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KR20220097414A - X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략 - Google Patents

X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략 Download PDF

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KR20220097414A
KR20220097414A KR1020227016494A KR20227016494A KR20220097414A KR 20220097414 A KR20220097414 A KR 20220097414A KR 1020227016494 A KR1020227016494 A KR 1020227016494A KR 20227016494 A KR20227016494 A KR 20227016494A KR 20220097414 A KR20220097414 A KR 20220097414A
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KR
South Korea
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nucleic acid
acid construct
protein
cell
sequence
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Application number
KR1020227016494A
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English (en)
Inventor
찰린 헌트
양 리우
궈춘 공
카멜로 로마노
브라이언 잠브로비츠
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

레티노스키신(retinoschisin) 코딩 서열의 삽입 및/또는 발현을 가능하게 하는 핵산 작제물 및 조성물이 제공된다. RS1 좌위(loci)를 표적화하는 뉴클레아제 제제가 제공된다. 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및/또는 세포에서의 발현을 위해 이러한 작제물을 사용하는 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물을 사용하여 X-연관 연소 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis)를 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 CRISPR 및 AAV 전략
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 11월 8일에 출원된 미국 출원 62/932,608호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조로서 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 694232SEQLIST.txt로 작성된 서열 목록은 1.22 메가바이트 크기이고, 2020년 11월 6일에 생성되고, 본 명세서에 참조로서 포함된다.
RS1 유전자는 망막의 세포성 구조화에 관여하는 고도로 보존된 세포외 단백질을 인코딩한다. 이는 광수용기(photoreceptor) 및 양극 세포(bipolar cell)로부터 동종-올리고머성(homo-oligomeric) 단백질 복합체로서 조립되고 분비된다. 200개 초과의 돌연변이가 RS1에서 검출되었고, 많은 것들이 비기능성(non-functional) 단백질 또는 단백질 분비의 존재로 인해 황반 변성(macular degeneration)의 조기 발병(early onset)을 유발한다. 기능성 Rs1 발현의 결여는 망막층 내에서 층간분리(schisis)를 야기하여, X-연관 연소 망막층간분리(XLRS: X-linked juvenile retinoschisis)와 관련된 조기의 진행성 시력 상실을 유발한다. XLRS에 대한 유전자 치료법 임상 시험이 존재하긴 하였지만, 이러한 시험은 그 종점을 충족시키지 못했다. XLRS를 치료하기 위해 새로운 전략이 필요하다.
표적 게놈 좌위, 예컨대 내인성 RS1 좌위 내로의 레티노스키신(retinoschisin) 코딩 서열의 삽입 및/또는 레티노스키신 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 핵산 작제물 및 조성물이 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및/또는 세포에서의 발현 방법에 또는 X-연관 연소 망막층간분리를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
일 양태에서, 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 양방향성 핵산 작제물이 제공된다. 일부 이러한 핵산 작제물은: (a) 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 제1 코딩 서열을 포함하는 제1 분절(segment); 및 (b) 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 제2 코딩 서열의 역보체(reverse complement)를 포함하는 제2 분절을 포함한다. 일부 이러한 작제물에서, 제2 분절은 제1 분절의 3'(즉, 다운스트림)에 위치한다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이거나, 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이거나, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 둘 다 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 이러한 작제물에서, 제1 코딩 서열은 상보적 DNA(cDNA)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제2 코딩 서열은 cDNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 cDNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 제1 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체(degenerate variant)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제2 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'(즉, 업스트림)에 위치하는 인간 RS1의 제1 인트론의 단편 또는 일부를 포함하고/하거나 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'(즉, 다운스트림)에 위치하는 인간 RS1의 제2 인트론의 단편 또는 일부의 역보체를 포함한다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 동일하다. 일부 이러한 작제물에서, 제2 코딩 서열은 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택한다. 일부 이러한 작제물에서, 제2 분절은 제1 분절과 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 99%의 상보성을 갖는다. 일부 이러한 작제물에서, 제2 분절은 제1 분절과 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 약 95% 미만, 약 97% 미만, 또는 약 99% 미만의 상보성을 갖는다. 일부 이러한 작제물에서, 제2 코딩 서열의 역보체는: (a) 제1 코딩 서열과 실질적으로 상보적이지 않거나; (b) 제1 코딩 서열의 단편과 실질적으로 상보적이지 않거나; (c) 제1 코딩 서열과 고도로 상보적이거나; (d) 제1 코딩 서열의 단편과 고도로 상보적이거나; (e) 제1 코딩 서열의 역보체와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 동일하거나; (f) 제1 코딩 서열의 역보체와 약 50% 내지 약 80% 동일하거나; (g) 제1 코딩 서열의 역보체와 약 60% 내지 약 100% 동일하다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 분절은 링커에 의해 제2 분절에 연결된다. 선택적으로, 링커는 약 5 내지 약 2000개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치하는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치하는 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함한다. 선택적으로, 제1 폴리아데닐화 신호 서열은 제2 폴리아데닐화 신호 서열과 상이하다.
일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치하는 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함한다. 선택적으로, 제1 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것이거나, 제2 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것이거나, 제1 스플라이스 수용기 부위와 제2 스플라이스 수용기 부위는 둘 다 RS1 유전자로부터의 것이다. 선택적으로, 제1 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것이거나, 제2 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것이거나, 제1 수용기 부위와 제2 스플라이스 수용기 부위는 둘 다 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것이다.
일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 단일-가닥이다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 이중-가닥이다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 DNA를 포함한다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되거나, 제2 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 하기 말단 구조: 헤어핀, 루프, 역 말단 반복부(ITR), 또는 원환체 중 하나 이상을 포함한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 ITR을 포함한다.
일부 이러한 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 및/또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 제1 코딩 서열 및/또는 제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 제1 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 46 또는 47과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 작제물에서, 제2 분절은 제1 분절의 3'에 위치하며, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 둘 다 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 동일하며, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하고, 제2 코딩 서열은 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택하며, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치한 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치한 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함하며, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치한 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함하며, 핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 양방향성 핵산 작제물을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 이러한 벡터는 바이러스 벡터이다. 선택적으로, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 선택적으로, AAV는 단일-가닥 게놈(ssAAV)을 포함한다. 선택적으로, AAV는 자기-상보성 게놈(scAAV)을 포함한다. 선택적으로, AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 이러한 벡터는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 벡터는 상동성 아암을 포함하지 않는다. 일부 이러한 벡터는 상동성 아암을 포함한다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 양방향성 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 양방향성 핵산 작제물을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 이러한 세포는 시험관내에 존재한다. 일부 이러한 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 세포는 포유류 세포이다. 일부 이러한 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 세포는 망막 세포이다.
일부 이러한 세포는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현한다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합된다. 일부 이러한 세포에서, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위이다. 선택적으로, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합된다. 선택적으로, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물의 제1 코딩 서열 또는 제2 코딩 서열 내로 스플라이스된다. 선택적으로, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다.
일부 이러한 세포에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시킨다.
또 다른 양태에서, 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 핵산 작제물이 제공된다. 일부 이러한 핵산 작제물은 각각의 측면(side) 상에서 뉴클레아제 제제에 대한 뉴클레아제 표적 서열에 의해 플랭킹된 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함한다. 또한, 표적 좌위와의 상동성 재조합을 위한 핵산 작제물이 제공된다. 일부 이러한 핵산 작제물은 각각의 측면 상에서 상동성 아암에 의해 플랭킹된 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하며, 선택적으로 상기 코딩 서열 및 상동성 아암은 각각의 측면 상에서 뉴클레아제 제제에 대한 표적 서열에 의해 추가로 플랭킹된다. 선택적으로, 각각의 상동성 아암은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이이다.
상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 뉴클레아제 표적 서열과 동일하고, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질(reform)된다.
일부 이러한 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 이러한 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 상보적 DNA(cDNA)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 인간 RS1의 제1 인트론의 단편 또는 일부를 포함한다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함한다. 선택적으로, 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것이다. 선택적으로, 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1의 인트론 1로부터의 것이다.
일부 이러한 작제물은 단일-가닥이다. 일부 이러한 작제물은 이중-가닥이다. 일부 이러한 작제물은 DNA를 포함한다. 일부 이러한 작제물에서, 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
일부 이러한 작제물에서, 작제물은 하기 말단 구조: 헤어핀, 루프, 역 말단 반복부(ITR), 또는 원환체 중 하나 이상을 포함한다. 선택적으로, 코딩 서열 및 뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 핵산 작제물은 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 이러한 작제물에서, 뉴클레아제 제제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA이고, 뉴클레아제 표적 서열은 가이드 RNA 표적 서열이다. 선택적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 역전(inverted) 가이드 RNA 표적 서열이다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9이다.
일부 이러한 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 45와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 핵산 작제물이며, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하며, 핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며, 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 뉴클레아제 표적 서열과 동일하며, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다.
일부 이러한 작제물에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위와의 상동성 재조합을 위한 핵산 작제물이며, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하며, 핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고, 핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며, 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 각각의 상동성 아암은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이이다.
또 다른 양태에서, 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 임의의 상기 핵산 작제물을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 이러한 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 이러한 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 선택적으로, AAV는 단일-가닥 게놈(ssAAV)을 포함한다. 선택적으로, AAV는 자기-상보성 게놈(scAAV)을 포함한다. 선택적으로, AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 이러한 벡터에서, 벡터는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 이러한 벡터에서, 벡터는 상동성 아암을 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 임의의 상기 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자가 제공된다.
또 다른 양태에서, 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 임의의 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 이러한 세포는 시험관내에 존재한다. 일부 이러한 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 세포는 포유류 세포이다. 일부 이러한 세포는 인간 세포이다. 일부 이러한 세포는 망막 세포이다.
일부 이러한 세포에서, 세포는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현한다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합된다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위이다. 선택적으로, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합된다. 선택적으로, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스된다. 선택적으로, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다.
일부 이러한 세포에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시킨다.
또 다른 양태에서, 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 데 사용하기 위한 또는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합하는 데 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 이러한 조성물은: (a) 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 이러한 조성물은: (a) 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 임의의 상기 핵산 작제물; 및 (b)뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열과 동일하다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다.
일부 이러한 조성물은: (a) 임의의 상기 양방향성 핵산 작제물; 및 (b) 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 이러한 조성물에서, 표적 게놈 좌위는 RS1 유전자에 존재한다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 세포에서 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다.
일부 이러한 조성물에서, 뉴클레아제 제제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA이고, 뉴클레아제 표적 서열은 가이드 RNA 표적 서열이다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9이다. 선택적으로, 조성물은 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA를 포함한다. 선택적으로, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 지질 나노입자에 존재한다. 선택적으로, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 하나 이상의 바이러스 벡터에 존재한다. 선택적으로, 하나 이상의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터이다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 단일 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 존재한다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 바이러스 벡터(예를 들어, 별개의 AAV 벡터)에 존재한다.
일부 이러한 조성물에서, 핵산 작제물은 바이러스 벡터에 존재한다. 선택적으로, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터이다. 선택적으로, AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 가이드 RNA는 RS1 유전자 내 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 분절을 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 선택적으로, Cas 단백질은 스트렙토콕커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질로부터 유래된다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 단백질 형태의 Cas 단백질을 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 선택적으로 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 선택적으로, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하며, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 하나 이상의 바이러스 벡터에 존재한다. 선택적으로, 하나 이상의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터이다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 단일 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 존재한다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 바이러스 벡터(예를 들어, 별개의 AAV 벡터)에 존재한다. 선택적으로, AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA를 포함하고, 선택적으로 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA를 포함하고, 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함하며, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 지질 나노입자에 존재한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 변형된 우리딘을 하나 이상의 또는 모든 우리딘 위치에 포함하도록 변형된다. 선택적으로, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 슈도우리딘으로 완전히 치환된다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 폴리(A) 테일을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 SEQ ID NO: 6243 또는 6245로 표시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, Cas 단백질은 SEQ ID NO: 27, 6242, 또는 6246로 표시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론에 존재한다. 선택적으로, 인트론은 RS1 유전자의 제1 인트론이다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, RS1 유전자는 인간 RS1 유전자이다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은: (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 인접 뉴클레오타이드; (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 인접 뉴클레오타이드; (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 인접 뉴클레오타이드; (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 인접 뉴클레오타이드; 또는 (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은: (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하거나; (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하거나; (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하거나; (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하거나; (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은: (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나; (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나; (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나; (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나; 또는 (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음의 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 적어도 하나의 변형은: (i) 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 44의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 선택적으로, 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 33-39 및 53 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA: trans-activating crRNA)를 포함하는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함하는 이중 가이드 RNA(dgRNA)이다. 선택적으로, crRNA는 SEQ ID NO: 29 및 52 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함한다. 선택적으로, tracrRNA는 SEQ ID NO: 30-32 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함한다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 지질 나노입자와 회합되며, 선택적으로 상기 조성물은 가이드 RNA를 포함한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 바이러스 벡터에 존재한다. 일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터이다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 단일 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)에 존재한다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 바이러스 벡터(예를 들어, 별개의 AAV 벡터)에 존재한다. 선택적으로, AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
일부 이러한 조성물 또는 용도용 조성물에서, 조성물은 제2 가이드 RNA 또는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 추가로 포함하며, 제2 가이드 RNA는 RS1 유전자 내 제2 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 분절을 포함하고, 제2 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내 제2 가이드 RNA 표적 서열로 표적화한다.
또한, 임의의 상기 조성물 또는 용도용 조성물을 포함하는 세포가 제공된다. 선택적으로, 세포는 시험관내에 존재한다. 선택적으로, 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 세포는 포유류 세포이다. 선택적으로, 세포는 인간 세포이다. 선택적으로, 세포는 망막 세포이다.
일부 이러한 세포에서, 세포는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현한다. 일부 이러한 세포에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합된다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위이다. 선택적으로, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합된다. 선택적으로, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물의 제1 코딩 서열 또는 제2 코딩 서열 내로 스플라이스된다. 선택적으로, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다.
일부 이러한 세포에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시킨다.
또 다른 양태에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 표적 게놈 좌위 내로 통합하고 세포에서 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 임의의 상기 핵산 작제물, 벡터, 지질 나노입자, 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 세포에서 발현된다. 선택적으로, 세포는 포유류 세포이다. 선택적으로, 세포는 인간 세포이다. 선택적으로, 세포는 망막 세포이다. 선택적으로, 세포는 시험관내에 존재한다. 선택적으로, 세포는 생체내에 존재한다. 선택적으로, 세포는 생체내에서 망막 세포이고, 투여하기에는 망막하 주사 또는 유리체내 주사가 포함된다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 선택적으로, 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산 전에 투여된다. 선택적으로, 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산에 후속하여 투여된다. 선택적으로, 순차적인 투여 사이의 시간은 약 2시간 내지 약 48시간이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동일한 전달 비히클에서 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 상이한 전달 비히클에서 투여된다.
일부 이러한 방법에서, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 유전자에 존재한다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 내인성 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되고, 여기서 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스된다. 선택적으로, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 RS1 좌위로부터의 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다.
또 다른 양태에서, X-연관 연소 망막층간분리를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 임의의 상기 핵산 작제물, 벡터, 지질 나노입자, 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 핵산 작제물은 대상체의 하나 이상의 망막 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 이로부터 발현되고, 치료적 유효 수준의 레티노스키신 발현이 대상체에서 달성된다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 인간이다. 일부 이러한 방법에서, 대상체는 X-연관 연소 망막층간분리와 관련이 있거나 이를 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 내인성 RS1 유전자를 갖는다. 선택적으로, 돌연변이는 R141C 돌연변이이다. 일부 이러한 방법에서, 투여하기에는 망막하 주사 또는 유리체내 주사가 포함된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물의 통합은 망막 구조 복구를 이끈다.
일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동시에 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 선택적으로, 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산 전에 투여된다. 선택적으로, 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산에 후속하여 투여된다. 선택적으로, 순차적인 투여 사이의 시간은 약 2시간 내지 약 48시간이다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동일한 전달 비히클에서 투여된다. 일부 이러한 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 상이한 전달 비히클에서 투여된다.
일부 이러한 방법에서, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 유전자에 존재한다. 선택적으로, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 내인성 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재한다. 선택적으로, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되고, 여기서 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스된다. 선택적으로, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다. 일부 이러한 방법에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 선택적으로, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 RS1 좌위로부터의 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체한다.
또 다른 양태에서, 세포 내 RS1 유전자를 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 이러한 방법은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 상기 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내의 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하며, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 포유류 세포이다. 선택적으로, 세포는 인간 세포이다. 선택적으로, 세포는 망막 세포이다. 선택적으로, 세포는 시험관내에 존재한다. 선택적으로, 세포는 생체내에 존재한다. 일부 이러한 방법에서, 세포는 망막 세포이고, 투여하기에는 망막하 주사 또는 유리체내 주사가 포함된다. 일부 이러한 방법에서, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재한다.
도 1(척도대로 도시되지 않음)은 X-연관 연소 망막층간분리(XLRS)와 관련된 R141C 돌연변이의 장소 및 인간 RS1의 엑손 2 내지 6을 포함하는 핵산 작제물의 삽입 부위를 포함하는 뮤린 Rs1 좌위의 개략도를 도시한다.
도 2는 인간 RS1의 엑손 2 내지 6을 포함하는 핵산 작제물을 마우스 Rs1 좌위의 인트론 1 내로 통합 시 발현되는 마우스 레티노스키신, 인간 레티노스키신, R141C 돌연변이를 갖는 인간 레티노스키신, R141C 돌연변이를 갖는 마우스 레티노스키신, 및 마우스/인간 레티노스키신 하이브리드의 정렬을 도시한다.
도 3a(척도대로 도시되지 않음)는 스플라이스 수용기(A), 인간 RS1의 엑손 2 내지 6, 및 소 성장 호르몬(bGH: bovine growth hormone) polyA를 포함하는 제1 분절 및 SV40 polyA의 역보체, 인간 RS1의 엑손 2 내지 6의 역보체, 및 스플라이스 수용기(A)의 역보체를 포함하는 제2 분절을 포함하는 양방향성 핵산 작제물의 개략도를 도시한다. 양방향성 작제물은 또한, 2개의 인간 RS1 분절 사이에서 뮤린 Rs1 좌위의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함한다. 별모양을 플랭킹하는 수평 화살표는 NGS를 위해 설계된 차세대 표적화된 리시퀀싱(resequencing) 앰플리콘을 나타낸다. 양방향성 ssAAV 작제물은 상단에 도시되어 있고, 양방향성 scAAV 작제물은 하단에 도시되어 있다.
도 3b(척도대로 도시되지 않음)는 스플라이스 수용기(A), 인간 RS1의 엑손 2 내지 6, 및 polyA 서열을 포함하는 상동성-독립적 표적화된 통합 핵산 작제물에 대한 개략도를 도시한다. 작제물은 또한, 인간 RS1 분절의 다운스트림에서 뮤린 Rs1 좌위의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함한다. 별모양을 플랭킹하는 수평 화살표는 NGS를 위해 설계된 차세대 표적화된 리시퀀싱 앰플리콘을 나타낸다.
도 4는 RS1 바이러스 벡터 버전 1, RS1 바이러스 벡터 버전 2, 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 3이 주사된 Rosa Cas9 /+; Rs1 R141C / Y 마우스로부터의 눈에서의 광 간섭 단층촬영(OCT: optical coherence tomography) 스캔에서 도시된 망막강(retinal cavity)의 채점을 도시한다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 1 내지 4개의 강(cavity)이 존재한다면 1의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 ≥ 4개의 강이 존재하지만 이들 강이 융합되지 않는다면 2의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 융합된 강이 존재한다면 3의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 융합된 강이 존재하고 망막이 신전(stretch)된다면 4의 점수를 지정하였다. 각각의 치료군에 대한 평균 점수는, 분산의 비모수 크루스칼-왈리스 일원 분석(nonparametric Kruskal-Wallis one-way analysis) 및 사후 검정 듄즈 다중 비교 검정(Post hoc test Dunn's multiple comparisons test)에 의해, 풀링된 비치료된 눈을 함유하는 대조군과 비교되었다.
도 5는 RS1 바이러스 벡터 버전 1(pssAAV mhRS1-sgu), RS1 바이러스 벡터 버전 2(pscAAV rs1_탠덤), 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 3(pssAAV hRs1_HITI)이 주사된 Rosa Cas9 /+; Rs1 R141C / Y 마우스로부터의 눈에서의 마우스 망막 시료의 NGS 결과를 도시한다. 4개의 예상된 서열 변이체에 대한 판독물 카운트가 도시되어 있다: (1) WT 마우스, R141C 돌연변이체를 함유하지 않는 마우스 기준 서열; (2) 돌연변이체 마우스, R141C 돌연변이체를 갖는 마우스 기준 서열; (3) 인간화 전사물 1, 인간 기준 서열; 및 (4) 인간화 전사물 2, 마우스 코돈-최적화된 인간 기준 서열. 차세대 표적화된 리시퀀싱 앰플리콘은 도 3에 도시된 영역에 대해 설계되었다(수평 화살표). 마우스 망막으로부터의 mRNA는 차세대 시퀀싱(NGS) 앰플리콘에 대한 주형으로서 작용하기 위한 cDNA를 생산하는 데 사용되었다.
도 6a 및 도 6b는 RS1 바이러스 벡터 버전 1(mhRS1-sgu), RS1 바이러스 벡터 버전 2(pscAAV_rs1_탠덤), 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 3(hRs1_cDNA HITI)이 주사된 Rosa Cas9 /+; Rs1 R141C / Y 마우스로부터의 눈에서의 마우스 망막 시료의 NGS 결과를 도시한다. 이들 NGS 결과에 대해, 별개의 앰플리콘은 Rs1 인트론 1 가이드 RNA 표적 서열을 증폭시키는 데 사용되었다. 마우스 기준 서열과 매칭하거나 비-상동성 말단 접합을 함유한 판독물을, 가이드 RNA가 삽입을 만들지 않으면서 절단하는 방법을 평가하기 위해 정량화하였다.
도 7a 내지 도 7c는 RS1 바이러스 벡터 버전 1(pssAAV mhRS1-sgu; 도 7a), RS1 바이러스 벡터 버전 2(pscAAV rs1_탠덤; 도 7b), 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 3(pssAAV hRs1_HITI; 도 7c)이 주사된 Rosa Cas9 /+; Rs1 R141C / Y 마우스로부터의 눈에서의 마우스 망막 시료의 NGS 결과를 도시한다. 4개의 예상된 서열 변이체에 대한 판독물 카운트가 도시되어 있다: (1) WT 마우스, R141C 돌연변이체를 함유하지 않는 마우스 기준 서열; (2) 돌연변이체 마우스, R141C 돌연변이체를 갖는 마우스 기준 서열; (3) 인간화 전사물 1, 인간 기준 서열; 및 (4) 인간화 전사물 2, 마우스 코돈-최적화된 인간 기준 서열. 차세대 표적화된 리시퀀싱 앰플리콘은 도 3에 도시된 영역에 대해 설계되었다(수평 화살표). 마우스 망막으로부터의 mRNA는 차세대 시퀀싱(NGS) 앰플리콘에 대한 주형으로서 작용하기 위한 cDNA를 생산하는 데 사용되었다. 마우스 기준 서열과 매칭하거나 비-상동성 말단 접합을 함유한 판독물을, 가이드 RNA가 삽입을 만들지 않으면서 절단하는 방법을 평가하기 위해 정량화하였다.
도 8a 및 도 8b는 인간 RS1 인트론 1로 표적화된 Cas9 mRNA 및 6개의 가이드 RNA 중 하나와 함께 제형화된 지질 나노입자로 처리하기 전 2시간째에 RS1 바이러스 벡터 버전 1(pssAAV mhRS1-sgu; 도 8a) 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 2(pscAAV rs1_탠덤; 도 8b)로 처리된 인간 망막아종(retinoblastoma) 세포로부터의 RT-qPCR 결과를 도시한다. 델타 Ct 값이 도시되어 있다(숫자가 낮을수록, 발현은 더 높음). "Ho"는 인간 기준 서열을 지칭하고, "Mo"는 마우스 발현을 위해 코돈-최적화된 인간 기준 서열을 지칭한다.
도 9a 및 도 9b는 인간 RS1 인트론 1로 표적화된 Cas9 mRNA 및 6개의 가이드 RNA 중 하나와 함께 제형화된 지질 나노입자로 처리한 후 2시간째에 RS1 바이러스 벡터 버전 1(pssAAV mhRS1-sgu; 도 9a) 또는 RS1 바이러스 벡터 버전 2(pscAAV rs1_탠덤; 도 9b)로 처리된 인간 망막아종 세포로부터의 RT-qPCR 결과를 도시한다. 델타 Ct 값이 도시되어 있다(숫자가 낮을수록, 발현은 더 높음). "Ho"는 인간 기준 서열을 지칭하고, "Mo"는 마우스 발현을 위해 코돈-최적화된 인간 기준 서열을 지칭한다.
도 10은 스플라이스 수용기(A), 인간 RS1의 엑손 2 내지 6, 및 polyA 서열을 포함하는 상동성 재조합을 위한 핵산 작제물에 대한 개략도를 도시한다. 작제물은 또한, 인간 RS1 분절의 다운스트림에서 뮤린 Rs1 좌위의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 U6 프로모터를 포함한다. 작제물은 또한 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암(HA)을 포함한다. 별모양을 플랭킹하는 수평 화살표는 NGS를 위해 설계된 차세대 표적화된 리시퀀싱 앰플리콘을 나타낸다.
정의
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어인 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 코딩된 및 비-코딩된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 비롯한 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 상기 용어들은 또한 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드와 같은 변형된 중합체를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정 기능 또는 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 파트를 지칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어인 "핵산", 및 "폴리뉴클레오타이드"는, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 또는 변형된 버전을 비롯한 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 이들은, 단일 가닥, 이중 가닥 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
용어 "게놈적으로 통합된"은, 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈 내로 통합되도록 세포 내로 도입된 핵산을 지칭한다. 임의의 프로토콜은 핵산을 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입하는 데 사용될 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물" 또는 "발현 카세트"는 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 요망되는 코딩 서열을 함유하는 재조합 핵산을 지칭한다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 통상, 프로모터, 오퍼레이터(선택적임), 및 리보솜 결합 부위, 뿐만 아니라 다른 서열을 포함한다. 진핵생물 세포는 일반적으로, 프로모터, 인핸서, 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있지만, 필요한 발현을 희생시키지 않으면서 일부 요소는 결실되고 다른 요소는 첨가될 수 있다.
용어 "바이러스 벡터"는, 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로의 포장(packaging)에 충분하거나 이를 허용하는 요소를 포함하는 재조합 핵산을 지칭한다. 벡터 및/또는 입자는 DNA, RNA, 또는 다른 핵산을 생체외에서 또는 생체내에서 세포 내로 이전시키는 목적에 이용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 알려져 있다.
단백질, 핵산, 및 세포에 관하여 용어 "단리된"은, 상기 단백질, 핵산, 또는 세포의 실질적으로 순수한 조제물까지 그리고 이를 포함하여, 인 시추에서(in situ) 통상 존재할 수 있는 다른 세포 또는 유기체 성분에 관하여 상대적으로 정제된 단백질, 핵산, 및 세포를 포함한다. 용어 "단리된"은, 어떠한 천연 발생 대응물(counterpart)이 없는 세포, 단백질, 및 핵산, 또는 화학적으로 합성되었고 따라서 다른 단백질 또는 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않는 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 용어 "단리된"은, 이들이 천연적으로 수반하는 대부분의 다른 세포성 성분 또는 유기체 성분으로부터 분리 또는 정제되었던 단백질, 핵산, 또는 세포(예를 들어, 다른 세포성 단백질, 핵산, 또는 세포성 또는 세포외 성분으로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.
용어 "야생형"은 정상(돌연변이체, 질환에 걸린(diseased), 변경된 등과 대조적임) 상태 또는 맥락에서 확인된 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 실체(entity)를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 종종 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다.
용어 "내인성 서열"은 세포 또는 동물 내에서 천연적으로 발생하는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 동물의 내인성 RS1 서열은 동물 내 RS1 좌위에서 천연적으로 발생하는 네이티브 RS1 서열을 지칭한다.
"외인성" 분자 또는 서열은 통상 해당 형태로는 세포에 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상적인 존재는, 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련된 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은 예를 들어, 세포 내의 상응하는 내인성 서열의 돌연변이화된 버전, 예컨대 내인성 서열의 인간화 버전을 포함할 수 있거나, 세포 내의 내인성 서열에 상응하지만 상이한 형태로(즉, 염색체 내에 있지 않음) 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 대조적으로, 내인성 분자 또는 서열은, 특정 환경 조건 하에 특정 발단 단계에서 특정 세포에서 해당 형태로 통상 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
용어 "이종성"은 핵산 또는 단백질의 맥락에서 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 동일한 분자에서 함께 천연적으로 발생하지 않는 적어도 2개의 분절을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 용어 "이종성"은 핵산의 분절 또는 단백질의 분절과 관련하여 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 자연상에서 서로(예를 들어, 함께 접합된) 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위-서열을 포함함을 나타낸다. 일례로, 핵산 벡터의 "이종성" 영역은, 자연상에서 다른 분자와 회합되어 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 벡터의 이종성 영역은, 자연상에서 코딩 서열과 회합되어 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹되는 코딩 서열을 포함할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 단백질의 "이종성" 영역은, 자연상에서 다른 펩타이드 분자(예를 들어, 융합 단백질, 또는 태그를 가진 단백질)와 회합되어 발견되지 않는 또 다른 펩타이드 분자 내에 있거나 이에 부착된 아미노산의 분절이다. 유사하게는, 핵산 또는 단백질은 이종성 표지 또는 이종성 분비 또는 위치 서열을 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는, 아미노산을 명시하는 3-염기 쌍 코돈 조합의 다중도(multiplicity)에 의해 나타난 바와 같이 코돈의 축퇴성(degeneracy)을 이용하고, 일반적으로 네이티브 아미노산 서열을 유지하는 한편 네이티브 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 특정 숙주 세포에서 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 인코딩하는 핵산은 천연 발생 핵산 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하여 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 코돈 사용빈도(codon usage) 표는 일반적으로 예를 들어, "코돈 사용빈도 데이터베이스"에서 입수 가능하다. 이들 표는 수많은 방식으로 개량될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Nakamura 등 (2000) Nucleic Acids Research 28:292]를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화에 대한 컴퓨터 알고리즘이 또한 입수 가능하다(예를 들어, Gene Forge 참조).
용어 "좌위"는 유기체의 게놈의 염색체 상의 유전자(또는 유의한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-인코딩 서열, 또는 장소의 특정 위치를 지칭한다. 예를 들어, "RS1 좌위"는, 이러한 서열이 체류하는 곳으로서 식별되었던 유기체의 게놈의 염색체 상의 RS1 유전자, RS1 DNA 서열, 레티노쉬신(retinoschisin)-인코딩 서열, 또는 RS1 장소의 특정 위치를 지칭할 수 있다. "RS1 좌위"는 예를 들어, 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR), 또는 이들의 조합을 포함하여 RS1 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는, 천연적으로 존재한다면, 적어도 하나의 코딩 영역 및 적어도 하나의 비-코딩 영역을 함유할 수 있는 염색체 내의 DNA 서열을 지칭한다. 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물이나 이로 제한되지 않음)을 코딩하는 염색체 내의 DNA 서열은, 유전자가 전장 mRNA(5' 및 3' 비번역 서열을 포함함)에 상응하도록 5' 단부와 3' 단부 둘 다 상의 코딩 영역에 인접하게 위치한 비-코딩 인트론 및 서열이 개재되어 있는(interrupted) 코딩 영역을 포함할 수 있다. 추가로, 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위이나 이로 제한되지 않음), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site), 사일런서(silencer), 인설레이션 서열(insulating sequence), 및 기질 부착 영역(matrix attachment region)을 포함한 다른 비-코딩 서열이 유전자에 존재할 수 있다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 근접해(예를 들어, 10 kb 내에 있으나 이로 제한되지 않음) 있거나 원거리 부위에 있을 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이체 형태를 지칭한다. 일부 유전자는 여러 가지 상이한 형태를 갖고, 이는 염색체 상의 동일한 위치 또는 유전자 좌위에 위치한다. 이배체(diploid) 유기체는 각각의 유전자 좌위에 2개의 대립유전자를 갖는다. 대립유전자의 각각의 쌍은 특정 유전자 좌위의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은, 특정 좌위에 2개의 동일한 대립유전자가 존재한다면 동형접합성(homozygous)으로서 기재되고, 2개의 대립유전자가 상이하다면 이형접합성(heterozygous)으로서 기재된다.
"프로모터"는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 폴리머라제 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 통상적으로 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는, 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에 개시된 하나 이상의 세포 유형(예를 들어, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능성 세포, 1-세포 단계(one-cell stage) 배아, 분화된 세포, 또는 이들의 조합)에서 활성적일 수 있다. 프로모터는 예를 들어, 구성적 활성(constitutively active) 프로모터, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 시간적 제약(temporally restricted) 프로모터(예를 들어, 발달적 조절(developmentally regulated) 프로모터), 또는 공간적 제약(spatially restricted) 프로모터(예를 들어, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는 예를 들어, 국제공개 WO 2013/176772호에서 확인할 수 있으며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
구성적 프로모터는 모든 조직 또는 모든 발달기(developing stage)에 있는 특정 조직에서 활성인 프로모터이다. 구성적 프로모터의 예는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(hCMV: human cytomegalovirus immediate early), 마우스 사이토메갈로바이러스 즉시 초기(mCMV: mouse cytomegalovirus immediate early), 인간 신장 인자 1 알파(hEF1α), 마우스 신장 인자 1 알파(mEF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 닭 베타 액틴 하이브리드(CAG 또는 CBh), SV40 초기, 및 베타 2 튜불린 프로모터를 포함한다.
유도적 프로모터의 예는 예를 들어, 화학적으로 조절된 프로모터 및 물리적으로-조절된 프로모터를 포함한다. 화학적으로 조절된 프로모터는 예를 들어, 알코올-조절된 프로모터(예를 들어, 알코올 데하이드로게나제(alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절된 프로모터(예를 들어, 테트라사이클린-반응적 프로모터, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO), tet-On 프로모터, 또는 tet-Off 프로모터), 스테로이드 조절된 프로모터(예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체의 프로모터, 또는 엑디손 수용체의 프로모터), 또는 금속-조절된 프로모터(예를 들어, 메탈로단백질 프로모터)를 포함한다. 물리적으로 조절된 프로모터는 예를 들어 온도-조절된 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터) 및 광(light)-조절된 프로모터(예를 들어, 광-유도적 프로모터 또는 광-억제적 프로모터)를 포함한다.
조직-특이적 프로모터는 예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터, 신경교(glia)-특이적 프로모터, 근육 세포-특이적 프로모터, 심장 세포-특이적 프로모터, 신장 세포-특이적 프로모터, 골 세포(bone cell)-특이적 프로모터, 내피 세포-특이적 프로모터, 또는 면역 세포-특이적 프로모터(예를 들어, B 세포 프로모터 또는 T 세포 프로모터)일 수 있다.
발달적으로 조절된 프로모터는 예를 들어, 발달의 배아기 동안 또는 성체 세포에서만 활성인 프로모터를 포함한다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 성분 둘 다 정상적으로 작용하고 상기 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 가능하게 하는 2개 이상의 성분(예를 들어, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면, 상기 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능한 연결부는 서로 인접하거나 트랜스로 작용하는 이러한 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 거리를 두고 작용할 수 있음).
핵산의 "상보성"은, 핵산의 하나의 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 이의 핵염기(nucleobase) 그룹의 배향으로 인해, 반대 핵산 가닥 상의 또 다른 서열과 수소 결합을 형성함을 의미한다. DNA 내 상보적 염기는 전형적으로 A와 T 그리고 C와 G이다. RNA에서, 이들은 전형적으로 C와 G 그리고 U와 A이다. 상보성은 완벽하거나 실질적/충분할 수 있다. 2개 핵산 사이의 완벽한 상보성은, 2개 핵산이 듀플렉스를 형성할 수 있고 상기 듀플렉스 내 모든 염기가 왓슨-크릭 쌍형성(pairing)에 의해 상보적 염기에 결합됨을 의미한다. "실질적인" 또는 "충분한" 상보성은, 하나의 가닥의 서열이 반대 가닥의 서열에 완전히 및/또는 완벽히 상보적이지 않지만, 2개 가닥 상의 염기 사이에서 충분한 결합이 발생하여 혼성화 조건의 세트(예를 들어, 염 농도 및 온도)에서 안정한 하이브리드 복합체를 형성함을 의미한다. 이러한 조건은, 혼성화된 가닥의 Tm(용융 온도)을 예측하기 위해 서열 및 표준 수학적 계산을 사용함으로써, 또는 일상적인 방법을 사용함으로써 Tm의 경험적 결정에 의해 예측될 수 있다. Tm은, 2개의 핵산 가닥 사이에서 형성된 혼성화 복합체의 집단이 50% 변성되는 온도를 포함한다(즉, 이중-가닥 핵산 분자의 집단은 절반이 단일 가닥으로 해리됨). Tm 미만의 온도에서, 혼성화 복합체의 형성이 선호되는 반면, Tm 초과의 온도에서, 혼성화 복합체의 가닥의 용융 또는 분리가 선호된다. Tm은 수성 1 M NaCl 용액에서 기지의 G+C 함량을 갖는 핵산에 대해 예를 들어, Tm=81.5+0.41(% G+C)을 사용함으로써 추정될 수 있지만, 다른 기지의 Tm 컴퓨터화(computation)는 핵산 구조적 특징을 고려한다.
혼성화는 2개의 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것으로 필요로 하지만, 염기 사이의 미스매치는 가능하다. 2개의 핵산 사이의 혼성화에 적절한 조건은 핵산의 길이 및 상보적 정도에 의존하고, 이에 대한 변수는 잘 알려져 있다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 상보적 정도가 클수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 용융 온도(Tm)의 값이 커진다. 상보성의 짧은 신전부(stretch)(예를 들어, 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 22개 이하, 20개 이하, 또는 18개 이하의 뉴클레오타이드에 걸친 상보성)를 갖는 핵산 사이의 혼성화에 대해, 미스매치의 장소가 중요해진다(상기 문헌[Sambrook 등, 11.7-11.8] 참조). 전형적으로, 혼성화 가능한 핵산에 대한 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오타이드이다. 혼성화 가능한 핵산에 예시적인 최소 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개 뉴클레오타이드, 적어도 약 22개 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개 뉴클레오타이드, 및 적어도 약 30개 뉴클레오타이드를 포함한다. 더욱이, 온도 및 세척액 염 농도는 상보성 영역 및 상보성 정도(degree)와 같은 인자에 따라 필요한 대로 조정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화 가능한 이의 표적 핵산과 100% 상보적일 필요는 없다. 더욱이, 폴리뉴클레오타이드는, 개입 또는 인접 분절이 혼성화 사건(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA)는, 이것이 표적화되는 표적 핵산 서열 내 표적 영역에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개 뉴클레오타이드 중 18개가 표적 영역에 상보적이고 따라서 특이적으로 혼성화할 gRNA는 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이 예에서, 잔여 비상보적 뉴클레오타이드는 상보적 뉴클레오타이드와 군집화되거나(clustered) 개재될(interspersed) 수 있으며, 서로에 또는 상보적 뉴클레오타이드에 인접할 필요는 없을 수 있다.
