KR20220089586A

KR20220089586A - Multi-functional phamaceutical composition for preventing adhesion

Info

Publication number: KR20220089586A
Application number: KR1020200180354A
Authority: KR
Inventors: 김영직; 최병현
Original assignee: 에이템즈 주식회사
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-06-28

Abstract

본 발명은 복합기능성 유착방지용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)에 해양동물에서 추출한 기능성 성분을 혼합하여 신생혈관 억제기전을 통해 조직간의 유착을 근본적으로 막고 염증발생을 억제할 수 있는 복합기능성 유착방지용 약학조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, and more particularly, the present invention mixes a functional ingredient extracted from marine animals with an extracellular matrix (ECM) derived from cartilage tissue to prevent adhesion between tissues through an angiogenesis inhibitory mechanism. It relates to a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition that can fundamentally prevent and inhibit inflammation.

Description

Multi-functional pharmaceutical composition for preventing adhesion

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질과 해양생물에서 추출한 기능성분을 유효성분으로 하는 복합기능성 유착방지용 약학조성물에 대한 것이다.The present invention relates to a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition comprising, as active ingredients, an extracellular matrix derived from cartilage tissue and a functional ingredient extracted from marine organisms.

유착이란 분리되어 있어야 할 장기의 조직 면이 섬유성 조직으로 연결, 융합되는 것을 일컫는 용어로서 주로 수술이나 염증에 의해 분리되어야 할 조직이 서로 연결되어 있는 것을 말한다. 유착은 그 자체로도 문제지만 유착으로 인한 합병증으로 소장폐색, 후천성 여성 불임증, 자궁 외 임신, 만성 복통, 재수술 등이 발생한다. 이러한 유착은 외과적 수술 후 50%에서 90% 정도까지 발생하며 유착에 의해 재수술을 받는 환자가 34.6%에 이를 정도로 발생이 잦다. 유착은 조직의 손상 이후 나타나는 치유 과정과 비슷하며 유착방지는 자연스러운 치유과정을 방해하지 않고 바람직하지 않은 유착만을 막는 것이 중요하다. 수술 후의 유착은 치유과정 중에 정상적으로 침착하는 섬유소가 상처의 치유과정이 완료되었음에도 불구하고 지속적으로 발생하여 인접한 다른 조직과 결합을 형성하고 궁극적으로 혈관이 형성되어 완전한 하나의 조직 혹은 기관으로 합쳐지게 된다. 이러한 유착을 방지하기 위해 인위적으로 섬유소를 분해하는 약물을 쓰기도 하지만 주로 사용되는 방법은 생분해성 소재를 활용하여 조직 간에 물리적인 장벽을 만들어 조직을 유격시키는 유착방지소재를 유착을 방지할 부위에 삽입하는 것이다.Adhesion is a term that refers to the connection and fusion of the tissue surfaces of organs to be separated with fibrous tissue, and mainly refers to the interconnection of tissues to be separated by surgery or inflammation. Adhesion itself is a problem, but complications from adhesions include small intestine obstruction, acquired female infertility, ectopic pregnancy, chronic abdominal pain, and reoperation. These adhesions occur in 50% to 90% of cases after surgical operation, and 34.6% of patients undergoing reoperation due to adhesions occur frequently. Adhesion is similar to the healing process that occurs after tissue damage, and it is important to prevent adhesions that are undesirable without interfering with the natural healing process. Postoperative adhesions occur continuously even though the healing process of the wound is completed, in which fibrin, which normally deposits during the healing process, forms a bond with other adjacent tissues and ultimately forms blood vessels and merges into a complete tissue or organ. To prevent such adhesions, drugs that artificially decompose fibrin are sometimes used, but the most commonly used method is to use biodegradable materials to create a physical barrier between tissues and insert an anti-adhesion material to the tissues to prevent adhesions. will do

기존의 유착방지 소재는 생분해성 소재, 즉 셀룰로오스 혹은 히알루론산을 이용하는 경우가 많은데 이러한 생분해성 소재는 가수분해를 특징으로 하고 있어 분해속도가 빠르기 때문에 복부의 수술 후에 사용되고 있지만 보통 젤 형태를 갖고 있어 투여 부위가 넓고 손상부위에 고정이 어려워 유착 방지 효과가 낮은 단점이 있다.Existing anti-adhesion materials often use biodegradable materials, that is, cellulose or hyaluronic acid, but these biodegradable materials are characterized by hydrolysis and are rapidly decomposed, so they are used after abdominal surgery. The disadvantage is that the adhesion prevention effect is low because the site is wide and it is difficult to fix the damaged area.

