyclic derivatives include “nucleoside bases,” which are basic molecules comprising a nitrogen-containing base moiety (purine or pyrimidine). The term includes optionally substituted nucleoside bases such as those substituted with halogen, for example fluorine. Exemplary heterocyclic derivatives having therapeutic activity (eg, purine or pyrimidine derivatives) include 6-mercaptopurine, azathioprine, 5-fluorouracil and thioguanine.

본 발명은 약학적으로 비활성인 결합에 의해 연결된 약학적으로 활성인 분자의 사슬로부터 형성된 중합체성 화합물을 포함할 수도 있다. 한 실시 양태에서, 약학적 활성 분자는 2' O-메틸 리보뉴클레오사이드와 같은 뉴클레아제 내성 잔기에 의해 사슬을 따라 분리된 치료모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오사이드 또는 헤테로 사이클릭 유도체이다. 단량체 그룹은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트(R-pO) 그룹에 의해 사슬을 따라 연결될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료적 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오시드 또는 이의 헤테로 사이 클릭 유도체를 포함한다.The present invention may also include polymeric compounds formed from chains of pharmaceutically active molecules linked by pharmaceutically inactive bonds. In one embodiment, the pharmaceutically active molecule is a therapeutic monomeric nucleoside, nucleoside analog, enucleated nucleoside or heterologous nucleoside separated along the chain by a nuclease resistant moiety such as 2' O-methyl ribonucleoside. It is a cyclic derivative. Monomer groups may be linked along the chain by phosphodiester (pO), phosphorothionate or alkyl or alkenyl phosphonate (R-pO) groups. In a preferred embodiment, the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs, enucleated nucleosides or heterocyclic derivatives thereof.

"포스포디에스테르"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는 데 사용되는 결합 -PO4를 의미한다. 발명에서 고려되는 포스포디에스테르 결합("PO")은 자연 발생 DNA에서 발견되는 결합이다. "Phosphodiester" means the bond -PO 4 used to link the nucleoside monomers. A phosphodiester bond (“PO”) contemplated in the present invention is a bond found in naturally occurring DNA.

"포스포로티오에이트"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3(S)를 나타낸다. 포스포로티오에이트 결합은 화학식 4에 나타낸 바와 같이 포스포 에스테르 결합상의 산소 원자 대신 황 원자를 포함한다."Phosphorothioate" refers to the bond -PO 3 (S) used to link the nucleoside monomers. The phosphorothioate bond contains a sulfur atom instead of an oxygen atom on the phosphoroester bond as shown in formula (4).

"H-, 알킬 또는 알케닐 포스포네이트"라는 용어는 뉴클레오시드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 탈핵 뉴클레오 사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3R-를 말한다. H-포스포네이트 결합은 상술한 포스 포디에스테르 결합과 같이 산소 원자 대신에 인에 결합된 수소 원자를 함유한다. 알킬 포스포네이트 결합(R-pO)은 산소 원자 대신 인 원자에 결합된 탄소 원자를 함유한다. 적합한 알킬기는 C1-35 선형 또는 분 지형 사슬 알킬기, 바람직하게는 C1-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알킬이다. 적합한 알 케닐 그룹은 C2-35 선형 또는 분지형 사슬 알케닐, 바람직하게는 C2-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알케닐이다.The term "H-, alkyl or alkenyl phosphonate" refers to the bond -PO 3 R- used to link the nucleoside, nucleoside analog or enucleated nucleoside monomer. The H-phosphonate bond contains a hydrogen atom bonded to phosphorus instead of an oxygen atom like the phosphodiester bond described above. An alkyl phosphonate bond (R-pO) contains a carbon atom bonded to a phosphorus atom instead of an oxygen atom. Suitable alkyl groups are C1-35 linear or branched chain alkyl groups, preferably C1-20, more preferably C1-5 linear or branched alkyl. Suitable alkenyl groups are C2-35 linear or branched chain alkenyl, preferably C2-20, more preferably C1-5 linear or branched chain alkenyl.

본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.The present invention relates to polynucleotide compounds formed from chains of phosphodiester (pO), phosphorothionate or pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleosides or nucleoside analogs linked by H- or alkyl or alkenyl phosphonates. it's about In a preferred embodiment, the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.

혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오네이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. 포스포로티오네이트 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 PS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다. Polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothionate linkages are contemplated. Oligomers with phosphorothionate linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and consequently PS oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages.

*본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분(예컨대, 탈회 2' O-메틸 뉴클레오시드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기(예컨대, 무-염기성 2' O-메틸 뉴클레오시드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.* The present invention uses alternating chains of therapeutically active nucleosides or nucleoside analogs and nuclease resistant moieties (eg, demineralized 2' O-methyl nucleosides) to control the release rate of nucleoside therapeutics. It is contemplated to form polynucleotides containing the ability to modulate. The structure of alternating segments of a therapeutically active nucleoside or nucleoside analog and a nuclease resistant moiety (eg, a basic free 2' O-methyl nucleoside) can be modified to achieve the desired release of the therapeutic agent. .

상기 표적화-치료분자는 약물의 활성 대사물이 도입된 올리고뉴클레오타이드 화합물을 지칭할 수도 있다. 약물의 활성 대사물에는 겜시타빈 트리포스페이트(dFdCTP)와 5-플루오로 우라실(5-FU)와 5-F-2'-UTP 트리 포스페이트(5FdUTP) 등의 단량체 뉴클레오사이드 치료제가 포함될 수 있다. The targeting-therapeutic molecule may also refer to an oligonucleotide compound into which an active metabolite of a drug has been introduced. Active metabolites of the drug may include monomeric nucleoside therapeutics such as gemcitabine triphosphate (dFdCTP) and 5-fluorouracil (5-FU) and 5-F-2'-UTP triphosphate (5FdUTP).

약물의 활성 대사물인 dFdC 입자와 5FdU 입자는 압타머에 유기합성 또는 효소적으로 도입할 수 있다. 또는 상기 단량체 뉴클레오사이드 치료제를 구성성분으로 제조되는 폴리머가 압타머의 말단에 연결될 수 도 있다. dFdC particles and 5FdU particles, which are active metabolites of drugs, can be introduced organically or enzymatically into the aptamer. Alternatively, a polymer prepared as a component of the monomeric nucleoside therapeutic agent may be linked to the end of the aptamer.

상기 표적화 치료분자에 영상소재, 또는 이온화 소재로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 부착할 수 있다.Any one or more selected from the group consisting of an imaging material or an ionizing material may be attached to the targeting therapeutic molecule.

c. 핵산 치료분자c. Nucleic Acid Therapeutic Molecules

<올리고뉴클레오타이드 치료분자><Oligonucleotide therapeutic molecule>

"뉴클레오타이드"는 탄소, 수소, 산소 및 질소(피리미딘 또는 퓨린), 펜토오스(데옥시리보스, 리보스, 아라비노스)로 이루어진 고리형 질소 함유 염기(아글리콘으로도 알려짐), 키실로오스 또는 리독소) 또는 육당 당 부분과 인산기(아인산)를 포함한다."Nucleotide" means a cyclic nitrogen-containing base (also known as aglycone) consisting of carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen (pyrimidine or purine), pentose (deoxyribose, ribose, arabinose), xylose or lysine. toxin) or a hexose sugar moiety and a phosphate group (phosphorous acid).

"올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 화합물의 사슬을 지칭하며, "중합체", "올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고"라는 용어와 상호 교환 가능하게 사용된다. "올리고머"는 출발 올리고뉴클레오타이드에 비례하여 점차적으로 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 올리고머는 올리고뉴클레오타이드의 부분적인 분해 또는 절단의 결과로서 시험관내 및 생체 내에서 생성될 수 있다. 바람직하게, “올리고뉴클레오타이드 치료제”는 압타머, siRNA, decoy 와 안티센스을 포함하는 핵산 약물은 다양한 방법으로 단량체가 연결되는 형태일 수 있다. "Oligonucleotide" refers to a chain of nucleotides and nucleoside compounds and is used interchangeably with the terms "polymer", "oligonucleotide" and "oligo". "Oligomer" refers to an oligonucleotide of progressively shorter length relative to the starting oligonucleotide. Oligomers can be generated in vitro and in vivo as a result of partial degradation or cleavage of oligonucleotides. Preferably, the “oligonucleotide therapeutic agent” may be a nucleic acid drug including an aptamer, siRNA, decoy, and antisense, in which monomers are linked in various ways.

핵산 치료분자는 약학적 효능이 있는 올리고뉴클레오타이드로부터 제조하는, 올리고뉴클레오타이드 치료분자 각각 하나 이상의 관능기가 있어 용이하게 효소합성 또는 화학 합성을 할 수 있다. Nucleic acid therapeutic molecules are prepared from oligonucleotides with pharmaceutical efficacy, and each of the oligonucleotide therapeutic molecules has one or more functional groups, so that it can be easily synthesized by enzymatic or chemical synthesis.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 활성제는 압타머, siRNA, decoy 와 안티센스을 포함하는 핵산 약물로 하기의 다양한 방법으로 연결할 수 있다. 핵산 약물 사이에 스페이서(spacer)가 있을 수 있으며 다양한 방법으로 단량체가 연결되는 형태일 수 있다. The oligonucleotide activator of the present invention can be linked to a nucleic acid drug including an aptamer, siRNA, decoy and antisense by the following various methods. There may be a spacer between the nucleic acid drugs, and the monomer may be linked in various ways.

"호모 폴리머"는 뉴클레오타이드 및 링커가 모두 동일한 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 단일 중합체 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서, HO-[dN-PO2X]n-OH는 각 뉴클레오타이드 "dN"및 각 X가 동일하다.A “homopolymer” refers to a polynucleotide compound in which both the nucleotide and the linker are identical. Thus, in the homopolymer polynucleotide prodrug of the present invention, HO-[dN-PO 2 X]n-OH is equal to each nucleotide “dN” and each X is identical.

"헤테로 폴리머"는 뉴클레오타이드 또는 링커의 각각이 동일하지 않은 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 헤테로 폴리머 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서 HO-[dN-PO2X]n-OH는 뉴클레오타이드 "dN"또는 결합 "PO2X"가 사슬을 따라 상이하다."Heteropolymer" refers to a polynucleotide compound in which each of the nucleotides or linkers is not identical. Thus, in the heteropolymer polynucleotide prodrug of the present invention, HO-[dN-PO 2 X]n-OH has different nucleotide “dN” or bond “PO 2 X” along the chain.

본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.The present invention relates to polynucleotide compounds formed from chains of phosphodiester (pO), phosphorothionate or pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleosides or nucleoside analogs linked by H- or alkyl or alkenyl phosphonates. it's about The chain contains 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.

혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. 포스포로티오네이트 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 포스포로티오네이트 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다. Polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothioate linkages are contemplated. Oligomers with phosphorothionate linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and as a result, phosphorothionate oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages.

본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분(예컨대, 탈회 2' O-메틸 뉴클레오시드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기(예컨대, 무-염기성 2' O-메틸 뉴클레오시드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.The present invention uses alternating chains of therapeutically active nucleosides or nucleoside analogs and nuclease resistant moieties (eg, demineralized 2' O-methyl nucleosides) to modulate the release rate of nucleoside therapeutics. It is contemplated to form polynucleotides containing the ability to The structure of alternating segments of a therapeutically active nucleoside or nucleoside analog and a nuclease resistant moiety (eg, a basic free 2' O-methyl nucleoside) can be modified to achieve the desired release of the therapeutic agent. .

본 발명의 치료분자는 압타머로 특정 표적으로 약물을 전달할 수 있으며, 예를 들면 압타머의 표적분자가 HER2인 경우, HER2 수용체가 과발현되어 있는 암세포에 선택적으로 약물을 전달하는 표적 지향형 치료분자를 제공하는 것이다.The therapeutic molecule of the present invention can deliver a drug to a specific target as an aptamer, for example, when the target molecule of the aptamer is HER2, it provides a target-oriented therapeutic molecule that selectively delivers the drug to cancer cells in which the HER2 receptor is overexpressed will do

상기 핵산치료분자는 표적화 분자 압타머 및 핵산 신약으로 구성될 수 있으며 핵산약물을 표적 세포로 운반하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 핵산치료분자는 (i) 상기 핵산약물은 RNA 간섭 타겟 RNA에 상보적이며 다른 가닥은 RNA 간섭 타겟 RNA와 동일한 것으로 이루어진 이중 가닥 RNA 절편을 포함하는 RNA 분자; (ii) 표적세포의 분자에 특이적으로 결합하는 압타머; 및 (iii) 상기 구성성분 사이에 잇는 링커를 포함하며, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 세포에서 RNA 간섭을 일으킨다. 바람직하게는, 상기 이중 가닥 RNA 절편은 siRNA이다.The nucleic acid therapeutic molecule may be composed of a targeting molecule aptamer and a new nucleic acid drug, and may provide a method for delivering a nucleic acid drug to a target cell. The nucleic acid therapeutic molecule comprises (i) an RNA molecule comprising a double-stranded RNA fragment, wherein the nucleic acid drug is complementary to the RNA interference target RNA and the other strand is identical to the RNA interference target RNA; (ii) an aptamer that specifically binds to a molecule of a target cell; and (iii) a linker between the components, wherein the double-stranded RNA fragment causes RNA interference in the cell. Preferably, the double-stranded RNA fragment is siRNA.

본 명세서에서 사용되는 용어 “이중 가닥(double stranded) RNA” 또는 “dsRNA”는 이중 가닥으로 구성된 RNA 분자를 의미한다. 이중-가닥 분자는 두-가닥(two-stranded) 구조를 형성하기 위해 그 자체로 이중 골격을 형성하는 단일 RNA 분자로 이루어진 분자를 포함한다. 예를 들어, 단일-가닥 miRNA를 만드는 선구 분자(premiRNA)의 스템-루프 구조는 dsRNA 분자를 포함한다.As used herein, the term “double stranded RNA” or “dsRNA” refers to an RNA molecule composed of double strands. Double-stranded molecules include molecules consisting of a single RNA molecule that itself forms a double backbone to form a two-stranded structure. For example, the stem-loop structure of a precursor molecule (premiRNA) that makes a single-stranded miRNA includes a dsRNA molecule.

본 명세서에서 사용되는 용어 “RNA 간섭-유도 분자(RNA interference inducing molecule)” 또는 “RNAi 분자” 또는 “RNAi 인자”는 RNA-매개된 타겟 전사체 분해 또는 RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 이중 가닥 RNA 같은 RNA 분자를 의미한다는 점에서 상호 교환되어 사용된다. As used herein, the term “RNA interference inducing molecule” or “RNAi molecule” or “RNAi factor” refers to inhibiting gene expression of a target gene through RNA-mediated degradation of the target transcript or RNA interference. They are used interchangeably in the sense that they refer to RNA molecules, such as double-stranded RNA, that function as

다른 방식에 따른 기술에서, RNA 간섭-유도 분자는 타겟 유전자의 유전자 사일런싱을 유도한다. RNA 간섭-유도 분자의 전체적인 효능은 타겟 유전자의 유전자 사일런싱이다. siRNA에서 이용되는 RNA 간섭-유도 분자 같은 이중-가닥 RNA는 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 DNA와는 다른 특징을 가진다. 대부분 각 핵산들은 세포에서 중첩되지 않은 결합 단백질들에 의해 결합되고 중첩되지 않은 뉴클레아제에 의해 분해된다. 모든 세포의 핵 게놈은 DNA-기반이며 자가면역 질환을 제외하고는 그 자체로 면역 반응을 유발하지 않는 것 같다. In a technique according to another scheme, the RNA interference-inducing molecule induces gene silencing of the target gene. The overall efficacy of RNA interference-inducing molecules is gene silencing of target genes. Double-stranded RNA, such as RNA interference-inducing molecules used in siRNA, has different characteristics from single-stranded RNA, double-stranded DNA, or single-stranded DNA. Most of the individual nucleic acids are bound by non-overlapping binding proteins and degraded by non-overlapping nucleases in the cell. The nuclear genome of all cells is DNA-based and does not appear to elicit an immune response by itself, except in autoimmune diseases.

단일-가닥 RNA(ssRNA)는 DNA 전사의 산물로서 또한, RNA 간섭이 타겟 서열과 완벽하게 일치해야만 일어나는 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다. 하지만, siRNA의 안티센스(가이드) 가닥의 5' 및 중간 부분이 타겟 핵산 서열과 완전히 상보적인 것이 바람직하다.It is well known that single-stranded RNA (ssRNA) is a product of DNA transcription, and that RNA interference does not have to be perfectly matched to the target sequence. However, it is preferred that the 5' and middle portions of the antisense (guide) strand of the siRNA are completely complementary to the target nucleic acid sequence.

RNA 간섭-유도 분자는 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드, 천연 리보오스 당 또는 변형된 당, 및 천연 또는 변형된 포스페이트 골격(backbone)을 가지는 RNA 분자를 포함한다.RNA interference-inducing molecules include RNA molecules having natural or modified nucleotides, natural ribose sugars or modified sugars, and natural or modified phosphate backbones.

따라서, 본 명세서에서 언급된 RNA 간섭-유도 분자는 짧은-일과성 RNA(short-temporal RNA, stRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA)을 포함하는 변형되지 않은 이중 가닥 RNA 분자 및 변형된 이중 가닥 RNA 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다(참조: Baulcombe, Science, 297: 2002-2003(2002)). 또한, dsRNA 분자(예: siRNA)는 3'-오버행을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3'UU-또는 3'TT-오버행을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 약 30-40 염기보다 큰 ssRNA, 약 40-50 염기보다 큰 ssRNA 또는 50 염기보다 큰 ssRNA를 포함하는 RNA 분자를 포함하지 않는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 이중 가닥 구조를 가진다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 분자 길이의 약 25% 이상의 부위, 약 50% 이상의 부위, 약 60% 이상의 부위, 약 70% 이상의 부위, 약 80% 이상의 부위 또는 약 90% 이상의 부위가 이중 가닥이다.Thus, the RNA interference-inducing molecules referred to herein are short-temporal RNA (stRNA), small interfering RNA (siRNA), short-hairpin RNA (shRNA), micro RNA (miRNA) or double-stranded unmodified double-stranded RNA molecules, including RNA (dsRNA), and modified double-stranded RNA molecules (Baulcombe, Science, 297: 2002-2003 (2002)). In addition, the dsRNA molecule (eg, siRNA) may include a 3'-overhang, preferably a 3'UU- or 3'TT-overhang. According to one embodiment of the present invention, siRNA molecules of the present invention do not contain RNA molecules comprising ssRNA greater than about 30-40 bases, ssRNA greater than about 40-50 bases or ssRNA greater than 50 bases. According to the present invention, the siRNA molecule of the present invention has a double-stranded structure. According to the present invention, the siRNA molecule of the present invention has at least about 25% of the molecule length, at least about 50% of the site, at least about 60% of the site, at least about 70% of the site, at least about 80% of the site, or at least about 90% of the site. It is double stranded.

또한, 본 명세서에서 기술한 바와 같이 본 발명의 RNA 간섭은 하나 이상의 비-천연(non-natural) 뉴클레오타이드(즉 아데노신 "A", 구아닌 "G", 우라실 "U" 또는 사이토신 "C"를 제외한 뉴클레오타이드), 변형된 뉴클레오타이드 잔기 또는 천연 뉴클레오타이드의 유도체 또는 유사체를 가지는 RNA 분자를 포함한다. diRNA의 RNAi 활성을 (적어도 50% 이상) 제거하지 않거나 또는 실질적으로 감소시키는 범위에서 어떠한 변형된 잔기, 유도체 또는 유사체가 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 형태는 아미노알릴 UTP, 슈도-UTP, 5-I-UTP, 5-I-CTP, 5-Br-UTP, 알파-S ATP, 알파-S CTP, 알파-S GTP, 알파-S UTP, 4-티오 UTP, 2-티오-CTP, 2'NH2 UTP, 2NH2 CTP 및 2'F UTP를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 모든 다른 유용한 형태의 뉴클레오타이드를 포함하여, 그러한 변형된 뉴클레오타이드는 아미노알릴 우리딘, 슈도 우리딘, 5-I-우리딘, 5-I-사이티딘(cytidine), 5-Br-우리딘, 알파-S 아데노신, 알파-S 사이티딘, 알파-S 구아노신, 알파-S 우리딘, 4-티오 우리딘, 2-티오-사이티딘, 2'NH2 우리딘, 2'NH2 사이티딘 및 2' F 우리딘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, as described herein, the RNA interference of the present invention is excluding one or more non-natural nucleotides (ie, adenosine "A", guanine "G", uracil "U" or cytosine "C"). nucleotides), modified nucleotide residues, or RNA molecules having derivatives or analogs of natural nucleotides. Any modified residue, derivative or analog may be used to the extent that it does not eliminate (at least 50% or more) or substantially reduces the RNAi activity of the diRNA. Thus, these forms are aminoallyl UTP, pseudo-UTP, 5-I-UTP, 5-I-CTP, 5-Br-UTP, alpha-S ATP, alpha-S CTP, alpha-S GTP, alpha-S UTP , 4-thio UTP, 2-thio-CTP, 2'NH2 UTP, 2NH2 CTP and 2'F UTP. Such modified nucleotides, including all other useful forms of nucleotides, are aminoallyl uridine, pseudouridine, 5-I-uridine, 5-I-cytidine, 5-Br-uridine, alpha- S adenosine, alpha-S cytidine, alpha-S guanosine, alpha-S uridine, 4-thiouridine, 2-thio-cytidine, 2'NH2 uridine, 2'NH2 cytidine and 2' F uridine including, but not limited to, Dean.

본 명세서에서 언급되는 RNA 간섭 인자는 뉴클레오타이드 체인의 “포스페이트 골격(phosphate backbone)” 상의 변형 뿐 아니라, 리보오스 당의 변형을 포함하는 RNA 분자를 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따르면 RNA에서 발견되는 자연적으로-발생하는(naturally-occurring) α-D-리보뉴클레오사이드를 대신해서 α-아라비노퓨라노실 구조를 포함하는 siRNA 또는 miRNA 분자가 RNA 간섭에 이용될 수 있다(미국 특허번호 제5,177,196호). 또 다른 예는 뉴클레아제 저항성을 수여하는 뉴클레오사이드의 당 및 헤테로사이클릭 염기 간의 o-결합(o-linkage), 및 2'-O-메틸 리보오스, 아라비노오스 및 특히 α-아라비노오스를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 유사한 올리고뉴클레오타이드 분자에 강하게 결합하는 상보적인 가닥을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 또한, siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages)이 이용될 수 있다(미국 특허번호 제5,177,196호). 3'-또는 5'-말단, 또는 양 말단에 공유결합으로 접합(attach)된 다양한 “꼬리(tails)”를 가지는 siRNA 및 miRNA 분자들도 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법을 이용하여 운반된 siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, RNA 분자의 3'-또는 5'-말단에 접합된 인터칼레이팅 군(intercalating groups), 다양한 리포터군 및 친유성 군(lipophilic groups)은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본 발명의 방법에 따라 유용하다. 본 발명에 따라 변형된 RNA 분자의 제조에 유용하게 적용할 수 있는 3'-콜레스테롤 또는 3'-아크리딘 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대한 기술은 다음 논문에서 발견할 수 있다.The RNA interference factor referred to herein additionally includes an RNA molecule comprising a modification of a ribose sugar as well as a modification on the “phosphate backbone” of a nucleotide chain. For example, according to the present invention, an siRNA or miRNA molecule comprising an α-arabinofuranosyl structure in place of a naturally-occurring α-D-ribonucleoside found in RNA is RNA It can be used for interference (U.S. Patent No. 5,177,196). Another example is the o-linkage between the sugar and heterocyclic bases of nucleosides that confers nuclease resistance, and 2'-0-methyl ribose, arabinose and especially α-arabinose. RNA molecules comprising a complementary strand that bind strongly to an oligonucleotide molecule similar to an oligonucleotide comprising a. In addition, phosphorothioate linkages can be used to stabilize siRNA and miRNA molecules (US Pat. No. 5,177,196). siRNA and miRNA molecules having various “tails” covalently attached to the 3'- or 5'-terminus, or both ends, are also well known in the art, and can be used using the method of the present invention. It can be used to stabilize delivered siRNA and miRNA molecules. In general, intercalating groups, various reporter groups and lipophilic groups conjugated to the 3'- or 5'-end of the RNA molecule are well known to those skilled in the art and useful according to the methods of the present invention. do. Techniques for the synthesis of 3'-cholesterol or 3'-acridine oligonucleotides that can be usefully applied to the preparation of modified RNA molecules according to the present invention can be found in the following papers.

다양한 특이적 siRNA 및 miRNA 분자들이 기술되어 왔으며 추가적인 분자를 용이하게 디자인할 수 있다. 예를 들어, 전세계-웹 주소(sanger.ac.uk 내의 /Software/Rfam/mirna/index)에 존재하는 miRNA 데이터 베이스는 본 발명에 따라 유용한 miRNA를 추가적으로 동정하기 위한 유용한 소스를 제공한다.A variety of specific siRNA and miRNA molecules have been described and additional molecules can be readily designed. For example, the miRNA database located at the worldwide web address (/Software/Rfam/mirna/index in sanger.ac.uk) provides a useful source for further identification of useful miRNAs in accordance with the present invention.

알려진 siRNA 운반 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 siRNA 치료법의 소망하지 않는 잠재적 부작용을 최소화하거나 또는 완전하게 회피하기 위한 특정 세포로의 타겟팅이 가능하다.Unlike known siRNA delivery methods, the methods of the present invention allow targeting to specific cells to minimize or completely avoid potential undesirable side effects of siRNA therapy.

<DNA 박스 치료분자><DNA box therapeutic molecule>

압타머 표적화약물은 DNA 박스 및 압타머로 구성될 수도 있다. 상기 DNA 박스는 이중가닥 핵산 또는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일가닥 DNA와 하나 이상의 약물(chemotherapeutic agent)이 자기 조립으로 특이 구조를 형성할 수 있다.The aptamer-targeting drug may consist of a DNA box and an aptamer. The DNA box may form a specific structure by self-assembly of double-stranded nucleic acid or single-stranded DNA capable of forming a hairpin structure and one or more drugs (chemotherapeutic agent).

바람직하게, 상기 DNA 박스는, 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 센스가닥 핵산 서열, 센스가닥 핵산 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 핵산 서열을 포함한다. 상기 센스 가닥 핵산서열은 GC 염기가 풍부한 서열로 이상적으로 GC 단위가 반복적으로 있을 수 있다.Preferably, the DNA box includes a sense strand nucleic acid sequence and an antisense strand nucleic acid sequence capable of complementary binding to the sense strand nucleic acid sequence sequentially from the 5' end to the 3' end. The sense strand nucleic acid sequence is a sequence rich in GC bases, and ideally, GC units may be repetitive.

상기 센스가닥 핵산 서열의 염기 개수는 DNA 박스 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 센스 가닥 핵산 서열은 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 안티센스 가닥 핵산 서열의 염기 개수도 DNA 박스 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 안티센스 서열 핵산분자는 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다. The number of bases of the sense strand nucleic acid sequence may be appropriately adjusted for preparing a DNA box, for example, the sense strand nucleic acid sequence may consist of 5 to 100, preferably 10 to 100 bases. In addition, the number of bases of the antisense strand nucleic acid sequence may also be appropriately adjusted for preparing a DNA box, for example, the antisense sequence nucleic acid molecule may consist of 5 to 100, preferably 10 to 100 bases.

DNA는 단백질 및 지질과 같은 많은 다른 생물학적 분자와 상호 작용한다. 이러한 상호작용은 DNA 모양, 주로 DNA 그루브 및 DNA 꼬임의 인식이다. 모든 유형의 핵산은 핵산 염기에 다양한 수소 공여체와 수용체를 가지고 있다. H 결합 공여체와 수용체는 다른 분자가 결합할 수 있는 앵커로 사용된다. 리간드는 groove 크기에 기초하여 이들의 결합 부위를 구별한다. 수소 결합 및 형태 인식은 리간드에 의한 결합 부위 인식의 주요 메카니즘이다. DNA interacts with many other biological molecules such as proteins and lipids. This interaction is the recognition of DNA shape, mainly DNA grooves and DNA twists. All types of nucleic acids have different hydrogen donors and acceptors at their bases. H bond donors and acceptors serve as anchors to which other molecules can bind. Ligands differentiate their binding sites based on groove size. Hydrogen bonding and conformational recognition are the main mechanisms of binding site recognition by ligands.

major 그루브는 더 많은 수소 결합 공여체와 수용체를 가지고 있기 때문에, 수소 결합은 major 그루브 결합(Groove Binding) 현상에서 결합 특이성에 더 많은 기여를 한다. minor 그루브에서 소수의 수소 결합 공여체와 수용체로 인해 많은 리간드가 T:A 염기쌍을 A:T 또는 G:C 염기쌍을 C:G와 구별 할 수 없다. 결합 특이성은 수소 결합 공여체와 수용체의 수에 의존할 뿐만 아니라 수소 결합 구조에도 의존한다. 리간드는 상이한 DNA 염기서열은 상이한 수소 결합 패턴을 가지므로 특정 표적과 결합한다. 물은 또한 홈 내에 수소 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 수화의 정도를 변화시킴으로써 리간드와 DNA 사이의 수소 결합을 중재하는 것이 가능하다. Since the major groove has more hydrogen bond donors and acceptors, hydrogen bonding contributes more to the binding specificity in the major groove binding phenomenon. Many ligands cannot distinguish T:A base pairs from A:T or G:C base pairs from C:G due to the few hydrogen bond donors and acceptors in the minor groove. Binding specificity depends not only on the number of hydrogen bond donors and acceptors, but also on the hydrogen bond structure. Ligands bind to specific targets because different DNA sequences have different hydrogen bonding patterns. Water can also form hydrogen bonds in the grooves. Thus, it is possible to mediate hydrogen bonding between ligand and DNA by varying the degree of hydration.

상기 DNA 박스에 결합하는 활성제는 삽입물질(intercalator) 및 그루브 결합물질(Groove binder)로 분류한다. The active agent binding to the DNA box is classified into an intercalator and a groove binder.

상기 삽입물질은 DNA의 평면 기저부 사이에 삽입되는 리간드를 의미한다. 알려진 예로 ethidium bromide(EtBr), berberine, proflavine 및 Doxorubicin이 있다. 그들은 암 세포에서 DNA 복제를 억제하기 위해 화학요법 치료에 적용된다. 삽입물질은 염기 쌍 사이에 삽입하기 때문에, DNA 분자는 삽입물질을 위한 공간을 열기 위해 풀림(unwind)과 연장(extend)해야 한다. 이러한 DNA의 구조적 변화는 삽입물질의 크기와 모양에 달려있다. 따라서 삽입물질은 DNA와 결합하여 복제, 전사 및 DNA 복구 과정을 억제한다. 이 메커니즘은 또한 돌연변이 유발 가능성을 증가시킨다. 그것은 또한 삽입물질의 결합으로 DNA의 구조적 변형에 의해 유도된 기능적 변화가 있다.The insert means a ligand inserted between the planar bases of DNA. Known examples are ethidium bromide (EtBr), berberine, proflavine and Doxorubicin. They are applied in chemotherapy treatments to inhibit DNA replication in cancer cells. Because the insert inserts between base pairs, the DNA molecule must unwind and extend to open space for the insert. These structural changes in DNA depend on the size and shape of the insert. Therefore, the insert binds to DNA and inhibits replication, transcription and DNA repair processes. This mechanism also increases the mutagenic potential. It also has functional changes induced by structural modifications of DNA with the binding of inserts.

그루브 결합물질은 major 그루브 결합물질와 minor 그루브 결합물질로 나눌 수 있다. major 그루브의 큰 치수로 인해 대형 단백질은 공통적인 major 그루브 결합물질이다. 그러나 triplex 형성 올리고 뉴클레오타이드(TFO), 펩티드 핵산(PNA), 플루마이신(pluramycins), 아플라톡신(aflatoxins) 및 아지노마이신(azinomycins)과 같은 작은 DNA 결합물질은 major 그루브에 결합한다. 그루브 바인더는 비공유적으로 DNA와 상호 작용한다. 그루브 결합물질은 아미노글리코시드(aminoglycosides) 와 같은 DNA와 공유 결합을 형성 할 수도 있다. 아미노글리코시드의 친전자성 그룹은 퓨린 염기의 친핵성 N7 위치와 반응한다. The groove bonding material can be divided into a major groove bonding material and a minor groove bonding material. Due to the large dimensions of the major grooves, large proteins are common major groove binding agents. However, small DNA binding agents such as triplex forming oligonucleotides (TFO), peptide nucleic acids (PNA), pluramycins, aflatoxins and azinomycins bind to the major groove. Groove binders interact with DNA non-covalently. Groove binding materials may form covalent bonds with DNA such as aminoglycosides. The electrophilic group of the aminoglycoside reacts with the nucleophilic N7 position of the purine base.

minor 그루브 결합물질은 커다란 단백질의 major 그루브 결합물질보다 작기때문에 DNA에 있는 좁고 깊은 minor그루브에 적합하다. 그러나 netroPSin과 distamycin A(Dst.A)와 같은 단순한 초승달 모양에서부터 trabectedin과 같은 복잡한 구조에 이르기까지 그들의 구조와 모양은 매우 다양하다. minor 그루브 결합물질은 공유 또는 비공유의 두 가지 유형의 힘을 통해 DNA와 상호 작용한다. DNA와 공유 결합을 형성하는 한 가지 예는 duocarmycin 계열에 속하는 CC1065이다. 안트라마이신 Anthramycin 은 또한 DNA와 공유 결합을 형성한다. 그것은 디아제핀 diazepine 고리에 탄소-질소 이중 결합을 가지고 있으며, 이는 염기의 아미노기와 반응한다. DAPI와 펜타미딘(pentamidine)과 같은 다른 합성 화합물들도 잘 연구되어 있다. Since the minor groove binding material is smaller than the major groove binding material of large proteins, it is suitable for narrow and deep minor grooves in DNA. However, their structures and shapes vary widely, from simple crescent-like structures such as netroPSin and distamycin A (Dst.A) to complex structures such as trabectedin. The minor groove binding material interacts with DNA through two types of forces, covalent or non-covalent. One example that forms a covalent bond with DNA is CC1065, which belongs to the duocarmycin family. Anthramycin also forms covalent bonds with DNA. It has a carbon-nitrogen double bond on the diazepine ring, which reacts with the amino group of the base. Other synthetic compounds such as DAPI and pentamidine have also been well studied.

본 발명의 실시예에서 사용한 약물은 헤어핀 구조 DNA에 삽입(intercalation)되는 성질을 가지는 안트라사이클린계(anthracycline) 약물은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신이다.The drug used in the examples of the present invention is an anthracycline drug having a property of being intercalated into the hairpin structure DNA is one selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, and idarubicin or more, preferably doxorubicin.

상기 접합체에서 약물, 특히 독소루비신이 DNA를 구성하는 염기 사이에 삽입되는 성질을 이용하여 독소루비신을 삽입할 수 있다. 독소루비신(Doxorubicin, Dox, 독소루비신 염산염)은 암 화학요법에서 가장 광범위하게 사용되는 세포독성 안트라사이클린 항생제 중의 하나이며, 다양한 종양에 대해 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 독소루비신은 수많은 고형암과 백혈병의 치료에 유용하며, 특히 복합치료와 관계있는 유방암의 치료에 효과적이다. 또한, 독소루비신은 AIDS와 연관된 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)에 대한 프로토콜 치료제이며 난소암, 폐암, 정소암, 전립샘암, 자궁암, 두경부암, 에스트로겐성 육종 및 에윙 육종(Ewing's sarcoma)에 대해 탁월한 활성을 보인다.In the conjugate, doxorubicin can be inserted using the property that drugs, particularly doxorubicin, are inserted between bases constituting DNA. Doxorubicin (Dox, doxorubicin hydrochloride) is one of the most widely used cytotoxic anthracycline antibiotics in cancer chemotherapy, and is known to exhibit activity against various tumors. The doxorubicin is useful for the treatment of numerous solid cancers and leukemias, and is particularly effective for the treatment of breast cancer related to combination therapy. In addition, doxorubicin is a protocol treatment for AIDS-related Kaposi's sarcoma and shows excellent activity against ovarian cancer, lung cancer, testicular cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, estrogenic sarcoma and Ewing's sarcoma. .

Dox는 토포아이소머라제 I 및 II와 같은 DNA 관련 효소에 결합하기 때문에 토포이소머라제 II 저헤제로 분류되지만 항암 활성에 영향을 미치는 다른 여러 생화학적 과정을 교란시킬 수 있다. 독소루비신은 DNA에 결합되는 성질을 지니고 있으므로 세포 내에 투과된 독소루비신은 핵으로 이동하여 DNA에 결합됨으로써 각종 생합성과정을 저해한다고 알려져 있다. Dox is classified as a topoisomerase II inhibitor because it binds to DNA-associated enzymes such as topoisomerase I and II, but can disrupt several other biochemical processes that affect anticancer activity. Since doxorubicin has a property of binding to DNA, it is known that doxorubicin permeated into cells moves to the nucleus and binds to DNA, thereby inhibiting various biosynthetic processes.

대표적으로는 DNA 전사과정에서 DNA supercoil 구조를 풀어주는 기능을 하는 topoisomerase II 효소의 작용을 방해함으로써 세포의 증식 혹은 사멸을 유도할 수 있다. topoisomerase II의 억제는 회복되지 않으면 세포 자멸사를 일으킬 수 있다. Typically, cell proliferation or death can be induced by interfering with the topoisomerase II enzyme, which functions to release the DNA supercoil structure during DNA transcription. Inhibition of topoisomerase II can lead to apoptosis if not reversed.

DNA는 이중가닥 DNA의 평면 염기쌍과 daunosamine 당단 부분에 의한 minor groove 사이의 tetracene 고리 시스템의 삽입을 통해 DNA와 상호 작용한다. 그러나 DNA에 대한 DNA의 비공유 결합은 쉽게 가역적이며 비공유 결합체는 상대적으로 짧은 반감기(t1/2 ~ 분)를 보인다. DNA interacts with DNA through insertion of a tetracene ring system between the planar base pairs of double-stranded DNA and the minor groove by daunosamine sugar moieties. However, non-covalent binding of DNA to DNA is easily reversible, and non-covalent conjugates show a relatively short half-life (t 1/2 ~ min).

Dox는 또한 더 안정한 DNA와 공유 결합 부가물을 형성하지만 DNA의 daunosamine sugar을 exocyclic에 연결시키는 알데히드 전구체를 필요로 한다. Dox-DNA 공유 결합 부가물은 비공유 결합체보다 세포 독성이 크고 공유 결합 부가물이 합성되어 안트라사이클린 세포 독성 연구에서 많이 사용된다. 공유 결합 Dox 부가물을 형성하며, 세포로의 이러한 병변의 독성은 토포이소머라아제 II 손상에 의해 유도된 것보다 높다. 생성된 Dox 부가물이 병변의 독성을 우세하게 유도한다. Dox also forms covalent adducts with more stable DNA, but requires an aldehyde precursor to link the daunosamine sugar of DNA exocyclically. Dox-DNA covalent adducts are more cytotoxic than non-covalent adducts and are widely used in anthracycline cytotoxicity studies because covalent adducts are synthesized. It forms covalent Dox adducts, and the toxicity of these lesions to cells is higher than that induced by topoisomerase II injury. The resulting Dox adduct predominantly induces toxicity of the lesion.

포름 알데히드는 Dox-DNA 부가물의 형성에 사용되며, 외인성 포름알데히드는 Dox 공유 결합 부가물 형성을 게놈 DNA로 촉진시킨다. DNA-포름알데히드 복합체는 게놈 DNA에 공유 결합 부가물 형성을 돕는 Dox의 활성화된 형태의 전달을 위해 사용하고 있다.Formaldehyde is used for the formation of Dox-DNA adducts, and exogenous formaldehyde promotes Dox covalent adduct formation to genomic DNA. DNA-formaldehyde complexes are being used to deliver the activated form of Dox, which aids in the formation of covalent adducts to genomic DNA.

포름알데히드는 Dox의 3'-아미노기를 DNA에 있는 dGuo의 2-아미노기에 Schiff 염기 화학(Schiff base chemistry) 을 통해 연결시키는 메틸렌기를 제공하기 때문에 DNA에 의한 Dox 부가 생성에 중심적인 역할을 한다. 이들 부가물의 특이성은 하나의 DNA 가닥에 공유 결합으로 형성하고 DNA의 국소 부위에 대한 안정화로 인해 열 변성에도 저항한다. Formaldehyde plays a central role in the generation of Dox addition by DNA because it provides a methylene group that connects the 3'-amino group of Dox to the 2-amino group of dGuo in DNA through Schiff base chemistry. The specificity of these adducts is that they form covalent bonds to one DNA strand and resist thermal denaturation due to their stabilization to local sites of DNA.

C. 링커C. Linker

상기 압타머 표적화약물은 압타머의 특이성을 활성제들로 이루어진 다중의 치료분자의 잠재력과 조합시키는 치료제 부류이다. 압타머 표적화약물은 두 성분의 특성들의 장점을 가지며 전신적인 노출과 관련된 독성을 최소화하는 동시에 표적 병변으로의 활성제의 전달을 최대화시키고, 그로써 치료효율을 증가시킴으로써 활성제들의 치료지수를 상당히 확대시킨다. The aptamer-targeting drugs are a class of therapeutic agents that combine the specificity of an aptamer with the potential of multiple therapeutic molecules of active agents. Aptamer-targeting drugs have the advantages of the properties of both components, maximize the delivery of the active agent to the target lesion while minimizing the toxicity associated with systemic exposure, and thereby significantly expand the therapeutic index of the active agent by increasing the therapeutic efficiency.

표적분자 선택, 종양 세포에 의한 압타머 표적화약물 내재화 및 활성제 약물의 잠재력은 접합체 개발에 대한 매개변수이다. 또한, 압타머 표적화약물을 형성하기 위하여 이들 빌딩 블록에 공유적으로 결합시키기 위한 화학적 링커의 디자인 또한 압타머 표적화약물의 개발에 커다란 역할을 한다.Target molecule selection, internalization of aptamer-targeted drugs by tumor cells, and the potential of activator drugs are parameters for conjugate development. In addition, the design of chemical linkers to covalently bind to these building blocks to form aptamer-targeting drugs also plays a major role in the development of aptamer-targeting drugs.