핵산 내의 핵산 서열의 특정 신전부 사이의 상보성 백분율은, 스미스 및 워터맨(Smith and Waterman)의 알고리즘을 사용하는 디폴트 설정(default setting)을 사용하는 BLAST 프로그램(베이직 로컬 정렬 검색 툴(basic local alignment search tools)) 및 PowerBLAST 프로그램(문헌[Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Zhang 및 Madden (1997) Genome Res. 7:649-656])을 사용하거나 갭 프로그램(Gap program)(유닉스에 대한 위스콘신 서열 분석 패키지, 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)을 사용함으로써 일상적으로 결정될 수 있다(문헌[Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489]).
본원에 제공된 방법 및 조성물은 여러 가지 상이한 성분을 이용한다. 상세한 설명 전반에 걸쳐 일부 성분은 활성 변이체 및 단편을 가질 수 있다. 이러한 성분은 예를 들어, Cas 단백질, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 가이드 RNA를 포함한다. 이들 성분 각각에 대한 생물학적 활성은 본원 어디에서나 기재되어 있다. 용어 "기능적"은, 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 단백질 또는 핵산(또는 이의 단편 또는 변이체)의 선천적인(innate) 능력을 지칭한다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은 예를 들어, 가이드 RNA 및 표적 DNA 서열에 결합하는 Cas 단백질의 능력을 포함할 수 있다. 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 기능은 원래의 분자와의 비교에서 동일할 수 있거나 사실상 분자의 기본적인 생물학적 기능의 보유에 대해서를 제외하고는 변할 수 있다(예를 들어, 이의 특이성 또는 선택성 또는 효능에 관하여).
용어 "변이체"는, 집단에 가장 우세한(prevalent) 서열과 상이한(예를 들어, 1개 뉴클레오타이드만큼) 뉴클레오타이드 서열 또는 집단에 가장 우세한 서열과 상이한(예를 들어, 1개 아미노산만큼) 단백질 서열을 지칭한다.
용어 "단편"은 단백질을 지칭할 때, 전장 단백질보다 더 짧거나 이보다 더 적은 수의 아미노산을 갖는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 지칭할 때, 전장 핵산보다 더 짧거나 이보다 더 적은 수의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산을 의미한다. 단편은 예를 들어, 단백질 단편을 지칭할 때, N-말단 단편(즉, 단백질의 C-말단 단부 중 일부의 제거), C-말단 단편(즉, 단백질의 N-말단 단부 중 일부의 제거), 또는 내부 단편(즉, 단백질의 내부 부분 중 일부의 제거)일 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 범위(comparison window)에 걸쳐 최대 상응도(correspondence)를 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되므로 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 서열이 보존적 치환에 있어 달라질 때, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 성질에 대해 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 달라지는 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이러한 조정을 수행하는 수단은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이는 보존적 치환을 완전 미스매치(full mismatch)가 아닌 부분 미스매치로서 채점(scoring)하여, 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것을 수반한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비-보존적 치환에 0의 점수가 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 채점은, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California)에서 구현된 바와 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열(완벽하게 매칭된 잔기의 최대 수)을 비교함으로써 결정된 값을 포함하고, 상기 비교 범위에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 상기 2개의 서열의 최적 정렬에 대한 기준 서열(첨가 또는 결실(deletion)을 포함하지 않음)과 비교하여 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하며, 상기 매칭된 위치의 수를 비교 범위 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 더 짧은 서열은 연결된 이종성 서열을 포함함), 비교 범위는 비교되는 2개의 서열 중 더 짧은 서열의 전체 길이이다.
달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 하기 매개변수를 사용하는 GAP 버전 10을 사용하여 수득된 값을 포함한다: 50의 GAP 중량 및 3의 길이 중량(Length Weight), 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스(scoring matrix)를 사용한 뉴클레오타이드 서열에 대한 동일성 % 및 유사성 %; 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용한 아미노산 서열에 대한 동일성 % 및 유사성 %; 또는 이와 동등한 임의의 프로그램. "동등한 프로그램"은, 대상이 되는 임의의 2개의 서열에 대하여, GAP 버전 10에 의해 발생된 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 백분율을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 비극성(소수성) 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 또는 류신을 또 다른 비극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는, 아르기닌과 라이신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이의 치환과 같이 하나의 극성(친수성) 잔기를 또 다른 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 추가로, 염기성 잔기, 예컨대 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘을 또 다른 잔기로 치환하는 것, 또는 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산을 또 다른 산성 잔기로 치환하는 것은 보존적 치환의 추가 예이다. 비-보존적 치환의 예는, 극성(친수성) 잔기, 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 라이신을 비극성(소수성) 아미노산 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌으로 치환하는 것 및/또는 비극성 잔기를 극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 전형적인 아미노산 분류는 하기 표 1에 요약되어 있다.
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"상동성" 서열(예를 들어, 핵산 서열)은, 공지된 기준 서열과 동일하거나 실질적으로 유사하여, 상기 공지된 기준 서열과 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 상동성 서열은 예를 들어, 이종상동성(orthologous) 서열 및 동종상동성(paralogous) 서열을 포함할 수 있다. 상동성 유전자는 예를 들어 전형적으로, 종분화(speciation) 사건(이종상동성 유전자) 또는 유전적 중복(duplication) 사건(동종상동성 유전자)을 통해 공통의 조상(ancestral) DNA 서열로부터 계통이 이어진다(descend). "이종상동성" 유전자는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 진화한 상이한 종의 유전자를 포함한다. 이종상동체(ortholog)는 전형적으로, 진화 과정에서 동일한 기능을 보유한다. "동종상동성" 유전자는 게놈 내에서 중복에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 동종상동체(paralog)는 진화의 과정에서 새로운 기능을 진화시킬 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공 환경, 및 인공 환경(예를 들어, 시험관 또는 단리된 세포 또는 세포주) 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체내"는 천연 환경(예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체), 및 천연 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체외"는 개체의 신체로부터 제거되었던 세포, 및 이러한 세포 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 포함한다.
이중-가닥 절단부(DSB: double-strand break)에 반응한 수선은 원칙적으로 2개의 보존된 DNA 수선 경로를 통해 발생한다: 상동성 재조합(HR) 및 비-상동성 말단 접합(NHEJ: non-homologous end joining). 문헌[Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 마찬가지로, 외인성 공여자 핵산에 의해 매개되는 표적 핵산의 수선은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서의 유전적 정보의 임의의 교환 과정을 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서의 유전적 정보의 임의의 교환 과정을 포함하고, 임의의 기전에 의해 발생할 수 있다. 재조합은 상동성 지시 수선(HDR: homology directed repair) 또는 상동성 재조합(HR)을 통해 발생할 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 할 수 있는 핵산 수선 형태를 포함하며, "공여자" 분자를 "표적" 분자(즉, 이중-가닥 절단을 경험하였던 분자)의 수선을 위한 주형으로서 사용하고, 공여자로부터 표적으로의 유전적 정보의 이전을 유발한다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 이전은, 절단된 표적과 공여자 사이에서 형성되는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 보정, 및/또는 표적의 일부가 되게 될 유전적 정보를 재합성하는 데에 공여자가 사용되는 합성-의존적 가닥 어닐링, 및/또는 관련 과정을 수반할 수 있다. 일부 경우, 공여자 폴리뉴클레오타이드, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 부분, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 복사체, 또는 공여자 폴리뉴클레오타이드의 복사체의 일부가 표적 DNA 내로 통합된다. 문헌[Wang 등 (2013) Cell 153:910-918]; 문헌[Mandalos 등 (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9]; 및 문헌[Wang 등 (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532]를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
비-상동성 말단 접합(NHEJ)은, 상동성 주형에 대한 필요성 없이 절단 단부를 서로 또는 외인성 서열에 직접 리게이션함으로써 핵산 내 이중-가닥 절단부를 수선하는 것을 포함한다. NHEJ에 의한 비-인접 서열의 리게이션은 종종, 이중-가닥 절단 부위 부근에서 결실, 삽입 또는 전좌를 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 또한, 외인성 공여자 핵산의 단부와의 절단 단부의 직접 리게이션을 통한 외인성 공여자 핵산의 표적화된 통합(즉, NHEJ-기초 캡처(capture))을 초래할 수 있다. 이러한 NHEJ-매개 표적화된 통합은, 상동성 지시 수선(HDR) 경로가 쉽게 사용 가능하지 않을 때(예를 들어, 비-분열 세포, 1차 세포, 및 상동성-기초 DNA 수선을 불량하게 수행하는 세포에서) 외인성 공여자 핵산의 삽입에 바람직할 수 있다. 게다가, 상동성-지시 수선과는 대조적으로, 절단 부위를 플랭킹하는 서열 동일성의 큰(large) 영역에 관한 지식이 필요하지 않으며, 이는 게놈 서열에 대해 제한된 지식이 존재하는 게놈을 갖는 유기체 내로의 표적화된 삽입을 시도할 때 유리할 수 있다. 통합은 외인성 공여자 핵산과 절단된 게놈 서열 사이에서 평활 단부의 리게이션을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 뉴클레아제 제제에 의해 발생된 것과 양립성(compatible)인 오버행(overhang)에 의해 플랭킹되는 외인성 공여자 핵산을 사용하여 점착성(sticky) 단부(즉, 5' 또는 3' 오버행을 가짐)의 리게이션을 통해 진행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2011/020722호, 국제공개 WO 2014/033644호, WO 2014/089290호, 및 문헌[Maresca 등 (2013) Genome Res. 23(3):539-546]을 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 평활 단부가 리게이션된다면, 단편 접합에 필요한 미세상동성의 영역을 발생시키기 위해 표적 및/또는 공여자 절제가 필요할 수 있으며, 이는 표적 서열에서 원치 않는 변경을 생성시킬 수 있다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는(comprise)" 또는 "포함하는(include)" 조성물은 상기 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다. 과도기적 어구(transitional phrase) "본질적으로 ~로 구성되는"은, 청구항의 범위가 상기 청구항에서 언급된 명시된 요소, 및 청구 발명의 기본적인 그리고 신규 특징(들)에 실제적으로 영향을 미치지 않는 것을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 그러므로, 용어 "본질적으로 ~로 구성되는"은 본 발명의 청구항에서 사용될 때, "포함하는"과 동등한 것으로 해석되고자 하는 것은 아니다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는, 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없으며, 설명은 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 사건 또는 상황이 발생하지 않는 상황을 포함한다는 것을 의미한다.
값의 범위의 표기는 그 범위 내의 또는 그 범위를 정의하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수에 의해 정의되는 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 다르게 분명해지지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값 ± 5를 포괄한다.
용어 "및/또는"은 관련하여 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 그리고 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적으로("또는") 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 지칭하고, 또한 해당 목록의 구성원들의 임의의 조합을 포함한다.
단수형 형태의 관사("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수형 지칭을 포함한다. 예를 들어, 용어 "일 단백질" 또는 "적어도 하나의 단백질"은 복수의 단백질을 이들의 혼합물을 포함하여 포함할 수 있다.
통계학적으로 유의하다는 것은 p ≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
X-연관 연소 망막층간분리(XLRS)는 레티노스키신(RS1)에서의 돌연변이에 의해 야기되는 연소-발병 황반 변성이다. RS1 유전자는 동종-올리고머성 복합체로서 분비되는 24 kDa 디스코이딘-도메인-함유 단백질을 인코딩한다. RS1의 유전자 돌연변이는 비기능성 단백질 또는 단백질 분비의 부재를 유발하며, 이는 망막층 내에서 층간분리 또는 분할을 야기하여 초기의 진행성 시력 상실을 유발한다. RS1 유전자에서 200개 초과의 상이한 돌연변이는 XLRS를 야기하는 것으로 알려져 있다. 40%의 질환-야기 돌연변이는, 전장 레티노스키신 단백질의 부재를 초래하는 것으로 예측되는 넌센스(nonsense) 또는 프레임이동(frameshift) 돌연변이이다. 50%의 질환-야기 돌연변이는 전장 돌연변이체 단백질의 생성을 가능하게 하는 미스센스(missense) 돌연변이이다. 이들 중 대부분은 디스코이딘(discoidin) 도메인에 존재하고, ER에서 유지되는 잘못 접혀진(misfolded) 단백질을 초래한다.
XLRS가 레티노스키신 기능의 소실에 의해 야기되는 열성 질환이기 때문에, 유전자 대체 치료법은 이 질환에 대한 잠재적인 치료이다. 더욱이, 레티노스키신은 세포외 단백질로서 작용하기 때문에, 유익한 치료는 필수적으로 대체 유전자를 발현하는 형질주입된 세포로 국한되지 않지만 발현 부위로부터 분비된 단백질의 확산으로 인해 더 광범위한 영역을 포괄할 수 있다.
표적 게놈 좌위, 예컨대 내인성 RS1 좌위 내로의 레티노스키신 코딩 서열의 삽입 및/또는 레티노스키신 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 핵산 작제물 및 조성물이 본원에 제공된다. 핵산 작제물 및 조성물은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및/또는 세포에서의 발현 방법에 또는 X-연관 연소 망막층간분리를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 표적 게놈 좌위, 예컨대 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합을 용이하게 하기 위해 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함) 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다.
내인성 RS1 좌위, 예컨대 RS1의 인트론 1 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지할 수 있다. 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질(예를 들어, XLRS-야기 돌연변이를 갖는 내인성 레티노스키신 단백질)의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체(예를 들어, XLRS-야기 돌연변이를 갖지 않는 레티노스키신)의 발현으로 대체할 수 있다. 일례에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시킨다. 또 다른 예에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 무력화시킨다. 이러한 방식으로, 핵산 작제물의 통합은 동시에, 내인성 RS1 유전자(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 R141C를 포함하는 내인성 RS1 유전자)를 넉아웃(knock out)시키고 대체 레티노스키신 코딩 서열(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 돌연변이를 포함하지 않는 대체 레티노스키신 코딩 서열)을 넉인(knock in)시킬 수 있다.
II. 표적 게놈 좌위 내로 통합하고 이로부터 발현시키기 위한 레티노스키신 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물
표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물(즉, 외인성 공여자 핵산)이 본원에 제공된다. 핵산 작제물은 단리된 핵산 작제물일 수 있다.
레티노스키신(X-연관 연소 망막층간분리 단백질)은 망막의 정상적인 구조 및 기능에 필요한 단백질이다. 예시적인 인간 레티노스키신 단백질은 UniProt 기탁 번호 O15537로 표기되고, SEQ ID NO: 2로 표시된 서열을 갖는다. 다른 종에서의 이종상동체가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 예시적인 마우스 레티노스키신 단백질은 UniProt 기탁 번호 Q9Z1L4로 표기되고, SEQ ID NO: 1로 표시된 서열을 갖는다. 레티노스키신은 RS1 유전자(XLRS1로도 알려져 있음)에 의해 인코딩된다. 인간 RS1 유전자는 5개의 인트론에 의해 개재된(interspaced) 6개의 별개의 엑손을 함유한다. 인간 RS1 유전자는 NCBI GeneID 6247로 표기된다. 마우스 Rs1 유전자는 NCBI GeneID 20147로 표기된다. 인간 RS1에 대한 예시적인 코딩 서열은 CCDS ID CCDS14187.1로 표기되고 SEQ ID NO: 6으로 표시된다. 레티노스키신에서의 돌연변이는 황반 병상(macular pathology) 및 망막의 천층(superficial layer)의 분할(splitting)을 특징으로 하는 유리체-망막 이영양증(vitreo-retinal dystrophy)인 X-연관 연소 망막층간분리(XLRS)를 야기한다. 본원에 개시된 핵산 작제물은 본원 어디에서나 더 상세히 기재된 바와 같이 XLRS를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
RS1의 기능성 도메인은 신호 펩타이드(SP), RS1, 및 디스코이딘 도메인이다. 신호 서열은 소포체(합성 부위)로부터 원형질막의 외부 리플렛(external leaflet)으로의 신생(nascent) RS1의 전좌(translocation)를 가이드하고, 그 동안 신호 서열은 신호 펩티다제에 의해 절단되어 특징적인 RS1 및 고도로 보존된 디스코이딘 도메인을 갖는 성숙한 단백질을 생산한다. RS1 신호 서열의 상이한 하위도메인은, 전좌를 매개하는 아미노 말단 단부에서의 양으로 하전된 N 영역, 표적화 및 막 삽입에 필요한 소수성 코어(H) 및 신호 펩티다제에 의한 인식 및 절단 부위를 결정하는 극성 "C" 영역이다. RS1은 주로 망막 광수용기 및 양극 세포에 의해 발현되고, 송과선(pineal gland)에도 존재한다.
본원에 개시된 핵산 작제물에 포함되는 레티노스키신 코딩 서열은 전장 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 코딩 서열일 수 있다. 일례에서, 핵산 작제물에 포함된 레티노스키신 코딩 서열은 RS1의 제1 엑손을 포함하지 않는다. 예를 들어, 핵산 작제물에 포함된 레티노스키신 코딩 서열은 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 변이체 또는 퇴행성 변이체를 포함할 수 있다. 일례로, RS1 유전자의 엑손 2 내지 6을 포함하는 cDNA 단편은 SEQ ID NO: 8로 표시된 서열을 포함할 수 있다. 64개의 코돈이 각각 단지 하나의 아미노산 또는 정지 신호에 특이적이긴 하지만, 단일 아미노산이 1개 초과의 코돈에 의해 코딩될 수 있기 때문에 유전자 코드는 축퇴성(즉, 잉여적(redundant))이다. 유전자의 축퇴성 변이체는 동일한 단백질을 인코딩하지만 적어도 하나의 상이한 코돈을 사용한다. 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 개입 인트론이 없는 상보적 DNA(cDNA)를 포함할 수 있거나, 핵산 작제물은 레티노스키신 코딩 서열 내 엑손을 분리하는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 엑손과 인트론을 둘 다 갖는 RS1 게놈 좌위에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
레티노스키신 코딩 서열은 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 레티노스키신 코딩 서열은 포유류, 비인간 포유류, 설치류, 마우스, 래트, 또는 인간 또는 이의 변이체일 수 있다. 대안적으로, 레티노스키신 코딩 서열은 키메라(예를 들어, 마우스 파트와 인간 파트)일 수 있다. 구체적인 예로, 레티노스키신 코딩 서열은 인간 레티노스키신 코딩 서열이다.
레티노스키신 코딩 서열은 특정 세포 또는 유기체에서 레티노스키신으로의 효율적인 번역을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 일례로, 인간 RS1의 엑손 2 내지 6의 코돈-최적화된 버전은 SEQ ID NO: 9로 표시된다. 예를 들어, 핵산은 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다.
레티노스키신 코딩 서열은 야생형 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 코딩할 수 있다. 마찬가지로, 레티노스키신 코딩 서열은 야생형 코딩 서열 또는 이의 변이체일 수 있다. 일례에서, 레티노스키신 코딩 서열은 X-연관 연소 망막층간분리와 관련이 있거나 이를 야기하는 임의의 돌연변이를 포함하지 않는다. 대안적으로, 레티노스키신 코딩 서열은 X-연관 연소 망막층간분리와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, R141C)를 포함할 수 있다.
핵산 작제물은 하나 이상의 RS1 인트론 또는 이의 단편 또는 변이체(예를 들어, 하나 이상의 인간 RS1 인트론 또는 이의 단편 또는 변이체)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 RS1 인트론 1 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. RS1 인트론 또는 이의 단편 또는 변이체는 스플라이스 수용기 부위 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. RS1 인트론 1의 단편의 예는 SEQ ID NO: 15 및 16으로 표시된다. 하나의 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 RS1의 엑손 2 내지 6의 5'(예를 들어, RS1의 엑손 2 내지 6을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 cDNA 서열의 업스트림)에 위치한 RS1 인트론 1 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
핵산 작제물은 하나 이상의 스플라이스 수용기 부위를 추가로 포함할 수 있다. 스플라이스 수용기 부위를 포함하는 서열(예를 들어, 인트론 서열) 및 이의 역보체의 예는 SEQ ID NO: 15-21로 표시된다. 예를 들어, 핵산 작제물은 레티노스키신 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 레티노스키신 코딩 서열은 RS1의 엑손 2 내지 6(예를 들어, 인간 RS1의 엑손 2 내지 6)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 스플라이스 수용기 부위는 RS1 엑손 1을 RS1 엑손 2로 스플라이싱하는 데 사용되는 RS1(예를 들어, 인간 RS1)의 인트론으로부터의 스플라이스 수용기 부위이다. 용어 스플라이스 수용기 부위는, 스플라이싱 머시너리에 의해 인식되고 결합될 수 있는 3' 인트론/엑손 경계에서의 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 개시된 핵산 작제물은 또한, 번역-후 조절 요소, 예컨대 우드척 간염(woodchuck hepatitis) 바이러스 번역-후 조절 요소를 포함할 수 있다.
핵산 작제물은 하나 이상의 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호 서열, 또는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 서열, 또는 이의 역보체의 예는 SEQ ID NO: 22-25로 표시된다. 예를 들어, 핵산 작제물은 레티노스키신 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 폴리아데닐화 신호 서열이 사용될 수 있다. 용어 폴리아데닐화 신호 서열은 전사의 종료 및 mRNA 전사물(transcript)에의 폴리-A 테일의 첨가를 지시하는 임의의 서열을 지칭한다. 진핵생물에서, 전사 종결자는 단백질 인자에 의해 인식되고, 종결에 뒤이어, 폴리(A) 폴리머라제의 존재 하에 폴리(A) 테일을 mRNA 전사물에 첨가하는 과정인 폴리아데닐화가 이어진다. 포유류 폴리(A) 신호는 전형적으로, 약 45개 뉴클레오타이드 길이인 코어 서열로 구성되며, 이는 절단 및 폴리아데닐화 효율을 증강시키는 역할을 하는 다양한 보조 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 코어 서열은, 절단 및 폴리아데닐화-특이성 인자(CPSF)에 의해 인식되는 폴리 A 인식 모티프 또는 폴리 A 인식 서열로 지칭되는, mRNA 내의 고도로 보존된 업스트림 요소(AATAAA 또는 AAUAAA), 및 절단 자극 인자(CstF)에 이해 결합되는 불량하게 정의된 다운스트림 영역(U 또는 G 및 U가 풍부함)으로 구성된다. 사용될 수 있는 전사 종결자의 예는 예를 들어, 인간 성장 호르몬(HGH) 폴리아데닐화 신호, 시미안 바이러스 40(SV40) 후기 폴리아데닐화 신호, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 폴리아데닐화 신호, AOX1 전사 종결 서열, CYC1 전사 종결 서열, 또는 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절하기에 적합한 것으로 알려진 임의의 전사 종결 서열을 포함한다.
핵산 작제물은 또한 레티노스키신 코딩 서열의 업스트림에 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 레티노스키 코딩 서열의 업스트림의 폴리아데닐화 신호는 부위-특이적 리컴비나제에 의해 인식되는 리컴비나제 인식 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 작제물에서, 리컴비나제 인식 부위는 또한, 예를 들어, 약물 내성 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 선택 카세트를 플랭킹한다. 다른 작제물에서, 리컴비나제 인식 부위는 선택 카세트를 플랭킹하지 않는다. 폴리아데닐화 신호 서열은 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질 또는 RNA의 전사 및 발현을 방지한다. 그러나, 부위-특이적 리컴비나제에 노출 시, 폴리아데닐화 신호 서열은 절제될 것이고, 단백질 또는 RNA가 발현될 수 있다.
이러한 배치는, 폴리아데닐화 신호 서열이 조직-특이적 또는 발증-기-특이적(developmental-stage-specific) 방식으로 절제된다면, 레티노스키신 코딩 서열을 포함하는 동물에서 조직-특이적 발현 또는 발증-기-특이적 발현을 가능하게 할 수 있다. 핵산 작제물을 포함하는 동물이 조직-특이적 또는 발증-기-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 부위-특이적 리컴비나제에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다면, 조직-특이적 또는 발증-기-특이적 방식에서의 폴리아데닐화 신호 서열의 절제가 달성될 수 있다. 그 후에, 폴리아데닐화 신호 서열은 조직에서만 또는 발증기에서만 절제되어, 조직-특이적 발현 또는 발증-기-특이적 발현을 가능하게 할 것이다. 일례에서, 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 또는 이의 단편 또는 변이체는 눈-특이적 또는 망막-특이적 방식으로 발현될 수 있다.
부위-특이적 리컴비나제는 리컴비나제 인식 부위 사이에서의 재조합을 용이하게 할 수 있는 효소를 포함하며, 2개의 재조합 부위는 단일 핵산 내에서 또는 별개의 핵산 상에서 물리적으로 분리된다. 리컴비나제의 예는 Cre, Flp, 및 Dre 리컴비나제를 포함한다. Cre 리컴비나제 유전자의 일례는 Crei이며, 여기서 Cre 리컴비나제를 인코딩하는 2개의 엑손은 원핵생물 세포에서 이의 발현을 방지하기 위해 인트론에 의해 분리된다. 이러한 리컴비나제는 핵으로의 위치화를 용이하게 하기 위해 핵 위치 신호(예를 들어, NLS-Crei)를 추가로 포함할 수 있다. 리컴비나제 인식 부위는, 부위-특이적 리컴비나제에 의해 인식되고 재조합 사건에 대한 기질로서 역할을 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 리컴비나제 인식 부위의 예는 FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox, 및 lox 부위, 예컨대 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, 및 lox5171을 포함한다.
핵산 작제물은 레티노스키신 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 생체내에서는 동물 내에서의 또는 시험관내에서는 단리된 세포 내에서의 발현을 위해 임의의 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 구성적 활성 프로모터(예를 들어, CAG 프로모터 또는 U6 프로모터), 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 시간적 제약(temporally restricted) 프로모터(예를 들어, 발달적 조절(developmentally regulated) 프로모터), 또는 공간적 제약(spatially restricted) 프로모터(예를 들어, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 이러한 프로모터는 잘 알려져 있고, 본원 어디에서나 논의되어 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능성 세포, 눈 세포(eye cell), 망막 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 또는 접합체(zygote) 중 하나 이상에서 활성적인 프로모터를 포함한다. 구체적인 예에서, 프로모터는 눈 세포 또는 망막 세포에서 활성적이다.
대안적으로, 일부 핵산 작제물은 레티노스키신 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하지 않는다(예를 들어, 일부 핵산 작제물은 프로모터-무함유(promoterless) 작제물임). 이러한 핵산 작제물은 예를 들어, 표적 게놈 좌위 내로 통합 시 표적 게놈 좌위(예를 들어, 내인성 RS1 좌위에서의 내인성 RS1 프로모터)에서 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 설계될 수 있다.
유전자를 발현할 수 있는 임의의 표적 게놈 좌위, 예컨대 세이프 하버 좌위(세이프 하버 유전자) 또는 내인성 RS1 좌위가 사용될 수 있다. 통합된 외인성 DNA와 숙주 게놈 사이의 상호작용은 통합의 신뢰성 및 안전성을 제한할 수 있고, 표적화된 유전적 변형으로 인한 것이 아니지만 대신에 주변 내인성 유전자 상에서의 통합의 의도치 않은 효과로 인한 것인 명시적인 표현형 효과를 유발할 수 있다. 예를 들어, 무작위로 삽입된 이식유전자는 장소 효과 및 침묵화(silencing)를 받아서, 이의 발현을 신뢰 불가능하게 그리고 예측 불가능하게 만들 수 있다. 마찬가지로, 염색체 좌위 내로의 외인성 DNA의 통합은 주변 내인성 유전자 및 염색질에 영향을 미쳐서, 세포 거동 및 표현형을 변경시킬 수 있다. 세이프 하버 좌위는, 이식유전자 또는 다른 외인성 핵산 삽입물이 세포 거동 또는 표현형을 명시적으로 변경시키지 않으면서(즉, 숙주 세포 상의 임의의 유해 효과 없이) 모든 관심 조직에서 안정하게 그리고 신뢰할 만하게 발현될 수 있는 염색체 좌위를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sadelain 등 (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58]을 참조하며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 세이프 하버 좌위는, 삽입된 유전자 서열의 발현이 이웃 유전자로부터의 임의의 판독(read-through) 발현에 의해 동요되지(perturbed) 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 세이프 하버 좌위는, 외인성 DNA가 내인성 유전자 구조 또는 발현에 유해한 영향을 미치지 않으면서 예측 가능한 방식으로 통합되고 작용할 수 있는 염색체 좌위를 포함할 수 있다. 세이프 하버 좌위는 예를 들어, 비-본질적이거나, 불필요하거나 명시적인 표현형 결과 없이 교란될 수 있는 유전자 내의 좌위와 같이 유전자외(extragenic) 영역 또는 유전자내(intragenic) 영역을 포함할 수 있다.
이러한 세이프 하버 좌위는 모든 조직에서 열린 염색질 배치를 제공할 수 있으며, 성체에서 배아 발달 동안 도처에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Zambrowicz 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3789-3794]을 참조하며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 게다가, 세이프 하버 좌위는 고효율로 표적화될 수 있으며, 세이프 하버 좌위는 명시적인 표현형 없이 교란될 수 있다. 세이프 하버 좌위의 예는 알부민, CCR5, HPRT, AAVS1, 및 Rosa26을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 제8,586,526호; 및 미국 특허 공보 2003/0232410호; 2005/0208489호; 2005/0026157호; 2006/0063231호; 2008/0159996호; 2010/00218264호; 2012/0017290호; 2011/0265198호; 2013/0137104호; 2013/0122591호; 2013/0177983호; 2013/0177960호; 및 2013/0122591호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
표적 게놈 좌위는 또한, 내인성 RS1 좌위, 예컨대 XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 인코딩된 레티노스키신 단백질 내 R141C 돌연변이)를 포함하는 내인성 RS1 좌위일 수 있다. 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 일부 경우에 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지할 수 있다. 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현으로 대체할 수 있다. 일례에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시킨다. 또 다른 예에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 무력화시킨다. 이러한 방식으로, 핵산 작제물의 통합은 동시에, 내인성 RS1 유전자(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 내인성 RS1 유전자)를 넉아웃시키고 대체 레티노스키신 코딩 서열(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 돌연변이를 포함하지 않는 대체 레티노스키신 코딩 서열)을 넉인시킬 수 있다.
핵산 작제물은 표적 게놈 좌위의 임의의 파트 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위의 인트론 또는 엑손 내로 삽입될 수 있거나 표적 게놈 좌위의 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손을 대체할 수 있다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위의 인트론, 예컨대 표적 게놈 좌위의 제1 인트론(예를 들어, RS1 인트론 1) 내로 통합될 수 있다. 표적 게놈 좌위 내로 통합된 발현 카세트는 표적 게놈 좌위에서 내인성 프로모터(예를 들어, 내인성 RS1 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 표적 게놈 좌위에서 이종성인 외인성 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
핵산 작제물은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있으며, 이들 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 이들 핵산은 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yoshimi 등 (2016) Nat. Commun. 7:10431]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 핵산 작제물은 나상(naked) 핵산일 수 있거나 벡터, 예컨대 AAV 벡터에 의해 전달될 수 있다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 AAV를 통해 전달될 수 있고, 비-상동성 말단 접합(예를 들어, 핵산 작제물은, 상동성 아암을 포함하지 않는 것일 수 있음)에 의해 내인성 RS1 게놈 좌위 내로 삽입을 할 수 있다. 선형 형태로 도입된다면, 핵산 작제물(예를 들어, 공여자 서열)의 단부는 잘 알려진 방법에 의해(예를 들어, 엑소뉴클레오용해성(exonucleolytic) 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 단부에 첨가될 수 있고/있거나 자기-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 단부에 리게이션될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chang 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963] 및 문헌[Nehls 등 (1996) Science 272:886-889]를 참조하며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 포함된다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하는 추가 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같이 변형된 뉴클레오타이드간 연결부(internucleotide linkage)의 사용을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 핵산 작제물은 약 50개 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb 길이 또는 약 50개 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb 길이이다. 대안적으로, 핵산 작제물은 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 2.5 kb, 약 2.5 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 4.5 kb, 또는 약 4.5 kb 내지 약 5 kb 길이일 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물은 예를 들어, 5 kb, 4.5 kb, 4 kb, 3.5 kb, 3 kb, 또는 2.5 kb 이하의 길이일 수 있다.
표적 게놈 좌위에서 핵산 작제물의 통합은 상기 표적 게놈 좌위에의 관심 핵산 서열의 첨가 또는 상기 표적 게놈 좌위에서의 관심 핵산 서열의 대체(즉, 결실 및 삽입)를 이끌 수 있다. 일부 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서의 임의의 상응하는 결실 없이 표적 게놈 좌위에서의 핵산 작제물의 삽입을 위해 설계된다. 다른 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 관심 핵산 서열을 결실시키고 이를 핵산 작제물로 대체하기 위해 설계된다.
결실되고/거나 대체되는 표적 게놈 좌위에서의 핵산 작제물 또는 상응하는 핵산은 다양한 길이일 수 있다. 결실되고/거나 대체되는 표적 게놈 좌위에서의 예시적인 핵산 작제물 또는 상응하는 핵산은 약 1개 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb 길이이거나 약 1개 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb 길이이다. 예를 들어, 결실되고/거나 대체되는 표적 게놈 좌위에서의 핵산 작제물 또는 상응하는 핵산은 약 1 내지 약 100개, 약 100 내지 약 200개, 약 200 내지 약 300개, 약 300 내지 약 400개, 약 400 내지 약 500개, 약 500 내지 약 600개, 약 600 내지 약 700개, 약 700 내지 약 800개, 약 800 내지 약 900개, 또는 약 900 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 마찬가지로, 결실되고/거나 대체되는 표적 게놈 좌위에서의 핵산 작제물 또는 상응하는 핵산은 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 2.5 kb, 약 2.5 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 4.5 kb, 약 4.5 kb 내지 약 5 kb 길이이거나 그보다 길 수 있다.
결실되고/거나 대체되는 표적 게놈 좌위에서의 핵산 작제물 또는 상응하는 핵산은 코딩 영역, 예컨대 엑손; 비코딩 영역, 예컨대 인트론, 비번역 영역, 또는 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 전사 억제자-결합 요소); 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
일부 경우에, 핵산 작제물은 하기 말단 구조: 헤어핀, 루프, 역 말단 반복부(ITR), 또는 원환체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 ITR을 포함할 수 있다.
일부 이러한 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제, 예컨대 Cas 단백질로 표적 게놈 좌위(예를 들어, 비제한적으로, 내인성 RS1 좌위)를 절단하거나 틈새 형성시킨 후 표적 게놈 좌위를 변형시킬 수 있다. 핵산 작제물은 절단된 또는 틈새 형성된 좌위를, 비-상동성 말단 접합(NHEJ)-매개 리게이션 또는 상동성-안내 수선을 통해 수선하도록 설계될 수 있다. 선택적으로, 핵산 작제물을 이용한 수선은 뉴클레아제 표적 서열을 제거하거나 방해하여, 표적화되었던 대립유전자는 뉴클레아제 제제에 의해 재-표적화될 수 없다.
일부 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 상동성 아암은 대칭적일 수 있거나(예를 들어, 각각 40개 뉴클레오타이드 또는 각각 60개 뉴클레오타이드 길이), 이들은 비대칭적일 수 있다(예를 들어, 36개 뉴클레오타이드 길이인 하나의 상동성 아암 또는 상보적 영역 및 91개 뉴클레오타이드 길이인 하나의 상동성 아암 또는 상보적 영역). 다른 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
본원에 개시된 일부 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함한다. 상동성 아암은 레티노스키신 코딩 서열을 플랭킹할 수 있다. 기준의 용이성을 위해, 상동성 아암은 본원에서 5' 및 3'(즉, 업스트림 및 다운스트림) 상동성 아암으로 지칭된다. 이 용어는 핵산 작제물 내의 핵산 삽입물(예를 들어, 레티노스키신 코딩 서열)에 대한 상동성 아암의 상대 위치에 관한 것이다. 5' 및 3' 상동성 아암은 표적 게놈 좌위 내의 영역에 상응하며, 이는 본원에서 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"로 지칭된다.
상동성 아암 및 표적 서열은, 2개의 영역이 서로 충분한 수준의 서열 동일성을 공유하여 상동성 재조합 반응에 대한 기질로서 작용할 때 서로 "상응한다" 또는 "상응하고" 있다. 용어 "상동성"은 상응하는 서열에 대해 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 주어진 표적 서열과 핵산 작제물에서 확인된 상응하는 상동성 아암 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합이 발생하게 하는, 서열 동일성의 임의의 정도일 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물(또는 이의 단편)의 상동성 아암 및 표적 서열(또는 이의 단편)에 의해 공유되는 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있으며, 따라서 서열은 상동성 재조합을 수행한다. 더욱이, 상동성 아암과 상응하는 표적 서열 사이의 상동성의 상응하는 영역은 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예시적인 상동성 아암은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이이거나, 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 1.5 kb 길이이거나, 약 25 내지 약 500개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 주어진 상동성 아암(또는 상동성 아암 각각) 및/또는 상응하는 표적 서열은 약 25 내지 약 30개, 약 30 내지 약 40개, 약 40 내지 약 50개, 약 50 내지 약 60개, 약 60 내지 약 70개, 약 70 내지 약 80개, 약 80 내지 약 90개, 약 90 내지 약 100개, 약 100 내지 약 150개, 약 150 내지 약 200개, 약 200 내지 약 250개, 약 250 내지 약 300개, 약 300 내지 약 350개, 약 350 내지 약 400개, 약 400 내지 약 450개, 또는 약 450 내지 약 500개 뉴클레오타이드 길이인 상동성의 상응하는 영역을 포함할 수 있으며, 따라서 상동성 아암은 표적 핵산 내의 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합을 수행하기에 충분한 상동성을 갖는다. 대안적으로, 주어진 상동성 아암(또는 상동성 아암 각각) 및/또는 상응하는 표적 서열은 약 0.5 kb 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 또는 약 2 kb 내지 약 2.5 kb 길이인 상동성의 상응하는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상동성 아암은 각각 약 750개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 상동성 아암은 각각 약 150 내지 약 750개, 약 200 내지 약 700개, 약 250 내지 약 650개, 약 300 내지 약 600개, 약 350 내지 약 550개, 약 400 내지 약 500개, 약 150 내지 약 450개, 약 200 내지 약 450개, 약 250 내지 약 450개, 약 300 내지 약 450개, 약 350 내지 약 450개, 약 400 내지 약 450개, 약 450 내지 약 500개, 약 450 내지 약 550개, 약 450 내지 약 600개, 약 450 내지 약 650개, 약 450 내지 약 700개, 약 450 내지 약 750개, 또는 약 450개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 상동성 아암은 각각 약 500 내지 약 1300개, 약 550 내지 약 1250개, 약 600 내지 약 1200개, 약 650 내지 약 1150개, 약 700 내지 약 1100개, 약 750 내지 약 1050개, 약 800 내지 약 1000개, 약 850 내지 약 950개, 약 500 내지 약 900개, 약 550 내지 약 900개, 약 600 내지 약 900개, 약 650 내지 약 900개, 약 700 내지 약 900개, 약 750 내지 약 900개, 약 800 내지 약 900개, 약 850 내지 약 900개, 약 900 내지 약 950개, 약 900 내지 약 1000개, 약 900 내지 약 1050개, 약 900 내지 약 1100개, 약 900 내지 약 1150개, 약 900 내지 약 1200개, 약 900 내지 약 1250개, 약 900 내지 약 1300개, 또는 약 900개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 상동성 아암은 각각 약 1500 내지 약 2100개, 약 1550 내지 약 2050개, 약 1600 내지 약 2000개, 약 1650 내지 약 1950개, 약 1700 내지 약 1900개, 약 1750 내지 약 1850개, 약 1500 내지 약 1800개, 약 1550 내지 약 1800개, 약 1600 내지 약 1800개, 약 1650 내지 약 1800개, 약 1700 내지 약 1800개, 약 1750 내지 약 1800개, 약 1800 내지 약 1850개, 약 1800 내지 약 1900개, 약 1800 내지 약 1950개, 약 1800 내지 약 2000개, 약 1800 내지 약 2050개, 약 1800 내지 약 2100개, 또는 약 1800개 뉴클레오타이드일 수 있다. 또 다른 예에서, 각각의 상동성 아암은 약 450개 이하의 뉴클레오타이드, 약 900개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 약 1800개 이하의 뉴클레오타이드이다. 또 다른 예에서, 각각의 상동성 아암은 적어도 약 450개 뉴클레오타이드, 적어도 약 900개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 1800개 뉴클레오타이드이다. 상동성 아암은 대칭적일 수 있거나(각각 약 동일한 길이), 이들 상동성 아암은 비대칭적일 수 있다(다른 것보다 더 긴 하나).