또한, 관절이나 인대 수술의 경우 회복속도가 늦어 유착방지막이 오랜 시간 분해되지 않고 그 자리에서 작용을 해줘야 하지만 장시간 관절부위에 분해되지 않은 상태로 체내에 존재함에 따라 이물반응(foreign body reaction)을 일으키고 염증이 발생할 수 있다. In addition, in the case of joint or ligament surgery, the recovery rate is slow, so the anti-adhesion film does not decompose for a long time and must act on the spot. Inflammation may occur.

하지만 기존의 유착방지제는 단순한 장벽의 역할을 수행할 뿐 생리적 기능, 즉 신생혈관을 억제한다던지 염증을 제어하는 기능이 없어 혈관이 생성되는 것을 완전히 막을 수 없기 때문에 조직 간의 유착을 근본적으로 방지할 수 없고, 관절부위에 유착방지막을 사용할 경우 유착방지를 위해 체내에 오랜 기간 존재해야 하므로 이물반응이 생기고 수술부위에 염증이 발생할 수 있고, 이러한 염증을 제어하기 위해 별도의 치료를 병행해야하는 문제점이 있다.However, the existing anti-adhesion agents only play the role of a simple barrier and cannot fundamentally prevent adhesions between tissues because they do not completely prevent the formation of blood vessels because they have no physiological function, that is, inhibit new blood vessels or control inflammation. In the case of using an anti-adhesion membrane in the joint area, it has to exist for a long time in the body to prevent adhesion, so a foreign body reaction may occur and inflammation may occur in the surgical site.

한국공개특허 제10-2010-0041027호(2010년 4월 22일 공개)Korean Patent Laid-Open Patent No. 10-2010-0041027 (published on April 22, 2010)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)에 해양동물에서 추출한 기능성 성분을 혼합하여 신생혈관 억제기전을 통해 조직간의 유착을 근본적으로 막고 염증발생을 억제할 수 있는 복합기능성 유착방지용 약학조성물을 제공함에 있다.The present invention is to solve the above problems, by mixing functional ingredients extracted from marine animals with the extracellular matrix (ECM) derived from cartilage tissue to fundamentally prevent adhesion between tissues through an angiogenesis inhibitory mechanism and prevent inflammation To provide a pharmaceutical composition for preventing multifunctional adhesions that can be inhibited.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물은 연골조직 유래 세포외 기질과 해양생물에서 추출한 기능성 성분을 유효성분으로 함유한다.In order to achieve the above object, the multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention contains an extracellular matrix derived from cartilage tissue and a functional ingredient extracted from marine organisms as active ingredients.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 돼지 무릎관절에서 추출된 연골조직을 처리하여 얻은 세포외 기질인 것을 특징으로 한다.In addition, the cartilage-derived extracellular matrix is characterized in that the extracellular matrix obtained by processing the cartilage tissue extracted from the pig knee joint.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 유착방지를 위해 수술부위에 신생혈관의 형성을 억제하는 기전을 이용하는 것을 특징으로 한다.In addition, the cartilage-derived extracellular matrix is characterized in that it uses a mechanism to inhibit the formation of new blood vessels in the surgical site to prevent adhesion.

또한, 상기 수술부위는 관절유착, 골흡수, 인대를 포함하는 정형외과용 수술부위의 유착을 방지하기 위해 활용되는 것을 특징으로 한다.In addition, the surgical site is characterized in that it is used to prevent adhesion of orthopedic surgical sites including joint adhesion, bone resorption, and ligaments.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 천연 연골 조직 세포외 기질에 포함되는 신생혈관 형성을 억제하는 혈관형성 억제 인자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the cartilage-derived extracellular matrix is characterized in that it contains an angiogenesis inhibitory factor that inhibits angiogenesis contained in the natural cartilage tissue extracellular matrix as an active ingredient.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan: GAG), 엔도스태틴(endostatin), SPARC, chondromodulin-1, TSP-1 또는 콜라겐 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.In addition, the cartilage-derived extracellular matrix contains any one or more of glycosaminoglycan (GAG), endostatin, SPARC, chondromodulin-1, TSP-1, or collagen as an active ingredient. characterized.