예를 들어 링커는 건강한 조직에 대한 손상을 제한하기 위해 혈류 내에서 안정해야 한다. 접합체의 분해 또는 붕괴는 표적 부위들에 활성제이 전달되기 전에 그것을 방출시킬 수 있다. 그러나 일단 접합체가 표적 부위들에 도달하게 되면, 접합체는 활성제을 그것의 활성 형태로 효율적으로 방출해야 한다. 표적 세포에서 원형질내 안정성과 효율적인 약물 방출 사이의 균형은 아직 밝혀지지 않았지만, 링커 디자인에 좌우될 수 있다.For example, linkers must be stable in the bloodstream to limit damage to healthy tissue. Degradation or disruption of the conjugate may release the active agent prior to delivery to the target sites. However, once the conjugate reaches the target sites, the conjugate must efficiently release the active agent in its active form. The balance between intraplasmic stability and efficient drug release in target cells has not yet been elucidated, but may depend on linker design.

적어도 3가지 유형의 링커가 접합체 디자인에 적용되는데, 즉 화학적-가변성 링커, 효소-가변성 링커 및 비-절단성 링커이다. At least three types of linkers are applied in the design of the conjugate: chemically-variable linkers, enzyme-variable linkers and non-cleavable linkers.

링커는 바람직하게는 생물학적 환경에 의해 생체 내에서 분리된다. 분리는 제한없이 임의의 공정, 예를 들면, 효소적, 환원적, pH 등으로부터 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 분리가능한 기는 원하는 작용 자리에서 활성화가 일어나도록 선택되는데, 이 자리는 치료적 작용 또는 마커 활성의 자리와 같은 표적 세포(예컨대, 암종 세포)나 조직 내의 또는 근처의 자리가 될 수 있다. 그러한 분리는 효소적일 수 있으며, 예시적인 효소적으로 분리가능한 기는 천연 뉴클레오타이드으로 끝나고 그의 인산기 말단에서 링커에 부착되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 분리 비율 증진의 정도가 본 발명에 중요한 것은 아니지만, 분리가능한 링커의 바람직한 예는 분리 가능한 기의 적어도 약 10%, 가장 바람직하게는 적어도 약 35%가 투여의 24 시간 이내에 혈류에서 분리되는 것들이다.The linker is preferably cleaved in vivo by the biological environment. Separation can be from any process without limitation, eg, enzymatic, reductive, pH, and the like. Preferably, the cleavable group is selected such that activation occurs at the desired site of action, which may be a site in or near a target cell (eg, carcinoma cell) or tissue, such as a site of therapeutic action or marker activity. . Such cleavage can be enzymatic, and exemplary enzymatically cleavable groups include nucleotide sequences that end with a native nucleotide and are attached to a linker at its phosphate end. Although the degree of enhancement of the cleavage rate is not critical to the present invention, preferred examples of cleavable linkers are those in which at least about 10%, most preferably at least about 35% of the cleavable groups are cleaved from the bloodstream within 24 hours of administration.

화학적 가변성 링커, 예컨대 Mylotarg에 대한 히드라존 링커 및 DM1/DM4에 대한 이황화물-함유 4-메르캅토펜타노에이트 링커에 대해, 링커의 선택적 절단 및 접합체에 대한 하중 방출은 원형질과 일부 세포내 구획 사이의 링커의 상이한 특성들을 토대로 한다. 링커는 혈액의 중성 pH 환경에서는 비교적 안정하지만 세포 내부의 더 낮은 pH 환경에 접합체가 들어간 후에는 절단될 수 있다. 생체 내 실험으로 화학적-가변성 링커들은 자주 제한된 원형질 안정성을 경험하는 것으로 증명되었다. For chemically variable linkers, such as the hydrazone linker to Mylotarg and the disulfide-containing 4-mercaptopentanoate linker to DM1/DM4, selective cleavage of the linker and unloading of the load to the conjugate is between the protoplast and some intracellular compartments. based on the different properties of the linker of The linker is relatively stable in the neutral pH environment of blood, but can be cleaved after the conjugate enters the lower pH environment inside the cell. In vivo experiments have demonstrated that chemically-variable linkers frequently experience limited protoplasmic stability.

효소-가변성 링커는 활성제 방출의 제어를 이루기 위해 대체 접근법-세포의 내부 및 외부에서의 프로테아제의 상이한 활성을 취한다. 프로테아제는 정상적으로는 바람직하지 못한 pH 조건과 혈청 프로테아제 억제제의 존재로 인해 세포 외부에서는 작용하지 않는다. 활성제는 리간드에 결합을 통해 포합될 수 있다. 활성제은 세포 내부에 존재하는 리소좀성 프로테아제의 작용에 의해, 그리고 특정 유형의 종양에서 상승된 수준에서 항체로부터 특이적으로 절단될 수 있다(Koblinsk et al). 화학적-가변성 링커를 가지는 접합체와 비교하면, 효소-가변성 링커는 활성제 방출의 더 나은 제어를 이룰 수 있다. 그러나, 일부 효소-가변성 링커의 증가된 관련 소수성은 접합체의 응집, 특히 강력하게 소수성인 활성제와의 응집을 유도할 수 있다.Enzyme-variable linkers take an alternative approach—different activities of proteases inside and outside the cell to achieve control of active agent release. Proteases normally do not act outside the cell due to unfavorable pH conditions and the presence of serum protease inhibitors. The active agent may be conjugated via binding to a ligand. Active agents can be specifically cleaved from antibodies by the action of lysosomal proteases present inside cells and at elevated levels in certain types of tumors (Koblinsk et al). Compared to conjugates with chemically-variable linkers, enzyme-variable linkers can achieve better control of the release of the active agent. However, the associated increased hydrophobicity of some enzyme-variable linkers may lead to aggregation of the conjugates, particularly with strongly hydrophobic active agents.

세 번째 부류의 링커는 비-절단성 링커이다. 활성제의 방출은 접합체의 내재화 및 이어서 리소좀에서 리간드 성분의 분해를 통해서 일어나고, 그 결과 여전히 링커에 부착된 활성제이 방출되는 것으로 여겨진다. 이들 비-절단성 링커는 혈청에서는 안정하지만, 효소-가변성 링커에 비교하면, 방출된 활성제이 충전되고 이웃 세포 안으로 확산될 수 없다는 사실로 인해 방관자 효과가 유발될 수 없다. 또한, 접합체의 내재화가 활성제 방출에 대한 요인이기 때문에, 효율은 표적분자-(및 그로써 리간드-) 의존적이다.A third class of linkers are non-cleavable linkers. Release of the active agent is believed to occur through internalization of the conjugate and subsequent degradation of the ligand component in the lysosome, resulting in release of the active agent still attached to the linker. Although these non-cleavable linkers are stable in serum, compared to enzyme-variable linkers, no bystander effect can be induced due to the fact that the released active agent is charged and cannot diffuse into neighboring cells. In addition, since internalization of the conjugate is a factor for the release of the active agent, the efficiency is target molecule- (and thus ligand-) dependent.

"링커"는 2개의 관능기 말단을 갖는 분자이고, 하나는 압타머를 포함하는 리간드 등의 생물학적 분자 또는 이의 단편에 결합하거나 달리는 회합하기 위한 것이고, 다른 하나는 활성제에 접합하기 위한 것이다.A “linker” is a molecule having two functional ends, one for binding or otherwise associating to a biological molecule or fragment thereof, such as a ligand comprising an aptamer, and one for conjugation to an active agent.

표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 리간드와 활성제 사이에 링커가 연결될 수 있다. 상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 스페이서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분은 활성제와 압타머를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 압타머와 활성제를 연결시켜 주는 기로서 압타머와 활성제를 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH) 일수 있으며, 상기 관능기는 압타머와 활성제 사이에 공유 결합을 할 수 있다.In order to be efficiently delivered to a target cancer cell or cancer tissue, a linker may be connected between the ligand and the active agent. The linker may include a spacer moiety and a functional group. If the spacer portion is too long, it cannot be used due to its high hydrophobicity, so a C1-C6 straight-chain or branched alkylene group, preferably a C1-C6 straight-chain alkylene group, is suitable as the spacer portion. For example, the spacer may be methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, or hexylene. In the spacer portion, a functional group is introduced to connect the active agent and the aptamer, and the functional group is a group that connects the aptamer and the active agent, and includes all functional groups capable of binding the aptamer and the active agent. For example, the functional group may be an amine group (-NH2) or a sulfhydryl group (-SH), and the functional group may form a covalent bond between the aptamer and the activator.

압타머 표적화약물은 활성제와 압타머를 부착시키는 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 활성제 및 압타머에 결합하여 접합체를 형성할 수 있으며, 여기서, 상기 접합체는 표적 세포로의 전달시 적어도 하나의 활성제를 방출한다. Aptamer-targeting drugs include one or more linkers that attach the active agent to the aptamer. The linker may bind to an active agent and an aptamer to form a conjugate, wherein the conjugate releases at least one active agent upon delivery to a target cell.

상기 활성제를 표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 압타머와 활성제 사이에 링커가 연결될 수 있다. 상기 활성제 치료분자는 활성제를 표적 세포로 전달하는 기능을 제공할 수 있다.A linker may be connected between the aptamer and the active agent in order to efficiently deliver the active agent to cancer cells or cancer tissues targeting the active agent. The active agent therapeutic molecule may provide the function of delivering an active agent to a target cell.

상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 링커는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분과 표적 펩타이드를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 연결시켜 주는 기로서 펩타이드와 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 티올기(-SH) 일수 있으며, 상기 관능기는 표적 펩타이드와 아미드 결합을 할 수 있다.The linker may include a spacer moiety and a functional group. If the spacer portion is too long, it cannot be used due to its high hydrophobicity, so a C1-C6 straight-chain or branched alkylene group, preferably a C1-C6 straight-chain alkylene group, is suitable as the spacer portion. For example, the linker may be methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, or hexylene. A functional group is introduced to connect the spacer portion and the target peptide, and the functional group is a group that connects the target peptide and includes all functional groups capable of binding to the peptide. For example, the functional group may be an amine group (-NH2) or a thiol group (-SH), and the functional group may form an amide bond with a target peptide.

상기 압타머 표적화약물은, 활성제 또는 압타머 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 활성제 또는 압타머에 공유 결합하는 스페이서를 형성할 수 있는 링커로부터 제조될 수 있다.The aptamer-targeting drug may be prepared from a linker capable of reacting with a reactive coupling group on an active agent or aptamer to form a spacer covalently bound to the active agent or aptamer.

상기 링커는 이산(diacid) 또는 치환된 이산일 수 있다. 발명에 사용된 이산은, 2개 이상의 카복실산 그룹을 갖는, 바람직하게는 2 내지 50개, 2 내지 30개, 2 내지 12개, 또는 2 내지 8개의 탄소원자를 갖는 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 화합물을 나타낼 수 있다. 적합한 이산은 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, 프탈산, 이소-프탈산, 테레프탈산, 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.The linker may be a diacid or a substituted diacid. The diacid used in the invention is a substituted or unsubstituted alkyl, heteroalkyl having 2 or more carboxylic acid groups, preferably 2 to 50, 2 to 30, 2 to 12, or 2 to 8 carbon atoms. , aryl, or heteroaryl compounds. Suitable diacids may include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, iso-phthalic acid, terephthalic acid, and derivatives thereof.

상기 링커는 활성화된 이산 유도체, 예를 들면, 이산 무수물, 이산 에스테르, 또는 이산 할로겐화물일 수 있다. 상기 이산 무수물은 이산 또는 이산 유도체, 예를 들면, 상기 기재된 것들의 분자내 탈수로부터 수득된 사이클릭 무수물일 수 있다. 상기 이산 무수물은 말론산 무수물, 석신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물, 피멜산 무수물, 프탈산 무수물, 디글리콜산 무수물, 또는 이들의 유도체; 바람직하게는 석신산 무수물, 디글리콜산 무수물, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 상기 이산 에스테르는 상기 기재된 이산 중 어느 하나 의 활성화된 에스테르일 수 있으며, 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산, 프탈산, 이소-프탈산, 테레프탈산, 및 이들의 유도체의 메틸 및 부틸 디에스테르 또는 비스-(p-니트로페닐) 디에스테르를 포함한다. 상기 이산 할로겐화물은 상기 기재된 이산의 상응하는 산 불화물, 산염화물, 산 브롬화물, 또는 산 요오드화물을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 이산 할로겐화물은 석시닐 클로라이드 또는 디글리콜릴 클로라이드이다. 예를 들면, 반응성(-OH) 커플링 그룹을 갖는 치료제 및 반응성(-NH2) 커플링 그룹을 갖는 압타머를 사용하여 하기 반응식에 따라 디석시네이트 링커를 갖는 접합체를 제조할 수 있다.The linker may be an activated diacid derivative, such as a diacid anhydride, diacid ester, or diacid halide. The diacid anhydride may be a cyclic anhydride obtained from intramolecular dehydration of diacids or diacid derivatives, such as those described above. The diacid anhydride may include malonic anhydride, succinic anhydride, glutaric anhydride, adipic anhydride, pimelic anhydride, phthalic anhydride, diglycolic anhydride, or derivatives thereof; Preferably, it may be succinic anhydride, diglycolic anhydride, or a derivative thereof. The diacid ester may be an activated ester of any of the diacids described above, including oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, iso -methyl and butyl diesters or bis-(p-nitrophenyl) diesters of phthalic acid, terephthalic acid, and derivatives thereof. The diacid halide may comprise the corresponding acid fluoride, acid chloride, acid bromide, or acid iodide of the diacids described above. In a preferred embodiment, the diacid halide is succinyl chloride or diglycolyl chloride. For example, a conjugate having a disuccinate linker can be prepared according to the following scheme using a therapeutic agent having a reactive (-OH) coupling group and an aptamer having a reactive (-NH2) coupling group.

치료분자는 하이드록실 그룹을 갖는 활성제를 제공하고, 이를 석신산 무수물 링커와 반응시켜 활성제-석시네이트-SSPy의 접합체를 형성함에 의해 제조될 수 있다. 이용가능한 -NH2 그룹을 갖는 압타머를 커플링 시약 및 활성제-석시네이트 -SSPy와 반응시켜 압타머-스페이서-활성제 접합체를 형성한다.Therapeutic molecules can be prepared by providing an active agent having a hydroxyl group and reacting it with a succinic anhydride linker to form an active agent-succinate-SSPy conjugate. An aptamer having an available -NH2 group is reacted with a coupling reagent and activator-succinate-SSPy to form an aptamer-spacer-activator conjugate.

연결될 수 있는 기타 관능성 그룹은 -CH, -COOH, 알케닐, 포스페이트, 설페이트, 헤테로사이클릭 NH, 알킨 및 케톤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.Other functional groups that may be linked include, but are not limited to, —CH, —COOH, alkenyl, phosphate, sulfate, heterocyclic NH, alkyne, and ketone.

상기 커플링 반응은 당업자들에게 공지된 에스테르화 조건하에, 예를 들면, 활성화제, 예를 들면, 카보디이미드(예를 들면, 디이소프로포일카보디이미드(DIPC))의 존재하에 촉매, 예를 들면, 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 또는 부재하에 수행될 수 있다. 이러한 반응은 적절한 용매, 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트 중에서, 약 0℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)의 온도에서 수행될 수 있다.The coupling reaction is carried out under esterification conditions known to those skilled in the art, for example in the presence of an activator, for example a carbodiimide (eg diisopropoylcarbodiimide (DIPC)), a catalyst, For example, it can be carried out in the presence or absence of dimethylaminopyridine (DMAP). This reaction can be carried out in a suitable solvent, such as dichloromethane, chloroform or ethyl acetate, at a temperature from about 0° C. to the reflux temperature of the solvent (eg, ambient temperature).

상기 커플링 반응은 일반적으로 용매, 예를 들면, 피리딘 중에서 또는 염소화 용매 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP 또는 피리딘의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)에서 수행된다. 바람직한 양태에서, 상기 커플링 시약은, 염소화, 에테르화 또는 아미드 용매(예를 들면, N,N-디메틸포름아미드) 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)의 온도에서 4-(2-피리딜디티오)-부탄산, 및 카보디이미드 커플링 시약, 예를 들면, DCC로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.The coupling reaction is generally carried out in the presence of a catalyst such as DMAP or pyridine in a solvent such as pyridine or in a chlorinated solvent at about 0° C. to the reflux temperature of the solvent (eg ambient temperature). . In a preferred embodiment, the coupling reagent is in a chlorinated, etherified or amide solvent (e.g., N,N-dimethylformamide) in the presence of a catalyst, e.g., DMAP, at a temperature from about 0 °C to the reflux temperature of the solvent ( for example, at a temperature of ambient temperature) 4-(2-pyridyldithio)-butanoic acid, and a carbodiimide coupling reagent such as DCC.

상기 구조체는, 활성제 또는 압타머 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 공유 결합을 형성할 수 있는 상보적 반응성 그룹을 갖는 링커에 하나 이상의 반응성 커플링 그룹을 갖는 커플링 활성제 및/또는 압타머를 커플링시킴에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 1급 아민 그룹을 갖는 활성제 또는 압타머를 이소티오시아노에이트 그룹 또는 또 다른 아민-반응성 커플링 그룹을 갖는 링커에 커플링시킬 수 있다. 상기 링커는, 활성제 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과, 압타머 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과 상이한 제2 반응성 커플링 그룹을 포함할 수 있다. 링커 상에서 반응성 커플링 그룹 중 하나 또는 둘 다를 합성의 일부 동안 적합한 보호 그룹으로 보호할 수 있다.The construct couples the coupling activator and/or aptamer having one or more reactive coupling groups to a linker having a complementary reactive group capable of reacting with the reactive coupling group on the activator or aptamer to form a covalent bond. It can be prepared by Sikkim. For example, an activator or aptamer having a primary amine group can be coupled to a linker having an isothiocyanoate group or another amine-reactive coupling group. The linker comprises a first reactive coupling group capable of reacting with a complementary functional group on the active agent and a second reactive coupling group different from the first reactive coupling group capable of reacting with a complementary functional group on the aptamer. It can contain groups. One or both of the reactive coupling groups on the linker may be protected with suitable protecting groups during part of the synthesis.

D. 압타머 표적화약물D. Aptamer Targeting Drugs

본 발명의 압타머 표적화약물은 (i) 1종의 선별된 표면 마커에 특이적으로 결합하는 압타머를 표적화분자 단위로 최소한 포함하는 표적화분자를 결정하는 단계; (ii) 1종 이상의 활성제 단위를 포함하는 치료분자를 결정하는 단계; 및 (iii) 상기 결정된 표적화분자와 상기 결정된 치료분자를 모듈로 구성하는 단계로 제조할 수 있다.The aptamer-targeting drug of the present invention comprises the steps of (i) determining a targeting molecule comprising at least an aptamer that specifically binds to one selected surface marker as a targeting molecule unit; (ii) determining a therapeutic molecule comprising one or more units of an active agent; and (iii) constructing the determined targeting molecule and the determined therapeutic molecule into modules.

상기 압타머 표적화약물은 표적화분자, 압타머 모듈에 약제학적 활성 성분인 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogs)를 구성성분으로 제조된 압타머인 표적화-치료분자 모듈, 올리고뉴클레오타이드, 이중가닥 DNA에 결합하는 상기 활성제를 포함하는 DNA 박스 및 상기 활성제를 포함하는 치료분자 모듈로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상의 모듈을 최소한 포함하는 구조체이다.The aptamer targeting drug is an aptamer, which is a targeting molecule prepared from nucleoside analogs, which are pharmaceutically active ingredients, in the aptamer module, a targeting-therapeutic molecule module, oligonucleotide, and double-stranded DNA. It is a construct comprising at least any one or more modules selected from the group consisting of a DNA box containing the active agent and a therapeutic molecule module including the active agent.

상기 표적화분자는 상기 세포표면에 결합하는 화합물, 항체 또는 펩타이드, 압타머이며 한 종류 이상의 압타머 표적화분자를 포함하는 다중 표적화분자일 수도 있다. The targeting molecule is a compound, antibody or peptide, or aptamer that binds to the cell surface, and may be a multi-targeting molecule including one or more types of aptamer targeting molecules.

압타머 표적화약물을 구성하는 모듈, 압타머 및 치료 분자 사이에 스페이서(spacer)를 둘 수도 있다. 압타머 표적화약물을 구성하는 표적화 분자와 치료 분자를 조합/연결하는 스페이서의 길이를 변경시킴으로써 두 표적화 분자에 동시에 결합하는데 필요하며, 선택성 및/또는 특이성 및/또는 효능에 따라 딱 맞는 유연성 및 거리를 선택할 수 있게 해 준다.A spacer may be placed between the module constituting the aptamer-targeting drug, the aptamer, and the therapeutic molecule. It is necessary to simultaneously bind to both targeting molecules by changing the length of the spacer that combines/connects the targeting molecule and the therapeutic molecule constituting the aptamer targeting drug, and provides the right flexibility and distance depending on the selectivity and/or specificity and/or efficacy. allows you to choose

상기 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 스페이서인 상기 1차 스페이서 및/또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것이다.wherein said spacer is a nucleic acid spacer comprising about 1 to 20 contiguous nucleotides, preferably 1 to 5 contiguous nucleotides, more preferably 2 contiguous nucleotides. The above ethylene glycol moieties or those having a plurality of such ethylene glycol moieties are included.

압타머 표적화약물에서 표적화 분자와 스페이서가 모두 동일한 올리고뉴클레오타이드 화합물로 호모 폴리머일 수도 있다. 경우에 따라 압타머의 한쪽 말단에 스페이서를 부가할 수도 있다. In the aptamer-targeting drug, both the targeting molecule and the spacer are the same oligonucleotide compound and may be a homopolymer. In some cases, a spacer may be added to one end of the aptamer.

압타머 표적화약물에서 표적화 분자와 스페이서의 각각이 동일하지 않은 올리고뉴클레오타이드 화합물로 헤테로 폴리머일 수도 있다. In the aptamer targeting drug, each of the targeting molecule and the spacer is an oligonucleotide compound that is not identical, and may be a heteropolymer.

또한, 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 스페이서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분은 활성제와 압타머를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 압타머와 활성제를 연결시켜 주는 기로서 압타머와 활성제를 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH) 일수 있으며, 상기 관능기는 압타머와 활성제 사이에 공유 결합을 할 수 있다.In addition, if the spacer portion is too long, it cannot be used due to its high hydrophobicity, so a C1-C6 straight-chain or branched alkylene group, preferably a C1-C6 straight-chain alkylene group, is suitable as the spacer portion. For example, the spacer may be methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, or hexylene. In the spacer portion, a functional group is introduced to connect the active agent and the aptamer, and the functional group is a group that connects the aptamer and the active agent, and includes all functional groups capable of binding the aptamer and the active agent. For example, the functional group may be an amine group (-NH2) or a sulfhydryl group (-SH), and the functional group may form a covalent bond between the aptamer and the activator.

상기 치료분자는 약제학적 활성 성분인 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogs)를 사용하여 제조된 압타머, 이중가닥 핵산에 결합하는 활성제가 있는 DNA 박스(box), 올리고뉴클레오타이드와 활성제에서 선택된 둘 이상의 치료분자를 포함할 수 있다.The therapeutic molecule is an aptamer prepared using nucleoside analogs as a pharmaceutically active ingredient, a DNA box having an active agent that binds to a double-stranded nucleic acid, an oligonucleotide and two or more therapeutic molecules selected from an active agent may include.

압타머 및 치료분자는 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(PS) 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오시드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물일 수 있다. 바람직하게, 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오시드 유사체 또는 무치환 뉴클레오시드를 포함한다.Aptamers and therapeutic molecules are phosphodiesters (pO), phosphorothionates (PS) or chains of pharmaceutically active or therapeutic monomeric nucleosides or nucleoside analogues linked by H- or alkyl or alkenyl phosphonates. It may be a polynucleotide compound formed from Preferably, the chain comprises 2 to 100 (more preferably 2 to 35) therapeutic monomeric nucleosides, nucleoside analogs or unsubstituted nucleosides.

본 발명은 혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. PS 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 PS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다. (S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger 's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) 및 그 안에 인용된 추가의 문헌들에 개시되어있다.The present invention contemplates polynucleotides containing mixed phosphodiester and phosphorothioate linkages. Oligomers with PS linkages are more stable than oligomers with pO linkages, and as a result, PS oligomers degrade at a slower rate than oligomers with pO linkages. (S. T. Crooke, Oligonucleotide Therapeutics, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Ed. M. E. Wolff 863-900, 1995) and additional references cited therein.

상기 압타머 표적화약물은 하나 이상의 압타머, 하나 이상의 링커, 하나 이상의 치료분자, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 상기 압타머 표적화약물은 임의의 수의 압타머, 링커, 및 활성제를 가질 수 있다. The aptamer-targeting drug includes one or more aptamers, one or more linkers, one or more therapeutic molecules, or any combination thereof. The aptamer-targeting drug may have any number of aptamers, linkers, and active agents.

상기 압타머 표적화약물은 다수의 상이한 합성 과정에 의해 제조될 수 있다. 상기 압타머 표적화약물은 치료분자, 활성제 또는 프로드럭으로 제조되는 압타머, 표적화 분자의 관능기와 활성제로부터 제조할 수 있거나, 하나 이상의 반응성 커플링 그룹을 갖는 링커로부터 제조될 수 있거나, 공유 결합을 형성하기 위해 활성제 또는 표적화 분자상에 관능기와 반응할 수 있는 하나 이상의 링커 전구체로부터 제조될 수 있다.The aptamer-targeting drug can be prepared by a number of different synthetic processes. The aptamer targeting drug may be prepared from a therapeutic molecule, an active agent or an aptamer prepared as a prodrug, a functional group of a targeting molecule and an active agent, may be prepared from a linker having one or more reactive coupling groups, or may form a covalent bond from one or more linker precursors capable of reacting with a functional group on the active agent or targeting molecule to

압타머들로 구성된 표적화 분자와 치료분자로 구성된 치료분자에 대한 링커를 이용한 모듈 연결법을 이용함으로써, 이종 다중 특이적 치료분자가 제공될 수 있다. 그러한 표적화 분자는 해당하는 세포표면 분자와 상호작용하는 리간드와 관련하여 또는 치료의 필요로 인해 개체의 세포 상에 실제 존재하는 세포표면 분자와 관련한다. 개체의 세포표면 분자 상태를 결정함으로써, 치료표적들의 조합이 선택될 수 있다.By using a modular linking method using a targeting molecule composed of aptamers and a linker for a therapeutic molecule composed of a therapeutic molecule, heterogeneous multispecific therapeutic molecules can be provided. Such targeting molecules relate to ligands that interact with the cell surface molecules of interest or to cell surface molecules that are actually present on a subject's cells due to the need for treatment. By determining the cell surface molecular state of an individual, a combination of therapeutic targets can be selected.

두 가지 상이한 에피토프를 표적으로 하며 동시에 결합하는 2개의 단일 치료분자를 포함함에 의한 이중 특이적 치료제의 그러한 생성으로 인해, 단일 치료분자에 비해 부가적/상승적 효과가 예측될 수 있다.Due to such generation of dual specific therapeutics by including two single therapeutic molecules that target and bind two different epitopes simultaneously, additive/synergistic effects over single therapeutic molecules can be predicted.

이미 이용 가능한 단일특이적 압타머, 예컨대 표적화 분자로부터 유도된 것을 이용함으로써, 필요한 다중 특이적 압타머의 신속하며 용이한 생산이 달성될 수 있다.By using already available monospecific aptamers, such as those derived from targeting molecules, rapid and easy production of the required multispecific aptamers can be achieved.

그러한 친화성 압타머는 단일 세포 상에 제시된 2 개 이상의 세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 그러한 결합은 모든/양방의 결합 단위가 동시에 세포에 결합하는 경우 필요하다. 그러한 목적을 위해, 중간 내지 높은 친화성 표적화 분자가 특히 적당하다. 이는 또한 스크리닝 프로세스 동안 결합 특이성의 덜 특이적인 조합은 배제할 수도 있다. Such affinity aptamers can bind two or more cell surface markers presented on a single cell. Such binding is necessary when all/both binding units bind to the cell at the same time. For that purpose, medium to high affinity targeting molecules are particularly suitable. It may also rule out less specific combinations of binding specificities during the screening process.

또한, 상기 압타머 표적화약물의 양 쪽 말단 또는 어느 한 쪽이 핵산인 경우, 혈청 내 안정성 증진을 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두가 변형되어 혈청 내 안정성이 증진된 것일 수 있다. 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 페리오스틴 압타머는 5' 말단에 PEG(polyethylene glycol; 예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되어 있거나, 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착되어 있거나, 5' 말단에 PEG(예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되고 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착된 것일 수 있다.In addition, when both ends or either one of the aptamer-targeting drugs are nucleic acids, the 5' end, 3' end, or both ends are modified to improve serum stability in order to improve serum stability. have. The modification may be PEG (polyethylene glycol), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-methoxy nucleoside, 2'-amino nucleoside at the 5' end, 3' end, or both ends. , 2'F-nucleoside, an amine linker, a thiol linker, and one or more selected from the group consisting of cholesterol, etc. may be combined and modified. In a preferred embodiment, the periostin aptamer has PEG (polyethylene glycol; for example, molecular weight 500-50,000 Da) attached to the 5' end, or inverted deoxythymidine (idT) attached to the 3' end, or to the 5' end. PEG (eg, molecular weight 500-50,000 Da) may be attached thereto and idT (inverted deoxythymidine) may be attached to the 3' end.

상기 'idT(inverted deoxythymidine)'는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-0H와 결합하여 사슬을 이루지만 idT는 앞 단위체의 3'-OH에 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제(3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.The 'idT (inverted deoxythymidine)' is one of the molecules used to prevent degradation by nucleases of aptamers, which are generally weak in resistance to nucleases. Combines with 5'-0H of the unit to form a chain, but idT combines the 3'-OH of the next unit with the 3'-OH of the previous unit to expose the 5'-OH rather than the 3'-OH. It is a molecule that has an effect of inhibiting degradation by 3' exonuclease, which is a kind of nuclease by adding it.

압타머 표적화약물의 상기 표적화분자들은, 압타머 표적화약물 성분의 몰 중량%의 합이 100%가 되도록 약 1% 내지 10%, 또는 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 30% 내지 40%, 또는 약 40% 내지 50%, 또는 약 50% 내지 60%, 또는 약 60% 내지 70%, 또는 약 70% 내지 80%, 또는 약 80% 내지 90%, 또는 약 90% 내지 99%의 소정의 몰 중량%로 존재한다. 상기 압타머 표적화약물의 표적화 분자의 양은 또한, 예를 들면, 표적화 분자 대 활성제의 비가 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4; 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10으로 활성제(들)에 대한 비로 표현될 수 있다.The targeting molecules of the aptamer targeting drug are present in an amount of from about 1% to about 10%, or from about 10% to about 20%, or from about 20% to about 30%, such that the sum of molar weight percent of the components of the aptamer targeting drug is 100%. or about 30% to 40%, or about 40% to 50%, or about 50% to 60%, or about 60% to 70%, or about 70% to 80%, or about 80% to 90%, or present in a predetermined molar weight percent of about 90% to 99%. The amount of targeting molecule of the aptamer targeting drug may also be, for example, a ratio of targeting molecule to active agent of about 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1 , 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4; 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, or 1:10 as a ratio to active agent(s).

III. 영상소재를 포함하는 AMIII. AM including video material

본 발명에서 영상소재를 포함하는 AM를 이용한 분자 영상은 비침습적 방법으로 살아있는 세포나 조직 또는 손상을 가하지 않는 물체를 세포적 분자적 수준에서 생화학적 사건을 실시간으로 시각화할 수 있다. 방사능 물질, 자성 나노물질이나 형광소재로 변형된 압타머는 표적화 형광 영상화나 magnetic resonance imaging(MRI)에서 좋은 소재로 제공될 수 있다. In the present invention, molecular imaging using AM including an imaging material can visualize biochemical events in real time at the cellular and molecular level of living cells, tissues, or objects that do not inflict damage in a non-invasive manner. Aptamers modified with radioactive materials, magnetic nanomaterials or fluorescent materials can serve as good materials for targeted fluorescence imaging or magnetic resonance imaging (MRI).

대사변화가 보통 해부학적 변화 전에 발생하기 때문에 PET은 분명하게 computed tomography(CT) 와 MRI 같은 해부학적 기술보다 진단에서 유리한 점이 있다. 임상활용에서 PET는 기초 연구와 전임상 분야에서 광범위한 응용이 되고 있다. 예를 들면 PET는 새로운 방사선 치료제 분석, 새로운 치료제의 효능 그리고 약제의 상체분포를 검증하는데 사용될 수 있다. PET이 가지고 있는 강점으로 탐침 깊이, 탁월한 민감도, 정량적 자료 그리고 전임상에서 임상까지의 전환성에 있다. Because metabolic changes usually occur before anatomical changes, PET clearly has a diagnostic advantage over anatomical techniques such as computed tomography (CT) and MRI. In clinical applications, PET has been widely applied in basic research and preclinical fields. For example, PET can be used to analyze new radiotherapeutic agents, to validate the efficacy of new therapies, and to validate the upper distribution of drugs. The strengths of PET include probe depth, excellent sensitivity, quantitative data, and convertibility from preclinical to clinical.

즉, PET은 대표적인 분자영상기기로 방사선 의약품을 이용하여 살아있는 생체의 표적분자 수준에서의 생화학적 변화를 감지할 수 있고 굉장히 민감도가 높아 기초과학이나 전임상 영역을 비롯한 광범위한 분야에서 이용되고 있다. In other words, PET is a representative molecular imaging device that can detect biochemical changes at the level of target molecules in living organisms using radiopharmaceuticals, and is used in a wide range of fields including basic science and preclinical fields because of its high sensitivity.

압타머의 표지인자는 어떠한 종래의 방법으로 탐지가능한 표지인자일 수 있으며, 예를 들면 방사성 동위원소, 형광 물질, 적외선 물질, 양자점, 이온 옥사이드 비드(ion oxide bead), PET 프로브 (예를 들어 갈륨), 산화철 (예를 들어 Fe3O4)을 포함하는 T1 MR 프로브 및 T2 MR 프로브 (예를 들어 MnFe2O4 또는 GdFe2O4 나노파티클) 및 기타 등등으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지는 않는다.The marker of the aptamer may be a marker detectable by any conventional method, for example, a radioactive isotope, a fluorescent material, an infrared material, a quantum dot, an ion oxide bead, a PET probe (eg, gallium ), a T1 MR probe and a T2 MR probe containing iron oxide (eg, Fe3O4) (eg, MnFe2O4 or GdFe 2 O 4 nanoparticles) and the like. does not

본 발명에서는 방사성 동위원소, 예를 18F, 32P, 123I, 89Zr, 67Ga, 201Tl, 111In-111나 형광염료, 예를 들어 시아닌 형광염료인 Cy3, Cy5, Cy7 등으로 표지된 압타머를 이용하여 생체 내 영상화를 위해 활용할 수 있다.In the present invention, labeled with a radioactive isotope, for example, 18 F, 32 P, 123 I, 89 Zr, 67 Ga, 201 Tl, 111 In-111 or a fluorescent dye, for example, a cyanine fluorescent dye, Cy3, Cy5, Cy7, etc. It can be utilized for in vivo imaging using the aptamer.

IV. 이온성 분자IV. ionic molecules

A. 양이온성 분자A. Cationic Molecules

본 발명의 기본입자(10)는 상기 AM과 상기 양이온성 분자는 정전기적 상호작용에 의해 응축되는 복합체이다. (-) 전하를 띄는 상기 AM과 (+) 전하를 띄는 양이온성 분자가 서로 혼합되면 응축될 수 있다. 좀 더 구체적으로, 강한 양전하를 가지는 분자는 이 음전하의 AM을 둘러싸면서 응축 또는 압축하여 입자 크기를 줄일 수 있다. The basic particle 10 of the present invention is a complex in which the AM and the cationic molecule are condensed by electrostatic interaction. When the AM having a negative charge and a cationic molecule having a positive charge are mixed with each other, they may be condensed. More specifically, a molecule having a strong positive charge may reduce the particle size by condensing or compressing while surrounding the negatively charged AM.

상기 AM은 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드로 구성된 압타머를 포함하는 압타머 약물(FAM)과 약학적 유효성분을 구성성분으로 있는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SSS)으로 구성된다.The AM is composed of an aptamer drug (FAM) containing an aptamer composed of natural nucleotides and modified nucleotides and an aptamer drug (SSS) containing an aptamer composed of a pharmaceutically active ingredient.

본 발명의 양이온성 분자는 중량 평균 분자량은 100 내지 100,000인 분자로, 예를 들면 양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 표면활성제 및 합성 중합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The cationic molecule of the present invention is a molecule having a weight average molecular weight of 100 to 100,000, for example, from the group consisting of cationic polypeptides, cationic polysaccharides, cationic lipids, cationic polypeptides, cationic surfactants and synthetic polymers. can be selected.

상기 양이온성 폴리펩타이드는 프로타민(Protamine, PS), 세포 침투성 펩타이드(CPP), 폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도아민 (PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 PS일 수 있다.The cationic polypeptide may be selected from the group consisting of protamine (PS), cell penetrating peptide (CPP), poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) and polyamidoamine (PAMAM: polyamidoamine). and preferably PS.

상기 양이온성 다당류는 키토산(chitosan) 및 글리코키토산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The cationic polysaccharide may be selected from the group consisting of chitosan and glycochitosan.

상기 양이온성 지질은 1,2-디라우로릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 및 1,2-디라우로릴-sn-글리세로-3-글리세롤 (DLPG), 디올레오일-1,2-디아실-3-트리메틸암모니움-프로판(DOTAP, 18:1; 14:0; 16:0, 18:0로) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA); 디메틸디옥타데실 암모니움(DDAB); 1,2-디라우로릴-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(에틸 PC, 12:0; 14:0; 16:0; 18:0; 18:1; 16:0 - 18:1로); 1,2-디-(9Z-옥타데센오일)-3-디메틸암모니움-프로판 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-3-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드 (DC-콜레스테롤)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.The cationic lipids are 1,2-dilaurolyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE) and 1,2-dilaurolyl-sn-glycero-3-glycerol (DLPG), Dioleoyl-1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP, 18:1; 14:0; 16:0, as 18:0) and N-[1-(2,3-diol) railoxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA); dimethyldioctadecyl ammonium (DDAB); 1,2-Dilaurolyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (ethyl PC, 12:0; 14:0; 16:0; 18:0; 18:1; 16:0 - 18: to 1); 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-dimethylammonium-propane and 3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-3-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC- cholesterol).

상기 양이온성 분자에 대한 유망한 후보자는 임상 실습에서 다양한 응용을 갖는 폴리 양이온성 펩티드인 프로타민(protamine)이다. 특히 약물 전달에 사용되며 주입된 인슐린 현탁액의 흡수를 지연시키는 효과가 보고되었다. 프로타민 분자량이 5.8 kDa이고 염기성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하므로 몰당 양이온이 1.26 ± 1025이다. 따라서 DNA와 복합체를 형성하면 프로타민은 DNA 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 일반적으로 PEC(Poly-Electrolyte Complex)라고 불리는 이 물질은 물에서 해리될 수 있는 그룹을 포함하고 있는 생물학적 거대 분자의 고분자로 구성되어 상호 작용하여 전하를 띤 구성 요소를 만든다.A promising candidate for the cationic molecule is protamine, a polycationic peptide with various applications in clinical practice. In particular, it is used for drug delivery and has been reported to have the effect of delaying the absorption of an injected insulin suspension. Since protamine has a molecular weight of 5.8 kDa and is rich in basic amino acids, especially arginine (70-80%), it has 1.26 ± 10 25 cations per mole. Thus, upon forming a complex with DNA, protamine neutralizes the negative charge of the DNA phosphate group. These substances, commonly called Poly-Electrolyte Complexes (PECs), are composed of polymers of biological macromolecules containing groups that can dissociate in water and interact to form charged components.

PS는 동물의 정소 중에서 특히 연어를 포함한 어류의 정자 핵에 많이 존재하며, 히스톤과 같이 DNA와 회합 또는 해리를 통하여 유전정보 발현에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 통상, 어류의 정자핵으로부터 추출되는 PS의 분자량은 약 4,000 내지 10,000이며, 구성 아미노산의 70% 이상이 아르기닌으로 존재하나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다. PS is abundantly present in the sperm nucleus of fish including salmon among animal testes, and is known as a protein involved in the expression of genetic information through association or dissociation with DNA like histones. Usually, the molecular weight of PS extracted from the sperm nucleus of fish is about 4,000 to 10,000, and 70% or more of the constituent amino acids are arginine, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 PS는 PS 자체 및 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함한다. 구체적으로 본 발명의 PS의 염은 염산염 또는 황산염을 포함한 산성 물질에 의한 염 형태를 포괄한다. PS은 염 형성 없이도 물에 용해가 가능하며 염 형태 또한 물에 용해가 가능하므로 어떤 형태로든 사용 가능하다. The PS of the present invention includes both PS itself and a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, the salt of PS of the present invention encompasses a salt form with an acidic substance including hydrochloride or sulfate. PS can be dissolved in water without salt formation, and since the salt form is also soluble in water, it can be used in any form.

본 발명에 따르면, 본 발명의 PS는 프로타민 P1( Protamine P1), 프로타민 1(Protamine 1) 및 프로타민 2(Protamine 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 단백질일 수 있다.According to the present invention, the PS of the present invention may be one or two or more proteins selected from the group consisting of Protamine P1, Protamine 1, and Protamine 2).

더 치밀한 '입자' 구조를 얻기 위해, PS에 acrylamide를 처리하여 변형된 형태(mPS로 표시)과 HA에 acrylate 그룹을 처리하여 변형된 형태(mHA로 표시)를 사용할 수도 있으며, 이 경우 최종 겔은 UV 조사를 통해 광 가교 결합에 의해 구축할 수도 있다.In order to obtain a denser 'particle' structure, it is also possible to use a form modified by treating PS with acrylamide (expressed as mPS) and a form modified by treatment with an acrylate group on HA (denoted as mHA), in which case the final gel is It can also be constructed by photocrosslinking through UV irradiation.

폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine)은 생분해설인 펩타이드 결합으로 연결되어 있어 AM과 이온복합체를 형성해서 세포 내로 전달될 수 있으나, 다소 독성을 나타내므로 단독으로 높은 전달효율을 나타내는 데에는 한계가 있어 CPP와 pH 의존성 CPP를 포함하는 엔도좀 파괴 물질이나 엔도좀 융합 펩타이드 등을 부착시켜 사용할 수 있다.Poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) is linked by a biodegradable peptide bond and can be delivered into cells by forming an ionic complex with AM. Because there is a limit, it can be used by attaching endosome-destroying substances or endosome fusion peptides including CPP and pH-dependent CPP.