CRISPR/Cas 시스템 또는 다른 뉴클레아제 제제가 본원에 개시된 핵산 작제물과 조합되어 사용될 때, 5' 및 3' 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하게(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열에 충분한 근접성 내에) 위치하여, 뉴클레아제 절단 부위 또는 뉴클레아제 절단 부위에서 단일-가닥 절단부(닉) 또는 이중-가닥 절단부 시 표적 서열과 상동성 아암 사이의 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진할 수 있다. 용어 "뉴클레아제 제제 절단 부위"는, 닉 또는 이중-가닥 절단부가 뉴클레아제 제제(예를 들어, 가이드 RNA와 복합체화된 Cas9 단백질)에 의해 생성되는 DNA 서열을 포함한다. 핵산 작제물의 5' 및 3' 상동성 아암에 상응하는 표적화된 좌위 내의 표적 서열은, 그 거리가 뉴클레아제 절단 부위에서 단일-가닥 절단부 또는 이중-가닥 절단부 시 5' 및 3' 표적 서열과 상동성 아암 사이의 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진하는 정도라면, 뉴클레아제 절단 부위에 "충분한 근접성으로 위치한"다. 그러므로, 핵산 작제물의 5' 및/또는 3' 상동성 아암에 상응하는 표적 서열은 예를 들어, 주어진 뉴클레아제 절단 부위의 적어도 1개 뉴클레오타이드 내에 또는 주어진 뉴클레아제 절단 부위의 적어도 10개 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있다. 일례로, 뉴클레아제 절단 부위는 표적 서열 중 적어도 하나 또는 둘 다에 바로 인접해 있을 수 있다.
핵산 작제물의 상동성 아암에 상응하는 표적 서열 및 뉴클레아제 절단 부위의 공간적 관계는 다양할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 대해 5'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위에 대해 3'에 위치할 수 있거나, 표적 서열은 뉴클레아제 절단 부위를 플랭킹할 수 있다.
다른 핵산 작제물은 임의의 상동성 아암을 포함하지 않는다. 이러한 핵산 작제물은 비-상동성 말단 접합에 의한 삽입을 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제를 이용한 절단 후 평활 단부 이중-가닥 절단부 내로 삽입될 수 있다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 AAV를 통해 전달될 수 있고, 비-상동성 말단 접합(예를 들어, 핵산 작제물은, 상동성 아암을 포함하지 않는 것일 수 있음)에 의해 표적 게놈 좌위 내로 삽입을 할 수 있다.
구체적인 예에서, 핵산 작제물은 상동성-독립적 표적화된 통합을 통해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 각각의 측면(side) 상에서 뉴클레아제 제제에 대한 표적 부위(예를 들어, 표적 게놈 좌위에서와 동일한 표적 부위, 및 표적 게놈 좌위 내 표적 부위를 절단하는 데 사용되는 동일한 뉴클레아제 제제)에 의해 플랭킹될 수 있다. 그 후에, 뉴클레아제 제제는 레티노스키신 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위를 절단할 수 있다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 AAV-매개 전달에 의해 전달되고, 레티노스키신 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위의 절단은 AAV의 역 말단 반복부(ITR)를 제거할 수 있다. 일부 방법에서, 표적 게놈 좌위 내 표적 부위(예를 들어, 플랭킹 프로토스페이서 인접 모티프를 포함하는 gRNA 표적 서열)는, 레티노스키신 코딩 서열이 표적 게놈 좌위 내로 올바른 배향으로 삽입된다면 더 이상 존재하지 않지만, 상기 표적 부위는, 레티노스키신 코딩 서열이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다. 이는, 레티노스키신 코딩 서열이 발현을 위해 올바른 배향으로 삽입되는 것을 보장하도록 도울 수 있다.
표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 하나의 예시적인 핵산 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이며, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하고, 핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않으며, 핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하며, 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 뉴클레아제 표적 서열과 동일하고, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다.
표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 하나의 예시적인 핵산 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 2 또는 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 하나의 예시적인 핵산 작제물에서, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO: 6, 8, 또는 9 또는 이의 축퇴성 변이체와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 하나의 예시적인 핵산 작제물에서, 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 45와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
다른 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 뉴클레아제-제제-매개 절단에 의해 생성된 하나 이상의 오버행에 상보적인 짧은 단일-가닥 영역을 5' 단부 및/또는 3' 단부에 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서의 5' 및/또는 3' 표적 서열에서 뉴클레아제-매개 절단에 의해 생성된 하나 이상의 오버행에 상보적인 짧은 단일-가닥 영역을 5' 단부 및/또는 3' 단부에 갖는다. 일부 이러한 핵산 작제물은 상보적 영역을 5' 단부에서만 또는 3' 단부에서만 갖는다. 예를 들어, 일부 이러한 핵산 작제물은 상보적 영역을, 표적 게놈 좌위에서의 5' 표적 서열에서 생성된 오버행에 상보적인 5' 단부에서만 또는 표적 게놈 좌위에서의 3' 표적 서열에서 생성된 오버행에 상보적인 3' 단부에서만 갖는다. 다른 이러한 핵산 작제물은 5' 단부와 3' 단부 둘 다에서 상보적 영역을 갖는다. 예를 들어, 다른 이러한 핵산 작제물은 상보적 영역을, 표적 게놈 좌위에서 뉴클레아제-매개 절단에 의해 생성된 5' 단부와 3' 단부 둘 다(예를 들어, 각각 제1 오버행 및 제2 오버행에 상보적임)에 갖는다. 예를 들어, 핵산 작제물이 이중-가닥이라면, 단일-가닥의 상보적 영역은 핵산의 상단 가닥의 5' 단부 및 공여자 핵산의 하단 가닥의 5' 단부로부터 연장되어, 각각의 단부 상에 5' 오버행을 형성할 수 있다. 대안적으로, 단일-가닥의 상보적 영역은 핵산 작제물의 상단 가닥의 3' 단부로부터 그리고 주형의 하단 가닥의 3' 단부로부터 연장되어, 3' 오버행을 형성할 수 있다.
상보적 영역은 핵산 작제물과 표적 핵산 사이에서의 리게이션을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예시적인 상보적 영역은 약 1 내지 약 5개 뉴클레오타이드 길이, 약 1 내지 약 25개 뉴클레오타이드 길이, 또는 약 5 내지 약 150개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 상보적 영역은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 대안적으로, 상보적 영역은 약 5 내지 약 10개, 약 10 내지 약 20개, 약 20 내지 약 30개, 약 30 내지 약 40개, 약 40 내지 약 50개, 약 50 내지 약 60개, 약 60 내지 약 70개, 약 70 내지 약 80개, 약 80 내지 약 90개, 약 90 내지 약 100개, 약 100 내지 약 110개, 약 110 내지 약 120개, 약 120 내지 약 130개, 약 130 내지 약 140개, 약 140 내지 약 150개 뉴클레오타이드 길이 또는 그 이상일 수 있다.
이러한 상보적 영역은 닉카제의 2개 쌍에 의해 생성된 오버행에 상보적일 수 있다. 엇갈린 단부(staggered end)를 갖는 2개의 이중-가닥 절단부는, DNA의 반대 가닥을 절단하여 제1 이중-가닥 절단부를 생성하는 제1 및 제2 닉카제, 및 DNA의 반대 가닥을 절단하여 제2 이중-가닥 절단부를 생성하는 제3 및 제4 닉카제를 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 제1, 제2, 제3 및 제4 가이드 RNA와 상응하는 제1, 제2, 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열을 닉킹하는 데 사용될 수 있다. 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열은, DNA의 제1 및 제2 가닥 상의 제1 및 제2 닉카제에 의해 생성된 닉이 이중-가닥 절단부(즉, 제1 절단 부위는 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 내에 닉을 포함함)를 생성하도록 놓여서 제1 절단 부위를 생성할 수 있다. 마찬가지로, 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열은, DNA의 제1 및 제2 가닥 상의 제3 및 제4 닉카제에 의해 생성된 닉이 이중-가닥 절단부(즉, 제2 절단 부위는 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내에 닉을 포함함)를 생성하도록 놓여서 제2 절단 부위를 생성할 수 있다. 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 및/또는 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉은, 오버행을 생성하는 닉을 오프셋(off-set)할 수 있다. 오프셋은 예를 들어, 적어도 약 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp 이상일 수 있다. 문헌[Ran 등 (2013) Cell 154:1380-1389]; 문헌[Mali 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31:833-838]; 및 문헌[Shen 등 (2014) Nat. Methods 11:399-404]를 참조하며, 이들은 각각 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 경우, 이중-가닥 핵산 작제물은, 제1 및 제2 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉에 의해 그리고 제3 및 제4 가이드 RNA 표적 서열 내의 닉에 의해 생성되는 오버행에 상보적인 단일-가닥 상보적 영역과 함께 설계될 수 있다. 그 후에, 이러한 핵산 작제물은 비-상동성-말단-접합-매개 리게이션에 의해 삽입될 수 있다.
본원에 개시된 일부 핵산 작제물은, 어느 한 배향에서 표적 게놈 좌위 내로 삽입되고 이로부터 발현될 수 있는 양방향성 작제물이다. 이러한 핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 제1 코딩 서열을 포함하는 제1 분절 및 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 제2 코딩 서열의 역보체를 포함하는 제2 분절을 포함할 수 있다. 제2 분절은 예를 들어, 핵산 작제물 내 제1 분절의 3'에 위치할 수 있다.
제1 분절 및 제2 분절은 함께 직접적으로 연결될 수 있거나 펩타이드 링커와 같은 링커에 의해 연결될 수 있다. 펩타이드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 링커는 약 5 내지 약 2000개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일례로, 링커 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 1500, 2000개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 양방향성 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체와 동일하다. 다른 양방향성 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체와 상이하다.
일부 양방향성 작제물에서, 제1 코딩 서열에서의 코돈 사용빈도는 제2 코딩 서열에서의 코돈 사용빈도와 동일하다. 다른 양방향성 작제물에서, 제2 코딩 서열은 헤어핀 형성을 감소시키기 위해 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택한다. 이러한 역보체는 제1 분절 내 코딩 서열의 모든 뉴클레오타이드보다는 몇몇 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하지만, 이는 선택적으로 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
제2 분절은 제1 분절과 임의의 백분율의 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 분절 서열은 제1 분절과 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 99%의 상보성을 갖는다. 또 다른 예로, 제2 분절 서열은 제1 분절과 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 약 95% 미만, 약 97% 미만, 또는 약 99% 미만의 상보성을 가질 수 있다. 일부 핵산 작제물에서, 제2 코딩 서열의 역보체는, 제1 코딩 서열과 실질적으로 상보적이지 않거나(예를 들어, 70% 이하 상보적임), 제1 코딩 서열의 단편과 실질적으로 상보적이지 않거나, 제1 코딩 서열과 고도로 상보적이거나(예를 들어, 적어도 90% 상보적임), 제1 코딩 서열의 단편과 고도로 상보적이거나, 제1 코딩 서열의 역보체와 약 50% 내지 약 80% 동일하거나, 제1 코딩 서열의 역보체와 약 60% 내지 약 100% 동일하다.
양방향성 작제물은 일부 경우에, 하나 이상의(예를 들어, 2개의) 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제2 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있고, 제2 분절은 제2 폴리아데닐화 신호 서열(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체)을 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치한 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치한 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치하는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치하는 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함할 수 있다. 제1 폴리아데닐화 신호 서열 및 제2 폴리아데닐화 신호 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 일례에서, 제1 폴리아데닐화 신호 및 제2 폴리아데닐화 신호는 상이하다.
양방향성 작제물은 일부 경우에, 하나 이상의(예를 들어, 2개의) 스플라이스 수용기 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제2 스플라이스 수용기 부위를 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함할 수 있고, 제2 분절은 제2 스플라이스 수용기 부위(예를 들어, 스플라이스 수용기 부위의 역보체)를 포함할 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치한 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함한다. 일부 양방향성 작제물에서, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함한다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치하는 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함한다. 제1 스플라이스 수용기 부위 및 제2 스플라이스 수용기 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 일례에서, 제1 스플라이스 수용기 부위 및 제2 스플라이스 수용기 부위는 상이하다. 제1 스플라이스 수용기 부위 및/또는 제2 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1 유전자와 같이 RS1 유전자로부터의(예를 들어, RS1 유전자의 인트론 1로부터의) 것일 수 있다.
일부 양방향성 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현을 구동하는 프로모터 및/또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현을 구동하는 프로모터의 역보체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 양방향성 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는 작제물(즉, 프로모터-무함유 작제물)일 수 있다.
코딩 서열 중 하나 또는 둘 다는 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 일부 양방향성 작제물에서, 코딩 서열 중 단지 하나만 코돈-최적화된다. 일부 양방향성 작제물에서, 제1 코딩 서열이 코돈-최적화된다. 일부 양방향성 작제물에서, 제2 코딩 서열이 코돈-최적화된다. 일부 양방향성 작제물에서, 코딩 서열은 둘 다 코돈-최적화된다.
예시적인 양방향성 작제물에서, 제2 분절은 제1 분절의 3'에 위치하며, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 둘 다 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 동일하며, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하고, 제2 코딩 서열은 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택하며, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치한 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치한 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함하며, 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치한 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함하며, 핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고, 선택적으로 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는다.
예시적인 양방향성 작제물에서, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 및/또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 2 또는 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 예시적인 양방향성 작제물에서, 제1 코딩 서열 및/또는 제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 6, 8, 또는 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 예시적인 양방향성 작제물에서, 제1 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고, 제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 예시적인 양방향성 작제물에서, 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 46 또는 47과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
핵산 작제물은 추가의 바람직한 특질(예를 들어, 변형된 또는 조절된 안정성; 형광 표지에 의한 추적 또는 검출; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 작제물은 하나 이상의 형광 표지, 정제 태그, 에피토프 태그, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 하나 이상의 형광 표지(예를 들어, 형광 단백질 또는 다른 형광단 또는 염료), 예컨대 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 형광 표지를 포함할 수 있다. 예시적인 형광 표지는 형광단, 예컨대 플루오레세인(fluorescein)(예를 들어, 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)), 텍사스 레드(Texas Red), HEX, Cy3, Cy5, Cy5.5, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 및 Cy7을 포함한다. 광범위한 범위의 형광 염료는 올리고뉴클레오타이드를 표지화하기 위해 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, Integrated DNA Technologies로부터). 이러한 형광 표지(예를 들어, 내부 형광 표지)는 예를 들어, 핵산 작제물의 단부와 양립성인 돌출(protruding) 단부를 갖는 절단된 표적 핵산 내로 직접적으로 통합되었던 핵산 작제물을 검출하는 데 사용될 수 있다. 표지 또는 태그는 핵산 작제물 내의 5' 단부, 3' 단부에, 또는 내부 영역에 존재할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 5 단부에서 Integrated DNA Technologies(5'IRDYE®700)로부터의 IR700 형광단과 접합될 수 있다.
핵산 작제물은 또한, 조건적 대립유전자(conditional allele)를 포함할 수 있다. 조건적 대립유전자는 미국 특허출원공개 US 2011/0104799호에 기재된 바와 같은 다기능적 대립유전자일 수 있으며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 조건적 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사에 관하여 센스 배향에서의 액추에이팅 서열(actuating sequence); (b) 센스 또는 안티센스 배향에서의 약물 선택 카세트(DSC); (c) 안티센스 배향에서의 관심 뉴클레오타이드 서열(NSI); 및 (d) 역배향에서 인버전 모듈에 의한 조건(COIN(conditional by inversion module), 이는 엑손-분할 인트론 및 역위 가능 유전자-트랩-유사 모듈을 이용함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2011/0104799호를 참조한다. 조건적 대립유전자는 제1 리컴비나제에 노출 시 재조합되어 (i) 액추에이팅 서열 및 DSC가 결여되고; (ii) 센스 배향에서 NSI 및 안티센스 배향에서 COIN을 함유하는 조건적인 대립유전자를 형성하는 재조합 가능한 단위를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2011/0104799호를 참조한다.
핵산 작제물은 또한, 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물은 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 결여될 수 있다. 선택 마커는 선택 카세트에 함유될 수 있다. 선택적으로, 선택 카세트는 자가-결실 카세트일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 8,697,851호 및 US 2013/0312129호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 일례로, 자가-결실 카세트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Crei 유전자(인트론에 의해 분리된 Cre 리컴비나제를 인코딩하는 2개의 엑손을 포함함) 및 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. Prm1 프로모터를 이용함으로써, 자가-결실 카세트는 F0 동물의 수컷 생식 세포에서 특이적으로 결실될 수 있다. 예시적인 선택 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neor), 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hygr), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라제(puror), 블라스티시딘 S 데아미나제(bsrr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt), 또는 단순 포진(herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제(HSV-k) 또는 이들의 조합을 포함한다. 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화되는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본원 어디에서나 기재되어 있다.
핵산 작제물은 또한, 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 리포터 유전자는 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 증강 녹색 형광 단백질(eGFP), 시안색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강 황색 형광 단백질(eYFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강 청색 형광 단백질(eBFP), DsRed, ZsGreen, MmGFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, mOrange, mKO, mCitrine, 비너스(Venus), YPet, 에메랄드, CyPet, 세룰린(Cerulean), T-사파이어, 및 알칼리 포스파타제를 인코딩하는 것을 포함한다. 이러한 리포터 유전자는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본원 어디에서나 기재되어 있다.
핵산 작제물은 또한, 하나 이상의 발현 카세트 또는 결실 카세트를 포함할 수 있다. 주어진 카세트는 하나 이상의 관심 뉴클레오타이드 서열, 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 리포터 유전자를, 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 성분과 함께 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자의 예는 본원 어디에서나 상세히 논의되어 있다.
핵산 작제물은 부위-특이적 재조합 표적 서열과 플랭킹된 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물은 하나 이상의 부위-특이적 재조합 표적 서열을 포함할 수 있다. 전체 핵산 작제물이 이러한 부위-특이적 재조합 표적 서열에 의해 플랭킹될 수 있긴 하지만, 핵산 작제물 내의 관심의 임의의 영역 또는 개별 폴리뉴클레오타이드는 또한 이러한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 핵산 작제물 또는 상기 핵산 작제물 내 임의의 관심 폴리뉴클레오타이드를 플랭킹할 수 있는 부위-특이적 재조합 표적 서열은 예를 들어, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일례에서, 부위-특이적 재조합 부위는 핵산 작제물 내에 함유된 선택 마커 및/또는 리포터 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 플랭킹한다. 표적화된 좌위에서 핵산 작제물의 통합 후, 부위-특이적 재조합 부위 사이의 서열은 제거될 수 있다.
핵산 작제물은 또한, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 및 유형 IV 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제(즉, 제한 효소)에 대한 하나 이상의 제한 부위를 포함할 수 있다. 유형 I 및 유형 III 제한 엔도뉴클레아제는 특이적인 인식 부위를 인식하지만, 전형적으로 뉴클레아제 결합 부위로부터 가변적인 장소에서 절단하며, 이는 절단 부위(인식 부위)로부터 떨어져 있는 수백 개의 염기쌍일 수 있다. 유형 II 시스템에서, 제한 활성은 임의의 메틸라제 활성에 독립적이고, 절단은 전형적으로 결합 부위 내의 또는 그 부근의 특정 부위에서 발생한다. 대부분의 유형 II 효소는 회문(palindromic) 서열을 자르지만, 유형 IIa 효소는 비-회문 인식 부위를 인식하고 인식 부위의 외부를 절단하며, 유형 IIb 효소는 인식 부위의 외부에서 2개 부위 모두를 갖는 서열을 2회 자르고, 유형 IIs 효소는 비대칭 인식 부위를 인식하며 하나의 면(side) 상에서 그리고 상기 인식 부위로부터 약 1 내지 20개 뉴클레오타이드의 정의된 거리에서 절단한다. 유형 IV 제한 효소는 메틸화된 DNA를 표적화한다. 제한 효소는 예를 들어, REBASE 데이터베이스에서 추가로 기재되고 분류된다(webpage at rebase.neb.com; 문헌[Roberts 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]; 문헌[Roberts 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31:1805-1812]; 및 문헌[Belfort 등 (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie 등(ASM Press, Washington, DC)]).
본원에 개시된 핵산 작제물은 또한 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 일부 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위를 표적화하는(예를 들어, RS1, 예컨대 RS1의 인트론 1을 표적화함) 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA를 인코딩하는 서열은 프로모터, 예컨대 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 핵산 작제물에서, 가이드 RNA 발현 카세트는 레티노스키신 코딩 서열(들)의 3'(다운스트림)에 위치한다. 일부 양방향성 핵산 작제물에서, 가이드 RNA 발현 카세트는 제1 분절과 제2 분절 사이에 위치한다.
III. 핵산 작제물을 포함하는 벡터
표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물(즉, 외인성 공여자 핵산)을 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공된다. 본원 어디에서나 개시된 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본원에 제공된다. 본원 어디에서나 개시된 핵산 작제물 및/또는 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 핵산 작제물 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터)가 또한 본원에 제공된다. 벡터는 예를 들어, 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 벡터는 표적 게놈 좌위 내 표적 부위에 상응하는 상동성 아암을 포함한다. 다른 이러한 벡터는 임의의 상동성 아암을 포함하지 않는다.
일부 벡터는 원형일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 선형일 수 있다. 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비지질(non-lipid) 나노입자, 또는 바이러스 캡시드를 통해 전달되기 위해 포장에 존재할 수 있다. 비제한적인 예시적 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터, 및 발현 벡터를 포함한다.
벡터는 예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터일 수 있다. AAV는 임의의 적합한 혈청형일 수 있고, 단일-가닥 AAV(ssAAV) 또는 자기-상보적 AAV(scAAV)일 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분열 세포, 비-분열 세포, 또는 분열 세포와 비-분열 세포 둘 다 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합할 수 있거나 대안적으로는 숙주 게놈 내로 통합하지 않는다. 이러한 바이러스는 또한, 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-적격(competent)일 수 있거나 복제-결함(defective)(예를 들어, 추가 라운드의 비리온 복제 및/또는 포장에 필요한 하나 이상의 유전자가 결함됨)일 수 있다. 바이러스는 일시적 발현, 장기-지속적 발현(예를 들어, 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 또는 3개월), 또는 영구적 발현(예를 들어, Cas9 및/또는 gRNA의)을 야기할 수 있다. 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 1012, 1013, 1014, 1015, 및 1016 벡터 게놈/mL를 포함한다. 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 및 약 1016 벡터 게놈(vg)/mL, 또는 약 1012 내지 약 1016, 약 1012 내지 약 1015, 약 1012 내지 약 1014, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1016, 약 1014 내지 약 1016, 약 1015 내지 약 1016, 또는 약 1013 내지 약 1015 vg/mL을 포함한다. 다른 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 및 약 1016 벡터 게놈(vg)/kg 체중, 또는 약 1012 내지 약 1016, 약 1012 내지 약 1015, 약 1012 내지 약 1014, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1016, 약 1014 내지 약 1016, 약 1015 내지 약 1016, 또는 약 1013 내지 약 1015 vg/kg 체중을 포함한다.
ssDNA AAV 게놈은, 상보적 DNA 가닥의 합성을 가능하게 하는 2개의 역 말단 반복부(inverted terminal repeat)에 의해 플랭킹되는 2개의 개방형 리딩 프레임(open reading frame)인 Rep 및 Cap으로 구성된다. AAV 이전 플라스미드를 작제할 때, 이식유전자는 2개의 ITR 사이에 놓이고, Rep 및 Cap는 인트랜스로(in trans) 공급될 수 있다. Rep 및 Cap 외에도, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드를 필요로 할 수 있다. 이들 유전자(E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개한다. 예를 들어, 이전 플라스미드, Rep/Cap, 및 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포 내로 형질주입되어, 감염성 AAV 입자를 생성할 수 있다. 대안적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 내로 조합될 수 있다. 유사한 포장 세포 및 방법은 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 사용될 수 있다.
AAV의 다수의 혈청형이 식별되었다. 이들 혈청형은, 이들이 감염시키는 세포의 유형이 상이하여(즉, 이의 향성(tropism)), 특정 세포 유형의 선호적인 형질도입을 가능하게 한다. 광수용기 세포에 대한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물을 포함하는 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, 또는 AAV8일 수 있다.
향성은 위형화(pseudotyping)을 통해 추가로 정제(refined)될 수 있으며, 이는 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드 및 게놈의 혼합이다. 예를 들어 AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 위형화된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 향상시킬 뿐만 아니라, 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드는 또한, 바이러스 향성을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고, 생체내에서 광범위한 세포 유형에 걸쳐 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 나타내지만 증강된 뇌 흡수(uptake)를 갖는 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 또한, 돌연변이를 통해 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이적 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이적 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이적 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형화된(pseudotyped)/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다. 구체적인 예에서, AAV는 모든 망막층 및 광수용기로의 고도로 효율적인 전달을 매개하는 AAV 변이체인 AAV7m8이다. 예를 들어, 문헌[Dalkara 등 (2013) Sci. Transl. Med. 5:189ra76]을 참조하며, 이의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
이식유전자 발현을 가속화하기 위해, 자가-상보적 AAV(scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV는 AAV의 단일-가닥 DNA 게놈의 상보적 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 머시너리에 의존하기 때문에, 이식유전자 발현이 지연될 수 있다. 이러한 지연을 해결하기 위해, 감염 시 자발적으로 어닐링할 수 있는 상보적 서열을 함유하는 scAAV가 사용되어, 숙주 세포 DNA 합성을 위한 요건을 배제할 수 있다. 그러나, 단일-가닥 AAV(ssAAV) 벡터가 또한 사용될 수 있다.
포장 수용력(capacity)을 증가시키기 위해, 더 긴 이식전자는 2개의 AAV 이전 플라스미드 사이에서 분할될 수 있으며, 제1 AAV는 3' 스플라이스 공여자이고 제2 AAV는 5' 스플라이스 수용기이다. 세포의 공동-감염 시, 이들 바이러스는 콘카테머(concatemer)를 형성하며, 함께 스플라이싱되고, 전장 이식유전자는 발현될 수 있다. 이는 더 장기적인 이식유전자 발현을 가능하게 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 수용력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동성 재조합을 이용한다. 예를 들어, 이식유전자는, 공동-발현이 전장 이식유전자의 상동성 재조합 및 발현을 유도하도록 2개의 이전 플라스미드 사이에서 그러나 실질적인 서열 중첩을 갖고 나눠질 수 있다.
IV. 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자
표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물(즉, 외인성 공여자 핵산)을 포함하는 지질 나노입자가 또한 본원에 제공된다. 본원 어디에서나 개시된 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 지질 나노입자가 또한 본원에 제공된다. 본원 어디에서나 개시된 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함)를 인코딩하는 핵산 작제물 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자가 또한 본원에 제공된다.
지질 제형은 생물학적 분자의 세포 흡수를 향상시키는 한편, 이들 분자를 분해로부터 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 관련되어 있는 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 미소구체(microsphere)(유니라멜라(unilamellar) 및 멀티라멜라(multilamella) 소낭(vesicle), 예를 들어, 리포솜을 포함함), 에멀젼 중 분산상, 미쉘, 또는 현탁액 중 내부상(internal pahse)을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전달을 위해 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제형은 다가음이온(polyanion), 예컨대 핵산을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질(즉, 비하전된 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 지질), 음이온성 지질, 형질주입을 증강시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스(stealth) 지질이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는 예를 들어, WO 2016/010840 A1호 및 WO 2017/173054 A1호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 예시적인 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일례에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤 및 중성 지질, 예컨대 DSPC를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤, 선택적인 중성 지질, 예컨대 DSPC, 및 스텔스 지질, 예컨대 S010, S024, S027, S031, 또는 S033을 포함할 수 있다.
LNP는 하기 중 하나 이상 또는 모두를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화를 위한 그리고 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 헬퍼 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예를 들어, 문헌[Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 소정의 LNP에서, 카고(cargo)는 뉴클레아제 제제를 추가로 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 핵산 작제물을 포함할 수 있다.
캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질은 양이온성 지질일 수 있다. 지질은 또한, 생분해성 지질, 예컨대 생분해성 이온화 가능한 지질일 수 있다. 적합한 지질의 일례는 지질 A 또는 LP01이며, 이는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트라고도 하는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트이다. 예를 들어, 문헌[Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 B이며, 이는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)라고도 하는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 C이며, 이는 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 D이며, 이는 3-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트리데실 3-옥틸운데카노에이트이다. 다른 적합한 지질은 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(Dlin-MC3-DMA(MC3)로도 알려져 있음)를 포함한다.
본원에 기재된 LNP에서 사용하기에 적합한 일부 이러한 지질은 생체내에서 생분해성이다. 예를 들어, 이러한 지질을 포함하는 LNP는 적어도 75%의 지질이 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 내에 혈장으로부터 청소되는 것을 포함한다. 또 다른 예로, 적어도 50%의 LNP는 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 내에 혈장으로부터 청소된다.
이러한 지질은 이것이 존재하는 배지의 pH에 따라 이온화 가능할 수 있다. 예를 들어, 약간의 산성 배지에서, 지질은 양성자화(protonate)되어서 양전하를 보유할 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약간의 염기성 배지에서, 지질은 양성화되지 않으므로 전하를 보유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 적어도 약 9, 9.5, 또는 10의 pH에서 양성자화될 수 있다. 전하를 보유하는 이러한 지질의 능력은 이의 내재성(intrinsic) pKa와 관련이 있다. 예를 들어, 지질은 독립적으로, 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 가질 수 있다.
중성 지질은 LNP의 가공을 안정화시키고 향상시키는 작용을 한다. 적합한 중성 지질의 예는 여러 가지 중성, 비하전된 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 5- 헵타데실벤젠-1,3-디올(레조르시놀), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 달걀(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
헬퍼 지질은 형질주입을 증강시키는 지질을 포함한다. 헬퍼 지질이 형질주입을 증강시키는 기전은 입자 안정성을 증강시키는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 경우, 헬퍼 지질은 막 융합원성(fusogenicity)을 증강시킬 수 있다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 적합한 헬퍼 지질의 예는 적합한 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트를 포함한다. 일례에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트일 수 있다.
스텔스 지질은, 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경시키는 지질을 포함한다. 스텔스 지질은 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제형 과정에 일조할 수 있다. 스텔스 지질은 LNP의 약물동력학적 특성을 조절할 수 있다. 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기(head group)를 갖는 지질을 포함한다.
스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 예를 들어, PEG(이따금 폴리(에틸렌 옥사이드)로 지칭됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N- 비닐피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드에 기초한 중합체로부터 선택되는 중합체 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 PEG는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 중합체를 의미한다. 소정의 LNP 제형에서, PEG는 PEG 2000이라고도 하는 PEG-2K이며, 이는 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
스텔스 지질의 지질 모이어티는 예를 들어, 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화된 또는 불포화된 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함하여 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래될 수 있으며, 상기 사슬은 예를 들어, 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다.
일례로, 스텔스 지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디라우일글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, 및 PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤(l-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)으로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정 예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다.
LNP는 상이한 각각의 몰비의 성분 지질을 제형에 포함할 수 있다. CCD 지질의 몰%는 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 42 몰% 내지 약 47 몰%, 또는 약 45%일 수 있다. 헬퍼 지질의 몰%는 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 41 몰% 내지 약 46 몰%, 또는 약 44 몰%일 수 있다. 중성 지질의 몰%는 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 20 몰%, 약 5 몰% 내지 약 15 몰%, 약 7 몰% 내지 약 12 몰%, 또는 약 9 몰%일 수 있다. 스텔스 지질의 몰%는 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 10 몰%, 약 1 몰% 내지 약 5 몰%, 약 1 몰% 내지 약 3 몰%, 약 2 몰%, 또는 약 1 몰%일 수 있다.
LNP는, 캡슐화되는 생분해성 지질의 양으로 하전된 아민기(N)와 핵산의 음으로 하전된 포스페이트기(P) 사이에서 상이한 비를 가질 수 있다. 이는 방정식 N/P에 의해 수학적으로 표시될 수 있다. 예를 들어, N/P 비는 약 0.5 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 7, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5일 수 있다.
일부 LNP에서, 카고는 Cas mRNA 및 gRNA를 포함할 수 있다. Cas mRNA 및 gRNA는 상이한 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, LNP 제형은 약 25:1 내지 약 1:25 범위, 약 10:1 내지 약 1:10 범위, 약 5:1 내지 약 1:5 범위, 또는 약 1:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:1 내지 약 1:5, 또는 약 10:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:10, 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:1 내지 약 1:2의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, Cas mRNA 대 gRNA의 비는 약 1:1 또는 약 1:2일 수 있다.
LNP의 예시적인 투여량은 총 RNA(Cas9 mRNA 및 gRNA) 카고 함량을 기준으로, 약 0.1, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 8, 또는 약 10 mg/kg 체중(mpk) 또는 약 0.1 내지 약 10, 약 0.25 내지 약 10, 약 0.3 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 10, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 8, 약 0.1 내지 약 6, 약 0.1 내지 약 5, 약 0.1 내지 약 4, 약 0.1 내지 약 3, 약 0.1 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.3, 약 0.1 내지 약 0.25, 약 0.25 내지 약 8, 약 0.3 내지 약 6, 약 0.5 내지 약 5, 약 1 내지 약 5, 또는 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중을 포함한다. 이러한 LNP는 예를 들어, 정맥내로 투여될 수 있다. 일례에서, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 0.3 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 3, 또는 약 10 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. LNP의 추가의 예시적인 투여량은 총 RNA(Cas9 mRNA 및 gRNA) 카고 함량을 기준으로, 약 0.1, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 8, 또는 약 10 mg/kg(mpk) 체중 또는 약 0.1 내지 약 10, 약 0.25 내지 약 10, 약 0.3 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 10, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 8, 약 0.1 내지 약 6, 약 0.1 내지 약 5, 약 0.1 내지 약 4, 약 0.1 내지 약 3, 약 0.1 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.3, 약 0.1 내지 약 0.25, 약 0.25 내지 약 8, 약 0.3 내지 약 6, 약 0.5 내지 약 5, 약 1 내지 약 5, 또는 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중을 포함한다. 이러한 LNP는 예를 들어, 정맥내로 투여될 수 있다. 일례에서, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 0.3 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 10 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 약 0.5 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 5, 약 0.5 내지 약 3, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다.
V. 핵산 작제물 및/또는 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물
본원에 개시된 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자 및 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원에 개시된 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 뉴클레아제 제제는 RS1 유전자 또는 좌위를 표적화함) 또는 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 지질 나노입자를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 예를 들어, 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 데 사용하기 위한 또는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 코딩 서열을 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합하는 데 사용하기 위한 것일 수 있다. 이러한 조성물은 또한 예를 들어, X-연관 연소 망막층간분리(XLRS)를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 것일 수 있다. 이러한 조성물은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물(또는 핵산 작제물을 포함하는 벡터 또는 지질 나노입자) 및 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다. 뉴클레아제 제제는 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, Cas 단백질 및 가이드 RNA) 또는 임의의 다른 적합한 뉴클레아제 제제일 수 있다. 적합한 뉴클레아제 제제의 예는 아래에 제공된다.
A. CRISPR/Cas 시스템
본원에 개시된 방법 및 조성물은 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부(CRISPR: Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)/CRISPR-관련(Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 이용하여 세포 내의 게놈(예를 들어, RS1 좌위)을 변형시킬 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는(directing) 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III 시스템, 또는 유형 V 시스템(예를 들어, 서브유형 V-A 또는 서브유형 V-B)일 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위-안내 결합 또는 절단을 위해 Cas와 복합체화된 CRISPR 복합체(가이드 RNA(gRNA)를 포함함)를 이용함으로써 CRISPR/Cas 시스템을 이용할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 비-천연 발생일 수 있다. "비-천연적으로 발생하는" 시스템은 인위적인 관여를 나타내는 임의의 것, 예컨대 이의 천연적으로 발생하는 상태로부터 변경되거나 돌연변이화되거나, 이것이 자연상에서 천연적으로 관련된 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없거나, 이것이 천연적으로 관련이 있지 않는 적어도 하나의 다른 성분과 관련이 있는 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은, 천연적으로 함께 발생하지 않는 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하는 비-천연 발생 CRISPR 복합체를 이용하거나, 천연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질을 이용하거나, 천연적으로 발생하지 않는 gRNA를 이용하지 않는다.
1. Cas 단백질
Cas 단백질은 일반적으로, 가이드 RNA와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한, 뉴클레아제 도메인(예를 들어, DNase 도메인 또는 RNase 도메인), DNA-결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 및 다른 도메인을 포함할 수 있다. 일부 이러한 도메인(예를 들어, DNase 도메인)은 네이티브(native) Cas 단백질로부터의 것일 수 있다. 다른 이러한 도메인이 첨가되어, 변형된 Cas 단백질을 만들 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 핵산 절단에 대해 촉매 활성을 소유하며, 이는 핵산 분자의 공유 결합의 절단을 포함한다. 절단은 평활 단부(blund end) 또는 엇갈린 단부(staggered end)를 생성할 수 있으며, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로, 평활 절단 생성물을 생성할 것이다. 대안적으로, 야생형 Cpf1 단백질(예를 들어, FnCpf1)은 5-뉴클레오타이드 5' 오버행을 갖는 절단 생성물을 초래할 수 있으며, 상기 절단은 비-표적화된 가닥 상의 PAM 서열로부터 18번째 염기쌍 다음에, 그리고 표적화된 가닥 상의 23번째 염기 다음에 발생한다. Cas 단백질은 표적 게놈 좌위에서 이중-가닥 절단부(예를 들어, 평활 단부를 갖는 이중-가닥 절단부)를 생성하기 위해 완전 절단 활성을 가질 수 있거나, Cas 단백질은 표적 게놈 좌위에서 단일-가닥 절단부를 생성하는 닉카제일 수 있다.
Cas 단백질의 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이의 상동체 또는 변형된 버전을 포함한다.