또한, 상기 해양생물에서 추출한 기능성 성분은 갈조류에서 추출된 플로로탄닌을 함유하는 것을 특징으로 한다.In addition, the functional component extracted from the marine organisms is characterized in that it contains phlorotannin extracted from brown algae.

또한, 상기 플로로탄닌은 상기 유착방지용 약학조성물의 항염증 및 항산화 기전을 이용하여 염증발생을 억제하는 것을 특징으로 한다.In addition, the phlorotannin is characterized in that it suppresses the occurrence of inflammation by using the anti-inflammatory and antioxidant mechanism of the anti-adhesion pharmaceutical composition.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 파우더(CAM powder)의 형태로 제작되고, 상기 파우더는 연골을 분리하여 세척한 후 탈세포 처리와 효소처리를 통해 제조되는 것을 특징으로 한다.In addition, the cartilage-derived extracellular matrix is produced in the form of powder (CAM powder), and the powder is characterized in that the cartilage is separated and washed, and then is produced through decellularization and enzyme treatment.

또한, 상기 해양생물에서 추출된 기능성 성분은 상기 효소처리 후 제조된 파우더 형태의 세포외 기질에 혼합하는 것을 특징으로 한다.In addition, the functional ingredient extracted from the marine organism is characterized in that it is mixed with the extracellular matrix in the form of a powder prepared after the enzyme treatment.

또한, 상기 유착방지용 조성물은 필름 형태로 제조하되 혼합 후 가교 및 세척과 건조 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 한다.In addition, the anti-adhesion composition is prepared in the form of a film, but it is characterized in that it is prepared through crosslinking, washing, and drying steps after mixing.

이상과 같은 구성의 본 발명은 천연 연골조직에 포함된 신생혈관 형성을 억제하는 인자를 그대로 유지하여 신생혈관 억제기전을 이용하여 조직간의 유착을 근본적으로 억제할 수 있는 약학조성물을 제공한다.The present invention having the configuration as described above provides a pharmaceutical composition capable of fundamentally inhibiting adhesion between tissues by using an angiogenesis inhibitory mechanism by maintaining the factors for inhibiting the formation of angiogenesis contained in natural cartilage tissue.

또한, 유착방지를 위해 수술부위에 삽입된 유착방지막에 의해 발생할 수 있는 이물반응에 따른 염증을 제어하여 유착방지막에 의한 부작용을 원천적으로 방지할 수 있는 복합기능성 약학조성물을 제공한다.In addition, there is provided a multifunctional pharmaceutical composition that can fundamentally prevent side effects caused by the anti-adhesion film by controlling inflammation due to a foreign body reaction that may occur by the anti-adhesion film inserted into the surgical site to prevent adhesion.

도 1은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질과 해양생물에서 추출한 기능성 성분을 유효성분으로 하는 복합기능성 유착방지용 약학조성물을 포함하는 유착방지막의 제조과정을 나타내는 도면이고,
도 2는 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분을 유효성분의 제조과정을 나타내는 도면이고,
도 3은 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분의 일실시예인 플로로탄닌의 염증억제효과를 나타내는 시험 그래프이고,
도 4는 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분의 일실시예인 플로로탄닌의 항산화효과를 나타내는 시험 그래프이고,
도 5는 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 세포독성을 확인하기 위해 다양한 농도(0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4%)에서의 세포독성에 대한 평가 결과이고,
도 6은 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 유착방지효과를 확인하기 위해 토끼 아킬레스건 모델에 복합기능성 유착방지용 약학조성물를 유착방지막으로 제조하여 적용하는 과정과 1주일 후 적용부위를 나타내는 이미지이고,
도 7은 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 유착방지효과를 확인하기 위해 토끼 아킬레스건 모델에 복합기능성 유착방지용 약학조성물을 유착방지막으로 제조하여 적용 후 유착방지효과를 나타내는 그래프이다.1 is a view showing the manufacturing process of an anti-adhesion film comprising a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an extracellular matrix derived from cartilage tissue of the present invention and a functional ingredient extracted from marine organisms;
2 is a view showing the manufacturing process of the active ingredient of the functional ingredient extracted from the marine life of the present invention,
3 is a test graph showing the anti-inflammatory effect of phlorotannin, which is an example of a functional ingredient extracted from marine organisms of the present invention;
4 is a test graph showing the antioxidant effect of phlorotannin, which is an example of a functional ingredient extracted from marine organisms of the present invention;
5 is an evaluation result of cytotoxicity at various concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4%) to confirm the cytotoxicity of the multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention;
6 is an image showing the process of preparing and applying the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition as an anti-adhesion film to the rabbit Achilles tendon model in order to confirm the anti-adhesion effect of the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention and the application site after one week,
7 is a graph showing the anti-adhesion effect after application of the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition to the rabbit Achilles tendon model as an anti-adhesion film to confirm the anti-adhesion effect of the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention.