현재 가장 흔히 사용되는 AM의 안정화 물질은 양전하를 띠는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이나 체내 독성이 있어 사용에 제한이 있는 단점이 있다. 이에 반하여 본 발명의 PS은 세포독성이 없으며 음전하를 띠는 세포막(엔도솜의 막)으로의 투과와 AM의 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 증진시켜 AM이 안전하게 세포질로 방출될 수 있도록 하는 장점이 있다.Currently, the most commonly used stabilizing material for AM is polyethylenimine (PEI), which has a positive charge, but has a limitation in its use due to toxicity in the body. In contrast, the PS of the present invention has no cytotoxicity and promotes penetration into negatively charged cell membranes (membrane of endosomal) and endosomal escape of AM so that AM can be safely released into the cytoplasm. have.

세포 침투성 펩타이드(CPP)는 화물 분자를 세포로 운반하는 데 광범위하게 사용된다. CPP는 세포 내에서 화물의 안정성과 생체 이용률을 증가시킨다. 따라서, AM을 전달하기 위한 CPP의 사용은 상당한 치료 이점을 가질 수 있다. 음으로 하전된 AM을 양전하를 띤 펩타이드에 결합시키는 일반적인 방법은 비공유 정전기 상호 작용이다. Cell penetrating peptides (CPPs) are used extensively to transport cargo molecules into cells. CPP increases the stability and bioavailability of cargo in cells. Thus, the use of CPPs to deliver AM may have significant therapeutic benefits. A common method for binding negatively charged AMs to positively charged peptides is non-covalent electrostatic interactions.

본 발명에 따르면, 본 발명은 AM/PS 기본입자(10)를 제공한다.According to the present invention, the present invention provides an AM/PS elementary particle (10).

본 발명에 따르면, 상기 AM/PS 기본입자(10)는 AM과 PS이 1:0.4∼1:5 범위의 질량비로 혼합되어 제조되며 200nm이하의 크기를 가지고 있고 양전하 특성을 보이는 특징이 있다.According to the present invention, the AM/PS basic particles 10 are manufactured by mixing AM and PS in a mass ratio ranging from 1:0.4 to 1:5, have a size of 200 nm or less, and exhibit positive charge characteristics.

상기 AM 및 PS의 중량비는 1:0.2~5, 바람직하게는 1:0.4~3.0일 수 있다. w/w의 비가 1:2.5 이하의 환경에서는 더욱 응축되다가 1:5 이상으로 PS가 추가될 경우 입자가 마이크로 이상의 크기가 될 수 있다.The weight ratio of AM and PS may be 1:0.2-5, preferably 1:0.4-3.0. In an environment with a w/w ratio of 1:2.5 or less, it is further condensed, and when PS is added at a ratio of 1:5 or more, the particles may become microscopic or larger.

본 발명의 입자는 물리 화학적 안정성으로 고순도의 물에서 안정적으로 유지되지만, 콜로이드 시스템에 염을 첨가하면 입자는 빠르게 응집될 수 있다. 소위 '입자'이라고 불리는 이들 1세대 AM/PS 입자의 또 다른 단점은 입자에서부터 AM의 낮은 방출일 수도 있다.Although the particles of the present invention remain stable in high-purity water due to their physicochemical stability, the addition of salts to the colloidal system can result in rapid agglomeration of the particles. Another disadvantage of these first-generation AM/PS particles, so-called 'particles', may be the low emission of AM from the particles.

두 가지 문제를 극복하기 위해, 입자의 응집을 방지하기 위해 생분해성, 무독성 거대 분자, 음전하를 띤 나노입자 또는 염을 조사했다. 또한, AM과 PS 사이의 세포 내 해리 (dissociation)는 양친매성 생체 고분자, 음전하를 띤 나노입자 및 염으로 강화될 수 있다. To overcome both problems, biodegradable, non-toxic macromolecules, negatively charged nanoparticles or salts were investigated to prevent agglomeration of particles. In addition, intracellular dissociation between AM and PS can be enhanced with amphiphilic biopolymers, negatively charged nanoparticles and salts.

상기 '양친매성 생체 고분자'는 친수성 (hydrophilic) 부분 및 소수성 (hydrophobic) 부분을 모두 가진 고분자를 말한다. 양친매성 고분자로는 예를 들어 키토산(chitosan), 폴록사머((폴리에틸렌옥사이드)-(폴리프로필렌옥사이드)-(폴리에틸렌옥사이드)), 폴리비닐알콜, tween 20, triton X-100, 폴리락타이드, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드-co-글리코리드, 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드 및 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드로 이루어진 폴리에스터군과 더불어 폴리카보네이트군, 폴리오쏘에스터군이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. The 'amphiphilic biopolymer' refers to a polymer having both a hydrophilic moiety and a hydrophobic moiety. Examples of the amphiphilic polymer include chitosan, poloxamer ((polyethylene oxide)-(polypropylene oxide)-(polyethylene oxide)), polyvinyl alcohol, tween 20, triton X-100, polylactide, poly -ε-caprolactone, polylactide-co-glycolide, poly(lactide-co-ε-caprolactone), poly-ε-caprolactone-co-glycolide and poly-ε-caprolactone-co-glyco In addition to the polyester group consisting of lead-co-lactide, the polycarbonate group and the polyorthoester group are included, but are not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 양친매성 생체 고분자는 장기간에 걸쳐 생체에 악영향을 나타내지 않고 원래의 기능을 다하면서 생체와 공존할 수 있는 '생체적합성 고분자'일 수 있다. 생체 적합성 물질로는 예를 들어 키토산, 폴리락틱코글라이콜릭산, 폴리락틱산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜 및 폴리아크릴 아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 등이 포함되며 이로 제한되는 것은 아니다. 키토산은 서서히 분해됨으로써 지속적인 방출을 나타낼 수 있다는 장점을 가진다.The amphipathic biopolymer used in the present invention may be a 'biocompatible polymer' that can coexist with a living body while performing its original function without adversely affecting the living body over a long period of time. Biocompatible materials include, for example, chitosan, polylacticcoglycolic acid, polylactic acid, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene, polytrimethylene glycol, polylactic acid and derivatives thereof, polyacrylic acid and derivatives thereof, Poly(amino acids), polyurethanes, polyphosphazines, poly(L-lysine), polyalkylene oxides, polysaccharides, dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and polyacrylamides, and copolymers of two or more thereof A group consisting of a coalescence is included, but is not limited thereto. Chitosan has the advantage that it can exhibit a sustained release by slowly decomposing.

본 발명에 사용되는 양친매성 생체 고분자는 적어도 분해의 한 과정에서 생물의 대사가 관여하여 저분자량 화합물로 변하는 '생분해성 고분자'일 수 있다. 생분해성 고분자로는 예를 들어 키토산, 탄수화물, 단백질, 셀룰로오스, 폴리아미노산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리트리메틸렌 글리콜, 폴리락트산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체, 폴리(아미노산), 폴리우레탄, 폴리포스파진, 폴리(L-라이신), 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜 및 폴리아크릴 아마이드 및 이들의 둘 이상의 공중합체로 이루어진 그룹 등이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. The amphiphilic biopolymer used in the present invention may be a 'biodegradable polymer' that is converted into a low molecular weight compound by being involved in the metabolism of an organism in at least one process of decomposition. Biodegradable polymers include, for example, chitosan, carbohydrates, proteins, cellulose, polyamino acids, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene, polytrimethylene glycol, polylactic acid and derivatives thereof, polyacrylic acid and derivatives thereof, poly( amino acids), polyurethane, polyphosphazine, poly(L-lysine), polyalkylene oxide, polysaccharide, dextran, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and polyacrylamide and copolymers of two or more thereof The group consisting of, etc. are included, but are not limited thereto.

본 발명에서, 양친매성 고분자 용액은 물에 용해시켜 제조하며, 용해도를 높이기 위하여 아세트산, 인산, 염산, 시트르산, 질산, 등의 산 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 암모니아 등의 알칼리를 In the present invention, the amphiphilic polymer solution is prepared by dissolving in water, and in order to increase solubility, acids such as acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, citric acid, nitric acid, or sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, ammonia, etc. alkali

첨가할 수 있다. 예를 들어, 키토산을 사용할 경우 아세트산과 같은 약산에 용해시킬 수 있으며, 이때 키토산은 양전하를 띄게 된다.can be added. For example, when using chitosan, it can be dissolved in a weak acid such as acetic acid, and at this time, chitosan is positively charged.

상기 음전하를 띤 나노입자는 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al) 등과 같은 전도성 금속원소 또는 이들의 금속산화물이 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 그룹으로부터 선택되는 나노입자일 수 있다. The negatively charged nanoparticles are silver (Ag), gold (Au), platinum (Pt), copper (Cu), tin (Sn), iron (Fe), nickel (Ni), ruthenium (Ru), titanium (Ti) ), tantalum (Ta), niobium (Nb), zirconium (Zr), aluminum (Al), etc. conductive metal elements or metal oxides thereof are synthesized in one or more combinations It can be a nanoparticle selected from the group have.

사람 혈청 알부민 (HSA)은 이러한 문제들을 해결할 수 있는 유망한 후보자일 수 있다. 약 65,000Da의 분자량과 생리 조건에서 약간 음의 표면 전하를 갖는 HSA는 및 미립자 제제 및 다른 의약품에서 널리 사용되는 무독성 거대 분자로 HSA는 보호 콜로이드이다. 이 콜로이드는 입자 매트릭스에만 작은 양으로 포획된다. 대부분의 거대 분자는 주변 매질에 남겨져 입자의 2차 응집을 억제한다. 높은 HSA 농도 (1000 ㎍/ml)에서 입자가 완전히 HSA로 코팅되어 이 보호 콜로이드에 의해 입자의 안정성이 연장될 수 있다. Human serum albumin (HSA) may be a promising candidate to solve these problems. With a molecular weight of about 65,000 Da and a slightly negative surface charge under physiological conditions, HSA is a non-toxic macromolecule widely used in particulate formulations and other pharmaceuticals. HSA is a protective colloid. These colloids are trapped only in small amounts in the particle matrix. Most of the macromolecules are left in the surrounding medium to inhibit secondary aggregation of the particles. At a high HSA concentration (1000 μg/ml), the particles can be completely coated with HSA so that the stability of the particles can be prolonged by this protective colloid.

B. 음이온성 분자B. Anionic Molecules

본 발명의 응용입자(20)는 상기 양이온성 분자층(21) 외면에 코팅된 음이온성 분자층(22)을 포함한다.The applied particle 20 of the present invention includes an anionic molecular layer 22 coated on the outer surface of the cationic molecular layer 21 .

상기 AM 입자 외면을 코팅하고 있는 양이온성 분자층(21)은 강한 양전하를 띠고 있어 질환의 병변인 표적 조직 장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 분자를 사용하여 2차로 상기 양이온성 분자층 외면에 코팅하였다.Since the cationic molecular layer 21 coating the outer surface of the AM particle has a strong positive charge, there is a problem in that it is difficult to pass through the target tissue barrier, which is a disease lesion. In the present invention, in order to solve this problem, anionic molecules having good biocompatibility and having a negative charge were secondarily coated on the outer surface of the cationic molecular layer.

상기 음이온성 분자층(22) 코팅단계는 음이온성 분자를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 분자층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.The coating step of the anionic molecular layer 22 is a step of adding anionic molecules and coating the anionic molecular layer on the outer surface of the particles by electrostatic attraction.

본 발명에 있어서, AM과 이온 복합체를 형성하기 위하여 반드시 양이온성 분자를 더 포함한다. 즉 음전하의 AM은 양이온성 분자와 정전기적 상호작용으로 인해 양이온성 분자 내부에 봉입된 이온 복합체를 형성하고, 형성된 이온 복합체는 입자의 코어 부분에 위치한다. In the present invention, in order to form an ionic complex with AM, a cationic molecule is necessarily further included. That is, the negatively charged AM forms an ionic complex enclosed in the cationic molecule due to the electrostatic interaction with the cationic molecule, and the formed ionic complex is located in the core portion of the particle.

본 발명의 음이온성 분자는 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates) 및 음이온성 지질에서 선택될 수 있다.The anionic molecule of the present invention is heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, carboxy methyl cellulose, pectin, carbopols, polyacrylates (Polyacrylates) and anionic lipids.

상기 음이온성 지질은 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.The anionic lipid may be selected from the group consisting of phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol.

상기 음이온성 분자는 음전하를 띄며 생체적 합성이 있는 분자를 제한없이 사용할 수 있다. The anionic molecule has a negative charge and a molecule having biosynthesis can be used without limitation.

헤파린은 히드록시기, 카복실기 및 아미노기를 포함하는 구조로, 비분획 헤파린, 분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파린 단편, 재조합 헤파린, 헤파린 유사체, 헤파란 설페이트, 헤파린 활성을 갖는 설폰화된 다당류 등을 사용할 수 있다.Heparin has a structure including a hydroxyl group, a carboxyl group and an amino group. Unfractionated heparin, molecular weight heparin, low molecular weight heparin, heparin fragment, recombinant heparin, heparin analog, heparan sulfate, sulfonated polysaccharide having heparin activity, etc. can be used. have.

상기 히알루론산(HA)은 기본단위로 디사카라이드 글루쿠로닌산-β(1-3) N-아세틸글루코즈-아민β(1-4)이 최고 50,000쌍으로 구성된 큰 복합 올리고사카라이드이다. 이는 세포외 매트릭스의 주요 성분으로써 생체내에서 발견된다. 이의 3차 구조는 직경이 약 50㎚인 무작위(random) 코일 형태이다.The hyaluronic acid (HA) is a large complex oligosaccharide composed of up to 50,000 pairs of disaccharide glucuronic acid-β(1-3) N-acetylglucose-amine β(1-4) as basic units. It is found in vivo as a major component of the extracellular matrix. Its tertiary structure is in the form of a random coil with a diameter of about 50 nm.

히알루론산(HA)은 전신 또는 국소적으로 인체의 질병과 질환을 치료하는데 사용되어 왔는 데 그 이유는 질병 또는 질환이 있는 부위로 활성물질을 표적 제공하는 능력이 있기 때문이다. 실험동물에서 손상된 경동맥(손상이 안 된 대측 동맥에 대해)과 대장암에서 HA가 형성됨을 볼 수 있고 이와 같은 실험동물의 피부에 유지된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 사용 가능한 상기 음이온성 분자로의 중량 평균 분자량은 5 ~ 90 K 범위일 수 있다.Hyaluronic acid (HA) has been used to treat diseases and disorders in the human body either systemically or locally because of its ability to target active substances to diseased or diseased sites. It is known that HA can be seen in the damaged carotid artery (for the intact contralateral artery) and colorectal cancer in experimental animals and is maintained in the skin of these animals. The weight average molecular weight of the anionic molecule usable in the present invention may be in the range of 5 to 90 K.

히알루론산 등의 상기 음이온성 분자층(21)은 상기 양이온성 분자층(22) 외면에 정전기적 인력으로 코팅된다. 상기 AM 입자와 상기 히알루론산의 중량비가 1:0.5~2(AM:HA) 범위일 수 있다.The anionic molecular layer 21 such as hyaluronic acid is coated on the outer surface of the cationic molecular layer 22 by electrostatic attraction. The weight ratio of the AM particles to the hyaluronic acid may be in the range of 1:0.5-2 (AM:HA).

본 발명의 히알루론산(hyaluronic acid)은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로 세포독성이 없는 천연 분자 물질이며 체내 안정성이 뛰어나고 상기 히알루론산을 흡수할 수 있는 다양한 수용체가 존재하는 장점이 있다. 체내에 존재하는 히알루론산 수용체 중 CD44 수용체는 대부분의 암세포에 과발현되는 수용체로서 암을 선택적으로 표적하는 치료제의 타겟으로 사용될 수 있다.Hyaluronic acid of the present invention is one of the complex polysaccharides composed of amino acids and uronic acid, and is a natural molecular substance without cytotoxicity. Among the hyaluronic acid receptors present in the body, the CD44 receptor is overexpressed in most cancer cells and can be used as a target for therapeutic agents that selectively target cancer.

상기 음이온성 분자층은 최외곽층을 형성하고, 따라서, 상기 입자도 그 외부가 (-)전하를 나타낸다. 정상 피부의 경우에는 입자 표면의 정전기적 성질이 피부의 투과에 영향을 약간 미치긴 하는데, 양이온성 성질이 이를 더 높인다고 알려져 있다. 하지만, 피부 같은 경우에는 피지 지질(sebaceous lipid)과 상피 인지질(epidermal phospholipid)에서의 지방산의 구조가 손상되며, 이러한 결과로 인한 피부의 산성도(acidity)의 감소는 본 발명과 같이 (-) 성질을 띤 음이온성 입자의 침투를 용이하게 만든다.The anionic molecular layer forms the outermost layer, and thus, the particle also exhibits a negative charge on the outside thereof. In the case of normal skin, it is known that the electrostatic properties of the particle surface slightly affect the skin permeation, but the cationic properties increase this. However, in the case of skin, the structure of fatty acids in sebaceous lipids and epidermal phospholipids is damaged, and the decrease in acidity of the skin as a result of this is a (-) property as in the present invention. It facilitates the penetration of strong anionic particles.

본 발명의 약물 조성물은 약학적 유효성분인 AM(코어), 양이온성 분자층(중간층) 및 음이온성 분자층(최외각층)로 구성되며, 입자 크기는 50~500nm, 바람직하게는 100~400nm, 더욱 바람직하게는 150~300nm 일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 코어로 제공되는 약학적 유효성분으로 AM 하이드로겔보다 입자 사이즈가 감소되었다.The drug composition of the present invention is composed of a pharmaceutically active ingredient AM (core), a cationic molecular layer (middle layer) and an anionic molecular layer (outermost layer), and the particle size is 50 to 500 nm, preferably 100 to 400 nm, More preferably, it may be 150 to 300 nm. The pharmaceutical composition of the present invention has a reduced particle size than the AM hydrogel as a pharmaceutically active ingredient provided as a core.

*본 발명은 상기 AM과 양이온성 분자 복합체의 외면층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 피부 내 AM을 분해시키는 효소로부터 핵산 입자를 보호할 수 있다.* Since the present invention further includes an outer layer of the AM and the cationic molecular complex and a hyaluronic acid layer, it is possible to protect the nucleic acid particles from enzymes that decompose AM in the skin.

또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 약학적 유효성분으로 하는 AM을 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 입자를 제공할 수 있다.In addition, the present invention reduces the particle size to nano size by condensing AM as a pharmaceutical active ingredient having a micro size or nano size equivalent thereto, and also coating the outermost layer with hyaluronic acid having a negative charge As a result, it is possible to provide particles that easily pass through the skin barrier.

C. 변형된 이온성 분자C. Modified Ionic Molecules

<변형된 양이온 분자> <Modified Cationic Molecules>

본 발명에 따르면, 상기 AM은 이온 복합체의 양이온성 분자와 정전기적 상호작용으로 결합되어 있으며, 상기 양이온성 분자에 공유결합된 담즙산 또는 그의 유도체는 친수성의 이온성 기를 가진 형태로 입자의 표면에 위치하게 할 수도 있다.According to the present invention, the AM is bound to the cationic molecule of the ion complex by electrostatic interaction, and the bile acid or its derivative covalently bound to the cationic molecule is located on the surface of the particle in the form of a hydrophilic ionic group. may make it

담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 양이온성 분자 및 AM을 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 입자를 제공한다.A bile acid or bile acid derivative comprises one or more cationic molecules covalently bound and an AM, wherein the covalently bound bile acid or bile acid derivative has an ionic group.

본 발명의 입자는 AM과 양이온성 분자의 이온 복합체를 포함하며, 상기 양이온성 분자는 담즙산과 공유결합된 형태일 수도 있다.The particles of the present invention include an ionic complex of AM and a cationic molecule, and the cationic molecule may be covalently bound to a bile acid.

본 발명의 입자는 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 양이온성 분자 및 AM 간의 정전기적 상호작용으로 형성되거나, 담즙산 또는 이의 유도체가 공유결합된 음이온성 분자, 양이온성 분자 및 AM 간의 정전기적 상호작용으로 형성된 것으로, 보다 안전하게 AM의 세포 내재화를 유도할 수 있다.The particles of the present invention are formed by an electrostatic interaction between a cationic molecule and AM to which a bile acid or a derivative thereof is covalently bonded, or an anionic molecule, a cationic molecule and an AM to which a bile acid or a derivative thereof is covalently bonded. As it is formed, it is possible to more safely induce cellular internalization of AM.

즉, 본 발명의 AM 입자는 양이온성 분자와 AM의 이온 복합체가 입자의 코어에 존재하며, 친수성의 이온성 기를 가지는 담즙산이 입자의 표면에 위치하는, 담즙산이 표면 수식된 형태의 입자이다.That is, the AM particle of the present invention is a particle in which a bile acid is surface-modified, in which a cationic molecule and an ionic complex of AM exist in the core of the particle, and a bile acid having a hydrophilic ionic group is located on the surface of the particle.

상기 AM을 표적 세포로 전달하기 위하여 본 발명의 담즙산이 표면 수식된 입자를 사용하는 경우 장 점막을 통해 AM을 잘 전달함과 동시에 입자의 코어에 존재하는 이온 복합체로 인하여 위장관에서 매우 안정하였다. 이로부터 본 발명에 따른 AM 전달용 입자는 경구 투여용으로 매우 적합함을 알 수 있다.In the case of using the surface-modified particles of the bile acid of the present invention in order to deliver the AM to target cells, AM was well delivered through the intestinal mucosa, and at the same time, it was very stable in the gastrointestinal tract due to the ionic complex present in the core of the particle. From this, it can be seen that the particles for AM delivery according to the present invention are very suitable for oral administration.

본 발명에서 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 상기 이온성 분자와 공유결합될 수 있는 작용기 이외에 친수성의 이온성 기를 가지고 있는 것으로, 디옥시콜린산 (DCA: deoxycholic acid), 우로디옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (TCA: taurocholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In the present invention, the bile acid or its derivative has a hydrophilic ionic group in addition to a functional group capable of covalent bonding with the ionic molecule, and includes deoxycholic acid (DCA), taurodeoxycholic acid) , taurocholic acid (TCA: taurocholic acid), may be selected from the group consisting of glycocholic acid (glycocholic acid) and glycochenodeoxycholic acid (glycochenodeoxycholic acid).

상기 담즙산은 소장의 회장 부분을 통해 95%이상의 높은 효율로 흡수가 되어 간으로 흡수되는데 이를 '장간순환(enterohepatic circulation)'이라 하며, 이러한 장간순환으로 지질 이동에 중요한 역할을 하는 생물학적 계면활성제로, 말단 장 부분에 존재하는 ASBT(apical sodium-dependent bile acid transporter)에 의해 특이적으로 인식되므로, 경구 전달에 있어서 표적 리간드로 작용할 수 있다.The bile acid is absorbed into the liver with a high efficiency of more than 95% through the ileum of the small intestine, which is called 'enterohepatic circulation'. Since it is specifically recognized by ASBT (apical sodium-dependent bile acid transporter) present in the distal intestinal region, it can act as a targeting ligand in oral delivery.

즉, 회장 부분을 통해 흡수가 이루어지는 답즙산은 상기 AM 전달용 입자의 표면에 위치함으로써 ASBT를 통하여 기존의 경구 투여 방식의 가장 큰 문제점인 장 내벽을 통한 상기 AM 전달용 입자의 타겟 세포내 흡수를 증대시키는 역할을 한다. 이로 인하여 본 발명의 AM 전달용 입자는 담즙산을 흡수하는 회장 부분을 통해 흡수가 용이하므로 경구용으로 사용될 수 있으며, 이로 인하여 약물의 생체내 이용률을 증대시킬 수 있다.That is, the bile acid, which is absorbed through the ileum, is located on the surface of the particles for AM delivery, so that the target intracellular absorption of the particles for AM delivery through the intestinal lining, the biggest problem of the conventional oral administration method, is increased through ASBT. serves to make Due to this, the particles for AM delivery of the present invention can be used orally because they are easily absorbed through the ileum for absorbing bile acids, thereby increasing the bioavailability of the drug.

본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 이의 유도체는 이온성 분자의 작용기 수에 따라 공유결합되는 정도가 달라질 수 있다. 바람직하게 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 이온성 분자는 1:1 내지 1:300의 몰비로 공유결합될 수 있다.In the present invention, the degree of covalent bonding of the bile acid or its derivative may vary depending on the number of functional groups of the ionic molecule. Preferably, the bile acid or its derivative and the ionic molecule may be covalently bonded in a molar ratio of 1:1 to 1:300.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 키토산의 경우 1:1 내지 1:100의 몰비로 공유결합될 수 있다.Preferably, the bile acid or its derivative and chitosan may be covalently bonded in a molar ratio of 1:1 to 1:100.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 헤파린의 경우 1:1 내지 1:30의 몰비로 공유결합될 수 있다.Preferably, the bile acid or its derivative and heparin may be covalently bonded in a molar ratio of 1:1 to 1:30.

바람직하게, 상기 담즙산 또는 이의 유도체 및 히알루론산의 경우에는 1:1 내지 1:200의 몰비로 공유결합될 수 있다.Preferably, the bile acid or its derivative and hyaluronic acid may be covalently bonded in a molar ratio of 1:1 to 1:200.

본 발명에 있어서, 상기 AM 입자는 입자 크기에 관계없이 흡수가 가능하나, 바람직하게는 500 nm 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 nm이다.In the present invention, the AM particles can be absorbed regardless of the particle size, preferably 500 nm or less, more preferably 100 to 300 nm.

본 발명에 있어서, AM과 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 이온성 분자는 1:0.5 내지 1:70의 질량비, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5의 질량비로 결합될 수 있다. In the present invention, AM and the ionic molecule to which the bile acid or the bile acid derivative is ionically bonded may be bound in a mass ratio of 1:0.5 to 1:70, preferably 1:0.5 to 1:5.

본 발명에 있어서, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체가 이온결합된 AM 및 양이온성 분자는 1:0.5 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5 질량비로 혼합될 수 있다. 양이온성 분자가 결합할 수 있는 한계가 있고 최적의 강한 결합능력을 가질 수 있는 범위에서만 전달이 가능하기 때문에 상기 범위 내에서 양이온성 분자와 AM의 정전기적 상호작용에 따른 이온복합체의 형성이 잘 이루어진다.In the present invention, the AM and the cationic molecule to which the bile acid or bile acid derivative is ionically bound may be mixed in a mass ratio of 1:0.5 to 1:10, preferably 1:0.5 to 1:5. Since there is a limit to which cationic molecules can bind and delivery is possible only in a range that can have an optimal strong binding ability, the formation of an ionic complex is well achieved within the above range according to the electrostatic interaction between the cationic molecule and AM. .

<변형된 음이온 분자><Modified Anion Molecules>

또한, 본 발명은 담즙산 또는 담즙산 유도체가 공유결합된 1종 이상의 음이온성 분자 및 AM/양이온성 분자 복합체를 포함하고, 상기 공유결합된 담즙산 또는 담즙산 유도체는 이온성 기를 가지고 있는 AM 입자를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention includes at least one anionic molecule and an AM/cationic molecule complex covalently bound to a bile acid or bile acid derivative, and the covalently bound bile acid or bile acid derivative includes AM particles having an ionic group as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition comprising.

본 발명의 타우로콜린산은 담즙산의 일종으로 체내에서 분비되어 소화과정 중 지질 또는 비타민의 흡수를 돕는 물질로 알려져 있으며 장간 순환을 통해 90%이상 재흡수되는 특징이 있다. 상기 타우로콜린산은 소화과정에서 소장 말단에서 ASBT(Apical Sodium dependent Bile acid Transporter)에 의하여 대부분이 흡수된다. 따라서 타우로콜린산을 히알루론산에 결합하여 입자를 제조하면 소장에서의 경구 흡수율을 향상시킬 수 있으며 장간 순환을 통한 전달성이 향상되는 장점이 있다.Taurocholic acid of the present invention is a type of bile acid, secreted in the body and known as a substance that helps the absorption of lipids or vitamins during the digestive process, and is characterized by being reabsorbed by more than 90% through enteric circulation. Most of the taurocholic acid is absorbed by ASBT (Apical Sodium Dependent Bile Acid Transporter) at the end of the small intestine during digestion. Therefore, when taurocholic acid is combined with hyaluronic acid to prepare particles, the oral absorption rate in the small intestine can be improved, and delivery through the enteric circulation is improved.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid)-타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제공한다.According to one embodiment of the present invention, the present invention provides a hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1~1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합되어 제조되며 음전하를 띠는 특징이 있다.According to another embodiment of the present invention, in the hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate of the present invention, hyaluronic acid and taurocholic acid are added in a molar ratio of 1:1 to 1:100 (feed mole ratio, hyaluronic acid: taurocholine). acid), and has the characteristic of having a negative charge.

상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 양전하의 특성을 띠면 양전하의 특성을 가지는 AM/PS 결합체와 결합할 수 없는 단점이 있다.If the hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate has a positive charge, there is a disadvantage in that it cannot be combined with the AM/PS conjugate having a positive charge.

본 발명에 따르면, 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1-1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산:타우로콜린산)로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1-1:50 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있으며 보다 바람직하게는 1:10 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있다.According to the present invention, the hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate is prepared by mixing hyaluronic acid and taurocholic acid in a feed mole ratio in the range of 1:1-1:100 (feed mole ratio, hyaluronic acid: taurocholic acid). can do. Preferably, the hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate can be prepared by mixing hyaluronic acid and taurocholic acid in an addition molar ratio in the range of 1:1-1:50, and more preferably in an addition molar ratio in the range of 1:10. It can be prepared by mixing.

상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:1 범위 미만의 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 AM/PS 복합체를 코팅하는데 효율적이지 않으며 상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:100 범위를 초과한 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 결합비율이 유사한 히알루론산-타우로콜린산 결합체만이 만들어지므로 경제적으로 효율적이지 않다.If it is prepared by mixing the hyaluronic acid and taurocholic acid in an addition molar ratio of less than 1:1, it is not efficient to coat the AM/PS complex, and the addition molar ratio of the hyaluronic acid and taurocholic acid exceeds the 1:100 range. It is not economically efficient because only a hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate having a similar binding ratio is produced when prepared by mixing with .

본 발명의 경구투여용 AM 입자는 상기 AM/PS 복합체가 히알루론산-타우로콜린산 결합체에 의해 코팅된 형태를 가진다.The AM particles for oral administration of the present invention have a form in which the AM/PS complex is coated with a hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate.

상세하게는 본 발명의 경구투여용 AM 입자는 내부에 상기 AM/PS 복합체가 위치하고 상기 AM/PS 복합체의 표면에 상기 히알루론산-타우로콜린산 결합체가 코팅된 형태를 가지며 음전하의 특성을 가지고 입자의 직경이 250nm 이하이며 상기 AM/PS 단백질 복합체의 봉입률이 90% 이상인 특징이 있다.Specifically, the AM particles for oral administration of the present invention have a form in which the AM/PS complex is located and the hyaluronic acid-taurocholic acid conjugate is coated on the surface of the AM/PS complex, and has a negative charge. has a diameter of 250 nm or less and an encapsulation rate of the AM/PS protein complex of 90% or more.

상기 AM/PS 입자의 직경이 100nm를 초과하면 하기 HA-TCA 결합체의 코팅으로 제조된 AM/PS/HA-TCA 입자의 크기가 250nm를 초과하여 입자로서의 장점이 사라질 수 있으므로 이를 고려하여 상기 AM/PS 입자의 직경이 100nm 이하가 되도록 제조하는 것이 바람직하다. 또한 상기 AM/PS 입자의 전하특성이 음전하를 띠게 되면 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체와의 결합(코팅)이 어려운 단점이 있으므로 상기 AM/PS 입자가 양전하를 띠도록 제조하는 것이 바람직하다.When the diameter of the AM/PS particles exceeds 100 nm, the size of the AM/PS/HA-TCA particles prepared by the coating of the following HA-TCA conjugate exceeds 250 nm, so the advantages as particles may disappear. It is preferable to manufacture so that the diameter of PS particle|grains may become 100 nm or less. In addition, when the charge characteristics of the AM/PS particles are negatively charged, it is difficult to bind (coating) with the negatively charged HA-TCA conjugate, so it is preferable to prepare the AM/PS particles to have a positive charge.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 AM/PS/HA-TCA 입자의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the AM/PS/HA-TCA particles.

또한, 상기 음이온 분자에 표적화 분자를 공유결합으로 연결할 수도 있다. 상기 AM 입자를 능동적 운반체로 사용할 수 있다. 상기 표적화 분자는 세포표면에 결합하는 화합물, 항체 또는 펩타이드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다.In addition, the targeting molecule may be covalently linked to the anionic molecule. The AM particles can be used as active carriers. The targeting molecule may be a cell surface-binding compound, antibody or peptide, aptamer, or a combination thereof.

V. 치료방법V. Treatment

임의의 AM 입자는 치료방법에 사용될 수 있다. AM 입자가 의약용으로 제공된다. 추가 국면에서, 암 치료의 AM 입자가 제공된다. 치료방법에 사용하기 위한 AM 입자가 제공된다. Any AM particle can be used in a method of treatment. AM particles are provided for medicament. In a further aspect, AM particles for the treatment of cancer are provided. AM particles for use in a method of treatment are provided.

본 발명은 개체에게 유효량의 AM 입자 투여하는 것을 포함하는, 암이 있는 개체의 치료방법에 사용하기 위한 AM 입자를 제공한다. 그 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기에 따르면, "개체" 는 특히 인간이다.The present invention provides AM particles for use in a method of treating a subject having cancer comprising administering to the subject an effective amount of the AM particles. The method further comprises administering to the subject an effective amount of one or more additional therapeutic agents. According to the above, the "individual" is in particular a human being.

의약의 제작 또는 제조를 위한 발명에 보고된 AM 입자의 용도가 제공된다. 의약은 암 치료이다. 의약은 암이 있는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법에서의 사용을 위한 것이다. 임의의 상기에서 "개체" 는 인간일 수 있다.The use of the AM particles as reported in the invention for the manufacture or manufacture of a medicament is provided. Medicine is cancer treatment. The medicament is for use in a method of treating cancer comprising administering to a subject having cancer an effective amount of the medicament. An "individual" in any of the above may be a human.

본 발명에서 암 치료방법이 제공된다. 그 방법은 그러한 암이 있는 개체에게 유효량의, 발명에 보고된 AM 입자를 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기에 따르면 "개체" 는 인간일 수 있다.The present invention provides a method for treating cancer. The method comprises administering to a subject having such cancer an effective amount of the AM particles as reported herein. An "individual" according to any of the above may be a human.

임의의 상기 치료방법에 사용하기 위한 발명에 제공되는 임의의 AM 입자가 제공된다. 약제학적 제형물은 발명에 제공되는 임의의 AM 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 또다른 약제학적 제형물은 발명에 보고된 임의의 AM 입자 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 함유한다.There is provided any AM particle provided herein for use in any of the above methods of treatment. The pharmaceutical formulation contains any of the AM particles provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier. Another pharmaceutical formulation contains any of the AM particles reported herein and one or more additional therapeutic agents.

AM 입자는 단독으로 또는 치료요법의 여타 약제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명에 보고된 AM 입자는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 병용 투여될 수 있다.AM particles can be used alone or in combination with other agents in therapy. For example, the AM particles as reported herein may be administered in combination with one or more additional therapeutic agents.

상기 언급한 그러한 병용 치료요법은 병용 투여(둘 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형물에 포함되어 있음), 및 별도 투여를 포함하며, 여기서 본 발명의 AM 입자의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 아쥬반트 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그에 후속하여 일어날 수 있다. 발명에 보고된 AM 입자는 또한 방사선 치료요법과 병용될 수 있다.Such combination therapies as mentioned above include combined administration (two or more therapeutic agents are included in the same or separate formulations), and separate administration, wherein administration of the AM particles of the present invention is administered with an additional therapeutic agent and/or adjuvant. It may occur prior to, concurrently with, and/or subsequent to administration. The AM particles reported herein can also be used in combination with radiation therapy.

AM 입자는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 비경구, 폐내 및 비강내, 및 필요에 따라 국소 치료, 병소내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다.The AM particles may be administered by any suitable means, including oral, parenteral, intrapulmonary and intranasal, and, if desired, topical treatment, intralesional administration.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구용으로 투여되며 상기 조성물에 포함되는 약물의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered orally, and the concentration of the drug contained in the composition is determined in consideration of the therapeutic purpose, the patient's condition, the required period, the severity of the disease, and the like, and is not limited to a concentration within a specific range.

비경구 주입에는, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 부분적으로는, 예를 들어 투여가 간단한 것인지 또는 만성인 것인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 실시될 수 있다. 다양한 시점에서의 단일 또는 다중 투여 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 발명에서 고려된다.Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. Administration may be effected by any suitable route, eg by injection such as intravenous or subcutaneous injection, depending in part on whether administration is brief or chronic, for example. Various dosing schedules are contemplated by the invention, including single or multiple administrations at various time points and pulse infusions.

AM 입자는 건실한 의료 행위와 일치되는 방식으로 제형화, 분량조절 및 투여될 것이다. 그러한 맥락에서 고려되는 요인에는 치료할 특정 장애, 치료할 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 행위에 있어 널리 공지된 여타 요인이 포함된다. AM 입자는 반드시 그런 것은 아니나, 임의로는 관심 대상의 장애의 예방 또는 치료에 현재 통용되는 하나 이상의 약제와 병용하여 제형화될 수도 있다. 그러한 타 약제의 유효량은 제형물에 존재하는 AM 입자의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 여타 요인들에 좌우된다. 그들은 일반적으로 발명에 기재된 것과 동일한 투여량으로 그리고 투여 경로로, 또는 발명에 기재된 투여량의 약 1% 내지 99% 의 범위로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절하다고 결정된 임의의 경로를 통해 사용된다.AM particles will be formulated, dosed and administered in a manner consistent with sound medical practice. Factors considered in that context include the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of drug delivery, the method of administration, the schedule of administration, and other factors well known in medical practice. AM particles may, but need not be, optionally formulated in combination with one or more agents currently used for the prevention or treatment of a disorder of interest. The effective amount of such other agents will depend on the amount of AM particles present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors discussed above. They are generally used in the same dosages and routes of administration as those described herein, or in the range of about 1% to 99% of the doses described herein, or via any route determined empirically/clinically to be appropriate. .

질환의 예방 또는 치료를 위해, 발명에 보고된 AM 입자(단독으로 사용시, 또는 하나 이상의 여타 추가적인 치료제와 병용시)의 적절한 투여량은 치료할 질환의 유형, AM 입자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, AM 입자가 투여되는 목적(예방 또는 치료), 과거의 치료경력, 환자의 임상 히스토리 및 AM 입자에 대한 응답성, 및 담당의의 재령에 좌우된다. AM 입자는 1회 또는 일련의 치료에서 환자에게 적하하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서는, 약 1㎍/kg 내지 15㎍/kg(예를 들어, 0.1㎍/kg 내지 10㎍/kg)의 AM 입자가, 예를 들어 1 회 이상의 구분되는 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량이 될 수 있다. 한가지 전형적인 1 일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100㎍/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 병태에 따라 수일간 또는 그 이상 반복되는 투여를 위해, 질환 병후의 원하는 억제가 나타날 때까지 치료는 일반적으로 지속될 수 있다. AM 입자의 한가지 예시적인 투여량은 약 0.05㎍/kg 내지 약 10㎍/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5㎍/kg, 2.0㎍/kg, 4.0㎍/kg 또는 10㎍/kg(또는 이들의 임의의 조합) 의 한가지 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 투여량이 환자에게 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다(예를 들어, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회분의 투여량의 AM 입자를 제공받음) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 로오딩 투여량에 후속하여 1 회 이상의 더 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러한 치료요법의 진행은 통상적 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.For the prophylaxis or treatment of a disease, the appropriate dosage of the AM particles as reported herein (either alone or in combination with one or more other additional therapeutic agents) will depend on the type of disease to be treated, the type of AM particles, the severity and course of the disease; It depends on the purpose for which the AM particles are administered (prophylaxis or treatment), past treatment history, the patient's clinical history and responsiveness to AM particles, and the age of the attending physician. The AM particles are administered dropwise to the patient in one or a series of treatments. Depending on the type and severity of the disease, about 1 μg/kg to 15 μg/kg (eg, 0.1 μg/kg to 10 μg/kg) of AM particles can be administered, eg, by one or more separate administrations. or an initial candidate dose for administration to a patient by continuous infusion. One typical daily dosage may range from about 1 μg/kg to 100 μg/kg or more, depending on the factors mentioned above. For repeated administrations for several days or longer, depending on the condition, treatment can generally be continued until the desired suppression of the disease manifestation is achieved. One exemplary dosage of AM particles ranges from about 0.05 μg/kg to about 10 μg/kg. Accordingly, one or more doses of about 0.5 μg/kg, 2.0 μg/kg, 4.0 μg/kg or 10 μg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient. Such dosages are administered to the patient intermittently, eg, weekly or every 3 weeks (eg, the patient is given a dose of about 2 to about 20, or eg, about 6 doses of the AM particles). can be One or more lower doses may be administered subsequent to the initial higher loading dose. The progress of such therapy can be readily monitored by routine techniques and assays.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000㎍/kg(체중)이다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be determined in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient. can be prescribed. Meanwhile, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-1000 μg/kg (body weight) per day.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effect of the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the following examples are provided for illustrative purposes only to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through specific examples. The following examples are intended to illustrate the present invention, but the present invention is not limited by the following examples.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.At this time, if there is no other definition in the technical terms and scientific terms used, it has the meaning generally understood by those of ordinary skill in the technical field to which this invention belongs. In addition, repeated description of the same technical configuration and operation as in the prior art will be omitted.

실시예 1. 시약 및 재료Example 1. Reagents and Materials

본 실시례에서 사용하는 시약들에서 Protamine sulfate salt (from Salmon sperm, 5.8 kDa, PS), Pluronic Taurocholic acid sodium salt(TCA), Dimethyl sulfoxide(DMSO), Ttriethylamine(TEA), 4-nitrophenyl chloroformate(4-NPC), Dimethyl formamide(DMF), Chitosan(키토산, CS), Sodium hyaluronate(히알루론산 나트륨 MW: 83 kDa, HA), 아세톤, N-hydroxysuccinimide(NHS), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC), Ethylene diamine(EDC), Heparin(헤파린, Hep)은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, 미국)로부터 구입하였다. 그외 모든 화학 물질은 별도의 규정이 없는 한 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용했다.Protamine sulfate salt (from Salmon sperm, 5.8 kDa, PS), Pluronic Taurocholic acid sodium salt (TCA), Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ttriethylamine (TEA), 4-nitrophenyl chloroformate (4-nitrophenyl chloroformate (4- NPC), Dimethyl formamide (DMF), Chitosan (chitosan, CS), Sodium hyaluronate (sodium hyaluronate MW: 83 kDa, HA), acetone, N-hydroxysuccinimide (NHS), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′- Ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), ethylene diamine (EDC), and heparin (heparin, Hep) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). All other chemicals were purchased from Sigma-Aldrich and used unless otherwise specified.