예시적인 Cas 단백질은 Cas9 단백질, 또는 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 것이며, 전형적으로 보존된 구조를 갖는 4개의 주요 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토콕커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토콕커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토콕커스 종(Streptococcus sp.), 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다쏜빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티내스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실루스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스실라 마리나(Microscilla marina), 부르콜데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스패라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 미크로사이스티스 애루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네코콕커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시룹토르 벡스치이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라내로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 악시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 악시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소콕커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소콕커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나배나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르쓰로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르쓰로스피라 종(Arthrospira sp.), 라인그바이아 종(Lyngbya sp.), 미크로콜레우스 크쏘노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오스칠라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 아카라이오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 또는 캄필로박터 예유니(Campylobacter jejuni)로부터의 것이다. Cas9 패밀리 구성원의 추가 예는 국제공개 WO 2014/131833에 기재되어 있으며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 에스. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9(SpCas9)(예를 들어, 지정된 UniProt 수탁 번호 Q99ZW2)는 예시적인 Cas9 단백질이다. 예시적인 SpCas9 단백질 서열은 SEQ ID NO: 27(SEQ ID NO: 26으로 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)로 표시된다. 예시적인 SpCas9 cDNA 서열은 SEQ ID NO: 28로 표시된다. 더 작은 Cas9 단백질(예를 들어, 가이드 RNA 코딩 서열 및 Cas9와 가이드 RNA에 대한 조절 요소와 조합될 때 코딩 서열이 최대 AAV 포장 수용력과 양립성인 Cas9 단백질, 예컨대 SaCas9 및 CjCas9와 Nme2Cas9)은 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 에스. 아우레우스(S. aureus)로부터의 Cas9(SaCas9)(표기된 UniProt 수탁 번호 J7RUA5)는 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 마찬가지로, 캄필로박터 예유니(Campylobacter jejuni)로부터의 Cas9(CjCas9)(표기된 UniProt 수탁 번호 Q0P897)는 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Kim 등 (2017) Nat. Commun. 8:14500]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. SaCas9는 SpCas9보다 더 작고, CjCas9는 SaCas9와 SpCas9 둘 다보다 작다. 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 Cas9(Nme2Cas9)는 또 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Edraki 등 (2019) Mol. Cell 73(4):714-726]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 스트렙토콕커스 써모필루스로부터의 Cas9 단백질(예를 들어, CRISPR1 좌위에 의해 인코딩되는 스트렙토콕커스 써모필루스 LMD-9 Cas9(St1Cas9) 또는 CRISPR3 좌위로부터의 스트렙토콕커스 써모필루스 Cas9(St3Cas9))는 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 프란치셀라 보디치다로부터의 Cas9(FnCas9), 또는 대안적인 PAM(E1369R/E1449H/R1556A 치환)을 인식하는 RHA 프란치셀라 보디치다 Cas9 변이체는 다른 예시적인 Cas9 단백질이다. 이들 및 다른 예시적인 Cas9 단백질은 예를 들어, 문헌[Cebrian-Serrano 및 Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261]에서 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. Cas9 코딩 서열, Cas9 mRNA, 및 Cas9 단백질 서열은 국제공개 WO 2013/176772호, WO 2014/065596호, WO 2016/106121호, 및 WO 2019/067910호에 제공되어 있으며, 이들 각각의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. ORF 및 Cas9 아미노산 서열의 구체적인 예는 WO 2019/067910호의 단락 [0449]의 표 30에 제공되고, Cas9 mRNA 및 ORF의 구체적인 예는 WO 2019/067910호의 단락 [0214]-[0234]에 제공된다. 일례로, Cas9 단백질은 SEQ ID NO: 6242로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 이러한 Cas9 단백질은 SEQ ID NO: 6243을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 mRNA에 의해 인코딩될 수 있다. 또 다른 예로, Cas9 단백질은 SEQ ID NO: 6246으로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 이러한 Cas9 단백질은 SEQ ID NO: 6245를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 mRNA에 의해 인코딩될 수 있다.
Cas 단백질의 또 다른 예는 Cpf1(프레보텔라 및 프란치셀라 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은, Cas9의 특징적인 아르기닌-풍부 군집(cluster)에 대한 대응물(counterpart)과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 단백질(약 1300개 아미노산)이다. 그러나, Cpf1은, Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있고, RuvC-유사 도메인은, HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물(insert)을 함유하는 Cas9와 대조적으로 Cpf1 서열에서 인접해 있다. 예를 들어, 문헌[Zetsche 등 (2015) Cell 163(3):759-771]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 예시적인 Cpf1 단백질은 프란치셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 1, 프란치셀라 툴라렌시스 아종 보디치다(Francisella tularensis subsp. novicida), 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 라흐노스피라세애 박테리움(라흐노스피라세애 박테리움(lachnospiraceae bacterium)) MC2017 1, 부타이리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미쎌라 종(Smithella sp.) SCADC, 악시다미노콕커스 종(Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라흐노스피라세애 박테리움(라흐노스피라세애 박테리움(lachnospiraceae bacterium)) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 라흐노스피라세애 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르파이로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 및 포르파이로모나스 마카캐(porphyromonas macacae)로부터의 것이다. 프란치셀라 보디치다 U112로부터의 Cpf1(FnCpf1; UniProt 수탁 번호 A0Q7Q2로 지정됨)은 예시적인 Cpf1 단백질이다.
Cas 단백질은 야생형 단백질(즉, 자연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질(즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한, 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매적 활성에 관하여 활성(active) 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매적 활성에 관하여 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 상기 활성 변이체는 요망되는 절단 부위에서 절단하는 능력을 보유하므로, 닉-유도 또는 이중-가닥-절단부-유도 활성을 보유한다. 닉-유도 또는 이중-가닥-절단부-유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고, 일반적으로 절단 부위를 함유하는 DNA 기질 상에서의 Cas 단백질의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화도, 핵산 결합 특이성, 및 효소적 활성 중 하나 이상을 증가시키거나 저하시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한, 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성, 예컨대 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형, 결실 또는 불활성화될 수 있거나, Cas 단백질은 단백질의 기능에 본질적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 또는 Cas 단백질의 활성 또는 특성을 최적화하기 위해(예를 들어, 증강시키거나 감소시키기 위해) 절단될 수 있다.
변형된 Cas 단백질의 일례는 변형된 SpCas9-HF1 단백질이며, 이는 비-특이적 DNA 접촉을 감소시키도록 설계된 변경을 보유하는 스트렙토콕커스 피오게네스 Cas9의 고-충실도(high-fidelity) 변이체이다(N497A/R661A/Q695A/Q926A). 예를 들어, 문헌[Kleinstiver 등 (2016) Nature 529(7587):490-495]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 변형된 Cas 단백질의 또 다른 예는 표적-외(off-target) 효과를 감소시키도록 설계된 변형된 eSpCas9 변이체(K848A/K1003A/R1060A)이다. 예를 들어, 문헌[Slaymaker 등 (2016) Science 351(6268):84-88]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 다른 SpCas9 변이체는 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 포함한다. 이들 및 다른 변형된 Cas 단백질은 예를 들어, 문헌[Cebrian-Serrano 및 Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261]에서 검토되어 있으며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 변형된 Cas9 단백질의 또 다른 예는 xCas9이며, 이는 확장된 범위의 PAM 서열을 인식할 수 있는 SpCas9 변이체이다. 예를 들어, 문헌[Hu 등 (2018) Nature 556:57-63]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
Cas 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로, 아마도 이량체 배치(configuration)에서 표적 DNA의 양쪽 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 각각 이중-가닥 DNA의 상이한 가닥을 절단하여, DNA에서 이중-가닥 절단부를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jinek 등 (2012) Science 337:816-821]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
뉴클레아제 도메인 중 하나 이상 또는 모두는 결실되거나 돌연변이화될 수 있어서, 이들은 더 이상 기능적이지 않거나 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는다. 예를 들어, 뉴클레아제 도메인 중 하나가 Cas9 단백질에서 결실되거나 돌연변이화된다면, 생성된 Cas9 단백질은 닉카제로 지칭될 수 있고, 이중-가닥 절단부가 아니라 이중-가닥 표적 DNA 내에서 단일-가닥 절단부를 발생시킬 수 있다(즉, 이는 상보적 가닥과 비-상보적 가닥 둘 다가 아니라 둘 중 하나를 절단할 수 있음). 뉴클레아제 도메인 둘 다 결실되거나 돌연변이화된다면, 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 이중-가닥 DNA(예를 들어, 뉴클레아제-무효(null) 또는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질, 또는 촉매적으로 사멸된(dead) Cas 단백질(dCas))의 양쪽 가닥을 절단하는 감소된 능력을 가질 것이다. 뉴클레아제 도메인 중 어느 것도 Cas9 단백질에서 결실되지 않거나 돌연변이화되지 않는다면, Cas9 단백질은 이중-가닥-절단부-유도 활성을 유지할 것이다. Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 일례는 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 도메인 내의 D10A(Cas9의 위치 10에서 아스파르테이트로부터 알라닌으로의) 돌연변이이다. 마찬가지로, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 HNH 도메인 내 H939A(아미노산 위치 839에서 히스티딘으로부터 알라닌으로), H840A(아미노산 위치 840에서 히스티딘으로부터 알라닌으로), 또는 N863A(아미노산 위치 N863에서 아스파라긴으로부터 알라닌으로)는 Cas9를 닉카제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 닉카제로 전환시키는 돌연변이의 다른 예는 에스. 써모필루스(S. thermophilus)로부터의 Cas9에 대한 상응하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sapranauskas 등 (2011) Nucleic Acids Res. 39(21):9275-9282] 및 국제공개 WO 2013/141680호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 돌연변이는 부위-안내(directed) 돌연변이유발(mutagenesis), PCR-매개 돌연변이유발, 또는 전체 유전자 합성과 같은 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 닉카제를 생성하는 다른 돌연변이의 예는 예를 들어, 국제공개 WO 2013/176772호 및 WO 2013/142578호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 모든 뉴클레아제가 Cas 단백질에서 결실되거나 돌연변이화된다면(예를 들어, 뉴클레아제 도메인 Cas9 단백질에서 둘 다 결실되거나 돌연변이화된다면), 생성된 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)은 이중-가닥 DNA(예를 들어, 뉴클레아제-무효 또는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질)의 양쪽 가닥을 절단하는 감소된 능력을 가질 것이다. 하나의 구체적인 예는 D10A/H840A 에스. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 에스. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9 내의 상응하는 이중 돌연변이체이다. 또 다른 구체적인 예는 D10A/N863A 에스. 피오게네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 에스. 피오게네스 Cas9와 최적으로 정렬될 때 또 다른 종으로부터의 Cas9 내의 상응하는 이중 돌연변이체이다.
xCas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예는 SpCas9에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 스타필로콕커스 아우레우스 Cas9 단백질의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 스타필로콕커스 아우레우스 Cas9 효소(SaCas9)는 위치 N580에서 치환(예를 들어, N580A 치환) 및 위치 D10에서 치환(예를 들어, D10A 치환)을 포함하여, 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2016/106236호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. Nme2Cas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D16A 및 H588A의 조합). St1Cas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D9A, D598A, H599A, 및 N622A의 조합). St3Cas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D10A 및 N870A의 조합). CjCas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, D8A 및 H559A의 조합). FnCas9 및 RHA FnCas9의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다(예를 들어, N995A).
Cpf1 단백질의 촉매적 도메인에서의 불활성화 돌연변이의 예가 또한 알려져 있다. 프란치셀라 보디치다 U112(FnCpf1), 악시다미노콕커스 종 BV3L6(AsCpf1), 라흐노스피라세애 박테리움 ND2006(LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237(MbCpf1 Cpf1)로부터의 Cpf1 단백질에 관하여, 이러한 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 이종상동체 내 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 이종상동체 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어, AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 이종상동체 내 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A 또는 Cpf1 이종상동체 내 상응하는 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0208243을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
Cas 단백질은 또한, 이종성 폴리펩타이드에 융합 단백질로서 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인 또는 유전외적 변형 도메인에 융합될 수 있다. 국제공개 WO 2014/089290을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. Cas 단백질은 이종성 폴리펩타이드에 융합되어, 증가된 또는 저하된 안정성을 제공할 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종성 폴리펩타이드는 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 내부적으로 위치할 수 있다.
일례로, Cas 단백질은 세포내 위치화(subcellular localization)를 제공하는 하나 이상의 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 이종성 폴리펩타이드는 예를 들어, 핵으로의 표적화를 위한 하나 이상의 핵 위치 신호(NLS), 예컨대 단립(monopartite) SV40 NLS 및/또는 이분(bipartite) 알파-임포틴(importin) NLS, 미토콘드리아로의 표적화를 위한 미토콘드리아 위치 신호, ER 체류 신호 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lange 등 (2007) J. Biol. Chem. 282(8):5101-5105]를 참조하며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 세포 내 위치 신호는 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 어디에서나 위치할 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 신전부를 포함할 수 있고, 단립 서열 또는 이분 서열일 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질은 N-말단에서의 NLS(예를 들어, 알파-임포틴 NLS 또는 단립 NLS) 및 C-말단에서의 NLS(예를 들어, SV40 NLS 또는 이분 NLS)를 포함하여 2개 이상의 NLS를 포함할 수 있다. Cas 단백질은 또한, N-말단에 2개 이상의 NLS 및/또는 C-말단에 2개 이상의 NLS를 포함할 수 있다.
Cas 단백질은 예를 들어, 1 내지 10개의 NLS와 융합될 수 있다(예를 들어, 1 내지 5개의 NLS와 융합되거나 하나의 NLS와 융합될 수 있음). 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 Cas 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 연결될 수 있다. NLS는 또한, Cas 단백질 서열 내에 삽입될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 하나 초과의 NLS와 융합될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 2, 3, 4, 또는 5개의 NLS와 융합될 수 있다. 구체적인 예에서, Cas 단백질은 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 소정의 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나(예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 카르복시 말단에 연결된 2개의 SV40 NLS 서열에 융합될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 2개의 NLS와 융합될 수 있으며, 하나의 NLS는 N-말단에 연결되고 하나의 NLS는 C-말단에 연결된다. 다른 예에서, Cas 단백질은 3개의 NLS와 융합될 수 있거나 어떠한 NLS와도 융합되지 않을 수 있다. NLS는 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV(SEQ ID NO: 49) 또는 PKKKRRV(SEQ ID NO: 50)와 같이 단립 서열일 수 있다. NLS는 이분 서열, 예컨대 핵플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 51)일 수 있다. 구체적인 예에서, 단일 PKKKRKV(SEQ ID NO: 49) NLS는 Cas 단백질의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커는 선택적으로 융합 부위에 포함된다.
Cas 단백질은 또한, 세포-투과 도메인 또는 단백질 형질도입 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-투과 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스로부터의 TLM 세포-투과 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스로부터의 세포 투과 펩타이드, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 신호로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/089290호 및 WO 2013/176772호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 세포-투과 도메인은 Cas 단백질 내의 N-말단, C-말단, 또는 어디에서나 위치할 수 있다.
Cas 단백질은 또한, 추적(tracking) 또는 정제의 용이성을 위해 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 단량체성 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, eYFP, 시트린, 비너스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질(예를 들어, eBFP, eBFP2, 아주라이트, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어), 시안색 형광 단백질(예를 들어, eCFP, 세룰린, CyPet, AmCyanl, 미도리이시-시안색), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-탠덤, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 주황색 형광 단백질(예를 들어, mOrange, mKO, 쿠사비라-오렌지, 단량체성 쿠사비라-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 태그의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신(TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화도 정제(TAP: tandem affinity purification) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 헤마글루티닌(HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘(His), 비오틴 카르복실 담체 단백질(BCCP), 및 칼모듈린(calmodulin)을 포함한다.
Cas 단백질은 또한, 표지된 핵산 또는 공여자 서열에 테더링(tether)될 수 있다. 이러한 테더링(즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 달성될 수 있으며, 테더링은 직접적일 수 있거나(예를 들어, 단백질 상의 시스테인 또는 라이신 잔기의 변형 또는 인테인(intein) 변형에 의해 달성될 수 있는 직접적 융합 또는 화학적 접합을 통해), 하나 이상의 개입 링커 또는 어댑터 분자, 예컨대 스트렙타비딘 또는 앱타머를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pierce 등 (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55]; 문헌[Duckworth 등 (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46):8819-8822]; 문헌[Schaeffer 및 Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10):1328-1332]; 문헌[Goodman 등 (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557]; 및 문헌[Khatwani 등 (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539]를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 참조에 의해 본원에 포함된다. 단백질-핵산 접합체를 합성하기 위한 비공유 전략은 비오틴-스트렙타비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 접합체는, 적절하게 작용화된 핵산 및 단백질을 광범위하게 다양한 화학을 사용하여 연결함으로써 합성될 수 있다. 이들 화학 중 일부는 단백질 표면 상의 아미노산 잔기(예를 들어, 라이신 아민 또는 시스테인 티올)에의 올리고뉴클레오타이드의 직접적 부착을 수반하는 한편, 다른 더욱 복잡한 계획은 단백질의 번역-후 변형 또는 촉매적 또는 반응성 단백질 도메인의 수반을 필요로 한다. 핵산에의 단백질의 공유 부착 방법은 예를 들어, 단백질 라이신 또는 시스테인 잔기에의 올리고뉴클레오타이드의 화학적 가교, 발현된 단백질-리게이션, 화학효소적 방법, 및 포토앱타머(photoaptamer)의 사용을 포함할 수 있다. 표지된 핵산 또는 공여자 서열은 Cas 단백질 내의 C-말단, N-말단에, 또는 내부 영역에 테더링될 수 있다. 일례에서, 표지된 핵산 또는 공여자 서열은 Cas 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 테더링된다. 마찬가지로, Cas 단백질은 표지된 핵산 또는 공여자 서열 내의 5' 단부, 3' 단부에, 또는 내부 영역에 테더링될 수 있다. 다시 말해, 표지된 핵산 또는 공여자 서열은 임의의 배향 및 극성으로 테더링될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 표지된 핵산 또는 공여자 서열 내의 5' 단부 또는 3' 단부에 테더링될 수 있다.
Cas 단백질은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA와 복합체화된 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대 RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)) 또는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. 선택적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산이 세포 내로 도입될 때, 상기 Cas 단백질은 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
mRNA로서 제공된 Cas 단백질은 향상된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위해 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오사이드에 이루어질 수 있다. mRNA 핵염기(nucleobase)에 대한 화학적 변형의 예는 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. 예를 들어, N1-메틸 슈도우리딘을 함유하는 캡핑(capped)되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다. 마찬가지로, Cas mRNA는 동의 코돈을 사용한 우리딘의 결핍에 의해 변형될 수 있다.
Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합되고 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 작제물에서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 관심 유전자 또는 다른 핵산 서열(예를 들어, Cas 유전자)의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함하고, 이는 이러한 관심 핵산 서열을 표적 세포로 이전시킬 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이는, gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터와는 별개인 벡터 또는 플라스미드에 존재할 수 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 만능성 세포, 배아 줄기(ES)세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포(progenitor cell), 유도 만능성 줄기(iPS)세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 하나의 방향에서 Cas 단백질과 다른 방향에서 가이드 RNA 둘 다의 발현을 구동하는 양방향성 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소를 함유하는 완전한 종래의 일방향적 Pol III 프로모터: 원위부 서열 요소(DSE), 근위부 서열 요소(PSE), 및 TATA 박스; 및 (2) 역배향에서 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스 및 PSE를 포함하는 제2 기본(basic) Pol III 프로모터로 구성될 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는, U6 프로모터로부터 유래된 TATA 박스 및 PSE를 부착함으로써 역방향에서의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성으로 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0074535호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. Cas 단백질을 인코딩하는 유전자 및 가이드 RNA를 발현하기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 동시에, 전달을 용이하게 하기 위해 컴팩트(compact) 발현 카세트의 발생을 가능하게 한다.
상이한 프로모터는 Cas 발현 또는 Cas9 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 일부 방법에서, 작은 프로모터가 사용되어, Cas 또는 Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물 내로 적합화될 수 있다. 예를 들어, Cas 또는 Cas9 및 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 1개의 gRNA 또는 2개의 gRNA 또는 3개의 gRNA 또는 4개의 gRNA)는 LNP-매개 전달(예를 들어, RNA의 형태) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)-매개 전달(예를 들어, AAV2-매개 전달, AAV5-매개 전달, AAV8-매개 전달, 또는 AAV7m8-매개 전달)을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 CRISPR/Cas9일 수 있고, 내인성 RS1 좌위(예를 들어, RS1의 인트론 1)를 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA는 LNP-매개 전달을 통해 전달될 수 있거나, 내인성 RS1 좌위(예를 들어, RS1의 인트론 1)를 표적화하는 Cas9를 인코딩하는 DNA 및 gRNA를 인코딩하는 DNA는 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. Cas 또는 Cas9 및 gRNA(들)는 단일 AAV에서 또는 2개의 별개의 AAV를 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 유사하게는, 제1 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 2개 이상의 gRNA 발현 카세트를 운반할 수 있다. 대안적으로, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 유사하게는, 단일 AAV는 Cas 또는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas 또는 Cas9 코딩 서열) 및 2개 이상의 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있다. 상이한 프로모터는 gRNA, 예컨대 U6 프로모터 또는 작은 tRNA Gln의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 상이한 프로모터가 Cas9 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 작은 프로모터가 사용되어, Cas9 코딩 서열은 AAV 작제물 내로 적합화(fit)될 수 있다. 유사하게는, 작은 Cas9 단백질(예를 들어, SaCas9 또는 CjCas9)은 AAV 포장 수용력(capacity)을 최대화하는 데 사용된다.
mRNA로서 제공된 Cas 단백질은 향상된 안정성 및/또는 면역원성 특성을 위해 변형될 수 있다. 변형은 mRNA 내의 하나 이상의 뉴클레오사이드에 이루어질 수 있다. mRNA 핵염기(nucleobase)에 대한 화학적 변형의 예는 슈도우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 및 5-메틸-시티딘을 포함한다. Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 캡핑될 수 있다. 캡은 예를 들어, 1+ 리보뉴클레오타이드가 리보스의 2'O 위치에서 메틸화되는 캡 1 구조일 수 있다. 캡핑은 예를 들어, 생체내에서(예를 들어, 천연 캡을 모방함으로써) 우수한 활성을 제공할 수 있으며, 숙주의 내재성 면역계의 자극을 감소시키는 천연 구조를 이끌 수 있다(예를 들어, 내재성 면역계에서 패턴 인식 수용체의 활성화를 감소시킬 수 있음). Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 폴리아데닐화(폴리(A) 테일을 포함함)될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 mRNA는 또한 슈도우리딘을 포함하도록 변형될 수 있다(예를 들어, 슈도우리딘으로 완전히 치환될 수 있음). 또 다른 예로, N1-메틸 슈도우리딘을 함유하는 캡핑(capped)되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다. 또 다른 예로, 슈도우리딘으로 완전히 치환된 Cas mRNA가 사용될 수 있다(즉, 모든 표준 우라실 잔기는, 우라실이 질소-탄소보다는 탄소-탄소 결합으로 부착되는 우리딘 이성질체인 슈도우리딘으로 대체됨). 마찬가지로, Cas mRNA는 동의 코돈을 사용한 우리딘의 결핍에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 슈도우리딘으로 완전히 치환된, 캡핑되고 폴리아데닐화된 Cas mRNA가 사용될 수 있다.
Cas mRNA는 적어도 하나의, 복수의, 또는 모든 우리딘 위치에 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 변형된 우리딘은 5 위치에서(예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로) 변형된 우리딘일 수 있다. 변형된 우리딘은 1 위치에서(예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로) 변형된 슈도우리딘일 수 있다. 변형된 우리딘은 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-요오도우리딘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸 슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-요오도우리딘의 조합이다. 일부 예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다.
본원에 개시된 Cas mRNA는 또한 5' 캡, 예컨대 Cap0, Cap1, 또는 Cap2를 포함할 수 있다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트리포스페이트를 통해 mRNA의 5'-으로부터(to)-3' 사슬의 제1 뉴클레오타이드의 5' 위치(즉, 제1 캡-근접(cap-proximal) 뉴클레오타이드)에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오타이드(이는 예를 들어, ARCA에 관해 추가로 변형될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 제1 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스와 제2 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 다 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 전사된 뉴클레오타이드의 리보스와 제2 전사된 뉴클레오타이드의 리보스는 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 각각 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스와 제2 캡-근접 뉴클레오타이드의 리보스는 둘 다 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Katibah 등 (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(33):12025-30] 및 문헌[Abbas 등 (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114(11):E2106-E2115]를 참조하며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 포함된다. 포유류 mRNA, 예컨대 인간 mRNA를 포함한 대부분의 내인성 고등 진핵생물 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap0, 및 Cap1과 Cap2와 상이한 다른 캡 구조는 인간과 같은 포유류에서 내재성 면역계의 성분, 예컨대 IFIT-1 및 IFIT-5에 의해 비자기(non-self)로서 인식되므로 면역원성일 수 있으며, 이는 유형 I 인터페론을 포함한 상승된 사이토카인 수준을 초래할 수 있다. 내재성 면역계의 성분, 예컨대 IFIT-1 및 IFIT-5는 또한, Cap1 또는 Cap2 이외의 캡과 mRNA의 결합을 위해 eIF4E와 경쟁하여, mRNA의 번역을 잠재적으로 저해할 수 있다.
캡은 공동-전사적으로(co-transcriptionally) 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA(안티-리버스 캡 유사체(anti-reverse cap analog); Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 AM8045)는 시험관내에서 개시 시 전사물 내로 혼입될 수 있는 구아닌 리보뉴클레오타이드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트리포스페이트를 포함하는 캡 유사체이다. ARCA는, 제1 캡-근접 뉴클레오타이드의 2' 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 이끈다. 예를 들어, 문헌[Stepinski 등 (2001) RNA 7:1486-1495]를 참조하며, 이의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7113) 또는 CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7133)는 Cap1 구조를 공동-전사적으로 제공하는 데 사용될 수 있다. CleanCapTM AG 및 CleanCapTM GG의 3'-O-메틸화된 버전은 또한, TriLink Biotechnologies로부터 각각 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로서 입수 가능하다.
대안적으로, 캡은 RNA에 전사-후에(post-transcriptionally) 첨가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아(Vaccinia) 캡핑 효소는 상업적으로 입수 가능하고(New England Biolabs 카탈로그 번호 M2080S), 이의 D1 하위단위에 의해 제공되는 RNA 트리포스파타제 및 구아닐릴트랜스퍼라제 활성, 및 이의 D12 하위단위에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼라제를 갖는다. 이와 같이, 이는 7-메틸구아닌을 RNA에 첨가하여, S-아데노실 메티오닌 및 GTP의 존재 하에 Cap0을 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Guo 및 Moss (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4023-4027] 및 문헌[Mao 및 Shuman (1994) J. Biol. Chem. 269:24472-24479]를 참조하며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 포함된다.
Cas mRNA는 폴리-아데닐화된(폴리-A 또는 폴리(A) 또는 폴리-아데닌) 테일을 추가로 포함할 수 있다. 폴리-A 테일은 예를 들어, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의 아데닌, 그리고 선택적으로 300개까지의 아데닌을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리-A 테일은 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
2. 가이드 RNA
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는, Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)에 결합하고 상기 Cas 단백질을 표적 DNA 내의 특정 위치로 표적화하는 RNA 분자이다. 가이드 RNA는 2개의 분절을 포함할 수 있다: "DNA-표적화 분절"("가이드 서열"이라고도 함) 및 "단백질-결합 분절". "분절"은 분자의 구획 또는 영역, 예컨대 RNA 내 뉴클레오타이드의 인접 신전부(stretch)를 포함한다. 일부 gRNA, 예컨대 Cas9에 대한 gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함할 수 있다: "활성자-RNA"(예를 들어, tracrRNA) 및 "표적자(targeter)-RNA"(예를 들어, CRISPR RNA 또는 crRNA). 다른 gRNA는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이며, 이는 "단일-분자 gRNA", "단일-가이드 RNA" 또는 "sgRNA"라고도 할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2013/176772호, WO 2014/065596호, WO 2014/089290호, WO 2014/093622호, WO 2014/099750호, WO 2013/142578호, 및 WO 2014/131833호를 참조하며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 또는 crRNA와 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)의 조합을 지칭할 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA 또는 sgRNA)로서 또는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA 또는 dgRNA)에서 회합될 수 있다. Cas9의 경우, 예를 들어, 단일-가이드 RNA는 tracrRNA에(예를 들어, 링커를 통해) 융합된 crRNA를 포함할 수 있다. Cpf1의 경우, 예를 들어, 표적 서열에의 결합 및/또는 이의 절단을 달성하기 위해 단지 crRNA가 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중-분자(즉, 모듈형) gRNA와 단일-분자 gRNA 둘 다 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, gRNA는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 gRNA 또는 이의 등가물이다. 본원에 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, gRNA는 에스. 아우레우스(S. aureus) Cas9 gRNA 또는 이의 등가물이다.
예시적인 2-분자 gRNA는 crRNA-유사("CRISPR RNA" 또는 "표적자-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사("트랜스-활성화 CRISPR RNA" 또는 "활성자-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 분절(단일-가닥) 및 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스 중 하나의 절반을 형성하는 뉴클레오타이드(즉, crRNA 테일)의 신전부 둘 다 포함한다. DNA-표적화 분절의 다운스트림(3')에 위치한 crRNA 테일의 일례는 GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO: 29) 또는 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 52)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 29 또는 52의 5' 단부에 결합되어, crRNA를 형성할 수 있다.
상응하는 tracrRNA(활성자-RNA)는, gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스 중 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 신전부를 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드의 신전부는 tracrRNA의 뉴클레오타이드의 신전부에 상보적이고 이와 혼성화하여, gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성한다. 이와 같이, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖고 있다고 할 수 있다. 예시적인 tracrRNA 서열은 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO: 30), AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 31), 또는 GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 32)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
crRNA와 tracrRNA 둘 다 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 혼성화하여 gRNA를 형성한다. crRNA만 필요한 시스템에서, crRNA는 gRNA일 수 있다. crRNA는, 표적 DNA의 상보적 가닥에 혼성화하는 단일-가닥 DNA-표적화 분절을 추가로 제공한다. 세포 내에서의 변형에 사용된다면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은, RNA 분자가 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mali 등 (2013) Science 339(6121):823-826]; 문헌[Jinek 등 (2012) Science 337(6096):816-821]; 문헌[Hwang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):227-229]; 문헌[Jiang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):233-239]; 및 문헌[Cong 등 (2013) Science 339(6121):819-823]을 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
주어진 gRNA의 DNA-표적화 분절(crRNA)은, 하기에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이 표적 DNA의 상보적 가닥 상의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 분절은 혼성화(즉, 염기쌍 형성(base pairing))을 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 이와 같이, DNA-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 다양할 수 있고, gRNA 및 표적 DNA가 상호작용할 상기 표적 DNA 내에서의 위치를 결정한다. 대상체 gRNA의 DNA-표적화 분절은 표적 DNA 내의 임의의 요망되는 서열에 혼성화하도록 변형될 수 있다. 천연 발생 crRNA는 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 따라 상이하지만, 종종 21 내지 46개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 직접 반복부(DR: direct repeat)에 의해 플랭킹되는 21 내지 72개 뉴클레오타이드 길이의 표적화 분절을 함유한다(예를 들어, 국제공개 WO 2014/131833호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적 참조로서 본원에 포함됨). 에스. 피오게네스의 경우, DR은 36개 뉴클레오타이드 길이이고, 표적화 분절은 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 3' 위치한 DR은 상응하는 tracrRNA에 상보적이고 이와 혼성화하며, 이는 다시 Cas 단백질에 결합한다.
DNA-표적화 분절은 예를 들어, 적어도 약 12개, 적어도 약 15개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 또는 적어도 약 40개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이러한 DNA-표적화 분절은 예를 들어, 약 12 내지 약 100개, 약 12 내지 약 80개, 약 12 내지 약 50개, 약 12 내지 약 40개, 약 12 내지 약 30개, 약 12 내지 약 25개, 약 12 내지 약 20개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 분절은 약 15 내지 약 25개 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 17 내지 약 20개 뉴클레오타이드, 또는 약 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오타이드)일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0024523호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 16 내지 20개 뉴클레오타이드 길이 또는 17 내지 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다. Cpf1의 경우, 전형적인 DNA-표적화 분절은 적어도 16개 뉴클레오타이드 길이 또는 적어도 18개 뉴클레오타이드 길이이다.
일례에서, DNA-표적화 분절은 약 20개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 그러나, 더 짧은 서열 및 더 긴 서열이 또한 표적화 분절(예를 들어, 15 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이)에 사용될 수 있다. DNA-표적화 분절과 상응하는 가이드 RNA 표적 서열 사이의 동일성 정도(degree)(또는 DNA-표적화 분절과 가이드 RNA 표적 서열의 다른 가닥 사이의 상보성의 정도)는 예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%일 수 있다. DNA-표적화 분절 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2, 3, 또는 4개의 미스매치를 함유할 수 있다(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열의 총 길이가 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 이상의 뉴클레오타이드인 경우). 예를 들어, 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절 및 상응하는 가이드 RNA 표적 서열은 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2, 3, 또는 4개의 미스매치를 함유할 수 있으며, 여기서 가이드 RNA 표적 서열의 총 길이는 20개 뉴클레오타이드이다.
일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절(즉, 가이드 서열)을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드로부터 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 이러한 가이드 서열의 예는 표 2 및 표 3에 표시된다.
가이드 RNA는 인간 RS1 유전자를 표적화할 수 있다. 일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절(즉, 가이드 서열)을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드로부터 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 인간 RS1 유전자를 표적화하고 표적-외(off-target) 효과를 피하도록 선택될 수 있다. 일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절(즉, 가이드 서열)을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드로부터 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 인간 RS1 유전자를 표적화할 수 있다. 일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절(즉, 가이드 서열)을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드로부터 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 마우스 Rs1 유전자를 표적화할 수 있다. 일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절(즉, 가이드 서열)을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절) 중 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)과 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 대안적으로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 4990-6241(예를 들어, SEQ ID NO: 5477 또는 5981) 중 임의의 하나로 표시된 서열(DNA-표적화 분절)의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드로부터 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다.
TracrRNA는 임의의 형태(예를 들어, 전장 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA) 및 다양한 길이일 수 있다. 이들은 1차 전사물 또는 가공된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA(단일-가이드 RNA의 파트로서, 또는 2-분자 gRNA의 파트와 별개의 분자로서)는 야생형 tracrRNA 서열 중 모두 또는 부분(예를 들어, 야생형 tracrRNA 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상 또는 약 이를 초과하는 뉴클레오타이드)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 에스. 피오게네스로부터의 야생형 tracrRNA 서열은 171-뉴클레오타이드, 89-뉴클레오타이드, 75-뉴클레오타이드, 및 65-뉴클레오타이드 버전을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Deltcheva 등 (2011) Nature 471(7340):602-607]; 국제공개 WO 2014/093661호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 단일-가이드 RNA(sgRNA) 내의 tracrRNA의 예는 sgRNA의 +48, +54, +67, 및 +85 버전 내에서 발견되는 tracrRNA 분절을 포함하며, 여기서, "+n"은 야생형 tracrRNA의 +n개 이하의 뉴클레오타이드가 sgRNA에 포함됨을 나타낸다. 미국 특허 제8,697,359호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 백분율은 적어도 60%(예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다. DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 백분율은 약 20개 인접(contiguous) 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 60%일 수 있다. 일례로, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 백분율은 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서의 약 14개 인접 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우, DNA-표적화 분절은 14개 뉴클레오타이드 길이인 것으로 여겨질 수 있다. 또 다른 예로, DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 상보성 백분율은 표적 DNA의 상보적 가닥의 5' 단부에서의 7개 인접 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 100%일 수 있고 나머지에 걸쳐 0%만큼 낮을 수 있다. 이러한 경우, DNA-표적화 분절은 7개 뉴클레오타이드 길이인 것으로 여겨질 수 있다. 일부 가이드 RNA에서, DNA-표적화 분절 내의 적어도 17개 뉴클레오타이드는 표적 DNA의 상보적 가닥에 상보적이다. 예를 들어, DNA-표적화 분절은 20개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 표적 DNA의 상보적 가닥과 1, 2 또는 3개의 미스매치를 포함할 수 있다. 일례에서, 미스매치는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif) 서열에 상응하는 상보적 가닥의 영역에 인접해 있지 않다(즉, PAM 서열의 역보체(reverse complement))(예를 들어, 미스매치는 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절의 5' 단부에 있거나, 미스매치는 PAM 서열에 상응하는 상보적 가닥의 영역으로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개 염기쌍만큼 떨어져 있음).
gRNA의 단백질-결합 분절은, 서로 상보적인 뉴클레오타이드의 2개 신전부를 포함할 수 있다. 단백질-결합 분절의 상보적 뉴클레오타이드는 혼성화하여, 이중-가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA)를 형성한다. 대상체 gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 결합된 Cas 단백질을, DNA-표적화 분절을 통해 표적 DNA 내의 특정 뉴클레오타이드 서열로 안내한다.
단일-가이드 RNA는 DNA-표적화 분절 및 스캐폴드 서열(즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가이드 RNA는 3' 스캐폴드 서열에 접합된 5' DNA-표적화 분절을 가질 수 있다. 예시적인 스캐폴드 서열은: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (버전 1; SEQ ID NO: 33); GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 2; SEQ ID NO: 34); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 3; SEQ ID NO: 35); GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 4; SEQ ID NO: 36);GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (버전 5; SEQ ID NO: 37); GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (버전 6; SEQ ID NO: 38); GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (버전 7; SEQ ID NO: 39); 또는 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (버전 8; SEQ ID NO: 53)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 가이드 sgRNA에서, 버전 6의 4개의 말단 U 잔기는 존재하지 않는다. 일부 sgRNA에서, 버전 6의 4개의 말단 U 잔기 중 단지 1, 2, 또는 3개가 존재한다. 본원에 개시된 임의의 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 가이드 RNA는 예를 들어, 가이드 RNA의 3' 단부 상의 임의의 예시적인 가이드 RNA 스캐폴드 서열에 융합된 가이드 RNA의 5' 단부 상에 DNA-표적화 분절을 포함할 수 있다. 즉, 본원에 개시된 임의의 DNA-표적화 분절은 임의의 하나의 상기 스캐폴드 서열의 5' 단부에 접합되어, 단일 가이드 RNA(키메라 가이드 RNA)를 형성할 수 있다.
가이드 RNA는 추가의 바람직한 특질(예를 들어, 변형된 또는 조절된 안정성; 세포 내 표적화; 형광 표지에 의한 추적; 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위 등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 다시 말해, 가이드 RNA는 캐노니컬 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 이에 더하여 사용되는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 또는 하나 이상의 비천연 및/또는 천연 발생 성분 또는 배치를 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 예를 들어, 5' 캡(cap)(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡(m7G)); 3' 폴리아데닐화된 테일(즉, 3' poly(A) 테일); 리보스위치(riboswitch) 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 가능하게 하기 위해); 안정성 제어 서열; dsRNA 듀플렉스(즉, 헤어핀)를 형성하는 서열; RNA를 하위세포 위치(예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 엽록체 등)로 표적화하는 서열; 추적을 제공하는 변형 또는 서열(예를 들어, 형광 분자에의 직접 접합, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에의 접합, 형광 검출을 가능하게 하는 서열 등); 단백질(예를 들어, 전사 활성자, 전사 억제자, DNA 메틸트랜스퍼라제, DNA 데메틸라제(demethylase), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제 등을 포함하여 DNA 상에 작용하는 단백질)에 대한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열; 및 이들의 조합을 포함한다. 변형의 다른 예는 조작된 스템 루프 듀플렉스 구조, 조작된 벌지(bulge) 영역, 스템 루프 듀플렉스 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2015/0376586호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 벌지는 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 이루어진 듀플렉스 내의 뉴클레오타이드의 홑(unpaired) 영역일 수 있다. 벌지는, 듀플렉스의 하나의 측면(side) 상에, X가 임의의 퓨린이고 Y가 반대 가닥 상의 뉴클레오타이드와 워블 쌍(wobble pair)을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드일 수 있는 홑 5'-XXXY-3', 및 듀플렉스의 다른 측면 상에 홑 뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
비변형된 핵산은 분해에 취약할 수 있다. 외인성 핵산은 또한 선천적 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입하고 면역원성을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 가이드 RNA는 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함한, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: (1) 포스포디에스테르 백본 연결부에서 비연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경 또는 대체(예시적인 백본 변형); (2) 리보스 당(sugar)의 구성원의 변경 또는 대체, 예컨대 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경 또는 대체(예시적인 당 변형); (3) 데포스포(dephospho) 링커에 의한 포스페이트 모이어티의 대체(예를 들어, 전체 대체)(예시적인 백본 변형); (4) 비캐노니컬 핵염기를 이용하는 것을 포함한 천연 발생 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (5) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형(예시적인 백본 변형); (6) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형(예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡, 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음)); 및 (7) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형). 다른 가능한 가이드 RNA 변형은 우라실 또는 폴리-우라실 트랙트(tract)의 변형 또는 대체를 포함한다. 예를 들어, 국제공개 WO 2015/048577호 및 미국 특허출원공개 US 2016/0237455호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 유사한 변형은 Cas-인코딩 핵산, 예컨대 Cas mRNA에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Cas mRNA는 동의 코돈을 사용한 우리딘의 결핍에 의해 변형될 수 있다.