이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따른 에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, with reference to the drawings, according to the present invention will be described in detail.

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 제공하는데, 본 발명에서 “연골조직(Cartilaginous tissue)”은 연골세포(chondrocyte)와 그에 따라 생산된 연골기질(cartilage matrix)로 된 섬유성 결합조직의 일종으로 주로 척추동물에서 잘 발달한 조직을 의미한다.The present invention provides a pharmaceutical composition comprising an extracellular matrix derived from cartilage tissue as an active ingredient, in the present invention, "cartilaginous tissue" is a chondrocyte and a cartilage matrix produced thereby. It is a type of fibrous connective tissue composed of

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, to help the understanding of the present invention, examples will be described in detail. However, the following examples are merely illustrative of the content of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.

<실시예 1> 연골조직 유래 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix; CAM) 파우더의 제조<Example 1> Preparation of cartilage acellular matrix (CAM) powder derived from cartilage tissue

도 1은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 파우더의 제조과정을 나타내는 도면으로 연골조직을 탈세포화(decellularization)하여 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix: CAM)을 제조한 후 효소처리(Enzymatic digestion)를 하여 본 발명의 약학조성물이 포함된 dg-CAM 파우더를 얻는다.1 is a view showing the manufacturing process of a powder comprising a pharmaceutical composition containing the cartilage-derived extracellular matrix of the present invention as an active ingredient. Cartilage acellular matrix (CAM) by decellularization of cartilage tissue. After preparing the enzyme treatment (Enzymatic digestion) to obtain the dg-CAM powder containing the pharmaceutical composition of the present invention.

연골조직은 PBS(Phosphate-buffered saline)으로 세척한 후 동결건조기를 이용하여 영하 80℃에서 72시간동안 동결건조 시킨다. 동결건조된 연골조직을 동결분쇄기를 이용하여 분쇄한다. 탈세포화를 위해서 분쇄된 연골조직 파우더를 저장성 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)에서 4시간동안 배양하고 상온에서 0.1% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate)이 함유된 TBS(Tris-buffered saline)로 2시간동안 교반시킨다. 교반 후 4℃에서 10분간 10,000g로 원심분리를 통해 연골조직 파우더를 추출한 후 초순수(deionized water)로 5번 세척하고 37℃에서 12시간 동안 100 U/ml DNase과 함께 배양한다. 2번 세척 후 다시 동결, 분쇄한다.Cartilage tissue was washed with PBS (Phosphate-buffered saline) and then freeze-dried at minus 80°C for 72 hours using a freeze dryer. The freeze-dried cartilage tissue is pulverized using a freeze crusher. For decellularization, the pulverized cartilage tissue powder was incubated in hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) for 4 hours, and TBS (Tris-buffered saline) containing 0.1% sodium dodecyl sulfate was incubated at room temperature (Tris-buffered saline). ) and stirred for 2 hours. After stirring, the cartilage tissue powder was extracted through centrifugation at 10,000 g at 4°C for 10 minutes, washed 5 times with deionized water, and incubated with 100 U/ml DNase at 37°C for 12 hours. After washing twice, freeze and grind again.