실시예 2. 압타머 및 활성제의 제조Example 2. Preparation of aptamers and active agents

<압타머><Aptamer>

하기 단백질에 대한 압타머를 유기합성하였다.Aptamers for the following proteins were organically synthesized.

TNF-α: 5'rGprGprGp rAprGprGp rApfCprGp rApfUprGp fCprGprGp fCpfCprAp fCpfUprGp rGpfCpfUp rAprGprGp rAprApfCp fUpfCprGp rAprGpfUp rApfCpfUp rGprGprGp fUprGprGp fCprAprGp rApfCprGp rApfCpfUp fCprGpfCp fCpfCprGp rAp-3' / 5'-rGpfCprGp rGprAprAp rGpfCprGp fUprGpfCp fUprGprGp rGpfCpfCp fCprGprGp fCpfUpfUp rGpfCprAp rGprGpfUp fCprGpfCp fCprGprAp rAprApfUp rGprApfCp fCprGpfCp rApfCprAp fCprApfUp rAprApfCp fCpfCprAp rGprAprGp rGpfUpfCp rGprApfUp-3'(한국 등록특허 10-1900878) TNF-α: 5 'rGprGprGp rAprGprGp rApfCprGp rApfUprGp fCprGprGp fCpfCprAp fCpfUprGp rGpfCpfUp rAprGprGp rAprApfCp fUpfCprGp rAprGpfUp rApfCpfUp rGprGprGp fUprGprGp fCprAprGp rApfCprGp rApfCpfUp fCprGpfCp fCpfCprGp rAp-3' / 5 '-rGpfCprGp rGprAprAp rGpfCprGp fUprGpfCp fUprGprGp rGpfCpfCp fCprGprGp fCpfUpfUp rGpfCprAp rGprGpfUp fCprGpfCp fCprGprAp rAprApfUp rGprApfCp fCprGpfCp rApfCprAp fCprApfUp rAprApfCp fCpfCprAp rGprAprGp rGpfUpfCp rGprApfUp-3' (Korea Patent 10-1900878)

VEGF: 5'-fCprGprGp rAprApfUp fCprAprGp fUprGprAp rApfUprGp fCpfUpfUp rApfUprAp fCprApfUp fCpfCprGp-3'(Chem Biol 2005;12:25-33.) VEGF: 5'-fCprGprGp rAprApfUp fCprAprGp fUprGprAp rApfUprGp fCpfUpfUp rApfUprAp fCprApfUp fCpfCprGp-3' (Chem Biol 2005;12:25-33.)

PDGF: 5'-dCpdApdCp dApdGpdGp dCpdTpdAp dCpdGpdGp dCpdApdCp dGpdTpdAp dGpdApdGp dCpdApdTp dCpdApdCp dCpdApdTp dGpdApdTp dCpdCpdTp dGpdTpdGpdTi-3'(Journal of Biochemistry, 1996; 35: 14413-14424.) PDGF: 5 '-dCpdApdCp dApdGpdGp dCpdTpdAp dCpdGpdGp dCpdApdCp dGpdTpdAp dGpdApdGp dCpdApdTp dCpdApdCp dCpdApdTp dGpdApdTp dCpdCpdTp dGpdTpdGpdTi-3'(Journal of Biochemistry, 1996; 35: 14413-14424.)

IL10: 5'-rGprGprGp fCpfUpfCp rApfUprGp fCprApfCp rGpfUpfUp fUprGpfCp fUpfCpfCp fUprGpfUp rAprApfUp fUprGprGp fCprGpfUp rApfUprGp fUprAprAp fCpfCpfCp rAprGprGp fCprApfCp fCprAprAp rApfCprAp fCpfCpfCp fCprAprGp rGpfCpfCp rGprGprGp fCpfCprAp fUprGprAp fUpfCpfCp rApfCprAp fUprAp-3' (Mol Ther 2012;, 20: 1242-1250) IL10: 5'-rGprGprGp fCpfUpfCp rApfUprGp fCprApfCp rGpfUpfUp fUprGpfCp fUpfCpfCp fUprGpfUp rAprApfUp fUprGprGp fCprGpfUp rApfUprGp fUprAprAp fCpfCpfCp rAprGprGp fCprApfCp fCprAprAp rApfCprAp fCpfCpfCp fCprAprGp rGpfCpfCp rGprGprGp fCpfCprAp fUprGprAp fUpfCpfCp rApfCprAp fUprAp-3' (Mol Ther 2012;, 20: 1242-1250)

Osteopontin(OPN): 5'-fCprGprGp fCpfCprAp fCprAprGprAp rApfUprGp rAprAprAp rAprApfCp fCpfUpfCp rApfUpfCp rGprApfUp rGpfUpfUp rGpfCprAp fUprAprGp fUpfUprGp-3' (Mol Ther 2009;17:153-61.) Osteopontin (OPN): 5'-fCprGprGp fCpfCprAp fCprAprGprAp rApfUprGp rAprAprAp rAprApfCp fCpfUpfCp rApfUpfCp 2009-fCprGprApfUpUprGpfUpfUp(RGprApfUpUprGpfUpfUp)

IL17: 5'-rGprGprGp fCpfUprAp rGpfCpfUp rGprApfUp fCprGpfUp rApfCpfCp rAprGpfUp rAprGpfCp rGpfUprGp rGpfCpfCp fUprGprGp rGprGprGp rGpfCpfCp fUprAprGp fUpfCprGp fUprGpfCp rGprApfUp rApfCpfUp rAprApfCp rAprGpfCp fUprAprAp fCprApfCp fCpfCp-3'(Biochimie, 2011; 93:1081-1088.) IL17: 5'-rGprGprGp fCpfUprAp rGpfCpfUp rGprApfUp fCprGpfUp rApfCpfCp rAprGpfUp rAprGpfCp rGpfUprGp rGpfCpfCp fUprGprGp rGprGprGp rGpfCpfCp fUprAprGp fUpfCprGp fUprGpfCp rGprApfUp rApfCpfUp rAprApfCp rAprGpfCp fUprAprAp fCprApfCp fCpfCp-3'(Biochimie, 2011; 93:1081-1088.)

HER2: 5′-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprAprAp rGprGprGp fUprAprGp rGprGpfCp rGpfCprGp rGpfCpfUp-3' (Nucl Med Biol. (2013);40(8):980-6) HER2: 5′-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprAprAp rGprGprGp fUprAprGp rGprGpfCp rGpfCprGp rGpfCprGp rGprAprGp

EpCAM: 5′-rGprGpfCp rGprApfCp fUprGprGp fUpfUprAp fCpfCpfCp rGprGpfUp fCprGp-3′(PLoS AME 2015; 10(7): e0132407.) EpCAM: 5′-rGprGpfCp rGprApfCp fUprGprGp fUpfUprAp fCpfCpfCp rGprGpfUp fCprGp-3′ (PLoS AME 2015; 10(7): e0132407.)

4-1 BB: 5'-rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp fUprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpfUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp-3'(Cancer Immunol Res. 2014 Sep;2(9):867-77.) 4-1 BB: 5'-rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp fUprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpfUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp-3'(Cancer Immunol Res. 2014 Sep ;2(9):867-77.)

<siRNA><siRNA>

하기 siRNA를 유기합성하였다.The following siRNA was organically synthesized.

EGFR siRNA: 5'-fUpfUprAp rGprApfUp rAprAprGp rApfCpfUp rGpfCpfUp rAprAprGp rGpfCprAp-3 (Sci Rep. 2016;6:30346.) EGFR siRNA : 5'-fUpfUprAp rGprApfUp rAprAprGp rApfCpfUp rGpfCpfUp rAprAprGp rGpfCprAp-3 (Sci Rep. 2016;6:30346.)

Survivin siRNA: 5'-rGpfUprAp rGprAprGp rApfUprGp fCprGprGpf UprGprGp fUpfCpfCp fUpfUp-3’(Sci Rep. 2016;6:30346.) Survivin siRNA : 5'-rGpfUprAp rGprAprGp rApfUprGp fCprGprGpf UprGprGp fUpfCpfCp fUpfUp-3' (Sci Rep. 2016;6:30346.)

<화학요법제><Chemotherapeutic agent>

젬시타빈(Gemcitabine)은 여러 종류의 암 치료에 사용되는 화학 요법 약물로 유방암, 난소 암, 비소 세포 폐암, 췌장암 및 방광암 등에 사용된다. 겜시타빈은 친수성이며 분자 운반자로 세포 내로 운반되어 뉴클레오시드(nucleosides)가 된다. 세포에 들어간 후, gemcitabine은 효소 deoxycytidine kinase(DCK)에 의해 인산염을 부가됨으로써 gemcitabine monophosphate(dFdC 입자)가 되며 이는 속도 결정 단계이다. 이어서 2 개의 다른 인산염이 다른 효소에 의해 부가된다. 3 개의 인산염이 부가된 젬시타빈은 마침내 gemcitabine triphosphate(dFdCTP)로 약리학적으로 활성화된다. gemcitabine은 3번 인산화된 후 cytidine으로 역할을 할 수 있으며 세포 복제시 합성되는 새로운 DNA 가닥에 통합된다. gemcitabine이 DNA에 통합되면 기본 또는 정상적인 뉴클레오사이드 염기가 옆에 부가된다. gemcitabine은 "결함있는" 염기이기 때문에 "masked chain termination"이 발생한다. 인접한 native nucleoside로 인해 세포의 정상적인 수복 시스템에 이상이 발생한다. 따라서 젬시타빈이 세포의 DNA에 결합되면 회복 불가능한 오류가 생겨 더 많은 DNA 합성이 억제되어 세포 사멸을 일으킨다. 2 개의 인산염이 부착된 젬시타빈(dFdCDP)의 형태는 또한 활성을 갖는다. 그것은 새로운 뉴클레오타이드를 생성하는데 필요한 효소 리보뉴클레오타이드 환원 효소(RNR)를 억제한다. Gemcitabine is a chemotherapy drug used to treat several types of cancer, including breast cancer, ovarian cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, and bladder cancer. Gemcitabine is hydrophilic and is transported into cells as molecular transporters to form nucleosides. After entering the cell, gemcitabine is phosphated by the enzyme deoxycytidine kinase (DCK) to form gemcitabine monophosphate (dFdC particles), which is a rate-determining step. Two different phosphates are then added by different enzymes. Gemcitabine with three phosphates is finally pharmacologically activated as gemcitabine triphosphate (dFdCTP). After being phosphorylated three times, gemcitabine can act as cytidine and is incorporated into new DNA strands synthesized during cell replication. When gemcitabine is incorporated into DNA, basic or normal nucleoside bases are flanked. Because gemcitabine is a "defective" base, "masked chain termination" occurs. Adjacent native nucleosides cause abnormalities in the cell's normal repair system. Thus, when gemcitabine binds to the cell's DNA, an irreversible error occurs, inhibiting further DNA synthesis, leading to cell death. A form of gemcitabine with two phosphates attached (dFdCDP) is also active. It inhibits the enzyme ribonucleotide reductase (RNR), which is required to produce new nucleotides.

Floxuridine(또는 5-fluorodeoxyuridine)은 항대사제(antimetabolites)로 deoxyuridine으로 분류되는 피리미딘 유사체이다. Floxuridine은 생체 내에서 5-Fluorouracil로 빠르게 대사되는 프로드럭이다. Floxuridine은 정상적인 pyrimidine이 세포주기의 S 단계 동안 DNA의 합성을 저해하는 pyrimidine-like 분자의 역할을 한다. Floxuridine은 thymidylate synthase(EC50 = 0.6 nM)를 억제하여 DNA 합성을 저해한다. Floxuridine은 세포 분열의 S-단계의 억제제로서 작용하여 빠르게 분열하는 세포를 선택적으로 사멸시킨다. Floxuridine은 약물의 활성 형태인 5-Fluorouracil로 분해되어 DNA 합성의 저해와 부분적으로 RNA 합성을 억제한다. Fluorouracil은 uracil riboside phosphorylase를 억제하여 RNA 합성에서 예비 형성된 우라실의 이용을 방지한다. 뿐만 아니라, 5-fluoro-2'-deoxyuridine-5-phosphate의 floxuridine monophosphate는 thymidylate synthetase 효소를 저해한다. 이것은 deoxyuridylic acid의 thymidylic acid로의 메틸화를 억제하여 DNA 합성을 방해한다. Floxuridine은 주로 암세포의 특징인 새롭고 빠르게 발생하는 세포들의 성장을 저해하여 궁극적으로, Floxuridine은 암세포를 사멸시킨다.Floxuridine (or 5-fluorodeoxyuridine) is a pyrimidine analogue classified as deoxyuridine as antimetabolites. Floxuridine is a prodrug that is rapidly metabolized to 5-Fluorouracil in vivo. Floxuridine acts as a pyrimidine-like molecule in which normal pyrimidine inhibits DNA synthesis during the S phase of the cell cycle. Floxuridine inhibits DNA synthesis by inhibiting thymidylate synthase (EC 50 = 0.6 nM). Floxuridine acts as an inhibitor of the S-phase of cell division and selectively kills rapidly dividing cells. Floxuridine is degraded into the active form of the drug, 5-Fluorouracil, which inhibits DNA synthesis and partially inhibits RNA synthesis. Fluorouracil inhibits uracil riboside phosphorylase, preventing the utilization of preformed uracil in RNA synthesis. In addition, floxuridine monophosphate of 5-fluoro-2'-deoxyuridine-5-phosphate inhibits the thymidylate synthetase enzyme. It inhibits the methylation of deoxyuridylic acid to thymidylic acid, thereby interfering with DNA synthesis. Floxuridine mainly inhibits the growth of new and rapidly developing cells that are characteristic of cancer cells, and ultimately, Floxuridine kills cancer cells.

Doxorubicin(독소루비신)은 암 치료에 사용되는 화학 요법 약물로 유방암, 방광암, 카포시 육종, 림프종 및 급성 림프 구성 백혈병에 사용된다. 독소루비신은 안트라사이클린 계열의 약물로 부분적으로 DNA의 기능을 방해한다. 독소루비신은 인터카레이션(intercalation)과 거대 분자 생합성(macromolecular biosynthesis)을 억제함으로써 DNA와 상호 작용하여 DNA의 슈퍼 코일을 이완시키는 효소인 토포아이소머라 제 II의 활성을 억제한다. 독소루비신은 복제를 위해 DNA 사슬을 절단하고 DNA 이중 나선의 구조적 이상으로 복제 과정을 저해한다. 그것은 또한 퀴논(quinone) 형태의 자유 라디칼 생성을 증가시킬 수 있으며, 세포 독성을 일으킨다.Doxorubicin (doxorubicin) is a chemotherapy drug used to treat cancer, used for breast cancer, bladder cancer, Kaposi's sarcoma, lymphoma, and acute lymphoblastic leukemia. Doxorubicin is an anthracycline drug that partially interferes with DNA function. Doxorubicin inhibits the activity of topoisomerase II, an enzyme that relaxes the supercoil of DNA by interacting with DNA by inhibiting intercalation and macromolecular biosynthesis. Doxorubicin cleaves DNA chains for replication and inhibits the replication process due to structural abnormalities in the DNA double helix. It can also increase the production of free radicals in the form of quinones, causing cytotoxicity.

DM1(Mertansine)은 tubulin(튜불린) 억제제로서 튜불린(rhizoxin binding site)에 결합하여 미세소관의 집합을 억제한다. Mertansine은 치료 목적으로 티올 그룹과 링커 구조를 반응시켜 항체 약물 접합체(ADC)를 만드는 단일 클론 항체에 부착되는 티올 함유 메이탄시노이드이다. 이 ADC는 trastuzumab emtansine, lorvotuzumab mertansine 및 cantuzumab mertansine이다. 단일 클론 항체는 종양의 특이적인 구조(일반적으로 단백질)에 특이적으로 결합하여 메르탄신을 종양에 표적한다.DM1 (Mertansine) is a tubulin (tubulin) inhibitor and inhibits the aggregation of microtubules by binding to tubulin (rhizoxin binding site). Mertansine is a thiol-containing maytansinoid that is attached to a monoclonal antibody to form an antibody drug conjugate (ADC) by reacting a thiol group with a linker structure for therapeutic purposes. These ADCs are trastuzumab emtansine, lorvotuzumab mertansine and cantuzumab mertansine. Monoclonal antibodies specifically bind to specific structures (usually proteins) of the tumor and target mertansine to the tumor.

Paclitaxel(PTX)은 “탁센”, “antimicrotubule agent” “plant alkaloids”로 분류되는 항암제로 세포 주기 선택적으로 다양한 세포 분열 주기 중 다양한 단계의 암세포를 공격한다. 이 약물은 세포분열 과정 중 분열과 자가 복제의 기구인 미세소관(microtubule)이 분리되는 과정을 방해함으로써 암세포의 증식을 저해하여, 난소암, 유방암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암 등의 치료에 사용된다. PTX는 튜불린을 표적으로 하는 약물이며 파클리탁셀 처리 세포는 유사 분열 스핀들 어셈블리, 염색체 분리 및 세포 분열에 결함이 생긴다. PTX은 microtubule polymer를 안정화시키고 분해를 저해하여 염색체는 중기 스핀들 구성을 달성할 수 없다. 이것은 mitosis의 진행을 차단하고 mitotic checkpoint의 연장된 활성화는 세포 분열없이 세포주기의 G0-phase에 apoptosis 또는 reversion을 유발한다.Paclitaxel (PTX) is an anticancer drug classified as “taxane”, “antimicrotubule agent” and “plant alkaloids” and selectively attacks cancer cells at various stages during various cell division cycles. This drug inhibits the proliferation of cancer cells by interfering with the process of separation of microtubules, a mechanism of division and self-replication, during cell division, thereby treating ovarian cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, and skin epithelial cell cancer. used for PTX is a drug that targets tubulin and paclitaxel-treated cells are defective in mitotic spindle assembly, chromosome segregation and cell division. PTX stabilizes microtubule polymers and inhibits degradation so that chromosomes cannot achieve metaphase spindle configuration. This blocks the progression of mitosis and prolonged activation of the mitotic checkpoint induces apoptosis or reversion in the G0-phase of the cell cycle without cell division.

Monomethyl auristatin E(MMAE)는 desmethyl-auristatin E로 합성 항종양제로 강력한 독성 때문에 약물 자체로 사용할 수 없으며 튜불린의 중합을 차단하여 세포 분열을 억제하는 항 세포분열 제제이다. 단클론 항체(MAb)에 대한 링커는 세포 외액에서 안정하지만, 일단 접합체가 종양 세포에 들어가면 카텝신에 의해 절단되어 항 세포분열 기전을 활성화시킨다. [화학식 1]의 MMAE-MAb-접합체의 구조에서 valine(Val)과 citrulline(Cit)의 아미노산으로 구성된 링커는 종양 세포 내 카텝신(catPSin)에 의해 분해된다. 스페이서(파라-아미노벤질카르바메이트)는 녹색으로 표시되고, 카텝신 분해 가능 링커는 청색이고, 부착 기(말레이미드 및 카프로산으로 구성됨)는 갈색이며 아우리스타틴 말레이미드카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메이트-MMAE(maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarbamate-MMAE)이다. Monomethyl auristatin E (MMAE) is desmethyl-auristatin E, a synthetic anti-tumor agent that cannot be used as a drug itself due to its strong toxicity. It is an anti-cell division agent that inhibits cell division by blocking the polymerization of tubulin. The linker to the monoclonal antibody (MAb) is stable in extracellular fluid, but once the conjugate enters the tumor cell, it is cleaved by cathepsin, activating the anti-mitotic mechanism. In the structure of the MMAE-MAb-conjugate of [Formula 1], the linker composed of amino acids of valine (Val) and citrulline (Cit) is degraded by cathepsin (catPSin) in tumor cells. The spacer (para-aminobenzylcarbamate) is shown in green, the cathepsin cleavable linker is blue, the attachment groups (consisting of maleimide and caproic acid) are brown and auristatin maleimidecaproyl-valine-citrulline -p-aminobenzylcarbamate-MMAE (maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarbamate-MMAE).

Figure pat00001
Figure pat00001

[화학식 1][Formula 1]

모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)는 합성 항종양제로 vorsetuzumab mafodotin 및 SGN-CD19A와 같은 실험용 항암 항체-약물 접합체의 일부이다. 모노메틸 아우리 스타틴 F는 튜뷸린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 항 세포분열 제제 이다. 이것은 암세포의 구조에 높은 친화성을 갖는 항체와 연결되어 MMAF가 그러한 세포에 축적되도록 한다. [화학식 2]의 MAb와 MMAF의 접합체의 구조는 부착 그룹은 말레이미드 및 카프로산으로 구성되며 말레이미도카프로일-MMAF(mal eimidocaproyl-MMAF)이다.Monomethyl auristatin F (MMAF) is a synthetic antitumor agent that is part of an experimental anticancer antibody-drug conjugate such as vorsetuzumab mafodotin and SGN-CD19A. Monomethyl auristatin F is an anti-mitotic agent that inhibits cell division by blocking the polymerization of tubulin. It binds to antibodies with high affinity to the structure of cancer cells, allowing MMAF to accumulate in those cells. In the structure of the conjugate of MAb and MMAF of [Formula 2], the attachment group is composed of maleimide and caproic acid and is maleimidocaproyl-MMAF (mal eimidocaproyl-MMAF).

Figure pat00002
Figure pat00002

[화학식 2][Formula 2]

실시 예 3. 압타머 표적화약물의 제조Example 3. Preparation of aptamer targeting drug

(1) 본 발명의 압타머 표적화약물은 (i) 1종류의 상기 선별된 압타머를 표적화분자 단위로 최소한 포함하는 표적화분 자를 결정하는 단계; (ii) 한 종류 이상의 치료분자를 결정하는 단계 ; 및 (iii) 상기 결정된 표적화분자와 상기 결정된 치료분자를 모듈 로 구성하는 단계로 제조하였다. (1) The aptamer-targeting drug of the present invention comprises the steps of (i) determining a targeting molecule comprising at least one type of the selected aptamer as a targeting molecule unit; (ii) determining one or more types of therapeutic molecules; and (iii) constructing the determined targeting molecule and the determined therapeutic molecule into modules.

(2) 본 실시예의 압타머 표적화약물에 사용하는 압타머 는 상기 실시례2에 제시한 HER2 압타머 및 EpCAM 압타머이고, TNF- α 압타머, IL-10 압타머 및 IL-17 압타머를 자체적으로 활성제로 사용하여 입자를 제조하였다. (2) The aptamer used in the aptamer-targeting drug of this example is the HER2 aptamer and the EpCAM aptamer presented in Example 2 above, and TNF-α aptamer, IL-10 aptamer and IL-17 aptamer Particles were prepared using their own as an activator.

(2) 본 실시예의 치료분자를 구성하는 활성제는 VEGF 압타머, PDGF 압타머, EGFR siRNA, Survivin siRNA, Gemcitabine, 5-FdU(2'-deoxy-5-fluoro-uridine), Dox(Doxorubicin), PTX(Paclitaxel), MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristati n F)와 DM1(Mertansine)이다.(2) The active agent constituting the therapeutic molecule of this embodiment is VEGF aptamer, PDGF aptamer, EGFR siRNA, Survivin siRNA, Gemcitabine, 5-FdU (2'-deoxy-5-fluoro-uridine), Dox (Doxorubicin), PTX (Paclitaxel), MMAE (monomethyl auristatin E), MMAF (monomethyl auristatin F), and DM1 (Mertansine).

본 발명에서 제조한 약학적 유효성분으로 하는 AM은 자체 적인 활성제인 압타머로 TNF-α 압타머(ⅰ), IL-10 압타머(ⅱ) 및 IL-17 압타머(ⅲ)이고 압타머와 핵산약물 키메라로 이중 4-1 BB 압타 머-EpCAM 압타머 키메라(ⅳ), 이중 4-1 BB 압타머-VEGF 압타머(ⅴ) 또는 OPN 압타머(ⅵ) 키메라, EpCAM 압타머-EGFR siRNA-HER2 압타머 키메라(ⅶ), EpCAM 압타머-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-HER2 압타머 키메 라(ⅷ) 및 HER2 압타머-젬시타빈 폴리머(ⅸ)이며 이에 제한되는 것은 아니다.AM as a pharmaceutically active ingredient prepared in the present invention is an aptamer that is its own activator, TNF-α aptamer (i), IL-10 aptamer (ii), and IL-17 aptamer (iii), and aptamer and nucleic acid Double 4-1 BB aptamer-EpCAM aptamer chimera (iv) as drug chimera, double 4-1 BB aptamer-VEGF aptamer (v) or OPN aptamer (vi) chimera, EpCAM aptamer-EGFR siRNA-HER2 Aptamer chimera (vii), EpCAM aptamer-survivin siRNA-EGFR siRNA-HER2 aptamer chimera (viii), and HER2 aptamer-gemcitabine polymer (viii), but are not limited thereto.

<이중 압타머 키메라 1: 이중 Ap4-1BB-ApEpCAM 키메라의 제조><Double Aptamer Chimera 1: Preparation of Dual Ap4-1BB-ApEpCAM Chimera>

4-1 BB 및 EpC AM 압타머는 개별적으로 주형(RNA1 주형 및 RNA2 주형)을 대상으로 5' 프라이머와 3' 프라이머를 사용한 PCR로 얻은 산물을 사용하여 시험관내 전사로 RNA1 과 RNA2를 합성하였다. 4-1 BB and EpC AM aptamers were individually synthesized RNA1 and RNA2 by in vitro transcription using the products obtained by PCR using 5' and 3' primers for templates (RNA1 template and RNA2 template).

상기 PCR 산물을 T-A 클로닝 pCR 2.1 벡터 (Invit rogen)에 넣고 시퀀싱하였다. PCR 산물을 대상으로 DuraScript 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 주형으로 전사를 수행하였다. 2' F-변 형된 피리미딘을 CTP 및 UTP를 대체하기 위해 RNA에 혼입시키거나 또 는 2' F-CTP 대신에 젬시타빈을 혼입시켰다. The PCR product was put into a T-A cloning pCR 2.1 vector (Invitrogen) and sequenced. The PCR product was transcribed using the DuraScript transcription kit as a template for the PCR product. 2' F-modified pyrimidines were incorporated into RNA to replace CTP and UTP, or gemcitabine was incorporated in place of 2' F-CTP.

a. RNA1(Ap4-1 BB-센스 링커): 5' -rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp f UprGp rGp rGprCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCp fUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfC pfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp rAprAprAp rAprGpfCp fUpfUprGp fUpfUpfCp rAprGprGp rAprGprAp fUp rGprAp rAprApfUp fUpfUp-3'a. RNA1(Ap4-1 BB-센스 링커) : 5' -rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp f UprGp rGp rGprCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCp fUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfC pfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp rAprAprAp rAprGpfCp fUpfUprGp fUpfUpfCp rAprGprGp rAprGprAp fUp rGprAp rAprApfUp fUpfUp-3'

RNA1 PCR 주형: 5'-dGpdGpdGp dApdGpdAp dGpdApdGp dGpdAp dAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdCpdGp dApdCpdCp dGpdApd Ap dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApdAp dApdGpdCp dCpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApdTpdAp dA pdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dApdTpdAp dGpdTpdAp dCpd TpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3' RNA1 PCR 주 형: 5'-dGpdGpdGp dApdGpdAp dGpdApdGp dGpdAp dAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdCpdGp dApdCpdCp dGpdApd Ap dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApdAp dApdGpdCp dCpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApdTpdAp dA pdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dApdTpdAp dGpdTpdAp dCpd TpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3'

RNA1 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpd ApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dGpdGpdAp dGpdAp dGp dApdGpdGp dApdApdGp dApdGpdGp dGpdApdTp dGp-3' RNA1 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpd ApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dGpdGpdAp dGpdAp dGp dGp dApdGp

RNA1 3' 프라이머: 5'-d ApdApdTp dTpdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dAp dGpdCp dTpdTpdTp dTpdGpdGp dGpdCpdCp dTp-3’ RNA1 3' Primer: 5'-d ApdApdTp dTpdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dAp dGpdCp dTpdTpdTpdCp dTpdGp dGp dGp

b. RNA 2(ApEpCAM-안티센스 링커) : 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUpfUprAp fCpfCpfCp rGprGpf Up fCprGpfUp rAprAprAp rApfUpfUp fUpfCprAp fUpfCpfUp fCpfC pfUp rGprAprAp fCprAprAp rGpfCpfUp fUp-3'b. RNA 2 (ApEpCAM-antisense linker) : 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUpfUprAp fCpfCpfCp rGprGpf Up fCprGpfUp rAprAprAp rApfUpfprA pUpr

RNA2 PCR 주형: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dC pdGpdAp dCpdTpdGp d GpdTpdTp dApdCpdCp dCpdGpdGp dTpdCpdGp dTpdA pdAp dApdApdTp dTp dTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTpdT p-3' RNA2 PCR 주형 : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dC pdGpdAp dCpdTpdGp d GpdTpdTp dApdCpdCp dCpdGpdGp dTpdCpdGp dTpdA pdAp dApdApdTp dTp dTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTpdT p-3'

RNA2 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdAp dCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpd Ap dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdGp dGpdTpdTp dAp-3' RNA2 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdAp dCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpd Ap dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdGp dG pdAp-3'

RNA2 3' 프라이머: 5'-dApdApdGp dCpdTpdT p dGpdTpdTp dCpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdGp dApdApdAp dTpdTpdTp dTpdApdCp dGpdAp-3' RNA2 3' Primer : 5'-dApdApdGp dCpdTpdT p dGpdTpdTp dCpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdGp dApdApdAp dTpdTpdTp dTp dApdCp

2 개의 RNA를 1:1의 몰비로 혼합하 고, 94℃에서 3분간 가열한 후 1시간 이내 에 실온으로 서서히 냉각 시킴으로써 하나의 이중 4-1 BB 압타머-EpCAM 이중 압타머 키메라를 형성하도록 어닐링하였다.Annealing to form one double 4-1 BB aptamer-EpCAM double aptamer chimera by mixing two RNAs in a molar ratio of 1:1, heating at 94°C for 3 minutes, and then slowly cooling to room temperature within 1 hour did.

<이중 압타머 키메라 2: 이중 Ap4-1 BB-ApVEGF 또는 ApOPN 키메라의 제조><Double Aptamer Chimera 2: Preparation of Dual Ap4-1 BB-ApVEGF or ApOPN Chimera>

4-1 BB 및 VEGF 또는 OPN(Osteopontin) 압타머는 개별적 으로 주형(RNA1 주형 및 RNA2 주형)을 대상으로 5' 프라이머와 3' 프라이머를 사용한 PCR로 얻은 산물을 사용하여 시험 관내 전사로 RNA1 과 RNA2를 합성하였다. 4-1 BB and VEGF or OPN (Osteopontin) aptamers individually target the templates (RNA1 template and RNA2 template) and use the products obtained by PCR using 5' and 3' primers to convert RNA1 and RNA2 by in vitro transcription. synthesized.

상기 PCR 산물을 T-A 클로닝 pCR 2.1 벡터(Invitrogen)에 넣고 시퀀싱하였다. PCR 산물을 대상으로 DuraScript 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 주형으로 전사를 수행하였다. 2' F-변형된 피 리미딘을 CTP 및 UTP를 대체하기 위해 RNA에 혼입시키거나 또는 2' F-CTP 대신에 젬시타빈을 혼입시켰다. The PCR product was put into a T-A cloning pCR 2.1 vector (Invitrogen) and sequenced. The PCR product was transcribed using the DuraScript transcription kit as a template for the PCR product. 2' F-modified pyrimidine was incorporated into RNA to replace CTP and UTP or gemcitabine was incorporated in place of 2' F-CTP.

a. RNA1(이중 Ap4-1 BB-센스 링커): 5'-rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp f UprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpf UpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpf Cp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpf CpfCp GprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp fUprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpfUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp-3'a. RNA1(이중 Ap4-1 BB-센스 링커) : 5'-rGprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp f UprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpf UpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpf Cp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpf CpfCp GprGprGp rAprGprAp rGprAprGp rGprAprAp rGprAprGp rGprGprAp fUprGprGp rGpfCprGp rApfCpfCp rGprAprAp fCprGpfUp rGpfCpfCp fCpfUpfUp fCprAprAp rAprGpfCp fCprGpfUp fUpfCprAp fCpfUprAp rApfCpfCp rAprGpfUp rGprGpfCp rApfUprAp rApfCpfCp fCprAprGp rAprGprGp fUpfCprGp rApfUprAp rGpfUprAp fCpfUprGp rGprApfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp-3'

RNA1 PCR 주형: 5'-dGpdGpdGp dAp dGpdAp dGpdApdGp dGpdApdAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdC pdGp dApdCpdC p dGpdApdAp dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApd Ap dApdGpdCp d CpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApd TpdAp dApdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dA pdTpdAp dGpdTpdAp dCpdTpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp dGpdGpdGp dApdGpdAp dGpdApdGp dGpdApdAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdCpdGp dApdCpdCp dGpdApdAp dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApdAp dApdGpdCp dCpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApdTpdAp dApdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dApdTpdAp dGpdTpdAp dCpdTpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3' RNA1 PCR 주형 : 5'-dGpdGpdGp dAp dGpdAp dGpdApdGp dGpdApdAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdC pdGp dApdCpdC p dGpdApdAp dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApd Ap dApdGpdCp d CpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApd TpdAp dApdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dA pdTpdAp dGpdTpdAp dCpdTpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp dGpdGpdGp dApdGpdAp dGpdApdGp dGpdApdAp dGpdApdGp dGpdGpdAp dTpdGpdGp dGpdCpdGp dApdCpdCp dGpdApdAp dCpdGpdTp dGpdCpdCp dCpdTpdTp dCpdApdAp dApdGpdCp dCpdGpdTp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dApdCpdCp dApdGpdTp dGpdGpdCp dApdTpdAp dApdCpdCp dCpdApdGp dApdGpdGp dTpdCpdGp dApdTpdAp dGpdTpdAp dCpdTpdGp dGpdApdTp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3'

RNA1 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dC pdTpdAp dTpdApdGp dGpdGpdAp dGpdApdGp d ApdGpdGp dApdApdGp dApdG pdGp dGpdApdTp dGp-3' RNA1 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dC pdTpdAp dTpdApdGp dGpdGpdAp dGpdApdGp d A

RNA1 3' 프라이머: 5'-dApdApdTp dT pdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTp dTpdTp dTpdGpdGp dGpdCpdCp dTp-3’RNA1 3' Primer: 5'-dApdApdTp dT pdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTp dTpdTp dTpdGp dTpdGp dTpdGp

b-1. RNA2(ApVEGF-안티 센스 링커): 5'-f CprGprGp rAprApfUp fCprAprGp fUprGprAp rApfUprGp fCpfUpfUp rA pfUprAp fCprApfUp fCpfCprGp fCprGpfUp rAprAprAp rApfUpfUp fUpfC prAp fUpfCpfUp fCpfCpfUp rGprAprAp fCprAprAp rGpfCpfUp fUp-3'b-1. RNA2(ApVEGF-안티 센스 링커 ): 5'-f CprGprGp rAprApfUp fCprAprGp fUprGprAp rApfUprGp fCpfUpfUp rA pfUprAp fCprApfUp fCpfCprGp fCprGpfUp rAprAprAp rApfUpfUp fUpfC prAp fUpfCpfUp fCpfCpfUp rGprAprAp fCprAprAp rGpfCpfUp fUp-3'

RNA2 VEGF PCR 주형: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCp dGpdGpdAp dApdTpdCp dApdGpdTp dGpdApdAp dTpdGpdCp dTpdTpdAp dTpdApdCp dApdTpdCp dCpdGpdCp dGpdTpdAp dApdApdAp dTpdTpdTp dCpdApdTp dCpdTpdCp dCpdTpdGp dApdApdCp dApdApdGp dCpdTpdTp-3' RNA2 VEGF PCR 주형 : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCp dGpdGpdAp dApdTpdCp dApdGpdTp dGpdApdAp dTpdGpdCp dTpdTpdAp dTpdApdCp dApdTpdCp dCpdGpdCp dGpdTpdAp dApdApdAp dTpdTpdTp dCpdApdTp dCpdTpdCp dCpdTpdGp dApdApdCp dApdApdGp dCpdTpdTp-3'

RNA2 VEGF 5' 프 라이머: 5'-dTpdApd Ap dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTp dAp dTpdApdCp dGpdGpdAp dApdTpdCp dApdGpdTp dGp-3 RNA2 VEGF 5' Primer : 5'-dTpdApd Ap dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTp dAp dTpdApdCp dGpdGpdAp dApdTpdTpdTp dGp dGp

RNA2 VEGF 3' 프라이머: 5'-dApdApdGp dCpdTpdTp dGpdTpdTp dCpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdG p dApdApdAp dTpdTpdTp dTpdCpdGp dGpdAp-3' RNA2 VEGF 3' Primer : 5'-dApdApdGp dCpdTpdTp dGpdTpdTp dCpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdG p dApdApdAp dTpdTpdAp-3DGp dTpdCp

b-2. RNA 2(ApOPN-안티센스 링커) : 5'-fCprGprGp fCpfCprAp fCprAprGp rAprApfUp rGprAprAp rAprApr Ap fCpfCpfUp fCprApfUp fCprGprAp fUprGpfUp fUprGpfCp rApfUprAp rGpfUpfUp rGpfCprGp fUprAprAp rAprApfUp fUpfUpfCp rApfUpfCp fUp fCpfCp fUprGprAp rApfCprAp rAprGpfCp fUpfUp-3'b-2. RNA 2(ApOPN-안티센스 링커) : 5'-fCprGprGp fCpfCprAp fCprAprGp rAprApfUp rGprAprAp rAprApr Ap fCpfCpfUp fCprApfUp fCprGprAp fUprGpfUp fUprGpfCp rApfUprAp rGpfUpfUp rGpfCprGp fUprAprAp rAprApfUp fUpfUpfCp rApfUpfCp fUp fCpfCp fUprGprAp rApfCprAp rAprGpfCp fUpfUp-3'

RNA2 OPN PCR 주형: 5'-dTpdA pdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCpd GpdGpd Cp dCpdApdCp dApdGpdAp d ApdTpdGp dApdApdAp dApdApdCp dCpdTpdCp dApdTpdCp dGpdApdTp dGpd TpdTp dGpdCpdAp dTpdApdGp dTpdTpdGp dT pdCpdGp dTpdApdAp dApdApd Tp dTpdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTpdTp-3' RNA2 OPN PCR 주형 : 5'-dTpdA pdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCpd GpdGpd Cp dCpdApdCp dApdGpdAp d ApdTpdGp dApdApdAp dApdApdCp dCpdTpdCp dApdTpdCp dGpdApdTp dGpd TpdTp dGpdCpdAp dTpdApdGp dTpdTpdGp dT pdCpdGp dTpdApdAp dApdApd Tp dTpdTpdCp dApdTpdCp dTpdCpdCp dTpdGpdAp dApdCpdAp dApdGpdCp dTpdTp-3'

RNA2 OPN 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdC p dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCp dGpdGpdCp dCpdApdCp dApdGpdTp dGp-3 RNA2 OPN 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdCp dGpdGpdCp dCpdApdCp dApdGp-3

RNA2 OPN 3' 프라이머: 5'-dApdApdGp dCpdTpdTp dGpdTpdTp d CpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdGp dApdApdAp dTpdTpdTp dTpdApdCp dAp dAp-3’ RNA2 OPN 3' Primer : 5'-dApdApdGp dCpdTpdTp dGpdTpdTp d CpdApdGp dGpdApdGp dApdTpdGp dApdApdAp dTpdTpdTp-3 dTp dAp

c) 동몰량의 RNA1 과 RNA2를 혼합하고, 95℃로 가열하고, 실온으로 냉각시 켰다. 아가로스 겔 전기영동으로 모니터링 한 어닐링 효율은> 80 % 였다. 2 개의 압타머의 접합을 방지하기 위해, 이들은 2 배 초과로 개별적으로 어 닐링시켰다. c) Equal molar amounts of RNA1 and RNA2 were mixed, heated to 95°C, and cooled to room temperature. The annealing efficiency monitored by agarose gel electrophoresis was >80%. To prevent bonding of the two aptamers, they were individually annealed more than two-fold.

<압타머와 siRNA 키메라 1: ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라의 제조> <Aptamer and siRNA chimera 1: Preparation of ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera>

<ApEp CAM-EGFR 안티센스 siRNA> 및 <ApHER2-EGFR 안티센스 siRNA> 는 개별 적으로 주형(RNA1 주형 및 RNA2 주형)을 대상으로 5' 프라이머와 3' 프라이 머를 사용한 PCR로 얻은 산물을 사용하여 시험관내 전사로 RNA1 과 RNA2를 합성하였다. <ApEp CAM-EGFR antisense siRNA> and <ApHER2-EGFR antisense siRNA> were individually prepared using the products obtained by PCR using 5' primers and 3' primers against templates (RNA1 template and RNA2 template) in vitro. RNA1 and RNA2 were synthesized by transcription.

상기 PCR 산물을 T-A 클로닝 p CR 2.1 벡터 (Invitrogen)에 넣고 시퀀싱하였 다. PCR 산물을 대상으 로 DuraScript 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 주형으로 전사를 수 행하였다. 2' F-변형된 피리미딘을 CTP 및 UTP를 대체하기 위해 RNA에 혼입시키거나 또는 2' F-CTP 대신에 젬시타빈을 혼입시켰다. The PCR product was put into a T-A cloning p CR 2.1 vector (Invitrogen) and sequenced. The PCR product was transcribed as a template using the DuraScript transcription kit. 2' F-modified pyrimidines were incorporated into RNA to replace CTP and UTP or gemcitabine was incorporated in place of 2' F-CTP.

a. RNA1(ApEpCAM-EGFR 안티센스 siRNA): 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUpfUprA p fCpfCpfCp rGprGpfUp rAprAprAp rAp fUpfUprAp rGprApfUp rAprAprGp rApfCpfUp rGpfCpfUp rAprAprGp rGpfCprAp-3'.a. R NA1 (ApEpCAM-EGFR antisense siRNA) : 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUpfUprA p fCpfCpfCp rGprGpfUp rAprAprAp rAp fUpfUprAp rGprApGp rAp fUpfUprAp rGprApGp rAp fUpfUprAp rGprAp3

RNA1 PCR 주형: 5'-dTpdApdAp dT pdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dCpdGpdAp dCp dTpdTp dGpdGpdTp dTpdApdCp dCpdCpdGp dGpdTpdAp dApApdAp dTpdTp dAp dGpdApdTp dApdApdGp dApdCpdTp dGpdCpdTp dApdApdGp dGpdCpdA p-3' RNA1 PCR 주형 : 5'-dTpdApdAp dT pdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dCpdGpdAp dCp dTpdTp dGpdGpdTp dTpdApdCp dCpdCpdGp dGpdTpdAp dApApdAp dTpdTp dAp dGpdApdTp dApdApdGp dApdCpdTp dGpdCpdTp dApdApdGp dGpdCpdA p-3'

RNA1 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpd CpdAp dCpdTpd Ap dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdTp-3'. RNA1 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpd CpdAp dCpdTpd Ap dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdTp-3'.