상기 나열된 이러한 호스(hose)에서의 화학적 변형은 조합되어, 2, 3, 4개 이상의 변형을 가질 수 있는 잔기(뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드)를 포함하는 변형된 gRNA 및/또는 mRNA를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일례에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다(예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트기, 예컨대 포스포로티오에이트기를 가짐). 예를 들어, gRNA의 모든 또는 실질적으로 모든 포스페이트기는 포스포로티오에이트기로 대체될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 gRNA는 5' 단부에 또는 그 부근에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 gRNA는 3' 단부에 또는 그 부근에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함할 수 있다.
일부 gRNA는 1, 2, 3개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변형된 gRNA 내 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 위치는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드일 수 있다.
비변형된 핵산은 분해에 취약할 수 있다. 외인성 핵산은 또한 선천적 면역 반응을 유도할 수 있다. 변형은 안정성을 도입하고 면역원성을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 본원에 기재된 일부 gRNA는 세포내 또는 혈청-기초 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 일부 변형된 gRNA는 세포 집단 내로 도입될 때 감소된 내재성 면역 반응을 나타낼 수 있다.
본원에 개시된 gRNA는, 산소 중 하나 이상을 상이한 치환기로 대체함으로써 변형되는 잔기의 포스페이트기가 변형될 수 있는 백본 변형을 포함할 수 있다. 변형은 비변형된 포스페이트 모이어티를 본원에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트기로 전체적으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 포스페이트 백본의 백본 변형은 또한, 비하전된 링커 또는 비대칭성 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 이끄는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형된 포스페이트기 내의 인 원자는 비카이랄(achiral)이다. 그러나, 비브릿지형(non-bridging) 산소 중 하나를 상기 원자 또는 원자군 중 하나로 대체하는 것은 인 원자를 카이랄로 되게 할 수 있다. 입체형성(stereogenic) 인 원자는 "R" 배치(Rp) 또는 "S" 배치(Sp)를 소유할 수 있다. 백본은 또한, 브릿지형 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(브릿지화된 포스포로아미데이트), 황(브릿지화된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브릿지화된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결형 산소에서 또는 연결형 산소 중 둘 다에서 발생할 수 있다.
포스페이트기는 소정의 백본 변형에서 비-인 함유 커넥터에 의해 대체될 수 있다. 소정의 구현예에서, 하전된 포스페이트기는 중성 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 제한 없이, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한 작제될 수 있으며, 여기서 포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대리물(surrogate)에 의해 대체된다. 이러한 변형은 백본 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대리물 백본에 의해 테더링(tether)될 수 있다. 예는 제한 없이, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대리물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형을 당 기(sugar group)(당 변형)에 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 변형(예를 들어, 다수의 상이한 옥시 또는 데옥시 치환기로 대체)될 수 있다. 2' 하이드록실기에의 변형은, 하이드록실이 더 이상 탈양성자화되어 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 증강시킬 수 있다.
2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서"R"는 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR을 포함할 수 있으며, 여기서 R은 예를 들어, H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있다. 2' 하이드록실기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 마찬가지로, 2' 하이드록실기 변형은 2'-플루오로 변형일 수 있으며, 이는 2' 하이드록실기를 플루오라이드로 대체한다. 2' 하이드록실기 변형은 잠금 핵산(LNA: locked nucleic acid)을 포함할 수 있으며, 여기서 2' 하이드록실은 예를 들어, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있고, 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 2' 하이드록실기 변형은 비잠금 핵산(UNA: unlocked nucleic acid)을 포함할 수 있으며, 여기서 리보스 고리는 C2'-C3' 결합이 결여되어 있다. 2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE)(OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
데옥시 2' 변형은 수소(즉, 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 오버행 위치에서 데옥시리보스 당); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노(여기서 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서 아미노는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서 R은 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 선택적으로 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노로 치환될 수 있다.
당 변형은 당 기를 포함할 수 있으며, 이는 또한 리보스의 상응하는 탄소의 배치보다는 반대의 입체화학적 배치를 소유하는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 그러므로, 변형된 핵산은 예를 들어, 아라비노스를 당으로서 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기성(abasic) 당(sugar)을 포함할 수 있다. 이들 무염기성 당은 또한, 구성분 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한, L 형태로 존재하는 하나 이상의 당을 포함할 수 있다(예를 들어, L-뉴클레오사이드).
변형된 핵산 내로 혼입될 수 있는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기라고도 하는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 및 우라실(U)을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 이들 핵염기는, 변형된 핵산 내로 혼입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 전체적으로 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 독립적으로, 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 예를 들어, 염기의 천연-발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA에서, 각각의 crRNA 및 tracrRNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracrRNA의 하나의 단부 또는 단부 둘 다에 존재할 수 있다. sgRNA에서, sgRNA의 하나의 단부 또는 단부 둘 다에서의 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있고/있거나 내부 뉴클레오사이드가 변형될 수 있고/있거나 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 gRNA는 5' 단부 변형을 포함한다. 일부 gRNA는 3' 단부 변형을 포함한다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 국제공개 WO 2018/107028 A1호에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 미국출원 US 2017/0114334호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 개시된 가이드 RNA는 국제공개 WO 2017/136794호, WO 2017/004279호, 미국출원 US 2018/0187186호, 또는 US 2019/0048338호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함할 수 있으며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
일례로, 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다(예를 들어, 염기는, 포스포로티오에이트기인 변형된 포스페이트기를 가질 수 있음). 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부의 2, 3, 또는 4개 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 연결부를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부에서의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부(예를 들어, 5' 단부)의 2, 3, 또는 4개 말단 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2017/173054 A1호 및 문헌[Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235]를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 다른 가능한 변형은 본원 어디에서나 더욱 상세히 기재되어 있다. 하나의 구체적인 예에서, 가이드 RNA는 처음 3개 5' 및 3' 말단 RNA 잔기에 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함한다. 또 다른 구체적인 예에서, 가이드 RNA는, Cas9 단백질과 상호작용하지 않는 모든 2'OH 기가 2'-O-메틸 유사체로 대체되도록 변형되며, Cas9와의 최소 상호작용을 갖는 가이드 RNA의 테일(tail) 영역은 5' 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부로 변형된다. 추가로, DNA-표적화 분절은 동일한 염기 상에 2'-플루오로 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yin 등 (2017) Nat. Biotech. 35(12):1179-1187]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 변형된 가이드 RNA의 다른 예는 예를 들어, WO 2018/107028 A1호에 제공되어 있으며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 화학적 변형은 예를 들어, 엑소뉴클레아제로부터 가이드 RNA에 대한 더 큰 안정성 및 보호를 제공하여, 이들이 비변형된 가이드 RNA보다 더 오랫동안 세포 내에서 지속되게 할 수 있다. 이러한 화학적 변형은 또한 예를 들어, RNA를 적극적으로(actively) 분해할 수 있는 선천적 세포내 면역 반응으로부터 보호하거나, 세포 사멸을 유발하는 면역 캐스케이드를 촉발할 수 있다.
일례로, 본원에 기재된 임의의 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 일례에서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 사이에서의 포스포로티오에이트(PS) 결합, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적어도 하나의 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일례에서, 본원에 기재된 가이드 RNA는 하나 이상의 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 사이에서의 하나 이상의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
변형은 가이드 RNA 내의 임의의 곳에서 발생할 수 있다. 일례로, 가이드 RNA는 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하거나, 가이드 RNA는 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하거나, 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 가이드 RNA는 상기 가이드 RNA의 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합, 상기 가이드 RNA의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 가이드 RNA는 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일례에서, 변형된 gRNA는 하기 서열을 포함할 수 있으며: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 44), 여기서 "N"은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드일 수 있으며, N 잔기의 전체는 본원에 기재된 바와 같은 RS1 DNA-표적화 분절을 포함한다(예를 들어, SEQ ID NO: 44로 표시된 서열로서, 여기서 N 잔기는 SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나, 또는 SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나, 또는 SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나, 또는 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나, 또는 SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나(예를 들어, 5477 또는 5981)의 DNA-표적화 분절로 대체됨). 용어 "mA," "mC," "mU," 및 "mG"는 2'-O-Me로 변형되었던 뉴클레오타이드(각각 A, C, U, 및 G)를 의미한다. 부호 "*"는 포스포로티오에이트 변형을 도시한다. 포스포로티오에이트 연결부 또는 결합은, 황이 포스포디에스테르 연결부에서, 예를 들어 뉴클레오타이드 염기 사이의 결합에서 하나의 비브릿지형(nonbridging) 포스페이트 산소에 대해 치환되는 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오타이드를 생산하는 데 사용될 때, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 S-올리고로 지칭될 수 있다. 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 포스포로티오에이트 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "mA*," "mC*," "mU*," 및 "mG*"는 2'-O-Me로 치환되었고 포스포로티오에이트 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결되는 뉴클레오타이드(각각 A, C, U, 및 G)를 의미한다.
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 주는 것으로 나타난 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리 상에서의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다. 무염기성 뉴클레오타이드는 질소형성 염기가 결여된 것을 지칭한다. 역전된 염기는, 정상적인 5'으로부터 3' 연결부로부터 역전된 연결부(즉, 5'으로부터 5' 연결부 또는 3'으로부터 3' 연결부)를 갖는 것을 지칭한다.
무염기성 뉴클레오타이드는 역전된 연결부를 이용하여 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기성 뉴클레오타이드는 5'으로부터 5' 연결부를 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 무염기성 뉴클레오타이드는 3'으로부터 3' 연결부를 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드에서의 역전된 무염기성 뉴클레오타이드는 역전된 무염기성 단부 캡이라고도 할 수 있다.
일례에서, 5' 말단에서의 처음 3, 4, 또는 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상, 및 3' 말단에서의 마지막 3, 4, 또는 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된다. 변형은 예를 들어, 2'-O-Me, 2'-F, 역전된 무염기성 뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키는 것으로 잘 알려진 다른 뉴클레오타이드 변형일 수 있다.
또 다른 예에서, 5' 말단에서의 처음 4개 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 4개 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결될 수 있다.
또 다른 예에서, 5' 말단에서의 처음 3개 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 3개 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 5' 말단에서의 처음 3개 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 3개 뉴클레오타이드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 5' 말단에서의 처음 3개 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 3개 뉴클레오타이드는 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 2개의 분자(별개의 crRNA 및 tracrRNA)로서 또는 1개의 분자(sgRNA)로서 RNA의 형태로, 그리고 선택적으로 Cas 단백질과의 복합체의 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 또한, 상기 gRNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 인코딩하는 DNA는 단일 RNA 분자(sgRNA) 또는 별개의 RNA 분자(예를 들어, 별개의 crRNA 및 tracrRNA)를 인코딩할 수 있다. 후자의 경우, gRNA를 인코딩하는 DNA는 1개의 DNA 분자로서 또는 crRNA 및 tracrRNA를 각각 인코딩하는 별개의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA가 DNA 형태로 제공될 때, 상기 gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNA를 인코딩하는 DNA는 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되고 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNA를 인코딩하는 DNA는 발현 작제물에서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 인코딩하는 DNA는 이종성 핵산, 예컨대 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 존재할 수 있다. 대안적으로, 이는, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로부터 별개인 벡터 또는 플라스미드에 존재할 수 있다. 이러한 발현 작제물에 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 만능성 세포, 배아 줄기(ES)세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포, 유도 만능성 줄기(iPS)세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 또한 예를 들어, 양방향성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 구체적인 예는 RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 래트 U6 폴리머라제 III 프로모터, 또는 마우스 U6 폴리머라제 III 프로모터를 포함한다. 또 다른 예에서, 작은 tRNA Gln은 가이드 RNA의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, gRNA는 다양한 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 국제공개 WO 2014/089290호 및 WO 2014/065596호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다). 가이드 RNA는 또한, 화학적 합성에 의해 제조된 합성적으로 생성된 분자일 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 처음 3개 5' 및 3' 말단 RNA 잔기에 2'-O-메틸 유사체 및 3' 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함하도록 화학적으로 합성될 수 있다.
가이드 RNA(또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산)는 하나 이상의 가이드 RNA(예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 가이드 RNA) 및 상기 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는(예를 들어, 주어진 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃ 또는 주위 온도) 하에서 분해 생성물이 역치 미만에, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만에서 유지되는 기간을 연장시키거나; 생체내에서의 안정성을 증가시키는) 담체를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체(microsphere), 폴리(D,L-락틱(lactic)-코글리콜(coglycolic)-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 미쉘(micelle), 인버스 미쉘(inverse micelle), 지질 코킬레에이트(cochleate), 및 지질 미세소관을 포함한다. 이러한 조성물은 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질, 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
3. 가이드 RNA 표적 서열
가이드 RNA에 대한 표적 DNA는, 결합에 대해 충분한 조건이 존재한다면 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 DNA에 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 세포에 정상적으로 존재하는 생리학적 조건을 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건(예를 들어, 세포-무함유 시스템에서의 조건)은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001)]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적 참조로서 본원에 포함됨). gRNA에 상보적이고 이와 혼성화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보적 가닥"이라고 할 수 있으며, "상보적 가닥"에 상보적인(따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보적이지 않은) 표적 DNA의 가닥은 "비상보적 가닥" 또는 "주형 가닥"이라고 할 수 있다.
표적 DNA는, 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 서열과, 비-상보적 가닥 상의 상응하는 서열(예를 들어, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접함) 둘 다 포함한다. 다르게 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "가이드 RNA 표적 서열"은 구체적으로, 가이드 RNA가 상보적 가닥 상에서 혼성화하는 서열에 상응하는 비-상보적 가닥 상의 서열(즉, 이의 역보체)을 지칭한다. 다시 말해, 가이드 RNA 표적 서열은 PAM에 인접한 비-상보적 가닥 상의 서열을 지칭한다(예를 들어, Cas9의 경우 PAM의 업스트림 또는 5'). 가이드 RNA 표적 서열은 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절에 동등하지만, 우라실 대신에 티민을 갖는다. 일례로, SpCas9 효소에 대한 가이드 RNA 표적 서열은 비-상보적 가닥 상의 5'-NGG-3' PAM의 업스트림 서열을 지칭할 수 있다. 가이드 RNA는 표적 DNA의 상보적 가닥에 대해 상보성을 갖도록 설계되며, 여기서, 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절과 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 야기하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 존재한다면, 완전 상보성이 본질적으로 필요한 것은 아니다. 가이드 RNA가 본원에서 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 것으로 지칭된다면, 의미하는 것은, 상기 가이드 RNA가, 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 역보체인 표적 DNA의 상보적 가닥 서열에 혼성화한다는 것이다.
표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 세포의 핵 또는 세포질에 또는 세포의 세포소기관, 예컨대 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 위치할 수 있다. 표적 DNA 또는 가이드 RNA 표적 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 서열)일 수 있거나, 둘 다 포함할 수 있다.
Cas 단백질에 의한 표적 DNA의 부위-안내 결합 및 절단은 (i) 가이드 RNA와 표적 DNA의 상보적 가닥 사이의 염기쌍-형성 상보성, 및 (ii) 표적 DNA의 비-상보적 가닥에서 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라고 하는 짧은 모티프 둘 다에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA 표적 서열을 플랭킹할 수 있다. 선택적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 3' 단부에서 PAM에 의해 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cas9의 경우). 대안적으로, 가이드 RNA 표적 서열은 5' 단부에서 PAM에 의해 플랭킹될 수 있다(예를 들어, Cpf1의 경우). 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열(예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 내)의 약 1 내지 약 10개, 또는 약 2 내지 약 5개 염기쌍(예를 들어, 3개 염기쌍)일 수 있다. SpCas9의 경우, PAM 서열(즉, 비-상보적 가닥 상)은 5'-N1GG-3'일 수 있으며, 여기서, N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며, PAM은 표적 DNA의 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열의 즉시(immediately) 3'이다. 이와 같이, 상보적 가닥(즉, 역보체) 상의 PAM에 상응하는 서열은 5'-CCN2-3'일 것이며, 여기서, N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이며 가이드 RNA의 DNA-표적화 분절이 표적 DNA의 상보적 가닥 상에서 혼성화하는 서열의 즉시 5'이다. 일부 이러한 경우, N1 및 N2는 상보적일 수 있고, N1- N2 염기쌍은 임의의 염기쌍일 수 있다(예를 들어, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A). 에스. 아우레우스로부터의 Cas9의 경우, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있으며, 여기서, N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 씨. 예유니(C. jejuni)로부터의 Cas9의 경우, PAM은 예를 들어, NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있으며, 여기서, N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우(예를 들어, FnCpf1의 경우), PAM 서열은 5' 단부의 업스트림에 있을 수 있고 서열 5'-TTN-3'를 가질 수 있다.
가이드 RNA 표적 서열의 일례는, SpCas9 단백질에 의해 인식되는 NGG 모티프 바로 앞의 20-뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 2개 예는 GN19NGG(SEQ ID NO: 40) 또는 N20NGG(SEQ ID NO: 41)이다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/165825호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 5' 단부에서의 구아닌은 세포에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열 + PAM의 다른 예는 시험관내에서 T7 폴리머라제에 의한 효율적인 전사를 용이하게 하기 위해 5' 단부에 2개의 구아닌 뉴클레오타이드(예를 들어, GGN20NGG; SEQ ID NO: 42)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2014/065596호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은, 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG를 포함하여 SEQ ID NO: 40-42의 4개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 더욱 다른 가이드 RNA 표적 서열 + PAM은 SEQ ID NO: 40-42의 14개 내지 20개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는, 예를 들어, RS1 유전자의 제1 인트론, 또는 RS1 유전자의 제1 인트론에 인접한 서열(예를 들어, RS1 유전자의 제1 엑손 또는 제2 엑손에 존재함)을 표적화할 수 있다.
표적 DNA에 혼성화된 CRISPR 복합체의 형성은 가이드 RNA 표적 서열에 상응하는 영역 내에서 또는 그 부근에서 표적 DNA의 하나의 가닥 또는 양쪽 가닥의 절단을 초래할 수 있다(즉, 표적 DNA의 비-상보적 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열, 및 가이드 RNA가 혼성화하는 상보적 가닥 상의 역보체). 예를 들어, 절단 부위는 가이드 RNA 표적 서열 내에 있을 수 있다(예를 들어, PAM 서열에 비해 정의된 위치에서). "절단 부위"는, Cas 단백질이 단일-가닥 절단부(break) 또는 이중-가닥 절단부를 생성하는 표적 DNA의 위치를 포함한다. 절단 부위는 이중-가닥 DNA 중 단지 하나의 가닥 상에 존재할 수 있거나(예를 들어, 닉카제(nickase)가 사용될 때) 또는 2개 가닥 모두 상에 존재할 수 있다. 절단 부위는 양쪽 가닥 상의 동일한 위치에 있을 수 있거나(평활 단부를 생성함; 예를 들어, Cas9), 각각의 가닥 상의 상이한 위치에 있을 수 있다(엇갈린 단부(즉, 오버행)를 생성함; 예를 들어, Cpf1). 엇갈린 단부는 예를 들어, 각각이 상이한 가닥 상의 상이한 절단 부위에서 단일-가닥 절단부를 생성하여 이중-가닥 절단부를 생성하는 2개의 Cas 단백질을 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 제1 닉카제는 이중-가닥 DNA(dsDNA)의 제1 가닥 상에 단일-가닥 절단부를 생성할 수 있고, 제2 닉카제는 오버행 서열이 생성되도록 dsDNA의 제2 가닥 상에 단일-가닥 절단부를 생성할 수 있다. 일부 경우, 제1 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카제의 절단 부위는 제2 가닥 상의 가이드 RNA 표적 서열 또는 닉카제의 절단 부위로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 또는 1,000개 염기쌍만큼 분리된다.
RS1 유전자, 예컨대 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 RS1 유전자 내 임의의 요망되는 장소를 표적화할 수 있다. RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는, 예를 들어, RS1 유전자의 제1 인트론, 또는 RS1 유전자의 제1 인트론에 인접한 서열(예를 들어, RS1 유전자의 제1 엑손 또는 제2 엑손에 존재함)을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자 내에 임의의 인접 서열을 포함할 수 있다. 용어 RS1 유전자는 RS1 조절 프로모터 및 인핸서 서열, 뿐만 아니라 코딩 서열을 포괄하는 게놈 영역을 포함한다. 가이드 RNA 표적 서열은 코딩 서열, 비코딩 서열(예를 들어, 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서 영역), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일례로, 가이드 RNA 표적 서열은 임의의 RS1 코딩 엑손 내에 인접 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 1에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 2에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 3에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 4에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 5에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 엑손 6에 존재할 수 있다. 가이드 RNA 표적 서열은 또한 임의의 RS1 인트론 내에 인접 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 1에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 2에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 3에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 4에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 5에 존재할 수 있다. 또 다른 예로, 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론 6에 존재할 수 있다.
가이드 RNA 표적 서열은 또한, 표적-외 변형을 최소화하거나 표적-외 효과를 피하기 위해 선택될 수 있다(예를 들어, 표적-외 게놈 서열에 대해 2개 이하의 미스매치를 피함으로써).
일례로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-3147 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-3147 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다. 이러한 가이드 RNA 표적 서열의 예는 표 2 및 표 3에 표시된다.
일례로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-1895 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-1895 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
일례로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-57, 60-92, 94-153, 및 155-1257 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 54-57, 60-92, 94-153, 및 155-1257 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
일례로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 581, 1203, 및 1210 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 인간 RS1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 581, 1203, 및 1210 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
일례로, 마우스 Rs1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1896-3147(예를 들어, SEQ ID NO: 2383 또는 2887) 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 예로, 마우스 Rs1 유전자를 표적화하는 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 1896-3147(예를 들어, SEQ ID NO: 2383 또는 2887) 중 임의의 하나로 표시된 가이드 RNA 표적 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 표적화할 수 있다.
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B. 다른 뉴클레아제 제제 및 뉴클레아제 제제에 대한 표적 서열
요망되는 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 유도하는 임의의 뉴클레아제 제제는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 천연 발생 또는 네이티브 뉴클레아제 제제는, 상기 뉴클레아제 제제가 요망되는 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 유도하는 한 이용될 수 있다. 대안적으로, 변형된 또는 조작된 뉴클레아제 제제가 이용될 수 있다. "조작된 뉴클레아제 제제"는, 요망되는 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 특이적으로 인식하고 유도하기 위해 이의 네이티브 형태로부터 조작되는(변형되는 또는 유래되는) 뉴클레아제를 포함한다. 그러므로, 조작된 뉴클레아제 제제는 네이티브, 천연 발생 뉴클레아제 제제로부터 유래될 수 있거나, 이는 인공적으로 생성되거나 합성될 수 있다. 조작된 뉴클레아제는 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 유도할 수 있으며, 예를 들어, 상기 표적 서열은 네이티브(비-조작된 또는 비-변형된) 뉴클레아제 제제에 의해 인식되었을 서열이 아니다. 뉴클레아제 제제의 변형은 단백질 절단 제제 내의 하나의 아미노산 또는 핵산 절단 제제 내의 하나의 뉴클레오타이드만큼 작을 수 있다. 표적 서열 또는 다른 DNA에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 생성하는 것은 본원에서 상기 표적 서열 또는 다른 DNA를 "자르는(cutting) 것" 또는 "절단하는(cleaving)" 것으로 지칭될 수 있다.
예시된 표적 서열의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 주어진 표적 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 상기 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유하므로, 뉴클레아제 제제에 의해 서열-특이적 방식으로 인식되고 절단될 수 있다. 뉴클레아제 제제에 의한 표적 서열의 이중-가닥 절단부를 측정하는 검정은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Frendewey 등 (2010) Methods in Enzymology 476:295-307]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
뉴클레아제 제제의 표적 서열은 표적 좌위에서 또는 그 부근에서 임의의 곳에 놓일 수 있다. 표적 서열은 유전자의 코딩 영역 내에, 또는 유전자의 발현에 영향을 미치는 조절 영역 내에 위치할 수 있다. 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 조절 영역, 또는 임의의 비-단백질 코딩 영역에 위치할 수 있다.
일 유형의 뉴클레아제 제제는 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는, 원핵 또는 진핵 유기체의 게놈 내 특정 표적 서열에서 이중-가닥 절단부를 만드는 데 사용될 수 있는 서열-특이적 뉴클레아제의 클래스이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 네이티브 또는 조작된 전사 활성자-유사(TAL) 이펙터, 또는 이의 기능적 파트를 뉴클레아제의 촉매적 도메인, 예컨대, 예를 들어, FokI에 융합함으로써 생성된다. 독특한 모듈형(modular) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 잠재적으로 임의의 주어진 DNA 인식 특이성을 갖는 단백질의 설계를 가능하게 한다. 그러므로, TAL 이펙터 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 특정 DNA 표적 부위를 인식하도록 조작되므로, 요망되는 표적 서열에서 이중-가닥 절단부를 만드는 데 사용될 수 있다. WO 2010/079430호; 문헌[Morbitzer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(50):21617-21622]; 문헌[Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432]; 문헌[Christian 등 Genetics (2010) 186:757-761]; 문헌[Li 등 (2010) Nucleic Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704]; 및 문헌[Miller 등 (2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148]을 참조하며, 이들은 각각 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
적합한 TAL 뉴클레아제, 및 적합한 TAL 뉴클레아제의 제조 방법의 예는 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2011/0239315 A1호, US 2011/0269234 A1호, US 2011/0145940 A1호, US 2003/0232410 A1호, US 2005/0208489 A1호, US 2005/0026157 A1호, US 2005/0064474 A1호, US 2006/0188987 A1호, 및 US 2006/0063231 A1호를 참조하며, 이들은 각각 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 다양한 구현예에서, TAL 이펙터 뉴클레아제는 예를 들어, 관심 좌위 또는 관심 게놈 좌위 내 표적 핵산 서열에서 또는 그 부근에서 자르도록 조작되며, 상기 표적 핵산 서열은 표적화 벡터에 의해 변형될 서열에서 또는 그 부근에 존재한다. 본원에 제공된 다양한 방법 및 조성물로 사용되기에 적합한 TAL 뉴클레아제는, 표적 핵산 서열에서 또는 그 부근에 결합하여 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 표적화함으로써 변형되도록 특이적으로 설계된 것을 포함한다.
일부 TALEN에서, TALEN의 각각의 단량체는, 2개의 초가변 잔기를 통해 단일 염기쌍을 인식하는 33 내지 35개의 TAL 반복부를 포함한다. 일부 TALEN에서, 뉴클레아제 제제는, 독립적 뉴클레아제, 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 제1 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결되고, 상기 제1 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인 및 제2 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인은 다양한 길이(12-20 bp)의 스페이서 서열에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하며, FokI 뉴클레아제 하위단위(subunit)는 이량체화되어, 표적 서열에서 이중 가닥 절단부를 만드는 활성 뉴클레아제를 생성한다.
본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 이용되는 뉴클레아제 제제는 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 ZFN에서, ZFN의 각각의 단량체는 3개 이상의 아연 핑거-기초 DNA 결합 도메인을 포함하며, 각각의 아연 핑거-기초 DNA 결합 도메인은 3 bp 하위부위에 결합한다. 다른 ZFN에서, ZFN은, 독립적 뉴클레아제, 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된 아연 핑거-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함할 수 있으며, 상기 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 각각 FokI 뉴클레아제 하위단위에 작동 가능하게 연결되고, 상기 제1 ZFN 및 제2 ZFN은 약 5-7 bp 스페이서에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하며, FokI 뉴클레아제 하위단위는 이량체화되어, 이중 가닥 절단부를 만드는 활성 뉴클레아제를 생성한다. 예를 들어, US20060246567호; US20080182332호; US20020081614호; US20030021776호; WO/2002/057308A2호; US20130123484호; US20100291048호; WO/2011/017293A2호; 및 문헌[Gaj 등 (2013) Trends Biotechnol., 31(7):397-405]를 참조하며, 이들은 각각 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
뉴클레아제 제제(즉, 조작된 뉴클레아제 제제)의 활성 변이체 및 단편이 또한 제공된다. 이러한 활성 변이체는 네이티브 뉴클레아제 제제와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 상기 활성 변이체는 요망되는 표적 서열에서 자르는 능력을 보유하므로, 닉 또는 이중-가닥-절단부-유도 활성을 보유한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 뉴클레아제 제제는 네이티브 엔도뉴클레아제 서열로부터 변형되고, 네이티브 뉴클레아제 제제에 의해 인식되지 않은 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 인식하고 유도하도록 설계될 수 있다. 그러므로, 일부 조작된 뉴클레아제는, 상응하는 네이티브 뉴클레아제 제제 표적 서열과 상이한 표적 서열에서 닉 또는 이중-가닥 절단부를 유도하는 특이성을 갖는다. 닉 또는 이중-가닥-절단부-유도 활성에 대한 검정은 알려져 있고, 일반적으로 표적 서열을 함유하는 DNA 기질 상에서의 엔도뉴클레아제의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
뉴클레아제 제제는 세포 또는 동물 내로 임의의 기지의 수단에 의해 도입될 수 있다. 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리펩타이드는 세포 또는 동물 내로 직접적으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 도입될 때, 상기 뉴클레아제 제제는 세포 내에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트에 함유될 수 있고, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본원 어디에서나 더 상세히 논의된다. 대안적으로, 뉴클레아제 제제는, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 mRNA로서 세포 내로 도입될 수 있다.
뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포의 게놈에서 안정하게 통합되고 상기 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 또는 표적화 벡터에 존재할 수 있다.
뉴클레아제 제제가 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 도입을 통해 세포에 제공될 때, 이러한 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 관심 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 천연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 또는 임의의 다른 관심 숙주 세포를 포함하여 주어진 관심 진핵 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 치환하도록 변형될 수 있다.
용어 "뉴클레아제 제제에 대한 표적 서열"은, 닉 또는 이중-가닥 절단부가 뉴클레아제 제제에 의해 유도되는 DNA 서열을 포함한다. 뉴클레아제 제제에 대한 표적 서열은 세포에 대해 내인성(또는 네이티브)일 수 있거나, 표적 서열은 세포에 대해 외인성일 수 있다. 세포에 대해 외인성인 표적 서열은 세포의 게놈에서 천연 발생하지 않는다. 표적 서열은 또한, 당업자가 표적 좌위에 위치되는 것을 요망하는 관심 폴리뉴클레오타이드에 대해 외인성일 수 있다. 일부 경우, 표적 서열은 숙주 세포의 게놈에서 단지 1회 존재한다.
표적 서열의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 쌍에 대해 약 30-36 bp(즉, 각각의 ZFN에 대해 약 15-18 bp), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에 대해 약 36 bp, 또는 CRISPR/Cas9 가이드 RNA에 대해 약 20 bp인 표적 서열을 포함한다.
VI. 핵산 작제물 및/또는 뉴클레아제 제제 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 동물 또는 게놈
본원에 개시된 방법에 의해 생성되는 게놈, 세포, 및 동물이 또한 제공된다. 마찬가지로, 본원에 기재된 바와 같은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물, 벡터, 지질 나노입자, 또는 조성물을 포함하는 게놈, 세포, 및 동물이 또한 제공된다. 마찬가지로, 기재된 뉴클레아제 제제 또는 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제 제제(예를 들어, 내인성 RS1 좌위를 표적화함)를 인코딩하는 핵산 또는 벡터, 지질 나노입자, 또는 조성물을 포함하는 게놈, 세포, 및 동물이 또한 제공된다. 게놈, 세포, 또는 동물은 표적 게놈 좌위에서(예를 들어, RS1 좌위에서) 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함할 수 있고, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 발현할 수 있다. 레티노스키신 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 시 표적 게놈 좌위에서 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 상기 코딩 서열은 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산 작제물이 본원에 개시된 양방향성 핵산 작제물이라면, 게놈, 세포, 또는 동물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 발현할 수 있거나 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 발현할 수 있다. 일부 게놈, 세포, 또는 동물에서, 표적 게놈 좌위는 RS1 좌위이다. 예를 들어, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 그 후에, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스될 수 있다. 구체적인 예에서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다. 구체적인 예에서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 6, 11, 또는 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 RS1 코딩 서열을 포함한다.
일부 게놈, 세포, 또는 동물에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지한다. 예를 들어, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현으로 대체할 수 있다. 일례에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시킨다. 또 다른 예에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 무력화시킨다. 구체적인 예에서, 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시킨다.
핵산 작제물이 안정하게 통합되는 표적 게놈 좌위는 핵산 작제물로부터의 레티노스키신 코딩 서열에 대해 이형접합성이거나 핵산 작제물로부터의 레티노스키신 코딩 서열에 대해 동형접합성일 수 있다. 이배체(diploid) 유기체는 각각의 유전자 좌위에 2개의 대립유전자를 갖는다. 대립유전자의 각각의 쌍은 특정 유전자 좌위의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은, 특정 좌위에 2개의 동일한 대립유전자가 존재한다면 동형접합성으로서 기재되고, 2개의 대립유전자가 상이하다면 이형접합성으로서 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 동물은 이의 생식세포계 내의 표적 게놈 좌위에서 핵산 작제물을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 게놈, 세포, 또는 동물은 예를 들어, 동물, 포유류, 비인간 포유류, 및 인간을 포함하여 예를 들어, 진핵생물일 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류는 예를 들어, 비인간 포유류, 인간, 설치류, 래트, 마우스, 또는 햄스터일 수 있다. 다른 비인간 포유류는 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축(예를 들어, 소 종, 예컨대 젖소 및 거세한 수소 등; 양 종, 예컨대 양 및 염소 등; 및 돼지 종, 예컨대 돼지 및 수퇘지)을 포함한다. 조류는 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리 등을 포함한다. 사육 동물 및 농장 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간"은 인간을 배제한다.
세포는 단리된 세포(예를 들어, 시험관내)일 수 있거나 생체내에서 동물 내에 존재할 수 있다. 세포는 또한, 임의의 유형의 비분화된 또는 분화된 상태일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성 세포, 만능성 세포(예를 들어, 인간 만능성 세포 또는 비인간 만능성 세포, 예컨대 마우스 배아 줄기(ES) 세포 또는 래트 ES 세포), 또는 비-만능성 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형을 발생시킬 수 있는 미분화된 세포를 포함하고, 만능성 세포는 1개 초과의 분화된 세포 유형으로 발달하는 능력을 소유하는 미분화된 세포를 포함한다.
본원에 제공된 세포는 또한, 생식 세포(예를 들어, 정자 또는 난모세포(oocyte))일 수 있다. 세포는 유사분열적으로(mitotically) 적격인(competent) 세포 또는 유사분열적으로-불활성 세포, 감수분열적으로(meiotically) 적격인 세포 또는 감수분열적으로-불활성 세포일 수 있다. 유사하게는, 세포는 또한 1차 체세포, 또는 1차 체세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식모세포(gametocyte), 또는 미분화된 줄기세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 간 세포, 신장 세포, 조혈 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포(mesenchymal cell), 케라틴 세포(keratinocyte), 혈액 세포, 멜라닌 세포(melanocyte), 단핵구, 단핵 세포, 단핵구 전구체(monocytic precursor), B 세포, 적혈구성-거핵구 세포(erythroid-megakaryocytic cell), 호산구, 대식세포, T 세포, 췌도 베타 세포(islet beta cell), 외분비 세포, 췌장 전구체, 내분비 전구체, 지방세포, 지방전구세포(preadipocyte), 뉴런, 신경교 세포(glial cell), 신경 줄기 세포(neural stem cell), 뉴런, 간아세포, 간세포, 심근세포(cardiomyocyte), 골격 근아세포(skeletal myoblast), 평활근 세포, 도관 세포(ductal cell), 선포 세포(acinar cell), 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 담관 세포(cholangiocyte), 백색 또는 갈색 지방세포, 또는 안구 세포(ocular cell)(예를 들어, 섬유주 그물 세포(trabecular meshwork cell), 망막 색소 상피 세포, 망막 미세혈관 내피 세포, 망막 혈관주위 세포(pericyte cell), 결막 상피 세포(conjunctival epithelial cell), 결막 섬유아세포, 홍채 색소 상피 세포, 케라틴 세포, 렌즈 상피 세포, 비-색소 모양체 상피 세포(non-pigment ciliary epithelial cell), 안구 맥락막 섬유아세포(ocular choroid fibroblast), 광수용기 세포(photoreceptor cell), 신경절 세포(ganglion cell), 양극 세포(bipolar cell), 수평 세포(horizontal cell), 또는 무축삭 세포(amacrine cell))일 수 있다. 예를 들어, 세포는 눈 세포, 예컨대 망막 세포(예를 들어, 광수용기)일 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적인 건강한 세포일 수 있거나, 유병(diseased) 또는 돌연변이체-보유 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 레티노스키신 단백질에서 R141C 치환을 인코딩함)를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 동물은 인간일 수 있거나, 이들 동물은 비인간 동물일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물은 본원 어디에서나 기재된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류는 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 말, 황소, 사슴, 들소, 양, 토끼, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니피그), 및 가축(예를 들어, 소(bovine) 종, 예컨대 젖소 및 거세한 수소(steer); 양(ovine) 종, 예컨대 양(sheep) 및 염소; 및 돼지(porcine) 종, 예컨대 돼지 및 수퇘지)을 포함한다. 조류는 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위 및 오리를 포함한다. 사육 동물 및 농장 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간 동물"은 인간을 배제한다. 비인간 동물의 특정 예는 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 포함한다.
비인간 동물은 임의의 유전적 배경으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 계통, C57BL/6 계통, 129와 C57BL/6의 혼합체, BALB/c 계통, 또는 스위스 웹스터(Swiss Webster) 계통으로부터의 것일 수 있다. 129 계통의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Festing 등 (1999) Mammalian Genome 10:836]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. C57BL 계통의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 포함한다. 적합한 마우스는 또한, 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통(예를 들어, 50% 129와 50% C57BL/6)의 혼합체로부터의 것일 수 있다. 마찬가지로, 적합한 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합체 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합체(예를 들어, 129S6(129/SvEvTac) 계통)로부터의 것일 수 있다.