효소 분해는 10 mg/ml의 최종 농도에서 0.1%(w/v) 펩신을 함유하는 0.1 M HCl로 이루어진다. CAM 서스펜젼(suspension)은 pH 7.4의 1 M NaOH로 중화시킨 후 상온에서 48시간 동안 교반시킨다. 분해된 CAM을 이후 투석막을 통해 12시간 동안 초순수로 투석시킨다. 최종 dg-CAM 파우더를 제조하기 위해 CAM 서스펜젼을 동결 건조시킨다. 제조된 dg-CAM 파우더는 멸균 후 영하 70℃ 이하에서 보관한다. dg-CAM 서스펜젼을 만들기 위해서 정제수, PBS, 세포배양배지(cell culture medium) 또는 식염수와 같은 용매 (Physiological solution)를 혼합하여 원하는 농도로 제조한다.Enzymatic digestion consists of 0.1 M HCl containing 0.1% (w/v) pepsin at a final concentration of 10 mg/ml. The CAM suspension was neutralized with 1 M NaOH of pH 7.4 and stirred at room temperature for 48 hours. The digested CAM is then dialyzed through a dialysis membrane with ultrapure water for 12 hours. The CAM suspension is freeze-dried to prepare the final dg-CAM powder. The prepared dg-CAM powder is stored at −70° C. or lower after sterilization. To make the dg-CAM suspension, purified water, PBS, cell culture medium, or a solvent (physiological solution) such as saline is mixed and prepared at a desired concentration.

도 2는 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분을 유효성분의 제조과정을 나타내는 도면으로 본 발명의 항염증 효과를 극대화한 복합기능성 유착방지막을 제조하기 위해 dg-CAM 서스펜젼에 혼합할 플로로탄닌 분말을 제조하는 과정이다.Figure 2 is a view showing the production process of the active ingredient of the functional ingredient extracted from marine organisms of the present invention, the flow to be mixed in the dg-CAM suspension to produce a multifunctional anti-adhesion film maximizing the anti-inflammatory effect of the present invention It is the process of manufacturing tannin powder.

플로로탄닌은 감태로부터 추출되는데 준비된 감태 원물은 수세과정을 거쳐 염분 및 부착생물들을 제거하고 동결건조하여 분말화 시킨다. 플로로탄닌 분말은 감태 원물 분말에 주정알코올(순도 95%)을 정제수와 혼합하여 70%로 조정하고 이를 교반기에 넣고 침지하여 추출한다. 추출 후 원심분리를 실시하여 상등액을 분리하고 원심분리된 침전물은 70% 주정알코올과 함께 교반기에 넣고 재추출한다. 재추출 후 다시 원심분리를 실시한 후 분리된 상등액을 여과를 통해 잔여물을 제거한다. 잔여물 제거 후 농축기를 이용하여 60℃에서 진공감압농축을 실시하며 농축액은 동결건조기에서 5일간 동결건조하여 감태로부터 추출된 플로로탄닌 분말을 얻어낸다. Phlorotannin is extracted from Ecklonia cava, and the prepared Ecklonia cava is washed with water to remove salt and attached organisms, and then freeze-dried and powdered. Phlorotannin powder is extracted by mixing alcohol (purity 95%) with purified water and putting it in a stirrer and immersing it in a stirrer. After extraction, centrifugation is performed to separate the supernatant, and the centrifuged precipitate is placed in a stirrer with 70% alcohol and re-extracted. After re-extraction and centrifugation again, the separated supernatant is filtered to remove the residue. After removing the residue, vacuum concentration is carried out at 60°C using a concentrator, and the concentrate is freeze-dried in a freeze dryer for 5 days to obtain a phlorotannin powder extracted from Ecklonia cava.

감태플로로탄닌 분말을 정제수와 혼합하여 감태플로로탄닌 용액을 제조하고 제조된 dg-CAM 서스펜젼 용액에 농도를 맞춰 혼합한 후 몰딩 및 건조 작업을 거쳐 감태플로로탄닌이 첨가된 필름을 제조한다.E. E. phlorotannin powder is mixed with purified water to prepare a E. E. phlorotannin solution, the concentration is matched to the prepared dg-CAM suspension solution, and then molded and dried to produce a film with E. phlorotannin added do.

<실시예 2> 플로로탄닌의 염증억제효과<Example 2> Inflammation inhibitory effect of phlorotannin

도 3은 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분의 일실시예인 플로로탄닌의 염증억제효과를 나타내는 시험 그래프이다.3 is a test graph showing the anti-inflammatory effect of phlorotannin, which is an example of a functional ingredient extracted from marine organisms of the present invention.