RNA1 3' 프라이머: 5'-dT pdGpdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dApdGpdTp dCpdTpdTp dApdTpdCp dTpdApdAp dTpdTpdTp dTpdApdCp dCpdGpdGp-3'. RNA1 3' Primer : 5'-dT pdGpdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dApdGpdTp dCpdTpdTp dApdTpdCp dTpdApdAp dTpdTpdTp dTp dApdCp-3'.

b. RNA2(ApHER2-EGFR 센스 siRNA): 5'-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGpr Gp rGprApfUp rAprGprGp rGpfUprAp rGprGprGp fCprGpfCp rGprGpfCp fUprAprAp rAprApfCp fCpfUpfUp rAprGpfCp rAprGpfUp fCpfUpfUp rAp fUpfCp fUprAprAp fUpfUp-3'b. RNA2(ApHER2-EGFR 센스 siRNA) : 5'-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGpr Gp rGprApfUp rAprGprGp rGpfUprAp rGprGprGp fCprGpfCp rGprGpfCp fUprAprAp rAprApfCp fCpfUpfUp rAprGpfCp rAprGpfUp fCpfUpfUp rAp fUpfCp fUprAprAp fUpfUp-3'

RNA2 PCR 주형: 5'-dApdGpdCp dCpdGpdCp dGpdApdGp dGpdGpdGp dApdGpdGp dGpdApdTp dApdGpdGp dGpdTpdAp dGpdGpdGp d CpdGpdCp dGpdGpdCp dTpdApdAp dApdApdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dAp dGpdTp dCpdTpdTp dApdTpdCp dTpdApdAp dTpdTp-3' RNA2 PCR 주형 : 5'-dApdGpdCp dCpdGpdCp dGpdApdGp dGpdGpdGp dApdGpdGp dGpdApdTp dApdGpdGp dGpdTpdAp dGpdGpdGp d CpdGpdCp dGpdGpdCp dTpdApdAp dApdApdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dAp dGpdTp dCpdTpdTp dApdTpdCp dTpdApdAp dTpdTp-3'

RNA2 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp dGpdCpdGp dApdGpdGp dGpdGpdAp dGpdGpdGp dAp-3'. RNA2 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp dGpdCpdGp dGp dGpdGp

RNA2 3' 프라이머: 5'-dApdAp dTp dTpdApdGp dApdTpdAp dApdGpdAp dCpdTpdGp dCpdTpdAp dApdGpdGp dTpdTpdTp dTpdAp-3'. RNA2 3' Primer : 5'-dApdAp dTp dTpdApdGp dApdTpdAp dApdGpdAp dCpdTpdGp dCpdTpdAp dApdGpdGp dTpdTpdTp dTpdAp-3'.

전사된 RNA는 이전 연구에서 설명한 방법에 따라 정제하였다. 2 개의 RNA를 1:1의 몰비로 혼합하고 어닐링하여 94 ℃에서 3 분간 가열하여 다음 실내 온도에서 천천히 냉각시켜 1 시간이내에 하나의 구조체를 형성시켰다. The transcribed RNA was purified according to the method described in the previous study. Two RNAs were mixed in a molar ratio of 1:1, annealed, heated at 94 °C for 3 minutes, and then slowly cooled at room temperature to form one construct within 1 hour.

<압타머와 siRNA 키메라 2: ESEH(ApEpCAM-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 키메라)의 제조 ><Aptamer and siRNA chimera 2: Preparation of ESEH (ApEpCAM-survivin siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 chimera) >

<ApEpCAM-서바이빈(survivin) 안티센스 siRNA>, <ApHER2-EGFR 센스 siRNA-서 바이빈 센스 siRNA> 및 <EGFR 안티센스 siRNA>는 개별적으로 주형(RNA1 주형 및 RNA2 주형)을 대상으로 5' 프라이머와 3' 프라이머를 사용한 PCR로 얻은 산물을 사용하여 시험관내 전사로 RNA1, RNA2와 RNA3를 합성하였다. <ApEpCAM-survivin antisense siRNA>, <ApHER2-EGFR sense siRNA-survivin sense siRNA>, and <EGFR antisense siRNA> were individually combined with a 5' primer to target the template (RNA1 template and RNA2 template) RNA1, RNA2 and RNA3 were synthesized by in vitro transcription using the products obtained by PCR using 3' primers.

상기 PCR 산물을 T-A 클로닝 pCR 2.1 벡터 (Invitrogen )에 넣고 시퀀싱하였다. PCR 산물을 대상으로 DuraScript 전사 키트 를 사용하여 PCR 산물을 주형으로 전 사를 수행하였다. 2' F-변형된 피리미딘을 CTP 및 UTP를 대체하기 위해 RNA에 혼입시키거나 또는 2' F-CTP 대신에 젬시타빈을 혼입시켰다. The PCR product was placed in a T-A cloning pCR 2.1 vector (Invitrogen) and sequenced. The PCR product was transcribed using the DuraScript transcription kit as a template for the PCR product. 2' F-modified pyrimidines were incorporated into RNA to replace CTP and UTP or gemcitabine was incorporated in place of 2' F-CTP.

a. RNA 1(ApEpCAM-서바 이빈 안티센스 siRNA): 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUp fUprAp fCpfCpfCp rGprGpfUp rAprAprAp rApGprUp rAprGprAp rGprApf Up rGpfCprGp rGpfUprGp rGpfUpfCp fCfpUpfUp-3 '. a. RNA 1 (ApEpCAM-survivin antisense siRNA) : 5'-rGpfCprGp rApfCpfUp fUprGprGp fUp fUprAp fCpfCpfCp rGprGpfUp rAprAprAp rApGprUp rApGprUp

RNA1 PCR 주형: 5'-dTpdApdA p dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdTp dGpdGpdTp dTpdApdCp dCpdCpdGp dGpdTdAp dApdApdAp dTpd GpdTp dApdGpdAp dGpdApdTp dGpdCpdGp dGpdTpdGp dGpdTpdCp dCpdTpd Tp-3'. RNA1 PCR 주형 : 5'-dTpdApdA p dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdGp dCpdGpdAp dCpdTpdTp dGpdGpdTp dTpdApdCp dCpdCpdGp dGpdTdAp dApdApdAp dTpd GpdTp dApdGpdAp dGpdApdTp dGpdCpdGp dGpdTpdGp dGpdTpdCp dCpdTpd Tp-3'.

RNA1 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTp dAp dTpdApdGp d CpdGpdAp dCpdTpdT-3'(F1). RNA1 5' primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTp dAp dTpdApdGp d CpdGpdAp dCpdTpdT-3' (F1).

RNA1 3' 프라이머: 5'-dApdApdGp dGpdApdCp dCpdApdCp dCpdGpdCp dApdTpdCp dTpdCpdTp dApdCpdAp dTpdTpdTp dTpdApdCp dCpdGpdGp-3' RNA1 3' Primer : 5'-dApdApdGp dGpdApdCp dCpdApdCp dCpdGpdCp dApdTpdCp dTpdCpdTp dApdCpdAp dTpdTpdTp dTp dCpdCp-3'

b. RNA2(ApHER2-EGFR 센스 siRNA-서바이빈 센스 siRNA): 5'-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprApfUp rAprGprGp rGpfUprAp rGp rGprGp fCprGpfCp rGprGpfCp fUprAprAp rAprAprAp rAprAprAp fCpfCpfUp fUprAprGp fCprAprGp fUpfCpfUp fUprApfUp fCpfUprAp rApfUpfUp fUpfUprGp rGprApfCp fCprApfCp fCprGpfCp rApfUpfCp fUpfCpfUp rApfCprAp fUpfUp-3'b. RNA2 (ApHER2-EGFR sense siRNA-survivin sense siRNA) : 5'-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprApfUp rAprGprGp rGpfUprAp rGp rGprGp fCprGpfCp rGprGpfCp fUprAprAp rAprAprAp rAprAprAp fCpfCpfUp fUprAprGp fCprAprGp fUpfCpfUp fUprApfUp fCpfUprAp rApfUpfUp fUpfUprGp rGprApfCp fCprApfCp fCprGpfCp rApfUpfCp fUpfCpfUp rApfCprAp fUpfUp-3'

RNA2 PCR 주형: 5'-dApdGpdCp dCpdGpdC p dGpdApdGp dGpdGpdGp dApdGpdGp dGpdApdTp dApdGpdGp dGpdTpdAp dGpdGpdGp dCpdGpdCp dGpdGpdCp dTpdApdAp dApdApdAp dApdApdAp dCpdCpdTp dTpdApdGp dCpdApdGp dTpdCpdTp dTpdApdTp dCpdTpdAp dApdTpdTp dTpdTpdGp dGpdApdCp dCpdApdCp dCpdGpdCp dApdTpdCp dTpdCpdTp dApdCpdAp dTpdTp-3' RNA2 PCR 주형 : 5'-dApdGpdCp dCpdGpdC p dGpdApdGp dGpdGpdGp dApdGpdGp dGpdApdTp dApdGpdGp dGpdTpdAp dGpdGpdGp dCpdGpdCp dGpdGpdCp dTpdApdAp dApdApdAp dApdApdAp dCpdCpdTp dTpdApdGp dCpdApdGp dTpdCpdTp dTpdApdTp dCpdTpdAp dApdTpdTp dTpdTpdGp dGpdApdCp dCpdApdCp dCpdGpdCp dApdTpdCp dTpdCpdTp dApdCpdAp dTpdTp-3'

RNA2 5' 프라이머: F1 RNA2 5' primer : F1

RNA2 3' 프라이머: 5'-dApdApdTp dGpdTpdAp dGpdApdGp dApdTpdGp dCpdGpdGp dTpdGpdGp dTpdCpdCp dApdApdAp dApdTpdTp dApdGpdAp-3'(R2) RNA2 3' Primer : 5'-dApdApdTp dGpdTpdAp dGpdApdGp dApdTpdGp dCpdGpdGp dTpdGpdGp dTpdCpdCp dApdApdAp dApdAp2p

c. RNA3(EGFR 안티 센스 siRNA): 5'-fUpfUprAp rGprApfUp rAprAprGp rApfCpfUp rGpfCpfUp rAprAprGp rGpfCprAp-3'c. RNA3 (EGFR antisense siRNA) : 5'-fUpfUprAp rGprApfUp rAprAprGp rApfCpfUp rGpfCpfUp rAprAprGp rGpfCprAp-3'

RNA3 PCR 주형: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGp dApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdTp dTpdApdGp dApdTpdAp dApdG pdAp dCpdTpdGp dCpdTpdAp dApdGpdGp dCpdAp-3' RNA3 PCR template : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGp dApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdTp dTpdApdGp dApdTpdAp dAp

RNA3 5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp-3'(F2) RNA3 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp-3'(F2)

RNA3 3' 프라이머: 5'-dTpdGpdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dApdGp dTp dCpdTpdTp-3'(R3). RNA3 3' primer : 5'-dTpdGpdCp dCpdTpdTp dApdGpdCp dApdGp dTp dCpdTpdTp-3' (R3).

전사된 RNA는 이소프로 판올 (Sigma-Aldric h)로 침전시킨 후 차가운 70 % 에탄올로 세척한 후 페놀 / 클로로포름 / 이소아밀알코올 (25:24:1) (Sigma-Aldrich) 로 정제하였다. RNA 펠릿을 뉴클레아제(nuclease)없는 물 (IDT)에 용해시켰다. 모 든 전사된 RNA에 대해 정제 과정을 사용했다. 3 개의 RNA를 1:1:1의 몰비로 혼합하 고 94 ℃에서 3 분간 가열 한 후 1 시간 이내에 실온으로 서서히 냉각시켜 어닐링 하여 하나의 개체를 형성시켰다.The transcribed RNA was precipitated with isopropanol (Sigma-Aldric h), washed with cold 70% ethanol, and purified with phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) (Sigma-Aldrich). The RNA pellet was dissolved in nuclease-free water (IDT). A purification procedure was used for all transcribed RNA. Three RNAs were mixed in a molar ratio of 1:1:1, heated at 94°C for 3 minutes, and then slowly cooled to room temperature within 1 hour and annealed to form one individual.

ESEH (EpCAM 압타머-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-HER2 압타머)의 경우, 3 개의 RNA (RNA1, RNA2 및 RNA3)를 1:1:1의 몰비 로 함께 어닐링 하였다.For ESEH (EpCAM aptamer-survivin siRNA-EGFR siRNA-HER2 aptamer), three RNAs (RNA1, RNA2 and RNA3) were annealed together in a molar ratio of 1:1:1.

<압타머-뉴클레오사이드 폴리머 키메라: ApHER2-PolyGem 의 제조><Aptamer-nucleoside polymer chimera: Preparation of ApHER2-PolyGem>

<ApHER2-Gem polymer>는 주형을 대상으로 5' 프라이머와 3' 프라이머 를 사용한 PCR로 얻은 산물을 사용하여 시험관내 전사로 합성하였다 . <ApHER2-Gem polymer> was synthesized by in vitro transcription using the product obtained by PCR using a 5' primer and a 3' primer for a template.

상기 PCR 산물을 T-A 클로닝 pCR 2.1 벡터 (Invitrogen )에 넣고 시퀀싱하였 다. PCR 산물을 대상으로 DuraScript 전사 키트를 사용하여 PCR 산물을 주형으로 전사를 수행하였다. 2' F-변형된 피리미딘을 CTP 및 UTP를 대체하기 위해 RNA에 혼입시키거나 또는 2' F-CTP 대신에 젬시타빈을 혼입시켰다. The PCR product was placed in a T-A cloning pCR 2.1 vector (Invitrogen) and sequenced. The PCR product was transcribed using the DuraScript transcription kit as a template for the PCR product. 2' F-modified pyrimidines were incorporated into RNA to replace CTP and UTP or gemcitabine was incorporated in place of 2' F-CTP.

ApHER2-Gem polymer : 5′-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprAp rAp rGprGprGp fUprAprGp rGprGpfCp rGpfCprGp rGpfCpfUp fCpfCpfCp fCpfCpfCp fCpfCpfCp fCp-3' ApHER2-Gem Polymer : 5′-rAprGpfCp fCprGpfCp rGprAprGp rGprGprGp rAprGprGp rGprAp rAp rGprGprGp fUprAprGp rGpfCpfCp rGpfCpfCpp fCpfCpfCpfCp

PCR 주형: 5′-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dT pdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp dGpdCpdGp dApdGpdGp dGp dGpdAp dGpdGpdGp dApdApdGp dGpdGpdTp dApdGpdGp dGpdCpdGp dCpdGp dGp dCpdTpdCp dCpdCpdCp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3' PCR 주형 : 5′-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dT pdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp dGpdCpdGp dApdGpdGp dGp dGpdAp dGpdGpdGp dApdApdGp dGpdGpdTp dApdGpdGp dGpdCpdGp dCpdGp dGp dCpdTpdCp dCpdCpdCp dCpdCpdCp dCpdCpdCp-3'

5' 프라이머: 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp-3' 5' Primer : 5'-dTpdApdAp dTpdApdCp dGpdApdCp dTpdCpdAp dCpdTpdAp dTpdApdAp dGpdCpdCp-3'

3' 프라이머: 5'- dGpdGpdGp dGpdGpdGp dGpdGpdGp dGpd ApdGp dCpdCpdGp dCpdGpdCp dCpdCpdTp dAp-3' 3' Primer : 5'-dGpdGpdGp dGpdGpdGp dGpdGpdGp dGpd ApdGp dCpdCpdGp dCpdGpdCp dCpdCpdTp dAp-3'

전사된 RNA는 이소프로판올(Sigma-Aldrich)로 침전시킨 후 차가운 70 % 에 탄올로 세척한 후 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (25:24:1) (Sigma-Aldrich) 로 정제하였다. RNA 펠릿을 뉴클레아제(nuclease)없는 물 (IDT)에 용해시켰다. 모든 전사된 RNA에 대해 정제 과정을 사용했다. The transcribed RNA was precipitated with isopropanol (Sigma-Aldrich), washed with cold 70% ethanol, and purified with phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) (Sigma-Aldrich). The RNA pellet was dissolved in nuclease-free water (IDT). A purification procedure was used for all transcribed RNA.

<압타머-화학요법제 복합체 제조><Preparation of aptamer-chemotherapeutic agent complex>

본 발명에서 제조한 약학적 유효성분을 포함하는 AM의 일부는 하기 압타머-화학요법제 복합체이며 이에 제한되는 것은 아니다.A part of the AM including the pharmaceutically active ingredient prepared in the present invention is the following aptamer-chemotherapeutic agent complex, but is not limited thereto.

ApGemHER2-S-S-DM1(A),ApGemHER2-S-S-DM1 (A),

ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B),ApFdUEpCAM-S-S-DM1 (B),

ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(C),ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-DM1 (C),

ApFdUEpCAM-S-S-DN A 박스-S-S-DM1(D),ApFdUEpCAM-S-S-DN A Box-S-S-DM1(D),

ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM(E), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM(E),

ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-D M1(F), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-D M1(F),

ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S -S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G),ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G),

ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) 및ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) and

ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)

추가적으로 Cy3 또는 Cy5-압타머(ApGemHER2)-콜레스테롤 복합체를 제조하였다. Additionally, a Cy3 or Cy5-aptamer (ApGemHER2)-cholesterol complex was prepared.

본 실시예에서 하기 모듈을 유기합성하고 모듈로부터 상기 압타머 표적화약물을 제조하였다.In this example, the following module was organically synthesized and the aptamer targeting drug was prepared from the module.

모듈 사이에 스페이서인 올리고뉴클레오타이드를 제공할 수도 있다.It is also possible to provide oligonucleotides that are spacers between modules.

모듈로 2' F-UTP와 젬시타빈(Gemcitabine)을 구성성분으로 포함하는 HER2 RNA 압타머의 3′ 말단에 티올기(-SH기)가 부가된 ‘ApGemHER2-SH’, 헤어핀 구조인 d(GCG AAA GC)를 갖는 작은 DNA 단편의 한쪽 말단에 티올기, 다른 한쪽에 NH2이 부가된 ‘SH-DNA 박스-NH2’, 2' F-CTP와 5-FdU(5-Fluorouracil)을 구성성분으로 포함하는 EpCAM RNA 압타머의 5′ 말단에 티올기, 3′말단에 -NH2가 부가된 ‘SH-ApFdUEpCAM-NH2’를 제조하였다(미국 Biosynthesis 사). 'ApGemHER2-SH' with a thiol group (-SH group) added to the 3' end of the HER2 RNA aptamer containing modulo 2' F-UTP and gemcitabine as components, hairpin structure d (GCG) 'SH-DNA box-NH 2 ', 2' F-CTP and 5-FdU (5-Fluorouracil) with a thiol group at one end and NH 2 at the other end of a small DNA fragment with AAA GC) 'SH-ApFdUEpCAM-NH 2 ' was prepared in which a thiol group at the 5' end and -NH 2 at the 3' end of the EpCAM RNA aptamer containing

ApGemHER2-SH: 5'-AGC CG C GAG GGG AGG GAA GGG TAG GGC GCG GCT-SH-3' ApGemHER2-SH : 5'-AGC CG C GAG GGG AGG GAA GGG TAG GGC GCG GCT-SH-3'

SH-DNA 박스-NH 2 : 5'-SH-G CG CGC GCG AAA GCG CGC GC-NH2-3’ SH-DNA box-NH 2 : 5'-SH-G CG CGC GCG AAA GCG CGC GC-NH 2 -3'

ApFdUEpCAM-SH: 5'- PEG-GGC GAC UGG UUA CCC G GU CG-SH-3′ ApFdUEpCAM-SH : 5'-PEG-GGC GAC UGG UUA CCC G GU C G-SH-3′

SH-ApFdUEpCAM-NH 2 : 5'-SH-GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG- NH2-3′ SH-ApFdUEpCAM-NH 2 : 5'-SH-GGC GAC UGG UUA CCC GGU CG - NH 2 -3′

제조된 모듈단위 100μmol를 0.1M triethylammonium acetate(TEAA) buffer에서 1.0M Dithiothrei tol(DTT) 10μL와 상온에서 15분 동안 반응시킴으로써, 3' 티올기의 활성을 실시하였고, 또한 과량의 DTT를 제거하기 위하여 ethyl acetate 를 이용하여 3회 이상 추출하였다. 상기 주문 제조한 모듈들은 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 10mM stock으로 제조하였다. By reacting 100 μmol of the prepared module unit with 10 μL of 1.0 M dithiothrei tol (DTT) in 0.1 M triethylammonium acetate (TEAA) buffer at room temperature for 15 minutes, the activity of the 3' thiol group was performed, and also to remove excess DTT It was extracted three or more times using ethyl acetate. The custom-made modules were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 10 mM stock.

a) [ApGemHER2-S-S-DM1(A) ]와 [ApFdUEpCAM- S-S-DM1(B)]의 제조a) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DM1(A)] and [ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B)]

상기 제조된 [ApGemHER2-SH] 또는 [ApFd UEpCAM-SH]와 DM1는 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1으로 하여 상온에서 48시간 반응시켜 복합체를 형성시켰다 . The prepared [ApGemHER2-SH] or [ApFd UEpCAM-SH] and DM1 were 1:1 in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) at room temperature for 48 hours. reacted to form a complex.

상기 [ApGemHER2-S-S-DM1] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DM1] 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. EcliPSe XDB- C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다. HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석하였고, 그 중에서 [ApGemHER2-S-S-DM1] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DM1] 구조체와 일치하는 피 크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다. The [ApGemHER2-S-S-DM1] or [ApFdUEpCAM-S-S-DM1] reaction solution was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Separation was carried out using EcliPSe XDB-C18 column, and it was separated through the gradient of binding buffer (95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile) and elution buffer (50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile). HPLC peaks were analyzed by mass spectroscopy, and among them, only peaks matching the [ApGemHER2-S-S-DM1] or [ApFdUEpCAM-S-S-DM1] structures were taken and used in the experiments of Examples below.

b) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스 -S-S-DM1(C)]와 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(D) ]의 제조b) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-DM1(C)] and [ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-S-S-DM1(D)]

(1) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH(1) [ApGemHER2-S-S-DNA box-NH 22 ]와 [ApFdUEpCAM-S- S-DNA 박스-NH] and [ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-NH 22 ]의 제조:] Manufacture of:

상기 제조된 [ApGemHER2-SH] 또는 [ApFdUEpCAM-SH]와 [SH-DNA 박스-NH2]는 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1으로 하여 상온에서 48시간 반응시 켜 복합체를 형성시켰다. The prepared [ApGemHER2-SH] or [ApFdUEpCAM-SH] and [SH-DNA box-NH 2 ] are 1: in 100mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 and reacted at room temperature for 48 hours to form a complex.

상기 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2] 또는 [ApF dUEpCAM-S-S-DNA 박스-NH2] 반응용액을 High Perfor mance Liquid Chrom atography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. EcliP Se XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다. HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석되었고, 그 중에서 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박 스-NH2]구조체와 일치하는 피크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다. The [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] or [ApF dUEpCAM-SS-DNA box-NH 2 ] reaction solution was purified by High Performance Liquid Chrom atography (HPLC). Separation was carried out using EcliP Se XDB-C18 column, and it was separated through the gradient of binding buffer (95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile) and elution buffer (50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile). HPLC peaks were analyzed through mass spectroscopy, and among them, only peaks matching the [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] or [ApFdUEpCAM-SS-DNA box-NH 2 ] structures were taken in the experiments of the following examples. was used.

(2) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]와 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-SH]의 제조(2) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH] and [ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-SH]

[ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]와 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-SH]의 제조는 [화학식 3]에 따라 하기처럼 수행하였다.

Figure pat00003
[ApGemHER2-SS-DNA box-SH] and [ApFdUEpCAM-SS-DNA box-SH] were prepared according to [Formula 3] as follows.
Figure pat00003

[화학식 3][Formula 3]

상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-NH2]를 사용 직전에 2㎍ SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA 에 용해 된 2-5㎍의 상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-NH2]에 2 5μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 반응시켰다 . 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산 물 및 과량의 비반응 SPDP시약을 제거하였다.Immediately before using the prepared [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] or [ApFdUEpCAM-SS-DNA box-NH 2 ], 2 μg SPDP (Pierce Biotechnology, USA) was dissolved in 320 μL DMSO to obtain a 20 mM SPDP reagent solution. prepared. To 2-5 μg of the prepared [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] or [ApFdUEpCAM-SS-DNA box-NH 2 ] dissolved in 1.0 mL PBS-EDTA, 25 μL of 20 mM SPDP solution was added to room temperature reacted for 30 min. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the buffer was exchanged to remove reaction by-products and excess unreacted SPDP reagent.

23㎍ DTT를 PBS-E DTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DTT) 30분 동안 반응 시켰다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염 하였다(현재 sulfhydryl-modified).23 μg DTT was dissolved in PBS-E DTA to make a 150 mM DTT solution. 0.5mL DTT solution was added per 1mL of the SPDP-modified reaction solution (final concentration 50mM DTT) and reacted for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the reaction solution was desalted to remove DTT (currently sulfhydryl-modified).

상기 탈염된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-D NA 박스-SH] 구조체를 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 10mM stock 으로 제조하였다. The desalted [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH] or [ApFdUEpCAM-S-S-D NA box-SH] construct was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare 10 mM stock.

(3) 상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-SH] 구조체와 상기 DM1을 상기(1)단계에 따라 반응시켜 복합체를 형성하였다. 최종적으로 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1] 또는 [ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박 스-S-S-DM1] 반응용액을 상기 b) 항에 따라 분리와 정제하였다.(3) The prepared [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH] or [ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-SH] construct was reacted with the DM1 according to step (1) to form a complex. The finally obtained [ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-DM1] or [ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-S-S-DM1] reaction solution was separated and purified according to section b) above.

c) ApGemHER2-S-S-U c) ApGemHER2-S-S-U 1515 -ApFdUEpCAM(E)의 제조Preparation of -ApFdUEpCAM(E)

상기 제조된 [ApGemHER2-SH] 와 [ApFdUEpCAM-U 15 -SH]는 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1으로 하여 상온에서 48시간 반응시켜 복합체를 형성시켰다. The prepared [ApGemHER2-SH] and [ApFdUEpCAM -U 15 -SH] were 1:1 in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) at room temperature for 48 hours. reacted to form a complex.

상기 [ApGemHER2-S-S-U15-ApFdUEpCAM] 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. EcliPSe XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetamitrile)와 elutiam buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetamitrile)의 gradient를 통해 분리하였다. HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석되었고, 그 중에서 [ApGemHER2-S-S-U15-ApFdUEpCAM] 구조체와 일치하는 피크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다. The [ApGemHER2-SSU 15 -ApFdUEpCAM] reaction solution was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Separation was carried out using EcliPSe XDB-C18 column, and it was separated through the gradient of binding buffer (95% 0.1M TEAA, 5% Acetamitrile) and elutiam buffer (50% 0.1M TEAA, 50% Acetamitrile). The peaks of HPLC were analyzed by mass spectroscopy, and among them, only peaks consistent with the [ApGemHER2-SSU 15 -ApFdUEpCAM] structure were taken and used in the experiments in Examples below.

d) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(F)]의 제조d) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(F)]

상기 b)항의 (2) 단계에 서 최종적으로 얻은 산물들을 모듈단위로 반응시켜 [ApGemHER 2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1]를 제조하였다. By reacting the products finally obtained in step (2) of b) in a module unit, [ApGemHER 2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-DM1] was prepared.

(1) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH (1) [ApGemHER2-S-S-DNA box-NH 22 ]의 제조:] of manufacture:

상기 제조된 [ApGemHER2-SH와 SH-DNA 박스-NH2]는 50% DMSO와 2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 100mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 내에서 1:1으로 하여 상온에서 48시간 반응시켜 복합체를 형성시켰 다. The prepared [ApGemHER2-SH and SH-DNA box-NH 2 ] was 1:1 in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 50% DMSO and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and reacted at room temperature for 48 hours. to form a complex.

상기 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2] 반응용액을 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)를 실시하여 정제하였다. EcliPSe XDB-C18 column을 이용하여 분리를 진행하였고, binding buffer(95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile)와 elution buffer(50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile)의 gradient를 통해 분리하였다. HPLC의 피크들은 mass spectroscopy 방법을 통해서 분석되었고, 그 중에서 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2]와 일치하는 피크들만 취하여 하기 실시예의 실험에서 사용하였다. The [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] reaction solution was purified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Separation was carried out using EcliPSe XDB-C18 column, and it was separated through the gradient of binding buffer (95% 0.1M TEAA, 5% Acetonitrile) and elution buffer (50% 0.1M TEAA, 50% Acetonitrile). HPLC peaks were analyzed by mass spectroscopy, and among them, only peaks consistent with [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] were taken and used in the experiments in Examples below.

(2) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]의 제조:(2) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH]:

[ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]의 제조는 [화학식 3]에 따라 하기처럼 수행하였다. 상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2]를 사용 직전에 2㎍ SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA 에 용해 된 2-5㎍의 상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-NH2]에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비 반응 SPDP시약을 제거하였다.Preparation of [ApGemHER2-SS-DNA box-SH] was performed according to [Formula 3] as follows. Immediately before use of the prepared [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ], 2 μg SPDP (USA, Pierce Biotechnology) was dissolved in 320 μL DMSO to prepare a 20 mM SPDP reagent solution. 25 μL of 20 mM SPDP solution was added to the prepared [ApGemHER2-SS-DNA box-NH 2 ] of 2-5 μg dissolved in 1.0 mL PBS-EDTA, followed by reaction at room temperature for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the buffer was exchanged to remove reaction by-products and excess unreacted SPDP reagent.

23㎍ DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질 된 반응용액 1 mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DT T) 30분 동안 반응시켰다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다(현재 sulfhydryl-modified).23 μg DTT was dissolved in PBS-EDTA to make a 150 mM DTT solution. 0.5mL DTT solution was added per 1mL of the SPDP-modified reaction solution (final concentration 50mM DT T) and reacted for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the reaction solution was desalted to remove DTT (currently sulfhydryl-modified).

상기 탈염된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]를 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 10mM stock으로 제조하였다. The desalted [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH] was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 10 mM stock.

(3) 상기 제조된 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]와 상기 주문 제조한 [SH-ApFdUEpCAM-S-S-DM1]을 상기(1)단계에 따라 반응시켜 복합체를 형성하였다. 최종적으로 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1] 반응용액을 상기 b) 항에 준하여 분리와 정제하였다.(3) The prepared [ApGemHER2-S-S-DNA box-SH] and the custom-made [SH-ApFdUEpCAM-S-S-DM1] were reacted according to step (1) to form a complex. The finally obtained [ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1] reaction solution was separated and purified according to section b) above.

e) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G)]의 제조e) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G)]

본 실시예 에서 상기 주문 제조한 [HS-ApFdUEpCAM-NH2]로부터 [P TX-S-S-ApFdUEpCAM-NH2]를 제조하고 이어서, [PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH]를 모듈 조 립 순서로 목적하는 약물운반체를 제조하였다.In this embodiment, [P TX-SS-ApFdUEpCAM-NH 2 ] was prepared from the order-made [HS-ApFdUEpCAM-NH 2 ], and then, [PTX-SS-ApFdUEpCAM-SH] was used in the module assembly order. A drug carrier was prepared.

(1) [PTX-S-S- ApFdUEpCAM-NH(1) [PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH 22 ]의 제조] manufacturing

상기 [PTX-S-S-ApFdUEp CAM-NH2]는 PTX(Paclitaxel, Sigma-Aldrich Inc.,미국 )에 링커(4-Maleimidobutyric acid)를 사용하여 제조한 티올(Thiol)기와 반응성이 있는 말레이미드 작용기가 부가된 PTX와 상기 주문 제조한 [HS -ApFdUEpCAM-NH2]와 반응시켜 제조하였다(대한민국 특허출원번호 10-2016-7000554).The [PTX-SS-ApFdUEp CAM-NH 2 ] is a maleimide functional group reactive with a thiol group prepared by using a linker (4-Maleimidobutyric acid) in PTX (Paclitaxel, Sigma-Aldrich Inc., USA). It was prepared by reacting the added PTX with the custom-made [HS -ApFdUEpCAM-NH 2 ] (Korean Patent Application No. 10-2016-7000554).

말레이미드(Maleimide)가 도입된 PTX의 합성: Synthesis of Maleimide-Incorporated PTX:

PTX 1g(1.17mmol, 1 eq), 4-Maleimidobutyric acid 210 ㎍(1.17 mmol, 1eq), 디메칠아미노피리딘(DMAP) 140㎍(2.34mmol, 2eq), 디시 클로헥실카르보디이미드(DCC) 480㎍(1.17mmol, 1eq)을 100ml 둥근 플 라스크(Round flask)에 담고, 메틸렌 클로라이드(Methylene chlorid e) 50ml를 넣은 후, 상온에서 교반하여 반응시켰다.PTX 1g (1.17mmol, 1 eq), 4-Maleimidobutyric acid 210㎍ (1.17mmol, 1eq), dimethylaminopyridine (DMAP) 140㎍ (2.34mmol, 2eq), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 480㎍ (1.17 mmol, 1eq) was placed in a 100ml round flask, and 50ml of methylene chloride was added thereto, followed by stirring at room temperature to react.

반응의 진행은 TLC(Thin Layer Chromatography)법을 이용하여 관찰하고 반응이 끝나면, 증류수(DW) 50ml를 넣어 흔들어 섞었다(Work up).(Rf Value = 0.43, Hexane:Ethyl acetate = 1:1)The progress of the reaction was observed using the TLC (Thin Layer Chromatography) method. After the reaction, 50 ml of distilled water (DW) was added and shaken (Work up). (Rf Value = 0.43, Hexane:Ethyl acetate = 1:1)

유기용매 층을 모아 마그네슘 설파이드(Magnesium sulfide)로 수분을 제거한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 이용하여 분리하였다.(Hexane:Ethyl acetate = 1:1) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 물질을 농축하여 말레이미드가 도입된 PTX의 화합물 620㎍을 얻었다. After the organic solvent layers were collected, moisture was removed with magnesium sulfide, and separated using silica gel column chromatography (Hexane:Ethyl acetate = 1:1), silica gel column chromatography was performed. The obtained material was concentrated to obtain 620 μg of a compound of PTX into which maleimide was introduced.

[PTX-S-S-ApFdUEpCAM-NH 2 ]의 제조: Preparation of [PTX-SS-ApFdUEpCAM-NH 2 ] :

상기 합성한 말레이미드가 도입된 PTX를 1ml DMSO에 20mM로 녹인 후, 1:1.5~5 비율로 상기 합성한 [SH-ApFdUEpCAM-NH2]을 혼합하였다. 여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에 서 5분간 반응시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량 을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다.The synthesized maleimide-introduced PTX was dissolved in 1 ml DMSO at 20 mM, and then the synthesized [SH-ApFdUEpCAM-NH 2 ] was mixed at a ratio of 1:1.5-5. After adding 2 to 3 drops of DIPEA (Diisopropyl ethyl amine), it was reacted in Vortex for 5 minutes. The completion of the reaction was confirmed with Elman's reagent, and when the yellow light disappeared, cooled diethyl ether was added to the obtained mixture, and then the obtained compound was precipitated by centrifugation. After purification by Prep-HPLC, the molecular weight was confirmed by LC/MS and frozen to make a powder.

(2) [PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH]의 제조:(2) Preparation of [PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH]:

먼저, 2㎍ SPDP(미국, Pierce Biot echnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA에 용해된 2-5㎍의 상기 제조된 [PTX-ApFdUEpCAM-NH2] 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP 시약을 제거하였다.First, 2㎍ SPDP (USA, Pierce Biotechnology) was dissolved in 320μL DMSO to prepare a 20mM SPDP reagent solution. 2-5 μg of the prepared [PTX-ApFdUEpCAM-NH 2 ] dissolved in 1.0 mL PBS-EDTA was added to 25 μL of 20 mM SPDP solution and reacted at room temperature for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the buffer was exchanged to remove reaction by-products and excess unreacted SPDP reagent.

23㎍ DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농 도 50mM DTT) 30분 동안 반응시켰다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화 하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다(현재 sulfhydryl- modified).23 μg DTT was dissolved in PBS-EDTA to make a 150 mM DTT solution. 0.5 mL DTT solution was added per 1 mL of the SPDP-modified reaction solution (final concentration 50 mM DTT), and the reaction was carried out for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA and the reaction solution was desalted to remove DTT (currently sulfhydryl-modified).

(3) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM- S-S-PTX]의 제조: (3) Preparation of [ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-PTX] :

상기 b) 항의 3단계에서 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH]와 상기 제조한 [PTX-S-S-ApFdUEpCAM-SH]의 복합체 형성 을 실시예2의(1)단계에 따라 수행하였다. 최종적으로 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX] 구조체를 상기 b) 항에 따라 분리와 정제하였다.The complex formation of [ApGemHER2-SS-DNA box-SH] obtained in step b) and [PTX-SS-ApFdUEpCAM-SH] prepared above was performed according to step (1) of Example 2. The finally obtained [ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM - SS-PTX] construct was isolated and purified according to section b) above.

f) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H)와 MMAF(I)]의 제조f) Preparation of [ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) and MMAF(I)]

본 실시예에서 상기 주문 제조한 [HS-ApFdUE pCAM-NH2]로부터 [MMAE 또는 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH2] 제조하고 이어서, [MMAE 또는 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH]를 모듈 조립 순서로 목적하는 약물운반체를 제조하였다.In this embodiment, [MMAE or MMAF-SS-ApFdUEpCAM-NH 2 ] was prepared from the order-made [HS-ApFdUE pCAM-NH 2 ], and then, [MMAE or MMAF-SS-ApFdUEpCAM-SH] was assembled in the order of module assembly. A desired drug carrier was prepared.

(1) [MMAE 또는 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-NH 2 ]의 제조: (1) Preparation of [MMAE or MMAF-SS-ApFdUEpCAM-NH 2 ] :

아우리스타틴 말레이미드카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질카바메 이트-MMAE(maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarba mate-MMAE) 또는 말레이미도카프로일-MMAF(maleimidocaproyl-MMAF)(Levena Biopharma, San Diego, CA)를 1ml DMSO에 20mM의 농도로 첨가하고 1.5-5 배 몰 과 량의 PBS + 2mM EDTA 중의 환원된 [SH-ApFdUEpCAM-NH2]에 첨가하였다. Auristatin maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarbamate-MMAE (maleimidecaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarba mate-MMAE) or maleimidocaproyl-MMAF (Levena Biopharma) , San Diego, CA) was added to 1 ml DMSO at a concentration of 20 mM and reduced [SH-ApFdUEpCAM-NH 2 ] in a 1.5-5 fold molar excess of PBS + 2 mM EDTA.

여기에 DIPEA(Dii sopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응 시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. 과량의 약물을 AmicAM Ultra 10k 스핀 컬럼을 사용하여 PBS로 탈염시킴으로써 제거하고 Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다. 분석 효율은 분석 HPLC에 의해 확인되었고, 99 % 순도로 진행되었다.After adding 2~3 drops of DIPEA (Dii sopropyl ethyl amine), it was reacted in Vortex for 5 minutes. The completion of the reaction was confirmed with Elman's reagent, and when the yellow light disappeared, cooled diethyl ether was added to the obtained mixture, and then the obtained compound was precipitated by centrifugation. Excess drug was removed by desalting with PBS using an AmicAM Ultra 10k spin column, purified by Prep-HPLC, molecular weight was confirmed by LC/MS, and frozen to make a powder. Analytical efficiency was confirmed by analytical HPLC and proceeded to 99% purity.

(2) [MMAE 또는 MMAF-S-S-ApF dUEpCAM-SH]의 제조: (2) Preparation of [MMAE or MMAF-SS-ApF dUEpCAM-SH] :

먼저, 2㎍ SPDP(미국, Pierce Biotechno logy사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA에 용해된 2-5㎍의 상기 제조된 [MMAE 또는 MMAF-S-S -ApFdUEpCAM-NH2]에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에 서 30분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP 시약을 제거하였다.First, 2㎍ SPDP (USA, Pierce Biotechnology) was dissolved in 320μL DMSO to prepare a 20mM SPDP reagent solution. 2-5 μg of the prepared [MMAE or MMAF-SS-ApFdUEpCAM-NH 2 ] dissolved in 1.0 mL PBS-EDTA was added with 25 μL of 20 mM SPDP solution and reacted at room temperature for 30 minutes. The desalting column was equilibrated with PBS-EDTA, and the buffer was exchanged to remove reaction by-products and excess unreacted SPDP reagent.

23㎍ DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용 액을 만들었다. SPDP로 개질된 반응용액 1mL 당 0.5mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50mM DTT) 30분 동안 반응시켰다. AmicAM Ultra 1 0kD 스핀 컬럼(Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 PBS + 2mM ED TA로 교환하여 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 반응용액을 탈염하였다(현재 sulfhydryl-modified).23 μg DTT was dissolved in PBS-EDTA to make a 150 mM DTT solution. A 0.5 mL DTT solution was added per 1 mL of the SPDP-modified reaction solution (final concentration 50 mM DTT), and the reaction was carried out for 30 minutes. Using an AmicAM Ultra 10 kD spin column (Millipore, Billerica, MA), it was exchanged with PBS + 2 mM ED TA, equilibrated with PBS-EDTA, and the reaction solution was desalted to remove DTT (currently sulfhydryl-modified).