유사하게는, 래트는 예를 들어, ACI 래트 계통, 다크 아구티(DA: Dark Agouti) 래트 계통, 위스타(Wistar) 래트 계통, LEA 래트 계통, 스프라그 돌리(SD: Sprague Dawley) 래트 계통, 또는 피셔(Fischer) 래트 계통, 예컨대 피셔 F344 또는 피셔 F6을 포함하여 임의의 래트 계통으로부터의 것일 수 있다. 래트는 또한, 상기 나열된 2개 이상의 계통의 혼합체로부터 유래된 계통으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 래트는 DA 계통 또는 ACI 계통으로부터의 것일 수 있다. ACI 래트 계통은 백색의 배(belly)와 발(feet) 및 RT1 av1 반수체형(haplotype)과 함께 블랙 아구티(black agouti)를 갖는 것으로서 특징화된다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함하여 여러 가지 공급원으로부터 입수 가능하다. 다크 아구티(DA) 래트 계통은 아구티 코트(agouti coat) 및 RT1 av1 반수체형을 갖는 것으로서 특징화된다. 이러한 래트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하여 여러 가지 공급원으로부터 입수 가능하다. 일부 경우, 적합한 래트는 동종 교배된(inbred) 래트 계통으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0235933호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
VII. 표적 게놈 좌위를 변형시키거나, 세포에서 레티노스키신을 발현시키거나, XLRS를 치료하는 방법
본원에 제공된 바와 같이 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물을 사용하여 표적 게놈 좌위를 변형시키는 방법 또는 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 바와 같은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물과 조합된 본원에 개시된 뉴클레아제 제제(또는 이를 인코딩하는 핵산)를 사용하여 표적 게놈 좌위를 변형시키는 방법 또는 세포에서 레티노스키신을 발현을 발현시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 개시된 뉴클레아제 제제(또는 이를 인코딩하는 핵산)를 사용하여 표적 게놈 좌위를 변형시키는 방법이 또한 본원에 제공된다.
방법은 예를 들어, 표적 게놈 좌위(예를 들어, 내인성 RS1 좌위)를 변형시키는 방법일 수 있다. 일부 이러한 방법은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하고 표적 게놈 좌위를 절단한다.
방법은 예를 들어, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 표적 게놈 좌위 내로 통합하고 세포에서 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 방법일 수 있다. 일부 이러한 방법은 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자를 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 그 후에, 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로 통합될 수 있고, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이 세포에서 발현된다. 레티노스키신 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 시 표적 게놈 좌위에서 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 상기 코딩 서열은 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 이러한 방법은 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다. 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위를 절단할 수 있고, 핵산 작제물로부터의 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로 통합될 수 있으며, 따라서 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이 세포에서 발현된다. 일부 이러한 방법은 본원에 개시된 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화한다. 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위를 절단할 수 있고, 핵산 작제물로부터의 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로 통합될 수 있으며, 따라서 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이 세포에서 발현된다. 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 예를 들어, 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터) 내에서 또는 지질 나노입자 내에서 투여될 수 있다.
상기 방법에서 세포는 단리된 세포(예를 들어, 시험관내)일 수 있거나 생체내에서 동물 내에 존재할 수 있다. 세포는 또한, 임의의 유형의 비분화된 또는 분화된 상태일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성 세포, 만능성 세포(예를 들어, 인간 만능성 세포 또는 비인간 만능성 세포, 예컨대 마우스 배아 줄기(ES) 세포 또는 래트 ES 세포), 또는 비-만능성 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형을 발생시킬 수 있는 미분화된 세포를 포함하고, 만능성 세포는 1개 초과의 분화된 세포 유형으로 발달하는 능력을 소유하는 미분화된 세포를 포함한다.
세포는 또한, 생식 세포(예를 들어, 정자 또는 난모세포(oocyte))일 수 있다. 세포는 유사분열적으로(mitotically) 적격인(competent) 세포 또는 유사분열적으로-불활성 세포, 감수분열적으로(meiotically) 적격인 세포 또는 감수분열적으로-불활성 세포일 수 있다. 유사하게는, 세포는 또한 1차 체세포, 또는 1차 체세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포는 배우자(gamete), 생식 세포, 생식모세포(gametocyte), 또는 미분화된 줄기세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 간 세포, 신장 세포, 조혈 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포, 중간엽 세포(mesenchymal cell), 케라틴 세포(keratinocyte), 혈액 세포, 멜라닌 세포(melanocyte), 단핵구, 단핵 세포, 단핵구 전구체(monocytic precursor), B 세포, 적혈구성-거핵구 세포(erythroid-megakaryocytic cell), 호산구, 대식세포, T 세포, 췌도 베타 세포(islet beta cell), 외분비 세포, 췌장 전구체, 내분비 전구체, 지방세포, 지방전구세포(preadipocyte), 뉴런, 신경교 세포(glial cell), 신경 줄기 세포(neural stem cell), 뉴런, 간아세포, 간세포, 심근세포(cardiomyocyte), 골격 근아세포(skeletal myoblast), 평활근 세포, 도관 세포(ductal cell), 선포 세포(acinar cell), 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 담관 세포(cholangiocyte), 백색 또는 갈색 지방세포, 또는 안구 세포(ocular cell)(예를 들어, 섬유주 그물 세포(trabecular meshwork cell), 망막 색소 상피 세포, 망막 미세혈관 내피 세포, 망막 혈관주위 세포(pericyte cell), 결막 상피 세포(conjunctival epithelial cell), 결막 섬유아세포, 홍채 색소 상피 세포, 케라틴 세포, 렌즈 상피 세포, 비-색소 모양체 상피 세포(non-pigment ciliary epithelial cell), 안구 맥락막 섬유아세포(ocular choroid fibroblast), 광수용기 세포(photoreceptor cell), 신경절 세포(ganglion cell), 양극 세포(bipolar cell), 수평 세포(horizontal cell), 또는 무축삭 세포(amacrine cell))일 수 있다. 예를 들어, 세포는 눈 세포, 예컨대 망막 세포(예를 들어, 광수용기)일 수 있다.
본원에 제공된 세포는 정상적인 건강한 세포일 수 있거나, 유병(diseased) 또는 돌연변이체-보유 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, R141C)를 포함할 수 있다.
세포는 예를 들어, 동물, 포유류, 비인간 포유류, 및 인간을 포함하여 예를 들어, 진핵생물일 수 있다. 구체적인 예에서, 세포는 인간 세포이다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류는 예를 들어, 비인간 포유류, 인간, 설치류, 래트, 마우스, 또는 햄스터일 수 있다. 다른 비인간 포유류는 예를 들어, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축(예를 들어, 소 종, 예컨대 젖소 및 거세한 수소 등; 양 종, 예컨대 양 및 염소 등; 및 돼지 종, 예컨대 돼지 및 수퇘지)을 포함한다. 조류는 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리 등을 포함한다. 사육 동물 및 농장 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간"은 인간을 배제한다.
세포는 생체내에서 동물 내에 존재할 수 있다. 동물은 인간일 수 있거나 비인간 동물일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 비인간 동물은 본원 어디에서나 기재된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 용어 "동물"은 포유류, 어류, 및 조류를 포함한다. 포유류는 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 말, 황소, 사슴, 들소, 양, 토끼, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니피그), 및 가축(예를 들어, 소(bovine) 종, 예컨대 젖소 및 거세한 수소(steer); 양(ovine) 종, 예컨대 양(sheep) 및 염소; 및 돼지(porcine) 종, 예컨대 돼지 및 수퇘지)을 포함한다. 조류는 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위 및 오리를 포함한다. 사육 동물 및 농장 동물 또한 포함된다. 용어 "비인간 동물"은 인간을 배제한다. 비인간 동물의 특정 예는 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 포함한다.
비인간 동물은 임의의 유전적 배경으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 적합한 마우스는 129 계통, C57BL/6 계통, 129와 C57BL/6의 혼합체, BALB/c 계통, 또는 스위스 웹스터(Swiss Webster) 계통으로부터의 것일 수 있다. 129 계통의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Festing 등 (1999) Mammalian Genome 10:836]을 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. C57BL 계통의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 포함한다. 적합한 마우스는 또한, 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통(예를 들어, 50% 129와 50% C57BL/6)의 혼합체로부터의 것일 수 있다. 마찬가지로, 적합한 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합체 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합체(예를 들어, 129S6(129/SvEvTac) 계통)로부터의 것일 수 있다.
유사하게는, 래트는 예를 들어, ACI 래트 계통, 다크 아구티(DA: Dark Agouti) 래트 계통, 위스타(Wistar) 래트 계통, LEA 래트 계통, 스프라그 돌리(SD: Sprague Dawley) 래트 계통, 또는 피셔(Fischer) 래트 계통, 예컨대 피셔 F344 또는 피셔 F6을 포함하여 임의의 래트 계통으로부터의 것일 수 있다. 래트는 또한, 상기 나열된 2개 이상의 계통의 혼합체로부터 유래된 계통으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 래트는 DA 계통 또는 ACI 계통으로부터의 것일 수 있다. ACI 래트 계통은 백색의 배(belly)와 발(feet) 및 RT1 av1 반수체형(haplotype)과 함께 블랙 아구티(black agouti)를 갖는 것으로서 특징화된다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함하여 여러 가지 공급원으로부터 입수 가능하다. 다크 아구티(DA) 래트 계통은 아구티 코트(agouti coat) 및 RT1 av1 반수체형을 갖는 것으로서 특징화된다. 이러한 래트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하여 여러 가지 공급원으로부터 입수 가능하다. 일부 경우, 적합한 래트는 동종 교배된(inbred) 래트 계통으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2014/0235933호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
X-연관 연소 망막층간분리(XLRS)를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 이러한 방법은 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자를 XLRS를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 핵산 작제물은 대상체의 하나 이상의 망막 세포(예를 들어, 광수용기) 내 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 이로부터 발현되고, 치료적 유효 수준의 레티노스키신 발현이 대상체에서 달성된다. 대상체는 예를 들어, X-연관 연소 망막층간분리와 관련이 있거나 이를 야기하는 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, R141C)를 포함하는 내인성 RS1 유전자를 가질 수 있다. 레티노스키신 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합 시 표적 게놈 좌위에서 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 상기 코딩 서열은 핵산 작제물에 존재하는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 이러한 방법은 또한, 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하고, 핵산 작제물은 대상체의 하나 이상의 망막 세포(예를 들어, 광수용기) 내 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 이로부터 발현되며, 치료적 유효 수준의 레티노스키신 발현이 대상체에서 달성된다. 일부 이러한 방법은 또한, 본원에 개시된 핵산 작제물, 벡터, 또는 지질 나노입자 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하고, 핵산 작제물은 대상체의 하나 이상의 망막 세포(예를 들어, 광수용기) 내 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 이로부터 발현되며, 치료적 유효 수준의 레티노스키신 발현이 대상체에서 달성된다.
XLRS는 황반 병상 및 망막의 천층의 분할을 특징으로 하는 유리체-망막 이영양증이다. 황반 변화는 대부분의 모든 경우에 존재한다. 안저(fundi)에서, 방사상으로 배향된 망막내 중심와황반 낭포(foveomacular cyst)는 스포크-차륜(spoke-wheel) 배치로 보이며, 대부분의 사례에서 중심와 반사(foveal reflex)는 부재한다. 이에 더하여, 대략 절반의 사례는 망막의 하측두(inferotemporal) 파트에서 양측성 말초 망막층간분리(bilateral peripheral retinoschisis)를 갖는다. 전형적인 안저 외양 외에도, 사시증(strabismus), 안진증(nystagmus), 축성 원시(axial hyperopia), 색각 이상(defective color vision) 및 중심와 변위(foveal ectopy)가 존재할 수 있다. 가장 중요한 합병증은 유리체 출혈(vitreous hemorrhage), 망막 박리(retinal detachment), 및 신생혈관 녹내장(neovascular glaucoma)이다. "스포크-차륜" 패턴을 갖는 중심와 층간분리(foveal schisis)는 안저 검사(fundus exam)에서 거의 100%의 사례에서 존재하는 특징적인 발견이다. 층간분리는 50%까지의 환자에서 말초적으로 발생할 수 있다. 말초 층간분리(peripheral schisis)는 비지지형 횡단 혈관(unsupported crossing vessel)으로부터의 출혈에 대한 잠재성을 갖는 내엽(inner leaf)의 정공(hole) 및 인열(tear)을 유발할 수 있다. 추가 말초 변화는 RP를 닮은 색소침착, 망막 섬유증(retinal fibrosis) 및 백색 얼룩(white fleck)을 포함한다.
XLRS가 레티노스키신 기능의 소실에 의해 야기되는 열성 질환이기 때문에, 유전자 대체 치료법은 이 질환에 대한 잠재적인 치료로서 여겨졌다. 더욱이, 레티노스키신은 세포외 단백질로서 작용하기 때문에, 유익한 치료는 필수적으로 대체 유전자를 발현하는 형질주입된 세포로 국한되지 않지만 발현 부위로부터 분비된 단백질의 확산으로 인해 더 광범위한 영역을 포괄할 수 있다.
일부 방법에서, 핵산 작제물의 통합은 망막 구조적 복구(예를 들어, 적어도 부분적인 망막 구조적 복구)를 초래한다. 일부 방법에서, 핵산 작제물의 통합은 망막 기능적 복구(예를 들어, 적어도 부분적인 망막 기능적 복구)를 초래한다.
상기 방법에서 XLRS를 갖는 대상체는 상기 개시된 바와 같이 임의의 유형의 동물일 수 있다. 특정 예에서, 대상체는 인간이다.
생체내에서 동물 내 세포를 표적화하는 방법에서, 핵산 작제물은 동물 내 특정 유형의 세포에 삽입될 수 있다. 뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산) 및 핵산 작제물을 동물 내로 도입하기 위한 방법 및 비히클은, 동물에서 어떤 유형의 세포가 표적화되는지에 영향을 미칠 수 있다. 일부 방법에서, 예를 들어, 핵산 작제물은 망막 세포, 예컨대 광수용기 내의 표적 게놈 좌위(예를 들어, 내인성 RS1 좌위) 내로 삽입된다. 뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산) 및 핵산 작제물을 동물 내로 도입하는 방법 및 비히클(눈 또는 망막 세포(예를 들어, 광수용기)를 표적화하는 방법 및 비히클, 예컨대 지질 나노입자-매개 전달 및 AAV2-매개 전달, AAV5-매개 전달, AAV8-매개 전달, 또는 AAV7m8-매개 전달 및 유리체내 또는 망막하 주사를 포함함)은 본원 어디에서나 더 상세히 개시되어 있다.
유전자를 발현할 수 있는 임의의 표적 게놈 좌위, 예컨대 세이프 하버 좌위(세이프 하버 유전자) 또는 내인성 RS1 좌위가 사용될 수 있다. 이러한 좌위는 본원 어디에서나 더 상세히 기재되어 있다. 구체적인 예에서, 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위, 예컨대 XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, R141C)를 포함하는 내인성 RS1 좌위일 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합될 수 있다. 그 후에, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스될 수 있다. 구체적인 예에서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩한다. 구체적인 예에서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 6, 11, 또는 12와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 RS1 코딩 서열을 포함한다.
내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 일부 경우에 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지할 수 있다. 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현으로 대체할 수 있다. 일례에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시킨다. 또 다른 예에서, 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 무력화시킨다. 생체내에서 세포를 표적화하는 방법, 예컨대 XLRS를 갖는 대상체를 치료하는 방법에서, 하나 이상의 세포 내의 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 이들 세포에서 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체의 발현으로 대체할 수 있다. 이러한 방식으로, 핵산 작제물의 통합은 동시에, 내인성 RS1 유전자(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 R141C를 포함하는 내인성 RS1 유전자)를 넉아웃시키고 대체 레티노스키신 코딩 서열(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 돌연변이를 포함하지 않는 대체 레티노스키신 코딩 서열)을 넉인시킬 수 있다. 그러나, 다른 방법에서, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 내인성 RS1 유전자가 먼저 불활성화될 수 있고(예를 들어, 내인성 RS1 유전자를 표적화하고 방해하는 하나 이상의 뉴클레아제 제제를 사용함), 대체 레티노스키신 코딩 서열(예를 들어, XLRS와 관련이 있거나 이를 야기하는 돌연변이를 포함하지 않는 대체 레티노스키신 코딩 서열)을 포함하는 핵산 작제물이 후속적으로 표적 게놈 좌위 내로 통합될 수 있다. 다른 방법에서, 핵산 작제물이 먼저 통합될 수 있고, 내인성 RS1 유전자가 후속적으로 불활성화될 수 있다.
표적 게놈 좌위, 특히 내인성 RS1 좌위 내로의 레티노스키신 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물의 표적화된 삽입은 다수의 이점을 부여한다. 이러한 방법은 레티노스키신 코딩 서열의 안정한 장기간 발현을 가능하게 하는 안정한 변형을 이끈다. RS1 좌위에 관하여, 이러한 방법은 내인성 RS1 프로모터 및 조절 영역을 이용하여 생리학적으로 관련된 발현(발현 수준, 발현 시기, 및 발현 장소)을 달성할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 프로모터-무함유 유전자를 포함할 수 있고, 삽입된 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위(예를 들어, RS1 좌위) 내 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 내인성 프로모터의 사용은, 이것이 핵산 작제물에서 프로모터의 포함에 대한 필요성을 배제하여, 통상(예를 들어, AAV에서) 효율적으로 포장할 수 없는 더 큰 이식유전자의 포장을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 대안적으로, 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 핵산 작제물 내 외인성 공여자 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 유형의 예는 본원 어디에서나 개시되어 있다.
선택적으로, 표적 게놈 좌위에서 내인성 유전자(예를 들어, 내인성 RS1 유전자) 중 일부 또는 모두는 핵산 작제물로부터의 레티노스키신 코딩 서열의 삽입 시 발현될 수 있다. 대안적으로, 일부 방법에서, 표적 게놈 좌위에서의 내인성 유전자 중 어느 것도 발현되지 않는다. 일례로, 핵산 작제물의 통합 후 변형된 표적 게놈 좌위(예를 들어, 변형된 RS1 좌위)는 내인성 분비 신호 또는 이의 단편 및 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩할 수 있다. 또 다른 예에서, RS1 좌위의 제1 인트론이 표적화될 수 있다. RS1의 분비 신호 펩타이드는 RS1 유전자의 엑손 1 및 엑손 2의 파트에 의해 인코딩된다. 이러한 시나리오에서, 스플라이스 수용기 및 레티노스키신 코딩 서열을 보유하는 프로모터-무함유 카세트는 레티노스키신 단백질의 발현 및 분비를 뒷받침할 것이다. 내인성 RS1 엑손 1과 통합된 레티노스키신 코딩 서열 사이의 스플라이싱은, 통합된 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 서열에 작동 가능하게 연결된 엑손 1에 의해 인코딩되는 내인성 레티노스키신 서열을 포함하는 키메라 mRNA 및 단백질을 형성한다.
핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 본원 어디에서나 기재된 바와 같이 상동성 재조합(HR) 및 비-상동성 말단 접합(NHEJ)을 포함한 임의의 수단에 의해 표적 게놈 좌위 내로 삽입될 수 있다.
구체적인 예에서, 핵산 작제물은 상동성-독립적 표적화된 통합(예를 들어, 방향성 상동성-독립적 표적화된 통합)을 통해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물 내 레티노스키신 코딩 서열은 각각의 측면 상에서 뉴클레아제 제제에 대한 표적 부위(예를 들어, 표적 게놈 좌위에서와 동일한 표적 부위, 및 표적 게놈 좌위 내 표적 부위를 절단하는 데 사용되는 동일한 뉴클레아제 제제)에 의해 플랭킹될 수 있다. 그 후에, 뉴클레아제 제제는 레티노스키신 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위를 절단할 수 있다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물은 AAV-매개 전달에 의해 전달되고, 레티노스키신 코딩 서열을 플랭킹하는 표적 부위의 절단은 AAV의 역 말단 반복부(ITR)를 제거할 수 있다. IRT의 제거는 성공적인 표적화를 평가하는 것을 더 용이하게 할 수 있는데, ITR의 존재는 반복된 서열로 인해 시퀀싱 노력을 방해할 수 있기 때문이다. 일부 방법에서, 표적 게놈 좌위 내 표적 부위(예를 들어, 플랭킹 프로토스페이서 인접 모티프를 포함하는 gRNA 표적 서열)는, 레티노스키신 코딩 서열이 표적 게놈 좌위 내로 올바른 배향으로 삽입된다면 더 이상 존재하지 않지만, 상기 표적 부위는, 레티노스키신 단백질 코딩 서열이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다. 이는, 레티노스키신 코딩 서열이 발현을 위해 올바른 배향으로 삽입되는 것을 보장하도록 도울 수 있다.
핵산 작제물(또는 벡터 또는 LNP) 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산이 핵산 작제물과 함께 투여되는 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산 다음에 투여될 수 있거나, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산이 핵산 작제물 다음에 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 핵산 작제물의 투여 전 또는 투여에 후속하여 약 1시간 내지 약 48시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 48시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 12시간, 약 2시간 내지 약 6시간, 약 3시간 내지 약 48시간, 약 6시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 또는 약 24시간 내지 약 48시간째에 투여될 수 있다.
핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 임의의 적합한 전달 비히클에서 투여될 수 있다. 일부 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동일한 전달 비히클(예를 들어, 동일한 지질 나노입자 또는 벡터)에서 투여될 수 있다. 뉴클레아제 제제가 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 일부 방법에서, 성분은 둘 다 동일한 전달 비히클에서 투여될 수 있거나, 대안적으로 이들 성분은 별개의 전달 비히클에서 전달될 수 있다. 다른 방법에서, 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 상이한 전달 비히클에서 투여될 수 있다(예를 들어, 제1 벡터에서의 또는 LNP에서의 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산의 투여, 및 제2 벡터, 예컨대 AAV 벡터에서의 핵산 작제물의 투여).
뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산) 및 핵산 작제물은 임의의 전달 방법(예를 들어, AAV, LNP, 또는 HDD) 및 본원 어디에서나 개시된 바와 같은 임의의 투여 경로(예를 들어, 유리체내 주사 또는 망막하 주사)를 통해 임의의 형태(예를 들어, 가이드 RNA에 대한 DNA 또는 RNA; Cas 단백질에 대한 DNA, RNA, 또는 단백질)로 도입될 수 있다. 일례로, 핵산 작제물은 아데노-관련 바이러스(AAV)-매개 전달(예를 들어, AAV2-매개 전달, AAV5-매개 전달, AAV8-매개 전달, 또는 AAV7m8-매개 전달)을 통해 전달된다. 마찬가지로, 뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산)는 지질 나노입자(LNP)-매개 전달 또는 AAV-매개 전달에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 CRISPR/Cas9일 수 있으며, 내인성 RS1 좌위(예를 들어, RS1의 인트론 1)를 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA는 LNP-매개 전달 또는 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있고, 핵산 작제물(예를 들어, 양방향성 작제물 또는 상동성-독립적 표적화된 통합 작제물)은 AAV2-매개 전달, AAV5-매개 전달, AAV8-매개 전달, 또는 AAV7m8-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산과 핵산 작제물은 둘 다 AAV-매개 전달을 통해(예를 들어, 단일 AAV에서 또는 2개의 별개의 AAV를 통해) 전달된다. 예를 들어, 제1 AAV는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 gRNA 발현 카세트 및 핵산 작제물을 운반할 수 있다. 유사하게는, 제1 AAV는 Cas9 발현 카세트를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 2개 이상의 gRNA 발현 카세트 및 핵산 작제물을 운반할 수 있다. 대안적으로, 제1 AAV는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas9 코딩 서열) 및 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 핵산 작제물을 운반할 수 있다. 유사하게는, 제1 AAV는 Cas9 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cas9 코딩 서열) 및 2개의 gRNA 발현 카세트(예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 gRNA 코딩 서열)를 운반할 수 있고, 제2 AAV는 핵산 작제물을 운반할 수 있다. 상이한 프로모터는 gRNA, 예컨대 U6 프로모터 또는 작은 tRNA Gln의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 상이한 프로모터가 Cas9 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 일부 방법에서, 작은 프로모터가 사용되어, Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물 내로 적합화(fit)될 수 있다. 일부 방법에서, 작은 Cas9 단백질(예를 들어, SaCas9 또는 CjCas9)은 AAV 포장 수용력을 최대화하는 데 사용된다.
본원에 개시된 방법은 뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산) 및 표적 게놈 좌위 내로의 통합 및 이로부터의 발현을 위한 레티노스키신 코딩 서열(즉, 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이나 변이체를 인코딩함)을 포함하는 핵산 작제물(즉, 외인성 공여자 핵산)을 세포 또는 동물 내로 투여하거나 도입하는 단계를 포함한다. "도입한다는 것"은 핵산 또는 단백질이 세포 내부로의 또는 동물 내 세포의 내부로의 접근을 획득하는 방식으로 핵산 또는 단백질을 세포 또는 동물에 제시하는 것을 포함한다. 도입은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 2개 이상의 성분(예를 들어, 성분 중 2개, 또는 모든 성분)은 임의의 조합으로 동시에 또는 순차적으로 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제는 핵산 작제물의 도입 전에 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 게다가, 2개 이상의 성분은 동일한 전달 방법 또는 상이한 전달 방법에 의해 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 유사하게는, 2개 이상의 성분은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 동물 내로 도입될 수 있다.
가이드 RNA는 RNA(예를 들어, 시험관내 전사된 RNA)의 형태로 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 마찬가지로, 단백질 성분, 예컨대 Cas9 단백질, ZFN, 또는 TALEN은 DNA, RNA, 또는 단백질의 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA와 Cas9 단백질 둘 다 RNA의 형태로 도입될 수 있다. DNA의 형태로 도입될 때, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 AAV를 통해 전달되고 U6 프로모터 하에 생체내에서 발현될 수 있다. 이러한 DNA는 하나 이상의 발현 작제물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 발현 작제물은 단일 핵산 분자의 성분일 수 있다. 대안적으로, 이들은 2개 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다(즉, 하나 이상의 CRISPR RNA를 인코딩하는 DNA 및 하나 이상의 tracrRNA를 인코딩하는 DNA는 별개의 핵산 분자의 성분일 수 있음).
가이드 RNA 또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 발현 작제물에서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 관심 유전자 또는 다른 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함하고, 이는 이러한 관심 핵산 서열을 표적 세포로 이전시킬 수 있다. 발현 작제물에 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 비인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능성 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성인 줄기세포, 발달 제약 전구 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포, 또는 1-세포 단계 배아 중 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도적 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 선택적으로, 프로모터는 하나의 방향에서 가이드 RNA와 다른 방향에서 다른 성분 둘 다의 발현을 구동하는 양방향적 프로모터일 수 있다. 이러한 양방향성 프로모터는 (1) 3개의 외부 제어 요소를 함유하는 완전한 종래의 일방향적 Pol III 프로모터: 원위부 서열 요소(DSE), 근위부 서열 요소(PSE), 및 TATA 박스; 및 (2) 역배향에서 DSE의 5' 말단에 융합된 TATA 박스 및 PSE를 포함하는 제2 기본(basic) Pol III 프로모터로 구성될 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는, U6 프로모터로부터 유래된 TATA 박스 및 PSE를 부착함으로써 역방향에서의 전사가 제어되는 하이브리드 프로모터를 생성함으로써 양방향성으로 될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 US 2016/0074535호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 가이드 RNA 및 또 다른 성분을 인코딩하는 유전자를 발현하기 위한 양방향적 프로모터의 사용은 동시에, 전달을 용이하게 하기 위해 컴팩트 발현 카세트의 발생을 가능하게 한다.
가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산(또는 다른 성분)은 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는(예를 들어, 주어진 저장 조건(예를 들어, -20℃, 4℃ 또는 주위 온도) 하에서 분해 생성물이 역치 미만에, 예컨대 출발 핵산 또는 단백질의 0.5 중량% 미만에서 유지되는 기간을 연장시키거나; 생체내에서의 안정성을 증가시키는) 담체를 포함하는 조성물에 제공될 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 예는 폴리(락트산)(PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락틱-코글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 미쉘, 인버스 미쉘, 지질 코킬레에이트, 및 지질 미세소관을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 핵산 또는 단백질을 세포 내에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않으며, 핵산 또는 단백질이 적어도 하나의 세포의 내부로의 접근을 획득하는 데에만 의존한다. 핵산 및 단백질을 다양한 세포 유형 내로 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 안정한 형질주입 방법, 일시적인 형질주입 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함한다.
형질주입 프로토콜, 뿐만 아니라 핵산 또는 단백질을 세포 내로 도입하는 프로토콜은 다양할 수 있다. 비제한적인 형질주입 방법은 리포솜; 나노입자; 칼슘 포스페이트(문헌[Graham 등 (1973) Virology 52 (2): 456-67], 문헌[Bacchetti 등 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4], 및 문헌[Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97]); 덴드리머; 또는 양이온성 중합체, 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민을 사용하는 화학적-기초 형질주입 방법을 포함한다. 비-화학적 방법은 전기천공, 초음파-천공(sonoporation), 및 광학 형질주입을 포함한다. 입자-기초 형질주입은 유전자 총(gene gun), 또는 자기-보조 형질주입(magnet-assisted transfection)의 사용을 포함한다(문헌[Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28]). 바이러스 방법이 또한 형질주입에 사용될 수 있다.
세포 내로의 핵산 또는 단백질의 도입 또한, 전기천공에 의해, 세포질내 주사에 의해, 바이러스 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 형질주입에 의해, 지질-매개 형질주입에 의해, 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 매개될 수 있다. 세포 내로의 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 아데노-관련 바이러스에 의해 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은, 핵산 기질이 세포질로 전달될 뿐만 아니라 핵막을 통해 핵 내로도 전달되게 할 수 있는 향상된 전기천공 기술이다. 게다가, 본원에 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로, 정기적인 전기천공보다 훨씬 더 적은 세포를 필요로 한다(예를 들어, 정기적인 전기천공에 의해 7백만개와 비교하여 단지 약 2백만개). 일례에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.
세포(예를 들어, 1-세포 단계 배아) 내로의 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 현미주사(microinjection)에 의해 달성될 수 있다. 1-세포 단계 배아에서, 현미주사는 모체(maternal) 및/또는 부체(paternal) 전핵 내로 또는 세포질 내로 수행될 수 있다. 현미주사가 단지 하나의 전핵 내로 수행된다면, 부체 전핵이 이의 더 큰 크기로 인해 바람직하다. mRNA의 현미주사는 바람직하게는 세포질 내로 수행되며(예를 들어, mRNA를 번역 머시너리에 직접 전달하기 위해), 한편 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하거나 RNA를 인코딩하는 핵산의 현미주사는 바람직하게는 핵/전핵 내로 수행된다. 대안적으로, 현미주사는 핵/전핵(pronucleus)과 세포질 둘 다 내로 주사에 의해 수행될 수 있으며: 우선 바늘이 핵/전핵 내로 도입되고 제1 양이 주사될 수 있으며, 한편 상기 바늘을 1-세포 단계 배아로부터 제거하여 제2 양이 세포질 내로 주사될 수 있다. Cas 단백질이 세포질 내로 주사된다면, Cas 단백질은 바람직하게는 핵/전핵으로의 전달을 보장하기 위해 핵 위치 신호를 포함한다. 현미주사를 수행하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Nagy 등 (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Meyer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026] 및 문헌[Meyer 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359]를 참조한다. 1-세포 단계 배아 내로의 도입은 또한 전기천공에 의해 달성될 수 있다.
다양한 방법 및 조성물은 세포 또는 동물 내로의 핵산 또는 단백질의 도입을 가능하게 하기 위해 본원에 제공된다. 핵산 또는 단백질을 세포 또는 동물 내로 도입하기 위한 이러한 방법은 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개 전달, 엑소좀-매개 전달, 지질-나노입자(LNP)-매개 전달, 세포-투과-펩타이드-매개 전달, 또는 이식 가능-장치-매개 전달을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 핵산 또는 단백질은 담체, 예컨대 폴리(락트산)(PLA), 미소구체, 폴리(D,L-락틱-코글리콜-산)(PLGA) 미소구체, 리포솜, 미쉘, 인버스 미셸, 지질 코클레이트(cochelate), 또는 지질 미세소관과 같은 담체에서 세포 또는 동물 내로 도입될 수 있다. 동물로의 전달의 일부 구체적인 예는 유체역학적 전달, 바이러스-매개 전달(예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV)-매개 전달, 또는 아데노바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 또는 레트로바이러스에 의해), 및 지질-나노입자-매개 전달을 포함한다. 하나의 구체적인 예에서, 뉴클레아제 제제와 핵산 작제물은 둘 다 LNP-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서, 뉴클레아제 제제와 핵산 작제물은 둘 다 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 제제 및 핵산 작제물은 다수의 상이한 AAV 벡터(예를 들어, 2개의 상이한 AAV 벡터)를 통해 전달될 수 있다. 뉴클레아제 제제가 CRISPR/Cas(예를 들어, CRISPR/Cas9)인 구체적인 예에서, 제1 AAV 벡터는 Cas(예를 들어, Cas9)를 전달할 수 있고, 제2 AAV 벡터는 gRNA 및 핵산 작제물을 전달할 수 있다. 예를 들어, 작은 프로모터가 사용될 수 있어서, Cas9 코딩 서열이 AAV 작제물 내로 적합화(fit)될 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 뉴클레아제 제제는 LNP-매개 전달을 통해 전달될 수 있고, 핵산 작제물은 둘 다 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서, 뉴클레아제 제제는 AAV-매개 전달을 통해 전달될 수 있고, 핵산 작제물은 둘 다 LNP-매개 전달을 통해 전달될 수 있다.
핵산의 도입은 또한, 바이러스-매개 전달, 예컨대 AAV-매개 전달 또는 렌티바이러스-매개 전달(예를 들어, AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)에 의해 달성될 수 있다. 다른 예시적인 바이러스/바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분열 세포, 비-분열 세포, 또는 분열 세포와 비-분열 세포 둘 다 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합할 수 있거나 대안적으로는 숙주 게놈 내로 통합하지 않는다. 이러한 바이러스는 또한, 감소된 면역력을 갖도록 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-적격(competent)일 수 있거나 복제-결함(defective)(예를 들어, 추가 라운드의 비리온 복제 및/또는 포장에 필요한 하나 이상의 유전자가 결함됨)일 수 있다. 바이러스는 일시적 발현, 장기-지속적 발현(예를 들어, 적어도 1주, 2주, 1개월, 2개월, 또는 3개월), 또는 영구적 발현(예를 들어, Cas9 및/또는 gRNA의)을 야기할 수 있다. 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 1012, 1013, 1014, 1015, 및 1016 벡터 게놈/mL를 포함한다. 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 및 약 1016 벡터 게놈(vg)/mL, 또는 약 1012 내지 약 1016, 약 1012 내지 약 1015, 약 1012 내지 약 1014, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1016, 약 1014 내지 약 1016, 약 1015 내지 약 1016, 또는 약 1013 내지 약 1015 vg/mL을 포함한다. 다른 예시적인 바이러스 역가(예를 들어, AAV 역가)는 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 및 약 1016 벡터 게놈(vg)/kg 체중, 또는 약 1012 내지 약 1016, 약 1012 내지 약 1015, 약 1012 내지 약 1014, 약 1012 내지 약 1013, 약 1013 내지 약 1016, 약 1014 내지 약 1016, 약 1015 내지 약 1016, 또는 약 1013 내지 약 1015 vg/kg 체중을 포함한다.
ssDNA AAV 게놈은, 상보적 DNA 가닥의 합성을 가능하게 하는 2개의 역 말단 반복부에 의해 플랭킹되는 2개의 개방형 리딩 프레임인 Rep 및 Cap으로 구성된다. AAV 이전 플라스미드를 작제할 때, 이식유전자는 2개의 ITR 사이에 놓이고, Rep 및 Cap는 인트랜스로(in trans) 공급될 수 있다. Rep 및 Cap 외에도, AAV는 아데노바이러스로부터의 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드를 필요로 할 수 있다. 이들 유전자(E4, E2a, 및 VA)는 AAV 복제를 매개한다. 예를 들어, 이전 플라스미드, Rep/Cap, 및 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포 내로 형질주입되어, 감염성 AAV 입자를 생성할 수 있다. 대안적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 내로 조합될 수 있다. 유사한 포장 세포 및 방법은 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 사용될 수 있다.
AAV의 다수의 혈청형이 식별되었다. 이들 혈청형은, 이들이 감염시키는 세포의 유형이 상이하여(즉, 이의 향성(tropism)), 특정 세포 유형의 선호적인 형질도입을 가능하게 한다. 광수용기 세포에 대한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 구체적인 예에서, 핵산 작제물을 포함하는 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, 또는 AAV8일 수 있다.
향성은 위형화(pseudotyping)을 통해 추가로 정제(refined)될 수 있으며, 이는 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 캡시드 및 게놈의 혼합이다. 예를 들어 AAV2/5는 혈청형 5로부터의 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 위형화된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 향상시킬 뿐만 아니라, 향성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드는 또한, 바이러스 향성을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개의 혈청형으로부터의 하이브리드 캡시드를 함유하고, 생체내에서 광범위한 세포 유형에 걸쳐 높은 감염성을 나타낸다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 나타내지만 증강된 뇌 흡수(uptake)를 갖는 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 또한, 돌연변이를 통해 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이적 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이적 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이적 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형화된(pseudotyped)/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다. 구체적인 예에서, AAV는 모든 망막층 및 광수용기로의 고도로 효율적인 전달을 매개하는 AAV 변이체인 AAV7m8이다. 예를 들어, 문헌[Dalkara 등 (2013) Sci. Transl. Med. 5:189ra76]을 참조하며, 이의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
이식유전자 발현을 가속화하기 위해, 자가-상보적 AAV(scAAV) 변이체가 사용될 수 있다. AAV는 AAV의 단일-가닥 DNA 게놈의 상보적 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 머시너리에 의존하기 때문에, 이식유전자 발현이 지연될 수 있다. 이러한 지연을 해결하기 위해, 감염 시 자발적으로 어닐링할 수 있는 상보적 서열을 함유하는 scAAV가 사용되어, 숙주 세포 DNA 합성을 위한 요건을 배제할 수 있다. 그러나, 단일-가닥 AAV(ssAAV) 벡터가 또한 사용될 수 있다.
포장 수용력을 증가시키기 위해, 더 긴 이식전자는 2개의 AAV 이전 플라스미드 사이에서 분할될 수 있으며, 제1 AAV는 3' 스플라이스 공여자이고 제2 AAV는 5' 스플라이스 수용기이다. 세포의 공동-감염 시, 이들 바이러스는 콘카테머(concatemer)를 형성하며, 함께 스플라이싱되고, 전장 이식유전자는 발현될 수 있다. 이는 더 장기적인 이식유전자 발현을 가능하게 하지만, 발현은 덜 효율적이다. 수용력을 증가시키기 위한 유사한 방법은 상동성 재조합을 이용한다. 예를 들어, 이식유전자는, 공동-발현이 전장 이식유전자의 상동성 재조합 및 발현을 유도하도록 2개의 이전 플라스미드 사이에서 그러나 실질적인 서열 중첩을 갖고 나눠질 수 있다.
소정의 AAV에서, 카고는 뉴클레아제 제제(즉, 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 소정의 AAV에서, 카고는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 소정의 AAV에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 소정의 AAV에서, 카고는 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 소정의 AAV에서, 카고는 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 뉴클레아제 제제 및 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 소정의 AAV에서, 카고는 본원 어디에서나 기재된 바와 같은 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 핵산 작제물을 포함할 수 있다.