플로로탄닌의 염증억제효과를 확인하기 위해 뇌 면역세포인 BV2 세포에 폐 혈증을 일으켜 염증을 유발한 뒤 플로로탄닌(dieckol)을 첨가하여 세포의 염증인자의 발현을 확인하였다. 뇌 손상을 포함한 염증의 매개체인 iNOS와 COX-2의 RNA 단백질 발현을 확인한 결과 도 3A, 3B에서와 같이 플로로탄닌의 농도(50, 100, 300 ug/ml)가 높아질수록 internal control인 베타-actin과 GAPDH에 비해 염증인자인 iNOS와 COX-2의 발현이 억제됨을 확인할 수 있다.To confirm the anti-inflammatory effect of phlorotannin, sepsis was induced in BV2 cells, which are brain immune cells, and then phlorotannin (dieckol) was added to confirm the expression of inflammatory factors in the cells. As a result of confirming the expression of RNA proteins of iNOS and COX-2, which are mediators of inflammation including brain damage, as the concentration of phlorotannin (50, 100, 300 ug/ml) increased, the internal control beta- It can be confirmed that the expression of iNOS and COX-2, which are inflammatory factors, is suppressed compared to actin and GAPDH.

<실시예 3> 플로로탄닌의 항산화 특성<Example 3> Antioxidant properties of phlorotannin

도 4는 본 발명의 해양생물에서 추출한 기능성 성분의 일실시예인 플로로탄닌의 항산화효과를 나타내는 시험 그래프이다.4 is a test graph showing the antioxidant effect of phlorotannin, which is an example of a functional ingredient extracted from marine organisms of the present invention.

플로로탄닌의 항산화효과를 확인하기 위해 세포내 활성산소의 농도를 DCHF-DA 분석을 통해 측정하였다. 플로로탄닌의 농도(0, 25, 50, 100 ug/ml)에 따라 H2O2유도 산화제에 대한 세포 생존력이 크게 향상되었음을 확인할 수 있고 이를 통해 항산화 활성이 향상되었음을 확인할 수 있다. 왼쪽 그래프는 세포내 활성산소와 반응하여 변화된 DCF의 농도를 통해 활성산소 발생 정도를 평가하는 것이며, 오른쪽 그래프는 MTT 분석을 통해 세포의 생존률을 확인한 것이다.In order to confirm the antioxidant effect of phlorotannin, the concentration of active oxygen in cells was measured through DCHF-DA analysis. Depending on the concentration of phlorotannin (0, 25, 50, 100 ug/ml), it can be confirmed that the cell viability to the H 2 O 2 induced oxidizer is greatly improved, and through this, it can be confirmed that the antioxidant activity is improved. The left graph evaluates the generation of reactive oxygen species through the concentration of DCF changed in reaction with intracellular reactive oxygen species, and the right graph confirms the cell viability through MTT analysis.

<실시예 4> 세포 독성 평가<Example 4> Cytotoxicity evaluation

도 5는 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 세포독성을 확인하기 위해 다양한 농도(0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4%)에서의 세포독성에 대한 평가 결과이다.5 is an evaluation result of cytotoxicity at various concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4%) to confirm the cytotoxicity of the multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention.

본 발명의 복합기능성 유착방지용 조성물의 MTT assay에서 In-vitro 독성평가를 위해 ISO10993-12:2014-Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials에 고시된 기준에 따라 세포배양배지에 37도에서 용출한 후 1일차, 3일차 용출물을 확보하여 인간 기도 유래 섬유아세포(human tracheal fibroblast; Hs680.Tr)로 MTT 방법을 통해 측정하였다. 도 5에서와 같이 1일차 용출물은 인간 기도 유래 섬유아세포의 세포 생존율에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.For in-vitro toxicity evaluation in the MTT assay of the multifunctional anti-adhesion composition of the present invention, 37 After elution in the figure, the first and third day eluates were obtained and measured with human tracheal fibroblasts (Hs680.Tr) using the MTT method. As shown in FIG. 5 , it was confirmed that the primary eluate did not affect the cell viability of human airway-derived fibroblasts.

<실시예 5> 토끼 아킬레스건 모델을 통한 유착방지 효과 분석<Example 5> Analysis of anti-adhesion effect through rabbit Achilles tendon model

도 6은 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 유착방지효과를 확인하기 위해 토끼 아킬레스건 모델에 복합기능성 유착방지용 약학조성물를 유착방지막으로 제조하여 적용하는 과정과 1주일 후 적용부위를 나타내는 이미지이고, 도 7은 본 발명의 복합기능성 유착방지용 약학조성물의 유착방지효과를 확인하기 위해 토끼 아킬레스건 모델에 복합기능성 유착방지용 약학조성물를 유착방지막으로 제조하여 적용 후 유착방지효과를 나타내는 그래프이다.6 is an image showing the process of preparing and applying the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition as an anti-adhesion film to the rabbit Achilles tendon model in order to confirm the anti-adhesion effect of the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention and the application site after one week, 7 is a graph showing the anti-adhesion effect after applying the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition to the rabbit Achilles tendon model as an anti-adhesion film to confirm the anti-adhesion effect of the multi-functional anti-adhesion pharmaceutical composition of the present invention.