(3) [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE 또는 MMAF]의 제조: (3) Preparation of [ApGemHER2-SS-DNA Box-SS-ApFdUEpCAM-SS-MMAE or MMAF] :

상기 b) 항의 3단계에서 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-SH] 구조체와 상기 제조 한 [MMAE 또는 MMAF-S-S-ApFdUEpCAM-SH]의 복합체 형성을 상기 b) 항의 (1)단계에 따라 수행하였다. 최종적으로 얻은 [ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE 또는 MMAF] 구조체를 상기 b) 항에 따라 분리와 정제하였다.The complex formation of the [ApGemHER2-SS-DNA box-SH] construct obtained in step b) in step 3 and the prepared [MMAE or MMAF-SS-ApFdUEpCAM-SH] was performed according to step (1) of item b). . The finally obtained [ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM - SS-MMAE or MMAF] construct was isolated and purified according to section b) above.

g) 독소루비신이 결합한 맞춤치료분자의 제조g) Preparation of customized therapeutic molecules bound to doxorubicin

상기 실시예에서 독소루비신이 특이적으로 결합할 수 있는 헤어핀 구조인 d(GCG AAA GC)를 갖는 작은 DNA 단편을 함유한 염기서열 5'-GCG CGC GCG AAA GCG CGC GC-3'(한국 바이오니아사) 을 함유한 다양한 맞춤치료분자를 제조하였다.In the above example, the base sequence 5'-GCG CGC GCG AAA GCG CGC GC-3' (Bionia Korea) containing a small DNA fragment having a hairpin structure d (GCG AAA GC) to which doxorubicin can bind specifically. Various customized therapeutic molecules containing

DNA(500μM), 상기 제조된 맞춤치료분자(20μM), 포름 알데히드(0.37%)를 반응 완충액(20mM 인산 나트륨, 150mM NaCl, 0.5mM ,EDTA, pH 7.0))에 배양하여 독소루비신이 탑재된 DNA-맞춤치료분자 (이하 ‘DNA/맞춤치료분자’라고 명명함)을 10℃에서 12시간 동안 제조하였다. DNA (500 μM), the prepared custom therapeutic molecule (20 μM), and formaldehyde (0.37%) were incubated in a reaction buffer (20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 0.5 mM ,EDTA, pH 7.0)) and doxorubicin-loaded DNA- A customized therapeutic molecule (hereinafter referred to as 'DNA/customized therapeutic molecule') was prepared at 10°C for 12 hours.

생성된 DNA/맞춤치료분자를 0.1M 트리틸아민 아세테이트(trithylamine acetate, TEAA, Glen Research Corp.) 및 아세토 니트릴을 사용하여 C-18 컬럼상에 서 역상 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 용리액으로 사용하여 정제하였다. The resulting DNA/custom therapeutic molecule was subjected to reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC, Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.) as eluent.

정제된 시료를 Dulbecco's 완충액(Sigma Aldrich)에서 동결 건조, 탈염 및 처리한 후 향후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다. UV-Vis spectrometry에 의한 약물 정량화를 위해 free DNA의 경우 480 nm에서 11,500 M-1cm-1의 몰 흡광 계수와 DNA/맞춤치료분자의 공유 결합 DNA의 경우 506nm에서 7,677 M-1cm-1이 사용되었다.Purified samples were lyophilized, desalted and treated in Dulbecco's buffer (Sigma Aldrich) and then stored at -20°C for future use. For drug quantification by UV-Vis spectrometry, a molar extinction coefficient of 11,500 M -1 cm -1 at 480 nm for free DNA and 7,677 M -1 cm -1 at 506 nm for covalently bound DNA of DNA/customized therapeutic molecule. was used

실시예 4. 담즙산이 교유결합된 양이온성 분자Example 4. Cationic Molecules Crosslinked with Bile Acids

<PS-TCA의 제조><Production of PS-TCA>

1 mmol의 TCA 을 투명한 용액이 될 때까지 0℃ 에서 5 mL DMSO 에 용해시켰다. 그 후 3 mmol의 TEA 및 2.5 mmol의 4-NPC 을 차례로 가하고, 0℃에서 30분, 상온에서 30분간 반응시켰다. 0.1 mmol의 PS 을 10 mL 2차 증류수에 용해시킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막(MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면 서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 PS-TCA을 수득하였다(수득율 78±2%).1 mmol of TCA was dissolved in 5 mL DMSO at 0° C. until a clear solution was obtained. Then, 3 mmol of TEA and 2.5 mmol of 4-NPC were sequentially added, and the reaction was conducted at 0° C. for 30 minutes and at room temperature for 30 minutes. After dissolving 0.1 mmol of PS in 10 mL of distilled water, it was added to the reaction solution and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction solution was dialyzed with secondary distilled water for 3 days while changing the medium every 6 hours using a dialysis membrane (MWCO: 1000Da). After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain PS-TCA (yield 78±2%).

<CS-TCA의 제조><Production of CS-TCA>

1 mmol의 TCA 을 투명한 용액이 될 때까지 0℃에서 5 mL DMSO 에 용 해시켰다. 그 후 3 mmol의 TEA 및 2.5 mmol의 4-NPC을 차례로 가하고, 0℃에서 30 분, 상온에서 30분간 반응시켰다. 0.01 mmol CS 을 20 mL 2차 증류수 에 용해시 킨 후 상기 반응용액에 가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 반응액을 투석막(MWCO: 1000Da)을 이용하여 매 6시간마다 매질을 바꾸면서 3일동안 2차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 CS-TCA을 수득하였다(수득율 92±2%).1 mmol of TCA was dissolved in 5 mL DMSO at 0 °C until a clear solution was obtained. After that, 3 mmol of TEA and 2.5 mmol of 4-NPC were sequentially added, and reacted at 0° C. for 30 minutes and at room temperature for 30 minutes. After dissolving 0.01 mmol CS in 20 mL of distilled water, it was added to the reaction solution and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction solution was dialyzed with secondary distilled water for 3 days while changing the medium every 6 hours using a dialysis membrane (MWCO: 1000Da). After dialysis, the reaction product was freeze-dried to obtain CS-TCA (yield 92±2%).

(구조 확인)(Check structure)

상기 PS-TCA 및 CS-TCA은 각각 PS 및 CS의 아민기가 TCA의 하이드록실기에 공유결합되어 제조되었다. The PS-TCA and CS-TCA were prepared by covalently bonding the amine groups of PS and CS to the hydroxyl groups of TCA, respectively.

이를 확인하기 위하여 D2O에 PS-TCA 및 CS-TCA를 각각 10㎍/mL로 용해시킨 후 1H NMR 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 도시하였으며, 이로부터 TCA와 PS 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션 및 TCA와 CS 사이의 아미드 결합 컨쥬게이션에 대한 피크가 δ 8 ppm에서 검출되었다.To confirm this, 1H NMR analysis was performed after dissolving PS-TCA and CS-TCA in D 2 O at 10 μg/mL, respectively. The results are shown in Figs. 3 and 4, from which peaks for amide bond conjugation between TCA and PS and amide bond conjugation between TCA and CS were detected at δ 8 ppm.

또한, 상기 PS-TCA 및 CS-TCA의 아민기 함량을 알아보기 위하여 TNBSA (trinitro benzene sulphonate) 분석을 통해 PS과 CS 각각에 TCA가 공유결합된 후 아미노화 정도를 정량화하였다. 그 결과 PS-TCA는 PS로의 TCA 공유결합 전에 비해 53%로, TCA의 공유결합 이후 아민기 함량이 감소되었음을 확인하였다.In addition, in order to determine the amine group content of PS-TCA and CS-TCA, the degree of amination was quantified after TCA was covalently bound to PS and CS through trinitro benzene sulphonate (TNBSA) analysis. As a result, it was confirmed that PS-TCA was 53% compared to before covalent bonding of TCA to PS, and the amine group content was reduced after covalent bonding of TCA.

실시예 5. 담즙산이 공유결합한 음이온성 분자 Example 5. Anionic Molecules Covalently Attached to Bile Acids

<HA-TCA의 제조><Production of HA-TCA>

활성화 TCA의 제조Preparation of activated TCA

활성화 TCA의 합성을 위해 1mol의 TCA를 DMF에 용해시킨 후 TCA 용액을 0∼4℃의 온도범위로 조절한 후 5 mol의 4-NPC를 첨가하였다. 상기 4-NPC을 모두 용해시킨 후 용액의 색이 노란색으로 변할 때까지 6 mol의 TEA을 한 방울씩 천천히 첨가하고 1시간동안 혼합하여 TCA-NPC-TEA 반응용액을 제조였다. 상기 제조한 TCA-NPC-TEA 반응용액을 상온에서 6시간 동안 교반시켜 TCA-NPC 복합체를 제조하였다. For the synthesis of activated TCA, 1 mol of TCA was dissolved in DMF, the TCA solution was adjusted to a temperature range of 0 to 4° C., and then 5 mol of 4-NPC was added. After dissolving all of the 4-NPC, 6 mol of TEA was slowly added dropwise until the color of the solution turned yellow, and mixed for 1 hour to prepare a TCA-NPC-TEA reaction solution. The TCA-NPC-TEA reaction solution prepared above was stirred at room temperature for 6 hours to prepare a TCA-NPC complex.

상기 반응이 완료된 TCA-NPC-TEA 반응용액을 4500rpm의 속도로 20분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 TCA-NPC 복합체 펠릿을 수득하였다. 상기 수득된 TCA-NPC 복합체 펠릿은 증류수와 에틸아세테이트(ethyl acetate)가 1:1 부피비로 혼합된 수용액을 이용하여 TCA-NPC 복합체 펠릿을 포함한 용액의 노란색이 사라질 때까지 액-액 추출을 수행함으로서 불순물을 제거하였다. After the reaction was completed, the TCA-NPC-TEA reaction solution was centrifuged at a speed of 4500 rpm for 20 minutes to remove the supernatant, and a TCA-NPC complex pellet was obtained. The obtained TCA-NPC complex pellet was obtained by using an aqueous solution in which distilled water and ethyl acetate were mixed in a 1:1 volume ratio until the yellow color of the solution including the TCA-NPC complex pellet disappeared by performing liquid-liquid extraction. Impurities were removed.

TCA-NPC 복합체는 수용성으로 추출 후 얻어진 증류수 층에 존재한다. 상기 TCA-NPC 복합체가 포함된 증류수 층은 회 전증발을 이용해 유기용매를 제거한 뒤 동결건조를 수행하여 파우더 형태의 TCA-NPC 복합체를 수득하였다. The TCA-NPC complex is present in the distilled water layer obtained after extraction with water solubility. The distilled water layer containing the TCA-NPC complex was subjected to lyophilization after removing the organic solvent by rotary evaporation to obtain a TCA-NPC complex in powder form.

상기 수득된 TCA-NPC 복합체 분말을 DMF에 완전히 용해시킨 후 상기 TCA-NPC 복합체 용액의 온도를 50℃로 조절하였다. 상기 온도가 50℃로 조절된 TCA-NPC 복합체 용액에 2mol의 4-methylmorpholine(4-MMP)를 첨가하고 동일 온도 분위기에서 1시간 동안 교반한 후 25mol의 Ethylenediamine(EDA)을 한 방울씩 떨어트려 천천히 반응시켰다. 상기 반응은 상온에서 16시간 동안 수행하였으며 반응이 완료된 용액은 TCA-NH2 결정을 얻기 위하여 아세톤을 첨가하여 TCA-NH2 결정을 침전시켰다. After the obtained TCA-NPC complex powder was completely dissolved in DMF, the temperature of the TCA-NPC complex solution was adjusted to 50°C. 2 mol of 4-methylmorpholine (4-MMP) was added to the TCA-NPC complex solution whose temperature was adjusted to 50° C., and after stirring for 1 hour in the same temperature atmosphere, 25 mol of Ethylenediamine (EDA) was slowly added dropwise. reacted. The reaction was carried out at room temperature for 16 hours, and the reaction solution was completed by adding acetone to obtain TCA-NH 2 crystals to precipitate TCA-NH 2 crystals.

상기 침전된 TCA-NH2 결정은 12000 rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 TCA-NH2 결정을 수득하였으며 상기 수득된 TCA-NH2 결정은 증류수에 다시 녹여 동결 건조하여 분말의 형태로 수득하였다. 상기 동결건조를 통해 수 득한 TCA-NH2 결정은 4℃ 냉장고에 보관하였다.The precipitated TCA-NH 2 crystals were centrifuged at a speed of 12000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant, and then TCA-NH 2 crystals were obtained. The obtained TCA-NH2 crystals were dissolved again in distilled water and freeze-dried to form a powder. was obtained with TCA-NH 2 crystals obtained through the freeze-drying were stored in a refrigerator at 4°C.

상기 과정을 통해 제조한 활성화 TCA(TCA-NH2를 D2O 용매 (10 ㎍/ml)에 용해시킨 후 수소핵자기공명(1H-NMR)을 수행하여 TCA-NH2의 화학구조를 분석함으로서 TCA-NH2가 성공적으로 합성되었음 을 확인하였다. By analyzing the chemical structure of TCA-NH 2 by dissolving activated TCA (TCA-NH 2 ) prepared through the above process in D 2 O solvent (10 μg/ml) and performing hydrogen nuclear magnetic resonance (1H-NMR). It was confirmed that TCA-NH 2 was successfully synthesized.

또한 TCA-NH2의 아민화 정도를 확인하기 위하여 아민기의 정량방법인 TNBSA(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) assay를 수행하였다.In addition, in order to confirm the degree of amination of TCA-NH 2 , TNBSA (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) assay, which is a quantitative method for amine groups, was performed.

HA-TCA의 제조Preparation of HA-TCA

1 mol의 HA를 증류수에 완전히 용해시켜 HA 용액을 제조하고 상기 HA용액의 온도를 0-4℃로 조절하였다. 상기 HA 용액에 12 mol의 EDC를 첨가하고 상온에서 5분 동안 교반하여 활성화 HA를 제조하였다. 상기 활성화된 HA를 포함하는 용액에 12mol의 NHS를 넣어주고 10분 동안 교반시켜 HA-NHS 용액을 제조하였다. 1 mol of HA was completely dissolved in distilled water to prepare an HA solution, and the temperature of the HA solution was adjusted to 0-4°C. Activated HA was prepared by adding 12 mol of EDC to the HA solution and stirring at room temperature for 5 minutes. 12 mol of NHS was added to the solution containing the activated HA and stirred for 10 minutes to prepare an HA-NHS solution.

상기 HA-NHS 용액에 상기 제조한 10 mol의 TCA-NH2이 포함된 TCA-NH2 용액을 첨가하여 HA-TCA 반응용액을 제조한 후 24시간 동안 상온에서 교반하여 HA-TCA 결합체를 합성하였다. A HA-TCA reaction solution was prepared by adding the TCA-NH2 solution containing 10 mol of TCA-NH 2 prepared above to the HA-NHS solution, followed by stirring at room temperature for 24 hours to synthesize an HA-TCA conjugate.

상기 HA-TCA 결합체의 합성은 HA와 TCA의 첨가몰비(feed mole ratio)가 1:10, 1:50 및 1:100이 되도록 수행하였다. HA-TCA 합성반응이 완료된 HATCA 반응 용액은 증류수에서 막여과(membrane filter MWCO: 1000 Da)를 이용하여 24시간동안 투석하였다. 상기 투석이 끝난 HA-TCA 반응용액은 동결건조를 수행하여 HA-TCA 분말을 수득하였다. 상기 수득한 얻어진 HA-TCA 분말은 4℃ 냉장고에 보관하였다.The HA-TCA conjugate was synthesized so that the HA and TCA feed mole ratios were 1:10, 1:50 and 1:100. The HATCA reaction solution in which the HA-TCA synthesis reaction was completed was dialyzed in distilled water for 24 hours using membrane filtration (membrane filter MWCO: 1000 Da). The HA-TCA reaction solution after the dialysis was lyophilized to obtain HA-TCA powder. The obtained HA-TCA powder obtained above was stored in a refrigerator at 4°C.

상기 합성된 HA-TCA 결합체를 D2O 용매(10 ㎍/ml)에 용해시켜 수소핵자기공명(1H-NMR)을 수행하여 화학구조를 분석하였다. The synthesized HA-TCA conjugate was dissolved in a D 2 O solvent (10 μg/ml), and hydrogen nuclear magnetic resonance (1H-NMR) was performed to analyze the chemical structure.

또한 HA와 TCA의 결합비율은 황산법(sulfuric acid method)을 통해 확 인하였다. 상기 황산법은 60 ㎍/ml HA 또는 HA-TCA를 증류수에 용해 시켜 황산과 혼합하여 황산반응용액을 제조한 후 상기 용액을 80℃에서 3분간 처리하고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 420 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다.In addition, the binding ratio of HA and TCA was confirmed by the sulfuric acid method. In the sulfuric acid method, 60 μg/ml HA or HA-TCA is dissolved in distilled water and mixed with sulfuric acid to prepare a sulfuric acid reaction solution, then the solution is treated at 80° C. for 3 minutes, and absorbance at 420 nm with a microplate reader was performed as a method of measuring .

HA 와 TCA를 결합하기 위해 먼저 TCA를 활성화시켜 NH2 기를 형성하였다. TCA 의 활성 확인은 수소핵자기공명법과 TNBSA assay를 통해 확인하였다.In order to bind HA and TCA, TCA was first activated to form an NH 2 group. TCA activity was confirmed by hydrogen nuclear magnetic resonance and TNBSA assay.

도 5는 TCA, TCA-NPC 및 TCA-NH2에 대한 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다. 상기 스펙트럼에는 8ppm에 서 확인되는 NH2 피크(peak)와 0.5~1.5ppm에서 확인되는 TCA moiety 의 양성자 피크가 확인되며 이를 통하여 TCA-NH2가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.5 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectra for TCA, TCA-NPC and TCA-NH 2 . In the spectrum, an NH2 peak confirmed at 8 ppm and a proton peak of the TCA moiety identified at 0.5 to 1.5 ppm were confirmed, thereby confirming that TCA-NH 2 was successfully synthesized.

도 6은 HA와 TCA의 결합을 확인할 수 있는 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다. HA-TCA 결합체는 TCA의 NH2기와 HA의 활성화된 COOH 기가 아마이드 결합을 통 해 합성된 것이 확인되었다. 6 shows a hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum that can confirm the binding of HA and TCA. It was confirmed that the HA-TCA conjugate was synthesized through an amide bond between the NH 2 group of TCA and the activated COOH group of HA.

상기 수소핵자기공명스펙트럼에서는 2ppm에서 확인되는 HA의 N-Acetyl-D-Glucosamine의 -NH기 피크(스펙트럼에서 2로 표시)를 기준으로 8ppm에 서 확인되는 TCA의 NH2기와 HA의 활성화된 COOH기에 의한 아마이드 결합의 피크(스펙트럼에서 1로 표시) 및 0.5~1.5 ppm 부근에서 확인되는 TCA moiety의 피크가 확 인되었다. In the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum, based on the -NH group peak of N-Acetyl-D-Glucosamine of HA (indicated as 2 in the spectrum) confirmed at 2 ppm, the NH 2 group of TCA and the activated COOH of HA at 8 ppm The peak of the amide bond due to the group (indicated by 1 in the spectrum) and the peak of the TCA moiety confirmed at around 0.5-1.5 ppm were confirmed.

표 2은 HA-TCA 결합체의 황산법(sulfuric acid me thod) 분석결과를 보여준다.Table 2 shows the analysis results of the sulfuric acid method of the HA-TCA conjugate.

HA-TCA 결합체의 황산법(sulfuric acid method) 분석결과 Sulfuric acid method analysis result of HA-TCA conjugate 시료명Sample name 첨가몰비
(Feed mole ratio, H A:TCA)addition molar ratio
(Feed mole ratio, HA:TCA) 결합몰비
(Binding mole ratio)bonding molar ratio
(Binding mole ratio) HA-TCA 10 HA-TCA 10 1:101:10 8.6 8.6 HA-TCA 50 HA-TCA 50 1:501:50 9.6 9.6 HA-TCA 100 HA-TCA 100 1:1001:100 13.3 13.3

표 2에는 활성화된 HA와 활성화된 TCA의 첨가몰비(feed mole ratio)를 1:10, 1:50 및 1:100으로 조절하여 제조한 HA-TCA 결합체의 HA-TCA 결합몰비(binding mole ratio)를 보여준다. HA와 TCA의 첨가몰비(HA:TCA)를 1:10, 1:50, 1:100으로 증가시킨 경우 HA와 TCA의 결합몰비는 각각 8.6, 9.6, 13.3으로 점차 증가한 것이 확인되었다. 상기 실험결과, HA-TCA 결합체의 HA-TCA 결합몰비는 첨가몰비의 증가에 비해 큰 차이가 없으므로 가장 효율적으로 결합하는 첨가몰비 1:10 조건에서 제조된 HA-TCA 결합체(결합몰비 HA:TCA = 1:8.6)를 선택하여 AM/PS 복합체의 코팅에 이용하였다.Table 2 shows the HA-TCA binding mole ratios of the HA-TCA conjugates prepared by adjusting the feed mole ratios of activated HA and activated TCA to 1:10, 1:50 and 1:100. shows When the HA and TCA addition molar ratios (HA:TCA) were increased to 1:10, 1:50, and 1:100, it was confirmed that the binding molar ratios of HA and TCA gradually increased to 8.6, 9.6, and 13.3, respectively. As a result of the above experiment, the HA-TCA binding molar ratio of the HA-TCA conjugate did not differ significantly compared to the increase in the addition molar ratio, so the HA-TCA conjugate (binding molar ratio HA:TCA = 1:8.6) was selected and used for the coating of the AM/PS composite.

<Hep-TCA의 제조><Production of Hep-TCA>

HA 대신 Hep를 사용한 것을 제외하고는 상기 <HA-TCA의 제조> 항과 동일한 방법으로 Hep-TCA 를 수득하였다. TCA의 아미노화는 TCA와 HA 또는 Hep 사이의 안정한 아미드 결합을 형성하는데 도움을 주었다. Hep-TCA was obtained in the same manner as in <Preparation of HA-TCA>, except that Hep was used instead of HA. Amination of TCA helped to form a stable amide bond between TCA and HA or Hep.

Hep 또는 HA에 결합된 TCA 분자의 수를 정량화하기 위하여 황산 분석을 실시하였다. 이후 실험은 Hep 또는 HA 와 TCA가 1:5의 컨쥬게이션 비율을 갖는 HA-TCA 또는 Hep-TCA으로 수행하였다. 게다가 이들의 제타 전위는 음전하를 나타냈다.Sulfuric acid analysis was performed to quantify the number of TCA molecules bound to Hep or HA. Subsequent experiments were performed with Hep or HA and TCA with HA-TCA or Hep-TCA having a conjugation ratio of 1:5. Moreover, their zeta potential showed a negative charge.

실시예 6. m-Protamine 및 m-HA의 제조Example 6. Preparation of m-Protamine and m-HA

<m-Protamine의 제조> <Preparation of m-Protamine>

4 mL의 탄산나트륨 완충액 (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 10 mg의 PS을 40 mL의 DMSO에 녹인 4 mg N-acryloxysuccinimide과 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 용 액을 멸균증류수에 대해 투석했다. m-Proamine의 농도는 Bradford 분석법 (Thermo Scientific)에 의해 결정하였다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼으로부터 얻은 PS 및 m-PS의 분자량은 각각 4225.62 Da 및 4391.54 Da이다. 변형 정도는 단백질 당 3개의 acrylamide groups으로 계산되었다. 10 mg of PS in 4 mL of sodium carbonate buffer (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5) was reacted with 4 mg N-acryloxysuccinimide dissolved in 40 mL of DMSO at room temperature for 2 hours. The reaction solution was dialyzed against sterile distilled water. The concentration of m-Proamine was determined by Bradford assay (Thermo Scientific). The molecular weights of PS and m-PS obtained from the MALDI-TOF mass spectrum were 4225.62 Da and 4391.54 Da, respectively. The degree of modification was calculated as 3 acrylamide groups per protein.

<m-HA의 제조><Preparation of m-HA>

1 g의 HA을 4℃의 탈이온수 50 mL에 녹인 후 methacrylic anhydride (MA) 20.8 mL를 첨가했다. 4℃에서 24시간 동안 계속 교반하면서 5M NaOH을 첨가하여 반응용액을 pH 8-9로 조정하였다. 이어서, 중합체를 아세톤에서 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 멸균증류수에 재용해시켰다. 탈 이온수에 대해 48 시간 동안 투 석 한 후, m-HA를 동결 건조에 의해 87.5 %의 수율로 수득하고 1H NMR (Varian Gemini 2300)을 특징으로 하였다. After dissolving 1 g of HA in 50 mL of deionized water at 4°C, 20.8 mL of methacrylic anhydride (MA) was added. The reaction solution was adjusted to pH 8-9 by adding 5M NaOH while stirring was continued at 4°C for 24 hours. The polymer was then precipitated in acetone, washed with ethanol, and redissolved in sterile distilled water. After dialysis against deionized water for 48 h, m-HA was obtained in a yield of 87.5% by lyophilization and characterized by 1H NMR (Varian Gemini 2300).

변형 정도는 5.74 및 6.17 ppm (methacrylate protons)에서 양성자 피크 하 면적의 비율을 1.99 ppm (HA의 N-acetyl glucosamine)에서의 피크의 비와 비교하여 약 15%로 결정하였다. The degree of modification was determined to be about 15% by comparing the ratio of the area under the proton peak at 5.74 and 6.17 ppm (methacrylate protons) to the ratio of the peak at 1.99 ppm (N-acetyl glucosamine of HA).

실시예 7. 기본입자(10)의 제조Example 7. Preparation of basic particles (10)

본 발명에서 제조한 약학적 유효성분으로 하는 AM(SAM)은 ApTNF-α(ⅰ), ApIL-10(ⅱ), ApIL-17(ⅲ), 이중 Ap4-1BB-ApEpCAM 키메라(ⅳ), 이중 Ap4-1BB-ApVEGF(ⅴ) 또는 ApOPN(ⅵ) 키메라, ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅶ), ApEpCAM-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅷ), ApHER2-PolyGem(ⅸ), ApGemHER2-S-S-DM1(A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(C), ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(D), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM(E), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEp CAM-S-S-DM1(F), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) 및 ApGemHE R2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)이며 이에 제한되는 것은 아니다.AM (SAM) as a pharmaceutically active ingredient prepared in the present invention is ApTNF-α (i), ApIL-10 (ii), ApIL-17 (iii), dual Ap4-1BB-ApEpCAM chimera (iv), dual Ap4 -1BB-ApVEGF (v) or ApOPN (vi) chimera, ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (vii), ApEpCAM-survivin siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (viii), ApHER2-PolyGem (vi), ApGemHER2- S-S-DM1(A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-DM1(C), ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-S-S-DM1(D), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM( E), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEp CAM-S-S-DM1 (F), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX (G), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM -S-S-MMAE(H) and ApGemHE R2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I).

상기 AM와 양이온성 분자를 혼합하여 자기조립으로 제조되는 입자를 “기본 입자(10)”라고 지칭하였다.The particles prepared by self-assembly by mixing the AM and cationic molecules were referred to as “basic particles 10”.

상기 제조한 AM은 n개의 뉴클레오타이드을 포함하고 있어 분자당 n-1개의 음 전하이고 또는 1 몰당 1.8 × 1025 음전하이다. 상기 PS 분자량이 5.8 kDa이고 염기 성 아미노산, 특히 아르기닌 (70~80 %)이 풍부하여 몰당 양이온이 1.26 × 1025이다. PS는 AM 인산염 그룹의 음전하를 중성화시킨다. 상기 AM와 PS의 전하 비율(charge ratio)이 1:0.4 이상으로 하는 AM/PS 기본입자를 제조하였다.The prepared AM contains n nucleotides, and thus n-1 negative charges per molecule or 1.8 × 10 25 negative charges per mole. The PS has a molecular weight of 5.8 kDa and is rich in basic amino acids, particularly arginine (70-80%), so that the cation per mole is 1.26 × 10 25 . PS neutralizes the negative charge of the AM phosphate group. AM/PS elementary particles were prepared in which the AM and PS charge ratio was 1:0.4 or more.

<AM/PS 기본입자><AM/PS basic particle>

상기 제조한 압타머 약물(AM), 프로타민(PS) 및 인간혈청알부민(HSA) 용액을 각각 증류수(DW)에서 2.5 mg/ml의 농도로 제조하였다. The prepared aptamer drug (AM), protamine (PS) and human serum albumin (HSA) solutions were each prepared in distilled water (DW) at a concentration of 2.5 mg/ml.

다른 실시예로, 상기 제조한 AM, PS 및, HSA 등장 용액을 등장 NaCl 용액(NaCl 140 mM), PBS 완충액 (NaCl 136.9 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.47 mM; pH 7.4) 또는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 세포 배지(CM)에 2.5 mg/㎖의 농도로 각각 준비하였다. In another embodiment, the prepared AM, PS and HSA isotonic solutions were mixed with isotonic NaCl solution (NaCl 140 mM), PBS buffer (NaCl 136.9 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.47 mM; pH 7.4) or phenol Each was prepared at a concentration of 2.5 mg/ml in RPMI 1640 cell medium (CM) without red.

0∼2000 ㎍의 HSA를 15∼150 ㎍의 PS에 첨가한 다음 5초 동안 혼합하였다. 그 후, 상기 제조한 30 ㎍ AM를 증류수에서 1ml의 최종 용적에 도달시켜 첨가하고, 5초 동안 볼텍싱하여 입자를 제조하였다.0-2000 μg of HSA was added to 15-150 μg of PS and then mixed for 5 seconds. Then, 30 μg AM prepared above was added to reach a final volume of 1 ml in distilled water, and vortexed for 5 seconds to prepare particles.

0∼2000 ㎍의 HSA를 15∼150 ㎍의 PS에 첨가하고 혼합하였다. 이후 상기 제조한 30 ㎍ AM 용액을 NaCl 용액, PBS 완충액 또는 CM에 중 1ml의 최종 부피에 첨가하고, 다시 혼합물을 5초 동안 와동하여 입자를 제조하였다.0-2000 μg of HSA was added to 15-150 μg of PS and mixed. Then, the 30 μg AM solution prepared above was added to a final volume of 1 ml in NaCl solution, PBS buffer or CM, and the mixture was vortexed again for 5 seconds to prepare particles.

여기에서 AM은 상기 여러 종류에서 선택되어진 어느 한 종류이거나 복수의 종류가 혼합물될 수도 있다.Here, AM may be any one type selected from the above various types, or a plurality of types may be mixed.

<AM/PS-TCA 기본입자><AM/PS-TCA elementary particle>

상기 제조된 PS-TCA를 증류수 또는 상기 등장액에 2.5 mg/mL로 용해시켜 스톡 용액(stock solution)을 제조하였다. The prepared PS-TCA was dissolved in distilled water or the isotonic solution at 2.5 mg/mL to prepare a stock solution.

0∼2000 ㎍의 HSA를 15∼150 ㎍의 PS-TCA에 첨가한 다음 5초 동안 혼합하였다. 그 후, 상기 제조한 30 ㎍ AM를 증류수에서 1ml의 최종 용적에 도달시켜 첨가하고, 5초 동안 볼텍싱하였다. 여기에서 AM은 상기 여러 종류에서 선택되어진 어느 한 종류이거나 복수의 종류가 혼합물될 수도 있다.0-2000 μg of HSA was added to 15-150 μg of PS-TCA and mixed for 5 seconds. Then, 30 μg AM prepared above was added to reach a final volume of 1 ml in distilled water, and vortexed for 5 seconds. Here, AM may be any one type selected from the above various types, or a plurality of types may be mixed.

그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간동안 방치하고 2일 동안 동결건조하여 제조한 AM/PS-TCA 입자를 수득하였다.Then, the reaction product was left at room temperature for 1 hour and freeze-dried for 2 days to obtain AM/PS-TCA particles prepared.

<AM/CS 또는 AM/CS-TCA 기본입자><AM/CS or AM/CS-TCA basic particle>

상기 CS 또는 상기 제조한 CS-TCA를 증류수 또는 상기 등장액에 2.5 mg/mL로 용해시켜 스톡 용액(stock solution)으로 사용하였다. The CS or the prepared CS-TCA was dissolved in distilled water or the isotonic solution at 2.5 mg/mL and used as a stock solution.

0∼2000 ㎍의 HSA를 15∼150 ㎍의 CS 또는 CS-TCA에 첨가한 다 음 5초 동안 혼합하였다. 그 후, 상기 제조한 30 ㎍ AM를 멸균증류수에서 1ml의 최종 용적에 도달시켜 첨가하고, 5초 동안 볼텍싱하였다. 여기에서 AM은 상기 여러 종류에서 선택되어진 어느 한 종류이거나 복수의 종류가 혼합물될 수도 있다.0-2000 μg of HSA was added to 15-150 μg of CS or CS-TCA and mixed for 5 seconds. Then, 30 μg AM prepared above was added to reach a final volume of 1 ml in sterile distilled water, and vortexed for 5 seconds. Here, AM may be any one type selected from the above various types, or a plurality of types may be mixed.

그런 다음, 반응물을 상온에서 1시간동안 방치하고 2일 동안 동결건조하여 제조한 AM/CS 또는 AM/CS-TCA 입자를 수득하였다.Then, the reaction product was left at room temperature for 1 hour and then lyophilized for 2 days to prepare AM/CS or AM/CS-TCA particles were obtained.

실시 예 8. 기본입자(10)의 분석Example 8. Analysis of the elementary particles (10)

<AM/PS 입자><AM/PS Particles>

실시예 7항에서 제조된 입자 크기는 Malvern Zetasizer 3000 HSA(Herrenberg, Germa ny)로 광자 상관 분광법(Photon correlation spectroscopy, PCS)으로 결정하였다. 입자 크기는 평균 유체 역학적 직경(mean hydrodynamic diameter, dh)으로 표현하였고, 크기 분포의 폭은 다분산 지수(polydispersity index, PDI)로 표현하였다. 입자의 크기 분포 계산을 위한 소프트웨어 데이터 분석은 비음수 제한 최소 제곱의 피팅 방법(Fitting method of non-negative constrained least-squares, NNLS)을 기반으로 하였다. 측정은 구성성분을 첨가한 혼합물의 배양 1시간 후 수행하였다.The particle size prepared in Example 7 was determined by photon correlation spectroscopy (PCS) using a Malvern Zetasizer 3000 HSA (Herrenberg, Germany). The particle size was expressed as a mean hydrodynamic diameter (dh), and the width of the size distribution was expressed as a polydispersity index (PDI). Software data analysis for particle size distribution calculation was based on the Fitting method of non-negative constrained least-squares (NNLS). Measurement was performed after 1 hour of incubation of the mixture to which the components were added.

상기 제조된 입자를 TEM (JEM-2000FX, 히타치)으로 관찰하였다.The prepared particles were observed by TEM (JEM-2000FX, Hitachi).

본 발명의 연구결과에 따르면, 본 발명의 압타머기반 입자는 상기 ApTNF-α 와 PS(Protamine) (㎍/mL)의 중량비는 30:15~150, 바람직하게는 30:15~90, 더욱 바람직하게는 30:75 조건으로 증류수(DW)에서 이상적인 압타머 약물 전달체의 성질을 보유하였다.According to the study results of the present invention, in the aptamer-based particles of the present invention, the weight ratio of ApTNF-α and PS (Protamine) (㎍/mL) is 30:15 to 150, preferably 30:15 to 90, more preferably Ideally, the properties of an aptamer drug carrier were retained in distilled water (DW) under the condition of 30:75.

PS를 HSA 용액에 첨가하며 양이온성 PS와 HSA 사이의 상호작용이 일어났으며 PS와 AM의 혼합물도 자발적으로 입자를 형성한다. When PS was added to the HSA solution, an interaction between cationic PS and HSA occurred, and the mixture of PS and AM spontaneously formed particles.

Malvern Zetasizer 3000 HSA (Herrenberg, Germany)로 측정한 PCS(Photon correlation spectroscopy) 결과, HSA/PS와 HSA/AM 혼합물은 모두 약 13nm 크기의 작은 복합체를 형성한다. As a result of PCS (Photon correlation spectroscopy) measured with a Malvern Zetasizer 3000 HSA (Herrenberg, Germany), both HSA/PS and HSA/AM mixtures form small complexes with a size of about 13 nm.

첫 단계에서 HSA와 PS의 초기 복합체가 형성되었고 강한 음으로 하전된 ApTNF-α를 첨가하면 자기 조립으로 ApTNF-α/PS/HSA 입자를 형성하였다. In the first step, an initial complex of HSA and PS was formed, and when strongly negatively charged ApTNF-α was added, ApTNF-α/PS/HSA particles were formed by self-assembly.

본 발명에서 HSA 및 PS로 구성된 수용액에 AM를 첨가하여 입자를 제조하였으며, 이를 “AM/PS/HSA 입자-DW”이라고 지칭하였다.In the present invention, particles were prepared by adding AM to an aqueous solution composed of HSA and PS, and this was referred to as “AM/PS/HSA particles-DW”.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

* HSA가 입자 크기에 미치는 영향 * Effect of HSA on particle size

상기 제조된 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 소량의 HSA이 있는 경우 작은 입자를 형성하나 HSA가 증가함에 따라 입자는 큰 구조로 응집되었다(도 7). The prepared ApTNF-α/PS/HSA particle-DW forms small particles in the presence of a small amount of HSA, but as the HSA increases, the particles aggregate into a large structure (FIG. 7).

ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 30 ㎍ ApTNF-α, 90 ㎍ PS에 100∼500 ㎍의 HSA를 1ml의 증류수에 첨가한 후 혼합하면 dh는 PDI가 ≤ 0.1인 250∼280 nm의 범위이었다. ApTNF-α/PS/H SA 입자-DW는 1000∼2000 ㎍의 HSA를 증가시키면 dh가 커지고 PDI가 0.2 이상이 된다. 이러한 결과는 고농도의 HSA가 DW에서의 제조 과정에 부정적인 영향을 미치므로 덜 안정한 입자를 형성한 것이다(도 7).ApTNF-α/PS/HSA particle-DW is 30 μg ApTNF-α, 90 μg PS, 100-500 μg HSA added to 1 ml distilled water and mixed, dh is in the range of 250-280 nm with PDI ≤ 0.1 It was. In the case of ApTNF-α/PS/HSA particle-DW, when HSA of 1000-2000 μg is increased, dh increases and PDI becomes 0.2 or more. These results indicate that the high concentration of HSA negatively affects the manufacturing process in DW, thus forming less stable particles (FIG. 7).

상기 제조된 ApTNF-α/PS/HSA 입자는 등장액에서 소량의 HSP이 있는 경우 큰 입자이나 또는 HSP가 증가함 에 따라 작은 입자를 형성한다(도 7). The prepared ApTNF-α/PS/HSA particles form large particles when there is a small amount of HSP in isotonic solution or small particles as HSP increases ( FIG. 7 ).

상기 제조한 ApTNF-α/PS/HSA 입자는 등장성 NaCl 용액(NaCl 14 0 mM), 등장성 PBS 완충액(NaCl 136.9 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 8. 1 mM, KH2PO4 1.47 mM; pH 7.4) 및 CM에서 큰 입자로 응집된다(도 7 ). dh는 PCS 측정에 의해 결정된 0.4 보다 큰 PDI로 나타낸 넓은 크기 분포로 1mm보다 큰 것으로 밝혀졌다.The prepared ApTNF-α/PS/HSA particles were prepared in isotonic NaCl solution (NaCl 14 0 mM), isotonic PBS buffer (NaCl 136.9 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 8. 1 mM, KH2PO4 1.47 mM; pH 7.4) and Aggregates into large particles in the CM (Fig. 7). dh was found to be greater than 1 mm with a broad size distribution represented by a PDI greater than 0.4 as determined by PCS measurements.

1 ml 등장액에서 30 ㎍ AM 및 90 ㎍ PS을 갖는 ApTNF-α/PS/HS A 입자에 첨가된 HSA의 증가는 안정성을 개선시켰다. 이 입자의 dh는 사용된 등장 용액에 따라 1∼2 mm에서 250∼400 nm로 감소한다(도 7 ). Increasing HSA added to ApTNF-α/PS/HS A particles with 30 μg AM and 90 μg PS in 1 ml isotonic solution improved stability. The dh of these particles decreases from 1-2 mm to 250-400 nm depending on the isotonic solution used (Figure 7).

페놀 레드가 없는 세포 배지 RPMI 1640 등장액(CM)에서 dh = 245 nm 및 PDI ≤ 0.15를 갖는 입자를 형성한다. 이를 “AM/PS/HSA 입자-CM”이라고 지칭하였다. Form particles with dh = 245 nm and PDI ≤ 0.15 in cell medium RPMI 1640 isotonic (CM) without phenol red. This was referred to as “AM/PS/HSA particle-CM”.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

PS가 입자 크기에 미치는 영향Effect of PS on particle size

HSP의 최적화 농도는 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW에서 100 ㎍/ml이고 ApTNF- α/PS/HSA 입자-CM에서 1000 ㎍/ml이며 PS의 영향은 15∼150 ㎍ 범위에서 평가하였다. ApTNF-α/PS/HSA 입자의 dh와 PDI는 PCS 측정으로 결정되었다.The optimized concentration of HSP was 100 μg/ml in ApTNF-α/PS/HSA particle-DW and 1000 μg/ml in ApTNF-α/PS/HSA particle-CM, and the effect of PS was evaluated in the range of 15 to 150 μg. The dh and PDI of ApTNF-α/PS/HSA particles were determined by PCS measurement.

상기 제조한 AM에 선택된 ApTNF-α를 사용하여 제조한 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 낮은 PS 농도에서 매우 작은 입자이지만 큰 분포가 관찰되었다(ApTNF-α:PS=30:15). 약 30:45 질량비의 ApTNF-α:PS (㎍/ml) 비율에서 PS 농도를 증가시킴으로써 입자 응집이 관찰되었다. 작은 크기 분포를 갖는 가장 유리하고 안정된 준비는 30:60 질량비보다 높은 ApTNF-α:PS (㎍/ml) 비율로 제조할 수 있다(도 8). ApTNF-α/PS/HSA particle-DW prepared using ApTNF-α selected for the AM prepared above was very small particles at a low PS concentration, but a large distribution was observed (ApTNF-α:PS=30:15). Particle aggregation was observed by increasing the PS concentration at an ApTNF-α:PS (μg/ml) ratio of about 30:45 mass ratio. The most advantageous and stable preparation with a small size distribution can be prepared with an ApTNF-α:PS (μg/ml) ratio higher than 30:60 mass ratio (Fig. 8).

반면, AM/PS/HSA 입자-CM는 낮은 PS 농도에서 큰 크기 분포(PDI ≤0.2) 및 약 650nm의 dh를 나타내었다. 더 높은 PS 농도와 약 30:60 질량비의 AM:PS 비율에 서, AM/PS/HSA 입자-CM 시료는 AM/PS/HSA 입자-DW 시료와 비교 가능한 dh 및 크기 분포 데이터를 나타내었다.On the other hand, AM/PS/HSA particle-CM showed a large size distribution (PDI ≤ 0.2) and a dh of about 650 nm at low PS concentration. At a higher PS concentration and an AM:PS ratio of about 30:60 mass ratio, the AM/PS/HSA particle-CM sample showed comparable dh and size distribution data to the AM/PS/HSA particle-DW sample.