핵산 및 단백질의 도입은 또한, 지질 나노입자(LNP)-매개 전달에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, LNP-매개 전달은 RNA 형태의 가이드 RNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법을 통한 전달은 가이드 RNA의 일시적인 존재를 초래하며, 생분해성 지질은 청소율(clearance)을 향상시키며, 내약성(tolerability)을 향상시키고, 면역원성을 저하시킨다. 지질 제형은 생물학적 분자의 세포 흡수를 향상시키는 한편, 이들 분자를 분해로부터 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 관련되어 있는 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 미소구체(microsphere)(유니라멜라(unilamellar) 및 멀티라멜라(multilamella) 소낭(vesicle), 예를 들어, 리포솜을 포함함), 에멀젼 중 분산상, 미쉘, 또는 현탁액 중 내부상(internal pahse)을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전달을 위해 하나 이상의 핵산 또는 단백질을 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제형은 다가음이온(polyanion), 예컨대 핵산을 전달하는 데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질(즉, 비하전된 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 지질), 음이온성 지질, 형질주입을 증강시키는 헬퍼 지질, 및 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 증가시키는 스텔스(stealth) 지질이다. 적합한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는 예를 들어, WO 2016/010840 A1호 및 WO 2017/173054 A1호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 예시적인 지질 나노입자는 양이온성 지질 및 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일례에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤 및 중성 지질, 예컨대 DSPC를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 성분은 헬퍼 지질, 예컨대 콜레스테롤, 선택적인 중성 지질, 예컨대 DSPC, 및 스텔스 지질, 예컨대 S010, S024, S027, S031, 또는 S033을 포함할 수 있다.
LNP는 하기 중 하나 이상 또는 모두를 함유할 수 있다: (i) 캡슐화를 위한 그리고 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 위한 지질; (ii) 안정화를 위한 중성 지질; (iii) 안정화를 위한 헬퍼 지질; 및 (iv) 스텔스 지질. 예를 들어, 문헌[Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 소정의 LNP에서, 카고는 뉴클레아제 제제를 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 및 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 외인성 공여자 서열을 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 뉴클레아제 제제 및 외인성 공여자 서열을 포함할 수 있다. 소정의 LNP에서, 카고는 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 인코딩하는 mRNA, 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 외인성 공여자 서열을 포함할 수 있다.
캡슐화 및 엔도솜 탈출을 위한 지질은 양이온성 지질일 수 있다. 지질은 또한, 생분해성 지질, 예컨대 생분해성 이온화 가능한 지질일 수 있다. 적합한 지질의 일례는 지질 A 또는 LP01이며, 이는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트라고도 하는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트이다. 예를 들어, 문헌[Finn 등 (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235] 및 국제공개 WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이들 각각의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 B이며, 이는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)라고도 하는 ((5-((디메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-디일)비스(데카노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 C이며, 이는 2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-디일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)이다. 적합한 지질의 또 다른 예는 지질 D이며, 이는 3-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트리데실 3-옥틸운데카노에이트이다. 다른 적합한 지질은 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(Dlin-MC3-DMA(MC3)로도 알려져 있음)를 포함한다.
본원에 기재된 LNP에서 사용하기에 적합한 일부 이러한 지질은 생체내에서 생분해성이다. 예를 들어, 이러한 지질을 포함하는 LNP는 적어도 75%의 지질이 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 내에 혈장으로부터 청소되는 것을 포함한다. 또 다른 예로, 적어도 50%의 LNP는 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 내에 혈장으로부터 청소된다.
이러한 지질은 이것이 존재하는 배지의 pH에 따라 이온화 가능할 수 있다. 예를 들어, 약간의 산성 배지에서, 지질은 양성자화(protonate)되어서 양전하를 보유할 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약간의 염기성 배지에서, 지질은 양성화되지 않으므로 전하를 보유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 적어도 약 9, 9.5, 또는 10의 pH에서 양성자화될 수 있다. 전하를 보유하는 이러한 지질의 능력은 이의 내재성(intrinsic) pKa와 관련이 있다. 예를 들어, 지질은 독립적으로, 약 5.8 내지 약 6.2 범위의 pKa를 가질 수 있다.
중성 지질은 LNP의 가공을 안정화시키고 향상시키는 작용을 한다. 적합한 중성 지질의 예는 여러 가지 중성, 비하전된 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 5- 헵타데실벤젠-1,3-디올(레조르시놀), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 달걀(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 중성 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
헬퍼 지질은 형질주입을 증강시키는 지질을 포함한다. 헬퍼 지질이 형질주입을 증강시키는 기전은 입자 안정성을 증강시키는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 경우, 헬퍼 지질은 막 융합원성(fusogenicity)을 증강시킬 수 있다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 적합한 헬퍼 지질의 예는 적합한 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트를 포함한다. 일례에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트일 수 있다.
스텔스 지질은, 나노입자가 생체내에서 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경시키는 지질을 포함한다. 스텔스 지질은 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제형 과정에 일조할 수 있다. 스텔스 지질은 LNP의 약물동력학적 특성을 조절할 수 있다. 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기(head group)를 갖는 지질을 포함한다.
스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 예를 들어, PEG(이따금 폴리(에틸렌 옥사이드)로 지칭됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N- 비닐피롤리돈), 폴리아미노산, 및 폴리 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드에 기초한 중합체로부터 선택되는 중합체 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 PEG는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에테르 중합체를 의미한다. 소정의 LNP 제형에서, PEG는 PEG 2000이라고도 하는 PEG-2K이며, 이는 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, WO 2017/173054 A1호를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
스텔스 지질의 지질 모이어티는 예를 들어, 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화된 또는 불포화된 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함하여 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유래될 수 있으며, 상기 사슬은 예를 들어, 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다.
일례로, 스텔스 지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디라우일글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, 및 PEG-디스테아로일글리카미드, PEG-콜레스테롤(l-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-디메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 및 1,2-디스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)으로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정 예에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다.
LNP는 상이한 각각의 몰비의 성분 지질을 제형에 포함할 수 있다. CCD 지질의 몰%는 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 42 몰% 내지 약 47 몰%, 또는 약 45%일 수 있다. 헬퍼 지질의 몰%는 예를 들어, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 35 몰% 내지 약 55 몰%, 약 40 몰% 내지 약 50 몰%, 약 41 몰% 내지 약 46 몰%, 또는 약 44 몰%일 수 있다. 중성 지질의 몰%는 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 20 몰%, 약 5 몰% 내지 약 15 몰%, 약 7 몰% 내지 약 12 몰%, 또는 약 9 몰%일 수 있다. 스텔스 지질의 몰%는 예를 들어, 약 1 몰% 내지 약 10 몰%, 약 1 몰% 내지 약 5 몰%, 약 1 몰% 내지 약 3 몰%, 약 2 몰%, 또는 약 1 몰%일 수 있다.
LNP는, 캡슐화되는 생분해성 지질의 양으로 하전된 아민기(N)와 핵산의 음으로 하전된 포스페이트기(P) 사이에서 상이한 비를 가질 수 있다. 이는 방정식 N/P에 의해 수학적으로 표시될 수 있다. 예를 들어, N/P 비는 약 0.5 내지 약 100, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 7, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5일 수 있다.
일부 LNP에서, 카고는 Cas mRNA 및 gRNA를 포함할 수 있다. Cas mRNA 및 gRNA는 상이한 비로 존재할 수 있다. 예를 들어, LNP 제형은 약 25:1 내지 약 1:25 범위, 약 10:1 내지 약 1:10 범위, 약 5:1 내지 약 1:5 범위, 또는 약 1:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:1 내지 약 1:5, 또는 약 10:1의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:10, 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10, 또는 1:25의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 대안적으로, LNP 제형은 약 1:1 내지 약 1:2의 Cas mRNA 대 gRNA 핵산의 비를 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, Cas mRNA 대 gRNA의 비는 약 1:1 또는 약 1:2일 수 있다.
LNP의 예시적인 투여량은 총 RNA(Cas9 mRNA 및 gRNA) 카고 함량을 기준으로, 약 0.1, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 8, 또는 약 10 mg/kg 체중(mpk) 또는 약 0.1 내지 약 10, 약 0.25 내지 약 10, 약 0.3 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 10, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 8, 약 0.1 내지 약 6, 약 0.1 내지 약 5, 약 0.1 내지 약 4, 약 0.1 내지 약 3, 약 0.1 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.3, 약 0.1 내지 약 0.25, 약 0.25 내지 약 8, 약 0.3 내지 약 6, 약 0.5 내지 약 5, 약 1 내지 약 5, 또는 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중을 포함한다. 이러한 LNP는 예를 들어, 정맥내로 투여될 수 있다. 일례에서, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 0.3 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 1, 약 3, 또는 약 10 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. LNP의 추가의 예시적인 투여량은 총 RNA(Cas9 mRNA 및 gRNA) 카고 함량을 기준으로, 약 0.1, 약 0.25, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 8, 또는 약 10 mg/kg(mpk) 체중 또는 약 0.1 내지 약 10, 약 0.25 내지 약 10, 약 0.3 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 10, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 10, 약 8 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 8, 약 0.1 내지 약 6, 약 0.1 내지 약 5, 약 0.1 내지 약 4, 약 0.1 내지 약 3, 약 0.1 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.1 내지 약 0.3, 약 0.1 내지 약 0.25, 약 0.25 내지 약 8, 약 0.3 내지 약 6, 약 0.5 내지 약 5, 약 1 내지 약 5, 또는 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중을 포함한다. 이러한 LNP는 예를 들어, 정맥내로 투여될 수 있다. 일례에서, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 0.3 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01, 약 0.03, 약 0.1, 약 0.3, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 10 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 약 0.5 내지 약 10, 약 0.5 내지 약 5, 약 0.5 내지 약 3, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2 mg/kg의 LNP 용량이 사용될 수 있다.
전달 모드는 면역원성을 저하시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상이한 성분은 상이한 모드에 의해 전달될 수 있다(예를 들어, 쌍봉형(bi-modal) 전달). 이들 상이한 모드는 대상체에게 전달되는 분자에게 상이한 약물역학적(pharmacodynamic) 또는 약물동력학적 특성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 상이한 모드는 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 상이한 시간적(temporal) 분포를 초래할 수 있다. 일부 전달 모드(예를 들어, 세포에서 자율 복제(autonomous replication) 또는 게놈 통합에 의해 지속되는 핵산 벡터의 전달)는 분자의 더욱 지속적인 발현 및 존재를 초래하는 반면, 다른 모드의 전달은 일시적이고 덜 지속적이다(예를 들어, RNA 또는 단백질의 전달). 예를 들어, 성분의 더욱 일시적인 방식, RNA로서의 전달은, Cas/gRNA 복합체가 단지 단기간 동안 존재하고 활성임을 보장할 수 있고 면역원성을 감소시킬 수 있다. 이러한 일시적인 전달은 또한, 표적-외(off-target) 변형의 가능성을 감소시킬 수 있다.
생체내 투여는 예를 들어, 유리체내 주사 또는 망막하 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다. 유의하게 더 소량의 성분(전신 접근법과 비교하여)은 전신적으로(예를 들어, 정맥내로) 전달될 때와 비교하여 국소로(예를 들어, 망막하 또는 유리체내) 투여될 때 효과를 발휘할 수 있다. 국소 투여 모드는 또한, 치료적 유효량의 성분이 전신 투여될 때 발생할 수 있는 잠재적으로 독성 부작용의 발생을 감소시키거나 해소시킬 수 있다.
본원에 개시된 뉴클레아제 제제(예를 들어, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산) 및/또는 핵산 작제물을 포함하는 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 그리고 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 의존할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은, 담체, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제형의 다른 성분과 양립성이고 이의 수혜자에게 실질적으로 유해하지 않음을 의미한다.
투여 빈도 및 투약 횟수는 다른 인자 중에서도 핵산 작제물 또는 뉴클레아제 제제(또는 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산)의 반감기 및 투여 경로에 의존할 수 있다. 세포 또는 동물 내로의 핵산 또는 단백질의 도입은 기간에 걸쳐 1회 또는 다수 회 수행될 수 있다. 예를 들어, 도입은 기간에 걸쳐 단지 1회, 기간에 걸쳐 적어도 2회, 기간에 걸쳐 적어도 3회, 기간에 걸쳐 적어도 4회, 기간에 걸쳐 적어도 5회, 기간에 걸쳐 적어도 6회, 기간에 걸쳐 적어도 7회, 기간에 걸쳐 적어도 8회, 기간에 걸쳐 적어도 9회, 기간에 걸쳐 적어도 10회, 적어도 11회, 기간에 걸쳐 적어도 12회, 기간에 걸쳐 적어도 13회, 기간에 걸쳐 적어도 14회, 기간에 걸쳐 적어도 15회, 기간에 걸쳐 적어도 16회, 기간에 걸쳐 적어도 17회, 기간에 걸쳐 적어도 18회, 기간에 걸쳐 적어도 19회, 또는 기간에 걸쳐 적어도 20회 수행될 수 있다.
선택적으로, 이러한 방법은 동물에서 또는 세포에서 삽입된 레티노스키신 코딩 서열 또는 인코딩된 레티노스키신 단백질의 발현 및/또는 활성을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형을 갖는 세포를 식별하는 데 사용될 수 있다. 스크리닝은 부모 염색체의 대립유전자의 변형(MOA)을 평가하기 위한 정량적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR(qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은, 표적 좌위를 인식하는 제1 프라이머 세트 및 비-표적화된 기준 좌위를 인식하는 제2 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다. 적합한 정량적 검정의 다른 예는 형광-매개 인 시추 혼성화(FISH: fluorescence-mediated in situ hybridization), 비교 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization), 등온 DNA 증폭(isothermic DNA amplication), 고정된 프로브(들)에의 정량적 혼성화, INVADER® 프로브, TAQMAN® Molecular Beacon 프로브, 또는 ECLIPSE™ 프로브 기술(예를 들어, US 2005/0144655를 참조하며, 이의 전체내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함됨)을 포함한다.
차세대 시퀀싱(NGS: next-generation sequencing)이 또한 스크리닝에 사용될 수 있다. 차세대 시퀀싱은 또한 "NGS" 또는 "대규모 병렬 시퀀싱(massively parallel sequencing)" 또는 "고 처리량 시퀀싱(high throughput sequencing)"으로 지칭될 수 있다. NGS는, 표적화된 유전적 변형의 정확한 성질, 그리고 이것이 세포 유형 또는 조직 유형 또는 기관 유형에 걸쳐 일관되는지의 여부를 정의하기 위해 MOA 검정에 더하여 스크리닝 툴로서 사용될 수 있다.
동물에서 표적 게놈 좌위의 변형을 평가하는 것은 임의의 조직 또는 기관으로부터의 임의의 세포 유형에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 평가는 동일한 조직 또는 기관(예를 들어, 눈)으로부터의 다수의 세포 유형에서 또는 조직 또는 기관 내 다수의 장소로부터의 세포에서 수행될 수 있다. 이는, 표적 조직 또는 기관 내의 어떤 세포 유형이 표적화되고 있는지 또는 조직 또는 기관의 어떤 구획이 핵산 작제물에 의해 도달되고 있는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또 다른 예로, 평가는 다수의 유형의 조직에서 또는 다수의 기관에서 수행될 수 있다. 특정 조직, 기관, 또는 세포 유형이 표적화되는 방법에서, 이는 해당 조직 또는 기관이 얼마나 효과적으로 표적화되는지 그리고 다른 조직 또는 기관에서 표적-외 효과가 존재하는지의 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다.
레티노스키신의 발현을 측정하는 방법은 예를 들어, 단백질 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 또한, 레티노스키신 코딩 서열에 의해 인코딩된 mRNA의 발현을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 측정은 눈 또는 눈 내의 특정 세포 유형 또는 영역(예를 들어, 망막 세포, 예컨대 광수용기) 내에서 수행될 수 있다.
사용될 수 있는 검정의 일례는 BASESCOPE™ RNA 인시추 혼성화(ISH) 검정이며, 이는 무손상 고정된 조직의 맥락에서 단일 뉴클레오타이드 변화를 포함하여 세포-특이적 편집된 전사물을 정량화할 수 있는 방법이다. BASESCOPE™ ISH 검정은 유전자 편집의 특징화에서 NGS 및 qPCR을 보완할 수 있다. NGS/qPCR이 야생형 서열 및 편집된 서열의 정량적 평균 값을 제공할 수 있는 반면, 이들은 조직 내의 편집된 세포의 이종성(heterogeneity) 또는 백분율에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다. BASESCOPE™ ISH 검정은 전체 조직의 랜드스케이프 뷰(landscape view) 및 단일-세포 분해능(resolution)을 이용한 야생형 대(versus) 편집된 전사물의 정량화를 제공할 수 있으며, 여기서, 편집된 mRNA 전사물을 함유하는 표적 조직 내의 세포의 실제 수가 정량화될 수 있다. BASESCOPE™은, 쌍형성된(paired) 올리고("ZZ") 프로브를 사용한 단일-분자 RNA 검출을 달성하여, 비-특이적 배경 없이 신호를 증폭시킨다. 그러나, BASESCOPE™ 프로브 설계 및 신호 증폭 시스템은 1 ZZ 프로브를 이용한 단일-분자 RNA 검출을 가능하게 하고, 이는 무손상 고정된 조직에서 단일 뉴클레오타이드 편집 및 돌연변이를 차별적으로 검출할 수 있다.
레티노스키신 단백질의 활성을 측정하기 위한 검정은 예를 들어, 광 간섭 단층촬영(OCT) 및 망막 전위도(ERG: electroretinogram) 검사를 포함할 수 있다. OCT 스캔은 망막 강을 채점하기 위해 그리고/또는 망막 광수용기 두께를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 검정은 시운동성 검사(optokinetic test)를 포함한다. 이러한 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 변형되는 세포 또는 동물이 X-연관 연소 망막층간분리와 관련되거나 이를 야기하는 돌연변이(예를 들어, R141C 돌연변이)를 갖는 세포라면, 이러한 기능성 검정은 질환 표현형의 구제(rescue)를 평가하는 데 사용될 수 있다. 광 간섭 단층촬영(OCT)은 황반 영역의 고해상 단면 이미지를 제공한다. XLRS를 갖는 개체에서, OCT는 망막의 내과립층(inner nuclear layer) 및 바깥 얽기층(outer plexiform layer)에서 주로 낭포성 공간(cystic space)을 보여준다. 이러한 기능성 검사는 또한, 망막 전위도(ERG) 검사를 포함할 수 있으며, 이 검사는 광 자극에 반응하여 망막에서 신경 세포 및 비신경(non-neuronal) 세포에 의해 생산되는 전기 활성을 측정하는 진단 검사이다. XLRS는 ERG에서 감소된 명소시(phototopic) 및 암소시(scotopic) b-파 진폭과 관련이 있다.
상기 또는 아래에 인용된 모든 특허출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁 번호 등은 각 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 그렇게 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 상이한 버전들의 서열이 다양한 시점에서 특정 수탁 번호와 연관되는 경우, 본원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효 출원일은, 해당되는 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일 중 더 빠른 날짜를 의미한다. 마찬가지로 상이한 버전들의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 지시되지 않는 한, 본원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구현예, 또는 양태는 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 명확성과 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예를 통해 상기 구현예는 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 특정 변경 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부된 서열 목록에서 나열된 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대해서는 표준 글자 약어, 및 아미노산에 대해서는 3-글자 코드를 사용하여 제시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부까지 포워드로(즉, 각각의 선(line)에서 좌측으로부터 우측으로) 진행되는 표준 관계를 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 단지 1개 가닥만 제시되지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되어 있는 것으로 이해된다. 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 이의 코돈 축퇴성(codon degenerate) 변이체가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단까지 포워드로(즉, 각각의 선에서 좌측으로부터 우측으로) 진행되는 표준 관계를 따른다.
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실시예
실시예 1. XLRS 마우스 모델에서 마우스 Rs1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입
생체내에서 잠재적인 X-연관 연소 망막층간분리 치료법(XLRS) CRISPR 치료 전략을 모델링하기 위해, 본 발명자들은 모든 조직에서 Cas9 단백질의 구성적 발현을 갖는 마우스 주(line)(Rosa Cas9 /+; 예를 들어, 미국출원 US 2019/0032155호 및 국제공개 WO 2019/028032호를 참조하며, 이들은 각각 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함됨)를 생산하고, 이러한 마우스 주를 뮤린 레티노스키신(Rs1)의 돌연변이체 복사물을 함유하는 마우스(Rs1 R141C / Y )와 교배시켜 Rosa Cas9 /+ ; Rs1 R141C / Y 마우스를 생산하였다. Rs1 R141C 돌연변이를 갖는 마우스는, 레티노스키신의 세포내 유지(retention)가 망막내 층간분리, 망막 변성, 및 감소된 ERG b-파를 포함한 인간 병태의 주요 특질을 복제하도록 야기한다.
Rs1 유전자는 망막의 세포성 구조화에 관여하는 고도로 보존된 세포외 단백질이다. 이는 광수용기 및 양극 세포로부터 동종-올리고머성 단백질 복합체로서 조립되고 분비된다. 200개 초과의 돌연변이가 RS1에서 검출되었고, 많은 것들이 비기능성 단백질 또는 단백질 분비의 존재로 인해 황반 변성의 조기 발병을 유발한다. 기능성 Rs1 발현의 결여는 망막층 내에서 층간분리를 야기하여, XLRS와 관련된 조기의 진행성 시력 상실을 유발한다. 현재까지, XLRS 치료를 위해 Cas9 기술을 사용하는 전임상 또는 임상 연구를 보고하는 공개문헌은 존재하지 않는다. 본원에서, 본 발명자들은 마우스에서 Rs1의 비분비형 R141C 변이체를 구제하기 위해 아데노-관련 바이러스(AAV)와 조합된 Cas9의 사용에 대한 접근법을 기재한다. 작제물은, 하이브리드 마우스-인간 RS1 전사물이 내인성 Rs1 프로모터를 통해 발현될 망막(예를 들어, 광수용기) 내 내인성 Rs1 좌위 내로 통합되도록 설계된다.
AAV 혈청형 7m8의 망막하 전달은 이식유전자의 성공적인 발현을 이끌었다(데이터는 도시되지 않음). AAV가 이소적으로(ectopically) 지속되는 잠재성을 1년 이상 동안 갖고 있는 한편, 본 발명자들은 돌연변이체 Rs1 표현형의 영구적인 구제를 위한 전략을 개발하기 위해 노력한다. 이를 위해, WT 인간 RS1 엑손 2 내지 6(프로모터 없음), 뿐만 아니라 마우스 Rs1 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA를 인코딩하는 바이러스 벡터를 설계하였다. 가이드 RNA의 서열은 SEQ ID NO: 43으로 표시되고, 마우스 Rs1 인트론 1 내 가이드 RNA 표적 서열은 SEQ ID NO: 2383으로 표시된다. 이들 바이러스 중 임의의 하나를 RosaCas9/+; Rs1R141C/Y 마우스에 주사 시, 본 발명자들은 가이드 RNA 발현이 Rs1 좌위에서의 절단 및 인간 RS1 cDNA 단편을 함유하는 바이러스 게놈의 통합을 이끌 것임을 예상하였다. 마우스 Rs1 좌위는 도 1에 도시된다. 마우스 엑손 1은 인간 엑손 2 내지 6 cDNA 내로 스플라이싱될 것이고(도 2), 하이브리드 마우스 인간 단백질의 발현은 돌연변이체 마우스 Rs1의 전사를 방지해야 한다.
단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입에 의해 바이러스 벡터 버전 1(SEQ ID NO: 47)을 생산하였다. RS1 인간 인트론 1(엑손 2 스플라이스 신호를 함유함)의 200개 염기를 인간 RS1 전사물의 엑손 2 내지 6을 인코딩하는 cDNA의 앞에 배치하고, 뒤이어 소 성장 호르몬(bGH) polyA(Th)를 배치하였다. 제2 인간 cDNA를 마우스 코돈 최적화로 생산하고, 반대 배향에서 벡터 내로 통합하였다. 이 서열을, 마우스 스플라이스 신호 및 SV40 polyA(Tmh)를 함유하는 200 bp에 의해 플랭킹하였다. 바이러스 전사물 자기-어닐링의 가능성을 감소시키기에 충분하게 분기(divergent)하도록 서열을 설계하였다. 나아가, sgRNA 발현 단위를 전사물 사이에 첨가하였다(도 3a). 이 전략의 이점은, 바이러스 게놈이 어느 한 배향으로 삽입되고 대립유전자 구제를 위해 실현 가능한 리딩 프레임을 여전히 형성할 수 있다는 점이다.
자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입에 의해 바이러스 벡터 버전 2(SEQ ID NO: 46)를 생산하였다. 이 버전을 2개의 차이를 두고 버전 1과 같이 배치한다. 첫째, 서열을 자기-상보적 AAV 벡터 내로 혼입하였다. 둘째, 2100 bp의 최대 자기-상보적 게놈 크기를 준수하기 위해, 스플라이스 신호 영역을 60 bp까지 감소시켰다(도 3a).
바이러스 벡터 버전 3(SEQ ID NO: 45)을 상동성-독립적 표적화된 통합(HITI)을 위해 설계하였다. HITI는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 갖기 위해 Cas9 인식 서열에 대한 필요성에 영향을 미친다. Th 및 Rs1 인트론 1을 표적화하는 동일한 가이드 RNA를 발현하도록 작제물을 설계하였다. 그러나, 버전 1 및 버전 2가 가이드 RNA 표적 서열을 함유하는 경우, 버전 3은 각각의 측면 상의 역전된 가이드 RNA 표적 서열에 의해 플랭킹된다(도 3b). 일단 바이러스 게놈이 이중-가닥이면, 이는, 마우스 Rs1 인트론 1에서, 뿐만 아니라 바이러스 게놈의 양측면 상에서 이중-가닥 절단부를 동시에 야기하여 ITR 서열을 효과적으로 절단해 내어야 하는 하나의 가이드 RNA 서열을 발현할 것이다. 유리된 바이러스 게놈은 이제, 어떤 한 배향에서 마우스 게놈 내로 삽입되기에 자유롭다. 그러나, cDNA가 역배향에서 통합된다면, 가이드 RNA 표적 서열은 재구성되고 추가의 Cas9 절단에 이용 가능해야 한다. cDNA가 요망되는 배향에서 통합된다면, 가이드 RNA 표적 서열은 파괴될 것이고, 서열은 장소에서 잠금될 것이다.
버전 1 및 버전 2의 Rs1 서열은 거의 동일한 한편, 바이러스 백본은 이중-가닥 바이러스 생성의 시기를 변화시켜서 유전자 삽입 효율에 영향을 미칠 수 있다. scAAV는 제2 가닥이 합성되는 기전에서의 차이로 인해 ssAAV보다 더 신속하게 이중 가닥으로 될 것이다. ssAAV에서의 ITR은 둘 다 복제 원점으로서 작용하고, 새로 합성된 가닥을 자르는 단일-가닥 뉴클레아제 도메인을 함유할 수 있다. 복제는 어느 한 ITR로부터 개시될 수 있으며, 따라서 + 가닥과 - 가닥의 혼합물이 형성될 것이다. 일단 폴리머라제가 다른 ITR에 도달하면, 합성된 가닥은 절단되고 방출된다. 보체 가닥(compliment strand)을 합성하기 위한 1차 기전은 숙주-세포 머시너리를 사용하는 것이다. 그러나, 낮은 수준에서, 바이러스에 의해 합성된 + 가닥 및 - 가닥은 자발적으로 어닐링되어 이중-가닥 바이러스를 형성할 수 있다. scAAV의 경우, 2개의 ITR 서열 중 하나는 뉴클레아제 도메인을 제거하도록 돌연변이화된다. 복제 분기점은 활성 ITR에서 시작하고 돌연변이체 ITR을 통해 이동하며, 절단되는 것 없이 합성은 반대 가닥 상에서 계속된다. + 가닥과 - 가닥을 둘 다 함유하는 단일-가닥 합성은 자기-상보적이어서 이중-가닥 바이러스를 만든다.
버전 1 내지 3은 각각 Cas9 마우스 백그라운드에서의 마우스 Rs1 좌위에서 유전자 삽입을 매개할 수 있었다. 파일럿 연구에서, 소량의 바이러스를 각각의 마우스의 우측 눈 내로 주사하고, 좌측 눈을 대조군으로서 주사하지 않았다. 망막 둘 다 수합하고 절반으로 잘랐다. 각각의 망막의 절반을 마우스 Rs1 좌위의 인트론 1에서의 비-상동성 말단 접합(NHEJ) 특징화에 사용하였다. 다른 절반을 사용하여, 돌연변이체 영역에 걸친 NGS 앰플리콘 시퀀싱을 위한 cDNA를 생산하였다. PCR 효율 및 편향(bias)으로 인해, 본 발명자들은 각각의 전사물 변이체를 증폭시킬 수 있었으나, 본 발명자들은 실제 발현 프로파일을 정량화할 수 없었다. NHEJ 특징화는 가이드 RNA 활성뿐만 아니라 삽입 활성에 대한 단서(clue)를 제공한다. NHEJ의 검출은, 돌연변이체 마우스 전사물을 발현하는 가능성이 있을 유전자 삽입이 없는 대립유전자를 암시한다. 어느 한 변형된 전사물의 검출은, 유전자 삽입이 발생하였음을 나타낸다.
13마리의 마우스의 우측 눈에 주사하였다: 버전 1의 경우 3마리, 및 버전 2 및 3의 경우 각각 5마리. 모든 주사된 눈은 광 간섭 단층촬영(OCT) 이미지화에서 관찰된 바와 같이 향상된 망막 구조화를 가졌다. 도 4를 참조한다. 각각의 눈의 3개의 상이한 장소로부터의 OCT 스캔(각각 61개의 이미지를 함유함)에서 도시된 망막강의 채점을 3개의 독립적인 판독자에 의해 하기 예비설정된 범주에 기초하여 시행하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 1 내지 4개의 강이 존재한다면 1의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 ≥ 4개의 강이 존재하지만 이들 강이 융합되지 않는다면 2의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 융합된 강이 존재한다면 3의 점수를 지정하였다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 융합된 강이 존재하고 망막이 신전된다면 4의 점수를 지정하였다. 각각의 치료군에 대한 평균 점수를, 분산의 비모수 크루스칼-왈리스 일원 분석 및 사후 검정 듄즈 다중 비교 검정에 의해, 풀링된 비치료된 눈을 함유하는 대조군과 비교하였다.
차세대 표적화된 리시퀀싱 앰플리콘을 도 3에 도시된 영역에 대해 설계하였으며(수평 화살표) 이들 영역은 4개의 예상된 서열 변이체에서 구별된다: (1) WT 마우스, R141C 돌연변이체를 함유하지 않는 마우스 기준 서열; (2) 돌연변이체 마우스, R141C 돌연변이체를 갖는 마우스 기준 서열; (3) 인간화 전사물 1, 인간 기준 서열; 및 (4) 인간화 전사물 2, 마우스 코돈-최적화된 인간 기준 서열. 마우스 망막을 연구 마우스로부터 수합하고, 총 mRNA를 조직으로부터 추출하였다. mRNA를, 차세대 시퀀싱(NGS) 앰플리콘에 대한 주형으로서 작용하기 위한 cDNA를 생산하는 데 사용하였다. 서열 식별을 위한 혼입된 바코드를 갖는 표적-특이적 올리고(oligo)를 사용하여 조직당 모든 4개의 변이체를 증폭시켰다. 각각의 마우스로부터의 PCR 생성물을 정규화하고, 추가 제조를 위해 단일 튜브 내로 풀링하였다. 최종 라이브러리를 MiSeq 상으로 로딩하고, 2x300 프로그램을 사용하여 시료를 시퀀싱하였다. 그 후에, 정보 코드를 사용하여, 시료를 비권취시키고(deconvolute) 드노보(de novo) 서열 기준을 형성하였다. 각각의 변이체를 매칭한 판독물의 수를 정량화하고, 변이체 판독물 카운트를 총 판독물 카운트로 나누어서 백분율을 수득하였다. 예상된 바와 같이, WT 마우스 서열은 암컷 Rosa Cas9/+ ;Rs1 R141C/+ 마우스에서만 발견되었다. 4개의 예상된 서열 변이체에 대한 NGS 결과를 도 5에 도시한다. PCR 편향 및 효율을 고려하지 않는다. 별개의 앰플리콘을 사용하여 Rs1 인트론 1 가이드 RNA 표적 서열을 증폭시켰다. 마우스 기준 서열과 매칭하거나 비-상동성 말단 접합을 함유한 판독물을, 가이드 RNA가 삽입을 만들지 않으면서 절단하는 방법을 평가하기 위해 정량화하였다. 도 6a 및 도 6b를 참조한다. 도 5의 표로부터의 데이터 중 일부를 보여주는 막대 그래프를 버전 1 내지 3에 대해 도 7a 내지 도 7c에 각각 도시한다.
모든 마우스는 다양한 수준의 모든 전사물을 보여주었으며, 모든 마우스에서 Tmh 판독물로부터 Th 판독물이 더 많았다. 예상된 바와 같이, 매우 높은 NHEJ 비율을 갖는 마우스는 존재하는 인간 전사물을 더 낮은 양으로 가졌다. 버전 1 및 버전 2가 유사한 서열 프로파일을 가진 한편, 버전 3은 잔여 돌연변이체 마우스 전사물의 더 큰 존재를 가졌다. 이는 특정 삽입 배향에 대한 필요성으로 인한 가능성이 있었다. 가이드 RNA 설계는 삽입을 요망되는 삽입 방향으로 위치시키는 것을 도와야 하는 한편, Cas9 절단은 재표적화의 가능성을 지나 인식 서열을 손상시켰다는 가능성이 있다. 추가로, 바이러스 게놈 상의 큰 삽입/결실(인델)은 스플라이스 신호를 방해하고 적절한 발현을 방지했을 수 있다.
실시예 2. 인간 망막아종 세포에서 인간 RS1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입
다음으로, 본 발명자들은 시험관내에서 WERI-Rb1 인간 망막아종 세포에서 인간 RS1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입을 시험하였다. WERI-Rb1 세포주(ATCC® HTB 169TM)를 인간 망막아종으로부터 유래하였다. 망막아종 세포는 광수용기의 전구체이고, 광수용기 세포주가 이용 가능하지 않기 때문에 적절한 시험관내 광수용기 세포 모델이다. 세포는 인하우스(in-house)에서 ICC 및 RT-PCR에 의한 망막 특이적 세포 마커를 특징으로 하였으며, 이는 단지 원추(cone)-특이적 mRNA/단백질을 보여주었고 이의 간상(rod) 대응물은 발견되지 않았으며, 이는 이러한 신생물이 원추 세포 계열이었음을 시사한다. 이에 더하여, RS1은 WERI-Rb1 세포에 의해 발현되고 방출되는 것으로 보고되었다. 본 발명자들은 또한 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 RS1 발현을 검출하였다(데이터는 도시되지 않음). 지질 나노입자(LNP)는 인간 RS1의 인트론 1을 표적화하는 6개의 가이드 RNA 중 하나 및 Cas9 mRNA(SEQ ID NO: 6245로 표시된 서열)로 제형화되었다.
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제1 실험에서, 현탁액 중 인간 망막아종 세포를 대략 5e5 MOI의 AAV 공여자(실시예 1로부터의 바이러스 벡터 버전 1 및 버전 2)로 형질도입하고, CRISPR/Cas9 LNP를 감염-후 2시간째에 투여하였다. 1000 ng LNP로 투입한 "고(high)" 시료를 제외하고는, 모든 LNP를 웰당 500 ng(48-웰 플레이트)으로 투입하였다. 그 후에, RT-qPCR에 의한 완전한 유전자 발현 분석을 수행하였다. 시료로부터 총 RNA를 수합하고 이를 DNAse로 처리하여 시료에 함유된 모든 DNA를 분해함으로써 RT-qPCR을 수행하였다. 다음, RNA 시료를 역전사시켜, 시료에 함유된 모든 mRNA에 대해 cDNA를 생산하였다. 그 후에, 표적 특이적 TaqMan 검정을 사용하여, 세포에서 발현된 독특한 RS1 서열을 정량화하였다. 감염-후 72시간째에 RNA를 수합하였다. 상기와 같이 총 RNA를 수합하고 DNAase로 처리함으로써 어떠한 역전사 대조군도 완료되지 않았다. 대조군에 대해, 어떠한 cDNA도 생산되지 않도록 역전사 폴리머라제를 물로 대체하였다. 역전사된 시료 및 대조군 비역전사된 시료를 하우스킵핑 유전자(DROSHA)와 함께 전개시켰다. 바이러스 벡터 버전 1(단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입)에 대한 결과를 도 8a에 도시한다. 바이러스 벡터 버전 1(자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입)에 대한 결과를 도 8b에 도시한다. RNA 양 및 품질에서의 차이를 정규화하기 위해 이들 결과를 델타 Ct로 나타낸다. 숫자가 낮을수록, 표적 서열의 발현은 더 높다. 이들 결과는 도입된 서열의 강력한 발현을 나타낸다. TaqMan 검정 및 바이러스 서열을 최적화하여, 내인성 인간 RS1 발현의 교차-검출을 감소시켰다. 제2 실험에서, 현탁액 중 인간 망막아종 세포를 대략 5e5 MOI의 AAV 공여자(실시예 1로부터의 바이러스 벡터 버전 1 및 버전 2)로 형질도입하고, CRISPR/Cas9 LNP를 감염 전 2시간째에 투여하였다. 1000 ng LNP로 투입한 "고" 시료를 제외하고는, 모든 LNP를 웰당 500 ng(48-웰 플레이트)으로 투입하였다. 그 후에, RT-qPCR에 의한 완전한 유전자 발현 분석을 수행하였다. 바이러스 벡터 버전 1(단일 가닥 AAV(ssAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입)에 대한 결과를 도 9a에 도시한다. 바이러스 벡터 버전 1(자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터에서의 양방향성 삽입)에 대한 결과를 도 9b에 도시한다. RNA 양 및 품질에서의 차이를 정규화하기 위해 이들 결과를 델타 Ct로 나타낸다. 숫자가 낮을수록, 표적 서열의 발현은 더 높다. 이들 결과는 도입된 서열의 강력한 발현을 나타낸다. TaqMan 검정 및 바이러스 서열을 최적화하여, 내인성 인간 RS1 발현의 교차-검출을 감소시켰다.
실시예 3. 상동성 재조합을 통한 XLRS 마우스 모델에서 마우스 Rs1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입
생체내에서 잠재적인 X-연관 연소 망막층간분리 치료법(XLRS) CRISPR 치료 전략을 모델링하기 위해, 본 발명자들은 뮤린 레티노스키신(Rs1)의 돌연변이체 복사물을 함유하는 마우스와 교배된 모든 조직에서 Cas9 단백질의 구성적 발현을 갖는 실시예 1에 기재된 마우스 주를 사용한다(Rosa Cas9 /+ ; Rs1 R141C / Y 마우스). 마우스에서 Rs1의 비분비형 R141C 변이체를 구제하기 위해 CRISPR/Cas9를 아데노-관련 바이러스(AAV)와 조합하여 사용한다. 작제물은, 하이브리드 마우스-인간 RS1 전사물이 내인성 Rs1 프로모터를 통해 발현될 망막(예를 들어, 광수용기) 내 내인성 Rs1 좌위 내로 상동성 재조합을 통해 통합되도록 설계된다. 마우스는 P14의 연령에 있으며, 이때 망막은 여전히 체세포분열, 세포성 분화, 및 성숙을 하고 있다. 망막의 체세포분열 동안 주사를 수행하고, 주사-후 2개월째에 체세포분열-후 평가를 수행한다.