사람의 수술 후 인대 건의 유착기전을 모사하는 환경을 제시하기 위해 토끼 아킬레스 건 손상 모델을 선정하였다. 토끼 아킬레스 건 손상 모델은 토끼 아킬레스건을 가로로 50% 절개한 후 modified kessier stich 방법으로 봉합한 후 유착방지막을 손상된 아킬레스건 부위에 감싸 제작하였다. 1주 후, 적출하여 유착정도를 확인해 본 결과 Defect 군에서 손상된 건 조직 주위로 과도한 섬유조직의 생성과 함께 유착이 일어난 것을 확인 할 수 있으며, dg-CAM Film을 이식한 경우 주변조직과 유착이 관찰되긴 하였으나 Defect군에 비해 경미한 수준이였으며, 플로로탄닌 필름을 이식한 경우에는 유착이 일어나지 않고, 필름이 적용부위에 남아있음을 확인하였다. 플로로타닌 필름의 경우 필름이 적용부위에 남아있음에도 불구하고 치유과정에서 발생하는 염증의 감소로 인해 dg-CAM Film에 비해 유착 방지 효과가 탁월한 것으로 평가할 수 있다.A rabbit Achilles tendon injury model was selected to present an environment simulating the adhesion mechanism of ligamentous tendons after human surgery. The rabbit Achilles tendon injury model was fabricated by making a 50% transverse incision in the rabbit Achilles tendon, sutures using the modified kessier stich method, and wrapping an anti-adhesion membrane around the damaged Achilles tendon. After 1 week, it was excised and the degree of adhesion was checked. As a result, in the Defect group, it was confirmed that excessive fibrous tissue was formed around the damaged tendon tissue and adhesion occurred. However, it was at a slight level compared to the Defect group, and when the phlorotannin film was transplanted, it was confirmed that adhesion did not occur and the film remained at the application site. In the case of the phlorotannin film, it can be evaluated that the anti-adhesion effect is excellent compared to the dg-CAM film due to the reduction of inflammation that occurs during the healing process despite the film remaining at the application site.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. is clear That is, the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

A multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition containing an extracellular matrix derived from cartilage tissue and functional ingredients extracted from marine organisms as active ingredients.

In claim 1,
The cartilage tissue-derived extracellular matrix is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it is an extracellular matrix obtained by processing the cartilage tissue extracted from the pig knee joint.

In claim 1,
The cartilage tissue-derived extracellular matrix is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it uses a mechanism to inhibit the formation of new blood vessels in the surgical site to prevent adhesions.

In claim 3,
The surgical site is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it is used to prevent adhesion of orthopedic surgical sites including joint adhesion, bone resorption, and ligaments.

In claim 1,
The cartilage-derived extracellular matrix is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition comprising an angiogenesis inhibitory factor that inhibits angiogenesis contained in the natural cartilage tissue extracellular matrix as an active ingredient.

In claim 4,
The cartilage-derived extracellular matrix is characterized in that it contains any one or more of glycosaminoglycan (GAG), endostatin, SPARC, chondromodulin-1, TSP-1, or collagen as an active ingredient. A multifunctional pharmaceutical composition for preventing adhesions.

In claim 1,
The functional ingredient extracted from the marine organisms is a multifunctional pharmaceutical composition for preventing adhesions, characterized in that it contains phlorotannin extracted from brown algae.

In claim 7,
The phlorotannin is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it suppresses the occurrence of inflammation by using the anti-inflammatory and antioxidant mechanism of the anti-adhesion pharmaceutical composition.

In claim 1,
The cartilage-derived extracellular matrix is prepared in the form of a powder,
The powder is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it is prepared through decellularization treatment and enzyme treatment after washing the cartilage.

In claim 9,
The functional ingredient extracted from the marine organism is a multifunctional anti-adhesion pharmaceutical composition, characterized in that it is mixed with the extracellular matrix in the form of a powder prepared after the enzyme treatment.