PS 농도가 입자 크기에 미치는 영향을 연구한 결과, 안정한 작은 monomodal size 분포를 갖는 AM/PS/HSA 입자를 제조하기 위해서는 60 ㎍/ml의 최소 PS 농도를 나타내는 30:60 질량비의 최소 AM:PS 비가 이상적이다.As a result of studying the effect of PS concentration on particle size, in order to prepare AM/PS/HSA particles having a stable small monomodal size distribution, a minimum AM:PS ratio of 30:60 mass ratio showing a minimum PS concentration of 60 μg/ml Ideal.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

표면 전하surface charge

표면 전하(zetapotential)는 콜로이드의 안정성과 ApTNF-α/PS/HSA 입자의 세포 흡수에 중요한 요소이다. 본 발명에서 HSA 및 PS의 양에 따른 일정한 ApTNF-α 농도에서 형성되는 표면 전하에 대한 영향을 조사하였다(도 9). Surface charge (zetapotential) is an important factor for colloidal stability and cellular uptake of ApTNF-α/PS/HSA particles. In the present invention, the effect of the amount of HSA and PS on the surface charge formed at a constant ApTNF-α concentration was investigated (FIG. 9).

HSA가 없는 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 45 ㎍/ml 이상의 PS 농도에서 양성 표면 전하를 보였다. ApTNF-α/PS/HSA particle-DW without HSA showed a positive surface charge at a PS concentration of 45 μg/ml or higher.

HSA를 포함한 ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 양성 표면 전하를 유도하기 위해서는 60 ㎍/ml 이상의 PS 농도가 필요했다. ApTNF-α/PS/HSA particle-DW containing HSA required a PS concentration of 60 μg/ml or higher to induce a positive surface charge.

높은 HSA 농도 (1000 ㎍/ml)로 준비된 ApTNF-α/PS/HSA 입자-CM에서 PS 농도 에 대해 약간 음의 표면 전하(225~212 mV)를 나타냈다. ApTNF-α/PS/HSA particles-CM prepared with high HSA concentration (1000 μg/ml) showed slightly negative surface charge (225-212 mV) with respect to PS concentration.

또한, ApTNF-α 백본 변형이 표면 전하에 미치는 영향은 무시할 수 있는 것으로 나타났다. 포스포로티오에이트 ApTNF-α를 갖는 입자는 ApTNF-α과 비교하여 유사한 제타 포텐셜 프로파일을 나타냈다. 이러한 관찰은 비변형 및 포스포로티오에이트 변형 ApTNF-α가 음으로 하전된 핵산 기능의 수의 관점에서 동일하기 때문으로 예상되었다.In addition, the effect of the ApTNF-α backbone modification on the surface charge was shown to be negligible. Particles with phosphorothioate ApTNF-α showed a similar zeta potential profile compared to ApTNF-α. This observation was expected because unmodified and phosphorothioate modified ApTNF-α are identical in terms of number of negatively charged nucleic acid functions.

흥미로운 점은 낮은 HSA 농도 (100 ㎍/ml)로 준비된 ApTNF-α/PS/HSA 입자는 제타 포텐셜 프로파일에서 관찰된 전하 중화에 가까운 물에서 입자 응집을 나타냈다는 것이다(도 9). Interestingly, ApTNF-α/PS/HSA particles prepared with a low HSA concentration (100 μg/ml) exhibited particle aggregation in water close to the charge neutralization observed in the zeta potential profile ( FIG. 9 ).

따라서, 안정성이 높은 대전 입자를 제조하는 것이 바람직할 것으로 보인다. AM/PS/HSA 입자-CM은 PS 농도와 무관하게 음전하를 띠기 때문에 향후 연구에서 유리한 것으로 보인다.Therefore, it seems desirable to prepare charged particles with high stability. AM/PS/HSA particle-CM seems to be advantageous in future studies because it is negatively charged regardless of PS concentration.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

분자 구성molecular composition

상기 제조된 입자의 화학적 조성에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해, ApTNF-α 함량은 PS 농도에 따라 HPLC에 의해 결정되었다. PS 및 HSA 함량은 TRITC 로 분자를 표지한 후 형광 분광법으로 측정하였다. To obtain more detailed information on the chemical composition of the prepared particles, the ApTNF-α content was determined by HPLC according to the PS concentration. PS and HSA content was measured by fluorescence spectroscopy after labeling the molecule with TRITC.

ApTNF-α/PS/HSA 입자-DW는 30 ㎍/ml ApTNF-α, 10.0 ㎍/ml HSA 및 다양한 양의 PS로 제조하였다. ApTNF-α/PS/HSA particle-DW was prepared with 30 μg/ml ApTNF-α, 10.0 μg/ml HSA and various amounts of PS.

도 10에 나타낸 바와 같이, 45 ㎍/ml보다 높은 PS 농도에서, 상기 제조한 AM에 선택 된 ApTNF-α의 총 함량은 입자에 결합되었다. 또한, 포획된 PS의 함량은 조립 혼합물에서 PS이 많을수록 증가하였다. HSA는 낮은 정도로 포획되었다(≤7%).As shown in FIG. 10 , at a PS concentration higher than 45 μg/ml, the total content of ApTNF-α selected in the AM prepared above was bound to the particles. In addition, the content of captured PS increased with more PS in the assembly mixture. HSA was captured to a low degree (≤7%).

또한, AM/PS/HSA 입자 -CM의 조성을 결정하였고, AM과 PS의 유사한 양이 입자 매트릭스에서 발견되었다. 약 ≤10 ㎍/ml의 HSA에 대해, AM/PS/HSA 입자-CM는 AM /PS/HSA 입자-DW 제조의 동일한 범위에 있는 큰 입자 분포가 이들 입자에 포획되었음을 보여주었다.In addition, the composition of AM/PS/HSA particles-CM was determined, and similar amounts of AM and PS were found in the particle matrix. For HSA of about <10 μg/ml, the AM/PS/HSA particle-CM showed that a large particle distribution in the same range of the AM/PS/HSA particle-DW preparation was captured by these particles.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

봉합 및 방출suture and release

ApTNF-α/PS 입자-DW의 제조는 양전하의 PS와 음전하의 ApTNF-α을 혼합하여 정전기적 상호작용에 따라 입자 형태를 형성한다. 형성된 ApTNF-α/PS 입자는 안정화를 위해 30분간 상온에서 배양하였다. PS와 ApTNF-α의 혼합을 위한 용매는 ApTNF-α의 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 RNase-free 용매를 사용하였다. In the preparation of ApTNF-α/PS particle-DW, positively charged PS and negatively charged ApTNF-α are mixed to form particles according to electrostatic interaction. The formed ApTNF-α/PS particles were incubated at room temperature for 30 minutes for stabilization. As a solvent for mixing PS and ApTNF-α, a DEPC-treated RNase-free solvent was used to prevent degradation of ApTNF-α.

ApTNF-α과 PS의 결합확 인은 1% agarose gel에서 전기영동을 수행하여 측정하였다. ApTNF-α은 0.5 μg/ml의 Etbr(ethidium bromide)을 이용해 염색하였으며, 1x TBE buffer를 이용해 80Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행하였다.The binding of ApTNF-α to PS was measured by electrophoresis on 1% agarose gel. ApTNF-α was stained with 0.5 μg/ml Etbr (ethidium bromide), and electrophoresis was performed for 20 minutes using 1x TBE buffer under 80 Volt conditions.

도 11은 PS가 상기 제조한 AM에 선택된 ApTNF-α을 봉입한 결과를 보여준다. PS의 ApTNF-α 봉입 결과를 확인하기 위하여 ApTNF-α과 PS의 질량비에 따라 제조된 ApTNF-α/PS 입자의 전기영동상 밴드의 이동정도를 확인하였다. 11 shows the results of PS encapsulating the selected ApTNF-α in the AM prepared above. In order to confirm the ApTNF-α encapsulation result of PS, the degree of movement of the band in the electrophoresis image of ApTNF-α/PS particles prepared according to the mass ratio of ApTNF-α and PS was confirmed.

ApTNF-α을 흡착하는데 필요한 ApTNF-α/PS (㎍/ml) 비율은 30:15, 30:30, 30:60, 3 0:75, 30:90 및 30:150로 ApTNF-α를 PS와 혼합한 후 원심 분리하여 조사하였다. ApTNF-α/PS (μg/ml) ratios required to adsorb ApTNF-α were 30:15, 30:30, 30:60, 3 0:75, 30:90 and 30:150. After mixing, centrifugation was performed to investigate.

상등액을 HPLC로 분석하여 결합 ApTNF-α은 첨가된 ApTNF-α의 양과 상등액의 ApTNF-α 함량 사이의 차이로 계산하였다. ApTNF-α/PS (㎍/ml) 비율 30:15 질량비에서 82% 미결합 ApTNF-α이 발견되었다. 30:30의 질량비에서 40% ApTNF-α가 용액에 남아 있었다. 30:75, 30:90 및 30:150 질량비에서는 ApTNF-α은 정량적으로 입자 형태로 존재한다.The supernatant was analyzed by HPLC, and the bound ApTNF-α was calculated as the difference between the amount of ApTNF-α added and the content of ApTNF-α in the supernatant. 82% unbound ApTNF-α was found at a 30:15 mass ratio of ApTNF-α/PS (μg/ml). At a mass ratio of 30:30, 40% ApTNF-α remained in solution. In the 30:75, 30:90 and 30:150 mass ratios, ApTNF-α is quantitatively present in the form of particles.

이는 양전하를 띠는 PS의 영향으로 PS의 첨가량이 증가할수록 ApTNF-α와 강하게 반응하여 더욱 안정한 입자 형태를 형성한 것으로 판단할 수 있다.It can be judged that, under the influence of positively charged PS, as the amount of PS added increased, it reacted strongly with ApTNF-α to form a more stable particle form.

입자의 안정성과 ApTNF-α의 방출은 PBS에서 37℃에서 조사되었다. 24 시간 후, ApTNF-α/PS 비율 30:90 및 30:150 조건에서 ApTNF-α 방출이 발생하지 않았다. 30:75 조건에서 ApTNF-α의 작은 방출을 보였으며 8.0 %의 미결합 ApTNF-α이 발견되었다. ApTNF-α/PS (㎍/ml) 비율 30:30 및 30:15 질량비에서 63.0 (30:30) 및 90.0 % (30:15) ApTNF-α이 용액에서 발견되었다.The stability of the particles and the release of ApTNF-α were investigated in PBS at 37°C. After 24 hours, ApTNF-α release did not occur in the conditions of ApTNF-α/PS ratios of 30:90 and 30:150. The 30:75 condition showed a small release of ApTNF-α, and 8.0% of unbound ApTNF-α was found. 63.0 (30:30) and 90.0% (30:15) ApTNF-α were found in solution at 30:30 and 30:15 mass ratios of ApTNF-α/PS (μg/ml) ratios.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

<AM/PS-TCA 입자> <AM/PS-TCA Particles>

형태학적 분석 및 표면전하Morphological analysis and surface charge

TEM 및 Malvern Zetasizer 3000 HSA (Herrenberg, Germany)로 측정한 PCS(Photon correlation spectroscopy)를 이용하여 상기 ApTNF-α/PS-TCA 입자의 형태 및 입자 크기 분포를 관찰하였다. 상기 입자의 크기는 평균 150 nm 정도이고, 상대적으로 균일한 크기의 분포를 나타내었다. The shape and particle size distribution of the ApTNF-α/PS-TCA particles were observed using TEM and PCS (Photon correlation spectroscopy) measured with a Malvern Zetasizer 3000 HSA (Herrenberg, Germany). The size of the particles was about 150 nm on average, and showed a relatively uniform size distribution.

제타전위 분석기(Zeta analyzer)를 이용하여 상기에서 제조된 입자의 제타전위를 측정한 결과, 양성의 제타 전위를 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 ApTNF-α이 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 입자의 세포 내로의 유입을 용이하게 한다. 또한, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집 현상을 감소시킨다.As a result of measuring the zeta potential of the particles prepared above using a zeta potential analyzer, a positive zeta potential was obtained. This positive surface charge means that the negatively charged ApTNF-α is completely surrounded inside the complex, and the positive surface charge facilitates the influx of particles into the cell. In addition, by generating an electrostatic repulsive force between the particles, the aggregation phenomenon between the particles is reduced.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다. These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

체외, 혈청 및 pH에 따른 안정성Stability in vitro, serum and pH

상기 제조된 입자의 안정성을 확인하기 위하여 Gel retardation 분석을 실시하였다. Gel retardation 실험은 1% agaros 겔과 1x TBE buffer 용액을 사용하여 수행되었다. 본 발명의 입자에 봉입된 ApTNF-α은 0.5 ㎍/mL EtBr로 염색되어져 겔상에 나타났다. 상기 실험은 100V에서 30분동안 진행되었다. Gel retardation analysis was performed to confirm the stability of the prepared particles. Gel retardation experiments were performed using 1% agaros gel and 1x TBE buffer solution. ApTNF-α encapsulated in the particles of the present invention appeared on a gel after staining with 0.5 μg/mL EtBr. The experiment was conducted at 100V for 30 minutes.

그 결과, 상기 ApTNF-α/PS-TCA 입자는 Ap TNF-α/PS-TCA (㎍/ml) 비율 30:15 이상의 질량비에서 이루어짐을 확인하였다. 특히, 상기 ApTNF-α/PS-TCA 입자 및 상기 ApTNF-α/CS-T CA 입자는 30:150의 질량비에서 이루어진 경우 ApTNF-α 응축으로 인한 지연 현상이 야기되어 ApTNF-α의 이동성이 완전히 지연되었다. As a result, it was confirmed that the ApTNF-α/PS-TCA particles were formed at a mass ratio of 30:15 or more in a ratio of Ap TNF-α/PS-TCA (μg/ml). In particular, when the ApTNF-α/PS-TCA particles and the ApTNF-α/CS-T CA particles were formed at a mass ratio of 30:150, a delay phenomenon due to ApTNF-α condensation was caused, so that the mobility of ApTNF-α was completely delayed. became

이로부터 상기 PS-TCA은 ApTNF-α을 효과적으로 응축시켜 상기 ApTNF-α/PS-TCA 입자가 형성되었음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 ApTNF-α/PS-TCA 입자는 ApTNF-α과 복합체를 형성함으로써 ApTNF-α 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.From this, it can be seen that the PS-TCA effectively condensed ApTNF-α to form the ApTNF-α/PS-TCA particles. Therefore, the ApTNF-α/PS-TCA particles according to the present invention can be usefully used as an ApTNF-α transporter by forming a complex with ApTNF-α.

상기에서 제조된 입자의 혈청 내 안정성을 확인하기 위하여 아래와 같이 실험을 실시하였다. ApTNF-α/PS-TCA 입자를 각각 20% 혈청 하에 37℃ 조건에서 48시간 동안 보관한 뒤, 0.5M 의 EDTA를 처리하였다. 그런 다음, ApTNF-α/PS-TCA 입자로부터 ApTNF-α을 분리하기 위해 1% SDS를 첨가하였다. 그 결과, free ApTNF-α과 비교하여 ApTNF-α/PS-TCA 입자에 봉입된 ApTNF-α은 48시간 동안 혈청으로부터 분 해되지 않았으며, 혈청 내에서 매우 안정함을 확인하였다.In order to confirm the stability in the serum of the particles prepared above, the experiment was carried out as follows. ApTNF-α/PS-TCA particles were stored for 48 hours at 37° C. under 20% serum, respectively, and then treated with 0.5M EDTA. Then, 1% SDS was added to separate ApTNF-α from ApTNF-α/PS-TCA particles. As a result, compared to free ApTNF-α, ApTNF-α encapsulated in ApTNF-α/PS-TCA particles was not decomposed from serum for 48 hours, and it was confirmed that it was very stable in serum.

다양한 pH 조건에서 본 발명의 입자의 안정성을 확인하였다. 즉, 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 1.2, pH 5.6 및 pH 7.4의 세가지 pH 용액에 ApTNF-α/PS-TCA 입자를 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 그 결과, ApTNF-α/PS-TCA 입자 모두 pH 1.2에서 24시간까지 안정함을 확인하였다.The stability of the particles of the present invention in various pH conditions was confirmed. That is, ApTNF-α/PS-TCA particles were placed in three pH solutions of pH 1.2, pH 5.6 and pH 7.4, similar to the pH conditions in the stomach, duodenum and ileum fragments of the GI tract, and the particle size was observed. As a result, it was confirmed that both ApTNF-α/PS-TCA particles were stable at pH 1.2 for 24 hours.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

생체 내(in vivo) 독성In vivo toxicity

4주령의 SD쥐(Sprague Dowley rats)를 나무로 된 케이지에 가두고 규칙적으로 음식과 물을 제공해주었다. ApTNF-α/PS-TCA 입자 100 μg를 각각 경구 및 정맥 투여하였다. 소정의 시간 간격으로 24시간 동안 실험동물의 혈액을 채취하여 일반 혈액 내용물을 분석하고 간 및 신장의 활성을 결정하는 생물학적 마커의 발현을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 ApTNF-α 전달 복합체를 매우 높은 농도로 투여하였을지라도 독성이 거의 나타나지 않았다. Four-week-old Sprague Dowley rats were housed in wooden cages and provided with food and water regularly. 100 μg of ApTNF-α/PS-TCA particles were administered orally and intravenously, respectively. Blood was collected from laboratory animals at predetermined time intervals for 24 hours, normal blood contents were analyzed, and expression of biological markers determining liver and kidney activity was evaluated. As a result, even when the ApTNF-α delivery complex of the present invention was administered at a very high concentration, almost no toxicity was observed.

투여 7일 후 동물들을 희생시키고, 회장과 간 단편의 면역 조직 검사를 실시하였다. 그 결과, 조직내 어떠한 염증도 관찰되지 않았으며, 독성 역시 거의 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 ApTNF-α 전달 복합체는 안전하고, 무독성이며, 치료에 사용 가능함을 알 수 있었다.After 7 days of administration, animals were sacrificed, and immunohistochemistry of ileum and liver fragments was performed. As a result, no inflammation was observed in the tissue and almost no toxicity was observed. Therefore, it was found that the ApTNF-α delivery complex of the present invention is safe, non-toxic, and can be used for treatment.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

실시예 9. 응용입자(20)의 제조Example 9. Preparation of applied particles 20

본 발명에서 제조한 약학적 유효성분으로 하는 AM은 ApTNF-α(ⅰ), ApIL-10(ⅱ), ApIL-17(ⅲ), 이중 Ap4-1BB-ApEpCAM 키메라( ⅳ), 이중 Ap4-1BB-ApVEGF(ⅴ) 또는 ApOPN(ⅵ) 키메라, ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅶ), ApEpCAM-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅷ), ApHER2-PolyGem(ⅸ), ApGemHER2-S-S-DM1(A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(C), ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(D), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM(E), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEp CAM-S-S-DM1(F), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G ), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAE(H) 및 ApGemHE R2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)이며 이에 제한되는 것은 아니다. AM prepared as a pharmaceutically active ingredient in the present invention is ApTNF-α (i), ApIL-10 (ii), ApIL-17 (iii), dual Ap4-1BB-ApEpCAM chimera (iv), dual Ap4-1BB- ApVEGF (v) or ApOPN (vi) chimera, ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (vii), ApEpCAM-survivin siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (viii), ApHER2-PolyGem (viii), ApGemHER2-S-S (A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1 (B), ApGemHER2-S-S-DNA box-S-S-DM1 (C), ApFdUEpCAM-S-S-DNA box-S-S-DM1 (D), ApGemHER2-S-S-ApFdUEpCAM (E), ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEp CAM-S-S-DM1(F), ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-PTX(G), ApGemHER2-S-S-DNA Box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S MMAE(H) and ApGemHE R2-S-S-DNA box-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I).

상기 기본입자와 음이온성 분자를 혼합하여 자기 조립으로 형성되는 입자를 “응용입자(20)”라고 지칭하였다.The particles formed by self-assembly by mixing the basic particles and anionic molecules were referred to as “application particles 20”.

<AM/PS/HA 입자><AM/PS/HA particles>

상기 제조된 AM/PS 입자를 다시 표면 개질을 위하여, 음이온성 분자인 히알루론산(Hyaluronic acid, HA, 83 kDa)을 멸균증류수에 1mg/mL 용해시켜 0.1% 스톡 용액(stock solution)으로 제조하였다. For surface modification of the AM/PS particles prepared above, 1 mg/mL of hyaluronic acid (Hyaluronic acid, HA, 83 kDa), an anionic molecule, was dissolved in sterile distilled water to prepare a 0.1% stock solution.

상기 AM:PS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조 동결건조한 AM/PS 입자를 멸균증류수에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% AM/PS 용액을 제조하였다. A 0.1% AM/PS solution was prepared by dissolving the lyophilized AM/PS particles prepared at a mass ratio of 30:75 in the AM:PS (μg/ml) ratio at 1mg/mL in sterile distilled water.

상기 제조한 0.1% AM/PS 용액과 0.1% HA 용액을 1:1, 1:2, 1:10, 1:20 또는 1:40 첨가몰비(feed mole rat io, nmol)로 섞어준 뒤 5분 정도 인큐베이팅하여 2일 동안 동결건조하여 AM/PS/HA 입자-DW를 수득하였다.After mixing the 0.1% AM/PS solution and 0.1% HA solution prepared above in 1:1, 1:2, 1:10, 1:20 or 1:40 addition molar ratio (feed mole rat io, nmol), 5 minutes AM/PS/HA particle-DW was obtained by lyophilization for 2 days after incubation.

상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(sonicator)와 압출기(extruder)를 사용할 수 있다.In order to control the size of the particles, a sonicator and an extruder may be appropriately used.

<AM/PS/HA-TCA 입자><AM/PS/HA-TCA particles>

상기 AM/PS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조, 동결한 AM/PS 입자-DW를 멸균증류수에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% AM/PS 용액을 제조하였다. A 0.1% AM/PS solution was prepared by dissolving the frozen AM/PS particles-DW in sterile distilled water at 1 mg/mL in the AM/PS (μg/ml) ratio of 30:75 mass ratio.

상기 HA-TCA 결합체는 HA와 TCA의 첨 가몰비가 1:10인 조건에서 제조된 HA-TCA 결합체를 멸균증류수 1mg/mL로 용해시켜 0.1% HA-TCA 수용액을 제조하였다The HA-TCA conjugate was prepared by dissolving the HA-TCA conjugate prepared under the condition that the addition molar ratio of HA and TCA was 1:10 with 1 mg/mL of sterile distilled water to prepare a 0.1% HA-TCA aqueous solution.

상기 0.1% AM/PS 입자 용액과 0.1% HA-TCA 수용액에 1 :1, 1:2, 1:10, 1:20 또는 1:40 첨가몰비로 gentle vortex 하에서 가 하고 상온에서 30분간 배양시킨 다음, 동결건조하여 AM/PS/HA-TCA 입자-DW를 수득하였다.Add to the 0.1% AM/PS particle solution and 0.1% HA-TCA aqueous solution in a molar ratio of 1:1, 1:2, 1:10, 1:20 or 1:40 under gentle vortex and incubate at room temperature for 30 minutes. , to obtain AM/PS/HA-TCA particles-DW by lyophilization.

상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(sonicator)와 압출기(extruder)를 사용할 수 있다.In order to control the size of the particles, a sonicator and an extruder may be appropriately used.

<AM/PS/Hep-TCA 입자><AM/PS/Hep-TCA Particles>

HA-TCA 대신에 Hep-TCA를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 AM/PS/Hep-TCA 입자-DW를 수득하였다. AM/PS/Hep-TCA particle-DW was obtained in the same manner as above except that Hep-TCA was used instead of HA-TCA.

상기 입자의 크기를 조절하기 위해 적절하게 초음파분석기(sonicator)와 압출기(extruder)를 사용할 수 있다.In order to control the size of the particles, a sonicator and an extruder may be appropriately used.

<AM/mPS/mHA 입자><AM/mPS/mHA particles>

상기 제조한 AM:mPS (㎍/ml) 비율이 30:75 질량비에서 제조 동결한 AM/mPS 복합체를 멸균증류수에 1 mg/mL로 용해시킨 0.1% AM/mPS 용액을 제조하였다. A 0.1% AM/mPS solution was prepared by dissolving the prepared AM/mPS complex at 1 mg/mL in sterile distilled water at a mass ratio of 30:75 and the prepared AM:mPS (μg/ml) ratio.

상기 제조한 mHA를 멸균증류수에 1mg/mL로 용해시켜 0.1% mHA 용액을 제조하였다. The prepared mHA was dissolved in sterile distilled water at 1 mg/mL to prepare a 0.1% mHA solution.

상기 0.1% AM/mPS 용액과 0.1% mHA (1 mg/mL) 용액을 1:1, 1:2, 1:10, 1:20 또는 1:40 첨가몰비로 gentle vortex 하에서 교반하면서 첨가한 후, glycerol dimethacrylate(GDA, 0.07 mg)를 첨가하였다. After adding the 0.1% AM/mPS solution and 0.1% mHA (1 mg/mL) solution in a molar ratio of 1:1, 1:2, 1:10, 1:20 or 1:40 while stirring under gentle vortex, Glycerol dimethacrylate (GDA, 0.07 mg) was added.

라디칼 중합은 Irgacure 2959 (0.1 %, w:v)에 의해 BlueWave 75 UV Curing Spot La 입자 (DYMAX)를 사용하여 60초 동안 약 20 mV/cm2 강도로 자외선을 노출 조건에서 광 개시하였다. Radical polymerization was photo-initiated by Irgacure 2959 (0.1%, w:v) using BlueWave 75 UV Curing Spot La particles (DYMAX) under exposure conditions to UV light at an intensity of about 20 mV/cm 2 for 60 seconds.

마지막으로, 생성된 AM/mPS/mHA 입자는 과도한 가교제 및 개시제를 제거하기 위해 원심 분리 필터 유닛(3 K MWCO) (Millipore)을 사용하여 핵산 분해 효소가 없는 물로 세척하여 얻어졌다. Finally, the resulting AM/mPS/mHA particles were obtained by washing with nuclease-free water using a centrifugal filter unit (3 K MWCO) (Millipore) to remove excess cross-linking agent and initiator.

AM/mPS에서 AM/mPS/mHA 입자 크기 및 제타 전위의 변화는 복합체의 효율 적인 HA 코팅 및 약 160nm의 최종 입자 직경을 갖는 AM/mPS/mHA 입자을 합성하였으며, -20 mV의 제타 전위를 갖는다. 투과 전자 현미경(TEM) 이미징은 약 150 nm의 균일한 입자 크기로 AM/mPS/mHA 입자의 회전 타원체 구조를 확인했다.Changes in AM/mPS/mHA particle size and zeta potential from AM/mPS synthesized AM/mPS/mHA particles with an efficient HA coating of the complex and a final particle diameter of about 160 nm, with a zeta potential of -20 mV. Transmission electron microscopy (TEM) imaging confirmed the spheroid structure of AM/mPS/mHA particles with a uniform particle size of about 150 nm.

실시예 10. 응용입자(20)의 평가Example 10. Evaluation of the applied particles (20)

<AM/PS/HA 응용입자 ><AM/PS/HA application particle>

형태학적 분석Morphological analysis

상기 AM/PS/HA 입자는 약학적 유효성분으로 하는 압타머 기반으로 구성되어 있어 온전한 구성 여부를 전기영동을 통해 분석하였다. Since the AM/PS/HA particles were composed of an aptamer-based pharmaceutical active ingredient, the complete composition was analyzed through electrophoresis.

도 12는 ApTNF-α/PS/HA 입자의 전기영동 분석 결과이다. 도 12를 참고하면, 1kb DNA ladder를 기준으로 ApTNF-α/ PS/HA 입자는 400 base pair(bp) 이상의 크기를 갖는 것으로 확인되었다. 일반적으로 사용되는 AM의 경우 대략 40~100bp를 가지는데 반하여 AM/PS/HA 입자의 경우, 다수의 40~100bp AM이 뭉쳐 있는 형태로 존재하기 때문에 약 20 배 정도 크기를 보인다.12 is an electrophoretic analysis result of ApTNF-α/PS/HA particles. Referring to Figure 12, based on the 1kb DNA ladder ApTNF-α / PS / HA particles were confirmed to have a size of 400 base pair (bp) or more. In the case of commonly used AM, it has approximately 40-100 bp, whereas in the case of AM/PS/HA particles, a plurality of 40-100 bp AMs exist in the form of agglomerates, so the size is about 20 times larger.

상기 제조된 ApTNF-α/PS/HA 입자의 사이즈 분포를 도 13에 나타내었다. 도 13을 참고하면, 상기 ApTNF-α/PS/HA 입자의 크기가 200nm 범위를 가짐을 확인할 수 있다. 이러한 상기 AM/PS/HA 입자는 코어로 제공된 ApTNF-α에 비해 크기가 대략 5μm에서 200nm로 25배 정도 감소되었다.The size distribution of the prepared ApTNF-α/PS/HA particles is shown in FIG. 13 . Referring to FIG. 13 , it can be confirmed that the size of the ApTNF-α/PS/HA particles has a range of 200 nm. These AM/PS/HA particles were reduced in size from approximately 5 μm to 200 nm by 25 times compared to ApTNF-α provided as a core.

도 14는 상기에서 제조된 ApTNF-α/PS/HA 입자를 촬영한 TEM 이미지이다. 도 14를 참고하면, 전반적으로 200 nm의 크기를 가지는 것으로 관찰되었으며, 그 이하의 크기도 존재하는 것으로 확인되었다. 14 is a TEM image of the ApTNF-α/PS/HA particles prepared above. Referring to FIG. 14 , it was observed that the overall size was 200 nm, and it was confirmed that a size smaller than that existed.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰 되었다.The above results were not limited to selected ApTNF-α, but were also generally observed in other AMs.

제타 포텐셜 측정Zeta Potential Measurement

표 3은 상기 ApTN F-α, 양이온성 분자만 코팅된 입자 및 제조된 ApTNF-α/PS/HA 입자의 제타 포텐셜을 측정한 것을 보여준다. Table 3 shows the measurements of the zeta potential of the ApTN F-α, particles coated with only cationic molecules, and the prepared ApTNF-α/PS/HA particles.

상기 ApTNF-α, 양이온성 분자만 코팅된 입자 및 제조된 ApTNF-α/PS/HA 입자의 제타 포텐셜 Zeta potential of the ApTNF-α, particles coated with only cationic molecules and the prepared ApTNF-α/PS/HA particles SampleSample Zeta potential (mV) Zeta potential (mV) ApTNF-α 용액 ApTNF-α solution -18.2±3.75-18.2±3.75 ApTNF-α/PS 입자 용액 ApTNF-α/PS particle solution 20.3±5.2520.3±5.25 ApTNF-α/PS/HA 입자 용액
(ApTNF-α/PS:HA 첨가몰비)ApTNF-α/PS/HA particle solution
(ApTNF-α/PS:HA addition molar ratio) 1:1 1:1 1.75±0.441.75±0.44 1:2 1:2 -3.54±0.6-3.54±0.6 1:10 1:10 -9.1±0.2-9.1±0.2 1:20 1:20 -13.0±0.7-13.0±0.7 1:40 1:40 -16.4±0.3-16.4±0.3

* ApTNF-α/PS 입자는 ApTNF-α:PS (㎍/ml) 비율 30:75로 혼합하여 제조한 것임. 표 3을 참고하면, 약학적 유효성분으로 AM 자체는 강한 음전하를 띄고 있고, 양전하를 띤 분자로 1차 코팅한 결과 양전하를 띄게 되며. 마지막 단계로 음전하를 띤 분자를 이용하여 2차 코팅한 경우, 약한 음전하를 띄고 있음을 확인할 수 있다. * ApTNF-α/PS particles were prepared by mixing ApTNF-α:PS (㎍/ml) ratio of 30:75. Referring to Table 3, AM itself as a pharmaceutically active ingredient has a strong negative charge, and as a result of the primary coating with positively charged molecules, it has a positive charge. As a final step, when the secondary coating is performed using a negatively charged molecule, it can be confirmed that it has a weak negative charge.

도 2의 모식도와 같이, TEM 결과를 보면 가장 안쪽에 약학적 유효성분으로 하는 AM이 존재하고, 그 바로 바깥층에 양전하를 띤 PS가 표면에 코팅되었으며, 가장 바깥층에 음전하를 띤 HA가 코팅된 것을 확인할 수 있다.As shown in the schematic diagram of FIG. 2, the TEM result shows that AM as a pharmaceutical active ingredient is present in the innermost layer, PS with a positive charge is coated on the surface of the immediately outer layer, and HA with a negative charge is coated on the outermost layer. can be checked

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

<AM/PS/HA-TCA 입자> <AM/PS/HA-TCA particles>

형태학적 특성Morphological Characteristics

상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자는 양전하의 ApTNF-α/PS 입자와 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체의 첨가몰비에 따라 제조하였다. The prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA particles were prepared according to the addition molar ratio of the positively charged ApTNF-α/PS particles and the negatively charged HA-TCA conjugate.

상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 제조에 사용된 HA-TCA 결합체의 첨가몰비는 HA 수용체인 CD44와 담즙산(bile acid) 수용체를 효과적으로 타켓팅할 수 있는 1:40 질량비를 선택하였다. The molar ratio of addition of the HA-TCA conjugate used in the preparation of the above-prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA particles was selected as a 1:40 mass ratio capable of effectively targeting the HA receptor CD44 and the bile acid receptor. .

표 4는 HA-TCA 결합체의 첨가량이 증가함에 따른 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 크기와 제타포텐셜(zeta potential) 및 AM 봉입율(%)을 보여준다. Table 4 shows the size and zeta potential and AM encapsulation rate (%) of ApTNF-α/PS/HA-TCA particles as the amount of HA-TCA conjugate increased.

HA-TCA 결합체의 첨가량이 증가함에 따른 AM/PS/HA-TCA 입자의 크기와 제타포텐셜(zeta potential) 및 AM 봉입율(%)AM/PS/HA-TCA particle size and zeta potential and AM encapsulation rate (%) as the amount of HA-TCA conjugate increased 시료 sample 첨가몰비
(feed mole ratio, nmol)addition molar ratio
(feed mole ratio, nmol) 크기
(diameter, nm)size
(diameter, nm) 제타포텐셜
(mV)Zeta potential
(mV) 봉인률
(%)sealing rate
(%) ApTNF-α/PS
입자ApTNF-α/PS
particle HA-TCA 결합체HA-TCA conjugate ApTNF-α/PS 1ApTNF-α/PS 1 1One 1 One 130±5130±5 1.75±0.44 1.75±0.44 96.896.8 ApTNF-α/PS 2ApTNF-α/PS 2 1One 2.0 2.0 138±5138±5 -5.88±0.6 -5.88±0.6 97.097.0 ApTNF-α/PS 10ApTNF-α/PS 10 1One 10.0 10.0 208±2.5208±2.5 -12.1±0.2 -12.1±0.2 96.596.5 ApTNF-α/PS 20ApTNF-α/PS 20 1One 20.0 20.0 237±13237±13 -16.0±0.2 -16.0±0.2 95.195.1 ApTNF-α/PS 40ApTNF-α/PS 40 1One 40.0 40.0 246±6246±6 -19.5±0.1 -19.5±0.1 92.492.4

* ApTNF-α/PS 입자는 ApTNF-α:PS (㎍/ml) 비율 30:75로 혼합하여 제조한 것임. 표 4에서 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 크기는 HA-TCA 결합체의 첨가량에 비례 하여 증가한 것이 확인되었으며 상기 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 제타포텐셜은 음 전하(negative charge)로 확인되었다. 또한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 AM 봉입율은 모든 비율에서 90%이상을 보이는 것이 확인되었다. * ApTNF-α/PS particles were prepared by mixing ApTNF-α:PS (㎍/ml) ratio of 30:75. In Table 4, it was confirmed that the size of the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles increased in proportion to the amount of the HA-TCA conjugate added, and the zeta potential of the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles was negatively charged. was confirmed as In addition, it was confirmed that the AM encapsulation rate of ApTNF-α/PS/HA-TCA particles was 90% or more in all ratios.

상기 결과는 HA-TCA 결합체가 양전하를 띠는 AM/PS 입자와 강하게 반응하여 AM/PS 입자의 표면에 코팅되므로 AM을 안전하게 보호해주는 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.The above result means that the HA-TCA conjugate reacts strongly with the positively charged AM/PS particles and is coated on the surface of the AM/PS particles, so it can play a role in safely protecting the AM.

상기 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자는 우라닐아세테이트(uranyl acetate)로 염색하여 확인한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 TEM 이미지(도 15)에서 입자의 크기는 약 250 nm로 PCS로 측정한 크기 값과 유사한 것으로 확인하였다.The ApTNF-α/PS/HA-TCA particles were stained with uranyl acetate and the TEM image (FIG. 15) of the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles confirmed that the particle size was about 250 nm. It was confirmed that it was similar to the size value measured by

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다. These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

안정성 확인Stability check

상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자에 봉입된 AM의 안정성을 확인하기 위하여 혈청(serum) 안정성, RNase 내성 및 pH에 따른 안정성을 확인하였다. In order to confirm the stability of the AM encapsulated in the AM/PS/HA-TCA particles prepared above, stability according to serum (serum) stability, RNase resistance and pH was confirmed.

상기 혈청안정성은 free AM과 상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자를 50% serum이 함유된 용액에서 37℃의 온도 조건으로 24시간 동안 처리를 한 후 전기영동을 수행하여 확인하였다. The serum stability was confirmed by electrophoresis after treating free AM and the prepared AM/PS/HA-TCA particles in a solution containing 50% serum at 37° C. for 24 hours.

도 16는 ApTNF-α/PS/HA 입자의 혈액내 안정성을 보여준다. Figure 16 shows the stability in blood of ApTNF-α/PS/HA particles.

상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA 입자를 24시간 동안 50% 혈청(serum)을 처리하고 이에 따른 ApTNF-α 분해정도를 전기영동을 통해 확인하였다. 대조군인 Free ApTNF-α의 경우 2시간 안에 모든 ApTNF-α이 혈청에 의해 분해되는 반면에 ApTNF-α/PS/HA 입 자의 경우 24시간 동안 혈청에서 처리함에도 불구하고 ApTNF-α이 혈청 에 의해 분해되지 않는 것이 확인되었다.The prepared ApTNF-α/PS/HA particles were treated with 50% serum for 24 hours, and the degree of ApTNF-α degradation was confirmed by electrophoresis. In the case of the control group, Free ApTNF-α, all ApTNF-α was degraded by serum within 2 hours, whereas in the case of ApTNF-α/PS/HA particles, ApTNF-α was degraded by serum despite treatment in serum for 24 hours. It has been confirmed that not

상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 RNase 보호성은 RNase 보호분석법을 이용하였으며 37℃에서 12시간 동안 0.005 μg/μl의 RNase을 처리한 후 RNase에 의한 ApTNF-α의 분해정도를 평가하여 수행하였다.The RNase protection of the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles prepared above was evaluated using an RNase protection assay. After treatment with 0.005 μg/μl of RNase at 37° C. for 12 hours, the degree of degradation of ApTNF-α by RNase was evaluated. was performed.

도 17은 free ApTNF-α과 ApTNF-α/PS/HA입자에 대한 RNase 보호분석법 수행결과를 보여준다. 실험결과 free ApTNF-α은 0.5시간 만에 RNase에 의해 분해되었으나, ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자에 봉입된 ApTNF-α은 1시간 이상 RNase에 의해 분해되지 않는 것을 확인하였으며 추가적인 실험을 통해 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자에 봉입된 ApTNF-α가 12시간 이상 RNase에 의해 분해되지 않는 것을 확인하였다. 17 shows the results of the RNase protection assay for free ApTNF-α and ApTNF-α/PS/HA particles. As a result of the experiment, it was confirmed that free ApTNF-α was degraded by RNase in 0.5 hours, but ApTNF-α encapsulated in ApTNF-α/PS/HA-TCA particles was not degraded by RNase for more than 1 hour. It was confirmed that ApTNF-α encapsulated in ApTNF-α/PS/HA-TCA particles was not degraded by RNase for more than 12 hours.

다양한 pH 조건에서 입자의 안정성을 확인하였다(도 18) 먼저 상기 제조한 ApTNF-α/PS:HA-TCA (1:0)(A), ApTNF-α/PS:HA-TCA(1:10) (B), ApTNF-α/PS :HA-TCA(1:20) (C) 및 ApTNF-α/PS:HA-TCA(1:40) (D) 첨가몰비로 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자를 이용한 ApTNF-α의 경구 투여를 위해 체내의 위장관 및 혈액의 pH에 따른 안정성을 평가하였다. 위장관(GI tract)의 위, 십이지장 및 회장(ileum) 단편에서의 pH 조건과 유사한 pH 1.2, pH 5.6 및 pH 7.4의 세 가지 pH 용액에 넣고, 입자 크기를 관찰하였다. 대조군으로서 RNase inhibitor인 DEPC를 처리한 용액을 사용하였다. The stability of the particles was confirmed under various pH conditions (FIG. 18). First, the prepared ApTNF-α/PS:HA-TCA (1:0) (A), ApTNF-α/PS:HA-TCA (1:10) (B), ApTNF-α/PS:HA-TCA(1:20) (C) and ApTNF-α/PS:HA-TCA(1:40) (D) ApTNF-α/PS/ For oral administration of ApTNF-α using HA-TCA particles, stability according to the pH of the gastrointestinal tract and blood in the body was evaluated. It was placed in three pH solutions of pH 1.2, pH 5.6 and pH 7.4, similar to the pH conditions in the gastric, duodenal and ileum fragments of the GI tract, and the particle size was observed. As a control, a solution treated with RNase inhibitor DEPC was used.

그 결과, ApTNF-α/PS 입자는 pH 1.2에서 불안정하였지만, Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류-TCA 분자로 코팅된 ApTNF-α/PS 입자는 Hep-TCA 또는 HA-TCA와 같은 다당류 -TCA 분자의 코팅으로 인해 입자 안정성이 개선되었으며, pH 1.2에서 24시간까지 안정함을 확인하였다. 따라서, 다당류-TCA 분자로 코팅된 후 입자는 안정함을 확인하였다.As a result, the ApTNF-α/PS particles were unstable at pH 1.2, but the ApTNF-α/PS particles coated with a polysaccharide-TCA molecule such as Hep-TCA or HA-TCA were treated with a polysaccharide such as Hep-TCA or HA-TCA. Particle stability was improved due to the coating of TCA molecules, and it was confirmed that it was stable at pH 1.2 for 24 hours. Therefore, it was confirmed that the particles were stable after being coated with polysaccharide-TCA molecules.