WT 인간 RS1 엑손 2 내지 6(프로모터 없음), 뿐만 아니라 마우스 Rs1 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA(SEQ ID NO: 2887로 표시된 가이드 RNA 표적 서열)를 인코딩하는 3개의 바이러스 벡터를 설계하였고, 이들 요소는 모두 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다. 도 10을 참조한다. 이들 요소는 각각의 측면 상의 역전된 가이드 RNA 표적 서열에 의해 플랭킹된다. 일단 바이러스 게놈이 이중-가닥이면, 이는, 마우스 Rs1 인트론 1에서, 뿐만 아니라 바이러스 게놈의 양측면 상에서 이중-가닥 절단부를 동시에 야기하여 ITR 서열을 효과적으로 절단하는 하나의 가이드 RNA 서열을 발현할 것이다. 제1 바이러스 벡터 내 상동성 아암은 각각 대략 1800 bp이며, 제2 바이러스 벡터 내 상동성 아암은 각각 대략 900 bp이고, 제3 바이러스 벡터 내 상동성 아암은 각각 대략 450 bp이다. 3개의 벡터에 대한 서열은 SEQ ID NO: 6247-6249로 각각 표시되어 있다. 이들 바이러스 중 임의의 하나를 RosaCas9/+ ; Rs1R141C/Y 마우스의 눈에 주사 시, 가이드 RNA 발현은 Rs1 좌위에서의 절단 및 인간 RS1 cDNA 단편을 함유하는 바이러스 게놈과의 상동성 재조합을 이끈다. 마우스 Rs1 좌위는 도 1에 도시된다. 마우스 엑손 1은 인간 엑손 2 내지 6 cDNA 내로 스플라이싱되고(도 2), 하이브리드 마우스 인간 단백질의 발현은 돌연변이체 마우스 Rs1의 전사를 방지한다.
망막을 수합하고 절반으로 자른다. 각각의 망막의 절반을 마우스 Rs1 좌위의 인트론 1에서의 비-상동성 말단 접합(NHEJ) 특징화에 사용한다. 다른 절반을 사용하여, 돌연변이체 영역에 걸친 NGS 앰플리콘 시퀀싱을 위한 cDNA를 생산한다. NHEJ 특징화는 가이드 RNA 활성뿐만 아니라 삽입 활성에 대한 정보를 제공한다. NHEJ의 검출은, 돌연변이체 마우스 전사물을 발현하는 가능성이 있을 유전자 삽입이 없는 대립유전자를 암시한다. 삽입된 전사물의 검출은, 유전자 삽입이 발생하였음을 나타낸다.
망막 구조화를 광 간섭 단층촬영(OCT) 이미지화에 의해 평가한다. OCT 스캔에서 망막강의 채점을 3개의 독립적인 판독자에 의해 하기 예비설정된 범주에 기초하여 시행한다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 1 내지 4개의 강이 존재한다면 1의 점수를 지정한다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 ≥ 4개의 강이 존재하지만 이들 강이 융합되지 않는다면 2의 점수를 지정한다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 융합된 강이 존재한다면 3의 점수를 지정한다. 적어도 하나의 개별 이미지 상에 강이 존재하고 망막이 신전된다면 4의 점수를 지정한다. 각각의 치료군에 대한 평균 점수를, 분산의 비모수 크루스칼-왈리스 일원 분석 및 사후 검정 듄즈 다중 비교 검정에 의해, 풀링된 비치료된 눈을 함유하는 대조군과 비교한다.
마우스 망막을 연구 마우스로부터 수합하고, 총 mRNA를 조직으로부터 추출한다. mRNA를, 차세대 시퀀싱(NGS) 앰플리콘에 대한 주형으로서 작용하기 위한 cDNA를 생산하는 데 사용한다. 서열 식별을 위한 혼입된 바코드를 갖는 표적-특이적 올리고를 사용하여 조직당 모든 변이체를 증폭시킨다. 각각의 마우스로부터의 PCR 생성물을 정규화하고, 추가 제조를 위해 단일 튜브 내로 풀링한다. 최종 라이브러리를 MiSeq 상으로 로딩하고, 2x300 프로그램을 사용하여 시료를 시퀀싱한다. 그 후에, 정보 코드를 사용하여, 시료를 비권취시키고 드노보 서열 기준을 형성한다. 각각의 변이체를 매칭하는 판독물의 수를 정량화하고, 변이체 판독물 카운트를 총 판독물 카운트로 나누어서 백분율을 수득한다.
실시예 4. 상동성 재조합을 통한 망막아종 세포에서 인간 RS1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입
다음으로, 본 발명자들은 시험관내에서 인간 망막아종 세포에서 상동성 재조합을 통한 인간 RS1 좌위 내로의 RS1 코딩 서열의 삽입을 시험한다. 인간 RS1의 인트론 1을 표적화하는 가이드 RNA 및 Cas9 mRNA로 지질 나노입자(LNP)를 제형화한다. 제1 실험에서, 현탁액 중 인간 망막아종 세포를 대략 5e5 MOI의 AAV 공여자(실시예 3으로부터의 바이러스 벡터, 그러나 인간 RS1 상동성 아암을 가짐)로 형질도입하고, CRISPR/Cas9 LNP를 감염-후 2시간째에 투여한다. 모든 LNP를 웰당 500 ng 또는 웰당 1000 ng에서 투입한다. 그 후에, RT-qPCR에 의한 완전한 유전자 발현 분석을 수행한다. 제2 실험에서, 현탁액 중 인간 망막아종 세포를 대략 5e5 MOI의 AAV 공여자(실시예 3으로부터의 바이러스 벡터, 그러나 인간 RS1 상동성 아암을 가짐)로 형질도입하고, CRISPR/Cas9 LNP를 감염 전 2시간째에 투여하였다. 모든 LNP를 웰당 500 ng 또는 웰당 1000 ng에서 투입하였다. 그 후에, RT-qPCR에 의한 완전한 유전자 발현 분석을 수행한다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> CRISPR AND AAV STRATEGIES FOR X-LINKED JUVENILE RETINOSCHISIS THERAPY <130> 057766/694232 <150> US 62/932,608 <151> 2019-11-08 <160> 6249 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 224 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr 1 5 10 15 Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro 20 25 30 Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Val Gly Ala Asn Ala 35 40 45 Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln 65 70 75 80 Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp 85 90 95 Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp 100 105 110 Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys 115 120 125 Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile 130 135 140 Asp Glu Trp Val Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg 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gcucgugaga cagcaacugc cugaaaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa 1140 uggguacgca ggguacaucg auggaggcgc uagccaggaa gaguucuaua aguucaucaa 1200 gccaauccug gaaaagaugg acggaaccga agaacugcug gucaagcuga acagggagga 1260 ucugcuccgg aaacagagaa ccuuugacaa cggauccauu ccccaccaga uccaucuggg 1320 ugagcugcac gccaucuugc ggcgccagga ggacuuuuac ccauuccuca aggacaaccg 1380 ggaaaagauc gagaaaauuc ugacguuccg caucccguau uacgugggcc cacuggcgcg 1440 cggcaauucg cgcuucgcgu ggaugacuag aaaaucagag gaaaccauca cuccuuggaa 1500 uuucgaggaa guuguggaua agggagcuuc ggcacaaagc uucaucgaac gaaugaccaa 1560 cuucgacaag aaucucccaa acgagaaggu gcuuccuaag cacagccucc uuuacgaaua 1620 cuucacuguc uacaacgaac ugacuaaagu gaaauacguu acugaaggaa ugaggaagcc 1680 ggccuuucug uccggagaac agaagaaagc aauugucgau cugcuguuca agaccaaccg 1740 caaggugacc gucaagcagc uuaaagagga cuacuucaag aagaucgagu guuucgacuc 1800 aguggaaauc agcggggugg aggacagauu caacgcuucg cugggaaccu aucaugaucu 1860 ccugaagauc aucaaggaca aggacuuccu ugacaacgag gagaacgagg acauccugga 1920 agauaucguc cugaccuuga cccuuuucga ggaucgcgag augaucgagg agaggcuuaa 1980 gaccuacgcu caucucuucg acgauaaggu caugaaacaa cucaagcgcc gccgguacac 2040 ugguuggggc cgccucuccc gcaagcugau caacgguauu cgcgauaaac agagcgguaa 2100 aacuauccug gauuuccuca aaucggaugg cuucgcuaau cguaacuuca ugcaauugau 2160 ccacgacgac agccugaccu uuaaggagga cauccaaaaa gcacaagugu ccggacaggg 2220 agacucacuc caugaacaca ucgcgaaucu ggccgguucg ccggcgauua agaagggaau 2280 ucugcaaacu gugaaggugg ucgacgagcu ggugaagguc augggacggc acaaaccgga 2340 gaauaucgug auugaaaugg cccgagaaaa ccagacuacc cagaagggcc agaaaaacuc 2400 ccgcgaaagg augaagcgga ucgaagaagg aaucaaggag cugggcagcc agauccugaa 2460 agagcacccg guggaaaaca cgcagcugca gaacgagaag cucuaccugu acuauuugca 2520 aaauggacgg gacauguacg uggaccaaga gcuggacauc aaucgguugu cugauuacga 2580 cguggaccac aucguuccac aguccuuucu gaaggaugac ucgaucgaua acaagguguu 2640 gacucgcagc gacaagaaca gagggaaguc agauaaugug ccaucggagg aggucgugaa 2700 gaagaugaag aauuacuggc ggcagcuccu gaaugcgaag cugauuaccc agagaaaguu 2760 ugacaaucuc acuaaagccg agcgcggcgg acucucagag cuggauaagg cuggauucau 2820 caaacggcag cuggucgaga cucggcagau uaccaagcac guggcgcaga ucuuggacuc 2880 ccgcaugaac acuaaauacg acgagaacga uaagcucauc cgggaaguga aggugauuac 2940 ccugaaaagc aaacuugugu cggacuuucg gaaggacuuu caguuuuaca aagugagaga 3000 aaucaacaac uaccaucacg cgcaugacgc auaccucaac gcuguggucg guaccgcccu 3060 gaucaaaaag uacccuaaac uugaaucgga guuuguguac ggagacuaca aggucuacga 3120 cgugaggaag augauagcca aguccgaaca ggaaaucggg aaagcaacug cgaaauacuu 3180 cuuuuacuca aacaucauga acuuuuucaa gacugaaauu acgcuggcca auggagaaau 3240 caggaagagg ccacugaucg aaacuaacgg agaaacgggc gaaaucgugu gggacaaggg 3300 cagggacuuc gcaacuguuc gcaaagugcu cucuaugccg caagucaaua uugugaagaa 3360 aaccgaagug caaaccggcg gauuuucaaa ggaaucgauc cucccaaaga gaaauagcga 3420 caagcucauu gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc 3480 gacugucgca uacuccgucc ucgugguggc caagguggag aagggaaaga gcaaaaagcu 3540 caaauccguc aaagagcugc uggggauuac caucauggaa cgauccucgu ucgagaagaa 3600 cccgauugau uuccucgagg cgaaggguua caaggaggug aagaaggauc ugaucaucaa 3660 acuccccaag uacucacugu ucgaacugga aaauggucgg aagcgcaugc uggcuucggc 3720 cggagaacuc caaaaaggaa augagcuggc cuugccuagc aaguacguca acuuccucua 3780 ucuugcuucg cacuacgaaa aacucaaagg gucaccggaa gauaacgaac agaagcagcu 3840 uuucguggag cagcacaagc auuaucugga ugaaaucauc gaacaaaucu ccgaguuuuc 3900 aaagcgcgug auccucgccg acgccaaccu cgacaaaguc cugucggccu acaauaagca 3960 uagagauaag ccgaucagag aacaggccga gaacauuauc cacuuguuca cccugacuaa 4020 ccugggagcc ccagccgccu ucaaguacuu cgauacuacu aucgaucgca aaagauacac 4080 guccaccaag gaaguucugg acgcgacccu gauccaccaa agcaucacug gacucuacga 4140 aacuaggauc gaucugucgc agcugggugg cgauggcggu ggaucuccga aaaagaagag 4200 aaagguguaa ugagcuagcc aucacauuua aaagcaucuc agccuaccau gagaauaaga 4260 gaaagaaaau gaagaucaau agcuuauuca ucucuuuuuc uuuuucguug guguaaagcc 4320 aacacccugu cuaaaaaaca uaaauuucuu uaaucauuuu gccucuuuuc ucugugcuuc 4380 aauuaauaaa aaauggaaag aaccucgaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 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ggtgctggac 4080 gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cccggatcga cctgagccag 4140 ctgggcggcg acagcggcgg caagcggccc gccgccacca agaaggccgg ccaggccaag 4200 aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg cctga 4245 <210> 6245 <211> 4245 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6245 auggccccca agaagaagcg gaaggugggc auccacggcg ugcccgccgc cgacaagaag 60 uacagcaucg gccuggacau cggcaccaac agcgugggcu gggccgugau caccgacgag 120 uacaaggugc ccagcaagaa guucaaggug cugggcaaca ccgaccggca cagcaucaag 180 aagaaccuga ucggcgcccu gcuguucgac agcggcgaga ccgccgaggc cacccggcug 240 aagcggaccg cccggcggcg guacacccgg cggaagaacc ggaucugcua ccugcaggag 300 aucuucagca acgagauggc caagguggac gacagcuucu uccaccggcu ggaggagagc 360 uuccuggugg aggaggacaa gaagcacgag cggcacccca ucuucggcaa caucguggac 420 gagguggccu accacgagaa guaccccacc aucuaccacc ugcggaagaa gcugguggac 480 agcaccgaca aggccgaccu gcggcugauc uaccuggccc uggcccacau gaucaaguuc 540 cggggccacu uccugaucga gggcgaccug aaccccgaca acagcgacgu ggacaagcug 600 uucauccagc uggugcagac cuacaaccag cuguucgagg agaaccccau caacgccagc 660 ggcguggacg ccaaggccau ccugagcgcc cggcugagca agagccggcg gcuggagaac 720 cugaucgccc agcugcccgg cgagaagaag aacggccugu ucggcaaccu gaucgcccug 780 agccugggcc ugacccccaa cuucaagagc aacuucgacc uggccgagga cgccaagcug 840 cagcugagca aggacaccua cgacgacgac cuggacaacc ugcuggccca gaucggcgac 900 caguacgccg accuguuccu ggccgccaag aaccugagcg acgccauccu gcugagcgac 960 auccugcggg ugaacaccga gaucaccaag gccccccuga gcgccagcau gaucaagcgg 1020 uacgacgagc accaccagga ccugacccug cugaaggccc uggugcggca gcagcugccc 1080 gagaaguaca aggagaucuu cuucgaccag agcaagaacg gcuacgccgg cuacaucgac 1140 ggcggcgcca gccaggagga guucuacaag uucaucaagc ccauccugga gaagauggac 1200 ggcaccgagg agcugcuggu gaagcugaac cgggaggacc ugcugcggaa gcagcggacc 1260 uucgacaacg gcagcauccc ccaccagauc caccugggcg agcugcacgc cauccugcgg 1320 cggcaggagg acuucuaccc cuuccugaag gacaaccggg agaagaucga gaagauccug 1380 accuuccgga uccccuacua cgugggcccc cuggcccggg gcaacagccg guucgccugg 1440 augacccgga agagcgagga gaccaucacc cccuggaacu ucgaggaggu gguggacaag 1500 ggcgccagcg cccagagcuu caucgagcgg augaccaacu ucgacaagaa ccugcccaac 1560 gagaaggugc ugcccaagca cagccugcug uacgaguacu ucaccgugua caacgagcug 1620 accaagguga aguacgugac cgagggcaug cggaagcccg ccuuccugag cggcgagcag 1680 aagaaggcca ucguggaccu gcuguucaag accaaccgga aggugaccgu gaagcagcug 1740 aaggaggacu acuucaagaa gaucgagugc uucgacagcg uggagaucag cggcguggag 1800 gaccgguuca acgccagccu gggcaccuac cacgaccugc ugaagaucau caaggacaag 1860 gacuuccugg acaacgagga gaacgaggac auccuggagg acaucgugcu gacccugacc 1920 cuguucgagg accgggagau gaucgaggag cggcugaaga ccuacgccca ccuguucgac 1980 gacaagguga ugaagcagcu gaagcggcgg cgguacaccg gcuggggccg gcugagccgg 2040 aagcugauca acggcauccg ggacaagcag agcggcaaga ccauccugga cuuccugaag 2100 agcgacggcu ucgccaaccg gaacuucaug cagcugaucc acgacgacag ccugaccuuc 2160 aaggaggaca uccagaaggc ccaggugagc ggccagggcg acagccugca cgagcacauc 2220 gccaaccugg ccggcagccc cgccaucaag aagggcaucc ugcagaccgu gaagguggug 2280 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600 atgcagattt acctatcaag ttttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaacacttt 660 attcactgtt ggtgggtatg taaactggca tatgtagcca ctatgaaaat cagcacagag 720 gttcccttcc cactccaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca 780 aaacaaaacc ctctagaact agaactagaa ctactgcacg actataatga tgatcttgtt 840 ctttctgttt aattttactg tccctagctt cttagcatct gcggatgttt ttcctggcag 900 atatttactc accatgactt cttccagaag gggtgttggt agctttcatg tgactatttc 960 tatttcactt ttccatgtaa cgagtgatgc tgttggattt ctctttcatt aattagattt 1020 tttctgtctc atccttttgc tttagccaca ttgggattat cgtctaccga ggatgaaggc 1080 gaggacccct ggtaccaaaa agcatgcaag tgcgattgcc aaggaggacc caatgctctg 1140 tggtctgcag gtgccacctc cttggactgt ataccagaat gcccatatca caagcctctg 1200 ggtttcgagt caggggaggt cacaccggac cagatcacct gctctaaccc ggagcagtat 1260 gtgggctggt attcttcgtg gactgcaaac aaggcccggc tcaacagtca aggctttggg 1320 tgtgcctggc tctccaagtt ccaggacagt agccagtggt tacagataga tctgaaggag 1380 atcaaagtga tttcagggat cctcacccag gggcgctgtg acatcgatga gtggatgacc 1440 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ttacatggaa tttatatttt attgtggttt aatagctcct gtacatcata gacaaacctc 4860 aagaaaaatt ttcaaccaat agtccaggca aaaataacct ctttttcttt ctttctttct 4920 ttcttttttt tttttttttt ttggtttttt gaaacagggt ttctctgtat agccctggct 4980 gtcctggaac tcactttgta caccaggctg gcctggatcg tgcagtagtt ctag 5034 <210> 6249 <211> 4296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6249 ctagaactac tgcacgatcc aggaagagga gatgggagga ttcctgtggc tggctggaca 60 gctaacctag cctattcatc tatttccagg ccactaaggg atggtacctt aaaaaataac 120 aataataata aaaaataaca ataataataa ataaaaaagg tagctggttc ctgaggagca 180 tctaaggata tcctttaact ccacgtgcac atacactgta tacacaggaa cacatacaag 240 catgcagatt tacctatcaa gttttaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagaacactt 300 tattcactgt tggtgggtat gtaaactggc atatgtagcc actatgaaaa tcagcacaga 360 ggttcccttc ccactccaac aaaacaaaac aaaacaaaac aaaacaaaac aaaacaaaac 420 aaaacaaaac cctctagaac tagaactaga actactgcac gactataatg atgatcttgt 480 tctttctgtt taattttact gtccctagct tcttagcatc tgcggatgtt tttcctggca 540 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ccagtttggt ctacatagtg agttctagta cagccataag accatatagc 3960 catatggagg ggggattgtg agcatagagt atgaatgttc ttgagagaat tattaaatga 4020 attggaatta ttatacactg tcttctttca taggaaaaat gaacagaaag ggagagatct 4080 ttgggtgggg ctaacagcat acatgacatg aaagcagaag gggattagtt attggaaggc 4140 agggagggac ccaggaggat gaagggaaga gaatgcaagg gaaaggagta aaggaggagg 4200 aggtagaggt acacactatt aattccagca cttgtgagga ggggacagag ctctgtgagt 4260 tcaaggtcag ccccctggat cgtgcagtag ttctag 4296

Claims (223)

  1. 표적 게놈 좌위(locus) 내로의 통합을 위한 핵산 작제물로서, 상기 핵산 작제물은 양방향성이고,
    (a) 제1 레티노스키신(retinoschisin) 단백질 또는 이의 단편에 대한 제1 코딩 서열을 포함하는 제1 분절(segment); 및
    (b) 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 제2 코딩 서열의 역보체(reverse complement)를 포함하는 제2 분절을 포함하는, 핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 분절은 제1 분절의 3'에 위치하는, 핵산 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이거나, 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이거나, 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 둘 다 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편인, 핵산 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열은 상보적 DNA(cDNA)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제2 코딩 서열은 cDNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 cDNA를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체(degenerate variant)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제2 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 인간 RS1의 제1 인트론의 단편 또는 일부를 포함하고/하거나 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치하는 인간 RS1의 제2 인트론의 단편 또는 일부의 역보체를 포함하는, 핵산 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 동일한 것인, 핵산 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 코딩 서열은 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택하는, 핵산 작제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 분절은 제1 분절과 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 99%의 상보성을 갖는, 핵산 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 분절은 제1 분절과 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 약 95% 미만, 약 97% 미만, 또는 약 99% 미만의 상보성을 갖는, 핵산 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 코딩 서열의 역보체는
    (a) 제1 코딩 서열과 실질적으로 상보적이지 않거나;
    (b) 제1 코딩 서열의 단편과 실질적으로 상보적이지 않거나;
    (c) 제1 코딩 서열과 고도로 상보적이거나;
    (d) 제1 코딩 서열의 단편과 고도로 상보적이거나;
    (e) 제1 코딩 서열의 역보체와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 동일하거나;
    (f) 제1 코딩 서열의 역보체와 약 50% 내지 약 80% 동일하거나;
    (g) 제1 코딩 서열의 역보체와 약 60% 내지 약 100% 동일한 것인, 핵산 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분절은 링커에 의해 제2 분절에 연결되는, 핵산 작제물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 링커는 약 5 내지 약 2000개 뉴클레오타이드 길이인, 핵산 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치하는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치하는 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함하는, 핵산 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 폴리아데닐화 신호 서열은 제2 폴리아데닐화 신호 서열과 상이한 것인, 핵산 작제물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는(drive) 프로모터를 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 제1 스플라이스 수용기(splice acceptor) 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치하는 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함하는, 핵산 작제물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것이거나, 제2 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것이거나, 제1 스플라이스 수용기 부위와 제2 스플라이스 수용기 부위는 둘 다 RS1 유전자로부터의 것인, 핵산 작제물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것이거나, 제2 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것이거나, 제1 수용기 부위와 제2 스플라이스 수용기 부위는 둘 다 인간 RS1로부터의 인트론 1로부터의 것인, 핵산 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 상동성 아암(homology arm)을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하는, 핵산 작제물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 단일-가닥인, 핵산 작제물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 이중-가닥인, 핵산 작제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 DNA를 포함하는, 핵산 작제물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되거나, 제2 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되거나, 제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 핵산 작제물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 하기 말단 구조: 헤어핀(hairpin), 루프, 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat), 또는 원환체(toroid) 중 하나 이상을 포함하는, 핵산 작제물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 ITR을 포함하는, 핵산 작제물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 및/또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열 및/또는 제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되고,
    제2 코딩 서열은 SEQ ID NO: 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%와 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 46 또는 47과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 분절은 제1 분절의 3'에 위치하며,
    제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 둘 다 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고,
    제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편과 동일하며,
    제1 코딩 서열과 제2 코딩 서열은 둘 다 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하고,
    제2 코딩 서열은 제1 코딩 서열의 코돈 사용빈도와 상이한 코돈 사용빈도를 채택하며,
    제1 분절은 제1 코딩 서열의 3'에 위치하는 제1 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 5'에 위치하는 제2 폴리아데닐화 신호 서열의 역보체를 포함하고,
    제1 분절은 제1 코딩 서열의 5'에 위치하는 제1 스플라이스 수용기 부위를 포함하고, 제2 분절은 제2 코딩 서열의 역보체의 3'에 위치하는 제2 스플라이스 수용기 부위의 역보체를 포함하며,
    핵산 작제물은 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 상동성 아암을 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터인, 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 상기 AAV는 단일-가닥 게놈(ssAAV: single-stranded genome)을 포함하는, 벡터.
  37. 제35항에 있어서, 상기 AAV는 자기-상보적 게놈(scAAV: self-complementary genome)을 포함하는, 벡터.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는, 벡터.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상동성 아암을 포함하지 않는, 벡터.
  41. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상동성 아암을 포함하는, 벡터.
  42. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자.
  43. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에 존재하는, 세포.
  45. 제43항에 있어서, 상기 세포는 생체내에 존재하는, 세포.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 세포.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 세포.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현하는, 세포.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  51. 제50항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위인, 세포.
  52. 제50항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  53. 제52항에 있어서, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물의 제1 코딩 서열 또는 제2 코딩 서열 내로 스플라이스되는, 세포.
  54. 제53항에 있어서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩하는, 세포.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지하는, 세포.
  56. 제55항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고(eliminate), 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체하는, 세포.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis)를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시키는, 세포.
  58. 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합(homology-independent targeted integration)을 위한 핵산 작제물로서, 상기 핵산 작제물은 각각의 측면(side) 상에서 뉴클레아제 제제(nuclease agent)에 대한 뉴클레아제 표적 서열에 의해 플랭킹된 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 뉴클레아제 표적 서열과 동일하고, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질(reform)되는, 핵산 작제물.
  60. 표적 게놈 좌위와의 상동성 재조합(homologous recombination)을 위한 핵산 작제물로서, 상기 핵산 작제물은 각각의 측면 상에서 상동성 아암에 의해 플랭킹된 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하며, 선택적으로 코딩 서열 및 상동성 아암은 각각의 측면 상에서 뉴클레아제 제제에 대한 뉴클레아제 표적 서열에 의해 추가로 플랭킹되고, 선택적으로 각각의 상동성 아암은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이인, 핵산 작제물.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편인, 핵산 작제물.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 상보적 DNA(cDNA)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 인간 RS1의 제1 인트론의 단편 또는 일부를 포함하는, 핵산 작제물.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는, 핵산 작제물.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하는, 핵산 작제물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 스플라이스 수용기 부위는 RS1 유전자로부터의 것인, 핵산 작제물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 스플라이스 수용기 부위는 인간 RS1의 인트론 1로부터의 것인, 핵산 작제물.
  70. 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 단일-가닥인, 핵산 작제물.
  71. 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 이중-가닥인, 핵산 작제물.
  72. 제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 DNA를 포함하는, 핵산 작제물.
  73. 제58항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열은 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 핵산 작제물.
  74. 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물은 하기 말단 구조: 헤어핀, 루프, 역 말단 반복부(ITR), 또는 원환체 중 하나 이상을 포함하는, 핵산 작제물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 코딩 서열 및 뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 핵산 작제물의 영역은 ITR에 의해 플랭킹되는, 핵산 작제물.
  76. 제58항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 제제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA이고, 뉴클레아제 표적 서열은 가이드 RNA 표적 서열인, 핵산 작제물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열은 역(inverted) 가이드 RNA 표적 서열인, 핵산 작제물.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9인, 핵산 작제물.
  79. 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 5와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  80. 제58항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 SEQ ID NO: 8 또는 9와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  81. 제58항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 SEQ ID NO: 45와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 핵산 작제물.
  82. 제58항, 제59항, 및 제61항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위 내로의 상동성-독립적 표적화된 통합을 위한 핵산 작제물이며,
    레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고,
    레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하며,
    핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며,
    핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하고,
    핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열은 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 뉴클레아제 표적 서열과 동일하고, 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질된다.
  83. 제60항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물 은 표적 게놈 좌위와의 상동성 재조합을 위한 핵산 작제물이며,
    레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 인간 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편이고,
    레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열은 인간 RS1의 엑손 2 내지 6 또는 이의 축퇴성 변이체를 포함하는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하며,
    핵산 작제물은 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않고,
    핵산 작제물은 코딩 서열의 3'에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며,
    핵산 작제물은 코딩 서열의 5'에 위치한 스플라이스 수용기 부위를 포함하고,
    각각의 상동성 아암은 약 25개 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb 길이인, 핵산 작제물.
  84. 제58항 내지 제83항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
  85. 제84항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  86. 제85항에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
  87. 제86항에 있어서, 상기 AAV는 단일-가닥 게놈(ssAAV)을 포함하는, 벡터.
  88. 제86항에 있어서, 상기 AAV는 자기-상보적 게놈(scAAV)을 포함하는, 벡터.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하지 않는, 벡터.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상동성 아암을 포함하지 않는, 벡터.
  92. 제58항 내지 제83항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 지질 나노입자.
  93. 제58항 내지 제83항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하는 세포.
  94. 제93항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에 존재하는, 세포.
  95. 제93항에 있어서, 상기 세포는 생체내에 존재하는, 세포.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 세포.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 세포.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 세포.
  99. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현하는, 세포.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  101. 제100항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위인, 세포.
  102. 제100항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  103. 제102항에 있어서, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스되는, 세포.
  104. 제103항에 있어서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩하는, 세포.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지하는, 세포.
  106. 제105항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체하는, 세포.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시키는, 세포.
  108. 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 데 사용하기 위한 또는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    (a) 표적 게놈 좌위 내로의 통합을 위한 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  109. 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 데 사용하기 위한 또는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    (a) 제58항 내지 제83항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물 내 뉴클레아제 표적 서열과 동일한 것인, 조성물.
  111. 제110항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 핵산 작제물이 올바른 배향으로 삽입된다면 파손되지만 핵산 작제물이 표적 게놈 좌위 내로 반대 배향으로 삽입된다면 개질되는, 조성물.
  112. 세포에서 레티노스키신을 발현시키는 데 사용하기 위한 또는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    (a) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물; 및
    (b) 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 뉴클레아제 제제는 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열을 표적화하는, 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  113. 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위는 RS1 유전자에 존재하는, 조성물.
  114. 제113항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재하는, 조성물.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지하는, 조성물.
  116. 제115항에 있어서, 상기 세포에서 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체하는, 조성물.
  117. 제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 바이러스 벡터에 존재하는, 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터인, 조성물.
  119. 제118항에 있어서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  120. 제108항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 제제는 Cas 단백질 및 가이드 RNA이고, 뉴클레아제 표적 서열은 가이드 RNA 표적 서열인, 조성물.
  121. 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA는 RS1 유전자 내 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 분절을 포함하고, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 상기 조성물은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 조성물.
  123. 제120항 또는 제122항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 조성물.
  124. 제123항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 스트렙토콕커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질로부터 유래되는, 조성물.
  125. 제120항 및 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단백질 형태의 Cas 단백질을 포함하는, 조성물.
  126. 제120항 및 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 선택적으로 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는, 조성물.
  127. 제126항에 있어서, 상기 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하고, 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하며, Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 하나 이상의 바이러스 벡터에 존재하는, 조성물.
  128. 제127항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터인, 조성물.
  129. 제128항에 있어서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  130. 제120항 및 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA를 포함하고, 선택적으로 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함하는, 조성물.
  131. 제120항 및 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하며, 핵산은 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA를 포함하고, 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함하며, 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 지질 나노입자에 존재하는, 조성물.
  132. 제131항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  133. 제132항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 변형된 우리딘을 하나 이상의 또는 모든 우리딘 위치에 포함하도록 변형되는, 조성물.
  134. 제133항에 있어서, 상기 변형된 우리딘은 슈도우리딘인, 조성물.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 슈도우리딘으로 완전히 치환되는, 조성물.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 5' 캡을 포함하는, 조성물.
  137. 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 폴리(A) 테일을 포함하는, 조성물.
  138. 제130항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA는 SEQ ID NO: 6243 또는 6245로 표시된 서열을 포함하는, 조성물.
  139. 제120항 및 제122항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 조성물.
  140. 제120항 및 제122항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 SEQ ID NO: 27, 6242, 또는 6246으로 표시된 서열을 포함하는, 조성물.
  141. 제120항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 인트론에 존재하는, 조성물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 인트론은 RS1 유전자의 제1 인트론인, 조성물.
  143. 제120항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RS1 유전자는 인간 RS1 유전자인, 조성물.
  144. 제120항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은
    (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접(contiguous) 뉴클레오타이드;
    (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드;
    (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드;
    (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드; 또는
    (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  145. 제120항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은
    (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하며;
    (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하고;
    (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하며;
    (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하거나;
    (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 조성물.
  146. 제120항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은
    (a) SEQ ID NO: 3148-6241 중 임의의 하나;
    (b) SEQ ID NO: 3148-4989 중 임의의 하나;
    (c) SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247, 및 3249-4351 중 임의의 하나;
    (d) SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나; 또는
    (e) SEQ ID NO: 4990-6241 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  147. 제120항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열의 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  148. 제120항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 것인, 조성물.
  149. 제120항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA-표적화 분절은 SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297, 및 4304 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  150. 제120항 및 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA 형태의 가이드 RNA를 포함하는, 조성물.
  151. 제120항 및 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는, 조성물.
  152. 제120항 및 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  154. 제152항 또는 제153항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  155. 제152항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음의 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하는, 조성물.
  156. 제152항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 5개 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하는, 조성물.
  157. 제152항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  158. 제152항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 조성물.
  159. 제152항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  160. 제152항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  161. 제152항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은: (i) 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; (ii) 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 결합; (iii) 가이드 RNA의 5' 단부에서의 처음 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드; 및 (iv) 가이드 RNA의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  162. 제152항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 44의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
  163. 제120항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)인, 조성물.
  164. 제163항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 SEQ ID NO: 33-39 및 53 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는, 조성물.
  165. 제120항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA: trans-activating crRNA)를 포함하는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함하는 이중 가이드 RNA(dgRNA)인, 조성물.
  166. 제165항에 있어서, 상기 crRNA는 SEQ ID NO: 29 및 52 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하는, 조성물.
  167. 제165항 또는 제166항에 있어서, 상기 tracrRNA는 SEQ ID NO: 30-32 중 임의의 하나로 표시된 서열을 포함하는, 조성물.
  168. 제120항 및 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 지질 나노입자와 회합되고, 선택적으로 조성물은 가이드 RNA를 포함하는, 조성물.
  169. 제120항 및 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 바이러스 벡터에 존재하는, 조성물.
  170. 제169항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 바이러스 벡터인, 조성물.
  171. 제170항에 있어서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV8, 또는 AAV7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  172. 제120항 및 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물인, 조성물.
  173. 제120항 및 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가이드 RNA 또는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 추가로 포함하며, 제2 가이드 RNA는 RS1 유전자 내 제2 가이드 RNA 표적 서열을 표적화하는 DNA-표적화 분절을 포함하고, 제2 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내 제2 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하는, 조성물.
  174. 제108항 내지 제173항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  175. 제108항 내지 제120항 및 제123항 내지 제173항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 세포.
  176. 제175항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에 존재하는, 세포.
  177. 제175항에 있어서, 상기 세포는 생체내에 존재하는, 세포.
  178. 제175항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 세포.
  179. 제178항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 세포.
  180. 제175항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 세포.
  181. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제1 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편 또는 제2 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현하는, 세포.
  182. 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 표적 게놈 좌위에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  183. 제182항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 좌위인, 세포.
  184. 제182항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되는, 세포.
  185. 제184항에 있어서, 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물의 제1 코딩 서열 또는 제2 코딩 서열 내로 스플라이스되는, 세포.
  186. 제185항에 있어서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩하는, 세포.
  187. 제183항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지하는, 세포.
  188. 제187항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체하는, 세포.
  189. 제187항 또는 제188항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위는 X-연관 연소 망막층간분리를 야기하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 RS1 유전자를 포함하고, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물은 돌연변이화된 RS1 유전자의 발현을 감소시키거나 무력화시키는, 세포.
  190. 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열을 표적 게놈 좌위 내로 통합하고 세포에서 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 방법으로서, 제108항 내지 제120항 및 제123항 내지 제173항 중 어느 한 항의 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 코딩 서열은 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편은 세포에서 발현되는, 방법.
  191. 제190항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 방법.
  193. 제190항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 방법.
  194. 제190항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에 존재하는, 방법.
  195. 제190항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체내에 존재하는, 방법.
  196. 제195항에 있어서, 상기 세포는 망막(retinal) 세포이고, 투여하기에는 망막하(subretinal) 주사 또는 유리체내(intravitreal) 주사가 포함되는, 방법.
  197. X-연관 연소 망막층간분리를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제108항 내지 제120항 및 제123항 내지 제173항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 핵산 작제물은 대상체의 하나 이상의 망막 세포 내 표적 게놈 좌위 내로 통합되고 이로부터 발현되고, 치료적 유효 수준의 레티노스키신 발현이 대상체에서 달성되는, 방법.
  198. 제197항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  199. 제197항 또는 제198항에 있어서, 상기 대상체는 X-연관 연소 망막층간분리와 관련이 있거나 이를 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 내인성 RS1 유전자를 갖는, 방법.
  200. 제199항에 있어서, 상기 돌연변이는 R141C 돌연변이인, 방법.
  201. 제197항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여하기에는 망막하 주사 또는 유리체내 주사가 포함되는, 방법.
  202. 제197항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물의 통합은 망막 구조 복구를 이끄는, 방법.
  203. 제190항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 상이한 전달 비히클에서 투여되는, 방법.
  204. 제190항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동일한 전달 비히클에서 투여되는, 방법.
  205. 제190항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 동시에 투여되는, 방법.
  206. 제190항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물 및 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산은 임의의 순서로 순차적으로 투여되는, 방법.
  207. 제206항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산 전에 투여되는, 방법.
  208. 제206항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 뉴클레아제 제제 또는 상기 뉴클레아제 제제를 인코딩하는 핵산에 후속하여 투여되는, 방법.
  209. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 순차적인 투여 사이의 시간은 약 2시간 내지 약 48시간인, 방법.
  210. 제190항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위는 내인성 RS1 유전자에 존재하는, 방법.
  211. 제210항에 있어서, 상기 표적 게놈 좌위 내 뉴클레아제 표적 서열은 내인성 RS1 유전자 내 제1 인트론에 존재하는, 방법.
  212. 제211항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 내인성 RS1 좌위의 인트론 1에서 게놈적으로 통합되고, 여기서 내인성 RS1 엑손 1은 핵산 작제물 내 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 내로 스플라이스되는, 방법.
  213. 제212항에 있어서, 게놈적으로 통합된 핵산 작제물을 포함하는 변형된 RS1 좌위는 SEQ ID NO: 2 또는 4와 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단백질을 인코딩하는, 방법.
  214. 제210항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 통합 부위의 다운스트림에서 내인성 RS1 유전자의 전사를 방지하는, 방법.
  215. 제214항에 있어서, 상기 내인성 RS1 좌위 내로의 핵산 작제물의 통합은 내인성 RS1 좌위로부터의 내인성 레티노스키신 단백질의 발현을 감소시키거나 무력화시키고, 상기 발현을 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 레티노스키신 단백질 또는 이의 단편의 발현으로 대체하는, 방법.
  216. 세포에서 RS1 유전자를 변형시키는 방법으로서, 제122항 내지 제173항 중 어느 한 항의 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하며, 가이드 RNA는 Cas 단백질에 결합하고 상기 Cas 단백질을 RS1 유전자 내 가이드 RNA 표적 서열로 표적화하고, Cas 단백질은 가이드 RNA 표적 서열을 절단하는, 방법.
  217. 제216항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  218. 제217항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 방법.
  219. 제216항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 방법.
  220. 제216항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에 존재하는, 방법.
  221. 제216항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체내에 존재하는, 방법.
  222. 제221항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포이고, 투여하기에는 망막하 주사 또는 유리체내 주사가 포함되는, 방법.
  223. 제216항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 표적 서열은 RS1 유전자의 제1 인트론에 존재하는, 방법.
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