상기 조건에서 12시간동안 처리한 후 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 크기를 측정한 결과 전달체 크기의 변화는 거의 없었으며 이는 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자가 강산성의 위산과 소장 및 혈액에서 모두 안정하다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자는 위장관에서 분해되지 않고 일정크기를 어느 정도 유지하면서 소장으로 이동하고 흡수되어 혈액으로 이동할 수 있다는 것을 의미한다. As a result of measuring the size of the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles after treatment under the above conditions for 12 hours, there was little change in the size of the transporter. and in blood. Therefore, it means that the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles of the present invention are not decomposed in the gastrointestinal tract and move into the small intestine while maintaining a certain size to some extent, and are absorbed and moved into the blood.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

실시예 11. AM/PS/HA 입자를 구성하는 압타머의 암세포 표적화 분석Example 11. Cancer cell targeting analysis of aptamers constituting AM/PS/HA particles

상기 제조한 AM/PS/HA 응용입자를 HER2와 EpCAM의 발현정도에 따른 세포 증식에 미치는 영향을 평가를 하기 위해, 압타머 약물 AM[ApGemHER2-S-S-DM1(A), ApFdUEpCAM-S-S-DM1(B), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(C), ApFdUEpCAM-S-S-DNA 박스-S-S-DM1(D), ApGemHER2-S-S-U15-ApFdUEpCAM(E), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-DM1(F), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFd UEpCAM-S-S-PTX(G), ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MM AE(H) 및 ApGemHER2-S-S-DNA 박스-S-S-ApFdUEpCAM-S-S-MMAF(I)]을 이 용하여 제조한 AM/PS/HA 응용입자의 효과를 평가하였다.In order to evaluate the effect of the prepared AM / PS / HA application particles on cell proliferation according to the expression levels of HER2 and EpCAM, aptamer drugs AM [ApGemHER2-SS-DM1 (A), ApFdUEpCAM-SS-DM1 ( B), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-DM1 (C), ApFdUEpCAM-SS-DNA box-SS-DM1 (D), ApGemHER2-SSU 15 -ApFdUEpCAM (E), ApGemHER2-SS-DNA box-SS- ApFdUEpCAM-SS-DM1 (F), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFd UEpCAM-SS-PTX (G), ApGemHER2-SS-DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-MM AE (H) and ApGemHER2-SS -DNA box-SS-ApFdUEpCAM-SS-MMAF(I)] was used to evaluate the effect of AM/PS/HA application particles.

본 실시 예에 사용한 세포주는 CD44+, HER2+ 및 EpCAM+인 유방암 세포주, MDA-MB-453(HTB-131™), CD44-, HER2- 및 EpCAM+인 유방암 세포주, MCF-7(HTB-22™) 그리고 CD44+, HER2- 및 EpCAM-인 유방암 세포주, MDA-MB-231(HTB-26™)이다.The cell lines used in this Example are CD44+, HER2+ and EpCAM+ breast cancer cell lines, MDA-MB-453 (HTB-131™), CD44-, HER2- and EpCAM+ breast cancer cell lines, MCF-7 (HTB-22™) and CD44+ , HER2- and EpCAM-, a breast cancer cell line, MDA-MB-231 (HTB-26™).

상기 압타머 표적화약물 입자들을 상기 세포 배양용액에 첨가하고 4시 간 동안 배양하고 세척한 후, 72시간 동안 배양하여 MTT 분석을 사용 하였다.The aptamer targeting drug particles were added to the cell culture solution, incubated for 4 hours, washed, and cultured for 72 hours to use the MTT assay.

일중 압타머 표적화약물 입자의 세포주에 따른 반응성Reactivity according to cell line of single aptamer-targeting drug particles

도 19에 제시한 바처럼, MDA-MB-453 세포에서는 A, B, C와 D의 압타머표적화 약물 입자의 IC50 값은 350 ng/mL이었다.As shown in FIG. 19 , in MDA-MB-453 cells, the IC 50 values of the aptamer-targeted drug particles of A, B, C and D were 350 ng/mL.

MCF-7에서는 B와 D를 사용하여 제조한 입자의 IC50 값이 750 ng/mL인 반면, A와 C의 압타머 표적화약물 입자의 IC50 값은 측정할 수 없었다. In MCF-7, the IC 50 value of the particles prepared using B and D was 750 ng/mL, whereas the IC 50 value of the aptamer-targeting drug particles of A and C could not be measured.

MDA-MB-231에서는 A, B, C와 D를 사용하여 제조한 입자의 IC50 값은 812 ng/mL이었다.In MDA-MB-231, the IC 50 value of the particles prepared using A, B, C and D was 812 ng/mL.

이중 압타머 표적화약물 입자의 세포주에 따른 반응성Reactivity according to cell line of double aptamer-targeting drug particles

도 20에 제시한 바처럼, MDA-MB-453 세포에서는 E, F, G, H와 I의 압타머 표적화약물 입자의 IC50 값은 300 ng/mL이었다.As shown in FIG. 20 , in MDA-MB-453 cells, the IC 50 values of E, F, G, H and I aptamer-targeting drug particles were 300 ng/mL.

MCF-7에서는 E, F, G, H와 I를 사용하여 제조한 입자의 IC50 값이 820 ng/mL이었다.In MCF-7, the IC 50 value of the particles prepared using E, F, G, H and I was 820 ng/mL.

MDA-MB-231에서는 E, F, G, H 와 I를 사용하여 제조한 입자의 IC50 값은 760 ng/mL 이었다.In MDA-MB-231, the IC 50 value of the particles prepared using E, F, G, H and I was 760 ng/mL.

이러한 세포독성 결과는 상기 암세포에 CD44, HER2 및 EpCAM 표적분자의 유무에 따라 선택적으로 AM/PS/HA 입자를 전달하여 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 평균 ± 표준편차(n = 5).These cytotoxicity results indicate that the cancer cells induce apoptosis by selectively delivering AM/PS/HA particles depending on the presence or absence of CD44, HER2 and EpCAM target molecules. Mean ± standard deviation (n = 5).

실시예 12. AM/PS/HA-TCA 입자의 생물학적 평가Example 12. Biological evaluation of AM/PS/HA-TCA particles

세포흡수 실험Cell uptake experiment

본 발명에서 사용한 AM들에서 ApTNF-α(ⅰ), ApIL-10(ⅱ), ApIL-17(ⅲ), 이중 Ap4-1BB-ApEpCAM 키메라(ⅳ), 이중 Ap4-1BB-ApVEGF(ⅴ) 또는 ApOPN(ⅵ) 키메라를 사용하여 제조된 AM/PS/PS-TCA 응용입자로 세포흡수 실험을 수행하였다.In the AMs used in the present invention, ApTNF-α (i), ApIL-10 (ii), ApIL-17 (iii), dual Ap4-1BB-ApEpCAM chimera (iv), dual Ap4-1BB-ApVEGF (v) or ApOPN (vi) A cell uptake experiment was performed with AM/PS/PS-TCA applied particles prepared using chimera.

상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자의 담즙산 수용체 에 의한 세포흡수정도를 평가하기 위하여 MDCK 및 MDCK-ASBT 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. In order to evaluate the degree of cellular uptake of the prepared AM/PS/HA-TCA particles by bile acid receptors, an experiment was performed using MDCK and MDCK-ASBT cells.

MDCK, MDCK-ASBT 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 배양하였다.MDCK and MDCK-ASBT cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS.

상기 제조한 투여용 AM/PS/HA-TCA 입자의 세포흡수 여부는 레이저현미경(Confocal laser scanning microscope, CLSM) 이미지 분석과 형광측정을 통하여 수행하였다. 이를 위하여 경구투여용 AM/P S/HA-TCA 입자는 Rhodamine B가 결합된 Protamine (Rhod-PS)을 이용하여 제조하였다.Whether or not the prepared AM/PS/HA-TCA particles for administration was absorbed into cells was performed through confocal laser scanning microscope (CLSM) image analysis and fluorescence measurement. For this purpose, AM/P S/HA-TCA particles for oral administration were prepared using Rhodamine B-conjugated Protamine (Rhod-PS).

도 21은 압타머 약물로 ApTNF-α(ⅰ)를 사용하여 제조한 ApTNF-α /PS/HA-TCA 입자의 담즙산 수용체에 의한 세포흡수를 확인결과를 보여준다.21 shows the results of confirming cell uptake by bile acid receptors of ApTNF-α /PS/HA-TCA particles prepared using ApTNF-α(i) as an aptamer drug.

TCA는 담즙산의 일종으로 담즙산 수용체에 의한 장간순환이 가능한 물질로 약물의 체순환(systemic circulation)을 증가시키며, 소장 말단 부분에서의 ASBT(Apical Sodium Dependent Bile Acid Transporter)에 의해 경구흡수를 증진시키는 장점이 있다. MDCK-ASBT세포는 ASBT가 수용체가 과발현된 세포로 MDCK 세포를 대조군으로 사용하였으며 시간에 따른 세포흡수는 Rhodamine B가 결합된 PS의 형광을 측정하여 분석하였다. TCA, a type of bile acid, is a substance capable of enterohepatic circulation by bile acid receptors. It increases the systemic circulation of drugs and has the advantage of enhancing oral absorption by ASBT (Apical Sodium Dependent Bile Acid Transporter) at the end of the small intestine. have. MDCK-ASBT cells were ASBT receptor overexpressed cells, and MDCK cells were used as a control. Cell uptake over time was analyzed by measuring the fluorescence of PS bound to Rhodamine B.

실험결과 ASBT가 발현되지 않은 MDCK세포에서는 ApTNF-α/PS 기본입자, [ApTNF-α/PS 기본입자+HA] 및 경구투여용 ApTNF-α/PS/HA-TCA 응용입자의 존재 정도가 큰 차이가 없었으나, MDCK-ASBT 세포에서는 상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자가 다른 샘플군보다 확연이 높은 것을 확인하였으며 시간이 경과할수록 더욱더 증가하는 것을 확인하였다. As a result of the experiment, there was a large difference in the presence of ApTNF-α/PS basic particles, [ApTNF-α/PS basic particles + HA], and ApTNF-α/PS/HA-TCA applied particles for oral administration in MDCK cells that did not express ASBT. However, in the MDCK-ASBT cells, it was confirmed that the above-prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA particles were significantly higher than that of other sample groups, and it was confirmed that the increase as time passed.

또한 상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자가 MDCK-ASBT 세포의 ASBT 수용체에 의해 흡수되었는지를 확인하기 위하여 TCA를 고농도로 전처리한 후 상기 제조한 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 흡수를 확인한 결과 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자의 MDCK-ASBT 세포흡수가 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다. In addition, in order to check whether the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA particles were absorbed by the ASBT receptor of MDCK-ASBT cells, the prepared ApTNF-α/PS/HA-TCA particles were pretreated with TCA at a high concentration. As a result of confirming the uptake of ApTNF-α/PS/HA-TCA particles, it was confirmed that the MDCK-ASBT cell uptake was significantly reduced.

따라서 본 발명의 ApTNF-α/PS/HA-TCA 입자는 세포독성이 매우 낮으며 소장말단을 통해 장간 순환으로 진입하는 것으로 확인되었다.Therefore, it was confirmed that the ApTNF-α/PS/HA-TCA particles of the present invention have very low cytotoxicity and enter the enterohepatic circulation through the end of the small intestine.

상기 결과들은 선택된 ApTNF-α에만 한정된 것이 아니라 다른 AM에서도 일반적으로 관찰되었다.These results were not limited to selected ApTNF-α, but were generally observed in other AMs as well.

세포표적화 실험Cell targeting experiment

본 발명에서 사용한 AM들에서 ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅶ), ApEpCAM-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅷ) 또는 ApHER2-PolyGem(ⅸ)를 사용하여 제조된 AM/PS/PS-TCA 응용입자로 세포 표적화 실험을 수행하였다.AM/PS/PS prepared by using ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (vii), ApEpCAM-survivin siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (viii) or ApHER2-PolyGem (viii) in the AMs used in the present invention - A cell targeting experiment was performed with TCA applied particles.

상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자를 구성하는 HA에 의한 CD44 수용체 매개에 의한 세포 표적화 정도를 평가하기 위하여 MDA-MB-231(CD44+, HER2 -, EpCAM-) 및 HepG2(CD44+, HER2+, E pCAM+) 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. MDA-MB-231 (CD44+, HER2 -, EpCAM-) and HepG2 (CD44+, HER2+, E pCAM+) cells were used for experiments.

MDA-MB-231 세포 는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, HepG2 세포 는 20% FBS가 포함된 MEM 배지 (25 nM MES, 25 nM HEPES)에서 배양하였다. MDA-MB-231 cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS, and HepG2 cells were cultured in MEM medium (25 nM MES, 25 nM HEPES) containing 20% FBS.

HA는 체내에 여러 HA 수용체가 있으며, CD44 수용체의 경우 대부분 암세포에서 과발현되어 있어 약물을 전달할 때 암세포 표적이 용이하다. HA has several HA receptors in the body, and most of the CD44 receptors are overexpressed in cancer cells, making it easy to target cancer cells when delivering drugs.

실험에 사용한 세포주는 CD44 positive cell 인 MDA-MB-231 세포 및 HepG2 세포를 사용하였다. The cell lines used in the experiment were CD44 positive cells, MDA-MB-231 cells and HepG2 cells.

도 22는 압타 머약물로 ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅶ)를 사용하여 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자의 CD44 수용체의 HA에 의한 HepG2 세포흡수율 및 CLSM이미지 분석 결과를 보여준다. 22 shows the results of analysis of HepG2 cell uptake rate and CLSM image by HA of the CD44 receptor of AM/PS/HA-TCA particles prepared using ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (vii) as an aptamer drug.

대조군으로서 PS만을 사용한 경우와 실험군으로서 경구투여용 AM/PS/HA-TCA 입자를 사용한 경우 AM/PS/HA-TCA 입자가 PS에 비하여 월등히 높은 흡수율을 보였으며 HA를 고농도로 전처리하여 CD44 수용체를 block 시킨 후 경구투여용 AM/PS/HA-TCA 입자의 흡수율을 확인하는 방법으로 HA에 특이적인 세포흡수 정도를 확인한 결과 상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자의 흡수율이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. When only PS was used as a control group and when AM/PS/HA-TCA particles for oral administration were used as an experimental group, AM/PS/HA-TCA particles showed a significantly higher absorption rate than PS. After blocking, the absorption rate of the AM/PS/HA-TCA particles for oral administration was confirmed. .

본 실험에 사용한 MDA-MB-231 세포는 CD44 수용체의 높은 발현에 의해 주로 HA의 흡수실험에 많이 쓰이는 세포주이며 HepG2 세포의 경우 원발성 간암세포로 CD44 수용체가 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서 HA 특이적으로 세포에 흡수되는 본 발명의 AM/PS/HA-TCA 입자는 원발성 간암 또는 간전이 암 모두에 적용되어 AM을 이용한 암표적형 치료제로서 사용될 수 있다.MDA-MB-231 cells used in this experiment are mainly used for HA uptake experiments due to their high expression of CD44 receptor, and HepG2 cells are known to express CD44 receptor as primary hepatocellular carcinoma cells. Therefore, the AM/PS/HA-TCA particles of the present invention that are specifically absorbed into cells by HA can be applied to both primary liver cancer and liver metastasis cancer, and can be used as a cancer-targeting therapeutic agent using AM.

엔도솜 탈출endosomal escape

본 발명에서 사용한 AM들에서 ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅶ) 또는 ApEpCAM-서바이빈 siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 키메라(ⅷ)를 사용하여 제조된 AM/PS/PS-TCA 응용입자로 엔도좀 탈출 실험을 수행하였다.In the AMs used in the present invention, using the ApEpCAM-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (vii) or the ApEpCAM-survivin siRNA-EGFR siRNA-ApHER2 chimera (viii), an AM/PS/PS-TCA application particle prepared as an endosome Escape experiments were performed.

상기 제조한 AM/PS/HA-TCA 입자의 엔도솜 탈출분석은 FAM-AM(green), Lysotracker (deep red)을 CLSM으로 촬영한 이미지를 분석하여 수행하였다. The endosomal escape analysis of the prepared AM/PS/HA-TCA particles was performed by analyzing the images taken by FAM-AM (green), Lysotracker (deep red) with CLSM.

이를 위하여 HepG2 세포를 96-well plate에서 1 x 104 cell/wel l의 농도로 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 Hep G2 세포에 100 nM FAM-AM이 봉입된 AM/PS/HA-TCA 입자를 투여한 후 0.5시간, 2시간, 또는 4시간 동안 배양하였다. 상기 AM/PS/HA-TCA 입자가 투여하여 배양한 HepG2 세포에 25 nM의 Lysotracker를 20분 동안 처리하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정시킨 후 CLSM 이미지를 분석하였다.To this end, HepG2 cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of 1 x 10 4 cell/well and then cultured for 24 hours. After administration of 100 nM FAM-AM-encapsulated AM/PS/HA-TCA particles to the cultured Hep G2 cells, the cells were cultured for 0.5 hours, 2 hours, or 4 hours. The AM/PS/HA-TCA particles were administered and cultured HepG2 cells were treated with 25 nM Lysotracker for 20 minutes, and the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then CLSM images were analyzed.

엔도솜 탈출(endosomal escape)은 효율적인 AM의 세포전달에 있어 매우 중요한 문제이다. 세포 내로 진입한 AM은 nuclease에 의해 분해되는데 이를 예방하고 AM에 포함된 활성제의 효능을 위해서는 반드시 엔도솜을 탈출하여 세포질에 발산되는 AM의 양이 충분해야 한다.Endosome escape (endosomal escape) is a very important problem for efficient AM cell delivery. AM that enters the cell is decomposed by nuclease, and for the efficacy of the active agent contained in AM, the amount of AM that escapes endosomes and is released into the cytoplasm must be sufficient.

도 23은 AM/PS/HA-TCA 입자에 의헤 세포내로 전달된 AM이 엔도솜으로부터 탈출하여 세포질에 존재하는 것을 확인한 결과를 보여준다. Figure 23 shows the results of confirming that the AM delivered into the cell by the AM / PS / HA-TCA particles escape from the endosome and exist in the cytoplasm.

본 발명의 PS은 핵단백질 특성을 가지고 있어 AM의 엔도솜 탈출을 향상시키는 장점이 있다. 이를 확인하기 위하여 FAM-AM(green), Lysotracker(red)에 대한 CLSM 이미지 분석을 통해 AM/PS/HA-TCA 입자의 AM(또는 AM/PS 복합체)에 대한 시간 에 따른 엔도솜 탈출정도를 확인하였다. AM/PS/HA-TCA 입자를 HepG2 세포에 처리하고 0.5시간, 2시간, 4시간 후 HepG2 세포에 대해 FAM-AM(green), Lysotracker (red)에 대한 CLSM 이미지를 분석하여 AM의 세포 흡수 과정을 확인하였다. PS of the present invention has the advantage of improving the endosomal escape of AM because it has a nucleoprotein characteristic. To confirm this, check the degree of endosomal escape over time for AM (or AM/PS complex) of AM/PS/HA-TCA particles through CLSM image analysis for FAM-AM (green) and Lysotracker (red). did. AM/PS/HA-TCA particles were treated in HepG2 cells, and CLSM images for FAM-AM (green) and Lysotracker (red) were analyzed for HepG2 cells after 0.5 hours, 2 hours, and 4 hours, and the process of AM cell uptake was confirmed.

처리 후 0.5시간 동안 배양 한 경우 AM/PS/HA-TCA 입자가 엔도솜(endosome)을 형성하여 세포질 내로 흡수된 것을 확인하였으며, 처리 후 2시간동안 배양한 경우 흡수된 AM/PS/HA-TCA 입자에 봉입된 대부분의 AM이 성공적으로 엔도솜을 탈출하여 세포질 내로 방출된 것이 확인되었다. 처리 후 4시간 동안 배양한 경우 대부분의 AM/PS/HA-TCA 입자이 작은 분자로 쪼개진 것을 확인하였다.When cultured for 0.5 hours after treatment, it was confirmed that AM/PS/HA-TCA particles formed endosomes and absorbed into the cytoplasm. When cultured for 2 hours after treatment, absorbed AM/PS/HA-TCA particles It was confirmed that most of the AM encapsulated in the particles successfully escaped the endosome and released into the cytoplasm. When cultured for 4 hours after treatment, it was confirmed that most of the AM/PS/HA-TCA particles were split into small molecules.

따라서 본 발명의 AM/PS/HA-TCA 입자는 세포 내로 흡수된 후 성공적으로 엔도솜을 탈출하여 세포질내로 방출되는 것이 확인되었다. 정리하면 상기 결과는 본 발명의 AM/PS/HA-TCA 입자가 간암 세포인 HepG2 세포와 접촉하여 엔도솜을 형성하므로 성공적으로 세포내 흡수가 이루어졌으며 대부분의 AM이 리소좀에서 분해되지 않고 PS의 핵단백질 기능에 의하여 세포질 내로 성공적인 엔도솜 탈출이 일어난 것을 시사하며, 세포질 내로 방출된 AM은 약학적 유효성분으로 치료에 효과적일 것으로 판단된다.Therefore, it was confirmed that the AM/PS/HA-TCA particles of the present invention were successfully absorbed into the cell and then escaped the endosome and released into the cytoplasm. In summary, the above results show that the AM/PS/HA-TCA particles of the present invention are in contact with HepG2 cells, which are hepatocarcinoma cells, and form endosomes, so they are successfully absorbed into cells, and most AMs are not degraded in lysosomes and the nucleus of PS It suggests that successful endosomal escape has occurred into the cytoplasm by the protein function, and AM released into the cytoplasm is considered to be effective in treatment as a pharmaceutical active ingredient.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The foregoing description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

10: 기본입자 20: 응용입자
21: 양이온성 분자층 22: 음이온성 분자층10: basic particle 20: applied particle
21: cationic molecular layer 22: anionic molecular layer

Claims (46)

압타머 약물(AM);
상기 AM과 접촉하여 정전기적 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 복합체, 기본입자(10)를 형성하는 양이온성 분자; 및
상기 형성된 복합체 층(21) 외면에 코팅되는 음이온성 층(22)으로 구성되는 응용입자(20)를 형성하는 (-)전하를 띄는 음이온성 고분자;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.aptamer drugs (AM);
cationic molecules that come into contact with the AM and condense the AM through electrostatic interaction to form a complex, elementary particles (10); and
an anionic polymer having a (-) charge to form the applied particles 20 composed of the anionic layer 22 coated on the outer surface of the formed composite layer 21;
Aptamer-based particles and a method for producing the same, comprising a. 제1항에 있어서, 상기 압타머 약물(AM)은
천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드를 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(FAM); 및
약학적 유효성분을 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SAM);
로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.The method of claim 1, wherein the aptamer drug (AM) is
an aptamer drug (FAM) comprising an aptamer composed of natural nucleotides and modified nucleotides; and
Aptamer drug (SAM) comprising an aptamer comprising a pharmaceutical active ingredient as a component;
Aptamer-based particles, characterized in that one selected from the group consisting of, and a method for producing the same. 제2항에 있어서, 상기 약학적 유효성분은
뉴클레오사이드 치료제에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머기반 입자 및 이의 제조방법. The method of claim 2, wherein the pharmaceutically active ingredient is
An aptamer-based particle characterized by at least one selected from nucleoside therapeutics and a method for preparing the same. 제3항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 치료제는
항바이러스, 항균 또는 항암 활성과 같은 입증된 치료학적 또는 약학적 활성을 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.4. The method of claim 3, wherein the nucleoside therapeutic agent is
An aptamer-based particle characterized by at least one selected from nucleosides or nucleoside analogs having proven therapeutic or pharmaceutical activity, such as antiviral, antibacterial or anticancer activity, and a method for preparing the same. 제2항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오타이드는
뉴클레오타이드의 구성성분인, 당, 핵염기, 또는 뉴클레오사이드 사이 연결(예를 들면, 연결 포스페이트/포스포디에스테르 연결/포스포디에스테르 골격)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 변형이 있는 천연 뉴클레오타이드의 변형체를 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.3. The method of claim 2, wherein the modified nucleotide is
A variant of a natural nucleotide having one or more modifications selected from the group consisting of sugars, nucleobases, or internucleoside linkages (eg, linked phosphate/phosphodiester linkages/phosphodiester backbones), which are constituents of nucleotides Aptamer-based particles and a method for producing the same, characterized in that. 제1항 내지 제5항에 있어서, 상기 AM은,
압타머 및 압타머 표적화약물로 이루어진 군에서 선택된 1종이고,
상기 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.According to claim 1 to 5, wherein the AM,
It is one selected from the group consisting of aptamers and aptamer-targeting drugs,
Aptamer-based particles and a method for producing the same, characterized in that at least one selected above. 제1항 내지 제6항에 있어서,
상기 AM에 영상소재, 중성 분자 및 양이온 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.7. The method according to any one of claims 1 to 6,
An aptamer-based particle and a method for producing the same, comprising at least one selected from the group consisting of an imaging material, a neutral molecule, and a cationic molecule in the AM. 영상소재가 포함된 압타머 약물(AM)에 중성 분자 또는 양이온 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 약물.Aptamer drug, characterized in that it contains a neutral molecule or a cationic molecule in the aptamer drug (AM) containing the imaging material. 제7항 내지 제8항에 있어서, 상기 영상소재는
방사능 동위원소, 형광 물질, 적외선 물질, 양자점, 이온 옥사이드 비드(ion oxide bead), PET 프로브, T1 MR 프로브 및 T2 MR 프로브로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.The method of claim 7 to 8, wherein the image material is
Aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of radioactive isotopes, fluorescent materials, infrared materials, quantum dots, ion oxide beads, PET probes, T1 MR probes and T2 MR probes, and preparation thereof Way. 제7항 내지 제8항에 있어서, 상기 중성 분자는 콜레스테롤을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.[9] The aptamer-based particles according to claim 7 to 8, wherein the neutral molecule is cholesterol, and a method for preparing the same. 제1항 및 제10항에 있어서, 상기 압타머는
표적분자와 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있으며, 독특한 3차원 구조를 가진 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.11. The method of claim 1 and 10, wherein the aptamer is
An aptamer-based particle characterized by an oligonucleotide having a unique three-dimensional structure and capable of binding to a target molecule with high specificity and affinity, and a method for preparing the same. 제1항 및 제11항에 있어서, 상기 압타머는
핵산분해효소(nuclease)에 대한 내성을 목적으로 압타머 양 쪽 말단의 변형, 뉴클레오사이드에 있는 당의 변형, phosphodiester 결합의 변형 및 압타머의 거울상으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.12. The method of claim 1 and 11, wherein the aptamer is
An aptamer characterized by at least one selected from the group consisting of modification of both ends of the aptamer for the purpose of resistance to nucleases, modification of sugars in nucleosides, modification of phosphodiester bonds, and mirror images of aptamers Tamer-based particles and method for preparing the same. 제6항에 있어서, 상기 압타머 표적화약물은
상기 압타머와 치료분자를 포함한 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.The method of claim 6, wherein the aptamer targeting drug is
An aptamer-based particle and a method for producing the same, comprising the aptamer and a therapeutic molecule. 제13항에 있어서, 상기 치료분자는
활성제 치료분자, 표적화 치료분자 및 핵산 치료분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.14. The method of claim 13, wherein the therapeutic molecule is
An aptamer-based particle, characterized in that at least one selected from the group consisting of an active agent therapeutic molecule, a targeting therapeutic molecule, and a nucleic acid therapeutic molecule, and a method for preparing the same. 제14항에 있어서, 상기 활성제 치료분자는
동종 또는 이종의 활성제를 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.15. The method of claim 14, wherein the active agent therapeutic molecule is
Aptamer-based particles characterized by homogeneous or heterogeneous active agents and a method for preparing the same. 제15항에 있어서, 상기 활성제는
소분자, 방사능제, 단백질 또는 펩티드, 뉴클레오시드 유사체, 지질, 당, 당지질, 당단백질 및 지단백질, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.16. The method of claim 15, wherein the active agent is
An aptamer-based particle characterized by at least one selected from the group consisting of small molecules, radioactive agents, proteins or peptides, nucleoside analogs, lipids, sugars, glycolipids, glycoproteins and lipoproteins, or a combination thereof, and a method for preparing the same. 제14항에 있어서, 상기 표적화 치료분자는
상기 뉴클레오사이드 치료제를 포함하는 압타머를 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.15. The method of claim 14, wherein the targeting therapeutic molecule is
An aptamer-based particle comprising an aptamer comprising the nucleoside therapeutic agent and a method for preparing the same. 제14항에 있어서, 상기 핵산 치료분자는
핵산 신약, DNA 박스 및 뉴클레오시드 유사체를 구성성분으로 포함하는 폴리머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.15. The method of claim 14, wherein the nucleic acid therapeutic molecule is
An aptamer-based particle comprising at least one selected from the group consisting of a new nucleic acid drug, a DNA box, and a polymer comprising a nucleoside analog as a component, and a method for preparing the same. 제18항에 있어서, 상기 핵산 신약은
RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), miRNA, 압타머, antisense oligodeoxynucleotide, 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.The method of claim 18, wherein the nucleic acid new drug is
RNA, DNA, siRNA (short interfering RNA), miRNA, aptamer, antisense oligodeoxynucleotide, antisense RNA (antisense RNA), ribozyme (ribozyme) and DNA zyme (DNAzyme) characterized by at least one selected from the group consisting of Aptamer-based particles and method for preparing the same. 제17항에 있어서, 상기 DNA 박스는
이중가닥 핵산 또는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일가닥 DNA에 삽입물질(intercalator) 및 그루브 결합물질(Groove binder)으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 자기 조립으로 특이 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.18. The method of claim 17, wherein the DNA box is
Aptamer-based, characterized in that one selected from the group consisting of an intercalator and a groove binder in single-stranded DNA capable of forming a double-stranded nucleic acid or hairpin structure forms a specific structure by self-assembly Particles and a method for preparing the same. 제20항에 있어서, 상기 삽입물질(intercalator)은
독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.21. The method of claim 20, wherein the intercalator is
Aptamer-based particles, characterized in that one selected from the group consisting of doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, and idarubicin, and a method for preparing the same. 제20항에 있어서, 상기 그루브 결합물질(Groove binder)는
플루마이신(pluramycins), 아플라톡신(aflatoxins) 및 아지노마이신(azinomycins)로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.The method of claim 20, wherein the groove binder (Groove binder)
Aptamer-based particles, characterized in that one selected from the group consisting of flumycins (pluramycins), aflatoxins (aflatoxins) and azinomycins (azinomycins), and a method for producing the same. 제18항에 있어서, 상기 폴리머를 구성하는 뉴클레오시드 유사체는
didanosine (ddI), vidarabine, BCX4430, cytarabine, gemcitabine, emtricitabine (FTC), lamivudine(3TC), zalcitabine(ddC), abacavir, aciclovir, entecavir, stavudine(d4T), telbivudine, zidovudine (azidothymidine, or AZT), idoxuridine 및 trifluridine으로 이루어진 군서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.19. The method of claim 18, wherein the nucleoside analog constituting the polymer is
didanosine (ddI), vidarabine, BCX4430, cytarabine, gemcitabine, emtricitabine (FTC), lamivudine (3TC), zalcitabine (ddC), abacavir, aciclovir, entecavir, stavudine (dAZ4T), telburivudine (azidothymidine) And aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of trifluridine, and a method for producing the same. 제1항 및 제8항에 있어서, 상기 양이온성 분자는
양이온성 폴리펩타이드, 양이온성 다당류, 양이온성 지질, 양이온성 표면활성제, 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유결합한 양이온성 분자 및 합성 중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.9. The method of claim 1 and 8, wherein the cationic molecule is
Aptamer-based particles characterized by one selected from the group consisting of cationic polypeptides, cationic polysaccharides, cationic lipids, cationic surfactants, cationic molecules covalently bound to bile acids or bile acid derivatives, and synthetic polymers, and particles thereof manufacturing method. 제24항에 있어서, 상기 양이온성 폴리펩타이드는
Protamine(PS), 세포 침투성 펩타이드(CPP), 폴리-L-라이신(PLL: poly-L-lysine) 및 폴리아미도 아민(PAMAM: polyamidoamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.25. The method of claim 24, wherein the cationic polypeptide is
Protamine (PS), cell penetrating peptide (CPP), poly-L-lysine (PLL: poly-L-lysine) and polyamido amine (PAMAM: polyamidoamine) characterized by one selected from the group consisting of aptamer-based Particles and a method for preparing the same. 제24항에 있어서, 상기 양이온성 다당류는
키토산, 글리코키토산 및 인위적으로 유도된 양이온 다당류로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.25. The method of claim 24, wherein the cationic polysaccharide is
Aptamer-based particles, characterized in that one selected from the group consisting of chitosan, glycochitosan and artificially induced cationic polysaccharides, and a method for preparing the same. 제24항에 있어서, 상기 양이온성 지질은
1,2-디라우로릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE) 및 1,2-디라 우로릴-sn-글리세로-3-글리세롤(DLPG), 디올레오일-1,2-디아실-3-트 리메틸암모니움-프로판(DOTAP, 18:1; 14:0; 16:0, 18:0로) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA); 디 메틸디옥타데실 암모니움(DDAB); 1,2-디라우로릴-글리세로-3-에틸포스포콜린(에틸 PC, 12:0; 14:0; 16:0; 18:0; 18:1; 16:0 ∼ 18:1로); 1,2-디-(9Z-옥타데센오일)-3-디메틸암모니움-프로판 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-3-카바모일]콜 레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.25. The method of claim 24, wherein the cationic lipid is
1,2-dilaurolyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DLPE) and 1,2-dilaurolyl-sn-glycero-3-glycerol (DLPG), dioleoyl-1, 2-Diacyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP, 18:1; 14:0; 16:0, as 18:0) and N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl ]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA); Dimethyldioctadecyl ammonium (DDAB); 1,2-Dilaurolyl-glycero-3-ethylphosphocholine (ethyl PC, 12:0; 14:0; 16:0; 18:0; 18:1; 16:0 to 18:1) ); 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-3-dimethylammonium-propane and 3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-3-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC -Cholesterol), characterized in that one selected from the group consisting of aptamer-based particles and a method for producing the same. 제24항에 있어서, 상기 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유결합한 양이온성 분자는
답즙산 또는 답즙산 유도체는 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산(taurocholic acid, TCA), 글리코콜린산(glycocholic acid) 및 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxycholic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.25. The method of claim 24, wherein the cationic molecule to which the bile acid or bile acid derivative is covalently bound is
Bile acids or bile acid derivatives include deoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, taurocholic acid (TCA), glycocholic acid and glycochenodeoxycholic acid. An aptamer-based particle, characterized in that one selected from the group consisting of acid (glycochenodeoxycholic acid) and a method for preparing the same. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는
헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate) 및 음이온성 지질으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.According to claim 1, wherein the anionic polymer is
Aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of heparin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, and anionic lipids, and a method for manufacturing the same. 제29항에 있어서, 상기 음이온성 지질은
포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.30. The method of claim 29, wherein the anionic lipid is
Aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol, and a method for preparing the same. 제1항에 있어서,
압타머 약물(AM) 및 상기 양이온성 분자를 포함하는 조성물을 접촉시키고, 정전기적 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 복합체, 기본입자(10)를 형성하는 단계; 및
상기 복합체(10)에 상기 음이온성 분자를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 분자를 정전기적 인력으로 코팅하여 음이온성 층(22)을 형성하는 복합체(20)를 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자의 제조방법.According to claim 1,
contacting an aptamer drug (AM) and a composition comprising the cationic molecule, and condensing the AM by electrostatic interaction to form a complex, basic particles (10); and
preparing a complex 20 for forming an anionic layer 22 by adding the anionic molecule to the complex 10 and coating the anionic molecule on the outer surface of the particle by electrostatic attraction;
A method of producing an aptamer-based particle comprising a. 제31항에 있어서, 상기 양이온성 분자를 포함하는 조성물은
알부민, 양친매성 고분자, 음전하를 띤 나노입자, 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.32. The composition of claim 31, wherein the composition comprising the cationic molecule is
Albumin, amphiphilic polymer, negatively charged nanoparticles, and aptamer-based particles, characterized in that it further comprises at least one selected from the group consisting of salts, and a method for producing the same. 제32항에 있어서, 상기 양친매성 고분자는
키토산(chitosan), 폴록사머 ((폴리에틸렌옥사이드)-(폴리프로필렌옥사이드)-(폴리에틸렌옥사이드)), 폴리비닐알콜, tween 20, triton X-100, 폴리락타이드, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리락타이드-co-글리코리드, 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드 및 폴리-ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드로 이루어진 폴리에스터, 폴리카보네이트및 폴리오쏘에스터로 구성된 군으로부터 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.33. The method of claim 32, wherein the amphiphilic polymer is
Chitosan, poloxamer ((polyethylene oxide)-(polypropylene oxide)-(polyethylene oxide)), polyvinyl alcohol, tween 20, triton X-100, polylactide, poly-ε-caprolactone, polylac consisting of tide-co-glycolide, poly(lactide-co-ε-caprolactone), poly-ε-caprolactone-co-glycolide and poly-ε-caprolactone-co-glycolide-co-lactide An aptamer-based particle, characterized in that one selected from the group consisting of polyester, polycarbonate and polyorthoester, and a method for producing the same. 제32항에 있어서, 상기 염은
NaCl 및 CaCl2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.33. The method of claim 32, wherein the salt is
NaCl and CaCl 2 Aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of and a method for producing the same. 제32항에 있어서, 상기 음전하를 띤 나노입자는
은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 구리(Cu), 주석(Sn), 철(Fe), 니켈(Ni), 루테늄(Ru), 타이타늄 (Ti), 탄탈럼(Ta), 니오비움(Nb), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al) 등과 같은 전도성 금속원소 또는 이들의 금속산화물이 하나 또는 그 이상의 배합으로 합성된 그룹으로부터 선택된 1종을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.33. The method of claim 32, wherein the negatively charged nanoparticles are
Silver (Ag), gold (Au), platinum (Pt), copper (Cu), tin (Sn), iron (Fe), nickel (Ni), ruthenium (Ru), titanium (Ti), tantalum (Ta) , niobium (Nb), zirconium (Zr), aptamer-based particles characterized by one selected from the group consisting of conductive metal elements such as aluminum (Al), or metal oxides thereof, one or more combinations thereof, and its manufacturing method. 압타머 약물(AM);
상기 AM과 접촉하여 정전기적 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 복합체, 기본입자(10)를 형성하는 양이온성 분자; 및
상기 형성된 복합체 층(21) 외면에 코팅되고 음이온성 층(22)을 형성하는 응용분자(20)을 형성하는 (-)전하를 띠는 답즙산 또는 답즙산 유도체가 공유 결합한 음이온성 분자;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머기반 입자 및 이의 제조방법.aptamer drugs (AM);
cationic molecules that come into contact with the AM and condense the AM through electrostatic interaction to form a complex, elementary particles (10); and
anionic molecules coated on the outer surface of the formed complex layer 21 and covalently bonded to bile acids or bile acid derivatives having a negative charge to form an application molecule 20 forming the anionic layer 22;
Aptamer-based particles and a method for producing the same, comprising a. 제31항 내지 제36항에 있어서, 적절한 크기의 상기 입자를 제조하기 위해
초음파분사기(sonicator) 및 압출기(extruder)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 압타머기반 입자의 제조방법.37. A method according to any of claims 31 to 36, for preparing said particles of an appropriate size.
A method for producing aptamer-based particles, characterized in that at least one selected from the group consisting of a sonicator and an extruder is used. 압타머 약물(AM);
아크릴아미드로 변형된 프로타민(mPS); 및
아크릴레이트 그룹으로 변형된 히알루론산(mHA);
을 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.aptamer drugs (AM);
protamine (mPS) modified with acrylamide; and
hyaluronic acid (mHA) modified with an acrylate group;
Aptamer-based particles and a method for producing the same, comprising a. 제38항에 있어서,
상기 압타머 약물(AM) 및 상기 mPS를 포함하는 조성물을 접촉시키고, 정전기적 상호작용으로 상기 AM을 응축시켜 복합체(21)를 형성하는 단계; 및
상기 형성된 복합체에 상기 mHA를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 분자를 교반하면서 glycerol dimethacrylate(GDA)를 첨가하고 라디칼 중합을 하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머기반 입자의 제조방법.39. The method of claim 38,
contacting the composition comprising the aptamer drug (AM) and the mPS, and condensing the AM by electrostatic interaction to form a complex 21; and
adding glycerol dimethacrylate (GDA) to the outer surface of the particle while stirring the anionic molecule by adding the mHA to the formed complex and performing radical polymerization;
A method of producing an aptamer-based particle comprising a. 제1항 내지 제39항에 있어서,
상기 음이온성 분자에 표적화 분자를 공유결합하는 능동적 약물 전달체를 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.40. The method according to any one of claims 1 to 39,
An aptamer-based particle and a method for preparing the same, characterized in that an active drug delivery system for covalently binding the targeting molecule to the anionic molecule. 제40항에 있어서,
상기 표적화 분자는 압타머, 펩타이드, 항체, 단백질, 탄수화물 및 화합물로 구성된 군에서 세포막에 특이적으로 결합하는 어느 하나 이상을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.41. The method of claim 40,
The targeting molecule is an aptamer-based particle, characterized in that any one or more specifically binding to a cell membrane from the group consisting of an aptamer, a peptide, an antibody, a protein, a carbohydrate, and a compound, and a method for producing the same. 약학적 유효성분을 구성성분으로 하는 압타머를 포함하는 압타머 약물(SAM); 및
상기 SAM과 접촉하여 정전기적 상호작용으로 상기 SAM을 응축시켜 복합체, 기본입자(10)를 형성하는 양이온성 분자;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머 기반 입자 및 이의 제조방법.Aptamer drug (SAM) comprising an aptamer comprising a pharmaceutical active ingredient as a component; and
cationic molecules that come into contact with the SAM and condense the SAM through electrostatic interaction to form a complex, basic particles (10);
Aptamer-based particles and a method for producing the same, comprising a. 제42항에 있어서,
상기 SAM을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 SAM 및 양이온성 분자를 접촉시키고, 정전기적 상호작용으로 상기 SAM을 응축시켜 기본입자(10)를 형성하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 압타머기반 입자의 제조방법.43. The method of claim 42,
preparing the SAM; and
contacting the prepared SAM and cationic molecules, and condensing the SAM through electrostatic interaction to form basic particles (10);
A method of producing an aptamer-based particle comprising a. 제43항에 있어서,
상기 SAM과 상기 양이온성 분자의 전하 비율(charge ratio)이 1:0.4 이상으로 제조하는 것을 특징으로 하는 압타머기반 입자의 제조방법.44. The method of claim 43,
A method of producing an aptamer-based particle, characterized in that the SAM and the charge ratio of the cationic molecule is 1:0.4 or more. 제1항 내지 제44항에 있어서,
상기 압타머기반 입자의 치료적 유효량을 개체에게 투여하고, 이에 의해 암을 치료하는 과정을 포함하는 이를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법.45. The method of any one of claims 1-44,
A method of treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the aptamer-based particles, thereby treating the cancer. 제1항 내지 제45항에 있어서, 상기 압타머 약물(AM)은
주사제, 크림 및 구강 점막 투여로 이루어진 군에서 선택된 1종을 특징으로 하는 약학적 조성물.46. The method of claim 1-45, wherein the aptamer drug (AM) is
A pharmaceutical composition, characterized in that one selected from the group consisting of injections, creams, and oral mucosal administration.
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